КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ СЕЛЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКА Российский патент 2024 года по МПК A61K39/00 

РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент США с порядковым номером 62/574188, поданной 18 октября 2017 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная ASCII-копия, созданная 17 октября 2018 года, имеет название N2067-7136WO_SL.txt, и ее размер составляет 2052554 байт.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Множество терапевтических белков были разработаны в качестве важных препаратов для предупреждения или лечения заболеваний. Во время или после лечения могут наблюдаться побочные эффекты, варьирующиеся от утраты эффективности лекарственного средства до опасных токсических явлений. Требуется разработка стратегий, осуществляющих модуляцию уровня экспрессии терапевтических белков, например, модуляцию уровней терапевтических белков для увеличения эффективности и/или уменьшения побочных эффектов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении, по крайней мере помимо прочего, представлен слитый полипептид, содержащий полипептид, связывающий соединение формулы (I) (COF1)/CRBN, полипептид, связывающий соединение формулы (II) (COF2)/CRBN, или полипептид, связывающий соединение формулы (III) (COF3)/CRBN, предназначенный для нацеливаемой инактивации белков. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит один или несколько COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающих полипептидов и один или несколько гетерологичных полипептидов, например, представляющих интерес полипептидов. COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид может быть функционально связан с гетерологичным полипептидом, например, через линкер. В некоторых вариантах осуществления в присутствии COF1 или COF2 (такого как талидомид и его производные (например, леналидомид, помалидомид и талидомид)) или в присутствии COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29) COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид изменяет уровень и/или активность слитого полипептида; например, увеличивает деградацию, например, протеасомную деградацию, слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида является убиквитин-зависимой.

Без ограничения какой-либо теорией, в некоторых вариантах осуществления в COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающем полипептиде предусмотрены аминокислотная последовательность и/или структурный мотив, которые в присутствии COF1 или COF2 (такого как талидомид и его производные (например, леналидомид, помалидомид и талидомид)) или в присутствии COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29) приводят к посттрансляционной модификации (например, убиквитинированию) слитого полипептида, что приводит к модифицированному, например, убиквитинированному, слитому полипептиду. Например, одна или несколько аминокислот, например, лизин или метионин, в слитом полипептиде могут подвергаться убиквитинированию в присутствии COF1, COF2 или COF3. В некоторых вариантах осуществления убиквитинированный слитый полипептид подвергается селективной деградации. В некоторых вариантах осуществления посттрансляционная модификация слитого полипептида увеличивает деградацию (например, увеличивает уровень и/или скорость деградации) слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления уровень и/или скорость деградации увеличиваются в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз относительно уровня и/или скорости деградации эталонного полипептида, например, слитого полипептида в отсутствие COF1, COF2 или COF3, гетерологичного полипептида или слияния гетерологичного полипептида без COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида или с фрагментом, отличным от COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида.

В одном аспекте данного документа представлен слитый полипептид, содержащий полипептид, связывающий соединение формулы (I) (COF1)/CRBN, и гетерологичный полипептид, где соединение формулы (I) представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат, сольват или таутомер, где:

X представляет собой O или S;

R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2, 3 или 4; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой гетерологичный полипептид млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой гетерологичный бактериальный полипептид. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой гетерологичный вирусный полипептид. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид содержит аминокислотную последовательность или получен из полипептида млекопитающего, бактериального полипептида, вирусного полипептида, полипептида растения, полипептида дрожжей, полипептида гриба, полипептида археи, полипептида рыбы, например, данио-рерио. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид содержит полипептид из таблицы 2, например, цитоплазматический и/или ядерный полипептид или трансмембранный полипептид, описанные в таблице 2.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид слит с гетерологичным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид связаны с помощью пептидной связи. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид связаны с помощью связи, отличной от пептидной связи. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид связан непосредственно с COF1/CRBN-связывающим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид связан опосредованно с COF1/CRBN-связывающим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид функционально связаны через линкер, например, глицин-сериновый линкер, например, линкер, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, 37, 38, 39 и 99.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид связан с C-концом гетерологичного полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид связан с N-концом гетерологичного полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид находится посередине гетерологичного полипептида.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация COF1/CRBN-связывающего полипептида с цереблоном (CRBN) в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид не связывается с CRBN в отсутствие COF1. В некоторых вариантах осуществления ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид не связывается с CRBN в отсутствие COF1. В некоторых вариантах осуществления ассоциация или связывание измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид или слитый полипептид подвергается убиквитинированию по одному или нескольким остаткам лизина или метионина в присутствии COF1. В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование измеряется в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида опосредуется убиквитинированием в присутствии COF1. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида опосредуется лизосомой. В некоторых вариантах осуществления деградация измеряется в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид представляет собой полипептид клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления скорость рециклирования слитого полипептида с клеточной поверхности во внутриклеточный компартмент в отсутствие COF1 составляет, например, не более 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, или 90% от рециклирования слитого полипептида с клеточной поверхности во внутриклеточный компартмент в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления рециклирование измеряется в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид составляет от 10 до 95 аминокислотных остатков в длину, от 15 до 90 аминокислотных остатков в длину, от 20 до 85 аминокислотных остатков в длину, от 25 до 80 аминокислотных остатков в длину, от 30 до 75 аминокислотных остатков в длину, от 35 до 70 аминокислотных остатков в длину, от 40 до 65 аминокислотных остатков в длину, от 45 до 65 аминокислотных остатков в длину, от 50 до 65 аминокислотных остатков в длину или от 55 до 65 аминокислотных остатков в длину.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-шпильку. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-шпильку из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-нить. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-нить из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит альфа-спираль. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит альфа-спираль из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить и первую альфа-спираль. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить и первую альфа-спираль из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить, первую альфа-спираль и вторую альфа-спираль. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить, первую альфа-спираль и вторую альфа-спираль из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления бета-шпилька и вторая альфа-спираль разделены не более чем 60, 50, 40 или 30 аминокислотными остатками.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит COF1/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе полипептида или его COF1/CRBN-связывающего варианта. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит COF1/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе полипептида IKZF или его COF1/CRBN-связывающего варианта. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит COF1/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4 или IKZF5 или их COF1/CRBN-связывающего варианта. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающая последовательность содержит две или более прерывистые последовательности из встречающегося в природе полипептида, например, встречающегося в природе полипептида IKZF, например, встречающегося в природе IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4 или IKZF5.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит полипептид IKZF или его структурный мотив.

В некоторых вариантах осуществления полипептид IKZF представляет собой полипептид IKZF1, полипептид IKZF3, полипептид IKZF2 с заменой H141Q (пронумерованной в соответствии с SEQ ID NO: 21) или полипептид IKZF4 с заменой H188Q (пронумерованной в соответствии с SEQ ID NO: 22).

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из IKZF (например, IKZF1 или IKZF3), так что:

i) ассоциация COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит от приблизительно 10 до приблизительно 95 аминокислотных остатков, от приблизительно 15 до приблизительно 90 аминокислотных остатков, от приблизительно 20 до приблизительно 85 аминокислотных остатков, от приблизительно 25 до приблизительно 80 аминокислотных остатков, от приблизительно 30 до приблизительно 75 аминокислотных остатков, от приблизительно 35 до приблизительно 70 аминокислотных остатков, от приблизительно 40 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 45 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 50 до приблизительно 65 аминокислотных остатков или от приблизительно 55 до приблизительно 65 аминокислотных остатков из IKZF1 или IKZF3.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5) или последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками (например, последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками) (например, последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 136-180 из SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-170 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-170 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-170 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6) или последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-170 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 или 30 аминокислотными остатками (например, последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-170 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, или 30 аминокислотными остатками) (например, последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, или 30 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 136-170 из SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления один, два, три или все из следующих аминокислотных остатков остаются неизмененными: глутамин в положении 147, цистеин в положении 148, глутамин в положении 150, глицин в положении 152, лейцин в положении 161 или лейцин в положении 162, пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается глутамин в положении 147, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается цистеин в положении 148, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается глутамин в положении 150, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается глицин в положении 152, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается лейцин в положении 161, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается лейцин в положении 162, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-139 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19), например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-170 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 78.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 236-249 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11) или последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками (например, последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками) (например, последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 236-249 из SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 91.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 и 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 и 236-249 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF1 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF1, например, избытка COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит первую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, первую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5), или первую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками (например, первую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками); и вторую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, вторую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11), или вторую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками (например, вторую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками).

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-180 и 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит первую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19), и вторую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность MALEKMALEKMALE (SEQ ID NO: 91). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 85. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 85.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит первую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 136-170 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19), и вторую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность MALEKMALEKMALE (SEQ ID NO: 91). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 86.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит на по меньшей мере один лизин меньше, чем соответствующая нативная последовательность. В некоторых вариантах осуществления один или несколько остатков лизина в соответствующей нативной последовательности заменены на другую аминокислоту, например, аргинин. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит менее 1, 2, 3, 4 или 5 остатков лизина. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид не содержит остаток лизина. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид не подвергается убиквитинированию, например, в присутствии COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, необязательно, где убиквитинирование измеряется в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 41, 42 и 43. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой иммуномодулирующее лекарственное средство на основе имида (IMiD) или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления COF1 характеризуется структурой формулы (I-a):

или ее фармацевтически приемлемой соли, сложного эфира, гидрата или таутомера, где:

кольцо A представляет собой карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

M отсутствует или представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил или C₁-C₆гетероалкил, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

R^3a представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N (R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2 или 3;

o составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления формулы (I-a) X представляет собой O. В некоторых вариантах осуществления M отсутствует. В некоторых вариантах осуществления кольцо A представляет собой гетероциклил (например, азотсодержащий гетероциклил, например, 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолин-1,3-дион). В некоторых вариантах осуществления R⁴ представляет собой оксо или OR^B (например, -OCH₃ или -OCH₂CH₃), и o составляет 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу. В некоторых вариантах осуществления R^3a представляет собой гетероалкил (например, -CH₂NHC(O)CH₂), -N(R^C)(R^D) (например, -NH₂) или -N(R^C)C(O)R^A (например, -NHC(O)CH₃). В некоторых вариантах осуществления n составляет 0.

В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой талидомид или его аналог или фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления COF1 выбрано из группы, состоящей из леналидомида, помалидомида, талидомида и 2-(4-(трет-бутил)фенил)-N-((2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)метил)ацетамида или их фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления COF1 выбрано из группы, состоящей из:

или их фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или его аналог или фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид дополнительно содержит домен деградации, где домен деградации отделен от COF1/CRBN-связывающего полипептида и гетерологичного полипептида с помощью гетерологичного сайта расщепления протеазами.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу:

i) домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, гетерологичный полипептид и COF1/CRBN-связывающий полипептид;

ii) домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид;

iii) COF1/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации; или

iv) гетерологичный полипептид и COF1/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, гетерологичный полипептид и COF1/CRBN-связывающий полипептид.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации имеет первое состояние, ассоциированное с первым уровнем экспрессии слитого полипептида, и второе состояние, ассоциированное со вторым уровнем экспрессии слитого полипептида, где второй уровень увеличивается, например, в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 20 или 30 раз, по сравнению с первым уровнем в присутствии стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления в отсутствие стабилизирующего соединения слитый полипептид подвергается деградации под действием клеточного пути деградации, например, подвергается деградации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более слитого полипептида, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления в присутствии стабилизирующего соединения:

i) домен деградации принимает конформацию, которая является более устойчивой к клеточной деградации относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения; или

ii) конформация слитого полипептида более восприимчива к расщеплению в гетерологичном сайте расщепления протеазами относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации выбран из домена эстрогенового рецептора (ER), домена белка FKB (FKBP) или домена дигидрофолатредуктазы (DHFR).

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 46 или 48. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48.

В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или 4-гидрокситамоксифен (4-OHT) или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER), и стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен белка FKB (FKBP). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой Shield-1 или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен дигидрофолатредуктазы (DHFR). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой триметоприм или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием внутриклеточной протеазы млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием протеазы, выбранной из группы, состоящей из фурина, PCSK1, PCSK5, PCSK6, PCSK7, катепсина B, гранзима B, фактора XA, энтерокиназы, гененазы, сортазы, протеазы precission, тромбина, протеазы TEV и эластазы-1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит последовательность, имеющую мотив расщепления, выбранный из группы, состоящей из консенсусного мотива RX(K/R)R (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 52), консенсусного мотива RXXX[KR]R (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 53), консенсусного мотива RRX (SEQ ID NO: 54), консенсусного мотива I-E-P-D-X (SEQ ID NO: 55), Ile-Glu/Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 56), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 57), Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO: 58), консенсусного мотива LPXTG/A (SEQ ID NO: 59), Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 60), Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 61), E-N-L-Y-F-Q-G (SEQ ID NO: 62) и [AGSV]-X (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 63). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием фурина. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит сайт расщепления фурином, выбранный из группы, состоящей из RTKR (SEQ ID NO: 123); GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG (SEQ ID NO: 125); GTGAEDPRPSRKRR (SEQ ID NO: 127); LQWLEQQVAKRRTKR (SEQ ID NO: 129); GTGAEDPRPSRKRRSLGG (SEQ ID NO: 131); GTGAEDPRPSRKRRSLG (SEQ ID NO: 133); SLNLTESHNSRKKR (SEQ ID NO: 135); CKINGYPKRGRKRR (SEQ ID NO: 137) и SARNRQKR (SEQ ID NO: 34). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами не содержит аминокислотную последовательность SARNRQKR (SEQ ID NO: 34). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит сайт расщепления фурином GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG (SEQ ID NO: 125). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием внеклеточной протеазы млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная протеаза млекопитающего выбрана из группы, состоящей из фактора XA, энтерокиназы, гененазы, сортазы, протеазы precission, тромбина, протеазы TEV и эластазы-1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Ile-Glu/Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 56), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 57), Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO: 58), консенсусного мотива LPXTG/A (SEQ ID NO: 59), Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 60), Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 61), E-N-L-Y-F-Q-G (SEQ ID NO: 62) и [AGSV]-X (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 63).

В одном аспекте данного документе представлен слитый полипептид, содержащий первый домен и второй домен, разделенные гетерологичным сайтом расщепления протеазами, где первый домен содержит домен деградации, а второй домен содержит полипептид, связывающий соединение формулы (II) (COF2)/CRBN, и гетерологичный полипептид, например, гетерологичный полипептид млекопитающего, бактериальный или вирусный полипептид, где соединение формулы (II) представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат, таутомер или пролекарство, где:

X представляет собой O или S;

R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

каждый из R¹⁰ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), или -N (R^C)S(O)_xR^E, или L-метку; где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R¹¹;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, C(O)R^A, -C(O)OR^B, OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R¹¹ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, галоген, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый L независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, -C(O)R^A1, -C(O)OR^B1, -OR^B1, -N(R^C1)(R^D1), -C(O)N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^A1, -S(O)_xR^E1, -S(O)_xN(R^C1)(R^D1) или -N (R^C1)S(O)_xR^E1, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R¹²;

каждая метка представляет собой нацеливающий фрагмент, способный к связыванию с белком-мишенью;

каждый из R^A1, R^B1, R^C1, R^D1, и R^E1 независимо представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R¹²;

каждый R¹² независимо представляет собой C₁-C₆алкил, галоген, циано, карбоциклил или гетероциклил;

n составляет 0, 1, 2, 3 или 4; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации имеет первое состояние, ассоциированное с первым уровнем экспрессии слитого полипептида, и второе состояние, ассоциированное со вторым уровнем экспрессии слитого полипептида, где второй уровень увеличивается, например, в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 20 или 30 раз, по сравнению с первым уровнем в присутствии стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления в отсутствие стабилизирующего соединения слитый полипептид подвергается деградации под действием клеточного пути деградации, например, подвергается деградации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более слитого полипептида, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления в присутствии стабилизирующего соединения:

i) домен деградации принимает конформацию, которая является более устойчивой к клеточной деградации относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения; или

ii) конформация слитого полипептида более восприимчива к расщеплению в гетерологичном сайте расщепления протеазами относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации выбран из домена эстрогенового рецептора (ER), домена белка FKB (FKBP) или домена дигидрофолатредуктазы (DHFR).

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 46 или 48. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48.

В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен, или 4-гидрокситамоксифен (4-OHT), или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER), и стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен белка FKB (FKBP). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой Shield-1 или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен дигидрофолатредуктазы (DHFR). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой триметоприм или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием внутриклеточной протеазы млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием протеазы, выбранной из группы, состоящей из фурина, PCSK1, PCSK5, PCSK6, PCSK7, катепсина B, гранзима B, фактора XA, энтерокиназы, гененазы, сортазы, протеазы precission, тромбина, протеазы TEV и эластазы-1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит последовательность, имеющую мотив расщепления, выбранный из группы, состоящей из консенсусного мотива RX(K/R)R (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 52), консенсусного мотива RXXX[KR]R (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 53), консенсусного мотива RRX (SEQ ID NO: 54), консенсусного мотива I-E-P-D-X (SEQ ID NO: 55), Ile-Glu/Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 56), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 57), Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO: 58), консенсусного мотива LPXTG/A (SEQ ID NO: 59), Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 60), Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 61), E-N-L-Y-F-Q-G (SEQ ID NO: 62) и [AGSV]-X (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 63). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием фурина. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит сайт расщепления фурином выбранный из группы, состоящей из RTKR (SEQ ID NO: 123); GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG (SEQ ID NO: 125); GTGAEDPRPSRKRR (SEQ ID NO: 127); LQWLEQQVAKRRTKR (SEQ ID NO: 129); GTGAEDPRPSRKRRSLGG (SEQ ID NO: 131); GTGAEDPRPSRKRRSLG (SEQ ID NO: 133); SLNLTESHNSRKKR (SEQ ID NO: 135); CKINGYPKRGRKRR (SEQ ID NO: 137); и SARNRQKR (SEQ ID NO: 34). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами не содержит аминокислотную последовательность SARNRQKR (SEQ ID NO: 34). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит сайт расщепления фурином GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG (SEQ ID NO: 125). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием внеклеточной протеазы млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная протеаза млекопитающего выбрана из группы, состоящей из фактора XA, энтерокиназы, гененазы, сортазы, протеазы precission, тромбина, протеазы TEV и эластазы-1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Ile-Glu/Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 56), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 57), Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO: 58), консенсусного мотива LPXTG/A (SEQ ID NO: 59), Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 60), Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 61), E-N-L-Y-F-Q-G (SEQ ID NO: 62) и [AGSV]-X (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 63).

В некоторых вариантах осуществления домен деградации слит с гетерологичным сайтом расщепления протеазами, который дополнительно слит со вторым доменом.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу:

i) домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, гетерологичный полипептид и COF2/CRBN-связывающий полипептид;

ii) домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, COF2/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид;

iii) COF2/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации; или

iv) гетерологичный полипептид и COF2/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, гетерологичный полипептид и COF2/CRBN-связывающий полипептид. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, COF2/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: COF2/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: гетерологичный полипептид и COF2/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация COF2/CRBN-связывающего полипептида с цереблоном (CRBN) в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид не связывается с CRBN в отсутствие COF2. В некоторых вариантах осуществления ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид не связывается с CRBN в отсутствие COF2. В некоторых вариантах осуществления ассоциация и/или связывание измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид или слитый полипептид подвергается убиквитинированию по одному или нескольким остаткам лизина или метионина в присутствии COF2. В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование измеряется в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида опосредуется убиквитинированием в присутствии COF2. В некоторых вариантах осуществления деградация измеряется в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид составляет от 10 до 95 аминокислотных остатков в длину, от 15 до 90 аминокислотных остатков в длину, от 20 до 85 аминокислотных остатков в длину, от 25 до 80 аминокислотных остатков в длину, от 30 до 75 аминокислотных остатков в длину, от 35 до 70 аминокислотных остатков в длину, от 40 до 65 аминокислотных остатков в длину, от 45 до 65 аминокислотных остатков в длину, от 50 до 65 аминокислотных остатков в длину или от 55 до 65 аминокислотных остатков в длину.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-шпильку. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-шпильку из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-нить. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-нить из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит альфа-спираль. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит альфа-спираль из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить и первую альфа-спираль. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить и первую альфа-спираль из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить, первую альфа-спираль и вторую альфа-спираль. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить, первую альфа-спираль и вторую альфа-спираль из IKZF1 или IKZF3 (например, IKZF1 или IKZF3 человека). В некоторых вариантах осуществления бета-шпилька и вторая альфа-спираль разделены не более чем 60, 50, 40 или 30 аминокислотными остатками.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит COF2/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе полипептида или его COF2/CRBN-связывающего варианта. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит COF2/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе полипептида IKZF или его COF2/CRBN-связывающего варианта. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит COF2/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4 или IKZF5 или их COF2/CRBN-связывающего варианта. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающая последовательность содержит две или более прерывистые последовательности из встречающегося в природе полипептида, например, встречающегося в природе полипептида IKZF, например, встречающегося в природе IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4 или IKZF5.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит полипептид IKZF или его структурный мотив.

В некоторых вариантах осуществления полипептид IKZF представляет собой полипептид IKZF1, полипептид IKZF3, полипептид IKZF2 с заменой H141Q (пронумерованной в соответствии с SEQ ID NO: 21) или полипептид IKZF4 с заменой H188Q (пронумерованной в соответствии с SEQ ID NO: 22).

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из IKZF (например, IKZF1 или IKZF3), так что:

i) ассоциация COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит от приблизительно 10 до приблизительно 95 аминокислотных остатков, от приблизительно 15 до приблизительно 90 аминокислотных остатков, от приблизительно 20 до приблизительно 85 аминокислотных остатков, от приблизительно 25 до приблизительно 80 аминокислотных остатков, от приблизительно 30 до приблизительно 75 аминокислотных остатков, от приблизительно 35 до приблизительно 70 аминокислотных остатков, от приблизительно 40 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 45 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 50 до приблизительно 65 аминокислотных остатков или от приблизительно 55 до приблизительно 65 аминокислотных остатков из IKZF1 или IKZF3.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5) или последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками (например, последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками) (например, последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 136-180 из SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-170 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-170 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-170 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6) или последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-170 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, или 30 аминокислотными остатками (например, последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-170 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, или 30 аминокислотными остатками) (например, последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, или 30 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 136-170 из SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления один, два, три или все из следующих аминокислотных остатков остаются неизмененными: глутамин в положении 147, цистеин в положении 148, глутамин в положении 150, глицин в положении 152, лейцин в положении 161 или лейцин в положении 162, пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается глутамин в положении 147, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается цистеин в положении 148, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается глутамин в положении 150, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается глицин в положении 152, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается лейцин в положении 161, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления неизмененным остается лейцин в положении 162, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-139 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19), например, COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-170 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 78.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 236-249 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11) или последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками (например, последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками) (например, последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 236-249 из SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 91.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 и 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, достаточную аминокислотную последовательность и/или структурный мотив из аминокислотных остатков 136-180 и 236-249 из SEQ ID NO: 19), так что:

i) ассоциация COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации COF2/CRBN-связывающего полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования гетерологичного полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе; или

v) деградация слитого полипептида в отсутствие COF2 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF2, например, избытка COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления ассоциация, убиквитинирование и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит первую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, первую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5), или первую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками (например, первую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 136-180 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками); и вторую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) (например, вторую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11), или вторую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из IKZF3 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 19) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками (например, вторую последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 236-249 из SEQ ID NO: 19 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотными остатками).

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-180 и 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит первую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 136-180 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19), и вторую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность MALEKMALEKMALE (SEQ ID NO: 91). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 85. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 85.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит первую последовательность, содержащую аминокислотные остатки 136-170 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19), и вторую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность MALEKMALEKMALE (SEQ ID NO: 91). В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 86.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит на по меньшей мере один лизин меньше, чем соответствующая нативная последовательность. В некоторых вариантах осуществления один или несколько остатков лизина в соответствующей нативной последовательности заменены на другую аминокислоту, например, аргинин. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит менее 1, 2, 3, 4 или 5 остатков лизина. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид не содержит остаток лизина. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид не подвергается убиквитинированию, например, в присутствии COF2, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, необязательно, где убиквитинирование измеряется в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 41, 42 и 43. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43.

В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления COF2 представляет собой иммуномодулирующее лекарственное средство на основе имида (IMiD) или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления COF2 характеризуется структурой формулы (I):

или ее фармацевтически приемлемой соли, сложного эфира, гидрата, сольвата или таутомера, где:

X представляет собой O или S;

R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2, 3 или 4; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления COF2 характеризуется структурой формулы (I-a):

или ее фармацевтически приемлемой соли, сложного эфира, гидрата или таутомера, где:

кольцо A представляет собой карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

M отсутствует или представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил или C₁-C₆гетероалкил, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

R^3a представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N (R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2 или 3;

o составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления COF2 представляет собой талидомид или его аналог или фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF2 выбрано из группы, состоящей из леналидомида, помалидомида, талидомида и 2-(4-(трет-бутил)фенил)-N-((2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)метил)ацетамида или их фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления COF2 выбрано из группы, состоящей из:

или их фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления COF2 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF2 представляет собой леналидомид или его аналог или фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF2 представляет собой леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит структуру формулы (I):

или ее фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат, сольват или таутомер, где:

X представляет собой O или S;

R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2, 3 или 4; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит структуру формулы (I-a):

или ее фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат или таутомер, где:

кольцо A представляет собой карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

M отсутствует или представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил или C₁-C₆гетероалкил, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

R^3a представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N (R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2 или 3;

o составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит иммуномодулирующее лекарственное средство на основе имида (IMiD) или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит талидомид или его аналог или фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит леналидомид, помалидомид, талидомид и 2-(4-(трет-бутил)фенил)-N-((2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)метил)ацетамид или их фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из:

или их фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит леналидомид или его аналог или фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления COF2 дополнительно содержит лиганд (например, где R¹⁰ в формуле (II) представляет собой L-метку). В некоторых вариантах осуществления R¹⁰ в формуле (II) представляет собой L-метку, при этом L представляет собой линкер, выбранный из линкера, раскрытого в публикации международной патентной заявки № WO2017/024318 (например, фигуры 28-31), а метка выбрана из лиганда, нацеливающегося на dTAG, раскрытого в публикации международной патентной заявки № WO2017/024318 (например, таблица T, страницы 119-129). В некоторых вариантах осуществления COF2 содержит IMiD (например, леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль) и лиганд, где IMiD (например, леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемая соль) связаны с лигандом, например, через линкер. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид связывается с лигандом, и при этом связывание между COF2/CRBN-связывающим полипептидом и IMiD (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью) в отсутствие лиганда составляет не более 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 или 10% от связывания между COF2/CRBN-связывающим полипептидом и лигандом, например, COF2/CRBN-связывающий полипептид не связывается с IMiD (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью), необязательно, где COF2/CRBN-связывающий полипептид выбран из dTAG, раскрытого в публикации международной патентной заявки № WO2017/024318 (например, страницы 36-65).

В одном аспекте данного документа представлен слитый полипептид, содержащий полипептид, связывающий соединение формулы (III) (COF3)/CRBN, и гетерологичный полипептид, где соединение формулы (III) представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат, сольват или таутомер, где:

X₁ представляет собой CR₃;

необязательно представляет собой двойную связь, если X₁ представляет собой CR₃ и R₃ отсутствует;

каждый R₁ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆галогеналкил, C₁-C₆гидроксиалкил или галоген, или

два R₁ вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклильное кольцо, или

два R₁, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членное гетероарильное кольцо, содержащее 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S;

R₂ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, -C(O)C₁-C₆алкил, -C(O)(CH₂)_0-3-C₆-C₁₀арил, -C(O)O(CH₂)_0-3-C₆-C₁₀арил, C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где алкил необязательно замещен одним или несколькими R₄; и арил, гетероарил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими R₅, или

R₁ и R₂, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклильное кольцо;

R₃ представляет собой водород, или R₃ отсутствует, если представляет собой двойную связь;

каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, -C(O)NR₆R_6', -NR₆C(O)R_6', галогена, -OH, -NH₂, циано, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-4 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклильного кольца, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, гетероарил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими R₇;

каждый R₅ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₂-C₆алкенила, C₂-C₆алкинила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂, циано, C₃-C₇карбоциклила, 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₆-C₁₀арила и 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, или

два R₅, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀, или

два R₅, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₅-C₇карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀;

каждый R₆ и R_6' независимо представляет собой водород, C₁-C₆алкил или C₆-C₁₀арил;

каждый R₇ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₂-C₆алкенила, C₂-C₆алкинила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, -C(O)R₈, -(CH₂)_0-3C(O)OR₈, -C(O)NR₈R₉, -NR₈C(O)R₉, -NR₈C(O)OR₉, -S(O)_pNR₈R₉, -S(O)_pR₁₂, (C₁-C₆)гидроксиалкила, галогена, -OH, -O(CH₂)_1-3CN, -NH₂, циано, -O(CH₂)_0-3-C₆-C₁₀арила, адамантила, -O(CH₂)_0-3-5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₆-C₁₀арила, моноциклического или бициклического 5-10-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₇ карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где алкил необязательно замещен одним или несколькими R₁₁, и арил, гетероарил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими заместителями, каждый из которых независимо выбран из галогена, C₁-C₆алкила, C₁-C₆галогеналкила и C₁-C₆алкокси, или

два R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют =(O), или

два R₇, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀, или

два R₇ вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₅-C₇карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀;

каждый R₈ и R₉ независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R₁₀ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂ и циано, или

два R₁₀ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют =(O);

каждый R₁₁ независимо выбран из циано, C₁-C₆алкокси, C₆-C₁₀арила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где каждый арил и гетероциклил необязательно замещен одним или несколькими заместителями, каждый из которых независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂ и циано;

R₁₂ представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆галогеналкил, C₆-C₁₀арил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S;

R_x представляет собой водород или дейтерий;

p составляет 0, 1 или 2;

n составляет 0, 1 или 2;

y составляет 1 или 2, где n+y≤3; и

q составляет 0, 1, 2, 3 или 4.

В одном варианте осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-b):

или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, пролекарство, стереоизомер и таутомер, где X₁, R₁, R₂, n, q и их подпеременные определены, как описано выше для формулы (III).

В одном варианте осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-d):

или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, пролекарство, стереоизомер и таутомер, где R₁, R₂, q, и их подпеременные определены, как описано выше для формулы (III).

В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид слит с гетерологичным полипептидом. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид связаны с помощью пептидной связи. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид связаны с помощью связи, отличной от пептидной связи. В одном варианте осуществления гетерологичный полипептид связан непосредственно с COF3/CRBN-связывающим полипептидом. В одном варианте осуществления гетерологичный полипептид связан опосредованно с COF3/CRBN-связывающим полипептидом. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид функционально связаны через линкер, например, глицин-сериновый линкер, например, линкер, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид связан с C-концом гетерологичного полипептида. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид связан с N-концом гетерологичного полипептида.

В одном варианте осуществления ассоциация слитого полипептида с CRBN в отсутствие COF3 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, или 20% от ассоциации слитого полипептида с CRBN в присутствии COF3, например, избытка COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации. В одном варианте осуществления слитый полипептид не связывается с CRBN в отсутствие COF3. В одном варианте осуществления убиквитинирование слитого полипептида в отсутствие COF3 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от убиквитинирования слитого полипептида в присутствии COF3, например, избытка COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе. В одном варианте осуществления слитый полипептид подвергается убиквитинированию по одному или нескольким остаткам лизина или метионина в присутствии COF3. В одном варианте осуществления деградация слитого полипептида в отсутствие COF3 составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от деградации слитого полипептида в присутствии COF3, например, избытка COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления деградация слитого полипептида опосредуется убиквитинированием в присутствии COF3. В одном варианте осуществления ассоциация, убиквитинирование, и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид составляет от 10 до 95 аминокислотных остатков в длину, от 15 до 90 аминокислотных остатков в длину, от 20 до 85 аминокислотных остатков в длину, от 25 до 80 аминокислотных остатков в длину, от 30 до 75 аминокислотных остатков в длину, от 35 до 70 аминокислотных остатков в длину, от 40 до 65 аминокислотных остатков в длину, от 45 до 65 аминокислотных остатков в длину, от 50 до 65 аминокислотных остатков в длину или от 55 до 65 аминокислотных остатков в длину. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид составляет 59 аминокислотных остатков в длину.

В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-шпильку. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-нить. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит альфа-спираль. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить и первую альфа-спираль. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: первую бета-нить, бета-шпильку, вторую бета-нить, первую альфа-спираль и вторую альфа-спираль. В одном варианте осуществления бета-шпилька и вторая альфа-спираль разделены не более чем 60, 50, 40 или 30 аминокислотными остатками.

В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит COF3/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе полипептида или его COF3/CRBN-связывающего варианта. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит COF3/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе полипептида IKZF или его COF3/CRBN-связывающего варианта. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит COF3/CRBN-связывающую последовательность из встречающегося в природе IKZF2 или его COF3/CRBN-связывающего варианта. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит две или более прерывистые последовательности из встречающегося в природе полипептида IKZF, например, встречающегося в природе IKZF2.

В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 130-174 из IKZF2 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 21). В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 113. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 130-174 из IKZF2 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 21) не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 130-174 из SEQ ID NO: 21 не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержат последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 130-174 из SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 230-243 из IKZF2 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 21). В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 114. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 230-243 из IKZF2 (пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO: 21) не более чем 1, 2, 3, 4, 5 или 10 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит последовательность, которая отличается от аминокислотных остатков 230-243 из SEQ ID NO: 21 не более чем 1, 2, 3, 4, 5 или 10 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит последовательность, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5 или 10 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными остатками 230-243 из SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления неизмененным остается гистидин в положении 141, пронумерованном в соответствии с SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 130-174 из IKZF2 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 21). В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 113. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 230-243 из IKZF2 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 21). В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 114. В одном варианте осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 109.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид дополнительно содержит домен деградации, где домен деградации отделен от COF3/CRBN-связывающего полипептида и гетерологичного полипептида с помощью гетерологичного сайта расщепления протеазами.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу:

i) домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, гетерологичный полипептид и COF3/CRBN-связывающий полипептид;

ii) домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид;

iii) COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации; или

iv) гетерологичный полипептид и COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный сайт расщепления протеазами и домен деградации.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит в направлении от N-конца к C-концу: домен деградации, гетерологичный сайт расщепления протеазами, гетерологичный полипептид и COF3/CRBN-связывающий полипептид.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации имеет первое состояние, ассоциированное с первым уровнем экспрессии слитого полипептида, и второе состояние, ассоциированное со вторым уровнем экспрессии слитого полипептида, где второй уровень увеличивается, например, в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 20 или 30 раз, по сравнению с первым уровнем в присутствии стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления в отсутствие стабилизирующего соединения слитый полипептид подвергается деградации под действием клеточного пути деградации, например, подвергается деградации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более слитого полипептида, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии и/или деградация измеряются в клетке млекопитающего, например, клетке человека.

В некоторых вариантах осуществления в присутствии стабилизирующего соединения:

i) домен деградации принимает конформацию, которая является более устойчивой к клеточной деградации относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения; или

ii) конформация слитого полипептида более восприимчива к расщеплению в гетерологичном сайте расщепления протеазами относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации выбран из домена эстрогенового рецептора (ER), домена белка FKB (FKBP) или домена дигидрофолатредуктазы (DHFR).

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 46 или 48. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48.

В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или 4-гидрокситамоксифен (4-OHT) или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER), и стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен белка FKB (FKBP). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой Shield-1 или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен дигидрофолатредуктазы (DHFR). В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой триметоприм или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием внутриклеточной протеазы млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием протеазы, выбранной из группы, состоящей из фурина, PCSK1, PCSK5, PCSK6, PCSK7, катепсина B, гранзима B, фактора XA, энтерокиназы, гененазы, сортазы, протеазы precission, тромбина, протеазы TEV и эластазы-1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит последовательность, имеющую мотив расщепления, выбранный из группы, состоящей из консенсусного мотива RX(K/R)R (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 52), консенсусного мотива RXXX[KR]R (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 53), консенсусного мотива RRX (SEQ ID NO: 54), консенсусного мотива I-E-P-D-X (SEQ ID NO: 55), Ile-Glu/Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 56), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 57), Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO: 58), консенсусного мотива LPXTG/A (SEQ ID NO: 59), Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 60), Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 61), E-N-L-Y-F-Q-G (SEQ ID NO: 62) и [AGSV]-X (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 63). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием фурина. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит сайт расщепления фурином, выбранный из группы, состоящей из RTKR (SEQ ID NO: 123); GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG (SEQ ID NO: 125); GTGAEDPRPSRKRR (SEQ ID NO: 127); LQWLEQQVAKRRTKR (SEQ ID NO: 129); GTGAEDPRPSRKRRSLGG (SEQ ID NO: 131); GTGAEDPRPSRKRRSLG (SEQ ID NO: 133); SLNLTESHNSRKKR (SEQ ID NO: 135); CKINGYPKRGRKRR (SEQ ID NO: 137) и SARNRQKR (SEQ ID NO: 34). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами не содержит аминокислотную последовательность SARNRQKR (SEQ ID NO: 34). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит сайт расщепления фурином GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG (SEQ ID NO: 125). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами расщепляется под действием внеклеточной протеазы млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная протеаза млекопитающего выбрана из группы, состоящей из фактора XA, энтерокиназы, гененазы, сортазы, протеазы precission, тромбина, протеазы TEV и эластазы-1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Ile-Glu/Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 56), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 57), Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO: 58), консенсусного мотива LPXTG/A (SEQ ID NO: 59), Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 60), Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 61), E-N-L-Y-F-Q-G (SEQ ID NO: 62) и [AGSV]-X (X может быть любой аминокислотой; SEQ ID NO: 63).

