АГОНИСТИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО К РЕЦЕПТОРУ ЛЕПТИНА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ НАРУШЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ИЛИ ГИПОЛЕПТИНЕМИИ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 A61P3/00 A61P19/08 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к терапевтическим способам лечения нарушения метаболизма и восстановления чувствительности к инсулину при недостаточности лептина и липодистрофии с применением агонистических антител и антигенсвязывающих фрагментов агонистических антител, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Официальная копия перечня последовательностей подана одновременно с описанием в электронном виде через EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII под названием 10436WO_SEQ_LIST_ST25, дата создания 5 апреля 2019 г., и размером приблизительно 105 килобайтов. Перечень последовательностей, содержащийся в данном документе в формате ASCII, является частью описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Лептин представляет собой полипептидный гормон, экспрессируемый преимущественно жировой тканью, который участвует в регуляции метаболизма, нейроэндокринной функции, иммунитета, энергетического баланса и потребления пищи. Активность лептина опосредуется взаимодействием с рецептором лептина и передачей через него сигналов. Рецептор лептина (также известный как «LEPR», «WSX», «ОВ-рецептор», «ОВ-R» и «CD295») представляет собой однопроходный трансмембранный рецептор семейства цитокиновых рецепторов класса I с крупным (818 аминокислот) внеклеточным доменом. Недостаточность лептина, резистентность к лептину и определенные мутации, обуславливающие нарушение передачи сигнала или ослабление передачи сигнала, опосредованной LEPR, ассоциированы с ожирением, сахарным диабетом типа 2, дислипидемией, видами липодистрофии, стеатозом печени, неалкогольной и алкогольной жировой болезнью печени, тяжелой инсулинорезистентностью, лепречаунизмом/синдромом Донохью, синдромом Рабсона-Менденхолла и связанными с ними осложнениями. Терапевтические подходы, направленные на преодоление резистентности к лептину, недостаточности лептина и гиполептинемии (например, липодистрофии), в основном сосредоточены на доставке дополнительного лептина или аналогов лептина лицам, страдающим соответствующими заболеваниями. Однако такие подходы, как правило, показали ограниченную эффективность, особенно у лиц с резистентностью к лептину, и часто ассоциированы с нежелательными побочными эффектами. Таким образом, в данной области техники существует потребность в альтернативных подходах к лечению резистентности к лептину и других состояний, ассоциированных с недостаточностью лептина или гиполептинемией.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека. Антитела по настоящему изобретению являются агонистическими антителами; т.е. связывание антител к LEPR по настоящему изобретению с LEPR вызывает, inter alia, активацию опосредованной рецептором лептина передачи сигнала в клетках. В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению не конкурируют с лептином за связывание с LEPR. Антитела по настоящему изобретению являются применимыми, например, для имитации, замены или дополнения нормальной биологической активности лептина у субъекта. Следовательно, антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению являются применимыми для терапевтического лечения заболеваний и нарушений, ассоциированных с резистентностью к лептину и недостаточностью лептина.

[0005] Антитела по настоящему изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут содержать только антигенсвязывающую часть (например, Fab-, F(ab')₂- или scFv-фрагмент) и могут быть модифицированы с обеспечением эффекта в отношении функциональности, например, с обеспечением устранения остаточных эффекторных функций (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

[0006] Иллюстративные антитела к LEPR по настоящему изобретению перечислены в таблицах 1 и 2 в данном документе. В таблице 1 представлены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR), вариабельных областей легкой цепи (LCVR), определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и определяющих комплементарность областей легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) из иллюстративных антител к LEPR. В таблице 2 представлены идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 из иллюстративных антител к LEPR.

[0007] Настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие HCVR, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0008] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие LCVR, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0009] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), которая содержит любую из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 1, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, содержащуюся в любом из иллюстративных антител к LEPR, перечисленных в таблице 1. В определенных вариантах осуществления пара аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 и 82/66.

[0010] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0011] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0012] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0013] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR1 легкой цепи (LCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0014] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR2 легкой цепи (LCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0015] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR3 легкой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в таблице 1, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0016] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCDR3 и LCDR3 (HCDR3/LCDR3), содержащую любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в таблице 1, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в таблице 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, содержащуюся в любом из иллюстративных антител к LEPR, перечисленных в таблице 1. В определенных вариантах осуществления пара аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3 выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/72, 80/72 и 88/72.

[0017] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие набор из шести CDR (т.е. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащийся в любом из иллюстративных антител к LEPR, перечисленных в таблице 1. В определенных вариантах осуществления набор аминокислотных последовательностей HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12, 14, 16; 44, 46, 48, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 68, 70, 72; 76, 78, 80, 68, 70, 72 и 84, 86, 88, 68, 70, 72.

[0018] В связанном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие набор из шести CDR (т.е. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, определенной для любого из иллюстративных антител к LEPR, перечисленных в таблице 1. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие набор аминокислотных последовательностей HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащийся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 и 82/66. Способы и методики идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны из уровня техники и могут быть применены для идентификации CDR в указанных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR, раскрытых в данном документе. К иллюстративным общепринятым способам, которые можно применять для идентификации границ CDR, относятся, например, определение согласно Kabat, определение согласно Chothia и определение согласно AbM. В общих чертах, определение согласно Kabat основано на вариабельности последовательности, определение согласно Chothia основано на расположении структурных областей петли, а определение согласно AbM является компромиссным решением между подходами согласно Kabat и Chothia. См., например, «Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest», National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997) и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:9268-9272 (1989). Также для идентификации последовательностей CDR в антителе доступны базы данных общего пользования.

[0019] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к LEPR или их части. Например, настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCVR, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0020] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0021] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0022] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0023] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0024] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0025] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0026] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в таблице 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней.

[0027] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HCVR, где HCVR содержит набор из трех CDR (т.е. HCDR1, HCDR2, HCDR3), при этом набор аминокислотных последовательностей HCDR1, HCDR2, HCDR3 является таким, как определено для любого из иллюстративных антител к LEPR, перечисленных в таблице 1.

[0028] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие LCVR, где LCVR содержит набор из трех CDR (т.е. LCDR1, LCDR2, LCDR3), при этом набор аминокислотных последовательностей LCDR1, LCDR2, LCDR3 является таким, как определено для любого из иллюстративных антител к LEPR, перечисленных в таблице 1.

[0029] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие как HCVR, так и LCVR, где HCVR содержит аминокислотную последовательность, из любой из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 1, и где LCVR содержит аминокислотную последовательность из любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 1. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCVR, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней, и полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCVR, перечисленных в таблице 2, или по сути сходную с ней последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней. В определенных вариантах осуществления в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR и LCVR, где как HCVR, так и LCVR получены из одного и того же антитела к LEPR, перечисленного в таблице 1.

[0030] Настоящее изобретение также предусматривает рекомбинантные векторы экспрессии, способные экспрессировать полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела к LEPR. Например, настоящее изобретение включает рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие любую из упомянутых выше молекул нуклеиновой кислоты, т.е. молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих любую из последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, приведенных в таблице 1. Также в объем настоящего изобретения включены клетки-хозяева, в которые были введены такие векторы экспрессии, а также способы получения антител или их частей путем культивирования клеток-хозяев в условиях, обеспечивающих продуцирование антител или фрагментов антител, и выделение полученных таким образом антител и фрагментов антител.

[0031] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантное антитело человека или его фрагмент, которые специфически связывают LEPR, и фармацевтически приемлемый носитель. В родственном аспекте в настоящем изобретении представлена композиция, которая представляет собой комбинацию антитела к LEPR и второго терапевтического средства. В одном варианте осуществления второе терапевтическое средство представляет собой любое средство, при объединении которого с антителом к LEPR обеспечивается преимущество.

[0032] Используемый по всему данному изобретению термин «субъект» является взаимозаменяемым с термином «пациент». Субъект или пациент может представлять собой взрослого. Также предполагается, что пациенты-дети получают пользу от способов и композиций, предусмотренных в данном документе.

[0033] В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает терапевтические способы усиления или стимуляции опосредованной LEPR передачи сигнала с применением антитела или антигенсвязывающей части антитела к LEPR по настоящему изобретению. Терапевтические способы согласно данному аспекту настоящего изобретения включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению, субъекту, нуждающемуся в этом. Подлежащее лечению нарушение представляет собой любое заболевание или состояние, улучшение в отношении которого, ослабление проявления, подавление или предупреждение которого обеспечивают путем стимуляции или активации опосредованной LEPR передачи сигнала, или иным способом имитируя природную активность лептина in vitro или in vivo.

[0034] В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены терапевтические способы лечения или предупреждения нарушения метаболизма или гиполептинемии. Способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0035] В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены терапевтические способы лечения или предупреждения нарушения метаболизма или гиполептинемии, или заболевания или состояния, ассоциированных с нарушением метаболизма или гиполептинемией, или одного или более симптомов данного заболевания или состояния. Способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0036] В некоторых вариантах осуществления состояние выбрано из группы, состоящей из неалкогольной жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита (NASH), женского бесплодия, аменореи, аномального гормонального цикла, нарушения иммунной функции, гипотиреоза, ожирения, моногенного ожирения, сахарного диабета типа I, сахарного диабета типа II, липодистрофии, врожденной липодистрофии, генерализованной липодистрофии, приобретенной липодистрофии, очаговой липодистрофии, врожденной очаговой липодистрофии, врожденной генерализованной липодистрофии, приобретенной очаговой липодистрофии и приобретенной генерализованной липодистрофии.

[0037] В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов заболевания или состояния, ассоциированных с нарушением метаболизма или гиполептинемией, выбраны из группы, состоящей из тучности, ожирения, гиперфагии, гипергликемии, гипертриглицеридемии, гиперхолестеринемии, инсулинорезистентности, дислипидемии, задержки роста, задержки пубертатного скачка роста, аномальной секреции гормона роста, повышенного уровня HbA1c, низкой минеральной плотности костной ткани (или низкой костной массы), низкой минерализации костной ткани и низкой безжировой массы тела. Предупреждение, ослабление симптомов заболевания или состояния, ассоциированных с нарушением метаболизма или гиполептинемией, или уменьшение их степени тяжести и/или продолжительности, или снижение их интенсивности могут быть достигнуты после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают LEPR человека.

[0038] В еще других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения метаболических осложнений липодистрофии. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления лечение обеспечивает облегчение гипергликемии, уменьшение выраженности инсулинорезистентности, уменьшение выраженности гипертриглицеридемии, понижение уровней циркулирующего холестерина и/или понижение уровней HbA1c у субъекта. Липодистрофия может включать приобретенную очаговую липодистрофию, приобретенную генерализованную липодистрофию, врожденную очаговую липодистрофию и врожденную генерализованную липодистрофию.

[0039] Врожденная недостаточность лептина представляет собой редкое заболевание, характеризующееся наличием патогенных вариантов LEPR или лептина. У некоторых субъектов есть циркулирующий лептин, но белок является нефункциональным из-за генетической мутации, например р.N103K, которая обуславливает кодирование биологически неактивной формы лептина. У некоторых субъектов циркулирующего лептина очень мало или он отсутствует. В нарушении опосредованной лептином передачи сигнала могут участвовать другие гены, включая LMNA, PPARG, PLIN1, AKT2, CIDEC, LIPE и ADRA2A, и антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для смягчения эффектов таких мутаций в отношении опосредованной лептином передачи сигнала.

[0040] В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения врожденной недостаточности лептина. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется липодистрофия и лечение с помощью метре лептина является неэффективным. В некоторых вариантах осуществления за счет введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают LEPR человека, обеспечивается предупреждение, ослабление симптомов, ассоциированных с врожденной липодистрофией, или уменьшение их степени тяжести и/или продолжительности, или снижение их интенсивности. В некоторых вариантах осуществления лечение обеспечивает обращение вспять или смягчение одного или более из гиперфагии, ожирения, гиперинсулинемии, дислипидемии и гепатостеатоза у субъекта. В некоторых вариантах осуществления уровень глюкозы в крови субъекта уменьшается, вес тела субъекта уменьшается, у субъекта наблюдается уменьшение уровня потребление пищи, жировая масса субъекта уменьшается, безжировая масса субъекта увеличивается и/или костная масса субъекта увеличивается.

[0041] В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены терапевтические способы лечения неалкогольной жировой болезни печени или неалкогольного стеатогепатита (NASH). В некоторых аспектах у субъекта имеется гиполептинемия, липодистрофия или недостаточность лептина. Согласно этому аспекту способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления вес печени субъекта уменьшается после лечения. В некоторых вариантах осуществления симптомы неалкогольной жировой болезни печени, включая неалкогольный стеатоз печени, уменьшаются у субъекта после лечения. В некоторых вариантах осуществления у субъекта уменьшаются уровни аланинтрансаминазы (ALT) в плазме крови и/или уровни аспартаттрансаминазы (AST) в плазме крови.

[0042] В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения женского бесплодия, аменореи или восстановления нормальных гормональных циклов, ассоциированных с нарушением метаболизма или гиполептинемией. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых аспектах введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают LEPR человека, может обеспечить повышение фертильности и/или повышение вероятности зачатия. В некоторых аспектах субъект беременеет. В некоторых аспектах лечение может обеспечить восстановление нормального менструального цикла или начало такового.

[0043] В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения нарушений иммунной функции, ассоциированных с нарушением метаболизма или гиполептинемией. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают LEPR человека, количества CD4+ Т-клеток увеличиваются.

[0044] В других аспектах в данном документе предусмотрены терапевтические способы увеличения костной массы у субъекта с нарушением метаболизма или гиполептинемией. Способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0045] В других аспектах в данном документе предусмотрены терапевтические способы лечения тучности или ожирения или снижения веса тела. Согласно этому аспекту способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления лечение обеспечивает снижение жировой массы, но не безжировой массы.

[0046] В некоторых вариантах осуществления субъект, нуждающийся в этом, представляет собой субъекта, у которого имеется гиполептинемия, липодистрофия или недостаточность лептина. В некоторых вариантах осуществления субъект, нуждающийся в этом, представляет собой субъекта, у которого не имеется гиполептинемии или недостаточности лептина. В некоторых вариантах осуществления нарушение метаболизма, тучность или ожирение не ассоциированы с мутацией LEPR, приводящей к нарушению передачи сигнала или ослаблению передачи сигнала, и не обусловлено ею.

[0047] В некоторых вариантах осуществления введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, в соответствии со способом, предусмотренным в данном документе, стимулирует опосредованную STAT3 передачу сигнала в гипоталамусе или усиливает индуцированную лептином или независимую от лептина опосредованную STAT3 передачу сигнала.

[0048] В некоторых вариантах осуществления введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, снижает уровень циркулирующих триглицеридов в плазме крови и/или снижает уровень циркулирующего общего холестерина в плазме крови.

[0049] В других аспектах в данном документе предусмотрены терапевтические способы лечения гиперфагии, гипергликемии, инсулинорезистентности, дислипидемии, неалкогольного стеатогепатита (NASH) или неалкогольной жировой болезни печени путем стимулирования опосредованной STAT3 передачи сигнала в гипоталамусе. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления лечение обеспечивает снижение уровней циркулирующих триглицеридов в плазме крови. В некоторых вариантах осуществления лечение обеспечивает снижение уровней циркулирующего общего холестерина в плазме крови.

[0050] В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения задержки роста, отсутствия пубертатного скачка роста и/или аномальной секреции гормона роста, ассоциированных с врожденной недостаточностью лептина. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0051] В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения гипотиреоза, ассоциированного с врожденной недостаточностью лептина. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0052] В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения низкой минеральной плотности костной ткани и/или минерализации костной ткани, ассоциированных с гиполептинемией и/или недостаточностью лептина. Такие способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0053] Одно или более дополнительных терапевтических средств можно вводить с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связывают LEPR человека, субъектам, описанным в данном документе. Второе терапевтическое средство может быть выбрано из группы, состоящей из рекомбинантного лептина человека, ингибитора PCSK9, статина, эзетимиба, инсулина, варианта инсулина, средства, усиливающего секрецию инсулина, метформина, сульфонилмочевины, ингибитора натрий-глюкозного котранспортера 2 (SGLT2), агониста/аналога GLP-1, ингибитора глюкагона (GCG), ингибитора рецептора глюкагона (GCGR), ингибитора ангиопоэтин-подобного белка (ANGPTL), фентермина, орлистата, топирамата, бупропиона, топирамата/фентермина, бупропиона/налтрексона, бупропиона/зонисамида, прамлинтида/метрелептина, лоркасерина, цетилистата, тезофензина, велнеперита, противосудорожного средства, дигоксина, кумадина, витамина D, тироксина, добавки для щитовидной железы, витаминной добавки, добавки, содержащей кальций, карнитина, кофермента Q10, лекарственных препарата против запора, противоаллергических лекарственных препаратов, габапентина, наркотического средства, кетамина, лидокаина или венлафаксина гидрохлорида.

[0054] Настоящее изобретение также предусматривает способ лечения, предупреждения или ослабления проявления (i) липодистрофии (любого типа) и/или моногенного ожирения; (ii) состояния, ассоциированного с липодистрофией и/или моногенным ожирением; или (iii) симптома (i) или (ii) у пациента, включающий введение пациенту, который в этом нуждается, агонистического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с LEPR (например, Н4Н17319Р2). Например, в варианте осуществления настоящего изобретения состояние, ассоциированное с липодистрофией и/или моногенным ожирением, представляет собой ожирение с чрезвычайно ранним началом; гиперфагию и нарушение чувства насыщения; нарушение иммунной функции (количеств CD4⁺); инсулинорезистентность; неалкогольную жировую болезнь печени; NASH, дислипидемию; сахарный диабет; нарушение репродуктивной функции; гипогонадизм; отсутствие пубертатного скачка роста; гипотиреоз; нарушение функции щитовидной железы; низкую минеральную плотность костной ткани и/или низкую костную массу. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанным симптомом является увеличение печени, повышение уровня печеночных ферментов, повышение уровней аланинаминотрансферазы (ALT) в крови, повышение уровней аспартатаминотрансферазы (AST) в крови, высокий уровень отложения жира; индекс массы тела >85-го процентиля для возраста и пола; аномальное поведение, связанное с поиском пищи; аномальное пищевое агрессивное поведение; рецидивирующие и потенциально смертельные инфекции; гиперинсулинемия; стеатоз печени; прогрессирование до NASH (липодистрофия); гипертриглицеридемия; повышение уровня HbA1c; повышение уровней глюкозы; нарушенная толерантность к глюкозе; задержка полового развития; снижение выраженности вторичных половых признаков; отсутствие или нерегулярность менструаций; бесплодие; низкорослость; аномальная секреция гормона роста; изменение уровня Т3; изменение уровней TSH и/или изменение уровней свободного тироксина.

[0055] В одном варианте осуществления настоящего изобретения агонистическое антитело к LEPR или его антигенсвязывающий фрагмент (например, Н4Н17319Р2; см. WO 2017/66204) вводят в виде доз следующим образом: (i) одну или более доз, составляющих приблизительно 5 мг/кг веса тела внутривенно; затем (ii) одну или более доз, составляющих приблизительно 250-300 мг, например 250 мг или приблизительно 300 мг, подкожно один раз в неделю; затем (iii) необязательно одну или более доз, составляющих приблизительно 250 мг или приблизительно 300 мг подкожно один раз в месяц или приблизительно в 28 дней. Например, (i) одну или более доз, составляющих приблизительно 5 мг/кг веса тела внутривенно; затем (ii) одну или более доз, составляющих приблизительно 250 мг или приблизительно 300 мг подкожно один раз в неделю. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело вводят в виде доз следующим образом: (i) 5 мг/кг веса тела однократно внутривенно (в день 1); затем (ii) четыре дозы по приблизительно по 250 мг или приблизительно 300 мг подкожно один раз в неделю (например, в день 4, 11, 18 и 25); затем (iii) одну или более доз, составляющих приблизительно 250 мг или приблизительно 300 мг подкожно один раз в месяц или в 28 дней (например, в дни 53, 81, 109, 137, 165 и 193 и т.д.). Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения подкожное введение первой дозы имеет место приблизительно в день 4, что приблизительно через три дня после внутривенного введения дозы, которое имеет место в день 1.

[0056] Другие варианты осуществления будут очевидны из обзора следующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0057] На фигуре 1 показано связывание димерного LEPR человека с лептином человека в присутствии возрастающих концентраций тестируемых антител к LEPR или контрольных молекул, измеренное с помощью ELISA (оптическая плотность при 450 нм).

[0058] На фигурах 2А-2С проиллюстрирована выраженность опосредованной LEPR передачи сигнала в клетках HEK293, экспрессирующих либо LEPR дикого типа (круги), либо мутантный вариант LEPR, характеризующийся нарушением передачи сигнала (А409Е, квадраты), либо мутантный вариант LEPR, характеризующийся ослаблением передачи сигнала (Р316Т, треугольники). Опосредованную LEPR передачу сигнала выражают в виде соотношения pSTAT3-Y705 / STAT3, измеряемого посредством денситометрии в образцах, полученных методом вестерн-блота из клеток, обработанных возрастающими концентрациями лептина (фигура 2А), Н4Н16650 (фигура 2В) или Н4Н16679 (фигура 2С).

[0059] На фигуре 3 показано среднее ежедневное потребление пищи мышами с недостаточностью лептина, которым вводили в виде доз либо антитело изотипического контроля при дозе 3 мг/кг, либо антитело к LEPR, выбранное из Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2, при дозе 3 мг/кг.

[0060] На фигуре 4 показано среднее процентное изменение веса тела мышей, которым вводили в виде доз либо антитело изотипического контроля при дозе 3 мг/кг, либо антитело к LEPR, выбранное из Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2, при дозе 3 мг/кг.

[0061] На фигуре 5 показана средняя жировая масса животных в каждой группе обработки антителами, количественно определенная с помощью μСТ за 1 день до обработки антителами (столбики не заштрихованы) и через 6 дней после нее (заштрихованные столбики), выраженная в виде среднего значения ±SEM.

[0062] На фигуре 6 показано процентное изменение веса тела мышей, которым вводили 30 мг/кг антитела, выбранного из Н4Н18482Р2, Н4Н18487Р2, Н4Н18492Р2 или изотипического контроля.

[0063] Фигуры 7А-7В. На фигуре 7А показана жировая масса мышей до введения доз антител к LEPR, представляющих собой Н4Н18482Р2, Н4Н18487Р2 или Н4Н18492Р2. На фигуре 7В показана жировая масса мышей, обработанных с помощью 30 мг/кг Н4Н18482Р2, Н4Н18487Р2 или Н4Н18492Р2.

[0064] Фигура 8. На фигуре 8 показано, что протестированные антитела к LEPR активировали LEPR обезьяны (Mf) в линии клеток IMR-32/STAT3-luc/Mf LEPR.

[0065] Фигуры 9А-9С. Недостаточность лептина индуцировали в день 0 путем HDD mLepr.ECD у самцов мышей Lepr^hu/hu в возрасте 18 недель. Через семь дней после HDD мышей разделяли на 2 группы на основании относительного процентного изменения веса тела, и им вводили SC (подкожно) однократную дозу 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (круги или столбики, закрашенные серым) или Н4Н17319Р2 (закрашенные круги или столбики). Данные представляют собой среднее значение ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении Н4Н17319Р2 и контрольного моноклонального антитела в указанные моменты времени. $ - Р<0,05 между моментом до HDD (день -1) и любым днем после HDD (день 6 или 13) в пределах одной и той же соответствующей группы введения доз. & - Р<0,05 между моментом до введения моноклонального антитела (день 6) и после введения моноклонального антитела (день 13) в пределах одной и той же соответствующей группы введения доз. Для группы, обозначенной соответствующим цветом символов, в указанные дни нет значимого отличия (ns) от исходного уровня в день 0. На фигуре 9А показаны вес тела (слева) и ежедневное потребление пищи (справа) мышей Lepr^hu/hu на протяжении всего исследования, демонстрирующие, что индукция недостаточности лептина приводит к быстрому набору веса тела и гиперфагии. N=14 на группу. На фигуре 9В показан анализ композиционного состава тела с помощью микро-КТ-визуализации, выполненный за 1 день до HDD (день -1), за 1 день до введения доз моноклональных антител (день 6 после HDD) и через 6 дней после введения доз (день 13 после HDD). Количественная оценка жировой массы (слева) и безжировой массы (справа) показана для групп введения доз контрольных моноклональных антител (N=14) и Н4Н17319Р2 (N=14) (серые и черные столбики соответственно). Фигура 9С.Химические анализы плазмы крови, полученной через 6 дней после обработки (день 13) от мышей Lepr^hu/hu с индуцированной недостаточностью лептина, которых обрабатывали однократной дозой контрольного моноклонального антитела (серые столбики, N=14) или Н4Н17319Р2 (черные столбики, N=14).

[0066] Фигуры 10А-10D. Фигура 10А. Схема, показывающая целенаправленное воздействие на ген для создания гуманизированных по эктодомену рецептора лептина мышей Lepr^hu/hu. Фигура 10В. Вес тела (возраст 9 недель) и количественная оценка композиционного состава тела с помощью микро-КТ (возраст 9-12 недель) самцов мышей дикого типа (Lepr^+/+, серые столбики) и Lepr^hu/hu (черные столбики). Данные представляют собой среднее значение±SEM. N=6-10 на группу. Фигура 10С. Тест на толерантность к инсулину (0,75 Ед./кг, IP) у самцов мышей Lepr^+/+ (серые круги) и Lepr^hu/hu (черные круги) в возрасте 8-11 недель. Данные представляют собой среднее значение ±SEM. N=8-9 на группу. Фигура 10D. Уровни лептина в сыворотке крови у самцов мышей Lepr^+/+ (серые столбики) и Lepr^hu/hu (черные столбики) в возрасте 9- 13 недель. Данные представляют собой среднее значение ±SEM. N=8-9 на группу.

[0067] Фигуры 11А-11В. Фигура 11А. Вес тела (слева), процентное изменение веса тела по сравнению с исходным уровнем в день 0 (в центре) и совокупное потребление пищи (справа) у самцов мышей C57BL/6N в возрасте 8 недель после гидродинамической доставки ДНК (HDD) в день 0 плазмиды, кодирующей эктодомен рецептора лептина мыши (mLeprECD.hFc, черные круги), или контрольной плазмиды (контроль с hFc, серые круги). Данные представляют собой среднее значение ±SEM. N=6 на группу. Фигура 11В. Количественная оценка с помощью микро-КТ композиционного состава тела через 7 дней после HDD плазмиды, кодирующей эктодомен рецептора лептина мыши (mLeprECD.hFc, черные столбики), или контрольной плазмиды (контроль с hFc, серые столбики). Данные представляют собой среднее значение ±SEM в случае жировой массы, безжировой массы, костной массы, минерализации костной ткани и плотности костной ткани (слева направо). N=6 на группу.

[0068] Фигуры 12А-12С. Недостаточность лептина индуцировали путем HDD mLepr.ECD в день 0 у мышей Lepr^hu/hu, являющихся самками в возрасте 17-20 недель или самцами в возрасте 18 недель. Через семь дней после HDD мышей разделяли на 2 группы животных, каждую на основании относительного процентного изменения веса тела, затем им вводили SC однократную дозу 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (серые незаштрихованные круги или столбики) или Н4Н17319Р2 (черные незаштрихованные круги или столбики). Данные представляют собой среднее значение ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении Н4Н17319Р2 и контрольного моноклонального антитела в указанные моменты времени. $ - Р<0,05 между моментом до HDD (день -1) и любым днем после HDD (день 6 или 13) в пределах одной и той же соответствующей группы введения доз. & - Р<0,05 между моментом до введения моноклонального антитела (день 6) и после введения моноклонального антитела (день 13) в пределах одной и той же соответствующей группы введения доз. Для группы, обозначенной соответствующим цветом символов, в указанные дни нет значимого отличия (ns) от исходного уровня в день 0. Фигура 12A. Вес тела (слева) и потребление пищи (справа) самок мышей на протяжении всего исследования показывают, что индукция недостаточности лептина приводит к быстрому набору веса тела и гиперфагии. Увеличение веса тела продолжается после введения контрольного моноклонального антитела (N=14). N=10-11 на группу. Фигура 12В. Анализ композиционного состава тела с помощью микро-КТ-визуализации у самок мышей выполняли за 1 день до HDD (день -1), за 1 день до введения доз моноклональных антител (день 6 после HDD) и через 6 дней после введения доз (день 13 после HDD). Данные представляют собой среднее значение ±SEM в случае жировой массы, безжировой массы, костной массы, минерализации костной ткани и плотности костной ткани (слева направо). N=10-11 на группу. Фигура 12С. Анализ композиционного состава тела с помощью микро-КТ-визуализации у самцов мышей выполняли за 1 день до HDD (день -1), за 1 день до введения доз моноклональных антител (день 6 после HDD) и через 6 дней после введения доз (день 13 после HDD). Данные представляют собой среднее значение ±SEM в случае костной массы, минерализации костной ткани и плотности костной ткани (слева направо). N=14 на группу.

[0069] Фигуры 13А-13D. Недостаточность лептина индуцировали в день 0 путем HDD mLepr.ECD у самок мышей Lepr^hu/hu в возрасте 17-20 недель. Для сравнения группу мышей подвергали HDD контрольного вектора. Через семь дней после HDD мышей, получивших mLepr.ECD, разделяли на 3 группы на основании веса тела и вводили им SC две (день 7 и 13) дозы 3 мг/кг контрольного моноклонального антитела (круги или столбики, закрашенные серым) или Н4Н17319Р2 (круги или столбики, закрашенные темно-серым) или для них применяли принцип одинакового кормления в парных группах (круги или столбики, закрашенные светло-серым) с использованием количества пищи, которое потребляли мыши с индуцированной недостаточностью лептина, обработанные с помощью Н4Н17319Р2. Данные представляют собой среднее значение ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении соответствующей группы, обозначенной цветом символа или столбиком, и HDD mLeprECD с введением контрольного моноклонального антитела в указанный момент времени. # обозначает статистическую значимость при сравнении животных с HDD mLeprECD, обработанных с помощью Н4Н17319Р2, и животных с HDD mLeprECD, для которых применяли принцип одинакового кормления в парных группах. $ - P<0,05 при сравнении соответствующей группы, обозначенной цветом символа или столбиком, и мышей контроля HDD, которым вводили контрольное моноклональное антитело, в указанные моменты времени. На фигуре 13А показано изменение веса тела мышей до HDD (слева) и совокупное потребление пищи (справа). N=6-11 на группу. На фигуре 13В продемонстрировано количественное определение композиционного состава тела мышей Lepr^hu/hu с помощью микро-КТ до в день 13 после HDD (7 дней после обработки). Жировая масса, безжировая масса, костная масса, минерализация костной ткани и плотность костной ткани (слева направо). N=5-10 на группу. На фигуре 13С показано тестирование на толерантность к инсулину в день 10 после HDD (3 дня после обработки) у мышей, которых не кормили в течение 4 ч. до обработки инсулином (1,0 Ед./кг, IP) в 0 мин. Для теста на толерантность к инсулину показаны уровни глюкозы в крови и площадь под кривой (AUC) для глюкозы (слева и справа соответственно). N=6-11 на группу. На фигуре 13D представлены данные химических анализов липидов плазмы крови, полученные в день 16 и день 17. N=6-11 на группу.

[0070] Фигуры 14А-14G. Самцам мышей с липодистрофией аР2-nSrebplc^Tg/+; Lepr^hu/hu (Tg) в возрасте 27-30 недель еженедельно вводили (SC) дозы 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (серые круги или столбики) или Н4Н17319Р2 (черные круги или столбики). Для сравнения, самцам нетрансгенных мышей Lepr^hu/hu (nonTg) в возрасте 27-30 недель также еженедельно вводили (SC) дозы 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (незаштрихованные ромбики и белые столбики). Все данные представляют собой среднее значение ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении соответствующей группы, обозначенной цветом символа или столбиком, и nonJg-мышей, которым вводили дозы контрольного моноклонального антитела, в указанный момент времени. # - Р<0,05 при сравнении соответствующей группы, обозначенной цветом символа или столбиком, и Jg-мышей, которым вводили дозы контрольного моноклонального антитела, в указанный момент времени. $ -Р<0,05 при сравнении значения в день 27 и значения в день -5 для соответствующей группы. На фигуре 14А слева и справа показаны вес тела и совокупное потребление пищи соответственно. N=8-9 на группу. На фигуре 14В слева и справа показаны безжировая масса и жировая масса соответственно, количественно определенные с помощью микро-КТ-визуализации до введения дозы в день -5 и после обработки в день 27. N=9 на группу. На фигуре 14С представлены уровни глюкозы в крови на протяжении всего исследования (слева) и процентные уровни гемоглобина А1с в день 28 (справа). N=9 на группу. На фигуре 14D представлены уровни глюкозы в крови и площадь под кривой (AUC) для глюкозы по данным тестирования на толерантность к инсулину (0,5 Ед./кг IP) в день 23. N=9 на группу. На фигурах 14Е и 14F показано, что уровни циркулирующих липидов (Е) и ферментов печени (F) снижены у обработанных с помощью Н4Н17319Р2 мышей с липодистрофией Lepr^hu/hu (Tg). Химические анализы плазмы крови, полученной в день 28, на уровни липидов (триглицериды, холестерин, LDL-C и HDL-C) и ферментов печени (аланинтрансаминазы, ALT, и аспартаттрансаминазы, AST). N=9 на группу. На фигуре 14G показаны значения массы печени, содержание триглицеридов в печени и репрезентативные окрашенные гематоксилином и эозином срезы печени из образцов печени, собранных в день 30 (слева, посредине и справа соответственно). N=5 на группу.

[0071] Фигуры 15А-15С. Фенотипическая характеристика самцов nonTg-мышей Lepr^hu/hu (черные незаштрихованные круги или черные столбики) и мышей аР2-nSrebplc^Tg/+ Lepr^hu/hu (черные незаштрихованные круги или черные столбики) в указанном возрасте. Данные представляют собой среднее значение ±SEM. * р<0,05 при сравнении с мышами Lepr^hu/hu в соответствующие моменты времени. Фигура 15А. Слева: значения веса тела при возрасте от 12 до 24 недель. Посредине: жировая масса, количественно определенная с помощью микро-КТ-визуализации при возрасте примерно 15-20 недель. Справа: уровни лептина в плазме крови, измеренные при возрасте 19-21 неделя. N=17-28 на группу. Фигура 15В. Уровни глюкозы в крови во время теста на толерантность к инсулину (0,75 Ед./кг инсулина, IP) при возрасте 18-20 недель. N=12-13 на группу. Фигура 15С. Слева направо: уровни триглицеридов, холестерина, LDL-C и HDL-C в плазме крови при возрасте 15-17 недель. N=20-28 на группу.

[0072] Фигура 16А. Самцам мышей с липодистрофией aP2-nSrebplc^Tg/+; Lepr^hu/hu (Tg) в возрасте 27-30 недель еженедельно вводили (SC) дозы 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (серые столбики) или Н4Н17319Р2 (черные столбики). Для сравнения, самцам нетрансгенных мышей Lepr^hu/hu (nonTg) в возрасте 27-30 недель также еженедельно вводили (SC) дозы 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (белые столбики). Все данные представляют собой среднее значение ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении соответствующей группы и nonJg-мышей, которым вводили дозы контрольного моноклонального антитела, в указанный момент времени. # - Р<0,05 при сравнении соответствующей группы и Tg-мышей, которым вводили дозы контрольного моноклонального антитела, в указанный момент времени. $ - Р<0,05 при сравнении значения в день 27 и значения в день -5 для соответствующей группы. Фигура 16А. Композиционный состав тела по данным микро-КТ-визуализации, показывающий костную массу, минерализацию костной ткани и плотность костной ткани (слева направо), определенные количественно до введения дозы в день -5 и после обработки в день 27. N=9 на группу.

[0073] Фигуры 17А-17Е. Данные на фигуре 17А относятся к самцам мышей с липодистрофией aP2-nSrebplc^Tg/+; Lepr^hu/hu (Tg), мышей с липодистрофией (Tg) в возрасте 32-38 недель, которые получали однократную дозу (10 мг/кг, SC) контроля (серые столбики) или Н4Н17319Р2 (темно-серые столбики) или инфузию лептина (30 мкг/день, SC; черные столбики). Для получения данных на фигурах 17В-17Е, самцам Jg-мышей в возрасте 27-30 недель еженедельно вводили (SC) дозы 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (серые круги или столбики) или Н4Н17319Р2 (темно-серые круги или столбики) или вводили путем инфузии лептин (30 мкг/день, SC; черные столбики). Показано, что самцам нетрансгенных мышей Lepr^hu/hu (nonTg) в возрасте 27-30 недель также еженедельно вводили (SC) дозы 10 мг/кг контрольного моноклонального антитела (незаштрихованные ромбики и белые столбики). Все данные представляют собой среднее значение±SEM. * - Р<0,05 при сравнении соответствующей группы, обозначенной цветом символа или столбиком, и Jg-мышей, которым вводили дозы контрольного моноклонального антитела. # - Р<0,05 при сравнении соответствующей группы, обозначенной цветом символа или столбиком, и Tg-мышей, которым вводили дозы Н4Н17319Р2. На фигуре 17А представлены данные иммуногистохимического окрашивания по pSTAT3 Y705 в аркуатном (Arc) и вентромедиальном (Vmh) ядре гипоталамуса на расстоянии примерно -1,52 мм от брегмы, показывающие увеличенное число клеток pSTAT3 Y705⁺ у самцов мышей с липодистрофией (Tg) в возрасте 32-38 недель. Срезы головного мозга получали из образцов головного мозга, отобранных через 3 дня после обработки однократной дозой контроля или Н4Н17319Р2 (10 мг/кг, SC) или инфузии лептина (30 мкг/день, SC). Показаны репрезентативные микрофотографии и количественная оценка числа клеток pSTAT3 Y705⁺ в Arc и Vmh (слева, посредине и справа соответственно). N=4-5 на группу. На фигуре 17В слева представлены уровни глюкозы в крови во время исследования. Посредине и справа: уровни глюкозы в крови и площадь под кривой для уровней глюкозы во время тестирования на толерантность к инсулину в день 9. N=8-9 на группу. На фигуре 17С представлены вес тела (слева), изменение веса тела (посредине) и совокупное потребление пищи (справа). N=8-9 на группу Tg-мышей. N=5 для nonTg-мышей. На фигуре 17D представлены данные химических анализов плазмы крови, полученной в день 13, на триглицериды, холестерин, LDL-C и HDL-C, показывающие снижение уровней триглицеридов и холестерина в плазме крови при обработке с помощью Н4Н17319Р2. N=8-9 на группу Jg-мышей. N=5 для nonTg-мышей. На фигуре 17Е представлены масса печени (слева) и содержание триглицеридов в печени (справа) для образцов печени, полученных в день 14. N=6-9 на группу Jg-мышей. N=5 для nonTg-мышей.

[0074] Фигуры 18А-18D. Данные, показанные на фигурах 18А и 18В, относятся к самкам мышей Lepr^hu/hu в возрасте 32 недели, которым вводили однократную дозу контрольного моноклонального антитела (10 мг/кг, SC; круги, закрашенные серым), Н4Н17319Р2 (3 мг/кг, SC; незаштрихованные круги) или Н4Н17319Р2 (10 мг/кг; круги, закрашенные черным). Данные, показанные на фигуре 18С, относятся к худым самцам и самкам яванских макак, которым вводили однократную дозу контроля (SC; круги, закрашенные серым), Н4Н17319Р2 (3 мг/кг, SC; незаштрихованные круги) или Н4Н17319Р2 (10 мг/кг; круги, закрашенные черным). Данные, показанные на фигуре 18D, относятся к самцам и самкам яванских макак с высоким содержанием жира в организме (~6,0 кг), которым вводили две дозы контроля (IV; круги, закрашенные серым) или Н4Н17319Р2 (30 мг/кг, IV; круги, закрашенные черным). Данные представляют собой среднее значение ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении Н4Н17319Р2 (10 мг/кг) и соответствующего контроля в указанные моменты времени. # - Р<0,05 при сравнении Н4Н17319Р2 (3 мг/кг) и соответствующего контроля в указанные моменты времени $ - Р<0,05 при сравнении Н4Н17319Р2 (3 мг/кг) и Н4Н17319Р2 (10 мг/кг) в указанные моменты времени. & - Р<0,05 при сравнении Н4Н17319Р2 (30 мг/кг, IV) и соответствующего контроля. На фигуре 18А представлено процентное изменение веса тела относительно значения до введения дозы в день 0 (слева) и потребление пищи (справа) во время исследования у худых самок мышей. N=6-7 на группу. На фигуре 18В продемонстрированы данные количественных анализов методом ЯМР, показывающие процентное изменение жировой массы (слева) и безжировой массы (справа) относительно значения до введения дозы в день 0 во время исследования у худых самок мышей. N=6-7 на группу. На фигуре 18С продемонстрировано процентное изменение веса тела относительно значения до введения дозы в день -1 во время исследования у худых обезьян. N=12 на группу. На фигуре 18D продемонстрировано процентное изменение веса тела относительно среднего значения до введения дозы в дни -14, -7 и -1 (слева) и процентное изменение жировой массы (посредине) и безжировой массы (справа), количественно определенное с помощью DEXA (двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия для измерения композиционного состава тела) во время исследования на обезьянах с высоким содержанием жира в организме. N=4 и 8 для групп введения доз контроля и Н4Н17319Р2 соответственно.

[0075] На фигуре 19 изображен протокол для одного пациента, применяемый в клиническом испытании незарегистрированного препарата, применяемого из соображений гуманности.

[0076] Фигура 20А-20В представляет собой таблицу, в которой предоставлен план оценки пациента, подвергающегося лечению с помощью Н4Н17319Р2, в период лечения 1 (А), и период лечения 2, и расширенный период лечения (В).

[0077] На фигурах 21А-21С продемонстрированы эффекты Н4Н17319Р2 в отношении уровня глюкозы в крови, веса тела и потребления пищи на мышиной модели врожденной недостаточности лептина. На фигуре 21А представлен уровень глюкозы в крови в мг/дл, на фигуре 21В представлен вес тела в граммах, а на фигуре 21С представлено совокупное потребление пищи в граммах. Серые круги - Lepr^hu/hu, которым вводили контрольный IgG4^P (N=5). Черные квадраты - Lepr^hu/huLep^-/-, которым вводили контрольный IgG4^P (N=7). Белые квадраты - Lepr^hu/huLep^-/-, которым вводили Н4Н17319Р2 (N=8). Данные выражены в виде среднего значения ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении группы Lepr^hu/hu Lep^-/- + Н4Н17319Р2 и контроля Lepr^hu/hu, Lep^-/- + IgG4^P с помощью двухфакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки. Две мыши исключили из группы Lepr^hu/hu Lep^-/- + контрольный IgG4^P и одну мышь из группы Lepr^hu/hu Lep^-/- + H4H17319P2 при оценке потребления пищи из-за чрезмерного измельчения пищи в их клетке.

[0078] На фигурах 22А-22С продемонстрированы жировая, костная и безжировая масса по данным анализа композиционного состава тела с помощью μCT на мышиной модели врожденной недостаточности лептина. На фигуре 22А представлена жировая масса, на фигуре 22В представлена костная масса, а на фигуре 22С представлена безжировая масса в граммах. Перед началом исследования мышам проводили исходное сканирование в D-5. Сканирование после введения mAb проводили в день 35 исследования. Серые столбики - Lepr^hu/hu, которым вводили контрольный IgG4^P (N=5). Черные столбики - Lepr^hu/hu Lep^-/-, которым вводили контрольный IgG4^P (N=7). Белые столбики - Lepr^hu/hu Lep^-/-, которым вводили Н4Н17319Р2 (N=8). Мыши еженедельно получали подкожные инъекции 10 мг/кг либо Н4Н17319Р2, либо антитела изотипического контроля. Данные выражены в виде среднего значения ±SEM. * - Р<0,05 при сравнении с исходным уровнем; # - Р<0,05 при сравнении с контролем Lepr^hu/hu + IgG4^P в соответствующий момент времени; + - Р<0,05 при сравнении с группой Н4Н17319Р2 в соответствующий момент времени. Статистические анализы проводили с помощью двухфакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки.

[0079] На фигурах 23А-23С продемонстрировано эффекты Н4Н17319Р2 в отношении уровня глюкозы в крови, веса тела и потребления пищи на мышиной модели врожденной недостаточности рецептора лептина. На фигуре 23А представлен уровень глюкозы в крови в мг/дл, на фигуре 23В представлен вес тела в граммах, а на фигуре 23С представлено совокупное потребление пищи в граммах. Серые круги - Lepr^hu/hu, которым вводили контрольный IgG4^P (N=7-8). Черные квадраты - Lepr^A409E/A409E, которым вводили контрольный IgG4^P (N=9-10). Белые квадраты - Lepr^A409E/A409E, которым вводили Н4Н17319Р2 (N=10). Данные выражены в виде среднего значения±SEM. * - Р<0,05 при сравнении группы Lepr^A409E/A409E + Н4Н17319Р2 и контроля Lepr^A409E/A409E + IgG4^P с помощью модели смешанных эффектов с апостериорным критерием Сидака. Одну мышь исключили из группы Lepr^hu/hu + контрольный IgG4^P и одну мышь из группы Lepr^A409E/A409E + контрольный IgG4^P при оценке потребления пищи из-за гибели в ходе исследования. Одну мышь исключили из группы Lepr^hu/hu + контрольный IgG4^P и трех мышей из группы Lepr^A409E/A409E + контрольный IgG4^P при оценке потребления пищи из-за чрезмерного измельчения пищи в ходе исследования.

[0080] На фигурах 24А-24С продемонстрированы жировая, костная и безжировая масса по данным анализа композиционного состава тела с помощью μСТ на мышиной модели врожденной недостаточности рецептора лептина. На фигуре 24А представлена жировая масса, на фигуре 24В представлена костная масса, а на фигуре 24С представлена безжировая масса в граммах. Перед началом исследования мышам проводили исходное сканирование в D-1. Сканирование после введения mAb проводили в день 41 исследования. Серые столбики - Lepr^hu/hu, которым вводили контрольный IgG4^P (N=7-8). Черные столбики - Lepr^A409E/A409E, которым вводили контрольный IgG4^P (N=9-10). Белые столбики - Lepr^A409E/A409E, которым вводили Н4Н17319Р2 (7V=10). Мыши еженедельно получали подкожные инъекции 10 мг/кг либо Н4Н17319Р2, либо антитела изотипического контроля (IgG4^P). Данные выражены в виде среднего значения ±SEM. * -Р<0,05 при сравнении с исходным уровнем; # - Р<0,05 при сравнении с контролем Lepr^hu/hu + IgG4^P в соответствующий момент времени; + - Р<0,05 при сравнении с рер}^409Е/А409Е+Н4Н17319Р2 в соответствующий момент времени. Все статистические анализы проводили с помощью модели смешанных эффектов с апостериорным критерием Сидака.

[0081] На фигуре 25 изображен график событий для когорт части А клинического испытания, впервые проводимого с участием людей, и он включает процедуры, которые необходимо выполнять при каждом визите для скрининга, лечения и при визитах последующих наблюдений.

[0082] На фигуре 26 изображен график событий для когорт части В клинического испытания, впервые проводимого с участием людей, и он включает процедуры, которые необходимо выполнять при каждом визите для предварительного скрининга, скрининга и определения исходного уровня.

[0083] На фигуре 27 изображен график событий для когорт части В клинического испытания, впервые проводимого с участием людей, и он включает процедуры, которые необходимо выполнять при каждом визите для лечения и последующего наблюдения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0084] Лептин представляет собой гормон жировой ткани, который регулирует энергетический баланс, а также метаболическую и нейроэндокринную функцию (Flak and Myers, Mol Endocrinol. 2016; 30: 3-12; Zhang et al. Nature. 1994; 372: 425-432). В состоянии дефицита энергии низкие уровни циркулирующего лептина вызывают адаптивные ответы, включая усиление голода и сохранение энергии за счет модулирования нейроэндокринных путей. Лептин модулирует энергетический и метаболический баланс путем взаимодействия с рецептором лептина (LEPR), представителем семейства цитокиновых рецепторов класса I (Tartaglia et al., 1995). LEPR кодируется одним геном, и альтернативный сплайсинг приводит к образованию нескольких изоформ сплайсинга LEPR, которые различаются по своей С-концевой последовательности (Baumann et al., 1996). Из этих изоформ сплайсинга LEPR-b является основной изоформой, которая опосредует эффекты лептина, и является единственной изоформой, которая стимулирует передачу сигнала, опосредованную JAK-STAT (Baumann et al., 1996; Tartaglia et al., 1995; White and Tartaglia, 1996). Нейроны мозга, экспрессирующие LEPR-b, являются основными мишенями и медиаторами действия лептина на энергетический, метаболический и нейроэндокринный гомеостаз. Это подтверждается наблюдениями, что селективная экспрессия Lepr-b в нейронах у мышей Lepr^db/db устраняет ожирение, фенотипы с диабетом и нарушениями репродуктивной функции (de Luca et al., 2005). Кроме того, делеция на генетическом уровне Lepr в нейронах обеспечивает копирование на фенотипическом уровне фенотипов ожирения и гипергликемии у животных Lepr^db/db (Cohen et al., 2001). Недостаточность лептина из-за генетических мутаций с потерей функции в гене Lep приводит к гиперфагии, ожирению, инсулинорезистентности, дислипидемии и нарушению нейроэндокринной функции у мышей, которые поддаются обращению вспять путем лечения лептином (Barash et al., 1996; Campfield et al., 1995; Chehab et al., 1996; Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995). В клиническом аспекте аналог лептина, метрелептин, обеспечивает обращение вспять ожирения, а также нарушения метаболической и репродуктивной функции у пациентов с моногенным типом ожирения вследствие недостаточности лептина (Farooqi et al., 1999; Farooqi et al., 2002). Подобно первичной недостаточности лептина, болезненные состояния, относящиеся к вторичной гиполептинемии, ассоциированы с нарушением метаболизма глюкозы и липидов, которую можно обратить вспять путем лечения лептином. Виды врожденной и приобретенной генерализованной липодистрофии представляют собой редкие и тяжелые заболевания, характеризующиеся почти полной потерей депо жировой ткани (Brown et al., 2016; Patni and Garg, 2015). Очень низкие уровни циркулирующего лептина у этих пациентов приводит к возникновению состояния гиперфагии, гипертриглицеридемии, гиперхолестеринемии, стеатозу печени, инсулинорезистентности и сахарному диабету (Brown et al., 2016; Patni and Garg, 2015). Тяжелым осложнением гипертриглицеридемии, особенно когда уровни TG превышают 500-1000 мг/дл, является острый и рецидивирующий панкреатит (Yadav and Pitchumoni 2003), который может быть опасным для жизни, с уровнем смертности более 40%, если он сопровождается осложнениями, такими как инфекция или органная недостаточность (UK Guidelines 2005). Эктопическое отложение липидов в печени (стеатоз печени) может привести к возникновению стеатогепатита, который характеризуется накоплением жира, повреждением клеток и воспалением в печени и является одной из наиболее распространенных причин цирроза (El-Zayadi 2008, Federico 2006 и Festi 2004).

[0085] Лечение лептином обеспечивает снижение выраженности гиперфагии и улучшение в отношении дислипидемии, стеатоза печени и гликемического контроля у мышей Tg-aP2-nSrebplc, у которых развивается почти полная потеря жировых депо, что характерно для генерализованной липодистрофии (Shimomura et al., 1999; Shimomura et al., 1998). Метрелептин обеспечивает смягчение проявления нарушения метаболизма у пациентов с генерализованной липодистрофией (Oral et al., 2002), но не одобрен для лечения пациентов с очаговой липодистрофией (Ajluni et al., 2016).

