ОЧИСТКА САХАРИДОВ Российский патент 2024 года по МПК C08B37/00 C12P19/04 

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Эта заявка подана в электронном виде по сети EFS и включает представленный в электронном виде список последовательностей в формате.txt. Файл.txt содержит список последовательностей под названием "PC72592_ST25.txt", созданный 29 января 2021 года и имеющий размер 34 КБ. Список последовательностей, содержащийся в этом файле.txt, является частью описания и включен в настоящий документ посредством отсылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам очистки бактериальных полисахаридов, в частности, удаления примесей из клеточных лизатов бактерий, продуцирующих полисахариды.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бактериальные полисахариды, в частности капсульные полисахариды, являются важными иммуногенами, обнаруженными на поверхности бактерий, вовлеченных в различные бактериальные заболевания. Это привело к тому, что они являются важным компонентом при разработке вакцин. Они оказались полезными при индукции иммунных ответов, особенно когда они связаны с белками-носителями.

Бактериальные полисахариды, как правило, образуются в процессе ферментации бактерий (например, стрептококков (например, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae или стрептококков группы C и G), стафилококков (например, Staphylococcus aureus), гемофилов (например, Haemophilus influenzae), нейссерий (например, Neisseria meningitidis), эшерихий (например, Escherichia coli) и клебсиелл (например, Klebsiella pneumoniae).

Как правило, бактериальные полисахариды получают с использованием периодического процесса культивирования в комплексной среде, периодического процесса культивирования с подпиткой или непрерывного процесса культивирования.

Существует потребность в надежных и эффективных процессах очистки, которые могут применяться в крупномасштабном производстве бактериальных полисахаридов после ферментации.

Также существует потребность в упрощенном способе очистки для снижения содержания растворимого белка в бактериальных лизатах и устранения неэффективности существующего способа очистки с получением по существу очищенных бактериальных сахаридов, подходящих для включения в вакцины.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложен способ очистки бактериального сахарида из раствора, включающего указанный сахарид и примеси после ферментации, где указанный способ включает следующие стадии: (a) кислотный гидролиз; (b) первую ультрафильтрацию/диафильтрацию (UFDF-1); (b) фильтрацию через активированный уголь; (c) хроматографию; и (d) вторую ультрафильтрацию/диафильтрацию (UFDF-2). В одном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию флокуляции после кислотного гидролиза в стадии (a).

В другом варианте осуществления вышеуказанных способов, бактерии являются грамоположительными бактериями. В одном аспекте бактерии являются любой из Streptococcus, Staphylococcus, Enterococci, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix или Clostridium. В другом аспекте бактерии являются любой из Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, стрептококков группы C и G или Staphylococcus aureus.

В другом варианте осуществления вышеуказанных методов бактерии являются грамотрицательными бактериями. В одном аспекте бактерии являются любой из Haemophilus, Neisseria, Escherichia или Klebsiella. В другом аспекте бактерии являются Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Escherichia coli или Klebsiella pneumoniae.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ. 1 показаны хроматограммы эВЭЖХ для K_p O-Ag после высвобождения в питательной среде (сверху) и очищенного K_p O-Ag (снизу) для варианта O1V1.

На ФИГ. 2 показаны хроматограммы эВЭЖХ для K_p O-Ag после высвобождения в питательной среде (сверху) и очищенного K_p O-Ag (снизу) для варианта O1V2.

На ФИГ. 3 показаны хроматограммы эВЭЖХ для K_p O-Ag после высвобождения в питательной среде (сверху) и очищенного K_p O-Ag (снизу) для варианта O2V1.

На ФИГ. 4 показаны хроматограммы эВЭЖХ для K_p O-Ag после высвобождения в питательной среде (сверху) и очищенного K_p O-Ag (снизу) для варианта O2V2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В данном изобретении предложен способ очистки сахарида бактериального происхождения из раствора, включающего указанный сахарид и примеси, после ферментации, где указанный способ включает следующие стадии: (a) кислотный гидролиз; (b) первую ультрафильтрацию/диафильтрацию (UFDF-1); (b) фильтрацию через активированный уголь; (c) хроматографию; и (d) вторую ультрафильтрацию/диафильтрацию (UFDF-2).

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию флокуляции после кислотного гидролиза в стадии (a).

В другом варианте осуществления вышеуказанных способов стадия хроматография (c) включает ионообменную (IEX) мембранную хроматографию и/или хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC).

В другом варианте осуществления вышеуказанных способов бактерия является грамоположительной бактерией. В одном аспекте бактерия являются любой из Streptococcus, Staphylococcus, Enterococci, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix или Clostridium. В другом аспекте бактерия является любой из Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, стрептококков группы C и G или Staphylococcus aureus.

В другом варианте осуществления вышеуказанных способов бактерии являются грамотрицательными бактериями. В одном аспекте бактерии являются любой из Haemophilus, Neisseria, Escherichia или Klebsiella. В другом аспекте бактерия является Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Escherichia coli или Klebsiella pneumoniae.

В другом аспекте бактерией является Escherichia coli, включающая сахарид, имеющий структуру, выбранную из любой из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D1, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 or Формулы O187.

В еще одном аспекте бактерией является Klebsiella pneumoniae, включающая сахарид, имеющий структуру, выбранную из любой из Формулы K.O1.1, Формулы K.O1.2, Формулы K.O1.3, Формулы K.O1.4, Формулы K.O2.1, Формулы K.O2.2, Формулы K.O2.3, Формулы K.O2.4, Формулы K.O3, Формулы K.O4, Формулы K.O5, Формулы K.O7, Формулы K.O12 или Формулы K.O8.

1. Процесс очистки бактериальных полисахаридов

1.1 Исходный материал

Способы согласно изобретению могут применяться для очистки бактериальных полисахаридов из раствора, включающего указанные полисахариды вместе с примесями.

1.1.1. Бактериальные клетки

Источниками подлежащего очистке бактериального полисахарида согласно данному изобретению являются бактериальные клетки, в частности, патогенные бактерии.

Неограничивающими примерами грамположительных бактерий для применения согласно данному изобретению являются стрептококк (например, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae или стрептококк группы C и G), стафилококк (например, Staphylococcus aureus), энтерококки, бациллы, коринебактерии, листерии, эризипелотрикс и клостридия. Неограничивающие примеры грамотрицательных бактерий для применения с настоящим изобретением включают Haemophilus (например, Haemophilus influenzae), Neisseria (например, Neisseria meningitidis), Escherichia (например, Escherichia coli) и Klebsiella (например, Klebsiella pneumoniae).

В варианте осуществления источник бактериальных полисахаридов для применения согласно данному изобретению выбран из группы, состоящей из Aeromonas hydrophila и других видов (spp.); Bacillus anthracis; Bacillus cereus; продуцирующих ботулинический нейротоксин видов Clostridium; Brucella abortus; Brucella melitensis; Brucella suis; Burkholderia mallei (ранее Pseudomonas mallei); Burkholderia pseudomallei (ранее Pseudomonas pseudomallei); Campylobacter jejuni; Chlamydia psittaci; Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum; Clostridium dificile; Clostridium perfringens; Coccidioides immitis; Coccidioides posadasii; Cowdria ruminantium (инфекционный гидроперикардит); Coxiella burnetii; Enterococcus faecalis; группы энтеровирулентных Escherichia coli (группа EEC) таких как Escherichia coli - энтеротоксигенная (ETEC), Escherichia coli - энтеропатогенная (EPEC), Escherichia coli - O157:H7 энтерогеморрагическая (EHEC) и Escherichia coli - энтероинвазивная (EIEC); Ehrlichia spp., такой как Ehrlichia chajfeensis; Francisella tularensis; Legionella pneumophilia; Liberobacter africanus; Liberobacter asiaticus; Listeria monocytogenes; прочих кишечных микроорганизмов, таких как Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Citrobacter, Aerobacter, Providencia и Serratia; Mycobacterium bovis; Mycobacterium tuberculosis; Mycoplasma capricolum; Mycoplasma mycoides ssp mycoides; Peronosclerospora philippinensis; Phakopsora pachyrhizi; Plesiomonas shigelloides; Ralstonia solanacearum расы 3, биотипа 2; Rickettsia prowazekii; Rickettsia rickettsii; Salmonella spp.; Schlerophthora rayssiae var zeae; Shigella spp.; Staphylococcus aureus; Streptococcus; Synchytrium endobioticum; Vibrio cholerae не O1; Vibrio cholerae O1; Vibrio parahaemolyticus и других вибрионов; Vibrio vulnificus; Xanthomonas oryzae; Xylella fastidiosa (штамма, вызывающего пестрый хлороз цитрусовых); Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis; и Yersinia pestis.

Полисахарид, требуемый для очистки, может быть ассоциирован с клеточным компонентом, таким как клеточная оболочка. Ассоциация с клеточной оболочкой подразумевает, что полисахарид является компонентом самой клеточной оболочки, и/или присоединен к клеточной оболочке, напрямую или ненапрямую, через молекулы посредники, или является временным покрытием клеточной оболочки (например, некоторые бактериальные штаммы выделяют капсульные полисахариды, также известные в искусстве как 'экзополисахариды').

В некоторых вариантах осуществления полисахарид, выделенный из бактерий, представляет собой капсульный полисахарид, субкапсульный полисахарид или липополисахарид. В предпочтительном варианте осуществления полисахарид является капсульным полисахаридом.

В одном варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является Escherichia coli. В другом варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является Escherichia coli, входящая в группу (группу EEC Group) энтеровирулентных Escherichia coli, такая как Escherichia coli - энтеротоксигенная (ETEC), Escherichia coli - энтеропатогенная (EPEC), Escherichia coli - O157:H7 энтерогеморрагическая (EHEC) или Escherichia coli - энтероинвазивная (EIEC). В одном варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является уропатогенная Escherichia coli (UPEC).

