Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам к CCL2, связывающимся с двумя разными эпитопами на CCL2 человека, их фармацевтическим композициям, их производству и применению в качестве лекарственных средств для лечения раковых, воспалительных, аутоиммунных и офтальмологических заболеваний.

Уровень техники

Ось CCL2/CCR2 является основным медиатором рекрутинга незрелых миелоидных клеток в опухоль. CCL2 сверхэкспрессируется злокачественными клетками и связывается со внеклеточным матриксом (ВКМ), создавая градиент хемоаттрактанта. После достижения опухоли миелоидные супрессорные клетки (МСК) становятся частью проонкогенного окружения за счет секреции/повышения регуляции противовоспалительных цитокинов/рецепторов, которые, в свою очередь, ингибируют инициацию противоопухолевого Т-клеточного ответа. Таким образом, МСК могут снижать или даже нарушать эффективность активирующей Т-клетки терапии (Meyer et al, 2014). Следовательно, специфическое ингибирование рекрутирования этих незрелых миелоидных клеток будет повышать эффективность ингибиторов контрольных точек, Т-клеточных биспецифических антител (ТСВ) или других вариантов иммунотерапии рака (ИТР). Кроме того, CCL2 также был связан со стимуляцией ангиогенеза, метастазирования и роста опухолей, что позволяет предположить, что нейтрализация CCL2 может стать частью нескольких линий противоопухолевого вмешательства.

Нацеливание на CCL2, а не на его рецептор, будет специфически ингибировать нежелательные опосредованные CCL2 эффекты, не затрагивая те, чья сигнализация может осуществляться через тот же рецептор (CCR2), но отличные лиганды (например, CCL7, CCL8, CCL13), которые вовлечены в рекрутирование популяций других иммунных клеток, таких как Th1- и NK-клетки.

Клинически CCL2 был предпочтительной мишенью антител в нескольких исследованиях, целью которых была нейтрализация его повышенных уровней, вызванных разными воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит (Haringman et al, Arthritis Rheum. 2006 Aug;54(8):2387-92), идиопатический фиброз легких (Raghu et al, Eur Respir J. 2015 Dec;46(6): 1740-50), диабетическая нефропатия (Menne et al, Nephrol Dial Transplant (2017) 32: 307-315) и рак (Sandhu et al, Cancer Chemother Pharmacol. 2013 Apr;71(4): 1041-50). Однако его высокая скорость синтеза вместе с высокими наблюдаемыми in vivo константами диссоциации (KD) антитело антиген были признаны основными причинами, мешающими супрессии свободного CCL2 традиционными антителами в клинически приемлемых дозах (Fetterly et al, J Clin Pharmacol. 2013 Oct;53(10):1020-7).

Нейтрализация CCL2 по всей видимости является более очевидно релевантной у пациентов с повышенными сывороточными уровнями CCL2, которые наблюдали при нескольких типах рака, таких как рак молочной железы (РМЖ), рак яичника (РЯ), колоректальный рак (КР), рак поджелудочной железы и рак предстательной железы. Однако даже для пациентов с этими показаниями, которые не демонстрируют подобную серологию, но чьи опухоли сильно инфильтрированы иммунными клетками миелоидной линии дифференцировки, эта новая терапия будет очень полезной благодаря многим ролям, которые играет CCL2 в опухолевом контексте, как упоминалось выше.

В Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151 описана свипинг-технология, в которой созданное антитело несет рН-зависимые CDR (в отношении диссоциации антитела и антигена в кислотных условиях эндосом, что приводит к деградации антигена) и сконструированный Fc-фрагмент с оптимизированной изоэлектрической точкой (pI) и повышенным связыванием с FcgammaRIIb (что способствует клеточному поглощению иммунных комплексов) и имеет умеренную аффинность к неонатальному Fc-рецептору для поддержания приемлемого фармакокинетического профиля.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам к CCL2, связывающимся с двумя разными эпитопами на CCL2 человека, их фармацевтическим композициям, их производству и применению в качестве лекарственных средств для лечения раковых, воспалительных, аутоиммунных и офтальмологических заболеваний.

В одном варианте осуществления изобретения представлено биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй отличный антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека, при этом биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG человека.

В одном варианте осуществления изобретения представлено биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй отличный антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым эпитопом на CCL2 человека,

причем

A) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46;

или

Б) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

или

В) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (e) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или

Г) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46;

или

Д) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (6) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; или

Е) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46;

или

Ж) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (e) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

или

И) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30;

или

К) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека дикого типа (или его Fc-домен), превышает по меньшей мере в два раза (в одном варианте осуществления превышает по меньшей мере в 5 раз, в одном варианте осуществления превышает по меньшей мере в 10 раз, в одном варианте осуществления превышает по меньшей мере в 20 раз) скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека (или его Fc-домен) с сайленсингом Fc-гамма-рецептора, содержащий мутации L234A, L235A, P329G (нумерация EU по Kabat), когда предварительно сформированный иммунный комплекс, состоящий из 20 мг/кг каждого биспецифического антитела и 0,1 мг/кг CCL2 человека, вводили в однократной дозе 10 мл/кг FcRn-трансгенным мышам.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым эпитопом на CCL2 человека, причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт связывается с тем же эпитопом на CCL2, что и антитело, содержащее домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт связывается с тем же эпитопом на CCL2, что и антитело, содержащее домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46.

В одном варианте осуществления скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека дикого типа (или его Fc-домен), превышает по меньшей мере в 15 раз, в частности превышает по меньшей мере в 20 раз скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека (или его Fc-домен) с сайленсингом Fc-гамма-рецептора, содержащий мутации L234A, L235A, P329G (нумерация EU по Kabat), когда предварительно сформированный иммунный комплекс, состоящий из 20 мг/кг каждого биспецифического антитела и 0,1 мг/кг CCL2 человека, вводили в однократной дозе 10 мл/кг FcRn-трансгенным мышам.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и

домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и

домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59, (г) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF из SEQ ID NO: 63, (д) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGQGLEWMG из SEQ ID NO: 64, (е) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR из SEQ ID NO: 65, и (ж) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS из SEQ ID NO: 66; и

домен VL, содержащий (и) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (к) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (л) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62, (м) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC из SEQ ID NO: 67, (н) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGQAPRLLIY из SEQ ID NO: 68, (п) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC из SEQ ID NO: 69, и (р) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность GQGTKVEIK из SEQ ID NO: 70; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е, (г) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS из SEQ ID NO: 82, (д) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGQGLEWMG из SEQ ID NO: 83, (е) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR из SEQ ID NO: 84, и (ж) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTTVTVSS из SEQ ID NO: 85; и

домен VL, содержащий (и) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (к) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, (л) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R, (м) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC из SEQ ID NO: 86, (н) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIH из SEQ ID NO: 87, (п) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC из SEQ ID NO: 88, и (p) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGGGTKVEIK из SEQ ID NO: 89.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым эпитопом на CCL2 человека,

причем

A) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Б) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

B) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Г) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Д) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Е) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Ж) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

И) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

К) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Л) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

М) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Н) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

П) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Р) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

С) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Т) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым эпитопом на CCL2 человека,

причем

A) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, X² представляет собой Р и X представляет собой Н, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F и X² представляет собой R, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W;

или

Б) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность

GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, X² представляет собой Р и X³ представляет собой Н, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F и X² представляет собой R, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W; или

В) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Г) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Д) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Е) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R;

или

Ж) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R;

или

И) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R;

или

К) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R;

или

Л) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

М) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Н) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

П) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Р) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

С) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или H, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Т) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Н, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело

i) блокирует связывание CCL2 с его рецептором CCR2 in vitro (анализ репортерного гена, IC₅₀=0,5 нМ); и/или

ii) ингибирует CCL2-опосредованный хемотаксис миелоидных клеток in vitro (IC₅₀=1,5 нМ); и/или

iii) является перекрестно-реагирующим с CCL2 яванского макака и человека.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело не является перекрестно-реагирующим с другими гомологами CCL, в частности оно демонстрирует в 100 раз меньшее связывание с другими гомологами CCL (такими как, например, CCL8) по сравнению со связыванием с CCL2.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело связывается с первым и вторым эпитопом на CCL2 человека ион-зависимым образом.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело связывается с CCL2 человека рН-зависимым образом и при этом как первый антигенсвязывающий сайт, так и второй антигенсвязывающий сайт связываются с CCL2 с большей аффинностью при нейтральном рН, чем при кислотном рН.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело связывается с CCL2 человека с аффинностью, в 10 раз большей при рН 7,4, чем при рН 5,8.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий одну или более из следующих мутаций (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и/или

ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, T307P, K326T и/или АЗЗОК (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и/или

iii) M428L, N434A и/или Y436T (подходят для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и/или

iv) Q438R и/или S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий одну или более из следующих мутаций (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и/или

ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, К326Т и/или АЗЗОК (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и/или

iii) N434A (подходит для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и/или

iv) Q438R и/или S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий следующие мутации (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pi для повышения поглощения антигена); и

ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T и A330K (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и

iii) N434A (подходит для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и

iv) Q438R и S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий следующие мутации (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и

ii) N434A (подходит для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и

iii) Q438R и S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий следующие мутации (нумерация EU по Kabat) Q311R и P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий одну или более из следующих мутаций (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и/или

ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, Т307Р и/или A330K (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и/или

iii) M428L, N434A и/или Y436T (подходят для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и/или

iv) Q438R и/или S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий одну или более из следующих мутаций (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и

ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P и A330K (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и

iii) M428L, N434A и Y436T (подходят для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и

iv) Q438R и S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 (или его Fc-домен), содержащий одну или более из следующих мутаций (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и

ii) L234Y, P238D, T250V, V264I, Т307Р и A330K (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и

iii) N434A (подходит для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и

iv) Q438R и S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит два константных домена тяжелой цепи IgG1 (или их Fc-домен), содержащих (независимо от описанных выше мутаций или в дополнение к ним) следующие мутации (нумерация EU по Kabat)

i) S354C и T366W в одном из константных доменов тяжелой цепи,

ii) Y349C, T366S, L368A, Y407V в другом из константных доменов тяжелой цепи.

В одном варианте осуществления изобретения представлено (выделенное) (моноспецифическое) антитело, которое (специфически) связывается с CCL2 человека, причем антитело содержит

А) домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или H, X² представляет собой Р или Н и X³ представляет собой Н или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и

домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; или

Б) домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и

домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Т и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R.

В одном варианте осуществления изобретения представлено (выделенное) (моноспецифическое) антитело, которое (специфически) связывается с CCL2 человека, причем антитело содержит

А) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и

домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;

или

Б) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72;

и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;

или

В) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73;

и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;

или

Г) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74;

и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;

или

Д) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:90;

и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Е) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91;

и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Ж) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92;

и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

И) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:90;

и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

В одном варианте осуществления изобретения представлена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая (моно- или биспецифическое) антитело в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления.

В одном варианте осуществления изобретения представлена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту.

В одном варианте осуществления изобретения представлен способ получения антитела, включающий культивирование такой клетки-хозяина так, чтобы получить антитело.

В одном варианте осуществления изобретения такой способ дополнительно включает шаг выделения антитела из клетки-хозяина.

В одном варианте осуществления изобретения представлен фармацевтический состав, содержащий описанное в данном документе биспецифическое антитело и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном варианте осуществления изобретения представлено описанное в данном документе биспецифическое антитело для применения в качестве лекарственного средства.

В одном варианте осуществления изобретения представлено применение описанного в данном документе биспецифического антитела в производстве лекарственного средства.

В одном варианте осуществления такое лекарственное средство предназначено для лечения рака.

В одном варианте осуществления такое лекарственное средство предназначено для лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания.

В одном варианте осуществления изобретения представлено описанное в данном документе биспецифическое антитело для применения в лечении рака.

В одном варианте осуществления изобретения представлено описанное в данном документе биспецифическое антитело для применения в лечении воспалительного или аутоиммунного заболевания.

В одном варианте осуществления изобретения представлен способ лечения индивида, имеющего рак, включающий введение индивиду эффективного количества описанного в данном документе антитела.

В одном варианте осуществления изобретения представлен способ лечения индивида, имеющего воспалительное или аутоиммунное заболевание, включающий введение индивиду эффективного количества описанного в данном документе антитела.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1: Сенсограммы поверхностного плазмонного резонанса (Biacore®), демонстрирующие связывание моноспецифических антител к CCL2 (CNT0888 (=CNTO), 1A5, 1G9 и гуманизированного 11K2 (=11k2) с рекомбинантным CCL2 и гомологами CCL2.

Фиг. 2а: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 CNT0888-SG1 (IgG1 дикого типа), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 CNTO888-SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), FcRn-трансгенным мышам.

Фиг. 2б: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 11K2-SG1 (IgG1 дикого типа), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 11K2-SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), FcRn-трансгенным мышам.

Фиг. 2в: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 ABN912-SG1 (IgG1 дикого типа), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 ABN912-SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), FcRn-трансгенным мышам.

Фиг. 2г: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 1A4-SG1 (IgG1 дикого типа), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 1A4-SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), FcRn-трансгенным мышам.

Фиг. 2д: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 1A5-SG1 (IgG1 дикого типа), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 1A5-SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), FcRn-трансгенным мышам.

Фиг. 2е: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 1G9 -SGI (IgG1 дикого типа), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 1G9 -SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), FcRn-трансгенным мышам.

Фиг. 2ж: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 2F6-SG1 (IgG1 дикого типа), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг моноспецифического антитела к CCL2 2F6-SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), FcRn-трансгенным мышам.

Фиг. 3: Иллюстрирует временную динамику общей сывороточной концентрации CCL2 мыши (Фиг. 3а) и профиль антитело - время (Фиг. 3б) после в/в инъекции а) сплошная линия: 20 мг/кг моноспецифических антител к CCL2 11K2-SG1 (IgG1 дикого типа), и б) пунктирная линия: 20 мг/кг моноспецифических антител к CCL2 11K2-SG105 (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора) у мышей.

Фиг. 4а: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 11K2//1G9-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 11K2//1G9-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4б: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 CNTO888//11K2-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 CNTO888//11K2-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4в: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 CNTO888//1G9-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 11K2//1G9-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4г: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 CNTO888//1А5-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 CNTO888//1A5-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4д: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 1А5//1G9-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 1A5//1G9-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4е: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 11K2//2F6-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 11K2//2F6-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4ж: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 ABN912//11K2-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 ABN912//11K2-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4и: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 1А4//2F6-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 1A4//2F6-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 4к: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после в/в инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из а) сплошная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 1А5//2F6-ДТ IgG1 (IgG1 дикого типа с интактным связыванием Fc-рецептора), или б) пунктирная линия: 0,1 мг/кг CCL2 человека (hCCL2) и 20 мг/кг биспецифического антитела к CCL2 1A5//2F6-PGLALA (IgG1 с сайленсингом связывания Fc-рецептора), мышам Balb/c.

Фиг. 5а: Сенсограммы Biacore®, демонстрирующие профиль связывания с мономерным CCL2 при рН 7,4 (черная линия) и рН 5,8 (серая линия) четырех модифицированных 11K2 и четырех вариантов CNT0888, а также 16 биспецифических антител к CCL2, от CKLO01 до CKLO16, с получением соответствующей комбинации антигенсвязывающих фрагментов четырех модифицированных 11K2 и четырех вариантов CNTO888.