[0086] Пациенты с липодистрофией часто сталкиваются с другими серьезными сопутствующими заболеваниями, такими как хроническое заболевание почек, сердечно-сосудистые осложнения, аутоиммунные заболевания и периферическая Т-клеточная лимфома, острый лимфобластный лейкоз и лимфома Ходжкина.

[0087] Пациенты с врожденной недостаточностью лептина демонстрируют в первые несколько месяцев жизни быстрый набор веса и иммунологические отклонения, при этом риск летального исхода в течение первого и второго десятилетий жизни является значимо повышенным (Funcke, et al., Monogenic forms of childhood obesity due to mutations in the leptin gene. Mol Cell Pediatr. 2014; 1(1): 3); (Dubern, et al., Leptin and leptin receptor-related monogenic obesity. Biochimie. 2012; 94(10): 2111-5); (Paz-Filho, et al., Ten years of leptin replacement therapy. Obesity reviews. 2011; 12: e315-e323.). Хотя не существует одобренных средств терапии для врожденной недостаточности лептина, в нескольких небольших открытых исследованиях пациентов с моногенным ожирением из-за мутаций лептина с потерей функции лечение лептином обеспечивало заметное снижение аппетита, веса тела, тучности, выраженности метаболических отклонений, разрыва между возрастом костной ткани и хронологическим возрастом, выраженности гормональных отклонений и иммунологических отклонений (Wabitsch, et al., Severe Early-Onset Obesity Due to Bioinactive Leptin Caused by a p.N103K Mutation in the Leptin Gene. J Clin Endocrinol Metab. 2015; 100(9): 3227-3230); (Farooqi, et al., Effects of recombinant leptin therapy in a child with congenital leptin deficiency. N Engl J Med. 1999; 341(12): 879-84); (Licinio, et al., Phenotypic effects of leptin replacement on morbid obesity, diabetes mellitus, hypogonadism, and behavior in leptin-deficient adults. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101(13): 4531-6); (Gibson et al., Congenital Leptin Deficiency Due to Homozygosity for the Deltal33G mutation: report of another case and evaluation of response to four years of leptin therapy. J Clin Endocrin. & Metab. 2004; 89(10): 4821-4826). Другие авторы сообщают, что терапия лептином приводила к быстрому и устойчивому увеличению уровней гормонов щитовидной железы в плазме крови и способствовала своевременному пубертатному развитию, и обеспечивала улучшение в отношении числа циркулирующих CD4(+) Т-клеток, пролиферации Т-клеток и высвобождения цитокинов (Farooqi et al., Beneficial effects of leptin on obesity, T cell hyporesponsiveness, and neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency. J Clin Invest. 2002; 110(8): 1093-1103). Однако в некоторых случаях выработка антител к метрелептину с нейтрализующей активностью оставляет пациентов без каких-либо возможностей в отношении нацеленной терапии (Özsu, et al., Early-onset severe obesity due to complete deletion of the leptin gene in a boy. J Pediatr Endocrinol Metab. 2017; 30(11): 1227-1230). В данном документе предусмотрены способы применения агониста рецептора лептина, такого как Н4Н17319Р2 (см. WO 2017/66204), для лечения пациентов с врожденной недостаточностью лептина.

[0088] В данном документе предусмотрены агонистические моноклональные антитела, которые активируют LEPR человека с эффективностью, сходной с таковой у лептина. Опосредованная моноклональными антителами активация LEPR является эффективной в отношении обращения вспять серьезного набора веса тела и нарушения метаболизма на мышиных моделях нарушений, представляющих собой первичную и вторичную недостаточность лептина. Кроме того, агонистические моноклональные антитела к LEPR снижают тучность и вес тела у мышей с нормальным весом, а также у приматов, отличных от человека, с нормальным и высоким содержанием жира в организме, а также стимулируют LEPR в присутствии циркулирующего лептина.

[0089] Необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и условиями экспериментов, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

[0090] Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как это обычно понимает специалист средней квалификации в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Используемое в данном документе выражение «приблизительно» при использовании в отношении конкретного указанного числового значения означает, что значение может отличаться от указанного значения на не более чем 1%. Например, используемое в данном документе выражение «приблизительно 100» включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).

[0091] Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные с описанными в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны только предпочтительные способы и материалы.

Определения

[0092] Выражение «рецептор лептина», «LEPR» и т.п., используемое в данном документе, относится к рецептору лептина человека, содержащему аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 113 (см. также номер доступа Р48357 в UniProtKB/Swiss-Prot). Альтернативные названия LEPR, используемые в научной литературе, включают «рецептор ОВ», «ОВ-R» и «CD295». LEPR также называется «WSX» (см., например, патент США №7524937). Выражение «LEPR» включает как мономерные, так и мультимерные (например, димерные) молекулы LEPR. Используемое в данном документе выражение «мономерный LEPR человека» означает белок LEPR или его часть, которые не содержат или не имеют в своем составе мультимеризующихся доменов и которые существуют в нормальных условиях в виде одной молекулы LEPR без непосредственного физического соединения с другой молекулой LEPR. Иллюстративной мономерной молекулой LEPR является молекула, называемая в данном документе «hLEPR.mmh», содержащая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 114 (см., например, пример 3 в данном документе). Используемое в данном документе выражение «димерный LEPR человека» означает конструкцию, содержащую две молекулы LEPR, присоединенные друг к другу посредством линкера, ковалентной связи, нековалентной связи или посредством мультимеризующего домена, такого как Fc-домен антитела. Иллюстративной димерной молекулой LEPR является молекула, называемая в данном документе «hLEPR.mFc», содержащая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 115 (см., например, пример 3 в данном документе), или молекула, называемая в данном документе «hLEPR.hFc», содержащая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 116. Используемые в данном документе выражения, такие как «антитело к LEPR», «антитело, которое специфически связывает LEPR», «LEPR-специфический связывающий белок» и т.п., если конкретно не указано иное, относятся к молекулам, которые связывают полноразмерный LEPR человека, мономерный LEPR человека, димерный LEPR человека или другие конструкции, которые содержат внеклеточный домен LEPR или состоят из него.

[0093] Все ссылки на белки, полипептиды и фрагменты белка в данном документе относятся к человеческой версии соответствующего белка, полипептида или фрагмента белка, если явно не указано, что они происходят из организма видов, отличных от человека. Таким образом, выражение «LEPR» означает LEPR человека, если не указано, что он происходит из организма видов, отличных от человека, например, «LEPR мыши», «LEPR обезьяны» и т.д.

[0094] Используемое в данном документе выражение «экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR» означает один или более белков LEPR или его внеклеточный домен, которые экспрессируются на поверхности клетки in vitro или in vivo, так что по меньшей мере часть белка LEPR располагается на внеклеточной стороне клеточной мембраны и доступна для антигенсвязывающей части антитела. «Экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR» может содержать белок LEPR, экспрессируемый на поверхности клетки, которая в норме {например, в нативном состоянии или состоянии дикого типа) экспрессирует белок LEPR, или состоять из такового. В качестве альтернативы, «экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR» может содержать белок LEPR, экспрессируемый на поверхности клетки, которая в норме не экспрессирует LEPR человека на своей поверхности, но была искусственно сконструирована для экспрессии LEPR на своей поверхности, или состоять из такового.

[0095] Используемые в данном документе выражения, такие как «антитело к LEPR» или «антитело, которое связывает рецептор лептина человека», включают как моновалентные антитела с одной специфичностью, так и биспецифические антитела, содержащие первое плечо, которое связывает LEPR, и второе плечо, которое связывает второй (целевой) антиген, где плечо к LEPR содержат любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, представленных в таблице 1 в данном документе.

[0096] Используемый в данном документе термин «антитело» означает любую антигенсвязывающую молекулу или молекулярный комплекс, содержащий по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR), которая специфически связывается или взаимодействует с определенным антигеном (например, LEPR). Термин «антитело» включает молекулы иммуноглобулинов, содержащие четыре полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как HCVR или V_H) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена: C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как LCVR или V_L) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (C_L1). V_H- и V_L-области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения FR антитела к LEPR (или его антигенсвязывающей части) могут быть идентичными последовательностям зародышевой линии человека или могут быть модифицированы естественным или искусственным путем. Консенсусную аминокислотную последовательность можно определить на основании анализа на основе прямого сравнения двух или более CDR.

[0097] Используемый в данном документе термин «антитело» также включает антигенсвязывающие фрагменты молекул полного антитела. Термины «антигенсвязывающая часть» антитела, «антигенсвязывающий фрагмент» антитела и т.п., используемые в данном документе, включают любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из молекул полного антитела с помощью любых подходящих стандартных методик, таких как протеолитическое расщепление или методики генной инженерии на основе рекомбинации, включающие манипуляцию с ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антител, и ее экспрессию. Такая ДНК известна и/или легко доступна, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (включая, например, фаговые библиотеки антител), или может быть синтезирована. ДНК можно секвенировать и с ней можно проводить химические манипуляции или манипуляции с применением методик молекулярной биологии, например, для расположения одного или более вариабельных и/или константных доменов в подходящую конфигурацию или для введения кодонов, включения остатков цистеина, модификации, добавления или удаления аминокислот ит.д.

[0098] Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают (i) Fab-фрагменты; (ii) F(ab')₂-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) dAb-фрагменты и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенная определяющая комплементарность область (CDR), как, например, пептид CDR3) или пептид с ограниченной конформационной свободой FR3-CDR3-FR4. Другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфические антитела, одно доменные антитела, антитела с удаленным доменом, химерные антитела, антитела с привитой CDR, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные нанотела, бивалентные нанотела и т.д.), иммунофармацевтические препараты на основе модульного белка небольшого размера (SMIP) и вариабельные домены IgNAR акулы, также включены в выражение «антигенсвязывающий фрагмент», используемое в данном документе.

[0099] Антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно будет содержать по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может быть любого размера или аминокислотного состава и будет, как правило, содержать по меньшей мере одну CDR, которая находится в смежном положении или в одной рамке считывания с одной или более каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, содержащих домен V_H, ассоциированный с доменом V_L, домены V_H и V_L могут размещаться друг относительно друга в любом подходящем порядке. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. В качестве альтернативы, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен V_H или V_L.

[0100] В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно соединенный с по меньшей мере одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут присутствовать в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают: (i) V_H-Ch1; (ii) V_H-Ch2; (iii) V_H-Сн3; (iv) V_H-Ch1-Ch2; (v) V_H-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) V_H-Ch2-Ch3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) V_L-Ch1-Ch2; (xii) V_L-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) VL-CH2-CH3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе любой из иллюстративных конфигураций, перечисленных выше, вариабельные и константные домены могут быть либо непосредственно соединены друг с другом, либо могут быть соединены с помощью целой шарнирной или линкерной области или ее части. Шарнирная область может состоять из по меньшей мере 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, которые обеспечивают образование гибкого или полугибкого соединяющего элемента между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной молекуле полипептида. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) из любой из конфигураций вариабельного и константного домена, перечисленных выше, находящихся в нековалентной ассоциации друг с другом и/или с одним или более мономерными доменами V_H или V_L (например, с помощью дисульфидной(-ых) связи(-ей)).

[0101] Как и в случае с молекулами полного антитела антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или полиспецифическими {например, биспецифическими). Полиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела будет, как правило, содержать по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связываться с отдельным антигеном или с другим эпитопом того же антигена. Любой формат полиспецифических антител, в том числе иллюстративные форматы биспецифических антител, раскрытые в данном документе, могут быть адаптированы для применения в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению с помощью стандартных методик, доступных из уровня техники.

[0102] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к LEPR по настоящему изобретению являются антителами человека. Термин «антитело человека», используемый в данном документе, предназначен для включения антител, содержащих вариабельные и константные области, полученные из последовательностей зародышевой линии иммуноглобулина человека. Антитела человека по настоящему изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями зародышевой линии иммуноглобулина человека (например, мутации, вводимые с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro, или с помощью соматической мутации in vivo), например в CDR, и в частности CDR3. Однако термин «антитело человека», используемый в данном документе, не предназначен для включения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающего, например мыши, привиты на каркасные последовательности человека.

[0103] Антитела по настоящему изобретению могут в некоторых вариантах осуществления представлять собой рекомбинантные антитела человека. Подразумевается, что используемый в данном документе термин «рекомбинантное антитело человека» включает все антитела человека, получаемые, экспрессируемые, создаваемые или выделяемые рекомбинантными способами, такие как антитела, экспрессируемые с применением рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (дополнительно описанные ниже), антитела, выделяемые из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (дополнительно описанные ниже), антитела, выделяемые у животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулинов человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, получаемые, экспрессируемые, создаваемые или выделяемые любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные и константные области, полученные из последовательностей зародышевой линии иммуноглобулина человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательности Ig человека, - соматическому мутагенезу in vivo) и, следовательно, аминокислотные последовательности V_H- и V_L-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из последовательностей V_H и V_L зародышевой линии человека, и родственными им, могут не существовать в естественный условиях в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

[0104] Настоящее изобретение охватывает антитела, содержащие одну или более мутаций в шарнирной области, C_H2- или C_H3-области, которые могут быть необходимыми, например, при получении, для обеспечения улучшения выхода необходимой формы антитела.

[0105] Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой выделенные антитела. Используемый в данном документе термин «выделенное антитело» означает антитело, которое было идентифицировано и отделено от по меньшей мере одного компонента его природного окружения и/или извлечено из такового. Например, антитело, которое было отделено или удалено от по меньшей мере одного компонента из организма, или из ткани или клетки, в которых антитело существует или продуцируется естественным путем, является «выделенным антителом» для целей настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела представляют собой антитела, прошедшие по меньшей мере одну стадию очистки или выделения. Согласно определенным вариантам осуществления выделенное антитело может по сути не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.

[0106] Настоящее изобретение включает варианты раскрытых в данном документе антител к LEPR, содержащих одну или более аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных областях и/или CDR-областях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены антитела. Такие мутации можно легко определить путем сравнения аминокислотных последовательностей, раскрытых в данном документе, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые получены из любых аминокислотных последовательностей, раскрытых в данном документе, где одна или более аминокислот в пределах одной или более каркасных областей и/или CDR-областей подвергнуты мутации до соответствующего(-их) остатка(-ов) последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело, или до соответствующего(-их) остатка(-ов) другой последовательности зародышевой линии человека, или до консервативной аминокислотной замены соответствующего(-их) остатка(-ов) зародышевой линии (такие изменения последовательностей называются в данном документе собирательно «мутациями зародышевой линии»). Специалист средней квалификации в данной области техники, исходя из раскрытых в данном документе последовательностей вариабельных областей тяжелых и легких цепей, легко может получить многочисленные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В определенных вариантах осуществления все остатки из каркасной области и/или CDR в доменах V_H и/или V_L подвергнуты обратной мутации до остатков, присутствующих в первоначальной последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело. В других вариантах осуществления только определенные остатки подвергнуты обратной мутации до первоначальной последовательности зародышевой линии, например только подвергнутые мутации остатки, присутствующие в пределах первых 8 аминокислот FR1 или в пределах последних 8 аминокислот FR4, или только подвергнутые мутации остатки, присутствующие в пределах CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или более остатков из каркасной области и/или CDR подвергнуты мутации до соответствующего(-их) остатка(-ов) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой первоначально было получено антитело). Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или более мутаций зародышевой линии в каркасных областях и/или CDR-областях, например, при этом определенные отдельные остатки подвергнуты мутации до соответствующего остатка последовательности определенной зародышевой линии, в то время как определенные другие остатки, которые отличаются от последовательности первоначальной зародышевой линии, оставляют или подвергают мутации до соответствующего остатка другой последовательности зародышевой линии. После получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или более мутаций зародышевой линии, можно легко протестировать в отношении одного или более требуемых свойств, таких как улучшение специфичности связывания, повышение аффинности связывания, улучшение или усиление биологических антагонистических или агонистических свойств (в случае необходимости), снижение иммуногенности и т.п. Настоящее изобретение охватывает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные с помощью этого общего способа.

[0107] Настоящее изобретение включает антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие аминокислотные последовательности, которые являются по сути сходными или по сути идентичными одной или более аминокислотным последовательностям вариабельного домена или CDR, присутствующим в любом из иллюстративных антител к LEPR, описанных в данном документе.

[0108] Применительно к полипептидам термин «существенный уровень сходства» или «по сути сходный» означает, что две последовательности пептидов при оптимальном выравнивании, как, например, с помощью программ GAP или BESTFIT, с применением значений штрафа за открытие гэпа по умолчанию, характеризуются по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% или 99% идентичностью последовательности. Предпочтительно, положения остатков, не являющихся идентичными, отличаются по консервативным аминокислотным заменам. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, содержащим боковую цепь (R-группу) со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислотная замена по сути не будет изменять функциональные свойства белка. В случаях, если две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процентная идентичность последовательности или степень сходства могут быть скорректированы до более высоких значений с тем, чтобы внести поправку на консервативную природу замены. Средства для осуществления этой коррекции хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24. 307-331. Примеры групп аминокислот, которые содержат боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают: (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатические боковые цепи с гидроксильными группами: серин и треонин; (3) амидосодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат и (7) серосодержащие боковые цепи представляют собой цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В качестве альтернативы, консервативной заменой является любое изменение, характеризующееся положительным значением в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. «Умеренно консервативной» заменой является любое изменение, характеризующееся неотрицательным значением в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250.

[0109] Для полипептидов сходство последовательностей, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно измеряют с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков сопоставляет сходные последовательности с применением показателей сходства, присваиваемых различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, программный пакет GCG включает программы, такие как Gap и Bestfit, которые можно применять с параметрами по умолчанию для определения степени гомологии последовательностей или идентичности последовательностей у близкородственных полипептидов, таких как гомологичные полипептиды из различных видов организмов, или белка дикого типа и его мутеина. См., например, GCG версии 6.1. Последовательности полипептидов также можно сравнивать с применением FASTA с применением параметров по умолчанию или рекомендованных параметров; программа в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) позволяет осуществлять выравнивания и расчет процентной идентичности последовательностей в областях с наибольшим перекрыванием между запрашиваемой и найденной последовательностями (Pearson (2000), выше). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности по настоящему изобретению с базой данных, содержащей большое число последовательностей от различных организмов, является компьютерная программа BLAST, в частности BLASTP или TBLASTN, с применением параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

[0110] Используемый в данном документе термин «субъект» относится к животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в ослаблении проявления, предупреждении и/или лечении заболевания или нарушения, ассоциированного с недостаточностью лептина. Субъект может представлять собой взрослого или ребенка. Субъект может характеризоваться наличием нарушения метаболизма, такого как общая или очаговая липодистрофия. Субъект может характеризоваться наличием врожденной недостаточности лептина или приобретенной недостаточности лептина. Субъекты, у которых имеется врожденная недостаточность лептина, включают субъектов с генными мутациями, которые приводят к тому, что уровни циркулирующего лептина являются незначительными или он отсутствует, или к тому, что лептин циркулирует, но является биологически неактивным. Субъект может характеризоваться наличием одного или более симптомов, ассоциированных с недостаточностью лептина. Используемый в данном документе термин «субъект» взаимозаменяем с термином «пациент». В некоторых аспектах у субъекта имеются нейтрализующие антитела против метрелептина.

[0111] Используемые в данном документе термины «лечить», «осуществление лечения» или «лечение» относятся к снижению интенсивности или ослаблению тяжести по меньшей мере одного симптома недостаточности лептина вследствие введения терапевтического средства, такого как антитело по настоящему изобретению, субъекту, нуждающемуся в этом. Эти термины включают ингибирование прогрессирования соответствующего заболевания или ухудшения состояния или симптомов, ассоциированных с заболеванием. Термины также предусматривают положительный прогноз заболевания, т.е у субъекта могут отсутствовать симптомы после введения терапевтического средства, такого как антитело по настоящему изобретению. Положительный прогноз может включать смягчение любого из следующих состояний: гиперфагия, гипергликемия, инсулинорезистентность, дислипидемия или стеатоз печени.

[0112] Термины «предупреждать», «осуществлять предупреждение» или «предупреждение» относятся к подавлению проявления любых симптомов, состояний или показаний, ассоциированных с недостаточностью лептина.

[0113] Терапевтическое средство можно вводить субъекту в терапевтической дозе. Фраза «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое приводит к требуемому эффекту, ради которого его вводят. Точное количество будет зависеть от цели лечения и будет установлено специалистом в данной области техники с помощью известных методик (см., например, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding), и это обсуждается более подробно в данном документе.

Антитела к LEPR, включающие Fc-варианты

[0114] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR содержат Fc-домен, содержащий одну или более мутаций, которые обеспечивают усиление или ослабление связывания антитела с FcRn-рецептором, например, при кислом значении рН по сравнению с нейтральным значением рН. Например, настоящее изобретение включает антитела к LEPR, содержащие мутацию в C_H2- или C_H3-области Fc-домена, где мутация(-и) обеспечивает(-ют) повышение аффинности Fc-домена к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где рН находится в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Результатом таких мутаций может быть увеличение периода полужизни антитела в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например, модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т), или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K), и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428, или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В одном варианте осуществления модификация предусматривает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S), модификацию 428L, 2591 (например, V259I) и 308F (например, V308F), модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y), модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е), модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L) и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).

[0115] Например, настоящее изобретение включает антитела к LEPR, содержащие Fc-домен, содержащий одну или более пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е); 428L и 434S (например, M428L и N434S); а также 433K и 434F (например, H433K и N434F). Все возможные комбинации вышеупомянутых мутаций в Fc-домене и другие мутации в пределах вариабельных доменов антител, раскрытых в данном документе, рассматриваются в объеме настоящего изобретения.

[0116] Антитела к LEPR по настоящему изобретению могут содержать модифицированный Fc-домен со сниженной эффекторной функцией. Используемое в данном документе выражение «модифицированный Fc-домен, обладающий сниженной эффекторной функцией» означает любую часть Fc иммуноглобулина, которая была модифицирована, подвергнута мутации, усечена и т.д., относительно встречающегося в природе Fc-домена дикого типа, так что при применении молекулы, содержащей модифицированный Fc, наблюдается снижение тяжести или степени по меньшей мере одного эффекта, выбранного из группы, состоящей из уничтожения клеток (например, ADCC и/или CDC), активации комплемента, фагоцитоза и опсонизации, по сравнению с молекулой сравнения, предусматривающей версию части Fc дикого типа, встречающуюся в природе. В определенных вариантах осуществления «модифицированный Fc-домен, обладающий сниженной эффекторной функцией» представляет собой Fc-домен со сниженным или ослабленным связыванием с Fc-рецептором (например, FcγR).

[0117] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения модифицированный Fc-домен представляет собой вариант Fc из IgG1 или вариант Fc из IgG4, содержащий замену в шарнирной области. Например, модифицированный Fc для применения в контексте настоящего изобретения может включать вариант Fc из IgG1, в котором по меньшей мере одна аминокислота шарнирной области Fc из IgG1 заменена соответствующей аминокислотой из шарнирной области Fc из IgG2. В качестве альтернативы, модифицированный Fc для применения в контексте настоящего изобретения может включать вариант Fc из IgG4, в котором по меньшей мере одна аминокислота шарнирной области Fc из IgG4 заменена соответствующей аминокислотой из шарнирной области Fc из IgG2. Неограничивающие примеры модифицированных Fc-областей, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, представлены в публикации заявки на патент США №2014/0243504.

[0118] Другие модифицированные Fc-домены и модификации Fc, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, включают любые модификации, представленные в US 2014/0171623; US 8697396; US 2014/0134162; WO 2014/043361. Способы конструирования антител или других антигенсвязывающих слитых белков, содержащих модифицированный Fc-домен, описанных в данном документе, известны в данной области техники.

Биологические характеристики антител

[0119] Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают LEPR человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала. Такие антитела могут называться в данном документе «агонистическими антителами». В контексте настоящего изобретения «активация опосредованной LEPR передачи сигнала» означает стимуляцию внутриклеточного эффекта, который в норме возникает в результате взаимодействия лептина с LEPR в клетках, экспрессирующих LEPR. В определенных вариантах осуществления «активация опосредованной LEPR передачи сигнала» означает активацию транскрипции STAT3, которая может быть обнаружена с применением любого способа, в котором можно измерять или идентифицировать, прямо или косвенно, активность STAT3, например, с применением меченой версии STAT3, экспрессируемой в линии репортерных клеток. Например, настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые активируют опосредованную LEPR передачу сигнала в клеточном анализе по гену-репортеру, например, с применением формата анализа, определенного в примере 7 в данном документе, или по сути сходного анализа. Клеточные анализы по гену-репортеру, в которых обнаруживают активацию LEPR, такие как анализ, представленный в примере 7 в данном документе, могут давать поддающийся обнаружению сигнал, который можно выразить в виде значения EC₅₀ (т.е. концентрации антитела, необходимой для получения полумаксимальной интенсивности передачи сигнала) и/или процента от максимальной интенсивности передачи сигнала, наблюдаемой в присутствии лептина. В определенных иллюстративных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR, которые активируют опосредованную LEPR передачу сигнала со значением ЕС₅₀, составляющим менее чем приблизительно 12,0 нМ в клеточном анализе по гену-репортеру, например, с применением формата анализа, определенного в примере 7 в данном документе, или по сути сходного анализа. В определенных иллюстративных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR, которые активируют опосредованную LEPR передачу сигнала с максимальным процентом активации относительно опосредованной лептином передачи сигнала, составляющим более приблизительно 65%, в клеточном анализе по гену-репортеру, например, с применением формата анализа, определенного в примере 7 в данном документе, или по сути сходного анализа.

[0120] Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают мономерный LEPR человека с высокой аффинностью. Например, настоящее изобретение включает антитела к LEPR, которые связывают мономерный LEPR человека (например, hLEPR.mmh, SEQ ID NO: 114) с K_D, составляющей менее чем приблизительно 150 нМ, измеренной с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25°С или 37°С, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают мономерный LEPR человека при 25°С с K_D, составляющей менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 140 нМ, менее чем приблизительно 130 нМ, менее чем приблизительно 120 нМ, менее чем приблизительно 110 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 90 нМ, менее чем приблизительно 80 нМ, менее чем приблизительно 70 нМ, менее чем приблизительно 60 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 40 нМ, менее чем приблизительно 30 нМ, менее чем приблизительно 20 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 9 нМ, менее чем приблизительно 8 нМ, менее чем приблизительно 7 нМ, менее чем приблизительно 6 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ, менее чем приблизительно 1 нМ, менее чем приблизительно 900 пМ, менее чем приблизительно 800 пМ, менее чем приблизительно 700 пМ, менее чем приблизительно 600 пМ, менее чем приблизительно 500 пМ, менее чем приблизительно 400 пМ или менее чем приблизительно 300 пМ, измеренной с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа.

[0121] Настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают мономерный LEPR человека (например, hLEPR.mmh, SEQ ID NO: 114) с периодом полудиссоциации (t½), составляющим более чем приблизительно 50 минут, измеренным с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25°С или 37°С, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают мономерный LEPR человека при 25°С с t½, составляющим более чем приблизительно 50 минут, более чем приблизительно 55 минут, более чем приблизительно 60 минут, более чем приблизительно 65 минут или больше, измеренным с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа.

[0122] Настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают димерный LEPR человека (например, hLEPR.mFc, SEQ ID NO: 115) с высокой аффинностью. Например, настоящее изобретение включает антитела к LEPR, которые связывают димерный LEPR человека с K_D, составляющей менее чем приблизительно 1,5 нМ, измеренной с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25°С или 37°С, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают димерный LEPR человека при 25°С с K_D, составляющей менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 130 нМ, менее чем приблизительно 110 нМ, менее чем приблизительно 80 нМ, менее чем приблизительно 70 нМ, менее чем приблизительно 60 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 40 нМ, менее чем приблизительно 30 нМ, менее чем приблизительно 20 нМ или менее чем приблизительно 10 нМ, измеренной с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа.

[0123] Настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают димерный LEPR человека (например, hLEPR.mFc, SEQ ID NO: 115) с периодом полудиссоциации (t½), составляющим более чем приблизительно 10 минут, измеренным с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25°С или 37°С, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают димерный LEPR человека при 25°С с t½, составляющим более чем приблизительно 10, более чем приблизительно 15 минут, более чем приблизительно 20 минут, более чем приблизительно 25 минут, более чем приблизительно 30 минут, более чем приблизительно 40 минут, более чем приблизительно 50 минут, более чем приблизительно 60 минут, более чем приблизительно 70 минут или больше, измеренным с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с применением формата анализа, определенного в примере 3 в данном документе, или по сути сходного анализа.

[0124] Настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают LEPR в комплексе с лептином человека («LEPR в комплексе с лептином человека» также может быть обозначен выражением «лептин:LEPR»). Например, настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны связываться с предварительно образованным комплексом, содержащим hLEPR и лептин человека. То есть, в соответствии с определенными вариантами осуществления взаимодействие между антителами к LEPR и LEPR не ингибируется присутствием лептина в комплексе с LEPR; аналогично, взаимодействие между лептином и LEPR в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения не ингибируется присутствием антитела к LEPR. Иллюстративный формат анализа для определения того, связывается ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с LEPR в комплексе с лептином человека, представлен в примере 4 в данном документе.

[0125] Точно так же настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают LEPR и не блокируют взаимодействие LEPR:лептин. Например, настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны связывать LEPR, тем самым продуцируя комплекс антитело:LEPR, где полученный комплекс антитело:LEPR способен взаимодействовать с лептином с образованием трехкомпонентного комплекса, содержащего антитело, LEPR и лептин. Иллюстративный формат анализа для определения того, способны ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывать LEPR таким образом, чтобы не блокировать взаимодействие между LEPR и лептином или не мешать таковому, представлен в примере 5 в данном документе.

[0126] Настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают LEPR, экспрессируемый на клеточной поверхности, в присутствии и/или в отсутствие лептина человека. LEPR, экспрессируемый на поверхности клетки, означает LEPR или его часть (например, внеклеточную часть LEPR), экспрессируемые на поверхности клетки, либо в естественных условиях, либо в сконструированной линии клеток, так что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с молекулой LEPR. В определенных вариантах осуществления LEPR, экспрессируемый на клеточной поверхности, включает рекомбинантные комплексы, содержащие внеклеточный домен LEPR, присоединенный к клетке посредством метки или якоря (например, якорь GPI, как проиллюстрировано в примере 6 в данном документе). В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предусмотрены антитела, которые способны связывать LEPR, экспрессируемый на клеточной поверхности, в отсутствие лептина, а также способны связывать LEPR, экспрессируемый на клеточной поверхности, в присутствии лептина (т.е. при обстоятельствах, когда лептин способен связываться с лептином, экспрессируемым на клеточной поверхности). То есть, в соответствии с определенными вариантами осуществления взаимодействие между антителами к LEPR и LEPR, экспрессируемым на клеточной поверхности, не ингибируется присутствием лептина в комплексе с LEPR, экспрессируемым на клеточной поверхности. Антитела в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения способны образовывать трехкомпонентный комплекс на поверхности клетки, содержащий антитело, LEPR, экспрессируемый на клеточной поверхности, и лептин. Иллюстративный формат анализа для определения того, способны ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывать LEPR, экспрессируемый на клеточной поверхности, в присутствии и в отсутствие лептина человека, представлен в примере 6 в данном документе.

[0127] Антитела по настоящему изобретению могут обладать одной или более из вышеупомянутых биологических характеристик или любой их комбинацией. Приведенный выше перечень биологических характеристик антител по настоящему изобретению не является исчерпывающим. Другие биологические характеристики антител по настоящему изобретению будут очевидны специалисту средней квалификации в данной области техники из обзора настоящего изобретения, включая практические примеры из данного документа.

Эпитопное картирование и родственные методики

[0128] Настоящее изобретение также включает антитела к LEPR, содержащие варианты любой из раскрытых в данном документе аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, имеющие одну или более консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает антитела к LEPR. содержащие аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR с, например, 10 или меньше, 8 или меньше, 6 или меньше, 4 или меньше и т.д. консервативными аминокислотными заменами по отношению к любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, представленных в таблице 1 в данном документе. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, содержащие вариантные аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR по отношению к последовательностям, представленным в таблице 1 в данном документе (например, содержащие консервативные аминокислотные замены), где такие вариантные антитела, тем не менее, проявляют одну или более функций и/или свойств иллюстративных антител к LEPR, раскрытых в данном документе.

[0129] Внеклеточный домен LEPR человека содержит N-концевой домен гомологии цитокиновых рецепторов (CRH-1), иммуноглобулин-подобный (Ig) домен и второй домен CRH (CRH-2), который называется лептин-связывающим доменом (LBD). (Carpenter et al. (2012) Structure 20:487-97). Кроме того, LEPR обладает наибольшей гомологией и сходным размером внеклеточного домена и организацией с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (GCSF) и гликопротеином 130 (gp13). (Haniu et al. (1998) J Biol Chem 273(44): 28691-699).

[0130] Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Один антиген может содержать более чем один эпитоп. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными участками на антигене и могут оказывать различные биологические эффекты. Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образуется аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи, располагающимися рядом в пространстве. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образуемый смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В определенных обстоятельствах эпитоп может содержать фрагменты сахаридов, фосфорильные группы или сульфонильные группы на антигене.

[0131] Настоящее изобретение включает антитела к LEPR, которые взаимодействуют с одним или более эпитопами, присутствующими в пределах аминокислот M1-D839 LEPR человека (SEQ ID NO: 113). Как представлено в примере 11, 201 пептид из LEPR человека обеспечивал значимое снижение уровня поглощения дейтерия при связывании с антителом Н4Н16650Р2. Пептиды, соответствующие аминокислотам 162-169 (аминокислоты LYVLPEVL из LEPR человека, SEQ ID NO: 113) и 170-191 (аминокислоты EDSPLVPQKGSF из LEPR человека, SEQ ID NO: 113), характеризовались более низкими уровнями дейтерирования при связывании с Н4Н16650Р2, указывая на то, что это антитело связывает по меньшей мере два эпитопа LEPR человека, имеющих последовательности LYVLPEVL или EDSPLVPQKGSF (аминокислоты 162-169 или 170-191 соответственно из SEQ ID NO: 113).

[0132] Эпитоп, с которым связываются антитела по настоящему изобретению, может состоять из одной непрерывной последовательности из 3 или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) аминокислот белка LEPR. В качестве альтернативы, эпитоп может состоять из множества несмежных аминокислот (или аминокислотных последовательностей) LEPR. В некоторых вариантах осуществления эпитоп расположен на лептин-связывающем домене LEPR или рядом с ним. В других вариантах осуществления эпитоп расположен в области, отличной от лептин-связывающего домена LEPR, например, в месте на поверхности LEPR, в котором антитело при связывании с таким эпитопом не препятствует связыванию лептина с LEPR.

[0133] Разные методики, известные специалистам средней квалификации в данной области техники, можно применять для идентификации аминокислот в эпитопе, распознаваемом конкретным антителом. К иллюстративным методикам относятся, например, мутационный анализ на основе аланинового сканирования, анализ на основе пептидного блоттинга и анализ на основе расщепления пептидов. Кроме того, можно применять такие способы, как вырезание эпитопа, выделение эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Другим способом, который можно применять для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым взаимодействует антитело, является водородно-дейтериевый обмен, обнаруживаемый с помощью масс-спектрометрии. В общих чертах метод водородно-дейтериевого обмена включает мечение дейтерием представляющего интерес белка с последующим связыванием антитела с белком, меченным дейтерием. Затем комплекс белок/антитело переносится в воду с обеспечением осуществления водородно-дейтериевого обмена по всем остаткам, за исключением остатков, защищенных антителом (которые остаются меченными дейтерием). После диссоциации антитела целевой белок подвергают расщеплению протеазами и масс-спектрометрическому анализу, за счет чего выявляют остатки, меченные дейтерием, которые соответствуют конкретным аминокислотам, с которыми антитело взаимодействует. См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Рентгеновский кристаллографический анализ антитела в комплексе с его антигеном также можно применять для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым взаимодействует антитело.

[0134] Настоящее изобретение дополнительно включает антитела к LEPR, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое из конкретных иллюстративных антител, описанных в данном документе (например антитела, содержащие любую из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 1 в данном документе). Аналогичным образом, настоящее изобретение также включает антитела к LEPR, которые конкурируют за связывание с LEPR с любым из конкретных иллюстративных антител, описанных в данном документе (например антитела, содержащие любую из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 1 в данном документе).

[0135] Используя стандартные способы, известные в данной области техники и представленные в данном документе в примерах, можно определить, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом, что и эталонное антитело к LEPR, или конкурирует с ним за связывание. Например, чтобы определить, связывается ли тестируемое антитело с тем же самым эпитопом, что и эталонное антитело к LEPR по настоящему изобретению, обеспечивают возможность связывания эталонного антитела с белком LEPR. Затем оценивают способность тестируемого антитела связываться с молекулой LEPR. Если тестируемое антитело способно связываться с LEPR после насыщающего связывания с эталонным антителом к LEPR, то можно сделать вывод, что тестируемое антитело связывается с другим эпитопом, отличным от того эпитопа, с которым связывается эталонное антитело к LEPR. С другой стороны, если тестируемое антитело не способно связываться с молекулой LEPR после насыщающего связывания с эталонным антителом к LEPR, то тестируемое антитело может связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, который связан эталонным антителом к LEPR по настоящему изобретению. В дальнейшем можно провести дополнительные стандартные эксперименты (например, анализы с внесением в пептиды мутаций и анализы связывания) для того, чтобы подтвердить, что наблюдаемое отсутствие связывания тестируемого антитела обусловлено фактом связывания с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, или что причиной отсутствия наблюдаемого связывания является пространственное блокирование (или другое явление). Эксперименты такого типа можно проводить с применением ELISA, RIA, Biacore, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антитела, существующего в данной области техники. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения два антитела связываются с одним и тем же (или перекрывающимся) эпитопом, если, например, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела подавляет связывание другого на по меньшей мере 50%, но предпочтительно 75%, 90% или даже 99%, при измерении с помощью анализа конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). В качестве альтернативы, считается, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если практически все аминокислотные мутации в антигене, которые ослабляют или устраняют связывание одного антитела, ослабляют или устраняют связывание другого антитела. Считается, что два антитела имеют «перекрывающиеся эпитопы», если только часть аминокислотных мутаций, которые ослабляют или устраняют связывание одного антитела, ослабляют или устраняют связывание другого антитела.

[0136] Для определения того, конкурирует ли антитело за связывание (или перекрестно конкурирует за связывание) с эталонным антителом к LEPR, описанную выше методику исследования связывания осуществляют в двух направлениях. В первом направлении обеспечивают возможность связывания эталонного антитела с белком LEPR при насыщающих условиях с последующей оценкой связывания тестируемого антитела с молекулой LEPR. Во втором направлении обеспечивают возможность связывания тестируемого антитела с молекулой LEPR при насыщающих условиях с последующей оценкой связывания эталонного антитела с молекулой LEPR. Если в обоих направлениях только первое (насыщающее) антитело способно к связыванию с молекулой LEPR, то делают заключение, что тестируемое антитело и эталонное антитело конкурируют за связывание с LEPR. Специалисту средней квалификации в данной области техники будет понятно, что антитело, которое конкурирует за связывание с эталонным антителом, необязательно может связываться с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, но может пространственно блокировать связывание эталонного антитела за счет связывания перекрывающегося или смежного эпитопа.

Получение антител человека

[0137] Антитела к LEPR по настоящему изобретению могут представлять собой полностью человеческие антитела. Способы получения моноклональных антител, включая полностью человеческие моноклональные антитела, известны из уровня техники. Любые такие известные способы можно применять в контексте настоящего изобретения для создания антител человека, которые специфически связываются с LEPR человека.

[0138] С помощью, например, технологии VELOCIMMUNE™ или любого другого сходного известного способа получения полностью человеческих моноклональных антител, первоначально выделяют высокоаффинные химерные антитела к LEPR, содержащие вариабельную область человека и константную область мыши. Как показано в приведенном ниже экспериментальном разделе, антитела подвергают анализу характеристик и отбору в отношении требуемых характеристик, включая аффинность, активность блокирования лиганда, селективность, эпитоп и т.д. При необходимости константные области мыши заменяют необходимой константной областью человека, например из IgG1 или IgG4 дикого типа или из модифицированных IgG1 или IgG4, с получением полностью человеческого антитела к LEPR. Хотя отобранная константная область может варьироваться в зависимости от конкретного применения, характеристики, касающиеся высокой аффинности связывания антигена или специфичности к мишени, присущи вариабельной области. В определенных случаях полностью человеческие антитела к LEPR выделяют непосредственно из антиген-положительных В-клеток.

Биологические эквиваленты

[0139] Антитела и фрагменты антител к LEPR по настоящему изобретению охватывают белки, имеющие аминокислотные последовательности, которые отличаются от последовательностей описанных антител, но которые сохраняют способность связывать LEPR человека. Такие вариантные антитела и фрагменты антител содержат одно или более из добавлений, делеций или замен аминокислот при сравнении с исходной последовательностью, однако проявляют биологическую активность, которая практически эквивалентна активности описанных антител. Аналогичным образом, последовательности ДНК, кодирующие антитело к LEPR по настоящему изобретению, охватывают последовательности, которые содержат одно или более из добавлений, делеций или замен нуклеотидов при сравнении с раскрытой последовательностью, но которые кодируют антитело или фрагмент антитела к LEPR, которые практически являются биологическими эквивалентами антитела или фрагмента антитела к LEPR по настоящему изобретению. Примеры таких вариантных аминокислотных и последовательностей ДНК обсуждались выше.

[0140] Два антигенсвязывающих белка или антитела считаются биологическими эквивалентами, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, скорость и/или степень поглощения которых значимо не отличаются при введении при одинаковой молярной дозе в сходных экспериментальных условиях, как в случае однократной дозе, так и в случае нескольких доз. Некоторые антитела будут считаться эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они являются эквивалентными по степени их поглощения, но не по скорости их поглощения, и все же могут считаться биологически эквивалентными, поскольку такие различия в скорости поглощения являются предусмотренными и отражены в информации по лекарственному препарату, не являются необходимыми для достижения в организме эффективных концентраций лекарственного средства, например при длительном применении, и считаются не значимыми с медицинской точки зрения в случае конкретного исследуемого лекарственного продукта.

[0141] В одном варианте осуществления два антигенсвязывающих белка являются биологическими эквивалентами, если отсутствуют клинически значимые различия в отношении их безопасности, чистоты и активности.

[0142] В одном варианте осуществления два антигенсвязывающих белка являются биологическими эквивалентами, если пациента можно перевести один или более раз с эталонного продукта на биологический продукт без ожидаемого увеличения риска возникновения побочных эффектов, в том числе значимого с клинической точки зрения изменения иммуногенности, или уменьшения эффективности по сравнению с таковой при продолжении терапии без такого перевода.

[0143] В одном варианте осуществления два антигенсвязывающих белка являются биологическими эквивалентами, если они оба действуют согласно общему механизму или механизмам действия при условии или условиях применения, в том объеме, в котором такие механизмы известны.

[0144] Биологическую эквивалентность можно продемонстрировать с помощью способов in vivo и in vitro. Измерения степени биологической эквивалентности включают, например, (а) тест in vivo у людей или других млекопитающих, в котором концентрацию антитела или его метаболитов измеряют в крови, плазме крови, сыворотке крови или других биологических жидкостях в виде зависимости от времени; (b) тест in vitro, который коррелировал с данными биологической доступности in vivo у человека и с достаточной точностью предсказывал их; (с) тест in vivo у людей и других млекопитающих, у которых соответствующий ранний фармакологический эффект антитела (или его мишени) измеряют в виде зависимости от времени; и (d) строго контролируемое клиническое испытание, в котором устанавливают безопасность, эффективность, или биологическую доступность, или биологическую эквивалентность антитела.

[0145] Биологически эквивалентные варианты антител к LEPR по настоящему изобретению можно конструировать с помощью, например, создания различных замен остатков или последовательностей или делеции концевых или внутренних остатков или последовательностей, которые не являются необходимыми для биологической активности. Например, остатки цистеина, не являющиеся необходимыми для биологической активности, можно подвергнуть делеции или заменить другими аминокислотами для предупреждения образования нежелательных или несоответствующих внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других ситуациях биологически эквивалентные антитела могут включать варианты антител к LEPR, содержащие аминокислотные изменения, которые модифицируют характеристики гликозилирования антител, например, мутации, которые обеспечивают устранение или удаление гликозилирования.

Видовая селективность и межвидовая перекрестная реактивность

[0146] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, которые связываются с LEPR человека, но не с LEPR других видов. Настоящее изобретение также включает антитела к LEPR, которые связываются с LEPR человека и с LEPR одного или более видов, отличных от человека. Например, антитела к LEPR по настоящему изобретению могут связываться с LEPR человека и могут связываться или не связываться, в зависимости от конкретного случая, с одним или более из LEPR мыши, крысы, морской свинки, хомяка, песчанки, свиньи, кошки, собаки, кролика, козы, овцы, коровы, лошади, верблюда, яванского макака, мартышки, макака-резуса или шимпанзе. В соответствии с определенными иллюстративными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR, которые специфически связывают LEPR человека и LEPR яванского макака (например, Масаса fascicularis). Другие антитела к LEPR по настоящему изобретению связывают LEPR человека, но не связывают или связывают, но слабо, LEPR яванского макака.

Полиспецифические антитела

[0147] Антитела по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими или полиспецифическими (например, биспецифическими). Полиспецифические антитела могут быть специфичными к разным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфичные к более чем одному целевому полипептиду. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Антитела к LEPR по настоящему изобретению могут быть соединены или совместно экспрессированы с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально соединены (например, посредством химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одним или более другими молекулярными объектами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, с получением биспецифического или полиспецифического антитела со второй специфичностью связывания.

[0148] Настоящее изобретение включает биспецифические антитела, в которых одно плечо иммуноглобулина связывает LEPR человека, а другое плечо иммуноглобулина специфично ко второму антигену. LEPR-связывающее плечо может включать любую из аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR или CDR, представленных в таблице 1 в данном документе.

[0149] Иллюстративное антитело в биспецифическом формате, которое можно применять в контексте настоящего изобретения, предусматривает применение C_H3-домена первого иммуноглобулина (Ig) и C_H3-домена второго Ig, где C_H3-домены первого и второго Ig отличаются друг от друга по меньшей мере одной аминокислотой, и где отличие в по меньшей мере одну аминокислоту ослабляет связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом, в котором отсутствует отличие по аминокислотам. В одном варианте осуществления C_H3-домен первого Ig связывает белок А, а C_H3-домен второго Ig содержит мутацию, которая ослабляет или устраняет связывание белка А, такую как модификация H95R (нумерация экзонов согласно IMGT; H435R нумерация согласно EU). Второй C_H3 может дополнительно содержать модификацию Y96F (по IMGT; Y436F по EU). Дополнительные модификации, которые могут присутствовать в пределах второго C_H3, включают: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I по EU) в случае антител на основе IgG1; N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I по EU) в случае антител на основе IgG2; и Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I по EU) в случае антител на основе IgG4. Варианты биспецифического формата антител, описанные выше, рассматриваются в объеме настоящего изобретения.

[0150] Другие иллюстративные биспецифические форматы, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, включают без ограничения, например, биспецифические форматы на основе scFv или диател, продукты слияния IgG-scFv, двойной вариабельный домен (DVD)-Ig, квадрому, структуру «выступы-во-впадины», общую легкую цепь (например, общую легкую цепь со структурой «выступы-во-впадины» и т.п.), CrossMab, CrossFab, (SEED)-антитело, «лейциновую застежку», DuoBody, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG двойного действия и биспецифические форматы на основе Mab² (в отношении обзора вышеизложенных форматов см., например, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, и источники, упоминаемые в данном документе). Биспецифические антитела также могут быть сконструированы с применением конъюгации пептид/нуклеиновая кислота, например, где не встречающиеся в природе аминокислоты с ортогональной химической реакционной способностью применяют для получения сайт-специфических конъюгатов антитело-олигонуклеотид, которые затем самостоятельно собираются в мультимерные комплексы с определенными составом, валентностью и геометрической формой. (См., например, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).

Составление и введение средства терапии

[0151] Настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, содержащие антитела к LEPR или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими средствами, которые обеспечивают улучшенный перенос, доставку, переносимость и т.п. Множество подходящих составов можно найти в справочнике, хорошо известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Истон, штат Пенсильвания. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воска, масла, липиды, содержащие липиды (катионные или анионные) везикулы (такие как LIPOFECTIN™, Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния), конъюгаты ДНК, безводные абсорбционные пасты, эмульсии типа «масло воде» и «вода в масле», эмульсии на основе карбовакса (полиэтиленгликоли с различной молекулярной массой), полужидкие гели и полужидкие смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al. «Compendium of excipients for parenteral formulations» PDA (1998) JPharm Sci Technol 52:238-311.

[0152] Доза антитела, вводимая пациенту, может варьировать в зависимости от возраста и размера пациента, целевого заболевания, патологического состояния, пути введения и т.п. Предпочтительную дозу обычно рассчитывают в соответствии с весом тела или площадью поверхности тела. Для взрослого пациента может быть преимущественным внутривенное введение антитела по настоящему изобретению, в норме при однократной дозе, составляющей от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг веса тела, более предпочтительно от приблизительно 0,02 до приблизительно 7, от приблизительно 0,03 до приблизительно 5 или от приблизительно 0,05 до приблизительно 3 мг/кг веса тела. В зависимости от тяжести состояния можно корректировать частоту введения и длительность лечения. Эффективные дозировки и схемы введения антител к LEPR могут быть определены эмпирически; например, прогресс пациента можно контролировать путем периодической оценки, и дозу можно корректировать соответствующим образом. Более того, межвидовое масштабирование дозировок можно выполнить с применением способов, хорошо известных в данной области техники (например, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 5:1351).

[0153] Для пациента, например, пациента-ребенка, может быть преимущественным вводить, например внутривенно, антитело при терапевтически эффективной дозе приблизительно 5 мг/кг веса тела, или приблизительно от 1 мг/кг веса тела до приблизительно 20 мг/кг веса тела, или от приблизительно 1 мг/кг веса тела до приблизительно 15 мг/кг веса тела, или от приблизительно 5 мг/кг веса тела до приблизительно 10 мг/кг веса тела. Например, может быть выбрана насыщающая доза для внутривенного (IV) введения приблизительно 5 мг/кг для достижения концентраций антитела в сыворотке крови 100 мг/л или выше. Кроме того, может быть преимущественным вводить антитело подкожно при дозе приблизительно 250 мг, или при дозе приблизительно 300 мг, или при дозе от приблизительно 100 мг до приблизительно 500 мг, или от приблизительно 200 мг до приблизительно 300 мг. Например, еженедельная подкожная (SC) поддерживающая доза 250 мг Н4Н17319Р2 или 300 мг Н4Н17319Р2 будет поддерживать минимальные концентрации в сыворотке крови на уровне 100 мг/л или выше. В некоторых аспектах схема SC введения доз начинается через несколько дней после введения IV насыщающей дозы для наилучшего поддержания целевых минимальных концентраций в сыворотке крови. В некоторых аспектах первая SC доза вводится через 2-7 дней после насыщающей дозы, например через 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней после насыщающей дозы. В некоторых аспектах SC дозу вводят один раз каждые 3-14 дней, например, один раз каждые 3 дня, один раз каждые 4 дня, один раз каждые 5 дней, один раз каждые 6 дней, один раз в неделю, один раз каждые 10 дней или один раз каждые 2 недели, например 3 еженедельные SC дозы после первой SC дозы с последующими ежемесячными дозами (приблизительно каждые 28 дней). В одном варианте осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективная доза антитела (например, Н4Н17319Р2) является такой, как представлено на фигуре 19 в данном документе, но необязательно продолжается после последней указанной на ней ежемесячной дозы.