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов гетерологичный полипептид выбран из цитоплазматического и/или ядерного полипептида или трансмембранного полипептида, например, гетерологичного полипептида из таблицы 2. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический и/или ядерный полипептид выбран из группы, состоящей из компонента пути апоптоза (например, каспазы 9), компонента системы CRISPR/Cas (например, Cas9), транскрипционного фактора (например, MITF, c-Myc, STAT3, STAT5, NF-каппа-B, бета-катенина, Notch, GLI или c-JUN), Tet-метилцитозиндиоксигеназы-2 (TET2), FKBP и тау-белка. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный полипептид выбран из группы, состоящей из CD62L, CCR1, CCR2, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CTLA4, PD1, BTLA, VISTA, CD137L, CD80, CD86, TIGIT, CD3, CD8, CD19, CD22, CD20, BCMA и химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид выбран из группы, состоящей из химерного антигенного рецептора (CAR), компонента системы CRISPR/Cas (например, Cas9), CD8, CD19 и CD22.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит в направлении от N-конца к C-концу: антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит один или несколько первичных сигнальных доменов. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит один или несколько костимулирующих сигнальных доменов. В некоторых вариантах осуществления один из одного или нескольких первичных сигнальных доменов содержит стимулирующий домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из костимулирующих сигнальных доменов представляют собой внутриклеточный домен из костимулирующего белка, выбранного из группы, состоящей из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, лимфоцитарного функционально-ассоциированного антигена-1 (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 и лиганда, который специфически связывается с CD83. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из указанных костимулирующих сигнальных доменов содержат костимулирующий домен 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из указанных костимулирующих сигнальных доменов содержат костимулирующий домен CD28. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывает антиген, выбранный из группы, состоящей из CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1; лектиноподобной молекулы-1 C-типа, CD33; варианта III рецептора эпидермального фактора роста (EGFRvIII); ганглиозида G2 (GD2); ганглиозида GD3; представителя семейства рецепторов TNF; антигена созревания B-клеток; Tn-антигена ((Tn Ag) или (GalNAcα-Ser/Thr)); простатического специфического мембранного антигена (PSMA); орфанного рецептора-1, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR1); Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3); опухолеассоциированного гликопротеина-72 (TAG72); CD38; CD44v6; раково-эмбрионального антигена (CEA); молекулы адгезии эпителиальных клеток (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); субъединицы альфа-2 рецептора интерлейкина-13; мезотелина; альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-11 (IL-11Ra); антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA); сериновой протеазы-21; рецептора-2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2); антигена системы Льюис (Y); CD24; рецептора фактора роста тромбоцитов бета-типа (PDGFR-бета); стадиеспецифического эмбрионального антигена-4 (SSEA-4); CD20; рецептора фолиевой кислоты альфа-типа; рецепторной тирозинпротеинкиназы ERBB2 (Her2/neu); муцина-1, ассоциированного с клеточной поверхностью (MUC1); рецептора эпидермального фактора роста (EGFR); молекулы адгезии нейронов (NCAM); простазы; простатической кислой фосфатазы (PAP); мутантного фактора элонгации 2 (ELF2M); эфрина B2; белка активации фибробластов альфа (FAP); рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 (рецептора IGF-I), карбоангидразы IX (CAIX); субъединицы-9 протеасомы (просомы, мультикаталитической протеазы) бета-типа (LMP2); гликопротеина 100 (gp100); онкогенного полипептида, состоящего из кластерного региона точечных разрывов (BCR) и гомолога-1 вирусного онкогена лейкоза мышей Абельсона (Abl) (bcr-abl); тирозиназы; эфринового рецептора-2 A-типа (EphA2); фукозил-GM1; молекулы адгезии, представляющей собой сиалилированный антиген системы Льюис (sLe); ганглиозида GM3; трансглютаминазы-5 (TGS5); высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена (HMWMAA); ганглиозида o-ацетил-GD2 (OAcGD2); рецептора фолиевой кислоты бета-типа; маркера-1 эндотелия опухоли (TEM1/CD248); белка, родственного маркеру-7 эндотелия опухоли (TEM7R); клаудина-6 (CLDN6); рецептора тиреотропного гормона (TSHR); представителя D группы 5 класса С рецепторов, сопряженных с G-белком (GPRC5D); белка, кодируемого открытой рамкой считывания 61 X-хромосомы (CXORF61); CD97; CD179a; киназы анапластической лимфомы (ALK); полисиаловой кислоты; плацентоспецифического белка-1 (PLAC1); гексасахаридной части гликоцерамида globoH (GloboH); дифференцировочного антигена молочной железы (NY-BR-1); уроплакина-2 (UPK2); клеточного рецептора-1 вируса гепатита A (HAVCR1); бета-3 адренорецептора (ADRB3); паннексина-3 (PANX3); рецептора-20, сопряженного с G-белком (GPR20); антигена локуса K9 комплекса лимфоцитарных антигенов 6 (LY6K); обонятельного рецептора 51E2 (OR51E2); белка, кодируемого альтернативной рамкой считывания гена TCR-гамма (TARP); белка опухоли Вильмса (WT1); раково-тестикулярного антигена-1 (NY-ESO-1); раково-тестикулярного антигена-2 (LAGE-1a); меланома-ассоциированного антигена-1 (MAGE-A1); белка, кодируемого транслокационным вариантом-6 гена ETS, локализованным в р-плече 12 хромосомы (ETV6-AML); белка-17 сперматозоидов (SPA17); представителя 1А семейства X-антигенов (XAGE1); ангиопоэтин-связывающего рецептора-2 клеточной поверхности 2 (Tie 2); раково-тестикулярного антигена-1 из клеток меланомы (MAD-CT-1); раково-тестикулярного антигена-2 из клеток меланомы (MAD-CT-2); Fos-родственного антигена-1; опухолевого белка p53 (p53); мутанта p53; простеина; сурвивина; теломеразы; опухолевого антигена-1 карциномы предстательной железы, антигена-1 меланомы, распознаваемого T-клетками; мутантного белка саркомы крыс (Ras); обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT); антигенов саркомы с точечными разрывами при транслокации; меланомного ингибитора апоптоза (ML-IAP); ERG (продукта слитого гена трансмембранной сериновой протеазы-2 (TMPRSS2) и ETS); N-ацетилглюкозаминилтрансферазы V (NA17); белка с парным box-доменом Рах-3 (PAX3); андрогенового рецептора; циклина-B1; нейробластомного гомолога вирусного онкогена миелоцитоматоза птиц v-myc (MYCN); представителя С семейства гомологов Ras (RhoC); белка-2, родственного тирозиназе (TRP-2); цитохрома P450 1B1 (CYP1B1); белка, подобного CCCTC-связывающему фактору (белку с "цинковыми пальцами"), антигена плоскоклеточной карциномы 3, распознаваемого Т-клетками (SART3); белка с парным box-доменом Рах-5 (PAX5); проакрозин-связывающего белка sp32 (OY-TES1); лимфоцит-специфической протеинтирозинкиназы (LCK); якорного белка-4 киназы A (AKAP-4); антигена 2 синовиальной саркомы с точечным разрывом в X-хромосоме (SSX2); рецептора конечных продуктов неферментативного гликозилирования (RAGE-1); почечного убиквитарного белка-1 (RU1); почечного убиквитарного белка-2 (RU2); легумаина; Е6 вируса папилломы человека (HPV E6); Е7 вируса папилломы человека (HPV E7); кишечной карбоксилэстеразы; мутантного белка теплового шока 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; иммуноглобулиноподобного рецептора-1, ассоциированного с лейкоцитами (LAIR1); рецептора Fc-фрагмента IgA (FCAR или CD89); представителя 2 подсемейства А иммуноглобулиноподобных рецепторов лейкоцитов (LILRA2); представителя f семейства белков, подобных молекулам CD300 (CD300LF); представителя А семейства 12 лектиновых доменов С-типа (CLEC12A); антигена-2 клеток стромы костного мозга (BST2); белка-2, подобного муциноподобному рецептору гормонов, содержащему EGF-подобный модуль (EMR2); лимфоцитарного антигена-75 (LY75); глипикана-3 (GPC3); белка-5, подобного Fc-рецептору (FCRL5); и полипептида-1, подобного лямбда-цепи иммуноглобулина (IGLL1). В некоторых вариантах осуществления антиген выбран из CD19, CD22, BCMA, CD20, CD123, EGFRvIII или мезотелина. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой CD19. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой CD22. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой BCMA. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой CD20. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой CD123. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой EGFRvIII.

В одном аспекте данного документа представлена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, раскрытый в данном документе. В другом аспекте данного документа представлен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой лентивирусный вектор. В другом аспекте данного документа представлена вирусная частица, содержащая вектор.

В другом аспекте данного документа представлена клетка, например, клетка-хозяин, содержащая слитый полипептид, раскрытый в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, или вектор, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка, например, клетка-хозяин, представляет собой клетку млекопитающего, например, клетку человека, например, эффекторную клетку человека, например, T-клетку человека или NK-клетку человека.

В некоторых вариантах осуществления клетка, например, клетка-хозяин, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR, например, CAR-T-клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка, например, клетка-хозяин, содержит компонент системы CRISPR/Cas. В некоторых вариантах осуществления клетка, например, клетка-хозяин, представляет собой раковую клетку человека, например, опухолевую клетку человека.

В некоторых вариантах осуществления клетка, например, клетка-хозяин, содержит комплекс убиквитинлигазы, например, комплекс убиквитинлигазы E3, где комплекс убиквитинлигазы содержит CRBN.

В некоторых вариантах осуществления клетка содержит слитый полипептид, раскрытый в данном документе (например, слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид), где при приведении клетки в контакт с COF1, например, избытком COF1:

i) ассоциация COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN увеличивается, например, в по меньшей мере 10, 50, 100, 1000 или 10000 раз, по сравнению с ассоциацией COF1/CRBN-связывающего полипептида с CRBN при отсутствии приведения клетки в контакт с COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN увеличивается, например, в по меньшей мере 10, 50, 100, 1000 или 10000 раз, по сравнению с ассоциацией слитого полипептида с CRBN при отсутствии приведения клетки в контакт с COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с убиквитинированием гетерологичного полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с убиквитинированием слитого полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

v) деградация слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с деградацией слитого полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии; или

vi) уровень экспрессии слитого полипептида составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от уровня экспрессии слитого полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит COF1, например, леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления клетка содержит слитый полипептид, раскрытый в данном документе (например, слитый полипептид, содержащий COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид), где при приведении клетки в контакт с COF3, например, избытком COF3:

i) ассоциация COF3/CRBN-связывающего полипептида с CRBN увеличивается, например, в по меньшей мере 10, 50, 100, 1000 или 10000 раз, по сравнению с ассоциацией COF3/CRBN-связывающего полипептида с CRBN при отсутствии приведения клетки в контакт с COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN увеличивается, например, в по меньшей мере 10, 50, 100, 1000 или 10000 раз, по сравнению с ассоциацией слитого полипептида с CRBN при отсутствии приведения клетки в контакт с COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с убиквитинированием гетерологичного полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с убиквитинированием слитого полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

v) деградация слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с деградацией слитого полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии; или

vi) уровень экспрессии слитого полипептида составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от уровня экспрессии слитого полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт с COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит COF3, например, соединение, раскрытое в таблице 29, или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления клетка содержит слитый полипептид, раскрытый в данном документе (например, слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид и домен деградации), где в отсутствие стабилизирующего соединения слитый полипептид подвергается деградации под действием клеточного пути деградации, например, подвергается деградации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более слитого полипептида, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид дополнительно содержит гетерологичный сайт расщепления протеазами. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит протеазу, способную к расщеплению гетерологичного сайта расщепления протеазами.

В некоторых вариантах осуществления клетка содержит слитый полипептид, раскрытый в данном документе (например, слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид и домен деградации), где при приведении клетки в контакт со стабилизирующим соединением, например, избытком стабилизирующего соединения:

i) домен деградации принимает конформацию, которая является более устойчивой к клеточной деградации относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения;

ii) конформация слитого полипептида более восприимчива к расщеплению в гетерологичном сайте расщепления протеазами относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения; или

iii) уровень экспрессии слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с уровнем экспрессии слитого полипептида при отсутствии приведения клетки в контакт со стабилизирующим соединением, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит стабилизирующее соединение. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46.

В некоторых вариантах осуществления клетка содержит слитый полипептид, раскрытый в данном документе (например, слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид и домен деградации), где при приведении клетки в контакт как со стабилизирующим соединением, например, избытком стабилизирующего соединения, так и с COF1, COF2 или COF3, например, избытком COF1, COF2 или COF3:

i) ассоциация COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида с CRBN увеличивается, например, в по меньшей мере 10, 50, 100, 1000 или 10000 раз, по сравнению с ассоциацией COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида с CRBN при приведении клетки в контакт только со стабилизирующим соединением, но не с COF1, COF2 или COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

ii) ассоциация слитого полипептида с CRBN увеличивается, например, в по меньшей мере 10, 50, 100, 1000 или 10000 раз, по сравнению с ассоциацией слитого полипептида с CRBN при приведении клетки в контакт только со стабилизирующим соединением, но не COF1, COF2 или COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, иммунопреципитации;

iii) убиквитинирование гетерологичного полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с убиквитинированием гетерологичного полипептида при приведении клетки в контакт только со стабилизирующим соединением, но не с COF1, COF2 или COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

iv) убиквитинирование слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с убиквитинированием слитого полипептида при приведении клетки в контакт только со стабилизирующим соединением, но не с COF1, COF2 или COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе;

v) деградация слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с деградацией слитого полипептида при приведении клетки в контакт только со стабилизирующим соединением, но не с COF1, COF2 или COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии; или

vi) уровень экспрессии слитого полипептида составляет, например, не более 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, или 70% от уровня экспрессии слитого полипептида при приведении клетки в контакт только со стабилизирующим соединением, но не с COF1, COF2 или COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит COF1 (например, леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль), COF2 (например, леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль) или COF3 (соединение, раскрытое в таблице 29, или его фармацевтически приемлемую соль).

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), необязательно, где CAR содержит в направлении от N-конца к C-концу: антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов.

В одном аспекте, в данном документе раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая слитый полипептид, раскрытый в данном документе, или клетку, раскрытую в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или стабилизатор.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ получения клетки, раскрытой в данном документе.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ деградации слитого полипептида, раскрытого в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, CAR-полипептид)), предусматривающий приведение слитого полипептида или клетки, содержащей указанный слитый полипептид, в контакт с COF1 (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью). В некоторых вариантах осуществления в присутствии COF1 (например, леналидомида или помалидомида или их фармацевтически приемлемой соли) уровень экспрессии указанного слитого полипептида значительно уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии указанного слитого полипептида в отсутствие COF1 (например, леналидомида или помалидомида или их фармацевтически приемлемой соли), например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF1 (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью) ex vivo. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF1 (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью) in vivo.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ регуляции экспрессии слитого полипептида, раскрытого в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептида, гетерологичный полипептид (например, CAR-полипептид) и домен деградации), предусматривающий:

i) приведение слитого полипептида или клетки, содержащей слитый полипептид, в контакт со стабилизирующим соединением, необязательно, где в присутствии стабилизирующего соединения:

a) домен деградации принимает конформацию, которая является более устойчивой к клеточной деградации относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения;

b) конформация слитого полипептида более восприимчива к расщеплению в гетерологичном сайте расщепления протеазами относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения; или

c) уровень экспрессии слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с уровнем экспрессии слитого полипептида в отсутствие стабилизирующего соединения, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) приведение слитого полипептида или клетки, содержащей слитый полипептид, в контакт с COF1 (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью) или COF2 (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью), необязательно, где в присутствии COF1 или COF2 уровень экспрессии слитого полипептида значительно уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии i) и перед стадией ii), например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF1 или COF2 (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью) и/или стабилизирующим соединением ex vivo. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF1 или COF2 (например, леналидомидом или помалидомидом или их фармацевтически приемлемой солью) и/или стабилизирующим соединением in vivo.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит в направлении от N-конца к C-концу: антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ получения клетки, предусматривающий:

i) обеспечение клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, содержащий полипептид, связывающий соединение формулы 1 (COF1)/CRBN, и химерный антигенный рецептор (CAR), необязательно, где CAR содержит в направлении от N-конца к C-концу: антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов; и

ii) приведение клетки в контакт с COF1 ex vivo, необязательно, где:

в присутствии COF1 уровень экспрессии слитого полипептида значительно уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида в отсутствие COF1, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии, где соединение формулы (I) представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат, сольват или таутомер, где:

X представляет собой O или S;

R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2, 3 или 4; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления после приведения клетки в контакт с COF1 ex vivo пролиферация клетки увеличивается, например, в по меньшей мере 1,2, 1,5, 2, 5 или 10 раз, по сравнению с пролиферацией клетки до приведения ее в контакт с COF1. В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100 (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3).

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) приведение клетки, раскрытой в данном документе (например, клетки, содержащей слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR)), в контакт с COF1 ex vivo, необязательно, где:

в присутствии COF1 уровень экспрессии слитого полипептида уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида перед приведением клетки в контакт с COF1 ex vivo, и

ii) введение субъекту эффективного количества клетки, необязательно, где способ дополнительно предусматривает после стадии i) и до стадии ii):

снижение количества COF1, контактирующего с клеткой, например, внутри клетки и/или в ее окружении,

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii):

iii) введение субъекту эффективного количества COF1, необязательно, где введение COF1 уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии ii) и до стадии iii), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) введение COF1 осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) введение COF1 снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iii):

iv) прекращение введения COF1, необязательно, где прекращение введения COF1 увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии iii) и до стадии iv) (например, где прекращение введения COF1 восстанавливает уровень экспрессии слитого полипептида до уровня экспрессии после стадии ii) и до стадии iii)), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) прекращение введения COF1 осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) прекращение введения COF1 приводит к лечению или предупреждению рецидива.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iv):

v) повторение стадии iii) и/или iv),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где COF1/CRBN-связывающий полипептид, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100 (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль вводят из расчета, например, 2,5 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг или 25 мг в день.

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) введение субъекту эффективного количества клетки, раскрытой в данном документе (например, клетки, содержащий слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR)), необязательно, где клетку приводят в контакт с COF1 ex vivo перед введением, необязательно, где:

в присутствии COF1 уровень экспрессии слитого полипептида уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида перед тем, как клетка приводится в контакт с COF1 ex vivo, необязательно, где после приведения клетки в контакт с COF1 ex vivo и перед введением клетки субъекту количество COF1, контактирующего с клеткой, например, внутри клетки и/или в ее окружении, снижают,

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления клетку не приводят в контакт с COF1 ex vivo перед введением.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) введение субъекту эффективного количества COF1, необязательно, где введение COF1 уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) введение COF1 осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) введение COF1 снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii):

iii) прекращение введения COF1, необязательно, где прекращение введения COF1 увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии ii) и до стадии iii) (например, где прекращение введения COF1 восстанавливает уровень экспрессии слитого полипептида до уровня экспрессии после стадии i) и до стадии ii)), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) прекращение введения COF1 осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) прекращение введения COF1 приводит к лечению или предупреждению рецидива.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iii):

iv) повторение стадии ii) и/или iii),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где COF1/CRBN-связывающий полипептид, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100 (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль вводят из расчета, например, 2,5 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг или 25 мг в день.

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) введение эффективного количества COF1 субъекту, где субъект содержит клетку, раскрытую в данном документе (например, клетку, содержащую слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR)), необязательно, где введение COF1 уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида перед введением COF1, необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) введение COF1 осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) введение COF1 снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) прекращение введения COF1, необязательно, где прекращение введения COF1 увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii) (например, где прекращение введения COF1 восстанавливает уровень экспрессии слитого полипептида до уровня экспрессии перед введением COF1), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) прекращение введения COF1 осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) прекращение введения COF1 приводит к лечению или предупреждению рецидива.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii):

iii) повторение стадии i) и/или ii),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где COF1/CRBN-связывающий полипептид, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100 (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль вводят из расчета, например, 2,5 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг или 25 мг в день.

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) введение субъекту:

(1) стабилизирующего соединения и

(2) эффективного количества клетки, раскрытой в данном документе (например, клетки, содержащей слитый полипептид, содержащий COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR) и домен деградации), необязательно, где:

уровень экспрессии слитого полипептида в присутствии стабилизирующего соединения, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз выше, чем уровень экспрессии слитого полипептида в отсутствие стабилизирующего соединения,

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) прекращение введения стабилизирующего соединения, необязательно, где прекращение введения стабилизирующего соединения снижает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii), необязательно, где:

a) у субъекта произошел ответ на лечение, осуществляемое на стадии i) (например, у субъекта имеется полный ответ на лечение, осуществляемое на стадии i), при этом у субъекта наблюдается сокращение опухолевой массы, у субъекта наблюдается уменьшение числа опухолевых клеток, или лечение, осуществляемое на стадии i), является эффективным у субъекта), и/или

b) прекращение введения стабилизирующего соединения осуществляют в ответ на ответ субъекта на лечение, осуществляемое на стадии i) (например, у субъекта имеется полный ответ на лечение, осуществляемое на стадии i), у субъекта наблюдается сокращение опухолевой массы, у субъекта наблюдается уменьшение числа опухолевых клеток, или лечение, осуществляемое на стадии i), является эффективным у субъекта).

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

iii) прекращение введения стабилизирующего соединения, необязательно, где прекращение введения стабилизирующего соединения снижает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) прекращение введения стабилизирующего соединения в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) прекращение введения стабилизирующего соединения снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

iv) прекращение введения стабилизирующего соединения и введение субъекту эффективного количества COF1 или COF2, необязательно, где стадия iv) снижает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии iv), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) стадию iv) осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) стадия iv) снижает или предупреждает нежелательный эффект. В некоторых вариантах осуществления нежелательный эффект представляет собой острую токсичность.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iv):

v) прекращение введения COF1 или COF2, например, после того, как число клеток, экспрессирующих слитый полипептид на поверхности, становится меньшим, чем заранее заданное значение, например, на 1 день, 5 дней, 10 дней или 15 дней.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii), iii), iv) или v):

vi) введение эффективного количества стабилизирующего соединения, необязательно, где введение стабилизирующего соединения увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии ii), iii), iv) или v) и до стадии vi), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) введение стабилизирующего соединения осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) введение стабилизирующего соединения приводит к лечению или предупреждению рецидива опухоли.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии vi):

vii) повторение стадии iii), iv), v) или vi),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает до стадии i):

viii) приведение клетки в контакт со стабилизирующим соединением ex vivo, необязательно, где уровень экспрессии слитого полипептида в присутствии стабилизирующего соединения, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз выше, чем уровень экспрессии слитого полипептида в отсутствие стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления клетку не приводят в контакт со стабилизирующим соединением ex vivo перед введением. В некоторых вариантах осуществления клетку не приводят в контакт с любым из стабилизирующего соединения, COF1 или COF2 ex vivo перед введением.

В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль, и необязательно, где домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46.

В некоторых вариантах осуществления COF1 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где COF1/CRBN-связывающий полипептид, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100 (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3).

В некоторых вариантах осуществления COF2 представляет собой леналидомид или помалидомид или их фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где COF2/CRBN-связывающий полипептид, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100 (например, COF1/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3).

В некоторых вариантах осуществления COF1 или COF2 представляет собой леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль, необязательно, где леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль вводят из расчета, например, 2,5 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг или 25 мг в день.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ деградации слитого полипептида, раскрытого в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR)), предусматривающий приведение слитого полипептида или клетки, содержащей указанный слитый полипептид, в контакт с COF3 (например, соединением, раскрытым в таблице 29, или его фармацевтически приемлемой солью). В одном варианте осуществления в присутствии COF3 уровень экспрессии указанного слитого полипептида значительно уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии указанного слитого полипептида в отсутствие COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF3 ex vivo. В одном варианте осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF3 in vivo.

В одном аспекте данного документ раскрыт способ регулирования экспрессии слитого полипептида, раскрытого в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR) и домен деградации), предусматривающий:

i) приведение слитого полипептида или клетки, содержащей слитый полипептид, в контакт со стабилизирующим соединением, необязательно, где в присутствии стабилизирующего соединения:

a) домен деградации принимает конформацию, которая является более устойчивой к клеточной деградации относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения;

b) конформация слитого полипептида более восприимчива к расщеплению в гетерологичном сайте расщепления протеазами относительно конформации в отсутствие стабилизирующего соединения; или

c) уровень экспрессии слитого полипептида увеличивается, например, в по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, по сравнению с уровнем экспрессии слитого полипептида в отсутствие стабилизирующего соединения, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) приведение слитого полипептида или клетки, содержащей слитый полипептид, в контакт с COF3 (например, соединением, раскрытым в таблице 29, или его фармацевтически приемлемой солью), необязательно, где в присутствии COF3 уровень экспрессии слитого полипептида значительно уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии i) и перед стадией ii), например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF3 ex vivo. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид или клетку приводят в контакт с COF3 in vivo. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ получения клетки, предусматривающий:

i) обеспечение клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, содержащий COF3/CRBN-связывающий полипептид и химерный антигенный рецептор (CAR), необязательно, где CAR содержит в направлении от N-конца к C-концу: антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов; и

ii) приведение клетки в контакт с COF3 ex vivo, необязательно, где:

в присутствии COF3 уровень экспрессии слитого полипептида значительно уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида в отсутствие COF3, например, как измерено с помощью анализа, описанного в данном документе, например, вестерн-блоттинг-анализа или анализа посредством проточной цитометрии.

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) приведение клетки, раскрытой в данном документе (например, клетки, содержащей слитый полипептид, содержащий COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR)), в контакт с COF3 ex vivo, необязательно, где:

в присутствии COF3 уровень экспрессии слитого полипептида уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида перед приведением клетки в контакт с COF3 ex vivo, и

ii) введение субъекту эффективного количества клетки, необязательно, где способ дополнительно предусматривает после стадии i) и до стадии ii):

снижение количества COF3, контактирующего с клеткой, например, внутри клетки и/или в ее окружении,

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii):

iii) введение субъекту эффективного количества COF3, необязательно, где введение COF3 уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии ii) и до стадии iii), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) введение COF3 осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) введение COF3 снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iii):

iv) прекращение введения COF3, необязательно, где прекращение введения COF3 увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии iii) и до стадии iv) (например, где прекращение введения COF3 восстанавливает уровень экспрессии слитого полипептида до уровня экспрессии после стадии ii) и до стадии iii)), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) прекращение введения COF3 осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) прекращение введения COF3 приводит к лечению или предупреждению рецидива.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iv):

v) повторение стадии iii) и/или iv),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления COF3 представляет собой соединение, раскрытое в таблице 29, или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 109 или аминокислотной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% идентичностью с ней.

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) введение субъекту эффективного количества клетки, раскрытой в данном документе (например, клетки, содержащий слитый полипептид, содержащий COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR)), необязательно, где клетку приводят в контакт с COF3 ex vivo перед введением, необязательно, где:

в присутствии COF3 уровень экспрессии слитого полипептида уменьшается, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, относительно уровня экспрессии слитого полипептида перед тем, как клетка приводится в контакт с COF3 ex vivo, необязательно, где после приведения клетки в контакт с COF3 ex vivo и перед введением клетки субъекту количество COF3, контактирующего с клеткой, например, внутри клетки и/или в ее окружении, снижают,

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления клетку не приводят в контакт с COF3 ex vivo перед введением.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) введение субъекту эффективного количества COF3, необязательно, где введение COF3 уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) введение COF3 осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) введение COF3 снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii):

iii) прекращение введения COF3, необязательно, где прекращение введения COF3 увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии ii) и до стадии iii) (например, где прекращение введения COF3 восстанавливает уровень экспрессии слитого полипептида до уровня экспрессии после стадии i) и до стадии ii)), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) прекращение введения COF3 осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) прекращение введения COF3 приводит к лечению или предупреждению рецидива.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iii):

iv) повторение стадии ii) и/или iii),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления COF3 представляет собой соединение, раскрытое в таблице 29, или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 109 или аминокислотной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% идентичностью с ней.

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) введение эффективного количества COF3 субъекту, где субъект содержит клетку, раскрытую в данном документе (например, клетку, содержащую слитый полипептид, содержащий COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR)), необязательно, где введение COF3 уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида перед введением COF3, необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) введение COF3 осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) введение COF3 снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) прекращение введения COF3, необязательно, где прекращение введения COF3 увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii) (например, где прекращение введения COF3 восстанавливает уровень экспрессии слитого полипептида до уровня экспрессии перед введением COF3), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) прекращение введения COF3 осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) прекращение введения COF3 приводит к лечению или предупреждению рецидива.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii):

iii) повторение стадии i) и/или ii),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления COF3 представляет собой соединение, раскрытое в таблице 29, или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 109 или аминокислотной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% идентичностью с ней.

В одном аспекте данного документа представлен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, предусматривающий:

i) введение субъекту:

(1) стабилизирующего соединения и

(2) эффективного количества клетки, раскрытой в данном документе (например, клетки, содержащей слитый полипептид, содержащий COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид (например, полипептид CAR) и домен деградации), необязательно, где:

уровень экспрессии слитого полипептида в присутствии стабилизирующего соединения, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз выше, чем уровень экспрессии слитого полипептида в отсутствие стабилизирующего соединения,

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

ii) прекращение введения стабилизирующего соединения, необязательно, где прекращение введения стабилизирующего соединения снижает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii), необязательно, где:

a) у субъекта произошел ответ на лечение, осуществляемое на стадии i) (например, у субъекта имеется полный ответ на лечение, осуществляемое на стадии i), при этом у субъекта наблюдается сокращение опухолевой массы, у субъекта наблюдается уменьшение числа опухолевых клеток, или лечение, осуществляемое на стадии i), является эффективным у субъекта), и/или

b) прекращение введения стабилизирующего соединения осуществляют в ответ на ответ субъекта на лечение, осуществляемое на стадии i) (например, у субъекта имеется полный ответ на лечение, осуществляемое на стадии i), у субъекта наблюдается сокращение опухолевой массы, у субъекта наблюдается уменьшение числа опухолевых клеток, или лечение, осуществляемое на стадии i), является эффективным у субъекта).

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

iii) прекращение введения стабилизирующего соединения, необязательно, где прекращение введения стабилизирующего соединения снижает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии ii), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) прекращение введения стабилизирующего соединения в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) прекращение введения стабилизирующего соединения снижает или предупреждает нежелательный эффект.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии i):

iv) прекращение введения стабилизирующего соединения и введение субъекту эффективного количества COF3, необязательно, где стадия iv) снижает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно экспрессии слитого полипептида после стадии i) и до стадии iv), необязательно, где:

a) у субъекта развилась нежелательная реакция, она развивается или ожидается ее развитие,

b) стадию iv) осуществляют в ответ на возникновение нежелательной реакции у субъекта или в ответ на ожидание возникновения нежелательной реакции у субъекта, и/или

c) стадия iv) снижает или предупреждает нежелательный эффект. В некоторых вариантах осуществления нежелательный эффект представляет собой острую токсичность.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии iv):

v) прекращение введения COF3, например, после того, как число клеток, экспрессирующих слитый полипептид на поверхности, становится меньшим, чем заранее заданное значение, например, на 1 день, 5 дней, 10 дней или 15 дней.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии ii), iii), iv) или v):

vi) введение эффективного количества стабилизирующего соединения, необязательно, где введение стабилизирующего соединения увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида после стадии ii), iii), iv) или v) и до стадии vi), необязательно, где:

a) у субъекта произошел рецидив, происходит рецидив или ожидается рецидив,

b) введение стабилизирующего соединения осуществляют в ответ на рецидив опухоли у субъекта или в ответ на ожидание рецидива у субъекта, и/или

c) введение стабилизирующего соединения приводит к лечению или предупреждению рецидива опухоли.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает после стадии vi):

vii) повторение стадии iii), iv), v) или vi),

за счет чего осуществляется лечение заболевания.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает до стадии i):

viii) приведение клетки в контакт со стабилизирующим соединением ex vivo, необязательно, где уровень экспрессии слитого полипептида в присутствии стабилизирующего соединения, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз выше, чем уровень экспрессии слитого полипептида в отсутствие стабилизирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления клетку не приводят в контакт со стабилизирующим соединением ex vivo перед введением.

В некоторых вариантах осуществления стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или его фармацевтически приемлемую соль, и необязательно, где домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46.

В некоторых вариантах осуществления COF3 представляет собой соединение, раскрытое в таблице 29, или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 109 или аминокислотной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% идентичностью с ней.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид слитого полипептида представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), необязательно, где CAR содержит в направлении от N-конца к C-концу: антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов.

В одном аспекте настоящего изобретения также представлены слитый полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, вирусная частица, клетка или фармацевтическая композиция, раскрытые в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата. В одном аспекте настоящего изобретения также представлены слитый полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, вирусная частица, клетка или фармацевтическая композиция, раскрытые в данном документе, для применения в лечении субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена.

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных способов заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, представляет собой рак.

В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой мезотелиому (например, злокачественную мезотелиому плевры), например, у субъекта, у которого имеется прогрессирование на фоне по меньшей мере одной предшествующей стандартной терапии; рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточный рак легкого или крупноклеточный рак легкого); рак поджелудочной железы (например, аденокарциному протоков поджелудочной железы или метастатическую аденокарциному протоков поджелудочной железы (PDA), например, у субъекта, у которого имеется прогрессирование на фоне по меньшей мере одной предшествующей стандартной терапии); аденокарциному пищевода, рак яичника (например, серозный эпителиальный рак яичника, например, у субъекта, у которого имеется прогрессирование после по меньшей мере одной предшествующей схемы стандартной терапии), рак молочной железы, колоректальный рак, рак мочевого пузыря или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, представляет собой гематологический рак, например, гематологический рак, выбранный из лейкоза или лимфомы.

В некоторых вариантах осуществления рак выбран из хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL), множественной миеломы, острого лимфоидного лейкоза (ALL), лимфомы Ходжкина, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза (BALL), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза (TALL), малого лимфоцитарного лейкоза (SLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBCL), DLBCL, ассоциированной с хроническим воспалением, хронического миелоидного лейкоза, миелопролиферативных новообразований, фолликулярной лимфомы, фолликулярной лимфомы у детей, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы (эстранодальной лимфомы маргинальной зоны из лимфоидной ткани слизистых оболочек), лимфомы маргинальной зоны, миелодисплазии, миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, новообразования из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, лимфомы маргинальной зоны селезенки, лимфомы/лейкоза селезенки, диффузной мелкоклеточной B-клеточной лимфомы красной пульпы селезенки, варианта волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, болезни тяжелых цепей, плазмоклеточной миеломы, солитарной плазмоцитомы кости, внекостной плазмоцитомы, нодальной лимфомы маргинальной зоны, нодальной лимфомы маргинальной зоны у детей, первичной кожной лимфомы из клеток центра фолликула, лимфоматоидного гранулематоза, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной B-клеточной лимфомы, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK+ крупноклеточной B-клеточной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастельмана, первичной выпотной лимфомы, B-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза (AML) или неклассифицируемой лимфомы.

В некоторых вариантах осуществления рак выбран из MCL, CLL, ALL, лимфомы Ходжкина, AML или множественной миеломы.

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных способов клетка является аутологичной для указанного субъекта. В определенных вариантах осуществления вышеуказанных способов клетка является аллогенной для указанного субъекта. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, экспрессирующую CAR, например CAR-T-клетку.

В некоторых вариантах осуществления субъекту вводили клетку, экспрессирующую по меньшей мере один слитый полипептид, раскрытый в данном документе, до введения COF1, COF2 или COF3.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ идентификации генетического элемента, ассоциированного со специфическим биологическим фенотипом, например, генетического элемента, ассоциированного с развитием и/или прогрессированием рака, причем способ предусматривает стадии:

i) модулирования экспрессии слитого полипептида, раскрытого в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего COF1/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид), в клетках посредством воздействия на указанную клетку с помощью COF1 или COF3, например, леналидомида или его фармацевтически приемлемой соли,

(ii) отбора клеток с представляющим интерес фенотипом, например, фенотипом, ассоциированным с развитием и/или прогрессированием рака, и

(iii) идентификации указанного слитого полипептида, который индуцирует указанный представляющий интерес фенотип,

где воздействие на указанную клетку с помощью COF1 или COF3, например, леналидомида или его фармацевтически приемлемой соли, уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии указанного слитого полипептида относительно уровня экспрессии указанного слитого полипептида до воздействия с помощью COF1 или COF3, например, леналидомида или его фармацевтически приемлемой соли.

В одном аспекте данного документа раскрыт способ идентификации генетического элемента, ассоциированного со специфическим биологическим фенотипом, например, генетического элемента ассоциированного с развитием и/или прогрессированием рака, причем способ предусматривает стадии:

i) модулирования экспрессии слитого полипептида, раскрытого в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид, гетерологичный полипептид и домен деградации), в клетках посредством воздействия на указанную клетку с помощью стабилизирующего соединения, например, базедоксифена или его фармацевтически приемлемой соли, а затем COF1, COF2 или COF3, например, леналидомида, или их фармацевтически приемлемой соли,

(ii) отбора клеток с представляющим интерес фенотипом, например, фенотипом, ассоциированным с развитием и/или прогрессированием рака, и

(iii) идентификации указанного слитого полипептида, который индуцирует указанный представляющий интерес фенотип,

где воздействие на указанную клетку с помощью стабилизирующего соединения, например, базедоксифена или его фармацевтически приемлемой соли, увеличивает, например, в по меньшей мере приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 раз, уровень экспрессии слитого полипептида относительно уровня экспрессии слитого полипептида до воздействия с помощью стабилизирующего соединения, например, базедоксифена или его фармацевтически приемлемой соли, и где воздействие на указанную клетку с помощью COF1, COF2 или COF3, например, леналидомида или его фармацевтически приемлемой соли, уменьшает, например, на по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов, уровень экспрессии указанного слитого полипептида относительно уровня экспрессии указанного слитого полипептида после воздействия с помощью стабилизирующего соединения и до воздействия с помощью COF1 или COF2 (такого как талидомид и его производные (например, леналидомид, помалидомид и талидомид)) или COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29).

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов гетерологичный полипептид представляет собой полипептид химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR представляет собой полипептид CAR для CD19 и содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в любой из таблицы 5, таблицы 6, таблицы 7 и таблицы 30. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR представляет собой полипептид CAR для CD123 и содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в любой из таблицы 8, таблицы 9, таблицы 10, таблицы 11, таблицы 12, таблицы 13 и таблицы 14. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR представляет собой полипептид CAR для BCMA и содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в любой из таблицы 15, таблицы 16, таблицы 17, таблицы 18 и таблицы 31. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR представляет собой полипептид CAR для CD22 и содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в любой из таблицы 19 и таблицы 20. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR представляет собой полипептид CAR для CD20 и содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 32. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR представляет собой полипептид CAR для EGFRvIII и содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 33. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR представляет собой полипептид CAR для мезотелина и содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 34.

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов слитый полипептид содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 4 или таблице 28.

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 1.

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов домен деградации содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 22.

В определенных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов гетерологичный сайт расщепления протеазами содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 23.

Краткое описание графических материалов

ФИГ. 1A представляет собой схему HilD-метки, представляющую собой дегрон IKZF3 136-180 и 236-249, слитый с NanoLuciferase через 16-глицин-сериновый линкер. ФИГ. 1B представляет собой диаграмму, на которой показан уровень люминесценции, измеренный у клеток HEK293T, подвергнутых обратной трансфекции с помощью 50 нг конструкции pNL1.1CMV, кодирующей NanoLuciferase, связанную с IKZF3 136-180 и 236-249. IKZF3 136-180 и 236-249 содействует снижению люминесценции у клеток, обработанных с помощью 1 мкМ, 10 мкМ или 100 мкМ леналидомида в течение 6 часов, по сравнению с клетками, обработанными только с помощью DMSO. Обработка с помощью MG132 блокировала леналидомид-зависимую деградацию NanoLuciferase.

ФИГ. 2 представляет собой вестерн-блот, на котором показано, что IKZF3 136-180 и 236-249 содействовал леналидомид-зависимой деградации NanoLuciferase (IC50=10 нМ) в клетках HEK293GT, трансфицированных с помощью конструкции pNL1.1CMV, кодирующей NanoLuciferase с меткой IKZF3 136-180 и 236-249. Леналидомид-зависимую деградацию не наблюдали к клетках HEK293GT с KO по цереблону (CRBN), которые были трансфицированы аналогичным образом. Обработка с помощью ингибитора протеасомы, MG132, блокировала способность IKZF3 136-180 и 236-249 содействовать леналидомид-зависимой деградации.

