АНТИ-αvβ8 АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 

По настоящей заявке испрашивается приоритет по заявке США № 62/728,688, поданной 7 сентября 2018, и заявке США № 62/890,945, поданной 23 августа 2019, содержание которых включено сюда посредством ссылки полностью.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Описание дополнительно включает посредством ссылки Список последовательностей, представленный 5 сентября 2019. В соответствии с 37 C.F.R. § 1.52(e)(5), Текстовый файл Списка последовательностей, идентифицированный как PC72413A_SequenceListing_ST25.txt, имеет размер 184,211 байт и создан 3 сентября 2019. Список последовательностей, поданный электронно, не выходит за объем описания и, следовательно, не содержит нового объекта.

СТОРОНЫ СОВМЕСТНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Заявленное в настоящее время изобретение было создано перечисленными ниже сторонами соглашения о совместных исследованиях или от их имени. Соглашение о совместных исследованиях вступило в силу на дату создания заявленного изобретения или ранее, и заявленное изобретение было создано в результате деятельности, предпринятой в рамках соглашения о совместных исследованиях. Сторонами соглашения о совместных исследованиях являются THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA от имени его SAN FRANCISCO CAMPUS и PFIZER INC.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связывают αvβ8 интегрин, и их композициям, способам и применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансформирующий фактор роста β (TGFβ) является мощным супрессором адаптивного и врожденного иммунитета и важным медиатором подавления иммунитета подмножеством регуляторных Т-клеток. TGFβ необходим для индукции клеток Th17, которые могут способствовать прогрессированию опухоли через индукцию гранулоцитарного воспаления и способствует эпителиально-мезенхимальной трансформации опухолевых клеток, секреции и накоплению фиброзной стромы опухоли, что может способствовать исключению иммунных клеток из некоторых солидных опухолей. По всем этим причинам ингибирование TGFβ исследовалось в качестве дополнительной иммунотерапии, особенно при так называемых «иммунно-исключенных» опухолях (Gorelik et al. Nat. Med.7:1118-1122, 2001; Tauriello et al. Nature 554:538-543, 2018; Mariathasan et al. Nature 554:544-548, 2018, Dodagatta et al. J Immunother Cancer. 7: 62. 2019; Патент США № 10,167,334). Однако, так как TGFβ играет важные гомеостатические роли во многих биологических системах, системное таргетирование передачи сигналов TGFβ представляет множество проблем из-за нежелательных побочных эффектов (Hata and Akhurst Nat. Rev. Drug Dev. 11, 791-811, 2012; Akhurst et al. Cold Spring Harbor Perspectives. 10, 2017; Flavell et al. Nat. Rev. Immunol. 10:554-567, 2010).

Предыдущие исследования показали, что ингибирование передачи сигналов TGFβ может усиливать ответы на радиационную или вакцинную терапию в сочетании с ингибированием контрольной точки (Vanpouille-Box et al. Cancer Res. 75:2232-2242, 2015; Terabe et al. OncoImmunology 6(5):e1308616, 2017). In vivo активность TGFβ регулируется через несколько механизмов. Например, TGFβ секретируется в виде неактивного или латентного комплекса, где домен расщепленного ассоциированного с латентностью пептида (LAP) включает активный TGFβ зрелый пептид. Латентный-TGFβ может быть ковалентно связан с внеклеточной матрицей через латентный TGFβ связывающий белок (LTBP) или проявляется на клеточной поверхности через преобладающий белок повторов гликопротеина-А (GARP). Ранние in vitro данные показали, что латентный комплекс TGFβ может быть активирован высокой температурой, кислым pH и разными протеазами (Annes et al. J Cell Sci. 116:217-24, 2003), однако важность этих механизмов in vivo еще предстоит определить.

Роль членов семейства αv интегрина, более конкретно, αvβ1, αvβ6 и αvβ8, была продемонстрирована для активации латентного-TGFβ. Интегрин αvβ8 является трансмембранным нековалентным гетеродимером, состоящим из ITGαV и ITGβ8 субъединиц. Экспрессия αvβ8 является уникальной среди αv интегринов, где его экспрессия иммунными клетками, такими как дендритные клетки, T регуляторные клетки и опухолеассоциированными макрофагами возникает как ситуативный активатор TGFβ для регулирования активных иммунных ответов. Экспрессия αvβ8 дендритными клетками (DC) действует как медиатор продуцирования TGFβ во время стимуляции T-клетки и сильно влияет на дифференциацию и развитие Tregs и Th17 клеток за счет дифференциации Th1 во время иммунных ответов. Мыши с условной делецией Itgb8 в DC или всех лейкоцитах демонстрируют сильное ингибирование TGFβ-зависимой индукции антигенспецифических Th17 клеток, и впоследствии их защищают от дисфункции органов в определенных доклинических моделях аутоиммунитета, таких как рассеянный склероз (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) и аллергическая астма (Travis et al. Nature. 449(7160):361-5, 2007; Melton et al. J Clin. Invest. 120(12):4436-44, 2010).

TGFβ играет роль и в дифференциации, и в рекрутменте иммунных клетках-суппрессорах в опухоль, и как внутренний фактор опухоли, который способствует иммуносупрессивной микросреде опухоли. При некоторых формах рака, TGFβ может способствовать развитию опухоли, влияя на многочисленные аспекты микросреды опухоли, включая ангиогенез, метастазирование, эпителиально-мезенхимальный переход и, что, возможно, наиболее важно, подавление инфильтрирующих иммунных клеток.

Следовательно, ввиду выдающейся роли TGFβ в микросреде опухоли и многочисленных проблем, связанных с системным таргетированием передачи сигналов TGFβ (Hata and Akhurst Nat. Rev. Drug Dev. 11, 791-811, 2012; Akhurst et al. Cold Spring Harbor Perspectives 10, 2017; Flavell et al. Nat. Rev. Immunol. 10:554-567, 2010), существует необходимость в разработке стратегий для селективного ингибирования αvβ8-зависимой активации латентного-TGFβ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе раскрыты антитела (например, гуманизированные и химерные антитела) и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с αvβ8 интегрином (также взаимозаменяемо названным в настоящем документе «AVB8», «αvβ8» или «avb8») (например, αvβ8 интегрином от человека, мыши, яванского макака и/или крысы). В определенных аспектах, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты связываются с αvβ8 интегрином и значительно снижают передачу сигналов TGFβ (например, TGFβ1 и TGFβ3), например, в опухоли или микросреде опухоли.

Зрелые TGFβ присутствуют в неактивной или латентной форме в комплексе с доменом ассоциированного с латентностью пептида (LAP). Связывание αvβ8 интегрина с LAP дает выделение активного TGFβ (например, TGFβ1 и TGFβ3). Снижение связывания αvβ8 интегрина с LAP может предотвратить выделение активного TGFβ, тем самым снижая передачу сигналов TGFβ. Известно, что TGFβ оказывает иммунодепрессивное действие, например, в микросреде опухоли, поэтому снижение активности и/или передачи сигналов TGFβ с применением антител, описанных в настоящем документе, может дать активацию иммунного ответа, например, противоопухолевого ответа in vivo.

Из-за ограниченной экспрессии αvβ8 интегрина на иммунных клетках (например, дендритных клетках, T регуляторных клетках, опухолеассоциированных макрофагах) и опухолевых клетках, антитела, описанные в настоящем документе, могут дать более таргетированное несистемное снижение передачи сигналов TGFβ. Таким образом, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу позволяют более селективный антагонизм активности TGFβ в иммунной системе и/или микросреде опухоли, тем самым улучшая противоопухолевый ответ у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, было показано, что антитела против αvβ8 интегрина вызывают подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животных моделях для нескольких видов рака, включая, например, плоскоклеточную карциному, рак груди и/или рак толстой кишки, отдельно или в сочетании с другими иммуномодуляторами, такими как модуляторы ингибиторов контрольной точки, (например, ингибиторы PD-1, PD-L1, CTLA-4 или агонисты 4-1BB) противораковые терапии, например, радиотерапия.

Следовательно, в определенных аспектах, описание представляет антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с αvβ8 интегрином с высокой аффинностью и специфичностью, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, векторы экспрессии, клетки-хозяева и способы их получения. В определенных аспектах, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты демонстрируют измененные эффекторные функции (например, имеют пониженную антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или пониженную комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC)). В определенных аспектах, анти-αvβ8 интегрин антитела и их антигенсвязывающие фрагменты демонстрируют улучшенную аффинность связывания для αvβ8 интегрина по сравнению с антителами гибридомы мыши и их антигенсвязывающими фрагментами, из которых они получены. Гуманизированные анти-αvβ8 интегрин антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут применяться отдельно или в комбинации с другими агентами или терапевтическими методами (например, иммуномодуляторами или противораковыми терапиями) для лечения, профилактики и/или диагностики расстройств, таких как раковые расстройства (например, опухоли твердых и мягких тканей). Таким образом, раскрыты композиции и способы определения αvβ8 интегрина, а также способы лечения различных расстройств, включая рак, с применением анти-αvβ8 интегрин антител и их антигенсвязывающих фрагментов.

Специалисты в данной области поймут или смогут установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных здесь. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются следующими вариантами осуществления (E).

E1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

i. аффинность связывания, выраженная как KD, для αvβ8 интегрина человека, которая меньше KD для антитела ADWA11 мыши, как описано в Патенте США № 9,969,804, который включен сюда посредством ссылки полностью, подтверждающую аминокислотные последовательности и представленную в, например, SEQ ID NO: 20-33 и 71-76 настоящего описания, например, где ADWA11 антитела по изобретению имеют KD менее чем 536 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 531, 532, 533, 534 или 535 пМ);

ii. KD для αvβ8 интегрина человека, которая меньше или равна 200 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 180, 190 или 200 пМ), например, для очищенного αvβ8 интегрина человека;

iii. KD для αvβ8 интегрина человека, которая меньше или равна 100 пМ для очищенного αvβ8 интегрина человека;

iv. KD для αvβ8 интегрина мыши, которая менее чем KD для антитело ADWA11 мыши, например, менее чем 489 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 460, 470, 480, 485, 486, 487 или 488 пМ);

v. KD для αvβ8 интегрина мыши, которая составляет 70,8 +/- 19,9 пМ для очищенного αvβ8 интегрина мыши;

vi. KD для αvβ8 интегрин яванского макака, которая менее чем KD для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 507 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 500, 501, 502, 503, 504, 505 или 506 пМ);

vii. KD для αvβ8 интегрин яванского макака, которая меньше или равна 100 пМ для очищенного αvβ8 интегрина яванского макака;

viii. KD для αvβ8 интегрин крысы, которая составляет примерно 160 пМ;

ix. приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с KD менее чем 100 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98 пМ), например, определенную с применением анализа аффинности Biacore;

х. IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации, которая меньше чем для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 183 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 181 или 182 пМ);

xi. IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации в U251 клетках примерно 199 +/- 93,6 пМ;

xii. IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации, составляющая, от примерно 100 пМ до примерно 300 пМ;

xiii. EC50 для U251 клеток примерно 126 +/- 34 пМ (например, примерно 50, 60, 70 80, 90, 100, 110, 115, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 140, 150, 160, 170, 180 или 190 пМ);

xiv. EC50 для U251 клеток примерно 256 +/- 115 пМ (например, примерно 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400 пМ);

xv. EC50 для U251 клеток от примерно 80пМ до примерно 400 пМ;

xvi. EC50 для C8-S клеток примерно 115 пМ;

xvii. EC50 для C8-S клеток примерно 145+/- 23,7 пМ;

xviii. EC50 для C8-S клеток от примерно 110 пМ до примерно 180 пМ;

xix. по меньшей мере, один спрогнозированный параметр фармакокинетики (ФК) у человека, выбранный из:

а. клиренс из центральной камеры (CL) примерно 0,12-0,15 мл/ч/кг;

b. межкамерный клиренс распределения (CLF) примерно 0,15-0,51 мл/ч/кг;

с. объем распределения для центральной камеры (V1) примерно 36-39 мл/кг;

d. объем распределения для периферической камеры (V2) примерно 21 -33 мл/кг; и/или

е. конечный период полувыведения (t_1/2) примерно 12 дней;

f. конечный период полувыведения (t_1/2) примерно 15-17 дней; или

хх. отсутствие определяемого связывания Fcγ рецепторами человека или C1q.

E2. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E1, где KD для αvβ8 интегрина человека меньше, чем KD для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 536 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 531, 532, 533, 534 или 535 пМ).

E3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E1 или E2, где KD для αvβ8 интегрина человека меньше или равна 100 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 пМ), например, для очищенного αvβ8 интегрина человека.

E4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где KD для αvβ8 интегрина мыши меньше чем KD для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 489 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 460, 470, 480, 485, 486, 487 или 488 пМ).

E5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где KD для αvβ8 интегрина мыши составляет примерно 70,8 +/- 19,9 пМ.

E6. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где KD для αvβ8 интегрина яванского макака меньше, чем KD для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 507 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 500, 501, 502, 503, 504, 505 или 506 пМ).

E7. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где KD для αvβ8 интегрина яванского макака составляет менее чем 100 пМ.

E8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где KD для αvβ8 интегрина крысы составляет примерно 160 пМ.

E9. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, показывают приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с KD менее чем 100 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 пМ), например, определенную с применением анализа аффинности Biacore.

E10. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, показывает приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с KD менее чем 100 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98 пМ), например, определенную с применением анализа аффинности Biacore.

E11. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации составляет менее чем у антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 183 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 181 или 182 пМ).

E12. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации в U251 клетках составляет примерно 199 +/- 93,6 пМ.

E13. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации составляет от примерно 100 пМ до примерно 300 пМ.

E14. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где EC50 для U251 клеток составляет примерно 126 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 34 пМ.

E15. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где EC50 для U251 клеток составляет примерно 256 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 115 пМ.

E16. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где EC50 для U251 клеток составляет от примерно 100 пМ до примерно 400 пМ.

E17. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где EC50 для C8-S клеток составляет примерно 115 пМ.

E18. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где EC50 для C8-S клеток составляет примерно 145 +/- 23,7 пМ.

E19. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где EC50 для C8-S клеток составляет от примерно 110 пМ до примерно 180 пМ.

E20. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, имеющее по меньшей мере один спрогнозированный фармакокинетический (ФК) параметр человека, выбранный из группы, состоящей из:

(i) клиренса из центральной камеры (CL) примерно 0,12-0,15 мл/ч/кг;

(ii) межкамерного клиренса распределения (CLF) примерно 0,15-0,51 мл/ч/кг;

(iii) объема распределения для центральной камеры (V1) примерно 36-39 мл/кг;

(iv) объема распределения для периферической камеры (V2) примерно 21-33 мл/кг; и/или

(v) конечного периода полувыведения (t_1/2) примерно 12-17 дней.

E21. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не показывает определяемого связывания с Fcγ рецептором человека или C1q.

E22. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вышепредставленных вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно имеют по меньшей мере одно из следующих свойств:

(i) связывается специфически с αvβ8 интегрином (например, αvβ8 интегрином человека, мыши, яванского макака и/или крысы);

(ii) снижает взаимодействие между αvβ8 интегрином и ассоциированным с латентностью пептидом (LAP);

(iii) снижает TGF-β передачу сигналов;

(iv) эффективно блокирует αvβ8 интегрин-опосредованную TGFβ активацию с IC50 ≤10 нМ;

(v) имеет сравнимую Kd (в 5-кратных пределах) к ортологу (NHP) примата, отличного от человека;

(vi) селективно связывает αvβ8 человека и не связывает определяемо гомолог αvβ8 (например, αvβ1, αvβ3, αvβ5 и αvβ6);

(vii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животной модели рака, отдельно или в комбинации с иммуномодуляторным агентом, например, модулятором ингибиторов контрольной точки, например, ингибиторами PD-1, PD-L1, CTLA-4 или агонистом стимулирующей молекулы, например, 4-1BB;

(viii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животной модели рака в комбинации с противораковой терапией, например, радиотерапией;

(ix) показывает по меньшей мере 60% снижение роста опухоли в сингенной модели ксенотрансплантата опухоли, например, при введении в дозе ≤10 мг/кг, отдельно или в комбинации с иммуномодуляторным агентом (например, ингибитором PD-1, PD-L1 или CTLA-4);

(х) повышает противоопухолевый ответ в присутствии одного или нескольких иммуномодуляторов, например, антагониста ингибитора контрольной точки, например, антагониста PD-1, PD-L1 или CTLA-4, или активатора иммунного ответа, например, 4-1BB агониста, при введении субъекту;

(xi) имеет эффективность, которая не зависит от экспрессии αvβ8 интегрина в модели опухоли;

(xii) повышает численность CD8+ GzmB+ T клеток в микросреде опухоли;

(xiii) показывает снижение, например по меньшей мере >80% снижение роста опухоли при применении в комбинации с антагонистом ингибитора контрольной точки (например, анти-PD-1 или анти-PD-L1 антителом), например, в сингенной модели плоскоклеточной карциномы, рака груди и/или рака толстой кишки;

(xiv) демонстрирует статистически значимое улучшение общего выживания субъекта по данным анализа Каплана-Мейера;

(xv) имеет высокую степень термостабильности;

(xvi) демонстрирует минимальную агрегацию при высоких концентрациях; и

(xvii) может демонстрировать воспроизводимую экспрессию и чистоту в условиях промышленного производства.

E23. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, H1, H2 или H3) и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, L1, L2 или L3), выбранную из:

(i) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или 14,

CDR-H2 содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или 15,

CDR-H3 содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или 16,

CDR-L1 содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 17,

CDR-L2 содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 18, и

CDR-L3 содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 19, или

(ii) CDR-H1 содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 8 или 14,

CDR-H2 содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативноой замены) относительно SEQ ID NO: 9 или 15,

CDR-H3 содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 10 или 16,

CDR-L1 содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 11 или 17,

CDR-L2 содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 12 или 18 или

CDR-L3 содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 13 или 19, необязательно где:

любой из CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3, не содержащей аминокислотную последовательность любой из:

(a) SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26 и 27, соответственно,

(b) SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 и 33, соответственно,

(c) SEQ ID NO: 22, 23, 24, 71, 72 и 73, соответственно, или

(d) SEQ ID NO: 28, 29, 30, 74, 75 и 76, соответственно.

Альтернативно или в комбинации с любым из вариантов осуществления, представленных здесь (например, E1-E23), антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее один или несколько из следующих аспектов, признаков и вариантов осуществления.

E24. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, включающее:

одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, H1, H2 или H3), и/или одной, двух или трех CDR из вариабельной области легкой цепи (например, L1, L2 или L3), выбранной из:

(i) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8,

CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,

CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10,

CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,

CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и

CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или

(ii) CDR-H1, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 8,

CDR-H2, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 9,

CDR-H3, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 10,

CDR-L1, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 11,

CDR-L2, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 12 или

CDR-L3, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 13, необязательно где:

любая из CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3 не содержит аминокислотную последовательность любой из:

(a) SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26 и 27, соответственно, или

(b) SEQ ID NO: 22, 23, 24, 71, 72 и 73, соответственно.

E25. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

одну, две или три определяющих комплементарность областей (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (например, H1, H2 или H3) и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, L1, L2 или L3), выбранной из:

CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,

CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,

CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и

CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

E26. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из варианта осуществления E24 или E25, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

E27. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вариантов осуществления E24-E26, содержащее:

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

E28. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

E29. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три определяющих комплементарность области (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (например, H1, H2 или H3) и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, L1, L2 или L3):

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYYMN (SEQ ID NO: 8);

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WIDPDX₁GNTIYX₂PKFQG (SEQ ID NO: 131), где X₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или Q; и X₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от D, консервативной замены D, D или E;

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RLLMDY (SEQ ID NO: 10);

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RSTKSLX₃HFNGNTYLF (SEQ ID NO: 132), где X₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или S;

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность YYMSX₄LAS (SEQ ID NO: 133), где X₄ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или S; и/или

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность X₅QSLEYPFT (SEQ ID NO: 134),где X₅ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от M, консервативной замены M, M или Q;

например, где CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 не содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26 и 27, соответственно или SEQ ID NO: 22, 23, 24, 71, 72 и 73, соответственно.

E30. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E29, где X₁ является Q и X₂ является E.

E31. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E29 или E30, где X₃ является S.

E32. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вариантов осуществления E29-E31, где X₄ является S.

E33. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вариантов осуществления E29-E32, где X₅ является Q.

E34. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E29, где X₁ является Q, X₂ является E, X₃ является S и X₅ является Q.

E35. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E29, где X₁ является Q, X₂ является E и X₃ является S.

E36. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E29, где X₁ является Q, X₂ является E, X₃ является S, X₄ является S и X₅ является Q.

E37. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три определяющих комплементарность области (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (например, H1, H2 или H3), и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, L1, L2 или L3):

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYYMN (SEQ ID NO: 8);

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WIDPDX₁GX₂TIYX₃X₄X₅X₆X₇G (SEQ ID NO: 167), где X₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или Q; X₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или Q; X₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от D, консервативной замены D, D или E; X₄ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от P, консервативной замены P, P, Q, D или A; X₅ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от K, консервативной замены K, K, S или A; X₆ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от F, консервативной замены F, F или V; и X₇ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от Q, консервативной замены Q, Q или K;

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RLLMDY (SEQ ID NO: 10);

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RSTKSX₈X₉HFNGNX₁₀YLF (SEQ ID NO: 168), где X₈ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или I; X₉ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или S; и X₁₀ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от T, консервативной замены T, T или S;

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность YX₁₁X₁₂SX₁₃LX₁₄S (SEQ ID NO: 169), где X₁₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от Y, консервативной замены Y, Y или A; X₁₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от M, консервативной замены M, M или A; X₁₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или S; и X₁₄ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от A, консервативной замены A, A или Q; и/или

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность X₁₅QSX₁₆X₁₇X₁₈PX₁₉T (SEQ ID NO: 170),где X₁₅ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от M, консервативной замены M, M или Q; X₁₆ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или Y; X₁₇ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от E, консервативной замены E, E или S; X₁₈ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от Y, консервативной замены Y, Y или T; и X₁₉ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от F, консервативной замены F, F, L или W;

например, где CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR- L3 не содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26 и 27, соответственно или SEQ ID NO: 22, 23, 24, 71, 72 и 73, соответственно, необязательно где:

X₁ является Q, X₂ является N, X₃ является E, X₄ является P, X₅ является K, X₆ является F и X₇ является Q,

X₈ является L, X₉ является S и X₁₀ является T,

X₁₁ является Y, X₁₂ является M, X₁₃ является S и X₁₄ является A, и/или

X₁₅ является Q, X₁₆ является L, X₁₇ является E, X₁₈ является Y и X₁₉ является F.

E38. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три определяющих комплементарность области (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи (например, H1, H2 или H3), и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, L1, L2 или L3):

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYYMN (SEQ ID NO: 8);

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WIDPDX₁GNTIYX₂PKX₃QG (SEQ ID NO: 171), где X₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или Q; X₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от D, консервативной замены D, D или E; и X₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от F, консервативной замены F, F или V;

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RLLMDY (SEQ ID NO: 10);

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RSTKSLX₄HFNGNTYLF (SEQ ID NO: 172), где X₄ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или S;

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность YYX₅SX₆LAS (SEQ ID NO: 173), где X₅ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от M, консервативной замены M, M или A; и X₆ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или S; и/или

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность X₇QSX₈EYPFT (SEQ ID NO: 174),где X₇ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от M, консервативной замены M, M или Q; и X₈ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или Y;

например, где CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 не содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26 и 27, соответственно или SEQ ID NO: 22, 23, 24, 71, 72 и 73, соответственно, необязательно где:

X₁ является Q, X₂ является E и X₃ является F,

X₄ является S,

X₅ является M и X₆ является S, и/или

X₇ является Q и X₈ является L.

E39. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три из CDR последовательностей из VH области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, где CDR последовательности определены согласно Kabat.

E40. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательностей из VL области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, где CDR последовательности определены согласно Kabat.

E41. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из VH области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и одну, две или три из CDR-L1 последовательностей из VL области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, где CDR последовательности определены согласно Kabat.

E42. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 189, 190 или 191, где CDR последовательности определены согласно Kabat.

E43. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 185 или 186, где CDR последовательности определены согласно Kabat.

E44. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 189, 190 или 191 и одну, две или три из CDR последовательностей из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 185 или 186, где CDR последовательности определены согласно Kabat.

E45. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR), выбранное из:

(i) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14,

CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15,

CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16,

CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; или

(ii) CDR-H1, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 14,

CDR-H2, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 15,

CDR-H3, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 16,

CDR-L1, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 17,

CDR-L2, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 18, или

CDR-L3, содержащей по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замены, делеции или вставки, например, консервативной замены) относительно SEQ ID NO: 19, необязательно где:

любая из CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3 не содержит аминокислотные последовательности любой из

(a) SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 и 33, соответственно, или

(b) SEQ ID NO: 28, 29, 30, 74, 75 и 76, соответственно.

E46. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR), выбранных из:

CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15,

CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и

CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

E47. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E45 или E46, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

E48. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вариантов осуществления E45-E47, содержащее:

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

E49. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

E50. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFNIKDYYMN (SEQ ID NO: 14);

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WIDPDX₁GN (SEQ ID NO: 135), где X₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N,N или Q;

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RLLMDY (SEQ ID NO: 16);

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность stkslX₂hfngntyl (SEQ ID NO: 136), где X₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L,L или S;

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность yymsX₃ (SEQ ID NO: 137), где X₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N,N или S; и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность qsleypft (SEQ ID NO: 19);

например, где CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 не содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 и 33, соответственно или SEQ ID NO: 28, 29, 30, 74, 75 и 76, соответственно.

E51. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E50, где X₁ является Q, X₂ является S и X₃ является S.

E52. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFNIX₁DYYMN (SEQ ID NO: 175), где X₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от K, консервативной замены K, K или A;

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WIDPDX₂GX₃ (SEQ ID NO: 176), где X₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или Q; и X₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или Q;

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RLLMDY (SEQ ID NO: 16);

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность stksX₄X₅hfngnX₆yl (SEQ ID NO: 177), где X₄ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены, L или I; X₅ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или S; и X₆ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от T, консервативной замены T, T или S;

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность yX₇X₈sX₉ (SEQ ID NO: 178), где X₇ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от Y, консервативной замены Y, Y или A; X₈ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от M, консервативной замены M, M или A; и X₉ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или S; и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность qsX₁₀X₁₁X₁₂pX₁₃t (SEQ ID NO: 197), где X₁₀ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или Y; X₁₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от E, консервативной замены E, E или S; X₁₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от Y, консервативной замены Y, Y или T; и X₁₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от F, консервативной замены F, F, L или W;

например, где CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 не содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 и 33, соответственно или SEQ ID NO: 28, 29, 30, 74, 75 и 76, соответственно, необязательно где:

X₁ является Q, X₂ является N, X₃ является E, X₄ является P, X₅ является K, X₆ является F и X₇ является Q,

X₈ является L, X₉ является S и X₁₀ является T,

X₁₁ является Y, X₁₂ является M, X₁₃ является S и X₁₄ является A, и/или

X₁₅ является Q, X₁₆ является L, X₁₇ является E, X₁₈ является Y и X₁₉ является F.

E53. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFNIKDYYMN (SEQ ID NO: 14);

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WIDPDX₁GN (SEQ ID NO: 135), где X₁ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или Q;

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RLLMDY (SEQ ID NO: 16);

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность stkslX₂hfngntyl (SEQ ID NO: 136), где X₂ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или S;

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность yyX₃sX₄ (SEQ ID NO: 179), где X₃ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от M, консервативной замены M, M или A; и X₄ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от N, консервативной замены N, N или S; и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность qsX₅eypft (SEQ ID NO: 180), где X₅ может быть любым из: аминокислоты, аминокислоты, отличной от L, консервативной замены L, L или Y;

например, где CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 не содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 и 33, соответственно или SEQ ID NO: 28, 29, 30, 74, 75 и 76, соответственно, необязательно где:

X₁ является Q,

X₂ является S,

X₃ является M и X₄ является S, и/или

X₅ является L.

E54. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из VH области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, где CDR последовательности такие, как определены согласно Чотиа.

E55. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из VL области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, где CDR последовательности такие, как определены согласно Чотиа.

E56. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из VH области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и одну, две или три из CDR-L1 последовательностей из VL области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, где CDR последовательности такие, как определены согласно Чотиа.

E57. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 189, 190 или 191, где CDR последовательности такие, как определены согласно Чотиа.

E58. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 185 или 186, где CDR последовательности такие, как определены согласно Чотиа.

E59. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну, две или три CDR последовательности из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 189, 190 или 191, и одну, две или три из CDR последовательностей из полипептида, кодированного последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 185, 186, где CDR последовательности такие, как определены согласно Чотиа.

E60. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или, предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VH каркасной области VH области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 или 93.

E61. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или, предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VL каркасной области VL области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 7, 47-69 или 92.

E62. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности зародышевого типа IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48.

E63. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности зародышевого типа IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11.

E64. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 замещений относительно VH каркасной области VH области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 или 93.

E65. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 замены относительно VL каркасной области VL области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 7, 47-69 или 92.

E66. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 замещений относительно аминокислотной последовательности зародышевого типа IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48.

E67. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 замещений относительно аминокислотной последовательности зародышевого типа IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11.

E68. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, содержащую IgG1 Fc область мыши, содержащую замещение в одном или нескольких положениях, выбранных из E233, E318, K320 и R322 (например, E233P, E318A, K320A и R322A), например, где IgG1 Fc область мыши содержит одно или несколько E233P, E318A, K320A и R322A замещений, пронумерованных согласно схеме нумерации Eu (см., например, Патент США № 5,624,821).

E69. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, содержащее IgG1 Fc область человека, содержащую замены в одном или нескольких положениях, выбранных из L234, L235 и G237 (например, L234A, L235A и G237A), например, где IgG1 Fc область человека содержит одно или несколько из L234A, L235A и G237A замещений, пронумерованных согласно схеме нумерации Eu.

E70. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело дополнительно содержит VH область, содержащую вариант VH аминокислотной последовательности зародышевого типа IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48, где VH область содержит одно или несколько замещений в положениях T28, F29, A49, R72, N74, A75, и/или L79 (например, одно или несколько замещений, выбранных из T28N, F29I, A49G, R72A, N74T, A75S и L79A), пронумерованных согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно, где VH область содержит замены:

(i) T28N и F29I;

(ii) T28N, F29I и R72A;

(iii) T28N, F29I, R72A, A49G и L79A;

(iv) T28N, F29I, R72A, N74T и A75S; или

(v) T28N, F29I, R72A, A49G, L79A, N74T и A75S,

где (i)-(v) такие, как пронумерованы согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно где:

VH область содержит замены T28N, F29I, R72A, A49G, L79A, N74T и A75S, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127.

E71. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело дополнительно содержит VH область, содержащую одно или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6 или все) из следующих:

(a) Asn в положении 28,

(b) Ile в положении 29,

(c) Gly в положении 49,

(d) Ala в положении 72,

(e) Thr в положении 74,

(f) Ser в положении 75, и

(g) Ala в положении 79, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно где VH область содержит:

(i) Asn в положении 28 и Ile в положении 29;

(ii) Asn в положении 28, Ile в положении 29 и Ala в положении 72;

(iii) Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 72, Gly в положении 49 и Ala в положении 79;

(iv) Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ser в положении 75; или

(v) Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 721, Gly в положении 49, Ala в положении 79, Thr в положении 74 и Ser в положении 75, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно где:

VH область содержит Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 72, Gly в положении 49, Ala в положении 79, Thr в положении 743 и Ser в положении 75, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127.

E72. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело дополнительно содержит VL область, содержащую вариант VL аминокислотной последовательности зародышевого типа IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11, где VH область содержат одно или несколько замещений в положениях Y36 и/или L46 (например, Y36F и/или L46R), пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128, необязательно где VL область содержит замены:

(i) L46R; или

(ii) L46R и Y36F,

где (i)-(v) пронумерованы согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128, необязательно где VL область содержит замещение L46R, пронумерованное согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128.

E73. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело дополнительно содержит VL область, содержащую одно или несколько из следующих:

(a) Tyr в положении 36, и

(b) Leu в положении 46, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:128, необязательно где VL область содержит:

(i) Leu в положении 46; или

(ii) Leu в положении 46 и Tyr в положении 36, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:128, необязательно где:

VL область содержит Leu в положении 46, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:128.

E74. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее одну или несколько CDR из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где одна или несколько CDR содержат по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замещение, делецию или вставку, например, консервативное замещение); где CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 не содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26 и 27, соответственно, SEQ ID NO: 22, 23, 24, 71, 72 и 73, соответственно, SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 и 33, соответственно или SEQ ID NO: 28, 29, 30, 74, 75 и 76, соответственно.

E75. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, дополнительно содержащее VH область, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в таблице 1.

E76. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, дополнительно содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в таблице 1.

E77. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, содержащее VH область, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO:6, 34-46, 88-91 или 93.

E78. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E77, содержащее VH область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

E79. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 7, 47-69 или 92.

E80. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E79, содержащее VL область, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности (например, 100%) к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

E81. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее VH область, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO:6, 34-46, 88-91 или 93.

E82. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E81, содержащее VH область, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности (например, 100%) к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

E83. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E81 или E82, дополнительно содержащее VL область, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности (например, 100%) к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

E84. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E81, содержащее VH область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

E85. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E84, содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

E86. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO:7, 47-69 или 92.

E87. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E86, содержащее VL область, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности (например, 100%) к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

E88. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E86or E87, дополнительно содержащее VH область, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности (например, 100%) к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

E89. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E86, содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:7, 47-69 или 92.

E90. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее VH область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, где один или несколько аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 39 содержит одно или несколько аминокислотных замещений, выбранных из K30A, N55Q, N57Q, D61E, P62A, K63A и F64V, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 39.

E91. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее VH область, содержащую по меньшей мере, одно из следующих:

(a) Ala в положении 30

(b) Gln в положении 55,

(c) Gln в положении 57,

(d) Glu в положении 61,

(e) Ala в положении 62,

(f) Ala в положении 63, и

(g) Val в положении 64, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 39.

E92. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E90, где указанная SEQ ID NO: 39 содержит:

(i) N55Q и D61E; или

(ii) N55Q, D61E и F64V, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 39, необязательно где указанная SEQ ID NO: 39 содержит N55Q и D61E замены, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 39.

E93. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E91, где VH область содержит:

(i) Gln в положении 55 и Glu в положении 61; или

(ii) Gln в положении 55, Glu в положении 61 и Val в положении 64, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 39, необязательно где VH область содержит Gln в положении 55 и Glu в положении 61, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 39.

E94. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E90 или E92, дополнительно содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, где один или несколько аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 47 содержит одно или несколько аминокислотных замещений, выбранных из L30S, Y55A, M56A, N58S, A60Q, M94Q, L97Y, F101L, F101W и Q105G или любой их комбинации, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 47, необязательно, где один или несколько аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 47 содержит одно или несколько аминокислотных замещений, выбранных из L30S, M56A, N58S, M94Q, L97Y и Q105G.

E95. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E91 или E93, дополнительно содержащее VL область, содержащую по меньшей мере одно из следующих:

(a) Ser в положении 30,

(b) Ala в положении 55,

(c) Ala в положении 56,

(d) Ser в положении 58,

(e) Gln в положении 60,

(f) Gln в положении 94,

(g) Tyr в положении 97,

(h) Leu в положении 101,

(i) Trp в положении 101 и

(j) Gly в положении 105, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 47, необязательно где VL область содержит по меньшей мере одно из следующих:

(a) Ser в положении 30,

(b) Ala в положении 56,

(c) Ser в положении 58,

(d) Gln в положении 94,

(e) Tyr в положении 97 и

(f) Gly в положении 105.

E96. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E94, где указанная SEQ ID NO: 47 содержит L30S, M56A, N58S, M94Q, L97Y и/или Q105G замещение, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 47.

E97. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E95, где VL область содержит Ser в положении 30, Ala в положении 56, Ser в положении 58, Gln в положении 94, Tyr в положении 97 и/или Gly в положении 105, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 47.

E98. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E94, где указанная SEQ ID NO: 47 содержит L30S, N58S, M94Q и/или Q105G замещение, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 47, необязательно где указанная SEQ ID NO: 47 содержит все из L30S, N58S, M94Q и Q105G замен.

E99. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E95, где VL область содержит Ser в положении 30, Ser в положении 58, Gln в положении 94 и/или Gly в положении 105, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 47, необязательно где VL область содержит все из: Ser в положении 30, Ser в положении 58, Gln в положении 94 и Gly в положении 105.

E100. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E94, где указанная SEQ ID NO: 39 содержит N55Q и D61E замены, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 39 и указанная SEQ ID NO: 47 содержит L30S, N58S, M94Q и Q105G замены, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 47.

E101. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E95, где VH область содержит Gln в положении 55 и Glu в положении 61, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 39 и VL область содержит Ser в положении 30, Ser в положении 58, Gln в положении 94 и Gly в положении 105, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 47.

E102. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, где один или несколько аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 47 содержит одно или несколько аминокислотных замещений, выбранных из L30S, Y55A, M56A, N58S, A60Q, M94Q, L97Y, F101L, F101W и Q105G или любых из комбинаций (например, все из L30S, M56A, N58S, M94Q, L97Y и Q105G), пронумерованных согласно SEQ ID NO: 47, необязательно где один или несколько аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 47 содержит одно или несколько аминокислотных замещений, выбранных из L30S, M56A, N58S, M94Q, L97Y и Q105G.

103. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E102, где указанная SEQ ID NO: 47 содержит aL30S, N58S, M94Q и/или Q105G замещение, пронумерованные согласно SEQ ID NO: 47.

E104. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E102, дополнительно содержащее VH область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, где последовательность SEQ ID NO: 39 содержит одно или несколько аминокислотных замещений, выбранных из K30A, N55Q, N57Q, D61E, P62A, K63A и F64V или любые из сочетания, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 39.

E105. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E104, где указанная SEQ ID NO: 39 содержит N55Q и D61E замены.

E106. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, содержащее тяжелую цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2 или 3.

E107. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, дополнительно содержащее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5.

E108. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельную область легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.

E109. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

E110. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, с или без C-концевого лизинового остатка.

E111. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, кодированную вставкой плазмиды, хранящейся в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124917, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, кодированную вставкой плазмиды, хранящейся в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124918, или обе.

E112. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% (например, 100%) идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2 или 3, необязательно, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

E113. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% (например, 100%) идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, необязательно, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, необязательно где выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, дополнительно содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

E114. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 5.

E115. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 3, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 5.

E116. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело дополнительно содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или все четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VH каркасной области VH области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 или 93, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одно, но немее двадцати изменений, аминокислотных замещений или делеций, аминокислотной последовательности всей VH каркасной области (включая FR1, FR2, FR3 и FR4).

E117. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело дополнительно содержит VL каркасную область (например, FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VL каркасной области VL области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 7, 47-69 или 92, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, десять, пятнадцать, но меньше чем двадцать изменений, например, аминокислотных замещений или делеций аминокислотной последовательности всей VL каркасной области (включая FR1, FR2, FR3 и FR4).

E118. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело содержит VH каркасную область (например, FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с VH каркасной области в аминокислотной последовательности зародышевого типа IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, десять, пятнадцать, но меньше чем двадцать изменений, например, аминокислотных замещений или делеций аминокислотной последовательности всей VH каркасной области (включая FR1, FR2, FR3 и FR4).

E119. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело содержит VH область, содержащую вариант VH аминокислотной последовательности зародышевого типа IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48, где VH область содержит одно или несколько замещений в положениях T28, F29, A49, R71, N73, A74 и/или L78 (например, одно или несколько замещений, выбранных из T28N, F29I, A49G, R72A, N74T, A75S и L79A), пронумерованных согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно где VH область содержит замены:

(i) T28N и F29I;

(ii) T28N, F29I и R72A;

(iii) T28N, F29I, R72A, A49G и L79A;

(iv) T28N, F29I, R72A, N74T и A75S; или

(v) T28N, F29I, R72A, A49G, L79A, N74T и A75S,

где (i)-(v) пронумерованы согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно где:

VH область содержит замены T28N, F29I, R72A, A49G, L79A, N74T и A75S, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127.

E120. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело содержит VH область, содержащую одно или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6 или все) из следующих:

(a) Asn в положении 28,

(b) Ile в положении 29,

(c) Gly в положении 49,

(d) Ala в положении 72,

(e) Thr в положении 74,

(f) Ser в положении 75, и

(g) Ala в положении 79, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно где VH область содержит:

(i) Asn в положении 28 и Ile в положении 29;

(ii) Asn в положении 28, Ile в положении 29 и Ala в положении 72;

(iii) Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 72, Gly в положении 49 и Ala в положении 79;

(iv) Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ser в положении 75; или

(v) Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 72, Gly в положении 49, Ala в положении 79, Thr в положении 74 и Ser в положении 75, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, необязательно где:

VH область содержит Asn в положении 28, Ile в положении 29, Ala в положении 72, Gly в положении 49, Ala в положении 79, Thr в положении 74 и Ser в положении 75, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127.

E121. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело содержит VL каркасную область (например, FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности зародышевого типа IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, десять, пятнадцать, но меньше чем двадцать изменений, например, аминокислотных замещений или делеций аминокислотной последовательности всей VL каркасной области (включая FR1, FR2, FR3 и FR4).

E122. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело содержит VL область, содержащую вариант VL аминокислотной последовательности зародышевого типа IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11, где VL область содержит одно или несколько замещений в положениях Y36 и/или L46 (например, Y36F и/или L46R), пронумерованных согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128, необязательно где VL область содержит замены:

(i) L46R; или

(ii) L46R и Y36F,

где (i) и (ii) пронумерованы согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128, необязательно где VL область содержит замещение L46R, пронумерованное согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128.

E123. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

где антитело содержит VL область, содержащую одно или оба из следующих:

(a) Tyr в положении 36, и

(b) Leu в положении 46, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128, необязательно где VL область содержит:

(i) Leu в положении 46; или

(ii) Leu в положении 46 и Tyr в положении 36, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128, необязательно где:

VL область содержит Leu в положении 46, пронумерованные согласно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128.

E124. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

дополнительно содержащее IgG1 Fc область мыши, содержащую одно или несколько замещений, выбранных из положений E233, E318, K320 и R322 (например, E233P, E318A, K320A и R322A) пронумерованных согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc мыши, представленной в таблице 1.

E125. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E124, где IgG1 Fc область мыши содержит E233P, E318A, K320A и R322A замены, пронумерованные согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc мыши, представленной в таблице 1.

E126. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и

дополнительно содержащее IgG1 Fc область человека, содержащую одно или несколько замещений, выбранных из положений L234, L235 и G237 (например, L234A, L235A и G237A), пронумерованных согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc человека, представленной в таблице 1.

E127. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E126, где IgG1 Fc область человека содержит L234A, L235A и G237A замены, пронумерованные согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc человека представленной в таблице 1.

E128. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и

где антитело дополнительно содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре или FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VH каркасной области VH области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 или 93.

E129. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и

где антитело дополнительно содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре или FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VL каркасной области VL области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 7, 47-69 или 92.

E130. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином, человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и

где антитело дополнительно содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре или FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с VH каркасной области в аминокислотной последовательности зародышевого типа IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48.

E131. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и

где антитело дополнительно содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре или FR1, FR2, FR3 или FR4) содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности зародышевого типа IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11.

E132. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и

дополнительно содержащее IgG1 Fc область мыши, содержащую одно или несколько замещений выбранных из положений E233, E318, K320 и R322 (например, E233P, E318A, K320A и R322A) пронумерованных согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc мыши представленной в таблице 1.

E133. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E132, где IgG1 Fc область мыши содержит E233P, E318A, K320A и R322A замены, пронумерованные согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc мыши представленной в таблице 1.

E134. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и

дополнительно содержащее IgG1 Fc область человека, содержащую L234A, L235A и G237A замены, пронумерованные согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc человека представленной в таблице 1.

E135. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и

где антитело дополнительно содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VH каркасной области VH области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 или 93.

E136. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрина человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; и

где антитело дополнительно содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4) содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VH каркасной области VH области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 или 93.

E137. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и

где антитело дополнительно содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с VL каркасной области VL области, содержащей аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 7, 47-69 или 92.

E138. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрина человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и

где антитело дополнительно содержит VH каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности зародышевого типа IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48.

E139. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрина человека, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и

где антитело дополнительно содержит VL каркасную область (например, одну, две, три или четыре из FR1, FR2, FR3 или FR4), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности зародышевого типа IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11.

E140. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:

CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28,

CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,

CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и

CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и

дополнительно содержащее IgG1 Fc область человека, содержащую одно или несколько замещений, выбранных из положений L234, L235 и G237 (например, L234A, L235A и G237A), пронумерованных согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc человека представленной в таблице 1.

E141. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E140, где IgG1 Fc область человека содержит L234A, L235A и G237A замены, пронумерованные согласно схеме нумерации Eu, например, относительно IgG1 Fc человека представленной в таблице 1.

E142. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антителом является мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело).

E143. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антителом является мультивалентное антитело (например, двухвалентное антитело).

E144. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антителом является гуманизированное антитело, антитело человека, антитело мыши, химерное антитело или антитело верблюда.

E145. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином, содержащее VH область и VL область, где VH область и VL область содержат аминокислотные последовательности:

(i) SEQ ID NO: 6 и 7, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(ii) SEQ ID NO: 34 и 65, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(iii) SEQ ID NO: 34 и 62, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(iv) SEQ ID NO: 34 и 66, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(v) SEQ ID NO: 34 и 63, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(vi) SEQ ID NO: 34 и 64, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(vii) SEQ ID NO: 37 и 65, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(viii) SEQ ID NO: 37 и 62, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(ix) SEQ ID NO: 37 и 66, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(x) SEQ ID NO: 37 и 63, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xi) SEQ ID NO: 37 и 64, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xii) SEQ ID NO: 36 и 65, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xiii) SEQ ID NO: 36 и 62, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xiv) SEQ ID NO: 36 и 66, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xv) SEQ ID NO: 36 и 63, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xvi) SEQ ID NO: 36 и 64, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xvii) SEQ ID NO: 35 и 65, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xviii) SEQ ID NO: 35 и 62, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xix) SEQ ID NO: 35 и 66, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xx) SEQ ID NO: 35 и 63, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxi) SEQ ID NO: 35 и 64, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxii) SEQ ID NO: 38 и 65, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxiii) SEQ ID NO: 38 и 62, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxiv) SEQ ID NO: 38 и 66, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxv) SEQ ID NO: 38 и 63, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxvi) SEQ ID NO: 38 и 64, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxvii) SEQ ID NO: 20 и 21, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxviii) SEQ ID NO: 88 и 47, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxix) SEQ ID NO: 89 и 47, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxx) SEQ ID NO: 90 и 47, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxi) SEQ ID NO: 90 и 92, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxii) SEQ ID NO: 39 и 47, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxiii) SEQ ID NO: 6 и 67, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxiv) SEQ ID NO: 6 и 68, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxv) SEQ ID NO: 6 и 69, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxvi) SEQ ID NO: 93 и 67, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxvii) SEQ ID NO: 93 и 68, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними;

(xxxviii) SEQ ID NO: 93 и 69, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними; или

(xxxix) SEQ ID NO: 93 и 7, соответственно или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или предпочтительно, 100% идентичность последовательности с ними, оптимально, где:

VH область и VL область содержит аминокислотные последовательности

(i) SEQ ID NO: 6 и 7, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 34 и 65, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 34 и 62, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 34 и 66, соответственно;

(v) SEQ ID NO: 34 и 63, соответственно;

(vi) SEQ ID NO: 34 и 64, соответственно;

(vii) SEQ ID NO: 37 и 65, соответственно;

(viii) SEQ ID NO: 37 и 62, соответственно;

(ix) SEQ ID NO: 37 и 66, соответственно;

(x) SEQ ID NO: 37 и 63, соответственно;

(xi) SEQ ID NO: 37 и 64, соответственно;

(xii) SEQ ID NO: 36 и 65, соответственно;

(xiii) SEQ ID NO: 36 и 62, соответственно;

(xiv) SEQ ID NO: 36 и 66, соответственно;

(xv) SEQ ID NO: 36 и 63, соответственно;

(xvi) SEQ ID NO: 36 и 64, соответственно;

(xvii) SEQ ID NO: 35 и 65, соответственно;

(xviii) SEQ ID NO: 35 и 62, соответственно;

(xix) SEQ ID NO: 35 и 66, соответственно;

(xx) SEQ ID NO: 35 и 63, соответственно;

(xxi) SEQ ID NO: 35 и 64, соответственно;

(xxii) SEQ ID NO: 38 и 65, соответственно;

(xxiii) SEQ ID NO: 38 и 62, соответственно;

(xxiv) SEQ ID NO: 38 и 66, соответственно;

(xxv) SEQ ID NO: 38 и 63, соответственно;

(xxvi) SEQ ID NO: 38 и 64, соответственно;

(xxvii) SEQ ID NO: 20 и 21, соответственно;

(xxviii) SEQ ID NO: 88 и 47, соответственно;

(xxix) SEQ ID NO: 89 и 47, соответственно;

(xxx) SEQ ID NO: 90 и 47, соответственно;

(xxxi) SEQ ID NO: 90 и 92, соответственно;

(xxxii) SEQ ID NO: 39 и 47, соответственно;

(xxxiii) SEQ ID NO: 6 и 67, соответственно;

(xxxiv) SEQ ID NO: 6 и 68, соответственно;

(xxxv) SEQ ID NO: 6 и 69, соответственно;

(xxxvi) SEQ ID NO: 93 и 67, соответственно;

(xxxvii) SEQ ID NO: 93 и 68, соответственно;

(xxxviii) SEQ ID NO: 93 и 69, соответственно; или

(xxxix) SEQ ID NO: 93 и 7, соответственно.

E146. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое содержит или имеет константную область тяжелой цепи (Fc), выбранную из, например, константных областей тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE.

E147. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело принадлежит к изотипу, выбранному из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или любого их варианта.

E148. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG1 или IgG2 (например, IgG1 человека или IgG2 человека).

E149. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое содержит или имеет константную область тяжелой цепи IgG1 человека.

E150. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое содержит или имеет константную область легкой цепи, выбранную из, например, константных областей легкой цепи каппа или лямбда.

E151. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое содержит или имеет каппа (например, каппа человека) константную область легкой цепи.

E152. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое содержит Fc область тяжелой цепи, имеющую измененную шарнирную область для снижения функции эффекторной клетки.

E153. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое имеет пониженную антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или пониженную комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).

E154. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое содержит шарнирную область, имеющую замещение в по меньшей мере одном положении из L234, L235 или G237, например, по сравнению с IgG1 человека, пронумерованных согласно схеме нумерации Eu.

E155. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, содержащее IgG1 Fc область человека, содержащую по меньшей мере одно замещение, выбранное из L234A, L235A и G237A, пронумерованных согласно схеме нумерации Eu.

E156. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое имеет шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAP (SEQ ID NO: 126).

E157. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое изменено для удаления иммуногенного T-клеточного эпитопа.

E158. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из варианта осуществления E157, которое содержит VL, содержащую по меньшей мере одно замещение, выбранное из группы, состоящей из L30S, N58S, M56A, M94Q, L97Y и Q105G, пронумерованных согласно SEQ ID NO: 47.

E159. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(i) аффинность связывания, выраженную как KD, для αvβ8 интегрина человека, меньше чем для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 536 пМ;

(ii) K_D для αvβ8 интегрина человека, которая меньше или равна 100 пМ для очищенного αvβ8 интегрина человека;

(iii) K_D для αvβ8 интегрина мыши, которая меньше чем 100 пМ;

(iv) K_D для αvβ8 интегрина яванского макака, которая меньше 100 пМ;

(v) K_D для αvβ8 интегрина крысы, которая составляет примерно 160 пМ;

(vi) приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с K_D менее чем 100 пМ, например, определенную с применением анализа аффинности Biacore;

(vii) IC₅₀ для ингибирования TGFβ трансактивации, которая меньше чем 183 пМ;

(viii) IC₅₀ для ингибирования TGFβ трансактивации в U251 клетках, которая составляет от примерно 100 пМ до примерно 300 пМ;

(ix) EC₅₀ для U251 клеток от примерно 100 пМ до примерно 400 пМ пМ;

(x) EC₅₀ для C8-S клеток от примерно 110 пМ до примерно 180 пМ;

(xi) по меньшей мере, один спрогнозированный фармакокинетический (ФК) параметр человека, выбранный из:

а. клиренса из центральной камеры (CL) примерно 0,12-0,15 мл/ч/кг;

b. межкамерного клиренса распределения (CLF) примерно 0,15-0,51 мл/ч/кг;

с. объема распределения для центральной камеры (V1) примерно 36-39 мл/кг;

d. объема распределения для периферической камеры (V2) примерно 21-33 мл/кг; и/или

е. конечного периода полувыведения (t_1/2) примерно 12-17 дней; и

(xii) отсутствие определяемого связывания с Fcγ рецепторами человека или C1q.

E160. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(i) связывается специфически с αvβ8 интегрином, но не с другими интегринами;

(ii) снижает взаимодействие между αvβ8 интегрином и ассоциированным с латентностью пептидом (LAP);

(iii) снижает TGF-β передачу сигналов;

(iv) эффективно блокирует αvβ8 интегрин-опосредованную TGFβ активацию с IC₅₀ ≤10 нМ;

(v) имеет сравнимую Kd (в 5-кратных пределах) к ортологу (NHP) примата, отличного от человека;

(vi) селективно связывает αvβ8 человека и не связывает определяемо гомолог αvβ8 (например, αvβ1, αvβ3, αvβ5 и αvβ6);

(vii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли у человека или в животной модели рака, например, плоскоклеточной карциномы, рака груди и/или рака толстой кишки, отдельно или в комбинации с иммуномодуляторным агентом, например, модулятором ингибиторов контрольной точки, например, ингибиторами PD-1, PD-L1, CTLA-4 или агонистом стимулирующей молекулы, например, 4-1BB;

(viii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животной модели рака в комбинации с противораковой терапией, например, радиотерапией;

(ix) показывает по меньшей мере 60% снижение роста опухоли в сингенной модели ксенотрансплантата опухоли, например, при введении в дозе ≤10 мг/кг, отдельно или в комбинации с иммуномодуляторным агентом (например, ингибитором PD-1, PD-L1 или CTLA-4);

(х) повышает противоопухолевый ответ в присутствии одного или нескольких иммуномодуляторов, например, антагониста ингибитора контрольной точки, например, антагониста PD-1, PD-L1 или CTLA-4, или активатора иммунного ответа, например, 4-1BB агониста, при введении субъекту, например, мыши или человеку;

(xi) имеет эффективность, которая не зависит от экспрессии αvβ8 интегрина в модели опухоли;

(xii) может повышать численность CD8+ GzmB+ T клеток в микросреде опухоли, например, в качестве монотерапии;

(xiii) показывает снижение, например по меньшей мере >80% снижение роста опухоли при применении в комбинации с антагонистом ингибитора контрольной точки (например, анти-PD-1 или анти-PD-L1 антителом), например, в сингенной модели плоскоклеточной карциномы, рака груди и/или рака толстой кишки;

(xiv) демонстрирует статистически значимое улучшение общего выживания субъекта по данным анализа Каплана-Мейера;

(xv) демонстрирует высокую степень термостабильности;

(xvi) демонстрирует минимальную агрегацию при высоких концентрациях; и

(xvii) может демонстрировать воспроизводимую экспрессию и чистоту в условиях промышленного производства.

E161. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(i) аффинность связывания, выраженную как K_D, для αvβ8 интегрина человека, которая меньше чем K_D для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 536 пМ;

(ii) K_D для αvβ8 интегрина человека, которая меньше или равна 100 пМ для очищенного αvβ8 интегрина человека;

(iii) K_D для αvβ8 интегрина мыши, которая меньше чем 100 пМ;

(iv) K_D для αvβ8 интегрина яванского макака, которая меньше чем 100 пМ;

(v) K_D для αvβ8 интегрина крысы, которая составляет примерно 160 пМ;

(vi) приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с K_D, которая меньше, чем 100 пМ, определенную с применением анализа аффинности Biacore;

(vii) IC₅₀ для ингибирования TGFβ трансактивации, которая меньше чем 183 пМ;

(viii) IC₅₀ для ингибирования TGFβ трансактивации в U251 клетках от примерно 100 пМ до примерно 300 пМ;

(ix) EC₅₀ для U251 клеток примерно 126 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 34 пМ;

(x) EC₅₀ для U251 клеток примерно 256 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 115 пМ;

(xi) EC₅₀ для U251 клеток от примерно 80 пМ до примерно 400 пМ;

(xii) EC₅₀ для C8-S клеток примерно 115 пМ;

(xiii) EC₅₀ для C8-S клеток примерно 145 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 23,7 пМ;

(xiv) EC₅₀ для C8-S клеток от примерно 110 пМ до примерно 180 пМ;

(xv) по меньшей мере, один спрогнозированный фармакокинетический (ФК) параметр человека, выбранный из:

а. клиренса из центральной камеры (CL) примерно 0,12-0,15 мл/ч/кг;

b. межкамерного клиренса распределения (CLF) примерно 0,15-0,51 мл/ч/кг;

с. объема распределения для центральной камеры (V1) примерно 36-39 мл/кг;

d. объема распределения для периферической камеры (V2) примерно 21-33 1мл/кг; и/или

е. конечного периода полувыведения (t_1/2) примерно 12-17 дней; и

(xvi) отсутствие определяемого связывания с Fcγ рецепторами человека или C1q.

E162. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое связывает αvβ8 интегрин человека с K_D менее или равной 100 пМ для очищенного αvβ8 интегрина человека.

E163. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое связывает αvβ8 интегрин человека с K_D менее чем 536 пМ.

E164. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое ингибирует активацию TGFβ с IC₅₀ менее чем 183 пМ.

E165. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое ингибирует активацию TGFβ с IC50 от 100 пМ до примерно 300 пМ.

E166. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, которое ингибирует активацию TGFβ в U251 клетках с IC50 199 +/- 93,6 пМ.

E167. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

E168. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вариантов осуществления E1-E166.

E169. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая:

(i) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, 183, 189 или 191 и кодирующую тяжелую цепь;

(ii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO:190 и кодирующую вариабельную область тяжелой цепи;

(iii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 192 или 193 и кодирующую константную область тяжелой цепи; или

(iv) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с последовательности нуклеиновой кислоты вставки плазмиды, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124917.

E170. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая:

(i) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 4 или 185 и кодирующую легкую цепь;

(ii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO:186 и кодирующую вариабельную область легкой цепи;

(iii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 194 и кодирующую константную область легкой цепи; или

(iv) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с последовательности нуклеиновой кислоты вставки плазмиды, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124918.

E171. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или 183, и нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 4.

E172. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 189 или 191, и нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 185.

E173. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления E168-E172.

E174. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления E168-E172 или вектор из варианта осуществления E173.

E175. Клетка-хозяин из варианта осуществления E174, где клеткой-хозяином является клетка млекопитающего, например, клетка человека.

E176. Клетка-хозяин из варианта осуществления E175, где клеткой-хозяином является CHO клетка, COS клетка, a HEK-293 клетка, NS0 клетка, PER.C6® клетка или Sp2.0 клетка.

E177. Способ получения выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с αvβ8 интегрином человека, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из вариантов осуществления E174-E176, в условиях, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется указанной клеткой-хозяином.

E178. Способ из варианта осуществления E177, дополнительно включающий выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

E179. Способ снижения TGFβ передачи сигналов у субъекта, нуждающегося в этом, где способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления E167.

E180. Способ снижения активности αvβ8 интегрина у субъекта, нуждающегося в этом, где способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления E167.

E181. Способ лечения заболевания, расстройства или состояния, связанного с или опосредованного ненормальной (например, повышенной) TGFβ передачи сигналов, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления E167.

E182. Способ вызова противоопухолевого ответа у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления E167, необязательно, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации со второй терапией, необязательно, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и вторую терапию вводят одновременно, последовательно или отдельно, необязательно где:

(i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до введения второй терапии, или

(ii) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вводят после введения второй терапии.

E183. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтическая композиция из варианта осуществления E167 для применения для снижения активности αvβ8 интегрина у субъекта.

E184. Способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления E167.

E185. Способ из варианта осуществления E184, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(i) связывается специфически с αvβ8 интегрином (например, αvβ8 интегрином человека, мыши, яванского макака и/или крысы);

(ii) снижает взаимодействие между αvβ8 интегрином и ассоциированным с латентностью пептидом (LAP);

(iii) снижает TGF-β передачу сигналов;

(iv) эффективно блокирует αvβ8 интегрин-опосредованную TGFβ активацию с IC50 ≤10 нМ;

(v) имеет сравнимую Kd (в 5-кратных пределах) к ортологу (NHP) примата, отличного от человека;

(vi) селективно связывает αvβ8 человека и не связывает определяемо гомолог αvβ8 (например, αvβ1, αvβ3, αvβ5 и αvβ6);

(vii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животной модели рака, выбранной из, например, плоскоклеточной карциномы, рака груди и рака толстой кишки, отдельно или в комбинации с иммуномодуляторным агентом, например, модулятором ингибиторов контрольной точки, например, ингибиторами PD-1, PD-L1, CTLA-4 или агонистом стимулирующей молекулы, например, 4-1BB;

(viii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животной модели рака в комбинации с противораковой терапией, например, радиотерапией;

(ix) показывает по меньшей мере 60% снижение роста опухоли в сингенной модели ксенотрансплантата опухоли, например, при введении в дозе ≤10 мг/кг;

(х) повышает противоопухолевый ответ в присутствии одного или нескольких иммуномодуляторов, например, антагониста ингибитора контрольной точки, например, антагониста PD-1 или CTLA-4, или активатора иммунного ответа, например, 4-1BB агониста, при введении субъекту, например, мыши или человеку;

(xi) имеет эффективность, которая не зависит от экспрессии αvβ8 интегрина в модели опухоли;

(xii) повышает численность CD8+ GzmB+ T клеток в микросреде опухоли, например, в качестве монотерапии;

(xiii) показывает снижение, например по меньшей мере 80% снижение роста опухоли при применении в комбинации с антагонистом ингибитора контрольной точки (например, анти-PD-1 или анти-PD-L1 антителом), например, в сингенной модели плоскоклеточной карциномы, рака груди и/или рака толстой кишки;

(xiv) демонстрирует статистически значимое улучшение общего выживания субъекта, например, человека или мыши, по данным анализа Каплана-Мейера;

(xv) имеет высокую степень термостабильности;

(xvi) демонстрирует минимальную агрегацию при высоких концентрациях; и

(xvii) может демонстрировать воспроизводимую экспрессию и чистоту в условиях промышленного производства.

E186. Способ из варианта осуществления E184 или E185, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(i) аффинность связывания, выраженную как KD, для αvβ8 интегрина человека, которая меньше, чем KD для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 536 пМ;

(ii) KD для αvβ8 интегрина человека, которая меньше или равна 100 пМ для очищенного αvβ8 интегрина человека;

(iii) KD для αvβ8 интегрина мыши, которая меньше чем 100 пМ;

(iv) KD для αvβ8 интегрина яванского макака, которая меньше, чем 100 пМ;

(v) KD для αvβ8 интегрина крысы, которая составляет примерно 160 пМ;

(vi) показывает приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с KD, которая меньше, чем 100 пМ, например, определенную с применением анализа аффинности Biacore.

(vii) IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации, которая меньше чем 183 пМ;

(viii) IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации в U251 клетках примерно 199 +/- 93,6 пМ;

(ix) IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации, которая составляет от примерно 100 пМ до примерно 300 пМ.

(x) EC50 для U251 клеток примерно 126 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 34 пМ;

(xi) EC50 для U251 клеток примерно 256 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 115 пМ;

(xii) EC50 для U251 клеток от примерно 80 пМ до примерно 400 пМ;

(xiii) EC50 для C8-S клеток примерно 115 пМ;

(xiv) EC50 для C8-S клеток примерно 145 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 23,7 пМ;

(xv) EC50 для C8-S клеток от примерно 110 пМ до примерно 180 пМ;

(xvi) по меньшей мере, один спрогнозированный фармакокинетический (ФК) параметр человека, выбранный из:

а. клиренса из центральной камеры (CL) примерно 0,12-0,15 мл/ч/кг;

b. межкамерного клиренса распределения (CLF) примерно 0,15-0,51 мл/ч/кг;

с. объема распределения для центральной камеры (V1) примерно 36-39 мл/кг;

d. объема распределения для периферической камеры (V2) примерно 21-33 мл/кг; и/или

е. конечного периода полувыведения (t_1/2) примерно 12-17 дней; и

(xvii) не показывает определяемое связывание с Fcγ рецепторами человека или C1q.

E187. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E186, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, соответствует любому из вариантов осуществления E1-E166, или фармацевтической композиции из варианта осуществления E167.

E188. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E187, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в количестве, достаточном для повышения инфильтрации CD45+ клетки, CD3+ T клетки, CD4+ T клетки, CD8+ T клеток и/или клеточной экспрессии Granzyme B.

E189. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E188, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в количестве достаточном для повышения инфильтрации CD8+ T клеток.

E190. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E189, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в количестве, достаточном для повышения экспрессии Granzyme B на CD8+ T клетках.