Фиг. 5б: Сенсограммы Biacore®, демонстрирующие профиль связывания с мономерным CCL2 четырех модифицированных 11K2 и четырех вариантов CNTO888, а также 16 биспецифических антител к CCL2, от CKLO01 до CKLO16, с получением соответствующей комбинации антигенсвязывающих фрагментов четырех модифицированных 11K2 и четырех вариантов CNTO888. Дополнительная фаза диссоциации при рН 5,8 была интегрирована в анализ BIACORE® непосредственно после фазы диссоциации при рН 7,4.

Фиг.6: Сенсограммы Biacore®, демонстрирующие профиль связывания биспецифических антител к CCL2 CKLO01, CKLO02, CKLO03 и CKLO04 с мономерным CCL8 при рН 7,4 (черная линия) и рН 5,8 (серая линия).

Фиг. 7а: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из hCCL2 и биспецифических антител к CCL2 (родительского CNTO//11K2 и рН-зависимых вариантов CKLO01, CKLO02, CKLO03 и CKLO04), мышам SCID.

Фиг. 7б: Сывороточная концентрация hCCL2 в течение времени после инъекции предварительно сформированного иммунного комплекса, состоящего из hCCL2 и CKLO03 (с Fc IgG1 дикого типа) или CKLO03-SG1099 (CKLO03 с Fc с повышенной pI), мышам SCID.

Фиг. 8: Хемотаксический анализ: Биспецифические антитела к CCL2 с идентичными CDR и вариабельными областями VH/VL, а именно CKLO2-IgG1 дикого типа и CKLO2-SG1095, но с разными Fc-фрагментами могут ингибировать миграцию клеток ТНР-1 с идентичной эффективностью (IC₅₀=0,2 мкг/мл; Фиг. 8, левая панель).

Аналогично, CCL2-0048, родительское немодифицированное биспецифическое антитело CNTO888/1 Ik2k2 IgG1 из CKLO2, которое не является рН-зависимым, также демонстрирует IC₅₀ 0,2 мкг/мл, поскольку рН-зависимость является критичной для свипинга антигена, явления, которое не наблюдается в этом анализе.

Соответствующие моноспецифические антитела CNTO888 IgG1 и гуманизированное 11k2 IgG1 демонстрируют значения IC₅₀ 0,3 и 0,7 мкг/мл, соответственно, тогда как изотипический контроль huIgG1 не демонстрирует ингибирования (Фиг. 8, правая панель).

Фиг. 9: In vivo противоопухолевая активность в генетически модифицированной мышиной модели. Обработка мышиной модели опухоли Mab CKLO2-IgG1 (IgG1 с Fc дикого типа) и CKLO2-SG1099 ((=CKLO2 с повышенной pI). Объем опухолей (слева), масса опухолей (по середине) и инфильтрат М-МСК (справа) в конце исследования, (носитель изображен черным цветом, IgG1 дикого типа CKLO2 серым цветом, a CKLO2 с Fc с повышенной pI (CKLO2-SG1099) белыми столбиками/пунктирной линией)

Фиг. 10: Сывороточные уровни общего (слева) и свободного (справа) CCL2 во время исследования in vivo противоопухолевой активности (смотрите эффективность на Фиг. 9) при обработке биспецифическими антителами к CCL2 (носитель изображен черным цветом, IgG1 дикого типа CKLO2 серым цветом, а Fc с повышенной pI (CKLO2-SG1099) белыми столбиками/пунктирной линией).

Фиг. 11: Исследование для подтверждения концепции эффективности свипинга CCL2 у яванских макаков. Профили зависимости общей концентрации антител от времени в сыворотке яванских макаков; левая панель: профили средняя концентрация - время четырех антител представлены за семь дней; группа 1: моноспецифическое CNTO888-SG1 (=IgG1 дикого типа) антитело к CCL2 (n=3 животных) в качестве контроля максимального накопления общего CCL2; группа 2: антитело к CCL2 с двумя паратопами CKLO2-SG1 (IgG1 дикого типа) с рН-зависимым связыванием мишени, но без Fc-модификаций (n=3); группа 3: антитело к CCL2 с двумя паратопами CKLO2-SG1100 с рН-зависимым связыванием мишени и Fc-pI и дополнительными модификациями (n=4) и группа 4: антитело к CCL2 с двумя паратопами CKLO2-SG1095 с рН-зависимым связыванием мишени, с модификациями Fc-pI и повышения аффинности к FcγRIIb и дополнительными модификациями (n=4); правая панель: индивидуальный профиль концентрация время индивида 4 (группа 2) представлен в течение ФК исследования (70 дней).

Фиг. 12: Исследование для подтверждения концепции эффективности свипинга CCL2 у яванских макаков. Профили концентрация общего CCL2 время в сыворотке яванских макаков; левая панель: профили средняя концентрация общего CCL2 - время четырех антител представлены за семь дней; правая панель: индивидуальный профиль концентрация общего CCL2 - время индивида 4 (группа 2) представлен в течение ФК исследования (70 дней).

Фиг. 13: Профили концентрация свободного CCL2 время в сыворотке яванских макаков; левая панель: профили средняя концентрация свободного CCL2 - время четырех антител представлены за семь дней; правая панель: индивидуальный профиль концентрация общего CCL2 - время индивида 4 (группа 2) представлен в течение ФК исследования (70 дней); средние профили рассчитывали, используя значение 0,01 нг/мл (нижний предел количественного обнаружения) для образцов, которые были ниже предела обнаружения.

Фиг. 14: ФК/ФД исследование эффективности свипинга CCL2 у яванских макаков. Профили концентрация общего CKL02-SG1095 время в сыворотке яванских макаков (обработка CKL02-SG1095 в разной концентрации (группы 1-3)); левая панель: профили средняя концентрация время (n=4) для трех уровней дозы представлены за семь дней; правая панель: индивидуальные профили концентрация - время двух ADA-отрицательных отдельных животных (группа дозы 25 мг/кг) представлены в течение исследования (98 дней).

Фиг. 15: ФК/ФД исследование эффективности свипинга CCL2 у яванских макаков. Профили концентрация общего CCL2 время в сыворотке яванских макаков при обработке CKL02-SG1095 в разной концентрации (группы 1-3) и в сравнении с обработкой CNT0888-SG1 (группа 4); левая панель: профили средняя концентрация общего CCL2 время (планки погрешностей указывают СО) четырех групп исследования представлены за семь дней; правая панель: индивидуальные профили концентрация общего CCL2 время ADA-отрицательных животных из групп 3 (n=2, планки погрешностей указывают диапазон) и 4 (n=3, планки погрешностей указывают СО) представлены в течение ФК исследования (98 дней).

Фиг. 16: ФК/ФД исследование эффективности свипинга CCL2 у яванских макаков. Профили концентрация свободного CCL2 время в сыворотке яванских макаков; левая панель: профили средняя концентрация свободного CCL2 время (планки погрешностей указывают СО) четырех групп исследования представлены за семь дней (обработка CKL02-SG1095 в разной концентрации (группы 1-3) и в сравнении с обработкой CNT0888-SG1 (группа 4)); правая панель: профили средняя концентрация свободного CCL2 время ADA-отрицательных животных из групп 3 (n=2, планки погрешностей указывают диапазон) и 4 (n=3, планки погрешностей указывают СО) представлены в течение ФК исследования (70 дней); средние профили рассчитывали, используя значение 0,01 нг/мл (нижний предел количественного обнаружения) для образцов, которые были ниже предела обнаружения.

Подробное описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам к CCL2, связывающимся с двумя разными эпитопами на CCL2 человека, их фармацевтическим композициям, их производству и применению в качестве лекарственных средств для лечения раковых, воспалительных, аутоиммунных и офтальмологических заболеваний. Таким образом, антитело содержит первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на СС2 человека, и второй отличный антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с отличным вторым эпитопом.

Настоящее изобретение включает биспецифические антитела, содержащие первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт связывается с тем же эпитопом на CCL2, что и антитело, содержащее домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:40, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт связывается с тем же эпитопом на CCL2, что и антитело, содержащее домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46.

В одном варианте осуществления скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека дикого типа (или его Fc-домен), превышает по меньшей мере в 15 раз, в частности превышает по меньшей мере в 20 раз скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека (или его Fc-домен) с сайленсингом Fc-гамма-рецептора, содержащий мутации L234A, L235A, P329G (нумерация EU по Kabat), когда предварительно сформированный иммунный комплекс, состоящий из 20 мг/кг каждого биспецифического антитела и 0,1 мг/кг CCL2 человека, вводили в однократной дозе 10 мл/кг FcRn-трансгенным мышам.

Термин «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах реализации эпитопная детерминанта содержит химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорильные или сульфонильные группы, а в некоторых вариантах осуществления может иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические зарядовые характеристики. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом. Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам к CCL2, связывающимся с двумя разными эпитопами на CCL2 человека. Термины первый и второй эпитоп относятся к двум разным эпитопам на CCL2 человека. Таким образом, второй эпитоп отличается от первого эпитопа. Можно легко определить, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом, что и референтный антигенсвязывающий сайт к CCL2, или конкурирует с ним за связывание, используя рутинные методы, известные в данной области техники. Например, чтобы определить, связывается ли исследуемое антитело с тем же эпитопом, что и референтный антигенсвязывающий сайт к CCL2 по изобретению, обеспечивают возможность связывания референтного антитела с доменом CCL2 в условиях насыщения. Далее оценивают способность исследуемого антитела связываться с CCL2 человека. Если исследуемое антитело способно связываться с CCL2 человека после насыщающего связывания с референтным антигенсвязывающим сайтом к CCL2, можно заключить, что исследуемое антитело связывается с другим эпитопом, чем референтный антигенсвязывающий сайт к CCL2. С другой стороны, если исследуемое антитело не способно связываться с CCL2 человека после насыщающего связывания с референтным антителом к CCL2, исследуемое антитело может связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, связываемый референтным антителом к CCL2 по изобретению. Затем можно проводить дополнительные рутинные эксперименты (например, анализ пептидных мутаций и связывания), чтобы подтвердить, что наблюдаемое отсутствие связывания действительно вызвано связыванием с тем же эпитопом, что и в случае референтного антитела, или что за отсутствие наблюдаемого связывания отвечает стерическое блокирование (или другое явление). Эксперименты такого рода можно проводить, используя ИФА, РИА, поверхностный плазменный резонанс (например, Biacore), проточную цитометрию или любой другой качественный или количественный анализ связывания антитела, доступный в данной области техники. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения два антитела связываются с одним и тем же (или перекрывающимся) эпитопом, если, например, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток антитела ингибирует связывание другого по меньше мере на 50%, но предпочтительно на 75%, 90% или даже 99% по данным измерения в анализе конкурентного связывания (смотрите, например, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502).

В альтернативном варианте считается, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если практически все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или устраняют связывание одного антитела, также снижают или устраняют связывание другого. Считается, что два антитела имеют «перекрывающиеся эпитопы», если только подгруппа аминокислотных мутаций, которые снижают или устраняют связывание одного антитела, снижают или элиминируют связывание другого.

Чтобы определить, конкурирует ли антитело за связывание с референтным антителом к CCL2, вышеописанную методологию связывания проводят в двух вариантах: В первом варианте обеспечивают возможность связывания референтного антитела с CCL2 в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания исследуемого антитела с CCL2 человека. Во втором варианте обеспечивают возможность связывания исследуемого антитела с молекулой CCL2 в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания референтного антитела с CCL2 человека. Если в обоих вариантах только первое (насыщающее) антитело способно связываться с молекулой CCL2, заключают, что исследуемое антитело и референтное антитело конкурируют за связывание с CCL2. Как будет понятно специалисту в данной области техники, антитело, которое конкурирует за связывание с референтным антителом, не обязательно может связываться с тем же эпитопом, что и референтное антитело, но может стерически блокировать связывание референтного антитела за счет связывания перекрывающегося или смежного эпитопа.

В контексте данного документа термин «CCL2», «CCL2 человека», также называемый «МСР-1» означает 76-аминокислотную последовательность, указанную в записи NCBI № NP_002973 и известную под разными названиями, такими как CCL2, МСР-1 (моноцитарный хемотаксический белок 1), SMC-CF (хемотаксический фактор гладкомышечных клеток), LDCF (лимфоцитарный хемотаксический фактор), GDCF (глиомный моноцитарный хемотаксический фактор), TDCF (опухолевый хемотаксический фактор), HCl1 (человеческий цитокин 11), MCAF (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор). Символом гена является SCYA2, ген JE в человеческой хромосоме 17, а новым обозначением является CCL2 (Ziotnik, Yoshie 2000. Immunity 12: 121-127). JE является мышиным гомологом человеческого MCP-1/CCL2.

Handel and others (Biochemistry. 1996; 35:6569-6584) определили структуру димера CCL2 в растворе. Эти исследования показали, что вторичная структура CCL2 состоит из четырех β-складок. Дополнительно остатки, отвечающие за поверхности димеризации CCL2, были описаны Zhang and Rollins (Mol Cell Biol. 1995; 15:4851-4855). Белковый комплекс имеет удлиненную форму с двумя мономерами, ориентированными таким образом, чтобы образовывать крупный карман. Также были определены структуры мономерного и димерного CCL2 в двух кристаллических формах, так называемых I и Р формах (Lubkowski et al., Nat Struct Biol. 1997; 4:64-69). В Paolini et al, (J Immunol. 1994 Sep 15; 153(6):2704-17)описано, что MCP1/CCL2 существует в виде мономера при физиологически релевантных концентрациях:

Посредством анализа рек. белка CCL2 (приобретенного у Peprotech) с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, седиментационного равновесного ультрацентрифугирования и химического перекрестного сшивания они смогли показать, что массовая доля мономерных и димерных форм МСР-1 зависит от концентрации in vitro. И наконец, Seo и коллеги (J Am Chem Soc. 2013 Mar 20; 135(11):4325-32) с помощью масс-спектрометрии ионной подвижности смогли показать наличие вводимого CCL2 как в мономерной, так и в димерной формах в физиологических условиях.

Таким образом, «CCL-2 дикого типа» (CCL2 дт) может существовать в виде мономера, но в действительности также может образовывать димеры при физиологических концентрациях. Это равновесие между мономерами и димерами безусловно является разным, и его следует аккуратно учитывать для всех описанных in vitro экспериментов, в которых могут использоваться разные концентрации. Чтобы избежать неопределенности, мы создали варианты CCL2 с точечными мутациями: Вариант «Р8А» CCL2 несет мутацию в поверхности димеризации, которая приводит к неспособности образовывать димер, что дает определенный чистый мономер CCL2. В противоположность этому, вариант «Т10С» CCL2 приводит к получению фиксированного димера CCL2 (J Am Chem Soc. 2013 Mar 20; 135(11):4325-32).

Ось CCL2/CCR2 является основным медиатором рекрутинга незрелых миелоидных клеток в опухоль. CCL2 сверхэкспрессируется злокачественными клетками и связывается со внеклеточным матриксом (ВКМ), создавая градиент хемоаттрактанта. После достижения опухоли миелоидные супрессорные клетки (МСК) становятся частью проонкогенного окружения за счет секреции/повышения регуляции противовоспалительных цитокинов/рецепторов, которые, в свою очередь, ингибируют инициацию противоопухолевого Т-клеточного ответа. Таким образом, МСК могут снижать или даже нарушать эффективность активирующей Т-клетки терапии (Meyer et al, 2014). Следовательно, специфическое ингибирование рекрутирования этих незрелых миелоидных клеток будет повышать эффективность ингибиторов контрольных точек, Т-клеточных биспецифических антител и вариантов иммунотерапии рака. Кроме того, CCL2 также был связан со стимуляцией ангиогенеза, метастазирования и роста опухолей, что позволяет предположить, что нейтрализация CCL2 может стать частью нескольких линий противоопухолевого вмешательства.