ФИГ. 3A представляет собой схему, изображающую IKZF3 136-180, который содержит два бета-листа, фланкирующие шпильку и альфа-спираль, а также IKZF3 236-249, который прогнозируется в виде дополнительной альфа-спирали. Под схемой находится диаграмма укороченных вариантов дегрона IKZF3 136-180 с удалением аминокислот на N- и C-конце (SEQ ID NO: 3, 5 и 7-10 соответственно, в представленном порядке). ФИГ. 3B представляет собой вестерн-блот, на котором показаны результаты исследования с тестированием леналидомид-зависимой деградации NanoLuciferase, слитой с различными метками деградации на основе IKZF3. Метки деградации на основе IKZF3 сливали с N-концом NanoLuciferase, клонировали в векторы pNL1.1CMV и трансфицировали в клетки HEK293T. Трансфицированные клетки обрабатывали с помощью либо DMSO, либо 10 мкМ леналидомида в течение 4 часов перед проведением вестерн-блоттинг-анализа. Два воздействия (длительное и короткое воздействие) показаны для NanoLuciferase ("Nanoluc"). Все из IKZF3 136-180 и 236-249, IKZF3 136-180 и 236-249 K245R, IKZF3 136-180 и 236-249 K245S, IKZF3 136-180 MALEK и IKZF3 136-170 MALEK содействовали леналидомид-индуцированной деградации, при этом IKZF3 140-170 MALEK, IKZF3 141-163 MALEK и IKZF3 145-155 MALEK не опосредовали леналидомид-индуцированную деградацию.

ФИГ. 4A и 4B представляют собой диаграммы вестерн-блотов, на которых показана леналидомид-зависимая деградация NanoLuciferase с меткой IKZF3 136-180 (ФИГ. 4A) или NanoLuciferase с меткой IKZF3 136-170 MALEK (ФИГ. 4B) в клетках HEK293T, при этом IC50 составляет примерно 100 нМ при 2-часовой обработке леналидомидом в обоих случаях. Слияния NanoLuciferase с меткой экспрессировали с использованием конструкций pNL1.1CMV. ФИГ. 4C представляет собой вестерн-блот, на котором показана временная динамика леналидомид-зависимой деградации NanoLuciferase с меткой IKZF3 136-180 в клетках HEK293T, при этом деградация видна уже через 1 час и почти полная деградация через 4 часа. Слияние NanoLuciferase с меткой экспрессировали с использованием конструкции pNL1.1CMV.

ФИГ. 5A представляет собой вестерн-блот, на котором показана леналидомид-зависимая деградация ассоциированного с меланогенезом транскрипционного фактора (MITF) с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 (левая панель), а также MITF с меткой IKZF3 136-180 (правая панель). Слияния MITF с меткой трансфицировали HEK293T с применением конструкций pNL1.1CMV. Деградация MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 показана при IC50, составляющей ~100 нМ. Эта деградация была зависимой от активности протеасомы, поскольку деградация блокировалась обработкой MG132. IKZF3 136-180 также опосредовал леналидомид-зависимую деградацию, хотя и в меньшей степени, чем IKZF3 136-180 и 236-249. ФИГ. 5B представляет собой вестерн-блот, на котором показана леналидомид-зависимая деградация MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 (левая панель), а также MITF с меткой IKZF3 136-180 (правая панель) после того, как клетки, экспрессирующие такие слитые белки, обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение различных временных промежутков. Среди протестированных моментов времени для 4-часовой обработки показана максимальная деградация.

ФИГ. 6A и 6B представляют собой диаграммы вестерн-блотов, на которых показана леналидомид-зависимая деградация MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 (ФИГ. 6A) или IKZF3 136-180 и 236-249, в которой каждый остаток лизина в метке был мутирован в аргинин ("IKZF3 136-180 и 236-249 без лизина") (ФИГ. 6B). Клетки HEK293T, экспрессирующие слияния MITF с меткой с применением конструкций pNL1.1CMV, обрабатывали различными концентрациями леналидомида в течение 24 часов. IC50 составляет примерно 10 нМ для MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 (ФИГ. 6A) и менее 100 нМ для MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 без лизина (ФИГ. 6B). В обоих случаях леналидомид-зависимая деградация была зависимой от протеасомы, поскольку деградацию можно было блокировать за счет ингибитора протеасомы, MG132. Эти данные позволяют предполагать, что MITF, а не метка-дегрон IKZF3, подвергалась убиквитинированию. ФИГ. 6C представляет собой вестерн-блот, на котором показана леналидомид-зависимая деградация MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 без лизина. Клетки HEK293T, экспрессирующие слияние MITF с меткой с применением конструкции pNL1.1CMV, обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение 2 часов, 4 часов, 8 часов или 24 часов. ФИГ. 6D представляет собой вестерн-блот для MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 (левая панель), а также MITF с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 без лизина (правая панель). Клетки HEK293T, экспрессирующие слияния MITF с меткой с применением конструкций pNL1.1CMV, обрабатывали с помощью 10 мкМ одного из леналидомида, помалидомида, талидомид, IMiD отрицательного контроля, который может связываться с CRBN, но отличен от IKZF1 или IKZF3, или DMSO в течение 24 часов перед тем, как клетки подвергали вестерн-блоттинг-анализу. Помалидомид опосредовал деградацию меченого MITF в немного большей степени, чем леналидомид, тогда как талидомид был намного менее эффективным в опосредовании такой деградации.

ФИГ. 7 представляет собой вестерн-блот, на котором показана леналидомид-зависимая деградация MITF с меткой IKZF3 136-180 Q147H. Клетки HEK293T, трансфицированные с помощью конструкций pNL1.1CMV, кодирующих слияния MITF с меткой, обрабатывали различными дозами леналидомида в течение 24 часов. Для MITF с меткой IKZF3 136-180 Q147H не показана деградация в присутствии леналидомида.

ФИГ. 8 представляет собой вестерн-блот, на котором показана леналидомид-зависимая деградация гомолога вирусного онкогена миелоцитоматоза птиц (MYC) с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 при IC50, составляющей примерно 10 нМ. Клетки HEK293T, экспрессирующие слияния MYC с меткой с применением конструкций pNL1.1CMV, обрабатывали различными дозами леналидомида в течение 4 часов.

ФИГ. 9A представляет собой вестерн-блот, на котором показана 4-часовая леналидомид-зависимая деградация однопроходных мембранных белков CD3-дзета, химеры CD8/CD3-дзета, CD8, CD19 и CD22 с меткой-дегроном на С-конце. Клетки Jurkat инфицировали с помощью вирусной конструкции pNGX_LV_V002-CDx-IKZF3 136-180 и 236-249, проводили отбор с помощью G418 и обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида или DMSO. На ФИГ. 9A показано окрашивание с применением антитела к V5 (показаны как длительное 1-минутное воздействие, так и короткое 1-секундное воздействие) и антитела к бета-актину. Все конструкции экспрессировались и подвергались деградации при обработке 10 мкМ леналидомида. В таблице на ФИГ. 9A показаны молекулярная масса (MW) белка, число цитозольных аминокислотных остатков ("цитозольные AA") и число цитозольных лизинов для каждого белка. Интересно, что деградация лучше коррелирует с суммарным числом цитоплазматических аминокислот ("AA"), чем с числом цитозольных остатков лизина. ФИГ. 9B, 9C и 9D представляют собой диаграммы вестерн-блотов, на которых показана леналидомид-зависимая деградация CD19 с меткой на C-конце (ФИГ. 9B), CD3-дзета с меткой на C-конце (ФИГ. 9C) и CD8/CD3-дзета с меткой на C-конце (ФИГ. 9D). Клетки, экспрессирующие CD19, CD3-дзета или CD8/CD3-дзета с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение 6 часов или различными дозами леналидомида в течение 24 часов. На ФИГ. 9B показано, что деградация CD19 с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 характеризуется IC50, составляющей приблизительно 100 нМ, и сильную деградацию определяли через 6 часов. Деградация CD3-дзета с меткой IKZF3 136-180 и 236-249, показанная на ФИГ. 9C, является более слабой, чем деградация CD19 с меткой IKZF3 136-180 и 236-249. Деградация меченого CD3-дзета была выраженной после того, как клеток обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение 24 часов. Деградация CD8/CD3-дзета с меткой IKZF3 136-180 и 236-249, показанная на ФИГ. 9D, является более сильной, чем деградация CD3-дзета с меткой IKZF3 136-180 и 236-249.

ФИГ. 10A, 10B, 10C и 10D представляют собой серию гистограмм проточной цитометрии, сравнивающих экспрессию CD19 с меткой IKZF3 136-180 и 236-249 на клеточной поверхности клеток Jurkat, которые обрабатывали с помощью 1 мкМ или 10 мкМ леналидомида в течение 1 часа (ФИГ. 10A), 6 часов (ФИГ. 10B), 16 часов (ФИГ. 10C) или 24 часов (ФИГ. 10D). Некоторые клетки предварительно обрабатывали с помощью 10 мкМ MG132 до обработки с помощью 10 мкМ леналидомида. DMSO служил в качестве контроля со средой-носителем. IKZF3 136-180 и 236-249 сливали с C-концом CD19. ФИГ. 10E и 10F представляют собой столбчатые диаграммы, на которых показан % CD19-положительных клеток (ФИГ. 10E) или средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD19-положительных клеток (ФИГ. 10F) для всех протестированных доз леналидомида и моментов времени. Минимальную деградацию наблюдали через 1 час и незначительную деградацию через 6 часов. Деградация была намного более заметна через 16 и 24 часа в обеих группах обработки 1 мкМ и 10 мкМ, и эту деградацию можно было частично блокировать за счет ингибитора протеасомы MG132. Наблюдали примерно 50% снижение числа CD19-положительных клеток через 16 часов в обеих группах обработки 1 мкМ и 10 мкМ (ФИГ. 10E), и это снижение соответствовало снижению MFI (ФИГ. 10F).

ФИГ. 11 представляет собой схему, на которой показан иллюстративный слитый белок, содержащий домен деградации (дегрон), сайт расщепления протеазами и второй белковый домен (CAR), а также изменение деградации слитого белка в присутствии лекарственного средства, например, стабилизирующего соединения.

ФИГ. 12A, 12B и 12C представляют собой схемы, на которых показана регуляция молекулы CAR, слитой с FurON (ФИГ. 12A), HilD (ФИГ. 12B) или как с FurON, так и с HilD (ФИГ. 12C). Как показано на ФИГ. 12A, CAR, слитый с FurON, может быть "включен" при введении стабилизирующего соединения (например, низкомолекулярного лиганда, который связывается с доменом деградации и стабилизирует его, например, базедоксифена (BZA)) или "выключен" при удалении стабилизирующего соединения. Как показано на ФИГ. 12B, CAR, слитый с HilD-меткой, может быть "включен" при введении соединения IMiD (например, леналидомида или помалидомида) и вновь "выключен" при прекращении введения соединения IMiD. Как показано на ФИГ. 12C, CAR, слитый как с FurON, так и с HilD-меткой, может быть "включен" при введении стабилизирующего соединения, "выключен" при остановке введения стабилизирующего соединения и введении соединения IMiD и вновь "включен" при остановке введения соединения IMiD и введении стабилизирующего соединения. Объединение переключателя FurON и переключателя HilD добавляет дополнительные возможности регуляции экспрессии и активности молекулы CAR.

ФИГ. 13A, 13B и 13C представляют собой диаграммы вестерн-блотов, на которых показана леналидомид-зависимая деградация молекулы CAR. Клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 765 (FurON_CAR19) (ФИГ. 13A), конструкцию 766 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка_V5) (ФИГ. 13B) или конструкцию 767 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 13C), инкубировали в присутствии 10 мкМ леналидомида ("+") или DMSO ("-") в течение 24 часов перед проведением вестерн-блоттинг-анализа. Все образцы обрабатывали 1 мкМ базедоксифена. "A" представляет клетки, трансдуцированные с помощью 275 мкл вирусного супернатанта. "B" представляет клетки, трансдуцированные с помощью 700 мкл вирусного супернатанта.

ФИГ. 14A, 14B, 14C и 14D представляют собой диаграммы вестерн-блотов, на которых показана леналидомид-зависимая деградация молекулы CAR. Клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 771 (CAR19_HilD-метка_V5) (ФИГ. 14A), конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 14B), конструкцию 768 (CAR19_16GS_HilD-метка_V5) (ФИГ. 14C) или конструкцию 770 (CAR19_16GS_HilD-метка_без K), инкубировали в присутствии 10 мкМ леналидомида ("+") или DMSO ("-") в течение 24 часов перед проведением вестерн-блоттинг-анализа. "A" представляет клетки, трансдуцированные с помощью 275 мкл вирусного супернатанта. "B" представляет клетки, трансдуцированные с помощью 700 мкл вирусного супернатанта.

ФИГ. 15A и 15B представляют собой диаграммы вестерн-блотов, на которых показана леналидомид-зависимая деградация молекулы CAR. Клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка), инкубировали с 10 мкМ леналидомида или DMSO в течение 2, 4, 8, 16 или 24 часов (ФИГ. 15A) или инкубировали с различными дозами леналидомида или DMSO в течение 24 часов (ФИГ. 15B) перед проведением вестерн-блоттинг-анализа. На ФИГ. 15A показана временная динамика при обработке 10 мкМ леналидомида. На ФИГ. 15B показан дозозависимый ответ на леналидомид через 24 часа.

ФИГ. 16A, 16B, 16C, 16D, 16E, 16F и 16G представляют собой комплект гистограмм проточной цитометрии, показывающих экспрессию CAR на поверхности клеток в присутствии или в отсутствие леналидомида. Протестированные конструкции включают: конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 16A), конструкцию 771 (CAR19_HilD-метка_V5) (ФИГ. 16B), конструкцию 6761 (CAR19_16KGS_HilD-метка_V5) (ФИГ. 16C), конструкцию 768 (CAR19_16GS_HilD-метка_V5) (ФИГ. 16D), конструкцию 770 (CAR19_16GS_HilD-метка_без K) (ФИГ. 16E), конструкцию 773 (HilD-метка_CAR19_modSigPep) (ФИГ. 16F) b конструкцию 774 (HilD-метка_CAR19) (ФИГ. 16G). Клетки JNL, экспрессирующие указанные конструкции, инкубировали с 10 мкМ леналидомида или без него в течение 24 часов и затем подвергали анализу посредством проточной цитометрии.

ФИГ. 17A, 17B и 17C представляют собой комплект гистограмм проточной цитометрии, показывающих экспрессию CAR на клеток под контролем леналидомида и/или базедоксифена (BZA). Протестированные конструкции включали: конструкцию 765 (FurON_CAR19) (ФИГ. 17A), конструкцию 767 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 17B) и конструкцию 766 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка_V5) (ФИГ. 17C). Клетки JNL, экспрессирующие указанные конструкции, инкубировали в присутствии или в отсутствие леналидомида и/или базедоксифена (BZA) в течение 24 часов до анализа посредством проточной цитометрии.

ФИГ. 18A, 18B, 18C и 18D представляют собой комплект гистограмм проточной цитометрии, показывающих экспрессию CAR на поверхности клеток в присутствии или в отсутствие различных концентраций леналидомида. Протестированные конструкции включали: конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 18A и 18C) и конструкцию 770 (CAR19_16GS_HilD-метка_без K) (ФИГ. 18B и 18D). Клетки JNL, экспрессирующие указанные конструкции, инкубировали в присутствии или в отсутствие леналидомида в течение 4 часов (ФИГ. 18A и 18B) или 20 часов (ФИГ. 18C и 18D) до анализа посредством проточной цитометрии. ФИГ. 18E и 18F представляют собой столбчатые диаграммы, на которых показаны % экспрессии CAR (ФИГ. 18E) или средняя интенсивность флуоресценции (ФИГ. 18F) для каждой клеточной линии и каждой протестированной концентрации леналидомида.

ФИГ. 19A и 19B представляют собой серию столбчатых диаграмм, на которых показаны сравнения ответов на леналидомид при разных условиях обработки линии клеток-мишеней для JNL, продолжительности времени обработки линии клеток-мишеней, времени обработки леналидомидом и количестве клеток. ФИГ. 19A представляет собой комплект диаграмм, на которых показаны сигналы люминесценции в исследовании, где клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка) (9000 или 12000 клеток/лунка), обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение 4 часов или 24 часов и затем инкубировали с клетками Nalm6, CD19-экспрессирующими клетками K562 ("K562 +CD19"), клетками K562 или средой (без клеток) в течение 4 часов, 8 часов или 20 часов. ФИГ. 19B представляет собой комплект диаграмм, на которых показана подгруппа данных из исследования, описанного на ФИГ. 19A: Клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка) (9000 клеток/лунка), обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение 4 часов и затем инкубировали с клетками Nalm6, CD19-экспрессирующими клетками K562 ("K562 +CD19"), клетками K562 или средой (без клеток) в течение 20 часов. По y-оси на ФИГ. 19B показаны сигналы люминесценции после вычитания фоновых сигналов (сигналов от среды образца). На обеих ФИГ. 19A и 19B два столбца на каждой диаграмме представляют образцы, обработанные с помощью DMSO ("DMSO"), и образцы, обработанные с помощью леналидомида ("леналидомид (10 мкМ μM)"), соответственно.

ФИГ. 20A и 20B представляют собой серию столбчатых диаграмм, на которых показаны сравнения ответов на леналидомид при разных условиях обработки клеток-мишеней для JNL, продолжительности времени обработки клеток-мишеней, времени обработки леналидомидом и количестве клеток. ФИГ. 20A представляет собой комплект диаграмм, на которых показаны сигналы люминесценции в исследовании, где клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 767 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка) (9000 или 12000 клеток/лунка), обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение 4 часов или 24 часов и затем инкубировали с клетками Nalm6, CD19-экспрессирующими клетками K562 ("K562 +CD19"), клетками K562 или средой (без клеток) в течение 4 часов, 8 часов или 20 часов. ФИГ. 20B представляет собой комплект диаграмм, на которых показана подгруппа данных из исследования, описанного на ФИГ. 20A: Клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 767 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка) (9000 клеток/лунка), обрабатывали с помощью 10 мкМ леналидомида в течение 4 часов и затем инкубировали с клетками Nalm6, CD19-экспрессирующими клетками K562 ("K562 +CD19"), клетками K562 или средой (без клеток) в течение 20 часов. По y-оси на ФИГ. 20B показаны сигналы люминесценции после вычитания фоновых сигналов (сигналов от среды образца). На обеих ФИГ. 20A и 20B четыре столбца на каждой диаграмме представляют образцы, не обработанные леналидомидом и базедоксифеном ("DMSO>>DMSO"), образцы, обработанные базедоксифеном, но не леналидомидом ("DMSO>>BZA (1 мкМ)"), образцы, обработанные леналидомидом, но не базедоксифеном ("леналидомид (10 мкМ)>>DMSO"), и образцы, обработанные как леналидомидом, так и базедоксифеном ("леналидомид (10 мкМ)>>BZA (1 мкМ)"), соответственно.

ФИГ. 21A, 21B, 21C и 21D представляют собой диаграммы, на которых показан дозозависимый эффект леналидомида на люциферазный репортер NFAT для трех различных моментов времени обработки. Клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 765 (FurON_CAR19) (ФИГ. 21A), конструкцию 767 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 21B), конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 21C) или конструкцию 770 (CAR19_16GS_HilD-метка_без K) (ФИГ. 21D), инкубировали клетками-мишенями K562 ("K562") или клетками-мишенями K562, экспрессирующими CD19 ("K562+CD19"). Леналидомид добавляли за 20 часов до добавления клеток-мишеней (44-часовая обработка леналидомидом, "20 ч до клеток-мишеней"), за 4 часа до добавления клеток-мишеней (28-часовая обработка леналидомидом, "4 ч до клеток-мишеней") или через 16 часов после добавления клеток-мишеней (8-часовая обработка леналидомидом, "16 ч после клеток-мишеней"). Клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 765 (FurON_CAR19) (ФИГ. 21A) или конструкцию 767 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 21B), также обрабатывали базедоксифеном. На каждой диаграмме исходный сигнал люминесценции нанесен на график относительно указанной концентрации леналидомида.

ФИГ. 22A, 22B, 22C и 22D представляют собой диаграммы, на которых показаны данные из исследования, описанного на ФИГ. 21A, 21B, 21C и 21D, где клетки JNL обрабатывали с помощью MG132 за 5 часов до обработки K562+CD19 клетками-мишенями и обрабатывали леналидомидом за 4 часа до обработки K562+CD19 клетками-мишенями. Протестированные клетки включали: клетки JNL, экспрессирующие конструкцию 765 (FurON_CAR19) (ФИГ. 22A), конструкцию 767 (FurON_CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 22B), конструкцию 769 (CAR19_16GS_HilD-метка) (ФИГ. 22C) или конструкцию 770 (CAR19_16GS_HilD-метка_без K) (ФИГ. 22D). Четыре столбца на каждой диаграмме представляют образцы, обработанные с помощью базедоксифена (BZA), MG132 и леналидомида ("BZA, MG132, леналидомид"), образцы, обработанные с помощью базедоксифена (BZA) и леналидомида ("BZA, леналидомид"), образцы, обработанные с помощью базедоксифена (BZA) ("BZA"), и образцы, обработанные только с помощью DMSO("DMSO"), соответственно. По y-оси на каждой диаграмме показан исходный сигнал люминесценции.

ФИГ. 23 представляет собой комплект схем, на которых показаны конструкции слияния HilD-тау. Использовали изоформу тау-белка 0N4R, которая содержит C-концевой экзон с доменом повтора, но содержит N-концевых экзонов. Использовали лентивирусные конструкций, хотя все конструкции вводили посредством трансфекции с липофектамином или нуклеофекции. Продукты слияния с тау-белком экспрессировались ниже промотора CAG или CMV.

ФИГ. 24A и 24B представляют собой диаграммы, на которых показаны дизайн и результаты исследования, проверяющего привлечение E3-лигазы CRBN к слитым белкам HilD-тау. ФИГ. 24A. Схема эксперимента. Леналидомид привлекает E3-лигазу цереблон (CRBN) к бета-шпильке IKZF3, что приводит к убиквитинированию и деградации ассоциированного белка. Для тестирования того, что данное привлечение происходило у слияний HilD-тау, создавали слияния HilD-тау-биотинлигаза. В присутствии биотина биотинлигаза образует реакционно-способные молекулы биотина, которые ковалентно связываются с ближайшими белками. Если добавляют леналидомид, CRBN должен привлекаться к слиянию HilD-тау и должен находиться в радиусе биотинилирования, опосредованного биотинлигазой. ФИГ. 24B. Клетки HEK293T трансфицировали с помощью слияний CRBN с FLAG-меткой и HilD-тау-биотинлигазы или тау-биотинлигазы. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали в течение 21 часа с помощью 50 мкМ биотина и либо DMSO, либо 1 мкМ леналидомида. После этого клетки промывали в PBS и затем лизировали в ледяном буфере M-PER с ингибиторами протеазы. Предположительно примерно 1 миллион клеток лизировали в объеме 300 мкл. Вестерн-блоттинг-анализ клеточного лизата показан на нижнем блоте, при зондировании с антителами к тау-белку (HT7) или GAPDH. Биотинилированные белки подвергали иммунопреципитации путем инкубирования 20% клеточного лизата с 50 мкл магнитных микрогранул со стрептавидином (Dynabeads M-280) в течение 30 минут при комнатной температуре. Биотинилированные белки элюировали из микрогранул путем кипячения и затем анализировали посредством вестерн-блоттинга. При анализе в отношении сигнала FLAG на FLAG-CRBN широкие полоски наблюдали только у подвергнутого иммунопреципитации материала из клеток HEK293T, обработанных леналидомидом и содержащих HilD-метки, но не у клеток, обработанных с помощью DMSO, или у клеток, обработанных леналидомидом, но трансфицированным с помощью конструкций с тау-белком, не содержащих HilD-метку.

ФИГ. 25A, 25B и 25C представляют собой диаграммы, на которых показано снижение уровня токсичного тау-белка путем индуцируемого привлечения E3-лигазы CRBN. Клетки HEK293T трансфицировали с помощью конструкций со слиянием HilD-тау (P301S)-YFP. Тау-белок (P301S) представляет собой склонную к образованию скоплений форму тау-белка, идентифицированную у пациентов с наследственными нейродегенеративными заболеваниями. После обработки леналидомидом на протяжении ночи флуоресценция YFP снижалась дозозависимым образом под действием леналидомида, что видно на визуализации флуоресценции YFP (ФИГ. 25A). Показано по девять полей зрения для каждого условия. ФИГ. 25B. Интенсивность флуоресценции YFP количественно определяли после обработки леналидомидом в различных дозах. ФИГ. 25C. Отмечали токсичность, обусловленную сверхэкспрессией склонного к образованию скоплений тау-белка, которую оценивали количественно как число клеток, идентифицированных за счет вычленения при флуоресценции красителя Hoecht. При обработке леналидомидом гибель клеток прекращалась, и снижение уровней тау-белка указывает на то, что индуцируемая леналидомидом деградация может оказывать цитопротекторное действие при нацеленной белковой деградации токсичных белков.

ФИГ. 26A, 26B, 26C и 26D представляют собой диаграммы, на которых показано количественное определение снижения содержания тау-белка и снижение содержания специфических форм тау-белка в клетках HEK293T при индуцируемом привлечении CRBN. ФИГ. 26A. Клетки HEK293T трансфицировали конструкциями со слиянием HilD-тау (дикого типа) и обрабатывали с помощью либо леналидомида при разных дозах, либо DMSO. Верхний и нижний вестерн блоты представляют эксперименты, проводимые в трех повторностях. Интенсивность полосок тау-белка, при использовании либо поликлонального антитела к тау-белку (Dako), либо антитела к фосфорилированным формам тау-белка (AT8), оценивали количественно путем нормализации относительно интенсивности полоски с антителом к актину. Трансфекция уменьшенного количества ДНК в данном эксперименте давала большее снижение фосфорилированной формы тау-белка (1X ДНК: 0,625 микрограммов ДНК трансфицировали в 50 мкл среды Optimem с 1,5 мкл липофектамина 2000; 0,1X ДНК=0,0625 микрограммов; в 24-луночных планшетах с клетками HEK). Это позволяет предположить, что такая система может измерять мощность деградации тау-белка, опосредованной E3-лигазой. В экспериментах показано, что дозу леналидомида применяли в течение 4 часов после трансфекции (в случае трансфекции с более высокой концентрацией ДНК) или 24 часов после трансфекции (в случае трансфекции с более низкой концентрацией ДНК). ФИГ. 26B. Левые панели: уровень тау-белка без HilD-метки не снижался при обработке леналидомидом. Правые панели: отсутствует снижение уровней тау-белка при обработке леналидомидом в клетках HEK293T с нокаутом по цереблону (CRBN). ФИГ. 26C. Количественное определение дозозависимого ответа интенсивности YFP на обработку леналидомидом в клетках с нокаутом (KO) по цереблону (CRBN) в сравнении с клетками дикого типа (WT) (те же данные для клеток дикого типа, показанные на ФИГ. 26B). ФИГ. 26D. Совместная обработка с ингибитором неддилирования MLN4924 (1 мкМ), включающая 1-часовую предварительную обработку с помощью MLN4924, также предотвращала деградацию тау-белка. Совместно эти данные указывают на то, что E3-лигазная функция CRBN требуется для деградации слияния HilD-тау, индуцированного леналидомидом.

ФИГ. 27 представляет собой комплект диаграмм, на которых показана оценка склонности к образованию скоплений у слияния HilD-тау (P301S)-YFP, экспрессируемого в кортикальных нейронах грызунов. Кортикальные нейроны грызунов подвергали нуклеофекции с помощью слияния HilD-тау (P301S)-YFP, а затем последовательно инкубировали с нерастворимыми фракциями тау-белка, выделенными из мыши, трансгенной по тау-белку, полученной в лаборатории. Прижизненную флуоресценцию YFP визуализировали с применением анализатора InCell 6000. На средней и нижней панелях показано увеличенное изображение нейронов, идентифицированных на верхней панели. Скопления тау-белка, на которые указывает интенсивная точечная флуоресценция YFP, явно различимы.

ФИГ. 28 представляет собой комплект диаграмм, на которых показана опосредованная леналидомидом деградация HilD-тау (P301S)-YFP, экспрессируемого в нейронах крыс. Кортикальные нейроны грызунов подвергали нуклеофекции с помощью слияния HilD-тау (P301S)-YFP или слияния тау (P301S)-YFP. Также тестировали совместную трансфекцию с CRBN с FLAG-меткой (верхние ряды). Начиная с 9 дней in vitro, нейроны обрабатывали указанными дозами леналидомида. Нейроны визуализировали прижизненно в отношении флуоресценции YFP в указанные интервалы времени. Обработка леналидомидом с течением времени снижала интенсивность YFP относительно нейронов, экспрессирующих HilD-тау (P301S)-YFP и обработанных с помощью DMSO, или нейронов, экспрессирующих тау (P301S)-YFP и обработанных леналидомидом. Деградация происходила как при совместной трансфекции с CRBN человека, так и без нее, что указывает на то, что слияние HilD-тау может быть подвергаться деградации с леналидомидом под действием CRBN или грызуна, или человека.

ФИГ. 29 представляет собой комплект диаграмм, на которых показана опосредованная леналидомидом деградация HilD-тау (P301S)-YFP, экспрессируемого в нейронах крыс. Суспензию отдельных клеток из диссоциированных нейросфер человека возрастом 63 дня in vitro, которые были получены из эмбриональных стволовых клеток, подвергали нуклеофекции с помощью HilD - тау (P301S) - YFP. Нейросферы содержат как нейроны, так и предшественники нейронов. После 10 дней культивирования нейроны обрабатывали леналидомидом (при суммарном возрасте 73 дня in vitro). На фотографиях показана флуоресценция YFP после 20 часов обработки леналидомидом при указанной дозе. Леналидомид в значительной степени снижал интенсивность флуоресценции YFP дозозависимым образом.

ФИГ. 30A и 30B представляют собой комплект диаграмм, на которых показана опосредованная леналидомидом деградация CAR19-16GS-HilD-метка. ФИГ. 30A представляет собой комплект диаграмм вестерн-блотов для клеток Jurkat, трансдуцированных с помощью CAR19-HilD-метка, обработанных одной дозой леналидомида с течением времени. Тестировали образцы после обработки соединением или после периода отмывки. ФИГ. 30B представляет собой комплект гистограмм проточной цитометрии, анализирующих те же образцы, которые использовали в вестерн-блоттинг-анализе. Антитело к CD3-дзета использовали в вестерн-блоттинг-анализе и конъюгат CD19-PE использовали в анализе посредством проточной цитометрии.

ФИГ. 31A, 31B и 31C представляют собой комплект гистограмм проточной цитометрии, анализирующих экспрессию CAR в различных условиях. ФИГ. 31A представляет собой комплект гистограмм проточной цитометрии, на которых показана экспрессия CAR в первичных T-клетках. Эффект леналидомида на экспрессию CAR19 через 24 часа показан на ФИГ. 31B. Эффект леналидомида на экспрессию CAR19-HilD через 24 или 48 часов показан на ФИГ. 31C.

ФИГ. 32A, 32B и 32C представляют собой комплект гистограмм, на которых показан % уничтожения, опосредованного CAR-T клетками. ФИГ. 32A представляет собой диаграмму, на которой показан процент уничтожения для CD19-отрицательных клеток. ФИГ. 32B и 32C представляют собой диаграммы, на которых показан процент уничтожения CAR19-T-клетками (ФИГ. 32B) или CAR19-HilD T клетками (ФИГ. 32C) для CD19-положительный клеток в присутствии или в отсутствие 1 мкМ леналидомида.

ФИГ. 33A и 33B представляют собой диаграммы, на которых показаны соответственно уровни IFN-гамма и IL2, секретируемых из T-клеток, экспрессирующих CAR19 или CAR19-HilD, в присутствии или в отсутствие 1 мкМ леналидомида. По x-оси показана концентрация леналидомида в мкМ.

ФИГ. 34 представляет собой диаграмму, на которой показано, что леналидомид устраняет способность CART19.HilD контролировать опухолевый рост in vivo. Суммарный поток ROI нанесен на график относительно дней после имплантации Nalm6.

ФИГ. 35 представляет собой комплект графиков проточной цитометрии, показывающих утрату экспрессии CAR19-HilD после обработки леналидомидом.

ФИГ. 36 представляет собой диаграмму, на которой показаны уровни контроля опухоли в различных группах обработки. Суммарный поток ROI нанесен на график относительно дней после имплантации Nalm6. Ранняя инъекция леналидомида эффективно устраняла экспрессию CART у мышей, которых обрабатывали с помощью CART-HilD, что приводило к отсутствию контроля опухоли в данной группе. Более поздняя обработка леналидомидом (день 5 после инъекции CART) также снижала функцию CART, на что указывает утрата контроля опухоли в данной группе мышей.

ФИГ. 37A, 37B, 37C, 37D и 37E представляют собой диаграммы, анализирующие экспрессию CAR в CD3+ клетках из спленоцитов. ФИГ. 37A представляет собой диаграмму, на которой показана экспрессия CAR в CD3+ клетках из спленоцитов мышей, обработанных с помощью CART-HilD (группа 1). ФИГ. 37B, 37C и 37D представляют собой диаграммы, на которых показана экспрессия CAR в CD3+ клетках из спленоцитов мышей, обработанных с помощью CART-HilD и леналидомида (группа 2, группа 3 и группа 4 соответственно). Пики на ФИГ. 37A-37D представляют уровни экспрессии CD3 у отдельный мышей. Группа 1. CART19.HilD (5×10⁶). Группа 2. CART19-HilD (5×10⁶) + леналидомид qd. Группа 3. CART19-HilD (5×10⁶) + леналидомид bid. Группа 4. CART19.HilD (5×10⁶) + леналидомид+ 5 дней. ФИГ. 37E представляет собой диаграмму, обобщающую данные.

ФИГ. 38A, 38B и 38C представляют собой диаграммы, на которых показано воздействие соединения I-112 на экспрессию и активность CAR19-CARB-метка. ФИГ. 38A представляет собой вестерн-блот для клеток Jurkat с NFAT-люциферазой (JNL), экспрессирующих CAR19-CARB-метку, обработанных различными дозами соединения I-112 или DMSO в течение 24 часов, на которых показана дозочувстительная деградация CAR19-CARB-метки. ФИГ. 38B представляет собой комплект гистограмм, на которых показан анализ посредством проточной цитометрии экспрессии CAR19 на поверхности клеток JNL с CAR19-CARB-меткой по сравнению с клетками с немеченным CAR19 после обработки с помощью 10 мкМ соединения I-112. ФИГ. 38C представляет собой диаграмму, на которой показаны результаты JNL-анализа для клеток JNL с люциферазой, экспрессирующих CAR19-CARB-метку, обработанных разными дозами соединения I-112 в течение 15 часов с последующей совместной обработкой с помощью либо клеток K562 (CD19-), либо клеток Nalm6 (CD19+) со считыванием люциферазной активности.

ФИГ. 39 представляет собой вестерн-блот для клеток HEK293T, транзиентно трансфицированный с помощью CARB-метка-MITF-FLAG и обработанных с помощью одного из 10 мкМ, 1 мкМ, 0,1 мкМ или 0,01 мкМ соединения I-112, или леналидомида, или DMSO, что показывает I-112-специфическую деградацию MITF с CARB-меткой.

ФИГ. 40A и 40B представляют собой диаграммы, анализирующие воздействие леналидомида на экспрессию и активность CAR для BCMA-HilD-метки. ФИГ. 40A представляет собой комплект гистограмм, на которых показаны результаты анализа посредством проточной цитометрии клеток JNL, инфицированных с помощью CAR для BCMA-HilD-метки и обработанных с помощью различных доз леналидомида в течение 24 часов, что показывает деградацию CAR для BCMA, зависимую от дозы леналидомида. ФИГ. 40B представляет собой диаграмму, на которой показаны результаты JNL-анализа для клеток Jurkat с NFAT- люциферазой, экспрессирующих BCMA-CARB-метку, обработанных разными дозами леналидомида в течение 15 часов с последующей совместной обработкой с помощью клеток KMS11 со считыванием люциферазной активности.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем изобретении, по крайней мере помимо прочего, представлен слитый полипептид, содержащий полипептид, связывающий соединение формулы (I) (COF1)/CRBN, полипептид, связывающий соединение формулы (II) (COF2)/CRBN, или полипептид, связывающий соединение формулы (III) (COF3)/CRBN, предназначенный для нацеливаемой инактивации белков. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит один или несколько COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающих полипептидов и один или несколько гетерологичных полипептидов, например, гетерологичных полипептидов млекопитающего, бактериальных или вирусных полипептидов, например, один или несколько представляющих интерес полипептидов. COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид может быть функционально связан с гетерологичным полипептидом, например, через линкер. В некоторых вариантах осуществления в присутствии COF1 или COF2 (такого как талидомид и его производные (например, леналидомид, помалидомид и талидомид)) или в присутствии COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29) COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид увеличивает деградацию слитого полипептида, например, деградацию, опосредованную убиквитинированием; и/или изменяет уровень и/или активность слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида является убиквитин-зависимой.

Без ограничения какой-либо теорией, в некоторых вариантах осуществления в COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающем полипептиде предусмотрены аминокислотная последовательность и/или структурный мотив, которые в присутствии COF1 или COF2 (такого как талидомид и его производные (например, леналидомид, помалидомид и талидомид)) или в присутствии COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29) приводят к посттрансляционной модификации (например, убиквитинированию) слитого полипептида, что приводит к модифицированному, например, убиквитинированному, слитому полипептиду. Например, одна или несколько аминокислот, например, лизин или метионин, в слитом полипептиде могут подвергаться убиквитинированию в присутствии COF1, COF2 или COF3. В некоторых вариантах осуществления убиквитинированный слитый полипептид подвергается селективной деградации. В некоторых вариантах осуществления посттрансляционная модификация слитого полипептида увеличивает деградацию (например, увеличивает уровень или скорость деградации) слитого полипептида (например, всего гетерологичного полипептида или его части). В некоторых вариантах осуществления увеличение уровня и/или скорости деградации составляет по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 500%, 10 раз, 100 раз, 1000 раз или более относительно уровня и/или скорости деградации эталонного белка, например, слитого полипептида в отсутствие COF1, COF2 или COF3, гетерологичного полипептида, слияния гетерологичного полипептида без COF1/CRBN-, COF2/CRBN-или COF3/CRBN-связывающего полипептида или слияния гетерологичного полипептида с фрагментом, отличным от COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида.