E191. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E190, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в количестве, достаточном для повышения аккумуляции воспалительных макрофагов, имеющих повышенный уровень экспрессии Ly6G.

E192. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E191, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в количестве, достаточном для повышения аккумуляции CD45+CD11b+CD11c-Ly6G-Ly6C^highCD206^low воспалительных макрофагов.

E193. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E192, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в количестве, достаточном для повышения ответа на вторую терапию.

E194. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E193, где эффективность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при введении в животной модели опухоли не зависит от экспрессии αvβ8 интегрина моделью опухоли.

E195. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E194, где введение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента происходит в комбинации со второй терапией.

E196. Способ из варианта осуществления E195, где вторая терапия включает противораковую терапию, цитотоксический или цитостатический агент, например, химиотерапевтический агент, лечение гормонами, вакцину и/или иммунотерапию.

E197. Способ из варианта осуществления E195 или E196, где второй терапией является, или она включает хирургию, радиацию, криохирургию и/или термотерапию.

E198. Способ по любому из вариантов осуществления E195-E197, где вторая терапия включает модулятор, например, ингибитор или агонист, молекулы иммунной контрольной точки, необязательно где второй терапией является, или она содержит модулятор молекулы иммунной контрольной точки, выбранный из группы, состоящей из PD1, PD-L1, 4-1BB, OX40, CTLA-4, PD-L2, TIM-3, LAG-3, VISTA, CD160, BTLA, TIGIT, 2B4, TGFβ, LAIR1 и их комбинации.

E199. Способ из варианта осуществления E198, где ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор PD1, PD-L1, CTLA-4, PD-L2, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, 2B4, TGFβ или LAIR1.

E200. Способ из варианта осуществления E199, где ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор PD1, например, антитело против PD1.

E201. Способ из варианта осуществления E199, где ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор CTLA-4, например, антитело против CTLA-4 или растворимый слитый CTLA-4.

E202. Способ из варианта осуществления E195-E201, где вторая терапия содержит агонист костимулирующей молекулы.

E203. Способ из варианта осуществления E202, где агонист костимулирующей молекулы выбирают из по меньшей мере одного из 4-1BB (CD137), OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160 или B7-H3.

E204. Способ из варианта осуществления E202, где агонистом костимулирующей молекулы является агонист 41-BB.

E205. Способ из варианта осуществления E195-E204, где вторая терапия содержит ингибитор PARP1 (например, олапариб, рукаапариб, нирапариб, велипариб, инициариб, талазопариб, 3-аминобензамид CEP 9722, E7016, BSI-201, KU-0059436, AG014699, MK-4827 или BGB-290).

E206. Способ из варианта осуществления E184-E205, где рак выбран из группы, состоящей из солидной опухоли, гематологического рака (например, лейкоза, лимфомы, миеломы, например, множественной миеломы) и метастатических очагов.

E207. Способ варианта осуществления E206, где раком является солидная опухоль.

E208. Способ из варианта осуществления E206 или E207, где раком является солидная опухоль и он выбран из злокачественного новообразования, например, сарком и карцином, например, аденокарцином различных систем органов, например, легких (например, немелкоклеточного рака легких (NSCLC)), груди, яичников, лимфоидных, желудочно-кишечного тракта (например, толстой кишки), прямой кишки, гениталий и мочеполовых путей (например, почек, уротелиальных, клеток мочевого пузыря, простаты), глотки, ЦНС (например, мозга, нервных или глиальных клеток), головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы (HNSCC), головы и шеи, кожи (например, меланомы, например, запущенной меланомы), поджелудочной железы, толстой кишки, ректальной, почек (например, почечно-клеточной карциномы), печени, рака тонкой кишки и рака пищевод, рака желудка и пищевода, рака щитовидной железы и рака шейки матки.

E209. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E208, где раком является лимфопролиферативное заболевание (например, лимфопролиферативное заболевание после трансплантации) или гематологический рак, T-клеточная лимфома, B-клеточная лимфома, неходжкинская лимфома или лейкоз (например, миелоидный лейкоз или лимфоидный лейкоз).

E210. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E209, где рак находится на ранней, промежуточной или поздней стадии или является метастатическим раком.

E211. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E210, где рак выбран из группы, состоящей из почечно-клеточной карциномы, рака яичников и плоскоклеточной карциномы головы и шеи.

E212. Способ из варианта осуществления E211, дополнительно включающий введение ингибитора контрольной точки, например, ингибитора PD-1, PD-L1 или CTLA-4.

E213. Способ из варианта осуществления E212, где ингибитором PD-L1 не является авелумаб.

E214. Способ из варианта осуществления E211 или E212, где раком является рак почек, например, почечно-клеточная карцинома (RCC).

E215. Способ из варианта осуществления E214, где раком является рак почек, выбранный из группы, состоящей из метастатической RCC, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (ccRCC), не светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (ncRCC) и почечно-клеточной карциномы с высокой степенью риска.

E216. Способ из варианта осуществления E215, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят как терапию 1 линии или 2 линии.

E217. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E216, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят как терапию 1 линии.

E218. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E216, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят как терапию 2 линии.

E219. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E212, где раком является рак яичников.

E220. Способ из варианта осуществления E219, где второй терапией является ингибитор PARP1 (например, олапариб, рукапариб, нирапариб, велипариб, инипариб, талазопариб, 3-аминобензамид, CEP 9722, E7016, BSI-201, KU-0059436, AG014699, MK-4827 или BGB-290).

E221. Способ из варианта осуществления E219, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят как терапию 2 линии, необязательно, где субъект имеет резистентность к платине.

E222. Способ из варианта осуществления E219, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят как терапию 1 линии.

E223. Способ по любому из вариантов осуществления E184-E222, где раком является плоскоклеточная карцинома головы и шеи.

E224. Способ из варианта осуществления E223, где способ дополнительно содержит введение радиационной терапии.

E225. Способ из варианта осуществления E223 или E224, где раком является резистентный к платине и/или рецидивирующий рак.

E226. Способ по любому из вариантов осуществления E179-E225, где указанным субъектом является человек.

E227. Способ по любому из вариантов осуществления E179-E226, включающий введение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции внутривенно.

E228. Способ по любому из вариантов осуществления E179-E227, включающий введение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции подкожно.

E229. Способ по любому из вариантов осуществления E179-E228, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическую композицию вводят примерно два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз каждые пять недель, один раз каждые шесть недель, один раз каждые семь недель, один раз каждые восемь недель, один раз каждые девять недель, один раз каждые десять недель, два раза в месяц, один раз в месяц, один раз каждые два месяца, один раз каждые три месяца, один раз каждые четыре месяца, один раз каждые пять месяцев, один раз каждые шесть месяцев, один раз каждые семь месяцев, один раз каждые восемь месяцев, один раз каждые девять месяцев, один раз каждые десять месяцев, один раз каждые одиннадцать месяцев или один раз каждые двенадцать месяцев.

E230. Способ по любому из вариантов осуществления E179-E229, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят каждые две недели, например, вплоть до 12 раз (например, вплоть до 10, 8, 6, 5, 4 или 3 раз).

E231. Способ из варианта осуществления E230, где каждое введение содержит 5-10 мг/кг (например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

E232. Способ из варианта осуществления E231, где каждое введение содержит примерно 7 мг/кг.

E233. Способ по любому из вариантов осуществления E179-E229, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят каждые четыре недели, например, вплоть до 6 раз (например, вплоть до 6, 5, 4, 3, 2 или 1 раза).

E234. Способ из варианта осуществления E233, где каждое введение содержит 10-15 мг/кг (например, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 мг/кг) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

E235. Способ из варианта осуществления E234, где каждое введение содержит примерно 12 мг/кг.

E236. Способ определения αvβ8 интегрина (например, αvβ8 интегрина человека) в образце, ткани или клетке с применением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтической композиции из варианта осуществления E167, включающий контакт образца, ткани или клетки с антителом и определения антитела.

E237. Набор, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтическую композицию из варианта осуществления E167.

E238. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления E1-E166 или фармацевтическая композиция из варианта осуществления E167, для применения в качестве лекарственного средства, например, в любом из вариантов осуществления способа, описанных в настоящем документе.

E239. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, где антителом или фрагментом является по меньшей мере одно антитело или фрагмент, выбранное из группы, состоящей из:

(a) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего определяющую комплементарность область легкой цепи 1 (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12; CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; CDR1 тяжелой цепи (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9; и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10;

(b) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18; CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19; CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15; и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16;

(c) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, кодированную вставкой плазмиды, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124918, и вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, кодированную вставкой плазмиды, депонированной в ATCC имеющей номер доступа PTA-124917;

(d) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 и VH область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;

(e) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:62-66, и VH область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:34-38;

(f) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:47 и 92, и VH область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:39 и 88-91;

(g) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:7 и 67-69, и VH область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:6 и 93;

(h) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 47-69 и 92, и VH область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, 34-46, 88-91 и 93;

(i) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего область легкой цепи (LC), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и область тяжелой цепи (HC), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;

(j) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего LC область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и HC область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;

(k) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего LC область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:123, и HC область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:124 или 182;

(l) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL область, кодированную последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO:186, и VH область, кодированную последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO:190; и

(m) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего LC область, кодированную последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO:185, и HC область, кодированную последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO:189 или 191.

E240. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из варианта осуществления E239, содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и VH область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

E241. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из вариантов осуществления E239 или E240, содержащее VL область, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO:7, и VH область, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO:6.

E242. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из варианта осуществления E239, содержащее LC область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и HC область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или 3.

E243. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из вариантов осуществления E239 или E242, содержащее LC область, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO:5, и HC область, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO:2 или 3.

E244. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, где антитело или фрагмент содержит VH область, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, 34-46, 88-91 и 93, и/или VL область, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 47-69 и 92.

E245. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, где антитело или фрагмент содержит:

(i) HC антитела, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2 или 3; и/или

(ii) LC антитела, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5.

E246. Выделенное антитело, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, содержащее LC, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и HC, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или 3.

E247. Выделенное антитело, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, содержащее:

VL область антитела, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из VL области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; и

VH область антитела, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 из VH области, содержащей аминокислотную последовательность SED ID NO:6.

E248. Выделенное антитело из варианта осуществления E247, содержащее константную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 181 или 184, и константную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.

E249. Выделенное антитело, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, содержащее:

a) VL область антитела, содержащую первую, вторую и третью CDR из VL области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7;

VH область антитела, содержащую первую, вторую и третью CDR из VH области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;

константную область легкой цепи (CL) антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:83; и

константную область тяжелой цепи (CH) антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:181 или 184;

b) VL область антитела, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO: 7; и VH область антитела, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO:6; или

c) LC область антитела, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO: 5, и HC антитела, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO: 2 или 3.

E250. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, содержащее VH антитела, содержащую аминокислотную последовательность, кодирован вставкой, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124917, и VL антитела, содержащую аминокислотную последовательность, кодированную вставкой, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124918.

E251. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, где антитело или фрагмент имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

а. аффинность связывания, выраженную как KD, для αvβ8 интегрина человека, которая меньше KD для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем примерно 536 пМ;

b. KD для αvβ8 интегрина человека, которая меньше или равна примерно 100 пМ;

с. KD для αvβ8 интегрина мыши, которая меньше чем KD для антитела ADWA11 мыши, например, менее чем примерно 489 пМ;

d. KD для αvβ8 интегрина мыши, которая меньше чем примерно 100 пМ;

е. KD для αvβ8 интегрина яванского макака, которая меньше чем KD для антитела ADWA11 мыши, например, меньше чем примерно 507 пМ;

f. KD для αvβ8 интегрина яванского макака, которая меньше или равна примерно 100 пМ;

g. KD для αvβ8 интегрина крысы, которая составляет примерно 160 пМ;

h. приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с KD, которая меньше чем примерно 100 пМ, определенную с применением анализа аффинности Biacore;

i. IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации, которая составляет от примерно 100 пМ до примерно 300 пМ;

j. EC30 для U251 клеток от примерно 100 пМ до примерно 400 пМ;

k. EC50 для C8-S клеток от примерно 110 пМ до примерно 180 пМ; и

l. по меньшей мере, один спрогнозированный фармакокинетический (ФК) параметр человека, выбранный из:

i. клиренса из центральной камеры (CL) примерно 0,12 мл/ч/кг;

ii. межкамерного клиренса распределения (CLF) примерно 0,51 мл/ч/кг;

iii. объема распределения для центральной камеры (V1) примерно 36 мл/кг;

iv. объема распределения для периферической камеры (V2) примерно 33 мл/кг;

v. конечного периода полувыведения (t_1/2) примерно 15-17 дней; и

vi. отсутствие определяемого связывания с Fcγ рецепторами человека или C1q.

E252. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вышепредставленных вариантов осуществления, содержащее IgG1 Fc область человека, содержащую одно или несколько замещений, выбранных из положений L234, L235 и G237 (например, одного или нескольких из L234A, L235A и G237A), пронумерованных согласно Eu нумерации согласно Kabat.

E253. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где антителом является гуманизированное антитело, антитело человека, антитело мыши, химерное антитело или антитело верблюда.

E254. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где изотип тяжелой цепи антитела выбирают из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или любого его варианта; и/или где константную область легкой цепи выбирают из каппа или лямбда.

E255. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления, где изотипом тяжелой цепи антитела является IgG1 и/или где константной областью легкой цепи является каппа легкая цепь.

E256. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с αvβ8 интегрином с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом из варианта осуществления E242.

E257. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из любого из вышеперечисленных вариантов осуществления и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

E258. Фармацевтическая композиция из варианта осуществления E257, содержащая i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, кодированную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и легкую цепь антитела, кодированную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, ii) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь антитела, кодированную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и легкую цепь антитела, кодированную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5 или iii) оба.

E259. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления E239-E256.

E260. Выделенная нуклеиновая кислота из варианта осуществления E259, где выделенная нуклеиновая кислота кодирует VH область, VL область или обе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и где указанная нуклеиновая кислота содержит: последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:190, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:186 или обе.

E261. Выделенная нуклеиновая кислота из варианта осуществления E259, где выделенная нуклеиновая кислота кодирует константную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи или обе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и где нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 192 или 193; последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 194; или обе.

E262. Выделенная нуклеиновая кислота из варианта осуществления E259, где выделенная нуклеиновая кислота кодирует HC, LC или обе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и где указанная нуклеиновая кислота содержит: последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:189 или 190; последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO185; или обе.

E263. Выделенная нуклеиновая кислота из варианта осуществления E259, где выделенная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представляющую интерес, плазмиды, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124917, последовательность нуклеиновой кислоты, представляющую интерес, плазмиды, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-124918, или обе.

E264. Выделенная нуклеиновая кислота из варианта осуществления E259, где выделенная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 189 или SEQ ID NO: 191; последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 185; или обе.

E265. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления E259-E264.

E266. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления E259-E264 или вектор из варианта осуществления E265.

E267. Клетка-хозяин из варианта осуществления E265, где клеткой-хозяином является клетка млекопитающего, выбранная из группы, состоящей из CHO клетки, COS клетки, HEK-293 клетки, NS0 клетки, PER.C6® клетки и Sp2.0 клетки.

E268. Способ получения выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина из варианта осуществления 266 в условиях, где антитело или фрагмент экспрессируется клеткой-хозяином, и выделение антитела или фрагмента.

E269. Способ снижения активности αvβ8 интегрина у субъекта, нуждающегося в этом, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E239-E256, или фармацевтической композиции из вариантов осуществления E257 или E258.

E270. Способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E239-E256, или фармацевтической композиции из варианта осуществления E257 или E258.

E271. Способ из варианта осуществления E270, дополнительно включающий применение цитотоксического агента, цитостатического агента, химиотерапевтического агента, гормонального лечения, вакцины, иммунотерапии, хирургии, радиации, криохирургии, термотерапии или их комбинации.

E272. Способ из варианта осуществления E271, где дополнительное введение проводят одновременно, последовательно или отдельно от введения терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической комбинации.

E273. Способ из варианта осуществления E271, где иммунотерапия включает модулятор молекулы иммунной контрольной точки, выбранный из группы, состоящей из анти-PD1 антитела, анти-PD-L1 антитела, анти-PD-L2 антитела, анти-CTLA-4 антитела, растворимого CTLA-4 слитого белка или из комбинации, и где анти-PD-L1 антитело не является авелумабом.

E274. Способ по любому из вариантов осуществления E270-E273, где рак выбран из группы, состоящей из плоскоклеточной карциномы головы и шеи, почечно-клеточной карциномы светлоклеточного или папиллярного типа, рака яичников, рака маточной трубы, первичного рака брюшины, рака желудка, рака гастроэзофагеального перехода, рака пищевода, плоскоклеточного рака легкого, протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, холангиокарциномы, рака матки, меланомы, уротелиальной карциномы и их комбинации.

E275. Способ определения αvβ8 интегрина в образце, ткани или клетке с применением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из вариантов осуществления E239-E256, включающий контакт образца, ткани или клетки с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и определение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

E276. Набор, содержащий антитело или фрагмент по любому из вариантов осуществления E239-E256 или фармацевтическую композицию из вариантов осуществления E257 или E258 и необязательно содержащий модулятор из варианта осуществления E273.

E277. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления E239-E256 или фармацевтическая композиция из вариантов осуществления E257 или E258 для применения в снижении активности αvβ8 интегрина у субъекта, нуждающегося в этом, для лечения рака.

E278. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вариантов осуществления E239-E256, или фармацевтическая композиция из вариантов осуществления E257 или E258 для применения при лечении рака, необязательно, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическая композиция предназначена для введения одновременно, последовательно или отдельно в комбинации с иммунотерапией, где комбинация необязательно оказывает синергетический терапевтический эффект.

E279. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическая композиция для применения по варианту E278, где рак выбран из группы, состоящей из плоскоклеточной карциномы головы и шеи, почечно-клеточной карциномы светлоклеточного или папиллярного типа, рака яичников, рака маточной трубы, первичного рака брюшины, рака желудка, рака эзофагеального перехода, рака пищевода, плоскоклеточного рака легких, протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, холангиокарциномы, рака матки, меланомы, уротелиальной карциномы и их комбинации, необязательно, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическая композиция или комбинация предназначены для использования вместе с введением иммунотерапии или радиационной терапии.

E280. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E239-E256 или фармацевтической композиции из вариантов осуществления E257 или E258 для лечения рака.

E281. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E239-E256 в производстве лекарственного средства для лечения рака.

E282. Способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества (i) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает αvβ8 интегрин, и (ii) модулятора анти-PD1, анти-PD-L1 или анти-PD-L2 молекулы иммунной контрольной точки.

E283. Способ из варианта осуществления E282, где раком является плоскоклеточная карцинома.

E284. Способ из варианта осуществления E282, где раком является рак груди или рак толстой кишки.

E285. Способ по любому из вариантов осуществления E282-E284, где модулятор выбран из группы, состоящей из анти-PD1 антитела, анти-PD-L1 антитела и анти-PD-L2 антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеизложенное краткое изложение, а также следующее подробное описание изобретения будет лучше понято при прочтении вместе с прилагаемыми чертежами. В целях иллюстрации изобретения на следующих чертежах показаны варианты осуществления, однако следует понимать, что изобретение не ограничивается показанными точными схемами и инструментами.

На ФИГ. 1A показано выравнивание последовательности, сравнивающий вариабельные области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей антитела ADWA11 гибридомы мыши (называемого «mADWA11», «ADWA11» или «ADWA11 гибридомы мыши»; SEQ ID NO:20), гуманизированного ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) антитела («huADWA11-2.4», «ADWA11 2.4» или «гуманизированное ADWA11-2.4»; SEQ ID NO:6) и IGHV3-07 зародышевого типа («IMGT» или «DP-54»; SEQ ID NO:195) последовательностей. Подчеркнутые аминокислотные остатки являются CDR последовательностями согласно Kabat.

На ФИГ. 1B показано выравнивание последовательности для сравнения вариабельных областей легкой цепи аминокислотных последовательностей антитела ADWA11 гибридомы мыши (называемого «mADWA11», «ADWA11» или «ADWA11 гибридомы мыши»; SEQ ID NO:21), гуманизированного ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) антитела («huADWA11-2.4», «ADWA11 2.4» или «гуманизированного ADWA11 2.4»; SEQ ID NO:7) и IGKV1-39 зародышевого типа («IMGT» или «DPK-9»; SEQ ID NO:196) последовательностей. Подчеркнутые аминокислотные остатки являются CDR последовательностями согласно Kabat.

На ФИГ. 2 показан репрезентативный график сравнения специфичности связывания антител ADWA2 и ADWA11 гибридомы мыши с человеческими интегринами αvβ3 («AVB3») и αvβ6 («AVB6») по данным ELISA. ADWA2 и ADWA11 не связывают интегрины αvβ3 («AVB3») и αvβ6 («AVB6»), в то время как контрольное αV связывающее антитело («AlphaV mAb») связывает оба αvβ3 и αvβ6.

На ФИГ. 3A показан репрезентативный график, демонстрирующий, что ADWA11 гибридомы мыши антитело связывается с αvβ8 человека по данным ELISA.

На ФИГ.3B показан репрезентативный график, демонстрирующий, что гуманизированное антитело ADWA11 VH05/VK01(2.4) связывается с αvβ8 человека по данным ELISA.

На ФИГ. 4A показан репрезентативный график, демонстрирующий аффинность связывания, по данным ELISA, ADWA11 VH05/VK01 Fab, имеющих K30A, N55Q, N57Q, D61E, P62A или K63A аминокислотные замены в вариабельной области тяжелой цепи, с αvβ8 человека, по сравнению с аффинностью связывания исходного гуманизированного ADWA11_VH05/VK01 (ADWA VH_1,5 и ADWA VL_1,1) антитела с αvβ8 человека. Fab, имеющие K30A, N55Q, N57Q, D61E, P62A или K63A аминокислотное замещение в вариабельной области тяжелой цепи, сохраняют аффинность связывания с αvβ8 человека.

На ФИГ. 4B показан репрезентативный график, демонстрирующий аффинность связывания, по данным ELISA, ADWA11 VH05-2/VK01 Fab, имеющих аминокислотное замещение либо в вариабельной области тяжелой цепи (например, F64V), либо в вариабельной области легкой цепи (например, L30S, Y55A, A60Q, M94Q, L97Y, F101L, F101W или Q105G), с αvβ8 человека, по сравнению с аффинностью связывания исходного ADWA11 VH05-2/VK01 антитела с αvβ8 человека. Fab, имеющие Y55A, A60Q, F101L или F101W аминокислотное замещение в вариабельной области легкой цепи, демонстрируют пониженную аффинность связывания с αvβ8 человека, по сравнению с гуманизированным ADWA11 VH05-2/VK01 антителом. Другие тестированные Fab сохранял аффинность связывания для αvβ8 человека.

На ФИГ. 4C показаны репрезентативные графики, демонстрирующие аффинность связывания, по данным ELISA, ADWA11 VH05-2/VK01 Fab, называемых VH05-2/VK01(2,1) (ADWA11 2,1), VH05-2/VK01(2.2) (ADWA 2.2), VH05-2/VK01(2.3) (ADWA 2.3), VH05-2/VK01(2.4) (ADWA 2.4), VH05-2(F64V)/VK01(2,1), VH05-2(F64V)/VK01(2.3) и VH05-2(F64V)/VK01(2.4), имеющих комбинацию аминокислотных замещений, показанную в таблице 5, с αvβ8 человека и по сравнению с исходным антителом (VH05-2_VK01 исходное). Каждое из тестированных Fab сохраняло аффинность связывания для αvβ8 человека.

На ФИГ. 5 показан репрезентативный график сравнения специфичности связывания ADWA11 гибридомы мыши («MsADWA11» или «mADWA11») и гуманизированного ADWA11 VH05-1/VK01 («ADWA11 5-1_1») и ADWA11 VH05-2/VK01 («ADWA11 5-2_1») для интегринов человека αvβ3 (avb3) и αvβ6 (avb6), по данным Biacore. ADWA11 антитела не связывают интегрины αvβ3 (avb3) и αvβ6 (avb6), в то время как контрольное αV связывающее антитело («анти-av») связывает оба αvβ3 и αvβ6.

На ФИГ. 6A показаны репрезентативные следы связывания Biacore для ADWA11 гибридомы («Ms ADWA11») Fab с αvβ8 человека.

На ФИГ. 6B показаны репрезентативные следы связывания Biacore для гуманизированного ADWA11_5-2 2.4 Fab, также называемого ADWA11VH05-2/VK01(2.4) или «ADWA11 2.4» Fab с αvβ8 человека.

На ФИГ. 6C показана репрезентативная таблица, демонстрирующая, что гуманизированное Fab ADWA11, названное в настоящем документе как ADWA115-2 2.4 (также известное как ADWA11 2.4 и ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)), сохраняет аффинность для αvβ8 человека и межвидовую реакционную способность по данным Biacore, по сравнению с исходным антителом мыши Fab («MsADWA11»). ADWA11 5-2 2.4 демонстрирует эквивалентную аффинность для αvβ8 человека, яванского макака, мыши и крысы с KD <200 пМ. Исходное антитело мыши демонстрирует эквивалентную аффинность для αvβ8 человека, яванского макака и мыши с KD 489-536 пМ.

На ФИГ. 7A показан репрезентативный график сравнения данных связывания U251 клетки для ADWA11 VH05-2/VK01 (исходных) Fab («ADWA11»), имеющих одно аминокислотное замещение либо в вариабельной области тяжелой цепи (например, F64V), либо в вариабельной области легкой цепи (например, L30S, M94Q, L97Y, F101L или Q105G). Fab, имеющие F101L аминокислотное замещение в вариабельной области легкой цепи, демонстрируют пониженное связывание с U251 клетками (αvβ8 человека) по сравнению с исходным антителом. Другие тестированные Fab сохраняли связывание с U251 клетками (αvβ8 человека).

На ФИГ. 7B показан репрезентативный график сравнения данных связывания U251 клетки для ADWA11 VH05-2/VK01 (исходных) Fab («ADWA11»), имеющих одно аминокислотное замещение в вариабельной области легкой цепи (например, M56A или N58S). M56A и N58S Fab сохраняли связывание с U251 клетками (αvβ8 человека).

На ФИГ. 7C показан репрезентативный график, демонстрирующий данные связывания U251 клетки для ADWA11 VH05-2/VK01 Fab («ADWA11»), имеющих комбинацию аминокислотных замещений, называемых 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.1 (F64V), 2.3 (F64V) и 2.4 (F64V) согласно таблице 5, по сравнению с исходным антителом. Каждое из тестированных Fab сохраняло связывание с фиксированными U251 клетками.

На ФИГ. 8 показан репрезентативный график сравнения аффинности связывания антител ADWA11 mIgG_4mut и ADWA11 VH05/VK01 с U251 клетками.

На ФИГ. 9A показаны репрезентативные графики, демонстрирующие связывание ADWA11 VH05-2/VK01, имеющего комбинацию аминокислотных замещений, называемую ADWA11_VH05-2/VK01(2.1) и ADWA11_VH05-2/VK01(2.4) с U251 (глиобластомы человека) или C8-S (астроциты мыши) клетками. ADWA11 VH05-2/VK01(2.1) и ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) антитела сохраняли связывание с U251 клетками (avb8 человека) и C8-S (avb8 мыши).

На ФИГ. 9B показаны репрезентативные графики, изображающие связывание интегрин-специфических антител, таких как ADWA11 VH05-2/VK01(2.4), с HEK клетками, экспрессирующими αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8. Результаты показывают насыщаемое связывание ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) с HEK клетками, экспрессирующими αvβ8, и отсутствие связывания с клетками, экспрессирующими αvβ3, αvβ5, αvβ6. Эти результаты демонстрируют специфическое связывание ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) с αvβ8 человека.

На ФИГ. 10A показан репрезентативный график сравнения действия ADWA11 гибридомы мыши («mFab») и гуманизированного ADWA11 Fab: ADWA11 VH01/VK01, ADWA11 VH02/VK01, ADWA11 VH02/VK02, ADWA11 VH05/VK02 и ADWA11 VH05/VK01 на TGFβ транс-активацию U251 клетками. VH01/VK01, VH02/VK01 и VH02/VK02 Fab демонстрируют пониженную активность, в то время как VH05/VK01 сохраняет активность и VH05/VK02 демонстрирует улучшенную активность блокирования активации TGFβ в анализе трансактивации U251 по сравнению с ADWA11 Fab гибридомы мыши («mFab»).

На ФИГ. 10B показан репрезентативный график сравнения действия указанных ADWA11 VH05-2/VK01 Fab, имеющих аминокислотное замещение либо в вариабельной области тяжелой цепи (например, F64V), либо в вариабельной области легкой цепи (например, L30S, M94Q, L97Y, F101L, F101W или Q105G) на TGFβ трансактивацию в U251 клетках. Fab, имеющие F101L или F101W одно аминокислотное замещение в вариабельной области легкой цепи, демонстрируют пониженное действие на TGFβ трансактивацию по сравнению с гуманизированным исходным ADWA11 VH05-2/VK01 Fab. Другие тестированные Fab сохраняют активность в анализе трансактивации TGFβ.

На ФИГ. 10C показан репрезентативный график сравнения действия ADWA11 VH05-2/VK01 Fab, имеющих аминокислотные замены, включая комбинацию аминокислотных замещений, называемых 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.1 (F64V), 2.3 (F64V) и 2.4 (F64V) согласно таблице 5. VH02-2/VK01(2.3) и VH05-2(F64V)/VK01(2.3) Fab демонстрируют пониженное действие на TGFβ трансактивацию по сравнению с исходным ADWA11 VH05-2/VK01 Fab. Другие тестированные Fab сохраняют активность в анализе трансактивации TGFβ.

На ФИГ. 10D показан репрезентативный график сравнения действия ADWA11 VH05-2/VK01 (исходных) Fab, имеющих указанное аминокислотное замещение в вариабельной области тяжелой цепи (например, F64V) или вариабельной области легкой цепи (например, L30S, M94Q, L97Y, Q105G, M56A или N58S). Тестированные Fab сохраняли активность в анализе трансактивации TGFβ по сравнению с исходным ADWA11 VH05-2/VK01 Fab.

На ФИГ. 10E показан репрезентативный график, демонстрирующий действие гуманизированного ADWA11 VH05/VK01, VH05/VK01-D61E (VH05-1/VK01) и VH05/VK01-N55Q-D61E (VH05-2/VK01) IgG на TGFβ трансактивацию U251 клетками. Тестированные антитела сохраняли активность в анализе трансактивации TGFβ.

На ФИГ. 10F показаны репрезентативные графики, демонстрирующие действие ADWA11_VH05-2_VK01(2.4) на TGFβ трансактивацию U251 клетками (левая панель) и C8-S (правая панель) по сравнению с изотипическим контрольным антителом. Дополнительные эксперименты продемонстрировали IC50 для ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) в анализе трансактивации TGFβ с U251 клетками, равную 199 ± 93,6 пМ (средняя ± стандартное отклонение).

На ФИГ. 11 показан репрезентативный график, демонстрирующий долю респондеров (антигенность) для разных ADWA11 VH05-2VK01 CDR пептидов по сравнению с положительными контрольными пептидами, указанными в таблице 1. Оценку антигенности пептида применяют для выбора возможных CDR последовательностей с пониженным риском иммуногенности.

На ФИГ. 12A показаны репрезентативные графики, демонстрирующие эффективность комбинированного лечения анти-αvβ8 (ADWA11), анти-PD1 антитела («PD-1», RMP1-14), mIgG1_4mut изотипа (2B8) и IgG2a изотипа крысы (2A3) в модели EMT6 рака груди. Рост опухоли измеряют с применением цифровых штангенциркулей три раза в неделю и показывают как объем опухоли (длина x ширина x ширина x 0,5). Средний объем опухоли +/- СОС в каждой группе лечения наносят на график, пока в каждой группе не останется менее чем 8/10 мышей. Выживаемость определяют как время до достижения 1000 мм³. Комбинация анти-PD1 и ADWA11 ингибирует рост опухоли и улучшает общую выживаемость в большей степени, чем другие тестированные комбинации.

На ФИГ. 12B показаны репрезентативные графики, демонстрирующие эффективность анти-αvβ8 антитела (ADWA11) в дозе 1, 3, 10 и 20 мг/кг в качестве монотерапии и изотипического контроля (mIgG1_4mut изотип (2B8)) в модели EMT6 рака груди на верхней панели. Также показана комбинация анти-αvβ8 антитела ADWA11 в дозе 1, 3, 10 и 20 мг/кг с анти-PD1 антителом (RMP1-14, 10 мг/кг) и изотипа IgG2a крысы (2A3) в модели EMT6 рака груди. Мышей обрабатывают антителами в день 0, 4 и 8 исследования, и рост опухоли измеряют цифровыми штангенциркулями три раза в неделю и показывают как объем опухоли (длина x ширина x ширина x 0,5).

На ФИГ. 13 показаны репрезентативные графики, демонстрирующие эффективность комбинированного лечения анти-αvβ8 (ADWA11), анти-41BB (MAB9371), анти-CTL4 (9D9), mIgG1_4mut изотипа (2B8) и IgG2a изотипа крысы (2A3) в модели ЕМТ6 рака груди. Рост опухоли измеряют цифровыми штангенциркулями три раза в неделю и показывают как объем опухоли (длина x ширина x ширина x 0,5), средний объем опухоли +/- СОС в каждой группе лечения наносят на график, пока в каждой группе не останется менее чем 8/10 мышей, и выживаемость определяют как время до достижения 1000 мм³. Комбинация анти-4-1BB и ADWA11 или анти-CLTA4 и ADWA11 лечения ингибирует рост опухоли и улучшает общую выживаемость в большей степени, чем другие тестированные комбинации.

На ФИГ. 14A показаны репрезентативные графики, демонстрирующие, что комбинация анти-αvβ8 антитела и радиационной терапии (ADWA11+5Гр группа радиации) ингибирует рост опухоли и улучшает общую выживаемость в большей степени, чем радиационная терапия с изотипическим контролем (mIgG4mut (2B8) + 5Гр группа радиации) в модели опухоли СТ26. Рост опухоли измеряют цифровыми штангенциркулями три раза в неделю и показывают как объем опухоли (длина x ширина x ширина x 0,5), средний объем опухоли +/- СОС в каждой группе лечения наносят на график, пока в каждой группе не останется менее чем 8/10 мышей, и выживаемость определяют как время до достижения 1000 мм³. *p <0,05 к без лечения, **P <0,05 к радиации+2B8.

На ФИГ. 14B верхний график показывает плотность клеток, экспрессирующих CD45, CD8 и Granzyme B в CT26 опухолевой ткани, собранной в день 12 у мышей, леченных в день 0, день 4 и день 8 дозой 10 мг/кг изотипического контроля (Контроль) или ADWA11 антитела (Анти-ITGαVβ8), n=6; p=P-значение. Нижний график показывает экспрессию гена CD45, CD8, GranzymeB и IFNγ в опухолевой ткани, собранной через 12 дней после первой 10 мг/кг дозы изотипического контроля (Изотиа), ADWA11 антитела (Анти-ITGαVβ8), Изотипа в комбинации с 5 Гр направленной на опухоль радиации или ADWA11 антитело в комбинации с 5 Гр направленной на опухоль радиации. Лечение антителом проводят внутривенно в день 1, день 4 и день 8 исследования, и радиационную терапию проводят в день 5 исследования. Пять мышей включают в каждую группу лечения; среднее значение и стандартную ошибку наносят на график.

На ФИГ. 15 показаны репрезентативные графики, демонстрирующие IHC анализ плотности CD45 (общее количество лимфоцитов и миелоидных клеток), CD3 (общее количество T клеток), CD4 T клеток, CD8 T клеток и Granzyme B (активированных CD8 и NK клеток) в модели опухоли EMT6. Лечение ADWA11(2.4) (также называемое ADWA11VH05-2/VK01(2.4) в настоящем документе) повышает плотность всех анализируемых типов клеток. N=10 на группу, p значение для двустороннего t-критерия указано на графике.

На ФИГ. 16A показана диаграмма, демонстрирующая схему лечения для модели опухоли CCK168. Представлены графики времени для имплантации опухолевых клеток и внутрибрюшинной (в.б.) инъекции антитела для четырех групп лечения.

На ФИГ. 16B показаны репрезентативные кривые выживаемости Каплана-Мейера с применением объема опухоли 2000 мм³ в качестве критического значения для выживаемости в модели опухоли CCK168. n=10 в каждой группе. **p <0,01 по лог-ранговому критерию Кокса-Мантеля.

На ФИГ. 16C показаны репрезентативные графики, демонстрирующие индивидуальные кривые роста опухолей, показанных на ФИГ. 16B. Мышей умерщвляют до 45-дневной конечной точки, если опухоли достигают ≥2000 мм³ или если наблюдается обширное изъязвление опухоли. Комбинированное лечение анти-PD1 антителом и ADWA11 синергетически ингибирует рост опухоли и улучшает общую выживаемость в большей степени, чем лечение только анти-PD1 антителом, ADWA11 или изотипическим контролем, или их отдельные эффекты, просто сложенные вместе. Показанные данные являются репрезентативными для 3 независимых биологических повторов.

На ФИГ. 17A показана стратегия гейтирования для идентификации инфильтрующих опухоль моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Живые отдельные клетки сначала гейтируют с воротами сброса, включающими Ly6G, SiglecF, CD90 и B220 для исключения нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и B клеток. Отрицательно окрашенные клетки затем анализируют проточной цитометрией и гейтируют. Макрофаги идентифицируют как CD45+CD11b+CD64^highF4/80^high, и дендритные клетки идентифицируют как CD45+CD11b+F4/80-CD64-MHCII^highCD11c^high. Из популяции макрофагов, профили, соответствующие иммуностимулирующим макрофагам, идентифицируют как Ly6C^highCD206^low, и иммунодепрессивные макрофаги идентифицируют как Ly6C^lowCD206^high. Канал сброса Ly6G+SiglecF+CD90.2+B220+.

На ФИГ. 17B показан репрезентативный график, демонстрирующий окрашивание клеточной поверхности для интегрина αvβ8, анализированное как часть многоцветной панели проточной цитометрии в дисагрегированных опухолях, описанных на ФИГ. 17A. Репрезентативные графики проточной цитометрии показывают флуоресценцию минус одно контрольное окрашивание (FMO) и окрашивание ADWA11 антитела в модели опухоли CCK168. N=4 опухоли.

На ФИГ. 18A показаны репрезентативные графики, демонстрирующие окрашивание ADWA11 на CD45-отрицательных клетках, выделенных из CCK168. Живые отдельные клетки анализируют на присутствие CD45. 4% CD45 отрицательных клеток в модели опухоли CCK168 были положительными к экспрессии αvβ8 с применением ADWA11 антитела.

На ФИГ. 18B показана экспрессия αvβ8 в CCK168, CT26 и EMT6 клеточных линиях. Живые отдельные клетки анализируют на экспрессию αvβ8 проточной цитометрией с применением изотипа и анти-αvβ8 (ALDWA11) окрашивающих антител. CCK168 и EMT6 клеточные линии имели определяемую экспрессию αvβ8, в то время как CT26 клетки не имели.

На ФИГ. 19A показаны репрезентативные графики, демонстрирующие общее внутриопухолевое количество CD8+ T клеток у мышей с CCK168 опухолями, леченными только контрольными антителами, анти-PD1, ADWA11 или комбинацией анти-PD1 и ADWA11. Репрезентативные графики проточной цитометрии для экспрессии CD4 и CD8 всеми CD45+ клетками показаны вместе с соотношением количества CD8+ клеток к CD45+ клеткам для каждой мыши в каждой группе.

На ФИГ. 19B показаны репрезентативные микрографики иммунофлуоресценции срезов опухоли CCK168, собранных у мышей в каждой группе лечения, окрашенных для анти-CD8 и DAPI. Масштабный отрезок 50 мкм.

На ФИГ. 19C показаны репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие внутриклеточное окрашивание для Granzyme B в клетках, гейтированных для экспрессии CD8, вместе с долей CD8+ клеток, экспрессирующих определяемый Granzyme B у каждой мыши в каждой группе.

На ФИГ. 19D показаны репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие иммуностимулирующие макрофаги (Ly6c^high, CD206^low) и иммунодепрессивные макрофаги (CD206^high, Ly6c^low) для клеток, гейтированных как CD45+Ly6G-CD11b+CD64^highF4/80^high. Из популяции макрофагов, иммуностимулирующие макрофаги были идентифицированы как Ly6C^highCD206^low и иммунодепрессивные макрофаги были идентифицированы как Ly6C^lowCD206^high, вместе с долей иммуностимулирующих макрофагов для каждой мыши. Данные на графиках являются средним±СОС, n=10 на группу. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 согласно однофакторному ANOVA.

На ФИГ. 20 показаны репрезентативные графики, демонстрирующие окрашивание ADWA11 на CD4+ и CD8+ T клетках в CCK168 микросреде опухоли. Живые отдельные CD45+ клетки гейтируют на CD4 и CD8 и окрашивают ADWA11. Репрезентативные графики показаны для мышей из каждой из 4 групп лечения.

На ФИГ. 21A показаны репрезентативные графики, демонстрирующие иммунную элиминацию CD8+ T клеток. Микрографики показывают иммуноокрашивание анти-CD8, контрокрашенных DAPI в CCK168 опухолях, выделенных после комбинированной анти-PD-1/ADWA11 терапии с или без предшествующего лечения анти-CD8 элиминирующим антителом или изотипическим контрольным антителом.

На ФИГ. 21B показаны репрезентативные графики, демонстрирующие средние кривые роста опухоли для CCK168 опухолей, предварительно леченных анти-CD8 элиминирующим антителом или изотипическим контрольным антителом за 24 часа до ADWA11/анти-PD-1 комбинированной терапии.

На ФИГ. 21C показаны репрезентативные графики, демонстрирующие выживание мышей, имеющих CCK168 опухоли после ADWA11/анти-PD-1 комбинированной терапии, предварительно леченных одним днем ранее либо анти-CD8 элиминирующим антителом, либо изотипическим контрольным антителом. Данные представлены как доля выживаемости, n=10 в каждой группе. **p <0,01 по лог-ранговому критерию Кокса-Мантеля.

На ФИГ. 22A показаны репрезентативные графики, демонстрирующие CCK168 опухоли, собранные у мышей, леченных либо ADWA-11, либо контрольным антителом, и окрашенные антителами к CD8, F4/80 для определения макрофагов и фосфо-SMAD3 для определения передачи сигналов TGFβ (pS3). Объединенные изображения со слабым увеличением и изображения, показывающие только pSMAD3 показаны слева, и увеличенные объединенные изображения и изображения для каждого отдельного антитела из площадей в рамках показаны справа.

На ФИГ. 22B показаны репрезентативные графики, демонстрирующие количественный анализ плотности окрашивания pSmad3 (pS3) у мышей, леченных контролем и ADWA11. Лечение ADWA11 снижает плотность pSmad3 в опухолях CCK168.

На ФИГ. 23A показаны репрезентативные графики, с данными, извлеченными из The Cancer Genome Atlas (TCGA) для интегрин-β8 мРНК экспрессии в 30 разных типах рака человека. Каждая точка представляет отдельный образец опухоли. Результаты, показанные на этом чертеже, основаны на данных, собранных TCGA Research Network.

На ФИГ. 23B показаны репрезентативные графики, демонстрирующие данные проточной цитометрии дезагрегированных клеток из свежей, де-идентифицированной карциномы яичников и почечно-клеточных карцином, гейтрированных для зрелых моноцитов (CD16+ моноцитов), опухолеассоциированных макрофагов (CD14+ макрофагов), двух популяций дендритных клеток, полученных из моноцитов (BCDA1+ moDCs и BCDA3+ moDCs) или эозинофилов, и окрашенных для экспрессии αvβ8. Ткани из нормальных миндалин также анализируют в качестве контроля. Стратегия гейтирования показана на ФИГ. 23C; n=2 для каждого типа опухоли.

На ФИГ. 23C показаны репрезентативные графики, демонстрирующие стратегию гейтирования для образцов биопсии опухолей человека. Живые отдельные CD45+ клетки гейтируют для SSC-A(hi) для удаления гранулоцитов. SSC-A(lo) гейтируют для HLA-DR+CD3- и окрашивают CD14 и CD16. CD14+CD16+ обозначают как CD16+ моноциты. CD16- клетки далее окрашивают для CD11c. CD14+CD11c+ клетки далее окрашивают с CD1c и CD141. CD1c+CD141- обозначают как CD1c+ MoDC. CD141+CD1c- обозначают как CD141+ MoDC. CD1c-CD141- клетки далее окрашивают с CD64 и популяцию CD64+ обозначают CD14+TAMs.

На ФИГ. 24A показан репрезентативный график, демонстрирующий результаты биоанализов совместного культивирования TMLC клетки, проводимого с концентрациями ADWA11 от 0,01 до 10 мг/мл. Активность TGFβ показана в относительных единицах люциферазы на основе активности репортера люциферазы PAI-1. n=3 на дозу ADWA11, повтор 3 раза.

На ФИГ. 24B показан репрезентативный график, демонстрирующий результаты анализов клеточной адгезии, проведенных на чашка, покрытых ассоциированным с латентностью пептидом (LAP) TGFβ1 в присутствии ADWA-11 в концентрациях от 0,001 до 10 мг/мл. Адгерентные клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым, и адгезию выражают как абсорбцию при 595 нм. n=3 на дозу ADWA11, повтор 3 раза.

На ФИГ. 24C показаны репрезентативные графики, демонстрирующие, что антитела к интегрину αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8 применяют для проточной цитометрии клеток карциномы толстой кишки дикого типа, SW-480, которые не экспрессируют никакие из этих интегринов, или SW-480 клеток, трансфицированных для экспрессии β3 (SW-itgb3), β6 (SW-itgb6) или β8 (SW-itgb8). Репрезентативные графики проточной цитометрии показаны для каждого тестированного антитела и типа клеток.

На ФИГ. 25A показан репрезентативный график, демонстрирующий двухкамерную нелинейную фармакокинетическую модель, адаптированную к 0,1, 0,3 и 3 мг/кг в.в. дозированию ADWA11(2.4) у мышей TG32. Круги: полученные данные. Линии: адаптация модели.

На ФИГ. 25B показан репрезентативный график, демонстрирующий двухкамерную фармакокинетическую модель, адаптированную к 3 мг/кг в.в. дозировнию ADWA11 2.4 у мышей TG32. Круги: полученные данные. Линии: адаптация модели.

На ФИГ. 26 показаны репрезентативные графики, демонстрирующие двухкамерную фармакокинетику ADWA11 2.4 у яванских макаков после однократного ВВ болюсного введения в дозе 4, 40 и 100 мг/кг, соответственно. Круги: полученные данные. Линии: адаптация модели.

На ФИГ. 27A-27B показаны репрезентативные графики, иллюстрирующие спрогнозированную фармакокинетику ADWA11 2.4 человека после 12 мг/кг Q28D и 7 мг/кг Q14D. CP является спрогнозированной концентрацией в плазме; CAVG является Cavg или средней концентрации в плазме; NOAEL грызунов является C_ave без наблюдаемого уровня побочных эффектов у грызунов; и NHP NOAEL является C_ave без наблюдаемого уровня побочных эффектов у приматов, отличных от человека.

На ФИГ. 28 показаны репрезентативные графики, демонстрирующие кривые выживания Каплана-Мейера с применением объема опухоли 2000 мм³ в качестве предельного значения для выживания для модели опухоли CCK168. Группы лечения включают: изотипический контроль, анти-PD1 антитело, ADWA11_4mut и комбинацию анти-PD1 антитела и ADWA11_4mut. Лечение комбинацией анти-PD1 антитела и ADWA11_4mut синергетически улучшает общую выживаемость в большей степени, чем лечение анти-PD1 антителом, ADWA11_4mut или изотипическим контролем по отдельности или ожидаемое аддитивное действие комбинированных лечений.

На ФИГ. 29A показаны графики, изображающие репрезентативные кривые выживания, и на ФИГ. 29B показаны репрезентативные индивидуальные кривые роста опухоли у мышей с имплантированными подкожно CT26 клетками и леченных изотипическими контрольными антителами, анти-PD1, ADWA11_4mut или комбинацией анти-PD1 и ADWA11_4mut, плюс 5 Гр радиации на 5 день. Одна группа мышей, леченных изотипическим контрольным антителом, не получала радиационную терапию. Данные представлены как доля выживаемости, n=10 в каждой группе. ***p <0,001, ****p <0,0001 по лог-ранговому критерию Кокса-Мантеля.

На ФИГ. 29C показаны графики, изображающие репрезентативные опухоли с повторным назначением препарата у CT26-вылеченных мышей, которые выжили в течение 50 дней после начала лечения. Исходные CT26 клетки имплантируют в бок, противоположный исходному месту имплантации опухоли CT-26-вылеченных мышей, через 51 день после начала иммунотерапии в комбинации с радиационной терапией. Контрольные мыши не получают радиацию и ранее не были заражены опухолевыми клетками. Мышей с повторным назначением препарата отслеживают в течение 30 дней. Контроль, n=10; РТ плюс анти-PD1, n=3; РТ плюс ADWA11_mut, n=5; РТ плюс ADWA11_mut и анти-PD1, n=7.

На ФИГ. 30A показаны графики, изображающие репрезентативные кривые выживания, и на ФИГ. 30B показаны графики, изображающие репрезентативные индивидуальные кривые роста у мышей с ортотопической имплантацией EMT6 клеток после лечения изотипическим контрольным антителом, ADWA11_4mut, 4-1BB, анти-CTLA4, анти-PD-1 или комбинацией ADWA-11_4mut и 4-1BB, анти-CTLA4 или анти-PD-1. Данные представлены как доля выживания, n=10 в каждой группе. ****p <0,0001 по лог-ранговому критерию Кокса-Мантеля

На ФИГ. 30C показаны графики, изображающие репрезентативные кривые выживания и на ФИГ. 30D показаны графики, изображающие репрезентативные индивидуальные кривые роста у мышей, леченных анти-CTLA4 или активатором 4-1BB.

На ФИГ. 30E показаны репрезентативные графики, демонстрирующие результаты опухоли с повторным назначением препарата у мышей, которые выжили через 50 дней с полной регрессией опухолей после лечения синергетической комбинацией ADWA-11_4mut и анти-CTLA4 или синергетической комбинацией ADWA-11_4mut и активатора 4-1BB. Контрольные мыши ранее не были заражены опухолевыми клетками. Мышей с повторным назначением препарата оценивают в течение 30 дней. n=5 контроль, n=6 ADWA-11_4mut+анти-CTLA4, n=5 ADWA-11_4mut+4-1BB.

На ФИГ. 31A изображен анализ экспрессии мРНК гена в MC38 опухолевой ткани с применением CD8a и GranzymeB специфических проб taqman. Опухолевую ткань собирают через 12 дней после первого дозирования изотипического контроля или ADWA11 2.4 антитела в указанных дозах. Лечение вводят внутривенно в 1 день, 5 день и 9 день исследования, в каждую группу лечения включают по 5 мышей. * = p-значение <0,05.

На ФИГ. 31B показаны репрезентативные графики, демонстрирующие скорость роста опухоли в модели опухоли MC38 у мышей, леченных изотипом (10 мг/кг), ADWA11 2.4 (10 мг/кг), анти-PD-1 антителом (RMP1-14, 10 мг/кг) и комбинацией ADWA11 2.4 (10 мг/кг) и анти-PD1 антитела (RMP1-14, 10 мг/кг). Дополнительно, репрезентативные графики, показывающие скорость роста опухоли MC38 опухолей у мышей, леченных ADWA11 (анти-ITGAVB8 (ADWA11_mIgG_4mut) антителом в дозе 0,03, 0,3, 3 и 30 мг/кг в комбинации с 10 мг/кг анти-PD-1 антителом (RMP1-14). Для всех графиков, антитела вводят в дни 1,5 и 9 исследования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем документе описаны антитела и их антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с αvβ8 интегрином (например, αvβ8 интегрином человека) и дополнительно, антитела, которые антагонизируют активность αvβ8 интегрина (например, антагонизируют активацию TGFβ, антагонизируют медиацию продуцирования TGFβ, антагонизируют модулирование Tregs и Th17 клеток) или их взаимодействие с TGFβ1 и TGFβ3 или выделение активного TGFβ. Также представлены способы получения анти-αvβ8 интегрин антител, композиций, содержащих анти-αvβ8 интегрин антитела, и способы применения анти-αvβ8 интегрин антител. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантные, например, представлены гуманизированные, антитела, которые связывают αvβ8 интегрин (например, αvβ8 интегрин человека). В некоторых вариантах осуществления, также представлены гуманизированные антитела тяжелых цепей и легких цепей, которые способны образовывать антитела, которые связывают αvβ8 интегрин. В некоторых вариантах осуществления, представлены гуманизированные антитела, тяжелые цепи и легкие цепи, содержащие одну или несколько конкретных определяющих комплементарность областей (CDR). В некоторых вариантах осуществления, гуманизированные анти-αvβ8 интегрин антитела имеют измененные эффекторные функции. В некоторых вариантах осуществления, антитела по изобретению имеют пониженную антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) относительно в другом идентичных анти-αvβ8 интегрин антител по изобретению.

Представлены полинуклеотиды, кодирующие антитела, которые связывают αvβ8 интегрин (например, αvβ8 интегрин человека) или их антигенсвязывающий фрагмент. Также представлены полинуклеотиды, кодирующие тяжелые цепи или легкие цепи антител. Представлены клетки-хозяева, которые экспрессируют анти-αvβ8 интегрин антитела, включая гуманизированные антитела. Представлены способы лечения с применением анти-αvβ8 интегрин антител, включая гуманизированные антитела.

Анти-αvβ8 интегрин антитела и их антигенсвязывающий фрагмент, включая гуманизированные антитела, могут применяться для профилактики, лечения и/или облегчения заболеваний, расстройств или состояний, вызванных и/или ассоциированных с аберрантной (например, повышенной) TGFβ передачей сигналов. Такие заболевания, расстройства или состояния включают рак (например, контроль пролиферации раковых клеток с аберрантной (например, повышенной) TGFβ передачей сигналов).

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, зрелый TGFβ присутствует в не активной или латентной форме в комплексе с доменом ассоциированного с латентностью пептида (LAP). Связывание αvβ8интегрина с LAP дает выделение активного TGFβ (например, TGFβ1 и TGFβ3). Снижение связывания αvβ8 интегрина с LAP может предотвратить выделение активного TGFβ, тем самым снижая TGFβ передачу сигналов. Известно, что TGFβ обладает действием, подавляющим иммунитет, например, в микросреде опухоли, поэтому снижение активности TGFβ и/или передачи сигналов с применением антител, описанных в настоящем документе, может вызвать активацию иммунного ответа, например, противоопухолевого ответа in vivo. Таким образом, антитела и их антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему документу, позволяют селективный антагонизм активности TGFβ в иммунной системе и/или микросреде опухоли, тем самым улучшая противоопухолевый иммунный ответ у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, было показано, что раскрытые в примерах настоящего документа антитела и их антигенсвязывающий фрагмент, против αvβ8 интегрина, вызывают подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животных моделях некоторых видов рака, включая плоскоклеточную карциному, рак груди и рак толстой кишки, отдельно или в комбинации другими иммуномодуляторами, такими как модулятор ингибиторов контрольной точки (например, ингибиторы PD-1, PD-L1, CTLA-4 или агонисты 4-1BB) или противораковые терапии, например, радиотерапия. Таким образом, анти-αvβ8 интегрин антитела и их антигенсвязывающий фрагмент, включая гуманизированные антитела, могут применяться, отдельно или в комбинации со второй терапией, для профилактики, лечения и/или облегчения рака, например, солидной опухоли, например, солидной опухоли, выбранной из: почечно-клеточной карциномы (RCC), рака яичников или плоскоклеточной карциномы головы и шеи (SCCHN).

Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничение описываемого объекта.

Все ссылки, цитируемые в настоящем документе, включая заявки на патенты, патентные публикации и номера доступа Genbank, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная ссылка была специфически индивидуально указана для включения посредством ссылки во всей ее полноте.

Методы и процедуры, описанные или упомянутые в настоящем документе, в целом хорошо понятны и обычно используются специалистами в данной области с использованием традиционной методологии, такой как, например, широко используемые методологии, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); серия METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames и G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather и P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths и D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir и C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley и Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway и P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles и Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993); и их обновленные версии.

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Настоящее изобретение можно легче понять, обратившись к нижеследующему подробному описанию примерных вариантов осуществления настоящего изобретения и включенных в него примеров.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит это изобретение. В случае противоречия преимущественную силу имеет настоящее описание, включая определения.

Кроме того, если иное не требуется контекстом или явно не указано, термины в единственном числе должны включать множественное число, а термины во множественном числе должны включать единственное число.

Подразумевается, что аспекты и варианты осуществления по настоящему описанию в настоящем документе включают «состоящие» и/или «состоящие по существу из» аспектов и вариантов осуществления. В контексте настоящего описания формы единственного числа «а», «an» и «the» включают множественные ссылки, если не указано иное.

В этой заявке использование «или» означает «и/или», если это явно не указано или не понятно специалисту в данной области. В контексте множественно зависимого пункта формулы изобретения, использование «или» относится к более чем одному предшествующему независимому или зависимому пункту формулы изобретения.

«Примерно» или «приблизительно», когда используется в связи с измеримой числовой переменной, относится к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые находятся в пределах экспериментальной ошибки указанного значения (например, в пределах 95% интервала достоверности для среднего) или в пределах 10 процентов от указанного значения, в зависимости от того, что больше. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон.

Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, определяющие широкую область применения изобретения, являются приблизительными, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, указаны как можно точнее. Однако любое числовое значение по своей природе содержит определенные ошибки, обязательно являющиеся результатом стандартного отклонения, обнаруженного в соответствующих испытательных измерениях. Кроме того, следует понимать, что все диапазоны, описанные в настоящем документе, включают любые и все входящие в него поддиапазоны. Например, заявленный диапазон «от 1 до 10» следует рассматривать как включающий любые и все поддиапазоны между (и включительно) минимальным значением 1 и максимальным значением 10; то есть все поддиапазоны, начиная с минимального значения 1 или больше, например от 1 до 6,1 и заканчивая максимальным значением 10 или меньше, например, от 5,5 до 10.

В данном описании и формуле изобретения слово «содержать» или его варианты, такие как «содержит» или «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел. Если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе должны включать множественное число, а термины во множественном числе должны включать единственное число. Любой пример(ы), следующий за термином «например» или «например», не является исчерпывающим или ограничивающим.

Понятно, что везде, где варианты осуществления описаны в настоящем документе термином «содержащий», также предусмотрены аналогичные варианты осуществления, описанные терминами «состоящий из» и/или «состоящий по существу из».

Если аспекты или варианты осуществления по изобретению описаны в терминах группы Маркуша или другой группировки альтернатив, настоящее изобретение охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но и каждого члена группы индивидуально и все возможные подгруппы основной группы, но также в основной группе отсутствуют один или несколько членов группы. Настоящее изобретение также предусматривает явное исключение одного или нескольких членов группы в заявленном изобретении.

Следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. В этом описании и в нижеследующей формуле изобретения будет сделана ссылка на ряд терминов, которые должны иметь следующие значения.

Термин «выделеная молекула» (где молекулой является, например, полипептид, полинуклеотид или антитело или его фрагмент) представляет молекулу, которая в силу своего происхождения или источника ее получения (1) не связана с природно ассоциированными компонентами, которые сопровождают его в нативном состоянии, (2) по существу не содержит других молекул того же вида, (3) экспрессируется клеткой другого вида или (4) не встречается в природе. Таким образом, молекула, которая химически синтезирована или экспрессирована в клеточной системе, отличной от клетки, из которой она происходит в природе, будет «выделена» от ее природно ассоциированных компонентов. Молекула также может оказаться по существу свободной от природно ассоциированных компонентов при выделении с использованием методов очистки, хорошо известных в данной области. Чистота или гомогенность молекулы может быть определена рядом способов, хорошо известных в данной области. Например, чистота образца полипептида может быть проанализирована с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и окрашивания геля для визуализации полипептида с использованием методов, хорошо известных в данной области. Для определенных целей более высокое разрешение может быть обеспечено ВЭЖХ или другими средствами очистки, хорошо известными в данной области.

При использовании в настоящем документе, «по существу чистый» означает, что виды объекта являются преобладающими присутствующими видами (т.е. на молярной основе он более распространен, чем любые другие отдельные виды в композици) и, предпочтительно, по существу очищенная фракция является композицией, где виды объекта (например, гликопротеин, включая антитело или рецептор) составляют по меньшей мере примерно 50 процентов (на молярной основе) всех присутствующих макромолекулярных видов. Как правило, по существу чистая композиция будет составлять более чем примерно 80 процентов всех макромолекулярных видов, присутствующих в композици, более предпочтительно, более чем примерно 85%, 90%, 95% и 99%. Наиболее предпочтительно, виды объекта очищены до по существу гомогенности (примеси не могут быть определены в композиции обычными способами определения), где композиция состоит по существу из одного макромолекулярного вида. В определенных вариантах осуществления, по существу чистый материал является по меньшей мере на 50% чистым (например, чистым от примесей), более предпочтительно по меньшей мере 90% чистым, более предпочтительно по меньшей мере 95% чистым, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% чистым и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% чистым.

Термин «идентичность», известный в данной области техники, относится к взаимосвязи между последовательностями двух или более полипептидных молекул или двух или более молекул нуклеиновой кислоты, по данным сравнения последовательностей. В данной области, «идентичность» также означает степень взаимосвязанности последовательностей между полипептидом или молекулой последовательностей нуклеиновых кислот, в зависимости от обстоятельств, по данным совместимости между нитями нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между двумя или более последовательностями с выравниванием гэпов, рассматриваемым конкретной математической моделью компьютерных программ (т.е. «алгоритмами»).

Термин «сходство» является родственным понятием, но, в отличие от «идентичности», относится к мере сходства, которая включает как идентичные совпадения, так и консервативные совпадения. Поскольку консервативные замены применяются к полипептидам, но не к молекулам нуклеиновой кислоты, сходство относится только к сопоставлениям полипептидных последовательностей. Если две полипептидные последовательности имеют, например, 10 из 20 идентичных аминокислот, а все остальные являются неконсервативными заменами, и процент идентичности и сходство будут равны 50%. Если в том же примере существует еще 5 положений, в которых есть консервативные замены, тогда процент идентичности останется 50%, но процент сходства будет 75% (15 из 20). Поэтому в случаях, когда существуют консервативные замены, степень сходства между двумя полипептидными последовательностями будет выше, чем процент идентичности между этими двумя последовательностями.

«Фрагменты» или «части» полипептида или антитела в соответствии с изобретением могут быть получены усечением, например, удалением одной или нескольких аминокислот из N и/или C-концов полипептида. Вплоть до 10, вплоть до 20, вплоть до 30, вплоть до 40 или более аминокислот могут быть удалены из N и/или C конца таким образом. Фрагменты также могут быть созданы одной или несколькими внутренними делециями.

Вариант антитела может содержать 1, 2, 3, 4, 5, вплоть до 10, вплоть до 20, вплоть до 30 или более аминокислотных замещений и/или делеций и/или вставок из специфических последовательностей и фрагментов, обсуждаемых выше. Варианты с «делецией» могут содержать делецию отдельных аминокислот, делецию небольших групп аминокислот, например, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или делецию больших аминокислотных областей, такую как делеция определенных аминокислотных доменов или другие признаки. Варианты со «вставкой» могут содержать вставку отдельных аминокислот, вставку небольших групп аминокислот, например, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или вставку больших аминокислотных областей, такую как вставка определенных аминокислотных доменов, или другие признаки. Варианты с «замещением», предпочтительно, включают замещение одной или нескольких аминокислот таким же количеством аминокислот и проведение консервативных аминокислотных замещений. Например, аминокислота может быть замещена альтернативной аминокислотой, имеющей подобные свойства, например, другой основной аминокислотой, другой кислой аминокислотой, другой нейтральной аминокислотой, другой заряженной аминокислотой, другой гидрофильной аминокислотой, другой гидрофобной аминокислотой, другой полярной аминокислотой, другой ароматической аминокислотой или другой алифатической аминокислотой.

Варианты с замещением имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле антитела и другой остаток, вставленный на его место. Наиболее интересные места для замещающего мутагенеза включают гипервариабельные области, но изменения в каркасных областях также рассматриваются. Консервативные замены показаны ниже под заголовком «консервативные замены». Если такие замены дают изменение биологической активности, то более существенные изменения, названные «примерные замены», показанные ниже или дополнительно описанные ниже со ссылкой на классы аминокислот, могут быть введены и продукты подвергнуты скриннингу.

Аминокислоты и замены

Исходный остаток Консервативные замены Типовые замены аланин Ala (A) Val Val; Leu; Ile аргинин Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn аспарагин Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg аспарагиновая кислота Asp (D) Glu Glu; Asn цистеин Cys (C) Ser Ser; Ala глутамин Gln (Q) Asn Asn; Glu глутаминовая кислота Glu (E) Asp Asp; Gln глицин Gly (G) Ala Ala гистидин His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg изолейцин Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин лейцин Leu (L) Ile Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe лизин Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn метионин Met (M) Leu Leu; Phe; Ile фенилаланин Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr пролин Pro (P) Ala Ala серин Ser (S) Thr Thr треонин Thr (T) Ser Ser триптофан Trp (W) Tyr Tyr; Phe тирозин Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser валин Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин

Существенные модификации биологических свойств антитела достигаются путем выбора замещений, которые значительно различаются по своему влиянию на сохранение (а) структуры полипептидного скелета в области замены, например, в виде бета-складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (с) основная часть боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки делятся на группы на основе общих свойств боковой цепи:

i. не полярные: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

ii. полярные без заряда: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

iii. кислые (отрицательно заряженные): Asp, Glu;

iv. основные (положительно заряженные): Lys, Arg;

v. остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и

vi. ароматические: Trp, Tyr, Phe, His.