В другом варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli, выбранный из группы, состоящей из серотипов O157:H7, O26:H11, O111:H- и O103:H2. В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli, выбранный из группы, состоящей из серотипов O6:K2:H1 и O18:K1:H7. В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli, выбранный из группы, состоящей из серотипов O45:K1, O17:K52:H18, O19:H34 и O7:K1. В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli O104:H4. В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli O1:K12:H7. В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli O127:H6. В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli O139:H28. В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является серотип Escherichia coli O128:H2.

В другом варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является Neisseria meningitidis. В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является N. meningitidis серогруппы A (MenA), N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), N. meningitidis серогруппы Y (MenY), N. meningitidis серогруппы X (MenX) или N. meningitidis серогруппы C (MenC). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является N. meningitidis серогруппы A (MenA). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является N. meningitidis серогруппы Y (MenY). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является N. meningitidis серогруппы C (MenC). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является N. meningitidis серогруппы X (MenX).

В дальнейшем варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является Klebsiella pneumoniae. В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O1 (O1), K. pneumoniae серогруппы O2 (O2), K. pneumoniae серогруппы O2ac (O2ac), K. pneumoniae серогруппы O3 (O3), K. pneumoniae серогруппы O4 (O4), K. pneumoniae серогруппы O5 (O5), K. pneumoniae серогруппы O7 (O7), K. pneumoniae серогруппы O8 (O8) или K. pneumoniae серогруппы O9 (O9). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O1 (O1). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O2 (O2). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O2ac (O2ac). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O3 (O3). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O4 (O4). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O5 (O5). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O7 (O7). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O8 (O8). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O9 (O9).

1.1.2. Рост бактериальных клеток

Как правило, полисахариды получают путем выращивания бактерий в среде (например, твердой или предпочтительно жидкой среде). Затем полисахариды получают при обработке бактериальных клеток.

Таким образом, в варианте осуществления исходный материал для способов согласно настоящему изобретению является бактериальной культурой и предпочтительно жидкой бактериальной культурой (например, средой культивирования).

Бактериальную культуру, как правило, получают путем периодического культивирования, периодического культивирования с подпиткой или непрерывного культивирования (см., например, WO 2007/052168 или WO 2009/081276). В ходе непрерывного культивирования свежую среду добавляют к культуре с постоянной скоростью, при этом клетки и среду удаляют со скоростью, которая позволяет поддерживать постоянный объем культуры.

Популяцию организма часто масштабируют с инокуляционного флакона до инокуляционных колб и пропускают через один или более инокуляционных ферментеров возрастающего объема, пока не будут достигнуты объемы ферментации промышленных масштабов.

1.1.3 Предварительная обработка бактериальных клеток для получения исходного материала

Как правило, небольшое количество полисахарида высвобождается в культуральную среду во время роста бактерий, поэтому исходным материалом может быть супернатант центрифугированной бактериальной культуры. Впрочем, исходный материал обычно получают при обработке самих бактерий, в результате которой высвобождается полисахарид.

Необязательно после роста клеток бактериальные клетки дезактивируют. Особенно это касается использования патогенных бактерий. Подходящим методом дезактивации является, например, обработка смесью фенола:этанола, например, как описано в Fattomet al. (1990) Infect lmmun. 58(7):2367-74. В представленных ниже вариантах осуществления бактериальные клетки могут быть предварительно дезактивированы или не дезактивированы.

Полисахариды могут высвобождать из бактерий различными способами, включая химическую, физическую или ферментативную обработку (см., например, WO 2010151544, WO 2011/051917 или WO 2007084856).

В одном варианте осуществления бактериальные клетки (дезактивированные или недезактивированные) обрабатывают в суспензии в их исходной культуральной среде. Таким образом, процесс могут начинать с клеток в суспензии в их исходной культуральной среде.

В другом варианте осуществления бактериальные клетки центрифугируют перед высвобождением капсульного полисахарида. Таким образом, процесс могут начинать с клеток в форме влажной клеточной пасты. В альтернативе клетки обрабатывают в высушенной форме. Впрчем, после центрифугирования бактериальные клетки, как правило, ресуспендируют в водной среде, которая подходит для следующей стадии процесса, например, в буфере или в дистиллированной воде. Клетки можно промывать этой средой перед ресуспендированием.

В одном варианте осуществления бактериальные клетки (например, в виде суспензии в исходной культуральной среде, в виде влажной клеточной пасты, в высушенном виде или ресуспендированные в водной среде после центрифугирования) обрабатывают литическим средством. "Литическое средство" представляет собой любое средство, которое способствует разрушению клеточной стенки. В одном варианте осуществления литическим средством является детергент. При использовании в настоящем документе термин "детергент" относится к любому анионному или катионному детергенту, способному вызывать лизис бактериальных клеток. Репрезентативные примеры таких детергентов для применения в способах согласно настоящему изобретению включают дезоксихолат натрия (DOC), N-лаурилсаркозин (NLS), натриевую соль хенодезоксихолевой кислоты и сапонины (см. WO 2008/118752, со стр. 13, строку 14 по стр. 14, строку 10). В одном варианте осуществления настоящего изобретения литическое средство, используемое для лизиса бактериальных клеток, представляет собой DOC.

В одном варианте осуществления литическое средство представляет собой литическое средство неживотного происхождения. В одном варианте осуществления литическое средство неживотного происхождения выбрано из группы, состоящей из декансульфоновой кислоты, трет-октилфенокси-5-поли(оксиэтилен)этанолов (например, IGEPAL CA-630, номер CAS: 9002-93-1, который можно приобрести у Sigma Aldrich, St. Louis, MO), продукты конденсации октилфенол-этиленоксида (например, TRITON X-100, который можно приобрести у Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-лаурилсаркозин натрия (NLS), лаурилиминодипропионат, додецилсульфат натрия, хенодезоксихолат, гиодезоксихолат, гликодезоксихолат, тауродезоксихолат, таурохенодезоксихолат и холат. В одном варианте осуществления литическим средством неживотного происхождения является NLS.

В одном варианте осуществления бактериальные клетки (например, в суспензии в исходной культуральной среде, в форме влажной клеточной пасты, в высушенной форме или ресуспендированные в водной среде после центрифугирования) обрабатывают ферментами, в результате чего высвобождается полисахарид. В одном варианте осуществления бактериальные клетки обрабатывают ферментом, выбранным из группы, состоящей из лизостафина, мутанолизина β-N-ацетилглюкозаминидазы и комбинации мутанолизина и β-N-ацетилглюкозаминидазы. Они воздействуют на бактериальный пептидогликан, что вызывает высвобождение капсульного сахарида для применения в изобретении, но также приводят к высвобождению группоспецифического углеводного антигена. В одном варианте осуществления бактериальные клетки обрабатывают фосфодиэстеразой II типа (PDE2).

Необязательно после высвобождения полисахарида фермент(ы) дезактивируют. Подходящим способо дезактивации является, например, термическая обработка или кислотная обработка.

В одном варианте осуществления бактериальные клетки (например, в виде суспензии в исходной культуральной среде, в виде влажной клеточной пасты, в высушенном виде или ресуспендированные в водной среде после центрифугирования) автоклавируют, в результате чего высвобождается полисахарид.

В другом варианте осуществления бактериальные клетки (например, в виде суспензии в исходной культуральной среде, в виде влажной клеточной пасты, в высушенном виде или ресуспендированные в водной среде после центрифугирования) подвергают химической обработке, в результате чего высвобождается полисахарид. В таком варианте осуществления химическая обработка может быть, например, гидролизом с использованием основания или кислоты (см., например, WO 2007084856).

В одном варианте осуществления химическая обработка бактериальных клеток представляет собой экстракцию основанием (например, с использованием гидроксида натрия). Экстракция основанием может вызывать расщепление фосфодиэфирной связи между капсульным сахаридом и пептидогликановым скелетом. В одном варианте осуществления основание выбрано из группы, состоящей из NaOH, KOH, LiOH, NaHCO₃, Na₂CO₃, K₂CO₃, KCN, Et₃N, NH₃, HzN2H2, NaH, NaOMe, NaOEt и KOtBu. После обработки основанием реакционная смесь может быть нейтрализована. Это может быть выполнено путем добавления кислоты. В одном варианте осуществления после обработки основанием реакционную смесь нейтрализуют кислотой, выбранной из группы, состоящей из HCl, H₃PO₄, лимонной кислоты, уксусной кислоты, азотистой кислоты и серной кислоты.

В одном варианте осуществления химическая обработка бактериальных клеток представляет собой обработку кислотой (например, серной кислотой). В одном варианте осуществления кислота выбрана из группы, состоящей из HCl, H₃PO₄, лимонной кислоты, уксусной кислоты, азотистой кислоты и серной кислоты. После обработки кислотой реакционная смесь может быть нейтрализована. Это может быть выполнено путем добавления основания. В одном варианте осуществления после обработки кислотой реакционную смесь нейтрализуют основанием, выбранным из группы, состоящей из NaOH, KOH, LiOH, NaHCO₃, Na₂CO₃, K₂CO₃, KCN, Et₃N, NH₃, HzN2H2, NaH, NaOMe, NaOEt и KOtBu.

1.2 Флокуляция

Способы согласно изобретению включают стадию флокуляции. Авторы изобретения обнаружили, что способ быстрый и простой и приводит к очищенному полисахариду с низким содержанием нежелательных примесей.

Таким образом, в способе согласно изобретению раствор, полученный любым из способов из раздела 1.1 выше, обрабатывают с помощью флокуляции.

В настоящем изобретении термин "флокуляция" относится к процессу, в котором коллоиды выпадают из суспензии в форме осадка или хлопьев в результате добавления флоккулянта.

Стадия флокуляции включает добавление "флокулянта" в раствор, включающий бактериальные полисахариды вместе с нежелательными примесями. В одном варианте осуществления нежелательные примеси включают остатки бактериальных клеток, белки и нуклеиновые кислоты бактериальных клеток. В одном варианте осуществления нежелательные примеси включают белки и нуклеиновые кислоты бактериальных клеток.

