Способ сокультивирования трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека для получения клеточной модели для исследований in vitro Российский патент 2024 года по МПК C12N5/02 G01N33/50 C12N5/71 

Изобретение относится к области медицины, токсикологии и может использоваться для экспресс-тестирования взаимодействия вредных веществ с биологическими объектами при проведении исследований в фармакологических, токсикологических и биологических лабораториях.

Важной особенностью всех тканей является то, что клетки растут в трех измерениях и находятся в постоянном взаимодействии друг с другом и межклеточной средой. Традиционно используемые культуры клеток представляют собой упрощенные двухмерные модели одного вида клеток. Взаимодействие выбранных клеток в трехмерной совместной культуре имитирует процессы, происходящие в нативной легочной ткани, адекватно отражая воздействие вредных веществ на нижние респираторные пути и респираторный отдел легочной системы. Предполагается, что разрабатываемая совместная сфероидная культура является более чувствительной моделью для проведения токсикологических тестов по сравнению с монокультурой.

Способ может быть использован как база для разработки скрининговых тестов в токсикологических лабораториях Роспотребнадзора и других. На данный момент в лабораториях такого типа токсические эффекты различных веществ и материалов исследуются преимущественно на лабораторных животных, что повышает стоимость эксперимента и снижает скорость получения результатов. Кроме этого, предлагаемая модель имитирует респираторный тракт человека, в то время как результаты, полученные на животных, не всегда коррелируют с эффектами в человеческом организме.

Известна «Трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro, способ получения указанной модели и ее применение для определения и/или предсказания сенсибилизирующего действия вдыхаемых продуктов» (Патент RU №2772642, МПК C12N 5/071, C12N 5/0784 - 23.05.2022, Бюл. №15), где культивирование четырех типов клеток (альвеолоциты, эндотелиальные клетки, дендритоподобные клетки, макрофагоподобные клетки) в лунке, оснащенной пористой мембраной, разделяющей апикальный и базолатеральный компартменты. Трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro может быть использована для определения сенсибилизирующего действия вдыхаемых веществ.

Недостатком модели является отсутствие фибробластных клеток, играющих основную роль в поддержании целостности структуры легочной ткани путем пролиферации и восстановления поврежденных участков, а также необходимость использования специальных пористых мембран для разделения компартментов.

Известен способ сокультивирования клеточных культур дыхательных путей человека (альвеолоциты, тучные клетки, эндотелиальные клетки, макрофагоподобные клетки) в 3D-условиях, описанные в литературе [Klein SG, Serchi Т, Hoffmann L, Blomeke В, Gutleb AC. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Part Fibre Toxicol. 2013; 10:31. Published 2013 Jul 26. doi:10.1186/1743-8977-10-31]. В качестве метода трехмерного сокультивирования в научной статье выбран метод air-liquid interface (ALI, культивирование на границе раздела воздух-жидкость), который позволяет получать клетки с морфологией, релевантной физиологическим условиям.

Недостатком описанной модели также является отсутствие фибробластных клеток. Способ культивирования на границе раздела воздух-жидкость требует использования ряда дорогостоящих расходных материалов и реактивов и специальных экспозиционных камер, воспроизводящих контролируемое воздействие аэрозолей на клетки, а также необходимым условием является специальная подготовка оператора.

Сфероидные культуры клеток широко используются в области изучения рака как объекты, моделирующие опухоли. В литературе описан способ культивирования сфероидов из двух типов клеточных культур (клетки альвеолярного эпителия и фибробласты) с использованием планшетов с низкоадгезионной поверхностью [Movia D., Prina-Mello A. Nanotoxicity in Cancer Research: Technical Protocols and Considerations for the Use of 3D Tumour Spheroids // Unraveling the Safety Profile of Nanoscale Particles and Materials. Chapter 5. Edited by Gomes A.C., Sarria M.P. IntechOpen. 2017]. Данный способ был разработан авторами в качестве подхода для получения модели, отражающей взаимодействие опухолевых клеток с близлежащими здоровыми стромальными тканями. Формировали сфероиды клеток аденокарциномы человека А549 путем центрифугирования 1 мл клеточной суспензии в концентрации 1×10⁶ клеток/мл и перемещения клеточного осадка в лунку 96-луночного планшета с низкоадгезионной поверхностью. Совместную культуру получали наслаиванием четырехдневных сфероидов опухолевых клеток А549 на монослой фибробластов MRC5-SV40. Недостатком описанного способа является использование монослойных клеток в сочетании со сфероидами, из-за чего не достигается морфология фибробластов, характерная для условий in vivo.