Без ограничения какой-либо теорией, деградация слитого полипептида может включать одну, две или все из следующих стадий: (1) связывание COF1 или COF2 (например, талидомида и его производных (например, леналидомида)) или COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29) с одной или несколькими субъединицами комплекса убиквитинлигазы (например, комплекса убиквитинлигазы E3), например, связывание с CUL4, RBX1, DDBI и/или CRBN, также известным как CRL4(CRBN), как правило, с комплексом DDB1-CRBN, за счет чего образуется комплекс COF1-лигаза или COF2-лигаза;

(2) комплекс COF1-лигаза, COF2-лигаза или COF3-лигаза связывается и увеличивает убиквитинирование одной или нескольких аминокислот, например, лизина или метионина, в слитом полипептиде, за счет чего образуется убиквитинированный слитый полипептид, например, моно- или полиубиквитинированный слитый полипептид; и

(3) убиквитинированный слитый полипептид направляется на деградацию, например, слитый полипептид селективно направляется, например, к протеасоме, для деградации.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит от приблизительно 10 до приблизительно 95 аминокислотных остатков, от приблизительно 15 до приблизительно 90 аминокислотных остатков, от приблизительно 20 до приблизительно 85 аминокислотных остатков, от приблизительно 25 до приблизительно 80 аминокислотных остатков, от приблизительно 30 до приблизительно 75 аминокислотных остатков, от приблизительно 35 до приблизительно 70 аминокислотных остатков, от приблизительно 40 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 45 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 50 до приблизительно 65 аминокислотных остатков или от приблизительно 55 до приблизительно 65 аминокислотных остатков из IKZF1 (например, SEQ ID NO: 20) или IKZF3 (например, SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит от приблизительно 10 до приблизительно 95 аминокислотных остатков, от приблизительно 15 до приблизительно 90 аминокислотных остатков, от приблизительно 20 до приблизительно 85 аминокислотных остатков, от приблизительно 25 до приблизительно 80 аминокислотных остатков, от приблизительно 30 до приблизительно 75 аминокислотных остатков, от приблизительно 35 до приблизительно 70 аминокислотных остатков, от приблизительно 40 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 45 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 50 до приблизительно 65 аминокислотных остатков или от приблизительно 55 до приблизительно 65 аминокислотных остатков из IKZF2 (например, SEQ ID NO: 21).

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб (например, бета-изгиб из IKZF3). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб (например, бета-изгиб из IKZF3) и альфа-спираль (например, альфа-спираль из IKZF3). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 136-170, или 136-180, и/или 236-249 из IKZF3 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 19) или аминокислотную последовательность, практически идентичную им (например, на по меньшей мере 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную им). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100, или аминокислотную последовательность, практически идентичную ей (например, на по меньшей мере 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную ей).

В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб (например, бета-изгиб из IKZF2). В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб (например, бета-изгиб из IKZF2) и альфа-спираль (например, альфа-спираль из IKZF2). В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотные остатки 130-174 и/или 230-243 из IKZF2 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 21) или аминокислотную последовательность, практически идентичную им (например, на по меньшей мере 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную им). В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 109, 113 и 114, или аминокислотную последовательность, практически идентичную ей (например, на по меньшей мере 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную ей).

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб (например, бета-изгиб из IKZF1). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит бета-изгиб (например, бета-изгиб из IKZF1) и альфа-спираль (например, альфа-спираль из IKZF1).

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид слитого полипептида восприимчив к посттрансляционной модификации (например, убиквитинированию по одному или нескольким остаткам) и деградации в присутствии COF1 или COF2 (например, талидомида и его производных, например, леналидомида, помалидомида и талидомида) или в присутствии COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29).

Необязательно, COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид могут быть функционально связаны, например, через линкер, например, глицин-сериновый линкер (например, SEQ ID NO: 28, 37, 38, 39 или 99). Например, слитые полипептиды могут содержать три элемента: COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид, например, часть аминокислотной последовательности деградации (например, дегрон), представляющий интерес гетерологичный полипептид, подлежащий деградации, и линкер, отделяющий эти два элемента. Гетерологичный полипептид может представлять собой цитозольный белок, ядерный белок, трансмембранный белок (например, включающий один или несколько трнасмембранных доменов) или секретируемый белок. Например, представляющие интерес гетерологичные полипептиды могут содержать, например, химерный антигенный рецептор (CAR), CRISPR-ассоциированный белок, CD8, CD19, CD22, транскрипционный фактор (например, STAT3, STAT5, NF-каппа-B, бета-катенин, Notch, GLI или c-JUN), например, описанные в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид по настоящему изобретению дополнительно содержит домен деградации. В некоторых вариантах осуществления домен деградации имеет первое состояние, ассоциированное с первым уровнем экспрессии слитого полипептида, и второе состояние, ассоциированное со вторым уровнем экспрессии слитого полипептида, где второй уровень увеличивается, например, в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 20 или 30 раз, по сравнению с первым уровнем в присутствии стабилизирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления домен деградации отделен от COF1/CRBN-связывающего полипептида и гетерологичного полипептида с помощью гетерологичного сайта расщепления. В некоторых вариантах осуществления домен деградации отделен от COF2/CRBN-связывающего полипептида и гетерологичного полипептида с помощью гетерологичного сайта расщепления. В некоторых вариантах осуществления домен деградации отделен от COF3/CRBN-связывающего полипептида и гетерологичного полипептида с помощью гетерологичного сайта расщепления.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид содержит первый домен и второй домен, где первый домен содержит домен деградации, а второй домен содержит COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления первый домен и второй домен отделены гетерологичным сайтом расщепления. Без ограничения какой-либо теорией, уровень экспрессии слитого полипептида может контролироваться стабилизирующим соединением и COF1, COF2 или COF3. В некоторых вариантах осуществления в отсутствие стабилизирующего соединения домен деградации не может приобрести правильную конформацию и направляется на деградацию под действием внутриклеточных путей деградации вместе с остальной частью слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления в присутствии стабилизирующего соединения домен деградации принимает правильную конформацию и менее восприимчив в деградации под действием внутриклеточных путей деградации. В некоторых вариантах осуществления в присутствии стабилизирующего соединения правильная укладка домена деградации открывает гетерологичный сайт расщепления, что приводит к расщеплению гетерологичного сайта расщепления и удалению домена деградации из остальной части слитого полипептида. Уровень слитого полипептида может дополнительно контролироваться с помощью COF1, COF2 или COF3, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления домен деградации выбран из домена эстрогенового рецептора (ER), домена белка FKB (FKBP) или домена дигидрофолатредуктазы (DHFR). В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER), например, домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 46 или 48, например, домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен эстрогенового рецептора (ER), и стабилизирующее соединение представляет собой базедоксифен или 4-гидрокситамоксифен (4-OHT). В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен белка FKB (FKBP), например, домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 50, например, домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен белка FKB (FKBP), и стабилизирующее соединение представляет собой Shield-1. В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен дигидрофолатредуктазы (DHFR), например, домен деградации содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 51, например, домен деградации содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления домен деградации представляет собой домен дигидрофолатредуктазы (DHFR), и стабилизирующее соединение представляет собой триметоприм.

Соответственно, в данном документе раскрыты слитые полипептиды, которые содержат гетерологичный полипептид, COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид и/или домен деградации, например, представляющие интерес полипептиды для селективной деградации белка, а также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые полипептиды, векторы и клетки, например, клетки-хозяева, которые содержат вышеуказанные слитые полипептиды. Слитые полипептиды и связанные с ними композиции, раскрытые в данном документе, можно применять для активации или инактивации, например, деградации, разнообразных белков-мишеней для регуляции средств терапии, например, секретируемых, клеточных или трансмембранных средств терапии (например, средств терапии в виде CAR), регуляции генной экспрессии (например, путем регуляции экспрессии и/или активности компонента системы CRISPR/CAS), валидации мишени, а также скрининга библиотек. Дополнительно раскрыты способы селективной регуляции (например, деградации) указанных слитых полипептидов, например, для лечения субъекта.

В композициях и способах, раскрытых в данном документе, предложены новые и патентоспособные признаки, усовершенствованные по сравнению с известными из уровня техники системами регуляции, предусматривающие тот факт, что COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид действует на уровне белка (а не на уровне мРНК) и приводит к активной деградации существующих и новообразованных белков в клетке (а не блокировке продуцирования растущего белка). Кроме того, COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид может иметь короткую длину, и COF1, COF2 и COF3, как правило, являются низкомолекулярными.

Без ограничения какой-либо теорией, как описано в примере 16, COF1 или COF2 (например, талидомид и его производные (например, леналидомид, помалидомид и талидомид)) не приводят или фактически не приводят к деградации слитого полипептида, содержащего COF3/CRBN-связывающий полипептид, описанный в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего CARB-метку, описанную в данном документе, например, слитого полипептида, содержащего CARB-метку, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 109, 113 и 114). В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида, содержащего COF3/CRBN-связывающий полипептид, описанный в данном документе, в присутствии COF1 или COF2 составляет не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, или 20% от деградации указанного слитого полипептида в присутствии COF3 при таких же условиях.

Аналогичным образом, COF3 (например, соединение, раскрытое в таблице 29) не приводит или фактически не приводит к деградации слитого полипептида, содержащего COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид, описанный в данном документе (например, слитого полипептида, содержащего HilD-метку, описанную в данном документе, например, слитого полипептида, содержащего HilD-метку, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100). В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида, содержащего COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид, описанный в данном документе, в присутствии COF3 составляет не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, или 20% от деградации указанного слитого полипептида в присутствии COF1 или COF2 при таких же условиях.

Вследствие этого, два полипептида-мишени, один, меченный с помощью COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающего полипептида, (например, HilD-метки, описанной в данном документе), другой, меченный с помощью COF3/CRBN-связывающего полипептида (например, CARB-метки, описанной в данном документе), могут контролироваться независимо с применением COF1 или COF2 и COF3. Например, клеткой, экспрессирующей белок с HilD-меткой и белок с CARB-меткой, можно управлять, чтобы она экспрессировала только белок с HilD-меткой (например, путем приведения клетки в контакт с COF3), экспрессировала только белок с CARB-меткой (например, путем приведения клетки в контакт с COF1 или COF2) или не экспрессировала ни один белок (например, путем приведения клетки в контакт с COF1 или COF2 и COF3).

Определения

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту обычной квалификации в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Используемый в данном документе термин "полипептид, связывающий соединение формулы (I) (COF1)/CRBN" относится к полипептиду, который связывается с COF1, полипептиду, которые связывается с комплексом COF1 и CRBN, или полипептиду, который связывается с CRBN в присутствии COF1. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид связывается с COF1 с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид связывается с комплексом COF1 и CRBN с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид связывается с CRBN в присутствии COF1 с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению убиквитинирования слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению деградации слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению инактивации слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления увеличение убиквитинирования, деградации и/или инактивации происходит в присутствии COF1 и одного или нескольких компонентов комплекса убиквитинлигазы (например, CRBN). В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование, деградация и/или инактивация увеличиваются на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 500%, в 10 раз, 100 раз, 1000 раз или более по сравнению с убиквитинированием, деградацией и/или инактивацией эталонного полипептида, например, эталонного слитого полипептида с COF1/CRBN-связывающим полипептидом в отсутствие COF1 или эталонного полипептида без COF1/CRBN-связывающего полипептида. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида, содержащего COF1/CRBN-связывающий полипептид, является убиквитин-зависимой. Например, одна или несколько аминокислот, например, лизин или метионин, в слитом полипептид с COF1/CRBN-связывающим полипептидом, подвергаются убиквитинированию в присутствии COF1.

Используемый в данном документе термин "полипептид, связывающий соединение формулы (II) (COF2)/CRBN" относится к полипептиду, который связывается с COF2, полипептиду, которые связывается с комплексом COF2 и CRBN, или полипептиду, который связывается с CRBN в присутствии COF2. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид связывается с COF2 с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид связывается с комплексом COF2 и CRBN с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид связывается с CRBN в присутствии COF2 с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению убиквитинирования слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению деградации слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF2/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению инактивации слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления увеличение убиквитинирования, деградации и/или инактивации происходит в присутствии COF2 и одного или нескольких компонентов комплекса убиквитинлигазы (например, CRBN). В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование, деградация и/или инактивация увеличиваются на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 500%, в 10 раз, 100 раз, 1000 раз или более по сравнению с убиквитинированием, деградацией и/или инактивацией эталонного полипептида, например, эталонного слитого полипептида с COF2/CRBN-связывающим полипептидом в отсутствие COF2 или эталонного полипептида без COF2/CRBN-связывающего полипептида. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида, содержащего COF2/CRBN-связывающий полипептид, является убиквитин-зависимой. Например, одна или несколько аминокислот, например, лизин или метионин, в слитом полипептид с COF2/CRBN-связывающим полипептидом, подвергаются убиквитинированию в присутствии COF2.

Используемый в данном документе термин "полипептид, связывающий соединение формулы (III) (COF3)/CRBN" относится к полипептиду, который связывается с COF3, полипептиду, которые связывается с комплексом COF3 и CRBN, или полипептиду, который связывается с CRBN в присутствии COF3. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид связывается с COF3 с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид связывается с комплексом COF3 и CRBN с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид связывается с CRBN в присутствии COF3 с аффинностью (K_D), которая является меньшей, чем 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 или 10^-8 M, например, как измерено с помощью способа, общепризнанного в данной области техники, например, Biacore. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению убиквитинирования слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению деградации слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид, когда присутствует в слитом полипептиде (например, функционально связан с гетерологичным полипептидом (например, в слитом полипептиде, описанном в данном документе)), может приводить к увеличению инактивации слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления увеличение убиквитинирования, деградации и/или инактивации происходит в присутствии COF3 и одного или нескольких компонентов комплекса убиквитинлигазы (например, CRBN). В некоторых вариантах осуществления убиквитинирование, деградация и/или инактивация увеличиваются на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 500%, в 10 раз, 100 раз, 1000 раз или более по сравнению с убиквитинированием, деградацией и/или инактивацией эталонного полипептида, например, эталонного слитого полипептида с COF3/CRBN-связывающим полипептидом в отсутствие COF3 или эталонного полипептида без COF3/CRBN-связывающего полипептида. В некоторых вариантах осуществления деградация слитого полипептида, содержащего COF3/CRBN-связывающий полипептид, является убиквитин-зависимой. Например, одна или несколько аминокислот, например, лизин или метионин, в слитом полипептид с COF3/CRBN-связывающим полипептидом, подвергаются убиквитинированию в присутствии COF3.

Используемое в данном документе "убиквитинирование" относится к добавлению молекулы убиквитина, например, одного убиквитина (моноубиквитинирование) или нескольких убиквитинов (например, цепи из молекул убиквитина или полиубиквитинирование). Убиквитинирование может осуществляться с помощью ферментного комплекса, включающего один или несколько из убиквитин-активирующего фермента (E1), убиквитин-конъюгирующего фермента (E2) и убиквитинлигазы (E3).

Используемый в данном документе термин "CRBN" относится к белку, который у человека кодируется геном CRBN, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему). Под номером доступа Swiss-Prot Q96SW2 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности CRBN человека.

Используемый в данном документе "полипептид IKZF" относится к IKZF, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей мере 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему).

Используемый в данном документе термин "IKZF3" относится к белку, который у человека кодируется геном IKZF3. Под номером доступа Swiss-Prot Q9UKT9 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности IKZF3 человека. Иллюстративная аминокислотная последовательность IKZF3 человека представлена под SEQ ID NO: 19. Термин "полипептид IKZF3" относится к IKZF3, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему).

Используемый в данном документе термин "IKZF1" относится к белку, который у человека кодируется геном IKZF1. Под номером доступа Swiss-Prot Q13422 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности IKZF1 человека. Иллюстративная аминокислотная последовательность IKZF1 человека представлена под SEQ ID NO: 20. Термин "полипептид IKZF1" относится к IKZF1, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему).

Используемый в данном документе термин "IKZF2" относится к белку, который у человека кодируется геном IKZF2. Под номером доступа Swiss-Prot Q9UKS7 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности IKZF2 человека. Иллюстративная аминокислотная последовательность IKZF2 человека представлена под SEQ ID NO: 21. Термин "полипептид IKZF2" относится к IKZF2, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему).

Используемый в данном документе термин "IKZF4" относится к белку, который у человека кодируется геном IKZF4. Под номером доступа Swiss-Prot Q9H2S9 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности IKZF4 человека. Иллюстративная аминокислотная последовательность IKZF4 человека представлена под SEQ ID NO: 22. Термин "полипептид IKZF4" относится к IKZF4, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему).

Используемый в данном документе термин "IKZF5" относится к белку, который у человека кодируется геном IKZF5. Под номером доступа Swiss-Prot Q9H5V7 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности IKZF5 человека. Иллюстративная аминокислотная последовательность IKZF5 человека представлена под SEQ ID NO: 23. Термин "полипептид IKZF5" относится к IKZF5, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему).

Используемый в данном документе "слитый полипептид" или "химерный полипептид" относится к полипептиду, который содержит две или более гетерологичных аминокислотных последовательности и/или белковых доменов в одном непрерывном полипептиде. В некоторых вариантах осуществления два или более гетерологичных белковых домена связаны ковалентно, непосредственно или опосредованно, например, через линкер.

Используемый в данном документе термин "эстрогеновый рецептор (ER)" относится к белку, который у человека кодируется геном ESR1. Под номером доступа Swiss-Prot P03372 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности эстрогенового рецептора (ER) человека. "Домен эстрогенового рецептора (ER)" относится к эстрогеновому рецептору, или его фрагменту, или варианту (например, с аминокислотной последовательностью, практически идентичной ему, например, на по меньшей мере 85, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичной ему). Иллюстративные аминокислотные последовательности домена эстрогенового рецептора (ER) представлены под SEQ ID NO: 44, 46 и 48. Иллюстративные нуклеотидные последовательности домена эстрогенового рецептора (ER) представлены под SEQ ID NO: 45, 47 и 49.

Используемый в данном документе "домен белка FKB (FKBP)" относится к FKBP, или его фрагменту, или варианту. Иллюстративная аминокислотная последовательность домена белка FKB (FKBP) представлена под SEQ ID NO: 50.

Используемый в данном документе термин "дигидрофолатредуктаза (DHFR)" относится к белку, который у человека кодируется геном DHFR. Под номером доступа Swiss-Prot P00374 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности дигидрофолатредуктазы (DHFR) человека. "Домен дигидрофолатредуктазы (DHFR)" относится к DHFR, или его фрагменту, или варианту. Иллюстративная аминокислотная последовательность домена дигидрофолатредуктазы (DHFR) представлена под SEQ ID NO: 51.

Используемый в данном документе термин "домен деградации" относится к домену слитого полипептида, который принимает стабильную конформацию при экспрессии в присутствии стабилизирующего соединения. В отсутствие стабильной конформации при экспрессии в представляющей интерес клетке большая часть доменов деградации (и, как правило, любой белок, с которым они слиты) будет подвергаться деградации под действием эндогенных клеточных механизмов. Следует отметить, что домен деградации представляет собой не встречающийся в природе домен белка, а сконструированный для того, чтобы быть нестабильным в отсутствие контакта со стабилизирующим соединением. Таким образом, домен деградации может быть определен по следующим характеристикам: (1) он не встречается в природе; (2) его экспрессия контролируется котрансляционно или посттрансляционно за счет увеличения или уменьшения скорости деградации; (3) скорость деградации значительно уменьшается в присутствии стабилизирующего соединение. В некоторых вариантах осуществления в отсутствие стабилизирующего соединения домен деградации или другой домен слитого полипептида фактически не выявляется в клетке или на ней. В некоторых вариантах осуществления домен деградации находится в дестабилизированном состоянии в отсутствие стабилизирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления домен деградации не подвергается самоассоциации, например, не подвергается гомодимеризации, в отсутствие стабилизирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления домен деградации слит с гетерологичным сайтом расщепления протеазами, где в присутствии стабилизирующего соединения расщепление гетерологичного сайта расщепления протеазами является более эффективным, чем в отсутствие стабилизирующего соединения.

Домен деградации не представляет собой домен агрегации, определенный в PCT-заявке под номером PCT/US2017/027778.

Под "стабилизирующим соединением" или "соединением стабилизации" подразумевается соединение, которое при добавлении к клетке, экспрессирующей домен деградации, стабилизирует домен деградации и любой белок, слитый с ним, и уменьшает скорость, с которой он впоследствии деградирует. Стабилизирующие соединения или соединения стабилизации могут быть встречающимися в природе или синтетическими.

Под термином "гетерологичный полипептид" подразумевается аминокислотная последовательность (например, домен белка), которая отличается от COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида (например, на по меньшей мере одну аминокислоту) и которая не представляет собой домен активной люциферазы или обладает последовательностью люциферазы. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид не является репортерным полипептидом, например, люциферазой, зеленым флуоресцентным белком или b-галактозидазой. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид содержит аминокислотную последовательность из или получен из полипептида млекопитающего, полипептида бактерии, полипептида вируса, полипептида растения, полипептида дрожжей, полипептида гриба, полипептида археи или полипептида рыбы, например, данио-рерио. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид предусматривает полипептид из таблицы 2, например, цитоплазматический и/или ядерный полипептид, секреторный полипептид или трансмембранный полипептид, описанный в таблице 2.

Кроме того, под "гетерологичным сайтом расщепления протеазами" подразумевается сайт расщепления протеазами, который имеет происхождение, отличное от одного или нескольких доменов белка, с которыми он слит (например, он слит не встречающимся в природе образом по меньшей мере с одним из других упомянутых доменов)

Под "протеазой" подразумевается белок, который расщепляет другой белок на основе присутствия сайта расщепления в белке, в котором предусматривается расщепление.

Под "внутриклеточной протеазой" подразумевается протеаза, которая нативным образом экспрессируется в представляющей интерес клетке.

Под "внеклеточной протеазой" подразумевается протеаза, которая нативным образом экспрессируется в организме (например, млекопитающем) и секретируется или выводится наружу клеток (например, в кровь или на поверхность кожи).

Используемый в данном документе термин "расщепление" относится к разрушению ковалентных связей, таких как в главной цепи молекулы нуклеиновой кислоты, или к гидролизу пептидных связей. Расщепление может инициироваться под действием различных способов, включающих без ограничения ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирной связи. Возможным является как расщепление одной нити, так и расщепление двух нитей. Расщепление двух нитей может происходить в результате двух различных событий расщепления одной нити.

Дополнительные термины описаны в данном документе ниже.

Форма единственного числа относится к одному или нескольким (т. e. по меньшей мере одному) грамматическим объектам настоящей заявки. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или несколько элементов.

Подразумевается, что термин "приблизительно" в отношении измеряемого значения, такого как количество, временной промежуток и т. п., охватывает вариации на ±20%, или в некоторых случаях на ±10%, или в некоторых случаях на ±5%, или в некоторых случаях на ±1%, или в некоторых случаях на ±0,1% от указанного значения, поскольку такие вариации являются допустимыми для осуществления раскрытых способов.

Используемый в данном документе термин "антитело" относится к последовательности белка или полипептида, полученной из молекулы иммуноглобулина, который специфически связывается с антигеном. Антитела могут являться поликлональными или моноклональными, многоцепочечными или одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами и могут быть получены из природных источников или из рекомбинантных источников. Антитела могут являться тетрамерными молекулами иммуноглобулинов.

Термин "фрагмент антитела" относится к по меньшей мере одной части антитела, которая сохраняет способность специфически взаимодействовать (например, посредством связывания, стерической изоляции, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения) с эпитопом антигена. Примеры фрагментов антител включают без ограничения Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fv-фрагменты, scFv-фрагменты антител, Fv, стабилизированные дисульфидными связями (sdFv), Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (либо VL, либо VH), VHH-домены верблюдовых, полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, таких как бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области, и выделенную CDR или другие эпитопсвязывающие фрагменты антитела. Антигенсвязывающий фрагмент также может быть включен в состав однодоменных антител, максиантител, миниантител, наноантител, интрател, диател, триател, тетрател, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть пересажены на каркасные структуры на основе полипептидов, таких как фибронектин III типа (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны миниантитела на основе полипептида фибронектина).

Термин "тяжелая цепь антитела" относится к большей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях, и которая обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.

Термин "легкая цепь антитела" относится к меньшей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие каппа- (κ-) и лямбда- (λ-) цепи относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.

Термин "антиген," "Ag" или "антигенная молекула" относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Такой иммунный ответ может предусматривать либо продуцирование антител, либо активацию специфических иммунокомпетентных клеток или как то, так и другое. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой любую макромолекулу, включая все белки или пептиды. В других вариантах осуществления антигены получены из рекомбинантной или геномной ДНК. Любая ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или частичную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вызывает иммунный ответ, тем самым кодирует "антиген" в том смысле, в котором этот термин используется в данном документе.

Антиген не должен кодироваться исключительно полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. В вариантах осуществления антигены предусматривают без ограничения применение частичных нуклеотидных последовательностей из нескольких генов, и такие нуклеотидные последовательности организованы в различных комбинациях для того, чтобы кодировать полипептиды, которые вызывают требуемый иммунный ответ. В одном варианте осуществления антиген вообще не обязательно должен кодироваться "геном". В одном варианте осуществления антиген может быть получен путем синтеза, или может быть получен из биологического образца, или может представлять собой макромолекулу, отличную от полипептида. Такой биологический образец может включать без ограничения образец ткани, образец опухоли, клетку или жидкость с другими биологическими компонентами. В вариантах осуществления антигены включают, например, углеводы (например, моносахариды, дисахариды, олигосахариды и полисахариды).

Термин "антигенпрезентирующая клетка" или "APC" относится к клетке иммунной системы, такой как вспомогательная клетка (например, B-клетка, дендритная клетка и т. п.), которая представляет чужеродный антиген в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) на своей поверхности. Т-клетки могут распознавать эти комплексы с помощью своих T-клеточных рецепторов (TCR). АРС процессируют антигены и презентируют их Т-клеткам.

Термин "химерный антигенный рецептор" или, в качестве альтернативы, "CAR" относится к совокупности полипептидов, в простейших вариантах осуществления, как правило, к двум полипептидам, которые, находясь в иммунной эффекторной клетке, наделяют клетку специфичностью в отношении клетки-мишени, как правило, раковой клетки, и способностью к генерации внутриклеточного сигнала. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также обозначаемый в данном документе как "внутриклеточный сигнальный домен"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, определенных ниже. В некоторых вариантах осуществления полипептиды из совокупности находятся в одной и той же полипептидной цепи (например, входят в состав химерного слитого белка). В некоторых вариантах осуществления полипептиды из совокупности не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления полипептиды из совокупности не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления набор полипептидов содержит переключатель димеризации, который при наличии димеризующей молекулы может связывать слитые полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В одном аспекте стимулирующая молекула представляет собой дзета-цепь, ассоциированную с Т-клеточным рецепторным комплексом. В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3-дзета). В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или несколько функциональных сигнальных доменов, полученных из по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, определенной ниже. В одном аспекте костимулирующая молекула CAR выбрана из костимулирующих молекул, описанных в данном документе, например, 4-1BB (т. е. CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий два функциональных сигнальных домена, полученные из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, полученные из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит необязательную лидерную последовательность на амино-конце (N-конце) слитого белка CAR. В одном аспекте CAR дополнительно содержит лидерную последовательность на N-конце внеклеточного антигенсвязывающего домена, где лидерная последовательность необязательно отщепляется от антигенсвязывающего домена (например, scFv) в ходе клеточного процессинга и локализации CAR в клеточной мембране.

Термин "рак" относится к заболеванию, которое характеризуется неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных форм рака описаны в данном документе и включают без ограничения рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почки, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легкого и т. п. Термины "опухоль" и "рак" используются в данном документе взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные опухоли и опухоли жидких тканей, например, диффузные или циркулирующие. Используемый в данном документе термин "рак" или "опухоль" включает предзлокачественные, а также злокачественные формы рака и опухоли.

В зависимости от контекста "молекула CAR" относится к CAR (например, полипептиду CAR), к нуклеиновой кислоте, кодирующей CAR, или к ним обоим.

CAR, который содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv или TCR), нацеливающийся на специфический опухолевый антиген X, такой как описанные в данном документе, также называется CAR для X. Например, CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, который нацеливается на CD19 или BCMA обозначается CAR для CD19 или CAR для BCMA соответственно.

Используемый в данном документе термин "ВСМА" относится к антигену созревания В-клеток. BCMA (также известный как TNFRSF17, BCM или CD269) является представителем семейства рецепторов некроза опухоли (TNFR) и преимущественно экспрессируется на терминально дифференцированных B-клетках, например, B-клетках памяти и плазматических клетках. Его лиганд называют B-клеточным активатором семейства TNF (BAFF) и лигандом, индуцирующим пролиферацию (APRIL). ВСМА вовлечен в опосредование выживания плазматических клеток для поддержания долгосрочного гуморального иммунитета. Ген BCMA кодируется в хромосоме 16, продуцируя первичный мРНК-транскрипт длиной 994 нуклеотида (№ доступа в NCBI NM_001192.2), который кодирует белок из 184 аминокислот (NP_001183.2). Был описан второй антисмысловой транскрипт, происходящий из локуса BCMA, который может играть роль в регуляции экспрессии BCMA. (Laabi Y. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:1147-1154). Были описаны дополнительные варианты транскрипта с неизвестным значением (Smirnova AS et al. Mol Immunol., 2008, 45(4):1179-1183). Была идентифицирована вторая изоформа, также известная как TV4 (идентификатор Uniprot Q02223-2). Используемый в данном документе "BCMA" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного BCMA дикого типа.

Используемый в данном документе термин "CD19" относится к белку кластера дифференцировки 19, который представляет собой антигенную детерминанту, выявляемую на лейкозных клетках-предшественниках. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот человека и мыши можно найти в общедоступной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотную последовательность CD19 человека можно найти под № доступа UniProt/Swiss-Prot P15391, а нуклеотидную последовательность, кодирующую CD19 человека, можно найти под № доступа NM_001178098. Используемый в данном документе "CD19" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного CD19 дикого типа.

CD19 экспрессируется на клетках большинства форм рака из B-клеточной линии дифференцировки, включая, например, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз и неходжкинскую лимфому. Другие клетки, экспрессирующие CD19, представлены ниже при определении "заболевания, ассоциированного с экспрессией CD19". Он также представляет собой ранний маркер предшественников B-клеток. См., например, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). В одном аспекте антигенсвязывающая часть CART распознает и связывает антиген в пределах внеклеточного домена белка CD19. В одном аспекте белок CD19 экспрессируется на раковой клетке.

Используемый в данном документе термин "CD20" относится к антигенной детерминанте, которую, как известно, можно выявить на В-клетках. CD20 человека также называют представителем 1 подсемейства А белков с 4 трансмембранными доменами (MS4A1). Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот человека и мыши можно найти в общедоступной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотную последовательность CD20 человека можно найти под №№ доступа NP_690605.1 и NP_068769.2, а нуклеотидную последовательность, кодирующую варианты транскрипта 1 и 3 CD20 человека, можно найти под № доступа NM_152866.2 и NM_021950.3 соответственно. В одном аспекте антигенсвязывающая часть CAR распознает и связывает антиген в пределах внеклеточного домена белка CD20. В одном аспекте белок CD20 экспрессируется на раковой клетке. Используемый в данном документе "CD20" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного CD20 дикого типа.

Используемый в данном документе термин "CD22" относятся к антигенной детерминанте, которую, как известно, можно выявить на лейкозных клетках-предшественниках. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот человека и мыши можно найти в общедоступной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотные последовательности изоформ 1-5 CD22 человека можно найти под №№ доступа NP 001762.2, NP 001172028.1, NP 001172029.1, NP 001172030.1 и NP 001265346.1 соответственно, и нуклеотидную последовательность, кодирующую варианты 1-5 CD22 человека, можно найти под № доступа NM 001771.3, NM 001185099.1, NM 001185100.1, NM 001185101.1 и NM 001278417.1 соответственно. В одном аспекте антигенсвязывающая часть CAR распознает и связывает антиген в пределах внеклеточного домена белка CD22. В одном аспекте белок CD22 экспрессируется на раковой клетке. Используемый в данном документе "CD22" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного CD22 дикого типа.

Используемый в данном документе термин "CD123" относится к антигенной детерминанте, которую, как известно, можно выявить на некоторых злокачественных клетках гематологического рака, например на лейкозных клетках. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот человека и мыши можно найти в общедоступной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотные последовательности CD123 человека можно найти под №№ доступа NP_002174.1 (предшественник изоформы 1); NP_001254642.1 (предшественник изоформы 2), и последовательности мРНК, кодирующие их, можно найти под №№ доступа NM_002183.3 (вариант 1); NM_001267713.1 (вариант 2). В одном аспекте антигенсвязывающая часть CAR распознает и связывает антиген в пределах внеклеточного домена белка CD123. В одном аспекте белок CD123 экспрессируется на раковой клетке. Используемый в данном документе "CD123" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного CD123 дикого типа.

Часть CAR, содержащая антитело или фрагмент этого антитела, может существовать в различных формах, при которых антигенсвязывающий домен экспрессируется в виде части непрерывной полипептидной цепи, включая, например, фрагмент однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечное антитело (scFv), гуманизированное антитело или биспецифическое антитело (Harlow et al., 1999, в: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен в составе CAR по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. В дополнительном аспекте CAR содержит фрагмент антитела, который содержит scFv.

Термин "когнатная антигенная молекула" относится к любому антигену, описанному в данном документе. В одном варианте осуществления он относится к антигену, который распознает, например, на который нацеливается, молекула CAR, например, любой CAR, описанный в данном документе. В другом варианте осуществления он относится к описанному в данном документе антигену, ассоциированному с раком. В одном варианте осуществления когнатная антигенная молекула представляет собой рекомбинантную молекулу.

Термин "консервативные модификации последовательности" относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их в значительной степени. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в уровне техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в пределах представляющего интерес полипептида (например, CAR), описанного в данном документе, могут быть заменены другими аминокислотными остатками из семейства с такой же боковой цепью, и измененный представляющий интерес полипептид (например, CAR) может быть протестирован с применением функциональных анализов, описанных в данном документе.

Термин "костимулирующая молекула" относится к когнатному партнеру по связыванию на Т-клетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, за счет чего происходит опосредование костимулируемого ответа Т-клетки, такого как, без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от антигенных рецепторов или их лигандов, которые необходимы для эффективного иммунного ответа. Костимулирующие молекулы включают без ограничения молекулу MHC класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, молекулы сигнальной активации лимфоцитов (белки SLAM), рецепторы, активирующие NK-клетки, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83. Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы. Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которого он получен, или ее функциональный фрагмент. Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которого он получен, или ее функциональный фрагмент.

Термин "полученный из", в том значении, в котором он используется в данном документе, указывает на взаимосвязь между первой и второй молекулой. Это обычно относится к структурному сходству между первой молекулой и второй молекулой и не имеет дополнительного значения или не включает ограничение способа или источника в отношении первой молекулы, которая получена из второй молекулы. Например, в случае внутриклеточного сигнального домена, который получен из молекулы CD3-дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет структуру CD3-дзета в достаточной степени, чтобы он характеризовался требуемой функцией, а именно, способностью генерировать сигнал в подходящих условиях. Это не имеет дополнительного значения или не включает ограничение в отношении конкретного способа получения внутриклеточного сигнального домена, например, это не означает, что для обеспечения внутриклеточного сигнального домена нужно начинать с последовательности CD3-дзета и удалять нежелательную последовательность или вводить мутации для получения внутриклеточного сигнального домена.

Описанная в данном документе фраза "заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена" включает без ограничения заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, описанного в данном документе, или состояние, ассоциированное с клетками, которые экспрессируют опухолевый антиген, описанный в данном документе, включая, например, пролиферативные заболевания, такие как рак или злокачественное новообразование, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или не связанное с раком показание, ассоциированное с клетками, которые экспрессируют опухолевый антиген, описанный в данном документе. В одном варианте осуществления рак, ассоциированный с экспрессией опухолевого антигена, описанного в данном документе, представляет собой гематологический рак. В одном варианте осуществления рак, ассоциированный с экспрессией опухолевого антигена, описанного в данном документе, представляет собой солидный рак. Дополнительные заболевания, ассоциированные с экспрессией опухолевого антигена, описанного в данном документе включают без ограничения, например, атипичные и/или неклассические формы рака, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией опухолевого антигена, описанного в данном документе. Не связанные с раком показания, ассоциированные с экспрессией опухолевого антигена, описанного в данном документе, включают без ограничения, например, аутоиммунное заболевание (например, волчанку), воспалительные нарушения (аллергию и астму) и трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, экспрессируют или в какой-либо момент времени экспрессировали мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, продуцируют белок опухолевого антигена (например, дикого типа или мутантный), и при этом белок опухолевого антигена может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, в один момент времени продуцировали белок опухолевого антигена на выявляемых уровнях, а затем фактически не продуцировали белок опухолевого антигена на выявляемых уровнях.

Фраза "заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19" включает без ограничения заболевание, ассоциированное с клетками, которые экспрессируют CD19 (например, CD19 дикого типа или мутантный CD19), или состояние, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует или в какое-либо время экспрессировала CD19 (например, CD19 дикого типа или мутантный CD19), включая, например, пролиферативные заболевания, такие как рак или злокачественное новообразование, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или не связанное с раком показание, ассоциированное с клетками, которые экспрессируют CD19. Во избежание неоднозначности толкования заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, может включать состояние, ассоциированное с клеткой, которая в настоящее время не экспрессирует CD19, например, вследствие того, что экспрессия CD19 была подавлена, например, вследствие обработки молекулой, нацеливающейся на CD19, например, CAR для CD19, но которая в один момент времени экспрессировала CD19. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией CD19, представляет собой гематологический рак. В одном аспекте гематологический рак представляет собой лейкоз или лимфому. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией CD19, включает формы рака и злокачественные новообразования, включающие без ограничения, например, одну или несколько форм острого лейкоза, включая без ограничения, например, острый миелоидный лейкоз (AML), B-клеточный острый лимфоидный лейкоз (BALL), T-клеточный острый лимфоидный лейкоз (TALL), острый лимфоидный лейкоз (ALL); одну или несколько форм хронического лейкоза, включая без ограничения, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоидный лейкоз (CLL). Дополнительные формы рака или гематологические состояния, ассоциированные с экспрессией CD19, предусматривают без ограничения, например, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмобластную лимфому, новообразование из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема, миелопролиферативное новообразование; гистиоцитарное нарушение (например, тучноклеточное нарушение или новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток); тучноклеточное нарушение, например, системный мастоцитоз или тучноклеточный лейкоз; B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, плазмоклеточную миелому и "предлейкоз", который представляет собой разнородную совокупность гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т. п.

Дополнительные заболевания, ассоциированные с экспрессией CD19, включают без ограничения, например, атипичные и/или неклассические формы рака, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией CD19. Не связанные с раком показания, ассоциированные с экспрессией CD19, включают без ограничения, например, аутоиммунное заболевание (например, волчанку), воспалительные нарушения (аллергию и астму) и трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CD19, экспрессируют или в какой-либо момент времени экспрессировали мРНК, кодирующую CD19. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие CD19, вырабатывают белок CD19 (например, дикого типа или мутантный), и при этом белок CD19 может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие CD19, в один момент времени продуцировали белок CD19 на выявляемых уровнях, а затем фактически не продуцировали белок CD19 на выявляемых уровнях.

В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, экспрессируют или в какой-либо момент времени экспрессировали мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, продуцируют белок опухолевого антигена (например, дикого типа или мутантный), и при этом белок опухолевого антигена может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, в один момент времени продуцировали белок опухолевого антигена на выявляемых уровнях, а затем фактически не продуцировали белок опухолевого антигена на выявляемых уровнях. В других вариантах осуществления заболевание представляет собой CD19-отрицательный рак, например, CD19-отрицательный рецидивирующий рак. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген (например, CD19), экспрессирует или в какой-либо момент времени экспрессировала мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген (например, CD19), продуцирует белок опухолевого антигена (например, дикого типа или мутантный), и при этом белок опухолевого антигена может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген (например, CD19), в один момент времени продуцировала белок опухолевого антигена на выявляемых уровнях, а затем фактически не продуцировала белок опухолевого антигена на выявляемых уровнях.