Как будет дополнительно раскрыто ниже, стадия флокуляции может дополнительно включать регуляцию рН до или после добавления флокулянта. В частности, раствор может быть подкислен.

Кроме того, добавление флокулянта и/или регуляцию рН можно проводить при температуре, установленной на требуемом уровне.

Следующие стадии могут выполняться в любом порядке:

- добавление флокулянта с последующей регуляцией pH с последующей регуляцией температуры или;

- добавление флокулянта с последующей регуляцией температуры с последующей регуляцией pH или;

- регуляция pH с последующим добавлением флокулянта с последующей регуляцией температуры или;

- регуляция pH с последующей регуляцией температуры с последующим добавлением флокулянта или;

- регуляция температуры с последующим добавлением флокулянта с последующей регуляцией pH или;

- регуляция температуры с последующей регуляцией pH с последующим добавлением флокулянта.

Кроме того, после добавления флокулянта и/или регуляции pH раствор можно выдерживать в течение некоторого времени, чтобы обеспечить осаждение хлопьев перед последующей обработкой.

В настоящем изобретении "флокулянт" относится к средству, способному обеспечивать или вызывать флокуляцию в растворе, содержащем представляющий интерес полисахарид вместе с нежелательными примесями, в результате агрегации коллоидов и других взвешенных частиц в форме осадка или хлопьев, тогда как представляющий интерес полисахарид остается в растворе.

В варианте осуществления настоящего изобретения флокулянт включает поливалентный катион. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой поливалентный катион. В предпочтительном варианте указанный поливалентный катион выбран из группы, состоящей из алюминия, железа, кальция и магния. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой смесь по меньшей мере двух поливалентных катионов, выбранных из группы, состоящей из алюминия, железа, кальция и магния. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой смесь по меньшей мере трех поливалентных катионов, выбранных из группы, состоящей из алюминия, железа, кальция и магния. В варианте осуществления флокулянт представляет собой смесь четырех поливалентных катионов, состоящую из алюминия, железа, кальция и магния.

В одном варианте осуществления флокулянт включает средство, выбранное из группы, состоящей из квасцов (например, алюмокалиевых квасцов, алюмонатриевых квасцов или алюмоаммониевых квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, полиэтиленимина (ПЭИ), алюмината натрия и силиката натрия. В одном варианте осуществления флокулянт выбран из группы, состоящей из квасцов (например, алюмокалиевых квасцов, алюмонатриевых квасцов или алюмоаммониевых квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, алюмината натрия и силиката натрия. В одном варианте осуществления флокулянтом является полиэтиленимин (ПЭИ). В одном варианте осуществления флокулянт включает квасцы. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой квасцы. В одном варианте осуществления флокулянт включает алюмокалиевые квасцы. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой алюмокалиевые квасцы. В одном варианте осуществления флокулянт включает алюмонатриевые квасцы. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой алюмонатриевые квасцы. В одном варианте осуществления флокулянт включает алюмоаммониевые квасцы. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой алюмоаммониевые квасцы.

В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой смесь средств (например, двух, трех или четырех средств), выбранных из группы, состоящей из квасцов (например, алюмокалиевых квасцов, алюмонатриевых квасцов или алюмоаммониевых квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, полиэтиленимина (ПЭИ), алюмината натрия и силиката натрия. В одном варианте осуществления флокулянт выбран из группы, состоящей из квасцов (например, алюмокалиевых квасцов, алюмонатриевых квасцов или алюмоаммониевых квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, алюмината натрия и силиката натрия.

В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой смесь двух средств, выбранных из группы, состоящей из квасцов (например, алюмокалиевых квасцов, алюмонатриевых квасцов или алюмоаммониевых квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, алюмината натрия и силиката натрия. В одном варианте осуществления флокулянт представляет собой смесь по меньшей мере трех средств, выбранных из группы, состоящей из квасцов (например, алюмокалиевых квасцов, алюмонатриевых квасцов или алюмоаммониевых квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, алюмината натрия и силиката натрия.

В одном варианте осуществления флокулянт включает средство, выбранное из группы, состоящей из хитозана, рыбьего клея, семян моринги масличной (хренного дерева), желатина, семян чилибухи картофельной (ореха нирмали), гуаровой камеди и альгинатов (например, экстрактов бурых водорослей). В одном варианте осуществления флокулянт выбран из группы, состоящей из хитозана, рыбьего клея, семян моринги масличной (хренного дерева), желатина, семян чилибухи картофельной (ореха нирмали), гуаровой камеди и альгинатов (например, экстрактов бурых водорослей).

Концентрация флокулянта может зависеть от используемого средства (средств), представляющего интерес полисахарида и параметра стадии флокуляции (например, температуры).

В вариантах осуществления, где флокулянт включает или представляет собой квасцы, может использоваться концентрация флокулянта от приблизительно 0,1 до 20% (в/об). Предпочтительно используется концентрация флокулянта от приблизительно 0,5 до 10% (в/об). Еще более предпочтительно используется концентрация флокулянта от приблизительно 1 до 5% (в/об). Любое количество в границах любого из вышеуказанных диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления используется концентрация флокулянта приблизительно 0,1% (в/об), приблизительно 0,25% (в/об), приблизительно 0,5% (в/об), приблизительно 1,0% (в/об), приблизительно 1,5% (в/об), приблизительно 2,0% (в/об), приблизительно 2,5% (в/об), приблизительно 3,0% (в/об), приблизительно 3,5% (в/об), приблизительно 4,0% (в/об), приблизительно 4,5% (в/об), приблизительно 5,0% (в/об), приблизительно 5,5% (в/об), приблизительно 6,0% (в/об), приблизительно 6,5% (в/об), приблизительно 7,0% (в/об), приблизительно 7,5% (в/об), приблизительно 8,0% (в/об), приблизительно 8,5% (в/об), приблизительно 9,0% (в/об), приблизительно 9,5% (в/об) или приблизительно 10% (в/об). В варианте осуществления используется концентрация флокулянта приблизительно 10,5% (в/об), приблизительно 11,0% (в/об), приблизительно 11,5% (в/об), приблизительно 12,0% (в/об), приблизительно 12,5% (в/об), приблизительно 13,0% (в/об), приблизительно 13,5% (в/об), приблизительно 14,0% (в/об), приблизительно 14,5% (в/об), приблизительно 15,0% (в/об), приблизительно 15,5% (в/об), приблизительно 16,0% (в/об), приблизительно 16,5% (в/об), приблизительно 17,0% (в/об), приблизительно 17,5% (в/об), приблизительно 18,0% (в/об), приблизительно 18,5% (в/об), приблизительно 19,0% (в/об), приблизительно 19,5% (в/об) или приблизительно 20,0% (в/об). В варианте осуществления используется концентрация флокулянта приблизительно 0,5% (в/об), приблизительно 1,0% (в/об), приблизительно 1,5% (в/об), приблизительно 2,0% (в/об), приблизительно 2,5% (в/об), приблизительно 3,0% (в/об), приблизительно 3,5% (в/об), приблизительно 4,0% (в/об), приблизительно 4,5% (в/об) или приблизительно 5,0% (в/об). В варианте осуществления используется концентрация флокулянта приблизительно 1,0% (в/об), приблизительно 1,5% (в/об), приблизительно 2,0% (в/об), приблизительно 2,5% (в/об), приблизительно 3,0% (в/об), приблизительно 3,5% (в/об) или приблизительно 4,0% (в/об).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения флокулянт добавляют в течение некоторого периода времени. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения флокулянт добавляют в течение периода от нескольких секунд (например, 1-10 секунд) до приблизительно одного месяца. В некоторых вариантах осуществления флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 2 секунд до приблизительно двух недель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 1 минуты до приблизительно одной недели. В некоторых вариантах осуществления флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 1 минуты, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 часом, приблизительно 22 часов, приблизительно 23 часов или приблизительно 24 часов до приблизительно двух дней.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

Предпочтительно флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

В некоторых вариантах осуществления флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 15 минут до приблизительно 3 часов. В некоторых вариантах осуществления флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 30 минут до приблизительно 120 минут. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления флокулянт может быть добавлен в течение периода длительностью приблизительно 2 секунды, приблизительно 10 секунд, приблизительно 30 секунд, приблизительно 1 минуты, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часа, приблизительно 3,5 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 4,5 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 5,5 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 6,5 часа, приблизительно 7 часов, приблизительно 7,5 часа, приблизительно 8 часов, приблизительно 8,5 часа, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 30 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 42 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней или приблизительно 15 дней.

В варианте осуществления флокулянт добавляют без перемешивания. В другом варианте осуществления флокулянт добавляют при перемешивании. В другом варианте осуществления флокулянт добавляют при легком перемешивании. В другом варианте осуществления флокулянт добавляют при энергичном перемешивании.

Авторы изобретения также неожиданно заметили, что флокуляция улучшается, когда ее проводят при кислом pH.

Таким образом, в варианте осуществления настоящего изобретения стадию флокуляции проводят при pH ниже 7,0, 6,0, 5,0 или 4,0. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения стадию флокуляции проводят при pH от 7,0 до 1,0. В варианте осуществления стадию флокуляции проводят при pH от 5,5 до 2,5, от 5,0 до 2,5, от 4,5 до 2,5, от 4,0 до 2,5, от 5,5 до 3,0, от 5,0 до 3,0, от 4,5 до 3,0, от 4,0 до 3,0, от 5,5 до 3,5, от 5,0 до 3,5, от 4,5 до 3,5 или от 4,0 до 3,5. В варианте осуществления стадию флокуляции проводят при pH приблизительно 5,5, приблизительно 5,0, приблизительно 4,5, приблизительно 4,0, приблизительно 3,5, приблизительно 3,0, приблизительно 2,5, приблизительно 2,0, приблизительно 1,5 или приблизительно 1,0. В варианте осуществления стадию флокуляции проводят при pH приблизительно 4,0, приблизительно 3,5, приблизительно 3,0 или приблизительно 2,5. В варианте осуществления стадию флокуляции проводят при pH приблизительно 3,5. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления указанный кислый pH получают при подкислении раствора, полученного любым способом из раздела 1.1 выше, или дополнительно осветленного, как раскрыто в разделе 1.2, кислотой. В варианте осуществления указанная кислота выбрана из группы, состоящей из HCl, H₃PO₄, лимонной кислоты, уксусной кислоты, азотистой кислоты и серной кислоты. В варианте осуществления указанной кислотой является аминокислота. В варианте осуществления указанной кислотой является аминокислота, выбранная из группы, состоящей из глицина, аланина и глутамата. В варианте осуществления указанной кислотой является HCl (соляная кислота). В варианте осуществления указанной кислотой является серная кислота.