Нацеливание на CCL2, а не на его рецептор, будет специфически ингибировать нежелательные опосредованные CCL2 эффекты, не затрагивая те, чья сигнализация может осуществляться через тот же рецептор (CCR2), но отличные лиганды (например, CCL7, CCL8, CCL13), которые вовлечены в рекрутирование популяций других иммунных клеток, таких как Th1- и NK-клетки.

Клинически CCL2 был предпочтительной мишенью антител в нескольких исследованиях, целью которых была нейтрализация его повышенных уровней, вызванных разными воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит (Haringman et al, 2006), идиопатический фиброз легких (Raghu et al, 2015), диабетическая нефропатия (Menne et al, 2016) и рак (Sandhu et al, 2013). Однако его высокая скорость синтеза вместе с высокими наблюдаемыми in vivo константами диссоциации (KD) антитело антиген были признаны основными причинами, мешающими супрессии свободного CCL2 традиционными антителами в клинически приемлемых дозах (Fetterly et al, 2013).

Нейтрализация CCL2 по всей видимости является более очевидно релевантной у пациентов с повышенными сывороточными уровнями CCL2, которые наблюдали при нескольких типах рака, таких как рак молочной железы (РМЖ), рак яичника (РЯ), колоректальный рак (КР), рак поджелудочной железы и рак предстательной железы. Однако даже для пациентов с этими показаниями, которые не демонстрируют подобную серологию, но чьи опухоли сильно инфильтрированы иммунными клетками миелоидной линии дифференцировки, эта новая терапия будет очень полезной благодаря многим ролям, которые играет CCL2 в опухолевом контексте, как упоминалось выше.

В контексте данного документа антитело, «связывающееся с CCL2 человека», «специфически связывающееся с CCL2 человека», «которое связывается с CCL2 человека», или «антитело к CCL2» относится к антителу, специфически связывающемуся с антигеном CCL2 человека с аффинностью связывания со значением k_d 5,0 х 10^-8 моль/л или ниже, в одном варианте осуществления со значением k_d 1,0 х 10^-9 моль/л или ниже, в одном варианте осуществления со значением k_d от 5,0 х 10^-8 моль/л до 1,0 х 10^-13 моль/л.

Аффинность связывания определяют с помощью стандартного анализа связывания, такого как метод поверхностного плазменного резонанса (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden), например используя конструкции, содержащие внеклеточный домен CCL2 (например, в его встречающейся в природе 3-мерной структуре). В одном варианте осуществления аффинность связывания определяют с помощью стандартного анализа связывания, используя растворимый CCL2.

Специфичность антитела относится к избирательному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифическими.

В контексте данного документа термин «моноспецифическое» антитело означает антитело, которое имеет один или более связывающих сайтов, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

В контексте данного документа термин «биспецифическое антитело, которое связывается с CCL2 (человека)», «антитело с двумя паратопами, которое связывается с CCL2 (человека)», «биспецифическое антитело к CCL2», «антитело с двумя паратопами к CCL2» означает, что антитело способно специфически связываться с по меньшей мере двумя разными эпитопами на CCL2 (человека). Как правило, такое биспецифическое антитело содержит два разных антигенсвязывающих сайта (два разных паратопа), каждый из которых является специфическим в отношении отличного эпитопа на CCL2 (человека). В определенных вариантах осуществления биспецифическое антитело способно связывать два разных и не перекрывающихся эпитопа на CCL2, что означает, что два разных антигенсвязывающих сайта не конкурируют за связывание с CCL2.

В целях настоящего документа «акцепторная каркасная область человека» представляет собой каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученную из каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, как определено ниже. Человеческая акцепторная каркасная область, «полученная из» каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, может содержать такую же самую аминокислотную последовательность или может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах реализации число аминокислотных изменений составляет 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше, или 2 или меньше. В некоторых вариантах осуществления человеческая акцепторная каркасная область VL идентична по последовательности с последовательностью каркасной области VL человеческого иммуноглобулина или последовательностью человеческой консенсусной каркасной области.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют необходимую антигенсвязывающую активность.

«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются этим, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

В контексте данного документа термин «валентный» обозначает наличие определенного числа антигенсвязывающих сайтов в антителе. Следовательно, термин «одновалентное связывание с антигеном» обозначает наличие одного (и не более одного) антигенсвязывающего сайта, специфического в отношении антигена, в антителе.

Термин «антигенсвязывающий сайт» относится к сайту или области, т.е. одному или более аминокислотным остаткам антитела, которые обеспечивают взаимодействие с антигеном. Например, антигенсвязывающий сайт антитела содержит аминокислотные остатки из определяющих комплементарность областей (CDR). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий сайт антитела содержит аминокислотные остатки из VH и VL. Нативная молекула иммуноглобулина, как правило, имеет два антигенсвязывающих сайта; молекула Fab, как правило, имеет один антигенсвязывающий сайт. «Антигенсвязывающий фрагмент» относится к молекуле полипептида, содержащей антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с антигенной детерминантой. Антигенсвязывающие фрагменты включают антитела и их фрагменты, которые дополнительно определены в данном документе. Конкретные антигенсвязывающие фрагменты включают антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты могут содержать константные области антитела, как дополнительно определено в данном документе и известно в данной области техники. Применимые константные области тяжелой цепи относятся к любому из пяти изотипов: α, δ, ε, γ или μ. Применимые константные области легкой цепи относятся к любому из двух изотипов: κ и λ.

В контексте данного документа термин «антигенная детерминанта» или «антиген» относится к сайту на макромолекуле полипептида, с которым связывается антигенсвязывающий фрагмент/сайт, с образованием комплекса антигенсвязывающий фрагмент - антиген. Применимые антигенные детерминанты можно обнаружить, например, на поверхностях опухолевых клеток, на поверхностях инфицированных вирусом клеток, на поверхностях других пораженных заболеванием клеток, на поверхности иммунных клеток, в свободном виде в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ВКМ).

Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена от определенного источника или вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи получена от другого источника или вида.

«Класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, которые содержит его тяжелая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Предпочтительно биспецифические антитела по изобретению относятся к изотипу IgG человека, более предпочтительно к изотипу IgG1 человека. В контексте данного документа термины изотип IgG и изотип IgG1 относятся к изотипу IgG человека и изотипу IgG1 человека. Как правило, разные изотипы IgG существуют в форме немного отличающихся на основе аллельной вариации аллотипов среди подклассов IgG (смотрите Vidarsson et al.; Front Immunol 5 (2014) Article 520, 1-17). «Эффективное количество» агента, например, фармацевтического состава, относится к количеству, эффективному в необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени для достижения необходимого терапевтического или профилактического результата.

В данном документе термин «Fc-домен» или «Fc-область» используют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Этот термин включает Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи IgG могут немного варьироваться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека по определению обычно простирается от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. Однако антитела, вырабатываемые клетками-хозяевами, могут подвергаться посттрансляционному отщеплению одной или более, в частности одной или двух; аминокислот от С-конца тяжелой цепи. Следовательно, антитело, вырабатываемое клеткой-хозяином посредством экспрессии конкретной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную тяжелую цепь, может содержать полноразмерную тяжелую цепь или может содержать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи (что также называется в данном документе «тяжелой цепью с расщепленным вариантом»). Такое может происходить, когда двумя последними С-концевыми аминокислотами тяжелой цепи являются глицин (G446) и лизин (K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Следовательно, С-концевой лизин (Lys447) или С-концевые глицин (Gly446) и лизин (K447) Fc-области могут присутствовать или нет. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей, включая Fc-домены (или субъединицу Fc-домена по определению в данном документе), обозначены в данном документе без С-концевого глицин-лизинового дипептида, если не указано иное. В одном варианте осуществления изобретения тяжелая цепь, содержащая субъединицу Fc-домена по определению в данном документе, содержащаяся в антителе или биспецифическом антителе в соответствии с изобретением, содержит дополнительный С-концевой глицин-лизиновый дипептид (G446 и K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном варианте осуществления изобретения тяжелая цепь, содержащая субъединицу Fc-домена по определению в данном документе, содержащаяся в антителе или биспецифическом антителе в соответствии с изобретением, содержит дополнительный С-концевой остаток глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Композиции по изобретению, такие как описанные в данном документе фармацевтические композиции, содержат популяцию антител или биспецифических антител по изобретению. Популяция антител или биспецифических антител может содержать молекулы, имеющие полноразмерную тяжелую цепь, и молекулы, имеющие расщепленный вариант тяжелой цепи. Популяция антител или биспецифических антител может состоять из смеси молекул, имеющих полноразмерную тяжелую цепь, и молекул, имеющих расщепленный вариант тяжелой цепи, при этом по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% антител или биспецифических антител имеют расщепленный вариант тяжелой цепи. В одном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая популяцию антител или биспецифических антител по изобретению, содержит антитело или биспецифическое антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым глицин-лизиновым дипептидом (G446 и K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая популяцию антител или биспецифических антител по изобретению, содержит антитело или биспецифическое антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит популяцию антител или биспецифических антител, состоящую из молекул, содержащих тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе; молекул, содержащих тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и молекул, содержащих тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым глицин-лизиновым дипептидом (G446 и K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует «системе нумерации EU», также называемой «нумерацией по индексу EU по Kabat» или «нумерацией EU по Kabat», описанной в Kabat et al.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (смотрите также выше). В контексте данного документа «субъединица» Fc-домена относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный Fc-домен, т.е. полипептиду, содержащему С-концевые константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, способные к стабильной самоассоциации. Например, субъединица Fc-домена IgG содержит константные домены СН2 IgG и СН3 IgG.

«Каркасная область» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности CDR и FR обычно находятся в VH (или VL) в следующем порядке: FR-H1(L1)-CDR-H1(L1)-FR-H2(L2)-CDR-H2(L2)-FR-H3(L3)-CDR-H3(L3)-FR-H4(L4).

В контексте данного документа термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» используются взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу сходную со структурой нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область по определению в данном документе.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, вырабатываемого человеком или клеткой человека, или полученного из источника, отличного от человека, в котором используются репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Это определение человеческого антитела явным образом исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.

«Человеческая консенсусная каркасная область» представляет собой каркасную область, которая представляет наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в наборе каркасных последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина. Обычно набор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина получен из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. В общем случае подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу по Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном варианте осуществления в случае VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I по Kabat et al., выше. В одном варианте осуществления в случае VH подгруппа представляет собой подгруппу III по Kabat et al., выше.

«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из нечеловеческих CDR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все CDR соответствуют таковым из нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют таковым из человеческого антитела. Гуманизированное антитело, необязательно, может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученную из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, подвергшемуся гуманизации.

В контексте данного документа термин «определяющие комплементарность области» или «CDR» относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности и/или образуют структурно определенные петли («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигенами остатки («антигенные контакты»). В общем случае антитела содержат шесть CDR: три в VH (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три в VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Типовые CDR по данному документу включают:

(а) гипервариабельные петли, находящиеся в аминокислотных остатках 26-32 (CDR-L1), 50-52 (CDR-L2), 91-96 (CDR-L3), 26-32 (CDR-H1), 53-55 (CDR-H2) и 96-101 (CDR-H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(б) CDR, находящиеся в аминокислотных остатках 24 34 (CDR-L1), 50 56 (CDR-L2), 89-97 (CDR-L3), 31-35b (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) и 95-102 (CDR-H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(в) антигенные контакты, находящиеся в аминокислотных остатках 27 с-36 (CDR-L1), 46 55 (CDR-L2), 89 96 (CDR-L3), 30 35b (CDR-H1), 47 58 (CDR-H2) и 93-101 (CDR-H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки CDR 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2), 89-97 (vL3), 31-35 (CDR-H1), 50-63 (CDR-H2) и 95 102 (CDR-H3).

Если не указано иное, остатки CDR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) пронумерованы в настоящем документе в соответствии с Kabat et al., Kabat et al.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

«Индивид» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В определенных вариантах реализации индивид или субъект представляет собой человека.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его естественного окружения. В некоторых вариантах осуществления антитело является очищенным до более чем 95% или 99% чистоты по определению, например, электрофоретическими (например, ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографическими (например, ионообменная или обращенно-фазовая ВЭЖХ) методами. Обзор методов оценки чистоты антител смотрите, например, в Flatman, S. et al., J. Chromatogr. В 848 (2007) 79-87.

«Выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат эту молекулу нуклеиновой кислоты, но при этом молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном положении, которое отличается от ее природного хромосомного положения.

«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моно- или биспецифическое антитело к CCL2» относится к одной или более молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая молекулы нуклеиновых кислот в одном векторе или отдельных векторах и молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие в одной или более локациях в клетке-хозяине.

В контексте данного документа термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих мутации, имеющие природное происхождение или возникающие во время получения препарата моноклональных антител, при этом такие варианты в целом присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение «моноклональный» указывает на характеристику антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует интерпретировать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с помощью различных методик, включая, но не ограничиваясь этим, метод гибридомы, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, причем такие методы и другие типичные методы получения моноклональных антител описаны в данном документе.

«Нативные антитела» относятся к молекулам иммуноглобулинов природного происхождения с различной структурой. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой около 150000 Дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными связями. В направлении от N-конца к С-концу каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следуют три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогично, в направлении от N-конца к С-концу каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин «вкладыш в упаковку» используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предостережениях относительно применения таких терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно референтной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в референтной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, которые известны в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. При этом в целях данного документа значения процента (%) идентичности аминокислотных последовательностей получают, используя компьютерную программу для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана компанией Genentech, Inc., а исходный код был подан вместе с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под номером регистрации авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 находится в свободном доступе от Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть скомпилирована из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует компилировать для использования в операционной системе UNIX, включая Digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не варьируются.

В тех случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, % идентичности аминокислотной последовательности заданной аминокислотной последовательности А с или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В (что в альтернативном варианте можно сформулировать как заданная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности с или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В) рассчитывают следующим образом:

100 умножить на соотношение X/Y,

где Х представляет собой число аминокислотных остатков, оцененных программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при программном выравнивании А и В, и где Y представляет общее количество аминокислотных остатков в В. Следует понимать, что в случае, когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В к А. Если специально не указано иное, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, которые используются в данном документе, получены, как описано в предыдущем параграфе с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в форме, обеспечивающей биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента, и который при этом не содержит дополнительные компоненты, являющиеся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введен состав.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается этим, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

В контексте данного документа термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечить» или «лечащий») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения заболевания индивида, подлежащего лечению, и может проводиться как для профилактики, так и в течении клинической патологии. Необходимые эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, предотвращение появления или повторного появления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению используют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (CDR). (Смотрите, например, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), страница 91). Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, можно выделять, используя домен VH или VL из антитела, которое связывает антиген, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. Смотрите, например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

В контексте данного документа термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной увеличивать число копий другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Этот термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую его внесли. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе «экспрессионными векторами».

I. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

В одном аспекте изобретение основано частично на открытии того, что описанные в данном документе биспецифические антитела используют разные антигенсвязывающие сайты к CCL2 в качестве первого и второго антигенсвязывающего сайта/фрагмента. Эти антитела к CCL2 связываются с определенными эпитопами CCL2 с высокой специфичностью и обладают способностью специфически ингибировать связывание CCL2 с его рецептором CCR2. Они демонстрируют улучшенное образование иммунного комплекса по сравнению с моноспецифическими антителами и улучшенное устранение CCL2 in vivo.

Биспецифические антитела к CCL2

Биспецифические антитела

Описанные в данном документе биспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух разных эпитопов на CCL2.

Методики для создания мульти- и биспецифических антител включают, но не ограничиваются этим, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина, имеющих разную специфичность (смотрите Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), и конструирование по типу «выступ во впадину» (смотрите, например, патент США №5731168 и Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Мультиспецифические антитела также можно создавать путем конструирования с использованием эффекта электростатического взаимодействия для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (смотрите, например, WO 2009/089004); перекрестного сшивания двух или более антител или фрагментов (смотрите, например, патент США №4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (смотрите, например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992) и WO 2011/034605); применения технологии общей легкой цепи для преодоления проблемы неправильного спаривания легкой цепи (смотрите, например, WO 98/50431); применения технологии «диател» для получения биспецифических фрагментов антител (смотрите, например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и применения одноцепочечных димеров Fv (sFv) (смотрите, например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Сконструированные антитела с тремя или более антигенсвязывающими сайтами, включая, например, «антитела-осьминоги» или DVD-Ig, также включены в данный документ (смотрите, например, WO 2001/77342 и WO 2008/024715). Другие примеры мультиспецифических антител с тремя или более антигенсвязывающими сайтами можно найти в WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2013/026831. Биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также включают «FAb двойного действия» или «DAF», содержащие антигенсвязывающий сайт, который связывается с CCL2, а также другим отличным антигеном, или с двумя разными эпитопами CCL2 (смотрите, например, US 2008/0069820 и WO 2015/095539).

Мультиспецифические антитела могут быть предоставлены в асимметрической форме с кроссовером доменов в одном или более связывающих плечах с одинаковой антигенной специфичностью, т.е. за счет обмена доменов VH/VL (смотрите, например, WO 2009/080252 и WO 2015/150447), доменов CH1/CL (смотрите, например, WO 2009/080253) или полных плеч Fab (смотрите, например, WO 2009/080251, WO 2016/016299, также смотрите Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 и Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20), что также называют CrossMab. Асимметрические связывающие плечи также можно сконструировать путем внесения заряженных или не заряженных аминокислотных мутаций в контактные поверхности доменов для обеспечения правильного спаривания Fab. Смотрите, например, WO 2016/172485.

Различные дополнительные молекулярные форматы для мультиспецифических антител известны в данной области техники и включены в данный документ (смотрите, например, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

Предпочтительные форматы биспецифических антител.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления изобретения представлено описанное в данном документе биспецифическое антитело с кроссовером доменов в одном или более связывающих плечах с одинаковой антигенной специфичностью, т.е. за счет обмена доменов VH/VL (смотрите, например, WO 2009/080252 и WO 2015/150447), доменов CH1/CL (смотрите, например, WO 2009/080253) или полных плеч Fab (смотрите, например, WO 2009/080251, WO 2016/016299, также смотрите Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 и Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20).

Зарядовые модификации в таких биспецифических антителах, в особенности содержащие обмен доменов VH/VL (смотрите WO 2015/150447):

Биспецифические антитела по изобретению могут содержать аминокислотные замены в содержащихся в них молекулах Fab, которые являются в особенности эффективными для снижения неправильного спаривания легких цепей с несовпадающими тяжелыми цепями (побочные продукты типа Бенс-Джонса), которое может происходить при получении биспецифических антител на основе Fab с обменом VH/VL в одном (или более в случае молекул, содержащих более двух антигенсвязывающих молекул Fab) из их связывающих плеч (также смотрите публикацию РСТ № WO 2015/150447, в полном объеме включенную в данный документ посредством ссылки, в частности, примеры в ней). Соотношение необходимого биспецифического антитела в сравнении с нежелательными побочными продуктами, в частности побочными продуктами типа Бенс-Джонса, возникающими в биспецифических антителах с обменом доменов VH/VL в одном из их связывающих плеч, можно улучшить путем внесения заряженных аминокислот с противоположными зарядами в определенные аминокислотные позиции в доменах СН1 и CL (что иногда называется в данном документе «зарядовыми модификациями»).

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, в которых первый и второй антигенсвязывающие фрагменты биспецифического антитела оба представляют собой молекулы Fab, а в одном из антигенсвязывающих фрагментов (в частности, во втором антигенсвязывающем фрагменте) вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом,

i) в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена положительно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с Kabat), и при этом в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 замещена отрицательно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); или

ii) в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена положительно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с Kabat), и при этом в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 замещена отрицательно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

Биспецифическое антитело не содержит обе модификации, указанные в i) и ii). Константные домены CL и СН1 антигенсвязывающего фрагмента, содержащего обмен VH/VL, не замещены друг другом (т.е. остаются необмененными).

В более конкретном варианте осуществления,

i) в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); или

ii) в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном таком варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В более конкретном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В даже более конкретном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретных вариантах осуществления, если аминокислотные замены в соответствии с вышеприведенными вариантами осуществления проведены в константном домене CL и константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента, константный домен CL первого антигенсвязывающего фрагмента относится к изотипу каппа.

В альтернативном варианте аминокислотные замены в соответствии с вышеприведенными вариантами осуществления могут быть проведены в константном домене CL и константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента вместо константного домена CL и константного домена СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента. В конкретных вариантах осуществления константный домен CL второго антигенсвязывающего фрагмента относится к изотипу канна.

Соответственно, в одном варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

Для улучшения гетеродимеризации Fc-домена эти асимметричных (гетеродимерных) белков в одном варианте осуществления в соответствии с этими аспектами изобретения в первой субъединице Fc-домена остаток треонина в позиции 366 замещен остатком триптофана (T366W), а во второй субъединице Fc-домена остаток тирозина в позиции 407 замещен остатком валина (Y407V) и, необязательно, остаток треонина в позиции 366 замещен остатком серина (T366S), а остаток лейцина в позиции 368 замещен остатком аланина (L368A) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в соответствии с этими аспектами изобретения в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в позиции 356 замещен остатком цистеина (Е356С) (в частности остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина), а во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в позиции 349 замещен остатком цистеина (Y349C) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

Альтернативные методики гетеродимеризации описаны ниже в разделе «Fc-домены» и также предусмотрены как дополнительные варианты осуществления изобретения.

В дополнительном варианте осуществления в соответствии с этими аспектами изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1 человека.

Fc-домены и модификации

В конкретных вариантах осуществления биспецифическое антитело по изобретению содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц. Понятно, что характеристики Fc-домена, описанные в данном документе в связи с биспецифическим антителом, можно в равной мере применять в отношении Fc-домена, содержащегося в антителе по изобретению.

Fc-домен биспецифического антитела состоит из пары полипептидных цепей, содержащих домены тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. Например, Fc-домен молекулы иммуноглобулина G (IgG) представляет собой димер, каждая субъединица которого содержит константные домены СН2 и CH3 тяжелой цепи IgG. Две субъединицы Fc-домена способны к стабильной ассоциации друг с другом. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело по изобретению содержит не более одного Fc-домена.

В одном варианте осуществления Fc-домен биспецифического антитела представляет собой Fc-домен IgG. В конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁. В другом варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₄. В более конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₄, содержащий аминокислотную замену в позиции S228 (нумерация EU по Kabat), в частности аминокислотную замену S228P. Эта аминокислотная замена уменьшает in vivo обмен плеч Fab антител IgG₄ (смотрите Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). В дополнительном конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен человека. В более конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁ человека.

Fc-домены изотипа IgG характеризуются различными свойствами с учетом их взаимодействия с Fc-гамма-рецепторами или с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) (смотрите, например, Vidarsson et al.; Front Immunol 5 (2014) Article 520, 1-17).

Модификации Fc-домена, способствующие гетеродимеризации

Биспецифические антитела в соответствии с изобретением содержат разные антигенсвязывающие домены, которые могут быть слиты с одной или другой из двух субъединиц Fc-домена, таким образом, две субъединицы Fc-домена, как правило, содержатся в двух неидентичных полипептидных цепях. Рекомбинантная коэкспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводит к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Следовательно, для улучшения выхода и чистоты биспецифических антител при рекомбинантном получении будет целесообразно внести в Fc-домен биспецифического антитела модификацию, способствующую ассоциации необходимых полипептидов.

Соответственно, в конкретных вариантах осуществления Fc-домен биспецифического антитела в соответствии с изобретением содержит модификацию, способствующую ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена. Сайтом наиболее активного белок-белкового взаимодействия между двумя субъединицами Fc-домена IgG человека является СН3-домен Fc-домена. Таким образом, в одном варианте осуществления указанная модификация находится в СН3-домене Fc-домена.

Существует несколько подходов для модификации в СН3-домене Fc-домена с целью стимуляции гетеродимеризации, которые хорошо описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Как правило, во всех таких подходах СН3-домен первой субъединицы Fc-домена и СН3-домен второй субъединицы Fc-домена сконструированы комплементарным образом так, чтобы каждый СН3-домен (или содержащая его тяжелая цепь) больше не мог образовывать гомодимер сам с собой, но был бы вынужден образовывать гетеродимер с комплементарно сконструированным другим СН3-доменом (так, чтобы происходила гетеродимеризация первого и второго СН3-доменов и не происходило образование гомодимеров между двумя первыми или двумя вторыми СН3-доменами). Эти разные подходы для улучшения гетеродимеризации тяжелой цепи предусмотрены как разные альтернативные варианты в комбинации с модификациями тяжелой-легкой цепи (например, обмен/замена VH и VL в одном связывающем плече и внесение замен из заряженных аминокислот с противоположными зарядами в поверхность контакта CH1/CL) в биспецифическом антителе, что снижает неправильное спаривание тяжелой/легкой цепи и количество побочных продуктов Бенс-Джонса.

В конкретном варианте осуществления указанные модификации, способствующие ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, представляют собой так называемую модификацию типа «выступ во впадину», включающую модификацию «выступа» в одной из двух субъединиц Fc-домена и модификацию «впадины» в другой из двух субъединиц Fc-домена.

Технология «выступ во впадину» описана, например, в US 5731168; US 7695936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) и Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). В общем случае этот способ включает внесение выпуклости («выступа») в контактную поверхность первого полипептида и соответствующей полости («впадины») в контактную поверхность второго полипептида, так чтобы выпуклость могла располагаться в полости так, чтобы стимулировать образование гетеродимера и затруднять образование гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены небольших аминокислотных боковых цепей в контактной поверхности первого полипептида на более крупные боковые цепи (например тирозин или триптофан). Компенсаторные полости идентичного или сходного размера с выпуклостями создают в контактной поверхности второго полипептида путем замещения крупных аминокислотных боковых цепей меньшими (например, аланином или треонином).

Соответственно, в конкретном варианте осуществления в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена биспецифического антитела аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, выпуклости в СН3-домене первой субъединицы, которая может располагаться в полости в СН3-домене второй субъединицы, а в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, полости в СН3-домене второй субъединицы, в которой может располагаться выпуклость в СН3-домене первой субъединицы.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковой цепи, выбран из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, выбран из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (Т) и валина (V).

Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, с помощью сайт-специфического мутагенеза или с помощью пептидного синтеза.

В конкретном варианте осуществления в (в СН3-домене) первой субъединице Fc-домена (субъединице «выступа») остаток треонина в позиции 366 замещен остатком триптофана (T366W), а во (в СН3-домене) второй субъединице Fc-домена (субъединицы «впадины») остаток тирозина в позиции 407 замещен остатком валина (Y407V). В одном варианте осуществления во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток треонина в позиции 366 замещен остатком серина (T366S), а остаток лейцина в позиции 368 замещен остатком аланина (L368A) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в позиции 356 замещен остатком цистеина (Е356С) (в частности остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина), а во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в позиции 349 замещен остатком цистеина (Y349C) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Внесение двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами Fc-домена, дополнительно стабилизируя димер (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

В конкретном варианте осуществления первая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены S354C и T366W, а вторая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены Y349C, T366S, L368A и Y407V (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, слит (необязательно посредством первого антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с CCL2, и/или пептидного линкера) с первой субъединицей Fc-домена (содержащей модификацию «выступа»). Не ограничиваясь теорией, слияние антигенсвязывающего фрагмента, который связывается со вторым антигеном, таким как активирующий Т-клеточный антиген, с содержащей выступ субъединицей Fc-домена будет (дополнительно) сводить к минимуму создание антител, содержащих два антигенсвязывающих фрагмента, которые связываются с активирующим Т-клеточным антигеном (вследствие стерического несоответствия двух содержащих выступ полипептидов).

Другие методики СН3-модификации для стимуляции гетеродимеризации предусмотрены как альтернативные варианты в соответствии с изобретением и описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в ЕР 1870459. Этот подход основан на внесении заряженных аминокислот с противоположными зарядами в определенных аминокислотных позициях в поверхности контакта доменов СН3/СН3 между двумя субъединицами Fc-домена. Одним предпочтительным вариантом осуществления для биспецифического антитела по изобретению являются аминокислотные мутации R409D; K370E в одном из двух СН3-доменов (Fc-домена) и аминокислотные мутации D399K; E357K в другом из двух СН3-доменов Fc-домена (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления биспецифическое антитело по изобретению содержит аминокислотную мутацию T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена, и дополнительно аминокислотные мутации R409D; K370E в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации D399K; E357K в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления биспецифическое антитело по изобретению содержит аминокислотные мутации S354C, T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A, Y407V в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена, или указанное биспецифическое антитело содержит аминокислотные мутации Y349C, T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в СН3-доменах второй субъединицы Fc-домена и дополнительно аминокислотные мутации R409D; K370E в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации D399K; E357K в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена (вся нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2013/157953. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366K, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию L351D (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен содержит дополнительную аминокислотную мутацию L351K. В дополнительном варианте осуществления второй СН3-домен содержит дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из Y349E, Y349D и L368E (в частности L368E) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2012/058768. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В дополнительном варианте осуществления второй СН3-домен содержит дополнительную аминокислотную мутацию в позиции Т411, D399, S400, F405, N390 или K392, например, выбранную из a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, Т411Е или T411W, б) D399R, D399W, D399Y или D399K, в) S400E, S400D, S400R или S400K, г) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V или F405W, д) N390R, N390K или N390D, е) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F или K392E (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации T366V, K409F. В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В дополнительном варианте осуществления второй СН3-домен дополнительно содержит аминокислотные мутации K392E, Т411Е, D399R и S400R (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2011/143545, например, с аминокислотной модификацией в позиции, выбранной из группы, состоящей из 368 и 409 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2011/090762, в котором также используется описанная выше технология «выступ во впадину». В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366W, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366Y, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407T (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело или его Fc-домен относится к подклассу IgG₂, и в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2010/129304.