Термин "эффекторная функция" относится к специализированной функции клетки. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Термин "кодирование" относится к свойству, присущему специфическим последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, в ходе биологических процессов служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул, имеющих либо заданную последовательность нуклеотидов (т. е. рРНК, тРНК и мРНК), либо заданную последовательность аминокислот и биологические свойства, обусловленные ими. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодирует белок, если в результате транскрипции и трансляции мРНК, соответствующей этому гену, в клетке или другой биологической системе продуцируется белок. Как кодирующая нить, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в перечнях последовательностей, так и некодирующая нить, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут обозначаться как кодирующие белок или другой продукт данного гена или кДНК.

Термин "эндогенный" относится к любому материалу, полученному из организма, клетки, ткани или системы или продуцируемому внутри них.

Термин "экзогенный" относится к любому материалу, введенному в организм, клетку, ткань или систему или продуцируемому вне их.

Термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности под управлением промотора.

Термин "4-1BB" относится к представителю суперсемейства TNFR с аминокислотной последовательностью, представленной под № доступа в GenBank AAA62478.2, или эквивалентным остаткам биологического вида, отличного от человека, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т. п.; и "костимулирующий домен 4-1BB" определен как аминокислотные остатки 214-255 из последовательности под № доступа в GenBank AAA62478.2 или эквивалентные остатки биологического вида, отличного от человека, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т. п. В одном аспекте "костимулирующий домен 4-1BB" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 158, или эквивалентные остатки биологического вида, отличного от человека, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т. п.

Термин "экспрессионный вектор" относится к вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, подлежащей экспрессии. Экспрессионный вектор содержит достаточное количество цис-действующих элементов для экспрессии; а другие элементы для экспрессии могут предоставляться клеткой-хозяином или в системе для экспрессии in vitro. Экспрессионные векторы включают все векторы, известные из уровня техники, включая космиды, плазмиды (например, "голые" или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), в состав которых включен рекомбинантный полинуклеотид.

Термин "гомологичный" или "идентичность" относится к идентичности последовательности субъединиц у двух полимерных молекул, например, двух молекул нуклеиновой кислоты, таких как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или двух полипептидных молекул. Если положение субъединицы в обеих из двух молекул занят одной и той же мономерной субъединицей, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они являются гомологичными или идентичными по этому положению. Гомология между двумя последовательностями находится в прямой зависимости от числа совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях являются гомологичными, то эти две последовательности являются гомологичными на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) являются совпадающими или гомологичными, то эти две последовательности являются гомологичными на 90%.

Композиции и способы по настоящему изобретению охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие указанные последовательности или последовательности, практически идентичные или сходные с ними, например, последовательности, идентичные на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или больше указанной последовательности. В контексте аминокислотной последовательности термин "практически идентичная" используется в данном документе для обозначения первой аминокислотной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество аминокислотных остатков, которые i) идентичны аминокислотным остаткам во второй аминокислотной последовательности после их выравнивания или ii) являются их консервативными заменами, вследствие чего первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь общий структурный домен и/или характеризоваться общей функциональной активностью. Например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, характеризуются по меньшей мере приблизительно 85%, 90%. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например, последовательностью, представленной в данном документе.

В контексте нуклеотидной последовательности термин "практически идентичная" используется в данном документе для обозначения первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное количество нуклеотидов, которые идентичны нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновой кислоты после их выравнивания, вследствие что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, характеризующийся общей функциональной активностью, или кодируют полипептидный домен с общей структурой или полипептид с общей функциональной активностью. Например, нуклеотидные последовательности характеризуются по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например, последовательностью, представленной в данном документе.

Термин "вариант" относится к полипептиду, который имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с встречающейся в природе последовательностью или кодируется практически идентичной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой функциональный вариант.

Термин "функциональный вариант" относится к полипептиду, который имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с встречающейся в природе последовательностью или кодируется практически идентичной нуклеотидной последовательностью и способен проявлять один или несколько видов активности встречающейся в природе последовательности.

Термин "COF1/CRBN-связывающий вариант" последовательности X относится к полипептиду, который: (1) имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с последовательностью X, и (2) связывается с COF1, связывается с комплексом COF1 и CRBN или связывается с CRBN в присутствии COF1.

Термин "COF2/CRBN-связывающий вариант" последовательности X относится к полипептиду, который: (1) имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с последовательностью X, и (2) связывается с COF2, связывается с комплексом COF2 и CRBN или связывается с CRBN в присутствии COF2.

Термин "COF3/CRBN-связывающий вариант" последовательности X относится к полипептиду, который: (1) имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с последовательностью X, и (2) связывается с COF3, связывается с комплексом COF3 и CRBN или связывается с CRBN в присутствии COF3.

Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная клетка" относится к клетке, которая участвует в иммунном ответе, например, способствуя иммунному эффекторному ответу. Примеры иммунных эффекторных клеток включают Т-клетки, например, альфа/бета-Т-клетки и гамма/дельта-Т-клетки, В-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), T-клетки натуральные киллеры (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.

Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная функция или иммунный эффекторный ответ" относится к функции или ответу, например, иммунной эффекторной клетки, которые усиливают иммунную атаку на клетку-мишень или способствуют ей. Например, иммунные эффекторные функция или ответ относятся к свойству T- или NK-клетки, которое способствует уничтожению или ингибированию роста или пролиферации клетки-мишени. В случае Т-клетки первичная стимуляция и костимуляция являются примерами иммунных эффекторных функции или ответа.

Термин "ингибирование" или "ингибитор" включает снижение определенного параметра, например, активности указанной молекулы, например, CD19, CD20, CD10, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, мезотелина или CD79a. Например, данный термин включает ингибирование активности, например, активности CD20, CD10, CD19, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, мезотелина или CD79a, составляющее по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или более. Таким образом, ингибирование не обязательно должно составлять 100%. Виды активности ингибиторов могут быть определены, как описано в данном документе, или с помощью анализов, известных из уровня техники.

Используемый в данном документе термин "внутриклеточный сигнальный домен" относится к внутриклеточной части молекулы. Внутриклеточный сигнальный домен может генерировать сигнал, который способствует иммунной эффекторной функции клетки, содержащей CAR, например, CAR-T-клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, у CAR-T-клетки, включают цитолитическую активность и хелперную активность, в том числе секрецию цитокинов. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен представляет собой часть белка, которая передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Хотя может использоваться весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях отсутствует необходимость использовать всю цепь. В том случае, если используют усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, такую усеченную часть можно использовать вместо интактной цепи, при условии, что она передает сигнал эффекторной функции. Таким образом, подразумевается, что термин "внутриклеточный сигнальный домен" включает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для передачи сигнала эффекторной функции.

В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Иллюстративные первичные внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий внутриклеточный домен. Иллюстративные костимулирующие внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за костимулирующие сигналы или антигеннезависимую стимуляцию. Например, в случае с CART первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность Т-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность корецептора или костимулирующей молекулы.

Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей, содержащих ITAM, включают без ограничения последовательности, полученные из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"), FcεRI, а также CD66d, CD32, DAP10 и DAP12.

Термин "выделенный" означает измененный относительно природного состояния или извлеченный из него. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природных условиях присутствующие в живом животном, не являются "выделенными", однако те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сопутствующих материалов в своем природном состоянии, являются "выделенными". Выделенные нуклеиновая кислота или белок могут находиться в практически чистой форме или могут находиться в ненативной среде, такой как, например, клетка-хозяин.

Используемый в данном документе термин "мезотелин" относится к белку размером 40 кДа, мезотелину, который заякорен в клеточной мембране посредством гликозилфосфатидилинозитоловой (GPI) связи и амино-концевого "слущивающегося" фрагмента размером 31 кДа, называемого потенцирующим фактором мегакариоцитов (MPF). Оба фрагмента содержат сайты N-гликозилирования. Термин также относится к растворимому сплайс-варианту карбокси-концевого фрагмента размером 40 кДа, также называемому "растворимым мезотелином/MPF-связанным". Предпочтительно данный термин относится к мезотелину человека с номером доступа в GenBank AAH03512.1 и его естественным образом расщепленным частям, например, которые экспрессируются на клеточной мембране, например, на мембране раковых клеток. Используемый в данном документе "мезотелин" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного мезотелина дикого типа.

Если не указано иное, то "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК" может также включать интроны в том случае, если нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в каком-либо варианте содержать интрон(-ы).

В контексте настоящего изобретения используются следующие сокращения для общераспространенных оснований нуклеиновых кислот. "А" относится к аденозину, "С" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "Т" относится к тимидину, и "U" относится к уридину.

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК) или комбинации на основе этих ДНК или РНК и их полимерам в однонитевой либо двухнитевой форме. Термин "нуклеиновая кислота" включает ген, кДНК или мРНК. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты является синтетической (например, химически синтезированной) или рекомбинантной. Если специально не ограничено, данный термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги или производные природных нуклеотидов, которые характеризуются свойствами связывания, аналогичными свойствам эталонной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются способом, аналогичным способу для встречающихся в природе нуклеотидов. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно охватывает ее варианты с консервативными модификациями (например, с заменами вырожденными кодонами), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. В частности, замены вырожденными кодонами можно осуществлять посредством генерирования последовательностей, в которых в третьем положении одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов произведена замена на любое из канонических оснований и/или дезоксиинозиновые остатки (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не установлено ограничение на максимальное количество аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Используемый в данном документе термин относится как к коротким цепям, которые также, как правило, обозначаются в уровне техники, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры, так и к более длинным цепям, которые обычно обозначаются в уровне техники как белки, которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, среди прочих, биологически активные фрагменты, практически гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.

Термин "функционально связанный" или "транскрипционный контроль" относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в тех случаях, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Функционально связанные последовательности ДНК могут быть смежными друг с другом и, например, если необходимо соединить два участка, кодирующих белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Термин "парентеральное введение" иммуногенной композиции включает, например, методики подкожной (s.c.), внутривенной (i.v.), внутримышечной (i.m.) или внутригрудинной инъекции, внутриопухолевого введения или инфузии.

Термин "промотор" относится к последовательности ДНК, распознаваемой синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом, которая необходима для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.

Термин "промоторная/регуляторная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая необходима для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может являться коровой промоторной последовательностью, а в других случаях эта последовательность может также содержать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые необходимы для экспрессии продукта гена. Например, промоторная/регуляторная последовательность может представлять собой последовательность, которая обеспечивает экспрессию продукта гена тканеспецифическим образом.

Термин "сигнальный домен" относится к функциональной части белка, которая действует путем передачи информации в пределах клетки для регуляции клеточной активности через определенные сигнальные пути за счет образования вторичных мессенджеров или функционирует в качестве эффекторов за счет ответа на такие мессенджеры.

Термин "scFv" относится к слитому белку, который содержит по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельные области легкой и тяжелой цепей непрерывно связаны, например, через синтетический линкер, например, короткий гибкий полипептидный линкер, и способны экспрессироваться в виде одноцепочечного полипептида, и где scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого он получен. Если не указано иное, то используемый в данном документе scFv может содержать вариабельные области VL и VH в любом порядке, например, относительно N-конца и С-конца слитого полипептида, при этом scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL.

Часть CAR, содержащая антитело или фрагмент этого антитела, может существовать в различных формах, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется в виде части непрерывной полипептидной цепи, в том числе, например, в виде фрагмента однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечного антитела (scFv) и гуманизированного антитела (Harlow et al., 1999, в: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен CAR содержит фрагмент антитела. В дополнительном варианте осуществления CAR содержит фрагмент антитела, который содержит scFv. Используемый в данном документе термин "связывающий домен" или "молекула антитела" относится к белку, например, к цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере последовательность одного вариабельного домена иммуноглобулина. Термин "связывающий домен" или "молекула антитела" охватывает антитела и фрагменты антител. В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой молекулу полиспецифического антитела, например, она содержит совокупность последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, где первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из совокупности характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, а вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из совокупности характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело характеризуется специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела отличается тем, что содержит первую последовательность вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, и вторую последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом.

Термин "стимуляция" относится к первичному ответу, индуцируемому связыванием стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3 или CAR) со своим когнатным лигандом (например, антигенной молекулой), за счет чего опосредуется событие передачи сигнала, такое как, без ограничения, передача сигнала с помощью комплекса TCR/CD3 или передача сигнала с помощью соответствующего рецептора NK или сигнальных доменов CAR. Стимуляция может опосредовать изменение экспрессии определенных молекул.

Термин "стимулирующая молекула" относится к молекуле, экспрессируемой иммунной клеткой (например, Т-клеткой, NK-клеткой, В-клеткой), которая обеспечивает цитоплазматическую(-ие) сигнальную(-ые) последовательность(-и), которая регулирует активацию иммунной клетки стимулирующим образом в по меньшей мере некоторых аспектах сигнального пути иммунной клетки. В одном аспекте сигнал представляет собой первичный сигнал, который инициируется, например, при связывании комплекса TCR/CD3 с молекулой МНС, нагруженной пептидом, и который приводит к опосредованию ответа Т-клеток, в том числе без ограничения пролиферации, активации, дифференцировки и т. п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также обозначаемая как "первичный сигнальный домен"), которая действует стимулирующим образом, может содержать сигнальный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры цитоплазматической сигнальной последовательности, содержащей ITAM, которая является особенно применимой в настоящем изобретении, включают без ограничения последовательности, полученные из CD3-дзета, общей гамма-цепи FcR (FCER1G), Fc-гамма-RIIa, FcR-бета (Fc-эпсилон-R1b), CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD79a, CD79b, DAP10 и DAP12. В конкретном CAR по настоящему изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CAR по настоящему изобретению содержит внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3-дзета. В конкретном CAR по настоящему изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 163, или эквивалентные остатки биологического вида, отличного от человека, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т. п. В конкретном CAR по настоящему изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 166, или эквивалентные остатки биологического вида, отличного от человека, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т. п.

Термин "вектор для переноса" относится к химическому соединению, которое содержит выделенную нуклеиновую кислоту и которое можно применять для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Из уровня техники известны многочисленные векторы, в том числе без ограничения линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, ассоциированные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин "вектор для переноса" включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Данный термин также следует толковать таким образом, что он дополнительно включает неплазмидные и невирусные соединения, которые содействуют переносу нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое соединение, липосома и т. п. Примеры вирусных векторов для переноса включают без ограничения аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т. п.

Термин "дзета" или, в качестве альтернативы, "дзета-цепь", "CD3-дзета" или "TCR-дзета" определен как белок, представленный под № доступа в GenBank BAG36664.1, или эквивалентные остатки биологического вида, отличного от человека, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т. п., и "стимулирующий домен дзета" или, в качестве альтернативы, "стимулирующий домен CD3-дзета" или "стимулирующий домен TCR-дзета" определен как аминокислотные остатки цитоплазматического домена дзета-цепи, которые являются достаточными для функциональной передачи исходного сигнала, необходимого для активации Т-клеток. В одном аспекте цитоплазматический домен дзета содержит остатки 52-164 из последовательности под № доступа GenBank BAG36664.1 или эквивалентные остатки биологического вида, отличного от человека, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т. п., которые являются его функциональными ортологами. В одном аспекте "стимулирующий домен дзета" или "стимулирующий домен CD3-дзета" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 163 (мутантная CD3-дзета). В одном аспекте "стимулирующий домен дзета" или "стимулирующий домен CD3-дзета" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 166 (CD3-дзета человека дикого типа).

Термин "конститутивный промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке при большинстве или всех физиологических условиях клетки.

Термин "индуцируемый промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке практически только при присутствии в клетке индуктора, который соответствует данному промотору.

Термин "тканеспецифический промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет ген, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке практически только в том случае, если клетка является клеткой из того типа ткани, который соответствует данному промотору.

Термины "антиген, ассоциированный с раком", "опухолевый антиген", "антиген, связанный с гиперпролиферативным нарушением" и "антиген, ассоциированный с гиперпролифративным нарушением" взаимозаменяемо относятся к антигенам, которые являются общими для специфических гиперпролиферативных нарушений. В некоторых вариантах осуществления такие термины относится к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности раковой клетки, либо полностью, либо в виде фрагмента (например, молекула MHC/пептид), и которая применима для преимущественного нацеливания фармакологического средства на раковую клетку. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой маркер, экспрессируемый как нормальными клетками, так и раковыми клетками, например, маркер линии дифференцировки, например, CD19 на В-клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая в раковой клетке сверхэкспрессируется по сравнению с нормальной клеткой, например, характеризуется 1-кратной сверхэкспрессией, 2-кратной сверхэкспрессией, 3-кратной или большей сверхэкспрессией по сравнению с нормальной клеткой. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая синтезируется в раковой клетке ненадлежащим образом, например молекулу, которая содержит делеции, добавления или мутации по сравнению с молекулой, экспрессируемой на нормальной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген будет экспрессироваться исключительно на клеточной поверхности раковой клетки, полностью или в виде фрагмента (например, молекула MHC/пептид), и не будет синтезироваться или экспрессироваться на поверхности нормальной клетки. В определенных аспектах антигены, связанные с гиперпролиферативным нарушением, по настоящему изобретению получены из форм рака, включающих без ограничения первичную или метастатическую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, формы лейкоза, рак матки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почки и формы аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы (например, кастрационнорезистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастатический рак предстательной железы), рак яичника, рак поджелудочной железы, и т. п., или плазмоклеточного пролиферативного нарушения, например, aсимптомaтической миеломы (вялотекущей множественной миеломы или невыраженной миеломы), моноклональной гаммапатии неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемии Вальденстрема, форм плазмоцитомы (например, плазмоклеточной дискразии, солитарной миеломы, солитарной плазмоцитомы, экстрамедуллярной плазмоцитомы и множественной плазмоцитомы), системного амилоидоза с амилоидом из легких цепей и POEMS-синдрома (также известного как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатцуки и PEP-синдром). В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению включают CAR, содержащие антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), который связывается с пептидом, презентируемым молекулой MHC. Обычно пептиды, полученные из эндогенных белков, заполняют карманы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса и распознаются T-клеточными рецепторами (TCR) на CD8+ T-лимфоцитах. Комплексы молекул MHC I класса конститутивно экспрессируются всеми ядросодержащими клетками. При раке комплексы вирусоспецифический и/или опухолеспецифический пептид/молекула MHC представляют собой уникальный класс мишеней клеточной поверхности для иммунотерапии. Были описаны TCR-подобные антитела, нацеливающиеся на пептиды, полученные из вирусных или опухолевых антигенов, связанные с лейкоцитарным антигеном человека (HLA)-A1 или HLA-A2 (см., например, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21): 1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Например, TCR-подобное антитело можно идентифицировать при скрининге библиотеки, такой как фаг-дисплейная библиотека scFv человека.

Термин "гибкий полипептидный линкер" или "линкер", используемый в отношении пептидного линкера, который содержит или состоит из аминокислот, таких как глициновые и/или сериновые остатки, применяемые отдельно или в комбинации, для связывания двух полипептидов вместе, например, COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида и гетерологичного полипептида, или вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. В одном варианте осуществления гибкий полипептидный линкер представляет собой Gly/Ser линкер и содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 173), где n составляет положительный целое число, равное 1 или более. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В одном варианте осуществления гибкие полипептидные линкеры включают без ограничения (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 141) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 142). В другом варианте осуществления линкеры включают множественные повторы (Gly2Ser), (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 143). В объем настоящего изобретения также включены линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в данный документ посредством ссылки.

Используемая в данном документе "транзиентная" относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение периода нескольких часов, дней или недель, где период времени экспрессии является меньшим, чем период времени для экспрессии гена, если он интегрирован в геном или содержится в пределах стабильного плазмидного репликона в клетке. В вариантах осуществления молекула CAR транзиентно экспрессируется в клетке, например, клетке-хозяине, в течение конечного периода времени или количества репликаций клетки, например, менее 50 дней (например, менее 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или менее дней). В одном варианте осуществления транзиентная экспрессия осуществляется с применением транскрибированной in vitro РНК.

Используемая в данном документе "стабильная" относится к экспрессии трансгена, которая продолжается в течение более длительного периода, чем транзиентая экспрессия. В вариантах осуществления трансген интегрируется в геном клетки, например, клетки-хозяина, или содержится в пределах стабильного плазмидного репликона в клетке. В одном варианте осуществления трансген интегрирован в геном клетки с применением вектора для доставки гена, например, ретровирусного вектора, такого как лентивирусный вектор.

Используемые в данном документе термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности пролиферативного нарушения или ослаблению одного или нескольких симптомов (например, одного или нескольких различимых симптомов) пролиферативного нарушения в результате введения одного или нескольких средств терапии (например, одного или нескольких терапевтических средств, таких как CAR по настоящему изобретению). В конкретных вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ослаблению по меньшей мере одного измеряемого физического параметра пролиферативного нарушения, такого как рост опухоли, необязательно различимого для пациента. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ингибированию прогрессирования пролиферативного нарушения либо физическим путем, например, посредством стабилизации различимого симптома, физиологическим путем, например, посредством стабилизации физического параметра, либо ими обоими. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или стабилизации размера опухоли или числа раковых клеток. Лечение не обязательно должно быть на 100%, и в некоторых вариантах осуществления снижение или отсрочка по меньшей мере одного симптома заболевания или нарушения на по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% являются достаточными, чтобы рассматриваться в рамках таких терминов.

Подразумевается, что термин "субъект" включает живые организмы, у которых можно вызвать иммунный ответ (например, млекопитающие, например, человек). Примеры субъектов включают человека, обезьян, шимпанзе, собак, кошек, мышей, крыс и их трансгенные формы. Т-клетки можно получить из ряда источников, в том числе из мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатических узлов, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцита, плеврального выпота, ткани селезенки и опухолей.

Термин "подвергнутый трансфекции", или "подвергнутый трансформированию", или "подвергнутый трансдуцированию" относится к процессу, в ходе которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-хозяина. "Трансфицированная", или "трансформированная", или "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, которая была подвергнута трансфекции, трансформации или трансдукции с помощью экзогенной нуклеиновой кислоты. Такая клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство.

Термин "специфически связывается" относится к антителу или лиганду, которые распознают когнатного белкового партнера по связыванию, присутствующего в образце, и связываются с ним, но при этом эти антитело или лиганд практически не распознают прочие молекулы в образце или не связываются с ними.

Диапазоны: на протяжении всего настоящего раскрытия различные аспекты настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов служит лишь для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание такого диапазона, как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее такие поддиапазоны, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т. д., а также отдельные числа в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера, такой диапазон, как 95-99% идентичность, включает что-либо с 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью и включает такие поддиапазоны, как 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99% идентичность. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Определения конкретных функциональных групп и химических терминов описаны более подробно ниже. Химические элементы идентифицированы в соответствии с Периодической таблицей элементов, CAS-версия, Handbook of Chemistry and Physics, 75-ое изд., форзац, и конкретные функциональные группы обычно определены, как описано там. Кроме того, общие принципы органической химии, а также конкретные функциональные фрагменты и реакционная способность, описаны в Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5^th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989 и Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3^rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

Используемый в данном документе термин "алкил" относится к одновалентному насыщенному углеводород с прямой или с разветвленной цепью, такому как прямая или разветвленная группа из 1-12, 1-10 или 1-6 атомов углерода, обозначаемая в данном документе как C₁-C₁₂алкил, C₁-C₁₀алкил и C₁-C₆алкил соответственно. Примеры алкильных групп включают без ограничения метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, втор-пентил, изопентил, трет-бутил, н-пентил, неопентил, н-гексил, втор-гексил и т. п.

Используемые в данном документе термины "алкенил" и "алкинил" относятся к ненасыщенным алифатическим группам, аналогичный по длине и возможному замещению с алкилами, описанными выше, но которые содержат по меньшей мере одну двойную или тройную связь соответственно. Иллюстративные алкенильные группы включают без ограничения -CH=CH₂ и -CH₂CH=CH₂.

Применяемый в данном документе термин "алкокси" относится к насыщенному углеводороду с прямой или разветвленной цепью, содержащему 1-12 атомов углерода и содержащему концевой "O" в цепи, например, -O(алкил). Примеры алкокси-групп включают без ограничения метокси-, этокси-, пропокси-, бутокси-, трет-бутокси- или пентокси-группы.

Используемый в данном документе термин "арил" относится к моноциклической, бициклической или полициклической углеводородной кольцевой системе, где по меньшей мере одно кольцо является ароматическим. Иллюстративные арильные группы включают полностью ароматические кольцевые системы, такие как фенил (например, (C₆)арил), нафтил (например, (C₁₀)арил) и антраценил (например, (C₁₄)арил), и кольцевые системы, где ароматическое углеродное кольцо слито с одним или несколькими неароматическими углеродными кольцами, такими как инданил, фталимид, нафтимидил или тетрагидронафтил и т. п.

Используемый в данном документе термин "карбоциклил" относится к моноциклической или конденсированной, спироконденсированной и/или мостиковой бициклической или полициклической углеводородной кольцевой системе, содержащей 3-18 атомов углерода, где каждое кольцо является либо полностью насыщенным, либо содержит одно или несколько ненасыщенных звеньев, но где ни одно из колец не является ароматическим. Иллюстративные карбоциклильные группы включают циклоалкильные группы (например, циклопентил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т. п.) и циклоалкенильные группы (например, циклопентенил, циклогексенил, циклопентадиенил и т. п.).

Используемый в данном документе термин "карбонил" относится к -C=O.

Используемый в данном документе термин "циано" относится к -CN.

Используемые в данном документе термины "галоген" или "галогенид" относятся к атому фтора (фтор, -F), атому хлора (хлор, -Cl), атому брома (бром, -Br) или атому йода (йод, -I).

Используемый в данном документе термин "галогеналкил" относится к одновалентной насыщенной прямой или разветвленной алкильной цепи, где по меньшей мере один атом углерода в цепи замещен одним или несколькими атомами галогена. В некоторых вариантах осуществления галогеналкильная группа может содержать, например, 1-12, 1-10 или 1-6 атомов углерода, и обозначается в данном документе как C₁-C₁₂галогеналкил, C₁-C₁₀галогеналкил и C₁-C₆галогеналкил. Примеры галогеналкильных групп включают без ограничения трифторметил, дифторметил, пентафторэтил, трихлорметил и т. д.

Термин "галогеналкокси" относится к насыщенному углеводороду с прямой или разветвленной цепью, содержащему 1-12 атомов углерода и содержащему концевой "O" в цепи, где по меньшей мере один атом углерода в цепи замещен одним или несколькими галогенами. Примеры галогеналкокси-групп включают без ограничения, трифторметокси, дифторметокси, пентафторэтокси, трихлорметокси и т. д.

Используемый в данном документе термин "гетероалкил" относится к одновалентной насыщенной прямой или разветвленной алкильной цепи, где по меньшей мере один атом углерода в цепи замещен гетероатомом, таким как O, S или N, при условии, что после замещения цепь содержит по меньшей мере один атом углерода. В некоторых вариантах осуществления гетероалкильная группа может содержать, например, 1-12, 1-10 или 1-6 атомов углерода и обозначается в данном документе как C₁-C₁₂гетероалкил, C₁-C₁₀гетероалкил и C₁-C₆гетероалкил. В некоторых случаях гетероалкильная группа содержит 1, 2, 3 или 4 независимо выбранных гетероатома вместо 1, 2, 3 или 4 отдельных атомов углерода в алкильной цепи. Иллюстративные гетероалкильные группы включают -CH₂NHC(O)CH₃, -CH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂NHCH₃, -CH₂CH₂N(CH₃)CH₃, и т. п.

Применяемые в данном документе термины "алкилен," "алкенилен", "алкинилен" и "гетероалкилен" относятся к двухвалентному радикалу алкильной, алкенильной, алкинильной или гетероалкильной группы соответственно. Любая из одновалентной алкильной, алкенильной, алкинильной или гетероалкильной группы может стать алкиленом, алкениленом, алкиниленом или гетероалкиленом при удалении второго атома водорода из алкильной, алкенильной, алкинильной или гетероалкильной группы.

Используемый в данном документе термин "гетероарил" относится к моноциклической, бициклической или полициклической кольцевой системе, где по меньшей мере одно кольцо является ароматическим и содержит гетероатом; и где ни одно из остальных колец не является гетероциклилом (как определено ниже). Иллюстративные гетероарильные группы включают кольцевые системы, в которых (i) каждое кольцо содержит гетероатом и является ароматическим, например, представляет собой имидазолил, оксазолил, тиазолил, триазолил, пирролил, фуранил, тиофенил пиразолил, пиридинил, пиразинил, пиридазинил, пиримидинил, индолизинил, пуринил, нафтиридинил и птеридинил; (ii) каждое кольцо является ароматическим или карбоциклильным, при этом по меньшей мере одно ароматическое кольцо содержит гетероатом и по меньшей мере одно другое кольцо представляет собой углеводородное кольцо или, например, индолил, изоиндолил, бензотиенил, бензофуранил, дибензoфуранил, индазолил, бензимидазолил, бензтиазолил, хинолил, изохинолил, циннолинил, фталазинил, хиназолинил, хиноксалинил, карбазолил, акридинил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, пиридо[2,3-b]-1,4-оксазин-3(4H)-он, тиазолo-[4,5-c]-пиридинил, 4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридинил, 5,6-дигидро-4H-тиено[2,3-c]пирролил, 4,5,6,7,8-тетрагидрохинолинил и 5,6,7,8-тетрагидроизохинолинил; и (iii) каждое кольцо является ароматический или карбоциклильным, и по меньшей мере одно ароматическое кольцо имеет общий мостиковый гетероатом с другим ароматическим кольцом, например, представляет собой 4H-хинолизинил. В определенных вариантах осуществления гетероарил представляет собой моноциклическое или бициклическое кольцо, где каждое из указанных колец содержит 5 или 6 атомов в кольце, где 1, 2, 3 или 4 из указанных атомов в кольце представляют собой гетероатом, независимо выбранный из N, O и S.

Используемый в данном документе термин "гетероциклил" относится к моноциклической или конденсированной, спироконденсированной и/или мостиковой бициклической и полициклической кольцевым системам, где по меньшей мере одно кольцо является насыщенным или частично ненасыщенным (но не ароматическим) и содержит гетероатом. Гетероциклил может быть присоединен к своей боковой группе по любому гетероатому или атому углерода, которые приводят к стабильной структуре, и любые из атомов в кольце могут быть необязательно замещенными. Иллюстративные гетероциклилы включают кольцевые системы, в которых (i) каждое кольцо является неароматическим и по меньшей мере одно кольцо содержит гетероатом, например, представляет собой тетрагидрофуранил, тетрагидротиенил, пирролидинил, пирролидонил, пиперидинил, пирролинил, декагидрохинолинил, оксазолидинил, пиперазинил, диоксанил, диоксоланил, диазепинил, оксазепинил, тиазепинил, морфолинил и хинуклидинил; (ii) по меньшей мере одно кольцо является неароматическим и содержит гетероатом, и по меньшей мере одно другое кольцо представляет собой ароматическое углеродное кольцо, например, 1,2,3,4-тетрагидрохинолинил; и (iii) по меньшей мере одно кольцо является неароматическим и содержит гетероатом, и по меньшей мере одно другое кольцо является ароматическим и содержит гетероатом, например, представляет собой 3,4-дигидро-1H-пиранo[4,3-c]пиридинил и 1,2,3,4-тетрагидро-2,6-нафтиридинил. В определенных вариантах осуществления гетероциклил представляет собой моноциклическое или бициклическое кольцо, где каждое из указанных колец содержит 3-7 атомов в кольце, где 1, 2, 3 или 4 из указанных атомов в кольце представляют собой гетероатом, независимо выбранный из N, O и S.

Как описано в данном документе, соединения по настоящему изобретению могут содержать "необязательно замещенные" фрагменты. Обычно термин "замещенный", независимо от того, предшествует ли ему термин "необязательно" или нет, означает, что один или несколько водородов обозначенного фрагмента заменены подходящим заместителем. Если не указано иное, "необязательно замещенная" группа может иметь подходящий заместитель в каждом замещаемом положении группы, и если несколько положений в любой данной структуре может быть замещено несколькими заместителями, выбранными из указанной группы, заместитель может быть либо одним и тем же, либо различным в каждом положении. Комбинации заместителей, предусмотренных в данном изобретении, предпочтительно являются такими, которые приводят к образованию стабильных или химически возможных соединений. Используемый в данном документе термин "стабильный" относится к соединениям, которые изменяются в незначительной степени, когда их подвергают условиям, позволяющим их продуцирование, выявление и, в определенных вариантах осуществления, их извлечение, очистку и применение для одной или нескольких целей, раскрытых в данном документе.

Используемый в данном документе термин "оксо" относится к -C=O.

Используемый в данном документе термин "тиокарбонил" относится к -C=O.

Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к тем солям, которые с медицинской точки зрения являются подходящими для применения в контакте с тканями человека или низших животных, не вызывая чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т. п., и соответствуют допустимому отношению польза/риск. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны из уровня техники. Например, Berge et al. подробно описывают фармацевтически приемлемые соли в J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1-19, включенной в данный документ посредством ссылки. Фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению включают соли, полученные из подходящих неорганических и органических кислот и оснований. Примеры фармацевтически приемлемых, нетоксичных солей присоединения кислот представляют собой соли аминогруппы, образуемые с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и перхлорная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота, или с применением других способов, известных из уровня техники, таких как ионный обмен. Другие фармацевтически приемлемые соли включают адипатные, альгинатые, аскорбатные, аспартатные, бензолсульфонатные, бензоатные, бисульфатные, боратные, бутиратные, камфоратные, камфорасульфонатные, цитратные, циклопентанпропионатные, диглюконатные, додецилсульфатные, этансульфонатные, формиатные, фумаратные, глюкогептонатные, глицерофосфатные, глюконатные, гемисульфатные, гептаноатные, гексанoатные, гидройодидные, 2-гидрокси-этансульфонатные, лактобионатные, лактатные, лауратные, лаурилсульфатные, малатные, малеатные, малонатные, метансульфонатные, 2-нафталинсульфонатные, никотинатные, нитратные, олеатные, оксалатные, пальмитатные, памоатные, пектинатные, персульфатные, 3-фенилпропионатные, фосфатные, пикратные, пивалатные, пропионатные, стеаратные, сукцинатные, сульфатные, тартратные, тиоцианатные, п-толуолсульфонатные, ундеканоатные, валератные соли и т. п. Соли, полученные из подходящих оснований, включают соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммония и N⁺(C_1-4 алкила)₄. Иллюстративные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают соли натрия, лития, калия, кальция, магния и т. п. При необходимости, дополнительные фармацевтически приемлемые соли включают нетоксичные аммониевые соли, соли четвертичного аммония и катионов аминов, образованные с применением противоионов, таких как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, сульфонат низшего алкила и арилсульфонат.

Термин "сольват" относится к формам соединения, которые ассоциированы с растворителем, обычно за счет реакции сольволиза. Данная физическая ассоциация может включать образование водородных связей. Традиционные растворители включают воду, метанол, этанол, уксусную кислоту, DMSO, THF, диэтиловый эфир и т. п. Соединения формулы (I), формула (I-a) и/или формулы (II) могут быть получены, например, в кристаллической форме и могут быть сольватированными. Подходящие сольваты включают фармацевтически приемлемые сольваты и дополнительно включают как стехиометрические сольваты, так и нестехиометрические сольваты. В некоторых случаях сольват может быть выделен, например, если одна или несколько молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. "Сольват" охватывает как фазу раствора, так и отделимые сольваты. Иллюстративные сольваты включают гидраты, этаноляты и метаноляты.

Термин "гидрат" относится к соединению, которое ассоциировано с водой. Как правило, количество молекул воды, содержащихся в гидрате соединения, находится в определенном отношении с количеством молекул соединения в гидрате. Следовательно, гидрат соединения может быть представлен, например, с помощью общей формулы R⋅x H₂O, где R представляет собой соединение, и где x составляет число более 0. Данное соединение может образовывать несколько типов гидратов, в том числе, например, моногидраты (x составляет 1), низшие гидраты (x составляет число больше 0 и меньше 1, например, полугидраты (R⋅0,5 H₂O)) и полигидраты (x составляет число более 1, например, дигидраты (R⋅2 H₂O) и гексагидраты (R⋅6 H₂O)).

Следует понимать, что соединения, которые имеют одинаковую молекулярную формулу, но отличаются природой или последовательностью связей своих атомов или расположением своих атомов в пространстве, называются "изомеры". Изомеры, которые отличаются расположением своих атомов в пространстве, называются "стереоизомеры".

Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отражениями друг друга, называются "диастереомеры", а стереоизомеры, которые не представляют собой несовпадающие при наложении зеркальные отражения друг друга, называются "энантиомеры". Когда соединение имеет асимметрический центр, например, он образует связи с четырьмя различными группами, то возможна пара энантиомеров. Энантиомер может быть охарактеризован с помощью абсолютной конфигурации его асимметрического центра и описан с помощью правил последовательности Кана и Прелога для R- и S-конфигурации или по способу, которым молекула вращает плоскость поляризованного света, и обозначен как правовращающий или левовращаюший (т. е. как (+) или (-)-изомеры соответственно). Хиральное соединение может существовать либо в виде отдельного энантиомера, либо в виде их смеси. Смесь, содержащая равные доли энантиомеров, называется "рацемической смесью".

Термин "таутомеры" относится к соединениям, которые являются взаимозаменяемыми формами конкретной структуры соединения и которые отличаются перестановками атомов водорода и электронов. Таким образом, две структуры могут находиться в равновесии благодаря движению π-электронов и атома (обычно H). Например, енолы и кетоны являются таутомерами, поскольку они быстро взаимопревращаются при обработке либо кислотой, либо основанием. Другим примером таутомерии являются аци- и нитроформы фенилнитрометана, которые подобным образом образуются при обработке кислотой или основанием.

Таутомерные формы могут иметь значение для достижения оптимальной химической реакционной способности и биологической активности представляющего интерес соединения.

Если не указано иное, то подразумевается, что структуры, изображенные в данном документе, также включают все изомерные (например, энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные)) формы данной структуры; например, R- и S-конфигурации для каждого асимметрического центра, Z- и E-изомеры с двойной связью и конформационные Z- и E-изомеры. Следовательно, в объем настоящего изобретения входят отдельные стереохимические изомеры, а также смеси из энантиомеров, диастереомеров и геометрических (или конформационных) изомеров соединений по настоящему изобретению. Если не указано иное, то в объем настоящего изобретения входят все таутомерные формы соединений по настоящему изобретению. Кроме того, если не указано иное, также подразумевается, что структуры, изображенные в данном документе, включают соединения, которые отличаются только присутствием одного или нескольких изотопно-обогащенных атомов. Например, в объем настоящего изобретения входят соединения со структурами по настоящему изобретению, включающие замену водорода на дейтерий или тритий или замену углерода на углерод, обогащенный ¹³C или ¹⁴C. В одном варианте осуществления атомы водорода, присутствующие в любом из соединений, раскрытых в данном документе (например, соединении формулы (I)), являются изотопно-обогащенными по дейтерию. Такие соединения применимы, например, в качестве аналитических инструментов, в качестве зондов в биологических анализах или в качестве терапевтических средств в соответствии с настоящим изобретением.

