Способ экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб Российский патент 2024 года по МПК G01N1/28 G01N1/34 

Из уровня техники известно, что щелочное расщепление с использованием гидроксида калия (КОН) является одним из наиболее рекомендуемых и используемых методов для экстракции микропластика из биологических тканей. Однако при использовании гидроксида калия (КОН) для обработки богатых липидами биологических образцов желудочно-кишечного тракта рыб происходит процесс омыления. Образуется суспензия глицерина и жирных кислот, которые могут захватывать микропластик, препятствуя его извлечению, засорять фильтры, снижая эффективность или полностью подавлять фильтрацию. Для оптимизации существующих процедур разложения с применением гидроксида калия (КОН) используют этанол (EtOH). Обработка этанолом является недорогим, простым и безопасным методом, который позволяет фильтровать омыленные биологические образцы. При этом этанол (EtOH) оказывает минимальное влияние на частицы микропластика [Dawson AL, Motti CA and Kroon FJ (2020) Solving a Sticky Situation: Microplastic Analysis of Lipid-Rich Tissue. Front. Environ. Sci. 8:563565. doi: 10.3389/fenvs.2020.563565].

При экстракции микропластика из биологических образцов желудочно-кишечного тракта рыб очередной проблемой является содержимое органов желудочно-кишечного тракта - устойчивые к расщеплению растительные остатки и хитин.

Известен метод извлечения микропластика из биологического образца (CN113092212, 13.04.2021), который включает следующие этапы: помещение биологического образца в раствор для расщепления и фильтрации; когда биологический образец содержит хитиновый экзоскелет, расщепляющий раствор содержит 30 мас.% перекиси водорода; в остальных биологических образцах в качестве раствора для гидролиза используют 10 мас.% раствора КОН. Когда раствор для переваривания представляет собой раствор КОН с концентрацией 10 мас.%, объемное отношение биологического образца к раствору для гидролиза составляет 1:3-4; при концентрации перекиси водорода 30 мас.% расход раствора для гидролиза на грамм биологического образца составляет 40-50 мл. Разложение проводят при 45-50°С в течение 48-72 часов. После щелочного гидролиза проводят операцию удаления неорганических частиц флотацией: добавление насыщенного раствора соли в расщепленный образец, перемешивание, отстаивание и сбор надосадочной жидкости. Фильтрацию осуществляют с использованием нейлонового фильтра с размером пор 5 мкм. Данный метод выбран в качестве прототипа.

В связи с тем, что в описании прототипа нет оговорки про ограничение применения метода в отношении различных биологических образцов, то следует полагать, что данный способ будет иметь низкую эффективность при обработке богатых липидами биологических образцов, в частности желудочно-кишечного тракта рыб, а именно вследствие омыления увеличатся временные затраты за счет засорения и разрыва фильтров, усложнится эксплуатация метода и снизится надежность получаемых результатов экстракции микропластика. В известном способе применяют фильтр с размером пор 5 мкм, через которые микропластиковые волокна могут теряться, что снижает надежность результатов при их количественном учете.

Технической задачей является разработка способа экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб, характеризующегося повышенной скоростью и надежностью экстракции микропластика.

Технический результат состоит в обеспечении условий для повышения скорости процесса и повышения точности количественного учета экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб.

Технический результат достигается тем, что способ включает щелочной гидролиз органов желудочно-кишечного тракта рыб путем добавления 100 мл 10 %-ного раствора гидроксида калия и перемешивания в лабораторном шейкере при 70-80 об./мин при 55 °С в течение 48 часов. Последовательное окисление остатков органического вещества в течение 24 часов при комнатной температуре путем добавления в гидролизат 5 % по объему 35%-ной перекиси водорода. Получение насыщенного солевого раствора путем добавления хлорида натрия в гидролизат до полного насыщения; разделение частиц в полученном растворе по плотности в делительной воронке в течение 24 часов. Сбор надосадочной фазы полученного раствора, содержащую микропластик, нагрев до 50°С и добавление 10 % по объему 96%-ого этанола, проведение вакуумной фильтрации микропластика на стекловолоконный фильтр с диаметром пор 1 мкм, подсушивание фильтра в ламинарном боксе в течение 30 минут.

Пример осуществления способа экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб.