[0154] В некоторых аспектах необходимо поддерживать минимальные концентрации в сыворотке крови от приблизительно 50 мг/л до приблизительно 200 мг/л, или приблизительно 100 мг/л, или приблизительно 150 мг/л, или на уровне 50 мг/л или выше, или на уровне 100 мг/л или выше, или на уровне 150 мг/л или выше.

[0155] Известны различные системы доставки, которые можно применять для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению, например инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения включают без ограничения внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Композицию можно вводить любым удобным способом, например с помощью инфузии или болюсной инъекцией, с помощью абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые покровы (например, слизистую ротовой полости, слизистую прямой кишки и кишечника и т.д.), и ее можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.

[0156] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять подкожно или внутривенно с помощью стандартной иглы и шприца. Кроме того, что касается подкожной доставки, то при доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению свободно можно применять устройство для доставки по типу шприца-ручки. Такое устройство для доставки по типу шприца-ручки может быть многоразовым или одноразовым. В многоразовом устройстве для доставки по типу шприца-ручки обычно применяют сменный картридж, который содержит фармацевтическую композицию. После того, как вся фармацевтическая композиция из картриджа была введена и картридж остался пустым, пустой картридж можно сразу удалить в отходы и заменить новым картриджем, который содержит фармацевтическую композицию. Устройство для доставки по типу шприца-ручки затем можно повторно применять. В случае одноразового устройства для доставки по типу шприца-ручки сменный картридж отсутствует.Вместо этого одноразовое устройство для доставки по типу шприца-ручки предварительно заполнено фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре внутри устройства. После освобождения резервуара от фармацевтической композиции устройство удаляют в отходы целиком.

[0157] При подкожной доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению применяют разнообразные многоразовые устройства для доставки по типу шприца-ручки и автоинъектора. Примеры включают без ограничения AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Вудсток, Великобритания), шприц-ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Бургдорф, Швейцария), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Индианаполис, Индиана), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Франклин-Лэйкс, Нью-Джерси), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Франкфурт, Германия), при этом упомянуты лишь некоторые из них. Примеры одноразовых устройств для доставки в виде шприца-ручки, применяемых для подкожного введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают без ограничения шприц-ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинъектор SURECLICK™ (Amgen, Таузанд-Окс, Калифорния), PENLET™ (Haselmeier, Штутгарт, Германия), EPIPEN (Dey, L.P.) и шприц-ручку HUMIRA™ (Abbott Labs, Эббот-Парк, Иллинойс), при этом упомянуты лишь несколько из них.

[0158] В определенных ситуациях фармацевтическую композицию можно доставлять в виде системы с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления может применяться помпа (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В другом варианте осуществления можно применять полимерные материалы; см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (ред.), 1974, CRC Pres., Бока-Ратон, Флорида. В еще одном варианте осуществления систему с контролируемым высвобождением можно поместить вблизи мишени композиции, при этом требуется лишь часть системной дозы (см., например, Goodson, 1984, в Medical Applications of Controlled Release, выше, том 2, ст. 115-138). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0159] Инъекционные препараты могут включать лекарственные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, для капельных инфузий и т.п. Эти инъекционные препараты можно получить с помощью общеизвестных способов. Например, инъекционные препараты можно получить, например, путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела или его соли, описанных выше, в стерильной водной среде или масляной среде, обычно применяемых для инъекций. В качестве водной среды для инъекций применяют, например, физиологический солевой раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные средства и т.п., которые можно применять в комбинации с подходящим солюбилизирующим средством, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностно-активное вещество [например, полисорбат 80, НСО-50 (полиоксиэтиленовый (50 моль) аддукт гидрогенизированного касторового масла)] и т.п. В качестве масляной среды применяют, например, кунжутное масло, соевое масло и т.п., которые можно применять в комбинации с солюбилизирующим средством, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.п. Полученным таким способом инъекционным составом предпочтительно наполняют подходящую ампулу.

[0160] Преимущественно описанные выше фармацевтические композиции для перорального или парентерального применения получают в виде лекарственных форм со стандартной дозой, подобранной таким образом, чтобы она соответствовала дозе активных ингредиентов. Такие лекарственные формы со стандартной дозой включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекционные составы (ампулы), суппозитории и т.д. Количество содержащегося вышеупомянутого антитела, как правило, составляет от приблизительно 5 до приблизительно 500 мг на лекарственную форму со стандартной дозой; в частности в форме инъекционного состава; для других лекарственных форм предпочтительно, чтобы содержание вышеупомянутого антитела составляло от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг и от приблизительно 10 до приблизительно 250 мг.

Применения антител в терапии

[0161] Настоящее изобретение включает способы, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, содержащей антитело к LEPR (например, антитело к LEPR, содержащее любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, приведенных в таблице 1 в данном документе). Терапевтическая композиция может содержать любое из раскрытых в данном документе антител к LEPR или их антигенсвязывающих фрагментов, а также фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

[0162] Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, являются применимыми, inter alia, для лечения, предупреждения и/или ослабления тяжести любого заболевания или нарушения, ассоциированного с нарушением метаболизма или гиполептинемией или опосредованного ими, например неалкогольной жировой болезни печени, NASH, женского бесплодия, аменореи, аномального гормонального цикла, нарушения иммунной функции, гипотиреоза, ожирения, моногенного ожирения, сахарного диабета типа I, сахарного диабета типа II, липодистрофии, врожденной липодистрофии, генерализованной липодистрофии, приобретенной липодистрофии, очаговой липодистрофии, врожденной очаговой липодистрофии, врожденной генерализованной липодистрофии, приобретенной очаговой липодистрофии и приобретенной генерализованной липодистрофии, или иным образом поддающегося лечению путем стимуляции или активации опосредованной LEPR передачи сигнала или имитации естественной активности лептина in vitro или in vivo. Например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты являются применимыми для лечения липодистрофических состояний. Иллюстративные липодистрофические состояния, которые поддаются лечению с помощью антител и антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, включают, например, врожденную генерализованную липодистрофию, врожденную очаговую липодистрофию, приобретенную генерализованную липодистрофию, семейную очаговую липодистрофию, приобретенную очаговую липодистрофию, центробежную абдоминальную липодистрофию, lipoatrophia annularis, локализованную липодистрофию и липодистрофию, ассоциированную с ВИЧ, а также симптомы, ассоциированные с такими состояниями.

[0163] Антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения, предупреждения и/или ослабления проявления моногенного ожирения и/или липодистрофии. Моногенное ожирение и липодистрофия могут быть ассоциированы со многими патологиями, включая, например: ожирение с чрезвычайно ранним началом у субъектов с ИМТ выше 85-^го процентиля для возраста и пола; гиперфагию и нарушение чувства насыщения у субъектов, у которых проявляется поведение, связанное с поиском пищи, и агрессивное пищевое поведение; нарушение иммунной функции со сниженным количеством CD4+ Т-клеток и рецидивирующими (и, возможно, летальными) инфекциями; инсулинорезистентность и гиперинсулинемию; неалкогольную жировую болезнь печени, стеатоз печени и прогрессирование до липодистрофии; дислипидемию, приводящую к гипертриглицеридемии; сахарный диабет с повышенными уровнями HbAlc и/или глюкозы и нарушенной толерантностью к глюкозе; нарушение репродуктивной функции вплоть до гипогонадизма, задержку полового развития; снижение выраженности вторичных половых признаков, отсутствие или нерегулярность менструаций и бесплодие; отсутствие пубертатного скачка роста, приводящее к низкорослости, аномальную секрецию гормона роста; гипотиреоз или нарушение функции щитовидной железы, изменение уровней Т3, или TSH, или свободного тироксина; и различные изменения костной ткани, включая плотность костной ткани и минерализацию костной ткани. Спектр состояний и симптомов, ассоциированных с моногенным ожирением и/или липодистрофией, может различаться в зависимости от лежащих в их основе генетических причин, например AGPAT2, LMNA, BSCL2 или других. Определенная мутация может привести к потере функции лептина или LEPR, которые имеют проявлениям в отношении эндокринной системы с различными степенями тяжести, например нерегулярные менструации по сравнению с полной аменореей.

[0164] Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, также являются применимыми для лечения, смягчения или предупреждения одного или более симптомов заболевания или состояния, ассоциированных с нарушением метаболизма или гиполептинемией. Такие симптомы включают тучность, ожирение, гиперфагию, гипергликемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, инсулинорезистентность, дислипидемию, задержку роста, задержку пубертатного скачка роста, аномальную секрецию гормона роста, повышенный уровень HbAlc, низкую минеральную плотность костной ткани (или низкую костную массу), низкую минерализацию костной ткани и низкую безжировую массу тела.

[0165] Настоящее изобретение также включает антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, которые являются применимыми для восстановления опосредованной лептином передачи сигнала в клетках, тканях и органах, экспрессирующих одну или более мутаций LEPR. Такие мутации могут быть ассоциированными с нарушением метаболизма или гиполептинемией и заболеваниями или состояниями, относящимися к нарушениям метаболизма или гиполептинемии, например, с ожирением, врожденной липодистрофией, бесплодием и неалкогольной жировой болезнью печени. Например, были идентифицированы определенные мутантные варианты LEPR, у которых наблюдается снижение или отсутствие передачи сигнала в присутствии лептина и ассоциированы с ожирением и связанными с ним нарушениями. Как используется в данном документе, мутантный вариант LEPR, у которого наблюдается отсутствие передачи сигнала в присутствии лептина, называется «мутантным вариантом LEPR, характеризующимся нарушением передачи сигнала». Примером мутации LEPR, приводящей к полному нарушению передачи сигнала, является LEPR-A409E (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). Как используется в данном документе, мутантный вариант LEPR, у которого наблюдается снижение уровня передачи сигнала в присутствии лептина (по сравнению с LEPR дикого типа), называется «мутантным вариантом LEPR, характеризующимся ослаблением передачи сигнала». Примером мутации LEPR, приводящей к ослаблению передачи сигнала, является LEPR-P316T (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464). Таким образом, настоящее изобретение включает антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, которые являются применимыми для лечения, предупреждения и/или ослабления проявления заболеваний и нарушений, обусловленных одним или более мутантными вариантами LEPR, характеризующимися нарушением передачи сигнала (например, А409Е) и/или ослаблением передачи сигнала (например, Р316Т), или ассоциированных с ними.

[0166] Настоящее изобретение также включает антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, которые являются применимыми для восстановления опосредованной лептином передачи сигнала путем смягчения мутаций в гене лептина. У некоторых субъектов циркулирующий лептин имеется, но белок является нефункциональным из-за генетической мутации, например мутации р.N103K в гене лептина, которая обуславливает кодирование биологически неактивной формы лептина. У некоторых субъектов циркулирующего лептина очень мало или он отсутствует. Другие гены могут участвовать в нарушении опосредованной лептином передачи сигнала, включая LMNA, PPARG, AGPAT2, BSCL2, PLIN1, АКТ2, CIDEC, LIPE и ADRA2A, и антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для смягчения эффектов таких мутаций в отношении опосредованной лептином передачи сигнала.

[0167] Антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению также являются применимыми для лечения или предупреждения одного или более состояний, заболеваний или нарушений, выбранных из группы, состоящей из ожирения, моногенного ожирения, метаболического синдрома, алиментарно-индуцированной булимии, функциональной гипоталамической аменореи, сахарного диабета типа 1, сахарного диабета типа 2, женского бесплодия, аменореи, нарушения иммунной функции, гипотиреоза, инсулинорезистентности, тяжелой инсулинорезистентности, включая тяжелую инсулинорезистентность из-за мутации в рецепторе инсулина, тяжелую инсулинорезистентность, не вызванную мутацией в рецепторе инсулина, тяжелую инсулинорезистентность, вызванную мутацией в нисходящих сигнальных путях или вызванную другими причинами, неалкогольной и алкогольной жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита (NASH), болезни Альцгеймера, недостаточности лептина, резистентности к лептину, видов липодистрофии, лепречаунизма/синдрома Донохью, синдрома Рабсона-Менденхолла.

[0168] Предусмотренные в данном документе агонистические антитела к LEPR являются применимыми для лечения нарушения метаболизма. Способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0169] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения тучности или ожирения или для снижения веса тела. В некоторых вариантах осуществления лечение обеспечивает снижение жировой массы, но не безжировой массы у субъекта, получающего лечение. В некоторых аспектах лечение заставляет человека потреблять меньше калорий или снижать потребление пищи.

[0170] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения женского бесплодия или восстановления нормального гормонального цикла, ассоциированного с недостаточностью лептина. В некоторых аспектах лечение может обеспечить повышение фертильности и/или повышение вероятности зачатия. В некоторых аспектах лечение может обеспечить восстановление нормального менструального цикла. Способы восстановления нормального менструального цикла, который был нарушен, по меньшей мере частично, из-за недостаточности лептина, также являются частью настоящего изобретения.

[0171] Как показано в данном документе, способ является применимым, если субъект, нуждающийся в этом, представляет собой субъекта, у которого имеется гиполептинемия или недостаточностью лептина, или у которого не имеется гиполептинемии или недостаточности лептина. Этот способ применим, если нарушение метаболизма, тучность или ожирение ассоциированы или не ассоциированы с мутацией LEPR, приводящей к нарушению передачи сигнала или ослаблению передачи сигнала, или обусловлены или не обусловлены ею.

[0172] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения неалкогольной жировой болезни печени или неалкогольного стеатогепатита (NASH) у пациентов с гиполептинемией, липодистрофией или недостаточностью лептина. Лечение может обеспечить уменьшение интенсивности симптомов неалкогольной жировой болезни печени, такой как стеатоз печени, у субъекта. В некоторых случаях уровни аланинтрансаминазы (ALT) и/или аспартаттрансаминазы (AST) в плазме крови у субъекта после получения лечения уменьшаются.

[0173] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения гиперфагии, гипергликемии, инсулинорезистентности, дислипидемии, неалкогольного стеатогепатита (NASH) или неалкогольной жировой болезни печени путем стимуляции опосредованной STAT3 передачи сигнала в гипоталамусе. Лечение может обеспечить снижение уровня циркулирующих триглицеридов в плазме крови и/или циркулирующего общего холестерина в плазме крови.

[0174] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения липодистрофии. Лечение обеспечивает облегчение гипергликемии, уменьшение выраженности инсулинорезистентности и/или понижение уровней HbAlc у субъекта, получающего лечение.

[0175] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения бесплодия и/или аменореи, ассоциированных с метаболическим заболеванием или гиполептинемией. Лечение обеспечивает регулирование гормональных циклов и может обеспечивать улучшение оплодотворяемости у женщин, получающих лечение. Лечение может обеспечить восстановление нормального менструального цикла.

[0176] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения нарушения иммунной функции, такой как снижение количества CD4+ Т-клеток, ассоциированное с гиполептинемией и/или недостаточностью лептина. Лечение может обеспечить улучшение иммунной функции, например может увеличение количества CD4+ Т-клеток.

[0177] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения задержки роста, отсутствия пубертатного скачка роста и/или аномальной секреции гормона роста, ассоциированных с врожденной недостаточностью лептина. Лечение может обеспечить улучшение роста, может способствовать пубертатному скачку роста и/или может обеспечить улучшение секреции гормона роста.

[0178] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения гипотиреоза, ассоциированного с врожденной недостаточностью лептина. Лечение может обеспечить улучшение в отношении симптомов, ассоциированных с гипотиреозом.

[0179] Агонистические антитела к LEPR, предусмотренные в данном документе, являются применимыми для лечения низкой минеральной плотности костной ткани и/или минерализации костной ткани, ассоциированных с гиполептинемией и/или недостаточностью лептина. Лечение может обеспечить улучшение в отношении минеральной плотности костной ткани и/или может обеспечить улучшение в отношении минерализации костной ткани.

[0180] В контексте способов лечения, описанных в данном документе, антитело к LEPR можно вводить в виде монотерапии (т.е. в качестве единственного терапевтического средства) или в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими средствами (примеры которых описаны в других местах в данном документе).

Комбинированные средства терапии и составы

[0181] Настоящее изобретение включает композиции и терапевтические составы, содержащие любое из описанных в данном документе антител к LEPR в комбинации с одним или более дополнительными терапевтически активными компонентами, и способы лечения, включающие введение таких комбинаций субъектам, нуждающимся в этом.

[0182] Антитела к LEPR по настоящему изобретению могут быть составлены вместе и/или введены в комбинации с одним или более дополнительными терапевтически активными компонентами, такими как, например, фармацевтические препараты, назначаемые для лечения ожирения, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, сахарного диабета типа 2, сахарного диабета типа 1, контроля аппетита, аменореи, бесплодия и т.д. Примеры таких дополнительных терапевтически активных компонентов включают, например, рекомбинантный лептин человека (например, метрелептин [MYALEPT]), ингибиторы PCSK9 (например, антитела к PCSK9 [алирокумаб, эволокумаб, бокоцизумаб, лодельцизумаб, ралпанцизумаб и т.д.]), статины (аторвастатин, розувастатин, церивастатин, питавастатин, флувастатин, симвастатин, ловастатин, правастатин и т.д.), эзетимиб, инсулин, варианты инсулина, средства, усиливающие секрецию инсулина, метформин, сульфонилмочевины, ингибиторы натрий-глюкозного котранспортера 2 (SGLT2) (например, дапаглифлозин, канаглифлозин, эмпаглифлозин и т.д.), агонисты/аналоги GLP-1 (например, экстендин-4, эксенатид, лираглутид, ликсисенатид, альбиглутид, дулаглутид и т.д.), ингибиторы глюкагона (GCG) (например, антитела к GCG), ингибиторы рецептора глюкагона (GCGR) (например, антитела к GCGR, низкомолекулярные антагонисты GCGR, GCGR-специфические антисмысловые олигонуклеотиды, аптамеры к GCGR [например, шпигельмеры] и т.д.), ингибиторы ангиопоэтин-подобного белка (ANGPTL) (например, антитела к ANGPTL3, антитела к ANGPTL4, антитела к ANGPTL8 и т.д.), фентермин, орлистат, топирамат, бупропион, топирамат/фентермин, бупропион/налтрексон, бупропион/зонисамид, прамлинтид/метрелептин, лоркасерин, цетилистат, тезофензин, велнеперит и т.д. Дополнительные примеры включают, например, рыбий жир, пиоглитазон, сетмеланотид, фибраты (например, фенофибрат), преднизон, ниацин, противосудорожные средства, дигоксин, кумадин, витамин D, тироксин, добавку для щитовидной железы, витаминную добавку, добавку, содержащую кальций, карнитин, кофермент Q10, лекарственный препарат против запора, противоаллергические лекарственные препараты, габапентин, наркотическое средство, кетамин, лидокаин и венлафаксина гидрохлорид. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к LEPR по настоящему изобретению не входят в состав анорексигенного средства или не вводятся с ним.

[0183] Дополнительный терапевтически активный компонент(ы), например, любое из перечисленных выше средств или их производных, можно вводить непосредственно перед антителом к LEPR по настоящему изобретению, одновременно с ним или вскоре после его введения (для целей настоящего изобретения такие схемы введения рассматриваются как введение антитела к LEPR «в комбинации с» дополнительным терапевтически активным компонентом). Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, в которых антитело к LEPR по настоящему изобретению составлено вместе с одним или более дополнительными терапевтически активными компонентами, как описано в других местах в данном документе.

[0184] Настоящее изобретение также включает способы применения композиций и терапевтических составов, содержащих любое из описанных в данном документе антител к LEPR, в комбинации с терапевтическими процедурами, такими как плазмаферез.

Схемы введения

[0185] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения несколько доз антитела к LEPR (или фармацевтической композиции, содержащей комбинацию антитела к LEPR и любого из дополнительных терапевтически активных средств, упомянутых в данном документе) можно вводить субъекту в течение определенного периода времени. Способы согласно этому аспекту настоящего изобретения включают последовательное введение субъекту нескольких доз антитела к LEPR по настоящему изобретению. Используемое в данном документе выражение «последовательное введение» означает, что каждую дозу антитела к LEPR вводят субъекту в отдельный момент времени, например, в разные дни, разделенные заранее определенным интервалом (например, часы, дни, недели или месяцы). Настоящее изобретение включает способы, которые предусматривают последовательное введение пациенту одной начальной дозы антитела к LEPR, затем одной или более вторичных доз антитела к LEPR, а затем необязательно одной или более третичных доз антитела к LEPR.

[0186] Термины «начальная доза», «вторичные дозы» и «третичные дозы» относятся к временной последовательности введения антитела к LEPR по настоящему изобретению. Таким образом, «начальная доза» представляет собой дозу, которую вводят в начале схемы лечения (также называемая «исходной дозой», «насыщающей дозой», «стартовой дозой» и т.п.); «вторичные дозы» представляют собой дозы, которые вводят после начальной дозы; и «третичные дозы» представляют собой дозы, которые вводят после вторичных доз. Все из начальной, вторичной и третичной доз могут содержать одинаковое количество антитела к LEPR, но, как правило, могут отличаться друг от друга частотой введения. Однако в определенных вариантах осуществления количество антитела к LEPR, содержащегося в начальной, вторичной и/или третичной дозах, отличается друг от друга (например, при необходимости корректируется в сторону повышения или понижения) на протяжении курса лечения. В некоторых вариантах осуществления две или более (например, 2, 3, 4 или 5) доз вводят в начале схемы лечения в виде «насыщающих доз» с последующим введением последующих доз, которые вводят с меньшей частотой (например, «поддерживающие дозы»).

Диагностическое и аналитическое применение антител

[0187] Антитело к LEPR по настоящему изобретению также можно применять для обнаружения и/или измерения содержания LEPR или LEPR-экспрессирующих клеток в образце, например, для диагностических целей. Например, антитело к LEPR или его фрагмент можно применять для диагностики состояния или заболевания, характеризующихся аберрантной экспрессией (например, сверхэкспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т.д.) LEPR. Иллюстративные диагностические анализы на LEPR могут предусматривать, например, приведение образца, полученного от пациента, в контакт с антителом к LEPR по настоящему изобретению, где антитело к LEPR мечено поддающейся обнаружению меткой или репортерной молекулой. В качестве альтернативы, немеченое антитело к LEPR можно применять в диагностических путях применения в комбинации со вторичным антителом, которое само является меченным с обеспечением обнаружения. Поддающаяся обнаружению метка или репортерная молекула может представлять собой радиоактивный изотоп, такой как ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S или ¹²⁵I; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеинизотиоцианат или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Конкретные иллюстративные анализы, которые можно применять для обнаружения или измерения содержания LEPR в образце, включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA), сортировку клеток с активацией флуоресценцией (FACS) и сканирование с помощью позитронно-эмиссионной томографии (PET).

[0188] Образцы, которые можно применять в диагностических анализах, связанных с LEPR, в соответствии с настоящим изобретением, включают образец любой ткани или жидкости, полученный от пациента, который содержит поддающиеся обнаружению количества белка LEPR либо его фрагментов в нормальном или патологическом состояниях. Обычно для первоначального определения исходного или стандартного уровня LEPR будут измерять уровни LEPR в конкретном образце, полученном от здорового пациента (например, пациента, не пораженного заболеванием или состоянием, ассоциированными с аномальными уровнями или активностью LEPR). Этот исходный уровень LEPR затем можно сравнивать с уровнями LEPR, измеренными в образцах, полученных от индивидуумов с подозрением на наличие заболевания или состояния, связанных с LEPR.

ПРИМЕРЫ

[0189] Следующие примеры представлены с тем, чтобы обеспечить специалистов средней квалификации в данной области техники полным раскрытием и описанием того, как осуществлять и применять способы и получать и применять композиции по настоящему изобретению, и они не предполагают ограничение объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Были приложены усилия для обеспечения точности по отношению к используемым числам (например, количеству, температуре и т.п.), однако необходимо учитывать некоторые экспериментальные погрешности и отклонения. Если не указано иное, то части являются частями по массе, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура представлена в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.

Пример 1. Получение антигенсвязывающих белков, которые специфически связывают рецептор лептина (LEPR)

[0190] Антитела к LEPR получали путем иммунизации мыши VELOCIMMUNE® (т.е. сконструированной мыши, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека) иммуногеном, содержащим внеклеточный домен LEPR. Мониторинг гуморального иммунного ответа осуществляли с помощью LEPR-специфического иммуноанализа. С применением ранее описанных методик выделяли и очищали полностью человеческие антитела к LEPR.

[0191] Определенные биологические свойства иллюстративных антител к LEPR, полученных в соответствии со способами из данного примера, подробно описаны в примерах, представленных ниже.

Пример 2. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепи

[0192] В таблице 1 представлены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей и CDR тяжелой и легкой цепи выбранных антител к LEPR по настоящему изобретению. Соответствующие идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот представлены в таблице 2.

[0193] В данном документе антитела обычно называются в соответствии со следующей номенклатурой: после префикса, обозначающего Fc (например, «Н4Н», «Н1М», «Н2М» и т.д.), следует числовой идентификатор (например, «16650», «16679» и т.д.), а затем следует суффикс «Р» или «N». Таким образом, в соответствии с данной номенклатурой в данном документе антитело может называться, например, «Н4Н16650Р2», «Н4Н16679Р2» и т.д. Префиксы, обозначающие Fc, в названиях антител, используемых в данном документе (Н4Н, H1M и Н2М), указывают на конкретный изотип Fc-области антитела. Например, антитело «Н4Н» содержит Fc IgG4 человека, тогда как антитело «Н1М» содержит Fc IgG1 мыши (все вариабельные области являются полностью человеческими, на что указывает первая буква «Н» в обозначении антитела). Специалисту средней квалификации в данной области техники будет понятно, что антитело с Fc конкретного изотипа можно превращать в антитело с Fc другого изотипа (например, антитело с Fc из IgG1 мыши можно превращать в антитело с Fc из IgG4 человека и т.д.), но в любом случае вариабельные домены (в том числе CDR), которые обозначены числовыми идентификаторами, показанными в таблицах 1 и 2, останутся такими же, и при этом ожидается, что свойства связывания будут идентичными или по сути сходными независимо от природы Fc-домена.

[0194] Термин «MAb сравнения», используемый в примерах в данном документе, относится к Fab9F8, описанному в Fazeli et al. (2006) J Immunol Methods 312:190-200 и Carpenter et al. (2012) Structure 20(3):487-97.

[0195] См. публикацию международной заявки на патент № WO 2017/66204.

Пример 3. Полученные с помощью поверхностного плазмонного резонанса значения аффинности связывания и кинетические константы моноклональных антител к LEPR человека

[0196] Равновесные константы диссоциации (значения K_D) для LEPR, связывающегося с очищенными моноклональными антителами к LEPR, определяли с применением биосенсора для поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени с применением прибора Biacore 4000. Все исследования связывания проводили в подвижном буфере, состоящем из 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20, рН 7,4 (HBS-ET), при 25°С и 37°С. Поверхность сенсора Biacore сначала дериватизировали путем иммобилизации по аминогруппе моноклонального мышиного антитела к Fc человека (GE, № BR-1008-39) для захвата моноклональных антител к LEPR. Исследования связывания проводили на следующих LEPR-реагентах: внеклеточный домен LEPR человека, экспрессируемый с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), внеклеточный домен LEPR Масаса fascicularis, экспрессируемый с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (mfLEPR.mmh; SEQ ID NO: 117), внеклеточный домен LEPR человека, экспрессируемый с С-концевой Fc-меткой мышиного IgG2a (hLEPR.mFc; SEQ ID NO: 115), внеклеточный домен LEPR мыши, экспрессируемый с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (mLEPR.mmh; SEQ ID NO: 118), и внеклеточный домен LEPR крысы, экспрессируемый с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (rLEPR.mmh; SEQ ID NO: 119). Различные концентрации LEPR-реагентов сначала получили в подвижном буфере HBS-ET (100 нМ-3,7 нМ; 3-кратное серийное разведение) и наносили на поверхность с моноклональным антителом к LEPR, захваченным антителом к Fc человека, на 4 минуты при скорости потока 30 мкл/минута, в то время как мониторинг диссоциации LEPR-реагента, связанного с моноклональным антителом, осуществляли в течение 10 минут в подвижном буфере HBS-ET. Кинетические константы скорости ассоциации (k_a) и диссоциации (k_d) определяли путем аппроксимации сенсограмм связывания в режиме реального времени по модели связывания 1:1 с ограничением массопереноса с применением программного обеспечения для аппроксимации кривой Scrubber 2.0 с. Равновесные константы диссоциации связывания (K_D) и полупериоды диссоциации (t½) рассчитывали исходя из кинетических констант скорости:

[0197] Параметры кинетики связывания для связывания hLEPR.mmh, mfLEPR.MMH или hLEPR.mFc с различными моноклональными антителами к LEPR по настоящему изобретению при 25°С и 37°С показаны в таблицах 3-8.

[0198] При 25°С моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-MMH со значениями K_D в диапазоне от 7,93 нМ до 148 нМ, как показано в таблице 5. При 37°С моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-MMH со значениями K_D в диапазоне от 14,8 нМ до 326 нМ, как показано в таблице 4.

[0199] Десять из 12 моноклональных антител к LEPR по настоящему изобретению связывались с mfLEPR.MMH. При 25°С моноклональные антитела к LEPR связывались с mfLEPR.MMH со значениями K_D в диапазоне от 2,27 нМ до 139 нМ, как показано в таблице 7. При 37°С моноклональные антитела к LEPR связывались с mfLEPR.MMH со значениями K_D в диапазоне от 5,18 нМ до 264 нМ, как показано в таблице 8.

[0200] При 25°С моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-mFc со значениями K_D в диапазоне от 613 пМ до 5,7 нМ, как показано в таблице 7. При 37°С моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-mFc со значениями K_D в диапазоне от 1,16 нМ до 12,8 нМ, как показано в таблице 8.

[0201] Ни одно из моноклональных антител к LEPR по настоящему изобретению не связывалось с mLEPR.MMH или rLEPR.MMH при 25°С или при 37°С (данные не показаны).

Пример 4. Антитела к LEPR по настоящему изобретению связывают LEPR в присутствии связывания лептин:LEPR

[0202] Блокирование связывания антител к LEPR с LEPR с помощью лептина человека оценивали с применением биосенсора для поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени на приборе Biacore Т200. Все исследование проводили в 10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20 (подвижный буфер HBS-ET) при 25°С.Поверхность сенсора Biacore СМ5 сначала дериватизировали путем иммобилизации по аминогруппе лептина человека (R&D Systems, №398-LP) с применением стандартных методов химической модификации поверхности с помощью EDC/NHS. Комплекс LEPR человека и лептина человека образовывали путем нанесения 20 нМ внеклеточного домена LEPR человека, экспрессируемого с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (hLEPR-MMH; SEQ ID NO: хх), на поверхность сенсора Biacore с иммобилизованным лептином человека при скорости потока 10 мкл/мин. или 25 мкл/мин. в течение 4 минут для достижения ответа на связывание, составляющего примерно 200 RU. Чтобы оценить, блокируется ли связывание антитела с hLEPR-MMH с помощью лептина человека, 200 нМ моноклональных антител к LEPR наносили на предварительно сформированный комплекс hLEPR-ММН:лептин человека при скорости потока 50 мкл/мин. или 25 мкл/мин. в течение 4-5 минут. Все антитела к LEPR по настоящему изобретению связывались с комплексом hLEPR-MMH и лептина человека («лептин:LEPR») с обеспечением почти одинаковой силы сигнала, и наблюдаемые значения связывания, выраженные в RU, представлены в таблице 9. Этот результат указывает на то, что лептин человека не блокирует связывание hLEPR-MMH с тестируемыми антителами к LEPR.

Пример 5. ELISA-анализ блокирования рецептора лептина человека

[0203] Для осуществления ELISA лептин человека (hLeptin; R&D Systems, №398-LP-01М) наносили в концентрации 5 мкг/мл в PBS на 96-луночный микротитровальный планшет на ночь при 4°С. Сайты неспецифического связывания впоследствии блокировали с применением 0,5% (вес/об.) раствора BSA в PBS. Постоянное количество части белка LEPR, представляющей собой внеклеточный домен, которая экспрессировалась с С-концевой меткой, представляющей собой Fc человека (hLEPR.hFc; SEQ ID NO: 116), составляющее 10 нМ, титровали антителами к LEPR, белком hLeptin, или антителом изотипического контроля в серийном разведении в диапазоне от 8,5 пМ до 500 нМ. Эти комплексы антитело-белок или белок-белок затем инкубировали в течение 1,5 часа при комнатной температуре (к.т.). Затем комплексы переносили на микротитровальные планшеты, покрытые hLeptin, и инкубировали в течение 2 часов при к.т., лунки промывали и связанный с планшетом hLEPR.hFc обнаруживали с помощью поликлонального антитела к IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Inc, №109-035-098). Образцы обрабатывали с помощью раствора ТМВ (BD Biosciences, №555214; субстраты А и В, смешанные в соотношении 1:1 согласно инструкциям производителя) для получения колориметрической реакции, а затем нейтрализовали с помощью 1 М серной кислотой перед измерением оптической плотности при 450 нм на планшет-ридере Victor Х5.

[0204] Анализ данных выполняли с применением сигмоидальной модели зависимости доза-ответ в программном обеспечении Prism™ (GraphPad). Процент блокирования при максимальной концентрации тестируемого антитела рассчитывали в качестве показателя способности антител блокировать связывание 10 нМ hLEPR.hFc с лептином человека на планшете. В расчетах сигнал связывания 10 нМ hLEPR.hFc без присутствия антитела обозначали в виде 100% связывания или 0% блокирования; и исходный сигнал буфера отдельно без присутствия hLEPR.hFc обозначали в виде 0% связывания или 100% блокирования. Данные о блокировании при концентрации антитела 500 нМ обобщены в таблице 10.

[0205] Как показано в таблице 10, ни одно из антител к LEPR по настоящему изобретению не продемонстрировало >28% блокирования связывания hLEPR.hFc с поверхностью, покрытой hLeptin. Однако антитело сравнения и hLeptin в качестве положительного контроля были способны блокировать 99% связывания hLEPR.hFc с поверхностью, покрытой hLeptin. Антитело изотипического контроля не продемонстрировало поддающегося измерению уровня блокирования при концентрациях до 500 нМ.

Пример 6. Связывание клеток по данным FACS-анализа с заякоренными клетками HEK293/Mycx2-hLepR(экто)-GPI

[0206] Рецептор лептина, LEPR, представляет собой однопроходный трансмембранный рецептор семейства цитокиновых рецепторов класса I (Tartaglia et al. (1997) JBiol Chem 7:272(10):6093-6). LEPR может связываться с лептином, белком, экспрессируемым преимущественно жировой тканью, который участвует в регуляции потребления пищи и метаболизма (Friedman et al. (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8).

[0207] Для оценки связывания клеток антителами к LEPR получали стабильные линии клеток HEK293. Одна линия клеток, известная в дальнейшем как HEK293/hLEPR-GPI, стабильно экспрессировала внеклеточный домен LEPR человека (аминокислоты 22-839 под № доступа Р48357 (SEQ ID NO: 113), изоформа В) с N-концевой myc-myc-меткой и С-концевой пептидной последовательностью из карбоксипептидазы М человека, которая направляет добавление GPI (гликозилфосфатидилинозитола) (Deddish et al. (1990) J. Biological Chemistry 265:25:15083-89), так что белок можно заякорить с помощью GPI в мембране. Другую линию клеток HEK293 получили для обеспечения стабильной экспрессии полноразмерного LEPR человека (аминокислоты 1-1165 под № доступа Р48357 (SEQ ID NO: 113), изоформа В) вместе с люциферазным репортером (StatS-люцифераза, Stat3-luc, SA Bioscience, № CLS-6028L), и далее в данном документе она известна как HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL. Клетки HEK293 только с StatS-люциферазным репортером (HEK293/Stat3-luc) также получили в качестве контрольной линии клеток.

[0208] Для FACS-анализа родительские клетки HEK293 и клетки HEK293/hLEPR-GPI разделяли и высевали на 96-луночные планшеты с v-образным дном при 5×10⁵ клеток/лунку в PBS, содержащем 2% FBS (буфер для FACS). Чтобы проверить, влияет ли присутствие лептина на способность антител к hLEPR связываться с клетками, буфер для FACS с 1 мкМ лептина человека или без него (R&D Systems, №398-LP) инкубировали с клетками в течение 30 минут при 4°С с последующим добавлением антител к LEPR или контрольных антител в концентрации 10 нМ в буфере для FACS. Затем клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°С с последующей промывкой и затем инкубацией с 16 мкг/мл вторичного антитела, конъюгированного с Alexa Fluor®-647(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., №109-547-003), в течение 30 минут при 4°С. Затем клетки фиксировали с помощью BD CytoFix™ (Becton Dickinson, №554655), фильтровали и анализировали на проточном питометре HyperCyt (Beckman Coulter). Контроли, представляющие собой отдельно неокрашенные и вторичные антитела, также тестировали для всех линий клеток. Результаты анализировали с применением программного обеспечения ForeCyt (IntelliCyt) и FlowJo версии 10 для определения геометрических средних значений флуоресценции для жизнеспособных клеток. Среднее геометрическое значение флуоресценции для каждого образца затем нормализовали к среднему геометрическому неокрашенных клеток с получением значений относительного связывания для каждого условия, называемых «коэффициентами связывания», и эти коэффициенты связывания регистрировали для каждого тестируемого антитела.

[0209] Как показано в таблице 11,9 антител к LEPR по настоящему изобретению, протестированных в концентрации 10 нМ, продемонстрировали связывание с клетками HEK293/hLEPR-GPI с коэффициентами связывания в диапазоне от 824 до 3374 без лептина. Антитела к LEPR также связывались в присутствии 1 мкМ лептина с коэффициентами связывания, составляющими от 398 до 4184 раз. Как показано в таблице 11, антитело сравнения, протестированное в концентрации 10 нМ, продемонстрировало связывание с клетками HEK293/hLEPR-GPI с коэффициентом связывания, составляющим 2349 раз, без лептина, но показало значимо меньший уровень связывания с клетками в присутствии 1 мкМ лептина с коэффициентом связывания 112. Антитела к LEPR не продемонстрировали какого-либо значимого уровня связывания с родительскими клетками HEK293, при этом коэффициенты связывания при наличии 1 мкМ лептина и без него, находились в диапазоне от 1 до 9 раз. Образцы антител изотипического контроля и вторичных антител отдельно также не продемонстрировали значимого уровня связывания ни с одной из линий клеток с лептином или без него, при этом коэффициенты связывания находились в диапазоне от 1 до 6 раз.

[0210] Как показано в таблице 12, четыре антитела по настоящему изобретению, протестированные в концентрации 70 нМ без лептина, продемонстрировали связывание с клетками HEK293/hLEPR-GPI с коэффициентами связывания, находящимися в диапазоне от 707 до 1131 раз, и с клетками HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL - с коэффициентами связывания, находящимися в диапазоне от 42 до 51. Антитела к LEPR не продемонстрировали какого-либо значимого уровня связывания с клетками HEK293/Stat3-luc, при этом коэффициенты связывания находились в диапазоне от 1 до 8 раз. Образцы антител изотипического контроля и вторичных антител отдельно также не продемонстрировали значимого уровня связывания с какой-либо из протестированных линий клеток, при этом коэффициенты связывания находились в диапазоне от 1 до 2 раз.

Пример 7. Антитела к LEPR по настоящему изобретению активируют опосредованную LEPR передачу сигнала в присутствии и в отсутствие лептина

[0211] Был разработан биологический анализ для обнаружения транскрипционной активации STAT3 при активации LEPR с применением линии репортерных клеток, которая стабильно экспрессирует полноразмерный LEPR человека (hLEPR; аминокислоты с 1 по 1165 под номером доступа NP 002294.2) вместе с люциферазным репортером (STAT3-Luc; Qiagen, № CLS-6028L) в линии клеток IMR-32, линии клеток нейробластомы человека. Полученную стабильную линию клеток, называемую IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, выделили и поддерживали в среде MEM с солями Эрла с добавлением 10% FBS, NEAA, 1 мкг/мл пуромицина, 100 мкг/мл гигромицина В и пенициллина/стрептомицина/L-глутамина (полная среда).

[0212] Полученный в результате биологический анализ использовали для измерения эффекта антител к LEPR по настоящему изобретению в отношении опосредованной LEPR передачи сигнала в присутствии или в отсутствие лептина. Для биологического анализа клетки IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR высевали с плотностью 20000 клеток/100 мкл/лунку для 96-луночного формата в полной среде и на следующий день заменяли соответствующим объемом среды Opti-MEM с добавлением 1% BSA и 0,1% FBS (буфер для анализа) в течение 30 минут. Чтобы измерить эффект антител по настоящему изобретению в отсутствие лептина, осуществляли полулогарифмические серийные разведения антител к LEPR или антитела изотипического контроля и лептина человека (hLeptin; R&D Systems, №398-LP) до конечных концентраций в диапазоне от 100 нМ до 300 фМ в буфере для анализа, полученные разведения добавляли к клеткам и затем инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% CO2.

[0213] Чтобы измерить эффект антител по настоящему изобретению в присутствии лептина, к клеткам добавляли фиксированную концентрацию лептина человека, составляющую 200 пМ в буфере для анализа, с немедленным последующим добавлением антител к LEPR или антител изотипического контроля, которые были подвергнуты полулогарифмическому серийному разведению до конечных концентраций в диапазоне от 100 нМ до 300 фМ. Затем образцы инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% CO2. Затем к образцам добавляли реагент OneGlo (Promega, № Е6051) и измеряли активность люциферазы на многоканальном планшет-ридере Envision (Perkin Elmer) в люминесцентном режиме. Получали значения относительных световых единиц (RLU) и результаты анализировали с применением нелинейной регрессии с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad). Максимальное значение RLU, полученное в ответ на дозу hLeptin, было принято за 100% активации в анализе на IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR.

[0214] Как показано в таблице 13, в исследовании 1 в отсутствие hLeptin все протестированные антитела к LEPR продемонстрировали слабую стимуляцию клеток IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR со значениями EC₅₀ в диапазоне от 134 пМ до 11,9 нМ и максимальной активацией в диапазоне от 5% до 13% соответственно от максимальной активации, полученной в результате ответа на дозу hLeptin. В исследовании 2 в отсутствие hLeptin 4 протестированных антитела к LEPR продемонстрировали стимуляцию клеток IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR со значениями EC₅₀ в диапазоне от 61,9 пМ до 206,9 пМ и максимальной активацией в диапазоне от 65% до 68% соответственно от максимальной активации, полученной в результате ответа на дозу hLeptin. В исследовании 1 в присутствии 200 пМ hLeptin все протестированные антитела к LEPR продемонстрировали стимуляцию клеток IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR со значениями EC₅₀ в диапазоне от 20,2 пМ до 523 пМ и максимальной активацией в диапазоне от 66% до 107% соответственно от максимальной активации, полученной в результате ответа на дозу hLeptin. Поскольку эти антитела усиливали индуцируемую лептином опосредованную LEPR передачу сигнала, эти антитела были классифицированы как «усилители», как определено в данном документе. В исследовании 2 в присутствии 200 пМ hLeptin 4 протестированных антитела к LEPR продемонстрировали стимуляцию клеток IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR со значениями EC₅₀ в диапазоне от 51,9 пМ до 257,3 пМ с максимальной активацией в диапазоне от 76% до 88% от максимальной активации, полученной в результате ответа на дозу hLeptin. Опосредованная LEPR передача сигнала не была заметно усилена этими антителами в присутствии лептина. Антитело изотипического контроля не продемонстрировало какого-либо поддающегося измерению уровня стимуляции клеток IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR ни в одном из анализов.

Пример 8. Антитела к LEPR по настоящему изобретению активируют передачу сигнала в клетках, экспрессирующих мутантные варианты LEPR, характеризующийся нарушением передачи сигнала или ослаблением передачи сигнала

[0215] Были идентифицированы мутантные варианты LEPR, у которых наблюдается нарушенная или ослабленная опосредованная лептином передача сигнала, и которые ассоциированы с ожирением с ранним началом. Например, LEPR-A409E представляет собой мутантный вариант белка LEPR, характеризующийся нарушением передачи сигнала, который не передает опосредованные лептином сигналы к STAT3; мутантный вариант с А409Е был первоначально идентифицирован в качестве моногенной причины ожирения с ранним началом. (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). LEPR-P316T представляет собой мутантный вариант белка LEPR, характеризующийся ослаблением передачи сигнала, который, как было показано, также ассоциирован с ожирением с ранним началом. (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464).

[0216] В этом примере оценивали способность антител к LEPR по настоящему изобретению стимулировать опосредованную LEPR передачу сигнала в линиях клеток, экспрессирующих мутантные варианты LEPR, характеризующиеся нарушением передачи сигнала или ослаблением передачи сигнала. В частности, были сконструированы линии репортерных клеток (HEK293), экспрессирующих LEPR дикого типа, LEPR-A409E (с нарушением передачи сигнала) или LEPR-P316T (с ослаблением передачи сигнала). Клетки обрабатывали либо только средой-носителем, либо рекомбинантным лептином человека, либо контрольным IgG, либо агонистическими антителами к LEPR по настоящему изобретению (Н4Н16650 или Н4Н16679), и определяли степень опосредованной LEPR передачи сигнала (измеряемое с помощью вестерн-блоттинга обнаружение экспрессии pSTAT3-Y705 относительно экспрессии STAT3).

[0217] В этих экспериментах было показано, что агонистические антитела к LEPR по настоящему изобретению (Н4Н16650 и Н4Н16679) стимулируют опосредованную LEPR передачу сигнала в клетках, экспрессирующих мутантный вариант LEPR-А409Е или мутантный вариант LEPR-P316T (измеренную по экспрессии STAT3), дозозависимым образом (фигура 2, панели В и С). Напротив, обработка лептином индуцировала лишь умеренный уровень передачи сигнала в клетках, экспрессирующих мутантный вариант LEPR-P316T, и наблюдалось отсутствие передачи сигнала в клетках, экспрессирующих мутантный вариант LEPR-A409E (фигура 2, панель А). Более того, не было обнаружено опосредованной LEPR передачи сигнала ни в одной из линий клеток, обработанных средой-носителем или контрольным антителом-IgG (данные не показаны). В этом анализе были протестированы другие мутантные варианты LEPR, характеризующийся нарушением передачи сигнала или ослаблением передачи сигнала, но они не активировались мутантными вариантами против LEPR (данные не показаны), позволяя предположить, что этот эффект спасения может быть мутантно-зависимым.

[0218] Результаты в этом примере указывают на то, что агонистические антитела к LEPR по настоящему изобретению могут быть применимыми при лечении заболеваний и нарушений (например, ожирения с ранним началом), которые обусловлены определенными мутантными вариантами LEPR, характеризующимися нарушением передачи сигнала или ослаблением передачи сигнала (например, LEPR-РЗ16Т или LEPR-A409E), или ассоциированы с ними.

Пример 9. Перекрестная конкуренция в анализе Octet между различными моноклональными антителами к LEPR

[0219] Конкуренция за связывание для панели различных моноклональных антител к LEPR определяли с применением анализа методом безметочной биослойной интерферометрии в режиме реального времени на платформе биосенсора Octet НТХ (Pall ForteBio Corp.). Весь эксперимент проводили при 25°С в буфере, содержащем 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20, 1 мг/мл BSA, рН 7,4 (HBS-EBT) при встряхивании планшета при скорости 1000 об./мин. Чтобы оценить, способны ли два антитела конкурировать друг с другом за связывание со своими соответствующими эпитопами на рекомбинантном LEPR человека, экспрессируемом с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), около 0,25 нМ или 0,34 нМ hLEPR-MMH сначала захватывали на наконечниках биосенсора Octet, покрытых антителом к пента-His (Fortebio Inc, №18-5122), погружая наконечники биосенсора на 5 минут в лунки, содержащие 20 мкг/мл hLEPR-MMH. Затем наконечники биосенсора с захваченным антигеном насыщали первым моноклональным антителом к LEPR (впоследствии называемым mAb-1) путем погружения в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора mAb-1, на 210 секунд. Затем наконечники биосенсора погружали в лунки, содержащие раствор второго моноклонального антитела к LEPR (впоследствии называемого mAb-2) с концентрацией 50 мкг/мл, на 150 секунд. Наконечники биосенсора промывали в буфере HBS-EBT между всеми стадиями эксперимента. Мониторинг ответа связывания в реальном времени осуществляли в течение всего эксперимента и регистрировали ответ связывания в конце каждой стадии. Сравнивали ответ связывания mAb-2 с предварительно образовавшимся комплексом hLEPR-MMH и mAb-1, и определяли характер конкурентного/неконкурентного связывания различных моноклональных антител к LEPR, как показано в таблице 14 и таблице 15.

Пример 10. Эффективность in vivo Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 и Н4Н17321Р2, представляющих собой агонистические антитела к LEPR, в индуцируемой мышиной модели недостаточности лептина

[0220] Эффекты четырех специфических агонистических антител к LEPR по настоящему изобретению, Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 и Н4Н17321Р2, в отношении потребления пищи, веса тела и тучности определяли на индуцируемой модели недостаточности лептина у генетически сконструированных мышей LEPR^Hu/Hu, в которой экспрессируется рецептор лептина, который состоит из последовательности эктодомена LEPR человека вместо последовательности эктодомена LEPR мыши. Модель недостаточности лептина индуцировали с помощью гидродинамической доставки ДНК (HDD) плазмиды, кодирующей hFc-меченный эктодомен LEPR мыши (называемый в данном документе mLEPR.hFc или «ловушка для лептина»; SEQ ID NO: 120). В случае экспрессии, ловушка для лептина секретируется и связывает циркулирующий лептин. После HDD 50 мкг ДНК-конструкции, кодирующей ловушку для лептина, у мышей наблюдалось повышенное потребление пищи и увеличение тучности и веса тела.

[0221] Исходное ежедневное потребление пищи измеряли за 7-4 дня до введения ловушки для лептина (дни -7 и -4). В день 0 тридцать пять мышей-самцов LEPR^Hu/Hu в возрасте от 13 до 17 недель успешно подвергли HDD ловушки для лептина. В дни 6 и 13 после HDD собирали образцы крови из ретроорбитального синуса и количественно определяли композиционный состав тела, включая тучность, с помощью мкКТ. В день 7 после HDD мышей случайным образом рандомизировали на пять групп по 7 мышей, исходя из процентного изменения веса тела относительно дня 0. Каждая группа получала путем подкожной инъекции однократную дозу одного из следующего: антитело изотипического контроля при дозе 3 мг/кг, Н4Н16650Р2 при дозе 3 мг/кг, Н4Н16679Р2 при дозе 3 мг/кг, Н4Н17319Р2 при дозе 3 мг/кг или Н4Н17321 при дозе 3 мг/кг. Антитело изотипического контроля не связывало ни один известный белок мыши. Потребление пищи и вес тела измеряли для каждого животного на протяжении всего исследования. На фигуре 3 приведены сводные данные по среднему суточному потреблению пищи для каждой группы обработки. На фигуре 3 пунктирная линия представляет средний исходный уровень потребления пищи до введения HDD. Процентное изменение относительно дня 0 рассчитывали для каждого животного в каждый момент времени. На фигуре 4 приведены сводные данные по среднему процентному изменению веса тела животных в каждой группе обработки антителами. На фигуре 5 приведены сводные данные по средней жировой массе животных в каждой группе обработки антителами, определенной количественно с помощью мкКТ за 1 день до и через 6 дней после обработки антителами. Все результаты выражены в виде среднего значения ±SEM.