Не консервативные замены производят замещением члена одного из этих классов на другой класс.

Один тип замены, например, который может быть осуществлен, заключается в замене одного или более цистеинов в антителе, которое может быть химически реакционноспособным, на другой остаток, такой как, без ограничения, аланин или серин. Например, может быть проведено замещение не канонического (например, не предпочтительного или распространенного) цистеина. Замещение может проводиться в CDR или каркасной области вариабельного домена или в константной области антитела. В некоторых вариантах осуществления, цистеин является каноническим (например, предпочтительным или наиболее распространенным). Любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, также может быть замещен, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. И наоборот, цистеиновая связь(и) может быть добавлена к антителу для повышения его стабильности, особенно если антителом является фрагмент антитела, такой как Fv фрагмент.

«Антителом» является молекула иммуноглобулина, способная к специфическому связыванию с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, жир, полипептид и т.д. по меньшей мере через один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. При использовании в настоящем документе, термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также, если не указано иное, любой их антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание, слитые белки, содержащие антигенсвязывающий фрагмент, и любые другие модифицированные конфигурации молекулы иммуноглобулина, которые включают сайт распознавания антигена. Антигенсвязывающие фрагменты включают, например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, домен антител (dAb, например, антител акулы и верблюда), фрагменты, включающие определяющие комплементарность области (CDR), одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv), макситела, минитела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина, которая достаточная для придания специфического антигенного связывания с полипептидом.

Антитело включает антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их подклассы), и антитело не обязательно относится к какому-либо определенному классу. В зависимости от, аминокислотных последовательностей константной области тяжелых цепей (HC) антитела, иммуноглобулины могут быть распределены на разные классы. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно поделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называют альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Подъединичные структуры и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термины «антигенсвязывающая часть» или «антигенсвязывающий фрагмент» антитела (или просто «часть антитела»), применяемые здесь взаимозаменяемо, относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, αvβ8 интегрином). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент», антитела включают (i) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов; (ii) F(ab')₂ фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком на шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, состоящий из VH и CH1 доменов; (iv) Fv фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела, (v) dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из VH домена; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR), дисульфидно-связанные Fv (dsFv) и анти-идиотипические (анти-Id) антитела и интратела. Кроме того, хотя два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодированы для отдельных генов, они могут быть объединены с применением рекомбинантных способов, синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде отдельных белковых цепей, в которых VL и VH области спарены с получением одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv)); см., например, Bird et al., Science 242:423-426 (1988) и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Другие формы одноцепочечного антитела, такие как диатела, также охватываются. Диатела являются двухвалентными биспецифическими антителами, в которых VH и VL домены экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с применением линкера, который слишком короткий, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, тем самым заставляя домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-1123).

Антитела может происходить от любого млекопитающего, включая, но не ограничиваясь ими, людей, обезьян, свиней, лошадей, кроликов, собак, кошек, мышей и т.д. или других животных, таких как птицы (например, куры), рыбы (например, акулы) и верблюды (например, ламы).

«Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела (VL) или вариабельной области тяжелой цепи антитела (VH), либо отдельно, либо в комбинации. Как известно в данной области техники, каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя «определяющими комплементарность областями (CDR)», также известных как гипервариабельные области (HVR), и участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антитела. Если желательны варианты таких вариабельных областей, в частности, с замещением в аминокислотных остатках вне CDR области (т.е. в каркасной области), подходящее аминокислотное замещение, предпочтительно, консервативное аминокислотное замещение, может быть идентифицировано сравнением указанных вариабельных областей с вариабельными областями других антител, которые содержат CDR1 и CDR2 последовательности в том же каноническом классе, что и указанная вариабельная область (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987).

В определенных вариантах осуществления, окончательное определение CDR и идентификацию остатков, составляющих сайт связывания антитела, проводят путем решения структуры антитела и/или решения структуры комплекса антитело-лиганд. В определенных вариантах осуществления, это может быть выполнено любым из множества методов, известных специалистам в данной области, таких как рентгеновская кристаллография. В определенных вариантах осуществления, могут быть использованы различные методы анализа для идентификации или приблизительного определения областей CDR. В определенных вариантах осуществления, могут использоваться различные способы анализа для идентификации или приблизительного определения областей CDR. Примеры таких способов включают, но не ограничиваются ими, определение по Kabat, определение по Чотиа, определение AbM, контактное определение и конформационное определение.

В данной области существует несколько способов нумерации аминокислотных остатков, которые образуют CDR. Способ нумерации согласно Kabat является стандартом для нумерации остатков в антителе, и также обычно используется для идентификации CDR. См., например, Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8. Определение по Чотиа похоже на определение согласно Kabat, но определение по Чотиа принимает во внимание положения определенных структурных петлевых областей. См., например, Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83. Определение AbM использует интегрированный набор компьютерных программ производства Oxford Molecular Group, которые моделируют структуру антитела. См., например, Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; «AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,» Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. Определения AbM моделирует третичную структуру антитела из первичной последовательности с применением комбинации баз знаний и способов ab initio, таких, как описаны у Samudrala et al., 1999, «Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach,» в PROTEINS, Structure, Function и Genetics Suppl., 3:194-198.

Контактное определение основано на анализе доступных комплексных кристаллических структур. См., например, MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45. В другом подходе, называемом здесь «конформационное определение» CDR, положения CDR могут быть идентифицированы как остатки, которые делают энтальпийный вклад в связывание с антигеном. См., например, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Другие определения границ CDR могут не следовать строго одному из представленных выше подходов, но тем не менее пересекаются с по меньшей мере частью CDR согласно Kabat, хотя они могут быть сокращены или увеличены в зависимости от прогнозируемых или экспериментальных открытий того, что определенные остатки или группы остатков незначительно влияют на антигенное связывание. При использовании в настоящем документе, CDR может относиться к CDR, определенным любым подходом, известны в данной области техники, включая комбинации подходов. Применяемые здесь способы могут применять CDR, определенные согласно любому из этих подходов. Для любого данного варианта осуществления, содержащего более одной CDR, CDR могут быть определены в соответствии с любым из Кэбота, Чотиа, расширенным, AbM, контактным и/или конформационным определениями.

«Контактный остаток» при использовании в настоящем документе в отношении антитела или антигена, специфически связанного с ним, относится к аминокислотному остатку, присутствующему в антителе/антигене, содержащему по меньшей мере один тяжелый атом (т.е. не водород), который находится в пределах 4 Å или менее от тяжелого атома аминокислотного остатка, присутствующего на родственном антителе/антигене.

«Каркасными» (FR) остатками являются остатки вариабельного домена антитела, отличные от CDR остатков. Каркасные области VH или VL домена содержат четыре каркасные под-области, FR1, FR2, FR3 и FR4, вперемежку с CDR в следующей структуре: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Остатки в вариабельном домене обычно нумеруют согласно Kabat, что дает систему нумерации, применяемую для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи при составлении антител. См., Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Применяя эту систему нумерации, действительная линейная аминокислотная последовательность сможет содержать меньше или дополнительные аминокислоты, соответствующие сокращению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одну аминокислотную вставку (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c, согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков согласно Kabat может быть определена для данного антитела выравниванием в областях гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной согласно Kabat последовательностью. Доступны разные алгоритмы для присвоения нумерации согласно Kabat. Алгоритм, внедренный в версию 2.3.3 релиза Abysis (www.abysis.org) может применяться для присвоения нумерации согласно Kabat вариабельным областям CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H2 и CDR-H3, и определение AbM затем может применяться для CDR-H1.

При использовании в настоящем документе, «моноклональное антитело» относятся к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельных антител, составляющих популяцию, которые идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, поскольку направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Модификатор «моноклональный» указывает на то, что антитело получено из по существу гомогенной популяции антител, и не должен толковаться как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены методом гибридомы, впервые описанным у Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495, или могут быть получены способами рекомбинантной ДНК, описанными в патенте США № 4,816,567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, созданных с применением методик, описанных в McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554, например. При использовании в настоящем документе, «гуманизированное» антитело относится к формам не человеческих (например, мышиных) антител, которые являются химерными иммуноглобулинами, иммуноглобулиновыми цепями или их фрагментами (такими как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие суб-последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из не человеческого иммуноглобулина. Предпочтительно, гуманизированными антителами являются иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в котором остатки из CDR реципиента замещены остатками из CDR видов, отличных от человека (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, имеющих желаемую специфичность, аффинность и емкость. Гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не найдены ни в реципиентном антителе, ни в импортированных CDR или каркасных последовательностях, но включены для дополнительной улучшения или оптимизации эффективности антитела.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по изобретению, может быть аффинно зрелым. Например, аффинно зрелое антитело могут быть получено методами, известными в данной области техники (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:`9-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; и WO2004/058184).

«Человеческое антитело» является таким, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует таковой антитела, продуцированного человеком, и/или полученного с применением любого из методов получения антитела человека, как описано в настоящем документе. Это определение антитела человека специфически исключает гуманизированное антитело, содержащее связывающие остатки не-человеческого антигена.

Термин «химерное антитело» относится к антителам, в которых последовательности вариабельной области получают из одних видов, и последовательности константной области получают из других видов, таких как антитело, в котором последовательности вариабельной области получают из антитела мыши, и последовательности константной области получают из антитела человека, или наоборот. Термин также охватывает антитело, содержащее V область от одного индивидуума из одного вида (например, первой мыши) и константную область от другого индивида из того же вида (например, второй мыши).

Термин «антиген (Ag)» относится к молекулярному веществу, применяемому для иммунизации иммунокомпетентного позвоночного для продуцирования антитела (Ab), которое распознает Ag, или для скриннинга библиотеки экспрессии (например, библиотеки фагового, дрожжевого или рибосомного дисплея, среди прочих). Здесь, Ag называется более широко и обычно включает молекулы-мишени, которые специфически распознаются Ab, тем самым включая фрагменты или миметики молекулы, применяемой при иммунизации для повышения Ab, или в скриннинге библиотеки для выбора Ab. Таким образом, для антител по изобретению, связывающихся с αvβ8 интегрином, полноразмерный αvβ8 интегрин от видов млекопитающих (например, αvβ8 интегрина человека, обезьяны, мыши и крысы), включая мономеры и мультимеры, такие как его димеры, тримеры и т.д., а также усеченные и другие варианты αvβ8 интегрина, называются антигеном.

В общем, термин «эпитоп» относится к зоне или области антигена (например, белка, нуклеиновой кислоты, углевода или жира, и т.д.), с которым антитело специфически связывается, т.е. зоне или области, находящейся в физическом контакте с антителом. Таким образом, термин «эпитоп» относится к той части молекулы, которая способна быть распознанной и связанной антителом в одной или нескольких антигенсвязывающих областях антитела. Обычно, эпитоп определен в контексте молекулярного взаимодействия между «антителом или его антигенсвязывающей частью» (Ab) и его соответствующим антигеном. Эпитопы часто состоят из поверхностной группировки молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и имеют определенные трехмерные структурные характеристики, в также определенные характеристики заряда. В некоторых вариантах осуществления, эпитопом может быть эпитоп белка. Эпитопы белка могут быть линейными или конформационными. В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) возникают линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. «Нелинейный эпитоп» или «конформационный эпитоп» содержит неконтигуальные полипептиды (или аминокислоты) в антигенном белке, с которым связывается антитело, специфическое к эпитопу. Термин «антигенный эпитоп», при использовании в настоящем документе, определен как часть антигена, с которой антитело может специфически связываться, по данным любого способа, известного в данной области техники, например, обычных иммуноанализов. Альтернативно, во время процесса обнаружения, создание и характеризация антитела может дать информацию в желаемых эпитопах. Из такой информации затем возможно провести конкурентный скриннинг антител для связывания с тем же эпитопом. Подход к этому включает проведение конкурентных и кросс-конкурентных исследований для поиска антител, которые конкурируют и кросс-конкурируют друг с другом за связывание с αvβ8 интегрином, например, антитела конкурируют за связывание с антигеном.

Антитело, которое «преимущественно связывается» или «специфически связывается» (применяются взаимозаменяемо в настоящем документе) с эпитопом, является термином, хорошо понимаемым в данной области техники, и способы определения такого специфического или преимущественного связывания также хорошо известны в данной области техники. Молекула демонстрирует «специфическое связывание» или «преимущественное связывание» если она взаимодействует или ассоциируется более часто, более быстро, с большей длительностью и/или с большей аффинностью с конкретной клеток или веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело «специфически связывается» или «преимущественно связывается» с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей длительностью, чем оно связывается с другими веществами. Также антитело «специфически связывается» или «преимущественно связывается» с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей длительностью с этой мишенью в образце, чем оно связывается с другими веществами, присутствующими в образце. Например, антителом, которое специфически или преимущественно связывается с эпитопом αvβ8 интегрина, является антитело, которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей длительностью, чем оно связывается с другими эпитопами αvβ8 интегрина или эпитопами не-αvβ8 интегрина. Это также понятно при чтении этого определения, например, что антитело (или фрагмент или эпитоп), которое специфически или преимущественно связывается с первой мишенью, может или не может специфически или преимущественно связываться со второй мишенью. По существу, «специфическое связывание» или «преимущественное связывание» не обязательно требует (хотя оно может включать) исключительное связывание. Обычно, но не обязательно, ссылка на связывание означает преимущественное связывание. «Специфическое связывание» или «преимущественное связывание» включает соединение, например, белок, нуклеиновую кислоту, антитело и подобное, которое распознает и связывается с определенной молекулой, но не распознает и не связывается по существу с другими молекулами в образце. Например, антитело или пептидный рецептор, который распознает и связывается с когнатным лигандом или партнером по связыванию (например, анти-αvβ8 интегрин антитела, которые связывают αvβ8 интегрин) в образце, но по существу не распознает и не связывается с другими молекулами в образце, специфически связывается с этим когнатным лигандом или партнером по связыванию. Таким образом, в указанных условиях анализа, определенная связывающая группа (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или его рецептор или его лиганд-связывающая часть) связывается преимущественно с конкретной молекулой-мишенью и не связывается в значительном количестве с другими компонентами, присутствующими в тестируемом образце.

Множество форматов анализа может применяться для выбора антитела или пептида, который специфически связывает молекулу, представляющую интерес. Например, твердофазный ELISA иммуноанализ, иммунопреципитация, Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ), KinExA, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), Octet™ (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA) и вестерн-блоттинг являются одними из многих анализов, которые можно использовать для идентификации антитела, которое специфически взаимодействует с антигеном, или его антигенсвязывающего фрагмента или его рецептора или его части, связывающей лиганд, которое специфически связывается с родственным лигандом или партнером по связыванию. Как правило, специфическая или селективная реакция будет по меньшей мере в два раза больше фонового сигнала или шума, чаще, более чем в 10 раз больше фона, даже более часто, более чем в 50 раз больше фона, более часто, более чем в 100 раз больше фона, но еще более часто, более чем в 500 раз больше фона, даже более чем часто, более чем в 1000 раз больше фона, и даже более типично, более чем в 10000 раз больше фона. Дополнительно, антитело «специфически связывает» антиген, когда равновесная константа диссоциации (K_D)составляет ≤1 мкМ, предпочтительно, ≤100 нМ, более предпочтительно, ≤10 нМ, даже более предпочтительно, ≤ 100 пМ, еще более предпочтительно, ≤10 пМ и даже более предпочтительно, ≤1 пМ. В некоторых вариантах осуществления, антитело «специфически связывает» антиген, когда равновесная константа диссоциации (K_D) составляет ≤7 нМ.

Термин «аффинность связывания» используется здесь как мера силы нековалентного взаимодействия между двумя молекулами, например, антитела или его фрагмента и антигена. Термин «аффинность связывания» используется для описания одновалентных взаимодействий (присущей активности).

Дополнительно, для определения аффинности связывания анти-αvβ8-интегрин антитела с клетками, экспрессирующими αvβ8-интегрин, могут быть проведены эксперименты по связыванию клеток для определения кажущейся аффинности. Кажущаяся аффинность связывания антитела с клетками, экспрессирующими мишень, может быть рассчитана как ЕС₅₀ кривых титрования равновесного связывания, на которых средняя геометрическая интенсивность флуоресценции (gMFI) популяции антигенного связывания количественно определяется проточной цитометрией.

Аффинность связывания между двумя молекулами, например, антитела или его фрагмента и антигена, через одновалентное взаимодействие, может быть количественно оценена определением константы диссоциации (K_D). В свою очередь, K_D может быть определена измерением кинетики образования комплекса и диссоциации с применением, например, способа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (Biacore). Константы скорости, соответствующие ассоциации и диссоциации одновалентного комплекса, называют константой скорости ассоциации k_a (или k_on) и константой скорости диссоциации k_d (или k_off), соответственно. K_D относится к k_a и k_d через уравнение K_D=k_d/k_a. Значение константы диссоциации может быть определено прямо хорошо известными способами, и может быть компьютеризовано даже для сложных смесей такими способами, которые описаны, например, у Caceci et al. (1984, Byte 9: 340-362). Например, K_D может быть установлена с применением анализа связывания с двойным нитроцеллюлозным фильтром, такого, как раскрыт в Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432). Другие стандартные анализы для оценки способности связывания лигандов, таких как антитела к целевым антигенами, известны в данной области техники, включая, например, ELISA, вестерн-блоттинг, RIA и анализы проточной цитометрией, и другие анализы, представленные везде в настоящем документе. Кинетика связывания и аффинность связывания антитела также может быть оценена стандартными анализами, известными в данной области техники, такими как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), например, с применением системы Biacore™ или KinExA.

Может быть проведен анализ конкурентного связывания, в котором связывание антитела с антигеном сравнивают со связыванием мишени другим лигандом этой мишени, таким как другое антитело или растворимый рецептор, который другим образом связывается с мишенью. Концентрация, при которой происходит 50% ингибирование, известна как K_i. В идеальных условиях, K_i эквивалентна K_D. Значение K_i никогда не будет меньше K_D, поэтому измерение K_i удобным образом может быть заменено с получением верхнего предела для K_D.

Следуя представленному выше определению аффинности связывания, ассоциированные с разными молекулярными взаимодействиями, например, сравнение аффинности связывания разных антител для данного антигена, может быть проведено сравнением значений K_D для отдельных комплексов антитело/антиген. Значение K_D для антител или других партнеров для связывания может быть определено с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Один из способов определения K_D включает применение поверхностного плазмонного резонанса, обычно с применением биосенсорной системы, такой как система Biacore®.

Также, специфичность взаимодействия может быть оценена определением и сравнением значения K_D для взаимодействия, представляющего интерес, например, специфического взаимодействия между антителом и антигеном, со значением K_D взаимодействия, не представляющего интерес, например, контрольного антитела, известного как не связывающее αvβ8 интегрин.

Антитело, которое специфически связывает свою мишень, может связывать свою мишень с высокой аффинностью, то есть с демонстрацией низкой K_D, как обсуждается выше, и может связываться с другими, не целевыми молекулами, с более низкой аффинностью. Например, антитело может связываться с не целевыми молекулами с K_D 1 x 10^-6 M или более, более предпочтительно, 1 x 10^-5 M или более, более предпочтительно, 1 x 10^-4 M или более, более предпочтительно, 1 x 10^-3 M или более, даже более предпочтительно, 1 x 10^-2 M или более. Антитело по изобретению предпочтительно способно связываться со своей мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза, 10 раз, 50 раз, 100 раз, 200 раз, 500 раз, 1000 раз или 10000 раз или больше, чем его аффинность для связывания с другой молекулой, не-αvβ8 интегрином.

Термин «конкурировать» в настоящем документе в отношении антитела означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом способом, достаточно похожим на связывание второго антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, так что результат связывания первого антитела с его родственным эпитопом заметно снижается в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Может, но не обязательно, существовать альтернатива, когда связывание второго антитела с его эпитопом также заметно снижается в присутствии первого антитела. То есть, первое антитело может ингибировать связывание второго антитела со своим эпитопом без того, чтобы второе антитело ингибировало связывание первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако, если каждое антитело определяемо ингибирует связывание другого антитела с его родственным эпитопом или лигандом в той же, большей или меньшей степени, говорят, что антитела «перекрестно конкурируют» друг с другом за связывание своего соответствующего эпитопа(ов). Настоящее изобретение охватывает как конкурирующие, так и перекрестно-конкурирующие антитела. Независимо от механизма, с помощью которого происходит такая конкуренция или перекрестная конкуренция (например, пространственное затруднение, конформационное изменение или связывание с обычным эпитопом или его частью), специалист в данной области техники поймет, основываясь на идеях, представленных в данном документе, что такие конкурирующие и/или перекрестно-конкурирующие антитела включены и могут применяться для способов, описанных настоящем документе.

Стандартные анализы конкуренции могут применяться для определения того, конкурируют ли антитела друг с другом. Один подходящий анализ для конкурирования антитела включает применение технологии Biacore, которая может измерять степень взаимодействий с применением технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR), обычно с применением биосенсорной системы (такой как система BIACORE®). Например, SPR может применяться в in vitro анализе ингибирование конкурентным связыванием для определения способности одного антитела ингибировать связывание второго антитела. Другой анализ для измерения конкуренции антитела применяет подход на основе ELISA.

Кроме того, способ с высокой пропускной способностью «сортировки» антител на основе из конкурентности описан в заявке на международный патент № WO2003/48731. Конкуренция присутствует, если одно антитело (или фрагмент) снижает связывание другого антитела (или фрагмента) с αvβ8 интегрином. Например, может применяться конкурентный анализ последовательного связывания с последовательным добавлением разных антитела. Первое антитело может быть добавлено для достижения связывания, которое близко к насыщению. Затем добавляют второе антитело. Если связывание второго антитела с αvβ8 интегрином не определяется или значительно понижено (например по меньшей мере примерно 10% по меньшей мере примерно 20% по меньшей мере примерно 30% по меньшей мере примерно 40% по меньшей мере примерно 50% по меньшей мере примерно 60% по меньшей мере примерно 70% по меньшей мере примерно 80% или по меньшей мере, примерно 90% снижение) по сравнению с параллельным анализом в отсутствие первого антитела (значение для которого может быть установлено как 100%), два антитела считаются конкурирующими друг с другом.

Кроме того, анализ связывания эпитопа типового антитела с применением обмена доменами между белками αvβ8интегрина человека и мыши, для оценки потенциальных эпитопов среди нескольких антител, представлен в примере 9. Специалист в данной области техники поймет, вооруженный представленными в настоящем документе идеями, что существует множество анализов, известных в данной области техники, которые могут применяться для определения связывания с мишенью по меньшей мере двух антител относительно друг друга, и такие анализы включены в настоящий документ.

Анти-αvβ8 интегрин антитела могут быть охарактеризованы с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Например, одним из способов является идентификация эпитопа, с которым оно связывается, или «картирование эпитопов». Существует много способов в данной области техники для картирования и характеризации расположения эпитопов на белках, включая растворение кристаллической структуры комплекса антитело-антиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии фрагмента гена и анализы на основе синтетического пептида, как описано, например, в главе 11 из Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. В качестве дополнительного примера, картирование эпитопов может применяться для определения последовательности, с которой связывается анти-αvβ8 интегрин антитело. Картирование эпитопов коммерчески доступно из разных источников, например, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). Эпитопом может быть линейный эпитоп, т.е. содержащийся в одной нити аминокислот, или конформационный эпитоп, образованный трехмерным взаимодействием аминокислот, которые не обязательно могут содержаться в одной нити. Пептиды с разной длиной (например по меньшей мере длиной 4-6 аминокислот) могут быть выделены или синтезированы (например, рекомбинантно) и применяться для анализов связывания с анти-αvβ8 интегрин антителом.

Кроме того, эпитоп, с которым связывается анти-αvβ8 интегрин антитело, может быть определен в системном скриннинге с применением перекрывающихся пептидов, полученных из последовательности αvβ8 интегрина (например, последовательности αvβ8 интегрин человека), и определения связывания антитела. Согласно анализам экспрессии фрагмента гена, открытая рамка считывания, кодирующая αvβ8 интегрин, может быть фрагментирована либо произвольно, либо определенными генетическими конструкциями, и реакционная способность экспрессированных фрагментов αvβ8 интегрина с тестированным антителом может быть определена. Фрагменты гена, например, могут быть получены ПЦР и транскрибированы и транслированы в белок in vitro, в присутствии радиоактивных аминокислот. Связывание антитела с радиоактивно меченными фрагментами αvβ8 интегрина затем определяют иммунопреципитацией и гель-электрофорезом.

Определенные эпитопы также могут быть идентифицированы с применением больших библиотек произвольных пептидных последовательностей, представленных на поверхности фаговых частиц (фаговые библиотеки) или дрожжей (дрожжевой дисплей). Альтернативно, определенная библиотека перекрывающихся пептидных фрагментов может быть тестирована на связывание с тестируемым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере, мутагенез антигена, эксперименты с обменом доменами и аланин-сканирующий мутаганез могут быть проведены для идентификации остатков, требуемых, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа. Например, Эксперименты с аланин-сканирующим мутагенезом могут быть проведены с применением мутантного αvβ8 интегрина, в котором разные остатки полипептида αvβ8 интегрина были замещены аланином. Через оценку связывания антитела с мутантным αvβ8 интегрином, может быть оценена важность конкретных остатков αvβ8 интегрина для связывания антителом.

Еще одним способом, который может применяться для характеризации анти-αvβ8 интегрин антитела, является применение конкурентных анализов с другими антителами, известными как связывающиеся с тем же антигеном, т.е. разными фрагментами на αvβ8 интегрине, для определения того, связывается ли анти-αvβ8 интегрин антитело с тем же эпитопом, что и другие антитела. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в данной области техники.

Кроме того, эпитоп для данной пары связывания антитело/антиген может быть определен и охарактеризован с разными уровнями детализации с применением множества экспериментальных и компьютеризованных способов картирования эпитопа. Экспериментальные способы включают мутагенез, рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) спектроскопию, масс спектрометрию с обменом водород/дейтерий (H/D-МС) и различные способ конкурентного связывания, хорошо известные в данной области техники. Поскольку каждый способ основан на уникальном принципе, описание эпитопа тесно связано со способом, которым он был определен. Таким образом, эпитоп для данной пары антитело/антиген будет определяться по-разному в зависимости от применяемого способа картирования эпитопов.

На самом детализированном уровне, эпитоп для взаимодействия между Ag и Ab можно определить с помощью пространственных координат, определяющих атомные контакты, присутствующие во взаимодействии Ag-Ab, а также информации об их относительном вкладе в термодинамику связывания. На менее детализированном уровне, эпитоп можно охарактеризовать с помощью пространственных координат, определяющих атомные контакты между Ag и Ab. На еще менее детализированном уровне, эпитоп может быть охарактеризован аминокислотными остатками, которые он содержит, как определено конкретным критерием, например, расстоянием между атомами (например, тяжелыми, то есть не водородными атомами) в Ab и Ag. На еще менее детализированном уровне, эпитоп может быть охарактеризован через функцию, например, через конкурентное связывание с другими Ab. Эпитоп также может быть определен более генерализованно как содержащий аминокислотные остатки, у которых замещение другой аминокислотой поменяет характеристики взаимодействия между Ab и Ag (например, с применением аланин-сканирования).

Из того факта, что описания и определения эпитопов, зависящие от используемого метода картирования эпитопов, получают с разными уровнями детализации, следует, что сравнение эпитопов для разных Ab на одном и том же Ag может аналогичным образом проводиться с разными уровнями детализации.

Эпитопы, описанные на уровне аминокислот, например, определенные с помощью рентгеновской структуры, считаются идентичными, если они содержат одинаковый набор аминокислотных остатков. Говорят, что эпитопы перекрываются, если эпитопы разделяют по меньшей мере одну аминокислоту. Эпитопы считаются отдельными (уникальными), если эпитопы не разделяют остатки аминокислот.

Говорят, что эпитопы, характеризующиеся конкурентным связыванием, перекрываются, если связывание соответствующих антител является взаимоисключающим, т.е. связывание одного антитела исключает одновременное или последовательное связывание другого антитела. Говорят, что эпитопы являются отдельными (уникальными), если антиген способен одновременно связывать оба соответствующих антитела.

Определение термина «паратоп» получают из приведенного выше определения «эпитоп» с изменением точки зрения. Таким образом, термин «паратоп» относится к области или области антитела, которая специфически связывает антиген, то есть аминокислотным остаткам антитела, которые контактируют с антигеном (αvβ8 интегрином или его частью), так, как «контакт» определяется в другом месте настоящего описания.

Эпитоп и паратоп для данной пары антитело/антиген может быть идентифицирован обычными способами. Например, общее расположение эпитопа может быть определено оценкой способности антитела связываться с различными фрагментами или вариантом полипептидов αvβ8 интегрина. Определенные аминокислоты в составе αvβ8 интегрина контактируют с антителом (эпитопом), и определенные аминокислоты в антителе, которые контактируют с αvβ8 интегрином (паратопом), также могут быть определены с использованием стандартных способов, таких как описаны в примерах. Например, антитело и молекула-мишень могут быть объединены, и комплекс антитело/антиген может быть кристаллизирован. Кристаллическая структура комплекса может быть определена и использована для идентификации конкретных сайтов взаимодействия между антителом и его мишенью.

Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с тем же эпитопом или доменом αvβ8 интегрина (например, αvβ8 интегрина человека), что и антитела по изобретению, которые специально описаны в настоящем документе. Анализы и исследования, которые могут быть использованы с целью такой идентификации, включают анализы, оценивающие конкуренцию за связывание αvβ8 интегрина между антителом, представляющим интерес, и рецептором αvβ8 интегрина, в анализах биологической активности, как описано в примерах 1-26.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может обладать способностью конкурировать или перекрестно конкурировать с другим антителом по изобретению за связывание с αvβ8 интегрином (например, αvβ8 интегрином человека), как описано в настоящем документе. Например, антитело по изобретению может конкурировать или перекрестно конкурировать с антителами, описанными в настоящем документе, за связывание с αvβ8 интегрином или с подходящим фрагментом или вариантом αvβ8 интегрина, который связан антителами, описанными в настоящем документе.

То есть, если первое антитело конкурирует со вторым антителом за связывание с αvβ8 интегрином, но не конкурирует, если второе антитело первым связывается с αvβ8 интегрином, считается, что оно «конкурирует» со вторым антителом (что также называется однонаправленной конкуренцией). Когда антитело конкурирует с другим антителом, независимо от того, какое антитело первым связывается с αvβ8 интегрином, тогда антитело «перекрестно конкурирует» за связывание с αvβ8 интегрином с другим антителом. Такие конкурирующие или перекрестно-конкурирующие антитела могут быть идентифицированы на основе их способности конкурировать/перекрестно конкурировать с известным антителом по изобретению в стандартных анализах связывания. Например, SPR, например с применением системы Biacore™, анализов ELISA или проточной цитометрии, может применяться для демонстрации конкуренции/перекрестной конкуренции. Такая конкуренция/перекрестная конкуренция позволяет предположить, что два антитела связываются с идентичными, перекрывающимися или аналогичными эпитопами.

Следовательно, антитело по изобретению можно идентифицировать способом, включающим анализ связывания, который оценивает, способно ли тестируемое антитело конкурировать/перекрестно конкурировать с эталонным антителом за сайт связывания на молекуле-мишени. Способы проведения анализов конкурентного связывания описаны в настоящем документе и/или хорошо известны в данной области. Например, они могут включать связывание эталонного антитела по изобретению с молекулой-мишенью с использованием условий, при которых антитело может связываться с молекулой-мишенью. Затем комплекс антитело/мишень может быть подвергнут воздействию тестируемого/второго антитела, и можно оценить степень, в которой тестируемое антитело способно вытеснить эталонное антитело по изобретению из комплексов антитело/мишень. Альтернативный способ может включать контакт тестируемого антитела с молекулой-мишенью в условиях, которые позволяют связывание антитела, затем добавление эталонного антитела по изобретению, которое способно связывать эту молекулу-мишень, и оценку степени, в которой эталонное антитело по изобретению способно вытеснить тестируемое антитело из комплексов антитело/мишень или одновременно связаться с мишенью (т.е. не конкурентные антитела).

Способность тестируемого антитела ингибировать связывание эталонного антитела по изобретению с мишенью демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с эталонным антителом по изобретению за связывание с мишенью, и, таким образом, что тестируемое антитело связывается с тем же или по существу тем же эпитопом или областью на белке αvβ8 интегрина, что и эталонное антитело по изобретению. Тестируемое антитело, которое идентифицировано как конкурирующее с эталонным антителом по изобретению в таком способе, также является антителом настоящего изобретения. Тот факт, что тестируемое антитело может связывать αvβ8 интегрин в же области, что и эталонное антитело по изобретению, и может конкурировать с эталонным антителом по изобретению, предполагает, что тестируемое антитело может действовать как лиганд в том же сайте связывания, что и антитело по изобретению, и что тестируемое антитело может, поэтому, имитировать действие эталонного антитела и, таким образом, является антителом по изобретению. Это может быть подтверждено путем сравнения активности αvβ8 интегрина в присутствии тестируемого антитела с активностью αvβ8 интегрина в присутствии эталонного антитела в других идентичных условиях с использованием анализа, который более подробно описан в другом месте настоящего документа.

Эталонным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению может быть антитело, описанное в настоящем документе, например, антитело из Таблицы 1 и любой его вариант или его фрагмент, как описано в настоящем документе, который сохраняет способность связываться с αvβ8 интегрином.

Как указывалось ранее в другом месте в данном документе, специфическое связывание можно оценить со ссылкой на связывание антитела с молекулой, которая не является мишенью. Это сравнение может быть выполнено путем сравнения способности антитела связываться с мишенью и с другой молекулой. Это сравнение может быть выполнено как описано выше в оценке K_D или K_i. Другой молекулой, используемой в таком сравнении, может быть любая молекула, которая не является молекулой-мишенью. Предпочтительно, другая молекула не идентична молекуле-мишени. Предпочтительно, молекула-мишень не является фрагментом молекулы-мишени.

Другая молекула, используемая для определения специфического связывания, может быть не связана по структуре или функции с мишенью. Например, другая молекула может быть неродственным материалом или сопутствующим материалом в среде.

Другой молекулой, используемой для определения специфического связывания, может быть другая молекула, участвующая в том же in vivo пути, что и молекула-мишень, например, αvβ8 интегрин (например, αvβ8 интегрин человека). Убедившись, что антитело по изобретению имеет специфичность в отношении αvβ8-интегрина по сравнению с другой такой молекулой, можно избежать нежелательной перекрестной реактивности in vivo.

Антитело по изобретению может сохранять способность связываться с некоторыми молекулами, которые являются родственными к молекуле-мишени.

Альтернативно, антитело по изобретению может иметь специфичность в отношении конкретной молекулы-мишени. Например, он может связываться с одной молекулой-мишенью, как описано в настоящем документе, но может не связываться или может связываться со значительно сниженной аффинностью с другой молекулой-мишенью, как описано в настоящем документе. Например, полноразмерный зрелый αvβ8 интегрин человека может использоваться в качестве мишени, но антитело, которое связывается с этой мишенью, может быть не способно связываться или может связываться с меньшей аффинностью с, например, другими белками αvβ8 интегрина из других видов, такими как αvβ8 интегрин других млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления, антитело связывается с αvβ8 интегрином как человека, так и мыши.

«Слитым Fc» белком является белок, в котором один или несколько полипептидов функционально связаны с Fc полипептидом. Fc слияние объединяет Fc область иммуноглобулина с партнером по слиянию.

«Fc область нативной последовательности» содержит аминокислотную последовательность, идентичную Fc области аминокислотной последовательности, найденной в природе. «Вариантная Fc область» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой из Fc области нативной последовательности по меньшей мере одной модификацией аминокислоты, но сохраняет по меньшей мере одну эффекторную функцию Fc области нативной последовательности. Предпочтительно, вариантная Fc область имеет по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с Fc областью нативной последовательностью или с Fc областью исходного полипептида, например, от примерно одной до примерно десяти аминокислотных замещений, и, предпочтительно, от примерно одного до примерно пяти аминокислотных замещений в Fc области нативной последовательности или в Fc области исходного полипептида. Вариантная Fc область в настоящем документе, предпочтительно, имеет по меньшей мере примерно 80% идентичность последовательности с Fc областью нативной последовательности и/или с Fc областью исходного полипептида, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% по меньшей мере примерно 96% по меньшей мере примерно 97% по меньшей мере примерно 98% по меньшей мере примерно 99% идентичность последовательности с ними.

Как известно в данной области техники, «константная область» антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, либо отдельно, либо в комбинации.

Термины «IgG Fc область», «Fc область», «Fc домен» и «Fc», применяемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к части IgG молекулы, которая коррелирует с кристаллизуемым фрагментом, полученным папаиновым переваром IgG молекулы. При использовании в настоящем документе, термины относятся к константной области антитела, за исключением первой константной области домена иммуноглобулина, и дополнительно относится к частям этой области. Таким образом, Fc относится к последним двум константным областям доменов иммуноглобулина IgA, IgD и IgG и последним трем константным областям доменов иммуноглобулина IgE и IgM, и гибким шарнирным областям от N-конца до этих доменов или их частям. Для IgA и IgM, Fc может включать цепь J. Для IgG, Fc содержит домены иммуноглобулина Cγ2 и Cγ3 (C гамма 2 и C гамма 3) и шарнирную область между Cγ1 (C гамма 1) и Cγ2 (C гамма 2). Хотя границы Fc области могут варьироваться, Fc область тяжелой цепи IgG человека обычно определена как содержащая остатки C226 или P230 до ее карбоксильного конца, где нумерацию проведена согласно Eu индексу из Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85 как описано у Kabat et al., 1991. Обычно Fc домен содержит от примерно аминокислотного остатка 236 до примерно 447 константного домена IgG1 человека. Примерная аминокислотная последовательность Fc домена IgG1 человека дикого типа приведена в SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 82 (включая необязательный концевой лизиновый (K) остаток). Fc полипептид может относиться к этой области при выделении, или к этой области в контексте антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или слитого Fc белка.

Константный домен тяжелой цепи содержит Fc область и дополнительно содержит CH1 домен и шарнирную область, а также CH2 и CH3 (и, необязательно, CH4 из IgA и IgE) домены тяжелой цепи IgG.

«Функциональная Fc область» обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией Fc области нативной последовательности. Примеры «эффекторных функций» включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с Fc рецептором; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность; фагоцитоз; подавление поверхностноклеточных рецепторов (например, рецептора В-клеток) и т. д. Такие эффекторные функции обычно требуют, чтобы Fc область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела или его антигенсвязывающим фрагментом), и их можно оценить с помощью различных известных анализов, известных в данной области техники для оценки таких эффекторных функций антитела.

«Fc область нативной последовательности» включает аминокислотную последовательность, идентичную к аминокислотной последовательности Fc области, найденной в природе. Fc области нативной последовательности человека включают Fc область нативной последовательности IgG1 человека (не-A и A аллотипы); Fc область нативной последовательности IgG2 человека; Fc область нативной последовательности IgG3 человека; и Fc область нативной последовательности IgG4 человека, а также их встречающиеся в природе варианты.

«Вариантная Fc область» включает аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой из Fc области нативной последовательности по меньшей мере одной модификацией аминокислоты.

«Fc рецептор» или «FcR» описывает рецептор, который связывается с Fc областью антитела. В некоторых вариантах осуществления, FcγR является нативным FcR человека. В некоторых вариантах осуществления, FcR является таким, который связывает IgG антитело (гамма рецептор) и включает рецепторы FcγRI, FcγRII и FcγRIII подклассов, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. FcγRII рецепторы включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют похожие аминокислотные последовательности, которые отличаются в первую очередь их цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (IT AM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) в его цитоплазматическом домене (см., например, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs рассматриваются, например, в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcRs, включая такие, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются термином «FcR» в настоящем документе.

Термин «Fc рецептор» или «FcR» также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) и регулирование гомеостаза иммуноглобулинов. Способ измерения связывания с FcRn известны (см., например, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

«Эффекторные функции» относятся к биологической активности, относящейся к Fc области антитела, которая варьируется в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание Clq и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление поверхностноклеточных рецепторов (например, рецептора B-клеток); и активацию В-клеток.

«Эффекторными клетками человека» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. В определенных вариантах осуществления, клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию(и) ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), естественные киллеры (NK), моноциты, макрофаги, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, например, из крови.

«Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при который секретированный Ig связывается с Fc рецепторами (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, NK клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяя этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущими антиген клетками-мишенями и затем уничтожать клетку-мишень цитотоксинами. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 из Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки ADCC активности молекулы, представляющей интерес, может быть проведен in vitro ADCC анализ, такой как описан в патентах США №№ 5,500,362 или 5,821,337 или патенте США № 6,737,056 (Presta). Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают PBMC и NK клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC молекулы, представляющей интерес, может быть оценена in vivo, например, в животной модели, такой как раскрыта в Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998). Дополнительные антитела с измененной Fc областью аминокислотных последовательностей и повышенной или пониженной активностью ADCC описаны, например, в патенте США № 7,923,538 и патенте США № 7,994,290.

Антитело, обладающее «повышенной активностью ADCC», относится к антителу, которое более эффективно опосредует ADCC in vitro или in vivo по сравнению с исходным антителом, где антитело и исходное антитело различаются по меньшей мере одним структурным аспектом, и где количества такого антитела и исходного антитела, используемые в анализе, по существу одинаковы. В некоторых вариантах осуществления, антитело и исходное антитело имеют одинаковую аминокислотную последовательность, но антитело афукозилировано, в то время как исходное антитело фукозилировано. В некоторых вариантах осуществления активность ADCC определяют с использованием анализа ADCC in vitro, как раскрыто в настоящем документе, но предусмотрены другие анализы или способы для определения активности ADCC, например, на модели животных и т.д. В некоторых вариантах осуществления, антитело с повышенной активностью ADCC имеет увеличенную аффинность для Fc гамма RIIIA.

Антителом с «измененной» аффинностью связывания FcR или активностью ADCC является антитело, которое имеет либо повышенную, либо пониженную активность связывания FcR и/или активность ADCC по сравнению с исходным антителом, где антитело и исходное антитело различаются по меньшей мере в одном структурном аспекте. Антитело, которое «демонстрирует повышенное связывание» с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с лучшей аффинностью, чем исходное антитело. Антитело, которое «проявляет пониженное связывание» с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более низкой аффинностью, чем исходное антитело. Такие антитела, которые демонстрируют пониженное связывание с FcR, могут обладать незначительным связыванием с FcR или не иметь заметного связывания с FcR, например, 0-20% связывания с FcR, по сравнению с Fc областью нативной последовательности IgG.

«Улучшенная аффинность для Fc гамма RIIIA» относится к антителу, которое имеет большую аффинность для Fc гамма RIIIA (также называемую, в некоторых случаях, CD 16a), чем исходное антитело, где антитело и исходное антитело различаются по меньшей мере в одном структурном аспекте.

«Гликоформа» относится к сложной олигосахаридной структуре, содержащей связи различных углеводных единиц. Такие структуры описаны в, например, Essentials of Glycobiology Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999), где также представлен обзор стандартной номенклатуры гликобиологии. Такие гликоформы включают, но не ограничены ими, G2, G1, G0, G-1 и G-2 (см., например, публикацию международного патента № WO 99/22764).

«Профиль гликозилирования» определен как профиль углеводных единиц, которые ковалентно присоединены к белку (например, гликоформе), а также к сайту(ам), в которых гликоформа(ы) ковалентно присоединена к пептидному скелету белка, более конкретно, белка иммуноглобулина.

«Комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с антителом (подходящего подкласса), которое связывается со своим родственным антигеном. Для оценки активации комплемента, может быть проведен анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Антитела с измененной Fc областью аминокислотных последовательностей и повышенной или пониженной способностью связывания Clq описаны, например, в Патенте США № 6, 194,551 B l, Патенте США № 7,923,538, Патенте США № 7,994,290 и WO 1999/51642. См. также, например, Idusogie et al., J.

При использовании в настоящем документе, термины «аминокислота дикого типа», «IgG дикого типа», «антитело дикого типа» или «mAb дикого типа» относятся к последовательности амино или нуклеиновых кислот, которая существует в природе в определенной популяции (например, к человека, мыши, крысы, в клетке и т.д.).

Термин «αvβ8 интегрин,» при использовании в настоящем документе, обычно относится к белковому комплексу, содержащему альфа подъединицу интегрина (например, альфа-V подъединицу интегрина, например, ITGAV, например, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77) и бета подъединицу интегрина (например, бета 8 подъединицу интегрина, например, ITGB8, например, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78). «αvβ8 интегрин человека» при использовании в настоящем документе, обычно относится к αvβ8 интегрину, например, содержащему альфа подъединицу ITGAV человека, например, содержащую последовательность SEQ ID NO: 77 и ITGB8 бета подъединицу человека, например, содержащую последовательность SEQ ID NO: 78. «Мышиный αvβ8 интегрин» или «αvβ8 интегрин мыши» при использовании в настоящем документе, обычно относится к αvβ8 интегрину, например, содержащему ITGAV альфа подъединицу мыши, например, содержащую последовательность SEQ ID NO: 79, и ITGB8 бета подъединицу мыши, например, содержащую последовательность SEQ ID NO: 80. Термин αvβ8 интегрин обычно включает гомологи и ортологи αvβ8 интегрина, включая, но не ограничиваясь ими, человека, яванского макака, крысы, кролика и мыши. При использовании в настоящем документе, «αvβ8 интегрин» обычно относится к αvβ8 интегрину млекопитающего, например, αvβ8 интегрину человека, крысы, мыши, примата, отличного от человека, коровы, овцы и свиньи (например, содержащему альфа-V подъединицу интегрина и бета 8 подъединицу интегрина от человека, крысы, мыши, примата, отличного от человека, коровы, овцы и свиньи, соответственно). Неограничивающие типовые примеры альфа-V подъединиц интегрина включают αvβ8 интегрин человека (см., например, Номер доступа Genbank P06756.2, SEQ ID NO: 77), яванского макака (см., например, SEQ ID NO:84) и мыши (см., например, SEQ ID NO: 79). Неограничивающие типовые примеры бета 8 подъединиц интегрина включают αvβ8 интегрин человека (см., например, Номер доступа Genbank P26012.1, SEQ ID NO: 78), яванского макака (см., например, SEQ ID NO: 85) и мыши (см., например, SEQ ID NO:80). Термин «αvβ8 интегрин» также охватывает фрагменты, варианты, изоформы и другие гомологи таких молекул подъединиц αvβ8 интегрина. Вариант молекул αvβ8 интегрина, как правило, характеризуется тем же типом активности, что и природный αvβ8 интегрин, например способностью связывать лиганд αvβ8 интегрина, например, как описано в настоящем документе, способностью вызывать рецептор-опосредованную активность и способностью связывать или не связывать антитело или его антигенный фрагмент по изобретению.

Типовые аминокислотные и нуклеотидные последовательности для TGFβ и LAP известны в данной области техники. Например, предшественник полипептида, содержащий TGFβ1 и LAP (например, последовательность человека, № доступа UniProt P01137) после трансляции процессируется в примерно 30-278 аминокислоты № доступа UniProt P01137, соответствующей LAP, и примерно 279-390 аминокислоты № доступа UniProt P01137, соответствующей TGFβ1 человека. Также, предшественник полипептида, содержащий TGFβ3 и LAP (например, последовательность человека, № доступа UniProt P10600) после трансляции процессируется в примерно 24-300 аминокислоты № доступа UniProt P10600, соответствующей LAP и примерно 301-412 аминокислоты № доступа UniProt 10600, соответствующей TGFβ3 человека.

αvβ8 интегрин может содержать один или более, два или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, десять или более, двенадцать или более или пятнадцать или более доступных на поверхности остатков αvβ8 интегрина. Молекула-мишень может содержать известный эпитоп из αvβ8 интегрина.

Как указано в другом месте настоящего документа, некоторые положения молекулы антитела могут быть изменены. Под «положением» при использовании в настоящем документе понимается место в последовательности белка. Положения могут быть пронумерованы последовательно или в соответствии с установленным форматом, например, индекс Eu и индекс Кэбота можно использовать для определения количества аминокислотных остатков антитела. Например, положение 297 представляет собой положение в IgG1 антителе человека. Соответствующие положения определяются, как описано выше, обычно путем согласования с другими исходными последовательностями.

Под «остатком» при использовании в настоящем документе понимают положение в белке и его ассоциированную аминокислотную идентичность. Например, Аспарагин 297 (также называемый Asn297, также называемый N297) является остатком в IgG1 антитела человека.

Как известно в данной области, «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», применяемые здесь взаимозаменяемо, относятся к цепям нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами, или любым субстратом, который может быть включен в цепь с помощью ДНК или РНК полимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует, модификация нуклеотидной структуры может быть внесена до или после сборки цепи. Последовательность нуклеотидов может быть прервана не нуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, «кэпы», замещение одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонатами, фосфотриэфирами, фосфоамидатами, карбаматами и т. д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоатами, фосфородитиоатами и т.д.), те, которые содержат боковые группы, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), те, которые содержат интеркаляторы (например, акридин, псорален и т. д.), те, которые содержат хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), те, которые содержат алкиляторы, те, которые содержат модифицированные связи (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Дополнительно, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть замещена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищенными стандартными защитными группами, или активирована с получением дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми подложками. 5 'и 3' концевая группа ОН может быть фосфорилирована или замещена аминами или фрагментами органических кэпирующих групп, содержащими от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть преобразованы в стандартные защитные группы. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые обычно известны в данной области, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, альфа- или бета-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть замещены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, варианты осуществления, в которых фосфат заменен на P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), (O)NR₂ («амидат»), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ («формацеталь»), в которых каждый R или R' независимо является H или замещенным или незамещенным алкилом (1-20 C), необязательно содержащим простую эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предыдущее описание применимо ко всем полинуклеотидам, указанным в настоящем документе, включая РНК и ДНК.

При использовании в настоящем документе «вектор» означает конструкт, который способен доставлять и, предпочтительно, экспрессировать один или более ген(ов) или последовательность(ей) представляющих интерес, в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы, векторы экспрессии голой ДНК или РНК, плазмиды, космиды или фаговые векторы, векторы экспрессии ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и определенные эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

«Клетка-хозяин» включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или быть реципиентом для вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и это потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или комплементу геномной ДНК) исходной родительской клетке из-за естественной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные и/или трансформированные in vivo полинуклеотидом по настоящему изобретению.

Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками или эукариотическими клетками. Примеры эукариотических клеток включают клетки млекопитающих, такие как клетки приматов или животных, отличных от приматов; грибковые клетки, такие как дрожжи; клетки растений; и клетки насекомых.

Любая клетка-хозяин, чувствительная к культуре клеток и к экспрессии белка или полипептидов, может применяться в соответствии с настоящим изобретением. В определенных вариантах осуществления, клетка-хозяин является клеткой млекопитающего. Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных клеточных линий, доступных из American Type Culture Collection (АТСС). Неограничивающие примеры клеток млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки NS0, клетки HEK 293 и клетки яичников китайского хомяка (СНО) и их производные, такие как клетки 293-6E и CHO DG44, клетки CHO DXB11 и Potelligent® CHOK1SV (BioWa/Lonza, Allendale, NJ). Клетки-хозяева млекопитающих также включают, но не ограничиваются ими, клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2), клетки почек детенышей хомяка (BHK, ATCC CCL 10), клетки почек обезьян (COS) и клетки печеночно-клеточной карциномы человека (например, Hep G2). Другие не ограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают человеческие ретинобласты (PER.C6®; CruCell, Leiden, The Netherlands); линия CV1 почек обезьян, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия 293 почек эмбриона человека (HEK 293) или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36:59); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки почек собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); опухоль молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 клетки (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 клетки; FS4 клетки; линия гепатомы человека (Hep G2); и множественные клеточные линии миеломы, включая, но не ограничиваясь ими, линию миеломы BALB/c мышей (NS0/1, ECACC No: 85110503), NS0 клетки и Sp2/0 клетки.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать любое количество коммерчески и не коммерчески доступных клеточных линий, которые экспрессируют полипептиды или белки. Специалист в данной области поймет, что разные клеточные линии могут иметь разные потребности в питании и/или могут потребовать разных условий культивирования для оптимального роста и экспрессии полипептида или белка, и сможет при необходимости, изменить условия.

Изобретение включает любую эукариотическую систему экспрессии, известную в данной области или описанную в настоящем документе, для получения белков, представляющих интерес, такую как экспрессия в системе клеток насекомых, система экспрессии дрожжей или система клеток млекопитающих, таких как, но не ограниченных ими, клетки CHO.

При использовании в настоящем документе «последовательность контроля экспрессии» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательность контроля экспрессии может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцируемый промотор, или энхансер. Последовательность контроля экспрессии функционально связана с транскрибируемой последовательностью нуклеиновых кислот.

Термины «лидерный пептид» или «лидерная последовательность» или «лидерная сигнальная последовательность» или «сигнальная последовательность», применяемые здесь взаимозаменяемо, подразумевают любую последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность, кодированную таким образом, которая может присутствовать на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и/или на N-конце полипептида или рядом с ним, которые, если присутствуют, могут опосредовать транспорт полипептида к органелле назначения, включая, но не ограничиваясь ими, секрецию полипептида из клетки. Такие лидерные последовательности включают, но не ограничены ими, последовательности нуклеиновых кислот, содержащие, например, ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTCC (SEQ ID NO: 187) и аминокислотные последовательности, кодированные таким образом, такие как, но не ограниченные ими, MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 188). Изобретение охватывает эти и любые другие лидерные сигналы (нуклеиновые и аминокислотные последовательности), известные в данной области или подлежащие идентификации, которые могут приводить к транспорту полипептида к желаемой органелле, например, эндоплазматическому ретикулюму и/или секретированию из клетки. Как правило, сигнальный пептид удаляется и/или отсутствует в зрелом полипептиде.

При использовании в настоящем документе «лечением» является подход к достижению положительных или желаемых клинических результатов. Для целей данного изобретения, полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничены ими, один или несколько из следующих: улучшенная выживаемость (снижение смертности), уменьшение воспалительной реакции на заболевание, уменьшение степени фиброза тканей, улучшение внешнего вида очагов заболевания, ограничение патологических очагов поражения фокальными сайтами, уменьшение степени повреждения от болезни, уменьшение продолжительности заболевания и/или уменьшение количества, степени или продолжительности симптомов, связанных с заболеванием. Термин включает введение соединений или агентов по настоящему изобретению для предотвращения или отсрочки появления симптомов, осложнений или биохимических признаков заболевания, облегчения симптомов или прекращения или ингибирования развития заболевания, состояния или расстройства. Лечение может быть профилактическим (для предотвращения или отсрочки начала заболевания или для предотвращения проявления его клинических или субклинических симптомов) или терапевтического подавления или облегчения симптомов после проявления заболевания. В некоторых вариантах осуществления заболеванием, состоянием или расстройством является рак.

При использовании в настоящем документе термин «рак» включает все типы раковых образований или онкогенных процессов, метастатических тканей или злокачественно трансформированных клеток, тканей или органов, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Примеры раковых расстройств включают, но не ограничиваются ими, солидные опухоли, гематологические раки, опухоли мягких тканей и метастатические поражения. Примеры солидных опухолей включают злокачественные новообразования, например, саркомы и карциномы (включая аденокарциномы и плоскоклеточные карциномы), различных систем органов, таких как печень, легкие, грудь, лимфа, желудочно-кишечный тракт (например, толстая кишка), мочеполовые пути (например, почки, уротелиальные клетки), простата и глотка. Аденокарциномы включают злокачественные новообразования, такие как рак толстой кишки, рак прямой кишки, почечно-клеточная карцинома, рак печени, немелкоклеточная карцинома легкого, рак тонкого кишечника и рак пищевода. Плоскоклеточные карциномы включают злокачественные новообразования, например, в легких, пищеводе, коже, области головы и шеи, полости рта, анусе и шейке матки. В одном варианте осуществления, раком является меланома, например меланома на поздней стадии. Метастатические поражения вышеупомянутых видов рака также можно лечить с использованием способов и композиций по настоящему изобретению. Типичные виды рака, рост которых можно лечить, например, уменьшать, с использованием описанных в настоящем документе молекул антител, включают рак, обычно чувствительный к иммунотерапии.

«Облегчение» означает уменьшение или улучшение одного или нескольких симптомов по сравнению с отсутствием приема анти-αvβ8 интегрин антитела. «Облегчение» также включает сокращение или снижение продолжительности симптома.

При использовании в настоящем документе «эффективная дозировка» или «эффективное количество» лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для воздействия на один или более благоприятных или желаемых результатов. В более конкретных аспектах, эффективное количество предотвращает, ослабляет или облегчает симптомы заболевания, например, рака и/или продлевает выживаемость субъекта, которого лечат. Для профилактического использования, полезные или желаемые результаты включают устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или отсрочку начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, проявляющиеся во время развития заболевания. Для терапевтического использования, полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как уменьшение одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или состояния, опосредованного αvβ8 интегрином, снижение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства и/или замедление прогрессирования заболевания у пациентов. Эффективную дозу можно вводить за одно или несколько введений. Для целей данного изобретения, эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического лечения прямо или косвенно. Как понимается в клиническом контексте, эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может или не может быть достигнута в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективная доза» может рассматриваться в контексте введения одного или нескольких терапевтических агентов, и один агент может считаться введенным в эффективном количестве, если в сочетании с одним или несколькими другими агентами желаемый результат может быть достигнут или достигается.

Антитела или их антигенсвязывающий фрагмент можно вводить в комбинации с одним или несколькими терапиями (например, названными в настоящем документе «второй терапией»). Под «в комбинации с» не подразумевается, что терапия или терапевтические агенты должны вводиться одновременно и/или составляться для совместной доставки, хотя эти способы доставки входят в объем, описанный в настоящем документе. Анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент можно вводить одновременно, до или после одной или нескольких других дополнительных терапий или терапевтических агентов. Анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент и вторую терапию, например, другой агент или терапевтический протокол, можно вводить в любом порядке. В общем, каждый агент будет вводиться в дозе и/или по схеме, определенной для этого агента. Также следует понимать, что дополнительный терапевтический агент, используемый в этой комбинации, может вводиться вместе, в одной композиции, или вводиться отдельно, в разных композициях. В некоторых вариантах осуществления, дозы, используемые в комбинации, будут ниже, чем дозы, используемые по отдельности.

«Синергетической комбинацией» или комбинацией, которая действует «синергетически» является комбинация, которая демонстрирует усиленные эффекты, которые не прогнозируются по сравнению с просто аддитивным эффектом отдельных комбинированных терапий.

«Индивидуумом» или «субъектом» является млекопитающее, более предпочтительно, человек. Млекопитающие также включают, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственных животных (например, коров, свиней, лошадей, кур и т.д.), спортивных животных, домашних животных, приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс. В некоторых вариантах осуществления, индивидуум подвержен риску заболевания, расстройства или состояния, опосредованного или связанного со связыванием αvβ8 интегрина с его рецептором и передачей сигналов, опосредованных им. В определенных вариантах осуществления, субъект имеет расстройство или состояние, описанное в настоящем документе, например, рак.

При использовании в настоящем документе «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемый эксципиент» включает любой материал, который, в сочетании с активным ингредиентом, позволяет ингредиенту сохранять биологическую активность и не вступает в реакцию с иммунной системой субъекта. Примеры включают, но не ограничиваются ими, любые стандартные фармацевтические носители, такие как физиологический раствор с фосфатным буфером, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы смачивающих агентов. Предпочтительными разбавителями для аэрозоля или парентерального введения являются физиологический раствор с фосфатным буфером (ФРФБ) или нормальный (0,9%) солевой раствор. Композиции, содержащие такие носители, составляют известными, широко применяемыми способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. Mack Publishing, 2000).

Примерные способы и материалы описаны в настоящем документе, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, также могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

II. АНТИ-αvβ8 ИНТЕГРИН АНТИТЕЛА

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с αvβ8 интегрином. Предпочтительно, антитела специфически связываются с αvβ8 интегрином, т.е., они связываются с αvβ8 интегрином, но они не связываются определяемо или связываются с более низкой аффинностью с другими αv интегринами (например, αvβ3 интегрином, αvβ5 интегрином и αvβ6 интегрином). Изобретение дополнительно относится к анти-αvβ8 интегрин антителам, которые демонстрируют измененную эффекторную функцию. В некоторых вариантах осуществления, измененной эффекторной функцией является пониженная ADCC. В некоторых вариантах осуществления, измененной эффекторной функцией является пониженная CDC. Изобретение также относится к композициям, содержащим такие антитела, а также к применению таких антител, включая терапевтическое и фармацевтическое применение.

В одном варианте осуществления, описание представляет любое из нижеследующего или композиции (включая фармацевтические композиции), содержащие антитело, имеющее последовательность легкой цепи или ее фрагмент и тяжелой цепи или ее фрагмент, полученные из, но не идентичные, антитела ADWA-11 гибридомы мыши (также называемого ADWA11, mADWA11, mADWA-11), как описано в Патенте США № 9,969,804, который включен сюда посредством ссылки полностью, и как показано в, например, SEQ ID NO: 20-33 и 71-76 настоящего описания.

Антитела, применяемые в настоящем изобретении, могут охватывать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антитела (например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc, и т.д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгатные антитела, одноцепочечные (ScFv), их мутанты, слитые белка, содержащие фрагмент антитела (например, домен антитела), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена с требуемой специфичностью, включая гликозилированные варианты антител, варианты аминокислотных последовательностей антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть получены от мыши, крысы, человека или иметь любое другое происхождение (включая химерные или гуманизированные антитела). В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антителом является моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антителом является антитело человека или гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антителом является химерное антитело.

Анти-αvβ8 интегрин антитела по изобретению могут быть получены любым способом, известным в данной области техники. Общие методики получения антител человека и мыши известны в данной области техники и/или описаны в настоящем документе.

После начальной идентификации, активность кандидатного анти-αvβ8 интегрин антитела может быть дополнительно подтверждена и уточнена биоанализами, известными для тестирования целевой биологической активности. В некоторых вариантах осуществления, in vitro клеточный анализ применяют для дополнительной характеризации кандидатного анти-αvβ8 интегрин антитела. Например, биоанализы могут применяться для прямого скриннинга кандидатов. Некоторые способы идентификации и характеризации анти-αvβ8 интегрин антитела описаны подробно в примерах.

В таблице 1 ниже представлены суммированные данные аминокислот и нуклеотидных последовательностей для мышиных, химерных и гуманизированных анти-αvβ8 интегрин антител, например, как описано в настоящем документе. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности CDR тяжелой и легкой цепи, аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей и аминокислотные и нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепей показаны в этой таблице. В общем, если не указано конкретно, анти-αvβ8 интегрин антитела по изобретению могут включать любую комбинацию одной или нескольких CDR согласно Kabat и/или гипервариабельных петель по Чотиа, как показано в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитела по изобретению могут включать любую комбинацию одной или нескольких VH и/или VL последовательностей, как показано в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитела по изобретению могут включать любую комбинацию одной или нескольких каркасных областей (например, FR1, FR2, FR3 и FR4) как описано в таблице 1. Как это понимается в целом и как указано в таблице 1, каждая VH и VL последовательность обычно включает три CDR и четыре FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

В некоторых вариантах осуществления, где анти-αvβ8 интегрин антитело содержит C-концевой лизиновый (K) аминокислотный остаток тяжелой цепи полипептида (например, тяжелая цепь IgG1 человека содержит концевой лизин), специалист в данной области техники поймет, что лизиновый остаток может быть усечен, давая антитело с тяжелой цепью, не имеющей C-концевой лизиновый остаток. Дополнительно, тяжелая цепь антитела может быть получена с применением нуклеиновой кислоты, которая не кодирует лизин. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело содержит тяжелую цепь, где концевой лизин, присутствующий в других случаях, не присутствует.

Таблица 1: Аминокислотные и нуклеотидные последовательности для αvβ8 интегрин антитела и других пептидов.