В альтернативном варианте осуществления модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, включает модификацию, которая опосредует эффекты электростатического взаимодействия, например, как описано в публикации РСТ WO 2009/089004. В общем случае этот способ включает замену одного или более аминокислотных остатков на поверхности контакта двух субъединиц Fc-домена заряженными аминокислотными остатками так, чтобы образование гомодимера становилось электростатически невыгодным, но гетеродимеризация была бы электростатический выгодной. В одном таком варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную замену K392 или N392 отрицательно заряженной аминокислотой (например, глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D), предпочтительно K392D или N392D), а второй СН3-домен содержит аминокислотную замену D399, Е356, D356 или Е357 положительно заряженной аминокислотой (например, лизином (K) или аргинином (R), предпочтительно D399K, E356K, D356K или E357K, и более предпочтительно D399K и E356K). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен дополнительно содержит аминокислотную замену K409 или R409 отрицательно заряженной аминокислотой (например, глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D), предпочтительно K409D или R409D). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен дополнительно или в качестве альтернативы содержит аминокислотную замену K439 и/или K370 отрицательно заряженной аминокислотой (например, глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D)) (вся нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2007/147901. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации K253E, D282K и K322D, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации D239K, E240K и K292D (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления в качестве альтернативы можно использовать подход гетеродимеризации, описанный в WO 2007/110205.

В одном варианте осуществления первая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены K392D и K409D, а вторая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены D356K и D399K (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В контексте данного документа термин «IgG или IgG1 дикого типа (ДТ)» в отношении биспецифических антител к CCL2 относится к биспецифическому антителу, которое содержит константную область тяжелой цепи IgG или IgG1, которая может содержать вышеописанные модификации/мутации, способствующие гетеродимеризации, но которая не содержит дополнительные модификации/мутации Fc-домена, повышающие или снижающие связывание Fc-рецептора и/или эффекторную функцию, как описано ниже.

Модификации/мутации Fc-домена, повышающие или снижающие связывание Fc-рецептора и/или эффекторную функцию:

Модификация биспецифических антител к CCL2 с помощью технологии свипинга

Биспецифические антитела к CCL2 модифицировали, используя технологию свипинга, чтобы биспецифические антитела к CCL2 могли уменьшать количество свободного CCL2 в течение больших периодов времени, чтобы сделать возможным длительный биологический эффект, такой как противораковая эффективность in vivo.

Концепция свипинга описана, например, в Igawa et al, Immunological Reviews 270 (2016) 132-151, WO 2012/122011, WO 2016/098357 и WO 2013/081143, которые включены в данный документ посредством ссылки.

В настоящем изобретении предложены способы облегчения опосредованного антителом поглощения антигена клеткой за счет снижения антигенсвязывающей активности (способности к связыванию) вышеописанного антитела в кислотном диапазоне рН до меньшей, чем его антигенсвязывающая активности в нейтральном диапазоне рН; и это облегчает поглощение антигена клеткой. В настоящем изобретении также предложены способы облегчения опосредованного антителом поглощения антигена клеткой, которые основаны на изменении по меньшей мере одной аминокислоты в антигенсвязывающем домене вышеописанного антитела, что облегчает поглощение антигена клеткой. В настоящем изобретении также предложены способы облегчения опосредованного антителом поглощения антигена клеткой, которые основаны на замещении гистидином по меньшей мере одной аминокислоты или вставке по меньшей мере одного гистидина в антигенсвязывающий домен вышеописанного антитела, что облегчает поглощение антигена клеткой.

В данном документе «поглощение антигенов клетками», опосредованное антителом, означает, что происходит поглощение антигенов клетками посредством эндоцитоза. При этом в данном документе «облегчение поглощения клетками» означает, что повышена скорость внутриклеточного поглощения антитела, связанного с антигеном, в плазме и/или уменьшено количество возвращения поглощенного антигена в плазму. Это означает, что скорость поглощения клетками повышается по сравнению с антителом до повышения активности связывания FcRn человека в нейтральном диапазоне рН или до повышения активности связывания FcRn человека и снижения антигенсвязывающей активности (способности к связыванию) антитела в кислотном диапазоне рН до меньшей, чем его антигенсвязывающая активности в нейтральном диапазоне рН. Повышение скорости происходит предпочтительно по сравнению с интактным IgG человека и более предпочтительно по сравнению с интактным IgG человека. Таким образом, в настоящем изобретении то, происходит ли облегчение поглощения антигена клетками, можно оценивать на основании повышения скорости поглощения антигена клетками. Скорость поглощения антигена клетками можно рассчитать, например, путем отслеживания снижения со временем концентрации антигена в культуральной среде, содержащей экспрессирующие FcRn человека клетки, после добавления в среду антигена и антитела, или отслеживания со временем уровня поглощения антигена экспрессирующими FcRn человека клетками. Используя способы по настоящему изобретению для повышения скорости опосредованного антителом поглощения антигена клетками, например, можно повысить скорость элиминации антигена из плазмы путем введения антител. Таким образом, то, происходит ли облегчение опосредованного антителом поглощения антигена клетками, также можно оценивать, например, путем исследования того, повышается ли скорость элиминации антигена из плазмы или снижается ли общая концентрация антигена в плазме при введении антитела.

В данном документе «общая концентрация антигена в плазме» означает общую концентрацию связанного антителом антигена и не связанного антителом антигена, или «концентрацию свободного антигена в плазме», которая представляет собой концентрацию не связанного антителом антигена. В данной области техники хорошо известны методы измерения «общей концентрации антигена в плазме» или «концентрации свободного антигена в плазме», которые описаны далее в данном документе.

В контексте данного документа «интактный человеческий IgG» (или «человеческий IgG дикого типа (ДТ)») означает немодифицированный (за исключением потенциальных модификаций для гетеродимеризации, описанных выше) человеческий IgG и не ограничен конкретным классом IgG. Это означает, что человеческий IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 можно использовать в качестве «интактного человеческого IgG» при условии, что он может связываться с FcRn человека в кислотном диапазоне рН. Предпочтительно «интактный человеческий IgG» может представлять собой человеческий IgG1.

В настоящем изобретении также предложены способы повышения числа антигенов, с которыми может связываться одно антитело. Конкретнее, в настоящем изобретении предложены способы повышения числа антигенов, с которыми может связываться одно антитело, обладающее активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, путем повышения активности связывания антителом FcRn человека в нейтральном диапазоне рН. В настоящем изобретении также предложены способы повышения числа антигенов, с которыми может связываться одно антитело, обладающее активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, путем изменения по меньшей мере одной аминокислоты в связывающем FcRn человека домене антитела.

В настоящем изобретении предложены способы облегчения опосредованного антителом поглощения антигена клетками. Конкретнее, в настоящем изобретении предложены способы облегчения поглощения антигена клетками антителом, обладающим активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, которые основаны на повышении активности связывания антителом FcRn человека в нейтральном диапазоне рН. В настоящем изобретении также предложены способы улучшения поглощения антигена клетками антителом, обладающим активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, которые основаны на изменении по меньшей мере одной аминокислоты в связывающем FcRn человека домене антитела.

В настоящем изобретении также предложены способы облегчения поглощения антигена клетками антителом, обладающим активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, которые основаны на использовании связывающего FcRn человека домена, содержащего аминокислотную последовательность с заменой отличной аминокислотой по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в позициях 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 (нумерация EU), в Fc-домене родительского IgG связывающего FcRn человека домена, содержащего Fc-домен родительского IgG.

В настоящем изобретении также предложены способы облегчения опосредованного антителом поглощения антигена клеткой за счет снижения антигенсвязывающей активности (способности к связыванию) вышеописанного антитела в кислотном диапазоне рН до меньшей, чем его антигенсвязывающая активности в нейтральном диапазоне рН; и это облегчает поглощение антигена клеткой. В настоящем изобретении также предложены способы облегчения опосредованного антителом поглощения антигена клеткой, которые основаны на изменении по меньшей мере одной аминокислоты в антигенсвязывающем домене вышеописанного антитела, что облегчает поглощение антигена клеткой. В настоящем изобретении также предложены способы облегчения опосредованного антителом поглощения антигена клеткой, которые основаны на замещении гистидином по меньшей мере одной аминокислоты или вставке по меньшей мере одного гистидина в антигенсвязывающий домен вышеописанного антитела, что облегчает поглощение антигена клеткой.

В данном документе «поглощение антигенов клетками», опосредованное антителом, означает, что происходит поглощение антигенов клетками посредством эндоцитоза. При этом в данном документе «облегчение поглощения клетками» означает, что повышена скорость внутриклеточного поглощения антитела, связанного с антигеном, в плазме и/или уменьшено количество возвращения поглощенного антигена в плазму. Это означает, что скорость поглощения клетками повышается по сравнению с антителом до повышения активности связывания FcRn человека в нейтральном диапазоне рН или до повышения активности связывания FcRn человека и снижения антигенсвязывающей активности (способности к связыванию) антитела в кислотном диапазоне рН до меньшей, чем его антигенсвязывающая активности в нейтральном диапазоне рН. Повышение скорости происходит предпочтительно по сравнению с интактным IgG человека и более предпочтительно по сравнению с интактным IgG человека. Таким образом, в настоящем изобретении то, происходит ли облегчение поглощения антигена клетками, можно оценивать на основании повышения скорости поглощения антигена клетками. Скорость поглощения антигена клетками можно рассчитать, например, путем отслеживания снижения со временем концентрации антигена в культуральной среде, содержащей экспрессирующие FcRn человека клетки, после добавления в среду антигена и антитела, или отслеживания со временем уровня поглощения антигена экспрессирующими FcRn человека клетками. Используя способы по настоящему изобретению для повышения скорости опосредованного антителом поглощения антигена клетками, например, можно повысить скорость элиминации антигена из плазмы путем введения антител. Таким образом, то, происходит ли облегчение опосредованного антителом поглощения антигена клетками, также можно оценивать, например, путем исследования того, повышается ли скорость элиминации антигена из плазмы или снижается ли общая концентрация антигена в плазме при введении антитела.

В данном документе «общая концентрация антигена в плазме» означает общую концентрацию связанного антителом антигена и не связанного антителом антигена, или «концентрацию свободного антигена в плазме», которая представляет собой концентрацию не связанного антителом антигена. В данной области техники хорошо известны методы измерения «общей концентрации антигена в плазме» или «концентрации свободного антигена в плазме», которые описаны далее в данном документе.

В контексте данного документа «интактный человеческий IgG» (или «IgG дикого типа») означает немодифицированный человеческий IgG (за исключением потенциальных модификаций для гетеродимеризации, описанных выше) и не ограничен конкретным классом IgG. Это означает, что человеческий IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 можно использовать в качестве «интактного человеческого IgG» при условии, что он может связываться с FcRn человека в кислотном диапазоне рН. Предпочтительно «интактный человеческий IgG» может представлять собой человеческий IgG1.

В контексте данного документа «родительский IgG» означает немодифицированный IgG, который впоследствии модифицируют для создания варианта, при условии, что модифицированный вариант родительского IgG может связываться с FcRn человека в кислотном диапазоне рН (следовательно, родительский IgG не обязательно должен обладать активностью связывания с FcRn человека в кислотных условиях). Родительский IgG может представлять собой встречающийся в природе IgG или вариант или сконструированную версию встречающегося в природе IgG. Родительский IgG может относиться к самому полипептиду, композициям, которые содержат родительский IgG, или аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Следует отметить, что «родительский IgG» включает известные коммерческие, рекомбинантно полученные IgG, описанные ниже. Происхождение «родительского IgG» не ограничено, и он может быть получен из любого организма отличных от человека животных или человека. Предпочтительно организм выбран из мыши, крысы, морской свинки, хомяка, песчанки, кошки, кролика, собаки, козы, овцы, коровы, лошади, верблюда и отличного от человека примата. В другом варианте осуществления «родительский IgG» также может быть получен от яванского макака, мармозетки, макак-резус, шимпанзе или человека. Предпочтительно «родительский IgG» получен из человеческого IgG1, но не ограничен конкретным классом IgG. Это означает, что человеческий IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 можно, соответственно, использовать в качестве «родительского IgG». Аналогично, любой класс или подкласс IgG из любого из вышеописанных организмов можно предпочтительно использовать в качестве «родительского IgG». Примеры варианта или сконструированной версии встречающегося в природе IgG описаны в Curr Opin Biotechnol. 2009 Dec; 20(6): 685-91, Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20(4): 460-70, Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 195-202, WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 и WO 2006/105338, но не ограничены ими.

В настоящем изобретении также предложены способы повышения способности к элиминации плазменного антигена путем введения антител. В настоящем изобретении выражение «способы повышения способности к элиминации плазменного антигена» является синонимичным выражению «способы усиления способности антитела к элиминации антигена из плазмы». Конкретнее, в настоящем изобретении предложены способы повышения способности к элиминации плазменного антигена антителом, обладающим активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, путем повышения активности связывания антителом FcRn человека в нейтральном диапазоне рН. В настоящем изобретении также предложены способы повышения способности к элиминации плазменного антигена антителом, обладающим активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, которые основаны на изменении по меньшей мере одной аминокислоты в связывающем FcRn человека домене антитела.

В настоящем изобретении также предложены способы повышения способности к элиминации плазменного антигена антителом, обладающим активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, путем использования связывающего FcRn человека домена, содержащего аминокислотную последовательность с заменой по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в позициях 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 (нумерация EU), в Fc-домене родительского IgG связывающего FcRn человека домена, содержащего Fc-домен родительского IgG, отличной аминокислотой.

В настоящем изобретении также предложены способы повышения способности к элиминации плазменного антигена антителом путем снижения активности связывания антигена в кислотном диапазоне рН вышеописанного антитела с улучшенной способностью к элиминации плазменного антигена по сравнению с активностью связывания антигена в нейтральном диапазоне рН. В настоящем изобретении также предложены способы повышения способности к элиминации плазменного антигена антителом путем изменения по меньшей мере одной аминокислоты в антигенсвязывающем домене вышеописанного антитела с улучшенной способностью к элиминации плазменного антигена. В настоящем изобретении также предложены способы повышения способности к элиминации плазменного антигена при введении антитела путем замены гистидином по меньшей мере одной аминокислоты или вставки по меньшей мере одного гистидина в антигенсвязывающем домене вышеописанного антитела с улучшенной способностью к элиминации плазменного антигена.

В данном документе «способность к элиминации плазменного антигена» означает способность к элиминации антигена из плазмы в случае введения или секреции антител in vivo. Таким образом, в данном документе «повышение способности к элиминации плазменного антигена» означает, что происходит повышение скорости элиминации антигена из плазмы после введения антитела по сравнению со скоростью до повышения активности связывания FcRn человека антителом в нейтральном диапазоне рН или до повышения активности связывания FcRn человека и одновременного снижения антигенсвязывающей активности в кислотном диапазоне рН до меньшей, чем в нейтральном диапазоне рН. Повышение активности антитела в отношении элиминации антигена из плазмы можно оценить, например, путем введения растворимого антигена и антитела in vivo и измерения концентрации растворимого антигена в плазме после введения. Когда концентрация растворимого антигена в плазме после введения растворимого антигена и антитела снижается за счет повышения активности связывания FcRn человека антителом в нейтральном диапазоне рН или повышения его активности связывания FcRn человека и одновременного снижения его антигенсвязывающей активности в кислотном диапазоне рН до меньшей, чем в нейтральном диапазоне рН, можно считать, что происходит повышение способности антитела к элиминации плазменного антигена. Формой растворимого антигена может быть связанный антителом антиген или не связанный антителом антиген, чью концентрацию можно определить как «концентрацию связанного антителом антигена в плазме» и «концентрацию не связанного антителом антигена в плазме», соответственно (последнее является синонимичным с «концентрацией свободного антигена в плазме»). Поскольку «общая концентрация антигена в плазме» означает общую концентрацию связанного антителом антигена и не связанного антителом антигена, или «концентрацию свободного антигена в плазме», которая представляет собой концентрацию не связанного антителом антигена, концентрацию растворимого антигена можно определить как «общую концентрацию антигена в плазме». В данной области техники хорошо известны методы измерения «общей концентрации антигена в плазме» или «концентрации свободного антигена в плазме», которые описаны далее в данном документе.

