Плазмидная генетическая конструкция pET21_Ab_CoV-2_1.3, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка AB_COV-2_1.3 в прокариотической системе E. coli, и рекомбинантный белок AB_COV-2_1.3, обладающий свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2 Российский патент 2023 года по МПК C12N15/70 A61K39/395 

Область техники

Изобретение относится к плазмидной генетической конструкции pET21_Ab_CoV-2_1.3, обеспечивающей синтез наноантитела против SARS-CoV-2 и рекомбинантному белку АВ_CoV-2_1.3, обладающему свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2 и могут быть использованы в генной инженерии, биотехнологии и медицине.

Рекомбинантный белок Ab_CoV-2_1.3 может служить компонентом для создания диагностикумов COVID-19.

Уровень техники.

Помимо антител традиционной структуры, животные семейства Верблюдовых обладают антителами, состоящими только из тяжелых цепей иммуноглобулинов (variable heavy-heavy, VII Η-антитела, наноантитела) [Maass DR, 2007]. Этот тип антител образовался в результате мутации в шарнирной области тяжелой цепи, что привело к делении участка связывания тяжелой и легкой цепей. Наноантитела обладают рядом преимуществ перед традиционными и уже широко используются для решения ряда научных и медицинских задач [Van Bockstaele 2009; Gorchakov, Α.Α., 2021]. Получение однодоменных антител, специфичных в отношении вирусных патогенов, является перспективным направлением для конструирования терапевтических препаратов [Detalle L., 2015; Есмагамбетов И.Б., 2021]. В частности, большое число работ посвященных использованию наноантител для противодействия SARS-CoV-2 было опубликовано с начала пандемии COVID-19 [Lu Q, Zhang Ζ, 2021, Zebardast Α., 2022].

Ближайшие аналоги.

Известна разработка американских исследователей по получению наноантитела, специфически связывающегося с RBD SARS-CoV-2, описанная в патенте (межд. заявка WO, 2021/224606, МПК C07K 16/10; А61Р 31/14, опубл. 11.11.2021 г.). Авторы с помощью фагового дисплея отобрали перспективные варианты наноантител, специфически узнающих RBD SARS-CoV-2. Затем переклонировали последовательность отобранного наноантитела в экспрессионный вектор pADL-23c. Продукцию наноантител проводили также BL21(DE3). Принципиальным отличием нашей разработки является другая последовательность, кодирующая наноантитело против SARS-CoV-2. Также разработчики поверяли специфическое взаимодействие полученного наноантитела с одним штаммом Alpha SARS-CoV-2.

Также известна разработка по получению наноантитела, специфически связывающегося с RBD SARS-CoV-2, описанная в патенте (межд. заявка WO, 2022/221120, МПК C07K 16/10; А61Р 31/14, опубл. 20.10.2022 г.). Отличием от нашей разработки является наработка рекомбинантного белка в эукариотических клетках. Как описано в примерах 1 и 2 указанной международной заявки, аминокислотные последовательности 70009-1 и 70009-2 однодоменных VHH были получены из В-лимфоцитов, полученных от ламы, иммунизированной аминокислотами 319-541 SARS-CoV-2 Si. Описанная методика получения наноантител недостаточно технологична. Кроме того, в техническом решении-прототипе отсутствуют результаты электрофореза в ПААГ, что не позволяет оценить выход и чистоту данного белка.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является создание плазмидной генетической конструкции с высоким и стабильным экспрессионным выходом в периплазму бактерий E.coli рекомбинантного белка, обладающего свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2, а также повышение технологичности получения указанного белка.

Технический результат достигается созданием плазмидной генетической конструкции pET21_Ab_CoV-2_1.3, содержащей ген, кодирующий наноантитело, для получения рекомбинантного белка Ab CoV-2_1.3. в прокариотической системе экспрессии E.coli, имеющей размер 5925 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и включающая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1, следующие основные элементы:

- участок начала репликации fl ori (координаты с 12 по 467 п.н) для включения одноцепочечной репликации;

- AmpR promoter (координаты с 494 по 598 п.н.)

- AmpR (координаты с 599 по 1459 п.н.), ген устойчивости к антибиотику ампициллину, позволяющий проводить амплификацию плазмиды в E.coli.;

- участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н) для включения двухцепочечной репликации;

- lad (координаты с 3648 по 4730 п.н.);

- lad promoter (координаты с 4731 по 4808 п.н.)

- T7promoter (координаты с 5117 по 5135 п.н.)

- lac operator (координаты с 5136 по 5160 п.н.)

- сайт связывания рибосомы RBS (координаты с 51 75 по 5197 п.н.)