Наименование SEQ ID NO. Последовательность ADWA11 2.4 VL
VL аминокислотная последовательность
Подчеркнутые аминокислотные остатки являются CDR последовательностями согласно Kabat (также называемыми ADWA11_VK01_2.4) 7 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrstkslshfngntylfwyqqkpgkapkrliyymsslasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsleypftfgggtkveik ADWA11 2.4 CDR-L1 согласно Kabat 11 rstkslshfngntylf ADWA11 2.4 CDR-L2 согласно Kabat 12 yYmsslas ADWA11 2.4 CDR-L3 согласно Kabat 13 qqsleypft ADWA11 2.4 CDR-L1 по Чотиа 17 stkslshfngntyl ADWA11 2.4 CDR-L2 по Чотиа 18 yymss ADWA11 2.4 CDR-L3 по Чотиа 19 qsleypft ADWA11 2.4 VH
VH аминокислотная последовательность
Подчеркнутые аминокислотные остатки являются CDR последовательностями согласно Kabat 6 evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdyymnwvrqapgkglewvgwidpdqgntiyepkfqgrftisadtsknsaylqmnslraedtavyycarrllmdywgqgtlvtvss ADWA11 2.4 CDR-H1 согласно Kabat 8 dyymn ADWA11 2.4 CDR-H2 согласно Kabat 9 widpdqgntiyepkfqg ADWA11 2.4 CDR-H3 согласно Kabat 10 rllmdy ADWA11 2.4 CDR-H1 по Чотиа 14 gfnikdyymn ADWA11 2.4 CDR-H2 по Чотиа 15 widpdqgn ADWA11 2.4 CDR-H3 по Чотиа 16 rllmdy ADWA11 2.4
Аминокислотная последовательность легкой цепи (LC)
VL последовательность подчеркнута 5 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrstkslshfngntylfwyqqkpgkapkrliyymsslasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsleypftfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec ADWA11 2.4
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи(HC)
VH последовательность подчеркнута 2 evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdyymnwvrqapgkglewvgwidpdqgntiyepkfqgrftisadtsknsaylqmnslraedtavyycarrllmdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk ADWA11 2.4
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи без концевого лизинового остатка
VH последовательность подчеркнута 3 evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdyymnwvrqapgkglewvgwidpdqgntiyepkfqgrftisadtsknsaylqmnslraedtavyycarrllmdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg ADWA11 2.4
ДНК последовательность легкой цепи
Остатки нуклеиновых кислот, кодирующие VL, подчеркнуты
Остатки нуклеиновых кислот, кодирующие лидер, указаны прописными буквами 4 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggcgtgcactccGACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCAGCCTGAGCGCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGTCCACCAAGTCCCTGTCCCACTTCAACGGCAACACCTACCTGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGGCTGATCTACTACATGTCCTCCCTGGCCTCCGGAGTGCCCTCCAGGTTCTCCGGATCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCCTGGAGTACCCCTTCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT ADWA11 2.4
ДНК последовательность легкой цепи
Остатки нуклеиновых кислот, кодирующие VL, подчеркнуты 185 GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCAGCCTGAGCGCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGTCCACCAAGTCCCTGTCCCACTTCAACGGCAACACCTACCTGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGGCTGATCTACTACATGTCCTCCCTGGCCTCCGGAGTGCCCTCCAGGTTCTCCGGATCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCCTGGAGTACCCCTTCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT ADWA11 2.4
ДНК последовательность VL 186 GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCAGCCTGAGCGCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGTCCACCAAGTCCCTGTCCCACTTCAACGGCAACACCTACCTGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGGCTGATCTACTACATGTCCTCCCTGGCCTCCGGAGTGCCCTCCAGGTTCTCCGGATCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCCTGGAGTACCCCTTCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAA ADWA11 2.4
Лидерные ДНК последовательности легкой цепи и тяжелой цепи 187 ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTCC ADWA11 2.4
Лидерные аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи 188 MGWSCIILFLVATATGVHS ADWA11 2.4
ДНК последовательность тяжелой цепи (с концевым лизином)
Остатки нуклеиновых кислот, кодирующие VH, подчеркнуты
Остатки нуклеиновых кислот, кодирующие лидер, указаны прописными буквами 1 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggcgtgcactccGAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACTACTACATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGGGCTGGATCGACCCCGACCAGGGCAACACCATCTACGAGCCCAAGTTCCAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACAGCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCTGCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCCGGAAAA ADWA11 2.4
ДНК последовательность тяжелой цепи (с концевым лизином)
Остатки нуклеиновых кислот, кодирующие VH, подчеркнуты 189 GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACTACTACATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGGGCTGGATCGACCCCGACCAGGGCAACACCATCTACGAGCCCAAGTTCCAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACAGCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCTGCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCCGGAAAA ADWA11 2.4
ДНК последовательность VH 190 GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACTACTACATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGGGCTGGATCGACCCCGACCAGGGCAACACCATCTACGAGCCCAAGTTCCAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACAGCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCTGCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCA ADWA11 2.4
ДНК последовательность тяжелой цепи
Нуклеиновая кислота без концевого лизина, остатки, коирующие VH, подчеркнуты
Остатки нуклеиновых кислот, кодирующие лидер, указаны прописными буквами 183 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggcgtgcactccGAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACTACTACATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGGGCTGGATCGACCCCGACCAGGGCAACACCATCTACGAGCCCAAGTTCCAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACAGCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCTGCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCCGGA ADWA11 2.4
ДНК последовательность тяжелой цепи
Нуклеиновая кислота без концевого лизина, остатки, коирующие VH, подчеркнуты 191 GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACTACTACATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGGGCTGGATCGACCCCGACCAGGGCAACACCATCTACGAGCCCAAGTTCCAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACAGCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCTGCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCCGGA Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
VL аминокислотная последовательность
Подчеркнутые аминокислотные остатки являются CDR последовательностями согласно Kabat 21 DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSTKSLLHFNGNTYLFWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGTGTKLEIK Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
VH аминокислотная последовательность
Подчеркнутые аминокислотные остатки являются CDR последовательностями согласно Kabat 20 EVQLQQSGAELVRPGAFVKLSCKASGFNIKDYYMNWVLQRPEQGLEWIGWIDPDNGNTIYDPKFQGKASITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTSVTVSS Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-L1 согласно Kabat 25 RSTKSLLHFNGNTYLF Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-L2 согласно Kabat 26 YYMSNLAS Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-L3 согласно Kabat 27 MQSLEYPFT Антитело ADWA-11 гибридомы мыши Альтернативная
Альтернативная CDR-L1 согласно Kabat 71 rstksllhfngntylf Антитело ADWA-11 гибридомы мыши Альтернативная
Альтернативная CDR-L2 согласно Kabat 72 yymsnlas Антитело ADWA-11 гибридомы мыши Альтернативная
Альтернативная CDR-L3 согласно Kabat 73 mqsleypft Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-H1 согласно Kabat 22 DYYMN Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-H2 согласно Kabat 23 WIDPDNGNTIYDPKFQG Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-H3 согласно Kabat 24 RLLMDY Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-L1 по Чотиа 31 STKSLLHFNGNTYL Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-L2 по Чотиа 32 YYMSN Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-L3 по Чотиа 33 QSLEYPFT Антитело ADWA-11 гибридомы мыши Альтернативная
Альтернативная CDR-L1 по Чотиа 74 stksllhfngntyl Антитело ADWA-11 гибридомы мыши Альтернативная
Альтернативная CDR-L2 по Чотиа 75 yymsn Антитело ADWA-11 гибридомы мыши Альтернативная
Альтернативная CDR-L3 по Чотиа 76 qsleypft Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-H1 по Чотиа 28 GFNIKDYYMN Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-H2 по Чотиа 29 WIDPDNGN Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
CDR-H3 по Чотиа 30 RLLMDY ADWA11_VK01 (1) (также указанная в настоящем документе как adwa_VL_1.1 L46R)
VL аминокислотная последовательность 47 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_1a (1) L29I
VL аминокислотная последовательность 48 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSILHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_1b (1) L30S
VL аминокислотная последовательность 49 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLSHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_1c (1) T36S
VL аминокислотная последовательность 50 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNSYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_2a (1) Y55A
VL аминокислотная последовательность 51 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYAMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_2b (1) M56A
VL аминокислотная последовательность 52 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_2c (1) N58S
VL аминокислотная последовательность 53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_2d (1) A60Q
VL аминокислотная последовательность 54 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_3a (1) M94Q
VL аминокислотная последовательность 55 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_3b (1) L97Y
VL аминокислотная последовательность 56 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSYEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_3c (1) E98S
VL аминокислотная последовательность 57 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLSYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_3d (1) Y99T
VL аминокислотная последовательность 58 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLETPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_4a (1) F101L
VL аминокислотная последовательность 59 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPLTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_4b (1) F101W
VL аминокислотная последовательность 60 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPWTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_4c (1) Q105G
VL аминокислотная последовательность 61 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGGGTKVEIK ADWA11VK1 IGKV2-28
VL аминокислотная последовательность 62 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTKSLLHFNGNTYLFWYLQKPGQSPQLLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK2 IGKV2-30
VL аминокислотная последовательность 63 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSTKSLLHFNGNTYLFWFQQRPGQSPRRLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK3 IGKV4-1
VL аминокислотная последовательность 64 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGQPPKLLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK4 IGKV1-39
VL аминокислотная последовательность 65 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKLLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK5 IGKV3-11
VL аминокислотная последовательность 66 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGQAPRLLIYYMSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11_VK01_2.1
VL аминокислотная последовательность 67 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrstkslshfngntylfwyqqkpgkapkrliyymsnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsleypftfgggtkveik ADWA11_VK01_2.2
VL аминокислотная последовательность 68 DiqmtqspsslsasvgdrvtitcrstkslshfngntylfwyqqkpgkapkrliyymsnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycMqsyeypftfgggtkveik ADWA11_VK01_2.3
VL аминокислотная последовательность 69 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrstkslshfngntylfwyqqkpgkapkrliyyAsnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsleypftfgggtkveik ADWA11VH1 IGHV1-46
VH аминокислотная последовательность 34 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMNWVRQAPGQGLEWIGWIDPDNGNTIYDQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH2 IGHV3-23
VH аминокислотная последовательность 35 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWIGWIDPDNGNTIYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH3 IGHV3-30
VH аминокислотная последовательность 36 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWIGWIDPDNGNTIYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH4 IGHV1-69
VH аминокислотная последовательность 37 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDYYMNWVRQAPGQGLEWIGWIDPDNGNTIYDQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 IGHV3-48
VH аминокислотная последовательность 38 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWIGWIDPDNGNTIYDDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11 VH05_VK1 (также указанная в настоящем документе как adwa_VH_1,5 T28N+F29I+R72A+A49G+L79A+N74T+A75S)
VH аминокислотная последовательность 39 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 D61E
VH аминокислотная последовательность 40 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYEPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 N55Q
VH аминокислотная последовательность 41 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDQGNTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 N28Q
VH аминокислотная последовательность 42 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDQGNTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5K30A
VH аминокислотная последовательность 43 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIADYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 N57Q
VH аминокислотная последовательность 44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGQTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 P62A
VH аминокислотная последовательность 45 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYDAKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 K63A
VH аминокислотная последовательность 46 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYDPAFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS Типовая аминокислотная последовательность подъединицы альфа-V (ITGAV) интегрина человека 77 mllgtlllilyilmlcrmfllvgapkanttqpgiveggqvlkcdwsstrrcqpiefdatgnrdyakddplefkshqwfgasvrskqdkilacaplyhwrtemkqerepvgtcflqdgtktveyapcrsqdidadgqgfcqggfsidftkadrvllggpgsfywqgqlisdqvaeivskydpnvysikynnqlatrtaqaifddsylgysvavgdfngdgiddfvsgvpraartlgmvyiydgknmsslynftgeqmaayfgfsvaatdingddyadvfigaplfmdrgsdgklqevgqvsvslqrasgdfqttklngfevfarfgsaiaplgdldqdgfndiaiaapyggedkkgivyifngrstglnavpsqilegqwaarsmppsfgysmkgatdidkngypdlivgafgvdrailyrarpvitvnaglevypsilnqdnktcslpgtalkvscfnvrfclkadgkgvlprklnfqvellldklkqkgairralflysrspshsknmtisrgglmqceeliaylrdesefrdkltpitifmeyrldyrtaadttglqpilnqftpanisrqahilldcgednvckpklevsvdsdqkkiyigddnpltlivkaqnqgegayeaelivsiplqadfigvvrnnealarlscafktenqtrqvvcdlgnpmkagtqllaglrfsvhqqsemdtsvkfdlqiqssnlfdkvspvvshkvdlavlaaveirgvsspdhiflpipnwehkenpeteedvgpvvqhiyelrnngpssfskamlhlqwpykynnntllyilhydidgpmnctsdmeinplrikisslqttekndtvagqgerdhlitkrdlalsegdihtlgcgvaqclkivcqvgrldrgksailyvksllwtetfmnkenqnhsyslkssasfnviefpyknlpieditnstlvttnvtwgiqpapmpvpvwviilavlagllllavlvfvmyrmgffkrvrppqeeqereqlqphengegnset Типовая аминокислотная последовательность подъединицы бета 8 (ITGB8) интегрина человека 78 MCGSALAFFTAAFVCLQNDRRGPASFLWAAWVFSLVLGLGQGEDNRCASSNAASCARCLALGPECGWCVQEDFISGGSRSERCDIVSNLISKGCSVDSIEYPSVHVIIPTENEINTQVTPGEVSIQLRPGAEANFMLKVHPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSRKMAFFSRDFRLGFGSYVDKTVSPYISIHPERIHNQCSDYNLDCMPPHGYIHVLSLTENITEFEKAVHRQKISGNIDTPEGGFDAMLQAAVCESHIGWRKEAKRLLLVMTDQTSHLALDSKLAGIVVPNDGNCHLKNNVYVKSTTMEHPSLGQLSEKLIDNNINVIFAVQGKQFHWYKDLLPLLPGTIAGEIESKAANLNNLVVEAYQKLISEVKVQVENQVQGIYFNITAICPDGSRKPGMEGCRNVTSNDEVLFNVTVTMKKCDVTGGKNYAIIKPIGFNETAKIHIHRNCSCQCEDNRGPKGKCVDETFLDSKCFQCDENKCHFDEDQFSSESCKSHKDQPVCSGRGVCVCGKCSCHKIKLGKVYGKYCEKDDFSCPYHHGNLCAGHGECEAGRCQCFSGWEGDRCQCPSAAAQHCVNSKGQVCSGRGTCVCGRCECTDPRSIGRFCEHCPTCYTACKENWNCMQCLHPHNLSQAILDQCKTSCALMEQQHYVDQTSECFSSPSYLRIFFIIFIVTFLIGLLKVLIIRQVILQWNSNKIKSSSDYRVSASKKDKLILQSVCTRAVTYRREKPEEIKMDISKLNAHETFRCNF Типовая аминокислотная последовательность подъединицы альфа-V (ITGAV) интегрина мыши 79 MAAPGRLLLRPRPGGLLLLLPGLLLPLADAFNLDVESPAEYAGPEGSYFGFAVDFFEPSTSSRMFLLVGAPKANTTQPGIVEGGQVLKCECSSSRRCQPIEFDSTGNRDYAKDDPLEFKSHQWFGASVRSKQDKILACAPLYHWRTEMKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSKNIDADGQGFCQGGFSIDFTKADRVLLGGPGSFYWQGQLISDQVAEIISKYDPNVYSIKYNNQLATRTAQAIFDDSYLGYSVAVGDFNGDGIEDFVSGVPRAARTLGMVYIYDGKNMSSLHNFTGEQMAAYFGFSVAATDINGDDYADVFIGAPLFMDRGSDGKLQEVGQVSVSLQRAVGDFQTTKLNGFEVFARFGSAIAPLGDLDQDGFNDIAIAAPYGGEDKKGLVYIFNGRSTGLNSVPSQILEGQWAAQSMPPSFGYSMKGATDVDRNGYPDLVVGAFGVDRAVLYRARPVVTVNAGLEVYPSILNQDNKICPLPGTALKVSCFNVRFCLKADGKGTLPRKLHFQVELLLDKLKQKGAIRRALFLHNRSPVHSKTMTVFRGGQMQCEELVAYLRDESEFRDKLTPITIFMEYRLDQRTAADATGLQPILNQFTPANVSRQAHILLDCGEDNVCKPKLEVSVNSDQKKIYIGDDNPLTLTVKAQNQGEGAYEAELIVSIPPQADFIGVVRNNEALARLSCAFKTENQTRQVVCDLGNPMKAGTQLLAGLRFSVHQQSEMDTSVKFDLKIQSSNSFDNVSPVVSYKVDLAVLAAVEIRGVSSPDHIFLPIPNWEYKENPETEEDVGPIVQHIYELRNNGPSSFSKAILNLQWPYKYNNNTLLYILHYDIDGPMNCTADTEINPLRIKTPEKNDTAAAGQGERNHLITKRDLTLREGDVHTLGCGIAKCLQITCQVGRLDRGKSAILYVKSLLWTETFMNKENQNHSYSLKSSASFNIIEFPYKNLPIEDLFNSTLVTTNITWGIQPAPMPVPVWVIILAVLAGLLLLAVLVFVMYRMGFFKRVRPPQEEQEREQLQPHENGEGNSET Типовая аминокислотная последовательность подъединицы бета 8 (ITGB8) интегрина мыши 80 MCGSALAFLTAALLSLHNCQRGPALVLGAAWVFSLVLGLGQSEHNRCGSANVVSCARCLQLGPECGWCVQEDFVSGGSGSERCDTVSSLISKGCPVDSIEYLSVHVVTSSENEINTQVTPGEVSVQLHPGAEANFMLKVRPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSKKMALYSRDFRLGFGSYVDKTVSPYISIHPERIHNQCSDYNLDCMPPHGYIHVLSLTENITEFEKAVHRQKISGNIDTPEGGFDAMLQAAVCESHIGWRKEAKRLLLVMTDQTSHLALDSKLAGIVVPNDGNCHLKNNVYVKSTTMEHPSLGQLSEKLIDNNINVIFAVQGKQFHWYKDLLPLLPGAIAGEIESKAANLNNLVVEAYKKIISEVKVQLENQVHGVHFNITAICPDGARKPGISGCGNVTSNDEVLFNVTVVMKTCDIMGGKNYAIIKPIGFNETTKVHIHRSCSCQCENHRGLKGQCAEAAPDPKCPQCDDSRCHFDEDQFPSETCKPQEDQPVCSGRGVCICGKCLCHKTKLGRVYGQYCEKDDFSCPYLHGDVCAGHGECEGGRCQCFSGWEGDRCQCPSASAQHCVNSKGQVCSGRGTCVCGRCECTDPRSIGRLCEHCPTCHLSCSENWNCLQCLHPHNLSQAALDQCKSSCAVMEQHRMDQTSECLSGPSYLRIFFIIFIVTFLIGLLKVLIIRQVILQWNNNKIKSSSDYRMSASKKDKLILQSVCTRAVTYRREKPEEIKMDISKLNAQEAFRCNF Типовая аминокислотная последовательность подъединицы альфа-V (ITGAV) интегрина яванского макака 84 maspprrrlrlgprglplllsglllplcrafnldvdspaeysgpegsyfgfavdffvpsassrmfllvgapkanttqpgiveggqvlkcdwsstrrcqpiefdatgnrdyakddplefkshqwfgasvrskqdkilacaplyhwrtelkqerepvgtcflqdgtktveyapcrsqdidadgqgfcqggfsidftkadrvllggpgsfywqgqlisdqvaeivskydpnvysikynnqlatrtaqaifddsylgysvavgdfngdgiddfvsgvpraartlgmvyiydgknmssiynftgdqmaayfgfsvaatdingddyadvfigaplfmdrgsdgklqevgqvsvslqrasgdfqttklngfevfarfgsaiaplgdldqdgfndiaiaapyggedkkgivyifngrstglnavpsqilegqwaarsmppsfgysmkgatdidkngypdlivgafgvdrailyrarpvitvnaglevypsilnqdnktcslpgtalkvscfnvrfclkadgkgvlprklnfqvellldklkqkgairralflysrspshsknmtisrgglmqceeliaylrdesefrdkltpitifmeywldyrtaadttglqpilnqftpanisrqahilldcgednvckpklevfvdsdqkkiyigddnpltlivkaqnqgegayeaelivsiplqadfigvvrnsealarlscafktenqtrqvvcdlgnpmkagtqllaglrfsvhqqsemdtsvkfdlqiqssnlfdkvspvvshkvdlavlaaveirgvsspdhiflpipnwehkenpeteedvgpvvqhiyelrnngpssfskamlhlqwpykynnntllyilhydidgpmnctsdmeinplrikisslqatekndtvagqgerdhlitkrdlalsegdihtlgcgvaqclkivcqvgrldrgksailyvksllwtetfmnkenqnhsyslkssasfnviefpyknlpieditnstlvttnvtwgiqpapmpvpvwviilavlagllllavlvfvmyrmgffkrvrppqeeqereqlqphengegnset Типовая аминокислотная последовательность подъединицы бета 8 (ITGB8) интегрина яванского макака 85 mcgsalafftaafvclqndrrgpasflwaawvlslvlglgqgednicassnaascarclalgpecgwcvqedfisggsrsercdivsnliskgcsvdsieypsvhviipteneintqvtpgevsiqlrpgaeanfmlkihplkkypvdlyylvdvsasmhnnieklnsvgndlsrkmaffsrdfrlgfgsyvdktvspyisihperihnqcsdynldcmpphgyihvlsltenitefekavhrqkisgnidtpeggfdamlqaavceshigwrkeakrlllvmtdqtshlaldsklagivvpndgnchlknnvyvksttmehpslgqlseklidnninvifavqgkqfhwykdllpllpgtiageieskaanlnnlvveayqklisevkvhvenqvqgvyfnitaicpdgsrkpgmegcrnvtsnhevlfnvtvtmkkcdvtggknyaiikpigfnetakihihrncscqcednrgpkgkcvdetfldskcfqcdenkchfdedqfssesckshkdqpvcsgrgvcvcgkcschkiklgkvygkycekddfscpyhhgnlcaghgeceagrcqcfsgwegdrcqcpsaaaqhcvnskgqvcsgrgtcvcgrcectdprsigrfcehcptchtackenwncvqclhphnlsqaildqcktscalmeqqhyvdqtsecfsspsylriffiifivtfligllkvliirqvilqwnsnkiksssdyrvsaskkdklilqsvctravtyrrekpeeikmdisklnahetfrcnf Типовая Fc IgG1 человека дикого типа (включает часть C_H1 и шарнирную область, C_H2 и C_H3)
Эффекторная функция последовательности LLGG дикого типа выделена курсивом
NST Asn297 N-связанный сайт гликозилирования 81 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Типовая константная область IgG1 человека
Эффекторная функция последовательности LLGG дикого типа выделена курсивом
NST Asn297 N-связанный сайт гликозилирования
Включает концевой лизин 82 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Типовая константная область IgG1 человека без эффекторов 184 astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg Типовая последовательность нуклеиновой кислоты константной области IgG1 человека без эффекторов 192 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCCGGA Типовая константная область IgG1 человека (с концевым лизином) 181 astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgK Типовая последовательность нуклеиновой кислоты константной области IgG1 человека (с концевым лизином) 193 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCCGGAAAA Типовая константная область IgG2 человека 70 astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdkterkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk Типовая каппа константная область легкой цепи (Cκ) человека 83 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Типовая последовательность нуклеиновой кислоты каппа константной области легкой цепи (Cκ) человека 194 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT Типовая константная область тяжелой цепи IgG1 мыши 86 AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPPVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKAFACAVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK Типовая константная область легкой цепи мыши 87 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC adwa_VH_1.1 T28N+F29I 88 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFniKDYYMNWVRQAPGKGLEWVAWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS adwa_VH_1.2
T28N+F29I+R72A 89 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFniKDYYMNWVRQAPGKGLEWVAWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISaDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS adwa_VH_1.3
T28N+F29I+R72A+A49G+L79A 90 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFniKDYYMNWVRQAPGKGLEWVgWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISaDNAKNSaYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS adwa_VH_1.4
T28N+F29I+R72A+N74T+A75S 91 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFniKDYYMNWVRQAPGKGLEWVAWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISaDtsKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS adwa_VL_1.2
L46R+Y36F 92 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWfQQKPGKAPKrLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK VH05-2(F64V)VK01 93 evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdyymnwvrqapgkglewvgwidpdqgntiyepkVqgrftisadtsknsaylqmnslraedtavyycarrllmdywgqgtlvtvss 5662_01 94 EPKFQGRFTISADTS 5662_02 95 TAVYYCARRLLMDYW 5662_03 96 TAVYYSARRLLXDYW 5662_04 97 KSLLHFNGNTYLFWY 5662_05 98 PKRLIYYMSNLASGV 5662_06 99 PKRLIYYXSNLASGV 5662_07 100 LIYYMSNLASGVPSR 5662_08 101 LIYYXSNLASGVPSR 5662_09 102 FATYYCMQSLEYPFT 5662_10 103 FATYYSXQSLEYPFT 5662_11 104 EYPFTFGQGTKVEIK 5662_12 105 EPKVQGRFTISADTS 5662_13 106 KSLSHFNGNTYLFWY 5662_14 107 FATYYCQQSLEYPFT 5662_15 108 FATYYSQQSLEYPFT 5662_16 109 FATYYCMQSYEYPFT 5662_17 110 FATYYSXQSYEYPFT 5662_18 111 EYPFTFGGGTKVEIK 5662_19 112 KRLIYYASNLASGVP 5662_20 113 KRLIYYMSSLASGVP 5662_21 114 KRLIYYXSSLASGVP 5662_22 115 QGDSLRTYYASWYQQ 5662_23 116 VLVIYGKHKRPSGIP 5662_24 117 EADYYCMSRSIWGNP 5662_25 118 EADYYSXSRSIWGNP 5662_26 119 SETLSLTCAVSGYST 5662_27 120 GLEWIGSISHTGNTY 5662_28 121 NPPLKSRVTISVDTS 5662_29 122 DTAVVYCARGGGISR ADWA 11 VK01 123 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ADWA11 VH05 124 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ADWA11 VH05 без концевого лизинового остатка 182 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Шарнирная область IgG1 человека дикого типа 125 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP Эффекторный нулевой (3m, трижды мутантный) вариант шарнирной области IgG1 человека 126 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAP IGHV3-07 (DP-54) тяжелая цепь зародышевого типа 127 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR IGKV1-39 (DPK-9) легкая цепь зародышевого типа 128 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP Синтетический пептид HA полученный из гемагглютинина гриппа A 129 PKYVKQNTLKLAT TET 830 модифицированный/T-хелперный эпитоп из столбнячного токсина 130 AQYIKANSKFIGITEL IMGT - тяжелая цепь 195 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMSWVRQA PGKGLEWVAN IKQDGSEKYY
VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR IMGT - легкая цепь 196 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS ----S-YLNW YQQKPGKAPK LLIYAASSLQ
SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCQQSYSTP

*В некоторых пептидах, метионин замещен норлейцином.

Таблица 14: Типовые CDR тяжелой цепи согласно Kabat

VH (SEQ ID NO) CDR-H1 (SEQ ID NO) CDR-H2 (SEQ ID NO) CDR-H3 (SEQ ID NO) ADWA-11 VH мыши (SEQ ID NO: 20) DYYMN (SEQ ID NO: 22) WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 23) RLLMDY (SEQ ID NO: 24) ADWA11 2.4 VH (SEQ ID NO: 6) dyymn (SEQ ID NO: 8) widpdqgntiyepkfqg (SEQ ID NO: 9) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH1 IGHV1-46(SEQ ID NO: 34) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDQKFQG (SEQ ID NO: 157) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH2 IGHV3-23(SEQ ID NO: 35) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDDSVKG (SEQ ID NO: 158) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH3 IGHV3-30 (SEQ ID NO: 36) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDDSVKG (SEQ ID NO: 158) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH4 IGHV1-69 (SEQ ID NO: 37) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDQKFQG (SEQ ID NO: 157) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5 IGHV3-48 (SEQ ID NO: 38) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDDSVKG (SEQ ID NO: 158) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11 VH05_VK1 (также указанная в настоящем документе как adwa_VH_1,5 T28N+F29I+R72A+A49G+L79A+N74T+A75S) (SEQ ID NO: 39) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 23) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5 D61E (SEQ ID NO: 40) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYEPKFQG (SEQ ID NO: 160) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5 N55Q (SEQ ID NO: 41) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDQGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 161) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5 N28Q (SEQ ID NO: 42) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDQGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 161) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5K30A (SEQ ID NO: 43) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 23) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5 N57Q (SEQ ID NO: 44) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGQTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 162) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5 P62A (SEQ ID NO: 45) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDAKFQG (SEQ ID NO: 163) rllmdy (SEQ ID NO: 10) ADWA11VH5 K63A (SEQ ID NO: 46) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDPAFQG (SEQ ID NO: 165) rllmdy (SEQ ID NO: 10) adwa_VH_1.1 T28N+F29I (SEQ ID NO: 88) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 23) rllmdy (SEQ ID NO: 10) adwa_VH_1.2 T28N+F29I+R72A (SEQ ID NO: 89) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 23) rllmdy (SEQ ID NO: 10) adwa_VH_1.3 T28N+F29I+R72A+A49G+L79A (SEQ ID NO: 90) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 23) rllmdy (SEQ ID NO: 10) adwa_VH_1.4 T28N+F29I+R72A+N74T+A75S (SEQ ID NO: 91) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 23) rllmdy (SEQ ID NO: 10) VH05-2(F64V) VK01 (SEQ ID NO: 93) dyymn (SEQ ID NO: 8) WIDPDQGNTIYEPKVQG (SEQ ID NO: 166) rllmdy (SEQ ID NO: 10)

Таблица 14 демонстрирует типовые CDR тяжелой цепи согласно Kabat.

Таблица 15: Типовые CDR легкой цепи согласно Kabat

VL (SEQ ID NO) CDR-L1 (SEQ ID NO) CDR-L2 (SEQ ID NO) CDR-L3 (SEQ ID NO) ADWA-11 VL мыши (SEQ ID NO: 21) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11 2.4 (SEQ ID NO: 7) rstkslshfngntylf (SEQ ID NO: 11) Yymsslas (SEQ ID NO: 12) qqsleypft (SEQ ID NO: 13) ADWA11_VK01 (1) (также указанная в настоящем документе как adwa_VL_1.1 L46R)(SEQ ID NO: 47) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_1a (1) L29I (SEQ ID NO: 48) RSTKSILHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 138) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_1b (1) L30S (SEQ ID NO: 49) rstkslshfngntylf (SEQ ID NO: 11) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_1c (1) T36S (SEQ ID NO: 50) RSTKSLLHFNGNSYLF (SEQ ID NO: 140) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_2a (1) Y55A (SEQ ID NO: 51) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YAMSNLAS (SEQ ID NO: 142) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_2b (1) M56A (SEQ ID NO: 52) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYASNLAS (SEQ ID NO: 144) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_2c (1) N58S (SEQ ID NO: 53) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) Yymsslas (SEQ ID NO: 12) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_2d (1) A60Q (SEQ ID NO: 54) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLQS (SEQ ID NO: 146) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_3a (1) M94Q (SEQ ID NO: 55) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) qqsleypft (SEQ ID NO: 13) ADWA11_VK01_3b (1) L97Y (SEQ ID NO: 56) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSYEYPFT (SEQ ID NO: 147) ADWA11_VK01_3c (1) E98S (SEQ ID NO: 57) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLSYPFT (SEQ ID NO: 149) ADWA11_VK01_3d (1) Y99T (SEQ ID NO: 58) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLETPFT (SEQ ID NO: 151) ADWA11_VK01_4a (1) F101L (SEQ ID NO: 59) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 153) ADWA11_VK01_4b (1) F101W (SEQ ID NO: 60) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPWT (SEQ ID NO: 155) ADWA11_VK01_4c (1) Q105G (SEQ ID NO: 61) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11VK1 IGKV2-28 (SEQ ID NO: 62) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11VK2 IGKV2-30 (SEQ ID NO: 63) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11VK3 IGKV4-1 (SEQ ID NO: 64) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11VK4 IGKV1-39 (SEQ ID NO: 65) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11VK5 IGKV3-11 (SEQ ID NO: 66) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27) ADWA11_VK01_2.1 (SEQ ID NO: 67) rstkslshfngntylf (SEQ ID NO: 11) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) qqsleypft (SEQ ID NO: 13) ADWA11_VK01_2.2 (SEQ ID NO: 68) rstkslshfngntylf (SEQ ID NO: 11) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSYEYPFT (SEQ ID NO: 147) ADWA11_VK01_2.3 (SEQ ID NO: 69) rstkslshfngntylf (SEQ ID NO: 11) YYASNLAS (SEQ ID NO: 144) qqsleypft (SEQ ID NO: 13) adwa_VL_1.2 L46R+Y36F (SEQ ID NO: 92) RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 25) YYMSNLAS (SEQ ID NO: 26) MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 27)

Таблица 15 демонстрирует типовые CDR легкой цепи согласно Kabat.

Таблица 16: Типовые CDR тяжелой цепи по Чотиа

VH (SEQ ID NO) CDR-H1 (SEQ ID NO) CDR-H2 (SEQ ID NO) CDR-H3 (SEQ ID NO) ADWA-11 VH мыши (SEQ ID NO: 20) GFNIKDYYMN (SEQ ID NO: 28) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) RLLMDY (SEQ ID NO: 30) ADWA11 2.4 VH (SEQ ID NO: 6) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) widpdqgn (SEQ ID NO: 15) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH1 IGHV1-46(SEQ ID NO: 34) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH2 IGHV3-23 (SEQ ID NO: 35) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH3 IGHV3-30 (SEQ ID NO: 36) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH4 IGHV1-69(SEQ ID NO: 37) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5 IGHV3-48 (SEQ ID NO: 38) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11 VH05_VK1 (также указанная в настоящем документе как adwa_VH_1,5 T28N+F29I+R72A+A49G+L79A+N74T+A75S) (SEQ ID NO: 39) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5 D61E (SEQ ID NO: 40) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5 N55Q (SEQ ID NO: 41) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) widpdqgn (SEQ ID NO: 15) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5 N28Q (SEQ ID NO: 42) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) widpdqgn (SEQ ID NO: 15) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5K30A (SEQ ID NO: 43) GFNIADYYMN (SEQ ID NO: 159) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5 N57Q (SEQ ID NO: 44) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGQ (SEQ ID NO: 164) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5 P62A (SEQ ID NO: 45) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) ADWA11VH5 K63A (SEQ ID NO: 46) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) adwa_VH_1.1 T28N+F29I (SEQ ID NO: 88) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) adwa_VH_1.2 T28N+F29I+R72A (SEQ ID NO: 89) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) adwa_VH_1.3 T28N+F29I+R72A+A49G+L79A (SEQ ID NO: 90) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) adwa_VH_1.4 T28N+F29I+R72A+N74T+A75S (SEQ ID NO: 91) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) WIDPDNGN (SEQ ID NO: 29) rllmdy (SEQ ID NO: 16) VH05-2(F64V) VK01 (SEQ ID NO: 93) gfnikdyymn (SEQ ID NO: 14) widpdqgn (SEQ ID NO: 15) rllmdy (SEQ ID NO: 16)

Таблица 16 демонстрирует типовые CDR тяжелой цепи по Чотиа.

Таблица 17: Типовые CDR легкой цепи по Чотиа

VL (SEQ ID NO) CDR-L1 (SEQ ID NO) CDR-L2 (SEQ ID NO) CDR-L3 (SEQ ID NO) ADWA-11 VL мыши (SEQ ID NO: 21) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) QSLEYPFT (SEQ ID NO: 33) ADWA11 2.4 (SEQ ID NO: 7) STKSLSHFNGNTYL (SEQ ID NO: 17) yymss(SEQ ID NO: 18) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01 (1) (также указанная в настоящем документе как adwa_VL_1.1 L46R) (47) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_1a (1) L29I (SEQ ID NO: 48) STKSILHFNGNTYL (SEQ ID NO: 139) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_1b (1) L30S (SEQ ID NO: 49) STKSLSHFNGNTYL (SEQ ID NO: 17) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_1c (1) T36S (SEQ ID NO: 50) STKSLLHFNGNSYL (SEQ ID NO: 141) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_2a (1) Y55A (SEQ ID NO: 51) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YAMSN (SEQ ID NO: 143) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_2b (1) M56A (SEQ ID NO: 52) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYASN (SEQ ID NO: 145) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_2c (1) N58S (SEQ ID NO: 53) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) yymss(SEQ ID NO: 18) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_2d (1) A60Q (SEQ ID NO: 54) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_3a (1) M94Q (SEQ ID NO: 55) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_3b (1) L97Y (SEQ ID NO: 56) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) QSYEYPFT (SEQ ID NO: 148) ADWA11_VK01_3c (1) E98S (SEQ ID NO: 57) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) QSLSYPFT (SEQ ID NO: 150) ADWA11_VK01_3d (1) Y99T (SEQ ID NO: 58) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) QSLETPFT (SEQ ID NO: 152) ADWA11_VK01_4a (1) F101L (SEQ ID NO: 59) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) QSLEYPLT (SEQ ID NO: 154) ADWA11_VK01_4b (1) F101W (SEQ ID NO: 60) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) QSLEYPWT (SEQ ID NO: 156) ADWA11_VK01_4c (1) Q105G (SEQ ID NO: 61) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11VK1 IGKV2-28 (SEQ ID NO: 62) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11VK2 IGKV2-30 (SEQ ID NO: 63) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11VK3 IGKV4-1 (SEQ ID NO: 64) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11VK4 IGKV1-39 (SEQ ID NO: 65) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11VK5 IGKV3-11 (SEQ ID NO: 66) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_2.1 (SEQ ID NO: 67) STKSLSHFNGNTYL (SEQ ID NO: 17) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19) ADWA11_VK01_2.2 (SEQ ID NO: 68) STKSLSHFNGNTYL (SEQ ID NO: 17) YYMSN (SEQ ID NO: 32) QSYEYPFT (SEQ ID NO: 148) ADWA11_VK01_2.3 (SEQ ID NO: 69) STKSLSHFNGNTYL (SEQ ID NO: 17) YYASN (SEQ ID NO: 145) qsleypft (SEQ ID NO: 19) adwa_VL_1.2 L46R+Y36F (SEQ ID NO: 92) STKSLLHFNGNTYL (SEQ ID NO: 31) YYMSN (SEQ ID NO: 32) qsleypft (SEQ ID NO: 19)

Таблица 17 демонстрирует типовые CDR легкой цепи по Чотиа.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 11-13.17-19, 25-27, 31-33 или 71-76.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, дополнительно содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности по меньшей мере одной из SEQ ID NO:8-10, 14-16, 22-24 или 28-30.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности, любой из SEQ ID NO: 34-46, 88-91 или 93.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности, любой из SEQ ID NO: 47-69 или 92 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 124 или SEQ ID NO: 182.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 123 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 124 или SEQ ID NO: 182.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 123 и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 как показано в аминокислотной последовательности, кодированной вставкой плазмиды, депонированной в ATCC имеющей номер доступа PTA-124918.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 как показано в аминокислотной последовательности, кодированной вставкой плазмиды, депонированной в ATCC имеющей номер доступа PTA-124917.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 в аминокислотной последовательности, кодированной вставкой плазмиды, депонированной в ATCC имеющей номер доступа PTA-124918, и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотной последовательности, кодированной вставкой плазмиды, депонированной в ATCC имеющей номер доступа PTA-124917.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельную область легкой цепи содержащую аминокислотную последовательность, кодированную вставкой плазмиды, депонированной в ATCC имеющей номер доступа PTA-124918.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, кодированную вставкой плазмиды, депонированной в ATCC имеющей номер доступа PTA-124917.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15 и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может содержать VH, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 90% идентичную к аминокислотной последовательности, любой из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 и 93 (например, SEQ ID NO: 6). VH может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную к аминокислотной последовательности, любой из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 и 93 (например, SEQ ID NO: 6). VH может содержать аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 и 93 (например, SEQ ID NO: 6).

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может содержать VH, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере, 90% идентичную к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. VH может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. VH может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может содержать VL, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 90% идентичную к аминокислотной последовательности, любой из SEQ ID NO: 7, 47-69 и 92 (например, SEQ ID NO: 7). VL может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную к аминокислотной последовательности, любой из SEQ ID NO: 7, 47-69 и 92 (например, SEQ ID NO: 7). VL может содержать аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 7, 47-69 и 92 (например, SEQ ID NO: 7).

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может содержать VL, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 90% идентичную к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7. VL может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7. VL может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит VL состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

В некоторых аспектах, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, может содержать тяжелую цепь, содержащую VH, содержащую аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 и 93 (например, SEQ ID NO: 6) и дополнительно содержащую IgG1 константный домен (например, IgG1 константный домен, содержащий аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 81, 82, 181 или 184). В некоторых аспектах, вариант антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 консервативных или не консервативных замещений, и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 добавлений и/или делеций в полноразмерной тяжелой цепи. В дополнительном аспекте, вариант имеет по меньшей мере 65% по меньшей мере 75% по меньшей мере 85% по меньшей мере 90% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% или по меньшей мере, 99% идентичность последовательности с полноразмерной тяжелой цепью, и где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывает αvβ8 интегрин.

В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит тяжелую цепь, содержащую VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и дополнительно содержит IgG1 константный домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 181 или SEQ ID NO: 184. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 и дополнительно содержащую IgG1 константный домен, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 181 или SEQ ID NO: 184. В некоторых вариантах осуществления, антитело не имеет эффекторную функцию(и). В дополнительных других вариантах осуществления, молекула антитела имеет константную область тяжелой цепи, выбранную из, например, константной области тяжелых цепей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE; в частности, выбранную из, например, константной области тяжелых цепей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 (например, человека). В другом варианте осуществления, молекула антитела имеет константную область легкой цепи, выбранную из, например, константной области легких цепей каппа (например, кодированной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 83) или лямбда (например, человека). Константная область может быть изменена, например, мутирована для модификации свойств антитела (например, для повышения ли снижения одного или нескольких из: связывания Fc рецептора, гликозилирования антитела, количества цистеиновых остатков, эффекторной клеточной функции и/или комплементной функции). В одном варианте осуществления антитело имеет: эффекторную функцию; и может фиксировать комплемент. В других вариантах осуществления, антитело не имеет; привлекает эффекторные клетки; или фиксирует комплемент. В другом варианте осуществления, антитело имеет пониженную или не имеет способность связывать Fc рецептор. Например, имеется изотип или подтип, фрагмент или другой мутант, который не поддерживает связывание с Fc рецептором, например, оно имеет сутагенизированную или удаленную область связывания Fc рецептора.

Способы изменения константной области антитела известны в данной области техники. Антитела с измененной функцией, например, измененной аффинностью для эффекторного лиганда, такого как FcR на клетке, или C1 компонентом комплемента, могут быть получены замещением по меньшей мере одного аминокислотного остатка в константной области антитела с другим остатком (см., например, EP 388151 A1, Патент США № 5,624,821 и Патент США № 5,648,260, содержание всех которых включено в настоящий документ посредством ссылки). Может быть описан похожий тип изменений, который при применении к иммуноглобулину мыши или других видов, снизит или устранит эти функции.

В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую VL, содержащую аминокислотную последовательность любую из SEQ ID NO: 7, 47-69 и 92 (например, SEQ ID NO: 7) и дополнительно содержит каппа константный домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и дополнительно содержит каппа константный домен, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 83.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь (HC), содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит HC, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HC, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, антитело не имеет эффекторных функций.

В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь (HC), содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HC, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HC, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, антитело не имеет эффекторных функций. В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь (LC), содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит LC, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит LC, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления, антитело не имеет эффекторную функцию.

Замены зародышевого типа

В определенных вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит следующие последовательности CDR тяжелой цепи: (i) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO:22, CDR-H2 содержащую SEQ ID NO:23 и CDR-H3 содержащую SEQ ID NO:24; и/или (ii) следующие последовательности CDR легкой цепи: CDR-L1 содержащую SEQ ID NO:25 или 71, CDR-L2 содержащую SEQ ID NO:26 или 72 и CDR-L3 содержащую SEQ ID NO:27 или 73. В определенных вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит следующие последовательности CDR тяжелой цепи: (i) CDR-H1 содержащую SEQ ID NO:28, CDR-H2 содержащую SEQ ID NO:29 и CDR-H3 содержащую SEQ ID NO:30; и/или (ii) следующие последовательности CDR легкой цепи: CDR-L1 содержащую SEQ ID NO:31 или 74, CDR-L2 содержащую SEQ ID NO:32 или 75 и CDR-L3 содержащую SEQ ID NO:33 или 76. Они являются CDR мыши и, предпочтительно, являются привитыми или другим образом добавленными в контексте VH и VL домена человека. Доступно множество акцепторных последовательностей зародышевого типа человека, и способ «гуманизации» антитела видов, отличных от человека, для применения у человека, хорошо известен в данной области техники и также обсуждается в других местах настоящего документа. Поэтому специалист в данной области техники поймет, что вышеуказанные CDR последовательности мыши могут быть размещены в контексте аминокислотных последовательностей V домена человека. При этом обычно вносятся изменения в акцептор последовательностей зародышевого типа человека, чтобы сохранить связывание антитела и другие желательные характеристики исходного родительского (т.е. донорного) антитела. И CDR и каркасные области (FW) могут быть сконструированы следующим образом.

В определенных вариантах осуществления, не более чем 11 или не более чем 10, не более чем 9, не более чем 8, не более чем 7, не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 замещение сделано в CDR-L1, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, 31, 71 или 74. В определенных вариантах осуществления, не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем одно замещение сделано в CDR-L2, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, 32, 72 или 75. В определенных вариантах осуществления, не более чем 8, не более чем 7, не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем одно замещение сделано в CDR-L3, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, 33, 73, 76. В некоторых вариантах осуществления, не более чем 10, не более чем 9, не более чем 8, не более чем 7, не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 замещение сделано в CDR-H1, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22 или 28. В некоторых вариантах осуществления, не более чем не более чем 17, не более чем 16, не более чем 15, не более чем 14, не более чем 13, не более чем 12, не более чем 11 или не более чем 10, не более чем 9, не более чем 8, не более чем 7, не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 замещение сделано в CDR-H2, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 или 29. В некоторых вариантах осуществления, не более чем 12, не более чем 11 или не более чем 10, не более чем 9, не более чем 8, не более чем 7, не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 замещение сделано в CDR-H3, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 или 30. В определенных вариантах осуществления, замещение(я) не меняют значение аффинности связывания (K_D) более чем 1000-кратно, более чем 100-кратно или 10-кратно. В определенных вариантах осуществления, замещением является консервативное замещение согласно таблице 1.

В определенных вариантах осуществления, замещением является замещение зародышевого типа человека, в котором (донорный) CDR остаток замещен соответствующим (акцепторным) остатком зародышевого типа человека для повышения содержания аминокислот человека и потенциального снижения иммуногенности антитела, как описано в, например, публикации заявки на патент США № 2017/0073395 и Townsend et al., 2015, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 112(50):15354-15359).

Способы и библиотеки для введения остатков зародышевого типа человека в CDR антитела описаны подробно в публикации заявки на патент США № 2017/0073395 и Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359, и оба документа в настоящем документе включены посредством ссылки полностью.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH каркасную область, содержащую VH каркасную последовательность зародышевого типа человека. VH каркасная последовательность может быть из VH3 зародышевого типа человека, VH1 зародышевого типа, VH5 зародышевого типа или VH4 зародышевого типа. Предпочтительными каркасными областями тяжелой цепи зародышевого типа человека являются каркасные области, полученные из VH1, VH3 или VH5 зародышевого типа. Например, могут применяться VH каркасные области следующего зародышевого типа: IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48 (наименования зародышевого типа основаны на IMGT определении зародышевого типа). Предпочтительными каркасными областями легкой цепи зародышевого типа человека являются каркасные области, полученные из Vκ или Vλ зародышевого типа. Например, могут применяться VL каркасные области следующего зародышевого типа: IGKV1-39, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11 (наименования зародышевого типа основаны на IMGT определении зародышевого типа). Альтернативно или в дополнение, каркасной последовательностью может быть консенсусная каркасная последовательность зародышевого типа человека, такая как каркасная область Vλ1 консенсусной последовательности человека, Vκ1 консенсусной последовательности, Vκ2 консенсусной последовательности, Vκ3 консенсусной последовательности , VH3 консенсусной последовательности зародышевого типа, VH1 консенсусной последовательности зародышевого типа, VH5 консенсусной последовательности зародышевого типа или VH4 консенсусной последовательности зародышевого типа. Последовательности каркасной области зародышевого типа человека доступны из разных общественных баз данных, таких как V-base, IMGT, NCBI или Abysis.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VL каркасную область, содержащую VL каркасную последовательность зародышевого типа человека. VL каркасная область может содержать одно или несколько аминокислотных замещений, дополнений или делеций, все еще сохраняя функциональное и структурное сходство с зародышевым типом из которого она получена. В некоторых аспектах, VL каркасная область на по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентична VL каркасной последовательности зародышевого типа человека. В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL каркасную область, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замещений, добавлений или делеций относительно VL каркасной последовательности зародышевого типа человека. В некоторых аспектах, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замещений, добавлений или делеций находятся только в каркасных областях. В некоторых аспектах, % идентичности основан на сходстве с VL за исключением тех частей в настоящем документе, которые определены как CDR.

VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область DPK9 (наименование IMGT: IGKV1-39, например, SEQ ID NO:128). VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область IGKV2-28. VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область DPK18 (наименование IMGT: IGKV2-30). VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область DPK24 (наименование IMGT: IGKV4-1). VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область HK102_V1 (наименование IMGT: IGKV1-5). VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vg_38K (наименование IMGT: IGKV3-11). VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vλ консенсусная последовательность человека. VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vλ1 консенсусная последовательность человека. VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vλ3 консенсусная последовательность человека. VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vκ консенсусная последовательность человека. VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vκ1 консенсусная последовательность человека. VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vκ2 консенсусная последовательность человека. VL каркасной областью зародышевого типа человека может быть каркасная область Vκ3 консенсусная последовательность человека.

В некоторых аспектах, VL каркасной областью является DPK9 (SEQ ID NO: 128). Другие похожие каркасные области также по прогнозам могут доставлять преимущественные антитела по изобретению, содержащие CDR из SEQ ID NO: 11-13 и 17-19; и CDR, характеризующиеся следующими VL аминокислотными последовательностями: 7, 47-69 и 92, включая, например,IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11, которые могут иметь 99, 97, 97, 96, 80, 76, 66, 97, 97, 96, 76 и 74% идентичность, соответственно, к FW области DPK-9 и одно или несколько аминокислотных различий в общих структурных (нумерация согласно Kabat) (A) остатках непосредственно ниже CDR (зона Вернье), L2, L4, L35, L36, L46, L47, L48, L49, L64, L66, L68, L69, L71, (B) VH/VL остатков для упаковки цепей: L36, L38, L44, L46, L87 и (C) канонических CDR остатков структурного каркаса L2, L48, L64, L71 (см. Lo, «Antibody Humanization by CDR Grafting», (2004) Antibody Engineering, Vol. 248, Methods in Molecular Biology pp 135-159 и O'Brien and Jones, «Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting», (2003) Recombinant Antibodies for Cancer Therapy, Vol. 207, Methods in Molecular Biology pp 81-100). Особенно предпочтительными являются каркасные области IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1 или IGKV3-11, имеющие 99, 97, 97, 96, 80, 76, 66% идентичность с DPK9, соответственно, и не имеющие аминокислотных различий в этих общих структурных признаках. В некоторых аспектах, % идентичности основан на сходстве с VL, исключая те части в настоящем документе, которые определены как CDR.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH каркасную область, содержащую VH каркасную последовательность зародышевого типа человека. VH каркасная область может содержать одно или несколько аминокислотных замещений, добавлений или делеций, все еще сохраняя функциональное и структурное сходство с зародышевым типом, из которого они получены. В некоторых аспектах, VH каркасная последовательность имеет по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентичность VH каркасной последовательности зародышевого типа человека. В некоторых аспектах, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH каркасную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замещений, добавлений или делеций относительно VH каркасной последовательности зародышевого типа человека. В некоторых аспектах, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замещений, добавлений или делеций находятся только в каркасных областях. В некоторых аспектах, % идентичности основан на сходстве с VH исключая те части в настоящем документе, которые определены как CDR.

VH каркасной последовательностью зародышевого типа человека может быть, например, каркаснная область IGHV3-07 (также известная как DP-54), IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48. VH каркасной последовательностью зародышевого типа человека может быть каркасная область VH консенсусной последовательности зародышевого типа человека. VH каркасной последовательностью зародышевого типа человека может быть каркасная область VH3 консенсусной последовательности зародышевого типа человека. VH каркасной последовательностью зародышевого типа человека может быть каркасная область VH5 консенсусной последовательности зародышевого типа человека. VH каркасной последовательностью зародышевого типа человека может быть каркасная область VH1 консенсусной последовательности зародышевого типа человека. VH каркасной последовательностью зародышевого типа человека может быть каркасная область VH4 консенсусной последовательности зародышевого типа человека.

В некоторых аспектах, VH каркасной последовательностью является IGHV3-07 (SEQ ID NO: 127). Другие похожие каркасные области также по прогнозам могут доставлять преимущественные антитела по изобретению, содержащие CDR из SEQ ID NO:8-10 и 14-16, и CDR, характеризующиеся следующими VH аминокислотными последовательностями: SEQ ID NO: 6, 34-46, 88-91 и 93, включая IGHV3-07, IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 или IGHV3-48, которые могут иметь 93, 92, 92, 99, 97, 97, 96, 96, 94, 94, 93, 92% идентичность, соответственно, к FW области DP-54, и одно или несколько аминокислотных различий в общих структурных признаках (нумерация согласно Kabat) (A) остатках непосредственно ниже CDR (зона Вернье), H2, H47, H48 и H49, H67, H69, H71, H73, H93, H94, (B) VH/VL остатков для упаковки цепей: H37, H39, H45, H47, H91, H93 и (C) канонических CDR остатков структурного каркаса H24, H71, H94 (см. Lo 2004 и O'Brien and Jones 2003). Типовые каркасные области DP-50, IGHV3-30*09, IGHV3-30*15 имеют 93, 92 и 92% идентичность DP-54, соответственно, и не имеют аминокислотных различий в этих общих структурных признаках. В некоторых аспектах, % идентичности основан на сходстве с VH, исключая те части в настоящем документе, которые определены как CDR.

В определенных вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, содержит (i) VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 75% по меньшей мере 80% по меньшей мере 85% по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и/или (ii) VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 66% по меньшей мере 70% по меньшей мере 75% по меньшей мере 76% по меньшей мере 80% по меньшей мере 85% по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7. Любая комбинация этих VL и VH последовательностей также охватывается изобретением.

В определенных вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, содержит (i) HC, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 75% по меньшей мере 80% по меньшей мере 85% по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3; и/или (ii) LC, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 75% по меньшей мере 80% по меньшей мере 85% по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5. Любая комбинация этих HC и LC последовательностей также охватывается изобретением.

В определенных вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, содержит Fc домен. Fc домен может быть получен из IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgG, IgE или IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄).

В изобретении дополнительно представлено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с αvβ8 интегрином человека с ассоциированным с латентностью пептидом (LAP). Например, если связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с αvβ8 интегрином человека затрудняет последующее связывание LAP с αvβ8 интегрином человека, то антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с LAP за связывание αvβ8 интегрина человека.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, представленные изобретением, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антитела (например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc, и т.д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгатные антитела, одноцепочечные (ScFv), их мутанты, слитые белки, содержащие фрагмент антитела, домен антитела (dAb), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена требуемой специфичности, включая варианты гликозилирования антитела, варианты аминокислотных последовательностей антитела и ковалентно модифицированные антитела. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут происходить от мыши, крысы, человека и любого другого вида (включая химерные или гуманизированные антитела). В некоторых вариантах осуществления, антителом является моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления, антителом является химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В определенных вариантах осуществления, антителом является антитело человека. В определенных вариантах осуществления, антителом является гуманизированное антитело.

Биологическая активность анти- αvβ8 интегрин антитела

В дополнение к связыванию эпитопа на αvβ8 интегрине, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может опосредовать биологическую активность. То есть, изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает αvβ8 интегрин и медиирует по меньшей мере одну определяемую активность, выбранную из следующих:

(i) связывается специфически с αvβ8 интегрином (например, αvβ8 интегрином человека, мыши, яванского макака и/или крысы);

(ii) снижает взаимодействие между αvβ8 интегрином и ассоциированным с латентностью пептидом (LAP);

(iii) снижает TGF-β передачу сигналов;

(iv) эффективно блокирует αvβ8 интегрин-опосредованную активацию TGFβ с IC50 ≤10 нМ;

(v) имеет сравнимую Kd (в пределах 5-кратной) с ортологом примата, отличного от человека (NHP);

(vi) селективно связывает αvβ8 человека и определимо не связывает гомолог αvβ8 (например, αvββ1, αvβ3, αvβ5 и αvβ6);

(vii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животной модели рака, выбранного из плоскоклеточной карциномы, рака груди и рака толстой кишки, отдельно или в комбинации с иммуномодулятором, например, модулятором ингибиторов контрольной точки, например, ингибиторов PD-1, PD-L1, CTLA-4 или агонистом стимулирующей молекулы, 4-1BB;

(viii) вызывает подавление роста и/или полную регрессию опухоли в животной модели рака в сочетании с противораковой терапией, например, радиотерапией;

(ix) демонстрирует по меньшей мере 60% снижение роста опухоли в сингенной модели ксенотрансплантата опухоли, например, при введении в дозе ≤10 мг/кг;

(х) повышает противоопухолевый ответ в присутствии одного или нескольких иммуномодуляторов, например, антагониста ингибитора контрольной точки или агониста активатора контрольной точки, например, антагониста PD-1, PD-L1 или CTLA-4 или активатора иммунного ответа, например, 4-1BB агониста, при введении субъекту, например, мыши или человеку;

(xi) обладает эффективностью, которая не зависит от экспрессии αvβ8 интегрина в модели опухоли;

(xii) повышает численность CD8+ GzmB+ T клетки в микросреде опухоли, например, в виде монотерапии;

(xiii) показывает снижение, например по меньшей мере >80% снижение роста опухоли при применении в комбинации с антагонистом ингибитора контрольной точки (например, анти-PD-1 или анти-PD-L1 антителом), например, в сингенной модели плоскоклеточной карциномы, рака груди и/или рака толстой кишки;

(xiv) показывает статистически значимое улучшение общей выживаемости у субъекта, например, человека или мыши, по данным анализа Каплана-Мейера;

(xv) показывает подходящие свойства состава, включая высокую степень термостабильности и минимальную агрегацию при высоких концентрациях; или

(xvi) может показывать воспроизводимую экспрессию и чистоту в условиях промышленного производства.

В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент имеют по меньшей мере одно из следующих свойства:

i. аффинность связывания, выраженную как KD, для αvβ8 интегрина человека, которая меньше чем KD антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 536 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 531, 532, 533, 534 или 535 пМ);

ii. KD для αvβ8 интегрина человека, которая меньше или равна 100 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 пМ), например, для очищенного αvβ8 интегрина человека;

iii. KD для αvβ8 интегрина мыши, которая меньше чем KD антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 489 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 460, 470, 480, 485, 486, 487 или 488 пМ);

iv. KD для αvβ8 интегрина яванского макака, которая меньше чем KD антитела ADWA11 мыши, например, менее чем 507 пМ (например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 370, 400, 450, 500, 501, 502, 503, 504, 505 или 506 пМ);

v. KD для αvβ8 интегрина крысы, которая составляет примерно 160 пМ;

vi. показывает приблизительно эквивалентную аффинность для по меньшей мере двух, трех или всех αvβ8 интегринов человека, яванского макака, мыши и крысы, например, с KD, которая меньше чем 100 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95 пМ), например, определенную с применением анализа аффинности Biacore;

vii. IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации, которая меньше чем антитело ADWA11 мыши, например, менее чем 183 пМ (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 181 или 182 пМ);

viii. IC50 для ингибирования TGFβ трансактивации в U251 клетках примерно 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320 или 340 пМ;

ix. EC50 для U251 клеток примерно 126 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 34 пМ;

х. EC50 для U251 клеток примерно 256 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 115 пМ;

xi. EC50 для C8-S клеток примерно 115 пМ;

xii. EC50 для C8-S клеток примерно 145 пМ со стандартным отклонением плюс/минус 23,7 пМ;

xiii. по меньшей мере, один спрогнозированный фармакокинетический (ФК) параметр человека, выбранный из:

а. клиренса из центральной камеры (CL) примерно 0,12-0,15 мл/ч/кг;

b. межкамерного клиренса распределения (CLF) примерно 0,15-0,51 мл/ч/кг;

с. объема распределения для центральной камеры (V1) примерно 36-39 мл/кг;

d. объема распределения для периферической камеры (V2) примерно 21-33 мл/кг; и/или

е. конечного периода полувыведения (t_1/2) примерно 12-17 дней; или

xiv. не показывает определяемое связывание с Fcγ рецепторами человека или C1q.

В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент связывают αvβ8 интегрин+клетки (например, клетки, экспрессирующие αvβ8 интегрин) с высокой кажущейся аффинностью. Кажущаяся аффинность связывания может быть оценена с применением проточной цитометрии для определения связывания антитела с клетками, экспрессирующими белок-мишень (например, αvβ8 интегрин). Клетки могут быть временно или стабильно трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей αvβ8 интегрин. Альтернативно, клетками могут быть клетки, который в природе экспрессируют αvβ8 интегрин на своей поверхности. Независимо от источников αvβ8 интегрина+клеток, связывание антитела с клетками может быть легко оценено с применением множества способов, известных в данной области техники. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается αvβ8 интегрин человека, αvβ8 интегрин яванского макака, αvβ8 интегрин мыши, αvβ8 интегрин крысы.

Изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает αvβ8 интегрин и антагонизирует активности, опосредованную αvβ8 интегрином (например, TGFβ передачу сигналов, которая может быть опосредована ингибированием взаимодействия αvβ8 интегрина с ассоциированным с латентностью пептидом (LAP)). В данной области техники известно множество анализов для определения ингибирования активности, опосредованной TGFβ передачей сигналов. Одним из таких анализов является анализ трансактивации пути TGFβ. В одном из примеров такого анализа, экспрессия SMAD, который может служить маркером активации TGFβ передачи сигналов и пути, отслеживается с использованием репортера люциферазы. Способность анти-αvβ8 интегрин антитела связывать αvβ8 интегрин и антагонизировать действие TGFβ передачи сигналов (например, ингибированием взаимодействия αvβ8 интегрина с LAP), таким образом, оценивается измерением уровня SMAD, экспрессированного в присутствии или в отсутствии антитела. Предпочтительно, антитело может опосредовать дозозависимое снижение люциферазы с EC50 примерно 1 пМ, примерно 2 пМ, примерно 3 пМ, примерно 4 пМ, примерно 5 пМ, примерно 6 пМ, примерно 7 пМ, примерно 8 пМ, примерно 9 пМ, примерно 10 пМ, примерно 20 пМ, примерно 30 пМ, примерно 40 пМ, примерно 50 пМ, примерно 60 пМ, примерно 70 пМ, примерно 80 пМ, примерно 90 пМ, примерно 100 пМ, примерно 125 пМ, примерно 150 пМ, примерно 175 пМ, примерно 200, пМ, примерно 225 пМ, примерно 250 пМ, примерно 275 пМ, примерно 300 пМ, примерно 400 пМ или примерно 500 пМ (например, EC50 между примерно 1 пМ и примерно 100 пМ, например, EC50 между примерно 1 пМ и примерно 200 пМ, например, EC50 между примерно 1 пМ и примерно 300 пМ, например, EC50 между примерно 1 пМ и примерно 400 пМ, например, EC50 между примерно 1 пМ и примерно 500 пМ). Более предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует TGFβ передачу сигналов (например, TGFβ трансактивацию, например, TGFβ трансактивацию SMAD) с EC50 примерно 100 пМ (например, EC50 между примерно 5 пМ и примерно 175 пМ, например, EC50 между примерно 25 пМ и примерно 175 пМ, например, EC50 примерно 100 пМ, примерно 105 пМ, примерно 110 пМ, примерно 115 пМ, примерно 120 пМ, примерно 125 пМ, примерно 130 пМ, примерно 135 пМ, примерно 140 пМ, примерно 145 пМ, примерно 150 пМ, примерно 155 пМ, примерно 160 пМ, примерно 165 пМ, примерно 170 пМ или примерно 175 пМ). В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует TGFβ передачу сигналов (например, TGFβ трансактивацию, например, TGFβ трансактивацию SMAD) с EC50 менее чем примерно 5 нМ (например, менее чем примерно 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,1, 5,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 нМ). В вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует TGFβ передачу сигналов (например, TGFβ трансактивацию, например, TGFβ трансактивацию SMAD) с EC50 примерно 5 нМ (например, примерно 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,1, 5,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 нМ).

В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего описания ингибирует TGFβ передачу сигналов с EC50 примерно 145 +/- 23,7 пМ. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего описания ингибирует TGFβ передачу сигналов в C8-S с EC50 примерно 145 +/- 23,7 пМ. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего описания ингибирует TGFβ передачу сигналов в C8-S клетках с EC50 от примерно 110 пМ до примерно 180 пМ.

В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего описания ингибирует TGFβ передачу сигналов с EC50 примерно 256 +/- 115 пМ. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего описания ингибирует TGFβ передачу сигналов в U251 клетках с EC50 примерно 256 +/- 115 пМ. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего описания ингибирует TGFβ передачу сигналов в U251 клетках с EC50 от примерно 80 пМ до примерно 400 пМ.

Изобретение охватывает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают αvβ8 интегрин человека, но определяемо не связывают белки αvβ3 интегрина человека, αvβ5 интегрин или αvβ6 интегрин.

III. ЭКСПРЕССИЯ И ПРОДУЦИРОВАНИЕ АНТИ-αvβ8 ИНТЕГРИН АНТИТЕЛА

Нуклеиновые кислоты, кодирующие анти-αvβ8 интегрин антитела

В изобретении также представлены полинуклеотиды, кодирующие любые антитела, включая фрагменты антитела и модифицированные антитела, описанные в настоящем документе. В изобретении также представлен способ получения любых полинуклеотидов, описанных в настоящем документе. Полинуклеотиды могут быть получены и экспрессироваться методами, известными в данной области техники.