В настоящем изобретении также предложены способы улучшения фармакокинетики антител. Конкретнее; в настоящем изобретении предложены способы улучшения фармакокинетики антитела, обладающего активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, путем повышения активности связывания антителом FcRn человека в нейтральном диапазоне рН. Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы улучшения фармакокинетики антитела, обладающего активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, путем изменения по меньшей мере одной аминокислоты в связывающем FcRn человека домене антитела.

В настоящем изобретении также предложены способы улучшения фармакокинетики антитела, обладающего активностью связывания FcRn человека в кислотном диапазоне рН, путем использования связывающего FcRn человека домена, содержащего аминокислотную последовательность с заменой отличной аминокислотой по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в позициях 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 (нумерация EU), в Fc-домене родительского IgG связывающего FcRn человека домена, содержащего Fc-домен IgG.

Плазменную концентрацию свободного антигена, не связанного с антителом, или отношение концентрации свободного антигена к общей концентрации можно определить методами, известными специалистам в данной области техники, например, методом, описанным в Pharm Res. 2006 Jan; 23 (I): 95-103. В альтернативном варианте, когда антиген проявляет конкретную функцию in vivo, то, связан ли антиген с антителом, которое нейтрализует функцию антигена (антагонистической молекулой), можно оценить путем исследования, происходит ли нейтрализация функции антигена. То, происходит ли нейтрализация функции антигена, можно оценить с помощью анализа in vivo маркера, который отражает функцию антигена. То, связан ли антиген с антителом, которое активирует функцию антигена (агонистической молекулой), можно оценить с помощью анализа in vivo маркера, который отражает функцию антигена.

Определение плазменной концентрации свободного антигена и отношения количества свободного антигена в плазме к общему количеству антигена в плазме, анализ in vivo маркера и подобные измерения не являются конкретным образом ограниченными; при этом анализ предпочтительно проводить после прохождения некоторого периода времени после введения антитела. В настоящем изобретении период после введения антитела не является конкретным образом ограниченным; специалисты в данной области техники могут определить соответствующий период в зависимости от свойств и т.п. вводимого антитела. Такие периоды включают, например, один день после введения антитела, три дня после введения антитела, семь дней после введения антитела, 14 дней после введения антитела и 28 дней после введения антитела. В данном документе «плазменная концентрация антигена» означает «общую концентрацию антигена в плазме», которая представляет собой общую концентрацию связанного антителом антигена и не связанного антителом антигена, или «концентрацию свободного антигена в плазме», которая представляет собой концентрацию не связанного антителом антигена.

Общую концентрацию антигена в плазме можно снизить путем введения антитела по настоящему изобретению в 2 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 50 раз, 100 раз, 200 раз, 500 раз, 1000 раз или даже более по сравнению с введением референтного антитела, содержащего интактный Fc-домен человеческого IgG в качестве FcRn-связывающего домена, или по сравнению со случаем, когда молекулу антигенсвязывающего домена по настоящему изобретению не вводят.

В другом аспекте в изобретении предложены биспецифические антитела к CCL2, которые демонстрируют рН-зависимые характеристики связывания. В контексте данного документа выражение «рН-зависимое связывание» означает, что антитело демонстрирует «сниженное связывание с CCL2 при кислотном рН по сравнению со связыванием при нейтральном рН» (в целях настоящего изобретения оба выражения можно использовать взаимозаменяемо). Например, антитела «с рН-зависимыми характеристиками связывания» включают антитела, которые связываются с CCL2 с большей аффинностью при нейтральном рН, чем при кислотном рН. В определенных вариантах осуществления биспецифические антитела по настоящему изобретению связываются с CCL2 с по меньшей мере в 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более раз большей аффинностью при нейтральном рН, чем при кислотном рН. В некоторых вариантах осуществления антитела связываются с CCL2 с большей аффинностью при рН 7,4, чем при рН 5,8. В дополнительных вариантах осуществления антитела связываются с CCL2 с по меньшей мере в 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более раз большей аффинностью при рН 7,4, чем при рН 5,8.

Когда антиген представляет собой растворимый белок, связывание антитела с антигеном может приводить к продлению времени полужизни антигена в плазме (т.е. снижению клиренса антигена из плазмы), поскольку антитело может иметь большее время полужизни в плазме, чем сам антиген, и может служить носителем для антигена. Это происходит благодаря рециркуляции комплекса антиген-антитело с помощью FcRn через эндосомальный путь в клетку (Roopenian, Nat. Rev. Immunol. 7(9): 715-725 (2007)). При этом ожидается, что антитело с рН-зависимыми характеристиками связывания, которое связывается со своим антигеном в нейтральном внеклеточном окружении с высвобождением антигена в кислотные эндосомальные компартменты после попадания в клетку, будет иметь превосходящие свойства в терминах нейтрализации и клиренса антигена по сравнению с антителом, которое связывается рН-независимым образом (Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al., mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825).

«Аффинность» антитела в отношении CCL2 в целях настоящего изобретения выражают в терминах KD антитела. KD антитела относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия антитело - антиген. Чем больше значение KD для связывания антитела со своим антигеном, тем слабее аффинность связывания в отношении этого конкретного антигена. Соответственно, в контексте данного документа выражение «большая аффинность при нейтральном рН, чем при кислотном рН» (или эквивалентное выражение «рН-зависимое связывание») означает, что KD связывания антитела с CCL2 при кислотном рН больше, чем KD связывания антитела с CCL2 при нейтральном рН. Например, в контексте настоящего изобретения считается, что антитело связывается с CCL2 с большей аффинностью при нейтральном рН, чем при кислотном рН, если KD связывания антитела с CCL2 при кислотном рН по меньшей мере в 2 раза больше, чем KD связывания антитела с CCL2 при нейтральном рН. Таким образом, настоящее изобретение включает антитела, которые связываются с CCL2 при кислотном рН с KD, которая по меньшей мере в 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более раз больше, чем KD связывания антитела с CCL2 при нейтральном рН. В другом варианте осуществления значение KD антитела при нейтральном рН может составлять 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, 10-12 М или менее. В другом варианте осуществления значение KD антитела при кислотном рН может составлять 10-9 М, 10-8 М, 10-7 М, 10-6 М или более.

В дополнительных вариантах осуществления считается, что антитело связывается с большей аффинностью при нейтральном рН, чем при кислотном рН, если KD связывания антитела с CCL2 при рН 5,8 по меньшей мере в 2 раза больше, чем KD связывания антитела с CCL2 при рН 7,4. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела, которые связываются с CCL2 при рН 5,8 с KD, которая по меньшей мере в 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более раз больше, чем KD связывания антитела с CCL2 при рН 7,4. В другом варианте осуществления значение KD антитела при рН 7,4 может составлять 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, 10-12 М или менее. В другом варианте осуществления значение KD антитела при рН 5,8 может составлять 10-9 М, 10-8 М, 10-7 М, 10-6 М или более.

Свойства связывания антитела в отношении конкретного антигена также можно выразить в терминах kd антитела, kd антитела относится к константе скорости диссоциации антитела в отношении конкретного антигена и выражается в обратных секундах (т.е. с-1). Повышение значения kd означает более слабое связывание антитела со своим антигеном. Следовательно, настоящее изобретение включает антитела, которые связываются с CCL2 с большим значением kd при кислотном рН, чем при нейтральном рН. Настоящее изобретение включает антитела, которые связываются с CCL2 при кислотном рН с kd, которая по меньшей мере в 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более раз больше, чем kd связывания антитела с CCL2 при нейтральном рН. В другом варианте осуществления значение kd антитела при нейтральном рН может составлять 10-2 1/с, 10-3 1/с, 10-4 1/с, 10-5 1/с, 10-6 1/с или менее. В другом варианте осуществления значение kd антитела при кислотном рН может составлять 10-3 1/с, 10-2 1/с, 10-1 1/с или более. Изобретение также включает антитела, которые связываются с CCL2 с большим значением kd при рН 5,8, чем при рН 7.4. Изобретение включает антитела, которые связываются с CCL2 при рН 5,8 с kd, которая по меньшей мере в 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более раз больше, чем kd связывания антитела с CCL2 при рН 7,4. В другом варианте осуществления значение kd антитела при рН 7,4 может составлять 10-2 1/с, 10-3 1/с, 10-4 1/с, 10-5 1/с, 10-6 1/с или менее. В другом варианте осуществления значение kd антитела при рН 5,8 может составлять 10-3 1/с, 10-2 1/с, 10-1 1/с или более.

В определенных случаях «сниженное связывание с CCL2 при кислотном рН по сравнению с его связыванием при нейтральном рН» выражают как отношение значения KD связывания антитела с CCL2 при кислотном рН к значению KD связывания антитела с CCL2 при нейтральном рН (или наоборот). Например, в целях настоящего изобретения можно считать, что антитело демонстрирует «сниженное связывание с CCL2 при кислотном рН по сравнению с его связыванием при нейтральном рН», если антитело демонстрирует отношение кислотная/нейтральная KD, составляющее 2 или более. В определенных вариантах осуществления отношение KD рН 5,8/рН 7,4 для антитела к CCL2 по настоящему изобретению составляет 2 или более. В определенных типовых вариантах осуществления отношение кислотная/нейтральная KD для антитела по настоящему изобретению может составлять 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более. В другом варианте осуществления значение KD антитела при нейтральном рН может составлять 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, 10-12 М или менее. В другом варианте осуществления значение KD антитела при кислотном рН может составлять 10-9 М, 10-8 М, 10-7 М, 10-6 М или более. В дополнительных случаях можно считать, что антитело демонстрирует «сниженное связывание с CCL2 при кислотном рН по сравнению с его связыванием при нейтральном рН», если антитело демонстрирует отношение KD рН 5,8/рН 7,4, составляющее 2 или более. В определенных типовых вариантах осуществления отношение KD рН 5,8/рН 7,4 для антитела может составлять 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более. В другом варианте осуществления значение KD антитела при рН 7,4 может составлять 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, 10-12 М или менее. В другом варианте осуществления значение KD антитела при рН 5,8 может составлять 10-9 М, 10-8 М, 10-7 М, 10-6 М или более.

В определенных случаях «сниженное связывание с CCL2 при кислотном рН по сравнению с его связыванием при нейтральном рН» выражают как отношение значения kd связывания антитела с CCL2 при кислотном рН к значению kd связывания антитела с CCL2 при нейтральном рН (или наоборот). Например, в целях настоящего изобретения можно считать, что антитело демонстрирует «сниженное связывание с CCL2 при кислотном рН по сравнению с его связыванием при нейтральном рН», если антитело демонстрирует отношение кислотная/нейтральная kd, составляющее 2 или более. В определенных типовых вариантах осуществления отношение kd рН 5,8/рН 7,4 для антитела по настоящему изобретению составляет 2 или более. В определенных типовых вариантах осуществления отношение кислотная/нейтральная kd для антитела по настоящему изобретению может составлять 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более. В другом варианте осуществления значение kd антитела при нейтральном рН может составлять 10-2 1/с, 10-3 1/с, 10-4 1/с, 10-5 1/с, 10-6 1/с или менее. В другом варианте осуществления значение kd антитела при кислотном рН может составлять 10-3 1/с, 10-2 1/с, 10-1 1/с или более. В определенных типовых вариантах осуществления отношение kd рН 5,8/рН 7,4 для антитела по настоящему изобретению может составлять 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 или более. В другом варианте осуществления значение kd антитела при рН 7,4 может составлять 10-2 1/с, 10-3 1/с, 10-4 1/с, 10-5 1/с, 10-6 1/с или менее. В другом варианте осуществления значение kd антитела при рН 5,8 может составлять 10-3 1/с, 10-2 1/с, 10-1 1/с или более.

В контексте данного документа выражение «кислотный рН» означает рН от 4,0 до 6,5. Выражение «кислотный рН» включает любые значения рН из 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 и 6,5. В конкретных аспектах «кислотный рН» составляет 5,8.

В контексте данного документа выражение «нейтральный рН» означает рН от 6,7 до около 10,0. Выражение «нейтральный рН» включает любые значения рН из 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 и 10,0. В конкретных аспектах «нейтральный рН» составляет 7,4.

Значения KD и значения kd, приводимые в данном документе, можно определять с помощью биосенсора на основе явления поверхностного плазменного резонанса для характеристики взаимодействия антитело антиген. Значения KD и значения kd можно определять при 25 градусах С или 37 градусах С.

В дополнительном аспекте в изобретении предложено биспецифическое антитело к CCL2, которое образует иммунный комплекс (т.е. комплекс антиген антитело) с CCL2. В определенных вариантах осуществления два или более биспецифических антител к CCL2 связываются с двумя или более молекулами CCL2 с образованием иммунного комплекса. Это возможно, поскольку CCL2 существует в виде гомодимера, содержащего две молекулы CCL2, тогда как антитело имеет два антигенсвязывающих сайта.

В целом, когда два или более антител образуют иммунный комплекс с двумя или более антигенами, получаемый в результате иммунный комплекс может сильно связываться с Fc-рецепторами на поверхности клеток благодаря эффектам авидности посредством Fc-областей антител в комплексе, а затем может поглощаться клеткой с большей эффективностью. Таким образом, вышеупомянутое антитело к CCL2, способное образовывать иммунный комплекс, содержащий два или более антител к CCL2 и две или более молекул CCL2, может приводить к быстрому клиренсу CCL2 из плазмы в живом организме за счет сильного связывания с Fc-рецепторами благодаря эффектам авидности.

Кроме того, считается, что антитело с рН-зависимыми характеристиками связывания, будет иметь превосходящие свойства в терминах нейтрализации и клиренса антигена по сравнению с антителом, которое связывается рН-независимым образом (Igawa et al., Nature Biotech. 28(11): 1203-1207 (2010); Devanaboyina et al. mAbs 5(6): 851-859 (2013); WO 2009/125825). Следовательно, ожидается, что антитело, имеющее оба вышеперечисленных свойства, то есть, антитело, которое имеет рН-зависимые характеристики связывания и которое образует иммунный комплекс, содержащий два или более антител, с двумя или более антигенами, будет иметь даже более превосходящие свойства в отношении сильного повышения элиминации антигенов из плазмы (WO 2013/081143).

В одном аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb, содержащие по меньшей мере два аминокислотных изменения, включающих: (а) изменение одной аминокислоты в позиции 236 и (б) изменение по меньшей мере одной аминокислоты в по меньшей мере одной позиции, выбранной из группы, состоящей из: 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 и 396 в соответствии с нумерацией EU.

В одном аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантную Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb, содержащую аминокислотное изменение в позиции 236 в соответствии с нумерацией EU.

В одном аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантную Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb, содержащую по меньшей мере два аминокислотных изменения, включающих: (а) изменение одной аминокислоты в позиции 236 и (б) изменение по меньшей мере одной аминокислоты в по меньшей мере одной позиции, выбранной из группы, состоящей из: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 и 396 в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область содержит аминокислотное изменение по меньшей мере в одной позиции, выбранной из группы, состоящей из: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 и 396 в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область содержит аминокислотное изменение по меньшей мере в одной позиции, выбранной из группы, состоящей из: 268, 295, 326 и 330 в соответствии с нумерацией EU.