[0222] Как показано на фигурах 3 и 4, после HDD ловушки для лептина сходные уровни увеличения потребления пищи и процентного изменения веса тела наблюдали в группах мышей до обработки антителами. Как показано на фигуре 3, у мышей, обработанных антителами Н4Н16650Р2 или Н4Н16679Р2 при дозе 3 мг/кг, наблюдали значимые уровни снижения потребления пищи, начиная с одного дня после обработки антителами (день 8 после HDD) и в последующие моменты времени при измерении по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля. У мышей, обработанных антителами Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при дозе 3 мг/кг, наблюдали значимое снижение потребления пищи через два дня после обработки антителами (день 9 после HDD) и в другие последующие моменты времени при измерении по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля. Как показано на фигуре 4, у мышей, обработанных антителом Н4Н16650Р2 при дозе 3 мг/кг, наблюдали значимое снижение процентного изменения веса тела через один день после обработки антителами (день 8 после HDD) и в другие последующие моменты времени при измерении по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля. Через день после обработки антителами, в день 8, у мышей, которых обрабатывали изотипическим контролем, наблюдалось увеличение веса тела на 21,16±1,27% относительно дня 0, тогда как мыши, которых обрабатывали с помощью Н4Н16650Р2, характеризовались увеличением веса тела на 15,57±0,9% относительно дня 0. У мышей, которых обрабатывали антителами Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при дозе 3 мг/кг, наблюдали значимое снижение процентного изменения веса тела через два дня после обработки антителами (день 9 после HDD) и в другие последующие моменты времени при измерении по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля. В день 9% изменения веса тела относительно дня 0 составил 23,18±1,22, 13,17±1,05, 12,95±1,26, 15,98±1,78 и 15,83±2,01 для мышей, которых обрабатывали изотипическим контролем, Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 соответственно. Как показано на фигуре 5, мыши, которых обрабатывали антителом изотипического контроля при дозе 3 мг/кг, продемонстрировали значимое увеличение жировой массы через 6 дней после обработки антителами (день 13 после HDD) по сравнению с 1 днем до обработки антителами (день 6 после HDD). Мыши, которых обрабатывали антителами Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при дозе 3 мг/кг, не набирали жировую массу после обработки антителами по сравнению с моментом до обработки антителами. Через 6 дней после обработки (день 13 после HDD) мыши, которых обрабатывали антителами Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2 или Н4Н17319Р2 при дозе 3 мг/кг, демонстрировали значимое уменьшение жировой массы по сравнению с мышами, которых обрабатывали антителом изотипического контроля при дозе 3 мг/кг.

Пример 11. Эпитопное картирование связывания Н4Н16650Р2 с рецептором лептина человека (hLEPR.mmh) с помощью водород-дейтериевого обмена

[0223] Провели эксперименты для определения аминокислотных остатков hLEPR.mmh (аминокислоты M1-D839 из SEQ ID NO: 114), с которыми взаимодействует Н4Н16650Р2. С этой целью проводили эпитопное картирование с помощью H/D-обмена с помощью масс-спектрометрии. Общее описание способа H/D-обмена приведено, например, в Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; и Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.

[0224] Порядок проведения эксперимента. Эксперименты HDX-MS проводили на интегрированной платформе Waters HDX/MS, состоящей из системы Leaptec HDX PAL для мечения дейтерием, Waters Acquity M-Class (вспомогательная система управления растворителями) для расщепления и загрузки образцов, Waters Acquity М-Class (система управления растворителями μBinary) для градиента аналитической колонки и масс-спектрометра Synapt G2-Si для измерения массы пептидов, полученных с помощью пепсина.

[0225] Раствор для мечения готовили в 10 мМ буфере PBS в D20 при pD 7,0 (эквивалент рН 6,6). Для мечения дейтерием 3,8 мкл hLEPR.mmh (8 пмоль/мкл) или hLEPR.mmh, предварительно смешанного с антителом в молярном соотношении 2:1, инкубировали с 56,2 мкл раствора для мечения D₂O в различные моменты времени (например, недейтерированный контроль = 0 с, меченый в течение 1 мин. и 20 мин.). Реакцию дейтерирования гасили путем переноса образца объемом 50 мкл в 50 мкл предварительно охлажденного буфера для гашения реакции (0,2 М ТСЕР, 6 М хлорида гуанидина в 100 мМ фосфатном буфере, рН 2,5) и смешанный образец инкубировали при 1,0°С в течение двух минут. Затем подвергнутый гашению образец вводили путем инъекции в систему управления HDX от Waters для расщепления пепсином/протеазой XIII в режиме реального времени. Расщепленные пептиды улавливали на предварительной колонке ACQUITY UPLC ВЕН С18 1,7 мкм, 2,1×5 мМ VanGuard при 0°С и элюировали в аналитическую колонку ACQUIT Y UPLC ВЕН С18 1,7 мкм, 1,0×50 мМ для 9 минутного градиентного разделения 5%-40% В (подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде, подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Масс-спектрометр был установлен на конусное напряжение 37 В, время сканирования 0,5 с и значение массы/заряда в диапазоне 50- 1700 Тс.

[0226] Для идентификации пептидов из LEPR человека данные LC-MSE, полученные для недейтерированного образца обрабатывали и выполняли поиск в базе данных, включающей LEPR человека, пепсин и их рандомизированные последовательности, с помощью программного обеспечения ProteinLynx Global Server (PLGS) от Waters. Идентифицированные пептиды импортировали в программное обеспечение DynamX и отфильтровывали по двум критериям: 1) минимальное количество продуктов на аминокислоту: 0,2 и 2) пороговое значение файла повторов: 3. Затем программное обеспечение DynamX автоматически определяло уровень поглощения дейтерия каждым пептидом на основании времени удерживания и высокой точности определения массы (<10 ppm) в нескольких моментах времени с 3 повторами в каждый момент времени.

[0227] Результаты. Применяя операцию сбора данных в режиме реального времени с колонки с пепсином/протеазой XIII в сочетании с MSE, воспроизводимо идентифицировали в общей сложности 201 пептид из LEPR человека в отсутствие или в присутствии антитела, что соответствует 70% покрытию последовательности. Пять пептидов характеризовались значимо сниженным уровнем поглощения дейтерия (значения дельта-центроида > 0,4 дальтона с р-значениями <0,05) при связывании с Н4Н16650Р2, как показано в таблице 16. Зарегистрированная масса пептида соответствует среднему значению массы центроида МН+ по трем повторам. Эти пептиды, соответствующие аминокислотам 162-169 (аминокислоты LYVLPEVL из LEPR человека; SEQ ID NO: 113) и аминокислотам 170-181 (аминокислоты EDSPLVPQKGSF из LEPR человека; SEQ ID NO: 113), характеризовались более низким уровнем дейтерирования при связывании с Н4Н16650Р2. Эти идентифицированные остатки также соответствуют остаткам кислот 162-169 и 170-181 LEPR человека, как определено в статье Uniprot Р48357 (SEQ ID NO: 113; рецептор лептина человека).

Пример 12. Тестирование эффективности in vivo антител-усилителей LEPR на гуманизированных по LEPR мышах

[0228] Эффекты трех специфических антител к LEPR, представляющих собой усилители, по настоящему изобретению, Н4Н18482Р2, Н4Н18487Р2 и Н4Н18492Р2, в отношении веса тела и тучности определяли у размещенных по одной генетически сконструированных мышей LEPR^Hu/Hu, которые экспрессируют рецептор лептина, который состоит из последовательности эктодомена LEPR человека вместо последовательности эктодомена LEPR мыши (mLEPR.hFc, SEQ ID NO: 120).

[0229] В день -19 композиционный состав тела, включая тучность, определяли количественно с помощью мкКТ. В день 0 сорок восемь самок мышей LEPR^Hu/Hu в возрасте от 14 до 16 недель рандомизировали на четыре группы по 12 мышей в зависимости от веса тела. В дни 0 и 11 мыши из каждой группы получали путем подкожной инъекции однократную дозу антитела изотипического контроля при дозе 30 мг/кг, Н4Н18482Р2 при дозе 30 мг/кг, Н4Н18487Р2 при дозе 30 мг/кг или Н4Н18492Р2 при дозе 30 мг/кг. Антитело изотипического контроля не связывало ни один известный белок мыши. Вес тела измеряли на протяжении всего исследования для каждого животного. Процентное изменение относительно дня 0 рассчитывали для каждого животного в каждый момент времени. На фигуре 6 приведены сводные данные по среднему процентному изменению веса тела животных в каждой группе обработки. На фигуре 6 приведены сводные данные по средней жировой массе животных в каждой группе обработки антителами, определенной количественно с помощью мкКТ за 19 дней до и через 11 дней после обработки антителами. Все результаты выражены в виде среднего значения ±SEM.

[0230] Как показано на фигуре 6, уменьшение процентного изменения веса тела наблюдали после введения доз антител-усилителей LEPR, но не антитела изотипического контроля. Как показано на фигуре 6, у мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н18482Р2 при дозе 30 мг/кг, наблюдали значимое уменьшение процентного изменения веса тела, начиная с двух дней после обработки (день 2), и в другие моменты времени, по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля. У мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н18487Р2 при дозе 30 мг/кг, наблюдали значимое уменьшение процентного изменения веса тела, начиная со дня 2 и в другие моменты времени, по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля. У мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н18492Р2 при дозе 30 мг/кг, наблюдали значимое снижение процентного изменения веса тела в дни 4, 5 и 17, но не в другие моменты времени, по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля. У мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н18482Р2 при дозе 30 мг/кг, наблюдали значимое уменьшение процентного изменения веса тела, начиная со дня 6 и в последующие дни, но не в дни 7, 14 и 17, по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции Н4Н18492Р2. У мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н18487Р2 при дозе 30 мг/кг, наблюдали значимое уменьшение процентного изменения веса тела, начиная со дня 3 и в другие моменты времени, но не в дни 4 и 5, по сравнению с мышами, которым вводили путем инъекции Н4Н18492Р2.

[0231] Как показано на фигуре 7А, между группами до обработки не было различий в отношении жировой массы (день -19). Как показано на фигуре 7В, мыши, которых обрабатывали антителами Н4Н18482 и Н4Н18487, но не Н4Н18492, при дозе 30 мг/кг, показали статистически значимое уменьшение жировой массы через 17 дней после обработки (день 12) по сравнению с антителом изотипического контроля.

Пример 13. Эффект антител к LEPR по настоящему изобретению в отношении опосредованной LEPR передачи сигнала у обезьяны

[0232] Для оценки транскрипционной активации рецептора лептина обезьян разработали стабильную линию клеток. Клетки IMR-32 (нейробластома человека АТСС) получили с обеспечением стабильной экспрессии внеклеточного домена LEPR Macaca fascicularis (MfLEPR; аминокислоты с 22 по 837 под номером доступа ХР 005543194.1 с заменой треонина в положении 827 на аланин), слитого с трансмембранным и цитозольным доменами LEPR человека (hLEPR; аминокислоты с 840 по 1165 под номером доступа NP 002294.2) вместе с люциферазным репортером (STAT3-Luc; SABiosciences, № CLS-6028L). Полученную линию клеток, называемую далее в данном документе IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR, выделяли и поддерживали в среде МЕМс солями Эрла с добавлением 10% FBS, NEAA, 1 мкг/мл пуромицина, 100 мкг/мл гигромицина В и пенициллина/стрептомицина/Е-глутамина.

[0233] Биологический анализ выполняли для измерения эффекта антител к LEPR по настоящему изобретению в отношении опосредованной LEPR передачи сигнала у обезьяны в отсутствие лептина. Для биологического анализа клетки IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR высевали из расчета 10000 клеток/лунку в 96-луночный планшет в 0,1% FBS в Optimem с пенициллином/стрептомицином (буфер для анализа) и инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% СО₂. На следующий день получали серийные разведения лептина человека (hLeptin), антител к LEPR или антитела изотипического контроля в диапазоне от 50 нМ до 0,8 пМ в буфере для анализа (плюс образец, содержащий только буфер без тестируемой молекулы) и добавляли к клеткам. Через 5,5 часов при 37°С в 5% СО₂ измеряли активность люциферазы с помощью реагента OneGlo™ (Promega, №Е6031) и многоканального планшет-ридера Victor™ X (Perkin Elmer). Результаты анализировали с применением нелинейной (логистической с 4 параметрами) регрессии с помощью программного обеспечения Prism™ 6 (GraphPad) с получением значений ЕС₅₀. Процент активации антител рассчитывали в виде максимального диапазона RLU, достигаемого с помощью антитела, по сравнению с максимальным диапазоном RLU, достигнутым с помощью hLeptin.

[0234] Как показано в таблице 17, в отсутствие hLeptin все протестированные антитела к LEPR показали активацию опосредованной LEPR обезьяны передачи сигнала в клетках IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR со значениями ЕС₅₀ в диапазоне от 266 пМ до 368 пМ и максимальной активацией в диапазоне от 76% до 82%, где 100% активация была получена с помощью hLeptin. hLeptin осуществлял активацию со значением ЕС₅₀, составляющим 333 пМ. Антитело изотипического контроля не продемонстрировало какого-либо поддающегося измерению уровня стимуляции клеток IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR.

Пример 14. Определение связывания эпитопа с полноразмерным внеклеточным доменом LEPR человека по полученному с помощью Luminex MFI-сигналу

[0235] Для определения эпитопа LEPR человека, с которым связываются антитела к LEPR по настоящему изобретению, использовали анализ на основе проточной цитометрии Luminex FLEXMAP (FM3DD, LuminexCorp) для определения характеристик взаимодействия антител к LEPR с доменами рекомбинантного белка LEPR человека. Для данного анализа примерно 3 миллиона карбоксилированных микросфер MicroplexR (Luminex, № по кат. LC1000A) промывали, встряхивали и обрабатывали ультразвуком в 0,1 М NaPO₄, рН 6,2 (буфер для активации), а затем центрифугировали для удаления надосадочной жидкости. Микросферы ресуспендировали в 120 мкл активационного буфера и карбоксильные группы (-СООН) активировали добавлением 15 мкл 50 мг/мл N-гидроксисукцинимида (NHS, Thermo Scientific, № по кат. 24500) с последующим добавлением 15 мкл 50 мг/мл 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC, ThermoScientific, № по кат. 22980) при 25°С. Через 10 минут рН реакции снижали до 5,0 добавлением 600 мкл 50 мМ MES, рН 5 (буфер для связывания), и микросферы встряхивали и центрифугировали для удаления надосадочной жидкости. Активированные шарики немедленно смешивали с 500 мкл 20 мкг/мл моноклональных антител к туе либо с мышиным IgG, либо с IgG человека в буфере для связывания и инкубировали в течение двух часов при 25°С. Реакцию связывания гасили добавлением 50 мкл 1 М Tris-HCl, pH 8,0, и микросферы быстро встряхивали, центрифугировали и четыре раза промывали с помощью 1 мл DPBS для удаления несвязанных белков и других компонентов реакционной смеси.

[0236] Транзиентно экспрессированные белки LEPR, включая внеклеточный домен LEPR человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR-MMH человека, SEQ ID NO: 113), LEPR CRH1 (D1) человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR CRH1 (D1)-MMH человека, аминокислоты 1-208 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 209-236), домен LEPR CRH1 (D1, D2) человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR CRH1 (D1, D2)-MMH человека, аминокислоты 1-318 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 319-346), домен LEPR CRH1-Ig (D1, D2, D3) человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR CRH1 (D1, D2, D3)-MMH человека, аминокислоты 1-278 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 279-306), домен LEPR CRH1-Ig (D2, D3) человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR CRH1-Ig (D2, D3)-MMH человека, аминокислоты 1-198 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 199-226), домен LEPR Ig (D3) человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR Ig (D3)-MMH человека, аминокислоты 1-88 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 89-116), домен LEPR CRH2 человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR CRH2-MMH человека, аминокислоты 1-207 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 208-235), домен LEPR FNIII человека, экспрессированный с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR FNIII-MMH человека, аминокислоты 1-204 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 205-232) и домен LEPR Ig-CRH2-FNIII человека, экспрессированный с помощью С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (LEPR Ig-CRH2-FNIII-MMH человека, аминокислоты 1-510 из SEQ ID NO: 113 с myc-myc-гексагистидиновой меткой, аминокислоты 511-538), суспендировали в бессывороточной среде CHO-S-SFMII (Thermo Fisher, № по кат. 31033020) и затем осветляли центрифугированием.

Аликвоты микросфер с иммобилизованными моноклональными антителами к туе, полученные, как описано выше, добавляли отдельно к 1 мл каждой из этих белковых надосадочных жидкостей. Микросферы осторожно перемешивали, инкубировали в течение двух часов при 25°С, дважды промывали с помощью 1 мл DBPS, центрифугировали для удаления надосадочной жидкости и, наконец, ресуспендировали в 1 мл буфера DPBS. Сорок восемь мкл микросфер, связанных с IgG к туе, полученных в результате отдельных реакций с полноразмерным LEPR человека и с каждым из белков, представляющих собой домен LEPR человека, извлекали и смешивали вместе в 3,6 мл PBS + 20 мг/мл BSA + 0,05% азида натрия (блокирующий буфер).

[0237] Из этого смешанного пула высевали из расчета 75 мкл микросфер на лунку на 96-луночный фильтровальный планшет (Millipore, № по кат.: MSBVN1250) и смешивали с 25 мкл индивидуальных моноклональных антител к LEPR человека (0,5 или 5 мкг/мл), инкубировали в течение двух часов при 25°С, а затем дважды промывали с помощью 200 мкл DPBS с 0,05% Tween 20 (промывочный буфер). Для обнаружения и количественной оценки уровней количеств антител к LEPR, связанных с отдельными микросферами, либо 100 мкл 2,5 мкг/мл конъюгированного с R-фикоэритрином козьего F(ab')2 к каппа-цепи человека (Southern Biotech, № по кат. 2063-09) в блокирующем буфере, либо 100 мкл 1,25 мкг/мл конъюгированного с R-фикоэритрином AffiniPure козьего F(ab')2-фрагмента к мышиному IgG, F(ab')2-фрагмент-специфического (Jackson Immunoresearch, № по кат.: 115-116-072) в блокирующем буфере, добавляли и инкубировали в течение 30 минут при 25°С. Через 30 минут образцы дважды промывали с помощью 200 мкл промывочного буфера и ресуспендировали в 150 мкл промывочного буфера. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) микросфер измеряли в анализаторе Luminex.

[0238] Результаты анализа на основе Luminex представлены в таблице 18. Интенсивность полученных с помощью Luminex MFI -сигналов указывает на то, что двенадцать антител к LEPR по настоящему изобретению связываются с полным внеклеточным доменом LEPR человека. Антитела к LEPR, представляющие собой Н4Н18417Р2, Н4Н18438Р2 и Н4Н18492Р2, связывались с эпитопами в домене CRH1 D2 LEPR человека. Антитела к LEPR, представляющие собой Н4Н18449Р2, Н4Н16650Р и Н4Н16679Р, связывались с эпитопами в домене CRHl(Dl-2) LEPR человека. Моноклональное антитело к LEPR, представляющее собой антитело сравнения, связывалось с эпитопами в домене CRH2 LEPR человека. Антитело к LEPR, представляющее собой Н4Н18445Р2, связывалось с эпитопами в домене FNIII LEPR человека. Антитела к LEPR, представляющие собой Н4Н18446Р2, Н4Н18482Р2 и Н4Н18487Р2, связывались с эпитопами в домене Ig-CRH2-FNIII LEPR человека.

Примеры 15-19. Протоколы исследований на животных

[0239] Все исследования на животных проводили в соответствии с руководствами Комитета по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC) и с его одобрением на базе Regeneron Pharmaceuticals. Исследования на обезьянах также проводили в соответствии с руководствами IACUC и с его одобрением на базе Covance Laboratories.

Исследования на мышах

Гидродинамическая доставка ДНК

[0240] Трансфекция in vivo на основе гидродинамической доставки ДНК (HDD) предусматривает протокол, включающий быструю инъекцию большого объема раствора с депротеинизированной плазмидной ДНК для экспрессии чужеродных белков в живых животных (Suda, 2007). Мышей взвешивали и свежеприготовленный вектор экспрессии суспендировали в конечном объеме физиологического раствора, равном 1/10 веса тела (об./вес), который вводили путем инъекции через латеральную хвостовую вену. Для валидационного исследования модели акцептора лептина (фигура 11) самцы мышей C57BL/6N (Taconic) в возрасте 8 недель получали вектор экспрессии mLeprECD (pRG977.mROR.mLepR.экто.hFc) или контрольный вектор (pRG977.hFc) из расчета 50 мкг ДНК на мышь. Для оценочного исследования Н4Н17319Р2 (фигура 9) самцы и самки мышей LEPR^hu/hu в возрасте от 17 до 20 недель получали вектор экспрессии mLeprECD (pRG977.mROR.mLepR.экто.hFc) из расчета 50 мкг ДНК на мышь.

Измерение веса тела и потребления пищи

[0241] Вес тела измеряли, помещая мышь в контейнер на тарированных цифровых лабораторных весах. Применяли значение среднего веса тела, полученное в результате динамического взвешивания в течение 3 с. Уровень потребления пищи определяли путем измерения массы корма в бункере для корма с помощью цифровых лабораторных весов. Уровень потребления пищи рассчитывали в виде разницы массы корма, оставшегося в бункере и массы корма, помещенного в бункер.

Композиционный состав тела

[0242] Визуализацию с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) проводили с помощью системы микро-КТ-визуализации Quantum (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя на живых мышах, анестезированных газообразным изофлураном. Композиционный состав тела (жировую массу, безжировую массу, костную массу, минерализацию и плотность костной ткани) измеряли с помощью системы микро-КТ-визуализации Quantum (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя. Затем изображения, полученные с помощью сканирования, анализировали с помощью программного обеспечения для обработки изображений AnalyzeDirect. Жировую массу, безжировую массу и костную массу рассчитывали путем умножения записанных объемов ткани на соответствующие значения массовой плотности: 0,92, 1,05 и 1,7 г/см³. Количественный ядерный магнитный резонанс (qNMR) на приборе EchoMRI 100 (EchoMRI) выполняли на живых мышах, находящихся в состоянии бодрствования, для измерения жировой, безжировой массы, значения массы свободной воды и общей массы воды.

Измерение уровня глюкозы в крови

[0243] Уровни глюкозы в крови после еды измеряли в образцах, полученных путем надреза хвостовой вены у находящихся в состоянии бодрствования мышей, с применением глюкометра (AlphaTrak2, Zoetis) и тест-полосок для определения уровня глюкозы (Zoetis).

Тестирование толерантности к инсулину

[0244] После 4-часовой выдержки без кормления животным внутрибрюшинно (IP) вводили путем инъекции дозу инсулина, составляющую 0,5, 0,75 или 1,0 Ед./кг (Humulin R, Eli Lilly and Company), как указано. Измерения уровня глюкозы проводили с применением глюкометра AlphaTRAK2 и тест-полосок (Zoetis) через 0, 15, 30, 60 и 120 мин. после инъекции инсулина. В исследовании для определения характеристик LEPR^hu/hu применяли глюкометр Accu-Chek® Compact Plus и тест-полоски (Roche Diabetes Care, Inc.).

Химические анализы и количественные анализы на гормоны

[0245] Если не указано иное, мышей не кормили в течение 4 ч., затем образцы крови собирали путем отбора крови из ретроорбитального синуса. Для отделения сыворотки крови кровь переносили в пробирки для отделения сыворотки крови (Sarstedt AG & Со.) и оставляли для свертывания на по меньшей мере 30 мин. на мокром льду перед центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин. Сыворотку крови отбирали и хранили при -80°С до обработки для количественного определения лептина. Для измерений в плазме крови кровь переносили в пробирки, покрытые K3EDTA (Sarstedt AG & Co.). Смесь ингибитора дипептидилпептидазы 4 (DPP4) и ингибитора протеаз добавляли к образцу крови, который хранили на льду до обработки для получения плазмы крови центрифугированием при 2000 × g в течение 10 мин. Плазму крови разделяли на аликвоты и хранили при -80°С до использования для количественного определения липидов в плазме крови, ферментов печени и уровней лептина. Уровни HbAlc измеряли в свежей цельной крови, собранной в пробирки, покрытые K3EDTA. Количественное определение HbAlc, липидов в плазме крови и ферментов печени осуществляли с применением химического анализатора (Advia Chemistry ХРТ, Siemens). Уровни лептина в сыворотке или плазме крови измеряли с применением набора для иммуноанализа (Milliplex MAP, Millipore) и следуя протоколу, рекомендованному производителем.

Количественное определение триглицеридов в печени

[0246] Количественное определение содержания триглицеридов в печени осуществляли в образцах печени размером 100-200 мг, которые измельчали в порошок при охлаждении жидким азотом с помощью ступки и пестика. Порошкообразную ткань печени взвешивали и гомогенизировали в PBS путем гомогенизации с помощью шариков (FastPrep 24-5G, MP Biomedical). Гомогенат переносили в стеклянную пробирку, содержащую 5 мл раствора Фолча (хлороформ:метанол в соотношении 2:1), встряхивали и центрифугировали в течение 20 мин. при 1500 × g. Нижнюю фазу собирали, доводили до объема 5 мл и встряхивали. Конкретные объемы (от 25 до 50 мкл) образцов и стандартов триолеина (Verichem) переносили в 96-луночный полипропиленовый планшет, смешивали с 10 мкл смеси хлороформ:Triton Х-100 в соотношении 1:1 и оставляли сушиться на воздухе. К высушенным образцам и стандартам добавляли 300 мкл реагента для триглицеридов (Thermo Scientific), планшет встряхивали в течение 5 мин, а затем инкубировали в течение 20 мин. при 37°С. 200 мкл каждой реакционной смеси переносили в новый 96-луночный планшет из прозрачного полипропилена и измеряли оптическую плотность при 500 нм с помощью планшет-ридера (Molecular Devices).

Фиксирующая перфузия и иммуногистохимия

[0247] Мышей анестезировали пентобарбиталом натрия (110 мг/кг, IP) и проводили транскардиальную перфузию с помощью 2 мл физиологического раствора, а затем 150 мл 4% параформальдегида в 0,1 М боратном буфере, рН 9,5. Образцы печени подвергали вторичной фиксации в течение 2 ч., переносили в 70% этанол и обрабатывали для заливки парафином, делали срезы для окрашивания гематоксилином и эозином в Histoserv. Головной мозг подвергали вторичной фиксации в течение 2 ч. при 4°С, а затем погружали в 15% сахарозу в физиологическом растворе, забуференном фосфатом калия, на ночь при 4°С. Целый головной мозг помещали на замораживающий скользящий микротом (Leica), делали срезы толщиной 30 мкм, собирали сериями через равные промежутки и хранили в криопротекторном средстве (20% глицерина и 30% этиленгликоля в 0,1 М фосфатном буфере) и хранили в криопротекторном средстве (20% глицерина и 30% этиленгликоля в 0,1 М фосфатном буфере) при -20°С.

[0248] Серийные срезы головного мозга, расположенные на расстоянии 150 мкм друг от друга, из каждой экспериментальной группы обрабатывали одновременно, чтобы обеспечить сопоставимое окрашивание для разных животных и видов обработки. В целом для иммунологического окрашивания срезы головного мозга блокировали и первичные/вторичные антитела разводили в растворе, содержащем 1% ослиную сыворотку крови (Equitech), 0,03% Triton Х-100 и 0,05 М физиологический раствор, забуференный фосфатом калия. Блокирование авидина и биотина выполняли согласно протоколу производителя (Vector Labs). Иммуногистохимическое окрашивание HapStat3 (Y705) (№9145, Cell Signaling Technologies; 1:1000, 16 ч. при 4°С) проводили на серийных срезах головного мозга с равным интервалом с помощью способа на основе комплекса авидин-биотин с хромогеном диаминобензидином (Vector Labs). Для иммуногистохимического (IHC) исследования P-STAT3 (Y705) срезы предварительно обрабатывали с помощью 1% Н₂О₂ в 1% NaOH в течение 10 мин., 0,3% глицином в K-PBS в течение 10 мин. и 0,03% SDS в K-PBS в течение 10 мин.

[0249] Светлопольные изображения получали при сканировании всего слайда с помощью объектива 40х на Scanscope XT (Aperio). Срезы сопоставляли путем сравнения тканей с атласом головного мозга мышей Франклина и Паксиноса. Нейроанатомические области и расстояние от брегмы аппроксимировали на основе этого атласа. Число иммунореактивных клеток с pSTAT3 (Y705) количественно определяли с двух сторон для данной области на ростро-каудальном уровне, указанном с применением программного обеспечения Halo (Indica Labs).

Исследования на обезьянах

[0250] Все исследования на яванских макаках проводили на базе Covance Laboratories, Inc. Обезьян кормили дважды в день сертифицированным рационом для приматов №5048 (PMI, Inc.) и обеспечивали свободный доступ к пресной воде.

Значения веса тела

[0251] Обезьян взвешивали до введения дозы в день введения дозы и, если применимо, по меньшей мере один раз в неделю на протяжении оставшейся части исследования.

Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (DEXA)

[0252] Сканирование всего тела выполняли с применением денситометра Discovery А (Hologic) на обезьянах натощак, анестезированных кетамином и дексмедетомидином, и по усмотрению ветеринарного персонала.

Пример 15. Антитела к LEPR обеспечивают обращение вспять ожирения, вызванного недостаточностью лептина

[0253] Провели исследования для определения эффективности Н4Н17319Р2 in vivo. Поскольку Н4Н17319Р2 не связывает LEPR мыши, получили генетически модифицированных мышей с применением технологии VelociGene® (Valenzuela et al., 2003), у которых часть гена Lepr мыши, кодирующую внеклеточный домен LEPR, заменили соответствующей геномной последовательностью LEPR человека (Lepr^hu/hu; фигура 10А). Мыши Lepr^hu/hu не демонстрируют отличий от мышей Lepr^+/+ в отношении веса тела, композиционного состава тела, чувствительности к инсулину и уровней лептина в сыворотке крови (фигуры 10В, С и D).

[0254] Мышиную модель недостаточности лептина разработали путем гидродинамической доставки ДНК (HDD) плазмиды, которая кодирует hFc-меченный эктодомен Lepr мыши (mLeprECD) чтобы связывать эндогенный циркулирующий лептин мыши, таким образом действуя как акцептор лептина и тем самым предотвращая опосредованную лептином передачу сигнала. После HDD mLeprECD мыши C57BL/6N, получавшие корм, быстро набрали вес тела со значимым увеличением начиная со дня 3 после HDD, по сравнению с мышами, которые получали HDD контрольного hFc (фигура 11А). В конце исследования (день 10 после HDD) значения веса тела увеличились на 24% после HDD mLeprECD, тогда как в контрольной группе наблюдалось лишь незначительное увеличение на 3% (фигура 11А). В соответствии с данными о весе тела, совокупное потребление пищи после HDD mLeprECD было значимо увеличенным по сравнению с контрольной группой, начиная со дня 3 после HDD (фигура 11А). Чтобы подтвердить, что увеличение веса тела отражало увеличение тучности, в день 7 после HDD проводили микро-КТ-визуализацию, которая показала значимое 2-кратное увеличение жировой массы после HDD mLeprECD по сравнению с контрольной группой (фигура 11В). Все остальные параметры композиционного состава тела в группах были одинаковыми (фигура 11В).

[0255] Для оценки эффективности Н4Н17319Р2 in vivo, индуцировали недостаточность лептина путем HDD mLeprECD у самцов и самок мышей Lepr^hu/hu, получавших корм. Как и ожидалось, экспрессия mLeprECD способствовала быстрому набору веса тела у мышей Lepr^hu/hu обоего пола (фигура 9А и 12А). Через семь дней после HDD мышей Lepr^hu/hu разделяли на основе относительного процентного изменения веса тела и вводили им однократную SC дозу контроля или Н4Н17319Р2, составляющую 10 мг/кг. Как самцы, так и самки мышей, которым вводили контрольное моноклональное антитело (далее - контрольное mAb), продолжали набирать вес тела с увеличением веса тела на 40,5±2,7% и 44,1±4,7% соответственно через 14 дней после HDD (фигура 9А и 11А). Напротив, мыши, которых обрабатывали с помощью однократной дозы агонистического моноклонального антитела к LEPR, потеряли вес тела и вернулись к исходным значениям веса тела, наблюдаемым до HDD (фигуры 9А и 11А). Поскольку Н4Н17319Р2 связывает LEPR человека, но не мыши, можно исключить возможность того, что улучшения в отношении веса тела являются вторичными по отношению к влиянию mAb к LEPR на способность mLeprECD связывать лептин. Снижение веса тела было ассоциировано со снижением потребления пищи (фигура 9А и 11А). Хотя суточное потребление пищи не различалось между двумя группами до введения дозы, у мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, наблюдалось значимое снижение потребления пищи по сравнению с группой контрольного моноклонального антитела (фигура 9А и 11А). Эффекты снижения веса тела и потребления пищи, наблюдаемые при однократной дозе Н4Н17319Р2, в конечном итоге ослабли. Уровень потребления пищи оставался значимо более низким у самцов и самок мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, чем у мышей, которым вводили контрольное моноклональное антитело, до дней 12 и 9 после обработки (дни 19 и 16) соответственно (фигура 9А и 11А). Значения веса тела самцов и самок мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, оставались сходным с их исходными значениями веса тела до дней 16 и 13 после обработки (дни 23 и 20), после чего происходило увеличение веса (фигура 9А и 11А).

[0256] Понижение веса тела, индуцированное обработкой Н4Н17319Р2, отражало снижение уровня тучности и безжировой массы. Анализ на основе микро-КТ показал, что до HDD в день -1 и до обработки в день 6 обе группы обработки мышей-самцов или самок показали сходный композиционный состав тела (фигура 9В, 12В и 12С). В соответствии с индуцированной недостаточностью лептина в день 6 в обеих группах наблюдалось значимое увеличение жировой и безжировой массы, но не костной массы, по сравнению с показателями до HDD в день -1 (фигура 9В, 12В и 12С). Через шесть дней после обработки (день 13) у мышей, которым вводили в виде доз контрольное моноклональное антитело, наблюдалось дальнейшее увеличение жировой массы по сравнению с днем 6, тогда как дополнительного увеличения тучности после обработки с помощью Н4Н17319Р2 обнаружено не было. В соответствии с изменениями веса тела, как жировая, так и безжировая масса были снижены у мышей, получавших Н4Н17319Р2, по сравнению с мышами, которым вводили контрольное моноклональное антитело, после 7 дней обработки. Никаких связанных с обработкой эффектов в отношении костной массы, минерального состава или плотности костной ткани не наблюдали (фигура 12В и 123С).

[0257] Затем Н4Н17319Р2 оценивали на предмет его способности изменять уровень циркулирующих липидов у мышей с индуцированной недостаточностью лептина. Химические анализы плазмы крови показал, что Н4Н17319Р2 обеспечивает понижение уровня циркулирующих триглицеридов и общего холестерина в плазме крови, включая холестерин HDL (HDL-C) и холестерин LDL (LDL-C), по сравнению с показателями у самцов мышей, получавших контрольное моноклональное антитело, после 6 дней обработки (фигура 9С).

[0258] Учитывая, что лептин способствует расходу энергии у мышей ob/ob с недостаточностью лептина (Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995), осуществили оценку эффектов принципа одинакового кормления в парных группах, чтобы определить, полностью ли снижение потребления пищи объясняет эффекта Н4Н17319Р2 в отношении снижения веса тела при индуцированной недостаточности лептина. Мыши Lepr^hu/hu с индуцированной недостаточностью лептина быстро набирали вес и проявляли гиперфагию по сравнению с мышами Lepr^hu/hu, которые получали контрольный вектор путем HDD (фигура 13А). После введения дозы в дни 7 и 13 мыши, которым вводили контрольное моноклональное антитело, продолжали потреблять больше корма и набирать вес, в то время как мыши, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, снижали потребление пищи и теряли вес тела (фигура 13А). Применение принципа одинакового кормления в парных группах также способствовало потере веса у мышей Lepr^hu/hu, экспрессирующих mLeprECD. Следует отметить, что мыши, для которых применяли принцип одинакового кормления в парных группах, потребляли такое же количество корма, как и мыши, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, но не демонстрировали такой же степени потери веса тела (фигура 13А). В соответствии с этими данными, тучность уменьшалась у мышей, для которых применяли принцип одинакового кормления в парных группах, по сравнению с мышами, которым вводили контрольное моноклональное антитело, но была значимо больше, чем тучность у мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2 (фигура 13В). Напротив, при применении принципа одинакового кормления в парных группах и обработке Н4Н17319Р2 наблюдались сходные эффекты в отношении уменьшения безжировой массы по сравнению с мышами с недостаточностью лептина, которым вводили контрольное моноклональное антитело (фигура 13В). Никаких эффектов не наблюдалось в отношении костной массы, плотности костной ткани или минерализации костной ткани (фигура 13В).

[0259] Лептин также обеспечивает улучшение чувствительности к инсулину у мышей ob/ob с недостаточностью лептина (Muzzin et al., 1996; Pelleymounter et al., 1995). Таким образом, относительные эффекты обработки с помощью Н4Н17319Р2 и применения принципа одинакового кормления в парных группах в отношении чувствительности к инсулину определяли после индуцирования недостаточности лептина. Тесты на толерантность к инсулину проводили через три дня после введения доз моноклональных антител или осуществления принципа одинакового кормления в парных группах. Как показано на фигуре 13С, мыши Lepr^hu/hu, экспрессирующие mLeprECD, которым вводили контрольные моноклональные антитела, продемонстрировали сниженную чувствительность к инсулину по сравнению с мышами Lepr^hu/hu, подвергнутыми HDD контрольного вектора. Примечательно, что обработка с помощью Н4Н17319Р2 обеспечивала восстановление чувствительности к инсулину, в то время как осуществление принципа одинакового кормления в парных группах не оказывало эффекта в отношении мышей Lepr^hu/hu с индуцированной недостаточностью лептина (фигура 13С).

[0260] Наконец, было подтверждено наличие эффекта Н4Н17319Р2 в отношении уменьшения уровня циркулирующих липидов, главным образом за счет уменьшения потребления пищи. В то время как получение Н4Н17319Р2 без осуществления принципа одинакового кормления в парных группах обеспечивало значимое понижение уровня триглицеридов в плазме крови при недостаточности лептина, одновременное получение Н4Н17319Р2 и осуществление принципа одинакового кормления в парных группах обеспечивало снижение уровня общего холестерина и HDL-C в плазме крови (фигура 13D).

[0261] Таким образом, данные демонстрируют, что на модели индуцированной недостаточности лептина Н4Н17319Р2 не только обеспечивает обращение вспять гиперфагии и ожирения, но также ослабляет инсулинорезистентность. Следует отметить, что хотя сокращение потребления пищи способствует снижению веса тела и тучности, наблюдаемым при обработке с помощью Н4Н17319Р2, уменьшения потребления пищи недостаточно для обеспечения улучшения чувствительности к инсулину или снижения уровней триглицеридов в плазме крови. Пример 16. Н4Н17319Р2 обеспечивает обращение вспять гипергликемии, инсулинорезистентности, дислипидемии и стеатоза печени у мышей с липодистрофией.

[0262] Затем протестировали Н4Н17319Р2, чтобы определить, будет ли оно смягчать гиперфагию, нарушение метаболизма и стеатоз печени у мышей с вторичной гиполептинемией из-за генерализованной липодистрофии. Чтобы проверить эту гипотезу, мышей aP2-nSrebplc^Tg/+, у которых развиваются фенотипические признаки, характерные для генерализованной липодистрофии (Shimomura et al., 1998), скрещивали с мышами Lepr^hu/hu. Мыши aP2-nSrebplc^Tg/+ экспрессируют ядерный Srebplc в жировой ткани с помощью промотора аР2 и их применяли в классическом эксперименте, с помощью которого было получено первое доказательство того, что лептин устраняет метаболические осложнения, обусловленные низкими уровнями лептина при генерализованной липодистрофии (Shimomura et al., 1999). Самцы мышей aP2-nSrebplc^Tg/+; Lepr^hu/hu (Tg) были тяжелее, чем животные aP2-nSrebplc^+/+; Lepr^hu/hu (nonTg) (фигура 15А). Однако, в соответствии с предыдущими сообщениями, Tg-мыши демонстрируют сниженную тучность и более низкие уровни лептина по сравнению с nonTg-мышами (фигура 15А). У мышей Р2-nSrebplc^Tg/+; Lepr^hu/hu также наблюдали выраженную инсулинорезистентность и легкую дислипидемию с повышенными уровнями триглицеридов, общего холестерина и LDL-C в плазме крови по сравнению с nonTg-мышами (фигура 15В и 15С).

[0263] Самцы Tg-мышей с липодистрофией получали один раз в неделю 10 мг/кг (SC) контрольного моноклонального антитела или Н4Н17319Р2. Кроме того, самцы nonTg-мышей также получали один раз в неделю 10 мг/кг (SC) контрольного моноклонального антитела, чтобы служить эталоном метаболических параметров дикого типа. Перед обработкой в день 0 у Jg-мышей были показаны значимо повышенные значения веса тела по сравнению с nonTg-мышами (фигура 14А). Через три дня после начала обработки значения веса тела мышей с липодистрофией, получавших Н4Н17319Р2, были значимо более низкими, чем у мышей с липодистрофией, которым вводили в виде доз контрольное моноклональное антитело (фигура 14А). Соответственно, Jg-мыши, которым вводили контрольное моноклональное антитело, характеризовались наличием гиперфагии и потребляли больше корма, чем nonTg-мьшш без липодистрофии, которым вводили контрольное моноклональное антитело (фигура 14А). Однако Jg-мыши, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, потребляли меньше корма, чем Jg-мыши, которым давали контрольное моноклональное антитело (фигура 14А).

[0264] Чтобы определить основную причину наблюдаемых изменений веса тела, осуществляли количественное определение композиционного состава тела с помощью микро-КТ. Эти анализы показали, что изменения между весом тела, обусловленным генотипами, и весом тела, обусловленным обработкой, в основном объясняются различиями в безжировой массе. Перед обработкой (день -5) безжировая масса была значимо увеличенной у Jg-мышей с липодистрофией по сравнению с nonTg-мышами (фигура 14В). Напротив, Jg-мыши имели сниженную жировую массу по сравнению с nonTg-мышами до введения дозы (день -5) (фигура 14В). После 4 недель введения Н4Н17319Р2 один раз в неделю происходило значимое снижение жировой массы и безжировой массы у Jg-мышей по сравнению с жировой массой и безжировой массой Jg-мышей, которым вводили дозы контрольного моноклонального антитела (фигура 14В). Костная масса и минерализация костной ткани были повышены у Jg-мышей по сравнению с мышами дикого типа, но не были значимо повышены в группах обработки до введения доз (фигура 16А). Более того, у между мышами с липодистрофией, которым вводили контрольное моноклональное антитело или Н4Н17319Р2, не наблюдали различий в костной массе или минерализации костной ткани (фигура 16А). Точно так же не было обнаружено значимых эффектов, связанных с генотипом или лечением, в отношении плотности костной ткани (фигура 16А). Эти данные показывают, что Н4Н17319Р2 обеспечивает уменьшение безжировой массы и жировой массы у мышей с липодистрофией, но не влияет на костную массу, минерализацию костной ткани или плотность костной ткани.

[0265] В соответствии с предыдущими результатами, Jg-мыши с липодистрофией демонстрировали выраженную гипергликемию по сравнению с поп Jg-мышами до обработки в день 0 (фигура 14С). Через три дня после обработки с помощью Н4Н17319Р2 уровни глюкозы в крови при кормлении ad-libitum у Jg-мышей нормализовались и не отличались от уровней глюкозы в крови nonTg-мышей. Следует отметить, что при обработке с помощью Н4Н17319Р2 один раз в неделю у Tg-мышей сохранялась нормогликемия до конца исследования, тогда как у Tg-мышей, получавших контрольное моноклональное антитело, гипергликемия оставалась на протяжении всего исследования (фигура 14С). Соответственно, в день 28 процентные уровни гемоглобина Ale (HbAlc) были снижены у мышей с липодистрофией по сравнению с показателем до обработки или при введении контрольного моноклонального антитела (фигура 14С). Кроме того, снижение уровней глюкозы в крови при обработке с помощью Н4Н17319Р2 было ассоциировано с улучшением чувствительности к инсулину. В день 23 тестирование толерантности к инсулину показало, что мыши с липодистрофией, которым вводили контрольное моноклональное антитело, были инсулинорезистентными, тогда как мыши с липодистрофией, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, были так же чувствительны к инсулину, как и nonTg-мыши, которым вводили контрольное моноклональное антитело (фигура 14D). В целом, эти результаты демонстрируют, что Н4Н17319Р2 обеспечивает облегчение гипергликемии, инсулинорезистентности и снижение уровней HbAlc на мышиной модели генерализованной липодистрофии.

[0266] Химические анализы плазмы крови, проведенные в конце исследования (день 28), дополнительно показали, что Н4Н17319Р2 обеспечивает снижение выраженности гипертриглицеридемии и гиперхолестеринемии у мышей с генерализованной липодистрофией. В конце исследования уровни триглицеридов, уровни общего холестерина и LDL-C в плазме крови были значимо повышенными у Jg-мышей, которые получали контрольное моноклональное антитело, по сравнению с nonTg-мышами, которые также получали контрольное моноклональное антитело (фигура 1Е). Примечательно, что уровни триглицеридов и холестерина в плазме крови были значимо более низкими у Tg-мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2. Следовательно, Н4Н17319Р2 обеспечивает улучшение в отношении дислипидемии у мышей с генерализованной липодистрофией.

[0267] Помимо сахарного диабета, инсулинорезистентности и дислипидемии у пациентов с видами генерализованной и очаговой липодистрофии может развиваться неалкогольная жировая болезнь печени (включая стеатоз печени). Таким образом, были изучены эффекты Н4Н17319Р2 в отношении уровней ферментов печени, массы печени и стеатоза печени у мышей с липодистрофией. В день 28 у Jg-мышей, которым вводили контрольное моноклональное антитело, наблюдалось значимое увеличение уровней циркулирующих ALT и AST по сравнению с Jg-мышами, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, или nonTg-мышами, которым вводили контрольное моноклональное антитело (фигура 14F). Важно отметить, что улучшенный профиль ферментов печени был ассоциирован с благоприятными эффектами в отношении веса печени и стеатоза печени (фигура 14G). В частности, образцы печени от мышей с липодистрофией, получавших контрольное моноклональное антитело, были значимо более тяжелыми, чем образцы печени от nonTg-мышей, получавших контрольное моноклональное антитело, при этом их вес составлял 3,6±0,7 г (фигура 14G). В образцах печени от Tg-мышей, получавших контрольное моноклональное антитело, также было более высокое содержание триглицеридов по сравнению с nonJg-мышами, получавшими контрольное моноклональное антитело, и с мышами с липодистрофией, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2 (фигура 14G). Примечательно, что образцы печени от Tg-мышей, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2, были только на 0,6±0,1 г тяжелее, и у них не наблюдали увеличения содержания триглицеридов в образцах печени по сравнению с образцами печени от nonTg-мышей, получавших контрольное моноклональное антитело (фигура 14G). Улучшения в отношении стеатоза печени, обеспечиваемые Н4Н17319Р2, также были очевидными на срезах печени, окрашенных гематоксилином и эозином (фигура 14G).

Пример 17. H4H17319P2 активирует опосредованную STAT3 передачу сигнала в гипоталамусе

[0268] Активация LEPR в Arc гипоталамуса играет ключевую роль в управлении энергетическим и метаболическим балансом (Coppari et al., 2005; Cowley et al., 2001). Поскольку H4H17319P2 обеспечивает облегчение гиперфагии и метаболических осложнений у мышей Lepr^hu/hu с липодистрофией, дополнительно исследовали, индуцирует ли Н4Н17319Р2 активацию STAT3 в Arc подобно лептину. Иммунологическое окрашивание на pSTAT3 Y705 проводили на сопоставимых срезах головного мозга, полученных от самцов Jg-мышей с липодистрофией, которые получали однократную дозу контроля или Н4Н17319Р2 в количестве 10 мг/кг (SC) или непрерывную инфузию лептина человека при дозе 30 мкг/сутки (SC) в течение 3 дней. Данная доза лептина была выбрана, поскольку предыдущая работа показала, что доза 5 мкг/сутки (SC) являлась эффективной у мышей с липодистрофией (Shimomura et al., 1999), а максимальная эффективность у мышей наблюдалась при дозе в диапазоне 10-42 мкг/сутки (SC) (Denroche et al., 2013; Halaas et al., 1997; Harris et al., 1998). Эти анализы показали, что несколько клеток в Arc проявляют окрашивание pSTAT3 Y705 у мышей с липодистрофией, которые получали контрольное моноклональное антитело. Напротив, и лептин, и Н4Н17319Р2 индуцируют pSTAT3 Y705 в Arc, при этом обнаруживается сходное число клеток pSTAT3 Y705⁺ (фигура 17А). Хотя первоначально основное внимание уделялось Arc из-за его установленной роли в опосредовании действий лептина и его проксимального расположения к срединному возвышению, циркумвентрикулярному органу, у которого отсутствует гематоэнцефалический барьер, было отмечено, что и лептин, и Н4Н17319Р2 индуцируют pSTAT3 Y705 в Vmh. Однако Н4Н17319Р2 индуцировал окрашивание pSTAT3 в большем числе клеток Vmh, чем обнаружено при обработке лептином (фигура 17А). Таким образом, эти данные показывают, что лептин и Н4Н17319Р2 индуцируют pSTAT3 Y705 в сходном числе клеток в Arc, в то время как Н4Н17319Р2 оказывает более выраженный эффект в Vmh.

[0269] Недостатком моноклональных антител в качестве терапевтических средств для ЦНС является их ограниченная способность преодолевать гематоэнцефалический барьер, при этом ~ 0,1% от концентраций циркулирующих антител обнаруживается в спинномозговой жидкости (CSF) (Zuchero et al., 2016). Несмотря на это ограничение, в данном документе определено, что Н4Н17319Р2 не только индуцирует фосфорилирование STAT3 в Arc гипоталамуса, но также стимулирует опосредованную STAT3 передачу сигнала в Vmh. Сообщается, что Arc омывается пористыми кровеносными сосудами, но в меньшей степени, чем смежное срединное возвышение (Ciofi et al., 2009; Norsted et al., 2008). В настоящее время в литературе отсутствуют свидетельства того, что Vmh имеет преимущество прямого воздействия молекул, переносимых с кровью. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, возможное объяснение состоит в том, что моноклональные антитела достигают Vmh путем диффузии из Arc. В качестве альтернативы, антитело Н4Н17319Р2 может проявлять свойства передачи сигнала, отличающиеся от таковых у лептина. Хотя в Vmh экспрессируются функциональные LEPR-b, другая возможность заключается в том, что моноклональное антитело Н4Н17319Р2 может косвенно стимулировать опосредованную STAT3 передачу сигнала в Vmh. Тем не менее, неожиданным является то, что Н4Н17319Р2 индуцирует опосредованную STAT3 передачу сигнала в большем количестве нейронов в Vmh, чем лептин.