Если предпочтителен конкретный энантиомер, в некоторых вариантах осуществления его можно получать практически не содержащим соответствующего энантиомера, и он может также называться "оптически обогащенным". Используемый в данном документе "оптически обогащенный" означает, что соединение составляет значительно большая доля одного энантиомера. В определенных вариантах осуществления соединение составляет по меньшей мере приблизительно 90% по весу предпочтительного энантиомера. В других вариантах осуществления соединение составляет по меньшей мере приблизительно 95%, 98% или 99% по весу предпочтительного энантиомера. Предпочтительные энантиомеры могут быть выделены из рацемических смесей с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники, включая хиральную жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC), а также образование и кристаллизация хиральных солей, или получены с помощью асимметрического синтеза. См., например, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen, et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972).

Эти и другие иллюстративные заместители описаны более подробно в разделах Подробное описание, Фигуры, Примеры и Формула изобретения. Подразумевается, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается вышеприведенным иллюстративным перечнем заместителей

COF1/CRBN-связывающий полипептид, COF2/CRBN-связывающий полипептид или COF3/CRBN-связывающий полипептид

В данном документе, помимо прочего, раскрыты слитые полипептиды, которые содержат полипептид, связывающий соединение формулы (I) (COF1)/CRBN, полипептид, связывающий соединение формулы (II) (COF2)/CRBN, или полипептид, связывающий соединение формулы (III) (COF3)/CRBN. В вариантах осуществления в присутствии COF1 или COF2 (например, талидомида и его производных, например, леналидомида, помалидомида и талидомид) или в присутствии COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29) COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид в слитом полипептиде увеличивает посттрансляционную модификацию и/или деградацию слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления посттрансляционная модификация может включать убиквитинирование (например, моно- или полиубиквитинирование) одного или нескольких аминокислотных остатков, например, одного или нескольких лизинов или метионинов, в слитом полипептиде (например, одного или всех во всем гетерологичном полипептиде и/или COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающем полипептиде или их части).

В определенных вариантах осуществления один или несколько остатков лизина слитого полипептида (например, всего гетерологичного полипептида и/или COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида или их части) подвергнуты убиквитинированию. В некоторых вариантах осуществления один или несколько остатков метионина слитого полипептида (например, всего гетерологичного полипептида и/или COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида или их части) подвергнуты убиквитинированию (например, моно- или полиубиквитинированию).

Без ограничения какой-либо теорией, в некоторых вариантах осуществления инактивация, например, деградация, слитого полипептида, описанного в данном документе, может включать одну, две, три или все из следующих стадий, например, в клетке или реакционной смеси:

(1) ассоциация слитого полипептида, который содержит COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид, с одной или несколькими субъединицами (например, CRBN) комплекса убиквитинлигазы (например, комплекса убиквитинлигазы E3) в присутствии COF1 или COF2 (например, талидомида и его производных (например, леналидомида)) или в присутствии COF3 (например, соединения, раскрытого в таблице 29);

(2) убиквитинирование слитого полипептида (например, убиквитинирование в гетерологичном полипептиде и/или COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающей полипептиде), за счет обеспечивается подвергнутый убиквитинированию слитый полипептид; и

(3) деградация подвергнутого убиквитинированию слитого полипептида.

В некоторых вариантах осуществления любой COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид, описанный в данном документе, увеличивает посттрансляционную модификацию и/или деградацию слитого полипептида в присутствии COF1, COF2 или COF3, например, относительно модификации и/или деградации в отсутствие COF1, COF2 или COF3. В одном варианте осуществления COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид увеличивает селективное убиквитинирование слитого полипептида в присутствии COF1, COF2 или COF3, например, относительно убиквитинирования в отсутствие COF1, COF2 или COF3.

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид получен из аминокислотной последовательности и/или структурного мотива (например, домена), который связывается с одним или несколькими компонентами комплекса убиквитинлигазы (например, комплекса убиквитинлигазы E3) в присутствии COF1, COF2 или COF3. В некоторых вариантах осуществления COF1 или COF2 представляет собой талидомидный класс соединений (например, леналидомид, помалидомид и талидомид), например, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления COF3 представляет собой соединение, раскрытое в таблице 29. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит домен "цинковых пальцев" (например, домен "цинковых пальцев" 2) или его часть. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит β-изгиб. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит β-изгиб из семейства транскрипционных факторов Ikaros, например, IKZF1 или IKZF3, или последовательность, практически идентичную ему (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную ему). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептида содержит β-шпильку из семейства транскрипционных факторов Ikaros, например, IKZF1 или IKZF3, или последовательность, практически идентичную ей (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную β-шпильке из IKZF1 или IKZF3, например, как описано в Kronke, J. et al. (2014) Science 343(6168):301-5). В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит β-изгиб из IKZF2 или последовательность, практически идентичную ему (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную ему). В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит β-шпильку из IKZF2 или последовательность, практически идентичную ей (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную ей).

В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит от приблизительно 10 до приблизительно 95 аминокислотных остатков, от приблизительно 15 до приблизительно 90 аминокислотных остатков, от приблизительно 20 до приблизительно 85 аминокислотных остатков, от приблизительно 25 до приблизительно 80 аминокислотных остатков, от приблизительно 30 до приблизительно 75 аминокислотных остатков, от приблизительно 35 до приблизительно 70 аминокислотных остатков, от приблизительно 40 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 45 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 50 до приблизительно 65 аминокислотных остатков или от приблизительно 55 до приблизительно 65 аминокислотных остатков из IKZF1 (например, SEQ ID NO: 20) или IKZF3 (например, SEQ ID NO: 19) или последовательность, практически идентичную им (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную им). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 15 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 25 аминокислот, по меньшей мере 30 аминокислот, по меньшей мере 35 аминокислот, по меньшей мере 40 аминокислот, по меньшей мере 45 аминокислот, по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 55 аминокислот, по меньшей мере 60 аминокислот, по меньшей мере 65 аминокислот, по меньшей мере 70 аминокислот, по меньшей мере 75 аминокислот, по меньшей мере 80 аминокислот, по меньшей мере 85 аминокислот, по меньшей мере 90 аминокислот, по меньшей мере 90 аминокислот или по меньшей мере 95 аминокислот из IKZF1 (например, SEQ ID NO: 20) или IKZF3 (например, SEQ ID NO: 19) или последовательность, практически идентичную им (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную им). В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN- или COF2/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, 11-15, 40, 41-43, 77, 78, 84-86, и 100.

В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит от приблизительно 10 до приблизительно 95 аминокислотных остатков, от приблизительно 15 до приблизительно 90 аминокислотных остатков, от приблизительно 20 до приблизительно 85 аминокислотных остатков, от приблизительно 25 до приблизительно 80 аминокислотных остатков, от приблизительно 30 до приблизительно 75 аминокислотных остатков, от приблизительно 35 до приблизительно 70 аминокислотных остатков, от приблизительно 40 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 45 до приблизительно 65 аминокислотных остатков, от приблизительно 50 до приблизительно 65 аминокислотных остатков или от приблизительно 55 до приблизительно 65 аминокислотных остатков из IKZF2 (например, SEQ ID NO: 21) или последовательность, практически идентичную им (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную им). В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 15 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 25 аминокислот, по меньшей мере 30 аминокислот, по меньшей мере 35 аминокислот, по меньшей мере 40 аминокислот, по меньшей мере 45 аминокислот, по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 55 аминокислот, по меньшей мере 60 аминокислот, по меньшей мере 65 аминокислот, по меньшей мере 70 аминокислот, по меньшей мере 75 аминокислот, по меньшей мере 80 аминокислот, по меньшей мере 85 аминокислот, по меньшей мере 90 аминокислот, по меньшей мере 90 аминокислот или по меньшей мере 95 аминокислот из IKZF2 (например, SEQ ID NO: 21) или последовательность, практически идентичную им (например, на по меньшей мере 85%, 87, 90, 95, 97, 98, 99, или 100% идентичную им). В некоторых вариантах осуществления COF3/CRBN-связывающий полипептид содержит или состоит из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 109, 113 и 114.

В некоторых вариантах осуществления иллюстративные полноразмерные последовательности IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4 и IKZF5 или их фрагмент, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Иллюстративные последовательности IKZF, варианты или фрагменты SEQ ID NO Комментарий Последовательность SEQ ID NO: 1 IKZF3 136-180 и 236-249 (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMG SEQ ID NO: 3 IKZF3 136-180 и 236-249 (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMG SEQ ID NO: 2 Вариант IKZF3 136-180 и 236-249 без лизина (с N-концевым метионином) MHRRSHTGERPFQCNQCGASFTQRGNLLRHIRLHTGERPFRCHLCNTASAEARHIRAEMG SEQ ID NO: 4 Вариант IKZF3 136-180 и 236-249 без лизина (без N-концевого метионина) HRRSHTGERPFQCNQCGASFTQRGNLLRHIRLHTGERPFRCHLCNTASAEARHIRAEMG SEQ ID NO: 77 IKZF3 136-180 (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCN SEQ ID NO: 5 IKZF3 136-180 (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCN SEQ ID NO: 41 IKZF3 136-180 без лизина HRRSHTGERPFQCNQCGASFTQRGNLLRHIRLHTGERPFRCHLCN SEQ ID NO: 78 IKZF3 136-170 (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTG SEQ ID NO: 6 IKZF3 136-170 (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTG SEQ ID NO: 42 IKZF3 136-170 без лизина HRRSHTGERPFQCNQCGASFTQRGNLLRHIRLHTG SEQ ID NO: 79 IKZF3 140-170 (с N-концевым метионином) MHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTG SEQ ID NO: 7 IKZF3 140-170 (без N-концевого метионина) HTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTG SEQ ID NO: 80 IKZF3 140-169 (с N-концевым метионином) MHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHT SEQ ID NO: 24 IKZF3 140-169 (без N-концевого метионина) HTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHT SEQ ID NO: 81 IKZF3 141-163 (с N-концевым метионином) MTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLR SEQ ID NO: 8 IKZF3 141-163 (без N-концевого метионина) TGERPFQCNQCGASFTQKGNLLR SEQ ID NO: 82 IKZF3 145-170 (с N-концевым метионином) MPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTG SEQ ID NO: 9 IKZF3 145-170 (без N-концевого метионина) PFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTG SEQ ID NO: 83 IKZF3 145-155 (с N-концевым метионином) MPFQCNQCGASF SEQ ID NO: 10 IKZF3 145-155 (без N-концевого метионина) PFQCNQCGASF SEQ ID NO: 11 IKZF3 236-249 TASAEARHIKAEMG SEQ ID NO: 43 IKZF3 236-249 без лизина TASAEARHIRAEMG SEQ ID NO: 12 IKZF3 136-180 и 236-249 K245R (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIRAEMG SEQ ID NO: 84 IKZF3 136-180 и 236-249 K245R (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIRAEMG SEQ ID NO: 13 IKZF3 136-180 и 236-249 K245S (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHISAEMG SEQ ID NO: 100 IKZF3 136-180 и 236-249 K245S (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHISAEMG SEQ ID NO: 14 IKZF3 136-180 MALEK (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 85 IKZF3 136-180 MALEK (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 15 IKZF3 136-170 MALEK (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 86 IKZF3 136-170 MALEK (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 16 IKZF3 140-170 MALEK (с N-концевым метионином) MHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 87 IKZF3 140-170 MALEK (без N-концевого метионина) HTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 17 IKZF3 141-163 MALEK (с N-концевым метионином) MTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 88 IKZF3 141-163 MALEK (без N-концевого метионина) TGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 18 IKZF3 145-155 MALEK (с N-концевым метионином) MPFQCNQCGASFMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 89 IKZF3 145-155 MALEK (без N-концевого метионина) PFQCNQCGASFMALEKMALEKMALE SEQ ID NO: 27 IKZF3 136-180 Q147H (с N-концевым метионином) MHKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCN SEQ ID NO: 90 IKZF3 136-180 Q147H (без N-концевого метионина) HKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCN SEQ ID NO: 109 IKZF2 130-174 и 230-243 HKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCPFCSAGQVMSHHVPPMED SEQ ID NO: 113 IKZF2 130-174 HKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCPFCS SEQ ID NO: 114 IKZF2 230-243 AGQVMSHHVPPMED SEQ ID NO: 19 Полноразмерный IKZF3 MEDIQTNAELKSTQEQSVPAESAAVLNDYSLTKSHEMENVDSGEGPANEDEDIGDDSMKVKDEYSERDENVLKSEPMGNAEEPEIPYSYSREYNEYENIKLERHVVSFDSSRPTSGKMNCDVCGLSCISFNVLMVHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDALTGHLRTHSVEKPYKCEFCGRSYKQRSSLEEHKERCRTFLQSTDPGDTASAEARHIKAEMGSERALVLDRLASNVAKRKSSMPQKFIGEKRHCFDVNYNSSYMYEKESELIQTRMMDQAINNAISYLGAEALRPLVQTPPAPTSEMVPVISSMYPIALTRAEMSNGAPQELEKKSIHLPEKSVPSERGLSPNNSGHDSTDTDSNHEERQNHIYQQNHMVLSRARNGMPLLKEVPRSYELLKPPPICPRDSVKVINKEGEVMDVYRCDHCRVLFLDYVMFTIHMGCHGFRDPFECNMCGYRSHDRYEFSSHIARGEHRALLK SEQ ID NO: 20 Полноразмерный IKZF1 MDADEGQDMSQVSGKESPPVSDTPDEGDEPMPIPEDLSTTSGGQQSSKSDRVVASNVKVETQSDEENGRACEMNGEECAEDLRMLDASGEKMNGSHRDQGSSALSGVGGIRLPNGKLKCDICGIICIGPNVLMVHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCHLCNYACRRRDALTGHLRTHSVGKPHKCGYCGRSYKQRSSLEEHKERCHNYLESMGLPGTLYPVIKEETNHSEMAEDLCKIGSERSLVLDRLASNVAKRKSSMPQKFLGDKGLSDTPYDSSASYEKENEMMKSHVMDQAINNAINYLGAESLRPLVQTPPGGSEVVPVISPMYQLHKPLAEGTPRSNHSAQDSAVENLLLLSKAKLVPSEREASPSNSCQDSTDTESNNEEQRSGLIYLTNHIAPHARNGLSLKEEHRAYDLLRAASENSQDALRVVSTSGEQMKVYKCEHCRVLFLDHVMYTIHMGCHGFRDPFECNMCGYHSQDRYEFSSHITRGEHRFHMS SEQ ID NO: 21 Полноразмерный IKZF2 METEAIDGYITCDNELSPEREHSNMAIDLTSSTPNGQHASPSHMTSTNSVKLEMQSDEECDRKPLSREDEIRGHDEGSSLEEPLIESSEVADNRKVQELQGEGGIRLPNGKLKCDVCGMVCIGPNVLMVHKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCPFCSYACRRRDALTGHLRTHSVGKPHKCNYCGRSYKQRSSLEEHKERCHNYLQNVSMEAAGQVMSHHVPPMEDCKEQEPIMDNNISLVPFERPAVIEKLTGNMGKRKSSTPQKFVGEKLMRFSYPDIHFDMNLTYEKEAELMQSHMMDQAINNAITYLGAEALHPLMQHPPSTIAEVAPVISSAYSQVYHPNRIERPISRETADSHENNMDGPISLIRPKSRPQEREASPSNSCLDSTDSESSHDDHQSYQGHPALNPKRKQSPAYMKEDVKALDTTKAPKGSLKDIYKVFNGEGEQIRAFKCEHCRVLFLDHVMYTIHMGCHGYRDPLECNICGYRSQDRYEFSSHIVRGEHTFH SEQ ID NO: 22 Полноразмерный IKZF4 MHTPPALPRRFQGGGRVRTPGSHRQGKDNLERDPSGGCVPDFLPQAQDSNHFIMESLFCESSGDSSLEKEFLGAPVGPSVSTPNSQHSSPSRSLSANSIKVEMYSDEESSRLLGPDERLLEKDDSVIVEDSLSEPLGYCDGSGPEPHSPGGIRLPNGKLKCDVCGMVCIGPNVLMVHKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCPFCNYACRRRDALTGHLRTHSVSSPTVGKPYKCNYCGRSYKQQSTLEEHKERCHNYLQSLSTEAQALAGQPGDEIRDLEMVPDSMLHSSSERPTFIDRLANSLTKRKRSTPQKFVGEKQMRFSLSDLPYDVNSGGYEKDVELVAHHSLEPGFGSSLAFVGAEHLRPLRLPPTNCISELTPVISSVYTQMQPLPGRLELPGSREAGEGPEDLADGGPLLYRPRGPLTDPGASPSNGCQDSTDTESNHEDRVAGVVSLPQGPPPQPPPTIVVGRHSPAYAKEDPKPQEGLLRGTPGPSKEVLRVVGESGEPVKAFKCEHCRILFLDHVMFTIHMGCHGFRDPFECNICGYHSQDRYEFSSHIVRGEHKVG SEQ ID NO: 23 Полноразмерный IKZF5 MGEKKPEPLDFVKDFQEYLTQQTHHVNMISGSVSGDKEAEALQGAGTDGDQNGLDHPSVEVSLDENSGMLVDGFERTFDGKLKCRYCNYASKGTARLIEHIRIHTGEKPHRCHLCPFASAYERHLEAHMRSHTGEKPYKCELCSFRCSDRSNLSHHRRRKHKMVPIKGTRSSLSSKKMWGVLQKKTSNLGYSRRALINLSPPSMVVQKPDYLNDFTHEIPNIQTDSYESMAKTTPTGGLPRDPQELMVDNPLNQLSTLAGQLSSLPPENQNPASPDVVPCPDEKPFMIQQPSTQAVVSAVSASIPQSSSPTSPEPRPSHSQRNYSPVAGPSSEPSAHTSTPSIGNSQPSTPAPALPVQDPQLLHHCQHCDMYFADNILYTIHMGCHGYENPFQCNICGCKCKNKYDFACHFARGQHNQH

Соединения деградации

В данном документе, среди прочего, раскрыты соединения деградации, которые могут, например, увеличивать убиквитинирование и/или деградацию слитых белков, содержащих метку деградации.

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации содержит представителя талидомидного класса соединений. В некоторых вариантах осуществления представители талидомидного класса соединений включают без ограничения леналидомид (CC-5013), помалидомид (CC-4047 или ACTIMID), талидомид или их соли или производные. В некоторых вариантах осуществления соединение деградации может представлять собой смесь из одного, двух, трех или более представителей талидомидного класса соединений. Аналоги талидомида и иммуномодулирующие свойства аналогов талидомида описаны в Bodera and Stankiewicz, Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 2011 Sep;5(3):192-6, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Структурный комплекс аналогов талидомида и убиквитина E3 описан в Gandhi et al., Br J Haematol. 2014 Mar;164(6):811-21, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Модуляция убиквитинлигазы E3 под действием аналогов талидомида описана в Fischer et al., Nature. 2014 Aug 7;512(7512):49-53, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации содержит соединение формулы (I):

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат, сольват или таутомер, где:

X представляет собой O или S;

R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2, 3 или 4; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления X представляет собой O.

В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен 1-12 R⁴ (например, 1 R⁴, 2 R⁴, 3 R⁴, 4 R⁴, 5 R⁴, 6 R⁴, 7 R⁴, 8 R⁴, 9 R⁴, 10 R⁴, 11 R⁴ или 12 R⁴). В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой 6-членный гетероциклил или 5-членный гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой 6-членный гетероциклил или 5-членный гетероциклил, каждый из которых независимо и необязательно замещен 1-6 R⁴ (например, 1 R⁴, 2 R⁴, 3 R⁴, 4 R⁴, 5 R⁴ или 6 R⁴). В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой азот-содержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой пиперидинил (например, пиперидин-2,6-дионил).

В некоторых вариантах осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления R^2a и R^2b вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу.

В некоторых вариантах осуществления каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен 1-12 R⁶ (например, 1 R⁶, 2 R⁶, 3 R⁶, 4 R⁶, 5 R⁶, 6 R⁶, 7 R⁶, 8 R⁶, 9 R⁶, 10 R⁶, 11 R⁶ или 12 R⁶). В некоторых вариантах осуществления R³ представляет собой C₁-C₆гетероалкил, -N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A. В некоторых вариантах осуществления R³ представляет собой C₁-C₆гетероалкил (например, CH₂NHC(O)CH₂-фенил-трет-бутил), -N(R^C)(R^D) (например, NH₂) или -N(R^C)C(O)R^A (например, NHC(O)CH₃). В некоторых вариантах осуществления R³ представляет собой C₁-C₆гетероалкил, необязательно замещенный 1-6 R⁶ (например, 1 R⁶, 2 R⁶, 3 R⁶, 4 R⁶, 5 R⁶ или 6 R⁶).

В некоторых вариантах осуществления каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен 1-12 R⁷ (например, 1 R⁷, 2 R⁷, 3 R⁷, 4 R⁷, 5 R⁷, 6 R⁷, 7 R⁷, 8 R⁷, 9 R⁷, 10 R⁷, 11 R⁷ или 12 R⁷).

В некоторых вариантах осуществления каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен 1-6 R⁸ (например, 1 R⁸, 2 R⁸, 3 R⁸, 4 R⁸, 5 R⁸ или 6 R⁸).

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидин-2,6-дионил). В одном варианте осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород. В одном варианте осуществления n составляет 1. В одном варианте осуществления R³ представляет собой -N(R^C)(R^D) (например, -NH₂). В одном варианте осуществления соединение деградации содержит леналидомид, например, 3-(4-амино-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой леналидомид, например, соответствующий следующей формулой:

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидинил-2,6-дионил). В некоторых вариантах осуществления R^2a и R^2b вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу. В одном варианте осуществления n составляет 1. В одном варианте осуществления R³ представляет собой -N(R^C)(R^D) (например, -NH₂). В одном варианте осуществления соединение деградации содержит помалидомид, например, 4-амино-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолин-1,3-дион или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой помалидомид, например, соответствующий следующей формуле:

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидинил-2,6-дионил). В одном варианте осуществления R^2a и R^2b вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу. В одном варианте осуществления n составляет 0. В одном варианте осуществления соединение деградации содержит талидомид, например, 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолин-1,3-дион или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления продукт деградации представляет собой талидомид, например, соответствующий следующей формуле:

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидин-2,6-дионил). В одном варианте осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород. В одном варианте осуществления n составляет 1. В одном варианте осуществления R³ представляет собой C₁-C₆гетероалкил (например, CH₂NHC(O)CH₂-фенил-трет-бутил). В одном варианте осуществления R³ представляет собой C₁-C₆гетероалкил, замещенный 1 R⁶ (например, CH₂NHC(O)CH₂-фенил-трет-бутил). В одном варианте осуществления соединение деградации содержит 2-(4-(трет-бутил)фенил)-N-((2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)метил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации характеризуется структурой, представленной следующей формулой:

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (I-a):

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат или таутомер, где:

кольцо A представляет собой карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

M отсутствует или представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил или C₁-C₆гетероалкил, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

R^3a представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый из R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N (R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

n составляет 0, 1, 2 или 3;

o составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления X представляет собой O.

В некоторых вариантах осуществления M представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил или C₁-C₆гетероалкил, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен 1-6 R⁴ (например, 1 R⁴, 2 R⁴, 3 R⁴, 4 R⁴, 5 R⁴ или 6 R⁴). В некоторых вариантах осуществления M отсутствует.

В некоторых вариантах осуществления кольцо A представляет собой карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен 1-6 R⁴ (например, 1 R⁴, 2 R⁴, 3 R⁴, 4 R⁴, 5 R⁴ или 6 R⁴). В некоторых вариантах осуществления кольцо A представляет собой гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления кольцо A представляет собой гетероциклил, например, 6-членный гетероциклил или 5-членный гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления кольцо A представляет собой азот-содержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления кольцо A представляет собой пиперидинил (например, пиперидин-2,6-дионил).

В некоторых вариантах осуществления M отсутствует и кольцо A представляет собой гетероциклил (например, пиперидинил, например, пиперидин-2,6-дионил).

В некоторых вариантах осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления R^2a и R^2b вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу.

В некоторых вариантах осуществления R^3a представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N(R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен 1-12 R⁶ (например, 1 R⁶, 2 R⁶, 3 R⁶, 4 R⁶, 5 R⁶, 6 R⁶, 7 R⁶, 8 R⁶, 9 R⁶, 10 R⁶, 11 R⁶ или 12 R⁶). В некоторых вариантах осуществления R^3a представляет собой водород, -N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A. В некоторых вариантах осуществления R^3a представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления R^3a представляет собой -N(R^C)(R^D) (например, -NH₂). В некоторых вариантах осуществления R^3a представляет собой -N(R^C)C(O)R^A (например, NHC(O)CH₃).

В некоторых вариантах осуществления каждый R³ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D) или -N (R^C)S(O)_xR^E, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен 1-12 R⁶ (например, 1 R⁶, 2 R⁶, 3 R⁶, 4 R⁶, 5 R⁶, 6 R⁶, 7 R⁶, 8 R⁶, 9 R⁶, 10 R⁶, 11 R⁶ или 12 R⁶). В некоторых вариантах осуществления R³ представляет собой C₁-C₆гетероалкил (например, CH₂NHC(O)CH₂-фенил-трет-бутил).

В некоторых вариантах осуществления каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен 1-12 R⁷ (например, 1 R⁷, 2 R⁷, 3 R⁷, 4 R⁷, 5 R⁷, 6 R⁷, 7 R⁷, 8 R⁷, 9 R⁷, 10 R⁷, 11 R⁷ или 12 R⁷).

В некоторых вариантах осуществления каждый R⁶ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен 1-6 R⁸ (например, 1 R⁸, 2 R⁸, 3 R⁸, 4 R⁸, 5 R⁸ или 6 R⁸).

В некоторых вариантах осуществления n составляет 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления n составляет 0. В некоторых вариантах осуществления n составляет 1.

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (III):

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат или таутомер, где:

X₁ представляет собой CR₃;

необязательно представляет собой двойную связь, если X₁ представляет собой CR₃ и R₃ отсутствует;

каждый R₁ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆галогеналкил, C₁-C₆гидроксиалкил или галоген, или

два R₁ вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклильное кольцо, или

два R₁, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членное гетероарильное кольцо, содержащее 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S;

R₂ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, -C(O)C₁-C₆алкил, -C(O)(CH₂)_0-3-C₆-C₁₀арил, -C(O)O(CH₂)_0-3-C₆-C₁₀арил, C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где алкил необязательно замещен одним или несколькими R₄; и арил, гетероарил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими R₅, или

R₁ и R₂, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклильное кольцо;

R₃ представляет собой водород, или R₃ отсутствует, если представляет собой двойную связь;

каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, -C(O)NR₆R_6', -NR₆C(O)R_6', галогена, -OH, -NH₂, циано, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-4 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклильного кольца, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, гетероарил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими R₇;

каждый R₅ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₂-C₆алкенила, C₂-C₆алкинила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂, циано, C₃-C₇карбоциклила, 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₆-C₁₀арила и 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, или

два R₅, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀, или

два R₅, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₅-C₇карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀;

каждый R₆ и R_6' независимо представляет собой водород, C₁-C₆алкил или C₆-C₁₀арил;

каждый R₇ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₂-C₆алкенила, C₂-C₆алкинила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, -C(O)R₈, -(CH₂)_0-3C(O)OR₈, -C(O)NR₈R₉, -NR₈C(O)R₉, -NR₈C(O)OR₉, -S(O)_pNR₈R₉, -S(O)_pR₁₂, (C₁-C₆)гидроксиалкила, галогена, -OH, -O(CH₂)_1-3CN, -NH₂, циано, -O(CH₂)_0-3-C₆-C₁₀арила, адамантила, -O(CH₂)_0-3-5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₆-C₁₀арила, моноциклического или бициклического 5-10-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₇ карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где алкил необязательно замещен одним или несколькими R₁₁, и арил, гетероарил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими заместителями, каждый из которых независимо выбран из галогена, C₁-C₆алкила, C₁-C₆галогеналкила и C₁-C₆алкокси, или

два R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют =(O), или

два R₇, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀, или

два R₇ вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₅-C₇карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀;

каждый R₈ и R₉ независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R₁₀ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂ и циано, или

два R₁₀ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют =(O);

каждый R₁₁ независимо выбран из циано, C₁-C₆алкокси, C₆-C₁₀арила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где каждый арил и гетероциклил необязательно замещен одним или несколькими заместителями, каждый из которых независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂ и циано;

R₁₂ представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆галогеналкил, C₆-C₁₀арил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S;

R_x представляет собой водород или дейтерий;

p составляет 0, 1 или 2;

n составляет 0, 1 или 2;

y составляет 1 или 2, где n+y≤3; и

q составляет 0, 1, 2, 3 или 4.

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-a):

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат или таутомер, где:

X₁ представляет собой CR₃;

необязательно представляет собой двойную связь, если X₁ представляет собой CR₃ и R₃ отсутствует;

каждый R₁ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆галогеналкил, C₁-C₆гидроксиалкил или галоген;

R₂ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где алкил необязательно замещен одним или несколькими R₄; и арил, гетероарил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими R₅;

R₃ представляет собой водород, или R₃ отсутствует, если представляет собой двойную связь;

каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, -C(O)NR₆R_6', -NR₆C(O)R_6', C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-4 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклильного кольца, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, гетероарил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним или несколькими R₇;

каждый R₅ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₂-C₆алкенила, C₂-C₆алкинила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂, циано, C₃-C₇карбоциклила, 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₆-C₁₀арила и 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, или

два R₅, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀, или

два R₅, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₅-C₇карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀;

каждый R₆ и R_6' независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R₇ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₂-C₆алкенила, C₂-C₆алкинила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, -C(O)R₈, -C(O)NR₈R₉, -NR₈C(O)R₉, -NR₈C(O)OR₉, (C₁-C₆)гидроксиалкил, галогена, -OH, -NH₂, циано, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₇карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, или

два R₇, когда они находятся при смежных атомах, вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₆-C₁₀арил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀, или

два R₇ вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют C₅-C₇карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенные одним или несколькими R₁₀;

каждый R₈ и R₉ независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R₁₀ независимо выбран из C₁-C₆алкила, C₁-C₆алкокси, C₁-C₆галогеналкила, C₁-C₆галогеналкокси, C₁-C₆гидроксиалкила, галогена, -OH, -NH₂ и циано;

R_x представляет собой водород или дейтерий;

n составляет 1 или 2; и

q составляет 0, 1, 2, 3 или 4.

В одном варианте осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-b):

, или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, пролекарство, стереоизомер и таутомер, где X₁, R₁, R₂, n, q и их подпеременные определены, как описано для формулы (III).

В одном варианте осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-c):

, или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, пролекарство, стереоизомер и таутомер, где R₁, R₂, n, q и их подпеременные определены, как описано для формулы (III).

В одном варианте осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-d):

, или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, пролекарство, стереоизомер и таутомер, где R₁, R₂, n, q и их подпеременные определены, как описано для формулы (III).

В одном варианте осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-e):

, или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, пролекарство, стереоизомер и таутомер, где R₁, R₂, n, q и их подпеременные определены, как описано для формулы (III).

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, и n составляет 1. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, и q составляет 0.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, и q составляет 0 или 1. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, и R₁ представляет собой C₁-C₆алкил. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄.

В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄.

В некоторых вариантах осуществления вышеприведенных формул X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, гетероарил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещен одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₃-C₈карбоциклил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₃-C₈карбоциклил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления вышеприведенных формул X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из галогена, -OH, фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила и 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная и гетероарильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила и 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная и гетероарильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила и 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная и гетероарильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из фенила и 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где фенильная и гетероарильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ м CH, n составляет 1, n1 составляет 1, q составляет 0, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, и n составляет 2. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, и q составляет 0. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, и q составляет 0 или 1. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, и R₁ представляет собой C₁-C₆алкил.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из -C(O)OR₆, C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, необязательно замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, R₂ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный одним-тремя R₄, и каждый R₄ независимо выбран из C₆-C₁₀арила, 5- или 6-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, C₃-C₈карбоциклила и 5-7-членного гетероциклила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арильная, гетероарильная, карбоциклильная и гетероциклильная группы необязательно замещены одним-тремя R₇.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой C₃-C₈карбоциклил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, где арил, карбоциклил и гетероциклил необязательно замещены одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, C₃-C₈карбоциклил или 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₆-C₁₀арил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0, и R₂ представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В еще одном варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой C₃-C₈карбоциклил, необязательно замещенный одним-тремя R₅. В другом варианте осуществления X₁ представляет собой CH, n составляет 2, q составляет 0 или 1, R₁ представляет собой C₁-C₆алкил, и R₂ представляет собой 5-7-членный гетероциклил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из O, N и S, необязательно замещенный одним-тремя R₅.

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) представляет собой

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) представляет собой

В некоторых вариантах осуществления формулы (III) представляет собой

Соединение деградации может содержать один или несколько хиральных центров или существовать в виде одного или нескольких стереоизомеров. В некоторых вариантах осуществления соединение деградации содержит один хиральный центр и представляет собой смесь стереоизомеров, например, R-стереоизомера и S-стереоизомера. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит R-стереоизомеры и S стереоизомеры при определенном соотношении, например, соотношении R-стереоизомеров и S-стереоизомеров приблизительно 1:1 (т. е. рацемическая смесь). В некоторых вариантах осуществления смесь содержит R-стереоизомеры и S-стереоизомеры при соотношении приблизительно 51:49, приблизительно 52: 48, приблизительно 53:47, приблизительно 54:46, приблизительно 55:45, приблизительно 60:40, приблизительно 65:35, приблизительно 70:30, приблизительно 75:25, приблизительно 80:20, приблизительно 85:15, приблизительно 90:10, приблизительно 95:5 или приблизительно 99:1. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит S-стереоизомеры и R-стереоизомеры при соотношении приблизительно 51:49, приблизительно 52: 48, приблизительно 53:47, приблизительно 54:46, приблизительно 55:45, приблизительно 60:40, приблизительно 65:35, приблизительно 70:30, приблизительно 75:25, приблизительно 80:20, приблизительно 85:15, приблизительно 90:10, приблизительно 95:5 или приблизительно 99:1. В некоторых вариантах осуществления соединение деградации представляет собой один стереоизомер формулы (I) или формулы (I-a), например, один R-стереоизомер или один S-стереоизомер.

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации (например, соединение формул (I), (I-a), (III), (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) или (III-e)) не присоединено к линкеру или группе присоединения. В некоторых вариантах осуществления соединение деградации (например, соединение формул (I), (I-a), (III), (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) или (III-e)) не содержит другой фрагмент, например, лиганд, нацеливающее средство или фрагмент, способный к димеризации.

В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (I-a) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (III) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (III-a) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (III-b) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (III-c) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (III-d) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой соединение формулы (III-e) или его фармацевтически приемлемую соль.

Иллюстративные соединения деградации по настоящему изобретению (например, соединение формулы (III), (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) или (III-e) или его фармацевтически приемлемая соль) включают соединения из таблицы 29.