Последовательность желаемого антитела, определенного фрагмента антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное антитело или его фрагмент, может быть определена с применением стандартных методик секвенирования. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая желаемое антитело, определенный фрагмент антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть вставлена в разные векторы (такие как векторы клонирования и экспрессиии) для рекомбинантного продуцирования и характеризации. Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь, определенный фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь, определенный фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент легкой цепи, могут быть клонированы в одном и том же векторе или разных векторах.

Полинуклеотид, кодирующий аминокислотные последовательности выше, кодирует аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и, более предпочтительно, идентичную аминокислотной последовательности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента настоящего изобретения, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления, в изобретении представлены полинуклеотиды, кодирующие один или несколько белков, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:2, 3 и 5-76 (например, полинуклеотид, содержащий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, 4, 183, 185, 186, 189, 190 или 191) или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и, более предпочтительно, идентичную SEQ ID NO:2, 3, 5-76, 88-93, 123, 124 и 182.

В изобретении представлены полинуклеотиды, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты представленную в одной или нескольких из SEQ ID NO: 1, 183, 189 или 191 и кодирующие тяжелую цепь антитела или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или идентичную SEQ ID NO: 1, 183, 189 или 191 и кодирующие тяжелую цепь антитела.

В изобретении представлены полинуклеотиды, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты представленную в одной или нескольких из SEQ ID NO: 4 или 185 и кодирующие легкую цепь антитела, или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или идентичную SEQ ID NO: 4 или 185 и кодирующую легкую цепь антитела.

В изобретении представлены полинуклеотиды, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты представленную в SEQ ID NO: 190 и кодирующие вариабельную область тяжелой цепи антитела, или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или идентичную SEQ ID NO: 190 и кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела.

В изобретении представлены полинуклеотиды, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 186, и кодирующие вариабельную область легкой цепи антитела, или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или идентичную SEQ ID NO: 186 и кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела.

В изобретении представлены полинуклеотиды, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 192 или 193 и кодирующие константную область тяжелой цепи антитела, или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или идентичную SEQ ID NO: 192 или 193, и кодирующую константную область тяжелой цепи антитела.

В изобретении представлены полинуклеотиды, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты представленную в SEQ ID NO: 194 и кодирующие константную область легкой цепи антитела, или нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или идентичную SEQ ID NO: 194 и кодирующую константную область легкой цепи антитела.

В изобретении представлен полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:189. В изобретении представлен полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 190. В изобретении представлен полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:185.

В изобретении представлен полинуклеотид, содержащий одну или обе последовательности нуклеиновых кислот ДНК вставки плазмиды, депонированной в ATCC и имеющей № доступа PTA-124917, и/или № доступа PTA-124918.

В изобретении представлен полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты вставки в плазмиде, депонированной в ATCC и имеющей № доступа PTA-124917, и/или № доступа PTA-124918.

В изобретении представлены клетки, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 1, 183 и 4.

В изобретении представлены клетки, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 185, 189 и 190.

В другом аспекте, в изобретении представлены полинуклеотиды и их варианты, кодирующие анти-αvβ8 интегрин антитело (например, анти-αvβ8 интегрин антитело человека), где такие варианты полинуклеотидов имеют по меньшей мере 70% по меньшей мере 75% по меньшей мере 80% по меньшей мере 85% по меньшей мере 87% по меньшей мере 89% по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% или по меньшей мере, 99% идентичность последовательности с любой из определенных последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе. Эти количества не предназначены для ограничения, и шаги между указанными процентами специально рассматриваются как часть по настоящему документу.

В изобретении представлены полипептиды, кодированные молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в настоящем документе.

В одном варианте осуществления, VH и VL домены или их антигенсвязывающие фрагменты или полноразмерные HC или LC, кодированы отдельными полинуклеотидами. Альтернативно, и VH и VL, или их антигенсвязывающий фрагмент, или HC и LC, кодированы одним полинуклеотидом.

Полинуклеотиды, комплементарные любым таким последовательностям, также охватываются настоящим описанием. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными, и могут быть ДНК (геномными, кДНК или синтетическими) или РНК молекулами. РНК молекулы включают гяРНК молекулы, которые содержат интроны и соответствуют ДНК молекуле взаимно-однозначно, и мРНК молекулы, которые не содержат интроны. Дополнительные кодирующие или не кодирующие последовательности могут, но не обязательно, присутствовать в полинуклеотиде настоящего описания, и полинуклеотид может, но не обязательно, быть связанным с другими молекулами и/или материалами подложки.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е., эндогенную последовательность, которая кодирует антитело или его фрагмент) или может содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотида содержат одно или несколько замещений, добавлений, делеций и/или вставок так, что иммунологическая реактивность кодированного полипептида не ослабляется относительно нативной иммунореакционой молекулы. Действие на иммунологическую реактивность кодированного полипептида обычно может быть оценена, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, варианты демонстрируют по меньшей мере примерно 70% идентичность, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере примерно 80% идентичность, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере примерно 90% идентичность и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере примерно 95% идентичность к полинуклеотидной последовательности, которая кодирует нативное антитело или его фрагмент. Эти количества не предназначены для ограничения, и шаги между указанными процентами специфически рассматриваются как часть по настоящему документу.

Две полинуклеотидных или полипептидных последовательности называют «идентичными», если последовательности нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно проводят сравнением последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. «Окно сравнения» при использовании в настоящем документе, относится к сегменту по меньшей мере из примерно 20 непрерывных положений, обычно от 30 до примерно 75 или от 40 до примерно 50, где последовательность может быть сравнена с эталонной последовательностью с тем же количеством непрерывных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено с применением программы MegAlign® в пакете биоинформатики Lasergene® программного обеспечения (DNASTAR®, Inc., Madison, WI), с применением параметров по умолчанию. Эта программа включает несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. и Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. и Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

В некоторых вариантах осуществления, «процент идентичности последовательности» определяют сравнением двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения из по меньшей мере 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е., гэпы) в количестве 20 процентов или менее, обычно от 5 до 15 процентов или от 10 до 12 процентов, по сравнению с эталонными последовательностями (которые не содержат добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывается через определение количества положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки существуют в обеих последовательностях, с получением количества совпадающих положений, и деление количества совпадающих положений на общее количество положенный в эталонной последовательности (т.е., размер окна) и умножение результатов на 100 с получением процента идентичности последовательности.

Варианты могут также или альтернативно быть по существу гомологичными нативному гену или его части или комплементу. Такие варианты полинуклеотидов способны гибридизоваться в умеренно жестких условиях с природной последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарную последовательность).

Подходящие «умеренно жесткие условия» включают предварительное промывание в растворе 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЭДТК (pH 8.0); гибридизацию при 50°C-65°C, 5X SSC, в течение ночи; с последующим промыванием дважды при 65°C в течение 20 минут каждым из 2X, 0,5X и 0,2X SSC, содержащим 0,1% SDS.

При использовании в настоящем документе, «очень жесткие условия» или «условия высокой жесткости» включают такие, где: (1) применяется низкая ионная сила и высокая температура для промывания, например 0,015 M хлорида натрия/0,0015 M цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°C; (2) во время гибридизации применяется денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50% (об./об.) формамида с 0,1% альбумином бычьей сыворотки/0,1% Фиколл/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ натрий-фосфатный буфер при pH 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°C; или (3) применяется 50% формамид, 5X SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5X раствора Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C, с промывками при 42°C в 0,2X SSC (хлорида натрия/цитрата натрия) и 50% формамид при 55°C, с последующей промывкой высокой жесткости, состоящей из 0,1X SSC, содержащего ЭДТК при 55°C. Специалист в данной области техники поймет как скорректировать температуру, ионную силу и т.д. при необходимости, чтобы приспособить такие факторы, как длина зонда и подобные.

Специалистам в данной области будет понятно, что в результате дегенерации генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, как описано в настоящем документе. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидными последовательностями любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые различаются из-за различий в использовании кодонов, специфически рассматриваются в настоящем описании. Кроме того, аллели генов, содержащие полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе, входят в объем настоящего описания. Аллелями являются эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или нескольких мутаций или изменений, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученная мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение баз данных последовательностей).

Полинуклеотиды настоящего описания могут быть получены с использованием химического синтеза, рекомбинантных методов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области и не нуждаются в подробном описании в настоящем документе. Специалист в данной области может использовать последовательности, предоставленные в настоящем документе, и коммерческий синтезатор ДНК для получения желаемой последовательности ДНК.

Для получения полинуклеотидов с использованием рекомбинантных способов, полинуклеотид, содержащий желаемую последовательность, может быть вставлен в подходящий вектор, и вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как дополнительно обсуждается в настоящем документе. Полинуклеотиды могут быть вставлены в клетки-хозяева любыми способами, известными в данной области. Клетки трансформируют введением экзогенного полинуклеотида путем прямого захвата, эндоцитоза, трансфекции, F-спаривания или электропорации. После введения, экзогенный полинуклеотид может сохраняться в клетке в виде не интегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрироваться в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид может быть выделен из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области. См., например, Sambrook et al., 1989.

Альтернативно, ПЦР позволяет репродуцировать ДНК последовательности. Технология ПЦР хорошо известна в данной области техники и описан в патентах США №№ 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 и 4,683,202, а так же в PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

РНК может быть получена с применением выделенной ДНК в соответствующем векторе и вставкой ее в подходящую клетку-хозяина. Когда клетка реплицируется и ДНК транскрибируется в РНК, эта РНК затем может быть выделена с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, представленных в Sambrook et al., 1989, например.

В некоторых вариантах осуществления, первый вектор содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и второй вектор содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления, первый вектор и второй вектор трансфицируются в клетки-хозяева в одинаковых количествах (таких как одинаковые молярные количества или одинаковые массовые количества). В некоторых вариантах осуществления, молярное или массовое соотношение от 5:1 до 1:5 первого вектора и второго вектора трансфицируют в клетки-хозяева. В некоторых вариантах осуществления, используют массовое отношение от 1:1 до 1:5 для вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления, используют массовое отношение 1:2 для вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь.

Векторы

В некоторых вариантах осуществления, выбирают вектор, который оптимизирован для экспрессии полипептидов в клетках CHO или происходящих из CHO или в клетках NSO. Примеры таких векторов описаны, например, в Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004).

Подходящие векторы клонирования и экспрессии могут включать множество компонентов, таких как промотор, энхансер и другие транскрипционные регуляторные последовательности. Вектор также может быть сконструирован так, чтобы позволить последующее клонирование вариабельного домена антитела в различные векторы. Подходящие векторы клонирования могут быть сконструированы в соответствии со стандартными методами, или могут быть выбраны из большого количества векторов клонирования, доступных в данной области. Хотя выбранный вектор клонирования может варьироваться в зависимости от клетки-хозяина, которую предполагается использовать, полезные векторы клонирования, как правило, будут обладать способностью к саморепликации, могут иметь единственную мишень для конкретной рестрикционной эндонуклеазы и/или могут нести гены маркера, который может быть использован при выборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и его производные, mp18, mp19, pBR322, пМB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и шаттл-вектор, такой как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие векторы клонирования доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen. Дополнительно представлены векторы экспрессии. Векторы экспрессии обычно представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, которые содержат полинуклеотид в соответствии с описанием. Подразумевается, что вектор экспрессии должен реплицироваться в клетках-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде неотъемлемой части хромосомной ДНК. Подходящие векторы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и вектор(ы) экспрессии, раскрытые в публикации РСТ № WO 87/04462. Компоненты вектора могут, как правило, включать, но не ограничиваются ими, один или несколько из следующих: сигнальная последовательность; точка начала репликации; один или несколько маркерных генов; подходящие элементы, контролирующие транскрипцию (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е. трансляции) также обычно требуются один или несколько элементов, контролирующих трансляцию, такие как сайты связывания рибосом, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.

Векторы, содержащие полинуклеотиды, представляющие интерес, и/или сами полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из множества подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус осповакцины). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто зависит от особенностей клетки-хозяина.

Клетки-хозяева

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть получено рекомбинантно с использованием подходящей клетки-хозяина. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть клонирована в вектор экспрессии, который затем может быть введен в клетку-хозяина, такую как клетка E. coli, дрожжевая клетка, клетка насекомого, COS клетка обезьяны, клетка яичника китайского хомяка (СНО) или клетка миеломы, где клетка иначе не продуцирует белок иммуноглобулин, для получения синтеза антитела в рекомбинантной клетке-хозяине. Предпочтительные клетки-хозяева включают клетку CHO, клетку HEK-293 почки эмбриона человека или клетку Sp2.0, среди многих клеток, хорошо известных в данной области. Фрагмент антитела может быть получен протеолитической или другой деградацией полноразмерного антитела, рекомбинантными методами или химическим синтезом. Полипептидный фрагмент антитела, особенно более короткие полипептиды вплоть до примерно 50 аминокислот, удобно получать химическим синтезом. Способы химического синтеза белков и пептидов известны в данной области и коммерчески доступны.

В разных вариантах осуществления, тяжелые цепи анти-αvβ8 интегрина и/или легкие цепи анти-αvβ8 интегрина могут экспрессироваться в прокариотических клетках, таких как бактериальные клетки; или эукариотических клетках, таких как клетки грибов (таких как дродди), клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Такая экспрессия может проводиться, например, согласно методам, известным в данной области техники. Типовые эукариотические клетки, которые могут применяться для экспрессии полипептидов, включают, но не ограничены ими, COS клетки, включая COS 7 клетки; 293 клетки, включая 293-6E клетки; CHO клетки, включая CHO-S, DG44. Lecl3 CHO клетки и FUT8 CHO клетки; PER.C6® клетки (Crucell); и NSO клетки. В некоторых вариантах осуществления, тяжелые цепи анти-αvβ8 интегрина и/или легкие цепи анти-αvβ8 интегрина могут экспрессироваться в дрожжах. См., например, публикацию США № US 2006/0270045 Al. В некоторых вариантах осуществления, конкретную эукариотическую клетку-хозяина выбирают на основе ее способности делать желаемые пост-трансляционные модификации тяжелых цепей анти-αvβ8 интегрина и/или легких цепей анти-αvβ8 интегрина. Например, в некоторых вариантах осуществления, CHO клетки дают полипептиды, которые имеют более высокий уровень сиалилизрования, чем тот же полипептид, продуцированный в 293 клетках.

Введение одной или нескольких нуклеиновых кислот в желаемую клетку-хозяина может быть выполнено любым способом, включая, но не ограничивающегося ими, трансфекцию фосфата кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, трансфекцию, опосредованную катионными липидами, электропорацию, трансдукцию, инфекцию и т. д. Не ограничивающие типовые способы описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Нуклеиновые кислоты могут быть временно или стабильно трансфицированы в желаемых клетках-хозяевах, согласно любому подходящему способу.

Анти-αvβ8 интегрин антитела могут быть очищены любым подходящим способом. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, использование матриц аффинности или хроматографии с гидрофобным взаимодействием. Подходящие аффинные лиганды включают лиганды, которые связывают константные области антитела. Например, аффинная колонка с белком A, белком G, белком A/G или антителом может применяться для связывания константной области и для очистки анти-αvβ8 интегрин антитела. Хроматографии с гидрофобным взаимодействием, например, бутиловая или фениловая колонка, также может подходить для очистки некоторых полипептидов. Многие способы очистки полипептидов известны в данной области.

В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело получают в бесклеточной системе. Не ограничивающие типовые бесклеточные системы описаны, например, в Sitaraman et al., Methods Mol.Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol.Adv. 21: 695-713 (2003).

IV. ПРИМЕНЕНИЕ И МЕДИЦНСКИЕ ТЕРАПИИ

Терапевтическое применение

В некоторых аспектах, в изобретении представлены терапевтические способы для ингибирования активности αvβ8 интегрина с использованием анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где терапевтические способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композици, содержащей анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Расстройством, которое лечат, является любое заболевание или состояние, которое улучшается, облегчается, ингибируется или предотвращается путем удаления, ингибирования или снижения активности αvβ8 интегрина или передачи сигналов. В частности, анти-αvβ8 интегрин антитела по изобретению, включая гуманизированные и химерные антитела, можно использовать для профилактики, лечения и/или облегчения заболеваний, расстройств или состояний, вызванных и/или связанных с аберрантной (например, повышенной) активностью αvβ8 интегрина и/или TGFβ передачей сигналов у субъекта (например, в микросреде опухоли субъекта, страдающего раком). В некоторых вариантах осуществления, заболевание, расстройство или состояние включает респираторное состояние (например, астму), фиброз или анемию. В некоторых вариантах осуществления, заболевание, расстройство или состояние поддается лечению или профилактике с помощью вакцины.

В некоторых аспектах, в изобретении представлен способ селективного ингибирования αvβ8-зависимой активации латентного-TGFβ в клетках микросреды опухоли, включая, например, дендритные клетки, Т-регуляторные клетки, опухолеассоциированные макрофаги и/или клетки самой опухоли. Без привязки к какой-либо конкретной теории, более точный и избирательный антагонизм активации TGFβ в иммунной системе и/или микросреде опухоли, опосредованный введением анти-αvβ8 интегрин антитела по изобретению, может способствовать противоопухолевому иммунному ответу у субъекта без нарушения более широких гомеостатических функций TGFβ. Можно ожидать, что такой противоопухолевый иммунный ответ субъекта, который не нарушает более широкие гомеостатические функции TGFβ, обеспечит безопасность и терапевтические преимущества по сравнению с системным ингибированием TGFβ.

Способы, представленные в настоящем документе, также могут применяться для снижения и/или ослабления активности TGFβ (например, опухоль-промотирующей активности TGFβ) у субъекта (например, внутри микросреды опухоли субъекта, страдающего раком). Активность TGFβ, влияющая на ангиогенез, метастазирование, эпителиально-мезенхимальный переход и/или подавление инфильтрирующих иммунных клеток (например, лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, например, Т-клеток, В-клеток, естественные киллеров, макрофагов, нейтрофилов, дендритных клеток, тучных клеток, эозинофилов и базофилов) в микросреде опухоли может быть уменьшена и/или ослаблена введением субъекту терапевтически эффективных количеств анти-αvβ8 интегрин антитела по изобретению (например, субъекту, страдающему раком).

В некоторых случаях, введение анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, страдающему раком, увеличивает количество (например, плотность по данным иммуногистохимического анализа (ИГХ)) инфильтрирующих иммунных клеток, например, общее количество лимфоцитов CD45 и миелоидных клеток, CD3 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD8 Т-клеток и клеток, экспрессирующих GranzymeB (например, активированных CD8 и NK-клеток) в образце опухоли (например, образце солидной опухоли), полученном от субъекта. Увеличение количества (например, плотности) инфильтрирующих иммунных клеток может быть определено, например, иммуногистохимическим (ИГХ) анализом образца опухоли (например, образца солидной опухоли), полученного от субъекта, страдающего раком, по сравнению с количеством (например, плотностью) инфильтрирующих иммунных клеток, полученных из эталонного образца опухоли (например, образца опухоли, полученного от того же субъекта или другого субъекта, страдающего подобным раком, где образец опухоли был взят до введения (например, первого введения или последующего введения) анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента).

В одном аспекте, изобретение относится к лечению субъекта in vivo с использованием анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, так что рост раковых опухолей ингибируется или снижается. В некоторых вариантах осуществления, субъект, получавший лечение in vivo с использованием анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, имеет первичный рак, например местнораспространенный рак. В некоторых вариантах осуществления, субъект, получавший лечение in vivo с использованием анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, имеет рецидивирующий рак, например метастатический рак.

В одном аспекте, изобретение относится к in vivo лечению субъекта, страдающего раком или опухолью, которая экспрессирует αvβ8 интегрин, интегрин β8 (ITGβ8) и/или интегрин αV (ITGαV), с использованием анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления, экспрессия αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина является экспрессией белка. В некоторых вариантах осуществления, экспрессия αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина является экспрессией мРНК. В некоторых вариантах осуществления, экспрессия αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина является повышенное экспрессией относительно уровня экспрессии αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина в нормальной ткани или образце, в контрольной ткани или образце, в ткани или образце до лечения и/или ткани или образце после лечения. В одном варианте осуществления, ткань или образец, используемые для определения относительных уровней экспрессии αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина, могут быть получены от субъекта с раком или опухолью, от другого субъекта, имеющего тот же тип рака или опухоли или другой тип рака или опухоли или от субъекта без рака или опухоли.

В некоторых вариантах осуществления, мРНК экспрессия αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина представляет собой повышенную экспрессию относительно уровня экспрессии в нормальной ткани или образце, в контрольной ткани или образце, в ткани или образце до лечения и/или ткани или образце после лечения. В некоторых вариантах осуществления мРНК экспрессия αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина повышается на примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 100%, примерно 150%, примерно 200%, примерно 300%, примерно 400%, примерно 500% относительно уровня мРНК экспрессии αvβ8, β8 интегрина и/или αV интегрина в нормальной ткани или образце, в контрольной ткани или образце, в ткани или образце до лечения и/или ткани или образце после лечения.

Анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может применяться отдельно (например, в качестве монотерапии) для ингибирования роста раковой опухоли. Альтернативно, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может применяться в сочетании с одним или несколькими из: стандартного лечения (например, для рака или инфекционных расстройств), другого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, иммуномодулятора (например, активатора костимулирующей молекулы или ингибитора ингибирующей молекулы); вакцины, например терапевтической противораковой вакцины; или других форм клеточной иммунотерапии.

Следовательно, в одном варианте осуществления, в изобретении представлен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем документе.

В одном варианте осуществления, способы подходят для лечения рака in vivo. Чтобы добиться повышения иммунитета, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть введен вместе с антигеном, представляющим интерес. Когда анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с одним или несколькими агентами, комбинацию можно вводить в любом порядке или одновременно.

В другом аспекте представлен способ лечения субъекта, например, уменьшения или облегчения состояния, гиперпролиферативного состояния или расстройства (например, рака), например, солидной опухоли, гематологического рака, опухоли мягких тканей или метастатического поражения, у субъекта. Способ включает введение субъекту одного или нескольких анти-αvβ8 интегрин антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, отдельно или в комбинации с другими агентами или терапевтическими методами. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может вводиться в качестве терапии 1-й линии при лечении субъектов, не получавших лечение, или в качестве терапии 2-й линии после рецидива или прогрессирования рака.

Типичные виды рака, рост которых можно лечить, например, уменьшать, с использованием молекул антител, описанных в настоящем документе, включают рак, обычно чувствительный к иммунотерапии. Неограничивающие примеры рака для лечения включают меланому (например, метастатическую злокачественную меланому, кожную меланому кожи), почечно-клеточный рак (RCC) (например, светлоклеточную карциному, папиллярно-клеточную карциному), рак простаты (например, гормонорезистентную аденокарциному простаты), рак груди, рак яичников (например, эпителиальный рак яичников, рак фаллопиевых труб или первичный рак брюшины), рак головы и шеи (например, плоскоклеточную карциному головы и шеи (SCCHN)), рак толстой кишки, рак пищевода (например, аденокарциному и плоскоклеточную карциному), рак желудка (например, аденокарциному желудка и гастроэзофагеального перехода), рак поджелудочной железы (например, протоковую аденокарциному поджелудочной железы), рак желчных протоков (например, холангиокарциному); рак эндометрия (например, карциному тела матки), уротелиальную карциному и рак легких (например, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточный рак). Кроме того, рефрактерные или рецидивирующие злокачественные новообразования можно лечить с применением молекул антител, описанных в настоящем документе.

Примеры других видов рака, которые можно лечить, включают рак костей, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак прямой кишки, анальный рак, рак яичек, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, рак из клеток Меркеля, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, хронический или острый лейкоз, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, детские солидные опухоли, лимфоцитарную лимфому, рак мочевого пузыря, множественную миелому, миелодиспластические синдромы почек или рак уретры, рак почечной лоханки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), первичную лимфому ЦНС, опухолевый ангиогенез, опухоль позвоночника, глиому ствола головного мозга, аденому гипофиза, саркому Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, Т-клеточную лимфому, раки, вызванные экологией, включающие раки, вызванные асбестом (например, мезотелиому) и комбинации указанных видов рака. В некоторых вариантах осуществления, рак выбран из почечно-клеточной карциномы, рака яичников, плоскоклеточной карциномы головы и шеи и рака кожи (например, меланомы, например, распространенной меланомы).

В некоторых случаях рак выбран из группы, состоящей из солидной опухоли, гематологического рака (например, лейкоза, лимфомы, миеломы, например, множественной миеломы) и метастатического поражения. Раком может быть солидная опухоль, например, такая солидная опухоль, как злокачественные новообразования, например, саркомы и карциномы, например, аденокарциномы различных систем органов, например легкого (например, немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ)), груди, яичников, лимфоидная, желудочно-кишечного тракта (например, толстой кишки), анального канала, половых органов и мочеполовых путей (например, почек, уротелия, клеток мочевого пузыря, предстательной железы), глотки, ЦНС (например, головного мозга, нервных или глиальных клеток), головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC)), кожи (например, меланомы, например, распространенной меланомы), поджелудочной железы, толстой кишки, прямой кишки, почки (например, почечно-клеточной карциномы), печени, рака тонкой кишки и рака пищевода, рака эзофагеального перехода, рака щитовидной железы и рака шейки матки. В некоторых случаях, раком может быть лимфопролиферативное заболевание (например, лимфопролиферативное заболевание после трансплантации) или гематологический рак, Т-клеточная лимфома, В-клеточная лимфома, неходжкинская лимфома или лейкоз (например, миелоидный лейкоз или лимфоидный лейкоз). В некоторых случаях, раком является рак на ранней, промежуточной, поздней стадии или метастатический рак. В конкретных случаях, раком является почечно-клеточная карцинома, рак яичников или плоскоклеточная карцинома головы и шеи.

В других вариантах осуществления, раком является гематологическое злокачественное новообразование или рак, включая, но не ограничиваясь ими, лейкоз или лимфому. Например, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно использовать для лечения рака и злокачественных новообразований, включая, но не ограничиваясь ими, острые лейкозы, включая, но не ограничиваясь ими, например, B-клеточный острый лимфоидный лейкоз («BALL»), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз («TALL»), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или несколько хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); дополнительные гематологические раки или гематологические состояния, включая, но не ограничиваясь ими, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, бластное плазмацитоидное дендритное клеточное новообразование, лимфому Беркитта, диффузную B-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT лимфому, мантийноклеточную лимфому, лимфому маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, плазмацитоидное дендритное клеточное новообразование, макроглобулинемию Вальденстрема и «предлейкоз, совокупность которых представляет собой разнообразную коллекцию гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови и подобных.

В одном варианте осуществления, рак выбран из рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) (например, NSCLC с плоскоклеточной и/или не плоскоклеточной гистологией или аденокарциномы NSCLC)), меланомы (например, распространенной меланомы), плоскоклеточного рака кожи (SCC кожи) (например, метастатического SCC кожи), рака почек (например, почечно-клеточной карциномы, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы), рака печени, миеломы (например, множественной миеломы), рака простаты, рака груди (например, рака груди, который не экспрессирует один, два или все из рецептора эстрогена, рецептора прогестерона или Her2/neu, например, трижды отрицательного рака груди), колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), рака анального канала, рака гастроэзофагеального перехода, рака щитовидной железы, рака шейки матки, лимфопролиферативного заболевания (например, лимфопролиферативного заболевания после трансплантации) или гематологического рака, T-клеточной лимфомы, неходжкинской лимфомы или лейкоза (например, миелоидного лейкоза).

В другом варианте осуществления, рак выбирают из карциномы (например, распространенной или метастатической карциномы), меланомы или карциномы легкого, например, немелкоклеточной карциномы легкого.

В одном варианте осуществления, раком является рак легкого, например, немелкоклеточный рак легкого.

В другом варианте осуществления, раком является рак простаты, например, распространенный рак простаты.

В еще одном варианте осуществления, раком является миелома, например, множественная миелома.

В еще одном варианте осуществления, раком является рак почек, например, почечно-клеточная карцинома (RCC) (например, a метастатический RCC или светлоклеточная почечно-клеточная карцинома).

В некоторых вариантах осуществления, раком является рак кожи (например, меланома, например, распространенная меланома, например, кожная плоскоклеточная карцинома, например, метастатическая кожная плоскоклеточная карцинома).

В одном варианте осуществления, раком является меланома, например, распространенная меланома. В одном варианте осуществления, раком является распространенная или неоперабельная меланома, которая не отвечает на другие терапии.

В некоторых вариантах осуществления, раком является рак почек, например, почечно-клеточная карцинома (RCC). В некоторых случаях, раком почек является метастатическая RCC, светлоклеточная почечно-клеточная карцинома (ccRCC)) или не светлоклеточная почечно-клеточная карцинома (ncRCC). В некоторых случаях, если раком является RCC, например, ccRCC, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может вводиться в качестве терапии 1-й линии или 2-й линии.

В некоторых вариантах осуществления, если раком является рак яичников, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по изобретению может вводиться в качестве терапии 2-й линии пациентам, резистентным к платине.

В некоторых вариантах осуществления, раком является резистентный к платине и/или рецидивирующий рак.

Способы и композиции, описанные в настоящем документе, применяют для лечения метастатических поражений, ассоциированных с вышеуказанными раками.

Комбинированные терапии

Опухоли ускользают от иммунного надзора хозяина с помощью большого количества различных механизмов. Многие из этих механизмов могут быть преодолены путем инактивации белков, которые экспрессируются опухолями и являются иммунодепрессивными. К ним относятся, среди прочего, TGF-бета (Kehrl, J. et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. & O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200) и Fas лиганд (Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Антитела или их антигенсвязывающий фрагмент для каждого из этих вещества могут применяться в комбинации с анти-αvβ8 интегрин антителом или их антигенсвязывающим фрагментом, для противодействия влиянию иммунодепрессивного агента и способствования противоопухолевым иммунным ответам хозяина.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут применяться в не конъюгированных формах или конъюгированных со вторым агентом, например, цитотоксическим лекарственным средством, радиоизотопом или белком, например, белковым токсином или вирусным белком. Этот способ включает: введение молекулы антитела, отдельной или конъюгированной с цитотоксическим лекарственным средством, субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Молекулы антител могут использоваться для доставки множества терапевтических агентов, например, цитотоксической группы, например, терапевтического лекарственного средства, радиоизотопа, молекул растительного, грибкового или бактериального происхождения или биологических белков (например, белковых токсинов) или частиц (например, рекомбинантных вирусных частиц, например; через вирусный белок оболочки) или их смесей.

В определенных вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут применяться в комбинации с другими терапиями для получения неожиданного синергетического терапевтическогго эффекта, который может дать эффект, больший чем просто аддитивный эффект добавления двух отдельных терапий. Например, комбинированная терапия может включать композицию настоящего изобретения, составленную совместно с и/или вводимую совместно с одни или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, например, одним или несколько противораковыми агентами, цитотоксическим или цитостатическими агентами, гормональным лечением, вакцинами и/или другими иммунотерапиями. В других вариантах осуществления, молекулы антител вводят в комбинации с другими терапевтическими лечебными средствами, включая хирургию, радиацию, криохирургию и/или термотерапию. Такие синергетические комбинированные терапии могут преимущественно применять более низкие дозы вводимых терапевтических агентов, тем самым избегая возможной токсичности или осложнений, связанных с разными монотерапиями.

В определенных вариантах осуществления, способы и композиции, описанные в настоящем документе, вводят в комбинации с одной или несколькими другими молекулами антитела, химиотерапией, другой противораковой терапией (например, таргетными противораковыми терапиями или онколитическими лекарственными средствами), цитоткосическими агентами, иммунными терапиями (например, цитокинами), хирургическими и/или радиационными терапиями. Типовые цитотоксические агенты, которые могут вводиться в комбинации, включают антимикротубулиновые агенты, ингибиторы топоизомеразы, антиметаболиты, ингибиторы митоза, алкилирующие агенты, антрациклины, алкалоиды барвинка, интеркалирующие агенты, агенты, способные взаимодействовать с путем трансдукции сигнала, агенты, которые способствуют апоптозу, ингибиторы протеасомы и радиацию (например, облучение местное или всего тела).

Альтернативно или в комбинации с вышеуказанными комбинациями, способ и композици, описанные в настоящем документе, могут быть введены в комбинации с одним или более из: иммуномодулятором (например, активатором костимулирующей молекулы или ингибитором ингибирующей молекулы); вакциной, например терапевтической противораковой вакциной; или другими формами клеточной иммунотерапии.

Типовые неограничивающие синергетические комбинации и применение анти-αvβ8 интегрин антител или их антигенсвязывающих фрагментов включают следующее.

В определенных вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с модулятором костимулирующей молекулы или ингибирующей молекулой, например, ко-ингибирующим лигандом или рецептором.

В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с модулятором, например, агонистом костимулирующей молекулы. В одном варианте осуществления, агонист костимулирующей молекулы выбран из агониста (например, агонистического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или растворимого слитого белка) 4-1BB (CD137), OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160 или B7-H3.

В другом варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент применяют в комбинации с иммуномодулятором, например, костимулирующей молекулой, например, агонистом или модулятором, ассоциированным с положительным сигналом, который включает костимулирующий домен 4-1BB (CD137), CD28, CD27, ICOS и GITR.

Типовые GITR модуляторы включают, например, GITR слитые белки и анти-GITR антитела (например, двухвалентные анти-GITR антитела), такие как GITR слитые белки, описанные в Патенте США №: 6,111,090, европейском патенте №: 090505B1, Патенте США №: 8,586,023, PCT публикациях №№: WO 2010/003118 и 2011/090754, или анти-GITR антитело, описанное, например, в Патенте США №: 7,025,962, Европейском патенте №: 1947183B1, Патенте США №: 7,812,135, Патенте США №: 8,388,967, Патент США №: 8,591,886, Европейском патенте №: EP 1866339, PCT Публикации №: WO 2011/028683, PCT Публикации №:WO 2013/039954, PCT Публикации №: WO2005/007190, PCT Публикации №: WO 2007/133822, PCT Публикации №: WO2005/055808, PCT Публикации №: WO 99/40196, PCT Публикации №: WO 2001/03720, PCT Публикации №: WO99/20758, PCT Публикации №: WO2006/083289, PCT Публикации №: WO 2005/115451, Патенте США №: 7,618,632 и PCT Публикации №: WO 2011/051726. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с ингибитором ингибирующей молекулы для молекулы иммунной контрольной точки. Специалистам в данной области будет понятно, что термин «иммунные контрольные точки» означает группу молекул на клеточной поверхности CD4 и CD8 Т-клеток. Эти молекулы могут эффективно служить «тормозами» для подавления или ингибирования противоопухолевого иммунного ответа. Молекулы иммунной контрольной точки включают, но не ограничиваются ими, запрограммированную смерть клетки 1 (PD-1), цитотоксический T-лимфоцмтарный антиген 4 (CTLA-4), B7H1, B7H4, OX-40, CD137, CD40, LAG-3 и TIM-3, которые прямо ингибируют иммунные клетки. Иммунотерапевтические агенты, которые могут действовать как ингибиторы иммунной контрольной точки, применяемые в способах настоящего изобретения, включают, но не ограничены ими, ингибиторы PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CEACAM, и/или TGF бета. Ингибирование ингибиторной молекулы может проводиться через ингибирование на уровне ДНК, РНК или белка. В вариантах осуществления, ингибирующие нуклеиновые кислоты (например, дцРНК, миРНК или кшРНК) могут применяться для ингибирования экспрессии ингибирующей молекулы. В других вариантах осуществления, ингибитором ингибирующего сигнала является полипептид, например, растворимый лиганд или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с ингибирующей молекулой.

В одном варианте осуществления, ингибитором является растворимый лиганд (например, CTLA-4-Ig или TIM-3-Ig) или антитело или фрагмент антитела, которые связываются с PD-1, PD-L1, PD-L2 или CTLA4. Например, молекула анти-PD-1 антитела может вводиться в комбинации с анти-CTLA-4 антителом, например, ипилимумабом, например, для лечения рака (например, рака, выбранного из: меланомы, например, метастатической меланомы; рака легкого, например, немелкоклеточного рака легкого; или рака простаты). Типовые анти-CTLA4 антитела включают тремелимумаб (IgG2 моноклональное антитело доступное от Pfizer, ранее известное как тицилимумаб, CP-675,206); и ипилимумаб (CTLA-4 антитело, также известное как MDX-010, CAS № 477202-00-9). В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после лечения, например, после лечения меланомы, с анти-CTLA4 антителом (например, ипилимумабом) с или без ингибитора BRAF (например, вемурафениба или дабрафениба). Типовые дозы анти-CTLA-4 антитела, например, ипилимумаба, составляют примерно 3 мг/кг.

Другие антитела, которые могут быть использованы для активации иммунного ответа хозяина, могут применяться в комбинации с анти-αvβ8 интегрин антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Они включают молекулы на поверхности дендритных клеток, которые активируют функцию DC и презентирование антигена. Анти-CD40 антитела способны эффективно заменять активность Т-клеточных хелперов. (Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478) и могут применяться в сочетании с анти-αvβ8 интегрин антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Антитела к костимулирующим молекулам T клетки, такие как CTLA-4 (например, Патент США № 5,811,097), OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) и ICOS (Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397: 262-266) также могут вызывать повышенные уровни активации T клетки.

В определенных вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, вводят в комбинации с одним или несколькими ингибиторами PD-1, PD-L1 и/или PD-L2, известными в данной области техники. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят одновременно с ингибитором иммунной контрольной точки (например, анти-PD-1, анти-PD-L1 и/или анти-PD-L2 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом) субъекту, который ранее не получал лечения ингибитором иммунной контрольной точки. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят одновременно с ингибитором иммунной контрольной точки (например, анти-PD-1, анти-PD-L1 и/или анти-PD-L2 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом) субъекту, который ранее получал лечение ингибитором иммунной контрольной точки, и у которого рак или опухоль прогрессирует (например, местно распространяется, метастазирует). В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят раз в две недели (например, каждые 2 недели) 28-дневным курсом, и ингибитор иммунной контрольной точки вводят каждые 4 недели в 1 день каждого 28-дневного курса. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят раз в две недели 28-дневным курсом, и ингибитор иммунной контрольной точки (например, анти-PD-1, анти-PD-L1 и/или анти-PD-L2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) вводят каждые 4 недели в 1 день каждого 28-дневного курса субъекту, который имеет рак или опухоль. В одном варианте осуществления, ингибитором иммунной контрольной точки является анти-PD1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в PCT Публикации № WO2016/092419, (например, RN888, называемый PF-06801591 или сасанлимаб). В одном варианте осуществления, раком или опухолью является плоскоклеточная карцинома, например, плоскоклеточная карцинома головы и шеи (SCCHN), почечно-клеточная карцинома (RCC), рак груди или рак толстой кишки.

Ингибитором PD-1, PD-L1 и/или PD-L2 может быть антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-1 антитело выбрано из MDX-1106, Merck 3475 или CT-011. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антителом является ниволумаб/Opdivo®, пембролизумаб/Keytruda®, спартализумаб, пидилизумаб, тислелизумаб, AMP-224, AMP-514, цемиплимаб или сасанлимаб (RN888, mAb7, PF-06801591). В одном варианте осуществления, анти-PD-L1 антителом является MEDI4736, MPDL3280A (YW243,55.s70), BMS-936559 (MDX-1105), атезолизумаб/Tecentriq®, дурвалумаб/Imfizi® или авелумаб/Bavencio®. В одном варианте осуществления, анти-PD-L1 антитело не является авелумабом. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антитело описано в PCT Публикации № WO2016/092419, включая, но не ограничиваясь ими, mAb7 (также называемое RN888, PF-06801591 или сасанлимаб).

В некоторых вариантах осуществления, PD-1 ингибитором является иммуноадгезин (например, иммуноадгезин, содержащий внеклеточную или PD-1 связывающую часть PD-L1 или PD-L2, слитого с константной областью (например, Fc областью иммуноглобулиновой последовательности). В некоторых вариантах осуществления, PD-1 ингибитором является AMP-224. В некоторых вариантах осуществления, PD-L1 ингибитором является анти-PD-L1 антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-L1 связывающий антагонист выбран из YW243,55.s70 (также известного как MPDL3280A, атезолизумаб), MEDI-4736, MSB-0010718C или MDX-1105. MDX-1105, также известный как BMS-936559, является анти-PD-L1 антителом, описанным в WO2007/005874. Антителом YW243,55.s70, также называемым MPDL3280A (последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи показаны в SEQ ID Nos. 20 и 21, соответственно) является анти-PD-L1, описанное в WO 2010/077634.

MDX-1106, также известный как MDX-1106-04, ONO-4538 или BMS-936558, является анти-PD-1 антителом, описанным в WO2006/121168. Merck 3745, также известный как MK-3475 или SCH-900475, является анти-PD-1 антителом, описанным в WO2009/114335. Пидилизумаб (CT-011; Cure Tech) является гуманизированным IgG1k моноклональным антителом, которое связывается с PD-1. Пидилизумаб и другие гуманизированные анти-PD-1 моноклональные антитела описаны в WO2009/101611. В других вариантах осуществления, анти-PD-1 антителом является пембролизумаб. Пембролизумаб (торговое наименование KEYTRUDA, ранее лабролизумаб, также известный как MK-3475) описан, например, в Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44. AMP-224 (B7-DCIg; амплиммун; например, описан в WO2010/027827 и WO2011/066342) является PD-L2 Fc слитым растворимым рецептором, который блокирует взаимодействие между PD-1 и B7-H1. Другие анти-PD-1 антитела включают AMP-514 (Амплиммун), среди прочих, например, анти-PD-1 антитела, описанные в US 8,609,089, US 2010028330 и/или US 20120114649.

В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-1 антителом является MDX-1106. Альтернативные наименования MDX-1106 включают MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 или ниволумаб. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-1 антителом является ниволумаб (регистрационный номер CAS: 946414-94-4). Ниволумаб (также называемый BMS-936558 или MDX1106; Bristol-Myers Squibb) является полным IgG4 моноклональным антителом человека, которое специфически блокирует PD-1. Ниволумаб (клон 5C4) и другие моноклональные антитела человека, которые специфически связываются с PD-1, описаны в US 8,008,449 и WO2006/121168. Ламбролизумаб (также называемый пембролизумаб или MK03475; Merck) является гуманизированным IgG4 моноклональным антителом, которое связывается с PD-1. Пембролизумаб и другие гуманизированные анти-PD-1 антитела описаны в US 8,354,509 и WO2009/114335. MDPL3280A (Genentech/Roche) является Fc оптимизированным IgG1 моноклональным антителом человека, которое связывается с PD-L1. MDPL3280A (также известный как YW243,55.s70, и другие моноклональные антитела человека к PD-L1 описаны в Патенте США № 7,943,743 и U.S Публикации № 20120039906. Последовательности YW243,55.s70 (вариабельные области тяжелой и легкой цепей показаны в SEQ ID NOs 20 и 21) также представлены в WO2010/077634 и US 8,217.149). MDX-1105 (также называемый BMS-936559) и другие анти-PD-L1 связывающие агенты описаны в WO2007/005874.

В других вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с цитокином, например, интерлейкином-21, интерлейкином-2, интерлейкином-12 или интерлейкином-15. В определенных вариантах осуществления, комбинация анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и цитокина, описанного в настоящем документе, используется для лечения рака, например, рака, описанного в настоящем документе (например, солидной опухоли или меланомы).

Во всех способах, описанных в настоящем документе, анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент может быть комбинирован с другими формами иммунотерапии, такими как лечение цитокинами (например, интерферонами, GM-CSF, G-CSF, IL-2, IL-21) или терапией биспецифическими антителами, которая обеспечивает усиленное презентирование опухолевых антигенов (см., например, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).

Типовые иммуномодуляторы, которые могут применяться в комбинации с анти-αvβ8 интегрин антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, включают, но не ограничиваются ими, например, афутузумаб (доступный от Roche®); пегфилграстим (Neulasta®); леналидомид (CC-5013, Revlimid®); талидомид (Thalomid®), актимид (CC4047); и цитокины, например, IL-21 или IRX-2 (смесь цитокинов человека, включая интерлейкин 1, интерлейкин 2 и интерферон γ, CAS 951209-71-5, доступна от IRX Therapeutics).

В некоторых вариантах осуществления, раком является рак яичников, и анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят комбинации с ингибитором PARP1 (например, олапарибом, рукапарибом, нирапарибом, велипарибом, инипарибом, талазопарибом, 3-аминобензамидом, CEP 9722, E7016, BSI-201, KU-0059436, AG014699, MK-4827 или BGB-290).

В некоторых вариантах осуществления, раком является рак головы и шеи, например, плоскоклеточная карцинома головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят комбинации с радиационной терапией.

Диагностическое применение

Анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению также можно использовать для обнаружения и/или измерения αvβ8 интегрина или клеток, экспрессирующих αvβ8 интегрин, в образце, например, для диагностических целей. Например, анти-αvβ8 интегрин антитело или его фрагмент может применяться для диагностики состояния или заболевания, характеризующегося аберрантной экспрессией (например, сверхэкспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т.д.) αvβ8 интегрина. Типовые диагностические анализы для αvβ8 интегрина могут включать, например, контакт образца, полученного от пациента, с анти-анти-αvβ8 интегрин антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению, где анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент помечен определяемой меткой или молекулой репортера.

В одном аспекте, настоящее изобретение представляет диагностический способ для обнаружения присутствия белка αvβ8 интегрина in vitro (например, в биологическом образце, таком как биопсия ткани, например, из раковой ткани) или in vivo (например, in vivo визуализация у субъекта). Способ включает: (i) контакт образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описанным в настоящем документе, или введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; (необязательно) (ii) контакт с эталонным образцом, например, с контрольным образцом (например, с контрольным биологическим образцом, таким как плазма, ткань, биопсия) или с контрольным субъектом)); и (iii) обнаружение образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и образцом или субъектом или контрольным образцом или субъектом, где изменение, например, статистически значимое изменение, в образовании комплекса в образце или у субъекта относительно контрольного образца или субъекта указывает на присутствие αvβ8 интегрина в образце. Молекула антитела может быть прямо или косвенно помечена определяемым веществом для облегчения обнаружения связанного или несвязанного антитела. Подходящие определяемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы, как описано выше и более подробно описано ниже.

Термин «образец» в отношении образцов, используемых для обнаружения полипептидов, включает, но не ограничен ими, клетки, клеточные лизаты, белки или экстракты мембран клеток, биологические жидкости или образцы тканей.

Образование комплекса между молекулой антитела и αvβ8 интегрином может быть обнаружено путем измерения или визуализации либо связывающей молекулы, связанной с αvβ8 интегрин антигеном, либо не связанной связывающей молекулы. Могут быть использованы обычные способы обнаружения, например, фермент-связанные иммуносорбентные исследования (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимия ткани. В качестве альтернативы мечению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, присутствие αvβ8 интегрина можно проанализировать в образце с помощью конкурентного иммуноанализа с использованием стандартов, меченных определяемым веществом и не меченой молекулой антитела. В этом анализе биологический образец, меченые стандарты и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент объединяют и определяют количество меченого стандарта, связанного с не меченой связывающей молекулой. Количество αvβ8 интегрина в образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта, связанного с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

V. КОМПОЗИЦИИ

В описании также представлены фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество анти-αvβ8 интегрин антитела, описанного в настоящем документе. Примеры таких композиций, а также способы их составления также описаны в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит одно или несколько анти-αvβ8 интегрин антител. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело распознает αvβ8 интегрин (например, αvβ8 интегрин человека, мыши, яванского макака или крысы). В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антителом является гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антителом является химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело содержит константную область, которая способна запускать желаемый иммунный ответ, такой как опосредованный антителом лизис или ADCC.

Композиции, используемые в настоящем описании, могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы в форме лиофилизированных составов или водных растворов.

При использовании в настоящем документе «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемый эксципиент» включает любой материал, который, при объединении с активным ингредиентом, позволяет ингредиенту сохранять биологическую активность и не вступает в реакцию с иммунной системой субъекта. Примеры включают, но не ограничиваются ими, любые стандартные фармацевтические носители, такие как физиологический раствор с фосфатным буфером, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы смачивающих агентов. Предпочтительными разбавителями для аэрозольного или парентерального введения являются физиологический раствор с фосфатным буфером (ФРФБ) или нормальный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, составляются обычными способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing, 2000).

Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в дозировках и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Фармацевтически приемлемые эксципиенты дополнительно описаны в настоящем документе.

Анти-αvβ8 интегрин антитела и их композици могут также использоваться в сочетании с другими агентами, включая дополнительный терапевтический агент (например, ингибитор молекулы иммунной контрольной точки), который служит для повышения и/или дополнения эффективности агентов.

В раскрытии также представлены композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды, кодирующие антитела, по настоящему документу. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит любой или оба полинуклеотида из SEQ ID NO: 1 или 4. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит любой или оба полинуклеотида из SEQ ID NO: 183 или 4. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит любой или оба полинуклеотида из SEQ ID NO: 185 или 189. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит любой или оба полинуклеотида из SEQ ID NO: 185 или 191.

В другом аспекте полинуклеотид может кодировать VH, VL и/или обе VH и VL антитела по настоящему документу. То есть, композиция содержит один полинуклеотид или более одного полинуклеотида, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему документу.

Фармацевтические соединения по настоящему документу могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотно-аддитивные соли включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфорная и подобные, а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и подобные. Основно-аддитивные соли включают соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и подобные, а также из нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и подобные.

Фармацевтическая композиция по настоящему документу также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и подобные; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и подобные; и (3) хелатирующие металл агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и подобные.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтических композициях по настоящему документу, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и подобные) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и сложные органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, применением материалов для покрытия, таких как лецитин, поддерживанием необходимого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ.

Эти композици могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как процедурами стерилизации, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и подобных. Также может быть желательно включить в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и подобные. Кроме того, пролонгированную абсорбцию фармацевтической формы для инъекций можно обеспечить включением агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Фармацевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и подобные) и их подходящие смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет подходящим включение в композицию изотонических агентов, например, сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция композиции для инъекций может быть достигнута включением в композицию агента, замедляющего абсорбцию, например, солей моностеаратов и желатина.

Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем добавления активного соединения в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, если требуется, с последующей стерилизационной микрофильтрацией.

Обычно дисперсии готовят добавлением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желаемого ингредиента из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.

Фармацевтическая композиция по настоящему описанию может быть приготовлена, упакована или продана в составе, подходящем для офтальмологического введения. Такие составы могут, например, быть в форме глазных капель, включая, например, 0,1%-1,0% (масс./масс.) раствор или суспензию активного ингредиента в водном или масляном жидком носителе. Такие капли могут дополнительно содержать буферные агенты, соли или один или несколько других дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем документе. Другие вводимые офтальмологически составы, которые могут применяться, включают такие, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме или в липосомальном препарате.

При использовании в настоящем документе, «дополнительные ингредиенты» включают, но не ограничиваются ими, один или несколько из следующих: эксципиенты; поверхностно-активные агенты; диспергирующие агенты; инертные разбавители; гранулирующие и разрыхляющие агенты; связующие агенты; смазывающие агенты; подсластители; ароматизаторы; красители; консерванты; физиологически разлагаемые композиции, такие как желатин; водные носители и растворители; масляные носители и растворители; суспендирующие агенты; диспергирующие или смачивающие агенты; эмульгаторы, мягчители; буферы; соли; загустители; наполнители; эмульгаторы; антиоксиданты; антибиотики; противогрибковые агенты; стабилизирующие агенты; и фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы. Другие «дополнительные ингредиенты», которые могут быть включены в фармацевтические композиции по настоящему документу, известны в данной области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985), который включен в настоящий документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент составлено во флаконе, содержащем 100 мг анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в 1 мл водного забуференного раствора.

В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во внутривенном составе в виде стерильного водного раствора, содержащего примерно 0,1 мг/мл, примерно 1 мг/мл, примерно 2 мг/мл, примерно 3 мг/мл, примерно 4 мг/мл, 5 мг/мл, или в некоторых вариантах осуществления, примерно 10 мг/мл, или в некоторых вариантах осуществления, примерно 15 мг/мл, или в некоторых вариантах осуществления, примерно 20 мг/мл антитела, или в некоторых вариантах осуществления, примерно 25 мг/мл, или в некоторых вариантах осуществления, примерно 50 мг/мл, или в некоторых вариантах осуществления, примерно 100 мг/мл и 5% декстрозы. В некоторых вариантах осуществления, внутривенным составом является стерильный водный раствор, содержащий от 0,1 мг/мл до 15 мг/мл анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в 5% декстрозе. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент составлено в композицию, содержащую ацетат натрия, полисорбат 80 и хлорид натрия при pH от примерно 5 до 6. В некоторых вариантах осуществления, внутривенным составом является стерильный водный раствор, содержащий 5 или 10 мг/мл антитела, с 20 мМ ацетатом натрия, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 140 мМ хлорида натрия при pH 5,5. Дополнительно, раствор, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может содержать, среди множества других соединений, гистидин, маннит, сахарозу, трегалозу, глицин, поли(этилен)гликоль, ЭДТК, метионин и любую их комбинацию и многие другие соединения, известные в соответствующей области.

В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция настоящего описания содержит следующие компоненты: 50 мг/мл анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему описанию, 20 мМ гистидина, 8,5% сахарозы и 0,02% полисорбата 80, 0,005% ЭДТК при pH 5,8; в другом варианте осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает следующие компоненты: 100 мг/мл анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему описанию, 10 мМ гистидина, 5% сахарозы и 0,01% полисорбата 80 при pH 5,8. Эта композиция может быть представлена в виде жидкого состава или в виде лиофилизированного порошка. При восстановлении до полного объема, композиция сохраняет тот же состав. Альтернативно, порошок может быть восстановлен до половины объема, в этом случае композиция содержит 100 мг анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему описанию, 20 мМ гистидина, 10% сахарозы и 0,02% полисорбата 80 при pH 5,8.

В одном варианте осуществления, часть дозы вводят внутривенным болюсом, и остальную часть вводят инфузией состава антитела. Например, 0,01 мг/кг внутривенную инъекцию анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно вводить в виде болюса, а остальную дозу антитела можно вводить внутривенной инъекцией. Заранее определенную дозу анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно вводить, например, от полутора до двух часов до пяти часов.

Что касается терапевтического агента, если агентом является, например, малая молекула, он может присутствовать в фармацевтической композиции в форме физиологически приемлемого сложного эфира или соли, например, в комбинации с физиологически приемлемым катионом или анионом, как хорошо известно в данной области техники.

Составы фармацевтических композиций, описанные в настоящем документе, могут быть приготовлены любым способом, известным или разработанным в дальнейшем в области фармакологии. В общем, такие способы получения включают стадию объединения активного ингредиента с носителем или одним или несколькими другими необязательными ингредиентами и затем, если необходимо или желательно, формование или упаковку продукта в желаемую форму для однократного или многократного дозирования.

В одном варианте осуществления, композицией по настоящему документу являются апирогенные составы, которые по существу не содержат эндотоксинов и/или родственных пирогенных веществ. Эндотоксины включают токсины, которые находятся внутри микроорганизма и высвобождаются, когда микроорганизмы разрушаются или умирают. Пирогенные вещества также включают вызывающие лихорадку термостабильные вещества (гликопротеины) из внешней мембраны бактерий и других микроорганизмов. Оба эти вещества могут вызвать лихорадку, гипотонию и шок при введении людям. Из-за потенциальных вредных эффектов полезно удалять даже небольшие количества эндотоксинов из растворов фармацевтических лекарственных препаратов, вводимых внутривенно. The Food and Drug Administration («FDA») установило верхний предел в 5 единиц эндотоксина (EU) на дозу на килограмм массы тела за один час для внутривенного введения лекарственного средства (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Когда терапевтические белки вводятся в количествах нескольких сотен или тысяч миллиграммов на килограмм массы тела, полезно удалять даже следовые количества эндотоксина. В одном варианте осуществления, уровни эндотоксина и пирогена в композиции составляют менее чем 10 EU/мг или менее чем 5 EU/мг или менее чем 1 EU/мг или менее чем 0,1 EU/мг или менее чем 0,01 EU/мг или менее чем 0,001 EU/мг. В другом варианте осуществления, ровни эндотоксина и пирогена в композиции составляют менее чем примерно 10 EU/мг или менее чем примерно 5 EU/мг или менее чем примерно 1 EU/мг или менее чем примерно 0,1 EU/мг или менее чем примерно 0,01 EU/мг или менее чем примерно 0,001 EU/мг.

В одном варианте осуществления, описание включает введение композиции, где указанное введение является пероральным, парентеральным, внутримышечным, интраназальным, вагинальным, ректальным, лингвальным, сублингвальным, буккальным, интрабуккальным, внутривенным, кожным, подкожным или трансдермальным.

В другом варианте осуществления описание дополнительно включает введении композиции в комбинации с другими терапиями, такими как хирургия, химиотерапия, гормональная терапия, биологическая терапия, иммунотерапия или радиационная терапия.

VI. ДОЗИРОВАНИЕ/ВВЕДЕНИЕ

Для приготовления фармацевтических или стерильных композиций, включающих анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, антитело смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. Составы терапевтических и диагностических агентов могут быть приготовлены смешиванием с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме, например, лиофилизированных порошков, суспензий, водных растворов, лосьонов или суспензий (см., например, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.).

Выбор схемы введения терапевтического агента зависит от нескольких факторов, включая метаболизм вещества в сыворотке или ткани субъекта, степень симптомов, иммуногенность вещества и доступность клеток-мишеней в биологической матрице. В определенных вариантах осуществления, схема введения максимизирует количество терапевтического препарата, доставляемого пациенту, в соответствии с приемлемым уровнем побочных эффектов. Следовательно, количество доставленного биологического агента частично зависит от конкретного вещества и тяжести состояния, которое лечат. Доступны инструкции по выбору подходящих доз антител, цитокинов и малых молекул (см., например, Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.).1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.; Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

Определение подходящей дозы производится клиницистом, например, с использованием параметров или факторов, известных или предполагаемых в данной области как влияющие на лечение или прогнозируемых как влияющие на лечение. Обычно доза начинается с количества, несколько меньшего, чем оптимальная доза, и затем ее увеличивают небольшими приращениями до тех пор, пока не будет достигнут желаемый или оптимальный эффект относительно любых отрицательных побочных эффектов. Важные диагностические меры включают симптомы, например, воспаление или уровень продуцируемых воспалительных цитокинов.

Фактические уровни дозирования активных ингредиентов в фармацевтических композициях настоящего описания могут варьироваться для получения количества активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, не является токсичным для пациента. Выбранный уровень дозирования будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композицией настоящего описания или их сложного эфира, соли или амида, способа введения, времени введения, скорости выведения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных препаратов, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и анамнеза пациента, которого лечат, и подобных факторов, хорошо известных в области медицины.

Композиции, содержащие анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу могут быть доставлены путем непрерывной инфузии или дозированием с интервалами, например, один день, одна неделя или 1-7 раз в неделю. Дозы могут быть введены внутривенно, подкожно, местно, перорально, назально, ректально, внутримышечно, интрацеребрально или ингаляцией. Конкретным протоколом дозирования является протокол, включающий максимальную дозу или частоту дозирования, который позволяет избежать значительных нежелательных побочных эффектов. Общая еженедельная доза может составлять по меньшей мере 0,05 мкг/кг массы тела по меньшей мере 0,2 мкг/кг по меньшей мере 0,5 мкг/кг по меньшей мере 1 мкг/кг по меньшей мере 10 мкг/кг по меньшей мере 100 мкг/кг по меньшей мере 0,2 мг/кг по меньшей мере 1,0 мг/кг по меньшей мере 2,0 мг/кг по меньшей мере 10 мг/кг по меньшей мере 15 мг/кг по меньшей мере 20 мг/кг по меньшей мере 25 мг/кг или по меньшей мере, 50 мг/кг (см., например, Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al., 2003, Cancer. Immunol. Immunother. 52: 133-144). Доза может составлять по меньшей мере 15 мкг по меньшей мере 20 мкг по меньшей мере 25 мкг по меньшей мере 30 мкг по меньшей мере 35 мкг по меньшей мере 40 мкг по меньшей мере 45 мкг по меньшей мере 50 мкг по меньшей мере 55 мкг по меньшей мере 60 мкг по меньшей мере 65 мкг по меньшей мере 70 мкг по меньшей мере 75 мкг по меньшей мере 80 мкг по меньшей мере 85 мкг по меньшей мере 90 мкг по меньшей мере 95 мкг или по меньшей мере 100 мкг. Количество доз, вводимых субъекту, может составлять по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 или более.

Для анти-αvβ8 интегрин антител или их антигенсвязывающего фрагмента по настоящему документу, доза, вводимая пациенту, может составлять от 0,0001 мг/кг до 100 мг/кг массы тела пациента. Доза может составлять между 0,0001 мг/кг и 20 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 10 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 5 мг/кг, 0,0001 и 2 мг/кг, 0,0001 и 1 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 0,75 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 0,5 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,25 мг/кг, от 0,0001 до 0,15 мг/кг, от 0,0001 до 0,10 мг/кг, от 0,001 до 0,5 мг/кг, от 0,01 до 0,25 мг/кг или от 0,01 до 0,10 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, составляет примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,3 мг/кг, примерно 2 мг/кг или примерно 3,0 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, нуждающемуся в этом, составляет примерно 0,4 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 40 мг/кг или примерно 100 мг/кг массы тела пациента.

В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, нуждающемуся в этом, каждые 14 дней, составляет от примерно 1 мг/кг до примерно 12 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, нуждающемуся в этом, каждые 14 дней, составляет примерно 2 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, нуждающемуся в этом, каждые 14 дней, составляет примерно 7 мг/кг массы тела пациента.

В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, нуждающемуся в этом, каждые 28 дней, составляет от примерно 1 мг/кг до примерно 20 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, нуждающемуся в этом, каждые 28 дней, составляет примерно 4 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления, доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, вводимая пациенту, нуждающемуся в этом, каждые 28 дней, составляет примерно 12 мг/кг массы тела пациента.

Доза анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может быть рассчитана с применением массы тела пациента в килограммах (кг), умноженной на вводимую дозу в мг/кг. Доза антитела по настоящему документу может быть 150 мкг/кг или менее, 125 мкг/кг или менее, 100 мкг/кг или менее, 95 мкг/кг или менее, 90 мкг/кг или менее, 85 мкг/кг или менее, 80 мкг/кг или менее, 75 мкг/кг или менее, 70 мкг/кг или менее, 65 мкг/кг или менее, 60 мкг/кг или менее, 55 мкг/кг или менее, 50 мкг/кг или менее, 45 мкг/кг или менее, 40 мкг/кг или менее, 35 мкг/кг или менее, 30 мкг/кг или менее, 25 мкг/кг или менее, 20 мкг/кг или менее, 15 мкг/кг или менее, 10 мкг/кг или менее, 5 мкг/кг или менее, 2,5 мкг/кг или менее, 2 мкг/кг или менее, 1,5 мкг/кг или менее, 1 мкг/кг или менее, 0,5 мкг/кг или менее или 0,1 мкг/кг или менее массы тела пациента.

Стандартная доза анти-αvβ8 интегрин антител или их антигенсвязывающего фрагмента по настоящему документу может быть от 0,1 мг до 200 мг, от 0,1 мг до 175 мг, от 0,1 мг до 150 мг, от 0,1 мг до 125 мг, от 0,1 мг до 100 мг, от 0,1 мг до 75 мг, от 0,1 мг до 50 мг, от 0,1 мг до 30 мг, от 0,1 мг до 20 мг, от 0,1 мг до 15 мг, от 0,1 мг до 12 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 8 мг, от 0,1 мг до 7 мг, от 0,1 мг до 5 мг, от 0,1 до 2,5 мг, от 0,25 мг до 20 мг, от 0,25 до 15 мг, от 0,25 до 12 мг, от 0,25 до 10 мг, от 0,25 до 8 мг, от 0,25 мг до 7 мг, от 0,25 мг до 5 мг, от 0,5 мг до 2,5 мг, 1 мг до 20 мг, 1 мг до 15 мг, 1 мг до 12 мг, 1 мг до 10 мг, 1 мг до 8 мг, 1 мг до 7 мг, 1 мг до 5 мг или 1 мг до 2,5 мг. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу вводят в стандартной дозе примерно 100 мг, примерно 300 мг, примерно 500 мг, примерно 600 мг, примерно 800 мг, примерно 1200 мг, примерно 1400 мг или примерно 1600 мг.