Наиболее близким подходом, принятым за прототип, является способ сокультивирования эпителиоподобных клеток аденокарциномы протоков молочной железы человека MCF-7 с фибробластами легких MRC5-SV40 в 96-луночных планшетах с поверхностью, покрытой 1% агарозой, также описанный в литературе [Yakavets, I., Francois, A., Benoit, A. et al. Advanced co-culture 3D breast cancer model for investigation of fibrosis induced by external stimuli: optimization study. Sci Rep 10, 21273 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78087-7]. Целью авторов было создание сфероидной модели опухоли молочной железы, в соответствии с которой были подобраны клеточные линии и их соотношение и засевные условия. Засевали MCF-7 в концентрации 1000 или 2500 клеток/лунку и через 24 часа добавляли фибробласты MRC5-SV40 в соотношении 1:1 или 1:3 по сравнению с количеством эпителиальных клеток. В данном способе использованы опухолевые клетки аденокарциномы протоков молочной железы, из-за чего подход не подходит для оценки взаимодействия вредных веществ с дыхательной системой человека.

Задачей заявленного изобретения является получение трехмерной модели клеточных культур нижних дыхательных путей человека, состоящей из двух типов клеток, а именно клеток бронхиального эпителия и фибробластов легких, с применением планшетов с низкоадгезионной поверхностью и круглым дном для дальнейшего использования в токсикологических лабораториях для тестирования взаимодействия вредных веществ с биологическими объектами.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение трехмерной сфероидной модели клеточных культур нижних дыхательных путей человека, состоящей из клеток бронхиального эпителия и фибробластов легких.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что для получения трехмерной сфероидной модели трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека проводят монослойное культивирование неопухолевых клеточных линий бронхиального эпителия BEAS-2B и фибробластов легких MRC5-SV40 в культуральных чашках в 7,5 мл питательной среды DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков пенициллина и стрептомицина в течение 2-4 пассажей, далее по достижении 80-90% конфлентности клеточного монослоя проводят пересев клеток в 96-луночные планшеты с низкоадгезионной поверхностью и круглым дном, для чего отбирают кондиционированную культуральную среду из культуральных чашек с монослоем выбранных клеток, промывают чашку 4 мл фосфатно-солевого раствора Дульбекко, добавляют 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,25% на чашку и инкубируют при 37°С в течение 3-5 минут для культуры BEAS-2B и в течение 5-6 минут для культуры MRC5-SV40, нейтрализуют ферментативную реакцию добавлением культуральной среды ДМЕМ из расчета 4 мл на чашку, собирают суспензии клеток в соответствующие центрифужные пробирки и центрифугируют при 1000 оборотов в минуту в течение 3 минут, аспирируют надосадочную жидкость и добавляют 2 мл культуральной среды для ресуспендирования, проводят подсчет жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим на счетчике клеток, при жизнеспособности клеток не менее 70% готовят суспензии обоих типов с концентрацией 0,3×10⁵ жизнеспособных клеток/мл и добавляют в лунку 96-луночного планшета с низкоадгезионной поверхностью 100 мкл суспензии, содержащей 3000 клеток в соотношении клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и фибробластов легких MRC5-SV40 1:2 (33 мкл и 67 мкл полученных суспензий клеток BEAS-2B и MRC5-SV40, соответственно), планшет помещают в инкубатор при условиях 37°С, 5% CO2 и постоянной влажности, клетки формируют характерные плотные сфероиды без некротического ядра с диаметром 30-40 мкм уже через 24 часа культивирования, через 48-72 часа культивирования добавляют 50 мкл культуральной среды DMEM для сохранения количества жизнеспособных клеток выше 70% до 120-144 часов культивирования.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:

Фиг. 1 - конфокальная микроскопия сфероидов совместной клеточной культуры BEAS-2B и MRC5-SV40 через 72 часа культивирования в засевной концентрации 3000 клеток в соотношении 1:2. Окрашивание Syto9/propidium iodide (live/dead - зеленые/красные);

Способ осуществляется следующим образом.

Для получения сфероидов используются клетки неопухолевой природы бронхиального эпителия человека BEAS-2B и фибробласты легких человека MRC5-SV40.

Культивирование выбранных клеточных линий проводили в CO2-инкубаторе при стандартных условиях: 37°С, 5% CO2, постоянная влажность. Монослойные клетки культивировали в течение 2-4 пассажей в стандартных культуральных чашках (100 мм × 20 мм, Servicebio, Китай) в 7,5 мл культуральной среды DMEM с глутамином, с содержанием глюкозы 4,5 г/л, с пируватом натрия (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (BioSera, Южная Америка) и антибиотиков пенициллина и стрептомицина (25000 Ед и 25000 мкг, 100-кратный лиофилизированный препарат, ПанЭко, Россия).