- Последовательность, кодирующая лидерный пептид pelB (координаты с 5205 по 5270 п.н.), последовательность в составе белка, которая обеспечивает экспорт белка из клетки;

- Ab_CoV-2_1.3. (координаты с 5271 по 5672 п.н.), нуклеотидная последовательность, кодирующая наноантитело против SARS-CoV-2;

- 6xHis (координаты с 5673 по 5690 п.н.) для очистки наноантитела против SARS-CoV-2.

- пептидная метка, обеспечивающая ферментативное биотинилирование AviTag (координаты с 5703 по 5747 п.н.)

- Т7 terminator (координаты с 5853 по 5900 п.н.)

Указанный технический результат достигается также получением рекомбинантного белка AB_COV-2_1.3, обладающего свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2, имеющего молекулярную массу 19,7 кДа и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг. 1, 2. На фиг. 1 изображена физическая и генетическая карта универсального рекомбинантного вектора pET21_Ab_CoV-2_1.3. На фиг. 2 представлено электрофореграмма разделения лизатов E.coli, трансформированных вектором pET21_Ab_CoV-2 1.3. На фиг. 3 приведена нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 рекомбинантной плазмиды pET21_Ab_CoV-2_1.3. На фиг. 4 представлена аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 рекомбинантного белка АВ COV-2 1.3, обладающий] свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2/

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K. etal. Science. 1988, 239(4839):487-491; Sanger F. ctal. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74:5463-5467].

Пример 1. Конструирование вектора pET21_Ab_CoV-2_1.3, обеспечивающего синтез наноантитела против SARS-CoV-2.

В состав вектора рЕТ21а(-) была клонирована последовательность, кодирующая наноантитела против SARS-CoV-2 (фиг. 1). Последовательности праймеров, использованные для сборки плазмиды pET21_Ab_CoV-2_L3, представлены в таблице 1.

С помощью ПЦР была амплифицирована нуклеотидная последовательность Ab_CoV-2_1.3, кодирующая наноантитело против SARS-CoV-2. ПЦР проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл, содержащая 2 мкг ДНК (плазмида pHEN2- Ab_CoV-2_1.3), 10 пкМ каждого праймера (F-Phage и R-Phage) (таблица 1), 10 мкл 5xQ5 реакционного буфера, 10 мкл 5xQ5 High GC Enhancer, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 0.5 ед. Q5 High-Fidelity ДНК-полимеразы, реакцию осуществляли при следующих параметрах: 10с 98°С, 10 с - 58°С, 30 с - 72°С (30 циклов). Еотовые ПЦР-продукты были выделены и очищены из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Еермания) в соответствии с инструкцией производителя.

Предварительно наработанную и очищенную плазмиду рЕТ21а(-) и готовый ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазами рестрикции FauNDI и Sail. Реакцию гидролиза проводили в условиях, рекомендованных производителем. С целью очистки линеаризованного вектора, плазмидную ДНК наносили на 1%-й агарозный гель и выделяли из геля с использованием набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Еермания). Реакцию лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакция проводилась при +4°С в течение ночи. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамм Neb Stable.

Первичную проверку на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с колонии. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл).

Положительные колонии, культивировали в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNAminikit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Первичную структуру экспрессионного вектора подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г.Новосибирск). В результате была получена рекомбинантная плазмида pET21_Ab_CoV-2_1.3., обеспечивающая синтез наноантитела против SARS-CoV-2.

Секвенирование плазмидной ДНК положительных клонов в районе встройки позволило отобрать клоны с отсутствием дефектов встраиваемых генов (вставки, делеции, замены), после чего из отобранных клонов была наработана и выделена целевая плазмидная ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг. 3.

Пример 2. Получение штамма Escherichia Coli - продуцента рекомбинантного белка.

При создании прокариотической системы экспрессии гена Ab_CoV-2_1.3, кодирующего наноантитело против SARS-Cov-2, использовали штамм BL21(DE3) культуры клеток E.coli (Novagen, США).

2.1. Трансформация «компетентных» клеток Е. coli рекомбинантной плазмидой.

К «компетентным» клеткам BL21(DE3) добавляли 10 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду в течение 30 минут. После этого клетки подвергали «температурному шоку» при 42°С в течение 45 сек. Охлаждали клетки на льду в течение 2 минут, затем добавляли 200 мкл среды «S.O.B» (Super Optimal Broth) и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. По окончании инкубации трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (Lysogeny broth) (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл).

2.2. Культивирование трансформированной культуры клеток E.coli и индукция синтеза рекомбинантного белка Ab_CoV-2_1.3

Клетки E.coli штамма BL21(DE3), трансформированные вектором pET21_Ab_CoV-2_1.3., селективно культивировали в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавлением ампициллина натриевой соли в рабочей концентрации 20 μg/ml. Синтез целевого рекомбинантного белка индуцировали 0,5 мМ IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид). Отбор клонов E.coli - продуцентов проводили по наличию синтезируемого целевого белка по результатам электрофореза лизатов клеток в 10% -ном полиакриламидном геле (фиг. 2) с додецилсульфатом натрия (SDS-ПΑΑΓ) (см. пример 3). В качестве контроля использовали, полученный аналогичным способом, неиндуцированный лизат клеток E.coli штамма BL21(DE3), содержащий векторную плазмиду рЕТ21_Ab_CoV-2_1.3.