Для осуществления способа экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб проводили щелочное расщепление органов всеядных рыб Leuciscus leuciscus L. (елец обыкновенный), для чего пищевод, желудок и кишечник каждого экземпляра рыбы промывали дистиллированной водой и помещали в стеклянную колбу с притертой стеклянной крышкой объемом 250 мл, куда добавляли 100 мл 10 %-ного раствора гидроксида калия (KOH), содержимое колбы перемешивали в лабораторном шейкере при 70-80 об./мин при 55°С в течение 48 часов. Для окисления остатков органического вещества в колбу с гидролизатом добавляли 5 % по объему 35%-ной перекиси водорода (H₂O₂) и выдерживали 24 часа при комнатной температуре. После щелочного гидролиза и окисления остатков органического материала для создания насыщенного солевого раствора в колбу с гидролизатом добавляли хлорид натрия (NaCl) до полного насыщения в расчете 75 г хлорида натрия на 150 мл гидролизата. Разделяли частицы в полученном растворе по плотности в делительной воронке объемом 0,5 л в течение 24 часов. Сливали половину раствора с делительной воронки, а надосадочную фазу полученного раствора, содержащую микропластик, собирали в стеклянную колбу на 250 мл и подогревали до 50°С, добавляли 10% по объему 96%-ый этанол (EtOH). Проводили вакуумную фильтрацию микропластика на белый стекловолоконный фильтр с диаметром пор 1 мкм, подсушивание фильтра в ламинарном боксе в течение 30 минут, микроскопический и спектроскопический анализ микропластика. Пластиковая природа частиц была подтверждена путем микроскопии, совмещенной со спектроскопией комбинационного рассеяния. Для этого использовали оборудование Томского регионального центра коллективного пользования ТГУ (ТРЦКП). Способ повторяли для каждого из 10 экземпляров рыб. По результатам применения способа среднее время фильтрации составило 8,2±1,5 мин./экземпляр рыбы, а среднее количество микропластика 3,4±1,8 ед./ экземпляр рыбы.

С целью подтверждения достижения технического результата провели два эксперимента, в которых реализовывали способ экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб частично.

Эксперимент 1

Проводили щелочное расщепление органов желудочно-кишечного тракта всеядных рыб Leuciscus leuciscus L. (елец обыкновенный), для чего пищевод, желудок и кишечник каждого экземпляра рыбы промывали дистиллированной водой и помещали в стеклянную колбу с притертой стеклянной крышкой объемом 250 мл, куда добавляли 100 мл 10 %-ного раствора гидроксида калия (KOH), содержимое колбы перемешивали в лабораторном шейкере при 70-80 об./мин при 55°С в течение 48 часов. Для окисления остатков органического вещества в колбу с гидролизатом добавляли 5 % по объему 35%-ной перекиси водорода (H₂O₂) и выдерживали 24 часа при комнатной температуре. После щелочного гидролиза и окисления остатков органического материала для создания насыщенного солевого раствора в колбу с гидролизатом добавляли хлорид натрия (NaCl) до полного насыщения в расчете 75 г хлорида натрия на 150 мл гидролизата. Разделяли частицы в полученном растворе по плотности в делительной воронке объемом 0,5 л в течение 24 часов. Сливали половину раствора с делительной воронки, а надосадочную фазу полученного раствора, содержащую микропластик, собирали в стеклянную колбу на 250 мл и проводили вакуумную фильтрацию микропластика из надосадочной фазы полученного раствора на белый стекловолоконный фильтр с диаметром пор 1 мкм, подсушивание фильтра в ламинарном боксе в течение 30 минут, микроскопический и спектроскопический анализ микропластика. Пластиковая природа частиц была подтверждена путем микроскопии, совмещенной со спектроскопией комбинационного рассеяния. Для этого использовали оборудование Томского регионального центра коллективного пользования ТГУ (ТРЦКП). Способ повторяли для каждого из 10 экземпляров рыб. Результаты представлены в таблице.