Дозировка анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающего фрагмента по настоящему документу может достигать сывороточного титра по меньшей мере 0,1 мкг/мл по меньшей мере 0,5 мкг/мл по меньшей мере 1 мкг/мл по меньшей мере 2 мкг/мл по меньшей мере 5 мкг/мл по меньшей мере 6 мкг/мл по меньшей мере 10 мкг/мл по меньшей мере 15 мкг/мл по меньшей мере 20 мкг/мл по меньшей мере 25 мкг/мл по меньшей мере 50 мкг/мл по меньшей мере 100 мкг/мл по меньшей мере 125 мкг/мл по меньшей мере 150 мкг/мл по меньшей мере 175 мкг/мл по меньшей мере 200 мкг/мл по меньшей мере 225 мкг/мл по меньшей мере 250 мкг/мл по меньшей мере 275 мкг/мл по меньшей мере 300 мкг/мл по меньшей мере 325 мкг/мл по меньшей мере 350 мкг/мл по меньшей мере 375 мкг/мл или по меньшей мере, 400 мкг/мл у субъекта. Альтернативно, дозировка антител по настоящему документу может достигать сывороточного титра по меньшей мере 0,1 мкг/мл по меньшей мере 0,5 мкг/мл по меньшей мере 1 мкг/мл по меньшей мере 2 мкг/мл по меньшей мере 5 мкг/мл по меньшей мере 6 мкг/мл по меньшей мере 10 мкг/мл по меньшей мере 15 мкг/мл по меньшей мере 20 мкг/мл по меньшей мере 25 мкг/мл по меньшей мере 50 мкг/мл по меньшей мере 100 мкг/мл по меньшей мере 125 мкг/мл по меньшей мере 150 мкг/мл по меньшей мере 175 мкг/мл по меньшей мере 200 мкг/мл по меньшей мере 225 мкг/мл по меньшей мере 250 мкг/мл по меньшей мере 275 мкг/мл по меньшей мере 300 мкг/мл по меньшей мере 325 мкг/мл по меньшей мере 350 мкг/мл по меньшей мере 375 мкг/мл или по меньшей мере, 400 мкг/мл у субъекта.

Дозы анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающего фрагмента по настоящему документу могут повторяться, и введения могут быть разделены по меньшей мере 1 днем, 2 днями, 3 днями, 5 днями, 10 днями, 15 днями, 30 днями, 45 днями, 2 месяцами, 75 днями, 3 месяцами или по меньшей мере, 6 месяцами.

Эффективное количество для конкретного пациента может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние, которое лечат, общее состояние здоровья пациента, способ и доза введения и тяжесть побочных эффектов (см., например, Maynard, et al., 1996, A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FIa.; Dent, 2001, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ, London, UK).

Путь введения может быть, например, местным или кожным нанесением, инъекцией или инфузией внутривенным, внутрибрюшинным, интрацеребральным, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным, интрацереброспинальным, внутриочаговым путем или системами с замедленным высвобождением или имплантатом (см., например, Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556; Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105; Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; Патенты США №№ 6,350466 и 6,316,024). В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу вводят внутривенно. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу вводят подкожно.

При необходимости, композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Кроме того, также может применяться легочное введение, например, с помощью ингалятора или небулайзера и состава с аэрозольным агентом. См., например, Патенты США №№ 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 и 4,880,078; и PCT публикации №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или композицию по настоящему документу вводят с использованием технологии легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR™ (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

Композиция настоящего описания также может быть введена одним или несколькими способами введения, используя один или несколько из множества способов, известных в данной области. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будет варьироваться в зависимости от желаемых результатов. Выбранные пути введения антитела по настоящему документу включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, инъекцией или инфузией. Парентеральное введение может представлять способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно инъекцией, и включает, без ограничения, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, внутрикапсульное, внутриглазничное, внутрисердечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, транстрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, подкапсулярное, субарахноидальное, интраспинальное, эпидуральное и интрастернальное, инъекцией и инфузией. Альтернативно, композицию по настоящему документу можно вводить не парентеральным путем, таким как местный, эпидермальный или слизистый путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно.

Анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу вводят в виде системы с контролируемым выделением или замедленным выделением, для достижения контролируемого или замедленного выделения может применяться помпа (см., Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:501; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:514).

Полимерные материалы могут применяться для достижения контролируемого или замедленного выделения терапевтических агентов по настоящему документу (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer и Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FL. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61; см. также Levy et al., 1985, Science 11 225:190; During et al., 19Z9, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105); Патент США № 5,679,377; Патент США № 5,916,597; Патент США № 5,912,015; Патент США № 5,989,463; Патент США № 5,128,326; PCT Публикация № WO 99/15154; и PCT Публикация № WO 99/20253. Примеры полимеров, используемых в составах с замедленным высвобождением, включают, но не ограничиваются ими, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловую кислоту), поли(этилен-ко-винилацетат), поли(метакриловую кислоту), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поливиниловый спирт), полиакриламид, полиэтиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимеры полиоактид-со-гликолиды) (PLGA) и полиортоэфиры. В одном варианте осуществления, полимер, используемый в составе с замедленным высвобождением, является инертным, не содержит вымываемых примесей, является стабильным при хранении, стерильным и биоразлагаемым. Система с контролируемым или замедленным высвобождением может быть размещена рядом с профилактической или терапевтической мишенью, что требует лишь части системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Системы с контролируемым выделением обсуждаются в обзоре у Langer, 1990, Science 249:1527-1533. Любая методика, известная специалисту в данной области, может быть использована для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одно или несколько антител по настоящему документу или их конъюгатов. См., например, Патент США № 4,526,938, Публикации международных патентов №№ WO 91/05548, WO 96/20698, Ning et al., 1996, «Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,» Radiotherapy and Oncology 59:179-189, Song et al., 1995, «Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,» PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, «Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,» Pro. Ml. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 и Lam et al., 1997, «Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,» Proc. Ml. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-160, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки полностью.

Если анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, вводят местно, он может быть составлен в форме мази, крема, трансдермального пластыря, лосьона, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии или другой формы, хорошо известной специалисту в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Для нераспыляемых местных дозированных форм обычно используют вязкие или полутвердые или твердые формы, содержащие носитель или один или несколько эксципиентов, совместимых с местным нанесением и имеющих динамическую вязкость, в некоторых случаях, большую, чем у воды. Подходящие составы включают, без ограничения, растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, линименты, бальзамы и подобные, которые, при желании, стерилизуют или смешивают со вспомогательными агентами (например, консервантами, стабилизаторами, смачивающими агентами, буферами или солями) для воздействия на различные свойства, такие как, например, осмотическое давление. Другие подходящие дозированные формы для местного применения включают распыляемые аэрозольные препараты, где активный ингредиент, в некоторых случаях, в комбинации с твердым или жидким инертным носителем, упакован в смеси с летучими веществами под давлением (например, газообразным газом-вытеснителем, таким как фреон) или в мягкой бутылке. При желании, в фармацевтические композиции и дозированные формы также могут быть добавлены увлажнители или смачиватели. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны в данной области.

Если композиции, содержащие анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент, вводят интраназально, они могут быть составлены в виде аэрозоля, спрея, мелкодисперсной смеси или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические агенты для использования в соответствии с настоящим описанием могут быть удобно доставлены в форме аэрозольного спрея из упаковок под давлением или небулайзера с использованием подходящего газа-вытеснителя (например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа). В случае аэрозоля под давлением, дозированная форма может определяться клапаном для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи (состоящие, например, из желатина) для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть составлены так, чтобы содержать порошковую смесь соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.

Способы совместного введения или лечения дополнительным терапевтическим агентом, например молекулой иммунной контрольной точки, цитокином, стероидом, химиотерапевтическим агентом, антибиотиком или радиационной терапией, хорошо известны в данной области (см., например, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.).

Эффективное количество терапевтического агента может уменьшить симптомы по меньшей мере на 10 процентов; по меньшей мере, на 20 процентов; по меньшей мере, примерно 30 процентов; по меньшей мере, 40 процентов или по меньшей мере 50 процентов.

Дополнительные терапии (например, профилактические или терапевтические агенты), которые могут вводиться в комбинации с анти-αvβ8 интегрин антителами или антигенсвязывающими фрагментами по настоящему документу, можно вводить с интервалом менее 5 минут, с интервалом менее чем 30 минут, с интервалом 1 час, с интервалом примерно 1 час, с интервалом от примерно 1 до примерно 2 часов, с интервалом от примерно 2 часов до примерно 3 часов, с интервалом от примерно 3 часов до примерно 4 часов, с интервалом от примерно 4 часов до примерно 5 часов, с интервалом от примерно 5 часов до примерно 6 часов, с интервалом от примерно 6 часов до примерно 7 часов, с интервалом от примерно 7 часов до примерно 8 часов, с интервалом от примерно 8 часов до примерно 9 часов, с интервалом от примерно 9 часов до примерно 10 часов, с интервалом от примерно 10 часов до примерно 11 часов, с интервалом от примерно 11 часов до примерно 12 часов, с интервалом от примерно 12 часов до 18 часов, с интервалом от 18 часов до 24 часов, с интервалом от 24 часов до 36 часов, с интервалом от 36 часов до 48 часов, с интервалом от 48 часов до 52 часов, с интервалом от 52 часов до 60 часов, с интервалом от 60 часов до 72 часов, с интервалом от 72 часов до 84 часов, с интервалом от 84 часов до 96 часов или с интервалом от 96 часов до 120 часов от антител по настоящему документу. Две или несколько терапий могут вводиться в течение одного посещения пациента.

Способы введения молекул антител известны в данной области и описаны ниже. Подходящие дозировки используемых молекул будут зависеть от возраста и массы тела субъекта и конкретного применяемого лекарственного средства. Дозировки и схемы лечения анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, молекулы антитела может определить квалифицированный специалист. В определенных вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят инъекцией (например, подкожно или внутривенно) в дозе примерно от 1 до 30 мг/кг, например, примерно от 5 до 25 мг/кг, примерно от 10 до 20 мг/кг, примерно от 10 до примерно 14 мг/кг, примерно от 5 до 9 мг/кг, примерно 7 мг/кг или примерно 12 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или 10 мг/кг, примерно 11 мг/кг, примерно 12 мг/кг, примерно 13 мг/кг, примерно 14 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 16 мг/кг, примерно 17 мг/кг, примерно 18 мг/кг, примерно 19 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 30 мг/кг или примерно 40 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе примерно 1-5 мг/кг, примерно 5-10 мг/кг или примерно 10-15 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе примерно 0,5-2, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-15, 5-15 или 5-20 мг/кг.

Схема дозирования может варьироваться от, например, одного раза в неделю до одного раза каждые 2, 3, 4, 5 или 6 недель. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе от примерно 10 до 20 мг/кг (например, примерно 7 мг/кг или примерно 12 мг/кг) через неделю (например, каждые две недели или раз в две недели). В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе от примерно 10 до 20 мг/кг (например, примерно 7 мг/кг или примерно 12 мг/кг) один раз в месяц (например, каждые четыре недели). В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или содержащую его фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или содержащую его фармацевтическую композицию вводят подкожно.

В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу вводят внутривенно или подкожно раз в две недели. В одном варианте осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу вводят в стандартной дозе примерно 100 мг, примерно 300 мг, примерно 800 мг, примерно 1200 мг или примерно 1600 мг внутривенно или подкожно раз в две недели. В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят анти-αvβ8 интегрин антитело или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу в стандартной дозе примерно 100 мг, примерно 300 мг, примерно 800 мг, примерно 1200 мг или примерно 1600 мг внутривенно раз в две недели и вводят анти-PD1 ингибитор каждые четыре недели. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD1 ингибитором является антитело вводят подкожно в стандартной дозе 300 мг. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD1 ингибитором является анти-PD1 антитело, описанное в PCT Публикации № WO2016/092419 (например, mAb7, также называемое RN888, PF-06801591 или сасанлимаб).

В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или содержащую его фармацевтическую композицию вводят примерно два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз каждые пять недель, один раз каждые шесть недель, один раз каждые семь недель, один раз каждые восемь недель, один раз каждые девять недель, один раз каждые десять недель, два раза в месяц, один раз в месяц, один раз каждые два месяца, один раз каждые три месяца, один раз каждые четыре месяца, один раз каждые пять месяцев, один раз каждые шесть месяцев, один раз каждые семь месяцев, один раз каждые восемь месяцев, один раз каждые девять месяцев, один раз каждые десять месяцев, один раз каждые одиннадцать месяцев или один раз каждые двенадцать месяцев. В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или содержащую его фармацевтическую композицию вводят каждые две недели, например, вплоть до 12 раз (например, вплоть до 10, 8, 6, 5, 4 или 3 раз). В некоторых вариантах осуществления, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или содержащую его фармацевтическую композицию вводят каждые четыре недели, например, вплоть до 12 раз (например, вплоть до 10, 8, 6, 5, 4 или 3 раза).

В некоторых вариантах осуществления, каждое введение анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит 5-10 мг/кг (например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, каждое введение содержит примерно 7 мг/кг.

В некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят каждые четыре недели, например, вплоть до 6 раз (например, вплоть до 6, 5, 4, 3, 2 или 1 раза).

В других вариантах осуществления, каждое введение анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит 10-15 мг/кг (например, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 мг/кг) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, каждое введение содержит примерно 12 мг/кг.

Анти-αvβ8 антитела или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу и другие терапевтические агенты можно вводить циклически. Циклическая терапия включает в себя введение первой терапии (например, первого профилактического или терапевтического агента) в течение определенного периода времени с последующим введением второй терапии (например, второго профилактического или терапевтического агента) в течение определенного периода времени, необязательно с последующим введением третьей терапии (например, профилактического или терапевтического агента) в течение определенного периода времени и так далее, и повторение этого последовательного введения, т.е. цикла для снижения развития резистентности к одной из терапий, чтобы избежать или уменьшить побочные эффекты одной из терапий, и/или для улучшения эффективности терапий.

В определенных вариантах осуществления анти-αvβ8 антитела или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу могут быть составлены для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (BBB) исключает многие высокогидрофильные соединения. Чтобы гарантировать, что терапевтические соединения по настоящему документу проникают через ВВВ (при желании), они могут быть составлены, например, в липосомах. Способы изготовления липосом представлены, например, в Патентах США 4,522,811; 5,374,548; и 5,399,331. Липосомы могут содержать одну или несколько групп, которые селективно транспортируются в определенные клетки или органы, таким образом улучшая таргетную доставку лекарственного средства (см., например, V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685). Типовые нацеливающие группы включают фолат или биотин (см., например, Патент США 5,416,016); маннозиды (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); антитела (P. G. Bloeman et al., 1995, FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); A рецептор поверхностно-активного белка (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); см. также K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123; Killion; Fidler, 1994; Immunomethods 4:273.

Описание представляет протоколы введения фармацевтической композиции, содержащей анти-αvβ8 антитела или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, отдельно или в комбинации с другими терапиями, субъекту, нуждающемуся в этом. Терапии (например, профилактические или терапевтические агенты) комбинированных терапий настоящего описания могут вводиться субъекту одновременно или последовательно. Терапия (например, профилактические или терапевтические агенты) комбинированных терапий настоящего описания также могут вводиться системно.

Терапевтические агенты (например, профилактические или терапевтические агенты) комбинированной терапии по настоящему документу можно вводить субъекту одновременно. Термин «одновременно» не ограничивается введением терапевтических агентов (например, профилактических или терапевтических агентов) в одно и то же время, а скорее означает, что фармацевтическую композицию, содержащую анти-αvβ8 интегрин антитела или их антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, вводят субъекту последовательно и в пределах такого временного интервала, чтобы антитела по настоящему документу или их конъюгаты могли действовать вместе с другой терапией(ями), чтобы получить увеличенную пользу, чем если бы они вводились иначе. Например, каждая терапия может быть введена субъекту одновременно или последовательно в любом порядке в разные моменты времени; однако, если они не вводятся одновременно, их следует вводить достаточно близко по времени, чтобы обеспечить желаемый терапевтический или профилактический эффект. Каждую терапию можно вводить субъекту отдельно, в любой подходящей форме и любым подходящим путем. В разных вариантах осуществления терапии (например, профилактические или терапевтические агенты) вводят субъекту с интервалом менее чем 15 минут, менее чем 30 минут, с интервалом менее чем 1 час, с интервалом примерно 1 час, с интервалом от примерно 1 часа до примерно 2 часов, с интервалом от примерно 2 часов до примерно 3 часов, с интервалом от примерно 3 часов до примерно 4 часов, с интервалом от примерно 4 часов до примерно 5 часов, с интервалом от примерно 5 часов до примерно 6 часов, с интервалом от примерно 6 часов до примерно 7 часов, с интервалом от примерно 7 часов до примерно 8 часов, с интервалом от примерно 8 часов до примерно 9 часов, с интервалом от примерно 9 часов до примерно 10 часов, с интервалом от примерно 10 часов до примерно 11 часов, с интервалом от примерно 11 часов до примерно 12 часов, с интервалом 24 часа, с интервалом 48 часов, с интервалом 72 часа или с интервалом 1 неделя. В других вариантах осуществления, две или более терапий (например, профилактических или терапевтических агентов) вводят в одно посещение пациента.

Профилактические или терапевтические агенты комбинированных терапий могут быть введены субъекту в одной фармацевтической композици. Альтернативно, профилактические или терапевтические агенты комбинированных терапий могут быть введены субъекту одновременно в отдельных фармацевтических композициях. Профилактические или терапевтические агенты могут вводиться субъекту одним и тем же или разными путями введения.

VII. НАБОРЫ

В описании также представлены наборы, содержащие любое или все антитела, описанные в настоящем документе. Наборы по настоящему документу включают один или несколько контейнеров, содержащих анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, и инструкции по использованию в соответствии с любым из способов по настоящему документу, описанных в настоящем документе. Как правило, эти инструкции содержат описание введения антитела для описанного выше терапевтического лечения. В некоторых вариантах осуществления представлены наборы для изготовления дозы для однократного приема. В определенных вариантах осуществления, набор может содержать как первый контейнер, содержащий высушенный белок, так и второй контейнер, содержащий водный состав. В определенных вариантах осуществления, включены наборы, содержащие аппликатор, например, однокамерные и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).

Инструкции, относящиеся к применению анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обычно включают информацию о дозировке, схеме дозирования и способе введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут быть стандартными дозами, объемными упаковками (например, многодозовыми упаковками) или субъединичными дозами. Инструкции, входящие в комплекты по настоящему документу, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, листе бумаги, вложенном в набор), но также применимы машиночитаемые инструкции (например, инструкции, хранящиеся на магнитном или оптическом запоминающем диске).

Наборы этого раскрытия находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается ими, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и подобные. Также предусмотрены упаковки для использования в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или устройство для инфузии, такое как минипомпа. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом с раствором для внутривенного введения или флаконом, имеющим пробку, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере, одним активным агентом в композиции является анти-αvβ8 интегрин антитело по настоящему документу. Контейнер может дополнительно содержать дополнительный терапевтический агент, как описано в настоящем документе.

Набор может дополнительно содержать по меньшей мере одно анти-PD1 антитело, такое как, но не ограничиваясь ими, ниволумаб, пембролизумаб, спартлизумаб, пидилизумаб, тислелизумаб, цемиплимаб, сасанлимаб (mAb7, RN888, PD-06801591), AMP-224, AMP-514.

Наборы могут необязательно включать дополнительные компоненты, такие как буферы, и разъясняющую информацию. Обычно в набор входит контейнер и этикетка или вкладыш(и) на контейнере или связанные с ним.

В раскрытии также представлены диагностические наборы, содержащие любые или все антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе. Диагностические наборы полезны, например, для обнаружения присутствия αvβ8 интегрина в образце. В некоторых вариантах осуществления, диагностический набор может применяться для идентификации индивидуума с латентным заболеванием, расстройством или состоянием, которое может подвергнуть его риску развития опосредованного αvβ8 интегрином заболевания, расстройства или состояния, или заболевания, расстройства или состояния, связанного с дефицитом αvβ8 интегрина. В некоторых вариантах осуществления, диагностический набор может применятся для обнаружения присутствия и/или уровня αvβ8 интегрина у индивидуума, у которого есть подозрение на опосредованное αvβ8 интегрином заболевание, или заболевание, расстройство или состояние, связанное с дефицитом αvβ8 интегрина.

Диагностические наборы по настоящему документу включают один или несколько контейнеров, содержащих анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, и инструкции по применению в соответствии с любым из способов по настоящему документу, описанным в настоящем документе. Как правило, эти инструкции содержат описание использования анти-αvβ8 интегрин антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для обнаружения присутствия αvβ8 интегрина у индивидуумов, подверженных риску или подозреваемых в наличии опосредованного αvβ8 интегрином заболевания или заболевания, расстройства или состояния, вызванного дефицитом αvβ8 интегрина. В некоторых вариантах осуществления, типовой диагностический набор может быть сконфигурирован таким образом, чтобы содержать реагенты, такие как, например, анти-αvβ8 интегрин антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, образец отрицательного контроля, образец положительного контроля и инструкции по использованию набора.

VIII. ЭКВИВАЛЕНТЫ

Вышеприведенное описание и следующие примеры подробно описывают определенные конкретные варианты осуществления по настоящему документу и описывают лучший режим, предполагаемый изобретателями. Однако следует принимать во внимание, что независимо от того, насколько подробно изложенное выше может быть представлено в тексте, раскрытие может быть реализовано на практике многими способами, и раскрытие следует толковать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

Хотя раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные применения, способы, наборы и композиции, следует понимать, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отступления от идей в настоящем документе и формулы изобретения ниже. Следующие ниже примеры представлены для лучшей иллюстрации раскрытых идей и не предназначены для ограничения объема идей, представленных в настоящем документе. Хотя настоящие идеи были описаны в терминах этих типовых вариантов осуществления, квалифицированный специалист легко поймет, что многочисленные вариации и модификации этих типовых вариантов осуществления возможны без излишнего экспериментирования. Все такие вариации и модификации входят в объем настоящего изобретения.

Все ссылки, процитированные в настоящем документе, включая патенты, заявки на патенты, статьи, учебники и подобные, а также ссылки, процитированные в настоящем документе, в той степени, в которой они еще не включены, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. В случае, если один или несколько включенных литературных и подобных материалов отличаются или противоречат данной заявке, включая, но не ограничиваясь ими, определенные термины, использование терминов, описанные методы и подобные, они контролируются этой заявкой.

IX. ОБЩИЕ МЕТОДЫ

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами синтеза для получения, которые, конечно, могут варьироваться. Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области. Кроме того, если иное не требуется контекстом, термины в единственном числе должны включать множественное число, а термины во множественном числе должны включать единственное число. Обычно номенклатуры, используемые в связи с методами, культурой клеток и тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией и гибридизацией белков и нуклеинов кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны и широко используются в данной области.

В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, обычные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в компетенции специалистов в данной области. Такие методы полностью описаны в литературе, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather и P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths и D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: a practical approach (P. Shepherd и C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Ферментативные реакции и методы очистки выполняются в соответствии со спецификациями производителя, как это обычно делается в данной области техники или как описано в настоящем документе. Номенклатуры, используемые в связи с лабораторными процедурами и методами аналитической химии, биохимии, иммунологии, молекулярной биологии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, хорошо известны и широко используются в данной области. Стандартные методы используются для химического синтеза, химического анализа, фармацевтической подготовки, составления и доставки и лечения пациентов.

X. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ

Типовые материалы настоящего изобретения депонированы в American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA 13 февраля 2018. Вектор ADWA11 VH05-02-VH, имеющий ATCC № доступа PTA-124917, содержит ДНК вставку, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела ADWA11 2.4, также известен как VH05-2_VK01(2.4) и ADWA11 5-2 2.4. Вектор ADWA11 VK2.4-VL, имеющий ATCC № доступа PTA-124918, содержит ДНК вставку, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела ADWA11 2.4, также известен как VH05-2_VK01(2.4) и ADWA11 5-2 2.4.

Депозиты были внесены в соответствии с положениями Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations thereunder (Budapest Treaty). Это гарантирует сохранение жизнеспособной культуры депозита в течение 30 лет с даты депонирования. Депозит будет доступен в ATCC в условиях Budapest Treaty и при условии соглашения между Pfizer Inc. и ATCC, которое гарантирует константную и неограниченную доступность потомства культуры депозита общественности после выдачи соответствующего патенте США или после публикации любой заявки на патент США или иностранного государства, в зависимости от того, что наступит раньше, и гарантирует доступность потомства тому, кто определен U.S. Commissioner of Patents and Trademarks как имеющий право на это 35 U.S.C. Section 122 и соответствующих правил Commissioner (включая 37 C.F.R. Section 1.14 с конкретной ссылкой на 886 OG 638).

Владелец настоящей заявки согласился с тем, что если культура депонированных материалов погибнет, будет потеряна или уничтожена при культивировании в подходящих условиях, материалы будут незамедлительно заменены, по уведомлении, другими такими же. Доступность депонированных материалов не должна толковаться как лицензия на использование изобретения в нарушение прав, предоставленных в соответствии с полномочиями любого правительства в соответствии с его патентным законодательством.

ПРИМЕРЫ

Раскрытие дополнительно подробно описано со ссылкой на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры предоставлены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, раскрытие никоим образом не следует истолковывать как ограниченное следующими примерами, а скорее должно толковаться как охватывающее любые и все вариации, которые становятся очевидными в результате идей, представленных в настоящем документе.

Пример 1: Создание анти-αvβ8 интегрин антител гибридомы мыши

Антитела гибридомы мыши против αvβ8 интегрина человека создают согласно способам, в общем описанным в Патенте США № 9,969,804, который включен сюда посредством ссылки полностью.

Коротко, интегрин β8 нокаутированных мышей, которые были скрещены с неродственными особями CD1, чтобы обеспечить постнатальное выживание, иммунизируют рекомбинантным αvβ8 интегрином человека (R&D Systems, 4135-AV-050) в дозе 50 мкг на мышь каждые две недели до получения приемлемых титров анти-αvβ8 антитела. Сыворотку иммунизированных мышей затем подвергают скриннингу твердофазным анализом для идентификации мышей для создания гибридомы.

Антитела из созданных гибридом затем характеризуют проточной цитометрией с применением клеток SW480, трансфицированных для экспрессии интегрина αvβ8 или αvβ3 или αvβ6 в качестве отрицательных контролей. Клетки Sw480 обычно не экспрессируют какие-либо αv интегрины, за исключением αvβ5. Антитело ADWA-11 гибридомы мыши (также называемое ADWA11) идентифицируют, и подтверждают специфичность этого антитела проточной цитометрией на каждой клеточной линии с применением меченого ADWA-11 или антитела к αvβ5 (Alula) или αvβ3 (Axum-2) или αvβ6 (10D5) (Su et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36:377-386, 2007; Su et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 185: 58-66, 2012; Huang et al., J. Cell Sci. 111 (Pt 15): 2189-2195).

Анализы адгезии клеток также проводят с клетками U251, которые экспрессируют интегрин αvβ8 на чашках, покрытых 1 мкг/мл TGFβ1 ассоциированного с латентностью пептида (Kueng et al., Anal. Biochem. 182: 16-19, 1989). Блокаду активности TGFβ определяют TMLC анализом люциферазы, в котором применяют клетки эпителия легких норки, экспрессирующие TGFβ чувствительную часть PAI-1 промотора, управляющую экспрессией люциферазы светляков (Abe et al., Anal. Biochem. 216:276-284, 1994). На основе скриннинга гибридомы, проведенного в общем как описано в настоящем документе, антитело ADWA-11 гибридомы мыши выбирают для дополнительной оценки.

Пример 2: Гуманизация анти-αvβ8 интегрин антител гибридомы мыши

Антитело ADWA-11 гибридомы мыши, описанное в Патенте США № 9,969,804 и представленною в, например, SEQ ID NO: 20-33 и 71-76 настоящего описания, гуманизируют прививкой CDR последовательностей мыши в различные каркасные области зародышевого типа человека, как перечислено в таблице 1, которые включают каркасные области легкой цепи зародышевого типа IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV4-1, IGKV1-39 (также указанную в настоящем документе как DPK9) и IGKV3-11, а также каркасные области тяжелой цепи зародышевого типа IGHV3-7 (также указанную в настоящем документе как DP54), IGHV1-46, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV1-69 и IGHV3-48 (см., например, IMGT базу данных).

Гуманизированные антитела, названные в настоящем документе «Гуманизированное ADWA-11», включают набор из шести CDR последовательностей мыши, представленных в SEQ ID NO: 20-33 и 71-76, привитых в каркасную область легкой цепи зародышевого типа IGKV1-39 (например, DPK9) и каркасную область тяжелой цепи зародышевого типа IGHV3-7 (например, DP54). Другие варианты каркасных областей зародышевого типа также испытывают, как показано ниже в таблицах 1.1 и 1.2.

Таблица 1.1

Гуманизированный вариант SEQ ID NO ADWA11 IGHV1-46/IGKV1-39 VH: SEQ ID NO: 34;
VL: SEQ ID NO: 65 ADWA11 IGHV1-46/IGKV2-28 VH: SEQ ID NO: 34;
VL: SEQ ID NO: 62 ADWA11 IGHV1-46/IGKV3-11 VH: SEQ ID NO: 34;
VL: SEQ ID NO: 66 ADWA11 IGHV1-46/IGKV2-30 VH: SEQ ID NO: 34;
VL: SEQ ID NO: 63 ADWA11 IGHV1-46/IGKV4-1 VH: SEQ ID NO: 34;
VL: SEQ ID NO: 64 ADWA11 IGHV1-69/IGKV1-39 VH: SEQ ID NO: 37;
VL: SEQ ID NO: 65 ADWA11 IGHV1-69/IGKV2-28 VH: SEQ ID NO: 37;
VL: SEQ ID NO: 62 ADWA11 IGHV1-69/IGKV3-11 VH: SEQ ID NO: 37;
VL: SEQ ID NO: 66 ADWA11 IGHV1-69/IGKV2-30 VH: SEQ ID NO: 37;
VL: SEQ ID NO: 63 ADWA11 IGHV1-69/IGKV4-1 VH: SEQ ID NO: 37;
VL: SEQ ID NO: 64 ADWA11 IGHV3-30/IGKV1-39 VH: SEQ ID NO: 36;
VL: SEQ ID NO: 65 ADWA11 IGHV3-30/IGKV2-28 VH: SEQ ID NO: 36;
VL: SEQ ID NO: 62 ADWA11 IGHV3-30/IGKV3-11 VH: SEQ ID NO: 36;
VL: SEQ ID NO: 66 ADWA11 IGHV3-30/IGKV2-30 VH: SEQ ID NO: 36;
VL: SEQ ID NO: 63 ADWA11 IGHV3-30/IGKV4-1 VH: SEQ ID NO: 36;
VL: SEQ ID NO: 64 ADWA11 IGHV3-23/IGKV1-39 VH: SEQ ID NO: 35;
VL: SEQ ID NO: 65 ADWA11 IGHV3-23/IGKV2-28 VH: SEQ ID NO: 35;
VL: SEQ ID NO: 62 ADWA11 IGHV3-23/IGKV3-11 VH: SEQ ID NO: 35;
VL: SEQ ID NO: 66 ADWA11 IGHV3-23/IGKV2-30 VH: SEQ ID NO: 35;
VL: SEQ ID NO: 63 ADWA11 IGHV3-23/IGKV4-1 VH: SEQ ID NO: 35;
VL: SEQ ID NO: 64 ADWA11 IGHV3-48/IGKV1-39 VH: SEQ ID NO: 38;
VL: SEQ ID NO: 65 ADWA11 IGHV3-48/IGKV2-28 VH: SEQ ID NO: 38;
VL: SEQ ID NO: 62 ADWA11 IGHV3-48/IGKV3-11 VH: SEQ ID NO: 38;
VL: SEQ ID NO: 66 ADWA11 IGHV3-48/IGKV2-30 VH: SEQ ID NO: 38;
VL: SEQ ID NO: 63 ADWA11 IGHV3-48/IGKV4-1 VH: SEQ ID NO: 38;
VL: SEQ ID NO: 64 ADWA11 химерный контроль

Таблица 1.2

Наимено вание Соответствующий зародышевый тип SEQ ID NO: Последовательность ADWA11VH1 IGHV1-46 34 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMNWVRQAPGQGLEWIGWIDPDNGNTIYDQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH2 IGHV3-23 35 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWIGWIDPDNGNTIYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH3 IGHV3-30 36 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWIGWIDPDNGNTIYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH4 IGHV1-69 37 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDYYMNWVRQAPGQGLEWIGWIDPDNGNTIYDQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VH5 IGHV3-48 38 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWIGWIDPDNGNTIYDDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS ADWA11VK1 IGKV2-28 62 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTKSLLHFNGNTYLFWYLQKPGQSPQLLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK2 IGKV2-30 63 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSTKSLLHFNGNTYLFWFQQRPGQSPRRLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK3 IGKV4-1 64 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGQPPKLLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK4 IGKV1-39 65 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKLLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK ADWA11VK5 IGKV3-11 66 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGQAPRLLIYYMSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIK

Выравнивание последовательности для сравнения аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела ADWA-11 гибридомы мыши (называемого «Гибридома mADWA-11» и «mADWA11»), Гуманизированного ADWA-11 антитела («huADWA11-2.4») и IGHV3-07 и IGKV1-39 последовательностей зародышевого типа показано на Фиг. 1A и 1B. Подчеркнутые аминокислотные остатки являются CDR последовательностями согласно Kabat, и выделенные жирным шрифтом аминокислотные остатки являются CDR последовательностями по Чотиа.

Пример 3: Введение каркасных мутаций в гуманизированные анти-αvβ8 интегрин антитела

Для улучшения аффинности связывания гуманизированного ADWA-11 антитела для αvβ8 интегрина по сравнению с аффинностью связывания антитело ADWA11 гибридомы мыши, создают несколько вариантов, имеющих каркасные замены в вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), как указано в таблице 2. Остатки тяжелой цепи, описанные в этом примере, пронумерованы согласно SEQ ID NO: 127. Остатки легкой цепи, описанные в этом примере, пронумерованы согласно SEQ ID NO: 128.

Таблица 2. Каркасные замены, введенные в гуманизированное ADWA11 антитело

Вариант VH и VL областей ADWA11 Альтернативное наименование(я) Аминокислотные замены относительно SEQ ID NO:127 (для остатков тяжелой цепи) и SEQ ID NO: 128 (для остатков легкой цепи) adwa_VH_1.1
(SEQ ID NO:88) ADWA11 VH01 T28N, F29I adwa_VH_1.2
(SEQ ID NO:89) ADWA11 VH02 T28N, F29I, R72A adwa_VH_1.3
(SEQ ID NO:90) ADWA11 VH03 T28N, F29I, R72A, A49G, L79A adwa_VH_1.4
(SEQ ID NO:91) ADWA11 VH04 T28N, F29I, R72A, N74T, A75S adwa_VH_1,5
(SEQ ID NO: 39) ADWA11 VH05
ADWA11 VH05_VK1 T28N, F29I, R72A, A49G, L79A, N74T, A75S adwa_VL_1.1
(SEQ ID NO: 47) ADWA11 VK01
ADWA11_VK01 (1) L46R adwa_VL_1.2
(SEQ ID NO:92) ADWA11 VK02 L46R, Y36F

Варианты гуманизированного ADWA11 антитела создают объединением разных наборов каркасных замещений, перечисленных в таблице 2. Такие комбинации дают антитела, имеющие VH ADWA11 VH01, ADWA11 VH02, ADWA11 VH03, ADWA11 VH04 или ADWA11 VH05 и VL либо ADWA11 VK01 либо ADWA11 VK02.

Варианты гуманизированного ADWA11 антитела ADWA11 VH01/VK01, ADWA11 VH02/VK01, ADWA11 VH03/VK01, ADWA11 VH03/VK02 и ADWA11 VH05/VK01 создают и оценивают как в общем описано в настоящем документе.

Вариант гуманизированного ADWA11 антитела, обозначенный ADWA11 VH01/VK01, включает T28N и F29I замены в VH (SEQ ID NO:88) и L46R замещение в VL (SEQ ID NO:47).

Вариант гуманизированного ADWA11 антитела ADWA11 VH02/VK01 включает T28N, F29I и R72A замены в VH (SEQ ID NO:89) и L46R замены в VL (SEQ ID NO:47).

Вариант гуманизированного ADWA11 антитела ADWA11 VH03/VK01 включает T28N, F29I, R72A, A49G и L79A замены в VH (SEQ ID NO:90) и L46R замещение в VL (SEQ ID NO:47).

Вариант гуманизированного ADWA11 антитела ADWA11 VH03/VK02 включает T28N, F29I, R72A, A49G и L79A замены в VH (SEQ ID NO:90) и L46R и Y36F замены в VL (SEQ ID NO:92).

Вариант гуманизированного ADWA11 антитела ADWA11 VH05/VK01 включает T28N, F29I, R72A, A49G, L79A,N74T и A75S замены в VH (SEQ ID NO: 39) и L46R замещение в VL (SEQ ID NO: 47).

Аффинности связывания Fab ADWA11 VH01/VK01, ADWA11 VH02/VK01, ADWA11 VH03/VK01, ADWA11 VH03/VK02 и ADWA11 VH05/VK01 для αvβ8 интегрина определяют как перечислено в таблице 3. Дополнительно, значения IC50 для ингибирования активации TGF-β также определяют для каждого антитела, и они перечислены в таблице 3.

Таблица 3. Характеризация вариантов гуманизированного ADWA11 антитела

Аффинность Fab TGFB анализ эффективности IgG Наименование антитела ka kd KD (M) KD (пМ) IC50 (пМ) Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
VH: SEQ ID NO: 20
VL: SEQ ID NO: 21
Также называемое:
Гибридома mADWA-11 9,22E+04 4,86E-05 5,36E-10 536 183
(n=3) Гуманизированные варианты (DP54/DPK9) ADWA11 VH01/VK01
VH: SEQ ID NO: 88
VL: SEQ ID NO: 47
Также называемое:
VH01/VK01 Fab 4,13E+04 2,51E-04 6,86E-09 6860 8473
(n=2) ADWA11 VH02/VK01
VH: SEQ ID NO: 89
VL: SEQ ID NO: 47
Также называемое:
VH02/VK01 Fab 1,30E+05 2,44E-04 1,89E-09 1890 1756
(n=2) ADWA11 VH03/VK01
VH: SEQ ID NO: 90
VL: SEQ ID NO: 47
Также называемое:
VH03/VK01 Fab 1,36E+05 <1E-05 7,35E-11 <100 138 ADWA11 VH03/VK02
VH: SEQ ID NO: 90
VL: SEQ ID NO: 92
Также называемое:
VH03/VK02 Fab 1,40E+05 5,23E-05 3,73E-10 370 223 ADWA11 VH05/VK01
VH: SEQ ID NO: 39
VL: SEQ ID NO: 47
Также называемое:
VH05-2_VK01;
VH05-2_VK01 исходное; и VH05/VK01 Fab 1,87E+05 <1E-05 5,00E-11 <100 148
(n=3)

Как показано в таблице 3, каждое из ADWA11 VH03/VK01, ADWA11 VH03/VK02 и ADWA11 VH05/VK01 демонстрирует улучшенную аффинность связывания для αvβ8 интегрина по сравнению с антителом ADWA-11 гибридомы мыши. Каждое из ADWA11 VH03/VK01 (GBT) и ADWA11 VH05/VK01 связывается с αvβ8 интегрином с KD менее чем 100 пМ, которое является по меньшей мере в 5 раз меньшим значением KD, чем KD 536 пМ, определенное для антитела ADWA-11 гибридомы мыши. Дополнительно, каждое из ADWA11 VH03/VK01 и ADWA11 VH05/VK01 демонстрирует значение более низкое значение IC50 для ингибирования TGF-β трансактивации, по сравнению с антителом ADWA-11 гибридомы мыши.

Затем было определено, как в общем описано в настоящем документе, что ADWA11 VH05/VK01 также сохраняет активность, специфичность и межвидовую реакционную способность антитела ADWA-11 гибридомы мыши. Таким образом, этот пример демонстрирует улучшенную аффинность связывания гуманизированного ADWA-11 антитела для αvβ8 интегрина по сравнению с аффинностью связывания антитела ADWA11 гибридомы мыши.

Пример 4: Оптимизация вариантов гуманизированных ADWA11 антител

Оценивают способность отдельных аминокислотных замещений, перечисленных в таблице 4, улучшать стабильность и/или снижать иммуногенность гуманизированного антитела ADWA11 VH05/VK01. Остатки тяжелой цепи, описанные в этом примере, пронумерованы согласно ADWA11 VH05 (SEQ ID NO: 39). Остатки легкой цепи, описанные в этом примере, пронумерованы согласно ADWA11 VK01 (SEQ ID NO: 47).

Таблица 4. Отдельные аминокислотные замены

Замены легкой цепи относительно ADWA11 VK01 (SEQ ID NO: 47) Замены тяжелой цепи относительно ADWA11 VH05 (SEQ ID NO: 39) L30S K30A Y55A N55Q M56A N57Q N58S D61E A60Q P62A M94Q K63A L97Y F64V F101L F101W Q105G

Как показано далее, было обнаружено, что отдельные замены, которые включают K30A, N55Q, N57Q, D61E или P62A в вариабельной области тяжелой цепи и L30S, M56A, N58S, M94Q, L97Y или Q105G в вариабельной области легкой цепи сохраняют активность исходной молекулы (Фиг. 4A-4B). Дополнительно, комбинации разных отдельных аминокислотных замещений, перечисленных в таблице 5, также оценивают и обнаруживают, что последовательности тяжелой цепи, содержащие двойной мутант, включающий N55Q и D61E, или тройной мутант, включающий N55Q, D61E и F64V, сохраняют активность исходной молекулы, как описано далее в настоящем документе (ФИГ. 4C).

Более конкретно, создают варианты ADWA11 VH05/VK01, включающие комбинации аминокислотных замещений, перечисленные в таблице 5, и называемые ADWA11 2.1 («2.1»), ADWA11 2.2 («2.2»), ADWA11 2.3 («2.3») и ADWA112.4 («2.4»). Было показано, что варианты ADWA11 VH05-2/VK01, ADWA11 2.1 и ADWA11 2.4, как описано далее в настоящем документе, имеют более благоприятные профили экспрессии и активности. Этот пример демонстрирует, что отдельные аминокислотные замены улучшают стабильность и/или снижают иммуногенность гуманизированного антитела ADWA11 VH05/VK01.

Таблица 5. Комбинации аминокислотных замещений

Наименование клона Альтернативные наименования Замены легких цепей относительно ADWA11 VK01 (SEQ ID NO: 47) Замены тяжелых цепей относительно ADWA11 VH05 (SEQ ID NO: 39) 2.1
VH: SEQ ID NO: 6
VL: SEQ ID NO: 67 ADWA11 2.1
VH05-2_VK01(2.1) L30S, M94Q, Q105G N55Q, D61E 2.2
VH: SEQ ID NO: 6
VL: SEQ ID NO: 68 ADWA11 2.2
VH05-2_VK01(2.2) L30S, L97Y, Q105G N55Q, D61E 2.3
VH: SEQ ID NO: 6
VL: SEQ ID NO: 69 ADWA11 2.3
VH05-2_VK01(2.3) L30S, M56S, M94Q, Q105G N55Q, D61E 2.4
VH: SEQ ID NO: 6
VL: SEQ ID NO: 7 ADWA11 2.4
VH05-2_VK01(2.4)
ADWA11 5-2 2.4 L30S, N58S, M94Q, Q105G N55Q, D61E 2.1 (F64V)
VH: SEQ ID NO: 93
VL: SEQ ID NO: 67 ADWA11 2.1 (F64V)
VH05-2(F64V)VK01(2.1) L30S, M94Q, Q105G N55Q, D61E, F64V 2.2 (F64V)
VH: SEQ ID NO: 93
VL: SEQ ID NO: 68 ADWA11 2.2 (F64V)
VH05-2(F64V)VK01(2.2) L30S, L97Y, Q105G N55Q, D61E, F64V 2.3 (F64V)
VH: SEQ ID NO: 93
VL: SEQ ID NO: 69 ADWA11 2.3 (F64V)
VH05-2(F64V)VK01(2.3) L30S, M56S, M94Q, Q105G N55Q, D61E, F64V 2.4 (F64V)
VH: SEQ ID NO: 93
VL: SEQ ID NO: 7 ADWA11 2.4 (F64V)
VH05-2(F64V)VK01(2.4) L30S, N58S, M94Q, Q105G N55Q, D61E, F64V

Пример 5: Создание анти-αvβ8 антител без эффекторной функции

Анти-αvβ8 интегрин антитела, имеющие пониженное связывание Fc-гамма рецептора и пониженную эффекторную функцию (например, пониженную антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или пониженную комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC)) создают субклонированием вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи по изобретению и как перечислено в таблице 1, в молекуле иммуноглобулина G (IgG).

Для создания антител мыши без эффекторной функции, вариабельные области из антитела ADWA-11 гибридомы мыши субклонируют в Fc скелет IgG1 мыши, который содержит E233P, E318A, K320A и R322A отдельные аминокислотные замены, как указано в Публикации США № US2009/0155256. Это антитело названо в настоящем документе ADWA-11_4mut и mIgG_4mut. Связывание ADWA-11_4mut с avB8 мыши оценивают с применением C8-S астроцитов мыши (ATCC), и блокаду активации TGFB определяют с применением C8-S клеток в анализе люциферазы совместно совместной культуры TMLC.

Для создания антител человека без эффекторной функции, вариабельные области из гуманизированного антитела ADWA11 VH05VK01 субклонируют в скелет IgG1 Fc человека (например, как описано в настоящем документе), который содержит L234A, L235A и G237A отдельные аминокислотные замены в шарнирной области, такие, что шарнирная область содержит аминокислотную последовательность EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAP (SEQ ID NO:126) вместо аминокислотной последовательности шарнирной области дикого типа EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO:125). Это моноклональное антитело человека без эффекторной функции названо в настоящем документе hIgG_VH05VK01.

Разные характеристики легкой цепи (SEQ ID NO: 123) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 124) hIgG_VH05VK01 идентифицированы последовательностях ниже.

Легкая цепи ADWA11 VK01

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSN LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 123)

Тяжелая цепь ADWA11VH05

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNG NTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 124)

В указанных выше последовательностях легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного ADWA11VH05VK01, подчеркнуты CDR последовательности; сайт N-связанного гликозилирования консенсусной последовательности находится на аминокислотных остатках N295, S296 и T297 тяжелой цепи; потенциальный сайт расщепления находится на аминокислотных остатках D52 и P53 тяжелой цепи; потенциальные сайты деамидирования находятся на аминокислотных остатках N33, G34, N35 и T36 легкой цепи и аминокислотных остатков N57, T58, N77, S78, N84 и S85 тяжелой цепи; потенциальный сайт изомеризации находится на аминокислотных остатках D90 и T91 тяжелой цепи; потенциальный сайт окисления метионина находится на аминокислотных остатках M4 и M56 легкой цепи и M34, M102 и M426 тяжелой цепи; тройной аланиновый мутант находится на аминокислотнных остатках A232 A233 и A235 тяжелой цепи; и не человеческими остатками вне CDR являются аминокислотные остатки R51 легкой цепи и G49, A72, T74, S75 и A79 тяжелой цепи. Остатки в тяжелой цепи и легкой цепи, описанные в этом примере, пронумерованы согласно SEQ ID NO: 124 и SEQ ID NO: 123, соответственно.

Пример 6: Оценка анти-αvβ8 интегрин антител с применением ELISA

Способ ELISA

Биотинилированный αvβ8 интегрин человека (50 мкл 0,6 мкг/мл) улавливают в планшет ELISA, покрытый стрептавидином. После блокирования и промывания, антитела, представляющие интерес (например, мышиные, химерные или гуманизированные варианты) добавляют в разных разведениях в разные лунки и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания добавляют идентифицирующее антитело, анти-человеческое IgG-HRP, и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания, добавляют ферментный субстрат (TMB) для проявления цвета в течение 10 минут. Ферментную реакцию останавливают добавлением 0,16 M серной кислоты, и конечную интенсивность сигнала измеряют при 450 нм.

Результаты

Антитела гибридомы мыши, у которых подтверждено связывание αvβ8 интегрина человека (hαvβ8), подвергают контр-скриннингу для связывания против близкородственных интегринов αvβ3 человека и αvβ6 человека для выбора антител мыши, которые связываются специфически с hαvβ8. Антитело ADWA11 гибридомы мыши было специфическим к hαvβ8 интегрину и не связывалось с близкородственными интегринами hαvβ3 или hαvβ6 (ФИГ. 2). Однако гуманизированное ADWA11 антитело ADWA11 VH05/VK01 показало по существу улучшенную аффинность для αvβ8 интегрина по сравнению с антителом ADWA11 гибридомы мыши (ФИГ. 3A-3B).

Молекулы анти-αvβ8 интегрин Fab ADWA11 VH05/VK01, имеющие отдельные или комбинации аминокислотных замещений, перечисленные в таблицах 4 и 5, также оценивают ELISA на связывание с hαvβ8 интегрином (ФИГ. 4A-4C). Как показано на ФИГ. 4A, Fab, имеющие K30A, N55Q, N57Q, D61E, P62A или K63A отдельное аминокислотное замещение в вариабельной области тяжелой цепи, сохраняет аффинность связывания для hαvβ8. Как показано на ФИГ. 4B, Fab, имеющие Y55A, A60Q, F101L или F101W отдельное аминокислотное замещение в вариабельной области легкой цепи, демонстрируют пониженную аффинность связывания для hαvβ8 по сравнению исходным антителом. Как показано на ФИГ. 4C, Fab, имеющие комбинацию аминокислотных замещений, перечисленных в таблице 5, сохраняют аффинность связывания для hαvβ8.

Этот пример демонстрирует, что гуманизированное ADWA11 антитело ADWA11 VH05/VK01 показывает по существу улучшенную аффинность для αvβ8 интегрина по сравнению с антителом ADWA11 гибридомы мыши, и некоторые Fab, имеющие отдельные аминокислотные замены, сохраняют связывание для hαvβ8.

Пример 7: Оценка анти-αvβ8 интегрин антител с применением Biacore™

Способ

Биотинилированный рекомбинантный αvβ8 интегрин улавливают на покрытом стрептавидином чипе Biacore™ (GE Healthcare Life Sciences) и измеряют ответ связывания ко времени для фрагментов Fab для ряда концентраций Fab. Получают типовые сенсограммы Biacore™ с вычитанием фона, наложенные на выравнивания кинетической кривой.

Более конкретно, рекомбинантный αvβ8 интегрин (например, R&D Systems) метят биотином через первичные амины и иммобилизуют на Sensor Chip SA с применением инструмента Biacore™ T200 (GE Healthcare Life Sciences). Эксперименты со связыванием Fab проводят при 25°C с применением скорости потока 30 мкл/мин в буфере 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1-2 мМ MgCl₂ и 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества P20 (HBS-P). Ассоциацию отслеживают в течение 5-10 минут и диссоциацию в течение еще 15-20 минут для каждой концентрации Fab. После каждой инъекции, поверхности чипа восстанавливают буфером для промывания IgG (Thermo Fisher Scientific). Все данные анализируют с применением программы Biacore™ T200 Evaluation. Из данных дважды вычитают фоном с использованием соседней измерительной ячейки, соединенной со стрептавидином, без захваченного интегрина и инъекциями только буфера. Получают кинетические константы для по меньшей мере трех экспериментов и представляют как средние.

Результаты

Оценивают связывание антитела с αvβ8 интегрином из разных видов. Было обнаружено, что и ADWA-11 Fab гибридомы мыши и гуманизированные ADWA-11 VH05-2/VK01(2.4) Fab перекрестно взаимодействуют с αvβ8 интегрином других видов. ADWA-11 Fab гибридомы мыши перекрестно взаимодействуют с αvβ8 интегрином человека, αvβ8 интегрином яванского макака и αvβ8 интегрином мыши. Гуманизированные ADWA-11 VH05-2/VK01(2.4) Fab перекрестно взаимодействуют αvβ8 интегрином человека, αvβ8 интегрином яванского макака и αvβ8 интегрином мыши. Дополнительно, эти антитела оценивают на их способность связываться с родственными интегринами hαvβ3 или hαvβ6. Эти антитела являются специфическими для hαvβ8 и не связываются с близкородственными интегринами hαvβ3 или hαvβ6 в анализе Biacore, как показано на ФИГ. 5.

Сравнение измерений аффинности, перечисленных в таблице 6, показывает, что гуманизированное ADWA-11 Fab имеет более низкую KD для связывания и с αvβ8 интегрином человека и αvβ8 интегрином мыши, по сравнению с KD ADWA-11 Fab гибридомы мыши для связывания с αvβ8 интегрином человека и αvβ8 интегрином мыши. Более специфически, гуманизированное ADWA-11 Fab имеет примерно KD в 2,5 раза ниже для связывания с αvβ8 интегрином человека и KD примерно в 3,5 раза ниже для связывания с αvβ8 интегрином мыши, по сравнению с соответствующими значениями KD ADWA-11 Fab гибридомы мыши. Эти данные показывают общее значительно улучшение аффинности для гуманизированного анти-αvβ8 антитела по сравнению с антителом гибридомы мыши (ФИГ. 6A-6B и таблица 6).

Для оценки KD мономера Fab ADWA112.4, также указанного в настоящем документе как ADWA-11 VH05-2/VK01(2.4) и ADWA11 5-2 2.4 и исходного IgG мыши, рекомбинантные αvβ8 человека, яванского макака, мыши и крысы иммобилизуют на чипе Biacore, и ka и kd для Fab определяют как в общем описано в настоящем документе (таблица 6). ADWA11 2.4 демонстрирует эквивалентную аффинность для αvβ8 человека, яванского макака, мыши и крысы с KD <200 пМ, однако из-за очень медленного kd, точное определение KD было невозможным. Исходный IgG мыши продемонстрировал эквивалентную KD аффинности для αvβ8 человека, яванского макака и мыши (KD 489-536 пМ) (крысиный не тестировали) (ФИГ. 6C).

Дополнительные эксперименты Biacore уточнили оценочные значения KD для ADWA11 2.4 до KD <100 пМ для αvβ8 человека и яванского макака и 70,8 ± 19,9 пМ (среднее ± стандартное отклонение) для αvβ8 мыши.

Таблица 6. Аффинность видов αvβ8 интегрина по данным Biacore (n ≥3)

Fab Виды αvβ8 ka (1/Мс) kd (1/с) KD Антитело ADWA-11 гибридомы мыши
Также указано в настоящем документе как:
ADWA11 мыши человек 9,22E+04 4,86E-05 5,36E-7M мышь 1,03E+05 5,03E-05 4,89E-7M яванский макак 9,81E+04 4,97E-05 5,07E-7M ADWA11 5-2 2.4
Также называемое:
ADWA11 2.4
VH05-2_VK01(2.4) человек 1,61E+05 ≤3E-05 ≤2E-010 яванский макак 1,72E+05 ≤2E-05 ≤2E-010 мышь 2,57E+05 1,82E-05 ≤2E-010 крыса 3,41E+05 ≤2E-05 ≤2E-010 Гуманизированное ADWA11 человек 1,73E+05 3,61E-05 2,09E-7M мышь 1,77E+05 2,43E-05 1,37E-7M ADWA11 VH05-2_VK01
VH: SEQ ID NO: 39
VL: SEQ ID NO: 47
Также называемое:
ADWA11 VH05/VK01
VH05-2_VK01;
VH05-2_VK01 исходное; и
VH05/VK01 Fab человек 2,00E+05 2,37E-05 1,18E-10 M мышь 2,20E+05 ≤2E-5 ≤1E-10 M крыса 1,94E+05 3,10E-05 1,60E-10 M яванский макак 2,25E+05 ≤2E-5 ≤1E-10 M

Для оценки специфичности ADWA11 2.4, рекомбинантное αvβ6 и αvβ3 человека иммобилизуют на чипе Biacore и определяют связывание исходного варианта гуманизированного mAb ADWA11 2.4 мыши. Исходная гибридома и гуманизированное mAb не связывают αvβ3 или αvβ6, при этом наблюдается связывание с αvβ8 в отдельных экспериментах BIAcore. Пан-интегрин αV антитело применяют для демонстрации иммобилизации αvβ3 или αvβ6 рекомбинантного белка на чипе Biacore. Таким образом, этот пример также демонстрирует специфичность гуманизированного антитела для αvβ8.

Пример 8: Оценка анти-αvβ8 интегрин антител в анализах клеточного связывания

Способы

Эксперименты по клеточному связыванию проводят с клетками глиобластомы человека U251 (Sigma) или C8-S (ATCC), культивированными в MEM 10% hiFBS. Клетки, выращенные до 70-90% конфлюэнтности, разъединяют 0,05% трипсином и промывают два раза ФРФБ, содержащим 2% АБС.

Для клеточного связывания экспериментируют с HEK293-F клетками, сверхэкспрессирующими αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8 человека. HEK293-F клетки, временно экспрессирующие полноразмерный интегрин бета 3 человека (№ доступа NP_000203.2), интегрин бета 5 человека (№ доступа NP_002204.2), интегрин бета 6 человека (№ доступа NP_000879.2) или интегрин бета 8 человека (№ доступа NP_002205.1) получают с применением запатентованных векторов и протоколов, представленных поставщиком. Клетки собирают через 4 дня и анализируют экспрессию интегрина. Для характеризации экспрессии интегрина αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8, 100000 клеток инкубируют в указанных коммерчески доступных или прямо конъюгированных запатентованных антителах в течение 30 минут, вместе с LIVE/DEAD фиксируемым клеточным красителем (Invitrogen) при 1:2000 для отделения живых клеток. Клетки центрифугируют в течение пяти минут при силе 300 g. Затем клетки промывают дважды промывочным буфером (ФРФБ+0,2% АБС) для удаления избытка несвязанных антител, и анализируют на проточном цитометре BD biosciences Fortessa.

Протокол связывания живых клеток: 100000 клеток инкубируют с серийным разведением анти-αvβ8 или IgG1_3mut изотипическим антителом человека в течение от трех до четырех часов на льду. Клетки центрифугируют в течение пяти минут при силе 300 g. Затем клетки промывают три раза промывочным буфером (ФРФБ+0,2% АБС) для удаления избытка несвязанных антител. После тщательной промывки, клетки инкубируют с Fab'2 анти-человеческим Fc-PE (Invitrogen) или Fab'2 анти-мышиным-APC козы (Jackson Labs) в разведении 1:1000 вместе с LIVE/DEAD фиксируемым клеточным красителем (Invitrogen) при 1:2000 для отделения живых клеток. Все содержимое инкубируют в течение 30 минут на льду. Полс промывания окрашенные клетки анализируют на проточном цитометре BD biosciences Fortessa (гейтированным для живых клеток) с применением аналитической программы FlowJo. Среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) для разных концентраций антитела наносят на график для разных антител.

Протокол связывания фиксированных клеток: В некоторых случаях, эксперименты клеточного связывания проводят с клетками глиобластомы человека U251 (Sigma), культивированных в MEM или 10% hiFBS. Клетки, выращенные до 70-90% конфлюэнтности, разъединяют 0,05% трипсином и промывают два раза ФРФБ, содержащим 2% АБС. U251 (25000 клеток) инкубируют вместе с LIVE/DEAD фиксируемым клеточным красителем (Invitrogen) при 1:2000 для отделения живых клеток. Клетки центрифугируют в течение 5 минут при силе 300 g и промывают промывочным буфером (ФРФБ+0,2% АБС), затем фиксируют 2% параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре. Фиксированные клетки промывают два раза промывочным буфером, затем добавляют серийные разведения анти-αvβ8 антитела, представляющего интерес, в течение 1 часа при 37 градусах. Клетки промывают три раза промывочным буфером для удаления избытка несвязанных антител. После тщательной промывки, Fab'2 анти-человеческое Fc-PE (Invitrogen) или анти-человческое Каппа легкая цепь-APC (Invitrogen) идентифицирующее антитело в разведении 1:1000 добавляют к клеткам и инкубируют в течение 30 минут на льду. После промывания, окрашенные клетки анализируют на проточном цитометре BD biosciences Fortessa (гейтированном для живых клеток) с применением аналитической программы FlowJo. Среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) для разных концентраций антитела наносят на график для разных антител.

Результаты

Данные связывания фиксированных U251 клеток для ADWA11 VH05/VK01 Fab, имеющих отдельные аминокислотные замены либо в вариабельной области тяжелой цепи, включающей F64V, либо в вариабельной области легкой цепи, включающей L30S, M94Q, L97Y, F101L, F101W или Q105G, или комбинацию аминокислотных замещений, называемую 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.1 (F64V), 2.2 (F64V), 2.3 (F64V) и 2.4 (F64V) в таблице 5, получают и сравнивают с исходным антителом (ФИГ. 7A-7C).

Данные связывания U251 клеток также получают для антител mIgG_4mut и hIgG_VH05VK01 (также называемого ADWA11 2.4 и описанного дополнительно в примере 5) (ФИГ. 8). Кажущаяся аффинность mIgG_4mut и hIgG_3mut_VH05VK01 для U251 клеток показана ниже в таблице 7. Эти данные демонстрируют, что hIgG_3mut_VH05VK01 было определено как имеющее более высокую аффинность по сравнению с mIgG_4mut.

Таблица 7. Значения аффинности из анализа связывания U251 клеток

ADWA11 антитело U251 app K_D (пМ) mIgG_4mut 823 hIgG_3mut_VH05VK01 430

Кажущуюся аффинность ADWA11 2.4 для U251 (глиобластома человека) или C8-S (астроцит мыши) клеток также оценивают в анализе клеточного связывания согласно способам, в общем описанным в настоящем документе. Коротко, клетки инкубируют с серийным разведением ADWA11 2.4 в течение 4 часов на льду, затем определяют на связанном антителе с анти-человеческим-PE вторичным антителом и анализируют проточной цитометрией. ADWA11 2.4 демонстрирует насыщаемое связывание с клетками, экспрессирующими αvβ8 человека и αvβ8 мыши, со средней EC50 в анализе клеточного связывания U251 (αvβ8 человека) 126 пм со стандартным отклонением плюс/минус 34 пМ (ФИГ. 9A; n=3).

В дополнительных исследованиях, EC50 ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) связывания с клетками U251 человека определяют как 256 ± 115 пМ (среднее ± стандартное отклонение в семи независимых экспериментах), и связывание с C8-S клетками мыши определяют как 145± 23,7 пМ (среднее ± стандартное отклонение в четырех независимых экспериментах).

Эксперименты клеточного связывания HEK293F, временно сверхэкспрессирующими члены семейства интегрина β, демонстрируют, что ADWA11 2.4 специфически связывается с клетками, экспрессирующими αvβ8 человека, но не с αvβ3, αvβ5 или αvβ6 (ФИГ. 9B). Таким образом, ADWA11 2.4 демонстрирует улучшенные характеристики по сравнению с исходным антителом ADWA11 мыши, тем самым предполагая, что гуманизированное ADWA11 2.4 является потенциальным улучшенным терапевтическим агентом для человека.

Пример 9: Оценка анти-αvβ8 интегрин антител в анализах αvβ8 индуцированной активации TGF-β

Способы

Действие анти-αvβ8 антитела на транс-активацию TGFβ пути изменяют с применением U251-MG (Sigma) и Mv1Lu-SMAD-люцифераза клеток-репортеров. В некоторых экспериментах, астроциты C8-S мыши применяют вместо U251 клеток. Коротко, клеточную линию эпителия легкого норки MvLu1 (ATCC) трансдуцируют с репортерными Cignal SMAD (luc) лентивирусными частицами (SABioscience) при множественностью заражения (MOI) 50. Стабильные клеточные линии, экспрессирующие конструкт SMAD люциферазы светляка создают культивированием в полной среде для выращивания (MEM плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) с L-глутамином+пенициллин/стрептомицин) с добавлением 2 мкг/мл пуромицина. Для эксперимента, U251 клетки (5000 клеток в 50 мкл в MEM среде, содержащей 2% очищенной на активированом ФТС) добавляют в каждую лунку TC-обработанного 96-луночного планшета с прозрачным дном и белыми стенками, и инкубируют в течение 1 ч при 37°C. Серийные разведения анти-αvβ8 антител, например, FAB антител, готовят в среде MEM, содержащей 2% очищенной на активированом ФТС, и добавляют к высеянным U251 клеткам, 25 мкл на лунку. Через час инкубирования, клетки-репортеры Mv1Lu-SMAD-люциферазы добавляют (5000 клеток/лунку в 25 мкл) в каждую лунку и через 18 часов инкубации при 37°C активность люциферазы измеряют с применением реагента Bright Glo (Promega) согласно протоколу, предложенному производителем. Люминесценцию измеряют с применением планшетного ридера Envision с временем интеграции 1 с.

Результаты

Ингибирующее действие разных антител на индуцированную αvβ8 трансактивацию TGF-β U251 клетками отслеживают через оценку пониженной активности люциферазы (ФИГ. 10A-10F).

На ФИГ. 10A изображено сравнение антител, созданных как описано в примере 3, и она включает сравнение между ADWA11 VH05/VK01 (также называемым VH05-VK01 Fab) и исходным антителом гибридомы мыши ADWA11 (mFab). Значение EC50, измеренное через кажущуюся аффинность в анализе трансактивации TGF-β, улучшается от 4,6 нМ для парентерального антитела гибридомы мыши ADWA11 (mFab) до 1,3 нМ для ADWA11 VH05/VK01 (также называемого VH05-VK01 Fab).

Также оценивают влияние аминокислотных замещений, проведенных либо в вариабельной области тяжелой цепи, либо в вариабельной области легкой цепи ADWA11 VH05/VK01 на трансактивацию TGFβ U251 клетками (ФИГ. 10B-10D). Fab, имеющие F101L или F101W отдельное аминокислотное замещение в вариабельной областью легкой цепи, демонстрируют пониженную трансактивацию TGFβ по сравнению с ADWA11 VH05/VK01 Fab.