В другом аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb, содержащие аминокислотные изменения по любому из следующих вариантов (1)-(37): (1) позиции 231, 236, 239, 268 и 330; (2) позиции 231, 236, 239, 268, 295 и 330; (3) позиции 231, 236, 268 и 330; (4) позиции 231, 236, 268, 295 и 330; (5) позиции 232, 236, 239, 268, 295 и 330; (6) позиции 232, 236, 268, 295 и 330; (7) позиции 232, 236, 268 и 330; (8) позиции 235, 236, 268, 295, 326 и 330; (9) позиции 235, 236, 268, 295 и 330; (10) позиции 235, 236, 268 и 330; (11) позиции 235, 236, 268, 330 и 396; (12) позиции 235, 236, 268 и 396; (13) позиции 236, 239, 268, 295, 298 и 330; (14) позиции 236, 239, 268, 295, 326 и 330; (15) позиции 236, 239, 268, 295 и 330; (16) позиции 236, 239, 268, 298 и 330; (17) позиции 236, 239, 268, 326 и 330; (18) позиции 236, 239, 268 и 330; (19) позиции 236, 239, 268, 330 и 396; (20) позиции 236, 239, 268 и 396; (21) позиции 236 и 268; (22) позиции 236, 268 и 295; (23) позиции 236, 268, 295, 298 и 330; (24) позиции 236, 268, 295, 326 и 330; (25) позиции 236, 268, 295, 326, 330 и 396; (26) позиции 236, 268, 295 и 330; (27) позиции 236, 268, 295, 330 и 396; (28) позиции 236, 268, 298 и 330; (29) позиции 236, 268, 298 и 396; (30) позиции 236, 268, 326 и 330; (31) позиции 236, 268, 326, 330 и 396; (32) позиции 236, 268 и 330; (33) позиции 236, 268, 330 и 396; (34) позиции 236, 268 и 396; (35) позиции 236 и 295; (36) позиции 236, 330 и 396; и (37) позиции 236 и 396 в соответствии с нумерацией EU.

В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr в позиции 231; (6) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr в позиции 232; (в) Asp в позиции 233; (г) Trp, Tyr в позиции 234; (д) Trp в позиции 235; (е) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val в позиции 236; (ж) Asp, Tyr в позиции 237; (и) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr в позиции 238; (к) Ile, Leu, Asn, Pro, Val в позиции 239; (л) Ile в позиции 264; (м) Phe в позиции 266; (н) Ala, His, Leu в позиции 267; (п) Asp, Glu в позиции 268; (р) Asp, Glu, Gly в позиции 271; (с) Leu в позиции 295; (т) Leu в позиции 298; (у) Glu, Phe, Ile, Leu в позиции 325; (ф) Thr в позиции 326; (х) Ile, Asn в позиции 327; (ц) Thr в позиции 328; (ш) Lys, Arg в позиции 330; (щ) Glu в позиции 331; (э) Asp в позиции 332; (ю) Asp, Ile, Met, Val, Tyr в позиции 334; и (я) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr в позиции 396; в соответствии с нумерацией EU.

В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит по меньшей мере одно аминокислотное изменение (например, замену), выбранное из группы, состоящей из: (а) Gly, Thr в позиции 231; (б) Asp в позиции 232; (в) Trp в позиции 235; (г) Asn, Thr в позиции 236; (д) Val в позиции 239; (е) Asp, Glu в позиции 268; (ж) Leu в позиции 295; (и) Leu в позиции 298; (к) Thr в позиции 326; (л) Lys, Arg в позиции 330; и (м) Lys, Met в позиции 396; в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит такие аминокислотные изменения (например, замены): Asn в позиции 236, Glu в позиции 268, Lys в позиции 330 и Met в позиции 396; в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит такие аминокислотные изменения (например, замены): Asn в позиции 236, Asp в позиции 268 и Lys в позиции 330; в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит такие аминокислотные изменения (например, замены): Asn в позиции 236, Asp в позиции 268, Leu в позиции 295 и Lys в позиции 330; в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит такие аминокислотные изменения (например, замены): Thr в позиции 236, Asp в позиции 268 и Lys в позиции 330; в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит такие аминокислотные изменения (например, замены): Asn в позиции 236, Asp в позиции 268, Leu в позиции 295, Thr в позиции 326 и Lys в позиции 330; в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления вариантная Fc-область с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb содержит такие аминокислотные изменения (например, замены): Trp в позиции 235, Asn в позиции 236, Asp в позиции 268, Leu в позиции 295, Thr в позиции 326 и Lys в позиции 330; в соответствии с нумерацией EU.

В другом аспекте в изобретении предложены выделенные полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной изоэлектрической точкой (pI). В определенных вариантах осуществления описанная в данном документе вариантная Fc-область содержит по меньшей мере два аминокислотных изменения в родительской Fc-области. В определенных вариантах осуществления каждое из аминокислотных изменений повышает изоэлектрическую точку (pI) вариантной Fc-области по сравнению с родительской Fc-областью. В их основе лежит открытие, что элиминацию антигена из плазмы можно стимулировать антителом, чья pI была повышена посредством модификации по меньшей мере двух аминокислотных остатков, например, когда антитело вводят in vivo.

В настоящем изобретении pI может быть как теоретически, так и экспериментально определенной pI. Значение pI можно определить, например, с помощью изоэлектрического фокусирования, известного специалистам в данной области техники. Теоретическое значение pI можно рассчитать, например, используя программное обеспечение для анализа генных и аминокислотных последовательностей (Genetyx и т.д.).

В одном варианте осуществления значение pI может быть повышено, например, по меньшей мере на 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 или более, по меньшей мере на 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или более, по меньшей мере на 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 или более или по меньшей мере на 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 3,0 или более по сравнению со значением до модификации.

В определенных вариантах осуществления аминокислота для повышения pI может находиться на поверхности вариантной Fc-области. В настоящем изобретении аминокислота, которая может находиться на поверхности, в общем случае относится к аминокислотному остатку, расположенному на поверхности полипептида, составляющего вариантную Fc-область. Аминокислотный остаток, расположенный на поверхности полипептида относится к аминокислотному остатку, чья боковая цепь может контактировать с молекулами растворителя (которые в общем случае преимущественно являются молекулами воды). При этом боковая цепь не обязательно должна полностью контактировать с молекулами растворителя, и даже когда часть боковой цепи контактирует с молекулами растворителя, аминокислоту определяют как «аминокислотный остаток, расположенный на поверхности». Аминокислотный остаток, расположенный на поверхности полипептида также включает аминокислотные остатки, расположенные близко к поверхности, и поэтому на его электрический заряд может влиять другой аминокислотный остаток, чья боковая цепь, даже частично, контактирует с молекулами растворителя. Специалисты в данной области техники могут создать гомологическую модель полипептида, например, используя коммерчески доступное программное обеспечение. В альтернативном варианте можно использовать методы, известные специалистам в данной области техники, такие как рентгеновская кристаллография. Аминокислотные остатки, которые могут находиться на поверхности, определяют, например, используя координаты из трехмерной модели, используя компьютерную программу, такую как программа InsightII (Accelrys). Находящиеся на поверхности сайты можно определять, используя алгоритмы, известные в данной области техники (например, Lee and Richards (J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)); Connolly (J. Appl. Cryst. 16:548-558 (1983)). Находящиеся на поверхности сайты можно определять, используя программное обеспечение, подходящее для белкового моделирования, и информацию о трехмерной структуре. Программное обеспечение, доступное для таких целей, включает, например, программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Когда алгоритм подразумевает введение пользователем параметра размера, «размер» зонда, который используют при расчетах, может быть установлен приблизительно на 1,4 ангстрема или менее в радиусе. Кроме того, методы для определения находящихся на поверхности областей с использованием программного обеспечения для персональных компьютеров, были описаны в Pacios (Comput. Chem. 18(4):377-386 (1994); J. Mol. Model. 1:46-53 (1995)). На основании информации, такой как описана выше, можно выбирать соответствующие аминокислотные остатки, расположенные на поверхности полипептида, который составляет вариантную Fc-область.

В определенных вариантах осуществления полипептид содержит как вариантную Fc-область, так и антигенсвязывающий домен. В дополнительных вариантах осуществления антиген представляет собой растворимый антиген. В одном варианте осуществления антиген находится в биологических жидкостях (например, плазме, интерстициальной жидкости, лимфатической жидкости, асцитной жидкости и плевральной жидкости) субъектов. Антиген также может представлять собой мембранный антиген.

В дополнительных вариантах осуществления антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена меняется в зависимости от условий концентрации ионов. В одном варианте осуществления концентрация ионов конкретным образом не ограничена и относится к концентрации ионов водорода (рН) или концентрации ионов металла. В данном документе ионы металла относятся к ионам элементов группы I за исключением водорода, таких как щелочные металлы и элементы группы меди, элементов группы II, таких как щелочноземельные металлы и элементы группы цинка, элементов группы III за исключением бора, элементов группы IV за исключением углерода и кремния, элементов группы VIII, таких как элементы группы железа и группы платины, элементов, принадлежащих к подгруппе А групп V, VI и VII, и элементов металлов, таких как сурьма, висмут и полоний. В настоящем изобретении ионы металла включают, например, ион кальция, как описано в WO 2012/073992 и WO 2013/125667. В одном варианте осуществления «условия концентрации ионов» могут представлять собой условия, которые сфокусированы на разнице в биологическом поведении антигенсвязывающего домена между низкой концентрацией ионов и высокой концентрацией ионов. Кроме того, выражение «антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена меняется в зависимости от условий концентрации ионов» означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена меняется между низкой концентрацией ионов и высокой концентрацией ионов (такой антигенсвязывающий домен называется в данном документе «зависимым от концентрации ионов антигенсвязывающим доменом»). Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена в условиях высокой концентрации ионов может быть выше (сильнее) или ниже (слабее), чем в условиях низкой концентрации ионов. В одном варианте осуществления зависимые от концентрации ионов антигенсвязывающие домены (такие как рН-зависимые антигенсвязывающие домены или зависимые от концентрации ионов кальция антигенсвязывающие домены) можно получать известными способами, например, описанными в WO 2009/125825, WO 2012/073992 и WO 2013/046722.

В настоящем изобретении антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена в условиях высокой концентрации ионов кальция может быть выше, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция. Высокая концентрация ионов кальция не ограничена конкретным образом, но может представлять собой концентрацию, выбранную между 100 мкМ и 10 мМ, между 200 мкМ и 5 мМ, между 400 мкМ и 3 мМ, между 200 мкМ и 2 мМ, между 400 мкМ и 1 мМ или между 500 мкМ и 2,5 мМ, что предпочтительно близко к концентрации ионов кальция в плазме (крови) in vivo. При этом низкая концентрация ионов кальция не ограничена конкретным образом, но может представлять собой концентрацию, выбранную между 0,1 мкМ и 30 мкМ, между 0,2 мкМ и 20 мкМ, между 0,5 мкМ и 10 мкМ, между 1 мкМ и 5 мкМ или между 2 мкМ и 4 мкМ, что предпочтительно близко к концентрации ионов кальция в ранних эндосомах in vivo.

В одном варианте осуществления отношение между антигенсвязывающей активностью в условиях низкой концентрации ионов кальция и условиях высокой концентрации ионов кальция не ограничено, но отношение константы диссоциации (KD) в условиях низкой концентрации ионов кальция к KD в условиях высокой концентрации ионов кальция, т.е. KD (условия низкой концентрации ионов кальция)/KO (условия высокой концентрации ионов кальция) составляет 2 или более, 10 или более или 40 или более. Верхний предел отношения может составлять 400, 1000 или 10000 при условии, что такой антигенсвязывающий домен можно получать методиками, известными специалистам в данной области техники. В альтернативном варианте, например, можно использовать константу скорости диссоциации (kd) вместо KD. В этом случае отношение kd в условиях низкой концентрации ионов кальция к kd в условиях высокой концентрации ионов кальция, т.е. kd (условия низкой концентрации ионов кальция)/kd (условия высокой концентрации ионов кальция) составляет 2 или более, 5 или более, 10 или более или 30 или более. Верхний предел отношения может составлять 50, 100 или 200 при условии, что антигенсвязывающий домен можно получать на основании общих технических знаний специалистов в данной области техники.

В настоящем изобретении антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена в условиях низкой концентрации ионов водорода (нейтральный рН) может быть выше, чем в условиях высокой концентрации ионов водорода (кислотный рН). Кислотный рН может представлять собой, например, рН, выбранный из от рН 4,0 до рН 6,5, выбранный из от рН 4,5 до рН 6,5, выбранный из от рН 5,0 до рН 6,5 или выбранный из от рН 5,5 до рН 6,5, что предпочтительно близко к in vivo рН в ранних эндосомах. Кислотный рН может также представлять собой рН 5,8 или рН 6,0. В конкретных вариантах осуществления кислотный рН составляет рН 5,8. При этом нейтральный рН может представлять собой, например, рН, выбранный из от рН 6,7 до рН 10,0, выбранный из от рН 6,7 до рН 9,5, выбранный из от рН 7,0 до рН 9,0 или выбранный из от рН 7,0 до рН 8,0, что предпочтительно близко к in vivo рН в плазме (крови). Нейтральный рН может также представлять собой рН 7,4 или рН 7,0. В конкретных вариантах осуществления нейтральный рН составляет рН 7,4.

В одном варианте осуществления отношение между антигенсвязывающей активностью в условиях кислотного рН и условиях нейтрального рН не ограничено, но отношение константы диссоциации (KD) в условиях кислотного рН к KD в условиях нейтрального рН, т.е. KD (условия кислотного pH)/KD (условия нейтрального рН) составляет 2 или более, 10 или более или 40 или более. Верхний предел отношения может составлять 400, 1000 или 10000 при условии, что такой антигенсвязывающий домен можно получать методиками, известными специалистам в данной области техники. В альтернативном варианте, например, можно использовать константу скорости диссоциации (kd) вместо KD. В этом случае отношение kd в условиях кислотного рН к kd в условиях нейтрального рН, т.е. kd (условия кислотного pH)/kd (условия нейтрального рН) составляет 2 или более, 5 или более, 10 или более или 30 или более. Верхний предел отношения может составлять 50, 100 или 200 при условии, что антигенсвязывающий домен можно получать на основании общих технических знаний специалистов в данной области техники.

В одном варианте осуществления, например, по меньшей мере один аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком с pKa боковой цепи 4,0 8,0 и/или по меньшей мере один аминокислотный остаток с pKa боковой цепи 4,0 8,0 вставлен в антигенсвязывающий домен, как описано в WO 2009/125825. Аминокислота может быть замещена и/или вставлена в любом участке при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена становится слабее в условиях кислотного рН, чем в условиях нейтрального рН по сравнению с активностью до проведения замены или вставки. Когда антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область или CDR, участок может находиться в пределах вариабельной области или CDR. Число аминокислотных остатков, которые замещены или вставлены, может быть соответствующим образом определено специалистами в данной области техники; и это число может составлять один или более. Аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 можно использовать для изменения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в зависимости от условий концентрации ионов водорода. Такие аминокислоты включают, например, природные аминокислоты, такие как His (Η) и Glu (Ε), и неприродные аминокислоты, такие как аналоги гистидина (US 2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21) и 3,5-12-Tyr (pKa 7,38) (Heyl et al., Bioorg. Med. Chem. 11(17):3761-3768 (2003)). Также можно использовать аминокислоты с pKa боковой цепи 6,0 7,0, которые включают, например, His (Η).