Эксперимент 2

Проводили щелочное расщепление органов желудочно-кишечного тракта всеядных рыб Leuciscus leuciscus L. (елец обыкновенный), для чего пищевод, желудок и кишечник каждого экземпляра рыбы промывали дистиллированной водой и помещали в стеклянную колбу с притертой стеклянной крышкой объемом 250 мл, куда добавляли 100 мл 10 %-ного раствора гидроксида калия (KOH), содержимое колбы перемешивали в лабораторном шейкере при 70-80 об./мин при 55°С в течение 48 часов. После щелочного гидролиза для создания насыщенного солевого раствора в колбу с гидролизатом добавляли хлорид натрия (NaCl) до полного насыщения в расчете 75 г хлорида натрия на 150 мл гидролизата. Разделяли частицы в полученном растворе по плотности в делительной воронке объемом 0,5 л в течение 24 часов. Сливали половину раствора с делительной воронки, а надосадочную фазу полученного раствора, содержащую микропластик, собирали в стеклянную колбу на 250 мл и проводили вакуумную фильтрацию микропластика из надосадочной фазы полученного раствора на белый стекловолоконный фильтр с диаметром пор 1 мкм, подсушивание фильтра в ламинарном боксе в течение 30 минут, микроскопический и спектроскопический анализ микропластика. Пластиковая природа частиц была подтверждена путем микроскопии, совмещенной со спектроскопией комбинационного рассеяния. Для этого использовали оборудование Томского регионального центра коллективного пользования ТГУ (ТРЦКП). Способ повторяли для каждого из 10 экземпляров рыб. Результаты представлены в таблице.

Таким образом, технический результат достигается за счет последовательного окисления оставшегося органического материала перекисью водорода после щелочного гидролиза органов желудочно-кишечного тракта рыб, а также обработки этанолом перед фильтрацией, что уменьшает риски засорения и разрыва стекловолоконного фильтра с диаметром пор 1 мкм.

Таблица - Результаты экспериментов 1 и 2. Вариант осуществления способа Среднее время фильтрации (мин./экз. рыбы) Среднее количество микропластика (ед./экз. рыбы) Эксперимент 1:
щелочной гидролиз органов желудочно-кишечного тракта и окисление остатков органического вещества перекисью водорода без последующей обработки этанолом 20,1±1,9 3,2±1,9 Эксперимент 2:
щелочной гидролиз органов желудочно-кишечного тракта без последующих окисления остатков органического вещества перекисью водорода и обработки этанолом 26,7±4,1 2,7±1,3

Список использованных источников:

1. Dawson AL, Motti CA and Kroon FJ (2020) Solving a Sticky Situation: Microplastic Analysis of Lipid-Rich Tissue. Front. Environ. Sci. 8:563565. doi: 10.3389/fenvs.2020.563565

2. CN113092212, 13.04.2021. Method for extracting micro-plastic from biological sample.

Изобретение относится к способам экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб и направлено на получение данных о поглощении микропластика рыбами, что является частью мониторинга потоков микропластика в окружающей среде. Способ экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб, характеризующийся тем, что проводят щелочной гидролиз органов желудочно-кишечного тракта рыб, к которым добавляют 100 мл 10 %-ного раствора гидроксида калия и перемешивают в лабораторном шейкере при 70-80 об./мин, при 55 °С в течение 48 часов, в течение 24 часов при комнатной температуре проводят окисление остатков органического вещества в гидролизате, к которому добавляют 5 % по объему 35 %-ной перекиси водорода, в гидролизат добавляют хлорид натрия до получения насыщенного солевого раствора, частицы в котором разделяют по плотности в делительной воронке в течение 24 часов, проводят сбор содержащей микропластик надосадочной фазы насыщенного солевого раствора, нагревают до 50 °С и добавляют 10 % по объему 96 %-ого этанола, проводят вакуумную фильтрацию микропластика на стекловолоконном фильтре с диаметром пор 1 мкм и подсушивают его в ламинарном боксе в течение 30 минут. Вышеописанный способ обеспечивает повышенную скорость и повышает точность количественного учета экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб. 1 табл., 1 пр.

Способ экстракции микропластика из органов желудочно-кишечного тракта рыб, характеризующийся тем, что проводят щелочной гидролиз органов желудочно-кишечного тракта рыб, к которым добавляют 100 мл 10 %-ного раствора гидроксида калия и перемешивают в лабораторном шейкере при 70-80 об./мин, при 55 °С в течение 48 часов, в течение 24 часов при комнатной температуре проводят окисление остатков органического вещества в гидролизате, к которому добавляют 5 % по объему 35 %-ной перекиси водорода, в гидролизат добавляют хлорид натрия до получения насыщенного солевого раствора, частицы в котором разделяют по плотности в делительной воронке в течение 24 часов, проводят сбор содержащей микропластик надосадочной фазы насыщенного солевого раствора, нагревают до 50 °С и добавляют 10 % по объему 96 %-ого этанола, проводят вакуумную фильтрацию микропластика на стекловолоконном фильтре с диаметром пор 1 мкм и подсушивают его в ламинарном боксе в течение 30 минут.