Сравнение действия молекул гуманизированного ADWA-11 IgG на вызванную αvβ8 трансактивацию TGF-β U251 клеток также отслеживают с применением анализа активности люциферазы (ФИГ. 10E). Эти данные показывают, что VH05/VK01-D61E и -N55Q-D61E мутанты имеют сравниваемое действие на трансактивацию TGFβ.

Для оценки эффективности ADWA11_VH05-2_VK01(2.4), альтернативно называемого в настоящем документе ADWA11 2.4, устанавливают систему совместного культивирования с клетками человека и мыши, которые эндогенно экспрессируют αvβ8, с системой клеток-репортеров TGFβ-чувствительности люциферазы. Коротко, клетки U251 (глиобластома человека) или C8-S (астроцит мыши) высевают с клетками эпителия легкого норки (Mv1Lu), стабильно трансдуцироваными Cignal SMAD репортерными (luc) лентивирусными частицами (SABioscience) при множественности заражения (MOI) 50 (клетки Mv1Lu-Smad). Клетки Mv1Lu-Smad отвечают на TGFβ, сгенерированный U251 или C8-S клетками, и ингибирование αvβ8 функции может отслеживаться через снижение активности люциферазы. На ФИГ. 10F показано действие ADWA112.4 на TGFβ трансактивацию U251 и C8-S клетками по сравнению с изотипическим отрицательным контрольным антителом.

Эти данные демонстрируют, что ADWA11 2.4 является более эффективным ингибитором вызванной αvβ8 трансактивации TGF-β, чем другие антитела, включая ADWA11 моноклональное антитело мыши. IC50 для ADWA11 VH05-2/VK01(2.4) в анализе трансактивации TGFβ с U251 клетками определяют как 199 ± 93,6 пМ (среднее ± стандартное отклонение в пяти независимых экспериментах).

Пример 10: Оценка иммуногенности анти-αvβ8 интегрин антител

Функциональную значимость пептидного связывания с Главным комплексом гистосовместимости (MHC) оценивают анализом пролиферации T-клетки. CD4, трансмембранный гликопротеин, экспрессируемый на T-хелперных клетках, распознает пептиды, связывающие молекулы MHC II класса на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). Это взаимодействие вызывает пролиферацию T-хелперных клеток, приводящую к иммунному ответу. Пролиферацию T-клетки отслеживают через снижение интенсивности флуоресценции отдельных клеток, содержащих краситель сукцинимидиловый сложный эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE). В анализе Т-клеток ProImmune's REVEAL® Immunogenicity System применяют способы проточной цитометрии для анализа деления меченых CFSE красителем клеток. PMBC от разных доноров инкубируют с CFSE с получением внутриклеточных флуоресцентных конъюгатов. Интенсивность флуоресценции CFSE уменьшается вдвое при каждом последующем делении клеток, что позволяет измерять пролиферацию клеток. Этот надежный и воспроизводимый анализ CFSE-меченых T-клеток применяют для определения потенциальных CD4-T-клеточных эпитопов на MHCII презентированных пептидах. Пептидные контроли, полученные из гриппа/столбняка от и очищенного белкового производного туберкулина (PPD), применяют в качестве положительных контролей для пролиферации клеток.

двадцать девять пептидов, охватывающих CDR, тестируют с PBMC, полученными от 51 донора для пролиферации T-клеток (таблица 1, SEQ ID NO: 94-122). Меченые CFSE PBMC инкубируют с тестируемыми пептидами в течение семи дней, и степень пролиферации CD4+ T клеток отслеживают способом проточной цитометрии. Число респондеров для пептида, полученного из оптимизированной молекулы, сравнивают с количеством респондеров для соответствующих последовательностей пептидов зародышевого типа.

Ссылочные антигены, содержащие известные эпитопы MHC II класса, применяют в этом исследовании.

Очищенное белковое производное туберкулина (PPD) является производным Mycobacterium tuberculosis, и его применяют в конечной концентрации для анализа 5 мкг/мл. Ожидается, что приблизительно 70-100% доноров PBMC реагируют на этот белок в результате предыдущей вакцинации, т.е. через иммунный ответ памяти.

Гемоцианин лимфы улитки (KLH) является распознанным и эффективным интактным белковым иммуногеном, применяемым в конечной концентрации 0,25 мг/мл в анализе. Обычно может ожидаться, что 50-80% доноров реагируют на этот белок, предположительно управляемый интактным иммунным ответом.

Синтетический пептид HA получают из гемагглютинина гриппа A (PKYVKQNTLKLAT, остатки 307-3192; SEQ ID NO: 129) и применяют в конечной концентрации для анализа 5 мкМ. Ожидается, что он вызывает ответ у вплоть до 50% доноров.

Синтетический пептид TT (AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO:130), TET 830 модифицированный/T-хелперный эпитоп из столбнячного токсина) является универсальным эпитопом Т-клетки столбнячного токсина человека, и его применяют в качестве хелперного пептида при вакцинации. Его применяют в конечной концентрации для анализа 5 мкМ, и ожидается реакция что вплоть до 45% доноров.

Было обнаружено, что F64V замещение (SEQ ID NO: 105) в тяжелой цепи повышает иммуногенность. Одиннадцать из 51 донорских PBMC давали ответ в анализе пролиферации CD4+ T клеток, и ни один из доноров не был чувствителен к соответствующей последовательности зародышевого типа. Было обнаружено, что другие замены, включающие Q105G (SEQ ID NO: 111), L30S (SEQ ID NO: 106), M94Q (SEQ ID NO: 107) и N58S (SEQ ID NO: 113), снижают иммуногенность, все в разной степени, как показано в таблице 8. Процент респондеров для разных CDR пептидов по сравнению с пептидами положительного контроля дан на ФИГ. 11.

Таблица 8

Количество респондеров^# для пептидов, соответствующих разным заменам Замена Исходное После замены F64V 0 11 Q105G 6 3 L30S 6 0 M94Q 6 0 N58S 5 3

^# количество доноров PBMC, отвечающих в анализе пролиферации CD4+ T клеток

Эти данные демонстрируют, что определенные антитела по изобретению, включая ADWA11 2.4, демонстрируют пониженные Т-клеточные ответы по сравнению с исходным mAb ADWA11 мыши. Эти результаты позволяют предположить, что ADWA11 2.4 является улучшенным потенциальным терапевтическим агентом для человека по сравнению с исходным антителом мыши.

Пример 11: Ингибирование αvβ8 улучшает эффективность анти-PD-1 терапии в модели опухоли EMT6

Способы

В этом исследовании, 3x10⁵ EMT6 (ATCC) клеток имплантируют в жировую подушку четверти молочной железы или подкожно мышам Balb/c (Charles River Laboratory). Мышей произвольно распределяют на группы лечения, когда их опухоли достигают среднего размера 50 мм³ и затем начинают лечение. Для лечения, мыши получают дозу 10 мг/кг указанного антитела 2A3_rat IgG («2A3»; BioXcell), анти-PD-1 антитела («PD1»; клон RMP1-14, BioXcell), 2B8_mIgG1_4mut («2B8») или ADWA11_mIgG1_4mut (ADWA11) внутривенной инъекцией каждые четыре дня в количестве всего трех введений. Опухоли измеряют в двух направлениях для отслеживания роста, где объем (V) = ½ L × W², и L (длину) определяют как наибольший диаметр опухоли и W (ширина) перпендикулярна L. Измерения опухоли записывают 2-3 раза в неделю до конца исследования.

Результаты

Анти-αvβ8 (ADWA11) в комбинации с анти-PD1 терапией (ADA11+PD1) синергетически и значительно снижает рост опухоли и улучшает выживаемость во сравнению с группами, леченными анти-PD1 или анти-αvβ8 монотерапией (Фиг. 12A и 12B).

В группе с дозой 10 мг/кг монотерапии ADWA11 лечение дает 47,1% ингибирование роста опухоли (ИРО) на 13 день исследования, однако ИРО было временным и ни одна из мышей не дошла до конца исследования (0% выживания на 51 день). Анти-PD1 монотерапия дала 15% ИРО на 14 день исследования, и ни одна из мышей не дошла до конца исследования (0% выживания на 51 день). Наоборот, ADWA11 (доза 10 мг/кг в группе) в комбинации с анти-PD-1 антителом дало 90,0% ИРО на 14 день исследования, и 60% мышей дошло до конца исследования (60% выживаемость на 51 день).

Эти результаты впервые демонстрируют, что ADWA11 антитела, включая ADWA11 2.4, дают синергетический терапевтический эффект при комбинировании с ингибитором PD-1, например, анти-PD-1 антителом. Эти данные позволяют предположить, что ADWA11 2.4 является потенциальным терапевтическим агентом для человека, который может обеспечить синергетический противоопухолевый ответ при комбинировании с PD-1 ингибитором.

Пример 12: Ингибирование αvβ8 улучшает эффективность 4-1BB и анти-CTLA4 терапии в модели EMT6

Способы

В данном исследовании эффективности EMT6 опухоли, 1x10⁶ EMT6 (ATCC) клетки имплантируют в жировую подушку четверти молочной железы мышей Balb/c (Charles River Laboratory). Мышей произвольно распределяют на группы лечения, когда их опухоли достигают среднего размера 100 мм³ и затем начинают лечение. Мыши получают в.в. дозу 4-1BB (MAB9371 R&D Systems, 1 мг/кг День 0 и День 4), анти-CTLA4 (клон 9D9 BioXcell, 10 мг/кг День 0, День 4 и День 8), анти-αvβ8 (ADWA11, 10 мг/кг День 0, День 4 и День 8), 2B8_mIgG_4mut (10 мг/кг, День 0, День 4 и День 8) или 2A3_rat IgG (BioXcell, 10 мг/кг День 0, День 4 и День 8). Опухоли измеряют в двух направлениях для отслеживания роста, где объем (V) = ½ L × W², и L (длину) определяют как наибольший диаметр опухоли и W (ширина) перпендикулярна L. Измерения опухоли записывают 2-3 раза в неделю до конца исследования.

Анализ иммуногистохимии (ИГХ): фиксированные в формалине залитые парафином (FFPE) срезы опухолевой ткани толщиной 4 мм для экспрессии CD8, CD45 и Granzyme B с использованием пользовательских протоколов и автоматического IHC-красителя Leica Bond-max. Изображения получают на цифровом сканере для цельных препаратов Leica/Aperio AT2 с применением 20-кратного увеличения. Изображения анализируют с использованием пользовательских алгоритмов, созданных в программе Visiopharm 7.2 и оптимизированных для каждой мишени, представляющей интерес. Подсчет клеток проводят на жизнеспособной ткани и нормализуют по площади жизнеспособной ткани. Плотность клеток рассчитывают с использованием следующего уравнения: Клетки/мкм2 = (#Положительные клетки/Площадь жизнеспособной опухоли (мкм2))*1 x 106. Процент плотности объекта рассчитывают с применением следующего уравнения: Площадь окрашивания (мкм2)/Площадь жизнеспособной опухоли (мкм2).

Результаты

Анти-αvβ8 (ADWA11) в комбинации с анти-4-1BB или анти-CTLA4 значительно и синергетически снижает рост опухоли и улучшает выживаемость в сравнении с группами, леченными анти-4-1BB, анти-CTLA4 или анти-αvβ8 монотерапией (ФИГ. 13).

Оценивают изменения плотности клеток, инфильтрующих опухоль, после лечения анти-αvβ8 антителом (ФИГ. 15). Численность лимфоцитов подсчитывают в модели опухоли EMT6 с применением IHC анализа плотности окрашивания CD45 (общее количество лимфоцитов и миелоидных клеток), CD3 (общее количество T-клеток), CD4 T клеток, CD8 T клеток и Granzyme B (активированных CD8 и NK клеток). Эти данные демонстрируют, что анти-αvβ8 монотерапия повышает численность общих CD45+ клеток, CD4+ T клетки и CD8+ T клеток, и вызывает очень значительное повышение плотности клеток, экспрессирующих Granzyme B (n=10 для каждой группы).

Численность опухолевых лимфоцитов в опухолевой ткани анализируют на 11 День (лечение антителом на День 0, 3, 6, 9) у мышей, леченных изотипическим контролем или ADWA11 (2.4) (ФИГ. 15). Лечение ADWA11 (2.4) повышает плотность общих лейкоцитов (CD45+, 1540±558 к 2470±407), CD8 T клеток (CD8+, 76,3±62,7 к 170±74,2) и цитотоксических клеток (% плотности Granzyme B, 11,8±11,0 к 106±35,1) в микросреде опухоли (среднее количество клеток CD45+, среднее количество клеток CD8+ или средний % площади окрашивания Granzyme B на мм² ± стандартное отклонение в лечении изотипом к ADWA11 (2.4)).

Эти результаты впервые демонстрируют, что ADWA11 антитела, включая ADWA11 2.4, дают синергетический терапевтический эффект по сравнению с агонистом 4-1BB, например, анти-4-1BB антителом. Эти данные позволяют предположить, что ADWA11 2.4 является потенциальным терапевтическим агентом для человека, который может обеспечить синергетический противоопухолевый ответ при комбинировании с агонистом 4-1BB.

Эти результаты также впервые демонстрируют, что ADWA11 антитела, включая ADWA11 2.4, дают синергетический терапевтический эффект при комбинировании с ингибитором CTLA4, например, анти-CTLA4 антителом. Эти данные позволяют предположить, что ADWA11 2.4 является потенциальным терапевтическим агентом для человека, который может обеспечить синергетический противоопухолевый ответ при комбинировании с ингибитором CTLA4.

Пример 13: Ингибирование αvβ8 улучшает эффективность радиационной терапии в модели опухоли СТ26

Способы

Анализ эффективности CT26: 4x10⁵ CT26 (ATCC) клеток имплантируют подкожно в бок мышей Balb/c (Charles River Laboratory). Мышей произвольно распределяют на группы лечения, когда их опухоли достигают среднего размера 100 мм³ и затем начинают лечение. Мыши получают 10 мг/кг в.в. дозу каждые 4 дня, 3 дозы всего, 2B8_mIgG1_4mut (собственного) изотипического контроля или ADWA11_mIgG1_4mut и одну дозу 5 Гр таргетной радиации опухоли на День 5 после первой дозы. Опухоли измеряют в двух направлениях для отслеживания роста, где объем (V) = ½ L × W², и L (длину) определяют как наибольший диаметр опухоли и W (ширина) перпендикулярна L. Измерения опухоли записывают 2-3 раза в неделю до конца исследования.

кПЦР анализ экспрессии гена: опухолевую ткань собирают и 30 мг ткани гомогенизируют в 900 мкл лизисного буфера, поставляемого в наборе RNeasy Plus Mini Kit, с применением Omin Bead Ruptor. РНК из гомогенизированных образцов опухоли выделяют с применением RNeasy Plus Mini Kit и протоколов, рекомендуемых поставщиком. кДНК синтезируют с применением 2 мкг суммарной РНК и набора для высокоэффективной обратной транскрипции кДНК с применением протоколов, рекомендуемых поставщиком. Экспрессию гена анализируют с применением 50 нг кДНК и ген-специфичных праймеров линейных разрушаемых зондов, TaqMan Universal Master Mix II и протоколов, рекомендуемых поставщиком. Систему кПЦР в реальном времени ViiA7 применяют для исследования кПЦР. Пороговые циклы (CT) для каждого образца анализируют с применением рекомендованного сравнительного CT способа, и экспрессию генов-мишеней показывают как кратное изменение в группе лечения по сравнению с группой изотипического контроля. Непарный двусторонний t-критерий Стьюдента применяют для сравнения группы лечения с группой изотипического контроля со статистической значимостью, выраженной как <0,05.

Анализ иммуногистохимии (ИГХ): фиксированные в формалине залитые парафином (FFPE) срезы опухолевой ткани толщиной 4 мм для экспрессии CD8, CD45 и Granzyme B с использованием пользовательских протоколов и автоматического IHC-красителя Leica Bond-max. Изображения получают на цифровом сканере для цельных препаратов Leica/Aperio AT2 с применением 20-кратного увеличения. Изображения анализируют с использованием пользовательских алгоритмов, созданных в программе Visiopharm 7.2 и оптимизированных для каждой мишени, представляющей интерес. Подсчет клеток проводят на жизнеспособной ткани и нормализуют по площади жизнеспособной ткани. Плотность клеток рассчитывают с использованием следующего уравнения: Клетки/мкм2 = (#Положительные клетки/Площадь жизнеспособной опухоли (мкм2))*1 x 106.

Результаты

Анти-αvβ8 антитело (ADWA11) в комбинации с радиационной терапией значительно снижает рост опухоли и улучшает выживаемость в сравнении с только радиационной терапией (ФИГ. 14A).

В исследованиях CT26, ADWA11 антитело (анти-ITGαVβ8) монотерапия дает 64,3% ИРО на 19 День исследования, но ответ был временным, и только 1 из 10 мышей дошла до конца исследования (10% выживаемости, День 57). Только радиационная терапия (5 Грэй (Гр) доза на 5 День) дает 57,7% ингибирование роста опухоли (День 18) и 1 из 20 мышей достигает конца исследования (5% выживаемость, День 57). Наоборот, сравнение лечения ADWA11 в комбинации с радиационной терапией дает 87,7% ингибирование роста опухоли (День 19, доза 10 мг/кг ADWA11 и 5 Гр радиационной терапии в группе) и 9 из 19 мышей достигают конца исследования (47,4% выживаемость, День 57).

Для исследования действия ADWA11 на численность лимфоцитов в опухоли в модели опухоли СТ26, опухолевую ткань собирают на 12 День (лечение антителом на День 0, 4, 8) у мышей, леченных изотипическим контролем или ADWA11 VH05-2/VK01 (анти-ITGαVβ8) и анализируют на маркеры лимфоцитов с применением IHC (ФИГ. 14B, верхняя панель). Лечение ADWA11 VH05-2/VK01 повышает плотность общих CD45+ лейкоцитов; Изотип: 367±128, ADWA11 VH05-2/VK01: 695±94,8 (среднее количество клеток на мм² ± стандартное отклонение). CD8+ T клетка; Изотип: 173±79,3, ADWA11 VH05-2/VK01: 374±80,4 (Среднее количество клеток на мм² ± стандартное отклонение). Granzyme B экспрессирующие цитотоксические клетки, Изотип: 264±65,5, ADWA11 VH05-2/VK01: 514±91,7 (Среднее количество клеток на мм² ± стандартное отклонение) в микросреде опухоли. Дополнительно, анти-ADWA11 лечение в комбинации с радиационной терапии повышает мРНК уровень экспрессии CD45 (3,86±0,979), CD8a (5,45±3,53), Granzyme B (4,21±1,02) и IFNγ (5,53±2,13) в микросреде опухоли (Кратность увеличения ± стандартное отклонение к группе лечения Изотипом) (ФИГ. 14B, нижняя панель).

Эти исследования демонстрируют, что анти-ITGαVβ8 (ADWA11_mIgG1_4mut) лечение повышает численность активированных лимфоцитов в микросреде опухоли и в комбинации с таргетным облучением опухоли является эффективным для регрессии опухоли и долговременной выживаемости.

Эти результаты также впервые демонстрируют, что ADWA11 антитела, включая ADWA11 2.4, обеспечивают синергетическое терапевтическое действие при комбинировании с радиационной терапией. Эти данные позволяют предположить, что ADWA11 2.4 является потенциальным терапевтическим агентом для человека, который может обеспечить синергетический противоопухолевый ответ при комбинировании с радиационной терапией.

Пример 14: Оценка интегрина αvβ8 в качестве нового супрессора иммунитета к опухоли и мишени для противоопухолевой иммунотерапии

В этом исследовании эффективное моноклональное антитело, блокирующее αvβ8 (ADWA-11), которое было создано иммунизацией мышей, нокаутированных по Itgb8, рекомбинантным αvβ8, используют для проверки того, может ли ингибирование этого интегрина способствовать противоопухолевому иммунитету.

В не опухолевых тканях αvβ8 интегрин экспрессируется на нейроэпителии, фибробластах, дендритных клетках и Т-клетках и может активировать латентный трансформирующий фактор роста β (TGFβ), важный иммуномодулятор. В настоящем документе показано, что в карциномах миелоидные клетки экспрессируют αvβ8 интегрин и что эффективное моноклональное антитело, блокирующее αvβ8 (ADWA-11), вызывает подавление роста или полную регрессию опухоли в сингенных моделях плоскоклеточной карциномы, рака груди и рака толстой кишки, особенно при комбинировании с другими иммуномодуляторами (анти-PD1, анти-CTLA-4 или 4-1BB) или радиационной терапией. Лечение ADWA-11 увеличивает инфильтрацию опухоли и экспрессию Granzyme B CD8+ Т-клеток и улучшает соотношение провоспалительных и супрессивных опухолеассоциированных макрофагов. Большинство опухолей человека экспрессируют мРНК ITGB8, и, как показано в настоящем документе, наблюдаются высокие уровни поверхностной экспрессии αvβ8 на моноцитах, макрофагах и подмножествах дендритных клеток в биопсиях карциномы яичников и почечно-клеточной карциномы человека. Эти данные идентифицируют интегрин αvβ8 как многообещающую новую мишень для противораковой иммунотерапии.

Эффективная синергетическая комбинация иммунотерапии с ADWA-11 и анти-PD-1 в модели плоскоклеточной карциномы

Действие ADWA11, отдельно или в комбинации с анти-PD-1 антителом, исследуют в сингенной модели опухоли верифицированной плоскоклеточной карциномы (клетки CCK168) (ФИГ. 16A и ФИГ. 28). Клетки CCK168, химически индуцированную клеточную линию плоскоклеточной карциномы, полученную от мышей FVB, вводят подкожной инъекцией в дорсолатеральный правый бок сингенных мышей FVB дикого типа в дозе 1,5x10⁴ клеток/мышь.

Опухолям позволяют расти более 14 дней. Мыши, отобранные для эксперимента, имеют размер опухоли по меньшей мере 5 мм в диаметре, и их оптимально распределяют в зависимости от размеров опухоли по разным группам лечения с использованием программы Studylog. Мышей взвешивают, и размер опухоли измеряют через день на протяжении всего исследования с помощью контролепригодного цифрового штангенциркуля (Fisher Scientific, модель #14-648-17). Мышей умерщвляют, когда размер опухоли достигает или превышает 2000 мм³ или развивается значительное изъязвление в месте опухоли.

Мышей лечат антителом ADWA11 гибридомы или изотипически сходными контрольными антителами в 0 и 7 дни и анти-PD-1 антителом мыши (RMP1-14, BioXcell) или его изотипически сходным контрольным антителом в 0, 4 и 8 дни (день 0 является первым днем терапии). Подходящее антитело для каждой группы и изотипические контрольные антитела вводят инъекцией внутрибрюшинно в дозах 10 мг/кг для каждого антитела, ADWA11, анти-PD-1 антитела (RMP1-14, BioXcell), контрольного антитела ADWA-21 (для ADWA11) и контроля 2A3 (BioXcell). Контроль ADWA-21 связывает интегрин-β8 человека, но не мыши.

CCK168 опухоли демонстрируют минимальные ответы на анти-PD1 антитело, но пять из десяти мышей, леченных ADWA11 монотерапией, показывают регрессию опухоли (ФИГ. 16B-16C). Комбинированная терапия с ADWA11 и анти-PD1 антителом вызывает полную регрессию в восьми из десяти опухолей и значительное увеличение общей выживаемости, когда мышей лечат ADWA11 гибридомы и анти-PD1 антителом (ФИГ. 16B) или ADWA11_4mut_mIgG1 и анти-PD1 антителом (ФИГ. 28).

Выживших мышей наблюдают вплоть до двух лет после регрессии опухоли, и ни у одной из них не было доказательств последующего возобновления роста опухоли. Тринадцать мышей из двух повторных экспериментов с полной регрессией после комбинированной терапии и 3 мыши с полной регрессией после монотерапии ADWA11 были повторно заражены один или два раза клетками CCK168, и ни у одной из них не наблюдалось роста опухоли, что свидетельствует о развитии долгосрочного иммунитета к опухоли.

Эти результаты впервые демонстрируют, что ADWA11 антитела, включая ADWA11 2.4, обеспечивают синергетический терапевтический эффект в сочетании с ингибитором PD-1, например, анти-PD-1 антителом. Эти данные позволяют предположить, что ADWA11 2.4 является потенциальным терапевтическим агентом для человека, который может обеспечивать синергетический терапевтический противоопухолевый ответ в сочетании с ингибитором PD-1.

Поверхностный интегрин αvβ8 присутствует на миелоидных клетках в микросреде опухоли

Проточную цитометрию применяют для идентификации того, какие типы клеток опухоли экспрессируют интегрин β8, предположительно выраженный как αvβ8 гетеродимер (ФИГ. 17A и ФИГ. 17B).Экспрессия αvβ8 легко определяется на более чем 80% CD45+CD11b+F4/80+CD64+ макрофагов и менее чем 20% CD45+CD11b+F4/80-CD64-CD11c+MHCII^high дендритных клеток в CCK168 опухолях (Фиг. 17B). αvβ8 экспрессируется на таких же уровнях в каждой из исследованных субпопуляций макрофагов, включая рано инфильтрующие (провоспалительные) Ly6C+ клетки и иммунодепрессивные CD206+ клетки (ФИГ. 17B). αvβ8 также экспрессируется на CCK168 опухолевых клетках in vitro (ФИГ. 18B). Низкие уровни экспрессии αvβ8 на CD45- опухоли и стромальных клетках in vivo также найдены (ФИГ. 18A). Никакой экспрессии αvβ8 не было найдено на внутриопухолевых T клетках (ФИГ. 20).

Животные

Все исследования на животных проводили в соответствии с утвержденными протоколами University of California, San Francisco, Institutional Animal Care and Use Committee of Pfizer, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee. Используемых мышей FVB/N дикого типа либо приобретают в Jackson Laboratories (The Jackson Laboratories, сток #001800), либо получают из нашей собственной племенной колонии, полученной из этого стока. Мышей Balb/c дикого типа приобретают в Charles River Laboratories (Charles River Laboratories, код штамма 028).

Обработка опухоли человека

Для всех образцов от человека было получено информированное согласие всех субъектов, и работа была выполнена в соответствии с одобрением Institutional Review Board (IRB). Свежие ткани собирают и обрабатывают согласно схеме рабочего процесса UCSF Immunoprofiler, трансляционной платформы, разработанной и оптимизированной для профилирования иммунных подгрупп внутри рака. Коротко, ткань берут из операционной и доставляют в лабораторию в течение 4 часов после сбора. Ткань интенсивно измельчают (кусочки <1 мм) и ферментативно переваривают (3 мг/мл коллагеназы A, 50 Ед/мл DNase I) в соответствии с разработанными стандартными операционными процедурами. Иммунные популяции подвергают мультиплексной проточной цитометрии (>60 цветов) для анализа пропорциональности и средней интенсивности флуоресценции известных подмножеств и их экспрессии αvβ8. Все антитела были приобретены у BD Pharmingen, eBioscience, Invitrogen или BioLegend. Анти-αvβ8-антитело получают, как описано ранее. Всю проточную цитометрию, включая сортировку клеток, проводят на специально заказанном проточном цитометре BD FACSAria Fusion. Анализ данных проточной цитометрии проводят с помощью FlowJo.

Протокол проточной цитометрии

Подкожные опухоли выделяют у мышей с помощью ножниц и тупого рассечения. Опухоли помещают в чашку Петри с коктейлем для переваривания из Коллагеназы XI (Sigma C9407) 2 мг/мл, Гиалуронидазы (Sigma H3506) 0,5 мг/мл и DNase (Sigma DN25) 0,1 мг/мл, полученным в среде C10 (RPMI 1640, Hepes 1%, пенициллин/стрептомицин 1X, фетальная телячья сыворотка 10%, пируват натрия 1 мМ, не жизненно-важные аминокислоты 1X и бета-меркаптоэтанол 0,45%). Опухоли измельчают стерильными ножницами. Полученную суспензию клеток переносят в 50 мл конические пробирки (Fisher Scientific #14-432-22), и чашку Петри, применяемую для измельчения опухоли, промывают 2 мл среды C10 для улавливания оставшихся клеток. Клетки инкубируют в шейкере при 255 об./мин в течение 45 минут при 37C. После инкубации, 15 мл среды C10 добавляют в переваренным опухолевым клеткам и осторожно встряхивают в течение 15 секунд. Клеточную суспензию пассеруют через 100 мкм сетчатый фильтр (Falcon® #352360) в чистую 50 мл коническую трубку. Клетки пеллетируют центрифугированием в течение 5 минут при 200 г при 4°C и восстанавливают в ФРФБ. Подсчет клеток проводят с применением гемоцитометра Countless II FL (Life Technologies).

Выделенные препараты отдельных клеток применяют для поверхностноклеточного и внутриклеточного окрашивания. После подсчета, 10 x 10⁶ клеток переносят в каждую лунку 96-луночного планшета v-формы для окрашивания. Живое/мертвое окрашивание Ghost Dye™ Violet 510 (TONBO bioscience #13-0870) при 1:1000 в течение 20 минут при 4°C. Fc рецептор и не специфическое связывание блокируют анти-CD16/30 (eBioscience #14061) в течение 10 минут при 4°C. Поверхностное окрашивание проводят в течение 20 минут при 4°C. Для внутриклеточного окрашивания, клетки инкубируют в буфере Fix/Perm (eBioscience #88-8824) в течение 20 минут при комнатной температуре с последующим внутриклеточным цитокиновым окрашиванием коктейлями антител в течение 20 минут при 4°C. После завершения окрашивания, клетки переносят в буфер для проточной цитометрии (ФРФБ с 2% ФТС, пенициллин/стрептомицин/глутамат, ЭДТК 2 мМ) для анализа.

Антитела, применяемые для экспериментов T-клеточного окрашивания: ICOS FITC (eBioscience#11-9949-80), CD25 AF780 (eBioscience#47-0251-82), CD45.1 AF700 (BioLegend#110723), CD8 BV605 (BioLegend#100743), CD4 BV650 (BioLegend#100546), Ki-67 PE-Cy7 (BD Biosciences#561283), CTLA4 PE (BD Biosciences#553720) и FoxP3 PB-e450 (eBiosciences#48-5773-82).

Антитела, применяемые для экспериментов внутриклеточного цитокинового окрашивания: CD3 APC (eBioscience#17-0032-82), NK1.1 APC-AF780 (eBioscience#47-5941-80), CD45.1 AF700 (BioLegend#110723), CD4 BV650 (BioLegend#104729), CD8 BV605 (BioLegend#100546), IFN-γ FITC (eBioscience#11-7311-82), IL-17A PE-Cy7 (BioLegend#506921), Granzyme-B PE (eBioscience#12-8898-82), FasL PerCP-eFluor710 (eBioscience#46-5911-82) и FoxP3 PB-e450 (eBioscience#48-5773-82).

Антитела, применяемые для экспериментов миелоидного клеточного окрашивания: Ly6G BV785 (BioLegend#127645), SiglecF BV785 (BD Biosciences#740956), CD90.2 BV785 (BioLegend#10533), B220 BV785 (BioLegend#103246), CD45.1 AF700 (BioLegend#110724), CD11b AF780 (eBioscience#47-0112-82), CD206 PerCP-Cy5,5 (BioLegend#141716), F4/80 PE (BioLegend#123109), CD11c BV650 (BioLegend#117339), Ly6C BV605 (BioLegend#128035), MHC-II PB-e450 (eBioscience#48-5321), CD24 PE-Cy7 (BioLegend#101822), CD103 FITC (eBioscience#11-1031-82), ADWA11 APC (конъюгированное в нашей лаборатории) и CD64 FITC (BioLegend#139316).

Антитела, применяемые для экспериментов NK-клеточного окрашивания: CD45.1 AF700 (BioLegend#110724), CD3 APC (eBioscience#17-0032-82), NK1.1 APC-AF780 (eBioscience#47-5941-80), CD314-NKG2D PE (eBioscience#12-5882-82), CD226-DNAM-1 PerCP-Cy5,5 (BioLegend#128814), CD335-NKp46 FITC (eBioscience#11-3351-82), CD107a-LAMP-1 PE-Cy7 (BioLegend#121620) и CD49b eFluor450 (eBioscience#48-5971-82).

Для стимулирования клеток, клетки стимулируют до поверхностноклеточного и внутриклеточного окрашивания. Приблизительно 3x10⁶ клеток в 200 мкл среды C10 на лунку инкубируют в круглодонных 96-луночных планшетах в инкубаторе для культивирования тканей в 5% CO₂ при 37°C. Стимулирующий коктейль (Иномицин, PMA, Брефелдин-A и Моненсин 500x стимулирующий коктейль Tombo #TNB4975-UL100) добавляют к клеткам, которые инкубируют в инкубаторе для культивирования тканей в 5% CO₂ при 37°C в течение 4 часов. Клетки переносят в v-донные лунки для окрашивания как описано выше. Проточную цитометрию проводят с применением BD LSRFortessa™ (BD Biosciences) и анализируют с применением FlowJo™ (Tree Star Inc.).

ADWA11 повышает инфильтрацию опухоли и улучшает дифференциацию цитотоксических CD8+ T клеток и повышает соотношение воспалительных моноцитов и супрессивных макрофагов

Действие ADWA11 (с или без анти-PD1) на природу иммунного инфильтрата также характеризуют (Thomas et al., Cancer Cell 8:369-380, 2005; Wu et al., Cancer Immunol. Res. 2:487-500, 2014). Хотя лечение анти-PD1 в этой модели не оказывает влияние на общее количество опухолевых CD8+ T клеток, лечение ADWA11 значительно повышает инфильтрацию CD8 T клеток, эффект, который был наиболее очевиден при иммуноокрашивании иссеченных опухолей (Фиг. 19A-19B). ADWA11 также значительно повышает долю CD8+ T клеток, которые экспрессируют Granzyme B (ФИГ. 19C), в то время как лечение анти-PD1 не оказывает действие. Воспалительные моноциты также играют роль в уклонении опухоли от иммунологического ответа хозяина. Ly6C экспрессируются на воспалительных моноцитах, и экспрессия Ly6C ослабляется в опухолеассоциированных макрофагах с супрессивными свойствами в микросреде опухоли (Franklin et al., Science 344:921-925, 2014; Movahedi et al., Cancer Res. 70:5728-5739). Дополнительно, классификация миелоидной популяции показывает, что лечение ADWA11 специфически повышает аккумуляцию CD45+CD11b+CD11c-Ly6G-Ly6C^highCD206^low воспалительных макрофагов (ФИГ. 19D) (Ostuni et al., Trends Immunol. 36:229-239, 2015; Noy et al., Immunity 41:49-61, 2014). Ни один из видов лечения не оказывал значительного действия на количество CD4+ T клеток, CD4+ FoxP3+ регулирующие T клетки или экспрессию интерферона-γ подмножествами T клеток в проанализированные моменты времени, и мы не смогли идентифицировать значительную экспрессию IL-17 в любых подмножествах T клеток (данные не показаны).

Для иммуноокрашивния, опухоли собирают и фиксируют в 4% параформальдегиде при 4°C в течение ночи. Фиксированные опухоли погружают в 30% раствор сахарозы при 4°C в течение ночи и заливают в соединение O.C.T. (Tissue Tek® #4583) и криорассекают на 15 мкм. Замороженные срезы окрашивают по описанным ранее протоколам (Henderson et al., Nat. Med. 19:1617-1624, 2013; Rock et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:E1475-1483, 2011). Коротко, криосрезы пермеабилизируют и блокируют 0,3% Triton X-100 и 3% АБС в ФРФБ. Срезы инкубируют с первичными антителами в течение ночи при комнатной температуре, затем с флуорофор-конъюгированными первичными и вторичными антителами, и затем готовят препарат с Prolong Gold (Invitrogen).

Антитела, применяемые для иммуноокрашивания: анти-F4/80 крысы (Alexa Fluor 647-конъюгированное, Serotec, клон C1, 1:100), анти-фосфо-Smad3 кролика (Epitomics, 1880-1; 1:100), анти-CD8 крысы (Alexa Fluor 488- или 594-конъюгированное, Biolegend, клон 53-6,7, 1:100). Alexa Fluor 488-, 555-, 647-конъюгированное анти-кроличье и анти-крысиное осла (Invitrogen). Конфокальную микроскопию проводят на микроскопах Zeiss LSM780 и LSM5 Pascal.

Все количественные оценки проводят с использованием конфокальных изображений с высоким разрешением, представляющих тонкий (1 воздушная единица; ~1 мкм) оптический срез образца. Изображения анализируют с помощью программы ImageJ. Каждая группа содержала образцы от по меньшей мере 5 контрольных и 5 леченных (ADWA11) мышей. Четыре изображения (размер поля 425,10 x 425,10 мкм) каждого среза ткани получают произвольно, с использованием одинаковых конфокальных настроек. Изображения размещают с одинаковыми границами, затем вычисляют площадь, покрытую пятнами миофибробластов или фосфо-Smad3.

Благоприятные синергетические эффекты комбинированной ADWA11 и анти-PD1 терапии отменяются истощением CD8+ T клеток

Так как наиболее сильные эффекты ADWA11 терапии наблюдали на CD8+ T клетках, в настоящем документе попытались определить, управляют ли эти клетки противоопухолевыми эффектами ADWA11. У мышей, имеющих опухоль CCK168, элиминируют цитотоксические T клетки с применением анти-CD-8a (Bio X Cell® BE0004-1 клон 53-6,72) антитела или контрольного антитела в дозе 10 мг/кг, которое вводят внутрибрюшинно за 24 часа до каждого введения терапевтических средств, начиная с 0 дня. Комбинированные ADWA11 (10 мг/кг) и анти-PD1 (10 мг/кг) вводят инъекцией в дни 1, 5 и 9. Иммуноокрашивание согласно способам, описанным в настоящем документе, показало эффективную элиминацию CD8 (ФИГ. 21A), которая полностью отменяет благоприятные эффекты (например, выживаемость и регрессию опухоли) комбинированной терапии с ADWA11 и анти-PD1 (ФИГ.21B-21C).

Эти данные позволяют предположить, что CD8+ T клетки являются важными для противоопухолевых эффектов, опосредованных анти-avb8, например, ADWA11.

pSmad3, маркер активной TGF β передачи сигналов, присутствует в CCK168 опухолевых клеток и клетках микросреды опухоли, и передача сигналов значительно ингибируется лечением ADWA11

Поскольку наилучшим образом охарактеризованной in vivo функцией αvβ8 интегрина является локальная активация латентного TGFβ, решили определить, какие клетки в нелеченных опухолях демонстрируют признаки передачи сигналов TGFβ, и будет ли эта передача сигналов ингибироваться или подавляться терапией ADWA11. Для идентификации типов клеток в опухолях CCK168, которые активно передают сигналы от TGFβ-рецепторов, иммуноокрашивание используют с антителом к фосфорилированному SMAD3, проксимальной стадии в передаче сигналов TGFβ, в качестве доказательства того, что клетки (CD8+ Т-клетки, макрофаги F4/80 и CD11c дендритные клетки) отвечают на активный TGFβ. Исследованные CCK168 опухоли имеют обширную сеть макрофагов (ФИГ. 22A) во всех опухолях и только незначительное количество интеркалированных DC. pSMAD3 легко определяется в опухолях, обычно в клетках, соседних к F4/80+ макрофагам, но не определяется в самих макрофагах. CD8+ T клетки были рассеянными у нелеченных мышей, и были по существу более многочисленными в опухолях мышей, леченных AWDA-11. pSMAD3 окрашивание не наблюдается в этих клетках. В нелеченных опухолях, высокие уровни pSMAD3 были видны во всей микросреде опухоли; однако, pSMAD3 окрашивание широко ингибировалось лечением ADWA11 (ФИГ. 22A). Таким образом, не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, эти данные указывают, что в некоторых вариантах осуществления, αvβ8 активность является существенной для TGFβ активации в этих опухолях, но что действие TGFβ, активированных αvβ8, на аккумуляцию CD8+ T клетки, экспрессию Granzyme B и распределение подмножеств макрофагов является косвенным или возникает вне микросреды опухоли.

Безэффекторное ADWA11 ингибирует рост опухоли, улучшает общую выживаемость и вызывает долговременный противоопухолевый иммунитет в модели CCK168 плоскоклеточной карциномы и CT-26 карциномах

Исходные исследования проводят с применением нативного антитела мыши, которое может взаимодействовать с Fc рецепторами. Поэтому возможно, что противоопухолевые действия ADWA11 могут возникать благодаря антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) опухолевых клеток или инфильтрующих опухоль макрофагов или дендритных клеток. Для определения действия ADCC на активность ADWA11, создают рекомбинантную, Fc «безэффекторную» версию ADWA11, названную ADWA11_4mut, введением 4 замещений в IgG1 Fc домен антитела мыши для отмены эффекторной функции. Ранее было показано, что эти замены полностью отменяют связывание антитела с Fc рецепторами (Alegre et al.,J. Immunol. 148: 3461-3468, 1992; Hezareh et al., J. Virol. 75: 12161-12168, 2001). ADWA11_4mut является таким же эффективным, как и антитело дикого типа в модели CCK168 (ФИГ. 28). Кроме того, ADWA11_4mut антитело тестируют на эффективность в двух сингенных опухолевых моделях (т.е., CT26 и EMT6 опухолевых моделях).

CT-26 клетки выбирают, в дополнение к CCK168, так как у первых полностью отсутствует определяемая экспрессия αvβ8 (ФИГ. 18B). CT-26 клетки карциномы толстой кишки мыши (ATCC® CRL-2638™) вводят инъекцией в дозе 4 x 10⁵ клеток/мышь в подкожно в подкожный бок самок мышей Balb/c (Charles River Labs). Опухоли выращивают до размера 50-100 мм³ для включения в исследование. Для этих исследований, ADWA11_4mut или изотипический контроль 2B8_mIgG_4mut вводят инъекцией в дни 0, 4, 8, 12, анти-PD1 антитело (RMP1-14, BioXcell) или изотипический контроль 2A3_rat IgG (BioXcell) водят инъекцией внутривенно в дни 0, 4, 8. Все антитела дозируют в количестве 10 мг/кг. На 5 день, опухоль всех мышей, за исключением контрольной группы лечения без облучения, таргетировано облучают 5 Гр дозой радиации. рост опухоли измеряют два раза в неделю цифровыми штангенциркулями и указывают как объем (длина x ширина x ширина x 0,5). Для эксперимента с повторным заражением, на 51 день (после первого лечения антителом) мышам с полным ответом и интактным мышам имплантируют в противоположный бок 2,5 x 10⁵ CT26 клеток в ФРФБ и рост опухоли отслеживают как описано выше.

В обеих моделях, ADWA11_mut4 является эффективным для управления противоопухолевым ответом (ФИГ. 28), демонстрируя, что функция ADCC не требуется для опосредованного ADWA11 противоопухолевого ответа.

ADWA11 является эффективным во множестве моделей карциномы и улучшает действие радиационной терапии и анти-PD-1, анти-CTLA-4 и 4-1BB терапии

Определяют эффективность ADWA11 в других моделях солидной опухоли, и то, может ли ADWA11 более широко улучшать благоприятное действие дополнительных иммуномодулирующих терапий. Способность ADWA11 улучшать действие радиационной терапии на CT-26 карциномы также исследуется, так как предварительно было показано, что эта опухоль является радиочувствительной, не экспрессирует αvβ8 либо in vitro либо in vivo, и было показано, что она отвечает на низкомолекулярный ингибитор TGFB рецептора (Young et al., PloS One 11:e0157164, 2016). При применении доз радиации, которые являются минимально эффективными в качестве терапии, добавление либо ADWA11_4mut либо анти-PD-1 значительно повышает регрессию опухоли и общую выживаемость мышей, с 5/9 и 3/10 пациентов с полным терапевтическим эффектом, соответственно (Фиг. 29A и 29B). Интересно, что добавление анти-PD1 к ADWA11 добавляет незначительную дополнительную пользу в этой модели, давая дополнительное доказательство того, что ингибирование αvβ8 может быть эффективным даже в отсутствии ингибиторов контрольной точки. Выживших мышей, которые показали полную регрессию первичных опухолей, и которые получали либо монотерапию, либо комбинированную терапию, повторно заражали на противоположной стороне теми же CT-26 опухолевыми клетками через по меньшей мере 51 день после начальное терапии. Минимальный рост опухоли наблюдается для противоположных опухолей у нескольких мышей. Все маленькие опухоли, которые изначально росли, впоследствии показали полную регрессию, показывая, что в некоторых вариантах осуществления, успешное лечение ADWA11 может вызвать долговременный противоопухолевый иммунитет, как было предварительно описано для других иммуномодуляторов (Ascierto et al., J. Transl. Med. 15:205, 2017) (ФИГ. 29C). Ни одна из первичных регрессировавших опухолей не показала повторный рост.

ADWA11_4mut является эффективным в модели EMT6 карциномы молочной железы и улучшает действие анти-CTLA-4 и анти-4-1BB.

Модель EMT-6 карциномы груди с исключенным иммунитетом микросреды опухоли и низкими уровнями экспрессии αvβ8 применяют для исследования действия анти-PD-1, анти-CTLA-4 (который, как недавно было показано, работает через другой молекулярный механизм, чем анти-PD1 (Wei et al., Cell 170:1120-1133, 2017) или агониста 4-1BB, костимулирующего рецептора, экспрессированного на CD8+ T клетке (Kang et al., Cancer Res. 2017) в комбинации с ADWA11_4mut.

ADWA11_4mut также тестируют в модели EMT-6 опухоли. 1 X 10⁶ EMT6 клетки (клеточная линия карциномы эпителия молочной железы мыши; ATCC®, CRL2755™) вводят инъекцией в четверть жировой подушки молочной железы самок мышей Balb/c (Charles River Labs). Опухоли выращивают вплоть до 50-100 мм³ в размере. Мышей произвольно распределяют на группы лечения антителом и операторов не ставят в известность, где какая группа лечения. ADWA11_4mut 10мг/кг или контроль 2B8_mIgG4mut 10мг/кг, анти-CTLA4 (9D9 BioXcell) или изотипический контроль E.tenella-mIgG2b 10мг/кг вводят в дни 0, 4 и 8 и анти-4-1BB (MAB9371, R&D systems) 1мг/кг вводят в дни 0 и 4 внутривенным путем. Рост опухоли измеряют дважды в неделю цифровыми штангенциркулями и показывают как объем (длина x ширина x ширина x 0,5).

Анти-PD1, анти-CTLA4 или анти-41-BB монотерапия показала значительную начальную регрессию опухоли, однако только одна мышь, леченная анти-4-1BB, и одна, леченная анти-PD1 имели полную регрессию (ФИГ. 30A-D). Наоборот, приблизительно 70% мышей, леченных ADWA11 в комбинации с анти-PD-1, анти-CTLA4 или анти-4-1BB, имели полную регрессию, долговременную выживаемость и резистентность к повторному заражению EMT6 опухолевыми клетками, что предполагает долговременный противоопухолевый иммунитет (ФИГ. 30E). Для эксперимента с повторным заражением, на 51 день (после первого лечения антителом) мышам с полным ответом и интактным мышам имплантируют с противоположную жировую подушку 1 X 10⁶ EMT-6 клеток, и рост опухоли отслеживают как описано выше.

Эти данные впервые демонстрируют, что ADWA11 антитела, включая ADWA11 2.4, обеспечивают синергетический терапевтический эффект при комбинировании с ингибитором PD-1 или CTLA4 (например, антагонистом антитела, который связывается с PD-1 или CTLA-4 и тем самым ингибируют действие PD-1 или CTLA-4, соответственно) и/или агонистом 4-1BB (например, агонистом антитела, который повышает биологическую активность 4-1BB). Эти данные позволяют предположить, что ADWA11 2.4 является эффективным терапевтическим агентом для человека, который может обеспечивать терапевтический противоопухолевый ответ при объединении с ингибитором, например, PD-1 или CTLA4, или агонистом, например, 4-1BB.

Экспрессия гена интегрина αvβ8 и окрашивание в опухолях человека

Исследование The Cancer Genome Atlas (TCGA) на предмет экспрессии мРНК ITGB8 показало, что почти все опухоли человека из тридцати исследованных типов опухолей экспрессируют устойчивые уровни мРНК ITGB8, причем самые высокие уровни экспрессии обнаруживаются в карциноме яичников и почечно-клеточной карциноме (ФИГ. 23А). Экспрессия ITGB8 в целых опухолевых лизатах может отражать экспрессию αvβ8 на инфильтрирующих иммунных клетках. Чтобы проверить это, была проведена многопанельная проточная цитометрия для оценки экспрессии αvβ8 белка в отдельных клетках в образцах свежесобранных и разъединенных срезах и биопсий опухолей человека. Анализ двух карцином яичников человека и двух почечно-клеточных карцином показал значительную экспрессию αvβ8 на CD16+ моноцитах, CD14+ опухолеассоциированных макрофагах и полученных из моноцитов BCDA1+ и BCDA3+ дендритных клетках (ФИГ. 23B).

Обсуждение

Как понятно специалистам в данной области, ADWA11 является моноклональным антителом, специфичным для блокирования αvβ8 интегрина и является эффективной противоопухолевой иммунотерапией при отдельном использовании. Например, ADWA11 продемонстрировало противоопухолевую активность в CCK168 плоскоклеточной карциноме кожи. Дополнительно или альтернативно, ADWA11 в сочетании с иммуномодулятором (например, анти-PD-1, анти-CTLA-4 и анти-4-1BB) или с радиационной терапией демонстрирует эффективную и синергетическую повышенную противоопухолевую активность в трех сингенных моделях аллотрансплантата эпителиальных карцином на трех разных штаммах мыши. В некоторых вариантах осуществления, ингибирование αvβ8 повышает количество CD8+ T клеток в опухолях, их цитотоксическую дифференциацию, по данным экспрессии Granzyme B в этих клетках. Элиминация CD8+ T клеток отменяет противоопухолевые эффекты ADWA11 и анти-PD1 лечения, показывая, что в некоторых вариантах осуществления, улучшение уничтожения опухолевых клеток CD8 T клетками является критичным для эффективности ADWA11. В дополнение к действию на CD8+ T клетки, ADWA11 повышает количество иммуностимулирующих моноцитов в микросреде опухоли (Franklin et al., Science 344:921-925, 2014; Movahedi et al.,Cancer Res. 70:5728-5739, 2010; Ostuni, Trends Immunol. 36: 229-239, 2015; Noy et al., Immunity 41:49-61, 2014). Хотя не было разницы в количестве иммунодепрессивных макрофагов, эти макрофаги, наряду с дендритными клетками, экспрессировали высокие уровни определяемого αvβ8. Хотя первая протестированная опухолевая линия, клетки CCK168, экспрессировала значительные поверхностные уровни αvβ8 in vitro, небольшая экспрессия αvβ8 была обнаружена проточной цитометрией на не гематопоэтических клеток из собранных опухолей, показывая, что в некоторых вариантах осуществления экспрессия теряется, когда эти злокачественные клетки образуют опухоли in vivo. Тем не менее, возможность того, что противоопухолевые эффекты ADWA11 были связаны с таргетированием злокачественной клетки непосредственно через ADCC, была исключена путем репликации результатов с использованием рекомбинантного, безэффекторного ADWA11 антитела в клетках, которые не экспрессируют какой-либо определяемый αvβ8 (т.е., клетках карциномы толстой кишки CT-26). Безэффекторное антитело было способно подавлять рост опухоли в трех моделях опухолей, CCK168, CT-26 и EMT-6, из которых CT-26 имела неопределяемую экспрессию αvβ8. Кроме того, краткосрочная терапия ADWA11 привела к длительному подавлению опухоли и устойчивости к последующему повторному заражению, что указывает, в некоторых вариантах осуществления, индукцию долговременного противоопухолевого иммунитета. Вместе эти данные указывают на то, что в некоторых вариантах осуществления блокада интегрина αvβ8 вызывает подавление опухоли путем блокирования αvβ8 на клетках врожденного иммунитета или регуляторных клетках Т для повышения адаптивного иммунитета к опухолям.

Активация TGFβ через αvβ8, экспрессированных на дендритных клетках, регуляторных T клетках, фибробластах, клетках эпителия воздушных путей и нейроэпителии, была показана (Travis et al., Nature 449:361-365, 2007; Melton et al., J. Clin. Invest. 120:4436-4444, 2010; Arnold et al., J. Neurosci. 32(4):1197-1206, 2012; Fenton et al., Mucosal Immunol. 10:624-634, 2017; Mu et al., J. Cell Biol. 157:493-507, 2002; Proctor et al., J. Neurosci. 25:9940-9948, 2005; Edwards et al., J. Immunol. 193:2843-2849, 2014), но определение полного диапазона экспрессии интегрина αvβ8 было ограничено отсутствием надежных реагентов для окрашивания тканей. В примерах, приведенных в настоящем документе, недавно разработанные антитела, способные обнаруживать интегрин αvβ8 с помощью проточной цитометрии, были использованы для демонстрации того, что опухолеассоциированные макрофаги и дендритные клетки являются основными типами клеток, демонстрирующими высокое поверхностноклеточное окрашивание для αvβ8 в карциномах мыши. Это указывает на то, что в некоторых вариантах осуществления экспрессия на одном или более из этих типов клеток важна для αvβ8-опосредованного подавления местного противоопухолевого иммунитета.

В Примерах, приведенных в настоящем документе, экспрессия αvβ8 на Т-клетках, включая регуляторные Т-клетки (Treg), не была обнаружена.

Активация TGFβ интегринами, включая αvβ8, жестко пространственно ограничена, позволяя клеткам, экспрессирующим αvβ8, презентировать TGFβ местно клеткам, с которыми они контактируют напрямую (Travis et al., Nature 449:361-365, 2007; Munger et al., Cell 96:319-328, 1999). Было описано, что TGFβ подавляет активность эффекторных Т-клеток. Как показано в примерах, приведенных в настоящем документе, CD8+ Т-клеток увеличены в опухолях, обработанных ADWA11, с большей вероятностью экспрессируют Granzyme B и важны для опосредования защитного действия ADWA11. В некоторых вариантах осуществления, подавляющее действие αvβ8 на клетки врожденного иммунитета обусловлено прямым презентированием активного TGFβ CD8 Т-клеткам. Однако иммуноокрашивание на pSMAD3 не выявило доказательств передачи сигналов TGFβ в CD8+ T-клетках, но показало устойчивую передачу сигналы в не гемопоэтических клетках (например, опухолевых клетках). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, опухолевые клетки и некоторые другие опухолеассоциированные не гемопоэтические клетки (например, фибробласты) являются функционально важными клетками, которые отвечают на TGFβ, активированный αvβ8, и подавляют местный опухолевый иммунитет.

Как описано в примерах, приведенных в настоящем документе, αvβ8 интегрин широко экспрессируется на моноцитах, макрофагах и дендритных клетках во множестве опухолей мыши и человека и является эффективным модулятором противоопухолевого иммунного ответа. Монотерапия (например, ADWA11), нацеленная на этот интегрин, эффективна в некоторых опухолях. Кроме того, эффективность синергетически усиливается за счет комбинирования ингибирования αvβ8 (например, лечением ADWA11) либо с ингибиторами контрольной точки (например, анти-PD1 или анти-CTLA4), либо с иммунным активатором (например, анти-4-1BB) или за счет комбинирования αvβ8 монотерапии с радиационной терапией. Взятые вместе, эти результаты идентифицируют αvβ8 интегрин как новую мишень для иммунотерапии опухолей.

Пример 15: Дополнительная in vivo оценка ADWA11 2.4

Краткое описание моделей опухолей для анти- αvβ8 оценки

Эффективность in vivo оценивают с использованием сингенных моделей опухолей на иммунокомпетентных мышах. Исследования эффективности проводят с безэффекторной версией исходного антитела ADWA11_4mut гибридомы мыши из-за сильного антивидового ответа на лекарственное средство, который ограничивал воздействие гуманизированного ADWA11 2.4.

Таблица 9. Модели опухоли для анти-αvβ8 оценки

Модель Микросреда опухоли Экспрессия αV интегринов Статус пути TGFβ EMT6, рак груди Модель микросреды опухоли с исключенным иммунитетом Экспрессирует оба αvβ8 и αvβ6 Высокий профиль экспрессии гена активации пути TGFβ CT26, рак толстой кишки Существующая ранее иммунная модель Не экспрессирует αvβ8 или αvβ6 Низкий профиль экспрессии гена активации пути TGFβ

Эффективность в модели EMT6

Исследование модели опухоли EMT6 проводят ортотропически (4-я жировая подушка молочной железы) и лечение анти-αvβ8 с или без ингибиторов контрольной точки проводят одновременно.

Мышам Charles River Balb/c (n=10 на группу) имплантируют 3x105 или 1x106 EMT6 клеток/мышь. Лечение начинают при среднем объеме опухоли 50 мм³ или 100 мм³.

Исходное анти-αvβ8 антитело мыши ADWA11_4mut дозируют в количестве 10 мг/кг один раз каждый четвертый день в количестве всего трех доз во всех исследованиях. Анти-PD1 антитело (клон RMP1-14, BioXcell) дозируют в количестве 10 мг/кг один раз каждые четыре дня в количестве всего трех доз, 4-1BB агонист mAb (клон MAB9371, R&D systems) дозируют в количестве 1 мг/кг один раз каждые четыре дня в количестве всего двух доз и анти-CTLA4 (клон 9D9, BioXcell) дозируют в количестве 10 мг/кг один раз каждые четыре дня в количестве всего трех доз.

Эффективность анти-αvβ8 монотерапии ~50% ингибирование роста опухоли (ИРО) (дни 10-20) наблюдают, когда 3x10⁵ клетки имплантируют и лечение начинают при 50 мм³. Однако когда 1x10⁶ клеток имплантируют и лечение начинают при 100 мм³, ИРО для анти-αvβ8 монотерапии не наблюдается. Разница ИРО для анти-αvβ8 монотерапии между двумя исследованиями была не ясна; однако, не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, быстрая скорость роста опухоли в этой модели при имплантации 1x10⁶ клеток может ограничивать ответ или обгонять противоопухолевый ответ на αvβ8-блокаду. Важно, анти-αvβ8 демонстрирует значительное синергетическое лечебное действие с анти-PD1 (7/10 полный ответ), 4-1BB агонистом (5 полных ответов) и анти-CTLA4 (6 полных ответов) и дает повышенную выживаемость по сравнению с группами монотерапии и изотипического контроля. Поэтому эти данные позволяют предположить, что ADWA11 антитела могут обеспечивать противоопухолевый ответ в EMT-6 модели опухоли.

Монотерапия анти-CTLA4 или 4-1BB агонистом демонстрирует значительный ответ (~50% ИРО, день 8-20); однако ответ является временным и опухоли в конечном счете перерастают ответ. Для демонстрации того, что комбинированное лечение вызывает клеточный ответ EMT6 опухоли, по сравнению с анти-ангиогенезным или анти-пролиферативным ответом, мышей с полным ответом повторно заражали на 51 день (после 1-й дозы) вторым имплантатом EMT6 опухоли, но без дополнительного лекарственного лечения. EMT6 опухоли быстро растут у интактных мышей, но быстро очищаются у мышей с полным ответом, показывая, в некоторых вариантах осуществления, развитие клеточного иммунитета к опухолевым клеткам, например, прямой гибели опухолевых клеток, не опосредованной анти-ангиогенезом или анти-пролиферацией.

Количественная оценка численности лимфоцитов в модели EMT6 опухоли

Для исследования влияния анти-αvβ8 лечения на EMT6 микросреду опухоли, численность подмножеств лимфоцитов количественно оценивания с применением IHC. Коротко, мышам Charles River Balb/c (n=10 на группу) имплантируют 1x10⁶ EMT6 клеток, и лечение начинают при среднем объеме опухоли 100 мм³ (День 0). Анти-αvβ8 ADWA11 2.4 антитело дозируют в количестве 10 мг/кг на каждый третий день (например, День 0, День 3, День 6 и День 9) в количестве всего четырех доз, и опухоли собирают на 11 день 11 (48 часов после 4-й дозы).

Иммуногистохимический (ИГХ) анализ плотности окрашивания CD45 (общего количества лимфоцитов и миелоидных клеток), CD3 (общего количества T клеток), CD4 T клеток, CD8 T клеток и Granzyme B (активированных CD8 и NK клеток) демонстрирует, что анти-αvβ8 монотерапия повышает численность общих CD45, CD4 T клеток, CD8 T клеток и очень значительно снижает плотность клеток, экспрессирующих Granzyme B (n=10 для каждой группы) (ФИГ. 15). Данные IHC показывают, что в некоторых вариантах осуществления, монотерапия ADWA11 2.4 является достаточной для изменения микросреды опухоли, что согласуется с ожидаемым механизмом действия (ОМД) αvβ8.

Эффективность в модели CT26

Модель CT26 выбирают на основе отсутствия экспрессии αvβ8, частичного ответа на анти-PD1 терапию и имеющихся в литературе данных о синергетическом ИРО для низкомолекулярного ингибитора TGFβ с субоптимальной дозой радиации. Радиационная терапия (РТ) представляет особый интерес из-за ее способности индуцировать гибель иммунологических клеток и de novo примирование DC-T клеток, где αvβ8 потенциально играет важную роль в формировании дифференциации и активации T-клеток. Коротко, мышам Charles River Balb/c (n=10 для каждой группы) подкожно имплантируют клетки 4e5, и лечение начинают при среднем объеме опухоли 100 мм³.

Анти-αvβ8 эффекторное нуль-антитело мыши ADWA11_4mut вводят в дозе 10 мкг/кг Q4Dx4, анти-PD1 (клон RMP1-14, BioXcell) дозируют в количестве 10 мкг/кг Q4Dx3 и дают дозу 5 Гр направленной на опухоль радиации через 5 дней после первой дозы mAb. Включение анти-αvβ8 с РТ приводит к значительному увеличению ИРО, причем 5/9 мышей показали полный ответ. Включение анти-PD1 с РТ приводит к менее значительному ИРО по сравнению с анти-αvβ8, при этом 3/10 мышей показали полный ответ. Тройная комбинация РТ, анти-αvβ8 и анти-PD1 дает очень значительное ИРО у 7/10 мышей с полным ответом. Как и в исследовании EMT6, мыши с полным ответом были невосприимчивы к повторному заражению клетками CT26.

Иммунофенотипирование популяции клеток, инфильтрующих CT26 опухоль

Для исследования влияния лечения анти-αvβ8 на микросреду опухоли CT26, численность подмножеств лимфоцитов количественно определяют проточной цитометрией. Коротко, мышам Charles River Balb/c (n=6 для каждой группы) подкожно имплантируют клетки 4e5, и лечение начинают при среднем объеме опухоли 100 мм³. Анти-αvβ8 ADWA11 2.4 дозируют в количестве 10 мг/кг или 1 мг/кг Q3Dx3, и опухоли собирают на 8 день (48 часов после 3-й дозы). Опухоли диссоциируют, и популяцию лимфоцитов количественно определяют CyTOF цитометрией. Анти-αvβ8 (10 и 1 мг/кг) увеличивает численность CD8 Т-лимфоцитов в гейте CD3 Т клеток. Кроме того, CD8 клетки более часто экспрессируют GranzymeB, маркер активированного фенотипа.

Сущность

Взятые вместе, исследования эффективности и ФД EMT6 и CT26 демонстрируют: (1) что анти-αvβ8 синергетически увеличивает ответ на несколько ингибиторов контрольной точки; (2) что эффективность анти-αvβ8 не зависит от экспрессии αvβ8 опухолевой клеткой; и (3) что монотерапии анти-αvβ8 ADWA11 2.4 достаточно для увеличения численности CD8+ GzmB+ T клетки в микросреде опухоли.

Пример 16: фармакокинетика ADWA11 2.4 у трансгенных FcRn человека (TG32) мышей

Было показано, что мышиная модель TG32 так же хороша как обезьяньи модели для прогнозирования фармакокинетики IgG1 и IgG2 mAb у человека, которая демонстрирует линейную фармакокинетику. Фармакокинетику ADWA11 2.4 оценивают у TG32 мышей после однократной ВВ болюсной дозы, введенной в количестве 0,1, 0,3 или 3 мг/кг. Затем измеряют концентрацию лекарственного средства в сыворотке. Как показано в ФИГ. 25A и ФИГ.25B, наблюдают четкую тенденцию к дозозависимому снижению клиренса антитела. Это типично для моноклональнальных антител, которые взаимодействуют с мишенями на клеточной поверхности, и указывает на то, что рецептор-мишень, αvβ8, может действовать как механизм клиренса. Следовательно, используют две отдельные фармакокинетические модели для описания линейного (типичный механизм клиренса антитела, опосредованного FcRn) против не линейного (опосредованного αvβ8) пути клиренса. Для оценки параметров линейного клиренса используют двухкамерную популяционную фармакокинетическую модель для согласования только с данными для 3 мг/кг (ФИГ. 25A). Для оценки фармакокинетических параметров не линейного клиренса для нескольких доз используют двухкамерную насыщаемую модель (Michaelis Menten), чтобы согласовать со всеми данными (0,1, 0,3, 3 мг/кг) (ФИГ. 25B). Расчетные линейные и не линейные фармакокинетические параметры показаны в таблицах 10 и 11, соответственно. Линейные фармакокинетические параметры находятся в пределах диапазона, наблюдаемого для типовых mAb у TG32 мышей.

Таблица 10. Двухкамерные фармакокинетические параметры у TG32 мышей (ВВ в дозе 3 мг/кг)

Параметр Оценка % CV CL (мл/ч/кг) 0,33 9,2 CLD (мл/ч/кг) 2,3 13 V1 (мл/кг) 49 2,4 V2 (мл/кг) 38 9,6 t_1/2 (день) 7,6

CL: клиренс из центральной камеры; CLD: межкамерный клиренс распределения; V1: объем распределения для центральной камеры; V2: объем распределения для периферической камеры; t_1/2, конечный период полувыведения, рассчитанный на основе оценочных параметров.