Пример 3. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ΠΑΑΓ)

Электрофорез проводили в разрешающем геле (состав: 30% акриламида; 1,5 Μ Tris (рН 8,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED (tetramethylethylenediamine) 1 мкл/мл) и концентрирующем геле (состав: 30% акриламида; 1М Tris (pH 6,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED 1 мкл/мл) в различных буферных растворах (верхний - 5Х трис-глициновый буферный раствор рН 8,3 (состав: 1,25 мМ Tris; 1,25 Μ глицина; 0,5% SDS), нижний - IX трис-ацетатный буферный раствор рН 8,0 (состав: 40 мМ Tris-HCl; 40 мМ уксусной кислоты; 2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Биологический материал смешивали с буферным раствором для нанесения, кипятили 5 минут и наносили в верхний концентрирующий гель. SDS-ΠΑΑΕ вели при напряжении ~10 В/см в концентрирующем геле, ~180 В в разрешающем геле. Окраску гелей проводили при помощи раствора Кумасси G-250.

Пример 4. Очистка рекомбинантного белка Ab_CoV-2_1.3 в денатурирующих условиях

Очистку рекомбинантного белка Ab_CoV-2_1.3, содержащего полигистидиновый блок, проводили аффинной хроматографией на Ni-хеллатной смоле, согласно протоколу фирмы-производителя (Qiagen). Полученные клеточные лизаты штамма E.coli - продуцента и очищенный рекомбинантной белок анализировали методом белкового электрофореза по методу Лэммли {Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Nature. 1970; 227(5259):680-685) в SDS-ΠΑΑΕ. В качестве контроля использовали полученный аналогичным способом лизат клеток Е.coli штамма BL21(DE3), содержавший векторную плазмиду рЕТ21а. Электрофоретическая подвижность в 10% SDS-ΠΑΑΕ (см. пример 3) синтезируемого белка, имеющего молекулярную массу 19,7 кДа и аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 4, совпадала с теоретическими расчетами. Концентрацию рекомбинантного белка измеряли визуально по данным электрофореграммы, представленной на фиг. 2, где: 1 - белковые маркеры молекулярной массы (кДа); 2 - индуцированный лизат клеток, трансформированных pET21_Ab_CoV-2_1.3.; 3 – неидуцированный лизат клеток pET21_Ab_CoV-2_1.3., а также с использованием набора «Bio-Rad Protein Assay Kit» в соответствии с рекомендациями производителя на спектрофотометре при длине волны 495 нм и оценивали путем калибровки по овальбумину в 4 Μ растворе мочевины (рН 8,0).

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить вектор pET21_Ab_CoV-2_1.3., содержащий в своем составе ген, кодирующий наноантитело против SARS-Cov-2. Трансформированная рекомбинантной плазмидой культура клеток E.coli BL21/DE3(+) при индукции IPTG осуществляет синтез наноантитела с молекулярной массой 19,7 кДа. На N-конце рекомбинантный белок Ab_CoV-2_1.3 содержит полигистидиновый тракт для аффинной очистки. Данный подход позволяет получать высокоочищенный рекомбинантный белок Ab_CoV-2_1.3.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="PET21_AB_COV-2_1.3.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2022-12-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RU-PET21_AB_COV-2_1.3.</ApplicationNumberText

>

<FilingDate>2022-11-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>RU-PET21_AB_COV-2_1.3.</ApplicantFileReferenc

e>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RU-PET21_AB_COV-2_1.3</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-09</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ГНЦ ВБ &quot;Вектор&quot;

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>State Research Center of Virology and

Biotechnology VECTOR</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle

languageCode="ru">PET21_AB_COV-2_1.3</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>5924</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5924</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>gene</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>5271..5672</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>gene</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>product</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>sig_peptide</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>5205..5270</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>function</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>sig_peptide</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>regulatory</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>5117..5135</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>regulatory_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>promoter</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtg

gtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttccctt

cctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatt

tagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccc

tgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactg

gaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattg

gttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttca

ggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgt

atccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaatatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaa

catttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgc

tggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacag

cggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgcta

tgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcaga

atgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatg

cagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaag

gagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctga

atgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaact

attaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagtt

gcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagc

gtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacac

gacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaag

cattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaattta

aaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca

ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgc

tgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactcttt

ttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttagg

ccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgct

gccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggt

cgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacct

acagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggc

agggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcg

ggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaa

cgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcg

ttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaa

cgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgca

tctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaa

gccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgct

gacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagct

gcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtg

gtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgtt

aatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccg

tgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggt

tactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgg

gaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggta

gccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagact

ttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcg

cttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccggg

tcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctc

gccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgca

agcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccg

gcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgc

ccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtg

agctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgc

attaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttca

ccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccac

gctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtct

tcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgca

ttgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttg

catggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattg

cgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaaca

gcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaa

aataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagct

tccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaa

gattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacc

cagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtg

gcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagct

ccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcggga

aacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccacc

ctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccg

ggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttga

gcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgc

caccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatg

tcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtaga

ggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcc

cctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaatacctattgcctacggcagc

cgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggagtctgggggagga

ttggtgcaggctggggactctctgagtctctcctgtgcagtctctggacgcgccttcagtaggagtgcca

tgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagccgctattagctggagtggtagcac

atactatgcagactccctgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtctatctg

caaatgaacagcctgacacctgaggacacggccgtttattactgtgcagcagataccgatcccccgtggt

atcatagtgctagtgtctacgaaaggaggtatgattactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctc

aggtagcggtagtggtgtcgaccatcatcaccatcatcatggtagcggatccggtctgaatgatattttt

gaagcccagaaaatcgaatggcacgaataataggcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgag

atccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcata

accccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>134</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..134</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QVQLQESGGGLVQAGDSLSLSCAVSGRAFSRSAMGWFRQAPGKEREFVA

AISWSGSTYYADSLKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLTPEDTAVYYCAADTDPPWYHSASVYERRYDYWGQ

GTQVTVSSGSGSGVD</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описана плазмидная генетическая конструкция pET21_Ab_CoV-2_1.3, предназначенная для получения наноантитела против SARS-CoV-2, и рекомбинантный белок AB_CoV-2_1.3, обладающий свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2. Плазмидная генетическая конструкция pET21_Ab__CoV-2_1.3 обеспечивает экспрессию в прокариотической системе Е. coli рекомбинантного белка ABCOV-21.3, обладающего свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2, имеет размер 5925 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NО: 1 и включает в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы: последовательность, кодирующую лидерный пептид pelB, который обеспечивает экспорт белка из клетки; нуклеотидную последовательность Ab_CoV-2_1.3, кодирующую вариабельный фрагмент тяжелой цепи наноантитела против SARS-CoV-2; 6xHis - последовательность для очистки наноантитела против SARS-CoV-2. Рекомбинантный белок AB_COV-2_1.3 обладает свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2, имеет молекулярную массу 19,7 кДа и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Техническим результатом заявленного изобретения является создание плазмидной генетической конструкции с высоким и стабильным экспрессионным выходом в периплазму бактерий E.coli рекомбинантного белка, обладающего свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Плазмидная генетическая конструкция pET21_Ab_CoV-2_1.3, обеспечивающая экспрессию в прокариотической системе Е. coli рекомбинантного белка AB_COV-2_1.3, обладающего свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2, имеющая размер 5925 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID ΝΟ: 1 и содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы:

- участок начала репликации f1 ori бактериофага, имеющий координаты с 12 по 467 п.н;

- AmpR promoter, имеющий координаты с 494 по 598 п.н.;

- AmpR - ген устойчивости к антибиотику ампициллину, имеющий координаты с 599 по 1459 п.н.;

- участок начала репликации ori, имеющий координаты с 1630 по 2218 п.н;

- lacI, имеющий координаты с 3648 по 4730 п.н.;

- lacI - promoter, имеющий координаты с 4731 по 4808 п.н.;

- Т7 - promoter, имеющий координаты с 51 17 по 5135 п.н.;

- lac operator, имеющий координаты с 5136 по 5160 п.н.;

- сайт связывания рибосомы RBS, имеющий координаты с 5175 по 5197 п.н.;

- последовательность, кодирующая лидерный пептид pelB, имеющая координаты с 5205 по 5270 п.н., и последовательность в составе белка, которая обеспечивает экспорт белка из клетки;

- Ab_CoV-2_1.3. - нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельный фрагмент тяжелой цепи наноантитела против SARS-CoV-2, имеющая координаты с 5271 по 5672 п.н.;

- 6xHis - последовательность для очистки наноантитела против SARS-CoV-2, имеющая координаты с 5673 по 5690 п.н.;

- пептидная метка, обеспечивающая ферментативное биотинилирование AviTag, имеющая координаты с 5703 по 5747 п.н.;

- Т7 terminator, имеющий координаты с 5853 по 5900 п.н.

2. Рекомбинантный белок AB_COV-2_1.3, обладающий свойствами однодоменного наноантитела против SARS-CoV-2, имеющий молекулярную массу 19,7 кДа и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.