Пример 18. Н4Н17319Р2 по меньшей мере так же эффективен, как лептин, в облегчении нарушения метаболизма и дисфункции печени у мышей с липодистрофией

[0270] Поскольку Н4Н17319Р2 задействует опосредованную STAT3 передачу сигнала в клетках Arc и Vmh так же, как лептин, или лучше, эффективность обработки с помощью Н4Н17319Р2 и лептина сравнивали на мышах с липодистрофией. Самцы Jg-мышей получали один раз в неделю дозу контрольного моноклонального антитела или агониста LEPR в количестве 10 мг/кг (SC) или непрерывную инфузию лептина при дозе 30 мкг/сутки (SC) в течение 14 дней. Для обеспечения эталона, самцы nonTg-мышей получали один раз в неделю дозу контрольного моноклонального антитела в количестве 10 мг/кг (SC). Перед обработкой в день 0 Tg-мыши характеризовались наличием выраженной гипергликемии (фигура 17В). Уровни глюкозы в крови снижались в одинаковой степени при введении Н4Н17319Р2 или лептина по сравнению с введением контрольного моноклонального антитела (фигура 17В). Уровни глюкозы в крови снижались через 2 дня после начала обработки с помощью Н4Н17319Р2 или лептином и оставались сниженными до конца исследования (фигура 17В). Чтобы проверить, влияет ли улучшенная чувствительность к инсулину на обеспечение эффекта снижения уровня глюкозы, в день 9 провели тесты на толерантность к инсулину. Действительно, тестирование толерантности к инсулину показало, что Tg-мыши, которым вводили контрольное моноклональное антитело, были инсулинорезистентными, тогда как Tg-мыши, которых обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2 и лептина, были чувствительными к инсулину (фигура 17В). Не наблюдалось различий между обработкой с помощью Н4Н17319Р2 и лептина в отношении снижения уровня глюкозы в крови или чувствительности к инсулину.

[0271] В соответствии с предыдущими данными, Н4Н17319Р2 способствовал значимой потере веса тела по сравнению с введением контрольного моноклонального антитела мышам с липодистрофией, начиная со дня 4 после обработки (фигура 17С). У Tg-мышей Н4Н17319Р2 обеспечивало уменьшение совокупного потребления пищи по сравнению с таковым в случае контрольного моноклонального антитела (фигура 17С). Интересно, что в то время как лептин снижал вес тела и потребление пищи у Tg-мышей, это приводило к меньшей потере веса тела, чем наблюдалось при обработке с помощью Н4Н17319Р2 (фигура 17С).

[0272] Н4Н17319Р2 обеспечивает лучшее преимущество по сравнению с лептином в отношении снижения уровня липидов в плазме крови и устранения гепатомегалии у мышей с липодистрофией. Химические анализы плазмы крови в день 13 показали, что у Tg-мышей Н4Н17319Р2, но не лептин, снижает уровни триглицеридов и холестерина в плазме крови по сравнению с таковыми в случае контрольного моноклонального антитела (фигура 17D). Никаких значимых изменений в уровнях других липидов не было обнаружено при обработке с помощью Н4Н17319Р2 по сравнению с таковыми при введении контрольного моноклонального антитела Tg-мышам. Н4Н17319Р2 также обеспечивал снижение массы печени и устранение стеатоза печени по сравнению с обработкой контрольным антителом у Tg-мышей (фигура 17Е). Хотя эти эффекты являлись сходными с таковыми у мышей, которых обрабатывали с помощью лептина, большее снижение массы печени наблюдалось при применении Н4Н17319Р2 (фигура 17Е). Масса печени нормализовалась при обработке с помощью Н4Н17319Р2, но не лептина, и была сходной с массой печени у nonTg-мышей, которые получали контрольное моноклональное антитело (фигура 17Е).

Пример 19. H4H17319P2 обеспечивает снижение веса тела и тучности у худых мышей, а также обезьян с нормальным и высоким содержанием жира в организме

[0273] Эксперименты по связыванию и функциональному анализу in vitro демонстрируют, что Н4Н17319Р2 не конкурирует за связывание с лептином и в присутствии лептина вызывает большую активацию LEPR, чем лептин отдельно. Таким образом, определяли, может ли Н4Н17319Р2 обуславливать понижение веса тела при условии гомеостаза с нормальным весом тела. Получавшим корм самцам мышей Lepr^hu/hu вводили однократную дозу контрольного моноклонального антитела (10 мг/кг, SC) или Н4Н17319Р2 в количестве 3 или 10 мг/кг в день 0. Значимое уменьшение веса тела по сравнению с таковым в случае контрольного моноклонального антитела наблюдали через 1 и 2 дня после обработки с помощью Н4Н17319Р2 при обоих уровнях доз (фигура 18А). Соответственно, оба уровня доз Н4Н17319Р2 обеспечивали снижение потребления пищи по сравнению с введением контрольного моноклонального антитела (фигура 18А). Изменения веса тела были ассоциированы со снижением жировой массы, но не безжировой массы (фигура 18В). При обоих уровнях доз обработка с помощью Н4Н17319Р2 обуславливала снижение жировой массы на 32%, в то время как введение контрольного моноклонального антитела приводило к минимальному изменению жировой массы, составляющему -2% (фигура 18В). Следует отметить, что не наблюдалось значимых различий в отношении безжировой массы между обработкой с помощью контрольного моноклонального антитела и Н4Н17319Р2 (фигура 18В). Хотя оба уровня доз Н4Н17319Р2 приводили к сходным величинам изменения веса тела и жировой массы, продолжительность эффектов различалась, вероятно, отражая различия в фармакокинетике (фигуры 18А и 18В).

[0274] Затем оценивали эффект обработки с помощью Н4Н17319Р2 в отношении стимуляции снижения веса тела у приматов, отличных от человека. Во-первых, были определены эффекты Н4Н17319Р2 в отношении веса тела у худых яванских макак. Обезьяны получали либо контрольный раствор, либо Н4Н17319Р2 при дозе 3 мг/кг или 10 мг/кг один раз в неделю в течение 13 недель. Обработка с помощью Н4Н17319Р2 приводила к дозозависимому уменьшению веса тела по сравнению с обезьянами, которые получали контрольный раствор (фигура 18С). После 13 недель исследования обезьяны, которым вводили контрольный раствор, прибавили 9,7±0,9% от их исходного веса тела, тогда как обработка с помощью Н4Н17319Р2 в дозах 3 и 10 мг/кг привела к минимальному изменению веса тела, составляющему 0,3±1,6%, и потере веса тела, составляющей -6,0±1,6%, соответственно (фигура 18С).

[0275] Поскольку Н4Н17319Р2 обеспечивало дозозависимое снижение веса тела у худых обезьян, эффекты обработки с помощью Н4Н17319Р2 в отношении веса тела и композиционного состава тела протестировали на яванских макаках с высоким содержанием жира в организме. Животные получали контрольный раствор или агонистическое антитело к LEPR при дозе 30 мг/кг один раз в неделю в течение 2 недель. Н4Н17319Р2 обеспечивало снижение веса тела по сравнению с инъекцией контрольного раствора. В конце исследования (день 56) обезьяны, которые получили две дозы Н4Н17319Р2, показали уменьшение веса тела, составляющее 3,6±1,9% относительно исходного уровня, тогда как обезьяны, которые получали контрольный раствор, набрали 6,4±1,5% веса тела. Параллельно с этим обработка с помощью Н4Н17319Р2 обеспечивала уменьшение жировой массы, но не безжировой массы, по сравнению с введением контрольного раствора, что количественно определяли с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA) (фигура 18D). У обезьян, получавших контрольный раствор, к концу исследования наблюдалось увеличение тучности на 28,0±1,5%. Напротив, обезьяны, которых обрабатывали агонистом LEPR Н4Н17319Р2, показали заметное уменьшение тучности на 13,7±6,4% (фигура 18D). Взятые вместе, эти данные показывают, что антитело Н4Н17319Р2 способствует снижению веса тела за счет избирательной потери тучности у мышей Lepr^hu/hu с нормальным весом, а также у приматов, отличных от человека, с низким или высоким содержанием жира в организме.

Пример 20. Двойное слепое исследование с применением антител к LEPR на людях

[0276] Ожирение поражает 13% людей во всем мире и является фактором риска развития сахарного диабета типа 2, сердечно-сосудистых заболеваний, различных видов рака и ортопедических нарушений. В странах Западной Европы более 20% людей страдают ожирением (Ng et al., Lancet. 2014; 384: 766-781), а в Соединенных Штатах распространенность ожирения сейчас превышает 35% (Flegal et al., JAMA. American Medical Association. 2016; 315(21): 2284-2291). Модификации с помощью диеты и физических упражнений эффективны для некоторых лиц, но часто приводят к умеренному снижению веса тела, при этом у большинства людей ожирение остается (определяется как индекс массы тела [ИМТ] ≥30 кг/м²) или избыточный вес тела (определяется как ИМТ от 25 до <30 кг/м²).

[0277] Современные лекарственные препараты для снижения веса тела также оказывают умеренные эффекты в отношении веса тела и/или имеют низкую безопасность/переносимость, что привело к ограниченному использованию этих средств клиентами, врачами и пациентами (Zhang et al., Obes Sci Pract. 2016; 2(2): 104-114). Современные фармакотерапевтические препараты стандартной клинической практики, такие как лираглутид, орлистат, налтрексона HCl/бупропиона HCl, фентермин/топирамат и лоркасерина HCl, снижают вес тела в среднем примерно на 3-10% от исходного уровня. Как правило, потеря веса тела выходит на плато, и терапию прекращают в течение года (Sjostrom et al., Lancet. 1998; 352(9123): 167-72) (Smith et al., N. Engl. J. Med. 2010; 363(3):245-56). Бариатрическая хирургия предназначена только для пациентов с наиболее тяжелым ожирением (ИМТ≥40 кг/м² или ИМТ ≥35 кг/м² с сопутствующими заболеваниями) с <200000 случаев в год в США (Американское общество метаболической и бариатрической хирургии) и менее 150000 случаев в год во всей Европе (Angrisani et al., Obes Surg. 2017, 27:2279-2289). Существует значимая неудовлетворенная медицинская потребность в безопасных и эффективных средствах терапии для лечения и предупреждения ожирения и связанных с ожирением метаболических осложнений.

[0278] Лептин представляет собой циркулирующий гормон жировой ткани, который связывается с рецепторами лептина (LEPR) в гипоталамусе и модулирует контроль потребления пищи, расход энергии и метаболизм глюкозы/липидов (Allison et al., J Endocrinol 2014, 223(1):T25-35). У лиц с первичной недостаточностью лептина из-за крайне редких гомозиготных мутаций с потерей функции в гене лептина (LEP) или с дефектом опосредованной лептином передачи сигнала из-за гомозиготных мутаций в LEPR развивается тяжелое ожирение, сахарный диабет, предрасположенность к инфекциям и бесплодие (Montague et al., Nature 1997, 387(6636):903-908) (Clement et al., Nature 1998, 392(6674):398-401). Введение рекомбинантного лептина человека пациентам-детям и взрослым с моногенным ожирением, обусловленным мутациями, обуславливающими потерю функции лептином, приводило к значительному уменьшению веса тела и улучшению в отношении метаболических осложнений (Farooqi et al., N Engl Jo Med 1999, 341(12):879-884) (Licinio et al., Proc Nat Acad Sci 2004, 101(13):4531-4536).

[0279] Вторичная недостаточность лептина также возникает при редких нарушениях с липодистрофией, которые обусловлены генетической или приобретенной потерей лептин-продуцирующей жировой ткани в различных областях тела.

[0280] У пациентов с генерализованной и очаговой липодистрофией развивается сахарный диабет различной степени, тяжелая инсулинорезистентность, гипертриглицеридемия и жировая дистрофия печени (Brown et al., J Clin Endocrinol Metab. 2016; 101(12):4500-4511). Было показано, что рекомбинантный лептин человека, вводимый подкожно один раз в день, снижает уровень гемоглобина А1с (HbAlc), глюкозы, триглицеридов и стеатоза печени у пациентов с генерализованной липодистрофией (Oral et al., N Engl J Med. 2002; 346(8):570-578) (Ebihara et al., J Clin Endocrinol Metab 2007, 92(2):532-541). У большинства пациентов с генерализованной липодистрофией уровни лептина в сыворотке крови составляли <4 нг/мл, и анализ в подгруппах показал, что снижение уровней HbAlc и триглицеридов (TG) при лечении лептином было большим у пациентов с генерализованной и очаговой липодистрофией, когда уровни лептина составляли <4 нг/мл (Brown et al., J Clin Endocrinol Metab. 2016; 101(12):4500-4511) (Заседание Экспертной комиссии FDA, 2013 г.).

[0281] Метре лептин (рекомбинантный метиониллептин; Novelion®) в настоящее время одобрен в США в рамках программы Стратегии оценки и снижения рисков (REMS) для лечения осложнений недостаточности лептина у пациентов с генерализованной врожденной и приобретенной липодистрофией, а также одобрен в Японии для всех подтипов липодистрофии. Требуется ежедневное введение дозы метрелептина, и побочные эффекты включают риск развития иммуногенности: у -85% пациентов вырабатываются связывающие антитела, а у ~9% вырабатываются нейтрализующие антитела, перекрестно реагирующие с эндогенным лептином (Chan, Clin Endocrinol. 2016; 85(1): 137-149).

[0282] В отличие от нарушений с низким уровнем лептина или недостаточностью лептина, люди с избыточной массой тела или ожирением обычно имеют высокие уровни лептина с медианным уровнем 10 нг/мл у мужчин и 24 нг/мл у женщин для субъектов с ИМТ в диапазоне 30-35 кг/м² (Ruhl and Everhart, Am J Clin Nutr. 2001; 74(3): 295-301). Уровни циркулирующего лептина у взрослых мужчин и женщин с нормальным ИМТ 20-25 кг/м² характеризуются медианными уровнями 3 и 9 нг/мл соответственно (Ruhl et al., Am J Clin Nutr 2001; 74(3): 295-301) с указанными нормальными диапазонами от 1,2 до 9,5 нг/мл у мужчин и от 4,1 до 25 нг/мл у женщин (эталонный диапазон Quest Lab). Многочисленные исследования продемонстрировали корреляцию между уровнями циркулирующего лептина и ИМТ и процентным содержанием жира в организме (Ruhl et al., Am J Clin Nutr. 2001, 74(3):295-301) (Considine et al., N Engl J. Med. 1996, 334(5):292-295), хотя существует высокая степень вариабельности уровней лептина среди лиц со сходными ИМТ (Buettner et al., J Endocrinol. 2002; 175(3): 745-756). Уровни лептина изменяются в течение суток (Gavrila et al., J Clin Endocrinol Metab. 2003, 88(6):2838- 43) (Schoeller et al., J Clin Invest. 1997, 100(7): 1882-87) и колеблются в зависимости от пищевого статуса. Уровни лептина быстро уменьшаются на 35-60% после 24-часового голодания у людей с нормальным весом и ожирением и продолжают падать после длительного голодания (Chan et al., J Clin Invest. 2003; 111(9): 1409-1421) (Schurgin et al., 2004, J Clin Endocrinol Metab, 89(11): 5402-5409) (Boden et al., J Clin Endocrinol Metab. 1996; 81(9): 3419-3423). Уровни лептина также уменьшаются при снижении массы тела (Considine et al., N. Engl J Med, 1996; 334(5): 292-295) (Herrick et al., J Obes. Hindawi. 2016; 2016(2): 8375828-5) (van Dielen et al., J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87(4): 1708-1716) и увеличиваются при наборе веса (Ravussin et al., Cell Metab. 2014; 20(4): 565-572), совпадая с изменениями жировой массы. Введение рекомбинантного лептина человека субъектам с ожирением приводило к минимальной потере веса (снижение веса тела 3% за вычетом РВО) (Heymsfield et al., JAMA. 1999; 282(16): 1568-1575) (Hukshorn et al., J Clin Endocrinol Metab. 2000; 11(12): 1163-1172) (Ravussin et al., Obesity. 2009; 17(9): 1736-1743), вероятно, из-за насыщения опосредованной рецептором лептина передачи сигнала высокими уровнями эндогенного лептина. Несколько популяционных исследований показывают, что могут быть подгруппы пациентов с ожирением, у которых уровни лептина относительно низкие (Ruhl and Everhart, Am J Clin Nutr. 2001; 74(3): 295-301) (Buettner et al., J Endocrinol. 2002; 175(3): 745-756) и рецепторы лептина могут быть не насыщенными. Ключевой вопрос, который необходимо решить, заключается в том, снизит ли восстановление опосредованной лептином передачи сигнала аппетит, потребление пищи и вес тела у субъектов с ожирением с относительно низкими исходными уровнями лептина.

[0283] Н4Н17319Р2 представляет собой антитело к LEPR человека, которое действует в качестве агониста LEPR и связывается с LEPR человека с наномолярной аффинностью. В доклинических исследованиях Н4Н17319Р2 активирует опосредованную LEPR передачу сигнала в присутствии или в отсутствие лептина. Еженедельное введение Н4Н17319Р2 (10 мг/кг подкожно [SC]) обеспечивало улучшение в отношении гликемического контроля, чувствительности к инсулину, дислипидемии, потребления пищи, веса тела, массы печени и стеатоза печени у гуманизированных по LEPR мышей с липодистрофией. Н4Н17319Р2 также обеспечивало снижение веса тела и ожирения у гуманизированных по LEPR мышей с индуцированной недостаточностью лептина, но не обеспечивало снижение веса тела у гуманизированных по LEPR мышей с ожирением, обусловленным диетой. В токсикологическом исследовании, проведенном в соответствии с надлежащей лабораторной практикой (GLP), в котором худых яванских макак обрабатывали с помощью Н4Н17319Р2 путем подкожных инъекций (3, 10, 30 мг/кг) или внутривенно (100 мг/кг) один раз в неделю в течение 13 недель, воздействие Н4Н17319Р2 приводило к подавлению набора веса или индукции потери веса тела. Обезьяны, которым вводили Н4Н17319Р2, потеряли до 8,7% веса тела (среднее значение для группы по сравнению со значениями веса до введения дозы), в то время как контрольные животные, которым одновременно вводили плацебо, набрали в среднем 8,3% веса тела за тот же период времени. Величина наблюдаемого снижения веса тела, по-видимому, не имела четкой зависимости от дозы или воздействия у животных, обработанных с помощью Н4Н17319Р2. Наблюдали обратное изменение веса тела после прекращения воздействия в течение восстановительного периода без введения доз.

[0284] Как описано выше, введение Н4Н17319Р2 хорошо переносилось при всех уровнях доз и обоих путях введения без каких-либо неблагоприятных клинических эффектов. Временное уменьшение количества инсулина и абсолютного количества циркулирующих лимфоцитов (уменьшение числа Т-клеток) наблюдалось в течение примерно 30 дней периода обработки, но эти результаты не наблюдались в конце периода введения доз, и эффект не зависел от дозы. Понижение значений веса тимуса и уменьшение насыщенности коры тимуса клетками наблюдались в группах, получавших Н4Н17319Р2, в течение периода обработки и были полностью или частично обратимыми в ходе восстановительного периода. Изменения в тимусе и временное снижение числа Т-клеток, вероятно, связаны с уменьшением потребления пищи и уровнями снижения веса тела у обезьян, находящихся в фазе роста, и, вероятно, не будут наблюдаться у взрослых людей с нормальным пищевым статусом.

[0285] Данное исследование представляет собой впервые проводимое с участием людей (FIH) рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, состоящее из двух частей, предназначенное для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) внутривенно (IV) и подкожно (SC) вводимых доз Н4Н17319Р2 у здоровых участников. Целью части А является оценка безопасности, переносимости, PK и PD однократных возрастающих IV и SC доз у здоровых мужчин и женщин. Промежуточный анализ PK/PD, безопасности и переносимости в части А будет применяться для выбора схемы введения для оценки в части В. Субъекты, включенные в часть А, не имеют права на участие в части В. Для части В новые субъекты, которые имеют избыточную массу тела или ожирение, будут включены в исследование для оценки безопасности, переносимости, PK и PD повторных доз Н4Н17319Р2 (на уровне однократной дозы) или плацебо в течение 12 недель. Эффекты Н4Н17319Р2 в отношении биомаркеров, таких как потребление пищи, аппетит, композиционный состав тела и вес тела, будет оцениваться в 4 различных когортах, определяемых по исходным уровням лептина.

Цели

[0286] Основная цель исследования представляет собой оценку безопасности и переносимости Н4Н17319Р2 у здоровых субъектов. Вторичные цели исследования заключались в следующем.

• Охарактеризовать фармакокинетический (PK) профиль однократной и повторных доз Н4Н17319Р2.

• Оценить эффекты повторных доз Н4Н17319Р2 в отношении веса тела.

• Оценить эффекты повторных доз Н4Н17319Р2 в отношении потребления энергии ad lib у лиц с избыточной массой тела и ожирением.

• Оценить эффекты однократных и повторных доз Н4Н17319Р2 в отношении уровней растворимых форм регулирующих липиды белков (sLEPR и ANGPTL3) с течением времени.

• Оценить иммуногенность однократных и повторных доз Н4Н17319Р2.

[0287] Другие исследовательские цели данного исследования заключались в следующем.

1. Оценить эффекты однократных доз Н4Н17319Р2 в отношении веса тела и параметров, касающихся уровней глюкозы и липидов в сыворотке/плазме крови.

2. Оценить эффекты повторных доз Н4Н17319Р2 в течение 12 недель в отношении

• параметров, касающихся уровней глюкозы и липидов в сыворотке/плазме крови;

• сообщаемой пациентом оценки аппетита, которая может повлиять на пищевое поведение (например, голод, сытость и чувство насыщения);

• общей массы тела и распределения жировой и безжировой массы тела по данным двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA);

• количественной оценки SC и висцерального жира (включая жир печени) с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ);

• других исследовательских биомаркеров, включая лептин, гормоны щитовидной железы (Т3, Т4, тиреотропный гормон [TSH]), лютеинизирующий гормон (ЛГ), тестостерон, эстрадиол, кортизол и адипонектин.

Обоснование

[0288] Часть А представляет собой схему FIH с однократной возрастающей дозой, в которой не более 88 здоровых субъектов будут рандомизированы в соотношении 3:1 для получения Н4Н17319Р2 либо плацебо на 7 когорт с возрастающими однократными дозами (не более 5 IV и 2 SC) для оценки безопасности, переносимости и фармакокинетики однократной возрастающей дозы Н4Н17319Р2 с периодом последующего наблюдения 112 дней. В семи когортах с возрастающими однократными дозами будет по 8 субъектов, рандомизированных для получения Н4Н17319Р2 или плацебо (6 активных: 2 плацебо) на каждом уровне дозы. Дизайн исследования также включает 2 дополнительные необязательные когорты (16 субъектов, рандомизированных для получения Н4Н17319Р2 или плацебо (12 активных: 4 плацебо в каждой когорте). Если промежуточные анализы в когортах возрастающих доз показывают, что могут быть эффекты ковариат (например, возраста, веса тела или пола) на профили PK, необязательные когорты можно включить для сбора дополнительных данных по одной или более дозам (вплоть до максимальной дозы в этом исследовании 30 мг/кг IV) для получения более точной оценки эффектов ковариат в отношении PK.

[0289] Часть А данного исследования состоит из периода скрининга (дни с -21 по -2), предварительного визита для оценки исходного уровня (день -1), когда пациенты будут госпитализированы в клинику для 2-дневного пребывания (для субъектов, получающих IV и SC дозы, которые находятся в сигнальном блоке безопасности) или 1-дневного пребывания в клинике (для субъектов, которым вводят дозу SC), периода последующего наблюдения (со дня 3 по день 113) с визитом окончания исследования (день 113).

[0290] Оценка безопасности и переносимости является основной целью части А, и безопасность будет тщательно оцениваться на протяжении всего исследования. Ожидается, что начальная и максимальная дозы, вводимые в этом исследовании, будут в -10000 и ~20 раз ниже соответственно, чем концентрации, наблюдаемые в токсикологических исследованиях. На протяжении всего клинического исследования оценки безопасности включают жизненно важные показатели, физикальное обследование, электрокардиограммы (ЭКГ), лабораторные тесты, включая гематологические тесты/лейкограммы, и мониторинг нежелательных явлений (АЕ). Также будет оцениваться вес тела. Фармакодинамические показатели также будут собраны в этом исследовании, но не ожидается, что будут наблюдаться значимые изменения в маркерах PD в этой популяции худых/с избыточной весом тела пациентов, исходя из минимальных эффектов в отношении веса тела (<1 кг), наблюдаемых при применении метрелептина у худых индивидуумов (Heymsfield, 1999).

[0291] Фармакодинамические показатели включают вес тела, метаболические параметры (глюкоза, липиды) и ANGPTL3, потенциальный маркер, который может регулироваться лептином и/или инсулином (Muniyappa, 2017) (Nidhina Haridas, 2015). Вес тела будет тщательно оцениваться при каждом визите. В случае, если однократные дозы обработки с помощью Н4Н17319Р2 оказывают клинически значимый эффект в отношении веса тела у худых/с избыточной весом тела субъектов, время принятия решений о безопасности/повышении дозы может быть изменено и собраны дополнительные данные по безопасности (например, в ожидании оценки безопасности в день 15) до принятия решения об увеличении дозы.

[0292] Часть В представляет собой исследование повторных доз на уровне однократной дозы с 12-недельным периодом лечения для оценки безопасности, PK и эффектов Н4Н17319Р2 в отношении веса тела у субъектов с избыточным весом тела/ожирением. Несколько популяционных исследований показывают, что существуют подгруппы пациентов с ожирением, у которых уровни лептина являются относительно низкими (Ruhl, 2001) (Buettner, 2002) и рецепторы лептина могут быть не насыщенными. Ключевой вопрос, который рассматривается в части В, заключается в том, снизит ли восстановление опосредованной лептином передачи сигнала аппетит, потребление пищи и вес тела у субъектов с избыточной весом тела или ожирением с относительно низкими исходными уровнями лептина.

[0293] Поэтому в части В будут оцениваться эффекты Н4Н17319Р2 в отношении веса тела, потребления пищи, метаболических параметров и композиционного состава тела у субъектов с различными значениями веса тела и относительно низкими исходными уровнями лептина. Здоровые субъекты с избыточной массой тела или ожирением (диапазон ИМТ 25-40 кг/м²) будут включены в 4 отдельные когорты, определенные по уровню лептина во время предварительного скрининга. Будет проведено зачисление в 4 отдельные когорты, чтобы обеспечить изучение адекватного числа субъектов в диапазоне относительно низких исходных уровней лептина и диапазонов ИМТ. Разделение на когорты будет происходить при рандомизации для получения Н4Н17319Р2 либо плацебо. В каждую из 4 когорт будет включено примерно до 20 субъектов с общим размером выборки, составляющим не более 81 субъект, для части В, как определено ниже. Уровни лептина и ИМТ будут измеряться во время визита предварительного скрининга для первоначальной оценки пригодности к участию в исследовании и для 1 из 4 когорт. Зачисление в исследование будет происходить при скрининге субъектов, соответствующих критериям участия. Если число зачисленных в определенную когорту достигло максимально допустимого числа, субъект не будет иметь права на зачисление. Некоторые когорты могут быть трудными для зачисления из-за низкой распространенности ожирения с низкими уровнями лептина; спонсор может прекратить зачисление в определенную когорту.

[0294] 4 когорты в части В определены следующим образом.

• Когорта 1: субъекты мужского и женского пола с ИМТ во время предварительного скрининга от 28,0 до 40,0 кг/м² включительно с уровнем лептина натощак во время предварительного скрининга <5 нг/мл.

• Когорта 2: субъекты мужского и женского пола с ИМТ во время предварительного скрининга от 25,0 до <28 кг/м² и уровнем лептина натощак во время предварительного скрининга <5 нг/мл.

• Когорта 3: субъекты мужского пола с ИМТ во время предварительного скрининга от 28,0 до 40,0 кг/м² включительно и уровнем лептина натощак во время предварительного скрининга от 5,0 до 8,0 нг/мл включительно.

• Когорта 4: субъекты женского пола с ИМТ во время предварительного скрининга от 28,0 до 40,0 кг/м² включительно и уровнем лептина натощак во время предварительного скрининга от 5,0 до 24,0 нг/мл включительно.

[0295] Примечание: пригодность к участию в одной из вышеперечисленных когорт основана на ИМТ и уровнях лептина во время визита предварительного скрининга. Если ИМТ и/или уровни лептина не попадают в диапазоны, определенные когортами, субъект не имеет право на зачисление. Если ИМТ или уровни лептина во время предварительного скрининга являются граничными для включения в 1 или более чем 1 когорту, измерения ИМТ и лептина можно повторить один раз во время окна предварительного скрининга. Для повторных измерений будет использоваться самый низкий уровень лептина для включения в одну из когорт.Если число зачисленных в определенную когорту достигло максимально допустимого числа, субъект не будет иметь права на зачисление.

[0296] Начало части В будет инициировано промежуточным анализом доступных данных по безопасности, PK и PD из части А, чтобы выбрать подходящую дозу, частоту введения доз и способ введения (IV или SC) для части В. Субъекты, включенные в часть А, не будут иметь права участвовать в части В. План исследования части В состоит из периода предварительного скрининга (дни с -60 по -14) для оценки ИМТ и уровней лептина натощак, а также соответствия критериям включения в 1 из 4 когорт, периода скрининга (дни с -32 по -14), периода оценки исходного уровня, состоящего из (дней с -29 по -1), периода лечения (дни 1-85) и периода последующего наблюдения без лечения (дни 107-191). Субъекты будут госпитализированы на 2 дня в клинику для точной оценки аппетита и потребления пищи ad lib в течение периода оценки исходного уровня (запланировано со дня -14 по -1) и в 2 моментах времени в течение периода лечения (дни 29-30 и дни 84-85). Пребывание в клинике необходимо для точного определения количества потребляемых калорий в ходе оценки еды ad lib в контролируемой обстановке, где есть стандартизированные приемы пищи и сведение к минимуму сигналов, которые могут повлиять на потребление пищи, помимо аппетита (например, время дня, пищевое поведение других людей, размер порции и т.д.). Субъекты также будут госпитализированы для 2-дневного пребывания в клинике в день -1. В день 1 в ходе периода лечения субъекты получат первую дозу исследуемого лекарственного средства или плацебо, у них будут взяты образцы крови для серийной PK и других лабораторных измерений, и они останутся на ночь, чтобы завершить 24-часовую оценку PK в день 2.

[0297] Визиты в период лечения для взятия крови будут происходить один раз в неделю. Дозу и частоту исследуемого лекарственного средства будут определять при промежуточном анализе данных PK из части А и, возможно, каждые 4 недели или каждые 2 недели (с максимальной частотой не более одного раза в неделю).

[0298] Оценку композиционного состава тела с помощью DXA и количественную оценку жира в печени, брюшной полости и бедрах с помощью МРТ будут проводить на исходном уровне, ближе к окончанию лечения и в течение периода последующего наблюдения. После периода лечения за субъектами будут наблюдать в течение 16-недельного периода без приема лекарственного средства для оценки эффектов в отношении безопасности и PD. Оценка безопасности и переносимости повторных доз на уровне однократной дозы (исходя из безопасности и переносимости из части А) будет основной целью части В исследования. В ходе исследования оценка безопасности будет включать жизненно важные показатели, физикальное обследование, ЭКГ, лабораторные тесты, мониторинг АЕ. Также будут оцениваться антитела к лекарственным средствам. Кроме того, на протяжении всего исследования будут тщательно анализироваться вторичные цели по оценке веса тела, потребления пищи ad lib и метаболических параметров, таких как глюкоза и липиды.

[0299] Фармакодинамические показатели в части В включают анализ исходных параметров и параметров во время лечения, на которые может повлиять усиление опосредованной рецептором лептина передачи сигнала. Эти оценки PD включают сообщаемые пациентом показатели аппетита, количественные измерения потребления пищи в контролируемых условиях стационара, точные измерения композиционного состава тела и жировой массы с помощью DXA и точное измерение веса тела с применением калиброванных весов. Кроме того, метаболические параметры, такие как лептин, глюкоза, инсулин, инсулинорезистентность, оцененная по модели гомеостаза (HOMA-IR), HbAlc, липиды, будут измеряться на исходном уровне, во время и по окончании периода лечения для оценки эффектов Н4Н17319Р2 в отношении чувствительности к инсулину и метаболизма липидов. МРТ печени также будет выполняться на исходном уровне и после лечения для определения того, влияет ли Н4Н17319Р2 на стеатоз печени.

Обоснование фармакодинамических переменных и биомаркеров

Оценка потребления пищи ad libitum (только часть В)

[0300] Предполагается, что лечение с помощью Н4Н17319Р2 усилит передачу сигналов рецептора лептина в гипоталамусе и окажет воздействие на нейроны, оказывающие эффект в отношении пищевого поведения. Обработка с помощью Н4Н17319Р2 привела к значимому снижению потребления пищи и веса тела у мышей с индуцированной недостаточностью лептина. Хотя количественную оценку потребления пищи в исследованиях на яванских макаках не проводили, обработка с помощью Н4Н17319Р2 привела к возникновению значимого эффекта в отношении веса тела и жировой массы. В текущем исследовании эффекты Н4Н17319Р2 в отношении потребления пищи у субъектов с избыточной массой тела/ожирением с относительно низкими уровнями лептина будут оцениваться на исходном уровне и в 2 моментах времени во время лечения с применением строгой количественной оценки в стационаре потребления пищи ad lib, как описано ранее (Krishna, 2009) (Addy, 2008). Коротко, после воздержания от потребления пищи субъекты будут допущены в отделение для клинических испытаний, и им будет предоставлен стандартизированный завтрак, обед и ужин, чтобы установить стандартное потребление энергии на исходном уровне. После ночного воздержания от потребления пищи субъектам будет предложен завтрак, обед и ужин ad lib для количественной оценки потребления пищи/энергии. Субъекты будут потреблять все тестовые приемы пищи в специализированных помещениях, которые маскируют восприятие времени/времени суток и социальных сигналов.

[0301] Блюда с известной калорийностью будут предоставляться в порциях с 4-5-кратным избытком и будут представлены таким образом, чтобы замаскировать общее число потребляемых калорий. Субъектов попросят есть в желаемом количестве. Блюда будут взвешивать до и после оценки потребления пищи, чтобы количественно определить потребление пищи, и будут подсчитывать потребленные калории.

Оценка аппетита (только часть В)

[0302] Эффекты лептина в отношении аппетита являются центральными в механизме его действия и, следовательно, представляют собой точную

[0303] оценку прогнозируемого механизма действия Н4Н17319Р2. Индивидуумы с гиполептинемией, вызванной мутациями LEP или генерализованной липодистрофией, проявляют ненасытный аппетит, который способствует потреблению пищи и ожирению. Лечение этих лиц метре лептин ом увеличивает чувство насыщения и уменьшает потребление пищи (Farooqi, 1999) (Farooqi, 2007) (McDuffie, 2004). Эффекты Н4Н17319Р2 в отношении аппетита будут оцениваться с применением вопросников (Flint, 2000) (Dalton, 2015), которые позволяют измерять различные компоненты аппетита (например, голод, чувство насыщения), на исходном уровне и во время последующего наблюдения.

[0304] Аппетит будет оцениваться до и после стандартной калорийной нагрузки во время визитов в клинику, а дополнительный вопросник по аппетиту будет заполняться ежедневно в течение исходного периода, периода лечения и периода последующего наблюдения.

ANGPTL3

[0305] Ангиопоэтинподобный белок 3 (ANGPTL3) регулирует уровни липопротеинов, а также TG, С липопротеинов низкой плотности (LDL-C), путем ингибирования липопротеинлипазы (обзор Tikka, 2016). Уровни ANGPTL3 могут регулироваться питанием, лептином и/или инсулином (Minicocci, 2012) (Nidhina, 2015). Уровни ANGPTL3 повышены у пациентов с липодистрофией и снижаются после лечения метрелептином (Muniyappa, 2017), и снижение ANGPTL3 может опосредовать повышенный клиренс липазой липопротеинов, богатых TG. Уровни ANGPTL3 и TG также увеличиваются в модели липодистрофии у мышей и нормализуются после обработки с помощью Н4Н17319Р2. Следовательно, ANGPTL3 может быть фармакодинамическим маркером, уровень которого может уменьшаться в условиях усиления опосредованной рецептором лептина передачи сигнала. ANGPTL3 будет измеряться на исходном уровне и после лечения в нескольких моментах времени в части А и В.

Растворимый LEPR

[0306] Лептин циркулирует в кровотоке как в свободном виде, так и в связанном с sLEPR, который образуется при отделении эктодомена LEPR (Sinha, 1996) (Lammert, 2001). Растворимый LEPR может регулировать биодоступность и/или клиренс лептина (Lou, 2010). Возможно, что насыщение мишени может зависеть от насыщения sLEPR, и поэтому на вариабельность линейной и нелинейной мишень-опосредованной кинетики могут влиять уровни sLEPR. Следовательно, в частях А и В sLEPR будут измерять на исходном уровне и в различные моменты времени (соответствующие отбору образцов для определения фармакокинетики антител) в течение периода лечения.

Визуализация (только часть В)

[0307] Визуализацию с помощью DXA и МРТ будут выполнять на исходном уровне, ближе к окончанию лечения и в конце исследования, чтобы оценить изменение по сравнению с исходным уровнем общего и регионального распределения жира, SC и висцерального жира в области бедер/живота и содержания жира в печени. В пилотном исследовании на яванских макаках доклинические данные продемонстрировали, что Н4Н17319Р2 обеспечивает снижение веса тела за счет уменьшения общей жировой массы без оказания эффектов в отношении безжировой массы (по оценке DXA). В клинических исследованиях показано, что DXA является полезным количественным биомаркером общей жировой массы и регионального распределения жира. Например, у пациентов с очаговой липодистрофией наблюдались значимые различия в региональном распределении жира по данным DXA (% жира на туловище к % жира на ногах (соотношение жировой массы [FMR]) 1,78±0,53) по сравнению с нормальными субъектами (Aijluni, 2017). DXA также применяли для количественной оценки изменений в общей и региональной жировой массе в испытаниях средств для снижения массы тела, таких как агонисты GLP-1 (Jendle, 2009) и когнитивная терапия (Ponti, 2018).

[0308] Магнитно-резонансная томография (МРТ) оказалась эффективным средством измерения содержания жира в различных тканях, включая печень (Aijluni, 2017) и мышцы (Burakiewicz, 2017), путем визуализации целых органов с применением специальных импульсных режимов или с помощью спектроскопии в ограниченном объеме ткани. МРТ также показала высококонтрастные изображения для измерения объема и распределения абдоминального жира (Klopfenstein, 2012), где у пациентов с семейной липодистрофией типа 2 процент висцерального жира был в 2,5 раза больше, чем у пациентов контрольной группы (Al-Attar, 2007). Жировую фракцию в мышцах также можно оценить с помощью количественной МРТ, как показали многочисленные исследования мышечной дистрофии, где спектроскопия и импульсный режим, дающие возможность анатомической визуализации и оценки жировой фракции, продемонстрировали потенциал при оценке прогрессирования заболевания (Burakiewicz, 2017).

[0309] В текущем исследовании будет проведена МРТ брюшной полости и бедра для количественной оценки региональных изменений SC, висцерального и печеночного жира на исходном уровне и после лечения с Н4Н17319Р2.

Обоснование выбора дозы

[0310] Дозы для внутривенного и SC введения выбирали для части А на основании эффективности, безопасности и

[0311] фармакокинетических данных доклинических исследований на мышиных моделях липодистрофии и моногенного ожирения и токсикологических исследований на обезьянах. Наиболее высокая доза в этом FIH-исследовании будет составлять не более 30 мг/кг, а начальная доза будет составлять примерно 0,3 мг/кг. В токсикологическом исследовании в соответствии с GLP на яванских макаках Н4Н17319Р2 хорошо переносилось при дозе до 100 мг/кг IV еженедельно в течение 12 недель с уровнем, при котором не наблюдаются нежелательные явления (NOAEL), составляющим 100 мг/кг. Основываясь на прогнозируемом воздействии Н4Н17319Р2 в сыворотке крови людей, запланированная максимальная доза 30 мг/кг в этом FIH-исследовании имеет концентрацию в двадцать раз ниже NOAEL. Исходная начальная доза 0,3 мг/кг имеет резерв безопасности более чем в 10000 ниже максимальной дозы, испытанной в токсикологическом исследовании в соответствии с GLP, и, как ожидается, обеспечит концентрацию Н4Н17319Р2 у человека выше предела количественного определения и, следовательно, предоставит полезную информацию по PK.

[0312] Цели выбора дозы для части В включают обеспечение широкого диапазона концентраций для оценки переносимости и облегчения характеристики зависимостей «воздействие-ответ», а также выяснение фармакокинетических профилей, которые позволяют характеризовать как линейную, так и нелинейную фармакокинетику. Кроме того, выбор дозы должен гарантировать концентрацию выше и ниже предполагаемых пороговых значений маркеров PD, которые могут представлять интерес (например, насыщение sLEPR). Доза для части В будет основываться на промежуточных данных по безопасности, PK и PK/PD из части А. Выбор уровней доз, интервала введения доз и пути введения (IV или SC) будет основываться на данных по безопасности, фармакокинетике и, если доступно, PK/PD, из части А, а также из доклинических исследований на животных. Доза в части В не будет превышать доз, оцененных в части А, и введение, вероятно, будет происходить каждые 4 недели или каждые 2 недели, но не чаще, чем один раз в неделю.

[0313] В схеме введения не должны превышаться концентрации, наблюдаемые в токсикологических исследованиях.

Критерии

[0314] Вплоть до 169 субъектов (до 88 для части А и до 81 для части В) будут представлять собой целевую популяцию субъектов, включенных в исследование. Целевой популяцией будут здоровые худые или с избыточной массой тела мужчины и женщины для части А и здоровые мужчины и женщины с избыточной массой тела или ожирением с различными исходными уровнями лептина для части В.

Ключевые критерии включения

[0315] Чтобы иметь право на включение в часть А исследования, при скрининге субъект должен соответствовать следующим критериям:

1. Мужчины и женщины в возрасте от 18 до 50 лет включительно

2. Индекс массы тела (BMI) от 18,5 до <30,0 кг/м²

3. Исследователь считает, что субъект находится в хорошем состоянии и не имеет серьезных сопутствующих заболеваний на основании истории болезни, физикального обследования, лабораторных тестов безопасности, проведенных при скрининге и/или до введения начальной дозы исследуемого лекарственного средства

4. Готовность и способность соблюдать требования визитов в клинику, выполнять процедуры, связанные с исследованием, и соблюдать инструкции относительно диеты

5. Готовность соблюдать обычную диету и режим упражнений на протяжении всего исследования

6. Способность и готовность предоставить подписанное информированное согласие

[0316] Субъект должен соответствовать всем следующим критериям при скрининге (за исключением соответствия критериям BMI и уровня лептина, которые определяются в доскрининговом периоде), чтобы иметь право на включение в часть В исследования:

1. Мужчины и женщины в возрасте от 18 до 65 лет включительно

2. Наличие индекса массы тела (BMI) и уровня лептина натощак во время доскринингового визита, как определено ниже для одной из когорт. Если число зачисленных в определенную когорту достигло максимально допустимого числа, субъект не будет иметь права на зачисление.

3. Исследователь считает, что субъект не имеет серьезных сопутствующих заболеваний на основании истории болезни, физикального обследования, лабораторных тестов безопасности, проведенных при скрининге и/или до введения начальной дозы исследуемого лекарственного средства. Субъекты могут иметь в анамнезе легкую гиперлипидемию и/или легкую гипертензию, но должны получать стабильные дозы гиполипидемических или понижающих кровяное давление лекарственных препаратов в течение по меньшей мере 2 месяцев до скрининга

4. Готовность и способность соблюдать требования визитов в клинику, выполнять процедуры, связанные с исследованием, и соблюдать инструкции относительно диеты

5. Готовность соблюдать обычную диету и режим упражнений на протяжении всего исследования

6. Способность и готовность предоставить подписанное информированное согласие

Критерии исключения

[0317] Субъект, который соответствует любому из следующих критериев при скрининге, будет исключен из части А исследования.

1. Наличие в анамнезе клинически значимых сердечно-сосудистых (например, гипертензии, инфаркта миокарда, инсульта, заболеваний периферических сосудов, сердечной недостаточности, форм аритмии в анамнезе), респираторных, печеночных, почечных, желудочно-кишечных, эндокринных (например, гиперлипидемии), гематологических или неврологических заболеваний.

2. Наличие в анамнезе сахарного диабета типа 1 или 2 или преддиабета, или уровня глюкозы в крови натощак (FBG) при скрининге >100 мг/дл, или HbAlc при скрининге >5,7%.

3. LDL-C≥130 мг/дл, TG>250 мг/дл натощак.

4. Клинически значимые аномалии в общем анализе крови, клинико-биохимическом анализе, анализе мочи или скрининговом тесте на наркотики в моче при скрининге. Допускаются незначительные отклонения в результатах лабораторных исследований. ПРИМЕЧАНИЕ: лабораторные исследования с любыми аномальными результатами (например, уровень креатинфосфокиназы (CPK) в пределах 3-кратного верхнего предела нормы (ULN) с подозреваемой обусловленностью тяжелыми физическими нагрузками) можно повторить один раз в течение периода скрининга.

[0318] Субъект, который соответствует любому из следующих критериев при скрининге, будет исключен из части В исследования.

1. Наличие в анамнезе клинически значимых сердечно-сосудистых (например, от умеренных до тяжелых гипертензии, инфаркта миокарда, инсульта, заболеваний периферических сосудов, сердечной недостаточности, форм аритмии в анамнезе), респираторных, печеночных, почечных, желудочно-кишечных, эндокринных (например, гиперлипидемии), гематологических или неврологических заболеваний.

2. Наличие в анамнезе сахарного диабета типа 1 или 2, или FBG при скрининге > 126 мг/дл, или HbAlc при скрининге > 6,5%. Допускается диагноз «преддиабет».

3. LDL-C>160 или TG>500 мг/дл натощак

4. Клинически значимые аномалии в общем анализе крови, клинико-биохимическом анализе, анализе мочи или скрининговом тесте на наркотики в моче при скрининге, за исключением незначительных аномалий уровней липидов или гликемии, как описано выше. Допускаются незначительные отклонения в результатах лабораторных исследований. ПРИМЕЧАНИЕ: лабораторные исследования с любыми аномальными результатами (например, CPK в пределах 3-кратного ULN с подозреваемой обусловленностью тяжелыми физическими нагрузками) можно повторить один раз в течение периода скрининга.

5. Ограничительные пищевые привычки (например, вегетарианцы или веганы), отвращение к определенным категориям продуктов, используемым при оценке потребления пищи, или пищевое поведение, которое может воспрепятствовать интерпретации потребления пищи, аппетита или оценок контроля питания или затруднить ее.

[0319] Субъект, который соответствует любому из следующих критериев при скрининге, будет исключен из части А и части В исследования.

1. Госпитализация (т.е. > 24 часов) по любой причине в течение 60 дней с момента скринингового визита

2. Субъект имеет какие-либо результаты физикального обследования и/или историю болезни, которая, по мнению исследователя, может искажать результаты исследования или представлять дополнительный риск для субъекта при его участии в исследовании.

3. Наличие в анамнезе гипоталамической аменореи или липодистрофии.

4. Изменение веса тела более чем на 5% за последние 3 месяца до скрининга.

5. Ранее перенесенные бариатрические процедуры по поводу ожирения (например, рукавная гастрэктомия, обходной желудочный анастомоз, бандажирование и т.д.).

6. Процедуры по снижению веса (например, липосакция) или коррекции фигуры за последние 6 месяцев.

7. Лечение лекарственными препаратами (безрецептурными [ОТС] или рецептурными) для снижения веса тела (например, такими как лорказерин, фентермин/топирамат, налтрексон-HCl/бупропион-HCl, лираглутид) в течение последних 3 месяцев.

8. Наличие в анамнезе серьезных психических расстройств, расстройств пищевого поведения (например, булимии, анорексии).

9. Нынешний курильщик сигарет или бывший курильщик (сигарет или электронных сигарет), бросивший курить в течение 3 месяцев до скрининга.

10. Рекреационное употребление наркотиков (включая марихуану) или злоупотребление алкоголем (>2 порций в день) в анамнезе в течение года до скринингового визита.

11. Наличие в анамнезе инфекции гепатита В или положительный результат теста на поверхностный антиген вируса гепатита В (HbsAg+) при скрининге.

12. Наличие в анамнезе ВИЧ-инфекции или ВИЧ-серопозитивный статус при скрининговом визите.

13. Наличие в анамнезе инфекции гепатита С или положительный результат теста на антитела к вирусу гепатита С при скрининге.

14. Любое злокачественное новообразование в течение последних 10 лет, за исключением базальноклеточных или плоскоклеточных эпителиальных карцином кожи или карциномы in situ шейки матки или заднего прохода, которые были удалены без свидетельств метастатического заболевания в течение 3 лет.

15. Наличие в анамнезе активного или латентного туберкулеза (ТВ). ПРИМЕЧАНИЕ: латентный ТВ в анамнезе определяется либо как положительный результат туберкулиновой кожной пробы (TST; определяется как уплотнение кожи > 5 мм, независимо от вакцинации бациллой Кальмета-Герена (BCG) или другой вакцинации в анамнезе), либо как положительный (не неопределенный) результат теста (QuantiFERON® ТВ Gold.

16. Для части А: показания кровяного давления в положении сидя или лежа на спине при по меньшей мере 2 измерениях (>140/90 или <90/60) и частота пульса в состоянии покоя (<45 или >125) или с ортостатическими изменениями (падение систолического давления на >20 мм рт. ст.и/или диастолического на >10 мм рт. ст.) при скрининговом визите и визите для оценки исходного уровня. Для части В: показания кровяного давления в положении сидя или лежа на спине при по меньшей мере 2 измерениях (>150/90 или <90/50) и частота пульса в состоянии покоя (<45 или >125) или с ортостатическими изменениями (падение систолического давления на >20 мм рт. ст. и/или диастолического на >10 мм рт. ст.) при скрининговом визите. Если показания кровяного давления повышены, сбор показаний кровяного давления можно повторить или субъектов можно подвергнуть однократному повторному скринингу.

17. У субъекта расчетная скорость клубочковой фильтрации (при использовании уравнения MDRD) при скрининге составляет < 60 мл/мин/1,73 м².

18. Клинически значимые патологические результаты ЭКГ или аномальные интервалы, подтвержденные по меньшей мере 2 определениями (QTcF>450 мс для мужчин и >470 мс для женщин; PR<120 мс или >220 мс; QRS>100 мс).

19. Повышенная чувствительность к доксициклину (или лекарственным средствам класса тетрациклинов) или другим компонентам состава.

20. Наличие в анамнезе острой гиперчувствительности и/или анафилаксии в отношении белковых терапевтических средств.

21. Наличие в анамнезе тяжелых аллергических реакций (включая реакции на латекс или анафилактические реакции или аллергические реакции), которые, по мнению исследователя, могут представлять значительный риск для субъекта.

22. Участие в любом клиническом исследовании по оценке другого исследуемого лекарственного средства (включая биологические препараты) или терапии в течение 90 дней или по меньшей мере 5 периодов полужизни (в зависимости от того, что дольше) исследуемого биологического лекарственного средства, или по меньшей мере 4 недель для других исследуемых препаратов, или 6 месяцев для иммунотерапии до скринингового визита.

23. Беременные или кормящие женщины.

24. Женщины детородного возраста*, которые не желают применять высокоэффективную контрацепцию до введения начальной дозы/начала первого лечения, во время исследования и в течение по меньшей мере 4 месяцев после приема последней дозы. К высокоэффективным противозачаточным средствам относятся:

a. стабильное применение комбинированных (содержащих эстроген и прогестоген) гормональных контрацептивов (пероральных, интравагинальных, трансдермальных) или гормональных контрацептивов, содержащих только прогестогены (пероральных, инъекционных, имплантируемых), ассоциированное с подавлением овуляции, начатое за 2 или более менструальных цикла до скрининга;

b. внутриматочная спираль (IUD); внутриматочная гормоновыделяющая система (IUS);

c. двусторонняя перевязка маточных труб;

d. вазэктомия у партнера;

e. и/или половое воздержание

[0320] *У женщин в постменопаузе должна быть аменорея в течение по меньшей мере 12 месяцев, чтобы они не считались обладающими детородным потенциалом. Женщинам с документально подтвержденной гистерэктомией или перевязкой маточных труб не требуются тестирование на беременность и противозачаточные средства.

[0321] Половое воздержание считается высокоэффективным способом только в том случае, если оно определяется как воздержание от гетеросексуальных контактов в течение всего периода риска, ассоциированного с исследуемым лечением.