В варианте осуществления кислоту добавляют без перемешивания. Предпочтительно кислоту добавляют при перемешивании. В варианте осуществления кислоту добавляют при легком перемешивании. В варианте осуществления кислота добавляется при энергичном перемешивании.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, после добавления флокулянта (и необязательного подкисления), раствор выдерживают в течение некоторого времени для осаждения хлопьев перед последующей обработкой.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от нескольких секунд (например, 2-10 секунд) до приблизительно 1 минуты. Предпочтительно время отстаивания составляет по меньшей мере приблизительно 2, по меньшей мере приблизительно 3, по меньшей мере приблизительно 4, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 35, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 55, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 65, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 75, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 85, по меньшей мере приблизительно 90, по меньшей мере приблизительно 95, по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 105, по меньшей мере приблизительно 110, по меньшей мере приблизительно 115, по меньшей мере приблизительно 120, по меньшей мере приблизительно 125, по меньшей мере приблизительно 130, по меньшей мере приблизительно 135, по меньшей мере приблизительно 140, по меньшей мере приблизительно 145, по меньшей мере приблизительно 150, по меньшей мере приблизительно 155 или по меньшей мере приблизительно 160 минут. Предпочтительно время отстаивания меньше недели, тем не менее, время отстаивания может быть больше.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 120, приблизительно 140, приблизительно 160, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320, приблизительно 1380, приблизительно 1440 минут, приблизительно двух дней, приблизительно трех дней, приблизительно четырех дней, приблизительно пяти дней или приблизительно шести дней до 1 недели.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения время отстаивания составляет от нескольких секунд (например, 1-10 секунд) до приблизительно одного месяца. В некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 2 секунд до приблизительно двух недель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения время отстаивания составляет от приблизительно 1 минуты до приблизительно одной недели. В некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 1 минуты, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 часом, приблизительно 22 часов, приблизительно 23 часов или приблизительно 24 часов до приблизительно двух дней.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

Предпочтительно время отстаивания составляет от приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

В некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 15 минут до приблизительно 3 часов. В некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 30 минут до приблизительно 120 минут.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет приблизительно 2 секунды, приблизительно 10 секунд, приблизительно 30 секунд, приблизительно 1 минуту, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часа, приблизительно 3,5 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 4,5 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 5,5 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 6,5 часа, приблизительно 7 часов, приблизительно 7,5 часа, приблизительно 8 часов, приблизительно 8,5 часа, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 30 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 42 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней или приблизительно 15 дней.

Предпочтительно время отстаивания составляет от приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 60, приблизительно 90, приблизительно 120, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320, приблизительно 1380 или приблизительно 1440 минут до двух дней. В некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 5 минут до приблизительно одного дня. В некоторых вариантах осуществления время отстаивания составляет от приблизительно 5 минут до приблизительно 120 минут.

Время отстаивания может составлять приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут или приблизительно 160 минут.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления необязательную стадию отстаивания проводят без перемешивания. В варианте осуществления необязательную стадию отстаивания проводят при перемешивании. В другом варианте осуществления необязательную стадию отстаивания проводят при легком перемешивании. В другом варианте осуществления необязательную стадию отстаивания проводят при энергичном перемешивании.

В варианте осуществления настоящего изобретения добавление флокулянта, отстаивание раствора и/или регуляцию pH проводят при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C. В варианте осуществления добавление флокулянта, отстаивание раствора и/или регуляцию pH проводят при температуре приблизительно 4°C, приблизительно 5°C, приблизительно 6°C, приблизительно 7°C, приблизительно 8°C, приблизительно 9°C, приблизительно 10°C, приблизительно 11°C, приблизительно 12°C, приблизительно 13°C, приблизительно 14°C, приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, приблизительно 18°C, приблизительно 19°C, приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C или приблизительно 30°C. В варианте осуществления добавление флокулянта, отстаивание раствора и/или регуляцию pH проводят при температуре приблизительно 20°C. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что флокуляцию можно дополнительно улучшить, если проводить ее при повышенной температуре. Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения добавление флокулянта, отстаивание раствора и/или регуляцию pH проводят при температуре от приблизительно 30°C до приблизительно 95°C. В варианте осуществления добавление флокулянта, отстаивание раствора и/или регуляцию pH проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C. В варианте осуществления добавление флокулянта, отстаивание раствора и/или регуляцию pH проводят при температуре приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C. В варианте осуществления добавление флокулянта, отстаивание раствора и/или регуляцию pH проводят при температуре приблизительно 50°C.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления добавление флокулянта проводят при любой из указанных выше температур.

В варианте осуществления отстаивание раствора после добавления флокулянта проводят при любой из указанных выше температур.

В варианте осуществления регулирование pH проводят при любой из указанных выше температур.

В варианте осуществления добавление флокулянта и отстаивание раствора после добавления флокулянта проводят при любой из указанных выше температур.

В варианте осуществления добавление флокулянта и регулировании pH проводят при любой из указанных выше температур.

В варианте осуществления добавление флокулянта, отстаивание раствора после добавления флокулянта и регулирование pH проводят при любой из указанных выше температур.

В варианте осуществления стадия флокуляции включает добавление флокулянта (как раскрыто выше) без регулирования pH.

В варианте осуществления стадия флокуляции включает добавление флокулянта и отстаивание раствора (как раскрыто выше) без регулирования pH.

В варианте осуществления стадия флокуляции включает добавление флокулянта, регулирование pH и отстаивание раствора (как раскрыто выше). В варианте осуществления флокулянт добавляют перед регулированием pH. В другом варианте осуществления pH регулируют перед добавлением флокулянта.

В варианте осуществления стадия флокуляции включает добавление флокулянта, отстаивание раствора и регулирование pH (как раскрыто выше). В варианте осуществления добавление флокулянта и отстаивание раствора проводят перед регулированием pH. В другом варианте осуществления pH регулируют перед добавлением флокулянта и отстаиванием раствора. В варианте осуществления добавление флокулянта и регулирование pH проводят перед отстаиванием раствора. В другом варианте осуществления pH регулируют перед добавлением флокулянта и отстаиванием раствора.

В варианте осуществления стадия флокуляции включает добавление флокулянта, регулирование pH и регулирование температуры (как раскрыто выше).

Эти стадии могут выполняться в любом порядке:

- добавление флокулянта с последующим регулированием pH с последующим регулированием температуры или;

- добавление флокулянта с последующим регулированием температуры с последующим регулированием pH или;

- регулирование pH с последующим добавлением флокулянта с последующим регулированием температуры или;

- регулирование pH с последующим регулированием температуры с последующим добавлением флокулянта или;

- регулирование температуры с последующим добавлением флокулянта с последующим регулированием pH или;

- регулирование температуры с последующим регулированием pH с последующим добавлением флокулянта.

Кроме того, после добавления флокулянта и/или регулирования pH раствор могут выдерживать в течение некоторого времени для отстаивания хлопьев перед последующей обработкой.

1.3. Разделение твердой/жидкой фаз

Выпавший в осадок материал может быть отделен от представлящего интерес полисахарида с помощью любого подходящего способа разделения твердой/жидкой фаз.

Таким образом, в варианте осуществления настоящего изобретения, после флокуляции, суспензию (полученную в разделе 1.2 выше) осветляют с помощью декантации, отстаивания, фильтрации или центрифугирования. В варианте осуществления содержащий полисахарид раствор затем собирают для хранения и/или дополнительной обработки.

В варианте осуществления настоящего изобретения, после флокуляции, суспензию (полученную в разделе 1.2 выше) осветляют с помощью декантации. Декантаторы используются для отделения жидкостей в случае достаточного различия по плотности между жидкостями и осаждаемыми флоккулированными частицами. В работающем декантаторе присутствует три разных зоны: прозрачная тяжелая жидкость, отделяемая жидкость с диспергированными частицами (зона дисперсии) и прозрачная легкая жидкость. Для получения чистого раствора небольшое количество раствора обычно нужно оставлять в емкости. Декантаторы могут быть разработаны для работы в непрерывном режиме.

В варианте осуществления настоящего изобретения, после флокуляции, суспензию (полученную в разделе 1.2 выше) осветляют путем отстаивания (седиментации). Отстаивание представляет собой отделение суспендированных твердых частиц от жидкой смеси с расслоением под действием силы тяжести на прозрачную жидкость и суспензию с более высоким содержанием твердой фазы. Отстаивание можно проводить в концентраторе, в осветлителе или в гидроциклоне. Поскольку загущение и осветление являются относительно дешевыми процессами при использовании для обработки больших объемов жидкости, их можно применять для предварительной концентрации материалов, подлежащих фильтрации.

В варианте осуществления настоящего изобретения, после флокуляции, суспензию (полученную в разделе 1.2 выше) осветляют путем центрифугирования. В варианте осуществления указанное центрифугирование является непрерывным центрифугированием. В варианте осуществления указанное центрифугирование является центрифугированием в роторе с качающимися стаканами. В варианте осуществления содержащий полисахарид супернатант затем собирают для хранения и/или дополнительной обработки.