№ соед. Структура Название соединения I-1 3-(5-(1-этилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-2 3-(1-оксо-5-(1-пропилпиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-3 3-(5-(1-(циклопропилметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-4 3-(5-(1-изобутилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-5 3-(5-(1-(циклобутилметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-6 3-(5-(1-(оксазол-2-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-7 3-(1-оксо-5-(1-(тиазол-2-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-8 3-(5-(1-(циклопентилметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-9 3-(5-(1-((5-хлортиофен-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-10 3-(5-(1-((2-хлортиазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-11 3-(5-(1-(циклогексилметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-12 3-(1-оксо-5-(1-(2-(пирролидин-1-ил)этил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-13 3-(1-оксо-5-(1-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-14 3-(1-оксо-5-(1-фенэтилпиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-15 3-(5-(1-(3-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-16 3-(5-(1-(3-хлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-17 3-(5-(1-(2-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-18 3-(5-(1-(2-хлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-19 3-(1-оксо-5-(1-(2-(пиперидин-1-ил)этил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-20 3-(5-(1-((3,5-диметилизоксазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-21 3-(5-(1-((1,3-диметил-1H-пиразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-22 3-(5-(1-((6-метилпиридин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-23 3-(5-(1-(3-морфолинoпропил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-24 3-(5-(1-(2,6-дифторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-25 3-(5-(1-(2,6-дихлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-26 3-(5-(1-(3,5-дифторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-27 3-(5-(1-(3,5-дибромбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-28 3-(5-(1-(3-хлор-5-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-29 3-(5-(1-(2,5-дифторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-30 3-(5-(1-(2,5-дихлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-31 4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензoнитрил
(или 3-(5-(1-(4-нитрилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион) I-32 3-(5-(1-(4-(гидроксиметил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-33 3-(5-(1-(3,4-дихлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-34 3-(5-(1-(4-хлор-2-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-35 3-(5-(1-(2-хлор-4-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-36 3-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензoнитрил I-37 3-(5-(1-(2,3-дифторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-38 2-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензoнитрил I-39 3-(5-(1-(4-метоксибензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-40 3-(5-(1-(2,5-диметилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-41 3-(5-(1-(3,4-диметилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-42 3-(5-(1-(2,4-диметилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-43 3-(5-(1-((1H-индазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-44 3-(5-(1-((1H-бензо[d]имидазол-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-45 3-(5-(1-(4-изопропилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-46 метил-5-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)фуран-2-карбоксилат I-47 3-(5-(1-(нафталин-2-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-48 3-(1-оксо-5-(1-(хинолин-2-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-49 3-(5-(1-(нафталин-1-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-50 3-(5-(1-((1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-51 3-(1-оксо-5-(1-(4-(трифторметокси)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-52 3-(5-(1-(4-(1H-пиррол-1-ил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-53 3-(5-(1-(4-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-54 3-(1-оксо-5-(1-(3-(трифторметокси)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-55 3-(1-оксо-5-(1-(2-(трифторметокси)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-56 3-(1-оксо-5-(1-((3-фенил-1,2,4-оксадиазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-57 3-(5-(1-бензилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-58 3-(1-оксо-5-(1-(пиридин-2-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-59 3-(1-оксо-5-(1-(пиридин-3-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-60 3-(1-оксо-5-(1-(пиридин-4-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-61 3-(1-оксо-5-(1-(пиримидин-5-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-62 3-(1-оксо-5-(1-(1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-63 3-(5-(1-(4-(фторметил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-64 3-(5-(1-(3,4-дифторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-65 2-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)пиримидин-5-карбонитрил I-66 3-(5-(1-(4-этилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-67 3-(5-(1-(2-метоксибензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-68 3-(5-(1-((2-метоксипиримидин-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-69 3-(5-(1-(3-фтор-4-метилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-70 3-(5-(1-(4-(дифторметил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-71 4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензамид I-72 4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензойная кислота I-73 3-(5-(1-(3-(дифторметил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-74 3-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензойная кислота I-75 3-(1-оксо-5-(1-(4-пропилбензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-76 3-(1-оксо-5-(1-(4-(трифторметил)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-77 3-(5-(1-(4-(дифторметокси)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-78 3-(1-оксо-5-(1-((5-(трифторметил)пиридин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-79 3-(5-(1-(3-(дифторметокси)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-80 3-(5-(1-(2-(дифторметокси)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-81 3-(5-(1-(4-циклобутилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-82 3-(5-(1-((2,3-дигидробензo[b][1,4]диоксин-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-83 3-(5-(1-((2,3-дигидробензo[b][1,4]диоксин-6-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-84 3-(5-(1-(4-(трет-бутил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-85 3-(5-(1-(4-изобутилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-86 N-(4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)фенил)ацетамид I-87 3-(5-(1-((2,2-дифторбензo[d][1,3]диоксол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-88 3-(5-(1-((3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]диоксепин-7-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-89 3-(1-оксо-5-(1-(4-(трет-пентил)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-90 3-(5-(1-([1,1'-бифенил]-4-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-91 3-(5-(1-(4-(1H-пиразол-1-ил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-92 3-(5-(1-(4-(1H-имидазол-1-ил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-93 3-(5-(1-(3-(1H-пиразол-1-ил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-94 3-(5-(1-(4-циклогексилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-95 3-(1-оксо-5-(1-(пиримидин-2-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-96 3-(5-(1-(4-бромбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-97 3-(5-(1-(4-хлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-98 3-(5-(1-(3,5-дихлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-99 3-(5-(1-(4-хлор-3-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-100 3-(5-(1-(3-хлор-4-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-101 3-(5-(1-(2,4-дифторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-102 3-(5-(1-(3-метоксибензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-103 3-(5-(1-(бензо[c][1,2,5]оксадиазол-5-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-104 3-(5-(1-(2-циклопропилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-105 3-(5-(1-((1,3-дигидроизобензoфуран-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-106 3-(1-оксо-5-(1-(2-(трифторметил)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-107 3-(5-(1-(3-(трет-бутил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-108 3-(5-(1-(3-изопропоксибензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-109 3-(1-оксо-5-(1-(4-(тиофен-3-ил)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-110 3-(5-(1-(4-циклопентилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-111 3-(1-оксо-5-(1-(4-(пирролидин-1-ил)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-112 3-(5-(1-(4-фторбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-113 3-(5-(1-(2,4-дихлорбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-114 3-(1-оксо-5-(1-(хинолин-8-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-115 3-(5-(1-((1-метил-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-116 3-(5-(1-((1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-117 3-(5-(1-((1-метил-1H-пиразол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-118 3-(5-(1-((1H-пиразол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-119 3-(5-(1-((1H-пиррол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-120 3-(5-(1-((1H-имидазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-121 3-(5-(1-((1-этил-1H-пиразол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-122 3-(5-(1-((2-аминопиримидин-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-123 3-(5-(1-((6-аминопиридин-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-124 3-(5-(1-((5-амино-1-метил-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-125 3-(5-(1-((6-метилимидазо[2,1-b]тиазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-126 3-(5-(1-(имидазо[1,2-a]пиразин-3-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-127 3-(5-(1-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-5-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-128 3-(1-оксо-5-(1-(пиразолo[1,5-a]пиридин-4-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-129 3-(5-(1-((1,4-диметил-1H-имидазол-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-130 3-(5-(1-(бензо[d]тиазол-5-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-131 3-(1-оксо-5-(1-(пиразолo[1,5-a]пиримидин-6-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-132 3-(5-(1-(имидазо[1,2-a]пиримидин-3-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-133 3-(5-(1-(имидазо[1,2-a]пиримидин-2-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-134 3-(5-(1-((1-циклобутил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-135 3-(1-оксо-5-(1-((4,5,6,7-тетрагидропиразолo[1,5-a]пиридин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-136 3-(5-(1-((1H-индол-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-137 3-(5-(1-((1H-индазол-6-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-138 3-(5-(1-((1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-139 3-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензамид I-140 3-(5-(1-((1H-пирроло[2,3-b]пиридин-6-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-141 3-(5-(1-((3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]тиазин-6-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-142 3-(1-оксо-5-(1-((2-(пирролидин-1-ил)пиримидин-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-143 3-(5-(1-((2-(трет-бутил)тиазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-144 3-(1-оксо-5-(1-((2-(тиофен-2-ил)тиазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-145 3-(5-(1-((2-циклогексилтиазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-146 3-(5-(1-((5-циклопропил-1H-пиразол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-147 3-(5-(1-((2-морфолинoпиримидин-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-148 3-(1-оксо-5-(1-((3-фенил-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-149 3-(5-(1-((6-метил-1H-индол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-150 метил-4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)-1H-пиррол-2-карбоксилат I-151 3-(1-оксо-5-(1-((3-(пиридин-3-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-152 3-(1-оксо-5-(1-((2-фенил-1H-имидазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-153 3-(1-оксо-5-(1-((5-(пиридин-2-ил)-1H-пиразол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-154 3-(1-оксо-5-(1-((4-фенил-1H-имидазол-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-155 3-(1-оксо-5-(пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-156 3-(5-(1-(3,5-дифтор-4-гидроксибензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-157 3-(5-(1-(2-метилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-158 3-(5-(1-(4-метилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-159 3-(5-(1-(3,5-диметилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-160 3-(5-((2S)-1-бензил-2-метилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-161 3-(5-((2R)-1-бензил-2-метилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-162 3-(5-(1-бензил-2-метилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-163 3-(5-(1-метил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-164 3-(1-оксо-5-(1-((5,6,7,8-тетрагидронафталин-1-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-165 3-(5-(азепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-166 3-(5-((R)-азепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-167 3-(5-((S)-азепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-168 3-(1-оксо-5-(1-((1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-169 метил-2-(4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)ацетат I-170 3-(1-оксо-5-(1-фенилпиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-171 3-(1-оксо-5-(2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-172 3-(5-(1-бензил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-173 3-(5-(1-(3-метилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-174 3-(5-(1-(2,6-диметилбензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-175 3-(1-оксо-5-(1-((5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-176 этил-2-(4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)ацетат I-177 трет-бутил-2-(4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)ацетат I-178 2-(4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)уксусная кислота I-179 3-(1-оксо-5-(1-(3,3,3-трифторпропил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-180 2-(4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)-N-фенилацетамид I-181 3-(5-(1-(3-фторпропил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-182 трет-бутил-4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)бензоат I-183 3-(5-(2-метилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-184 3-(5-(3,3-диметилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-185 3-(5-(1-бензил-3,3-диметилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-186 5-(3-метилпиперидин-4-ил)-2-(2-оксопиперидин-3-ил)изоиндолин-1-он I-187 3-(5-(1-бензил-3-метилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-188 3-(5-(8-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-189 3-(5-(1-(2-гидрокси-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-190 3-(5-((S)-1-бензилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-191 3-(5-(1-бензил-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-192 3-(5-(1-бензил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-193 3-(5-(1-бензил-2-оксопиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-194 3-(1-оксо-5-(2-оксопиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-195 3-(1-оксо-5-(2-оксо-1,2-дигидропиридин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-196 3-(1-оксо-5-(1,2,3,4-тетрагидрохинолин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-197 3-(5-(1-бензил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-198 3-(5-(1-((1-бензил-1H-тетразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-199 3-(1-оксо-5-(1-((5-фенил-1,3,4-оксадиазол-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-200 3-(5-(1-(бензо[d]тиазол-2-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-201 3-(1-оксо-5-(1-((3-(пиридин-2-ил)-1H-пиразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-202 3-(5-(1-((R)-2-гидрокси-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-203 3-(5-(1-((1-метил-1H-индазол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-204 3-(5-(1-((1,2,4-оксадиазол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-205 3-(5-(1-(4-гидрокси-3-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-206 2-(4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)фенил)ацетонитрил I-207 3-(5-(1-((2-(4-хлорфенил)-5-метилоксазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-208 3-(5-(1-((7-гидрокси-2-метилпиразолo[1,5-a]пиримидин-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-209 3-(5-(1-(2,2-дифтор-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-210 3-(5-(1-((3-фторбицикло[1.1.1]пентан-1-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-211 3-(1-оксо-5-(1-((2-фенилтиазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-212 3-(5-(1-(2-фтор-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-213 3-(1-оксо-5-(1-((4-оксо-3,4-дигидротиено[3,2-d]пиримидин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-214 3-(1-оксо-5-(1-(хинолин-4-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-215 3-(5-(1-(3,5-бис(трифторметил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-216 3-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)-N, N-диметилбензолсульфонамид I-217 6-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)пиколинoнитрил I-218 2-(4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)фенокси)ацетонитрил I-219 3-(5-(1-((1H-индазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-220 3-(5-(1-(2,2-дифторэтил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-221 3-(5-(1-((7-метил-4-оксо-4H-пиридо[1,2-a]пиримидин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-222 бензил-4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-карбоксилат I-223 3-(1-оксо-5-(1-(2-фенилацетил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-224 3-(1-оксо-5-(1-(2,2,2-трифтор-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-225 3-(5-(1-(4-(5-метилбензo[d]тиазол-2-ил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-226 3-(5-(1-(изохинолин-1-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-227 3-(5-(1-(4-(4-метоксипиперидин-1-ил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-228 3-(5-(1-(4-(изопропилтио)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-229 трет-бутил-(5-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)-4-(трифторметил)тиазол-2-ил)карбамат I-230 3-(1-оксо-5-(1-((S)-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-231 2-(4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)фенил)уксусная кислота I-232 3-(5-(1-((7-фторхинолин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-233 3-(5-(1-((5-метил-2-(4-(трифторметил)фенил)оксазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-234 3-(5-(1-((2-амино-4-(трифторметил)тиазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-235 3-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)-1,2,4-оксадиазол-5-карбоксамид I-236 3-(5-(1-(3-(морфолинoсульфонил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-237 4-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)-N, N-диметилбензолсульфонамид I-238 3-(1-оксо-5-(1-(тиазол-4-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-239 3-(1-оксо-5-(1-(хиноксалин-6-илметил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-240 3-(5-(1-((2-(4-фторфенил)-5-метилоксазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-241 3-(1-оксо-5-(1-((3-(м-толил)-1,2,4-оксадиазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-242 3-(5-(1-(4-(трет-бутил)бензоил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-243 3-(1-оксо-5-(1-((5-(4-(трифторметил)фенил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-244 3-(5-(1-(4-((4-фторбензил)окси)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-245 3-(5-(1-((3-метилизоксазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-246 3-(5-(1-(изоксазол-3-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-247 3-(1-оксо-5-(1-((R)-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-248 3-(5-(1-(4-(метоксиметил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-249 3-(5-(1-((S)-2-гидрокси-1-фенилэтил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-250 3-(1-оксо-5-(1-(фенилсульфонил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-251 3-(5-(1-((5-метил-3-фенилизоксазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-252 3-(5-(1-(4-((дифторметил)сульфонил)бензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-253 3-(1-оксо-5-(1-(2,2,2-трифторэтил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-254 метил-2-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)оксазол-4-карбоксилат I-255 3-(1-оксо-5-(1-(4-(пиридин-2-илметокси)бензил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-256 3-(5-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-257 3-(5-(1-((5-метил-2-фенилоксазол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-258 3-(5-(1-((3-циклогексилизоксазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-259 3-(1-оксо-5-(1-((2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-260 3-(5-(1-бензилпирролидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-261 (R)-3-(5-((R)-1-бензилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-262 (S)-3-(5-((S)-1-бензилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-263 3-(5-(1-бензилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-264 3-(5-(1-метил-2,3,6,7-тетрагидро-1H-азепин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-265 3-(5-(8-бензил-8-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-266 транс-3-(1-оксо-5-(1-((4-(трифторметил)циклогексил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-267 (S)-3-(1-оксо-5-((S)-пиперидин-3-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-268 3-(5-(1-ацетил-1,2,5,6-тетрагидропиридин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-269 (R)-3-(5-((R)-1-ацетилпирролидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-270 3-(5-(1-ацетил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-271 3-(5-(октагидроиндолизин-7-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-272 (R)-3-(5-((S)-1-бензилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-273 3-(5-((R)-1-бензилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-274 3-(5-(2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-275 3-(5-(1-ацетил-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-276 цис-3-(1-оксо-5-(1-((4-(трифторметил)циклогексил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-277 3-(1-оксо-5-(2,3,6,7-тетрагидро-1H-азепин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-278 3-(5-(1-метилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-279 (R)-3-(1-оксо-5-((S)-пиперидин-3-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-280 3-(1-оксо-5-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-281 (S)-3-(5-((R)-1-бензилазепан-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-282 3-(1-оксо-5-(1,2,5,6-тетрагидропиридин-3-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-283 3-(1-оксо-5-(2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-284 (S)-3-(5-((R)-1-ацетилпирролидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-285 3-(5-(1-((6-изопропоксипиридин-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-286 3-(1-оксо-5-(1-((1-фенил-1H-пиразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-287 3-(5-(1-(4-этоксибензил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-288 3-(1-оксо-5-(1-((1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-289 3-(5-(1-((1-изопропил-1H-пиразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-290 3-(5-(1-(изотиазол-5-илметил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-291 3-(5-(1-((1-изопропил-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-292 3-(5-(1-((1H-пиразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-293 3-(5-(1-((5-изопропоксипиридин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-294 3-(1-оксо-5-(1-((1-(пиридин-3-ил)-1H-пиразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-295 3-(1-оксо-5-(1-((1-(пиридин-3-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-296 5-((4-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)пиперидин-1-ил)метил)-2-фторбензoнитрил I-297 3-(5-(1-((5-фторпиридин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-298 3-(5-(1-((1-этил-3-(пиридин-3-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-299 3-(5-(1-((6-метоксипиридин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-300 3-(5-(1-((3-((3S,5S)-адамантан-1-ил)-1H-пиразол-5-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-301 3-(5-(1-((6-изопропоксипиридин-2-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-302 3-(5-(1-((1-бензил-5-(пиридин-2-ил)-1H-пиразол-3-ил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион I-303 транс-3-(5-(1-((4-метоксициклогексил)метил)пиперидин-4-ил)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион

В другом аспекте, соединение деградации представляет собой соединение формулы (II):

или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, гидрат, таутомер или пролекарство, где:

X представляет собой O или S;

R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или R^2a и R^2b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу или тиокарбонильную группу;

каждый из R¹⁰ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), или -N (R^C)S(O)_xR^E, или L-метку; где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R¹¹;

каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, C(O)R^A, -C(O)OR^B, OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый из R^A, R^B, R^C, R^D и R^E независимо представляет собой водород или C₁-C₆алкил;

каждый R¹¹ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R⁸;

каждый R⁷ независимо представляет собой галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый R⁸ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, галоген, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A;

каждый L независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, -C(O)R^A1, -C(O)OR^B1, -OR^B1, -N(R^C1)(R^D1), -C(O)N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^A1, -S(O)_xR^E1, -S(O)_xN(R^C1)(R^D1) или -N (R^C1)S(O)_xR^E1, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R¹²;

каждая метка представляет собой нацеливающий фрагмент, способный к связыванию с белком-мишенью;

каждый из R^A1, R^B1, R^C1, R^D1, и R^E1 независимо представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещен одним или несколькими R¹²;

каждый R¹² независимо представляет собой C₁-C₆алкил, галоген, циано, карбоциклил или гетероциклил;

n составляет 0, 1, 2, 3 или 4; и

x составляет 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления X представляет собой O.

В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых независимо и необязательно замещен 1-12 R⁴ (например, 1 R⁴, 2 R⁴, 3 R⁴, 4 R⁴, 5 R⁴, 6 R⁴, 7 R⁴, 8 R⁴, 9 R⁴, 10 R⁴, 11 R⁴ или 12 R⁴). В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C₁-C₆алкил или гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C₁-C₆алкил (например, метил или этил), замещенный R⁴. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C₁-C₆алкил (например, метил или этил), замещенный 1-6 R⁴. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой 6-членный гетероциклил или 5-членный гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой 6-членный гетероциклил или 5-членный гетероциклил, необязательно замещенный 1-6 R⁴ (например, 1 R⁴, 2 R⁴, 3 R⁴, 4 R⁴, 5 R⁴ или 6 R⁴). В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой азот-содержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой пиперидинил (например, пиперидин-2,6-дионил).

В некоторых вариантах осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления R^2a и R^2b вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу.

В некоторых вариантах осуществления каждый R¹⁰ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, -C(O)R^A, -C(O)OR^B, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, -S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), или -N (R^C)S(O)_xR^E, или L-метку; где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещены 1-12 R¹¹ (например, 1 R¹¹, 2 R¹¹, 3 R¹¹, 4 R¹¹, 5 R¹¹, 6 R¹¹, 7 R¹¹, 8 R¹¹, 9 R¹¹, 10 R¹¹, 11 R¹¹ или 12 R¹¹). В некоторых вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой C₁-C₆гетероалкил, -N(R^C)(R^D) или -N(R^C)C(O)R^A. В некоторых вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой C₁-C₆гетероалкил (например, CH₂NHC(O)CH₂), -N(R^C)(R^D) (например, NH₂) или -N(R^C)C(O)R^A (например, NHC(O)CH₃).

В некоторых вариантах осуществления каждый R⁴ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, галоген, циано, оксо, C(O)R^A, -C(O)OR^B, OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, S(O)_xR^E, -S(O)_xN(R^C)(R^D), -N (R^C)S(O)_xR^E, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещены 1-12 R⁷ (например, 1 R⁷, 2 R⁷, 3 R⁷, 4 R⁷, 5 R⁷, 6 R⁷, 7 R⁷, 8 R⁷, 9 R⁷, 10 R⁷, 11 R⁷ или 12 R⁷).

В некоторых вариантах осуществления каждый R¹¹ независимо представляет собой C₁-C₆алкил, галоген, оксо, циано, -OR^B, -N(R^C)(R^D), -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, арил или гетероарил, где каждый арил и гетероарил независимо и необязательно замещен 1-6 R⁸ (например, 1 R⁸, 2 R⁸, 3 R⁸, 4 R⁸, 5 R⁸ или 6 R⁸).

В некоторых вариантах осуществления каждый L независимо представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, -C(O)R^A1, -C(O)OR^B1, -OR^B1, -N(R^C1)(R^D1), -C(O)N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^A1, -S(O)_xR^E1, -S(O)_xN(R^C1)(R^D1) или -N (R^C1)S(O)_xR^E1, где каждый алкил, алкенил, алкинил и гетероалкил независимо и необязательно замещен 1-12 R¹² (например, 1 R¹², 2 R¹², 3 R¹², 4 R¹², 5 R¹², 6 R¹², 7 R¹², 8 R¹², 9 R¹², 10 R¹², 11 R¹² или 12 R¹²).

В некоторых вариантах осуществления каждый из R^A1, R^B1, R^C1, R^D1 и R^E1 независимо представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо и необязательно замещенный 1-12 R¹² (например, 1 R¹², 2 R¹², 3 R¹², 4 R¹², 5 R¹², 6 R¹², 7 R¹², 8 R¹², 9 R¹², 10 R¹², 11 R¹² или 12 R¹²).

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидин-2,6-дионил). В одном варианте осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород. В одном варианте осуществления n составляет 1. В одном варианте осуществления R¹⁰ представляет собой -N(R^C)(R^D) (например, -NH₂). В одном варианте осуществления соединение деградации содержит леналидомид, например, 3-(4-амино-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой леналидомид, например, соответствующий следующей формулой:

.

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидинил-2,6-дионил). В некоторых вариантах осуществления R^2a и R^2b вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу. В одном варианте осуществления n составляет 1. В одном варианте осуществления R¹⁰ представляет собой -N(R^C)(R^D) (например, -NH₂). В одном варианте осуществления соединение деградации содержит помалидомид, например, 4-амино-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолин-1,3-дион или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации представляет собой помалидомид, например, соответствующий следующей формуле:

.

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидинил-2,6-дионил). В одном варианте осуществления R^2a и R^2b вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонильную группу. В одном варианте осуществления n составляет 0. В одном варианте осуществления соединение деградации содержит талидомид, например, 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолин-1,3-дион или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления продукт деградации представляет собой талидомид, например, соответствующий следующей формуле:

.

В одном варианте осуществления X представляет собой O. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гетероциклил (например, пиперидин-2,6-дионил). В одном варианте осуществления каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород. В одном варианте осуществления n составляет 1. В одном варианте осуществления R¹⁰ представляет собой C₁-C₆гетероалкил (например, CH₂NHC(O)CH₂-фенил-трет-бутил). В одном варианте осуществления соединение деградации содержит 2-(4-(трет-бутил)фенил)-N-((2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)метил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение деградации характеризуется структурой, представленной следующей формулой:

.

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации (например, соединение формулы (II)) не присоединено к линкеру или группе присоединения. В некоторых вариантах осуществления соединение деградации (например, соединение формулы (II)) не содержит другой фрагмент, например, лиганд, нацеливающее средство или фрагмент, способный к димеризации. В некоторых вариантах осуществления R¹⁰ не представляет собой L-метку.

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации (например, соединение формулы (II)) присоединено к линкеру или группе присоединения (например, по меньшей мере один R¹⁰ представляет собой L-метку). В некоторых вариантах осуществления соединение деградации (например, соединение формулы (II)) содержит другой фрагмент, например, лиганд, нацеливающее средство или фрагмент, способный к димеризации. В некоторых вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой L-метку, и L представляет собой алкил или гетероалкил (например, PEG-цепь). В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер, выбранный из линкера, раскрытого в публикации международной патентной заявки № WO2017/024318 (например, фигуры 28-31).

В некоторых вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой L-метку, а метка представляет собой нацеливающий фрагмент, который способен к связыванию или связан с белком-мишенью. Метка может содержать низкомолекулярное соединение или аминокислотную последовательность (например, пептид или полипептид). В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой ингибитор киназы, ингибитор бромодомен-содержащего белка, семейства BET, лиганд цитозольного сигнального белка FKBP12, ингибитор HDAC, ингибитор лизинметилтрансферазы, ингибитор ангиогенеза, иммуносупрессорное соединение или ингибитор арилуглеводородного рецептора (AHR).

В определенных вариантах осуществления метка представляет собой SERM (селективный модулятор эстрогенового рецептора) или SERD (селективный деструктор эстрогенового рецептора). Неограничивающие примеры SERM и SERD представлены в публикациях международных патентных заявок №№ WO2014/191726, WO2013/090921, WO2014/203129, WO2014/205136, WO2014/205138 и WO 2014/203132; публикациях заявок на патент США №№ US2013/0178445 и US 2015/0005286; и патентах США №№ 9078871, 8853423 и 8703810.

Дополнительные метки включают, например, любой фрагмент, который связывается с эндогенным белком (связывается с белком-мишенью). Иллюстративные метки включают, среди всего прочего, ингибиторы Hsp90, ингибиторы киназ, ингибиторы HDM2 и MDM2, соединения, нацеливающиеся на бромодомен-содержащие белки человека семейства BET, ингибиторы HDAC, ингибиторы лизинметилтрансферазы человека, ингибиторы ангиогенеза, соединения, представляющие собой ядерные рецепторы гормонов, иммуносупрессорные соединения и соединения, нацеливающиеся на арилуглеводородный рецептор (AHR). Такие низкомолекулярные метки также включают фармацевтически приемлемые соли, энантиомеры, сольваты и полиморфы таких композиций, а также другие малые молекулы, которые могут связываться с представляющим интерес белком-мишенью.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд 5F6D, нацеливающийся на Ubc9 SUMO-лигазу E2, например, описанный в Hewitt, W.M., et. al. (2016) Angew.Chem.Int.Ed.Engl.55: 5703-5707.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на Tank1, например, описанный в Kirby, C.A. et al, (2012) Acta Crystallogr. Sect.F 68: 115-118; и Shultz, M.D., et al. (2013) J.Med.Chem.56: 7049-7059.

В одном варианте осуществления метка представляет собой SH2-домен лиганда, нацеливающегося на pp60 Src, например, описанный в Gudrun Lange, et al., (2003) J. Med. Chem. 46, 5184-5195.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на Sec7-домен, например, описанный в Huta, B.P., et al., (2016) Chemmedchem 11: 277.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на сапозин-B, например, описанный в I. Nemcovicova and D. M. Zajonc Acta Cryst. (2014). D70, 851-862.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на белок S100-A7 2OWS, например, описанный в Leon, R., Murray, et al., (2009) Biochemistry 48: 10591-10600.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на фосфолипазу A2, например, описанный в Schevitz, R.W., et al., (1995) Nat. Struct. Biol. 2, 458-465.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на PHIP, например, описанный в Krojer, T.; et al. Chem. Sci.2016, 7, 2322-2330.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на PDZ, например, описанный в Mangesh Joshi, et al. Angew. Chem. Int. Ed. (2006) 45, 3790-3795.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на PARP15, например, описанный в Karlberg, T., et al., (2015) J.Biol.Chem.290: 7336-7344.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на PARP14, например, описанный в Andersson, C.D., et al.,(2012) J.Med.Chem. 55: 7706-7718.; Wahlberg, E., et al. (2012) Nat.Biotechnol. 30: 283-288.; Andersson, C.D., et al. (2012) J.Med.Chem.55: 7706-7718.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на MTH1, например, описанный в Helge Gad, et. al. Nature, (2014) 508, 215-221.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на mPGES-1, например, описанный в Luz, J.G., et al., (2015) J.Med.Chem.58: 4727-4737.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на FLAP-5-липоксигеназа-активирующий белок, например, описанный в Ferguson, A.D., et al (2007) Science 317: 510-512.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на FA-связывающий белок, например, описанный в Kuhn, B.; et al. J. Med. Chem. (2016) 59, 4087-4102.

В одном варианте осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на BCL2, например, описанный в Souers, A.J., et al. (2013) Nat Med 19: 202-208.

В одном варианте осуществления метка представляет собой какие-либо малую молекулу или белок, которые могут связываться с белком-мишенью, и при этом на белок-мишень воздействует убиквитинлигаза и приводит к его деградации. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой лиганд, нацеливающийся на dTAG, раскрытый в публикации международной патентной заявки № WO2017/024318 (например, таблица T, страницы 119-129).

Когда R¹⁰ представляет собой L-метку, метка способна к связыванию или соединению с белком-мишенью. Иллюстративные белки-мишени включают FK506-связывающий белок-12 (FKBP12), бромодомен-содержащий белок 4 (BRD4), CREB-связывающий белок (CREBBP) или транскрипционный активатор BRG1 (SMARCA4). В некоторых вариантах осуществления белок-мишень содержит рецептор гормона, например, белок эстрогенового рецептора, белок андрогенового рецептора, белок ретиноидного X рецептора (RXR) или дигидрофолатредуктазу (DHFR), в том числе бактериальную DHFR. В некоторых вариантах осуществления белок-мишень содержит аминокислотную последовательность, полученную из бактериальной дегалогеназы. В других вариантах осуществления белок-мишень содержит аминокислотные последовательности, полученные из 7,8-дигидро-8-оксогуанинтрифосфатазы, AFAD, белка, активирующего арахидонат-5-липоксигеназу, аполипобелка, ASH1L, ATAD2, белка-2, содержащего бакуловирусный IAP-повтор, BAZ1A, BAZ1B, BAZ2A, BAZ2B, Bcl-2, Bcl-xL, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRD5, BRD6, BRD7, BRD8, BRD9, BRD10, BRDT, BRPF1, BRPF3, BRWD3, CD209, CECR2, CREBBP, E3-лигаза XIAP, EP300, FALZ, белка-4, связывающего жирные кислоты, из адипоцитов (FABP4), GCN5L2, GTPазы k-RAS, HDAC6, гемопоэтической простагландин-D-синтазы, KIAA1240, лактоилглутатионлиазы, LOC93349, Mcl-1, MLL, PA2GA, PB1, PCAF, белка-1 пептидил-пролил-цис-транс изомеразы, взаимодействующего с NIMA, PHIP, поли-АДФ-рибозаполимеразы-14, поли-АДФ-рибозаполимеразы-15, PRKCBP1, просапозина, простагландин-E-синтазы, дельта-субъединицы cGMP 3','5-циклической фосфодиэстеразы, чувствительной к родопсину палочек сетчатки, S100-A7, SMARCA2, SMARCA4, SP100, SP110, SP140, Src, Sumo-конъюгирующего фермента UBC9, супероксиддисмутазы, TAF1, TAF1L, танкиразы-1, танкиразы-2, TIF1a, TRIM28, TRIM33, TRIM66, WDR9, ZMYND11 или MLL4. В других вариантах осуществления белок-мишень содержит аминокислотную последовательность, полученную из MDM2. В некоторых вариантах осуществления белок-мишень представляет собой dTAG, раскрытый в публикации международной патентной заявки № WO2017/024318 (например, страницы 112-114).

В одном варианте осуществления белок-мишень получен из BRD2, BRD3, BRD4 или BRDT. В одном варианте осуществления белок-мишень представляет собой модифицированный или мутантный белок BRD2, BRD3, BRD4 или BRDT. В определенных вариантах осуществления одна или несколько мутаций BRD2 включают мутацию триптофана (W) в аминокислотном положении 97, мутацию валина (V) в аминокислотном положении 103, мутацию лейцина (L) в аминокислотном положении 110, мутацию W в аминокислотном положении 370, мутацию V в аминокислотном положении 376 или мутацию L в аминокислотном положении 381.

В одном варианте осуществления белок-мишень получен из цитозольного сигнального белка FKBP12. В определенных вариантах осуществления белок-мишень представляет собой модифицированный или мутантный цитозольный сигнальный белок FKBP12. В определенных вариантах осуществления модифицированный или мутантный цитозольный сигнальный белок FKBP12 содержит одну или несколько мутаций, которые создают увеличенный карман связывания для лигандов FKBP12. В определенных вариантах осуществления одна или несколько мутаций включают мутацию фенилаланина (F) в аминокислотном положении 36 на валин (V) (F36V) (обозначаемую взаимозаменяемо в данном документе как FKBP12* или FKBP*).

В некоторых вариантах осуществления соединение деградации представляет собой соединение, раскрытое в патенте США № 7973057; патенте США № 8546430; патенте США № 8716315; публикации международной патентной заявки № WO2017/059062 или публикации международной патентной заявки № WO2017/024318; каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Гетерологичные полипептиды

В данном документе представлены слитые полипептиды, включающие COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид и представляющий интерес гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид отделены линкером (например, глицин-сериновым линкером). В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид, описанный в данном документе, содержит три элемента: COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид (например, часть аминокислотной последовательности дегрона, описанного в данном документе), гетерологичный полипептид и линкер, разделяющий COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид и гетерологичный полипептид. В других вариантах осуществления слитый полипептид, описанный в данном документе, содержит два элемента: COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид (например, часть аминокислотной последовательности дегрона, например, описанного в данном документе), связанный непосредственно с гетерологичным полипептидом. Такие элементы могут быть организованы таким образом, что COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид (например, часть аминокислотной последовательности дегрона, например, описанного в данном документе) расположен на N-конце представляющего интерес гетерологичного полипептида, на C-конце представляющего интерес гетерологичного полипептида или по центру представляющего интерес гетерологичного полипептида. В одном варианте осуществления гетерологичный полипептид представляет собой цитозольный и/или ядерный белок, и COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид расположен на N-конце гетерологичного полипептида. В одном варианте осуществления гетерологичный полипептид представляет собой трансмембранный белок, и COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающий полипептид расположен на C-конце гетерологичного полипептида.

В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид дополнительно содержит домен деградации. В некоторых вариантах осуществления домен деградации отделен от COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающего полипептида и гетерологичного полипептида гетерологичным сайтом расщепления протеазами.

Слитые полипептиды, раскрытые в данном документе, могут содержать любой представляющий интерес гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид может представлять собой трансмембранный белок (например, трансмембранный рецептор). В определенных вариантах осуществления представляющий интерес гетерологичный полипептид может представлять собой, например, рецептор, связанный с ионными каналами, рецептор, связанный с ферментом (например, рецепторную тирозинкиназу, рецептор, ассоциированный с тирозинкиназой, рецептороподобную тирозинфосфатазу, рецепторную серин/треонинкиназу; рецепторную гуанилилциклазу и рецептор, ассоциированный с гистидинкиназой), или рецептор, сопряженный с G-белком. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный белок представляет собой химерный антигенный рецептор, например, описанный в данном документе.

В другом варианте осуществления гетерологичный полипептид представляет собой секретируемый белок (например, малый секретируемый белок). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид может представлять собой, например, антитело, нанотело или белок-связывающую молекулу при производстве в клетке. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид может представлять собой терапевтический или клинический белок (например, инсулин, гормон роста, эритропоэтин или терапевтическое антитело). В определенных вариантах осуществления белок может быть токсичным для клетки при производстве (например, бактериальные токсины и протеазы).

В таблицу 2 включен перечень иллюстративных гетерологичных полипептидов для применения в слитых полипептидах, раскрытых в данном документе. Дополнительный представляющий интерес гетерологичный полипептид включает химерные антигенные T-клеточные рецепторы, описанные в разделе ниже.

Таблица 2. Представляющие интерес гетерологичные полипептиды Цитоплазматические или ядерные Трансмембранные Секретируемые Путь апоптоза
(например, каспаза-9) CD62L IL-12 p35 TALEN CCR1 IL-12 p40 ZFN CCR2 IL-12 p70 Мегануклеаза CCR5 IL-15 или комплекс IL-15 Cas9 CCR7 IL-2 MITF CCR10 IL-7 MYC CXCR2 IL-18 STAT3 CXCR3 IL-9 STAT5 CXCR4 IL-21 NF-каппа-B CXCR6 RANTES/CCL5 Бета-катенин CTLA4 CCL2 Notch PD1 CCL1 GLI BTLA CCL22 c-JUN VISTA Гепараназа Tet-метилцитозиндиоксигеназа-2 (TET2) CD137L Матриксная металлопротеиназа (MMP) FKBP CD80 Катепсин Тау-белок CD86 Антитело (например, противоопухолевое антитело, например, герцептин, или антитело-ингибитор контрольных точек иммунного ответа, например, антитело к PD1) Фермент TIGIT Пептид
(например, противоопухолевый пептид или белковый гормон) Каркасный белок Химерный антигенный рецептор (например, CAR, который связывается с CD19, CD22, CD20, BCMA, CD123, CD33, EGFRvIII или мезотелином) IL-6-ингибирующий пептид CD3 TGF-бета-ингибирующий пептид CD8 CD19 CD22 CD20 BCMA

Антигенсвязывающий домен CAR

В одном аспекте CAR по настоящему изобретению, связанный с COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающим полипептидом и/или доменом деградации, содержит мишень-специфический связывающий элемент, иначе обозначаемый как антигенсвязывающий домен. В одном варианте осуществления часть CAR, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацеливается, например, специфически связывается, на антиген, например, антиген, описанный в данном документе, например, CD19. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD19 человека, например, специфически связывается с ним.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид, связанный с COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающим полипептидом и/или доменом деградации, содержит химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, TCR или фрагмент TCR), который связывается с опухолевым антигеном, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен) и/или первичный сигнальный домен. Конструкции нуклеиновой кислоты для CAR, кодируемые ими белки, содержащие их векторы, клетки-хозяева, фармацевтические композиции и способы введения и лечения, связанные с настоящим изобретением раскрыты подробно в публикации международной патентной заявки № WO2015142675, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, TCR или фрагмент TCR), который связывается с опухолеподдерживающим антигеном (например, опухолеподдерживающим антигеном, описанным в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе) и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе) (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен (например, костимулирующий домен, описанный в данном документе) и/или первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен, описанный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления опухолеподдерживающий антиген представляет собой антиген, присутствующий на стромальной клетке или супрессорной клетке миелоидного происхождения (MDSC). В других аспектах настоящего изобретения описаны полипептиды, кодируемые такими нуклеиновыми кислотами, и клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или полипептиды.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен, выбранный из сигнального домена CD137 (4-1BB), сигнального домена CD28, сигнального домена CD27, сигнального домена ICOS, сигнального домена CD3-дзета или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления молекула CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен, выбранный из одной или нескольких костимулирующих молекул, выбранных из CD137 (4-1BB), CD28, CD27 или ICOS.

В некоторых вариантах осуществления совокупность иммунных эффекторных клеток, например, популяция, истощенная по T-регуляторным клеткам, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, который содержит мишень-специфический связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающим доменом. Выбор связывающего элемента зависит от типа и количества лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен может быть выбран таким образом, чтобы он распознавал лиганд, который выступает в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Таким образом, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут выступать в качестве лигандов для антигенсвязывающего домена в CAR, описанного в данном документе, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.

Последовательности для неограничивающих примеров различных компонентов, которые могут быть частью молекулы CAR, например, CAR для TA или CAR для BCA, описанной в данном документе, перечислены в таблице 3, где "а. к." обозначает аминокислотные последовательности, а "н. к." обозначает последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют соответствующий пептид.