[0322] Периодическое воздержание (календарный, симптотермальный, постовуляционный способы), прерванный половой акт (coitus interruptus), использование только спермицидов и способ лактационной аменореи (LAM) не являются приемлемыми способами контрацепции. Женский презерватив и мужской презерватив нельзя применять вместе.

25. Сексуально активные мужчины, которые не желают применять следующие формы приемлемых с медицинской точки зрения средств контроля рождаемости во время периода лечения исследуемым лекарственным средством и в течение 4 месяцев после приема последней дозы исследуемого лекарственного средства: вазэктомия с медицинской оценкой успешности хирургического вмешательства ИЛИ постоянное использование презерватива. Донорство спермы запрещено во время исследования и в течение 4 месяцев после приема последней дозы исследуемого лекарственного средства.

26. Применение сопутствующих лекарственных препаратов, за исключением перечисленных среди разрешенных лекарственных препаратов или пищевых добавок.

Описание когорт исследования и повышения дозы

[0323] Планируется, что семь когорт с последовательно возрастающими дозами будут включать дозы от 0,3 мг/кг до максимальной дозы 30 мг/кг. Каждая дозовая когорта будет состоять из 8 субъектов: 6 рандомизированных для получения Н4Н17319Р2 и 2 рандомизированных для получения плацебо. В целях оптимизации безопасности 8 субъектов (6 принимающих активный препарат: 2 принимающих плацебо) в каждой из когорты 1 (0,3 мг/кг IV), когорты 2(1 мг/кг IV), когорты 3 (3 мг/кг IV), когорты 4 (300 мг SC) и когорты 5 (10 мг/кг IV) будут разделены на 2 блока. Два субъекта (1 принимающий активный препарат: 1 принимающий плацебо) будут включены в блок 1 в качестве сигнальной группы безопасности, а остальные 6 субъектов (5 принимающих активный препарат: 1 принимающий плацебо) будут включены в блок 2. Субъекты из блока 1 будут включены в исследование первыми, и им в тот же день введут дозу. Зачисление субъектов в блок 2 начнется только после того, как оба субъекта в блоке 1 благополучно завершат по меньшей мере 24-часовую оценку безопасности, данные безопасности будут рассмотрены исследователем и медицинским наблюдателем спонсора, и будет достигнута договоренность между исследователем и медицинским наблюдателем спонсора о том, что можно начать зачисление субъектов в блок 2. Всем субъектам из блока 2 можно вводить дозу в один и тот же день.

[0324] 8 субъектов (6 принимающих активный препарат: 2 принимающих плацебо) в каждой из когорты 6 (600 мг SC) и когорты 7 (30 мг/кг IV) будут разделены на 2 блока по 4 субъекта (3 принимающих активный препарат: 1 принимающий плацебо). Введение дозы в каждом блоке будет производиться в разные дни. Когорты с возрастающей дозой будут включены в исследование следующим образом.

Когорта 1: Н4Н17319Р2 при 0,3 мг/кг IV, однократная доза

Когорта 2: Н4Н17319Р2 при 1 мг/кг IV, однократная доза

Когорта 3: Н4Н17319Р2 при 3 мг/кг IV, однократная доза

Когорта 4: Н4Н17319Р2 при 300 мг SC, однократная доза

Когорта 5: Н4Н17319Р2 при 10 мг/кг IV, однократная доза

Когорта 6: Н4Н17319Р2 при 600 мг SC, однократная доза

Когорта 7: Н4Н17319Р2 при номинальной дозе 30 мг/кг IV, однократная доза

[0325] Необязательные когорты будут включены в исследование, если вариабельность РК является большей, чем ожидается, и требуются дополнительные субъекты для изучения роли конкретных ковариат, таких как возраст, вес, пол:

Когорта 8: H4H17319P2 при номинальной дозе 30 мг/кг IV, однократная доза

Когорта 9: Н4Н17319Р2 при номинальной дозе 30 мг/кг IV, однократная доза. Максимальная доза до 30 мг/кг IV была назначена когортам 8 и 9, но может вводиться более низкая доза в зависимости от появляющихся данных PK.

[0326] Повышение дозы. В состав команды по контролю безопасности/повышения дозы войдут исследователь, медицинский руководитель/руководитель исследования, специалист по медико-биологической статистике исследования и руководитель отдела управления рисками. Исследователь(исследователи) и другой персонал исследовательского центра, а также исследовательская команда спонсора, включая медицинского наблюдателя, также не будут осведомлены о назначенном лечении. У спонсора могут быть допущенные к рандомизационным кодам индивидуумы, но эти допущенные к рандомизационным кодам индивидуумы не будут частью исследовательской команды спонсора.

[0327] Повышение дозы до когорты 2 (1 мг/кг) может произойти после того, как все субъекты в предыдущей когорте завершат оценки безопасности в день 8, и обезличенные данные о безопасности будут рассмотрены на совещании команды по контролю безопасности/повышения дозы.

[0328] Повышение дозы до когорты 3 (3 мг/кг IV) и когорты 4 (300 мг SC) может произойти после того, как все субъекты в предыдущей когорте завершат оценки безопасности в день 8, и обезличенные данные о безопасности будут рассмотрены на совещании команды по контролю безопасности/повышения дозы. Введение дозы в когорте 4 может происходить параллельно с введением дозы в когорте 3.

[0329] Повышение дозы до когорты 5 (10 мг/кг IV) может произойти после того, как все субъекты в когорте 3 завершат оценки безопасности в день 8, и обезличенные данные о безопасности будут рассмотрены на совещании команды по контролю безопасности/повышения дозы.

[0330] Повышение дозы до когорты 6 (600 мг SC) может происходить параллельно с повышением до когорты 5, но только после того, как все субъекты в когорте 4 завершат оценки безопасности в день 8, и обезличенные данные о безопасности будут рассмотрены на совещании команды по контролю безопасности/повышения дозы.

[0331] Номинальная доза 30 мг/кг IV была назначена когорте 7, но может вводиться более низкая доза в зависимости от появляющихся данных PK. Перед повышением дозы до 30 мг/кг IV все субъекты в когорте 5 должны завершить оценки безопасности в день 8, и обезличенные данные о безопасности должны быть рассмотрены на совещании команды по контролю безопасности/повышения дозы. Сроки принятия решений о безопасности/повышении дозы могут быть изменены, и могут быть собраны дополнительные данные о безопасности, если фармакодинамические эффекты в отношении веса тела превышают ожидаемые. Например, если вес тела снижается на >3% у по меньшей мере 3 из 6 субъектов за 8 дней, период наблюдения будет продлен до дня 15, прежде чем будут приняты какие-либо решения о повышении дозы; если вес тела дополнительно снижается до >5% в течение 2 недель у по меньшей мере 3 из 6 субъектов, период наблюдения будет продлен до 4 недель, прежде чем будет принято решение о повышении дозы.

План исследования

[0332] Это рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое состоящее из 2 частей исследование фазы I в отношении безопасности, переносимости, РК и фармакодинамики (PD) однократных и повторных доз Н4Н17319Р2 у здоровых участников. В части А будут включены здоровые худые субъекты или субъекты с избыточным весом тела для оценки безопасности, переносимости, PK и PD однократных возрастающих внутривенных (IV) и подкожных (SC) доз. Промежуточная информация о PK и безопасности из части А будет использоваться для выбора уровня дозы, частоты и способа введения (IV или SC) для части В. В части В субъекты с избыточным весом тела/ожирением с индексом массы тела (BMI) 25-40 кг/м² будут включены для оценки безопасности, переносимости, PK и PD повторных доз Н4Н17319Р2 в 4 различных когортах, определяемых исходными уровнями лептина.

[0333] В части А до 88 субъектов будут рандомизированы в 7 когорт с последовательно возрастающими однократными дозами (до 5 IV и 2 SC) (когорты 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) и 2 необязательные когорты с однократными дозами (когорты 8 и 9). В 7 последовательных когортах с однократной дозой будет по 8 субъектов, рандомизированных для получения Н4Н17319Р2 или плацебо (6 принимающих активный препарат: 2 принимающих плацебо) на каждом уровне дозы. В 2 дополнительных необязательных когортах с однократной дозой будет до 16 субъектов, рандомизированных для получения Н4Н17319Р2 или плацебо (12 принимающих активный препарат: 4 принимающих плацебо). До 5 уровней однократной IV дозы (0,3, 1,0, 3, 10 и 30 мг/кг) и 2 SC дозы (300 и 600 мг) будут оценивать в режиме однократной возрастающей дозы. Решения о повышении доз будут основываться на анализе параметров безопасности и АЕ. Промежуточные анализы концентраций антител с течением времени, исследовательские показатели PD и, если применимо, отношения PK/PD между когортами доз также могут влиять на принятие решений о повышении дозы. Решение о включении в исследование 2 необязательных когорт на уровнях доз до максимум 30 мг/кг будет основано на промежуточном анализе вариабельности PK-профиля.

[0334] Необязательные когорты: когорты 8 и 9 будут включены в исследование, если среди субъектов наблюдается большая, чем ожидалось, вариабельность PK и необходимы дополнительные субъекты, чтобы понять эффекты конкретных ковариат в отношении PK-профилей. Могут быть включены субъекты в конкретных подгруппах в популяции, определенной критериями включения/исключения, такими как заранее заданное число мужчин, женщин, возрастные диапазоны, вес тела или конкретные точки отсечения по BMI. Номинальная доза 30 мг/кг IV была назначена когортам 8 и 9, но может вводиться более низкая доза в зависимости от появляющихся данных PK. В каждую из когорт 8 и 9 будет включено по 16 субъектов (4 из них будет назначено получение плацебо, а 12 - получение Н4Н17319Р2). Перед повышением дозы до 30 мг/кг IV все субъекты в когорте 5 должны завершить оценки безопасности в день 8, и обезличенные данные о безопасности должны быть рассмотрены на совещании команды по контролю безопасности/повышения дозы. План исследования части А состоит из периода скрининга (дни с -21 по -2), предварительного визита для оценки исходного уровня (день -1), когда пациенты поступят в клинику для пребывания с 2 ночевками (для субъектов, получающих IV, и для субъектов, получающих SC дозы, которые находятся в сигнальном блоке безопасности) или 1-дневного пребывания в клинике (для остальных субъектов, которым вводят дозу SC), периода последующего наблюдения (с дня 3 до дня 113) и визита окончания исследования (день 113). На протяжении всего исследования оценки безопасности включают жизненно важные показатели, вес тела, физикальное обследование, ЭКГ, лабораторные тесты и мониторинг АЕ, показателей РК и различных оценок PD.

[0335] В части В до 81 субъекта с BMI 25-40 кг/м² будут включены в 4 когорты (до примерно 20 на когорту), определяемые исходными уровнями лептина, и рандомизированы (3:1 или 6:1 для Н4Н17319Р2 и плацебо в зависимости от назначения в когорту) в плацебо-контролируемом двойном слепом 12-недельном исследовании повторных доз. Выбор дозы, интервала введения доз и способа введения (IV в сравнении с SC) будет основываться на данных по безопасности, PK и, если доступно, PK/PD из части А. Будут использоваться PK-профили Н4Н17319Р2 из части А для прогнозирования концентраций в сыворотке крови после повторного введения.

[0336] Исследование состоит из доскринингового периода (дни с -60 по -14), скринингового периода (дни с -32 по -14), периода оценки исходного уровня (дни с -29 по -1) для получения исходных измерений веса тела, композиционного состава тела по данным DXA и MRI, а также пребывания в клинике для сбора исходных измерений уровня лептина натощак, веса тела, оценок аппетита и оценок потребления пищи ad lib. Субъекты будут поступать в клинику для 2-дневного пребывания в клинике в день -1. В день 1 субъекты получат первую дозу исследуемого лекарственного средства или плацебо, у них будет проведен серийный забор крови для измерений фармакокинетических показателей, и они останутся на ночь для 24-часового отбора образцов для РК в день 2, когда они будут выписаны. Исследуемое лекарственное средство можно вводить каждые 4 недели или каждые 2 недели, но будут вводить не чаще, чем один раз в неделю в течение периода лечения (частота введения дозы будет определена при промежуточном анализе данных PK из части А).

[0337] Визиты в ходе периода лечения будут происходить не реже чем каждую неделю для сбора точных и повторных измерений веса тела и метаболических параметров сыворотки крови (уровней глюкозы, инсулина, HOMA-IR, липидов). Оценки аппетита и потребления пищи ad lib в период последующего наблюдения будут проводиться во время пребывания в клинике в неделю 4 и в конце периода лечения (12 недель). Субъекты также будут заполнять ежедневный вопросник по аппетиту во время периода оценки исходного уровня, лечения и последующего наблюдения. Оценки DXA- и MRI-визуализации также будут выполнены в период последующего наблюдения. После периода лечения за субъектами будут наблюдать в течение 16-не дельно го периода без приема лекарственного средства. В ходе исследования оценка безопасности будет включать жизненно важные показатели, физикальное обследование, ЭКГ, лабораторные тесты и мониторинг АЕ. На протяжении всего исследования также будут измерять концентрацию лекарственного средства, маркеры взаимодействия с мишенью (sLEPR) и исследовательские биомаркеры.

Продолжительность исследования

[0338] Продолжительность части А исследования для субъекта составляет примерно 19 недель, включая скрининговый период. Продолжительность части В исследования для субъекта составляет примерно 35 недель, включая доскрининговый период/скрининговый период/период оценки исходного уровня. Окончанием исследования считается последний визит последнего субъекта в части В.

Доза/путь/график введения средства(средств) лечения

[0339] Н4Н17319Р2 будет поставляться в виде лиофилизированного порошка в стерильном одноразовом стеклянном флаконе на 20 мл для IV или SC введения. Соответствующее плацебо для Н4Н17319Р2 получают в том же составе без добавления белка. Для части А однократные дозы будут вводить IV и SC. Для части В выбор дозы, интервала введения доз и способа введения (IV или SC) будет производиться на основании данных по безопасности, PK и, если доступно, PK/PD из части А.

Процедуры и оценки

[0340] Безопасность будет оцениваться путем мониторинга/оценки ТЕАЕ, жизненно важных показателей, физикального обследования, электрокардиограммы (ЭКГ) и лабораторных тестов. Для оценки фармакокинетики будут собираться образцы как в частой, так и в разреженной выборке для измерения концентрации Н4Н17319Р2 в сыворотке крови в заранее определенные моменты времени. Фармакодинамика будет оцениваться путем измерения веса тела и окружности талии, оценки потребления пищи и аппетита, а также композиционного состава тела с помощью DXA и MRI.

[0341] Основные критерии оценки эффективности

1. Число нежелательных явлений, возникших в ходе лечения (ТЕАЕ) [Временные рамки: неделя 12 (конец периода лечения)]

[0342] Вторичные критерии оценки эффективности

1. Концентрации Н4Н17319Р2 в сыворотке крови с течением времени [Временные рамки: до недели 27 (окончание исследования)]

2. Процентное изменение веса тела у субъектов с избыточным весом тела или ожирением [Временные рамки: от исходного уровня до недели 12]

3. Абсолютное изменение веса тела у субъектов с избыточным весом тела или ожирением [Временные рамки: от исходного уровня до недели 12]

4. Изменение потребления калорий по сравнению с исходным уровнем в ответ на стандартизованное питание у субъектов с избыточным весом тела или ожирением [Временные рамки: от исходного уровня до недели 12]

5. Изменение уровней регулирующего липиды белка с течением времени после однократных доз Н4Н17319Р2 [Временные рамки: до недели 16]

6. Изменение уровней регулирующего липиды белка с течением времени после повторных доз Н4Н17319Р2 [Временные рамки: до недели 27]

7. Частота появления антител к лекарственному средству Н4Н17319Р2 с течением времени после однократных доз Н4Н17319Р2 [Временные рамки: до недели 16]

8. Частота появления антител к лекарственному средству Н4Н17319Р2 с течением времени после повторных доз Н4Н17319Р2 [Временные рамки: до недели 27]

Фармакокинетические переменные

[0343] Помимо времени, будут измеряться концентрации общего Н4Н17319Р2. Фармакокинетические параметры могут включать, без ограничения, следующее:

• AUC_last - площадь под кривой (AUC), рассчитанная с нулевого момента времени до момента последней положительной концентрации

• AUC_0-τ - AUC, вычисленная для интервала введения доз длиной т

• C_max - пиковая концентрация

• t_max - время до C_max

• CL - клиренс

• C_trough - минимальная концентрация

[0344] Обратите внимание, что для части В выбор этих (и других) параметров зависит от выбранного окончательного графика отбора образцов, а также от полученных в результате данных.

Переменные антител к лекарственному средству

[0345] Переменные антител к лекарственному средству (ADA) включают ответ с образованием ADA и их титр следующим образом:

• Возникший в ходе лечения ответ, определяемый как любой положительный ответ в анализе ADA после введения дозы, если результаты на исходном уровне являются отрицательными

• Стимулируемый лечением ответ с образованием ADA, определяемый как любой положительный ответ в анализе ADA после введения дозы, который в 9 или более раз превышает исходные уровни титра, если исходный уровень является положительным в анализе ADA

• Значения титра

• Категория титра

- Низкий (титр < 1000)

- Умеренный (1000 ≤ титр ≤ 10000)

- Высокий (титр > 10000)

Фармакодинамические и другие биомаркерные переменные

[0346] Фармакодинамические и биомаркерные переменные представляют собой: вес тела, оценки потребления пищи ad lib, оценки аппетита, гликемические параметры сыворотки/плазмы крови (например, уровень глюкозы, инсулина, HbAlc натощак) и липидные параметры (например, уровень общего холестерина, TG, LDL-C, HDL-C), измерения с помощью DXA жировой и безжировой массы в целом и по локализации в теле, количественную оценку с помощью MRI регионального SC и висцерального жира, уровни ANGPTL3, лептина и sLEPR. Дополнительные исследовательские биомаркеры будут включать эффекты Н4Н17319Р2 в отношении гормонов щитовидной железы (Т3, Т4, TSH), лютеинизирующего гормона (LH), тестостерона, эстрадиола, кортизола и адипонектина.

Процедуры оценки эффективности

[0347] Вес тела будут оценивать во время скрининга и на протяжении всего исследования во время назначенных визитов в рамках исследования. Вес тела будут оценивать в трех повторностях с применением высокоточных калиброванных цифровых весов до того, как будут выполнены другие оценки в рамках исследования. Перед оценкой веса тела субъекты должны опорожнить мочевой пузырь (до пустого мочевого пузыря). Во время оценок веса тела субъекты должны быть в нижнем белье и без обуви. Значения веса тела будет записаны с точностью до 0,1 кг.

[0348] Все антропометрические измерения следует проводить в трех повторностях, при этом окончательное указанное значение является средним. Толщину кожной складки трехглавой мышцы, подлопаточной области, надподвздошной области и бедра следует измерять с правой стороны тела на участках сухой, неповрежденной кожи, за исключением случаев, когда деформация или отсутствие конечности требуют иного. Для измерения окружности талии субъекту дают указание стоять прямо и расслабленно, держа руки по бокам и направленные вперед ноги вместе. Гребень подвздошной кости и нижние края ребер идентифицируют при пальпации, а кожу, покрывающую эти области, отмечают ручкой. Затем с помощью рулетки определяют срединную точку между этими отметинами на коже и отмечают ручкой. Затем измеряют окружность талии на срединной отметке с помощью рулетки в конце легкого выдоха. Рост измеряют в полностью выпрямленном положении стоя в конце вдоха с помощью калиброванного ростомера и записывают с точностью до 0,1 см. Для части В и необязательных когорт в части А рост будет измеряться как разовое измерение во время доскринингового или скринингового визита соответственно. Индекс массы тела будет рассчитан как среднее значение массы (в килограммах), разделенное на квадрат роста (в метрах). В части А (за исключением необязательных когорт) для расчета должно использоваться среднее значение роста. В части В и необязательных когортах в части А для расчета BMI используются значения роста (разовое измерение в доскрининговый период или при скрининге соответственно) и веса (среднее для 3 определений) при каждом визите.

[0349] Будет оцениваться потребление пищи ad libitum. Субъекты будут исключены при скрининге, если они имеют аномальное пищевое поведение или отвращение к пище, используемой при оценке потребления пищи. Потребление энергии (завтрак + обед + ужин) с применением оценки потребления пищи ad lib будет количественно определено в части В на исходном уровне, после 4 недель лечения и в конце периода лечения (12 недель). Субъектов попросят избегать физических нагрузок и употребления алкоголя за 1 день до визитов в клинику, когда будут проводиться оценки питания.

[0350] Пациенты будут поступать в клинику натощак, прибывая в клинику утром. В ходе оценок потребления пищи в стационаре в течение 4-недельного периода лечения субъекты будут получать назначенное им лечение (исследуемое лекарственное средство или плацебо). Затем им будет предоставлен стандартизированный завтрак, обед и ужин с фиксированным содержанием калорий и питательных макроэлементов, а затем они будут голодать в течение ночи. На следующий день им будет предоставлен завтрак ad lib, обед ad lib и ужин ad lib. Во время тестового приема пищи ad lib субъектам будет предоставлено количество пищи, значительно превышающее (в 4-5 раз) типичную порцию. Блюда будут разработаны диетологом с учетом стандартизированного содержания питательных макроэлементов и известной калорийности. Все блюда и предметы сервировки будут незаметно взвешиваться с применением специальных калиброванных весов до тестовых приемов пищи и после тестовых приемов пищи, чтобы оценить количество потребляемой пищи с точностью до 0,1 г. Субъекты будут принимать всю пищу в личных специализированных комнатах, в которых нет часов, радиоприемников, мобильных телефонов и телевизоров, чтобы исключить временные или социальные сигналы, которые могут повлиять на потребление пищи. Блюда будут представлены таким образом, чтобы скрыть количество потребляемой пищи, чтобы на прием пищи не влияли визуальные/социальные сигналы переедания, такие как количество доступной пищи. Субъектов попросят есть так много или так мало, как они захотят, и на время тестового приема пищи их не будут беспокоить, и им будет запрещено заниматься такими видами досуга, как чтение, прослушивание музыки, разговор по телефону или просмотр видеозаписей. Субъектам будет разрешено покинуть комнату для тестового приема пищи, когда они будут достаточно насыщены, и если они не сделали этого через 1 час, прием пищи будет прекращен персоналом исследования. Оценка аппетита в клинике и ежедневный вопросник по аппетиту (только часть В)

[0351] Аппетит в клинике будут оценивать с помощью перечня вопросов (Flint, 2000), при этом субъектам дают указание записывать свой ответ согласно визуальной аналоговой шкале. Субъекты завершат оценку аппетита в клинике приблизительно за 30 минут до и после стандартизированного ужина в течение первого дня пребывания в клинике, а также будут заполнять ежедневный вопросник по аппетиту во время периода оценки исходного уровня, лечения и последующего наблюдения. Будут приняты меры к тому, чтобы субъекты исследования не делились результатами опроса с другими участниками исследования. Подробная информация о вопросах, используемых при оценке аппетита в клинике и в ежедневном вопроснике по аппетиту для части В исследования, будет описана в руководстве по исследованию, а вопросы (после окончательного утверждения) будут переданы в комитет по этике для рассмотрения до начала части В.

Композиционный состав тела по данным DXA (только часть В)

[0352] DXA широко используется в клинической денситометрии скелета всего тела. Общее время обследования является коротким (от ~ 6 до 7 минут), а дозы ионизирующего излучения минимальны и составляют ~0,1 мГр. Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия позволяет получать оценки безжировой массы тела (LBM) и композиционного состава тела, и она использовалась для измерений LBM в условиях клинических исследований. Клиническая валидность DXA для измерений LBM подтверждается лонгитюдными исследованиями, демонстрирующими значимую связь между изменениями LBM и снижением физической функции (Goodpaster, 2006). Двухэнергетическую рентгеновскую абсорбциометрию будут выполнять дважды в течение периода оценки исходного уровня, во время визита окончания лечения и в конце исследования. Что касается индивидуальной подготовки субъектов к сканированию DXA, следует прилагать усилия для поддержания соответствующей гидратации, соответствующего приема пищи, соответствующего приема кофеина, соответствующей активности (отсутствие физических нагрузок за 24 часа до сканирования), соответствующей одежды и соответствующего расположения субъекта на столе DXA для сканирования на протяжении всего исследования. Кроме того, DXA-сканирование должно проводиться в одно и то же время суток для любого данного субъекта на протяжении всего исследования.

Композиционный состав тела по данным MRI (только часть В)

[0353] Магнитно-резонансная томография используется для измерения жировой фракции печени. Рекомендуется последовательность множественного градиент-восстановленного эха, позволяющая получить аксиальные изображения для охвата всей печени. Моменты времени появления эхо-сигнала должны быть такими, чтобы в последовательные моменты времени появления эхо-сигнала (ТЕ) жир и вода чередовались в противофазе и в синфазе. Чтобы свести к минимуму артефакты движения, данные следует получать при коротких периодах задержки дыхания. Полный сбор данных займет от 3 до 5 минут. Сканирование бедер на жировую фракцию требует осторожного расположения пациента и иммобилизации с применением формованных опор из пеноматериала и локализаторов. Полный сбор данных MRI бедра может занять до 10 минут. От субъектов может потребоваться от 10 до 12 часов голодания перед утренним сканированием.

Расписание мероприятий в рамках исследования и примечания

[0354] Оценки и процедуры в рамках исследования представлены по периодам и визитам на фигурах 25, 26 и 27 со следующими примечаниями.

1. Выписка из клиники для дозовых групп с SC, не являющихся сигнальными, но в исследовательском центре есть возможность для субъекта остаться на ночь с выпиской на следующий день.

2. Выписка из клиники для группы с IV введением доз и сигнальной группы безопасности с SC введением доз.

3. В день 1 для когорт IV в части А также необходимо измерить жизненно важные показатели и осуществлять мониторинг АЕ до введения дозы, через 30 минут, в конце инфузии исследуемого лекарственного средства и через 1 час, 2 часа, 4 часа и 8 часов после инфузии. В день 1 для когорт SC в части А также следует измерить жизненно важные показатели и осуществлять мониторинг АЕ до введения дозы, через 30 минут после инъекции и через 1 час, 2 часа, 4 часа и 8 часов после инъекции. Для введения дозы в части В в день 1 также необходимо измерить жизненно важные показатели и осуществлять мониторинг АЕ до введения дозы, через 30 минут, в конце инфузии исследуемого лекарственного средства для IV доз и через 1 час, 2 часа, 4 часа и через 8 часов после инфузии или инъекции для IV или SC доз соответственно. В последующие дни введения доз также следует измерять жизненно важные показатели и осуществлять мониторинг АЕ до введения дозы, через 30 минут, в конце инфузии исследуемого лекарственного средства для IV доз и через 1 час, 2 часа и 4 часа после инфузии или инъекции для IV и SC доз соответственно. Жизненно важные показатели также включают ортостатические оценки кровяного давления во время скринингового визита (части А и В) и в день 1 (только часть А). Для ортостатических оценок кровяное давление и частоту пульса измеряют, когда субъект лежит на спине в течение примерно 10 минут, после стояния в течение примерно 1 минуты и после стояния в течение примерно 3 минут.

4. Взятие крови производят после голодания в течение по меньшей мере 8 часов. В дни введения доз только образец до введения дозы должен быть взят натощак.

5. Вес тела необходимо измерять в трех повторностях натощак, после мочеиспускания (с пустым мочевым пузырем), без обуви и только в нижнем белье с применением специальных калиброванных весов.

6. Толщина кожной складки должна быть определена в трех повторностях в следующих областях: трехглавая мышца, подлопаточная область, надподвздошная область и бедро, чтобы обеспечить надлежащее описание распределения жира в организме.

7. Сбор образцов для определения концентрации лекарственного средства, концентрации sLEPR и концентрации ANGPTL3 в день 1 будет происходить до инфузии/инъекции, после инфузии/инъекции ± 15 минут и через 1 час ± 15 минут, 2 часа ± 15 минут, 4 часа ± 15 минут, 8 часов ± 15 минут, 12 часов ± 15 минут и 24 часа ± 15 минут после инфузии/инъекции. sLEPR и ANGPTL3 можно анализировать только в том подмножестве моментов времени, когда измеряют концентрацию лекарственного средства.

8. ДНК можно собрать при любом визите.

9. Возможность остаться на ночь с выпиской на следующий день. Что касается части В, субъекты также будут поступать в клинику за день до дня 1 (в день -1) и останутся на ночь. Процедуры дня 1 (за исключением оценок, которые необходимо проводить после ночного голодания, измерения ЭКГ, РК и введения исследуемого лекарственного средства), такие как скрининг на наркотики, общий анализ мочи и тесты мочи на беременность, могут проводиться в день -1.

10. Визит в день 30 должен происходить ровно через 1 день после визита в день 29.

11. Визит в день 85 должен происходить через 1 день после визита в день 84.

12. Частота введения доз исследуемого лекарственного средства в части В будет зависеть от результатов, полученных в части А.

13. Два изображения на исходном уровне (DXA и MRI) будут получены с дня -29 по день -14. И DXA, и MRI можно проводить в один и тот же день или в разные дни; тем не менее, 1-я и 2-я DXA и 1-я и 2-я MRI должны выполняться в отдельные дни.

14. Процедуры DXA и MRI для визита 18 могут быть выполнены в течение периода до 5 дней до визита или в течение периода до 5 дней после визита 18, но DXA и MRI не должны выполняться через < 24 часа после введения дозы исследуемого лекарственного средства. Процедуры DXA и MRI для визита 24 могут быть выполнены за 7 дней до визита 24.

15. Для части В фактический график сбора образцов будет зависеть от промежуточного обзора данных РК из части А. Однако, поскольку это является повторным введением доз, после первой дозы будет выполнен отбор образцов в частой выборке, а в другие моменты времени - образцов с минимальной концентрацией препарата.

16. Оценка аппетита в клинике будет проводиться до и после стандартизированного ужина.

17. Центр будет проверять приверженность субъекта к заполнению ежедневного вопросника по аппетиту при каждом назначенном визите.

18. ЭКГ будет проводиться до введения дозы.

Безопасность

[0355] Жизненно важные показатели, включая температуру, кровяное давление, частоту пульса и частоту дыхания, будут собираться после того, как субъект находился в состоянии покоя в сидячем или лежачем положении в течение по меньшей мере 10 минут до введения дозы в моменты времени, указанные на фигурах 25-27.

[0356] Тщательный физикальное обследование будет проводиться в моменты времени, указанные на фигурах 25-27. Следует внимательно изучить и оценить любые аномалии, которые могут присутствовать, на что указывает медицинский анамнез субъекта.

[0357] Электрокардиограмму следует выполнять перед взятием крови во время визитов, требующих взятия крови. Стандартная ЭКГ в 12 отведениях будет выполняться в моменты времени, указанные на фигурах 25-27. ЭКГ в 12 отведениях следует выполнять в положении лежа на спине после того, как субъект находился в состоянии покоя по меньшей мере 10 минут. ЭКГ будет интерпретироваться исследователем на месте. Частота сердечных сокращений будет записана согласно желудочковому ритму, а также будут записаны интервалы PR, QRS, RR, QTcB и QTcF. Любую клинически значимую аномалию следует документировать как AE/SAE, если это применимо. Каждая запись ЭКГ будет проанализирована в сравнении с записью при скрининге. Полоски или отчеты ЭКГ будут храниться с первичными документами.

[0358] Будут проанализированы образцы для гематологического, биохимического анализа, общего анализа мочи, скрининга на наркотики и тестов на беременность (сыворотки крови или мочи). Подробные инструкции по сбору образцов крови можно найти в руководстве по проведению лабораторных работ, которое предоставляется в исследовательские центры. Образцы для проведения лабораторных тестов будут собираться при визитах, указанных на фигурах 25-27. Тесты включают: биохимический анализ крови: натрий, калий, хлорид, бикарбонат, кальций, глюкоза, альбумин, общий белок сыворотки крови, креатинин, азот мочевины в крови (BUN), аспартатаминотрансфераза (AST), аланинаминотрансфераза (ALT), щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа (LDH), гамма-глутамилтрансфераза (GGT), общий билирубин, общий холестерин (липопротеины низкой плотности [LDL] и липопротеины высокой плотности [HDL]), триглицериды, мочевая кислота, креатинфосфокиназа (СРК), LDL-C, HDL-C; гематология: показатели гемоглобина, гематокрита, количества эритроцитов (RBC), лейкоцитов (WBC), эритроцитарные индексы (средний корпускулярный объем [MCV], среднее количество корпускулярного гемоглобина [МСН], средняя концентрация корпускулярного гемоглобина [МСНС], распределение эритроцитов по объему [RDW]), количество тромбоцитов, лейкограмму (*для оценки субпопуляций клеток, если наблюдаются клинически значимые аномалии, может быть выполнено дополнительное тестирование с помощью проточной цитометрии), включая нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, базофилы и эозинофилы; общий анализ мочи: цвет, глюкоза, эритроциты, прозрачность, кровь, гиалиновые цилиндры и другие цилиндры, рН, билирубин, бактерии, удельный вес, лейкоцитарная эстераза, эпителиальные клетки, кетоновые тела, нитриты, кристаллы, белок, лейкоциты, дрожжевые грибки; другие лабораторные тесты: лептин, инсулин и гормоны эндокринных желез, такие как гормоны щитовидной железы (Т3, Т4, TSH), лютеинизирующий гормон (LH), тестостерон, эстрадиол, а также HbAlc будут оцениваться в частях А и В. Для части В лептин будет измеряться в сыворотке крови во время доскринингового визита для определения соответствия субъекта критериям включения в 1 из 4 когорт. Лептин также будет измеряться на протяжении всего исследования, как указано на фигурах 25-27'. Другие белки, которые будут измеряться, включают адипонектин и кортизол.

Аномальные лабораторные значения и лабораторные нежелательные явления

[0359] Все лабораторные значения должны быть проверены исследователем или уполномоченным лицом. Тесты со значимыми аномальными результатами, которые возникают после начала лечения, необходимо повторить, чтобы подтвердить природу и степень аномалии. При необходимости следует начать соответствующие дополнительные исследования. Если аномалия не устраняется или не может быть объяснена явлениями или условиями, не связанными с исследуемым лекарственным препаратом или его введением, необходимо проконсультироваться с медицинским руководителем/руководителем исследования.

[0360] Клиническая значимость аномального значения в тесте в контексте изучаемого заболевания должна быть определена исследователем.

Измерения концентрации лекарственного средства и образцы

[0361] Образцы для измерения концентрации Н4Н17319Р2 в сыворотке крови во время проведения части А будут собираться в моменты времени, указанные на фигуре 25. Формально образцы для измерения концентрации Н4Н17319Р2 в сыворотке крови во время проведения части В будут собираться в моменты времени, указанные на фигуре 27. Однако, как только график мероприятий для части В будет подтвержден на основании промежуточного анализа данных из части А, образцы для измерения Н4Н17319Р2 в сыворотке крови во время проведения части В будут собраны в совокупности (возможно) пересмотренных моментов времени. Любые неиспользованные образцы могут быть использованы для изучения исследовательских биомаркеров.

Измерения уровней антител к лекарственному средству и образцы

[0362] Образцы для оценки уровней антител к лекарственному средству для частей А и В будут собраны в моменты времени, указанные на фигурах 25 и 27. Любые неиспользованные образцы могут быть использованы для изучения исследовательских биомаркеров.

Процедуры с использованием фармакодинамических и исследовательских биомаркеров

[0363] В этом исследовании будут проведены исследовательские оценки для изучения того, как Н4Н17319Р2 может изменять аппетит, потребление пищи, вес тела и циркулирующие маркеры, такие как растворимый LEPR и ANGPTL3, а также исследовательские биомаркеры.

[0364] Растворимый LEPR присутствует в кровотоке здоровых лиц и субъектов с заболеваниями. Он представляет собой несигнальную форму рецептора лептина, которая способна связываться с лептином и может регулировать его биодоступность. Н4Н17319Р2 может связываться с sLEPR в кровотоке дозозависимым и зависимым от времени образом. Растворимый LEPR будут измерять до введения дозы во время визита в день 1 и при последующих визитах, указанных на фигурах 25 и 27. Изменение sLEPR может отражать взаимодействие с мишенью и ее насыщение после введения Н4Н17319Р2.

[0365] ANGPTL3 представляет собой эндогенный ингибитор липопротеинлипазы, который регулирует циркулирующие триглицериды. Возможно, что Н4Н17319Р2 регулирует триглицериды посредством ANGPTL3; поэтому циркулирующие концентрации ANGPTL3 будут измеряться в сыворотке крови до введения дозы и после лечения в различные моменты времени после введения дозы, чтобы зафиксировать постпрандиальные изменения. Дозозависимый эффект Н4Н17319Р2 в отношении ANGPTL3 будет исследован как в части А, так и в части В, как указано на фигурах 25-27.

[0366] Другие исследовательские биомаркеры, которые можно измерить в сыворотке или плазме крови, включают лептин, адипонектин и гормоны эндокринных желез, которые, как считается, модулируются во время снижения веса тела. Маркеры будут измеряться в соответствии с наборами биомаркеров для оценки, приведенными на фигурах 25-27.

Нежелательные реакции и нежелательные явления

[0367] Оборудование и лекарственные препараты для неотложной помощи при лечении инфузионных реакций должны быть доступны для немедленного применения. Обо всех инфузионных реакциях следует сообщать как об АЕ и оценивать их с применением соответствующих оценочных шкал. Инфузию следует прервать, если наблюдаются какие-либо из следующих АЕ: кашель, озноб/зябкость, высыпания, чесотка (зуд), крапивница (сыпь, волдыри, аллергические папулы), потоотделение (потливость), гипотензия, одышка (нехватка воздуха), рвота и гиперемия.

[0368] Реакцию(реакции) следует лечить симптоматически, и инфузию не следует начинать повторно. Если исследователи считают, что существует медицинская необходимость в лечении или прекращении инфузии, отличная от описанной выше, они должны применять клиническую оценку, чтобы обеспечить соответствующий ответ в соответствии с типичной клинической практикой.

[0369] Инфузию следует прекратить и НЕ начинать повторно, если возникнут какие-либо из следующих АЕ: анафилаксия, отек гортани/глотки, тяжелый бронхоспазм, боль в груди, эпилептические припадки, тяжелая гипотензия, другие неврологические симптомы (спутанность сознания, потеря сознания, парестезия, паралич и т.д.), любые другие симптомы или признаки, которые, по мнению исследователя, требуют прекращения IV инфузии. Следует рассмотреть возможность анафилаксии, если наблюдается следующее (Sampson, 2006): острое начало болезни (от нескольких минут до нескольких часов) с поражением кожи, слизистой ткани или и того и другого (например, генерализованная крапивница, чесотка или гиперемия, опухшие губы, язык и небный язычок) и по меньшей мере одно из следующего: нарушение дыхания (например, одышка, хрипы и бронхоспазм, стридор, снижение максимальной скорости выдоха, гипоксемия) и снижение кровяного давления или ассоциированные с ними симптомы дисфункции органов-мишеней (например, гипотония [коллапс], обморок, недержание мочи).

[0370] Оборудование и лекарственные препараты для неотложной помощи при лечении системных реакций должны быть доступны для немедленного применения. Обо всех инфузионных реакциях следует сообщать как об АЕ и оценивать их с помощью оценочных шкал в соответствии с указаниями. Острые системные реакции после инъекции исследуемого лекарственного средства (SC) следует лечить с учетом клинической оценки, чтобы определить соответствующий ответ в соответствии с типичной клинической практикой.

[0371] О местных реакциях в месте инъекции следует сообщать как об АЕ и оценивать в соответствии со Шкалой оценки токсичности для здоровых взрослых и подростков добровольцев, участвующих в клинических испытаниях профилактических вакцин, из Отраслевой инструкции Управления по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA), сентябрь 2007 г. (приведена в нормативном обязательном документе исследования)

[0372] АЕ представляет собой любое нежелательное медицинское событие у субъекта, которому вводили исследуемое лекарственное средство, которое может иметь или не иметь причинную связь с исследуемым лекарственным средством. Следовательно, АЕ представляет собой любой неблагоприятный и непредусмотренный признак (включая аномальные лабораторные показатели), симптом или заболевание, для которых наблюдается временная ассоциация с применением исследуемого лекарственного средства, независимо от того, считается ли оно связанным с исследуемым лекарственным средством или нет. АЕ также включает любое ухудшение (т.е. любое клинически значимое изменение частоты и/или интенсивности) ранее существовавшего состояния, для которого наблюдается временная ассоциация с применением исследуемого лекарственного средства.

[0373] Серьезное нежелательное явление (SAE) представляет собой любое нежелательное медицинское событие, которое при любой дозе характеризуется следующим.

• Приводит к смерти - включает все случаи смерти, даже те, которые, по всей видимости, совсем не связаны с исследуемым лекарственным средством (например, автомобильную аварию, в которой субъект является пассажиром).

• Опасно для жизни - по мнению исследователя, субъект подвергается непосредственному риску смерти в момент явления. Это не включает АЕ, которое, если бы оно произошло в более тяжелой форме, могло бы вызвать смерть.

• Требует госпитализации в стационар или продления текущей госпитализации. Госпитализация в стационар определяется как поступление в больницу или отделение неотложной помощи на срок более 24 часов. Продление текущей госпитализации определяется как пребывание в больнице, которое является более длительными, чем первоначально предполагалось в связи с явлением, или продленным из-за развития нового АЕ, как это определено исследователем или лечащим врачом.

• Приводит к стойкой или значительной инвалидности/нетрудоспособности (существенное нарушение способности выполнять нормальные жизненные функции).

• Представляет собой врожденную аномалию/врожденный порок.

• Является важным медицинским явлением - важные медицинские явления могут не представлять непосредственной угрозы для жизни или приводить к смерти или госпитализации, но могут поставить под угрозу субъекта или могут потребовать вмешательства для предотвращения одного из других серьезных исходов, перечисленных выше (например, интенсивное лечение в отделении неотложной помощи или дома при аллергическом бронхоспазме; дискразия крови или судороги, не приводящие к госпитализации; или развитие лекарственной зависимости или злоупотребления наркотиками).

[0374] В отношении этих явлений необходимо соблюдать критерии сообщения о SAE.

[0375] Нежелательное явление, представляющее особый интерес (AESI; серьезное или несерьезное) представляет собой одну из научных и медицинских проблем, связанных с препаратом или программой спонсора, для которой может быть целесообразным постоянный мониторинг и оперативное общение исследователя со спонсором. Такое явление может потребовать дополнительного исследования, чтобы охарактеризовать и понять его. В зависимости от характера явления также может быть оправдано оперативное общение спонсора испытания с другими сторонами (например, регулирующими органами).

[0376] Инфузионные реакции определяются как любые соответствующие АЕ, происходящие во время инфузии или в течение 2 часов после завершения инфузии. Обо всех инфузионных реакциях следует сообщать как об АЕ и оценивать их.

[0377] Исследователь (или уполномоченное лицо) будет регистрировать все АЕ, которые произошли с момента подписания информированного согласия до конца исследования. Аномалии лабораторных показателей, жизненно важных показателей или ЭКГ должны регистрироваться как АЕ. Обо всех SAE, независимо от оценки причинной связи с исследуемым лекарственным средством, необходимо сообщать спонсору (или уполномоченному лицу) в течение 24 часов.

[0378] Информация, недоступная на момент составления первоначального отчета, должна быть задокументирована в последующем отчете. Также могут быть запрошены подтверждающие данные, такие как соответствующие больничные или медицинские записи и отчеты о диагностических тестах. В случае, если исследователь проинформирован о SAE после того, как субъект завершит исследование, будет применяться следующее.

[0379] Часть A: SAE с началом в течение 30 дней после окончания исследования или в течение 112 дней после последнего введения исследуемого лекарственного средства, если субъект досрочно прекратил участие в исследовании - о SAE будет сообщено спонсору. Исследователь должен приложить все усилия для получения дополнительной информации о результате до тех пор, пока явление не станет считаться хроническим и/или стабильным.

[0380] Часть В: SAE с началом в течение 30 дней после окончания исследования или в течение 112 дней после последнего введения исследуемого лекарственного средства, если субъект досрочно прекратил участие в исследовании - о SAE будет сообщено спонсору. Исследователь должен приложить все усилия для получения дополнительной информации о результате до тех пор, пока явление не станет считаться хроническим и/или стабильным.

[0381] Части А и В: SAE с днем начала позднее 30 дней после окончания исследования/визита досрочного прекращения - спонсору будет сообщено только о SAE со смертельным исходом и о тех SAE, которые исследователь сочтет связанными с лекарственным средством. Исследователь должен приложить все усилия для получения дополнительной информации об исходе связанного с лекарственным средством SAE до тех пор, пока явление не станет считаться хроническим и/или стабильным.

Результаты

[0382] В начальной (часть А) части исследования с однократной возрастающей дозой пациенты были рандомизированы в соотношении 3:1 для получения Н4Н17319Р2 и плацебо в одну из 7 когорт для получения доз от 0,3 мг/кг внутривенно (IV) до 30 мг/кг IV и от 300 мг подкожно (SC) до 600 мг SC. Пятьдесят шесть пациентов получили дозу Н4Н17319Р2 или плацебо, и данные фармакокинетики (PK) и безопасности доступны за период как минимум 85 дней после введения дозы. Обзор обезличенных данных не выявил каких-либо серьезных или тяжелых нежелательных явлений при какой-либо из введенных доз, и о смерти не сообщалось. Лечение с помощью Н4Н17319Р2 или плацебо обычно хорошо переносилось при IV или SC пути введения. Прерывания или досрочного прекращения лечения не было. Головная боль была наиболее частым нежелательным явлением, возникшим в ходе лечения (ТЕАЕ), о котором сообщалось. Клинически значимых аномалий или дозозависимых отклонений от исходного уровня лабораторных параметров безопасности, жизненно важных показателей или ЭКГ не было.

Пример 21. Клиническое применение антитела к LEPR для лечения врожденной недостаточности лептина у пациента-ребенка

[0383] Вкратце, в 6-месячном возрасте у пациента проявились крайняя степень ожирения, гиперфагия, гиперинсулинемия, дислипидемия, гепатостеатоз 2 степени и низкие уровни лептина (0,55 нг/мл). У пациента была диагностирована делеция гена лептина (LEP^-/-) с помощью полимеразной цепной реакции, и диагноз был подтвержден мультиплексной амплификацией лигированных зондов в соответствии со стандартами Европейской сети гарантии качества в области медицинской генетики. Пациент начал терапию метрелептином в возрасте 24 месяцев, и в последующие 6 месяцев его вес тела снизился на 10 кг (с 37 кг до 27 кг). Затем пациент начал быстро набирать вес. Недавно у пациента возникла респираторная недостаточность, потребовавшая госпитализации, предположительно в результате крайней степени ожирения и частых инфекций. Врач провел тест на нейтрализующие антитела, измерив уровни лептина через 1 час после введения метрелептина. Лабораторные тесты показали уровни лептина <0,1 нг/мл, что подтвердило выработку у пациента нейтрализующих антител к метрелептину. Эти результаты объясняют прибавку в весе у пациента и демонстрируют, что метрелептин больше не является эффективным средством терапии для лечения этого состояния пациента.

[0384] Лечение с помощью Н4Н17319Р2 будет применяться для восстановления передачи сигнала, опосредованной LEPR, при врожденной недостаточности лептина и для обеспечения улучшения в отношении гиперфагии, набора веса и метаболических осложнений этого состояния.

Критерии включения/исключения дополнительных пациентов-детей

[0385] Пациент должен соответствовать следующим критериям, чтобы иметь право на включение в эту программу применения из соображений гуманности:

1. Врожденная недостаточность лептина с подтвержденным генетическим диагнозом наличия варианта LEP с потерей функции и/или делеции гена

2. Тяжелая форма ожирения, определяемая для взрослых как BMI≥40 кг/м² и для детей как вес > 97^го процентиля для соответствующего возраста и пола

3. Уровни лептина < 1,0 нг/мл

4. Свидетельства наличия нейтрализующих антител к метрелептину, определяемые как:

• потеря эффективности метрелептина по мнению лечащего врача с документально подтвержденными свидетельствами набора веса при терапии лептином И

• уровни лептина < 1,0 нг/мл через 1 час после инъекции лептина ИЛИ положительный результат анализа активности нейтрализующих антител, проведенный Aegerion, производителем метрелептина.

[0386] Пациенты, подходящие для продолжающегося клинического испытания по лечению врожденной недостаточности лептина, будут исключены.

Выбор дозы

[0387] Ожидается, что описанная в данном документе схема введения доз обычно хорошо переносится. Н4Н17319Р2 хорошо переносился здоровыми взрослыми добровольцами при введении в виде однократных доз от 0,3 до 30 мг/кг IV и 300 и 600 мг SC. При IV дозе 30 мг/кг наблюдалась максимальная концентрация в сыворотке крови 1035 мг/л, что почти вдвое превышает максимальное значение, которое согласно прогнозам наблюдается у пациентов-детей в ходе лечения. Кроме того, прогнозируемая площадь под кривой зависимости концентрации от времени (AUC) в течение 1-недельного интервала введения доз в равновесном состоянии, как ожидается, будет по меньшей мере в 8 раз ниже, чем AUC в равновесном состоянии в течение того же интервала введения доз (на уровне, при котором отсутствуют наблюдаемые нежелательные явления [NOAEL]), рассчитанная на основе фармакокинетической модели, полученной в результате 3 доклинических токсикологических исследований на яванских макаках.

[0388] Была выбрана насыщающая доза 5 мг/кг для внутривенного (IV) введения для того, чтобы быстро достичь концентраций Н4Н17319Р2 в сыворотке крови на уровне 100 мг/л или выше. Включение этой IV насыщающей дозы позволит немедленно оценить максимальную концентрацию (C_max) Н4Н17319Р2 в сыворотке крови. Еженедельная поддерживающая доза 250 мг Н4Н17319Р2 для подкожного (SC) введения будет поддерживать минимальные концентрации в сыворотке крови на уровне 100 мг/л или выше. Эта схема SC введения доз должна начинаться через 3 дня после введения насыщающей IV дозы для наилучшего поддержания целевых минимальных концентраций в сыворотке крови.

График лечения и оценки

[0389] Первоначальный план лечения и оценки пациентов-детей представлен в таблице 20. Рекомендации по лечению и оценке будут обновляться и сообщаться врачу(врачам) по мере появления данных PK и PD. Плана следует придерживаться как можно точнее, и любые отклонения следует отмечать. Перед введением Н4Н17319Р2 или выполнением любых из следующих оценок необходимо получить письменное информированное согласие. После однократной IV насыщающей дозы 5 мг/кг в день 1 Н4Н17319Р2 будут вводить в виде SC дозы 250 мг по дням в режиме Q7 (еженедельно). Первая SC доза будет введена в день 4.

[0390] Н4Н17319Р2 будут вводить однократно IV в день 1 в ходе 1-часовой инфузии. Внутривенное введение Н4Н17319Р2 следует осуществлять через указанные типы инфузионных IV-насосов (Alaris, Gemini, РС-1 или аналогичные; Baxter, Flo-Gard 6201 или аналогичные; Hospira, Lifecare 5000 или аналогичные) и наборы для IV-инфузии (Baxter, код продукта 2С6571, или аналогичный; Alaris, номер продукта 2430-0500, или аналогичный; Alaris, номер продукта 11532269, или аналогичный; Hospira, номер продукта 14255-28, или аналогичный; Baxter, код продукта 2Н6480, или аналогичный; Hospira, номер продукта 12336-05, или аналогичный). Встроенный фильтр и инфузионный IV-насос должны обеспечивать точную доставку всего 1 мл/мин.