В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют при приблизительно 1000 g, приблизительно 2000 g, приблизительно 3000 g, приблизительно 4000 g, приблизительно 5000 g, приблизительно 6000 g, приблизительно 8000 g, приблизительно 9000 g, приблизительно 10000 g, приблизительно 11000 g, приблизительно 12000 g, приблизительно 13000 g, приблизительно 14000 g, приблизительно 15000 g, приблизительно 16000 g, приблизительно 17000 g, приблизительно 18000 g, приблизительно 19000 g, приблизительно 20000 g, приблизительно 25000 g, приблизительно 30000 g, приблизительно 35000 g, приблизительно 40000 g, приблизительно 50000 g, приблизительно 60000 g, приблизительно 70000 g, приблизительно 80000 g, приблизительно 90000 g, приблизительно 100000 g, приблизительно 120000 g, приблизительно 140000 g, приблизительно 160000 g или приблизительно 180000 g. В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют при приблизительно 8000 g, приблизительно 9000 g, приблизительно 10000 g, приблизительно 11000 g, приблизительно 12000 g, приблизительно 13000 g, приблизительно 14000 g, приблизительно 15000 g, приблизительно 16000 g, приблизительно 17000 g, приблизительно 18000 g, приблизительно 19000 g, приблизительно 20000 g или приблизительно 25000 g.

В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют при приблизительно от 5000 g до приблизительно 25000 g. В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют при приблизительно от 8000 g до приблизительно 20000 g. В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют при приблизительно от 10000 g до приблизительно 15000 g. В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют при приблизительно от 10000 g до приблизительно 12000 g.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют в течение по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 105, по меньшей мере 110, по меньшей мере 115, по меньшей мере 120, по меньшей мере 125, по меньшей мере 130, по меньшей мере 135, по меньшей мере 140, по меньшей мере 145, по меньшей мере 150, по меньшей мере 155 или по меньшей мере 160 минут. Предпочтительно время центрифугирования составляет меньше 24 часов.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 120, приблизительно 140, приблизительно 160, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320 или приблизительно 1380 минут до 1440 минут.

Предпочтительно суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 60, приблизительно 90, приблизительно 120, приблизительно 180, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480 или приблизительно 540 минут до приблизительно 600 минут. В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 3 часов. В некоторых вариантах осуществления суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 120 минут.

Суспензию могут центрифугировать в течение от приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут или приблизительно 155 минут до приблизительно 160 минут.

Суспензию могут центрифугировать в течение от приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут или приблизительно 55 минут до приблизительно 60 минут.

Суспензию могут центрифугировать в течение приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 120, приблизительно 140, приблизительно 160, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320, приблизительно 1380 минут или приблизительно 1440 минут.

Суспензию могут центрифугировать в течение приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут или приблизительно 160 минут.

Суспензию могут центрифугировать в течение приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут или приблизительно 60 минут.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления настоящего изобретения центрифугирование является непрерывным центрифугированием. В указанном варианте осуществления скорость подачи может составлять в пределах 50-5000 мл/мин, 100-4000 мл/мин, 150-3000 мл/мин, 200-2500 мл/мин, 250-2000 мл/мин, 300-1500 мл/мин, 300-1000 мл/мин, 200-1000 мл/мин, 200-1500 мл/мин, 400-1500 мл/мин, 500-1500 мл/мин, 500-1000 мл/мин, 500-2000 мл/мин, 500-2500 мл/мин или 1000-2500 мл/мин.

В варианте осуществления скорость подачи может составлять приблизительно 10, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, приблизительно 1000, приблизительно 1050, приблизительно 1100, приблизительно 1150, приблизительно 1200, приблизительно 1250, приблизительно 1300, приблизительно 1350, приблизительно 1400, приблизительно 1450, приблизительно 1500, приблизительно 1650 приблизительно 1700, приблизительно 1800, приблизительно 1900, приблизительно 2000, приблизительно 2100, приблизительно 2200, приблизительно 2300, приблизительно 2400, приблизительно 2500, приблизительно 2600, приблизительно 2700, приблизительно 2800, приблизительно 2900, приблизительно 3000, приблизительно 3250, приблизительно 3500, приблизительно 3750 приблизительно 4000, приблизительно 4250, приблизительно 4500 или приблизительно 5000 мл/мин.

В варианте осуществления настоящего изобретения, после флокуляции, суспензию (полученную в разделе 1.2 выше) осветляют с помощью фильтрации. При фильтрации суспендированные твердые частицы в жидкости удаляются при пропускании смеси через пористую среду, которая задерживает частицы и пропускает прозрачный фильтрат. Фильтрацию проводят на ситах под действием силы тяжести или на фильтрах под действием вакуума, давления или центрифугирования. Твердая фаза может задерживаться на поверхности фильтрующего материала, что представляет собой фильтрацию с образованием осадка на фильтре, или захватываться в фильтрующем материале, что представляет собой глубинную фильтрацию. В варианте осуществления, после флокуляции, суспензию (полученную в разделе 1.2 выше) осветляют с помощью микрофильтрации. В варианте осуществления микрофильтрация является тангенциальной микрофильтрацией. В другом варианте осуществления микрофильтрация является тупиковой фильтрацией (перпендикулярной фильтрацией). В варианте осуществления микрофильтрация является тупиковой фильтрацией, где диатомовая земля (DE), также известная как диатомит DE, используется в качестве вспомогательного фильтрующего материала для облегчения и повышения эффективности разделения твердой/жидкой фаз. Таким образом, в варианте осуществления, после флокуляции, суспензию (полученную в разделе 1.2 выше) осветляют с помощью тупиковой микрофильтрацией, включающей диатомовую землю (DE). DE может пропитывать (или может быть включен в) тупиковый фильтр в качестве единого целого глубинного фильтра.

В другом формате DE могут добавлять во флокулированный раствор (полученный после раздела 1.2) в порошковой форме. В последнем случае обработанный DE флокулированный раствор можно затем очищать с помощью глубинной фильтрации.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-2 микрона, приблизительно 0,05-2 микрона, приблизительно 0,1-2 микрона, приблизительно 0,2-2 микрона, приблизительно 0,3-2 микрона, приблизительно 0,4-2 микрона, приблизительно 0,45-2 микрона, приблизительно 0,5-2 микрона, приблизительно 0,6-2 микрона, приблизительно 0,7-2 микрона, приблизительно 0,8-2 микрона, приблизительно 0,9-2 микрона, приблизительно 1-2 микрона, приблизительно 1,25-2 микрона, приблизительно 1,5-2 микрона или приблизительно 1.75-2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-1 микрон, приблизительно 0,05-1 микрон, приблизительно 0,1-1 микрон, приблизительно 0,2-1 микрон, приблизительно 0,3-1 микрон, приблизительно 0,4-1 микрон, приблизительно 0,45-1 микрон, приблизительно 0,5-1 микрон, приблизительно 0,6-1 микрон, приблизительно 0,7-1 микрон, приблизительно 0,8-1 микрон или приблизительно 0,9-1 микрон.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный показатель задерживания приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,45, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9 или приблизительно 2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный показатель задерживания приблизительно 0,45 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-5000 л/м², 200-5000 л/м², 300-5000 л/м², 400-5000 л/м², 500-5000 л/м², 750-5000 л/м², 1000-5000 л/м², 1500-5000 л/м², 2000-5000 л/м², 3000-5000 л/м² или 4000-5000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-2500 л/м², 200-2500 л/м², 300-2500 л/м², 400-2500 л/м², 500-2500 л/м², 750-2500 л/м², 1000-2500 л/м², 1500-2500 л/м² или 2000-2500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-1500 л/м², 200-1500 л/м², 300-1500 л/м², 400-1500 л/м², 500-1500 л/м², 750-1500 л/м² или 1000-1500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-1250 л/м², 200-1250 л/м², 300-1250 л/м², 400-1250 л/м², 500-1250 л/м², 750-1250 л/м² или 1000-1250 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-1000 л/м², 200-1000 л/м², 300-1000 л/м², 400-1000 л/м², 500-1000 л/м² или 750-1000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-750 л/м², 200-750 л/м², 300-750 л/м², 400-750 л/м² или 500-750 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-600 л/м², 200-600 л/м², 300-600 л/м², 400-600 л/м² или 400-600 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-500 л/м², 200-500 л/м², 300-500 л/м² или 400-500 л/м².

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, приблизительно 1000, приблизительно 1050, приблизительно 1100, приблизительно 1150, приблизительно 1200, приблизительно 1250, приблизительно 1300, приблизительно 1350, приблизительно 1400, приблизительно 1450, приблизительно 1500, приблизительно 1550, приблизительно 1600, приблизительно 1650, приблизительно 1700, приблизительно 1750, приблизительно 1800, приблизительно 1850, приблизительно 1900, приблизительно 1950, приблизительно 2000, приблизительно 2050, приблизительно 2100, приблизительно 2150, приблизительно 2200, приблизительно 2250, приблизительно 2300, приблизительно 2350, приблизительно 2400, приблизительно 2450 или приблизительно 2500 л/м².

Способы разделения твердой/жидкой фаз, описанные выше, могут использоваться в автономном формате или в комбинации двух в любом порядке, или в комбинации трех в любом порядке.

1.4 Фильтрация (например, глубинная фильтрация)

После обработки раствора в стадии флокуляции, описанной в разделе 1.2 выше, и/или в стадии разделения твердой и жидкой фаз, описанной выше в разделе 1.3, раствор, содержащий полисахарид (например, супернатант), может быть дополнительно осветлен.

В одном варианте раствор фильтруют, получая в результате дополнительно осветленный раствор. В варианте осуществления фильтрацию применяют непосредственно к раствору, полученному любым из способов, описанных в разделе 1.2 выше. В одном варианте фильтрацию применяют к раствору, дополнительно очищенному в стадии разделения твердой и жидкой фаз, как описано в разделе 1.3 выше.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии фильтрации, выбранной из группы, состоящей из глубинной фильтрации, фильтрации через активированный уголь, гель-фильтрации, диафильтрации и ультрафильтрации. В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии диафильтрации, в частности фильтрации в тангенциальном потоке. В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации.