Таблица 3. Последовательности различных компонентов CAR (а. к. - аминокислотная последовательность, н. к. - последовательность нуклеиновой кислоты). SEQ ID NO: Описание Последовательность SEQ ID NO: 144 Промотор EF-1 (н к.) CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA SEQ ID NO: 64 Лидерная последовательность (а.к.) MALPVTALLLPLALLLHAARP SEQ ID NO: 145 Лидерная последовательность (н. к.) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC SEQ ID NO: 146 Лидерная последовательность (н.к.) atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggccc SEQ ID NO: 147 Шарнирная область CD8 (а. к.) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD SEQ ID NO: 148 Шарнирная область CD8 (н. к.) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT SEQ ID NO: 149 Шарнирная область Ig4 (а. к.) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM SEQ ID NO: 150 Шарнирная область Ig4 (н. к.) GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG SEQ ID NO: 151 Шарнирная область IgD (а. к.) RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH SEQ ID NO: 152 Шарнирная область IgD (н. к.) AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT SEQ ID NO: 153 Шарнирная область/линкер GS (а. к.) GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 154 Шарнирная область/линкер GS (н. к.) GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC SEQ ID NO: 155 CD8TM (а. к.) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC SEQ ID NO: 156 CD8 TM (н. к.) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC SEQ ID NO: 157 CD8 TM (н. к.) ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT SEQ ID NO: 158 Внутриклеточный домен 4-1BB (а. к) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID NO: 159 Внутриклеточный домен 4-1BB (н. к.) AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG SEQ ID NO: 160 Внутриклеточный домен 4-1BB (н. к.) aagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactg SEQ ID NO: 161 CD27 (а. к.) QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP SEQ ID NO: 162 CD27 (н. к.) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC SEQ ID NO: 163 CD3-дзета (а. к.) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 164 CD3-дзета (н. к.) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 165 CD3-дзета (н. к.) CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG SEQ ID NO: 166 CD3-дзета (а. к.) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 167 CD3-дзета (н. к.) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 168 Линкер (а. к.) GGGGS SEQ ID NO: 154 Линкер (а. к.) GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC SEQ ID NO: 169 Внеклеточный домен PD-1 (а. к.) Pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlv SEQ ID NO: 170 Внеклеточный домен PD-1 (н. к.) Cccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtc SEQ ID NO: 171 PD-1-CAR с сигнальной последовательностью (а. к.) Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr SEQ ID NO: 172 PD-1 CAR (н. к.) Atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc SEQ ID NO: 173 Линкер (а. к.) (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n=1-10 SEQ ID NO: 141 Линкер (а. к.) (Gly4 Ser)4 SEQ ID NO: 142 Линкер (а. к.) (Gly4 Ser)3 SEQ ID NO: 143 Линкер (а. к.) (Gly3Ser) SEQ ID NO: 174 полиA (н. к.) [a]_50-5000 SEQ ID NO: 175 PD1-CAR (а. к.) Pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr SEQ ID NO: 176 Внутриклеточный домен ICOS (a. к.) TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL SEQ ID NO: 177 Внутриклеточный домен ICOS (н. к.) ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA SEQ ID NO: 178 TM-домен ICOS (а. к.) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWL SEQ ID NO: 179 TM-домен ICOS (н. к.) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTT SEQ ID NO: 180 Внутриклеточный домен CD28 (а. к) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS SEQ ID NO: 162 Внутриклеточный домен CD28 (н. к.) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

Таблица 4. CAR, модифицированный с помощью метки деградации и/или FurON SEQ ID NO Описание Аминокислотные последовательности (включая сигнальный пептид) SEQ ID NO: 64 Сигнальный пептид (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARP SEQ ID NO: 140 Модифицированный сигнальный пептид (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPRSSLA SEQ ID NO: 28 Линкер 16GS (а. к.) GGGGSGGGGTGGGGSG SEQ ID NO: 99 Линкер 16KGS (а. к.) KGGGSKGGGTKGGGSK SEQ ID NO: 29 CAR19 (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 92 FurON_CAR19 (конструкция 765) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPRSSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLALHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSSKRMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 93 FurON_CAR19_16GS_HilD-метка_V5 (конструкция 766) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPRSSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLALHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSSKRMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGMHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMGGKPIPNPLLGLDST SEQ ID NO: 32 FurON_CAR19_16GS_HilD-метка (конструкция 767) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPRSSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLALHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSSKRMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGMHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMG SEQ ID NO: 33 FurON_CAR19_16GS_HilD-метка_без K (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPRSSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLALHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSSKRMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGMHRRSHTGERPFQCNQCGASFTQRGNLLRHIRLHTGERPFRCHLCNTASAEARHIRAEMG SEQ ID NO: 94 CAR19_16GS_HilD-метка_V5 (конструкция 768) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGMHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMGGKPIPNPLLGLDST SEQ ID NO: 30 CAR19_16GS_HilD-метка (конструкция 769) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGMHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMG SEQ ID NO: 31 CAR19_16GS_HilD-метка_без K (конструкция 770) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGMHRRSHTGERPFQCNQCGASFTQRGNLLRHIRLHTGERPFRCHLCNTASAEARHIRAEMG SEQ ID NO: 95 CAR19_HilD-метка_V5 (конструкция 771) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMGGKPIPNPLLGLDST SEQ ID NO: 96 CAR19_16KGS_HilD-метка_V5 (конструкция 6761) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRKGGGSKGGGTKGGGSKMHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMGGKPIPNPLLGLDST SEQ ID NO: 97 HilD-метка_CAR19_modSigPep (конструкция 773) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPRSSLAHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMGGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 98 HilD-метка_CAR19 (конструкция 774) (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMGGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 112 CAR19-16GS-CARB-метка (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGHKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCPFCSAGQVMSHHVPPMED SEQ ID NO: 1450 CAR для BCMA-линкер 16GS-HilD (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSGGGGTGGGGSGMHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNTASAEARHIKAEMG SEQ ID NO: 837 MALEK

В одном аспекте иллюстративные конструкции CAR содержат необязательную лидерную последовательность (например, лидерную последовательность, описанную в данном документе), внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе), шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе) и внутриклеточный стимулирующий домен (например, внутриклеточный стимулирующий домен, описанный в данном документе). В одном аспекте иллюстративная конструкция CAR содержит необязательную лидерную последовательность (например, лидерную последовательность, описанную в данном документе), внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе), шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе), внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен (например, костимулирующий сигнальный домен, описанный в данном документе) и/или внутриклеточный первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен, описанный в данном документе).

В одном аспекте CAR (например, CAR для CD19) по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен, выбранный из группы сигнального домена CD137 (4-1BB), сигнального домена CD28, сигнального домена CD27, сигнального домена ICOS, сигнального домена CD3-дзета и любой их комбинации. В одном аспекте CAR содержат по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен из одной или нескольких костимулирующих молекул, выбранных из CD137 (4-1BB), CD28, CD27 или ICOS.

Антигенсвязывающий домен CAR

В одном аспекте CAR по настоящему изобретению, связанный с COF1/CRBN-, COF2/CRBN- или COF3/CRBN-связывающим полипептидом и/или доменом деградации, содержит мишень-специфический связывающий элемент, иначе обозначаемый как антигенсвязывающий домен. В одном варианте осуществления часть CAR, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацеливается, например, специфически связывается, на антиген, например, антиген, описанный в данном документе, например, CD19. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD19 человека, например, специфически связывается с ним.

В некоторых вариантах осуществления совокупность иммунных эффекторных клеток, например, популяция, истощенная по T-регуляторным клеткам, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, который содержит мишень-специфический связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающим доменом. Выбор связывающего элемента зависит от типа и количества лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен может быть выбран таким образом, чтобы он распознавал лиганд, который выступает в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Таким образом, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут выступать в качестве лигандов для антигенсвязывающего домена в CAR, описанного в данном документе, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.

В одном аспекте часть CAR, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацеливается на опухолевый антиген, например, на опухолевый антиген, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен выбран из: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1; лектиноподобной молекулы-1 C-типа, CD33; варианта III рецептора эпидермального фактора роста (EGFRvIII); ганглиозида G2 (GD2); ганглиозида GD3; представителя семейства рецепторов TNF; антигена созревания B-клеток (BCMA); Tn-антигена ((Tn Ag) или (GalNAcα-Ser/Thr)); простатического специфического мембранного антигена (PSMA); орфанного рецептора-1, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR1); Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3); опухолеассоциированного гликопротеина-72 (TAG72); CD38; CD44v6; раково-эмбрионального антигена (CEA); молекулы адгезии эпителиальных клеток (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); субъединицы альфа-2 рецептора интерлейкина-13; мезотелина; альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-11 (IL-11Ra); антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA); сериновой протеазы-21; рецептора-2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2); антигена системы Льюис (Y); CD24; рецептора фактора роста тромбоцитов бета-типа (PDGFR-бета); стадиеспецифического эмбрионального антигена-4 (SSEA-4); CD20; рецептора фолиевой кислоты альфа-типа; рецепторной тирозинпротеинкиназы ERBB2 (Her2/neu); муцина-1, ассоциированного с клеточной поверхностью (MUC1); рецептора эпидермального фактора роста (EGFR); молекулы адгезии нейронов (NCAM); простазы; простатической кислой фосфатазы (PAP); мутантного фактора элонгации 2 (ELF2M); эфрина B2; белка активации фибробластов альфа (FAP); рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 (рецептора IGF-I), карбоангидразы IX (CAIX); субъединицы-9 протеасомы (просомы, мультикаталитической протеазы) бета-типа (LMP2); гликопротеина 100 (gp100); онкогенного слитого белка, состоящего из кластерного региона точечных разрывов (BCR) и гомолога-1 вирусного онкогена лейкоза мышей Абельсона (Abl) (bcr-abl); тирозиназы; эфринового рецептора-2 A-типа (EphA2); фукозил-GM1; молекулы адгезии, представляющей собой сиалилированный антиген системы Льюис (sLe; ганглиозида GM3; трансглютаминазы-5 (TGS5); высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена (HMWMAA); ганглиозида o-ацетил-GD2 (OAcGD2); рецептора фолиевой кислоты бета-типа; маркера-1 эндотелия опухоли (TEM1/CD248); белка, родственного маркеру-7 эндотелия опухоли (TEM7R); клаудина-6 (CLDN6); рецептора тиреотропного гормона (TSHR); представителя D группы 5 класса С рецепторов, сопряженных с G-белком (GPRC5D); белка, кодируемого открытой рамкой считывания 61 X-хромосомы (CXORF61); CD97; CD179a; киназы анапластической лимфомы (ALK); полисиаловой кислоты; плацентоспецифического белка-1 (PLAC1); гексасахаридной части гликоцерамида globoH (GloboH); дифференцировочного антигена молочной железы (NY-BR-1); уроплакина-2 (UPK2); клеточного рецептора-1 вируса гепатита A (HAVCR1); бета-3 адренорецептора (ADRB3); паннексина-3 (PANX3); рецептора-20, сопряженного с G-белком (GPR20); антигена локуса K9 комплекса лимфоцитарных антигенов 6 (LY6K); обонятельного рецептора 51E2 (OR51E2); белка, кодируемого альтернативной рамкой считывания гена TCR-гамма (TARP); белка опухоли Вильмса (WT1); раково-тестикулярного антигена-1 (NY-ESO-1); раково-тестикулярного антигена-2 (LAGE-1a); меланома-ассоциированного антигена-1 (MAGE-A1); белка, кодируемого транслокационным вариантом-6 гена ETS, локализованным в р-плече 12 хромосомы (ETV6-AML); белка-17 сперматозоидов (SPA17); представителя 1А семейства X-антигенов (XAGE1); ангиопоэтин-связывающего рецептора-2 клеточной поверхности 2 (Tie 2); раково-тестикулярного антигена-1 из клеток меланомы (MAD-CT-1); раково-тестикулярного антигена-2 из клеток меланомы (MAD-CT-2); Fos-родственного антигена-1; опухолевого белка p53 (p53); мутанта p53; простеина; сурвивина; теломеразы; опухолевого антигена-1 карциномы предстательной железы, антигена-1 меланомы, распознаваемого T-клетками; мутантного белка саркомы крыс (Ras); обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT); антигенов саркомы с точечными разрывами при транслокации; меланомного ингибитора апоптоза (ML-IAP); ERG (продукта слитого гена трансмембранной сериновой протеазы-2 (TMPRSS2) и ETS); N-ацетилглюкозаминилтрансферазы V (NA17); белка с парным box-доменом Рах-3 (PAX3); андрогенового рецептора; циклина-B1; нейробластомного гомолога вирусного онкогена миелоцитоматоза птиц v-myc (MYCN); представителя С семейства гомологов Ras (RhoC); белка-2, родственного тирозиназе (TRP-2); цитохрома P450 1B1 (CYP1B1); белка, подобного CCCTC-связывающему фактору (белку с "цинковыми пальцами"), антигена плоскоклеточной карциномы 3, распознаваемого Т-клетками (SART3); белка с парным box-доменом Рах-5 (PAX5); проакрозин-связывающего белка sp32 (OY-TES1); лимфоцит-специфической протеинтирозинкиназы (LCK); якорного белка-4 киназы A (AKAP-4); антигена 2 синовиальной саркомы с точечным разрывом в X-хромосоме (SSX2); рецептора конечных продуктов неферментативного гликозилирования (RAGE-1); почечного убиквитарного белка-1 (RU1); почечного убиквитарного белка-2 (RU2); легумаина; Е6 вируса папилломы человека (HPV E6); Е7 вируса папилломы человека (HPV E7); кишечной карбоксилэстеразы; мутантного белка теплового шока 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; иммуноглобулиноподобного рецептора-1, ассоциированного с лейкоцитами (LAIR1); рецептора Fc-фрагмента IgA (FCAR или CD89); представителя 2 подсемейства А иммуноглобулиноподобных рецепторов лейкоцитов (LILRA2); представителя f семейства белков, подобных молекулам CD300 (CD300LF); представителя А семейства 12 лектиновых доменов С-типа (CLEC12A); антигена-2 клеток стромы костного мозга (BST2); белка-2, подобного муциноподобному рецептору гормонов, содержащему EGF-подобный модуль (EMR2); лимфоцитарного антигена-75 (LY75); глипикана-3 (GPC3); белка-5, подобного Fc-рецептору (FCRL5); и полипептида-1, подобного лямбда-цепи иммуноглобулина (IGLL1).

В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен связывается с CD19. В другом варианте осуществления антигенсвязывающий домен связывается с CD123. В другом варианте осуществления антигенсвязывающий домен связывается с BCMA. В другом варианте осуществления антигенсвязывающий домен связывается с CD20.

Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, в том числе без ограничения моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, в том числе без ограничения однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) нанотела верблюдовых, а также альтернативную каркасную структуру, которая, как известно из уровня техники, функционирует в качестве антигенсвязывающего домена, такую как рекомбинантный фибронектиновый домен, T-клеточный рецептор (TCR) или его фрагмент, например, одноцепочечный TCR и т. п. В некоторых случаях целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен был получен от того же биологического вида, в котором в конечном итоге будут применять CAR. Например, для применения у человека может быть целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал в антигенсвязывающем домене антитела или фрагмента антитела человеческие или гуманизированные остатки.

Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, в том числе без ограничения моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, в том числе без ограничения однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) нанотела верблюдовых, а также альтернативную каркасную структуру, которая, как известно из уровня техники, функционирует в качестве антигенсвязывающего домена, такую как рекомбинантный фибронектиновый домен, и т. п. В некоторых случаях целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен был получен от того же биологического вида, в котором в конечном итоге будут применять CAR. Например, для применения у человека может быть целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал в антигенсвязывающем домене антитела или фрагмента антитела человеческие или гуманизированные остатки. Таким образом, в одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит антитело человека или фрагмент антитела.

В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две или три (например, все три) CDR тяжелой цепи, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, из антитела, описанного в данном документе (например, антитела, описанного в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки), и/или одну, две или три (например, все три) CDR легкой цепи, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, из антитела, описанного в данном документе (например, антитела, описанного в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, перечисленного выше.

В вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, описанный в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки.

Иллюстративные антигены-мишени, на которые можно нацеливаться с помощью клеток, экспрессирующих CAR, включают без ограничения, среди прочих, CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, мезотелин, BCMA и GFR-альфа 4, описанные, например, в WO2014/153270, WO 2014/130635, WO2016/028896, WO 2014/130657, WO2016/014576, WO 2015/090230, WO2016/014565, WO2016/014535 и WO2016/025880, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Полиспецифический CAR

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR представляет собой молекулу полиспецифического, например биспецифического, CAR, характеризующуюся первой специфичностью связывания с первым антигеном, например, эпитопом B-клетки, и второй специфичностью связывания с тем же или другим антигеном, например, эпитопом B-клетки. В некоторых вариантах осуществления молекула биспецифического CAR характеризуется первой специфичностью связывания с CD19 (например, молекула биспецифического CAR содержит CAR для CD19, раскрытый в таблицах 5, 6, 7 и 30) и второй специфичностью связывания с CD22 (например, молекула биспецифического CAR содержит CAR для CD22, раскрытый в таблицах 19 и 20). В некоторых вариантах осуществления молекула биспецифического CAR характеризуется первой специфичностью связывания с CD19 (например, молекула биспецифического CAR содержит CAR для CD19, раскрытый в таблицах 5, 6, 7 и 30) и второй специфичностью связывания с CD20 (например, молекула биспецифического CAR содержит CAR для CD20, раскрытый в таблице 32).

В одном варианте осуществления первая и вторая специфичности связывания предусматривают молекулу антитела, например, связывающий домен антитела (например, scFv). В пределах каждой молекулы антитела (например, scFv) молекулы биспецифического CAR VH может быть вышерасположенной или нижерасположенной относительно VL.

В некоторых вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VH (VH₁) расположена выше их VL (VL₁), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VL (VL₂) расположена выше их VH (VH₂), вследствие чего вся молекула биспецифического CAR имеет такую организацию в ориентации от N- до C-конца: VH₁-VL₁-VL₂-VH₂.

В некоторых вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VL (VL₁) расположена выше их VH (VH₁), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VH (VH₂) расположена выше их VL (VL₂), вследствие чего вся молекула биспецифического CAR имеет такую организацию в ориентации от N- до C-конца: VL₁-VH₁-VH₂-VL₂.

В некоторых вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VL (VL₁) расположена выше их VH (VH₁), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VL (VL₂) расположена выше их VH (VH₂), вследствие чего вся молекула биспецифического CAR имеет такую организацию в ориентации от N- до C-конца: VL₁-VH₁-VL₂-VH₂.

В еще одних некоторых вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VH (VH₁) расположена выше их VL (VL₁), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) организованы так, что их VH (VH₂) расположена выше их VL (VL₂), вследствие чего вся молекула биспецифического CAR имеет такую организацию в ориентации от N- до C-конца: VH₁-VL₁-VH₂-VL₂.

В любой из вышеуказанных конфигураций между двумя антителами или фрагментами антител (например, scFv) необязательно расположен линкер, например, между VL₁ и VL₂, если конструкция организована в виде VH₁-VL₁-VL₂-VH₂; между VH₁ и VH₂, если конструкция организована в виде VL₁-VH₁-VH₂-VL₂; между VH₁ и VL₂,если конструкция организована в виде VL₁-VH₁-VL₂-VH₂; или между VL₁ и VH₂, если конструкция организована в виде VH₁-VL₁-VH₂-VL₂. Обычно линкер между двумя scFv должен иметь достаточную длину, чтобы предотвращать неправильное спаривание между доменами двух scFv. Линкер может представлять собой линкер, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой линкер (Gly₄-Ser)_n, где n составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой (Gly₄-Ser)_n, где n=1 (SEQ ID NO: 168), например, линкер имеет аминокислотную последовательность Gly₄-Ser (SEQ ID NO: 168). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой (Gly₄-Ser)_n, где n=3 (SEQ ID NO: 142). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой (Gly₄-Ser)_n, где n= 4 (SEQ ID NO: 141). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит, например, состоит из аминокислотной последовательности: LAEAAAK (SEQ ID NO: 822).

В любой из вышеуказанных конфигураций линкер необязательно располагается между VL и VH первого scFv. Линкер необязательно располагается между VL и VH второго scFv. В конструкциях, которые имеют несколько линкеров, любые два или более линкера могут быть одинаковыми или разными. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления биспецифический CAR содержит VL, VH и необязательно один или несколько линкеров в виде организации, описанной в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления каждая молекула антитела, например, каждый антигенсвязывающий домен (например, каждый scFv), содержит линкер между VH- и VL-областями. В некоторых вариантах осуществления линкер между VH- и VL-областями представляет собой линкер (Gly₄-Ser)_n, где n составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой (Gly₄-Ser)_n, где n=1 (SEQ ID NO: 168), например, линкер имеет аминокислотную последовательность Gly₄-Ser (SEQ ID NO: 168). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой (Gly₄-Ser)_n, где n= 3 (SEQ ID NO: 142). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой (Gly₄-Ser)_n, где n= 4 (SEQ ID NO: 141). В некоторых вариантах осуществления VH- и VL-области соединены без линкера.

Дополнительные иллюстративные молекулы полиспецифических CAR раскрыты на страницах 26-39 в WO2018/067992, включенной в данный документ посредством ссылки.

CAR для CD19

В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфически связываться с CD19, например, могут содержать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен (например, гуманизированный антигенсвязывающий домен) в соответствии с таблицей 3 из WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки.

В вариантах осуществления молекула CAR содержит антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с CD19 (CAR для CD19). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD19 человека. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен CAR характеризуется такой же или аналогичной специфичностью связывания, которой характеризуется scFv-фрагмент FMC63, описанный в Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен CAR содержит scFv-фрагмент, описанный в Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Молекула антитела к CD19 может представлять собой, например, молекулу антитела (например, молекулу гуманизированного антитела к CD19), описанную в WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В WO2014/153270 также описаны способы выполнения анализа связывания и эффективности различных конструкций CAR.

В одном аспекте исходная последовательность scFv мыши представляет собой конструкцию CAR19, представленную в публикации согласно PCT WO2012/079000 (включенной в данный документ посредством ссылки). В одном варианте осуществления CD19-связывающий домен представляет собой scFv, описанный в WO2012/079000.

В одном варианте осуществления молекула CAR содержит последовательность слитого полипептида, представленную под SEQ ID NO: 12 в публикации согласно PCT WO2012/079000, и представлена в данном документе в таблице 5, в которой представлен scF-фрагмент мышиного происхождения, который специфически связывается с CD19 человека. Гуманизация этого scFv мыши может быть необходима в клинической ситуации, когда специфические для мышей остатки могут индуцировать ответ с образованием антител человека к антигену мыши (HAMA) у пациентов, которые получают лечение CART19, например, лечение с помощью T-клеток, трансдуцированных конструкцией CAR19.

В одном варианте осуществления CAR для CD19 содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 12 в публикации согласно PCT WO2012/079000. В варианте осуществления аминокислотная последовательность представляет собой

или последовательность практически гомологичную ей. Необязательная последовательность сигнального пептида показана заглавными буквами и круглыми скобками.

В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность представляет собой:

или последовательность практически гомологичную ей.

В одном варианте осуществления CAR для CD19 имеет обозначение согласно USAN TISAGENLECLEUCEL-T. В вариантах осуществления CTL019 получают за счет генной модификации T-клеток, опосредованной стабильной вставкой путем трансдукции с помощью самоинактивирующегося лентивирусного (LV) вектора, дефектного по репликации, содержащего трансген CTL019 под контролем промотора EF-1 альфа. CTL019 может представлять собой смесь положительных и отрицательных по трансгену Т-клеток, которые доставляют субъекту из расчета процентного количества положительных по трансгену Т-клеток.

В других вариантах осуществления CAR для CD19 содержит антигенсвязывающий домен (например, гуманизированный антигенсвязывающий домен) в соответствии с таблицей 3 из WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки.

Гуманизация мышиного антитела к CD19 необходима в клинической ситуации, когда специфические для мышей остатки могут индуцировать ответ с образованием антител человека к антигену мыши (HAMA) у пациентов, которые получают лечение CART19, т. е. лечение с помощью T-клеток, трансдуцированных конструкцией CAR19. Получение, определение характеристик и эффективность гуманизированных последовательностей CAR для CD19 описаны в международной заявке WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, включая примеры 1-5 (стр. 115-159).

В некоторых вариантах осуществления конструкции CAR для CD19 описаны в публикации согласно PCT WO 2012/079000, включенной в данный документ посредством ссылки, и аминокислотная последовательность мышиного CAR для CD19 и конструкции scFv показаны в таблице 5 ниже, или предусматривают последовательность, практически идентичную любой из вышеуказанных последовательностей (например, на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или больше идентичную любой из последовательностей, описанных в данном документе).

Таблица 5 . Конструкции CAR для CD19 SEQ ID NO Область Последовательность CTL019 SEQ ID NO: 183 Полная аминокислотная последовательность CTL019 MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr SEQ ID NO: 184 Полная нуклеотидная последовательность CTL019 atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc SEQ ID NO: 185 scFv-домен CTL019 Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss Гуманизированный CAR2 SEQ ID NO: 197 scFv-домен CAR2 -a. к. (линкер подчеркнут) EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 198 scFv-домен CAR2 - н. к. atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagccaccaccatcatcaccatcaccat SEQ ID NO: 199 CAR2 - полная последовательность - а. к. MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 200 CAR 2 - полная последовательность - н. к. atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg SEQ ID NO: 201 CAR2 - растворимый scFv - а. к. MALPVTALLLPLALLLHAARPeivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvsshhhhhhhh Мышиный CART19 221 HCDR1 (Kabat) DYGVS 222 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYNSALKS 223 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 224 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 225 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 226 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT Гуманизированный CART19 a 221 HCDR1 (Kabat) DYGVS 227 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYSSSLKS 223 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 224 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 225 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 226 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT Гуманизированный CART19 b 221 HCDR1 (Kabat) DYGVS 228 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYQSSLKS 223 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 224 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 225 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 226 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT Гуманизированный CART19 c 221 HCDR1 (Kabat) DYGVS 229 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYNSSLKS 223 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 224 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 225 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 226 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT

Таблица 30. Дополнительные конструкции CAR для CD19 SEQ ID NO Описание mCAR1 SEQ ID NO: 186 scFv mCAR1 SEQ ID NO: 187 Полная аминокислотная последовательность mCAR1 mCAR2 SEQ ID NO: 188 scFv mCAR2 SEQ ID NO: 189 Аминокислотная последовательность mCAR2 SEQ ID NO: 190 Полная аминокислотная последовательность mCAR2 mCAR3 SEQ ID NO: 191 scFv mCAR3 SEQ ID NO: 192 Полная аминокислотная последовательность mCAR3 SSJ25-C1 SEQ ID NO: 193 Последовательность VH SSJ25-C1 SEQ ID NO: 194 VL SSJ25-C1 Гуманизированный CAR1 SEQ ID NO: 195 scFv-домен CAR1 SEQ ID NO: 196 CAR 1 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR3 SEQ ID NO: 202 scFv-домен CAR3 SEQ ID NO: 203 CAR 3 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR4 SEQ ID NO: 204 scFv-домен CAR4 SEQ ID NO: 205 CAR 4 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR5 SEQ ID NO: 206 scFv-домен CAR5 SEQ ID NO: 207 CAR 5 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR6 SEQ ID NO: 208 scFv-домен CAR6 SEQ ID NO: 209 CAR6 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR7 SEQ ID NO: 210 scFv-домен CAR7 SEQ ID NO: 211 CAR 7 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR8 SEQ ID NO: 212 scFv-домен CAR8 SEQ ID NO: 213 CAR 8 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR9 SEQ ID NO: 214 scFv-домен CAR9 SEQ ID NO: 215 CAR 9 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR10 SEQ ID NO: 216 scFv-домен CAR10 SEQ ID NO: 215 CAR 10 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR11 SEQ ID NO: 217 scFv-домен CAR11 SEQ ID NO: 218 CAR 11 - полная последовательность - а. к. Гуманизированный CAR12 SEQ ID NO: 219 scFv-домен CAR12 SEQ ID NO: 220 CAR 12 - полная последовательность - а. к.

Конструкции CAR для CD19, содержащие гуманизированные scFv-домены, связывающие CD19, описаны в публикации согласно PCT WO 2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки.

Последовательности мышиных и гуманизированных CDR в последовательностях scFv-доменов, связывающих CD19, показаны в таблице 6 в случае вариабельных доменов тяжелой цепи и в таблице 7 в случае вариабельных доменов легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления HCDR1 мышиного или гуманизированного CD19-связывающего домена представляет собой GVSLPDYGVS (SEQ ID NO: 230).

Таблица 6. SEQ ID NO CDR (Kabat) вариабельных доменов тяжелой цепи антител к CD19 Кандидат HCDR1 HCDR2 HCDR3 CART19 мыши SEQ ID NO: 221 SEQ ID NO: 222 SEQ ID NO: 223 Гуманизированный_CART19 a SEQ ID NO: 221 SEQ ID NO: 227 SEQ ID NO: 223 Гуманизированный CART19 b SEQ ID NO: 221 SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 223 Гуманизированный CART19 c SEQ ID NO: 221 SEQ ID NO: 229 SEQ ID NO: 223

Таблица 7. SEQ ID NO CDR (Kabat) вариабельных доменов легкой цепи антител к CD19 Кандидат LCDR1 LCDR2 LCDR3 CART19 мыши SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 SEQ ID NO: 226 Гуманизированный_CART19 a SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 SEQ ID NO: 226 Гуманизированный CART19 b SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 SEQ ID NO: 226 Гуманизированный CART19 c SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225 SEQ ID NO: 226

В соответствии с настоящим изобретением можно применять любой известный CAR для CD19, например, антигенсвязывающий домен для CD19 из любого известного из уровня техники CAR для CD19. Например, CAR для CD19, LG-740, описан в патенте США № 8399645; патенте США № 7446190; Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39 (2013); и 16^th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10.

Иллюстративные CAR для CD19 включают CAR для CD19, описанные в данном документе, например, в одной или нескольких таблицах, описанных в данном документе, CAR для CD19, описанный в Xu et al. Blood 123.24(2014):3750-9; Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39, Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73, NCT00586391, NCT01087294, NCT02456350, NCT00840853, NCT02659943, NCT02650999, NCT02640209, NCT01747486, NCT02546739, NCT02656147, NCT02772198, NCT00709033, NCT02081937, NCT00924326, NCT02735083, NCT02794246, NCT02746952, NCT01593696, NCT02134262, NCT01853631, NCT02443831, NCT02277522, NCT02348216, NCT02614066, NCT02030834, NCT02624258, NCT02625480, NCT02030847, NCT02644655, NCT02349698, NCT02813837, NCT02050347, NCT01683279, NCT02529813, NCT02537977, NCT02799550, NCT02672501, NCT02819583, NCT02028455, NCT01840566, NCT01318317, NCT01864889, NCT02706405, NCT01475058, NCT01430390, NCT02146924, NCT02051257, NCT02431988, NCT01815749, NCT02153580, NCT01865617, NCT02208362, NCT02685670, NCT02535364, NCT02631044, NCT02728882, NCT02735291, NCT01860937, NCT02822326, NCT02737085, NCT02465983, NCT02132624, NCT02782351, NCT01493453, NCT02652910, NCT02247609, NCT01029366, NCT01626495, NCT02721407, NCT01044069, NCT00422383, NCT01680991, NCT02794961 или NCT02456207, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

CAR для CD123

В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфически связываться с CD123, например, могут содержать молекулу CAR (например, любую из CAR1 - CAR8) или антигенсвязывающий домен в соответствии с таблицей 1-2 из WO 2014/130635, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул CAR для CD123 и антигенсвязывающих доменов (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia), а также нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указанные в WO 2014/130635, представлены в таблицах 8-14. Аминокислотные и нуклеотидная последовательности, идентичные и практически идентичные вышеуказанным последовательностям, представленные в таблицах 8-14, конкретным образом включены в настоящее описание.

CDR для CD123-связывающих доменов, представленных в таблицах 8-14, изложены в соответствии с комбинацией схемы нумерации по Kabat и Chothia.

Таблица 8. CDR вариабельного домена тяжелой цепи Кандидат HCDR1 SEQ ID NO HCDR2 SEQ ID NO HCDR3 SEQ ID NO CAR123-2 GYTFTGYYMH 231 WINPNSGGTNYAQKFQG 234 DMNILATVPFDI 236 CAR123-3 GYIFTGYYIH 232 WINPNSGGTNYAQKFQG 234 DMNILATVPFDI 236 CAR123-4 GYTFTGYYMH 231 WINPNSGGTNYAQKFQG 234 DMNILATVPFDI 236 CAR123-1 GYTFTDYYMH 233 WINPNSGDTNYAQKFQG 235 DMNILATVPFDI 236

Таблица 9. CDR вариабельного домена легкой цепи Кандидат LCDR1 SEQ ID NO LCDR2 SEQ ID NO LCDR3 SEQ ID NO CAR123-2 RASQSISSYLN 237 AAFSLQS 239 QQGDSVPLT 241 CAR123-3 RASQSISSYLN 237 AASSLQS 240 QQGDSVPLT 241 CAR123-4 RASQSISSYLN 237 AASSLQS 240 QQGDSVPLT 241 CAR123-1 RASQSISTYLN 238 AASSLQS 240 QQGDSVPLT 241

Таблица 10. CDR вариабельного домена тяжелой цепи HCDR1 SEQ ID NO HCDR2 SEQ ID NO HCDR3 SEQ ID NO hzCAR123 GYTFTSYWMN 242 RIDPYDSETHYNQKFKD 243 GNWDDY 244

Таблица 11. CDR вариабельного домена легкой цепи LCDR1 SEQ ID NO LCDR2 SEQ ID NO LCDR3 SEQ ID NO hzCAR123 RASKSISKDLA 245 SGSTLQS 246 QQHNKYPYT 247

Таблица 12. Иллюстративные последовательности CAR для CD123 Название SEQ ID NO CAR123-2 н. к. SEQ ID NO: 248 CAR123-2 а. к. SEQ ID NO: 249 scFv CAR123-2 SEQ ID NO: 250 VH CAR123-2 SEQ ID NO: 251 VL CAR123-2 SEQ ID NO: 252 CAR123-3 н. к. SEQ ID NO: 253 CAR123-3 а. к. SEQ ID NO: 254 scFv CAR123-3 SEQ ID NO: 255 VH CAR123-3 SEQ ID NO: 256 VL CAR123-3 SEQ ID NO: 257 CAR123-4 н. к. SEQ ID NO: 258 CAR123-4 а. к. SEQ ID NO: 259 scFv CAR123-4 SEQ ID NO: 260 VH CAR123-4 SEQ ID NO: 261 VL CAR123-4 SEQ ID NO: 262 CAR123-1 н. к. SEQ ID NO: 263 CAR123-1 а. к. SEQ ID NO: 264 scFv CAR123-1 SEQ ID NO: 265 VH CAR123-1 SEQ ID NO: 266 VL CAR123-1 SEQ ID NO: 267

Таблица 13. Гуманизированные последовательности CAR для CD123 Название SEQ ID NO hzCAR123-1 н. к. 268 hzCAR123-1 а. к. 269 scFv hzCAR123-1 270 VH hzCAR123-1 271 VL hzCAR123-1 272 hzCAR123-2 н. к. 273 hzCAR123-2 а. к. 274 scFv hzCAR123-2 275 VH hzCAR123-2 271 VL hzCAR123-2 276 hzCAR123-3 н. к. 277 hzCAR123-3 а. к. 278 scFv hzCAR123-3 279 VH hzCAR123-3 271 VL hzCAR123-3 280 hzCAR123-4 н. к. 281 hzCAR123-4 а. к. 282 scFv hzCAR123-4 283 VH hzCAR123-4 271 VL hzCAR123-4 284 hzCAR123-5 н. к. 285 hzCAR123-5 а. к. 286 scFv hzCAR123-5 287 VH hzCAR123-5 271 VL hzCAR123-5 272 hzCAR123-6 н. к. 288 hzCAR123-6 а. к. 289 scFv hzCAR123-6 290 VH hzCAR123-6 271 VL hzCAR123-6 276 hzCAR123-7 н. к. 291 hzCAR123-7 а. к. 292 scFv hzCAR123-7 293 VH hzCAR123-7 271 VL hzCAR123-7 280 hzCAR123-8 н. к. 294 hzCAR123-8 а. к. 295 scFv hzCAR123-8 296 VH hzCAR123-8 271 VL hzCAR123-8 284 hzCAR123-9 н. к. 297 hzCAR123-9 а. к. 298 scFv hzCAR123-9 299 VH hzCAR123-9 300 VL hzCAR123-10 272 hzCAR123-10 н. к. 301 hzCAR123-10 а. к. 302 scFv hzCAR123-10 303 VH hzCAR123-10 300 VL hzCAR123-10 276 hzCAR123-11 н. к. 304 hzCAR123-11 а. к. 305 scFv hzCAR123-11 306 VH hzCAR123-11 300 VL hzCAR123-11 280 hzCAR123-12 н. к. 307 hzCAR123-12 а. к. 308 scFv hzCAR123-12 309 VH hzCAR123-12 300 VL hzCAR123-12 284 hzCAR123-13 н. к. 310 hzCAR123-13 а. к. 311 scFv hzCAR123-13 312 VH hzCAR123-13 300 VL hzCAR123-13 272 hzCAR123-14 н. к. 313 hzCAR123-14 а. к. 314 scFv hzCAR123-14 315 VH hzCAR123-14 300 VL hzCAR123-14 276 hzCAR123-15 н. к. 316 hzCAR123-15 а. к. 317 scFv hzCAR123-15 318 VH hzCAR123-15 300 VL hzCAR123-15 280 hzCAR123-16 н. к. 319 hzCAR123-16 а. к. 320 scFv hzCAR123-16 321 VH hzCAR123-16 300 VL hzCAR123-16 284 hzCAR123-17 н. к. 322 hzCAR123-17 а. к. 323 scFv hzCAR123-17 324 VH hzCAR123-17 325 VL hzCAR123-17 272 hzCAR123-18 н. к. 326 hzCAR123-18 а. к. 327 scFv hzCAR123-18 328 VH hzCAR123-18 325 VL hzCAR123-18 276 hzCAR123-19 н. к. 329 hzCAR123-19 а. к. 330 scFv hzCAR123-19 331 VH hzCAR123-19 325 VL hzCAR123-19 280 hzCAR123-20 н. к. 332 hzCAR123-20 а. к. 333 scFv hzCAR123-20 334 VH hzCAR123-20 325 VL hzCAR123-20 284 hzCAR123-21 н. к. 335 hzCAR123-21 а. к. 336 scFv hzCAR123-21 337 VH hzCAR123-21 325 VL hzCAR123-21 272 hzCAR123-22 н. к. 338 hzCAR123-22 а. к. 339 scFv hzCAR123-22 340 VH hzCAR123-22 325 VL hzCAR123-22 276 hzCAR123-23 н. к. 341 hzCAR123-23 а. к. 342 scFv hzCAR123-23 343 VH hzCAR123-23 325 VL hzCAR123-23 280 hzCAR123-24 н. к. 344 hzCAR123-24 а. к. 345 scFv hzCAR123-24 346 VH hzCAR123-24 325 VL hzCAR123-24 284 hzCAR123-25 н. к. 347 hzCAR123-25 а. к. 348 scFv hzCAR123-25 349 VH hzCAR123-25 350 VL hzCAR123-25 272 hzCAR123-26 н. к. 351 hzCAR123-26 а. к. 352 scFv hzCAR123-26 353 VH hzCAR123-26 350 VL hzCAR123-26 276 hzCAR123-27 н. к. 354 hzCAR123-27 а. к. 355 scFv hzCAR123-27 356 VH hzCAR123-27 350 VL hzCAR123-27 280 hzCAR123-28 н. к. 357 hzCAR123-28 а. к. 358 scFv hzCAR123-28 359 VH hzCAR123-28 350 VL hzCAR123-28 284 hzCAR123-29 н. к. 360 hzCAR123-29 а. к. 361 scFv hzCAR123-29 362 VH hzCAR123-29 350 VL hzCAR123-29 272 hzCAR123-30 н. к. 363 hzCAR123-30 а. к. 364 scFv hzCAR123-30 365 VH hzCAR123-30 350 VL hzCAR123-30 276 hzCAR123-31 н. к. 366 hzCAR123-31 а. к. 367 scFv hzCAR123-31 368 VH hzCAR123-31 350 VL hzCAR123-31 280 hzCAR123-32 н. к. 369 hzCAR123-32 а. к. 370 scFv hzCAR123-32 371 VH hzCAR123-32 350 VL hzCAR123-32 284

В вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, содержит scFv, который специфически связывается с CD123 и не содержит лидерной последовательности, например, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 64. В приведенной ниже таблице 14 представлены аминокислотные и нуклеотидные последовательности для последовательностей scFv CD123, которые не содержат лидерную последовательность под SEQ ID NO: 64.

Таблица 14. Последовательности scFv CAR для CD123 Название SEQ ID NO scFv CAR123-2 - н. к. 372 scFv CAR123-2 - а. к. 373 CAR123-2 без ORF н. к. 374 scFv CAR123-3 - н. к. 375 scFv CAR123-3 - а. к. 376 scFv CAR123-4 - н. к. 377 scFv CAR123-4 - а. к. 378 scFv CAR123-1 - а. к. 379 scFv hzCAR123-1 380 scFv hzCAR123-2 381 scFv hzCAR123-3 382 scFv hzCAR123-4 383 scFv hzCAR123-5 384 scFv hzCAR123-6 385 scFv hzCAR123-7 386 scFv hzCAR123-8 387 scFv hzCAR123-9 388 scFv hzCAR123-10 389 scFv hzCAR123-11 390 scFv hzCAR123-12 391 scFv hzCAR123-13 392 scFv hzCAR123-14 393 scFv hzCAR123-15 394 scFv hzCAR123-16 395 scFv hzCAR123-17 396 scFv hzCAR123-18 397 scFv hzCAR123-19 398 scFv hzCAR123-20 399 scFv hzCAR123-21 400 scFv hzCAR123-22 401 scFv hzCAR123-23 402 scFv hzCAR123-24 403 scFv hzCAR123-25 404 scFv hzCAR123-26 405 scFv hzCAR123-27 406 scFv hzCAR123-28 407 scFv hzCAR123-29 408 scFv hzCAR123-30 409 scFv hzCAR123-31 410 scFv hzCAR123-32 411