Таблица 11. Двухкамерные не линейные фармакокинетические параметры у TG32 мышей (ВВ в дозе 0,1, 0,3 и 3 мг/кг)

Параметр Оценка % CV Km (нг/мл) 1659 25 Vmax (нг/ч/кг) 6596 5 CLD (мл/ч/кг) 3,4 20 V1 (мл/кг) 49 4 V2 (мл/кг) 48 8

Vmax: максимальная скорость; Km: концентрация субстрата для достижения полумаксимальной скорости; CLD: межкамерный клиренс распределения; V1: объем распределения для центральной камеры; V2: объем распределения для периферической камеры.

В соответствии с наблюдаемым мишень-опосредованным распределением препарата (TMDD), основанным на фармакокинетике в сыворотке, дозозависимое уменьшение распределения препарата в нескольких тканях (из-за насыщающего связывания мишени), особенно в почках, также наблюдают в исследовании распределения в тканях.

Пример 17: Фармакокинетика у приматов, отличных от человека (NHP)

Фармакокинетику ADWA11 2.4 оценивают в диагностическом токсикологическом исследовании NHP после первой дозы в исследовании многократного введения в дозах 4, 40 или 100 мг/кг. Как показано в ФИГ. 26, воздействие ADWA11 2.4 представляется линейным в пределах этого диапазона доз из-за того, что он находится выше диапазона насыщения для мишень-опосредованного распределения препарата (TMDD). Двухкамерную линейную модель используют для согласования данных (ФИГ. 26), и расчетные параметры фармакокинетики показаны в таблице 12. В то время как наблюдаемые объемы CL и распределения находились в пределах диапазонов для типовых mAb, конечный t_1/2, по-видимому, находится на коротком конце диапазона. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, это, вероятно, связано с тем, что конечная фаза не была четко определена, из-за выборки только до 7 дней после введения дозы (предел дизайна исследования ETS).

Таблица 12. Двухкамерные фармакокинетические параметры у NHP (ВВ в дозе 4, 40 и 100 мг/кг - первая доза)

Параметр Оценка % CV CL (мл/ч/кг) 0,41 8,7 CLD (мл/ч/кг) 15,9 25 V1 (мл/кг) 35,6 12 V2 (мл/кг) 25,1 25 t_1/2 (день) 4,3

CL: клиренс из центральной камеры; CLD: межкамерный клиренс распределения; V1: объем распределения для центральной камеры; V2: объем распределения для периферической камеры; t_1/2, конечный период полувыведения, рассчитанный на основе оценочных параметров.

Пример 18: Фармакокинетика суррогатного антитела мыши в качестве монотерапии и при совместном дозировании с анти-PD-1

Фармакокинетические данные для однократной дозы исходного (IgG мыши) не доступны, но степень воздействия измеряют вплоть до четырех временных точек в нескольких исследованиях эффективности, и они, по-видимому, согласуются по всем этим исследованиям. Степень воздействия исходного (IgG мыши), по-видимому, является линейной в исследованном диапазоне доз (1, 3 и 10 мг/кг), что соответствует насыщению TMDD по оценке на TG32 мышах для гуманизированного антитела, ADWA11 2.4. Двухкамерную фармакокинетическую модель сопоставляют с данными степени воздействия в дозозависимом исследовании модели EMT6 опухоли, оценивая только CL при фиксации других параметров со значениями, показанными выше, для гуманизированного антитела у TG32 мышей. Оценочный CL для исходного (IgG мыши) у этих мышей, имеющих опухоль, составляет 0,74 мл/ч/кг.

Степень воздействия исходного (IgG мыши), по-видимому, на ~5-50x ниже согласно исследованию повторяющегося совместного дозирования с анти-PD-1 антителом по сравнению с таковой при дозировании только суррогатного антитела мыши или совместном дозировании с контрольным IgG 2A3 крысы. Это явление наблюдают в двух отдельных исследованиях с применением двух разных моделей опухолей (CT26 и EMT6). Более низкая степень воздействия обуславливается, вероятно, повышенным образованием ADA в присутствии анти-PD-1, как было показано у PD-1 нокаутных мышей (Nishimura H et al., 1998, International Immunol. 10(10): 1563-72). Повышенное образование ADA после лечения анти-PD-1 антителом (пембролизумаб) также было показано в клинике.

Пример 19: Прогнозирование ФК/степени воздействия у человека

Фармакокинетический профиль ADW11 2.4 у человека в дозах, насыщающих мишень-опосредованное распределение препарата (TMDD) прогнозируют масштабированием линейных фармакокинетических параметров от TG32 мышей (таблица 13). Спрогнозированные линейные фармакокинетические параметры для человека даны в таблице 13. Кроме того, линейный CL для человека 0,12 мл/ч/кг прогнозируют на основе измеренного AC-SINS связывания (оценка=2, раздел 2.4), с применением платформы модели PBPK. Линейный CL для человека 0,086 мл/ч/кг прогнозируют аллометрическим масштабированием из NHP. Эти значения CL находятся в пределах 2x диапазона к прогнозу на основе аллометрического масштабирования TG32 (0,15 мл/ч/кг), дополнительно подтверждая, что в дозах, насыщающих TMDD, ADW11 2.4 будет иметь фармакокинетический профиль, который является типовым для моноклонального антитела.

Эти результаты показывают, что ADWA11 2.4 является потенциальным полезным терапевтическим антителом для человека.

Таблица 13. Спрогнозированные линейные фармакокинетические параметры для человека для ADWA11 2.4

Параметр Коэффициент масштабирования Спрогнозированное значение CL (мл/ч/кг) 0,9 0,15 CLD (мл/ч/кг) 0,67 0,15 V1 (мл/кг) 0,97 39 V2 (мл/кг) 0,93 21 t_1/2 (день) НД 12

CL: клиренс из центральной камеры; CLD: межкамерный клиренс распределения; V1: объем распределения для центральной камеры; V2: объем распределения для периферической камеры; t_1/2, конечный период полувыведения, рассчитанный на основе оценочных параметров.

Дополнительные ФК и/или TK для одной ВВ и ПК дозы ADWA11 (2.4) характеризуют на самцах hFcRn TG32 мышей (n=4 или 8/группу дозирования) и самцах яванского макака (n=1/группу дозирования) и корректируют фармакокинетические параметры для человека, указанные ранее в настоящем документе. Более конкретно, после однократного ВВ дозирования (0,1, 0,3 и 3 мг/кг TG32 мышам и яванским макакам), ФК ADWA11 (2.4) не была линейной у обоих видов при тенденции дозозависимого снижения CL, что согласуется с насыщаемым мишень-опосредованным распределеним препарата. В дозах выше насыщаемого клиренса, ФК ADWA11 (2.4) является линейной и согласуется с типовым IgG1 mAb человека. Средние параметры ФК и TK после однократного ПК дозирования в количестве 10 мг/кг, T_max наблюдают через 240 часов после дозирования, и биодоступность оценивают как приблизительно 100% на основе сравнения с нормализованной по дозе ППК_inf после однократного ВВ дозирования в количестве 3 мг/кг.

Ожидается, что ADWA11 (2.4) будет дозозависимым при более низких дозах, чем указано выше в других частях настоящего документа. То есть, ФК ADWA11 (2.4) для человека прогнозируют на основе аллометрического масштабирования ФК модели для яванского макака, которая включает и линейный, и не линейный клиренс. Скорректированные прогнозируемые ФК параметры для человека следующие: 36 мл/кг для объема распределения для центральной камеры, 33 мл/кг для объема распределения для периферической камеры, 0,12 мл/кг/ч для клиренса из центральной камеры (линейный CL), 0,51 мл/кг/ч для межкамерного клиренса и максимальная скорость не линейного выведения 0,46 мкг/мл/ч, и Km 0,42 мкг/мл для не линейного клиренса. Эта модель прогнозирует, что не линейный клиренс ADWA11 (2.4), по-видимому, будет насыщенным при концентрации в плазме свыше 14 мкг/мл при спрогнозированном t½ приблизительно 15-17 дней.

Пример 20: Соотношение фармакокинетики-фармакодинамики и прогнозирование эффективной дозы для человека

При отсутствии четких ответов степень воздействи-ИРО в сингенных моделях опухоли у мышей, доза 10 мг/кг считается эффективной дозой для оценки эффективной концентрации. С применением фармакокинетической модели для парентерального введения (IgG мыши), среднюю концентрацию (C_avg) оценивают как 107 мкг/мл на 12 день (4 дня после последней дозы в исследовании Q4D x 3 дозирования в количестве 10 мг/кг). Также, хотя и немного выше, значения C_avg оценивают расчетом ППК с применением линейного правила трапеций из доступных данных степени воздействия.

Поскольку для ADWA11 2.4 при этих эффективных уровнях концентрации ожидается типичная фармакокинетика антитела, для прогнозирования дозы для человека используют двухкамерную фармакокинетическую модель с масштабированными параметрами TG32 мыши (таблица 13) (Betts et al. MABS (2018) 1-14). Кроме того, дозы для человека, спрогнозированные с использованием масштабированных фармакокинетических параметров для NHP, отличаются всего примерно на 20% от доз, спрогнозированных с применением TG32 мыши. Чтобы подгонки C_avg, эффективная ВВ доза для человека 7 мг/кг прогнозируется для дозирования Q14D x 3, а ВВ доза 12 мг/кг прогнозируется для дозирования Q28D x 3 (Фиг. 27A-27B). Доза также может быть адаптирована к конкретным популяциям пациентов, клиническим показаниям и/или клиническим признакам и симптомам.

Прогнозирование ФК ADWA11 2.4 для человека было уточнено на основе аллометрического масштабирования от яванского макака и результатов дополнительных доклинических исследований эффективности. Спрогнозированную эффективную дозу (C_eff) определяют как концентрацию в плазме, которая в 10 раз превышает полумаксимальный эффект на ингибирование роста опухоли в различных исследованиях с использованием 2 вышеупомянутых моделей опухолей у мышей. C_eff во всех исследованиях составляла в диапазоне 10-98 нМ; поэтому был использован консервативный подход для определения 100 нМ (верхний предел диапазона) в качестве целевой C_eff. Эффективная доза ADWA11 2.4, по прогнозам, составляет примерно 2 мг/кг ВВ Q14D или 4 мг/кг ВВ Q28D, что, по прогнозам, обеспечивает покрытие ингибирования роста опухоли >IC90 при расчетной минимальной концентрации препарата (100 нМ). Прогнозируемые C_max, C_ave и C_min в устойчивом состоянии при прогнозируемых эффективных дозах составляют 84, 44 и 29 мкг/мл после 2 мг/кг Q14D (ВВ) и 132, 45 и 21 мкг/мл после 4 мг/кг Q28D (ВВ), соответственно. Спрогнозированны й t½ для человека составляет приблизительно 15-17 дней при прогнозируемой эффективной дозе.

Эти результаты подтверждают, что ADWA11 2.4 является потенциально полезным терапевтическим антителом для человека в том, что оно может быть дозировано в количествах, которые экономически целесообразны и подходят для производства.

Пример 21: Токсикокинетика у CD-1 мышей при повторном введении

Оценки токсикокинетики и антитела к лекарственному средству проводят после недельного внутривенного (ВВ) или подкожного (ПК) введения ADWA11 2.4 в дозе 10 (ВВ), 100 (ПК) или 200 (ВВ) мг/кг/неделю в количестве всего 4 доз мышам CD-1 (n=3/пол/доза в группе) как часть GLP исследования токсичности при повторном введении.

Не было количественно измеряемых концентраций ADWA11 2.4 в образцах, собранных и проанализированных из контрольной группы носителя в любой момент времени во время исследования. На основе качественного обзора данных не было устойчивых половых различий в системном воздействии (по оценке Cmax и AUC168), поэтому средние по группе токсикокинетические параметры представлены с использованием объединенных данных от самцов и самок мышей CD-1 (таблица 18).

Таблица 18. Общие средние токсикокинетические параметры для ADWA11 2.4 у мышей CD-1.

Доза (мг/кг/неделю)/Путь День C_max
(мкг/мл) T_max
(часы) ППК₁₆₈ (мкг•ч/мл) 10/ВВ 1
22 199
615 0,54
1,1 15400
46400 100/ПК 1
22 871
750 72
18 104000
591000 200/ВВ 1
22 5020
6510 0,25
0,54 258000
267000

ППК₁₆₈=Площадь под кривой концентрация-время от 0 до 168 часов; C_max=максимальная наблюдаемая концентрация; T_max=время, в которое впервые наблюдается C_max.

После ВВ дозирования, системное воздействие повышается при повышении дозы в приблизительно дозозависимой манере на 1 день 1, и менее чем дозозависимой манере на 22 день. Средние коэффициенты накопления (ППК₁₆₈, День 22/День 1) составляют 3,0, 0,6 и 1,0 для 10 мг/кг/неделю (ВВ), 100 мг/кг/неделю (ПК) и 200 мг/кг/неделю (ВВ), соответственно. Отсутствие накопления после повторного дозирования в количестве 100 мг/кг/неделю (ПК) и 200 мг/кг/неделю (ВВ) может быть связано с присутствием ADA у животных в этих группах дозирования.

Общая частота индукции ADA к ADWA11 2,4 составила 28% (5/18 животных). Частота индукции ADA к ADWA11 2.4 составила 0% (0/6 животных), 67% (4/6 животных) и 17% (1/6 животных) у мышей CD-1, которым вводили дозу ADWA11 2.4 10 (ВВ), 100 (ПК) или 200 (ВВ) мг/кг/неделя, соответственно. В целом, воздействие на ADA-положительных животных было таким же или ниже, чем для ADA-отрицательных животных.

Пример 22: Токсикокинетика у яванских макаков при повторном введении

Оценки токсикокинетики и антитела к лекарственному средству проводят после еженедельного внутривенного (ВВ) или подкожного (ПК) введения ADWA11 2.4 в дозах 8 (ВВ), 100 (ПК) и 200 (ВВ) мг/кг/неделю в количестве всего 5 доз яванским макакам в рамках исследования токсичности повторных доз GLP.

Не было количественно измеряемых концентраций ADWA11 2.4 в образцах, собранных и проанализированных в контрольной группе носителя в любой момент времени во время исследования или в любой группе, получавшей дозу исследуемого препарата до введения дозы в 1 день. Не было очевидных половых различий в системных воздействиях. (по оценке C_max и ППК₁₆₈) по группам дозирования; поэтому средние групповые параметры TK обсуждаются и представлены с использованием объединенных данных по самцам и самкам яванских макаков (таблица 19).

Таблица 19. Общие средние токсикокинетические параметры для ADWA11 2.4 у яванских макаков.

Доза (мг/кг/неделю)/Путь День C_max
(мкг/мл) T_max
(часы) ППК₁₆₈ (мкг•ч/мл) 8/ВВ 1
22 248
394 0,54
6,3 17300
44600 100/ПК 1
22 1270
2880 72
32 161000
393000 200/ВВ 1
22 6200
11400 1,1
2,7 479000
1100000

ППК₁₆₈=Площадь под кривой концентрация-время от 0 до 168 часов; C_max=максимальная наблюдаемая концентрация; T_max=время, в которое впервые наблюдается C_max.

После недельного дозирования в количестве 8 (ВВ), 100 (ПК) и 200 (ВВ) мг/кг системное воздействие увеличивается примерно пропорционально дозе как в 1 день, так и в 22 день, с коэффициентами накопления (День исследования 22/День исследования 1) в диапазоне от примерно 2,3 до 2,6.

Общая частота индукции ADA к ADWA11 2,4 составила 39% (7/18 животных) для всех групп дозирования. Частота индукции ADA к ADWA11 2.4 составила 17% (1/6), 33% (2/6) и 67% (4/6) у животных, которым вводили дозу ADWA11 2.4 8 (ВВ), 100 (ПК) или 200 (ВВ) мг/кг/неделя, соответственно. В целом, воздействие на ADA-положительных животных было таким же по сравнению с ADA-отрицательными животными.

Пример 23: Не клиническая токсикология у мышей и яванских макакаков

AWA11 2.4 вводили мышам и яванским макакам в рамках внутривенных (ВВ) и подкожных (ПК) исследований продолжительностью вплоть до 1 месяца. Органы-мишени, идентифицированные в этих исследованиях, включают кость, селезенку и изменения клинической химии, хотя эти изменения не считаются неблагоприятными. Доза, не приводящая к развитию наблюдаемого нежелательного эффекта (NOAEL) в 1-месячных исследованиях составила 200 мг/кг/неделю ВВ (C_max и ППК₁₆₈ 6510 мкг/мл и 267000 мкг⋅ч/мл) для мышей и (C_max и ППК₁₆₈ 11,400 мкг/мл и 1100000 мкг⋅ч/мл) для яванских макаков, соответственно.

Токсичность однократной дозы

ADWA11 2.4 переносится после однократной ПК дозы 10, 30 или 100 мг/кг самками мышей CD-1 после 2-недельной фазы наблюдения. Во время исследования не было никаких данных, связанных с тестируемым препаратом, и среднее системное воздействие увеличивалось с каждой дозой дозозависимым образом, по данным площади под кривой (ППК). При 100 мг/кг средние C_max и ППК₃₃₆ составили 795 мкг/мл и 148000 мкг*ч/мл, соответственно.

Токсичность при повторном дозировании

Исследование 1 : В исследовании 1, самкам мышей CD-1 вводят ADWA11 2.4 ВВ болюсом в дозах 0, 1, 10 или 100 мг/кг/дозу в дни 1, 4, 8, 11 и 14. Все мыши выживают в течение исследования и все дозы переносятся. При 100 мг/кг/дозу, имеются связанные с тестируемым веществом различия в параметрах клинической химии по сравнению с контрольными средними, которые включают пониженную глюкозу (0,75x) и повышенный фосфор (1,35x), глобулин (1,09x) и азот мочевины в крови (1,18x) без каких-либо связанных микроскопических данных или четкой связи с дозой (глюкоза и фосфор). При ≤10 мг/кг/дозу, связанные с тестируемым веществом различия в параметрах клинической химии включают низкую глюкозу (0,77x только при 10 мг/кг/дозу) и высокий фосфор (1,26x), по сравнению с контрольными средними. Среднее системное воздействие повышается при повышении дозы в приблизительно дозозависимой манере на 1 день и 11 день. При 100 мг/кг/дозу, наивысшей вводимой дозе, средняя C_max и ППК48 составляют 4510 мкг/мл и 124,000 мкг⋅ч/мл на 11 день.

Исследование 2 : В исследовании 2, яванским макакам вводят ADWA11 2.4 ВВ болюсом один раз в неделю в дозах 0, 4, 40 или 100 мг/кг/дозу в дни 1, 8 и 14. Все обезьяны выживают в течение исследования и все дозы переносятся. Единственными, связанными с тестируемым веществом данными были снижения в CD8+ интактных T клетках и у самок (0,21x от базового значения) и у самцов (0,44x от базового значения) обезьян в группе 100 мг/кг/дозу, но никаких изменений не наблюдается в группах 4 или 40 мг/кг/дозу. Среднее системное воздействие повышается при повышении дозы в приблизительно дозозависимой манере на 1 день. При 100 мг/кг/дозу, наивысшей вводимой дозе, средняя C_max и ППК₁₆₈ составляют 3550 мкг/мл и 162,000 мкг⋅ч/мл на 1 день.

Исследование 3 : В исследовании 3, ADWA11 2.4 вводят самцам яванских макаков ВВ болюсом один раз в 1 день в дозах 0,1, 0,3 или 3 мг/кг/дозу или ПК инъекцией в 1 день в дозах 0,1, 0,3 или 3 мг/кг или ПК инъекцией 10 мг/кг. Затем животным, которым вводили 0,1 или 0,3 мг/кг (ВВ) в 1 день, также вводят 30 или 100 мг/кг ПК инъекцией, соответственно, на 8 день. Все вводимые дозы, пути введения переносились. Прижизненные наблюдения, связанные с тестируемым веществом, отсутствуют (т.е. клинические признаки или изменение массы тела или потребления пищи) в течение 22- или 29-дневного периода наблюдения после введения дозы. Отсутствуют доказательства покраснения или отека в местах введения.

После однократного ВВ введения 0,1, 0,3 и 3 мг/кг в 1 день 1, системное воздействие лекарственного средства дозозависимо повышается между 0,1 и 0,3 мг/кг, и более чем дозозависимо между 0,3 и 3 мг/кг. После однократного ПК введения 10 мг/кг в 1 день, или при 30 мг/кг и 100 мг/кг на 8 день, системное воздействие лекарственного средства повышается дозозависимо. ПК биодоступность относительно ВВ дозы 3 мг/кг составляет 103%, 79% и 100% при 10, 30 и 100 мг/кг, соответственно. Введение ADWA11 2.4 в дозе 0,1, 0,3 или 3 мг/кг (ВВ) или 10, 30 или 100 мг/кг (ПК) яванским макакам переносилось, и системное воздействие повышалось с дозой.

Исследование 4 : В исследовании 4, ADWA11 2.4 вводят один раз в неделю самцам и самкам мышей CD-1 ВВ и/или ПК в дозах 0 (ВВ и ПК), 10 (ВВ), 100 (ПК) или 200 (ВВ) мг/кг/неделю в течение 1 месяца (всего 5 доз). Данные, связанные с тестированным веществом, были ограничены неопасными изменениями в клинической химии, параметрах иммунофенотипирования в селезенке и в весе селезенки.

Все животные выжили до планового вскрытия трупа, за исключением одного самца 100 (ПК) мг/кг в неделю, который был найден мертвым на 5 день; однако смерть этого животного не считается связанной с исследуемым веществом. Посмертный аутолиз наблюдается в различных органах и явился причиной смерти в группе 200 (ВВ) мг/кг/неделя, и включал более высокий глобин (1,15x до 1,16x) у обоих полов, более низкое отношение AG (0,85x) у самок и более высокое содержание общего белка (1,11x) у самцов по сравнению с одновременным контролем. Введение тестируемого mAb повышает системную концентрацию гаммаглобулина и, вероятно, способствует этим изменениям в сывороточных белках. Из-за их небольшой величины и отсутствия соответствующих микроскопических или макроскопических результатов, эти наблюдения в параметрах клинической химии не были неблагоприятными. В селезенке, связанное с исследуемым веществом меньшее количество CD8+ Т-клеток (0,52x, 0,65x и 0,60x контрольное среднее) у самок и более высокий процент CD4+ T-клеток, экспрессирующих маркер активации CD25 (1,62x, 1,90x и 1,52x контрольное среднее) у самцов были отмечены при дозах 10 (ВВ), 100 (ПК) и 200 (ВВ) мг/кг/неделя, соответственно, на 30 день. Средняя абсолютная и относительная (к массе тела и мозга) масса селезенки была ниже (от 0,86x до 0,88x контроль) у самок при дозе 200 (ВВ) мг/кг/неделя. Не было коррелирующих макроскопических или микроскопических результатов для более низкой массы селезенки. На основании качественного обзора данных, не было выявлено устойчивых связанных с полом различий в системном воздействии, оцененных по C_max и ППК₁₆₈. Системное воздействие увеличивалось с увеличением ВВ или ПК дозы. После повторного дозирования, воздействие увеличивалось при 10 мг/кг/неделя (ВВ), уменьшалось при 100 (ПК) мг/кг/неделя и оставались прежними при 200 (ВВ) мг/кг/неделя. Частота индукции антилекарственного антитела (ADA) к ADWA11 2.4 составила 0% (0/6), 67% (4/6) и 17% (1/6) при 10 (ВВ), 100 (ПК) или 200 (ВВ) мг/кг/неделя, соответственно. Не было никаких доказательств наличия связанных с ADWA11 2.4 микроскопических данных в сердце или коже через месяц после введения ADWA11 2.4.

После повторного введения дозы, воздействие у ADA-положительных животных было аналогичным или немного ниже по сравнению с ADA-отрицательными животными. Наивысшая введенная доза, 200 (ВВ) мг/кг/неделя, была определена как доза, не приводящая к развитию наблюдаемого нежелательного эффекта (NOAEL) на основании отсутствия побочных эффектов при любой дозе и была связана с C_max 6510 мкг/мл и ППК₁₆₈ от 267000 мкг⋅ч/мл на 22 день.

Исследование 5 : В исследовании 5, яванским макакам вводят ADWA11 2.4 в виде ВВ и/или ПК доз 0 (ВВ и ПК), 8 (ВВ), 200 (ВВ) или 100 (ПК) мг/кг/неделю в течение 1 месяца (всего 5 доз). В этом исследовании не было обнаружено неблагоприятных результатов, связанных с тестируемым веществом. Не неблагоприятные результаты, связанные с тестируемым веществом, включают одностороннюю физическую дисплазию в реберно-хрящевом соединении у самцов и изменения белков сыворотки (увеличение глобулина (вплоть до 1,29x), общего белка (вплоть до 1,10x) и/или снижение соотношения альбуминов и глобулинов (вплоть до 0,75x) у самок при 100 (ПК) мг/кг/неделю и обоих полов при 200 (ВВ) мг/кг/неделю. Системное воздействие (по оценке C_max и ППК₁₆₈) было похожим у самцов и самок в разных группах дозирования, а среднее системное воздействие в группах с ВВ дозой увеличивалось с увеличением дозы в приблизительно дозозависимой манере в дни 1 и 22. Воздействия были выше после повторных доз во всех группах. Не было никаких доказательств наличия связанных с ADWA11 2.4 микроскопических результатов в сердце или коже через месяц после введения ADWA11 2.4.

Частота индукции ADA составила 17% (1/6 животных), 33% (2/6 животных) и 67% (4/6 животных) для животных, получавших ADWA11 2.4 в дозе 8 (ВВ), 100 (ПК) или 200 (ВВ) мг/кг/неделю, соответственно; частота индукции ADA к ADWA11 2,4 составляла 39% во всех группах. Воздействие в сыворотке у ADA-положительных животных было в целом сходным по сравнению с ADA-отрицательными животными. После ВВ или ПК введения один раз в неделю ADWA11 2.4, 200 (ВВ) мг/кг/неделя была определены как NOAEL в этом 1-месячном исследовании токсичности на обезьянах, на основании отсутствия неблагоприятных результатов в каких-либо исследованиях при жизни или после смерти. При 200 (ВВ) мг/кг/неделю, средняя C_max составляет 11400 мкг/мл и средняя ППК₁₆₈ составляет 1100000 мкг⋅ч/мл на 22 день.

NOAEL в 1-месячных исследованиях составляют 200 мг/кг ВВ и для мышей (C_max и ППК_last 6510 мкг/мл и 267000 мкг⋅ч/мл) и для яванских макаков (C_max и ППК_last 11400 мкг/мл и 1100000 мкг⋅ч/мл), соответственно.

Пример 24: In vitro связывание комплементного белка C1q и FcR

Потенциал ADWA11 2.4 вызывать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) и антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) исследуют в анализах in vitro скрининга через связывание гамма-рецепторов C1q и Fc (FcγR), соответственно. ADWA11 2.4 не связывается с C1q при тестируемых концентрациях (вплоть до 30 мкг/мл) и поэтому считается имеющим низкий потенциал для индукции CDC. Связывание ADWA11 2.4 со всеми протестированными FcγR было сходным или более низким по сравнению со связыванием с отрицательным контрольным антителом и более низким по сравнению со связыванием с положительным контрольным антителом. Таким образом, считается, что ADWA11 2.4 имеет низкий потенциал вызывать активность ADCC.

Пример 25: In vitro анализ выделения цитокина

Анализ выделения цитокинов in vitro проводят в форматах цельной крови и PBMC с использованием образцов от 8 доноров-людей. После инкубации с ADWA11 2.4 не наблюдают выделение TNF, IL-6 или INF-γ, связанное с исследуемым веществом. Эти данные согласуются с отсутствием изменений в профилях цитокинов сыворотки после введения ADWA11 2.4 в исследованиях на мышах и обезьянах, описанных выше.

Пример 26: Ингибирование αvβ8 улучшает эффективность анти-PD-1 терапии с модели MC38 опухоли

Способы:

В этом исследовании, клеточную линию MC38 карциномы толстой кишки мыши сохраняют в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 единиц/мл пенициллина G натрия, 100 мкг/мл сульфата стрептомицина и 25 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в колбах для тканевых культур в увлажненном инкубаторе при 37°C, в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха. В день имплантации опухоли, опухолевые клетки MC38 собирают во время экспоненциального роста и ресуспендируют в физиологическом растворе с фосфатным буфером (ФРФБ). Каждая мышь получает 5 x 10⁵ клеток в 0,1 мл суспензии подкожно (пк) в правый бок. Опухоли измеряют в двух измерениях, чтобы контролировать рост, когда средний объем достигает 80-120 мм³. Объем (V) = ½ L × W² и L (длина) определяется как наибольший диаметр опухоли и W (ширина) перпендикулярна L. На 1 день исследования, животных сортируют на семь групп (n=10 на группу) со средним объемом опухоли в группе 100 мм³ и лечат, как описано ниже. Измерения опухоли записывают 2-3 раза в неделю, пока объем опухоли не достигал более 1200 мм³.

Количественный ПЦР (кПЦР) анализ экспрессии генов проводят на 30 мг собранной опухолевой ткани, гомогенизированной в 900 мкл буфера для лизиса, поставляемого в наборе RNeasy Plus Mini Kit, с использованием Omin Bead Ruptor. РНК из гомогенизированных образцов опухолей выделяют с использованием RNeasy Plus Mini Kit и протоколов, рекомендованных производителем. Концентрацию РНК количественно определяют с помощью спектрофотометра Epoch BioTek и ресуспендируют до 200 нг/мкл с ddH20. кДНК синтезируют с использованием 2 мкг общей РНК и набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости с использованием протоколов, рекомендованных производителем. Экспрессию генов анализируют с использованием 50 нг кДНК и ген-специфичных праймеров taqman, TaqMan Universal Master Mix II и протоколов, рекомендованных поставщиком. Систему кПЦР в реальном времени ViiA7 используют для исследований кПЦР. Пороговые циклы (CT) для каждого образца анализируют с использованием рекомендованного сравнительного способа CT, и экспрессию целевых генов представляют как кратное изменение в группе лечения по сравнению с группой изотипического контроля. Двусторонний непарный t-критерий Стьюдента используют для сравнения группы лечения с контрольной изотипического группой со статистической значимостью <0,05.

Результаты:

Для исследования влияния αvβ8-блокады на численность опухолевых лимфоцитов, опухолевую ткань собирают на 12 день (лечение антителом в 1, 5, 9 день) у мышей, леченных изотипическим контролем или ADWA11 VH05-2/VK01 (ADWA 2.4), и анализируют экспрессию мРНК маркера лимфоцитов с помощью количественной ПЦР. Лечение ADWA11 VH05-2/VK01 (ADWA 2.4) увеличивает уровень экспрессии CD8a (2,62 ± 0,763) и Granzyme B (5,79 ± 1,55) в микросреде опухоли (кратное изменение ± стандартное отклонение по сравнению с группой изотипа, группа лечения 10 мг/кг) (ФИГ. 31А). Эти данные демонстрируют, что лечение ADWA11 2.4 антителом увеличивает количество активированных лимфоцитов, которые играют роль в регрессии опухоли, в микросреде опухоли.

Лечение ADWA11 2.4 дает 18% ИРО на 15 день исследования, в то время как лечение анти-PD-1 антителом (RMP1-14) дает 10,3% ИРО на 16 день исследования, и ни одна мышь не достигает конца исследования (выживание 0% на 30 день). Для сравнения, ADWA11 2.4 в сочетании с анти-PD-1 дает 35,8% ТРО на 16 день исследования и 60% мышей достигают конца исследования (% выживаемости на 30 день) (ФИГ. 31B верхняя панель).

Эти результаты демонстрируют, что комбинированная терапия анти-PD1 и анти-αvβ8, как показано на примере антитела, использованного в настоящем документе, дает неожиданный синергетический противоопухолевый эффект. Эти данные указывают на то, что комбинированная терапия новым анти-αvβ8 (например, ADWA11 2.4) антителом, описанным в настоящем документе, и анти-PD-1 антителом, хорошо известным в данной области, дает потенциально новое терапевтическое средство для лечения опухолей.

Хотя раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные приложения, способы, наборы и композиции, следует понимать, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отступления от идей в настоящем документе и формуле изобретения ниже. Вышеупомянутые примеры представлены для лучшей иллюстрации раскрытых идей и не предназначены для ограничения объема идей, представленных в настоящем документе. Хотя настоящие идеи были описаны в терминах этих типовых вариантов осуществления, квалифицированный специалист легко поймет, что многочисленные вариации и модификации этих типовых вариантов осуществления возможны без излишнего экспериментирования. Все такие вариации и модификации находятся в пределах объема настоящих идей.

Все ссылки, процитированные в настоящем документе, включая патенты, заявки на патенты, статьи, учебники и подобные, а также ссылки, процитированные в настоящем документе, в той степени, в которой они еще не указаны, настоящим включены сюда посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В случае, если один или несколько включенных литературных и подобных материалов отличаются от данной заявки или противоречат ей, включая, помимо прочего, определенные термины, использование терминов, описанные способы и подобное, это заявка является контролирующей.

Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные модификации и вариации, не выходящие за рамки объема и сущности изобретения. Другие варианты осуществления по описанию будут очевидны специалистам в данной области из рассмотрения описания и практики изобретения в настоящем документе. Предполагается, что описание и примеры следует рассматривать только как иллюстративные, причем истинный объем и сущность изобретения указаны в следующей формуле изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PFIZER INC.

THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA

<120> АНТИ-αvβ8 АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PC72413A

<140>

<141>

<150> 62/728,688

<151> 2018-09-07

<150> 62/890,945

<151> 2019-08-23

<160> 197

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1392

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 1

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgt gcactccgag

60

gtgcagctgg tggaaagcgg aggaggcctg gtgcagcctg gaggaagcct gaggctgagc

120

tgtgccgcca gcggcttcaa catcaaggac tactacatga actgggtgag gcaggcccct

180

ggcaaaggac tggagtgggt gggctggatc gaccccgacc agggcaacac catctacgag

240

cccaagttcc agggcaggtt caccatcagc gccgacacca gcaagaacag cgcctacctg

300

cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag gaggctgctg

360

atggactact ggggccaggg cacactggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca

420

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc

480

tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg

540

accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc

600

agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat

660

cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact

720

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgctgggg caccgtcagt cttcctcttc

780

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg

840

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag

900

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc

960

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc

1020

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc

1080

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc

1140

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc

1200

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc

1260

ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc

1320

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg

1380

tcccccggaa aa

1392

<210> 2

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 3

<211> 444

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

<210> 4

<211> 714

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 4

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgt gcactccgac

60

atccagatga cccagtcccc ttccagcctg agcgcttccg tgggcgacag ggtgaccatc

120

acctgcaggt ccaccaagtc cctgtcccac ttcaacggca acacctacct gttctggtac

180

cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagagg ctgatctact acatgtcctc cctggcctcc

240

ggagtgccct ccaggttctc cggatccggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc

300

tccctgcagc ccgaggattt cgccacctac tactgccagc agtccctgga gtaccccttc

360

accttcggcg gcggcaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc

420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg

480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg

540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc

600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc

660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

714

<210> 5

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 6

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 8

Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5

<210> 9

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 9

Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 10

Arg Leu Leu Met Asp Tyr

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 11

Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 12

Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 13

Gln Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 14

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 15

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 15

Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 16

Arg Leu Leu Met Asp Tyr

1 5

<210> 17

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 17

Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 18

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 18

Tyr Tyr Met Ser Ser

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 19

Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 20

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 20

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Phe Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Leu Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 22

Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 23

Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 24

Arg Leu Leu Met Asp Tyr

1 5

<210> 25

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 25

Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe

1 5 10 15

<210> 26

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 26

Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 27

Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 28

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 28

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 29

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 29

Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn

1 5

<210> 30

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 30

Arg Leu Leu Met Asp Tyr

1 5

<210> 31

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 31

Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 32

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 32

Tyr Tyr Met Ser Asn

1 5

<210> 33

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 33

Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 34

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 43

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ala Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 44

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Gln Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Ala Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Ala Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 48

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Ile Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 49

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 50

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 51

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 52

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 53

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 54

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 55

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 56

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 57

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 58

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 60

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 60

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 61

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 62

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 62

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 63

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 63

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 64

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 64

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 65

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 65

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 66

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 66

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro

50 55 60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 68

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 69

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 69

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 70

<211> 325

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 70

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

100 105 110

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

115 120 125

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

130 135 140

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

145 150 155 160

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu

180 185 190

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala

195 200 205

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

210 215 220

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

225 230 235 240

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

245 250 255

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

260 265 270

Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

275 280 285

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

290 295 300

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

305 310 315 320

Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 71

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 71

Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe

1 5 10 15

<210> 72

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 72

Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 73

Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 74

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 74

Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 75

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 75

Tyr Tyr Met Ser Asn

1 5

<210> 76

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 76

Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 77

<211> 1002

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 77

Met Leu Leu Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu Tyr Ile Leu Met Leu Cys

1 5 10 15

Arg Met Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr

35 40 45

Arg Arg Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr

50 55 60

Ala Lys Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala

65 70 75 80

Ser Val Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr

85 90 95

His Trp Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys

100 105 110

Phe Leu Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser

115 120 125

Gln Asp Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser

130 135 140

Ile Asp Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser

145 150 155 160

Phe Tyr Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val

165 170 175

Ser Lys Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu

180 185 190

Ala Thr Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr

195 200 205

Ser Val Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val

210 215 220

Ser Gly Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr

225 230 235 240

Asp Gly Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met

245 250 255

Ala Ala Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp

260 265 270

Asp Tyr Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly

275 280 285

Ser Asp Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln

290 295 300

Arg Ala Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val

305 310 315 320

Phe Ala Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln

325 330 335

Asp Gly Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp

340 345 350

Lys Lys Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn

355 360 365

Ala Val Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met

370 375 380

Pro Pro Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys

385 390 395 400

Asn Gly Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala

405 410 415

Ile Leu Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu

420 425 430

Val Tyr Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro

435 440 445

Gly Thr Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys

450 455 460

Ala Asp Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu

465 470 475 480

Leu Leu Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu

485 490 495

Phe Leu Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser

500 505 510

Arg Gly Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp

515 520 525

Glu Ser Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu

530 535 540

Tyr Arg Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro

545 550 555 560

Ile Leu Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile

565 570 575

Leu Leu Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val

580 585 590

Ser Val Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro

595 600 605

Leu Thr Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu

610 615 620

Ala Glu Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val

625 630 635 640

Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr

645 650 655

Glu Asn Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys

660 665 670

Ala Gly Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln

675 680 685

Ser Glu Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser

690 695 700

Asn Leu Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu

705 710 715 720

Ala Val Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His

725 730 735

Ile Phe Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr

740 745 750

Glu Glu Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn

755 760 765

Asn Gly Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro

770 775 780

Tyr Lys Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile

785 790 795 800

Asp Gly Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg

805 810 815

Ile Lys Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala

820 825 830

Gly Gln Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu

835 840 845

Ser Glu Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu

850 855 860

Lys Ile Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile

865 870 875 880

Leu Tyr Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu

885 890 895

Asn Gln Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val

900 905 910

Ile Glu Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser

915 920 925

Thr Leu Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met

930 935 940

Pro Val Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu

945 950 955 960

Leu Leu Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys

965 970 975

Arg Val Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro

980 985 990

His Glu Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr

995 1000

<210> 78

<211> 769

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 78

Met Cys Gly Ser Ala Leu Ala Phe Phe Thr Ala Ala Phe Val Cys Leu

1 5 10 15

Gln Asn Asp Arg Arg Gly Pro Ala Ser Phe Leu Trp Ala Ala Trp Val

20 25 30

Phe Ser Leu Val Leu Gly Leu Gly Gln Gly Glu Asp Asn Arg Cys Ala

35 40 45

Ser Ser Asn Ala Ala Ser Cys Ala Arg Cys Leu Ala Leu Gly Pro Glu

50 55 60

Cys Gly Trp Cys Val Gln Glu Asp Phe Ile Ser Gly Gly Ser Arg Ser

65 70 75 80

Glu Arg Cys Asp Ile Val Ser Asn Leu Ile Ser Lys Gly Cys Ser Val

85 90 95

Asp Ser Ile Glu Tyr Pro Ser Val His Val Ile Ile Pro Thr Glu Asn

100 105 110

Glu Ile Asn Thr Gln Val Thr Pro Gly Glu Val Ser Ile Gln Leu Arg

115 120 125

Pro Gly Ala Glu Ala Asn Phe Met Leu Lys Val His Pro Leu Lys Lys

130 135 140

Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Val Asp Val Ser Ala Ser Met His

145 150 155 160

Asn Asn Ile Glu Lys Leu Asn Ser Val Gly Asn Asp Leu Ser Arg Lys

165 170 175

Met Ala Phe Phe Ser Arg Asp Phe Arg Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Val

180 185 190

Asp Lys Thr Val Ser Pro Tyr Ile Ser Ile His Pro Glu Arg Ile His

195 200 205

Asn Gln Cys Ser Asp Tyr Asn Leu Asp Cys Met Pro Pro His Gly Tyr

210 215 220

Ile His Val Leu Ser Leu Thr Glu Asn Ile Thr Glu Phe Glu Lys Ala

225 230 235 240

Val His Arg Gln Lys Ile Ser Gly Asn Ile Asp Thr Pro Glu Gly Gly

245 250 255

Phe Asp Ala Met Leu Gln Ala Ala Val Cys Glu Ser His Ile Gly Trp

260 265 270

Arg Lys Glu Ala Lys Arg Leu Leu Leu Val Met Thr Asp Gln Thr Ser

275 280 285

His Leu Ala Leu Asp Ser Lys Leu Ala Gly Ile Val Val Pro Asn Asp

290 295 300

Gly Asn Cys His Leu Lys Asn Asn Val Tyr Val Lys Ser Thr Thr Met

305 310 315 320

Glu His Pro Ser Leu Gly Gln Leu Ser Glu Lys Leu Ile Asp Asn Asn

325 330 335

Ile Asn Val Ile Phe Ala Val Gln Gly Lys Gln Phe His Trp Tyr Lys

340 345 350

Asp Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ile Ala Gly Glu Ile Glu Ser

355 360 365

Lys Ala Ala Asn Leu Asn Asn Leu Val Val Glu Ala Tyr Gln Lys Leu

370 375 380

Ile Ser Glu Val Lys Val Gln Val Glu Asn Gln Val Gln Gly Ile Tyr

385 390 395 400

Phe Asn Ile Thr Ala Ile Cys Pro Asp Gly Ser Arg Lys Pro Gly Met

405 410 415

Glu Gly Cys Arg Asn Val Thr Ser Asn Asp Glu Val Leu Phe Asn Val

420 425 430

Thr Val Thr Met Lys Lys Cys Asp Val Thr Gly Gly Lys Asn Tyr Ala

435 440 445

Ile Ile Lys Pro Ile Gly Phe Asn Glu Thr Ala Lys Ile His Ile His

450 455 460

Arg Asn Cys Ser Cys Gln Cys Glu Asp Asn Arg Gly Pro Lys Gly Lys

465 470 475 480

Cys Val Asp Glu Thr Phe Leu Asp Ser Lys Cys Phe Gln Cys Asp Glu

485 490 495

Asn Lys Cys His Phe Asp Glu Asp Gln Phe Ser Ser Glu Ser Cys Lys

500 505 510

Ser His Lys Asp Gln Pro Val Cys Ser Gly Arg Gly Val Cys Val Cys

515 520 525

Gly Lys Cys Ser Cys His Lys Ile Lys Leu Gly Lys Val Tyr Gly Lys

530 535 540

Tyr Cys Glu Lys Asp Asp Phe Ser Cys Pro Tyr His His Gly Asn Leu

545 550 555 560

Cys Ala Gly His Gly Glu Cys Glu Ala Gly Arg Cys Gln Cys Phe Ser

565 570 575

Gly Trp Glu Gly Asp Arg Cys Gln Cys Pro Ser Ala Ala Ala Gln His

580 585 590

Cys Val Asn Ser Lys Gly Gln Val Cys Ser Gly Arg Gly Thr Cys Val

595 600 605

Cys Gly Arg Cys Glu Cys Thr Asp Pro Arg Ser Ile Gly Arg Phe Cys

610 615 620

Glu His Cys Pro Thr Cys Tyr Thr Ala Cys Lys Glu Asn Trp Asn Cys

625 630 635 640

Met Gln Cys Leu His Pro His Asn Leu Ser Gln Ala Ile Leu Asp Gln

645 650 655

Cys Lys Thr Ser Cys Ala Leu Met Glu Gln Gln His Tyr Val Asp Gln

660 665 670

Thr Ser Glu Cys Phe Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Arg Ile Phe Phe Ile

675 680 685

Ile Phe Ile Val Thr Phe Leu Ile Gly Leu Leu Lys Val Leu Ile Ile

690 695 700

Arg Gln Val Ile Leu Gln Trp Asn Ser Asn Lys Ile Lys Ser Ser Ser

705 710 715 720

Asp Tyr Arg Val Ser Ala Ser Lys Lys Asp Lys Leu Ile Leu Gln Ser

725 730 735

Val Cys Thr Arg Ala Val Thr Tyr Arg Arg Glu Lys Pro Glu Glu Ile

740 745 750

Lys Met Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ala His Glu Thr Phe Arg Cys Asn

755 760 765

Phe

<210> 79

<211> 1044

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 79

Met Ala Ala Pro Gly Arg Leu Leu Leu Arg Pro Arg Pro Gly Gly Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Pro Gly Leu Leu Leu Pro Leu Ala Asp Ala Phe Asn

20 25 30

Leu Asp Val Glu Ser Pro Ala Glu Tyr Ala Gly Pro Glu Gly Ser Tyr

35 40 45

Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Glu Pro Ser Thr Ser Ser Arg Met

50 55 60

Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile

65 70 75 80

Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Glu Cys Ser Ser Ser Arg Arg

85 90 95

Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ser Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys

100 105 110

Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val

115 120 125

Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp

130 135 140

Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu

145 150 155 160

Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Lys Asn

165 170 175

Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp

180 185 190

Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr

195 200 205

Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr

225 230 235 240

Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val

245 250 255

Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Glu Asp Phe Val Ser Gly

260 265 270

Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly

275 280 285

Lys Asn Met Ser Ser Leu His Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala

290 295 300

Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp

325 330 335

Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala

340 345 350

Val Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala

355 360 365

Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly

370 375 380

Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys

385 390 395 400

Gly Leu Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ser Val

405 410 415

Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Gln Ser Met Pro Pro

420 425 430

Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Val Asp Arg Asn Gly

435 440 445

Tyr Pro Asp Leu Val Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Val Leu

450 455 460

Tyr Arg Ala Arg Pro Val Val Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr

465 470 475 480

Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Ile Cys Pro Leu Pro Gly Thr

485 490 495

Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp

500 505 510

Gly Lys Gly Thr Leu Pro Arg Lys Leu His Phe Gln Val Glu Leu Leu

515 520 525

Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu

530 535 540

His Asn Arg Ser Pro Val His Ser Lys Thr Met Thr Val Phe Arg Gly

545 550 555 560

Gly Gln Met Gln Cys Glu Glu Leu Val Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser

565 570 575

Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg

580 585 590

Leu Asp Gln Arg Thr Ala Ala Asp Ala Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu

595 600 605

Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Val Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu

610 615 620

Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val

625 630 635 640

Asn Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr

645 650 655

Leu Thr Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu

660 665 670

Leu Ile Val Ser Ile Pro Pro Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg

675 680 685

Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn

690 695 700

Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly

705 710 715 720

Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu

725 730 735

Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Lys Ile Gln Ser Ser Asn Ser

740 745 750

Phe Asp Asn Val Ser Pro Val Val Ser Tyr Lys Val Asp Leu Ala Val

755 760 765

Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe

770 775 780

Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu Tyr Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu

785 790 795 800

Asp Val Gly Pro Ile Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly

805 810 815

Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Ile Leu Asn Leu Gln Trp Pro Tyr Lys

820 825 830

Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly

835 840 845

Pro Met Asn Cys Thr Ala Asp Thr Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys

850 855 860

Thr Pro Glu Lys Asn Asp Thr Ala Ala Ala Gly Gln Gly Glu Arg Asn

865 870 875 880

His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Thr Leu Arg Glu Gly Asp Val His

885 890 895

Thr Leu Gly Cys Gly Ile Ala Lys Cys Leu Gln Ile Thr Cys Gln Val

900 905 910

Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr Val Lys Ser Leu

915 920 925

Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln Asn His Ser Tyr

930 935 940

Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Ile Ile Glu Phe Pro Tyr Lys

945 950 955 960

Asn Leu Pro Ile Glu Asp Leu Phe Asn Ser Thr Leu Val Thr Thr Asn

965 970 975

Ile Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val Pro Val Trp Val

980 985 990

Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Val

995 1000 1005

Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg Val Arg Pro Pro

1010 1015 1020

Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His Glu Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Gly Asn Ser Glu Thr

1040

<210> 80

<211> 767

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 80

Met Cys Gly Ser Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Ala Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

His Asn Cys Gln Arg Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Ala Ala Trp Val

20 25 30

Phe Ser Leu Val Leu Gly Leu Gly Gln Ser Glu His Asn Arg Cys Gly

35 40 45

Ser Ala Asn Val Val Ser Cys Ala Arg Cys Leu Gln Leu Gly Pro Glu

50 55 60

Cys Gly Trp Cys Val Gln Glu Asp Phe Val Ser Gly Gly Ser Gly Ser

65 70 75 80

Glu Arg Cys Asp Thr Val Ser Ser Leu Ile Ser Lys Gly Cys Pro Val

85 90 95

Asp Ser Ile Glu Tyr Leu Ser Val His Val Val Thr Ser Ser Glu Asn

100 105 110

Glu Ile Asn Thr Gln Val Thr Pro Gly Glu Val Ser Val Gln Leu His

115 120 125

Pro Gly Ala Glu Ala Asn Phe Met Leu Lys Val Arg Pro Leu Lys Lys

130 135 140

Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Val Asp Val Ser Ala Ser Met His

145 150 155 160

Asn Asn Ile Glu Lys Leu Asn Ser Val Gly Asn Asp Leu Ser Lys Lys

165 170 175

Met Ala Leu Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Val

180 185 190

Asp Lys Thr Val Ser Pro Tyr Ile Ser Ile His Pro Glu Arg Ile His

195 200 205

Asn Gln Cys Ser Asp Tyr Asn Leu Asp Cys Met Pro Pro His Gly Tyr

210 215 220

Ile His Val Leu Ser Leu Thr Glu Asn Ile Thr Glu Phe Glu Lys Ala

225 230 235 240

Val His Arg Gln Lys Ile Ser Gly Asn Ile Asp Thr Pro Glu Gly Gly

245 250 255

Phe Asp Ala Met Leu Gln Ala Ala Val Cys Glu Ser His Ile Gly Trp

260 265 270

Arg Lys Glu Ala Lys Arg Leu Leu Leu Val Met Thr Asp Gln Thr Ser

275 280 285

His Leu Ala Leu Asp Ser Lys Leu Ala Gly Ile Val Val Pro Asn Asp

290 295 300

Gly Asn Cys His Leu Lys Asn Asn Val Tyr Val Lys Ser Thr Thr Met

305 310 315 320

Glu His Pro Ser Leu Gly Gln Leu Ser Glu Lys Leu Ile Asp Asn Asn

325 330 335

Ile Asn Val Ile Phe Ala Val Gln Gly Lys Gln Phe His Trp Tyr Lys

340 345 350

Asp Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Ala Ile Ala Gly Glu Ile Glu Ser

355 360 365

Lys Ala Ala Asn Leu Asn Asn Leu Val Val Glu Ala Tyr Lys Lys Ile

370 375 380

Ile Ser Glu Val Lys Val Gln Leu Glu Asn Gln Val His Gly Val His

385 390 395 400

Phe Asn Ile Thr Ala Ile Cys Pro Asp Gly Ala Arg Lys Pro Gly Ile

405 410 415

Ser Gly Cys Gly Asn Val Thr Ser Asn Asp Glu Val Leu Phe Asn Val

420 425 430

Thr Val Val Met Lys Thr Cys Asp Ile Met Gly Gly Lys Asn Tyr Ala

435 440 445

Ile Ile Lys Pro Ile Gly Phe Asn Glu Thr Thr Lys Val His Ile His

450 455 460

Arg Ser Cys Ser Cys Gln Cys Glu Asn His Arg Gly Leu Lys Gly Gln

465 470 475 480

Cys Ala Glu Ala Ala Pro Asp Pro Lys Cys Pro Gln Cys Asp Asp Ser

485 490 495

Arg Cys His Phe Asp Glu Asp Gln Phe Pro Ser Glu Thr Cys Lys Pro

500 505 510

Gln Glu Asp Gln Pro Val Cys Ser Gly Arg Gly Val Cys Ile Cys Gly

515 520 525

Lys Cys Leu Cys His Lys Thr Lys Leu Gly Arg Val Tyr Gly Gln Tyr

530 535 540

Cys Glu Lys Asp Asp Phe Ser Cys Pro Tyr Leu His Gly Asp Val Cys

545 550 555 560

Ala Gly His Gly Glu Cys Glu Gly Gly Arg Cys Gln Cys Phe Ser Gly

565 570 575

Trp Glu Gly Asp Arg Cys Gln Cys Pro Ser Ala Ser Ala Gln His Cys

580 585 590

Val Asn Ser Lys Gly Gln Val Cys Ser Gly Arg Gly Thr Cys Val Cys

595 600 605

Gly Arg Cys Glu Cys Thr Asp Pro Arg Ser Ile Gly Arg Leu Cys Glu

610 615 620

His Cys Pro Thr Cys His Leu Ser Cys Ser Glu Asn Trp Asn Cys Leu

625 630 635 640

Gln Cys Leu His Pro His Asn Leu Ser Gln Ala Ala Leu Asp Gln Cys

645 650 655

Lys Ser Ser Cys Ala Val Met Glu Gln His Arg Met Asp Gln Thr Ser

660 665 670

Glu Cys Leu Ser Gly Pro Ser Tyr Leu Arg Ile Phe Phe Ile Ile Phe

675 680 685

Ile Val Thr Phe Leu Ile Gly Leu Leu Lys Val Leu Ile Ile Arg Gln

690 695 700

Val Ile Leu Gln Trp Asn Asn Asn Lys Ile Lys Ser Ser Ser Asp Tyr

705 710 715 720

Arg Met Ser Ala Ser Lys Lys Asp Lys Leu Ile Leu Gln Ser Val Cys

725 730 735

Thr Arg Ala Val Thr Tyr Arg Arg Glu Lys Pro Glu Glu Ile Lys Met

740 745 750

Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ala Gln Glu Ala Phe Arg Cys Asn Phe

755 760 765

<210> 81

<211> 329

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 81

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 82

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 82

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 83

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 83

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 84

<211> 1048

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 84

Met Ala Ser Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu

1 5 10 15

Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn

20 25 30

Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Tyr

35 40 45

Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser Arg Met

50 55 60

Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile

65 70 75 80

Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg

85 90 95

Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys

100 105 110

Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val

115 120 125

Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp

130 135 140

Arg Thr Glu Leu Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu

145 150 155 160

Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gln Asp

165 170 175

Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp

180 185 190

Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr

195 200 205

Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val Ser Lys

210 215 220

Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr

225 230 235 240

Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val

245 250 255

Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly

260 265 270

Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly

275 280 285

Lys Asn Met Ser Ser Ile Tyr Asn Phe Thr Gly Asp Gln Met Ala Ala

290 295 300

Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp

325 330 335

Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala

340 345 350

Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala

355 360 365

Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly

370 375 380

Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys

385 390 395 400

Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ala Val

405 410 415

Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro

420 425 430

Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys Asn Gly

435 440 445

Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Ile Leu

450 455 460

Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr

465 470 475 480

Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro Gly Thr

485 490 495

Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp

500 505 510

Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu Leu Leu

515 520 525

Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu

530 535 540

Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser Arg Gly

545 550 555 560

Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser

565 570 575

Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Trp

580 585 590

Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu

595 600 605

Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu

610 615 620

Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Phe Val

625 630 635 640

Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr

645 650 655

Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu

660 665 670

Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg

675 680 685

Asn Ser Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn

690 695 700

Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly

705 710 715 720

Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu

725 730 735

Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu

740 745 750

Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala Val

755 760 765

Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe

770 775 780

Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu

785 790 795 800

Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly

805 810 815

Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr Lys

820 825 830

Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly

835 840 845

Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys

850 855 860

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly Gln

865 870 875 880

Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser Glu

885 890 895

Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu Lys Ile

900 905 910

Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr

915 920 925

Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln

930 935 940

Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile Glu

945 950 955 960

Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr Leu

965 970 975

Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val

980 985 990

Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu

995 1000 1005

Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg

1010 1015 1020

Val Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro

1025 1030 1035

His Glu Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr

1040 1045

<210> 85

<211> 769

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 85

Met Cys Gly Ser Ala Leu Ala Phe Phe Thr Ala Ala Phe Val Cys Leu

1 5 10 15

Gln Asn Asp Arg Arg Gly Pro Ala Ser Phe Leu Trp Ala Ala Trp Val

20 25 30

Leu Ser Leu Val Leu Gly Leu Gly Gln Gly Glu Asp Asn Ile Cys Ala

35 40 45

Ser Ser Asn Ala Ala Ser Cys Ala Arg Cys Leu Ala Leu Gly Pro Glu

50 55 60

Cys Gly Trp Cys Val Gln Glu Asp Phe Ile Ser Gly Gly Ser Arg Ser

65 70 75 80

Glu Arg Cys Asp Ile Val Ser Asn Leu Ile Ser Lys Gly Cys Ser Val

85 90 95

Asp Ser Ile Glu Tyr Pro Ser Val His Val Ile Ile Pro Thr Glu Asn

100 105 110

Glu Ile Asn Thr Gln Val Thr Pro Gly Glu Val Ser Ile Gln Leu Arg

115 120 125

Pro Gly Ala Glu Ala Asn Phe Met Leu Lys Ile His Pro Leu Lys Lys

130 135 140

Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Val Asp Val Ser Ala Ser Met His

145 150 155 160

Asn Asn Ile Glu Lys Leu Asn Ser Val Gly Asn Asp Leu Ser Arg Lys

165 170 175

Met Ala Phe Phe Ser Arg Asp Phe Arg Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Val

180 185 190

Asp Lys Thr Val Ser Pro Tyr Ile Ser Ile His Pro Glu Arg Ile His

195 200 205

Asn Gln Cys Ser Asp Tyr Asn Leu Asp Cys Met Pro Pro His Gly Tyr

210 215 220

Ile His Val Leu Ser Leu Thr Glu Asn Ile Thr Glu Phe Glu Lys Ala

225 230 235 240

Val His Arg Gln Lys Ile Ser Gly Asn Ile Asp Thr Pro Glu Gly Gly

245 250 255

Phe Asp Ala Met Leu Gln Ala Ala Val Cys Glu Ser His Ile Gly Trp

260 265 270

Arg Lys Glu Ala Lys Arg Leu Leu Leu Val Met Thr Asp Gln Thr Ser

275 280 285

His Leu Ala Leu Asp Ser Lys Leu Ala Gly Ile Val Val Pro Asn Asp

290 295 300

Gly Asn Cys His Leu Lys Asn Asn Val Tyr Val Lys Ser Thr Thr Met

305 310 315 320

Glu His Pro Ser Leu Gly Gln Leu Ser Glu Lys Leu Ile Asp Asn Asn

325 330 335

Ile Asn Val Ile Phe Ala Val Gln Gly Lys Gln Phe His Trp Tyr Lys

340 345 350

Asp Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ile Ala Gly Glu Ile Glu Ser

355 360 365

Lys Ala Ala Asn Leu Asn Asn Leu Val Val Glu Ala Tyr Gln Lys Leu

370 375 380

Ile Ser Glu Val Lys Val His Val Glu Asn Gln Val Gln Gly Val Tyr

385 390 395 400

Phe Asn Ile Thr Ala Ile Cys Pro Asp Gly Ser Arg Lys Pro Gly Met

405 410 415

Glu Gly Cys Arg Asn Val Thr Ser Asn His Glu Val Leu Phe Asn Val

420 425 430

Thr Val Thr Met Lys Lys Cys Asp Val Thr Gly Gly Lys Asn Tyr Ala

435 440 445

Ile Ile Lys Pro Ile Gly Phe Asn Glu Thr Ala Lys Ile His Ile His

450 455 460

Arg Asn Cys Ser Cys Gln Cys Glu Asp Asn Arg Gly Pro Lys Gly Lys

465 470 475 480

Cys Val Asp Glu Thr Phe Leu Asp Ser Lys Cys Phe Gln Cys Asp Glu

485 490 495

Asn Lys Cys His Phe Asp Glu Asp Gln Phe Ser Ser Glu Ser Cys Lys

500 505 510

Ser His Lys Asp Gln Pro Val Cys Ser Gly Arg Gly Val Cys Val Cys

515 520 525

Gly Lys Cys Ser Cys His Lys Ile Lys Leu Gly Lys Val Tyr Gly Lys

530 535 540

Tyr Cys Glu Lys Asp Asp Phe Ser Cys Pro Tyr His His Gly Asn Leu

545 550 555 560

Cys Ala Gly His Gly Glu Cys Glu Ala Gly Arg Cys Gln Cys Phe Ser

565 570 575

Gly Trp Glu Gly Asp Arg Cys Gln Cys Pro Ser Ala Ala Ala Gln His

580 585 590

Cys Val Asn Ser Lys Gly Gln Val Cys Ser Gly Arg Gly Thr Cys Val

595 600 605

Cys Gly Arg Cys Glu Cys Thr Asp Pro Arg Ser Ile Gly Arg Phe Cys

610 615 620

Glu His Cys Pro Thr Cys His Thr Ala Cys Lys Glu Asn Trp Asn Cys

625 630 635 640

Val Gln Cys Leu His Pro His Asn Leu Ser Gln Ala Ile Leu Asp Gln

645 650 655

Cys Lys Thr Ser Cys Ala Leu Met Glu Gln Gln His Tyr Val Asp Gln

660 665 670

Thr Ser Glu Cys Phe Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Arg Ile Phe Phe Ile

675 680 685

Ile Phe Ile Val Thr Phe Leu Ile Gly Leu Leu Lys Val Leu Ile Ile

690 695 700

Arg Gln Val Ile Leu Gln Trp Asn Ser Asn Lys Ile Lys Ser Ser Ser

705 710 715 720

Asp Tyr Arg Val Ser Ala Ser Lys Lys Asp Lys Leu Ile Leu Gln Ser

725 730 735

Val Cys Thr Arg Ala Val Thr Tyr Arg Arg Glu Lys Pro Glu Glu Ile

740 745 750

Lys Met Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ala His Glu Thr Phe Arg Cys Asn

755 760 765

Phe

<210> 86

<211> 324

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 86

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Pro Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 87

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 87

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 88

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 88

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 89

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 89

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 90

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 91

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 91

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 92

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 93

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 93

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 94

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 94

Glu Pro Lys Phe Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

1 5 10 15

<210> 95

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp

1 5 10 15

<210> 96

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 96

Thr Ala Val Tyr Tyr Ser Ala Arg Arg Leu Leu Xaa Asp Tyr Trp

1 5 10 15

<210> 97

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 97

Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr

1 5 10 15

<210> 98

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 98

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

1 5 10 15

<210> 99

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> прочий_признак

<222> (8)..(8)

<223> Xaa может быть любой существующей в природе аминокислотой

<400> 99

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Xaa Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

1 5 10 15

<210> 100

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 100

Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

1 5 10 15

<210> 101

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> прочий_признак

<222> (5)..(5)

<223> Xaa может быть любой существующей в природе аминокислотой

<400> 101

Leu Ile Tyr Tyr Xaa Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

1 5 10 15

<210> 102

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 102

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5 10 15

<210> 103

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> прочий_признак

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может быть любой существующей в природе аминокислотой

<400> 103

Phe Ala Thr Tyr Tyr Ser Xaa Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5 10 15

<210> 104

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 104

Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10 15

<210> 105

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 105

Glu Pro Lys Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

1 5 10 15

<210> 106

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 106

Lys Ser Leu Ser His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr

1 5 10 15

<210> 107

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 107

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5 10 15

<210> 108

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 108

Phe Ala Thr Tyr Tyr Ser Gln Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5 10 15

<210> 109

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 109

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5 10 15

<210> 110

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> прочий_признак

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может быть любой существующей в природе аминокислотой

<400> 110

Phe Ala Thr Tyr Tyr Ser Xaa Gln Ser Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5 10 15

<210> 111

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 111

Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10 15

<210> 112

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 112

Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

1 5 10 15

<210> 113

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 113

Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

1 5 10 15

<210> 114

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> прочий_признак

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может быть любой существующей в природе аминокислотой

<400> 114

Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Xaa Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

1 5 10 15

<210> 115

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 115

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln

1 5 10 15

<210> 116

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 116

Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro

1 5 10 15

<210> 117

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 117

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ser Arg Ser Ile Trp Gly Asn Pro

1 5 10 15

<210> 118

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> прочий_признак

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может быть любой существующей в природе аминокислотой

<400> 118

Glu Ala Asp Tyr Tyr Ser Xaa Ser Arg Ser Ile Trp Gly Asn Pro

1 5 10 15

<210> 119

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 119

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Thr

1 5 10 15

<210> 120

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 120

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser His Thr Gly Asn Thr Tyr

1 5 10 15

<210> 121

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 121

Asn Pro Pro Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser

1 5 10 15

<210> 122

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 122

Asp Thr Ala Val Val Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ile Ser Arg

1 5 10 15

<210> 123

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 123

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45