На 2-4 пассаже по достижении 80-90%) конфлюэнтности клеточного монослоя проводили пересев клеток в 96-луночные планшеты из полистирола с низкоадгезионной поверхностью и круглым дном (SPL3D™ Cell Floater, SPL Life Sciences, Южная Корея). Кондиционированную культуральную среду полностью отбирали пипеткой, промывали чашку 4 мл стерильного фосфатно-солевого раствора Дульбекко с солями кальция и магния (ПанЭко, Россия). Добавляли 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,25% (ПанЭко, Россия) на чашку и инкубировали при 37°С в течение 3-5 минут для культуры BEAS-2B и в течение 5-6 минут для культуры MRC5-SV40 под контролем микроскопа. Добавляли культуральную среду для нейтрализации ферментативной реакции трипсина-ЭДТА из расчета 4 мл на чашку. Собирали суспензии клеток в соответствующие центрифужные пробирки и помещали в центрифугу на 3 минуты при 1000 оборотов в минуту. Аспирировали надосадочную жидкость из центрифужных пробирок. Добавляли 2 мл культуральной среды для ресуспендирования. Смешивали 10 мкл полученной суспензии клеток и 10 мкл красителя трипанового синего. Проводили автоматический подсчет жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим (Bio-Rad, США) с использованием счетчика клеток (С100, RWD Life Science, Китай)). Жизнеспособность клеток должна быть не менее 70%.

С учетом количества жизнеспособных клеток, проводили расчеты и готовили суспензии клеток двух типов с концентрацией 0,3×10⁵ жизнеспособных клеток/мл, что соответствует концентрации 3000 клеток на 100 мкл культуральной среды в лунке. Добавляли 33 мкл и 67 мкл полученных суспензий клеток BEAS-2B и MRC5-SV40, соответственно, в лунку 96-луночного планшета с низкоадгезионной поверхностью, что соответствовало засевному соотношению клеток BEAS-2B и MRC5-SV40 1:2 (Фиг. 1). Планшет помещали в инкубатор при условиях 37°С, 5% CO2 и постоянной влажности, сфероиды начинали формироваться через 24 часа культивирования. Клетки формировали характерные плотные сфероиды без некротического ядра с диаметром 30-40 мкм. При добавлении 50 мкл культуральной среды DMEM через 48-72 часа культивирования сфероиды сохраняли количество жизнеспособных клеток выше 70% до 120-144 часов культивирования (Фиг. 1).

При проведении токсикологических экспериментов добавление изучаемых веществ или материалов может быть осуществлено на 2-3 день культивирования со временем экспозиции до 72 часов.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области медицины, токсикологии, и может использоваться для экспресс-тестирования взаимодействия вредных веществ с биологическими объектами при проведении исследований в фармакологических, токсикологических и биологических лабораториях. Изобретение заключается в разработке способа получения трехмерной сфероидной модели клеточных культур нижних дыхательных путей человека, состоящей из клеток бронхиального эпителия и фибробластов легких. Изобретение позволит получить клеточную культуру для дальнейшего использования в токсикологических лабораториях для тестирования взаимодействия вредных веществ с биологическими объектами. 1 ил.

Способ сокультивирования трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека для получения клеточной модели для исследований in vitro, включающий совместное культивирование двух клеточных линий в 96-луночных планшетах для создания сфероидной модели, отличающийся тем, что для получения трехмерной сфероидной модели трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека проводят монослойное культивирование неопухолевых клеточных линий бронхиального эпителия BEAS-2B и фибробластов легких MRC5-SV40 в культуральных чашках в 7,5 мл питательной среды DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков пенициллина и стрептомицина в течение 2-4 пассажей, далее по достижении 80-90% конфлентности клеточного монослоя проводят пересев клеток в 96-луночные планшеты с низкоадгезионной поверхностью и круглым дном, для чего отбирают кондиционированную культуральную среду из культуральных чашек с монослоем выбранных клеток, промывают чашку 4 мл фосфатно-солевого раствора Дульбекко, добавляют 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,25% на чашку и инкубируют при 37°С в течение 3-5 мин для культуры BEAS-2B и в течение 5-6 мин для культуры MRC5-SV40, нейтрализуют ферментативную реакцию добавлением культуральной среды ДМЕМ из расчета 4 мл на чашку, собирают суспензии клеток в соответствующие центрифужные пробирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин, аспирируют надосадочную жидкость и добавляют 2 мл культуральной среды для ресуспендирования, проводят подсчет жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим на счетчике клеток, при жизнеспособности клеток не менее 70% готовят суспензии обоих типов с концентрацией 0,3×105 жизнеспособных клеток/мл и добавляют в лунку 96-луночного планшета с низкоадгезионной поверхностью 100 мкл суспензии, содержащей 3000 клеток в соотношении клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и фибробластов легких MRC5-SV40 1:2, 33 мкл и 67 мкл полученных суспензий клеток BEAS-2B и MRC5-SV40, соответственно, планшет помещают в инкубатор при условиях 37°С, 5% СO₂ и постоянной влажности, клетки формируют характерные плотные сфероиды без некротического ядра с диаметром 30-40 мкм уже через 24 ч культивирования, через 48-72 ч культивирования добавляют 50 мкл культуральной среды DMEM для сохранения количества жизнеспособных клеток выше 70% до 120-144 ч культивирования, для проведения токсикологических экспериментов добавление изучаемых веществ или материалов может быть осуществлено на 2-3 день культивирования со временем экспозиции до 72 ч.