В глубинных фильтрах пористая фильтрующая среда используется для удержания частиц по всему объему среды, а не только на поверхности среды. Из-за извилистой и каналообразной природы фильтрующей среды частицы задерживаются по всему объему среды внутри ее структуры, а не на поверхности.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где конструкция глубинного фильтра выбрана из группы, состоящей из кассет, картриджей, фильтров с глубоким слоем (например, песочных фильтров) и линзообразных фильтров.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-100 микрон, приблизительно 0,05-100 микрон, приблизительно 0,1-100 микрон, приблизительно 0,2-100 микрон, приблизительно 0,3-100 микрон, приблизительно 0,4-100 микрон, приблизительно 0,5-100 микрон, приблизительно 0,6-100 микрон, приблизительно 0,7-100 микрон, приблизительно 0,8-100 микрон, приблизительно 0,9-100 микрон, приблизительно 1-100 микрон, приблизительно 1,25-100 микрон, приблизительно 1,5-100 микрон, приблизительно 1,75-100 микрон, приблизительно 2-100 микрон, приблизительно 3-100 микрон, приблизительно 4-100 микрон, приблизительно 5-100 микрон, приблизительно 6-100 микрон, приблизительно 7-100 микрон, приблизительно 8-100 микрон, приблизительно 9-100 микрон, приблизительно 10-100 микрон, приблизительно 15-100 микрон, приблизительно 20-100 микрон, приблизительно 25-100 микрон, приблизительно 30-100 микрон, приблизительно 40-100 микрон, приблизительно 50-100 микрон или приблизительно 75-100 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-75 микрон, приблизительно 0,05-75 микрон, приблизительно 0,1-75 микрон, приблизительно 0,2-75 микрон, приблизительно 0,3-75 микрон, приблизительно 0,4-75 микрон, приблизительно 0,5-75 микрон, приблизительно 0,6-75 микрон, приблизительно 0,7-75 микрон, приблизительно 0,8-75 микрон, приблизительно 0,9-75 микрон, приблизительно 1-75 микрон, приблизительно 1,25-75 микрон, приблизительно 1,5-75 микрон, приблизительно 1,75-75 микрон, приблизительно 2-75 микрон, приблизительно 3-75 микрон, приблизительно 4-75 микрон, приблизительно 5-75 микрон, приблизительно 6-75 микрон, приблизительно 7-75 микрон, приблизительно 8-75 микрон, приблизительно 9-75 микрон, приблизительно 10-75 микрон, приблизительно 15-75 микрон, приблизительно 20-75 микрон, приблизительно 25-75 микрон, приблизительно 30-75 микрон, приблизительно 40-75 микрон или приблизительно 50-75 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-50 микрон, приблизительно 0,05-50 микрон, приблизительно 0,1-50 микрон, приблизительно 0,2-50 микрон, приблизительно 0,3-50 микрон, приблизительно 0,4-50 микрон, приблизительно 0,5-50 микрон, приблизительно 0,6-50 микрон, приблизительно 0,7-50 микрон, приблизительно 0,8-50 микрон, приблизительно 0,9-50 микрон, приблизительно 1-50 микрон, приблизительно 1,25-50 микрон, приблизительно 1,5-50 микрон, приблизительно 1,75-50 микрон, приблизительно 2-50 микрон, приблизительно 3-50 микрон, приблизительно 4-50 микрон, приблизительно 5-50 микрон, приблизительно 6-50 микрон, приблизительно 7-50 микрон, приблизительно 8-50 микрон, приблизительно 9-50 микрон, приблизительно 10-50 микрон, приблизительно 15-50 микрон, приблизительно 20-50 микрон, приблизительно 25-50 микрон, приблизительно 30-50 микрон, приблизительно 40-50 микрон или приблизительно 50-50 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-25 микрон, приблизительно 0,05-25 микрон, приблизительно 0,1-25 микрон, приблизительно 0,2-25 микрон, приблизительно 0,3-25 микрон, приблизительно 0,4-25 микрон, приблизительно 0,5-25 микрон, приблизительно 0,6-25 микрон, приблизительно 0,7-25 микрон, приблизительно 0,8-25 микрон, приблизительно 0,9-25 микрон, приблизительно 1-25 микрон, приблизительно 1,25-25 микрон, приблизительно 1,5-25 микрон, приблизительно 1,75-25 микрон, приблизительно 2-25 микрон, приблизительно 3-25 микрон, приблизительно 4-25 микрон, приблизительно 5-25 микрон, приблизительно 6-25 микрон, приблизительно 7-25 микрон, приблизительно 8-25 микрон, приблизительно 9-25 микрон, приблизительно 10-25 микрон, приблизительно 15-25 микрон или приблизительно 20-25 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-10 микрон, приблизительно 0,05-10 микрон, приблизительно 0,1-10 микрон, приблизительно 0,2-10 микрон, приблизительно 0,3-10 микрон, приблизительно 0,4-10 микрон, приблизительно 0,5-10 микрон, приблизительно 0,6-10 микрон, приблизительно 0,7-10 микрон, приблизительно 0,8-10 микрон, приблизительно 0,9-10 микрон, приблизительно 1-10 микрон, приблизительно 1,25-10 микрон, приблизительно 1,5-10 микрон, приблизительно 1,75-10 микрон, приблизительно 2-10 микрон, приблизительно 3-10 микрон, приблизительно 4-10 микрон, приблизительно 5-10 микрон, приблизительно 6-10 микрон, приблизительно 7-10 микрон, приблизительно 8-10 микрон или приблизительно 9-10 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-8 микрон, приблизительно 0,05-8 микрон, приблизительно 0,1-8 микрон, приблизительно 0,2-8 микрон, приблизительно 0,3-8 микрон, приблизительно 0,4-8 микрон, приблизительно 0,5-8 микрон, приблизительно 0,6-8 микрон, приблизительно 0,7-8 микрон, приблизительно 0,8-8 микрон, приблизительно 0,9-8 микрон, приблизительно 1-8 микрон, приблизительно 1,25-8 микрон, приблизительно 1,5-8 микрон, приблизительно 1,75-8 микрон, приблизительно 2-8 микрон, приблизительно 3-8 микрон, приблизительно 4-8 микрон, приблизительно 5-8 микрон, приблизительно 6-8 микрон или приблизительно 7-8 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-5 микрон, приблизительно 0,05-5 микрон, приблизительно 0,1-5 микрон, приблизительно 0,2-5 микрон, приблизительно 0,3-5 микрон, приблизительно 0,4-5 микрон, приблизительно 0,5-5 микрон, приблизительно 0,6-5 микрон, приблизительно 0,7-5 микрон, приблизительно 0,8-5 микрон, приблизительно 0,9-5 микрон, приблизительно 1-5 микрон, приблизительно 1,25-5 микрон, приблизительно 1,5-5 микрон, приблизительно 1,75-5 микрон, приблизительно 2-5 микрон, приблизительно 3-5 микрон или приблизительно 4-5 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-2 микрона, приблизительно 0,05-2 микрона, приблизительно 0,1-2 микрона, приблизительно 0,2-2 микрона, приблизительно 0,3-2 микрона, приблизительно 0,4-2 микрона, приблизительно 0,5-2 микрона, приблизительно 0,6-2 микрона, приблизительно 0,7-2 микрона, приблизительно 0,8-2 микрона, приблизительно 0,9-2 микрона, приблизительно 1-2 микрона, приблизительно 1,25-2 микрона, приблизительно 1,5-2 микрона, приблизительно 1,75-2 микрона, приблизительно 2-2 микрона, приблизительно 3-2 микрона или приблизительно 4-2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-1 микрон, приблизительно 0,05-1 микрон, приблизительно 0,1-1 микрон, приблизительно 0,2-1 микрон, приблизительно 0,3-1 микрон, приблизительно 0,4-1 микрон, приблизительно 0,5-1 микрон, приблизительно 0,6-1 микрон, приблизительно 0,7-1 микрон, приблизительно 0,8-1 микрон или приблизительно 0,9-1 микрон.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,05-50 микрон, 0,1-25 микрон, 0,2-10 микрон, 0,1-10 микрон, 0,2-5 микрон или 0,25-1 микрон.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-2500 л/м², 5-2500 л/м², 10-2500 л/м², 25-2500 л/м², 50-2500 л/м², 75-2500 л/м², 100-2500 л/м², 150-2500 л/м², 200-2500 л/м², 300-2500 л/м², 400-2500 л/м², 500-2500 л/м², 750-2500 л/м², 1000-2500 л/м², 1500-2500 л/м² или 2000-2500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-1000 л/м², 5-1000 л/м², 10-1000 л/м², 25-1000 л/м², 50-1000 л/м², 75-1000 л/м², 100-1000 л/м², 150-1000 л/м², 200-1000 л/м², 300-1000 л/м², 400-1000 л/м², 500-1000 л/м² или 750-1000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-750 л/м², 5-750 л/м², 10-750 л/м², 25-750 л/м², 50-750 л/м², 75-750 л/м², 100-750 л/м², 150-750 л/м², 200-750 л/м², 300-750 л/м², 400-750 л/м² или 500-750 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-500 л/м², 5-500 л/м², 10-500 л/м², 25-500 л/м², 50-500 л/м², 75-500 л/м², 100-500 л/м², 150-500 л/м², 200-500 л/м², 300-500 л/м² или 400-500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-400 л/м², 5-400 л/м², 10-400 л/м², 25-400 л/м², 50-400 л/м², 75-400 л/м², 100-400 л/м², 150-400 л/м², 200-400 л/м² или 300-400 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-300 л/м², 5-300 л/м², 10-300 л/м², 25-300 л/м², 50-300 л/м², 75-300 л/м², 100-300 л/м², 150-300 л/м² или 200-300 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-200 л/м², 5-200 л/м², 10-200 л/м², 25-200 л/м², 50-200 л/м², 75-200 л/м², 100-200 л/м² или 150-200 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-100 л/м², 5-100 л/м², 10-100 л/м², 25-100 л/м², 50-100 л/м² или 75-100 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где глубинный фильтр имеет производительность 1-50 л/м², 5-50 л/м², 10-50 л/м² или 25-50 л/м².