[0391] Сроки отбора образцов сыворотки крови для определения концентрации лекарственного средства Н4Н17319Р2 и антител к Н4Н17319Р2, оценок веса тела, оценок метаболических параметров и отправки образцов спонсору испытания также представлены в таблице 20. Уровни Н4Н17319Р2 у пациента и показатели его веса тела могут использоваться для обновления рекомендаций по уровню дозы и частоте введения дозы после дня 25 и для установления того, показывает ли введение Н4Н17319Р2 признаки пользы у этого пациента. Измерение концентраций антител позволит оценить, были ли выбранные дозы и схема введения доз оптимальными или требуются корректировки. Любые неиспользованные образцы сыворотки крови, собранные для оценок концентрации лекарственного средства и уровня антител к лекарственному средству (ADA), могут быть использованы для исследования неожиданных нежелательных явлений и в исследовательских целях и могут храниться до 15 лет.

[0392] Любые другие клинические параметры, связанные с заболеванием, полученные врачом в рамках обычного и стандартного ухода за пациентом, должны быть сообщены спонсору испытания в целях мониторинга безопасности. Они включают, без ограничения, жизненно важные показатели и лабораторные значения (т.е. биохимический анализ крови с ферментами печени, гематологию, метаболические параметры). Такая информация может влиять на дальнейшее введение доз пациенту, а также может помочь определить, показывает ли введение Н4Н17319Р2 признаки пользы или вреда.

[0393] В случае анафилаксии или гиперчувствительности необходимо собрать дополнительные образцы сыворотки крови в как можно более короткие сроки от момента явления. Дополнительные метки будут предоставлены в случае незапланированного сбора образцов.

[0394] В исследовательском центре должно быть доступно оборудование и лекарственные препараты для оказания неотложной помощи при лечении инфузионных реакций после IV инфузии Н4Н17319Р2 или системных реакций после инъекции Н4Н17319Р2. Острые реакции на IV-инфузию или системные реакции на инъекцию после введения Н4Н17319Р2 следует лечить с учетом клинической оценки, чтобы определить соответствующий ответ в соответствии с типичной клинической практикой. Обо всех связанных с безопасностью результатах и нежелательных явлениях, о которых становится известно лечащему врачу, следует сообщать спонсору испытания как можно скорее и строго в соответствии с любыми местными требованиями, касающимися применения исследуемых препаратов с точки зрения применения из соображений гуманности. Такие нежелательные явления включают любое неблагоприятное медицинское событие, которое приводит к смерти, представляет угрозу для жизни, требует госпитализации в стационар или продления текущей госпитализации, приводит к стойкой или значительной инвалидности/нетрудоспособности, является врожденной аномалией/врожденным дефектом или является важным медицинским явлением (таким как интенсивное лечение в отделении неотложной помощи или дома при аллергическом бронхоспазме; дискразия крови или судороги, не приводящие к госпитализации; или развитие лекарственной зависимости или злоупотребления наркотиками).

Получение Н4Н17319Р2 для дозы 5 мг/кг, вводимой с помощью пакета для IV инфузии

[0395] Объем восстановленного Н4Н17319Р2, добавляемого в пакет для IV инфузии в дозе 5 мг/кг, указан ниже в таблице 21.

[0396] Содержимое каждого флакона с Н4Н17319Р2 будет восстановлено с применением 4,9 мл стерильной воды для инъекций.

[0397] После восстановления каждый флакон с Н4Н17319Р2 будет содержать 4,8 мл удаляемого объема. При восстановлении для IV введения концентрация Н4Н17319Р2 во флаконе будет 50 мг/мл. Стадии восстановления являются следующими.

1. Получите необходимое число флаконов с лиофилизированным Н4Н17319Р2 вместе с инфузионным пакетом на 100 мл с 0,9% хлорида натрия.

2. Подготовьте Н4Н17319Р2, работая на твердой чистой поверхности.

3. Снимите колпачок(колпачки) с флакона(флаконов) и протрите верхнюю поверхность флакона спиртовым тампоном.

4. Для каждого флакона, который будет использоваться для введения дозы, возьмите одну иглу 21-го калибра и один полипропиленовый шприц на 10,0 мл. Не снимая колпачок с игл, прикрепите иглы 21-го калибра к полипропиленовому шприцу на 10,0 мл. С надетой крышкой оттяните поршень шприца на 10,0 мл до отметки 5,5 мл. Это необходимо для втягивания воздуха в шприцы.

5. Снимите колпачки с игл 21-го калибра. Вставьте иглы в резиновую крышку флакона, содержащего стерильную воду для инъекций. Надавите на поршни, чтобы во флакон попал весь воздух. Переверните флакон вверх дном в одной руке и убедитесь, что кончик иглы находится в воде. Наберите в шприц по меньшей мере 5,5 мл стерильной воды для инъекций. Не кладите иглы на грязную поверхность, не касайтесь игл пальцами и не дышите прямо на иглы.

6. Заправьте шприцы, перевернув шприцы (иглой вверх) и нажимая на поршень до тех пор, пока из шприцев не будет удален воздух. Продолжайте нажимать на поршни, пока не выйдет небольшое количество жидкости и поршни не достигнут 4,9 мл.

7. Поместите флакон с Н4Н17319Р2 на твердую поверхность и вставьте иглу в верхнюю часть. Добавьте 4,9 мл стерильной воды для инъекций во флакон с лекарственным средством, направляя струю воды на стенку флакона и в порошкообразное лекарственное средство.

8. Удалите иглы из флакона, вытолкнув всю воду из шприцев во флакон. Выбросьте иглы и шприцы в контейнер для острых предметов.

9. Осторожно покрутите флакон в вертикальном положении, пока весь порошок не растворится.

10. Не трясите флакон. Встряхивание может привести к вспениванию.

IV-введение Н4Н17319Р2

[0398] Стадии введения антитела являются следующими.

1. Используйте стандартную асептическую методику, чтобы извлечь необходимое количество Н4Н17319Р2 в соответствии с таблицей 21, используя полипропиленовый шприц подходящего размера и иглу 21-го калибра. Не кладите иглу на грязную поверхность, не касайтесь иглы пальцами и не дышите прямо на иглу.

2. Перед добавлением растворов Н4Н17319Р2 в пакет для IV инфузии на 100 мл извлеките из пакета для IV инфузии объем 0,9% хлорида натрия, равный объему Н4Н17319Р2, который нужно добавить в пакет для IV инфузии.

3. Добавьте соответствующий объем Н4Н17319Р2 в пакет для IV инфузии, затем переверните пакет для IV инфузии 10 раз, чтобы убедиться, что лекарственное средство и 0,9% хлорид натрия хорошо перемешаны.

4. Подготовленный пакет для IV инфузии маркируют в соответствии с утвержденными в исследовательском центре требованиями к маркировке. Этикетка должна включать: инициалы пациента, дату/время приготовления, мг Н4Н17319Р2 в пакете с 0,9% хлорида натрия 1x1, инструкции по внутривенной инфузии всего содержимого инфузионного пакета и промыванию в течение 1 часа согласно протоколу, применение согласно дате/времени и имя лечащего врача.

5. Н4Н17319Р2 следует ввести путем инфузии в течение 4 часов после восстановления.

Подготовка для подкожного введения и подкожное введение Н4Н17319Р2

[0399] Содержимое каждого флакона с Н4Н17319Р2 будет восстановлено с применением 1,4 мл стерильной воды для инъекций. После восстановления каждый флакон будет содержать 1,2 мл удаляемого объема. При восстановлении для SC введения концентрация Н4Н17319Р2 составляет 150 мг/мл. Два флакона Н4Н17319Р2 потребуются для введения дозы.

1. Подготовьте Н4Н17319Р2, работая на твердой чистой поверхности.

2. Снимите колпачок(колпачки) с флакона(флаконов) и протрите верхнюю поверхность флакона(флаконов) спиртовым тампоном.

3. Не снимая колпачок с иглы, прикрепите иглу 21-го калибра к полипропиленовому шприцу на 3,0 мл. С надетой крышкой оттяните поршень шприца до отметки 2,0 мл, чтобы втянуть воздух в шприц. Снимите колпачок с иглы 21-го калибра. Вставьте иглу в резиновую крышку флакона, содержащего стерильную воду для инъекций. Надавите на поршень, чтобы во флакон попал весь воздух. Переверните флакон вверх дном в одной руке и убедитесь, что кончик иглы находится в воде. Наберите в шприц минимум 2,0 мл стерильной воды для инъекций. Не кладите иглу на грязную поверхность, не касайтесь иглы пальцами и не дышите прямо на иглу.

4. Заправьте шприц, перевернув шприц (иглой вверх) и нажимая на поршень до тех пор, пока из шприца не будет удален воздух. Продолжайте нажимать на поршень, пока не выйдет небольшое количество жидкости и поршень не достигнет отметки 1,4 мл.

5. Поместите флакон с Н4Н17319Р2 на твердую поверхность и вставьте иглу в верхнюю часть. Добавьте 1,4 мл стерильной воды для инъекций во флакон с Н4Н17319Р2, направляя струю воды на стенку флакона и в порошкообразное лекарственное средство.

6. Удалите иглу из флакона, вытолкнув всю воду из шприца во флакон. Выбросьте иглу и шприц в контейнер для острых предметов.

7. Осторожно покрутите флакон в вертикальном положении, пока весь порошок не растворится.

8. Не трясите флакон. Встряхивание может привести к вспениванию.

SC введение дозы 250 мг Н4Н17319Р2

[0400] Для этой дозы необходимо 2 инъекции Н4Н17319Р2. Одна инъекция представляет собой SC инъекцию 0,67 мл, а другая - SC инъекцию 1,0 мл.

1. Возьмите полипропиленовый пластиковый шприц на 1,0 мл и полипропиленовый шприц на 3,0 мл и присоедините иглу 21-го калибра к каждому шприцу.

2. Получите 2 флакона с лиофилизированным Н4Н17319Р2.

3. Восстановите лиофилизированный Н4Н17319Р2 в каждом флаконе с помощью 1,4 мл стерильной воды для инъекций, как указано выше.

4. С надетой на иглу крышкой оттяните поршень полипропиленового шприца на 1,0 мл до отметки 1,0 мл, чтобы втянуть воздух в шприц.

5. Снимите колпачок с иглы и вставьте иглу в резиновую крышку флакона.

6. Надавите на поршень и введите во флакон весь воздух.

7. Удерживая иглу во флаконе, переверните флакон вверх дном в одной руке и убедитесь, что кончик иглы находится в жидкости. Другой рукой оттяните поршень, чтобы набрать в шприц минимум 1,0 мл лекарственного средства. Установите колпачок на иглу. Снимите иглу с колпачком и положите в контейнер для острых предметов.

8. Не снимая крышку с иглы, прикрепите 0,5-дюймовую иглу 27-го калибра к полипропиленовому шприцу объемом 1,0 мл, содержащему минимум 1,0 мл лекарственного средства.

9. Снимите колпачок иглы и заправьте 0,5-дюймовую иглу 27-го калибра лекарственным средством. Установите колпачок на иглу.

10. Подготовленный шприц для SC содержит 0,67 мл = 100 мг/0,67 мл.

11. Подготовленный шприц для SC маркируют в соответствии с требованиями стандартной операционной процедуры исследовательского центра.

12. С надетой на иглу крышкой оттяните поршень полипропиленового шприца на 3,0 мл до отметки 1,5 мл, чтобы втянуть воздух в шприц.

13. Снимите колпачок с иглы и вставьте иглу в резиновую крышку флакона.

14. Надавите на поршень и введите во флакон весь воздух.

15. Удерживая иглу во флаконе, переверните флакон вверх дном в одной руке и убедитесь, что кончик иглы находится в жидкости. Другой рукой оттяните поршень, чтобы набрать в шприц минимум 1,2 мл лекарственного средства. Установите колпачок на иглу. Снимите иглу с колпачком и положите в контейнер для острых предметов.

16. Не снимая крышку с иглы, прикрепите 0,5-дюймовую иглу 27-го калибра к полипропиленовому шприцу объемом 1,0 мл, содержащему минимум 1,2 мл лекарственного средства.

17. Снимите колпачок иглы и заправьте 0,5-дюймовую иглу 27-го калибра лекарственным средством. Установите колпачок на иглу.

18. Подготовленный шприц для SC содержит 1,0 мл = 150 мг/1,0 мл.

19. Подготовленный шприц для SC маркируют в соответствии с требованиями стандартной операционной процедуры исследовательского центра.

20. Н4Н17319Р2 следует доставить в течение 4 часов после восстановления.

Окончательное прекращение приема Н4Н17319Р2

Рекомендуется окончательно прекратить введение Н4Н17319Р2 в случае, если имеет место следующее.

• Серьезные или тяжелые аллергические реакции, считающиеся связанными с Н4Н17319Р2

• Конкретные типы дисфункции печени (например, соблюдается закон Хая ([Guidance for Industry Drug Induced Liver Injury: Premarketing Clinical Evaluation FDA 2009])

• Свидетельства беременности

• Пациент/законный представитель отзывает согласие

• Для пациента не показана клиническая польза (т.е. потеря веса тела) после периода времени (который обсуждается лечащим врачом и спонсором) применения того, что спонсор считает оптимальной дозой и схемой введения доз Н4Н17319Р2.

Временное прекращение приема Н4Н17319Р2

Рекомендуется временно прекратить введение Н4Н17319Р2 в случае, если имеет место следующее.

• Количество нейтрофилов ≤ 1,0×10³/мкл

• Устойчивые значения уровня ALT/AST более чем в 3 раза превышают верхний предел нормы (ULN), а также общий билирубин > 2х ULN или AST/ALT по отдельности > 5х ULN

• Хирургическая процедура

• Госпитализация

После того, как состояние, приводящее к временному прекращению приема Н4Н17319Р2, устранится, введение доз Н4Н17319Р2 можно возобновить. Решение о временном прекращении приема Н4Н17319Р2 и/или возобновлении введения доз Н4Н17319Р2 следует обсудить с представителем спонсора.

Лечащий врач может временно прекратить введение доз Н4Н17319Р2 в любое время, даже без консультации с представителем спонсора, если срочность ситуации требует немедленных действий и если это будет определено как отвечающее наилучшим интересам пациента. Однако следует как можно скорее связаться с представителем спонсора. Возобновление введения доз Н4Н17319Р2 следует обсудить и согласовать между лечащим врачом и представителем спонсора.

[0401] Таким образом, Н4Н17319Р2 будет обеспечивать восстановление передачи сигнала, опосредованной LEPR, у пациента, у которого имеется врожденная недостаточность лептина, и будет обеспечивать у пациента улучшение в отношении гиперфагии, набора веса и/или метаболических осложнений этого состояния или обращение вспять таковых.

Пример 22. Клиническое применение антитела к LEPR для лечения очаговой липодистрофии у пациентов-детей

[0402] В возрасте 11 лет у пациентки проявились гепатоспленомегалия и высокий уровень триглицеридов (>500 мг/дл), а также отсутствие жира на конечностях. У нее были обнаружены антитела к GAD (декарбоксилазе глутаминовой кислоты), и коммерческий анализ гена LMNA дал отрицательный результат. Другие особенности, идентифицированные во время оценки для исследования по изучению эффективности метрелептина при лечении заболеваний печени, ассоциированных с липодистрофией, включали атипичные признаки контрактур рук, сколиоз и отсутствие адренархе. Ее исходный уровень лептина составлял 3,2 нг/дл.

[0403] Терапия метрелептином была начата в возрасте 13 лет в рамках протокола клинического исследования (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT01679197) для лечения высокого уровня триглицеридов и тяжелого стеатоза печени, и она продолжала прием метрелептина в течение 12 месяцев без каких-либо серьезных нежелательных явлений. После метрелептина ее метаболические параметры улучшились незначительно, однако ее биопсия печени показала улучшение. Она продолжила прием метрелептина в рамках другого протокола исследования (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT02654977). Однако в течение 17^го месяца лечения пациентка сообщила об усталости, жажде, нечеткости зрения и полидипсии и потеряла 5 фунтов за месяц. Результаты лабораторных исследований показали значительную гипергликемию и гиперлипидемию с положительной анионной разницей и положительным результатом анализа на кетоновые тела. Уровень антител к GAD65 (изоформе декарбоксилазы глутаминовой кислоты размером 65 кДа) составлял 5,39 нмоль/л (повторный анализ на антитела к GAD65: 8,38 нмоль/л, два месяца спустя), а уровень лептина, измеренный через час после инъекции, не поддавался определению. В конечном итоге было подтверждено присутствие антител к метрелептину с нейтрализующей активностью. Такое низкое значение уровня лептина, вероятно, было следствием иммуногенной перекрестной реактивности в отношении продолжающейся терапии метрелептином с образованием антител к метрелептину, возможной продолжающейся потери жировой ткани или механизма, подавляющего выработку лептина.

[0404] Положительная нейтрализующая активность в отношении метрелептина, а также эндогенного лептина была подтверждена через приблизительно 6 месяцев. В это время контроль глюкозы и липидов был значительно хуже, при этом уровень триглицеридов постоянно превышал 2000 мг/дл. Пациентка продолжала получать высокодозовую инсулинотерапию по базально-болюсной схеме и перешла на инсулиновую помпу. Она также начала прием метформина. Потребовалось несколько госпитализаций по поводу диабетического кетоацидоза, панкреатита или предупреждения панкреатита.

[0405] Затем пациентка начала прием фенофибрата и впоследствии пиоглитазона из-за ухудшения контроля липидов (триглицериды > 2000 мг/дл). Через месяц после отмены метрелептина показатели LFT существенно выросли до 10-кратного превышения нормы. Биопсия печени показала очаговое портальное и перипортальное воспаление, которое включало повреждение плазматических клеток и поверхности контакта, что соответствует аутоиммунному гепатиту. Чтобы контролировать аутоиммунный гепатит, пациентка получала лечение преднизоном в течение периода трех месяцев, что помогло устранить аномалии функции печени. Как во время приема, так и после прекращения приема преднизона пациентка страдала от множественных эпизодов острого панкреатита из-за гипертриглицеридемии (до 8000 мг/дл) в сочетании с диабетическим кетоацидозом. В связи с указанными выше метаболическими осложнениями или панкреатитом пациентка регулярно поступала в больницу.

[0406] Пациентка начала принимать сетмеланотид (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT03262610) при дозе 1 мг/день, и дозу подбирали в сторону увеличения до тех пор, пока уровень триглицеридов не упал ниже 500 мг/дл. Сетмеланотид не вызывал потери веса у этой пациентки. Хотя наблюдалось небольшое уменьшение по шкале голода, эффект не был стойким. Лечение не обеспечило улучшения в отношении гликемического контроля и гипертриглицеридемии. Небольшое снижение общей суточной дозы инсулина не считалось клинически значимым, поскольку уровни HbAlc оставались высокими. Сетмеланотид не оказал эффект в отношении содержания жира в печени, хотя количество висцерального жира немного уменьшилось.

[0407] Повышенные уровни триглицеридов у пациентки (>500 мг/дл и до 2000 мг/дл) требуют плазмообменной терапии для предотвращения рецидива панкреатита. Она также получает лечение эмпаглифлозином в количестве 10 мг в сутки в дополнение к инсулину аспарту, инсулину гларгину и метформину. Обоснование

[0408] Целью данного протокола клинического исследования является предоставление исследуемого препарата (IP) Н4Н17319Р2 пациенту, который соответствует требуемым критериям отбора и соответствует следующим критериям, изложенным ниже.

• У пациента имеется серьезное или опасное для жизни заболевание, для которого разрешен протокол расширенного доступа.

• Достаточные свидетельства эффективности, позволяющие ожидать клинически значимой пользы, на основании предполагаемого механизма действия лекарственного средства.

• Не существует сопоставимых или удовлетворительных альтернативных средств терапии для лечения данного заболевания или состояния.

• У этого конкретного пациента нет ничего уникального, что предполагало бы наличие необоснованного риска, связанного с введением данному пациенту Н4Н17319Р2.

[0409] Антитела к метрелептину с нейтрализующей активностью были идентифицированы у пациентов с генерализованной липодистрофией, получавших лечение метрелептином. Последствия воздействия этих нейтрализующих антител недостаточно хорошо изучены, но могут включать ингибирование действия эндогенного лептина и/или потерю эффективности метрелептина (Chan, et al. Immunogenicity associated with Metreleptin treatment in patients with obesity or lipodystrophy. Clin Endocrinol. 2016; 85(1): 137-149). Сообщалось о серьезных инфекциях и/или ухудшении метаболического контроля. У этой пациентки было отмечено прогрессирующее ухудшение метаболизма, а также появление сахарного диабета типа 1 одновременно с появлением устойчивых нейтрализующих антител к метрелептину. Неясно, прогрессировало ли заболевание естественным путем или сыграло роль появление антител. Тем не менее, липодистрофия пациентки не поддается надлежащему лечению.

[0410] Целью этого индивидуального протокола расширенного доступа для пациента является предоставление Н4Н17319Р2 в качестве потенциального средства лечения тяжелых метаболических осложнений, возникающих в результате липодистрофии, у этой пациентки с рефрактерной гипертриглицеридемией, приводящей к рецидивирующим приступам панкреатита. Дополнительно будет оценена безопасность и эффективность Н4Н17319Р2 у этой пациентки. Период лечения будет зависеть от степени ответа у этой отдельной пациентки, которая является тяжелобольной пациенткой с липодистрофией, гипертриглицеридемией и рецидивирующим панкреатитом, с целью оценки того, может ли Н4Н17319Р2 иметь терапевтическую пользу для обеспечения улучшения в отношении тяжелых метаболических аномалий.

[0411] Первичные конечные точки

• Процентное изменение уровней триглицеридов натощак от исходного уровня до недели 24

• Достижение уровня триглицеридов натощак < 500 мг/дл без необходимости в постоянном плазмаферезе в неделю 24

• Нежелательные явления, возникшие в ходе лечения

[0412] Вторичные конечные точки:

• Процентное изменение уровней триглицеридов натощак от исходного уровня до недели 12

• Достижение уровня триглицеридов натощак < 500 мг/дл без необходимости в постоянном плазмаферезе в неделю 12

• Изменение оценки голода от исходного уровня с течением времени

• Изменение уровня глюкозы натощак и гликозилированного гемоглобина (HbAlc) от исходного уровня с течением времени

• Частота госпитализаций по поводу панкреатита с течением времени

• Изменение потребности в средней дозе инсулина от исходного уровня с течением времени

• Изменение других параметров липидов натощак, включая уровень общего холестерина, HDL-C, LDL-C и VLDL-C натощак, от исходного уровня с течением времени

• Процентное изменение параметров DEXA и жира в печени, если его возможно определить, у этой пациентки от исходного уровня с течением времени

• Концентрация общего Н4Н17319Р2 в сыворотке крови с течением времени

• Наличие антител к лекарственному средству (ADA) Н4Н17319Р2 с течением времени

План протокола

[0413] Протокол включает 2-недельный скрининговый период и 3 периода лечения в открытом режиме: 1-й период лечения (недели 1-12), 2-й период лечения (недели 13-24) и период продления лечения (недели 25-52). Во время скринингового периода пациентку будут оценивать на соответствие критериям, и ей дадут указание заполнить вопросник по голоду за по меньшей мере 3 отдельных дня, чтобы лучше понять симптомы голода, ассоциированные с липодистрофией и отсутствием или недостаточностью эндогенного лептина в результате отсутствия или недостатка жировой ткани до лечения с помощью Н4Н17319Р2. Поскольку это состояние встречается редко, получение оценок голода во время скрининга позволит собрать важные детали, характерные для данной пациентки, которые позволят лучше понять симптомы голода при этом нарушении.

[0414] Во время 1-го периода лечения пациентка будет получать Н4Н17319Р2 согласно начальной схеме введения доз. В конце 1-го периода лечения (неделя 12) будет проведена оценка эффективности (снижения уровня TG) и уровней лекарственного средства (PK) Н4Н17319Р2 для определения схемы введения доз Н4Н17319Р2 для 2-го периода лечения. Уровень дозы и частота введения доз во 2-й период лечения не будут превышать таковые в 1-й период лечения. В неделю 24 будет проведена оценка эффективности (снижения уровня TG) и уровней лекарственного средства (PK) Н4Н17319Р2 для определения права пациентки на продолжение участия в периоде продления лечения.

[0415] Таким образом, эта пациентка будет последовательно выполнять протокол, как показано на фигуре 19.

[0416] Уровни триглицеридов (TG) натощак и потребность в плазмаферезе будут основными критериями, используемыми для оценки достижения терапевтического эффекта. Если у этой пациентки не демонстрируется требуемый целевой терапевтический ответ, заключающийся в достижении уровня TG натощак < 500 мг/дл до недели 24, она будет исключена из протокола.

[0417] Для одновременного контроля гипертриглицеридемии эта пациентка будет иметь право продолжить лечение плазмаферезом, если это необходимо по решению лечащего врача. Уровни TG натощак для определения того, был ли достигнут терапевтический ответ на лечение с помощью Н4Н17319Р2, следует измерять в момент времени через по меньшей мере 1 неделю после последнего курса лечения плазмаферезом.

Выбор дозы

[0418] В доклинических исследованиях, описанных выше в примерах 15-19, эффекты PD были ассоциированы с широким диапазоном воздействий Н4Н17319Р2, тогда как устойчивость эффектов наблюдалась в условиях введения доз, в которых мишень опосредованный клиренс (ТМС) Н4Н17319Р2 был насыщенным. В мышиной модели липодистрофии (описанной выше) однократные дозы Н4Н17319Р2 приводили к нормализации концентрации глюкозы и потере веса тела. Эти эффекты были очевидны при концентрациях Н4Н17319Р2 в сыворотке крови выше 4 мг/л, но были заметно более устойчивыми при концентрациях, насыщающих путь ТМС. В исследованиях на обезьянах, описанных выше, устойчивые эффекты в отношении веса тела (потеря веса тела или снижение набора веса тела по сравнению с контрольными животными) наблюдались при равновесных концентрациях выше 30 мг/л. Однако более выраженные общие эффекты наблюдались, когда концентрации Н4Н17319Р2 превышали 100 мг/л, концентрацию, необходимую для насыщения ТМС у обезьян. С учетом того, что лептин-связывающие рецепторы широко экспрессируются, но рецепторы-мишени (сигнальные) ограничены центральной нервной системой, предполагается, что доклинические данные PK/PD отражают необходимость насыщения ТМС, ассоциированного со связыванием с периферическим LEPR, для достижения надлежащего воздействия на головной мозг. Кроме того, межвидовые различия в концентрации, необходимой для насыщения ТМС и обеспечения устойчивых эффектов PD, могут быть следствием различий в нагрузке на периферические мишени.

[0419] В клиническом исследовании с участием людей, описанном в примере 20, насыщение пути ТМС было очевидным при концентрациях в сыворотке крови, превышающих 100 мг/л, на основании профилей зависимости концентрации от времени. Популяционная модель РК была построена с применением данных этого FIH-исследования, в котором были отражены соответствующие фармакокинетические характеристики Н4Н17319Р2 при введении в качестве однократной дозы здоровым добровольцам. Эта модель была использована для моделирования ожидаемых профилей концентрации при различных схемах введения доз при предположении, что РК-характеристики Н4Н17319Р2, наблюдаемые у здоровых добровольцев, относятся к этой пациентке.

[0420] Н4Н17319Р2 будет поставляться в виде лиофилизированного порошка в стерильном одноразовом стеклянном флаконе на 20 мл для IV или SC введения. Каждый флакон содержит 265 мг Н4Н17319Р2, который будет восстановлен стерильной водой для инъекций для IV введения и SC введения.

[0421] Была выбрана насыщающая доза 5 мг/кг для внутривенного (IV) введения для того, чтобы быстро достичь концентраций Н4Н17319Р2 в сыворотке крови на уровне 100 мг/л или выше. Включение этой IV насыщающей дозы также позволит немедленно оценить максимальную концентрацию (C_max) Н4Н17319Р2 в сыворотке крови. Согласно прогнозам еженедельная поддерживающая доза 300 мг Н4Н17319Р2 для подкожного (SC) введения будет обеспечивать поддержание минимальных концентраций в сыворотке крови на уровне 100 мг/л или выше. Эта схема SC введения доз должна начинаться через 4 дня после введения насыщающей IV дозы и согласно прогнозам обеспечивает наилучшее поддержание целевых минимальных концентраций в сыворотке крови. В дни, когда пациентке проводят плазмаферез по клиническим показаниям, введение Н4Н17319Р2 должно происходить после завершения плазмафереза.

[0422] На основании данных первой части продолжающегося исследования, состоящего из 2 частей, с участием 56 здоровых субъектов (пример 20) ожидается, что описанная схема введения доз в целом будет хорошо переноситься. Н4Н17319Р2 хорошо переносился здоровыми взрослыми добровольцами в примере 20 при введении в виде однократных доз от 0,3 до 30 мг/кг IV и 300 и 600 мг SC. При IV дозе 30 мг/кг наблюдалась максимальная концентрация в сыворотке крови 1035 мг/л, что более чем в шесть раз превышает максимальное воздействие, которое согласно прогнозам может быть достигнуто у этой пациентки на протяжении исследования. Кроме того, прогнозируемая площадь под кривой зависимости концентрации от времени (AUC) в течение 1-недельного интервала введения доз в равновесном состоянии, как ожидается, будет почти в двадцать семь раз ниже, чем AUC в равновесном состоянии в течение того же интервала введения доз (на уровне, при котором отсутствуют наблюдаемые нежелательные явления [NOAEL]), рассчитанная на основе фармакокинетической модели, полученной в результате 3 доклинических токсикологических исследований на яванских макаках.

[0423] Ожидается, что терапия в виде начальной насыщающей дозы 5 мг/кг IV в сочетании с 300 мг еженедельной поддерживающей SC дозы будет переносимой, и она была выбрана для быстрого достижения концентрации Н4Н17319Р2 в сыворотке крови, которая насыщает периферические рецепторы и тем самым обеспечивает устойчивые фармакологические эффекты. Возможно, что более низкий уровень дозы или менее частое введение доз могут быть столь же эффективными. Следовательно, уровень дозы и частота введения доз могут быть скорректированы в сторону уменьшения после запланированных промежуточных оценок эффективности и уровня лекарственного средства. Кроме того, поскольку при плазмаферезе могут удаляться из кровотока антитела, включая Н4Н17319Р2, может потребоваться корректировка дозы после плазмафереза для обеспечения эффективных уровней Н4Н17319Р2. В дни, когда пациентке проводят плазмаферез, может потребоваться дополнительная доза 300 мг Н4Н17319Р2 для достижения целевых концентраций лекарственного средства. Обычные максимальные дозы (без учета возможных изменений вследствие плазмафереза) не должны превышать 300 мг SC еженедельно.

Оценки эффективности и уровня лекарственного средства

[0424] Промежуточные оценки эффективности и уровня лекарственного средства будут выполнены через 12 недель и 24 недели согласно протоколу, чтобы оценить, позволила ли выбранная схема введения доз достичь ожидаемых уровней лекарственного средства и профилей РК и эффектов в отношении параметров липидов. Уровень дозы и частота введения доз могут быть скорректированы при необходимости после оценок эффективности и уровня лекарственного средства.

[0425] Комитет по рассмотрению данных будет включать (1) опытного специалиста по липодистрофии, (2) врача пациентки из педиатрического отделения интенсивной терапии, (3) одного из узких специалистов, участвующих в ее лечении (либо педиатра-GI, либо гепатолога), и (4) представителя(представителей) спонсора, знакомого с зависимостью «воздействие-ответ» для Н4Н17319Р2 из доклинических и клинических исследований.

Продолжительность участия пациентки

[0426] Ожидается, что общая продолжительность периода выполнения протокола будет составлять примерно 54 недели, включая скрининговый период. Участие пациентки в этом протоколе будет состоять из следующих периодов: скрининговый период, 1-й период лечения [ожидается, что его продолжительность составит 12 недель], 2-й период лечения [ожидается, что его продолжительность составит 12 недель], а затем, если пациентка соответствует критериям, длительный период продления лечения [28 недель]. Ожидается, что если в течение периода продления лечения будет продемонстрировано существенное улучшение метаболизма с хорошей безопасностью и переносимостью, пациентке может быть предложена возможность зарегистрироваться в будущем отдельном расширенном протоколе, чтобы дать возможность продолжить лечение. Этот будущий расширенный протокол будет представлен и утвержден соответствующими регулирующими органами до введения пациентке дозы за рамками продолжительности этого протокола.

[0427] Окончанием испытания будет считаться последний визит последнего пациента. Пациентка имеет право отказаться от протокола в любое время, по любой причине и без каких-либо последствий. Исследователь также может исключить пациентку в любое время из-за проблем клинической безопасности или недостаточной эффективности.

Прекращение выполнения протокола

[0428] Выполнение этого протокола может быть прекращено досрочно, если по мнению главного исследователя или спонсора для этого имеется достаточно веская причина. Прекращающая сторона предоставит письменное уведомление, документирующее причину прекращения выполнения протокола, либо исследователю, либо спонсору.

[0429] Обстоятельства, которые требуют прекращения выполнения, включают, без ограничения, следующее.

• Определение неожиданного, значительного или неприемлемого риска для пациентки

• Недостаточное соблюдение требований протокола

• Недостаточно полных и/или поддающихся оценке данных

• Свидетельства беременности

• Серьезные или тяжелые аллергические реакции, считающиеся связанными с лекарственным средством

• Тяжелое повреждение или дисфункция печени, для объяснения которых невозможно найти другую причину, такую как вирусный гепатит А, В или С; ранее существовавшее или острое заболевание печени; или другое лекарственное средство, способное вызвать наблюдаемое повреждение. Повреждение печени у этой пациентки определяется как уровень ALT или AST, в > 3 раза превышающий средний исходный уровень, И уровень общего билирубина, в > 2 раза превышающий исходный уровень (или международное нормализованное отношение (INR) > 1,5)

• Пациентка отзывает согласие

• Планы по изменению, приостановке или прекращению разработки лекарственного средства

• При рассмотрении данных в неделю 12 комитет по рассмотрению данных пришел к выводу, что достаточная польза не наблюдается

• При рассмотрении данных в неделю 24 комитет по рассмотрению данных пришел к выводу, что пациентка не может постоянно поддерживать значение TG натощак < 500 мг/дл без контроля посредством сопутствующего плазмафереза.

[0430] Если комитет по рассмотрению данных единогласно считает, что у пациентки наблюдается значительная клиническая польза, несмотря на то, что она не может постоянно поддерживать значение TG<500 мг/дл без контроля посредством сопутствующего плазмафереза, введение доз можно продолжать до визита окончания лечения в неделю 52.

Оценка соблюдения режима лечения

[0431] Чтобы оценить безопасность, переносимость и фармакокинетику лекарственного средства, очень важно, чтобы пациентка получала Н4Н17319Р2 в соответствии с указаниями. Все использованные Н4Н17319Р2 будут собраны для оценки соблюдения протокола.

[0432] В течение первых 2 периодов протокола (периода начальной дозы и периода лечения активным препаратом в открытом режиме) Н4Н17319Р2 будет вводить пациентке опытный медицинский работник. В течение периода продления лечения в открытом режиме Н4Н17319Р2 может вводиться в клиническом центре или вводиться самостоятельно/вводиться пациенткой или уполномоченным лицом соответственно. Если пациентка выбирает самостоятельное введение Н4Н17319Р2 или имеет уполномоченное лицо, вводящее Н4Н17319Р2, обучение по введению Н4Н17319Р2 должно проводиться квалифицированным персоналом клинического центра, и первый случай самостоятельного введения должен им контролироваться. Кроме того, пациентке/уполномоченному лицу будет предоставлен дневник введения лекарственных препаратов до начала самостоятельного введения или введения уполномоченным лицом, таким как родитель или опекун. Дневник необходимо заполнять при каждом введении лекарственного средства. Пациентка и/или ее опекуны должны будут вести дневник для мониторинга соблюдения указаний по применению. Кроме того, время введения дозы будет записано в дневнике пациентки. Если пациентка не получит полную дозу лекарственного средства, будет записано введенное количество. Причина(причины) корректировки дозы должны быть записаны в первичных документах и CRF.

[0433] Кроме того, образцы крови будут собраны в соответствии с SOA для измерения минимальных концентраций Н4Н17319Р2 и антител к Н4Н17319Р2 в сыворотке крови.

Предыдущее и сопутствующее лечение и процедуры/разрешенные лекарственные препараты

[0434] Если сопутствующие лекарственные препараты с большой долей вероятности не представляют серьезной потенциальной проблемы безопасности, то общая цель этого протокола заключается в том, чтобы позволить пациентке с этим крайне редким состоянием участвовать в протоколе. Таким образом, пациентке будет разрешен продолжительный прием сопутствующих лекарственных препаратов (например, как описано ниже) при участии в протоколе. Они могут включать следующее.

• Препараты инсулина для лечения сахарного диабета типа 1

• Метформин для лечения инсулинорезистентности

• Витамин D для лечения недостаточности

• Тироксин или другие добавки для щитовидной железы

• Другие лекарственные препараты, обычно применяемые у пациентов с LD, включающие: средства терапии для эндокринной системы (например, добавки, содержащие витамины и кальций) и другие лекарственные препараты (например, карнитин, кофермент Q10, витамины, лекарственные препараты от запора, противоаллергические лекарственные препараты)

• Нейронтин вместе с необходимыми инфузиями наркотических средств или кетамина/лидокаина, пластырями или таблетками для снятия боли

• Эффексор для улучшения настроения

• За исключением низкопороговых лекарственных средств (т.е. противосудорожных средств, дигоксина, кумадина и т.д.), другие лекарственные препараты могут быть разрешены, если принимается их стабильная доза и лечащий врач считает их необходимыми

• Плазмаферез может быть продолжен по усмотрению лечащих врачей пациентки

[0435] В настоящее время нет данных о взаимодействии Н4Н17319Р2 с вышеуказанными средствами лечения. Пациентка и ее опекуны должны быть предупреждены о возможных побочных эффектах взаимодействий лекарственных средств, которые могут возникнуть с любыми лекарственными препаратами, которые будет получать пациентка.

[0436] Этой пациентке будут напоминать при каждом визите, что, если ей необходимо будет принимать какие-либо другие лекарственные препараты в течение периода выполнения протокола, от скрининга до заключительного визита согласно протоколу, она должна немедленно сообщить персоналу протокола, и конкретный(конкретные) лекарственный(лекарственные) препарат(препараты) и показание(показания) должны быть обсуждены с исследователем. Все сопутствующие лекарственные препараты, принимаемые в ходе протокола, должны быть записаны в первичных документах.

Запрещенные лекарственные препараты и вещества и сопутствующие процедуры

[0437] Лекарственные препараты, которые могут повлиять на оценку эффективности в течение осуществления протокола, запрещены, например, добавление новых гиполипидемических средств терапии или любое добавление новых лекарственных препаратов от сахарного диабета, если ее лечащий врач не сочтет это необходимыми.

[0438] Средства, вызывающие анорексию, или лекарственные средства, вызывающие анорексию в качестве нередкого побочного эффекта, запрещены во время выполнения протокола.

[0439] Сопутствующие процедуры, проводимые в течение периода выполнения протокола, включая плазмаферез и другие, используемые для лечения нежелательных явлений, должны регистрироваться в CRF.

Оценки и график

[0440] График проведения оценок (SOA), которые будут проводиться в ходе выполнения протокола, показан на фигуре 20 (А-В).

[0441] Хотя процедуры и оценки, требуемые в этом протоколе для одного пациента, классифицируются как «Отсутствие риска или минимальный риск» (за исключением DEXA, которая может быть классифицирована как «Незначительное увеличение относительно минимального риска») в соответствии с Руководящим документом 2008 г. «Ethical Considerations for Clinical Trials on Medicinal Products Conducted with the Paediatric Population», включены соображения по уменьшению боли и дистресса у участников в возрасте моложе 18 лет.

[0442] После предоставления информированного согласия пациентка войдет в скрининговый период. Во время скринингового периода пациентку будут оценивать на соответствие критериям, и ей дадут указание заполнить вопросник по голоду за 3 отдельных дня, чтобы лучше понять голод, ассоциированный с липодистрофией, до лечения с помощью Н4Н17319Р2. Во время скрининга также очень важно получить любой дополнительный медицинский анамнез, включая недавний анализ медицинской карты, если это необходимо.

[0443] Дополнительный медицинский анамнез вместе с демографическими данными для этого пациента будет получен во время скринингового периода. Данные, которые должны быть записаны в первичном документе и CRF, включают пол, расу, дату рождения пациентки и применение сопутствующих лекарственных препаратов.

[0444] Недавний медицинский анамнез будет получен в день 1 перед первой дозой лекарственного средства, чтобы оценить возможность продолжения участия в протоколе и соблюдение окончательных критериев включения/исключения. Этот недавний медицинский анамнез включает в себя обзор изменений по результатам скрининга, а также обзор недавнего приема пациенткой лекарственных препаратов и оценку того, произошли ли какие-либо изменения с момента предыдущего визита.

[0445] Полное физикальное обследование будет проводиться включительно с рассмотрением периферических лимфатических узлов, головы, глаз (в том числе конъюнктивы), ушей, носа, рта и ротоглотки, шеи, сердца, легких, брюшной полости, опорно-двигательного аппарата, включая спину, конечности и неврологический статус.Эту пациентку также будут оценивать в соответствии со шкалой Таннера; поскольку она не достигла стадии V по Таннеру. Это будет выполнено в соответствии cSOA.

[0446] Изменения по сравнению с исходным уровнем любых результатов физикального обследования, определенных исследователем как клинически значимые, должны быть зарегистрированы как АЕ в соответствующей CRF.

[0447] Рост (см) будет измеряться без обуви в соответствии с SOA с помощью настенного ростомера.

[0448] Рассмотрение сопутствующих лекарственных препаратов будет проводиться во время скринингового периода и при каждом визите согласно протоколу. Любые лекарственные препараты, принимаемые пациентом, будут записаны в первичных документах.

[0449] Исследователю известно, что дозы сопутствующих антидиабетических и гиполипидемических лекарственных препаратов могут потребовать корректировки в начале лечения по мере улучшения в отношении инсулинорезистентности и гипертриглицеридемии. Пациентка будет находиться под тщательным мониторингом в период корректировки ее сопутствующего(сопутствующих) лекарственного(лекарственных) препарата(препаратов). Пациент, получающий инсулинотерапию, должен находиться под тщательным мониторингом в течение первых нескольких недель лечения, так как дозы инсулина, возможно, придется снижать с частотой раз в неделю (особенно для пациентов, получающих высокие дозы инсулина), чтобы избежать гипогликемии. Аналогичным образом, исследователь должен оценить необходимость корректировки доз гиполипидемических лекарственных препаратов при каждом визите последующего наблюдения во время лечения пациентов, принимающих гиполипидемические лекарственные препараты от гипертриглицеридемии, и будет учитывать необходимость плазмафереза. Если данное медикаментозное лечение по какой-либо причине прекращается, может потребоваться дополнительная корректировка сопутствующих лекарственных препаратов, например, гиполипидемического лекарственного препарата, для смягчения потенциального риска панкреатита.

[0450] Жизненно важные показатели будут получены в сидячем положении после по меньшей мере 5 минут покоя каждый раз, когда они измеряются в соответствии с SOA. Кровяное давление (BP; мм рт. ст.) и частота сердечных сокращений (HR; уд./мин) будут измеряться с применением одной и той же методики на протяжении всего протокола (вручную или автоматически). Все измерения BP и HR следует проводить в сидячем положении после по меньшей мере 5 минут покоя. Все измерения будут проводиться в трех повторностях с интервалом примерно 2 минуты. По возможности BP следует измерять в недоминирующей руке на протяжении всего протокола, используя одну и ту же методику (автоматически или вручную). При значительном увеличении BP или HR можно проводить повторные измерения и более частый мониторинг.

[0451] Чтобы обеспечить минимальное значение кровяного давления, пациенту следует дать указания о том, что он не должен принимать лекарственный препарат согласно протоколу в дни протокола, когда жизненно важные показатели должны измеряться в клинике, а должен принимать лекарственный препарат в клинике. Это особенно важно во время визитов в 1-м периоде лечения, когда мониторинг кровяного давления осуществляется более интенсивно в течение периода после приема дозы в клинике согласно SOA.

[0452] Температура тела (°С) и частота дыхания (вдохов в минуту) будут измерены в сидячем положении после по меньшей мере 5 минут покоя.

[0453] Однократные электрокардиограммы в 12 отведениях будут получены после периода по меньшей мере 10 минут покоя в положении лежа на спине.

[0454] Лабораторные тесты на клиническую безопасность должны проводиться местной лабораторией, и пациенты должны голодать в течение 8 часов. До введения дозы необходимо провести лабораторные тесты по безопасности.

[0455] Все клинически значимые лабораторные аномалии будут отслеживаться путем повторного тестирования и дополнительно исследоваться в соответствии с заключением исследователя.

[0456] Аномалии функциональных проб печени будут оцениваться в соответствии с руководством FDA (2009). Образцы для гематологического и биохимического анализа будут взяты натощак. Будет получен общий анализ крови с подсчетом тромбоцитов и стандартными индексами.

• Биохимический анализ: натрий, калий, хлорид, СО₂, альбумин, общий белок, глюкоза, азот мочевины в крови (BUN), креатинин, мочевая кислота, аспартатаминотрансфераза (AST), аланинаминотрансфераза (ALT), гамма-глутамилтранспептидаза (GGT), креатинфосфокиназа (СРК), щелочная фосфатаза, общий билирубин, прямой билирубин, лактатдегидрогеназа (LDH), кальций и фосфор.

• Общий анализ мочи: рН, глюкоза, белок, кетоновые тела, билирубин, кровь, уробилиноген, удельный вес, нитриты и лейкоциты с помощью анализа с тест-полосками или автоматизированного общего анализа мочи. Микроскопическое исследование мочи будет выполнено, если положительные результаты на тест-полосках потребуют дальнейшего исследования.

• Коагулограмма: протромбиновое время (РТ) или международное нормализованное отношение (INR) и частичное тромбопластиновое время (РТТ), также называемое активированным частичным тромбопластиновым временем (аРТТ).

[0457] Места инъекций будут тщательно проверяться, изучаться и оцениваться в течение периода выполнения протокола. Оценка места инъекции будет включать идентификацию и измерение участков эритемы, отека и уплотнения, а также наличие локальной боли, болезненности и зуда.

[0458] Незапланированные оценки также могут регистрироваться, если это оправдано клиническими условиями.

Измерения уровней антител к лекарственному средству (АРА)

[0459] Образцы крови для измерения антител к лекарственному средству будут собираться до введения дозы, а затем в моменты времени, указанные в SOA. Если эта пациентка демонстрирует положительные ADA, за ней будут следить до устранения.

Вопросники для пациента

[0460] На вопросники для пациента ответит пациентка и/или ее опекун после тщательного обучения.

Оценки голода

[0461] Голод будет оцениваться с помощью вопросника, состоящего из 3 частей, а также набора из 2 универсальных опросов, задаваемых во время определенных визитов согласно протоколу в соответствии с SOA. Голод будет оцениваться с применением числовой рейтинговой шкалы от 0 до 10; где 0 = совсем не голоден, а 10 = наиболее голодный из возможных случаев. Все результаты ежедневного вопросника по голоду будут оценивать, предлагая пациенту оценить свой голод по лайкертовской шкале, где 0 - совсем не голоден, а 10 - наиболее голодный из возможных случаев. Оценки вопросника по голоду будут записываться ежедневно до утреннего приема пищи пациента. Вопросник по голоду следует заполнять в течение трех отдельных дней во время скрининга и во время визитов в клинику перед утренним введением дозы. Пациенты будут записывать свои оценки голода до утреннего приема пищи (натощак). Универсальные опросы по голоду: во время определенных визитов согласно протоколу в соответствии с графиком проведения оценок будут проведены два универсальных опроса.

Вопросник состояния здоровья SF-36

[0462] SF-36 представляет собой многоцелевой краткий опрос о состоянии здоровья, состоящий всего из 36 вопросов. Он дает 8-шкальный профиль оценок функционального здоровья и благополучия, а также сводные показатели физического и психического здоровья на основе психометрических показателей и индекс полезности для здоровья на основе предпочтений. Это является общей характеристикой, в отличие от характеристики, нацеленной на определенный возраст, заболевание или группу лечения. Соответственно, SF-36 оказался полезным при обследовании общих и конкретных популяций, сравнении относительного бремени болезней и дифференциации пользы для здоровья, обеспечиваемой широким спектром различных видов лечения.

Вопросник здоровья пациента-9 (PHQ-9)

[0463] PHQ-9 представляет собой шкалу депрессии из девяти пунктов вопросника здоровья пациента. PHQ-9 представляет собой инструмент, помогающий врачам диагностировать депрессию, а также выбирать лечение и осуществлять его мониторинг. После того, как пациент заполнил вопросник PHQ-9, персонал протокола оценивает его.

[0464] Если на каком-либо этапе выполнения протокола индивидуальный показатель PHQ-9 пациента составляет ≥ 10, пациента следует направить к МНР. PHQ-9 будет реализован в соответствии с SOA.

Шкала Колумбийского университета для оценки степени тяжести суицидальных проявлений (C-SSRS)

[0465] C-SSRS представляет собой инструмент, который используется не только для прогнозирования попыток самоубийства, но также для оценки всего спектра основанных на фактических данных идей и поведенческих элементов с критериями для следующих шагов (например, направления к специалистам в области психического здоровья (МНР)). В соответствии с SOA в этом протоколе будут использоваться две версии C-SSRS: (1) Исходная/скрининговая версия шкалы объединяет исходную форму со скрининговой формой для оценки суицидальных наклонностей в течение жизни пациента и в течение заранее определенного периода времени. Эта версия может позволить оценить суицидальные наклонности пациента на протяжении всей жизни в целях сбора данных, а также для оценки соответствия критериям включения/исключения. (2) Версия шкалы с момента последнего визита позволяет оценить суицидальные наклонности с момента последнего визита пациента. Эта версия предназначена для оценки пациентов, которые завершили по меньшей мере одну начальную оценку C-SSRS, и ее следует применять при каждом последующем визите. В версии C-SSRS «С момента последнего визита» спрашивается о любых суицидальных мыслях или поведении, которые мог иметь пациент/участник с момента последнего заполнения C-SSRS.

[0466] Если на каком-либо этапе выполнения протокола у пациента возникают суицидальные мысли типа 4 или 5 или какое-либо суицидальное поведение, пациента следует направить к МНР.

[0467] После скринингового периода, в ходе которого определяется подтверждение соответствия пациентки критериям отбора, пациентка переходит к 1-му периоду лечения. В этой фазе первая доза Н4Н17319Р2 будет вводиться IV в день 1 протокола. Первое подкожное (SC) введение дозы будет происходить в день 5 протокола. Пациентка будет возвращаться в клинику каждую неделю для введения ей дозы. Лабораторные и тестовые оценки описаны на фигуре 20.

[0468] Подробное описание оценки безопасности, лабораторных показателей, PK и ADA, которые должны проводиться в ходе этого протокола, представлены в следующих разделах.

[0469] Пациентка должна будет голодать всю ночь в день, предшествующий всем визитам, начиная со скринингового визита. Утром перед каждым визитом в клинику ей будет разрешено принимать свои обычные лекарственные препараты, запивая водой.

[0470] Оценки могут происходить в течение нескольких дней в течение скринингового периода. Для получения достаточных исходных данных о симптомах голода, собранных в 3 отдельных дня, скрининговый период должен составлять минимум 3 дня и до 2 недель.

[0471] Чтобы обеспечить этой пациентке и персоналу протокола гибкость в отношении числа визитов в клинику, фактическое планирование визитов в клинику может позволить гибкость в выборе времени визитов. В течение 1-го периода лечения и 2-го периода лечения цель будет состоять в том, чтобы визиты происходили в течение +/- 3 дней. Все собранные данные, даже если они находятся за пределами окна визитов, будут включены в анализ конечных точек.