В другом варианте осуществления описаны предпочтительные антигенсвязывающие домены для вариантной Fc-области с повышенной pI, которые могут быть получены способами, описанными в WO 2016/125495 и WO 2017/046994.

В определенных вариантах осуществления вариантная Fc-область с повышенной pI содержит по меньшей мере два аминокислотных изменения по меньшей мере в двух позициях, выбранных из группы, состоящей из: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 и 431 в соответствии с нумерацией EU.

В дополнительных вариантах осуществления вариантная Fc-область с повышенной pI содержит по меньшей мере два аминокислотных изменения по меньшей мере в двух позициях, выбранных из группы, состоящей из: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402 и 413 в соответствии с нумерацией EU.

В другом аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной pI, содержащие аминокислотные изменения по любому из следующих вариантов (1) (10): (1) позиции 311 и 341; (2) позиции 311 и 343; (3) позиции 311, 343 и 413; (4) позиции 311, 384 и 413; (5) позиции 311 и 399; (6) позиции 311 и 401; (7) позиции 311 и 413; (8) позиции 400 и 413; (9) позиции 401 и 413; и (10) позиции 402 и 413; в соответствии с нумерацией EU.

В одном аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb и повышенной pI, содержащие по меньшей мере три аминокислотных изменения, включающих: (а) изменение по меньшей мере одной аминокислоты в по меньшей мере одной позиции, выбранной из группы, состоящей из: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 и 396 в соответствии с нумерацией EU, и (б) изменения по меньшей мере двух аминокислот в по меньшей мере двух позициях, выбранных из группы, состоящей из: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 и 431 в соответствии с нумерацией EU.

В одном аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb и повышенной pI, и которые содержат по меньшей мере три аминокислотных изменения, включающих: (а) изменение по меньшей мере одной аминокислоты в по меньшей мере одной позиции, выбранной из группы, состоящей из: 231, 232, 235, 236, 239, 268, 295, 298, 326, 330 и 396 в соответствии с нумерацией EU, и (б) изменения по меньшей мере двух аминокислот в по меньшей мере двух позициях, выбранных из группы, состоящей из: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402 и 413 в соответствии с нумерацией EU.

В другом аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb и повышенной pI, содержащие аминокислотные изменения по любому из следующих вариантов (1) (9): (1) позиции 235, 236, 268, 295, 311, 326, 330 и 343; (2) позиции 236, 268, 295, 311, 326, 330 и 343; (3) позиции 236, 268, 295, 311, 330 и 413; (4) позиции 236, 268, 311, 330, 396 и 399; (5) позиции 236, 268, 311, 330 и 343; (6) позиции 236, 268, 311, 330, 343 и 413; (7) позиции 236, 268, 311, 330, 384 и 413; (8) позиции 236, 268, 311, 330 и 413; и (9) позиции 236, 268, 330, 396, 400 и 413; в соответствии с нумерацией EU.

В одном аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb и повышенной pI, содержащие по меньшей мере три аминокислотных изменения, включающих: (а) изменение по меньшей мере одной аминокислоты в по меньшей мере одной позиции, выбранной из группы, состоящей из: 234, 238, 250, 264, 267, 307 и 330, и (б) изменения по меньшей мере двух аминокислот в по меньшей мере двух позициях, выбранных из группы, состоящей из: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 и 431 в соответствии с нумерацией EU. В дополнительных вариантах осуществления полипептиды содержат по меньшей мере два аминокислотных изменения по меньшей мере в двух позициях, выбранных из группы, состоящей из: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402 и 413 в соответствии с нумерацией EU.

В другом аспекте в изобретении предложены полипептиды, содержащие вариантные Fc-области с повышенной активностью связывания FcgammaRIIb и повышенной pI, содержащие аминокислотные изменения по любому из следующих вариантов (1)-(16): (1) позиции 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 и 343; (2) позиции 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 и 413; (3) позиции 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 и 343; (4) позиции 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 и 413; (5) позиции 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 и 343; (6) позиции 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 и 413; (7) позиции 234, 238, 250, 307, 311, 330 и 343; (8) позиции 234, 238, 250, 307, 311, 330 и 413; (9) позиции 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 и 343; (10) позиции 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 и 413; (11) позиции 238, 250, 264, 307, 311, 330 и 343; (12) позиции 238, 250, 264, 307, 311, 330 и 413; (13) позиции 238, 250, 267, 307, 311, 330 и 343; (14) позиции 238, 250, 267, 307, 311, 330 и 413; (15) позиции 238, 250, 307, 311, 330 и 343; и (16) позиции 238, 250, 307, 311, 330 и 413; в соответствии с нумерацией EU.

Кроме того, аминокислотные изменения, проводимые в других целях, можно комбинировать в описанной в данном документе вариантной Fc-области. Например, можно добавлять аминокислотные замены, которые улучшают активность связывания FcRn (Hinton et al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2): 157-159 (2010); WO 2006/019447; WO 2006/053301; и WO 2009/086320), и аминокислотные замены для улучшения гетерогенности или стабильности антитела (WO 2009/041613). В альтернативном варианте полипептиды со свойством стимуляции клиренса антигена, которые описаны в WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 или WO 2013/180201, полипептиды со свойством специфического связывания с целевой тканью, которые описаны в WO 2013/180200, полипептиды со свойством повторного связывания со множеством молекул антигенов, которые описаны в WO 2009/125825, WO 2012/073992 или WO 2013/047752, можно комбинировать с описанной в данном документе вариантной Fc-областью. В альтернативном варианте с целью придания способности к связыванию с другими антигенами аминокислотные изменения, описанные в ЕР1752471 и ЕР1772465, можно комбинировать в СН3 описанной в данном документе вариантной Fc-области. В альтернативном варианте с целью продления удержания в плазме аминокислотные изменения, которые снижают pI константной области (WO 2012/016227) можно комбинировать в описанной в данном документе вариантной Fc-области. В альтернативном варианте с целью стимуляции поглощения клетками аминокислотные изменения, которые повышают pI константной области (WO 2014/145159) можно комбинировать в описанной в данном документе вариантной Fc-области. В альтернативном варианте с целью стимуляции элиминации целевой молекулы из плазмы аминокислотные изменения, которые повышают pI константной области (WO 2016/125495) можно комбинировать в описанной в данном документе вариантной Fc-области. В одном варианте осуществления такое изменение может включать, например, замену в по меньшей мере одной позиции, выбранной из группы, состоящей из 311, 343, 384, 399, 400 и 413 в соответствии с нумерацией EU. В дополнительном варианте осуществления такая замена может представлять собой замещение аминокислоты Lys или Arg в каждой позиции.

Аминокислотные изменения для повышения активности связывания FcRn человека при кислотном рН также можно комбинировать в описанной в данном документе вариантной Fc-области. В частности, такие изменения могут включать, например, замену Leu на Met в позиции 428 и замену Ser на Asn в позиции 434 в соответствии с нумерацией EU (Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010)); замену Ala на Asn в позиции 434 (Deng et al., Metab. Dispos. 38(4):600-605 (2010)); замену Tyr на Met в позиции 252, замену Thr на Ser в позиции 254 и замену Glu на Thr в позиции 256 (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006)); замену Gin на Thr в позиции 250 и замену Leu на Met в позиции 428 (Hinton et al., J. Immunol. 176(l):346-356 (2006)); замену His на Asn в позиции 434 (Zheng et al., Clin. Pharmacol. Ther. 89(2):283-290 (2011), и изменения, описанные в WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752 или WO 2002/060919. Такие изменения могут включать, например, по меньшей мере одно изменение, выбранное из группы, состоящей из замены Leu на Met в позиции 428, замены Ala на Asn в позиции 434 и замены Thr на Tyr в позиции 436. Такие изменения могут дополнительно включать замену Arg на Gln в позиции 438 и/или замену Glu на Ser в позиции 440 (WO 2016/125495).

Типовые биспецифические антитела к CCL2

В одном варианте осуществления изобретения представлено биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй отличный антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

A) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46;

или

Б) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (e) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

или

В) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

или

Г) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (6) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43;

и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46;

или

Д) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46;

или

Ε) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, и (e) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46;

или

Ж) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

или

И) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30;

или

К) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека дикого типа (или его Fc-домен), превышает по меньшей мере в два раза (в одном варианте осуществления превышает по меньшей мере в 5 раз, в одном варианте осуществления превышает по меньшей мере в 10 раз, в одном варианте осуществления превышает по меньшей мере в 20 раз) скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека (или его Fc-домен) с сайленсингом Fc-гамма-рецептора, содержащий мутации L234A, L235A, P329G, когда предварительно сформированный иммунный комплекс, состоящий из 20 мг/кг каждого биспецифического антитела и 0,1 мг/кг CCL2 человека, вводили в однократной дозе 10 мл/кг FcRn-трансгенным мышам.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт связывается с тем же эпитопом на CCL2, что и антитело, содержащее домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (e) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт связывается с тем же эпитопом на CCL2, что и антитело, содержащее домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека дикого типа (или его Fc-домен), превышает по меньшей мере в 15 раз, в частности превышает по меньшей мере в 20 раз скорость клиренса in vivo для CCL2 человека (мл/день/кг) после введения биспецифического антитела, содержащего константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека (или его Fc-домен) с сайленсингом Fc-гамма-рецептора, содержащий мутации L234A, L235A, P329G, когда предварительно сформированный иммунный комплекс, состоящий из 20 мг/кг каждого биспецифического антитела и 0,1 мг/кг CCL2 человека, вводили в однократной дозе 10 мл/кг FcRn-трансгенным мышам.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X1 представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59;

и

домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX1EDIYNRX2A из SEQ ID NO: 79, где X1 представляет собой F или Τ и X представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X1 представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59, (г) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF из SEQ ID NO: 63, (д) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGQGLEWMG из SEQ ID NO: 64, (е) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR из SEQ ID NO: 65, и (ж) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS из SEQ ID NO:66;

и

домен VL, содержащий (и) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (к) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (л) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62, (м) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC из SEQ ID NO: 67, (н) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGQAPRLLIY из SEQ ID NO: 68, (п) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC из SEQ ID NO:69, и (р) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность GQGTKVEIK из SEQ ID NO: 70; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е, (г) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGLTIS из SEQ ID NO: 82, (д) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGQGLEWMG из SEQ ID NO: 83, (е) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR из SEQ ID NO: 84, и (ж) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTTVTVSS из SEQ ID NO:85;

и

домен VL, содержащий (и) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (к) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, (л) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R, (м) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC из SEQ ID NO: 86, (н) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIH из SEQ ID ΝΟ: 87, (п) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC из SEQ ID NO: 88, и (р) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGGGTKVEIK из SEQ ID NO: 89.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

A) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Б) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

В) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Г) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Д) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Ε) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Ж) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

И) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

К) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Л) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Μ) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Η) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Π) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94;

или

Ρ) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

С) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

или

Τ) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94.

В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека,

причем

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека. В одном варианте осуществления изобретения (выделенное) биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается с первым эпитопом на CCL2 человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который (специфически) связывается со вторым отличным эпитопом на CCL2 человека, причем

A) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность

GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, X² представляет собой Ρ и X³ представляет собой Н, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F и X² представляет собой R, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W; или

Б) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, X² представляет собой Ρ и X представляет собой Н, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F и X² представляет собой R, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W; или

В) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO:78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Г) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X3 представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Д) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X1 представляет собой F или Τ и X представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Е) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, Χ² представляет собой Ρ или Η и Χ³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO:78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Ж) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

И) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

К) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Л) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO:78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

М) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Н) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

П) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Τ, (6) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R;

или

Ρ) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

С) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R; или

Т) i) указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SHYGXS из SEQ ID NO: 57, где X представляет собой I или Т, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GX¹IX²IFX³TANYAQKFQG из SEQ ID NO: 58, где X¹ представляет собой V, I или Η, X² представляет собой Ρ или Η и X³ представляет собой Η или G, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность YDAHYGELDF из SEQ ID NO: 59; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 75, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQHVSDAYLA из SEQ ID NO: 60; (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность DASDRAE из SEQ ID NO: 61, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность HQYIHLHSFT из SEQ ID NO: 62; и

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит последовательность домена VH, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, причем домен VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность HTYMH из SEQ ID NO: 76, (6) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RIDPXNHNTKFDPKFQG из SEQ ID NO: 77, где X представляет собой D или Е, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVFGFFXH из SEQ ID NO: 78, где X представляет собой D или Е; и последовательность домена VL, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93, причем домен VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность KAX¹EDIYNRX²A из SEQ ID NO: 79, где X¹ представляет собой F или Τ и X² представляет собой R или L, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GATSLEH из SEQ ID NO: 80, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQFXSAPYT из SEQ ID NO: 81, где X представляет собой W или R.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело

i) блокирует связывание CCL2 с его рецептором CCR2 in vitro (анализ репортерного гена, IC₅₀=0,5 нМ); и/или

ii) ингибирует CCL2-опосредованный хемотаксис миелоидных клеток in vitro (IC₅₀=1,5 нМ); и/или

iii) является перекрестно-реагирующим с CCL2 яванского макака и человека.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело не является перекрестно-реагирующим с другими гомологами CCL человека, в частности оно демонстрирует в 100 раз меньшее связывание с другими гомологами CCL (выбранными из группы из CCL8, CCL7 и CCL13) по сравнению со связыванием с CCL2.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело связывается с первым и вторым эпитопом на CCL2 человека ион-зависимым образом.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело связывается с CCL2 человека рН-зависимым образом и при этом как первый антигенсвязывающий сайт, так и второй антигенсвязывающий сайт связываются с CCL2 с большей аффинностью при нейтральном рН, чем при кислотном рН.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело связывается с CCL2 человека с аффинностью, в 10 раз большей при рН 7,4, чем при рН 5,8.

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит два константных домена тяжелой цепи IgG1 (или их Fc-домен), содержащих (независимо от описанных выше мутаций или в дополнение к ним) следующие мутации (нумерация EU по Kabat)

i) S354C и T366W в одном из константных доменов тяжелой цепи,

ii) Y349C, T366S, L368A, Y407V в другом из константных доменов тяжелой цепи.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 человека.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи изотипа IgG1 человека. В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 человека (или его Fc-домен), содержащий одну или более из следующих мутаций (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и/или

ii) L234Y, L235W, G236N, P238D, T250V, V264I, H268D, Q295L, Т307Р, К326Т и/или А330К (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и/или

iii) M428L, N434A и/или Y436T (подходят для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и/или

iv) Q438R и/или S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 человека (или его Fc-домен), содержащий одну или более из следующих мутаций (нумерация EU по Kabat)

i) Q311R и/или P343R (подходят для увеличения pI для повышения поглощения антигена); и/или

ii) L235W, G236N, H268D, Q295L, K326T и/или A330K (подходят для повышения аффинности к FcgRIIb человека и снижения аффинности к другим FcgR человека); и/или

iii) N434A (подходит для повышения аффинности к FcRn для продления плазменного времени полужизни); и/или

iv) Q438R и/или S440E (подходят для супрессии связывания ревматоидного фактора).

В одном варианте осуществления описанное в данном документе биспецифическое антитело содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 человека (или его Fc-домен), содержащий следующие мутации (нумерация EU по Kabat)