Любое целое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где скорость подачи составляет в пределах 1-1000 лмч (литр/м²/час), 10-1000 лмч, 25-1000 лмч, 50-1000 лмч, 100-1000 лмч, 125-1000 лмч, 150-1000 лмч, 200-1000 лмч, 250-1000 лмч, 300-1000 лмч, 400-1000 лмч, 500-1000 лмч, 600-1000 лмч, 700-1000 лмч, 800-1000 лмч или 900-1000 лмч.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где скорость подачи составляет в пределах 1-500 лмч, 10-500 лмч, 25-500 лмч, 50-500 лмч, 100-500 лмч, 125-500 лмч, 150-500 лмч, 200-500 лмч, 250-500 лмч, 300-500 лмч или 400-500 лмч.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где скорость подачи составляет в пределах 1-400 лмч, 10-400 лмч, 25-400 лмч, 50-400 лмч, 100-400 лмч, 125-400 лмч, 150-400 лмч, 200-400 лмч, 250-400 лмч или 300-400 лмч.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где скорость подачи составляет в пределах 1-250 лмч, 10-250 лмч, 25-250 лмч, 50-250 лмч, 100-250 лмч, 125-250 лмч, 150-250 лмч или 200-250 лмч.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где скорость подачи составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 210, приблизительно 220, приблизительно 230, приблизительно 240 приблизительно 250, приблизительно 260, приблизительно 270, приблизительно 280, приблизительно 290, приблизительно 300, приблизительно 310, приблизительно 320, приблизительно 330, приблизительно 340, приблизительно 350, приблизительно 360, приблизительно 370, приблизительно 380, приблизительно 390, приблизительно 400, приблизительно 425, приблизительно 450, приблизительно 475, приблизительно 500, приблизительно 525, приблизительно 550, приблизительно 575, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950 или приблизительно 1000 лмч.

1.5 Необязательная дополнительная фильтрация

После обработки раствора в стадии фильтрации в разделе 1.4 выше, полученный раствор (т.е. фильтрат) может быть необязательно дополнительно осветлен.

В варианте осуществления раствор подвергают микрофильтрации. В варианте осуществления микрофильтрация является тупиковой фильтрацией (перпендикулярной фильтрацией). В варианте осуществления микрофильтрация является тангенциальной микрофильтрацией.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-2 микрона, приблизительно 0,05-2 микрона, приблизительно 0,1-2 микрона, приблизительно 0,2-2 микрона, приблизительно 0,3-2 микрона, приблизительно 0,4-2 микрона, приблизительно 0,45-2 микрона, приблизительно 0,5-2 микрона, приблизительно 0,6-2 микрона, приблизительно 0,7-2 микрона, приблизительно 0,8-2 микрона, приблизительно 0,9-2 микрона, приблизительно 1-2 микрона, приблизительно 1,25-2 микрона, приблизительно 1,5-2 микрона или приблизительно 1,75-2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии глубинной фильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-1 микрон, приблизительно 0,05-1 микрон, приблизительно 0,1-1 микрон, приблизительно 0,2-1 микрон, приблизительно 0,3-1 микрон, приблизительно 0,4-1 микрон, приблизительно 0,45-1 микрон, приблизительно 0,5-1 микрон, приблизительно 0,6-1 микрон, приблизительно 0,7-1 микрон, приблизительно 0,8-1 микрон или приблизительно 0,9-1 микрон.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный показатель задерживания приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,45, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9 или приблизительно 2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный показатель задерживания приблизительно 0,45 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-5000 л/м², 200-5000 л/м², 300-5000 л/м², 400-5000 л/м², 500-5000 л/м², 750-5000 л/м², 1000-5000 л/м², 1500-5000 л/м², 2000-5000 л/м², 3000-5000 л/м² или 4000-5000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-2500 л/м², 200-2500 л/м², 300-2500 л/м², 400-2500 л/м², 500-2500 л/м², 750-2500 л/м², 1000-2500 л/м², 1500-2500 л/м² или 2000-2500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-1500 л/м², 200-1500 л/м², 300-1500 л/м², 400-1500 л/м², 500-1500 л/м², 750-1500 л/м² или 1000-1500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-1250 л/м², 200-1250 л/м², 300-1250 л/м², 400-1250 л/м², 500-1250 л/м², 750-1250 л/м² или 1000-1250 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-1000 л/м², 200-1000 л/м², 300-1000 л/м², 400-1000 л/м², 500-1000 л/м² или 750-1000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-750 л/м², 200-750 л/м², 300-750 л/м², 400-750 л/м² или 500-750 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-600 л/м², 200-600 л/м², 300-600 л/м², 400-600 л/м² или 400-600 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность в пределах 100-500 л/м², 200-500 л/м², 300-500 л/м² или 400-500 л/м².

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, приблизительно 1000, приблизительно 1050, приблизительно 1100, приблизительно 1150, приблизительно 1200, приблизительно 1250, приблизительно 1300, приблизительно 1350, приблизительно 1400, приблизительно 1450, приблизительно 1500, приблизительно 1550, приблизительно 1600, приблизительно 1650, приблизительно 1700, приблизительно 1750, приблизительно 1800, приблизительно 1850, приблизительно 1900, приблизительно 1950, приблизительно 2000, приблизительно 2050, приблизительно 2100, приблизительно 2150, приблизительно 2200, приблизительно 2250, приблизительно 2300, приблизительно 2350, приблизительно 2400, приблизительно 2450 или приблизительно 2500 л/м².

1.6 Ультрафильтрация и/или диафильтрация

После фильтрации раствора любым из способов в разделе 1.4 выше и/или в стадии фильтрации в разделе 1.5 выше, полученный раствор (т.е. фильтрат) может быть необязательно дополнительно очищен с помощью ультрафильтрации и/или диафильтрации.

Ультрафильтрация (UF) представляет собой процесс концентрирования разбавленного потока продукта. UF позволяет отделять молекулы в растворе в зависимости от размера пор мембраны или отсечения по молекулярной массе (MWCO).

В варианте осуществления настоящего изобретения раствор (например, фильтрат, полученный в разделе 1.5 или 1.6 выше), обрабатывают с помощью ультрафильтрации.

В варианте осуществления раствор обрабатывают с помощью ультрафильтрации, и отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 килодальтон до 1000 килодальтон. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 750 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 500 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 300 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 100 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 50 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 30 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 10 до 1000 кДа, приблизительно от 20 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 30 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 40 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 50 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 75 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 100 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 150 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 200 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 300 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 400 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 500 кДа до 1000 кДа или приблизительно от 750 кДа до 1000 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 500 кДа, приблизительно от 10 кДа до 500 кДа, приблизительно от 20 кДа до 500 кДа, приблизительно от 30 кДа до 500 кДа, приблизительно от 40 кДа до 500 кДа, приблизительно от 50 кДа до 500 кДа, приблизительно от 75 кДа до 500 кДа, приблизительно от 100 кДа до 500 кДа, приблизительно от 150 кДа до 500 кДа, приблизительно от 200 кДа до 500 кДа, приблизительно от 300 кДа до 500 кДа или приблизительно от 400 кДа до 500 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 300 кДа, приблизительно от 10 кДа до 300 кДа, приблизительно от 20 кДа до 300 кДа, приблизительно от 30 кДа до 300 кДа, приблизительно от 40 кДа до 300 кДа, приблизительно от 50 кДа до 300 кДа, приблизительно от 75 кДа до 300 кДа, приблизительно от 100 кДа до 300 кДа, приблизительно от 150 кДа до 300 кДа или приблизительно от 200 кДа до 300 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 100 кДа, приблизительно от 10 кДа до 100 кДа, приблизительно от 20 кДа до 100 кДа, приблизительно от 30 кДа до 100 кДа, приблизительно от 40 кДа до 100 кДа, приблизительно от 50 кДа до 100 кДа или приблизительно от 75 кДа до 100 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны, составляет приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 50 кДа, приблизительно 60 кДа, приблизительно 70 кДа, приблизительно 80 кДа, приблизительно 90 кДа, приблизительно 100 кДа, приблизительно 110 кДа, приблизительно 120 кДа, приблизительно 130 кДа, приблизительно 140 кДа, приблизительно 150 кДа, приблизительно 200 кДа, приблизительно 250 кДа, приблизительно 300 кДа, приблизительно 400 кДа, приблизительно 500 кДа, приблизительно 750 кДа или приблизительно 1000 кДа.

В варианте осуществления коэффициент концентрирования в стадии ультрафильтрации составляет приблизительно от 1,5 до 10. В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет приблизительно от 2 до 8. В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет приблизительно от 2 до 5.

В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5 или приблизительно 10,0. В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5 или приблизительно 6.

В варианте осуществления настоящего изобретения раствор (например, фильтрат, полученный в разделе 1.4 или 1.5 выше), обрабатывают с помощью диафильтрации.

В варианте осуществления настоящего изобретения раствор, полученный после ультрафильтрации (UF), как раскрыто в настоящем разделе выше, дополнительно обрабатывают с помощью диафильтрации (обработки UF/DF).

Диафильтрация (DF) используется для обмена продукта в требуемом буферном растворе (или только воде). В варианте осуществления диафильтрацию используют для изменения химических свойств удерживаемого раствора при постоянном объеме. Нежелательные частицы проходят через мембрану, тогда как состав потока поступающего материала изменяется до более желаемого состояния посредством добавления раствора для замены (буферный раствор, солевой раствор, буферный солевой раствор или вода).