[0472] Мониторинг нежелательных явлений будет проводиться на протяжении всего протокола. Нежелательные явления будут регистрироваться в CRF с момента скрининга до заключительного визита согласно протоколу. Нежелательные явления, происходящие после начала введения лекарственного средства, будут считаться нежелательными явлениями, возникшими в ходе лечения (TEAE). SAE будут регистрироваться до заключительного визита согласно протоколу. Мониторинг всех нежелательных явлений следует осуществлять до тех пор, пока они не устранятся или не будет четко определено, что они вызваны стабильным или хроническим состоянием пациента или интеркуррентной(интеркуррентными) болезнью(болезнями).

Нежелательные явления: определения, документация и отчетность

[0473] Нежелательное явление (АЕ) представляет собой любое неблагоприятное медицинское событие, ассоциированное с применением лекарственного средства у людей, независимо от того, считается ли оно связанным с этим лекарственным средством или нет. Нежелательное явление (также называемое нежелательным опытом) может быть любым неблагоприятным и непреднамеренным признаком (например, аномалией лабораторного показателя), симптомом или заболеванием, для которого наблюдается временная ассоциация с применением лекарственного средства, без какого-либо суждения о причинной связи. АЕ может возникнуть в результате любого применения лекарственного средства (например, применения не по назначению, применения в комбинации с другим лекарственным средством) и любого пути введения, составления или дозирования, включая передозировку.

[0474] Н4Н17319Р2 хорошо переносился в исследовании первого применения у людей. Сообщалось о связанных с лекарственным средством ТЕАЕ (для которых нежелательное явление было оценено исследователем как возможно или вероятно связанное с лекарственным средством). Из-за очень ограниченного на сегодняшний день клинического опыта с Н4Н17319Р2 могут быть другие неизвестные побочные эффекты. PI (или обслуживающий врач) будет в любое время доступным для участников протокола в случае возникновения неотложной клинической ситуации; как об этой доступности, так и о том, как связаться с исследователями в чрезвычайной ситуации, будет четко сообщено участникам протокола устно и письменно. Все вмешательства согласно протоколу будут предоставлены бесплатно.

[0475] АЕ или предполагаемая нежелательная реакция считаются серьезными (SAE), если, по мнению исследователя или спонсора, они приводят к любому из следующих результатов.

• Смерть.

• Угроза жизни. Угроза жизни означает, что пациент находился в непосредственной опасности смерти от реакции в том виде, в котором она произошла, т.е. не включает реакцию, которая гипотетически могла бы вызвать смерть, если бы она произошла в более тяжелой форме.

• Госпитализация в стационар или продление текущей госпитализации. Госпитализация и/или хирургические операции, предусмотренные графиком в течение периода выполнения протокола, но запланированные до вхождения в протокол, не считаются АЕ, если болезнь или заболевание существовало до включения пациента в протокол, при условии, что его состояние не ухудшилось неожиданным образом в ходе протокола (например, при операции, проведенной раньше запланированного срока).

• Стойкая или значительная нетрудоспособность или существенное нарушение способности выполнять нормальные жизненные функции.

• Важное медицинское явление. Важное медицинское явление представляет собой явление, которое может не привести к смерти, не быть опасным для жизни или не требовать госпитализации, но может рассматриваться как SAE, когда, на основании соответствующего медицинского заключения, оно может подвергнуть пациента опасности или пациент может потребовать медицинского или хирургического вмешательства для предотвращения одного из исходов, перечисленных в определениях SAE.

Примеры таких медицинских явлений включают аллергический бронхоспазм, требующий интенсивного лечения в отделении неотложной помощи или дома, дискразию крови или судороги, которые не приводят к госпитализации в стационар, или развитие лекарственной зависимости или злоупотребления наркотиками.

Мониторинг нежелательных явлений и период наблюдения

[0476] Необходимо производить тщательный мониторинг каждого пациента на предмет развития каких-либо АЕ. Эта информация должна быть получена в форме ненаводящих вопросов (например, «Как вы себя чувствуете?»), а также на основе признаков и симптомов, обнаруживаемых во время каждого обследования, наблюдений сотрудников протокола и самостоятельных отчетов пациентов.

[0477] АЕ будут регистрироваться в первичных документах, начиная со скрининга и до заключительного визита согласно протоколу включительно. SAE и смертельные случаи будут регистрироваться в CRF SAE, начиная с момента подписания ICF и продолжая до заключительного визита согласно протоколу. Мониторинг всех АЕ следует осуществлять до тех пор, пока они не устранятся или не будет четко определено, что они вызваны стабильным или хроническим состоянием пациента или интеркуррентной(интеркуррентными) болезнью(болезнями).

[0478] Все АЕ (серьезные и несерьезные), спонтанно сообщенные пациентом и/или в ответ на открытый вопрос персонала протокола или выявленные при наблюдении, физикальном обследовании или других диагностических процедурах, будут регистрироваться в соответствующей CRF. Любое клинически значимое ухудшение лабораторных оценок или других клинических данных считается АЕ и должно регистрироваться в соответствующей CRF. По возможности признаки и симптомы, указывающие на общую первопричинную патологию, следует отмечать как одно комплексное явление.

[0479] О любых SAE, происходящих в любое время после завершения протокола, которые исследователь считает связанными с лекарственным средством, необходимо сообщать спонсору.

[0480] Обо всех SAE, которые происходят в ходе выполнения протокола, исследователь должен сообщать медицинскому наблюдателю в течение 24 часов с момента, когда исследователь узнает о SAE. Необходимо сообщать обо всех SAE, независимо от того, имеется ли их причинная связь с лекарственным средством или нет. Формы SAE будут заполнены, и собранная информация будет включать номер пациента, повествовательное описание (которое может включать соответствующий анамнез, сопутствующие лекарственные препараты и соответствующие результаты лабораторных и диагностических тестов) явления, а также оценку исследователем степени тяжести явления и его связи с лекарственным средством. Спонсор или уполномоченное им лицо может запросить дополнительную информацию о SAE.

[0481] Вся корреспонденция о SAE должна передаваться спонсору.

[0482] Будет происходить тщательный мониторинг пациентов в ходе периода лечения в исследовательском центре во время визита в клинику, а также во время периодических телефонных звонков пациентам со стороны персонала протокола. В случае, если пациент прекращает лечение из-за АЕ, его следует поощрять к совершению заключительного визита согласно протоколу/визита досрочного прекращения, чтобы производить мониторинг явления до устранения и получить дополнительные оценки безопасности, определенные протоколом.

[0483] Как упоминалось выше, пациента следует направить к МНР, если он/она имеет оценку PHQ-9 выше 10, любое суицидальное поведение или любые суицидальные мысли типа 4 или 5 по шкале C-SSRS. Направление к МНР также должно быть сделано, если, по мнению исследователя, это необходимо для безопасности пациента. Если психическое расстройство пациента можно надлежащим образом лечить с помощью психо- и/или фармакотерапии, тогда пациент, по усмотрению МНР, должен продолжать участие в испытании.

[0484] Если возникнут серьезные, неожиданные нежелательные лекарственные реакции, ассоциированные с применением лекарственного средства, соответствующие регулирующий(регулирующие) орган(органы), комитеты по этике (ЕС) и все участвующие исследователи будут уведомлены в ускоренном порядке. Исследователь несет ответственность за незамедлительное уведомление Институционального наблюдательного совета (IRB)/Независимого этического комитета (IEC), если это необходимо для IRB/IEC, обо всех неожиданных серьезных нежелательных лекарственных реакциях, представляющих риск для пациентов-людей. Неожиданное явление представляет собой явление, о котором не сообщается в IB.

[0485] Как для серьезных, так и для несерьезных АЕ исследователь должен определить как интенсивность явления, так и связь явления с введением Н4Н17319Р2. Только те реакции в месте инъекции, которые исследователь считает клинически значимыми, будут зарегистрированы как АЕ.

[0486] Интенсивность всех АЕ, включая клинически значимые лабораторные аномалии, возникшие в ходе лечения, реакции в месте инъекции и потенциальные системные реакции, будет оцениваться в соответствии с СТСАЕ версии 4.03. Степень СТСАЕ относится к степени тяжести АЕ и находится в диапазоне от степени 1 (легкое АЕ), степени 2 (умеренное АЕ), степени 3 (тяжелое АЕ) и степени 4 (опасное для жизни или инвалидизирующее АЕ) до степени 5 (смерть, связанная с АЕ).

[0487] Нежелательные явления, не перечисленные в СТСАЕ, будут оцениваться следующим образом.

• Легкое: ощущается дискомфорт, но нет нарушения нормальной повседневной активности.

• Умеренное: дискомфорт, достаточный, чтобы уменьшить или изменить повседневную активность.

• Тяжелое: невозможность работать или выполнять обычные повседневные дела.

• Угроза жизни: представляет непосредственную угрозу жизни.

[0488] Связь с введением Н4Н17319Р2 будет определена исследователем в соответствии со следующими критериями.

• Отсутствует: нет связи между явлением и введением лекарственного средства. Явление связано с другой этиологией, как, например, с сопутствующими лекарственными препаратами или клиническим состоянием пациента.

• Маловероятно: текущее состояние знаний указывает на то, что связь с Н4Н17319Р2 маловероятна или временная связь такова, что Н4Н17319Р2 не будет иметь какой-либо разумной ассоциации с наблюдаемым явлением.

• Возможно: реакция, которая соответствует вероятной временной последовательности от введения Н4Н17319Р2 и соответствует известной схеме ответа на предполагаемое лекарственное средство. Реакция могла быть вызвана клиническим состоянием пациента или другими видами терапии, назначенными пациенту.

• Вероятно: реакция, которая соответствует вероятной временной последовательности от введения Н4Н17319Р2 и соответствует известной схеме ответа на лекарственное средство. Реакция не может быть разумно объяснена известными характеристиками клинического состояния пациента или другими видами терапии, назначенными пациенту.

[0489] Для целей анализов безопасности все АЕ, которые классифицируются как возможные или вероятные, будут считаться явлениями, связанными с лечением.

Административные требования

Надлежащая клиническая практика

[0490] Протокол будет проводиться в соответствии с Международным советом по гармонизации (ICH) надлежащей клинической практики (GCP) и соответствующими нормативными требованиями. Исследователь должен быть хорошо знаком с надлежащим применением лекарственного средства, как описано в протоколе и IB. Существенные клинические документы будут сохраняться для демонстрации достоверности протокола и целостности собранных данных. Основные файлы должны быть созданы в начале протокола, сохранены на протяжении всего протокола и зафиксированы согласно соответствующим правилам.

Этические соображения

[0491] Протокол будет проводиться в соответствии с этическими принципами, заложенными в Хельсинкской декларации. IRB/IEC рассмотрит всю соответствующую документацию протокола, чтобы гарантировать права, безопасность и благополучие пациентов. Протокол будет проводиться только в тех исследовательских центрах, где было получено одобрение IRB/IEC. Протокол, IB, информированное согласие, рекламные объявления (если применимо), письменная информация, предоставляемая пациентам (включая дневниковые карточки), обновления безопасности, годовые отчеты о проделанной работе, а также любые изменения к этим документам будут предоставлены в IRB/IEC исследователем.

[0492] Н4Н17319Р2 будет обеспечивать лечение очаговой липодистрофии (PLD) у пациента, а также ослабление проявления гепатоспленомегалии, высокого уровня триглицеридов и недостатка жира на конечностях у пациента, которые ассоциированы с PLD.

Примеры 23 и 24. Эффекты агонистических антител к LEPR в мышиных моделях врожденной недостаточности лептина и врожденной недостаточности LEPR

[0493] Эффекты специфического агонистического антитела к LEPR по настоящему изобретению, Н4Н17319Р2, в отношении уровней глюкозы в крови, веса тела, потребления пищи и композиционного состава тела (жировой массы, безжировой массы и костной массы) определяли в мышиных моделях врожденной недостаточности лептина и врожденной недостаточности рецепторов лептина вследствие мутации с потерей функции. Генетически сконструированные мыши Lepr^hu/hu Lep^-/-, экспрессирующие рецептор лептина, который состоит из последовательности эктодомена LEPR человека вместо последовательности эктодомена LEPR мыши, и не экспрессирующие лептин, были использованы в качестве мышиной модели врожденной недостаточности лептина. Модель врожденной недостаточности LEPR представляет собой генетически сконструированных мышей Lepr^{huA409E/huA409E}, которые экспрессируют рецептор лептина, состоящий из последовательности эктодомена LEPR человека с миссенс-мутацией А409Е вместо последовательности эктодомена LEPR мыши.

Пример 23. Эффекты Н4Н174319Р2 в мышиной модели врожденной недостаточности лептина

[0494] В день 0 шестнадцать самок мышей Lepr^hu/hu Lep^-/- в возрасте от 27 до 32 недель разделяли на две группы в зависимости от веса тела. Каждая группа получала путем подкожной инъекции вводимое один раз в неделю антитело изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 10 мг/кг или Н4Н17319Р2 при дозе 10 мг/кг в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35. Семь самок контрольных мышей Lepr^hu/hu в возрасте от 27 до 32 недель получали путем подкожной инъекции вводимое один раз в неделю антитело изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 10 мг/кг в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35. В дни -5 и 35 композиционный состав тела определяли количественно с помощью мкСТ. Потребление пищи, вес тела и уровни глюкозы в крови измеряли на протяжении исследования для каждого животного. На фигуре 21 обобщены уровни глюкозы в крови, вес тела и совокупное потребление пищи для каждой группы лечения. На фигуре 22 обобщена жировая масса, безжировая масса и костная масса для животных в каждой группе лечения антителами, определенная количественно с помощью мкСТ за 5 дней до и через 35 дней после лечения антителами. Все результаты выражены в виде среднего значения ±SEM.

[0495] Как показано на фигуре 21А, в день 0 до введения антитела у мышей Lepr^hu/hu Lep^-/- с недостаточностью лептина наблюдалась гипергликемия по сравнению с контрольными мышами Lepr^hu/hu. Мыши с недостаточностью лептина, получавшие лечение с помощью Н4Н17319Р2 при дозе 10 мг/кг, показали значимое снижение уровней глюкозы в крови, начиная с момента через 2 дня после лечения антителом и в другие последующие моменты времени измерений, по сравнению с мышами с недостаточностью лептина, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P). У мышей Lepr^hu/hu Lep^-/- с недостаточностью лептина, которые получали антитело изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 10 мг/кг, сохранялась гипергликемия во все моменты времени измерений.

[0496] Как показано на фигуре 21В, в день 0 до введения антитела мыши Lepr^hu/hu Lep^-/- с недостаточностью лептина были значительно тяжелее по сравнению с контрольными мышами Lepr^hu/hu. Мыши с недостаточностью лептина, получавшие лечение с помощью Н4Н17319Р2 при дозе 10 мг/кг, показали значимое снижение веса тела, начиная с момента через 15 дней после лечения антителами и в другие последующие моменты времени измерений, по сравнению с мышами с недостаточностью лептина, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P). Мыши Lepr^hu/hu Lep^-/- с недостаточностью лептина, которые получали антитело изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 10 мг/кг, не показали снижения веса тела по сравнению с исходным уровнем во все моменты времени измерений.

[0497] Как показано на фигуре 21С, мыши Lepr^hu/hu Lep^-/- с недостаточностью лептина показали значимое снижение совокупного потребления пищи через два дня после лечения с помощью с Н4Н17319Р2 и в другие последующие моменты времени измерений по сравнению с мышами с недостаточностью лептина, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P).

[0498] Как показано на фигуре 22, до введения антитела в день -5 мыши Lepr^hu/hu Lep^-/- с недостаточностью лептина показали значимое увеличение количества жировой массы, снижение безжировой массы и снижение костной массы по сравнению с мышами Lepr^hu/hu. В день 35 мыши Lepr^hu/hu Lep^-/- с недостаточностью лептина, получавшие лечение с помощью Н4Н17319Р2 при дозе 10 мг/кг, показали значимое снижение жировой массы и набор безжировой и костной массы по сравнению с мышами с недостаточностью лептина, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P).

Пример 24

[0499] В день 0 двадцать самцов мышей Lepr^{huA409E/huA409E} в возрасте от 24 до 28 недель разделяли на две группы в зависимости от веса тела. Каждая группа получала путем подкожной инъекции введение один раз в неделю антитела изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 5 мг/кг или Н4Н17319Р2 при дозе 5 мг/кг в дни 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42. Восемь самцов контрольных мышей Lepr^hu/hu в возрасте от 24 до 28 недель получали путем подкожной инъекции введение один раз в неделю антитела изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 5 мг/кг в дни 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42. В дни -1 и 41 определяли количественно композиционный состав тела с помощью мкКТ. Потребление пищи, вес тела и уровни глюкозы в крови измеряли на протяжении исследования для каждого животного. На фигуре 23 обобщены уровни глюкозы в крови, вес тела и совокупное потребление пищи для каждой группы лечения. На фигуре 24 обобщена жировая масса, безжировая масса и костная масса для животных в каждой группе лечения антителами, определенная количественно с помощью мкСТ за 1 день до и через 41 день после лечения антителами. Все результаты выражены в виде среднего значения ±SEM.

[0500] Как показано на фигуре 23А, в день 0 до введения антитела у мышей Lepr^{huA409E/huA409E} с недостаточностью рецептора лептина наблюдалась гипергликемия по сравнению с контрольными мышами Lepr^hu/hu. Мыши Lepr^{huA409E/huA409E} получавшие лечение с помощью Н4Н17319Р2 при дозе 5 мг/кг, показали значимое снижение уровней глюкозы в крови, начиная с момента через 7 дней после лечения антителами и в другие последующие моменты времени измерений, по сравнению с мышами Lepr^{huA409E/huA409E}, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P). У мышей Lepr^{huA409E/huA409E} с недостаточностью рецептора лептина, которые получали антитело изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 5 мг/кг, сохранялась гипергликемия во все моменты времени измерений.

[0501] Как показано на фигуре 23В, в день 0 до введения антитела мыши Lepr^{huA409E/huA409E} с недостаточностью рецептора лептина были значительно тяжелее по сравнению с контрольными мышами Lepr^hu/hu. Мыши Lepr^{huA409E/huA409E}, получавшие лечение с помощью Н4Н17319Р2 при дозе 5 мг/кг, показали значимое снижение веса тела, начиная с момента через 13 дней после лечения антителами и в другие последующие моменты времени измерений, по сравнению с мышами с недостаточностью рецептора лептина, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P). Lepr^{huA409E/huA409E}, которые получали антитело изотипического контроля (IgG4^P) при дозе 5 мг/кг, не показали снижения веса тела по сравнению с исходным уровнем во все моменты времени измерений.

[0502] Как показано на фигуре 23С, Lepr^{huA409E/huA409E} показали значимое снижение совокупного потребления пищи через 7 дней после лечения с помощью Н4Н17319Р2 и в другие последующие моменты времени измерений по сравнению с мышами с недостаточностью лептина, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P).

[0503] Как показано на фигуре 24, до введения антитела в день -1 мыши Lepr^{huA409E/huA409E} показали значимое увеличение тучности, снижение безжировой массы и снижение костной массы по сравнению с мышами Lepr^hu/hu. В день 41 мыши Lepr^{huA409E/huA409E} получавшие лечение с помощью Н4Н17319Р2 при дозе 5 мг/кг, показали значимое снижение жировой массы и набор безжировой и костной массы по сравнению с мышами Lepr^{huA409E/huA409E}, которым вводили путем инъекции антитело изотипического контроля (IgG4^P).

[0504] Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, кроме описанных в данном документе, будут очевидны специалистам в данной области техники из вышеизложенного описания и сопутствующих фигур. Предполагается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Редженерон Фармасьютикалс, Инк.

Громада, Джеспер

Стевис, Панаийотис

Альтареджос, Джудит

Мерфи, Эндрю Дж.

<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ АГОНИСТИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЛЕПТИНА

<130> 9774.436WO1/10436WO01

<140> Подлежит уточнению

<141> 2019-04-05

<160> 120

PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 1

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt tccgatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggaatg ggtggcagtt atttattatg atggaaatta tcaatactat 180

gaagactccg ttaagggtcg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cacgctggat 240

ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggctgtat atttctgtgc gcgtctcaac 300

tgggattact ggtatctcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357

<210> 2

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Asn Tyr Gln Tyr Tyr Glu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 3

ggattcacct tcagttccga tgcc 24

<210> 4

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp Ala

1 5

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 5

atttattatg atggaaatta tcaa 24

<210> 6

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 6

Ile Tyr Tyr Asp Gly Asn Tyr Gln

1 5

<210> 7

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 7

gcgcgtctca actgggatta ctggtatctc gatctc 36

<210> 8

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300

caagggacac gactggagat taaa 324

<210> 10

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 11

cagagcatta gcagctat 18

<210> 12

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 12

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 13

gctgcatcc 9

<210> 14

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 14

Ala Ala Ser

1

<210> 15

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 15

caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30

<210> 16

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 17

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtacag cgtctggatt caccttcagt agttatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatactatg atggaagtta taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatgg acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagttataac 300

tggaactact ggtacttcga tttctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357

<210> 18

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Tyr Asn Trp Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 19

ggattcacct tcagtagtta tgcc 24

<210> 20

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 20

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 21

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 21

atatactatg atggaagtta taaa 24

<210> 22

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys

1 5

<210> 23

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 23

gcgagttata actggaacta ctggtacttc gatttc 36

<210> 24

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 24

Ala Ser Tyr Asn Trp Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 25

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 25

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaagc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt acatatgcca tgtactgggt ccgccagact 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggctgtt ttatactctg atggaagtaa taaatactat 180

atagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca cttccacgaa cactctgtat 240

ctgcaaatga gcagcctgcg agccgacgac tcggctctat attactgtgc gcgtctcaac 300

tgggattact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357

<210> 26

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ile Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 27

ggattcacct tcagtacata tgcc 24

<210> 28

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 28

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala

1 5

<210> 29

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 29

ttatactctg atggaagtaa taaa 24

<210> 30

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 30

Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 31

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 31

gcgcgtctca actgggatta ctggtacttc gatctc 36

<210> 32

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 32

Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 33

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 33

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgaag cgtctggatt cagcagcagt gacaatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatatcatg atggaagtta taaatactat 180

gaagactccg tgaagggccg attcaccatc gccagagaca attccaagaa cacgctttat 240

ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gaggtataac 300

tggaaccact ggtacttcga tgtctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357

<210> 34

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Asp Asn

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr His Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Glu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Asn Trp Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 35

ggattcagca gcagtgacaa tgcc 24

<210> 36

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 36

Gly Phe Ser Ser Ser Asp Asn Ala

1 5

<210> 37

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 37

atatatcatg atggaagtta taaa 24

<210> 38

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 38

Ile Tyr His Asp Gly Ser Tyr Lys

1 5

<210> 39

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 39

gcgaggtata actggaacca ctggtacttc gatgtc 36

<210> 40

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 40

Ala Arg Tyr Asn Trp Asn His Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 41

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 41

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatcatatg acgaaagtaa taagtactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatt tctagagaca attccaagaa cgcgctgtat 240

ttacaaatga acagcctgag aaatgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300

ccttttggat tggttaccgg atggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 42

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Tyr Asp Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 43

ggattcacct tcagtaccta tggc 24

<210> 44

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 44

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly

1 5

<210> 45

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 45

atatcatatg acgaaagtaa taag 24

<210> 46

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 46

Ile Ser Tyr Asp Glu Ser Asn Lys

1 5

<210> 47

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 47

gcgagagatc ggccttttgg attggttacc ggatggttcg acccc 45

<210> 48

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 48

Ala Arg Asp Arg Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 49

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 49

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt cagtttcaat acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacaatt atatggtatg atggaagtat taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attattgtgc gagaggtgga 300

tatagtggct acctctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

<210> 50

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 51

ggattcagtt tcaataccta tggc 24

<210> 52

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 52

Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr Gly

1 5

<210> 53

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 53

atatggtatg atggaagtat taaa 24

<210> 54

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 54

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys

1 5

<210> 55

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 55

gcgagaggtg gatatagtgg ctacctctac tttgactac 39

<210> 56

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 56

Ala Arg Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 57

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 57

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agcggtggtg actactggag ctggatccgc 120

cagctcccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcgcctac 180

tataatccgt ccctcaagag tcgaggtacc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tatatttctg tgtgaaatta 300

cgatttttgg agtggttctt ggggggctgg ttcggcccct ggggccaggg aaccctggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 58

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 58

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Gly Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 59

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 59

ggtggctcca tcagcagcgg tggtgactac 30

<210> 60

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 60

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 61

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 61

atctattaca gtgggagcgc c 21

<210> 62

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 62

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala

1 5

<210> 63

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 63

gtgaaattac gatttttgga gtggttcttg gggggctggt tcggcccc 48

<210> 64

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 64

Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly Pro

1 5 10 15

<210> 65

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 65

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatggca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct attactggtg gtggtggtag cacatactac 180

tcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240

ctgcgaatga acagtgtgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatataag 300

tggaacttcg tggacgactg gggccaggga accacggtca ccgtctcctc a 351

<210> 66

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Met Asn Ser Val Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 67

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 67

ggattcacct ttagcaacta tggc 24

<210> 68

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 68

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 69

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 69

attactggtg gtggtggtag caca 24

<210> 70

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 70

Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 71

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 71

gcgaaatata agtggaactt cgtggacgac 30

<210> 72

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 72

Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp

1 5 10

<210> 73

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 73

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgttg cctctggatt caccttcaat aaatacgaca tgcactgggt ccgccaaact 120

actggaaaag gtctagagtg ggtctcaggt attgatactg atggtgacac atactatcca 180

ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccgagaactc cctgtatctt 240

caaatgaacg gcctgagagt cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag atggccttgg 300

agtggtttct atggtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360

<210> 74

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Thr Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Gly Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 75

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 75

ggattcacct tcaataaata cgac 24

<210> 76

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 76

Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Asp

1 5

<210> 77

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 77

attgatactg atggtgacac a 21

<210> 78

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 78

Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr

1 5

<210> 79

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 79

gcaagatggc cttggagtgg tttctatggt gcttttgata tc 42

<210> 80

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 80

Ala Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 81

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 81

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtaatt actactggaa ctggatccgc 120

caacagccag gagagggcct ggagtggatt gcttacatct atcacaatgg ggtcaccaac 180

ttcaatccgt ccctcaagag tcgacttact atatcagtag acacgtctaa gactcagttc 240

tccctgaagt tgaggtctgt gactgccgcg gacacggccg tttattactg tgcgagatca 300

ggcagctggt tcgagaactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcactgtc 360

tcctca 366

<210> 82

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 82

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Asn Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Gln Pro Gly Glu Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Ala Tyr Ile Tyr His Asn Gly Val Thr Asn Phe Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ser Gly Ser Trp Phe Glu Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 83

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 83

ggtggctcca tcagcagtgg taattactac 30

<210> 84

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 84

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asn Tyr Tyr

1 5 10

<210> 85

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 85

atctatcaca atggggtcac c 21

<210> 86

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 86

Ile Tyr His Asn Gly Val Thr

1 5

<210> 87

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 87

gcgagatcag gcagctggtt cgagaactgg tacttcgatc tc 42

<210> 88

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 88

Ala Arg Ser Gly Ser Trp Phe Glu Asn Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 89

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 89

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 90

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 90

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 91

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 91

cagagtgtta gcagcagcta c 21

<210> 92

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 92

Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 93

ggtgcatcc 9

<210> 94

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 94

Gly Ala Ser

1

<210> 95

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 95

cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27

<210> 96

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 96

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 97

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 97

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt aattcctact ggagctggat ccggcagccc 120

ccagggaagg gactggagtg gattggatat gtctattccc gtgggaacac caagtacaac 180

ccctccctca cgagtcgagt caccatgtca tttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aaactgaggt ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagcagcagc 300

tggtacgagg actggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 360

<210> 98

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 98

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val Tyr Ser Arg Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Thr

50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Ser Phe Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Ser Ser Trp Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 99

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 99

ggtggctcca tcagtaattc ctac 24

<210> 100

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 100

Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser Tyr

1 5

<210> 101

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 101

gtctattccc gtgggaacac c 21

<210> 102

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 102

Val Tyr Ser Arg Gly Asn Thr

1 5

<210> 103

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 103

gcgagaagca gcagctggta cgaggactgg tacttcgatc tc 42

<210> 104

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 104

Ala Arg Ser Ser Ser Trp Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 105

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 105

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcaggg ctgtttaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgatg tctatggtgg gtccttcaga ggttattatt ggagttggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcagttata gtggtttcac caattacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt catcatatca atagatacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagatgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtttatt actgtgcgag agttacctat 300

ggttatggga cctttgatta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 106

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 106

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Phe Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asp Val Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Ile Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Thr Tyr Gly Tyr Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 107

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 107

ggtgggtcct tcagaggtta ttat 24

<210> 108

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 108

Gly Gly Ser Phe Arg Gly Tyr Tyr

1 5

<210> 109

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 109

atcagttata gtggtttcac c 21

<210> 110

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 110

Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr

1 5

<210> 111

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 111

gcgagagtta cctatggtta tgggaccttt gattat 36

<210> 112

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 112

Ala Arg Val Thr Tyr Gly Tyr Gly Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 113

<211> 1165

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hLEPR под номером доступа P48357

<400> 113

Met Ile Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Ile

1 5 10 15

Tyr Val Ile Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg

20 25 30

Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu

35 40 45

Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr

50 55 60

Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser

65 70 75 80

Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp

85 90 95

Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val

100 105 110

Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn

115 120 125

Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val

130 135 140

Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His

145 150 155 160

Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro

165 170 175

Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu

180 185 190

Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr

195 200 205

Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser

210 215 220

Pro Leu Met Ser Val Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro

225 230 235 240

Leu Gly Leu His Met Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser

245 250 255

Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys

260 265 270

Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val

275 280 285

Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr

290 295 300

Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser

305 310 315 320

Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe

325 330 335

Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys

340 345 350

Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp

355 360 365

Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val

370 375 380

Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys

385 390 395 400

Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His

405 410 415

Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile

420 425 430

Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg

435 440 445

Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu

450 455 460

Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His

465 470 475 480

Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr

485 490 495

Glu Cys Ile Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp

500 505 510

Ile Arg Ile Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys

515 520 525

Val Leu Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys

530 535 540

Ala Glu Ile Thr Ile Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys

545 550 555 560

Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu

565 570 575

Ser Gly Lys Glu Val Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys

580 585 590

Ser Lys Ser Val Ser Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala

595 600 605

Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn

610 615 620

Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met

625 630 635 640

Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys

645 650 655

Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser

660 665 670

Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn

675 680 685

Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu

690 695 700

Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile

705 710 715 720

Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser

725 730 735

Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser

740 745 750

Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met

755 760 765

Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys

770 775 780

Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His

785 790 795 800

Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met

805 810 815

Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp

820 825 830

Ile Glu Lys His Gln Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Val

835 840 845

Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser His

850 855 860

Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn

865 870 875 880

Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Pro Glu Thr Phe Glu

885 890 895

His Leu Phe Ile Lys His Thr Ala Ser Val Thr Cys Gly Pro Leu Leu

900 905 910

Leu Glu Pro Glu Thr Ile Ser Glu Asp Ile Ser Val Asp Thr Ser Trp

915 920 925

Lys Asn Lys Asp Glu Met Met Pro Thr Thr Val Val Ser Leu Leu Ser

930 935 940

Thr Thr Asp Leu Glu Lys Gly Ser Val Cys Ile Ser Asp Gln Phe Asn

945 950 955 960

Ser Val Asn Phe Ser Glu Ala Glu Gly Thr Glu Val Thr Tyr Glu Asp

965 970 975

Glu Ser Gln Arg Gln Pro Phe Val Lys Tyr Ala Thr Leu Ile Ser Asn

980 985 990

Ser Lys Pro Ser Glu Thr Gly Glu Glu Gln Gly Leu Ile Asn Ser Ser

995 1000 1005

Val Thr Lys Cys Phe Ser Ser Lys Asn Ser Pro Leu Lys Asp Ser

1010 1015 1020

Phe Ser Asn Ser Ser Trp Glu Ile Glu Ala Gln Ala Phe Phe Ile

1025 1030 1035

Leu Ser Asp Gln His Pro Asn Ile Ile Ser Pro His Leu Thr Phe

1040 1045 1050

Ser Glu Gly Leu Asp Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Asn Phe Pro

1055 1060 1065

Glu Glu Asn Asn Asp Lys Lys Ser Ile Tyr Tyr Leu Gly Val Thr

1070 1075 1080

Ser Ile Lys Lys Arg Glu Ser Gly Val Leu Leu Thr Asp Lys Ser

1085 1090 1095

Arg Val Ser Cys Pro Phe Pro Ala Pro Cys Leu Phe Thr Asp Ile

1100 1105 1110

Arg Val Leu Gln Asp Ser Cys Ser His Phe Val Glu Asn Asn Ile

1115 1120 1125

Asn Leu Gly Thr Ser Ser Lys Lys Thr Phe Ala Ser Tyr Met Pro

1130 1135 1140

Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr Gln Thr His Lys Ile Met Glu Asn

1145 1150 1155

Lys Met Cys Asp Leu Thr Val

1160 1165

<210> 114

<211> 846

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hLEPR.mmh aa 1—818: F22-D839 из P48357 aa 819-846:

myc-myc-гексагистидиновая метка

<400> 114

Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys

1 5 10 15

Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu

20 25 30

Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu

35 40 45

Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr

50 55 60

Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu

65 70 75 80

Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser

85 90 95

Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu

100 105 110

Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys

115 120 125

Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu

130 135 140

Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe

145 150 155 160

Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu

165 170 175

Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu

180 185 190

Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Val

195 200 205

Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met

210 215 220

Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro

225 230 235 240

Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser

245 250 255

Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu

260 265 270

Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg

275 280 285

Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro

290 295 300

Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu

305 310 315 320

Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Lys Glu

325 330 335

Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala

340 345 350

Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser

355 360 365

Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe

370 375 380

Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg

385 390 395 400

Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu

405 410 415

Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr

420 425 430

Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser

435 440 445

Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Glu Pro

450 455 460

Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Ile Phe Gln

465 470 475 480

Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His

485 490 495

Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser

500 505 510

Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys Ala Glu Ile Thr Ile

515 520 525

Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu

530 535 540

Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Val

545 550 555 560

Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys Ser Lys Ser Val Ser

565 570 575

Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala Val Gln Val Arg Cys

580 585 590

Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala

595 600 605

Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe

610 615 620

Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys Glu Lys Asn Val Thr

625 630 635 640

Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Gln

645 650 655

Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn Gly Thr Trp Ser Glu

660 665 670

Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu Trp Thr Glu Gln Ala

675 680 685

His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Val Ala

690 695 700

Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ile Val

705 710 715 720

Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser Cys Val Ile Val Ser

725 730 735

Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met Tyr Phe Ile Ile Glu

740 745 750

Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys Trp Leu Arg Ile Ser

755 760 765

Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His Phe Ile Pro Ile Glu

770 775 780

Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met Glu Gly Val Gly Lys

785 790 795 800

Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp Ile Glu Lys His Gln

805 810 815

Ser Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln

820 825 830

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His

835 840 845

<210> 115

<211> 1051

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hLEPR.mFc aa 1—818: F22—D839 из P48357 aa 819—1051: IgG2a мыши

(E98—K330 из P01863)

<400> 115

Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys

1 5 10 15

Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu

20 25 30

Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu

35 40 45

Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr

50 55 60

Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu

65 70 75 80

Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser

85 90 95

Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu

100 105 110

Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys

115 120 125

Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu

130 135 140

Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe

145 150 155 160

Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu

165 170 175

Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu

180 185 190

Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Val

195 200 205

Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met

210 215 220

Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro

225 230 235 240

Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser

245 250 255

Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu

260 265 270

Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg

275 280 285

Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro

290 295 300

Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu

305 310 315 320

Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Lys Glu

325 330 335

Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala

340 345 350

Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser

355 360 365

Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe

370 375 380

Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg

385 390 395 400

Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu

405 410 415

Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr

420 425 430

Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser

435 440 445

Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Glu Pro

450 455 460

Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Ile Phe Gln

465 470 475 480

Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His

485 490 495

Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser

500 505 510

Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys Ala Glu Ile Thr Ile

515 520 525

Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu

530 535 540

Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Val

545 550 555 560

Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys Ser Lys Ser Val Ser

565 570 575

Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala Val Gln Val Arg Cys

580 585 590

Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala

595 600 605

Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe

610 615 620

Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys Glu Lys Asn Val Thr

625 630 635 640

Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Gln

645 650 655

Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn Gly Thr Trp Ser Glu

660 665 670

Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu Trp Thr Glu Gln Ala

675 680 685

His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Val Ala

690 695 700

Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ile Val

705 710 715 720

Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser Cys Val Ile Val Ser

725 730 735

Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met Tyr Phe Ile Ile Glu

740 745 750

Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys Trp Leu Arg Ile Ser

755 760 765

Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His Phe Ile Pro Ile Glu

770 775 780

Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met Glu Gly Val Gly Lys

785 790 795 800

Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp Ile Glu Lys His Gln

805 810 815

Ser Asp Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys

820 825 830

Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

835 840 845

Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr

850 855 860

Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser

865 870 875 880

Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His

885 890 895

Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile

900 905 910

Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

915 920 925

Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys

930 935 940

Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu

945 950 955 960

Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe

965 970 975

Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu

980 985 990

Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr

995 1000 1005

Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu

1010 1015 1020

Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn

1025 1030 1035

His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

1040 1045 1050

<210> 116

<211> 1045

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hLEPR.hFc aa 1—818: F22-D839 из P48357 aa 819—1045: метка, представляющая

cобой IgG1 человека (D104—K330 из P01857)

<400> 116

Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys

1 5 10 15

Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu

20 25 30

Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu

35 40 45

Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr

50 55 60

Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu

65 70 75 80

Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser

85 90 95

Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu

100 105 110

Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys

115 120 125

Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu

130 135 140

Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe

145 150 155 160

Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu

165 170 175

Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu

180 185 190

Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Val

195 200 205

Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met

210 215 220

Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro

225 230 235 240

Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser

245 250 255

Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu

260 265 270

Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg

275 280 285

Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro

290 295 300

Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu

305 310 315 320

Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Lys Glu

325 330 335

Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala

340 345 350

Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser

355 360 365

Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe

370 375 380

Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg

385 390 395 400

Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu

405 410 415

Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr

420 425 430

Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser

435 440 445

Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Glu Pro

450 455 460

Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Ile Phe Gln

465 470 475 480

Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His

485 490 495

Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser

500 505 510

Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys Ala Glu Ile Thr Ile

515 520 525

Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu

530 535 540

Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Val

545 550 555 560

Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys Ser Lys Ser Val Ser

565 570 575

Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala Val Gln Val Arg Cys

580 585 590

Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala

595 600 605

Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe

610 615 620

Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys Glu Lys Asn Val Thr

625 630 635 640

Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Gln

645 650 655

Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn Gly Thr Trp Ser Glu

660 665 670

Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu Trp Thr Glu Gln Ala

675 680 685

His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Val Ala

690 695 700

Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ile Val

705 710 715 720

Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser Cys Val Ile Val Ser

725 730 735

Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met Tyr Phe Ile Ile Glu

740 745 750

Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys Trp Leu Arg Ile Ser

755 760 765

Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His Phe Ile Pro Ile Glu

770 775 780

Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met Glu Gly Val Gly Lys

785 790 795 800

Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp Ile Glu Lys His Gln

805 810 815

Ser Asp Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

820 825 830

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

835 840 845

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

850 855 860

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

865 870 875 880

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

900 905 910

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

915 920 925

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

930 935 940

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

945 950 955 960

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

965 970 975

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

980 985 990

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

995 1000 1005

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

1010 1015 1020

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

1025 1030 1035

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

1040 1045

<210> 117

<211> 844

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> MFlePR.mmh aa 1—816: F22—D837 от Macaca fascicularis с замещением T827A

из XP_005543194.1 aa 817—844: myc-myc-гексагистидиновая метка

<400> 117

Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys

1 5 10 15

Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu

20 25 30

Ser Lys Asn Thr Ser Asn Leu Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu

35 40 45

Phe Asn Ser Ser Asp Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe

50 55 60

His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala

65 70 75 80

Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser Ser Val

85 90 95

Phe Gln Gln Met Gly Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly

100 105 110

Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys Asn Pro

115 120 125

Phe Lys Asn Tyr Lys His Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu

130 135 140

Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met

145 150 155 160

Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu Arg Cys Glu Cys Leu Val Pro

165 170 175

Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile

180 185 190

Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Val Gln Pro

195 200 205

Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu Arg Met Glu Ile

210 215 220

Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val

225 230 235 240

Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Glu Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr

245 250 255

Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val

260 265 270

Asp Gly Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Gly Lys

275 280 285

Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro His Val

290 295 300

Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser

305 310 315 320

Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Lys

325 330 335

Ile Val Ser Ser Lys Lys Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys

340 345 350

Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser Lys Val

355 360 365

Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr

370 375 380

Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg Tyr Ala

385 390 395 400

Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp

405 410 415

Gly His Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Asn Thr Ile Gln

420 425 430

Ser Leu Ala Gly Ser Thr Leu Gln Leu Arg Tyr Arg Arg Ser Ser Leu

435 440 445

Tyr Cys Phe Asp Ile Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Lys Pro Lys Asp

450 455 460

Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile

465 470 475 480

Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Pro Leu

485 490 495

Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val

500 505 510

Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys Ala Glu Ile Ile Lys Asn Ile

515 520 525

Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn

530 535 540

Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ile Gln Trp

545 550 555 560

Lys Met Tyr Asp Val Tyr Asp Ala Lys Ser Lys Ser Val Ser Leu Pro

565 570 575

Val Pro Asp Phe Cys Ala Val Tyr Ala Val Gln Val Arg Cys Lys Arg

580 585 590

Ser Asp Gly Leu Gly Leu Trp Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr

595 600 605

Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg

610 615 620

Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu

625 630 635 640

Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr

645 650 655

Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val

660 665 670

Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu Trp Thr Glu Gln Ala His Thr

675 680 685

Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe

690 695 700

Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ile Val Gln Ser

705 710 715 720

Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Ile

725 730 735

Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys

740 745 750

Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser

755 760 765

Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr

770 775 780

Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys

785 790 795 800

Ile Ile Asn Ser Phe Ala Gln Asp Asn Thr Glu Lys His Gln Asn Asp

805 810 815

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu

820 825 830

Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His

835 840

<210> 118

<211> 846

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mLEPR.mmh aa 1—818: LEPR мыши (L22—G839 NP_666258.2) aa

817—846: myc-myc-гексагистидиновая метка

<400> 118

Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys Phe Lys Leu Phe Cys

1 5 10 15

Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu Ser Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser Glu Ala Ile Val Glu

35 40 45

Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro Glu Leu Ser Lys Thr

50 55 60

Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly Gln Asn Cys Ser Ala

65 70 75 80

Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Val Val Lys Ala

85 90 95

Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp Ile Glu Cys Trp Met

100 105 110

Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met Glu Pro Leu Pro Lys

115 120 125

Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His Leu Leu Tyr Asp Leu

130 135 140

Pro Glu Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro Leu Lys Asp Ser Phe

145 150 155 160

Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly Cys Glu Cys His Val

165 170 175

Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu Leu Met Tyr Leu Glu

180 185 190

Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Leu Gln

195 200 205

Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu

210 215 220

Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Asp Ser Gln Thr Met

225 230 235 240

Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Thr

245 250 255

Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val

260 265 270

Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Ser Lys

275 280 285

Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Ser Pro Gln Val

290 295 300

Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser

305 310 315 320

Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln

325 330 335

Ile Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Arg Asn Leu Ala Glu Lys

340 345 350

Ile Pro Glu Ile Gln Tyr Ser Ile Val Ser Asp Arg Val Ser Lys Val

355 360 365

Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr

370 375 380

Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala

385 390 395 400

Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp

405 410 415

Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln

420 425 430

Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu

435 440 445

Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser Ile His Pro Thr Ser Glu Pro Lys Asn

450 455 460

Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile

465 470 475 480

Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu

485 490 495

Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val

500 505 510

Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu Ile Thr Val Asn Thr

515 520 525

Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn

530 535 540

Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ile Gln Trp

545 550 555 560

Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Leu

565 570 575

Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg

580 585 590

Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr

595 600 605

Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg

610 615 620

Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu

625 630 635 640

Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr

645 650 655

Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val

660 665 670

Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr Glu Pro Ala His Thr

675 680 685

Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe

690 695 700

Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Ser Ala Val Glu Ser

705 710 715 720

Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr

725 730 735

Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys

740 745 750

Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn

755 760 765

Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr

770 775 780

Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys

785 790 795 800

Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp Lys Gln Gln Asn Asp

805 810 815

Ala Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln

820 825 830

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His

835 840 845

<210> 119

<211> 846

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> rLEPR.mmh aa 1—818: LEPR крысы (L22-G839 NP_036728.1) aa

819—846: myc-myc-гексагистидиновая метка

<400> 119

Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Thr Ser Pro Trp Arg Phe Lys Leu Phe Cys

1 5 10 15

Ala Pro Pro Ser Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu Ser Pro Ala Gly Val

20 25 30

Pro Asn Asn Thr Ser Ser Leu Lys Gly Ala Ser Glu Ala Leu Val Glu

35 40 45

Ala Lys Phe Asn Ser Thr Gly Ile Tyr Val Ser Glu Leu Ser Lys Thr

50 55 60

Ile Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly Gln Asn Cys Ser Ala

65 70 75 80

Leu Thr Gly Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Val Val Lys Pro

85 90 95

Leu Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp Ile Glu Cys Trp Met

100 105 110

Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met Glu Pro Leu Leu Lys

115 120 125

Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His Leu Leu Tyr Asp Leu

130 135 140

Pro Glu Val Ile Asp Asp Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Asp Ser Phe

145 150 155 160

Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Val Arg Glu Cys Glu Cys His Val

165 170 175

Pro Val Pro Arg Ala Lys Val Asn Tyr Ala Leu Leu Met Tyr Leu Glu

180 185 190

Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Leu Gln

195 200 205

Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu Arg Met Glu

210 215 220

Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Asp Ser Gln Thr Lys

225 230 235 240

Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Thr

245 250 255

Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Asp Thr Ser Leu Leu Val

260 265 270

Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Ser Lys

275 280 285

Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Leu Pro Gln Leu

290 295 300

Phe Thr Thr Gln Asp Val Met Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser

305 310 315 320

Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe Cys Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln

325 330 335

Thr Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys

340 345 350

Ile Pro Glu Thr Gln Tyr Asn Thr Val Ser Asp His Ile Ser Lys Val

355 360 365

Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr

370 375 380

Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala

385 390 395 400

Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp

405 410 415

Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln

420 425 430

Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu

435 440 445

Tyr Cys Pro Asp Asn Pro Ser Ile Arg Pro Thr Ser Glu Leu Lys Asn

450 455 460

Cys Val Leu Gln Thr Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile

465 470 475 480

Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu

485 490 495

Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val

500 505 510

Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu Ile Thr Ile Asn Thr

515 520 525

Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn

530 535 540

Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Asn Gly Lys Glu Ile Gln Trp

545 550 555 560

Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Pro

565 570 575

Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg

580 585 590

Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr

595 600 605

Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg

610 615 620

Ile Met Asp Gly Asp Ile Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu

625 630 635 640

Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr

645 650 655

Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val

660 665 670

Gly Asn Gln Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Ala Glu Ser Ala His Thr

675 680 685

Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe

690 695 700

Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ala Val Gln Ser

705 710 715 720

Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr

725 730 735

Leu Ser Pro Asn Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys

740 745 750

Asn Leu Asn Asp Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn

755 760 765

Val Asn Lys Tyr Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr

770 775 780

Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys

785 790 795 800

Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Asp Ile Ala Lys Gln Gln Asn Asp

805 810 815

Ala Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln

820 825 830

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His

835 840 845

<210> 120

<211> 1045

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mLEPR.hFc aa 1—818: LEPR мыши (L22—G839 NP_666258.2) aa

819—1045: метка, представляющая собой IgG1 человека

(D104—K330 из P01857)

<400> 120

Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys Phe Lys Leu Phe Cys

1 5 10 15

Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu Ser Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser Glu Ala Ile Val Glu

35 40 45

Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro Glu Leu Ser Lys Thr

50 55 60

Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly Gln Asn Cys Ser Ala

65 70 75 80

Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Val Val Lys Ala

85 90 95

Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp Ile Glu Cys Trp Met

100 105 110

Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met Glu Pro Leu Pro Lys

115 120 125

Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His Leu Leu Tyr Asp Leu

130 135 140

Pro Glu Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro Leu Lys Asp Ser Phe

145 150 155 160

Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly Cys Glu Cys His Val

165 170 175

Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu Leu Met Tyr Leu Glu

180 185 190

Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Leu Gln

195 200 205

Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu

210 215 220

Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Asp Ser Gln Thr Met

225 230 235 240

Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Thr

245 250 255

Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val

260 265 270

Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Ser Lys

275 280 285

Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Ser Pro Gln Val

290 295 300

Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser

305 310 315 320

Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln

325 330 335

Ile Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Arg Asn Leu Ala Glu Lys

340 345 350

Ile Pro Glu Ile Gln Tyr Ser Ile Val Ser Asp Arg Val Ser Lys Val

355 360 365

Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr

370 375 380

Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala

385 390 395 400

Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp

405 410 415

Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln

420 425 430

Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu

435 440 445

Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser Ile His Pro Thr Ser Glu Pro Lys Asn

450 455 460

Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile

465 470 475 480

Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu

485 490 495

Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val

500 505 510

Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu Ile Thr Val Asn Thr

515 520 525

Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn

530 535 540

Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ile Gln Trp

545 550 555 560

Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Leu

565 570 575

Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg

580 585 590

Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr

595 600 605

Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg

610 615 620

Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu

625 630 635 640

Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr

645 650 655

Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val

660 665 670

Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr Glu Pro Ala His Thr

675 680 685

Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe

690 695 700

Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Ser Ala Val Glu Ser

705 710 715 720

Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr

725 730 735

Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys

740 745 750

Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn

755 760 765

Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr

770 775 780

Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys

785 790 795 800

Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp Lys Gln Gln Asn Asp

805 810 815

Ala Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

820 825 830

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

835 840 845

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

850 855 860

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

865 870 875 880

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

900 905 910

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

915 920 925

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

930 935 940

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

945 950 955 960

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

965 970 975

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

980 985 990

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

995 1000 1005

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

1010 1015 1020

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

1025 1030 1035

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

1040 1045

<---

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно к способу увеличения костной массы у субъекта, имеющего низкую костную массу, которая является симптомом врожденной недостаточности лептина, от которой страдает субъект, включающему введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), которая содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26; и вариабельную область легкой цепи (LCVR), которая содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом. Технический результат заключается в увеличении костной массы у субъекта, имеющего низкую костную массу, которая является симптомом врожденной недостаточности лептина. 3 з.п. ф-лы, 27 ил., 24 пр.

1. Способ увеличения костной массы у субъекта, имеющего низкую костную массу, которая является симптомом врожденной недостаточности лептина, от которой страдает субъект, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор лептина (LEPR) человека и активируют опосредованную LEPR передачу сигнала, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), которая содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26; и вариабельную область легкой цепи (LCVR), которая содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, субъекту, нуждающемуся в этом.

2. Способ по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.

3. Способ по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат комбинацию аминокислотных последовательностей HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 под SEQ ID NO: 28/30/32/12/14/16.

4. Способ по любому из пп. 1-3, дополнительно включающий введение второго терапевтического средства субъекту, где второе терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из рекомбинантного лептина человека, ингибитора PCSK9, статина, эзетимиба, инсулина, варианта инсулина, средства, усиливающего секрецию инсулина, метформина, сульфонилмочевины, ингибитора натрий-глюкозного котранспортера 2 (SGLT2), агониста/аналога GLP-1, ингибитора глюкагона (GCG), ингибитора рецептора глюкагона (GCGR), ингибитора ангиопоэтин-подобного белка (ANGPTL), фентермина, орлистата, топирамата, бупропиона, топирамата/фентермина, бупропиона/налтрексона, бупропиона/зонисамида, прамлинтида/метрелептина, лоркасерина, цетилистата, тезофензина, велнеперита, противосудорожного средства, дигоксина, кумадина, витамина D, тироксина, добавки для щитовидной железы, витаминной добавки, добавки, содержащей кальций, карнитина, кофермента Q10, лекарственного препарата против запора, противоаллергических лекарственных препаратов, габапентина, наркотического средства, кетамина, лидокаина и венлафаксина гидрохлорида.