В варианте осуществления раствором для замены является вода.

В варианте осуществления раствором для замены является солевой водный раствор. В некоторых вариантах осуществления соль выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном варианте солью является хлорид натрия. В одном варианте осуществления раствором для замены является хлорид натрия в концентрации приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 110 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 140 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 160 мМ, приблизительно 170 мМ, приблизительно 180 мМ, приблизительно 190 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 300 мМ, приблизительно 350 мМ, приблизительно 400 мМ, приблизительно 450 мМ или приблизительно 500 мМ. В одном конкретном варианте раствором для замены является хлорид натрия в концентрации приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 110 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 140 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 160 мМ, приблизительно 170 мМ, приблизительно 180 мМ, приблизительно 190 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ или приблизительно 300 мМ.

В варианте осуществления раствором для замены является буферный раствор. В варианте осуществления раствором для замены является буферный раствор, где буфер выбран из группы, состоящей из N-(2-ацетамидо)аминоэтансульфоновой кислоты (ACES), соли уксусной кислоты (ацетата), N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты (ADA), 2-аминоэтансульфоновой кислоты (AES, таурина), аммиака, 2-амино-2-метил-1-пропанола (AMP), 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола AMPD, аммедиола, N-(1,1-диметил-2-гидроксиэтил)-3-амино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (AMPSO), N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES), гидрокарбоната (бикарбоната) натрия, N,N'-бис(2-гидроксиэтил)-глицина (бицина), [бис-(2-гидроксиэтил)-имино]-трис-(гидроксиметилметана) (бис-триса), 1,3-бис[трис(гидроксиметил)-метиламино]пропана (бис-трис-пропана), борной кислоты, диметиларсиновой кислоты (какодилата), 3-(циклогексиламино)-пропансульфоновой кислоты (CAPS), 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновой кислоты (CAPSO), карбоната натрия (Карбоната), циклогексиламиноэтансульфоновой кислоты (CHES), соли лимонной кислоты (цитрата), 3-[N-бис(гидроксиэтил)амино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (DIPSO), соли муравьиной кислоты (формиата), глицина, глицилглицина, N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-этансульфоновой кислоты (HEPES), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-3-пропансульфоновой кислоты (HEPPS, EPPS), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-2-гидроксипропан-сульфоновой кислоты (HEPPSO), имидазола, соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES), 3-(N-морфолино)-пропансульфоновой кислоты (MOPS), 3-(N-морфолино)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO), соли фосфорной кислоты (фосфата), пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES), пиперазин-N,N'-бис(2-гидроксипропансульфоновой кислоты) (POPSO), пиридина, соли янтарной кислоты (сукцината), 3-{[трис(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновой кислоты (TAPS), 3-[N-трис(гидроксиметил)-метиламино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (TAPSO), триэтаноламина (ТЭА), 2-[трис(гидроксиметил)метиламино]этансульфоновой кислоты (TES), N-[трис(гидроксиметил)метил]глицина (трицина) и трис(гидроксиметил)аминометана (триса).

В варианте осуществления диафильтрационный буфер выбран из группы, состоящей из соли уксусной кислоты (ацетата), соли лимонной кислоты (цитрата), соли муравьиной кислоты (формиата), соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), соли фосфорной кислоты (фосфата) и соли янтарной кислоты (сукцината). В варианте осуществления диафильтрационный буфер представляет собой соль лимонной кислоты (цитрат). В варианте осуществления диафильтрационный буфер представляет собой соль янтарной кислоты (сукцинат). В варианте осуществления указанной солью является натриевая соль. В варианте осуществления указанной солью является калиевая соль.

В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 4,0-11,0, в пределах приблизительно 5,0-10,0, в пределах приблизительно 5,5-9,0, в пределах приблизительно 6,0-8,0, в пределах приблизительно 6,0-7,0, в пределах приблизительно 6,5-7,5, в пределах приблизительно 6,5-7,0 или в пределах приблизительно 6,0-7,5. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0, приблизительно 10,5 или приблизительно 11,0. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5 или приблизительно 9,0. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,5, приблизительно 7,0 или приблизительно 7,5. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 7,0.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 0,1 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 0,5 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 1 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 2 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 3 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 4 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 5 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 6 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 7 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 8 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 9 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 10 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 11 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 12 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 13 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 14 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 15 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 16 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 17 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 18 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 19 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 20 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 25 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 30 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 35 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 40 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 45 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 50 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 55 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 60 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 65 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 70 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 75 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 80 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 85 мМ-100 мМ, в пределах приблизительно 90 мМ-100 мМ или в пределах приблизительно 95 мМ-100 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 0,1 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 0,5 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 1 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 2 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 3 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 4 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 5 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 6 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 7 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 8 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 9 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 10 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 11 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 12 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 13 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 14 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 15 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 16 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 17 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 18 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 19 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 20 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 25 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 30 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 35 мМ-50 мМ, в пределах приблизительно 40 мМ-50 мМ или в пределах приблизительно 45 мМ-50 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 0,1 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 0,5 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 1 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 2 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 3 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 4 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 5 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 6 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 7 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 8 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 9 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 10 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 11 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 12 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 13 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 14 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 15 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 16 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 17 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 18 мМ-25 мМ, в пределах приблизительно 19 мМ-25 мМ или в пределах приблизительно 20 мМ-25 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 0,1 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 0,5 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 1 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 2 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 3 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 4 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 5 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 6 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 7 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 8 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 9 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 10 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 11 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 12 мМ-15 мМ, в пределах приблизительно 13 мМ-15 мМ или в пределах приблизительно 14 мМ-15 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 0,1 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 0,5 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 1 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 2 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 3 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 4 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 5 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 6 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 7 мМ-10 мМ, в пределах приблизительно 8 мМ-10 мМ или в пределах приблизительно 9 мМ-10 мМ.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,01 мМ, приблизительно 0,05 мМ, приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 0,3 мМ, приблизительно 0,4 мМ, приблизительно 0,5 мМ, приблизительно 0,6 мМ, приблизительно 0,7 мМ, приблизительно 0,8 мМ, приблизительно 0,9 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 или приблизительно 100 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ или приблизительно 50 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 10 мМ.

В варианте осуществления раствор для замены включает хелатообразователь. В варианте осуществления раствор для замены включает хелатообразователь на основе квасцов. В некоторых вариантах осуществления хелатообразователь выбран из групп, состоящих из этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин-N,N',N'-триуксусной кислоты (ЭДТА-ОН), гидроксиэтилендиаминтриуксусной кислоты (ГЭДТА), этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1,2-циклогександиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (CyDTA), диэтилентриамин-N,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты (DTPA), 1,3-диаминопропан-2-ол-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (DPTA-OH), этилендиамин-N,N'-бис(2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA), этилендиамин-N,N'-дипропионовой кислоты дигидрохлорид (EDDP), этилендиамин-тетракис(метиленсульфоновой кислоты) (EDTPO), нитрилотрис(метиленфосфоновой кислоты) (NTPO), иминодиуксусной кислоты (IDA), гидроксииминодиуксусной кислоты (HIDA), нитрилотриуксусной кислоты (NTP), триэтилентетрамингексауксусной кислоты (TTHA), димеркаптоянтарной кислоты (DMSA), 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновой кислоты (DMPS), альфа-липоевой кислоты (ALA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), тиаминтетрагидрофурфурил-дисульфида (TTFD), димеркапрола, пеницилламина, дефероксамина (DFOA), деферасирокса, фосфонатов, соли лимонной кислоты (цитрата) и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления хелатообразователь выбран из групп, состоящих из этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин-N,N',N'-триуксусной кислоты (ЭДТА-ОН), гидроксиэтилендиаминтриуксусной кислоты (ГЭДТА), этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1,2-циклогександиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (CyDTA), диэтилентриамин-N,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты (DTPA), 1,3-диаминопропан-2-ол-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (DPTA-OH), этилендиамин-N,N'-бис(2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA), соли лимонной кислоты (цитрата) и их комбинаций.

В некоторых вариантах осуществления хелатообразователем является этилендиаминтетраацетат (ЭДТА).

В некоторых вариантах осуществления хелатообразователем является соль лимонной кислоты (цитрат). В некоторых вариантах осуществления хелатообразователем является цитрат натрия.

Как правило, хелатообразователь используется при концентрации от 1 до 500 мМ. В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 2 до 400 мМ. В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 400 мМ. В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 200 мМ. В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 100 мМ. В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 50 мМ. В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 30 мМ.

В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 0,01 мМ, приблизительно 0,05 мМ, приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 0,3 мМ, приблизительно 0,4 мМ, приблизительно 0,5 мМ, приблизительно 0,6 мМ, приблизительно 0,7 мМ, приблизительно 0,8 мМ, приблизительно 0,9 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 21 мМ, приблизительно 22 мМ, приблизительно 23 мМ, приблизительно 24 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 26 мМ, приблизительно 27 мМ, приблизительно 28 мМ, приблизительно 29 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 31 мМ, приблизительно 32 мМ, приблизительно 33 мМ, приблизительно 34 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 36 мМ, приблизительно 37 мМ, приблизительно 38 мМ, приблизительно 39 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 или приблизительно 100 мМ.

В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 мМ или приблизительно 100 мМ.

В варианте осуществления концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ или приблизительно 50 мМ.

В варианте осуществления раствор для диафильтрационного буфера включает соль. В некоторых вариантах осуществления соль выбрана из групп, состоящих из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном варианте солью является хлорид натрия. В варианте осуществления раствор для диафильтрационного буфера включает хлорид натрия в концентрации приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450 или приблизительно 500 мМ. В одном конкретном варианте осуществления раствор для диафильтрационного буфера включает хлорид натрия в концентрации приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 250 или приблизительно 300 мМ.

В варианте осуществления настоящего изобретения количество диаобъемов составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50. В варианте осуществления настоящего изобретения количество диаобъемов составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95 или приблизительно 100. В варианте осуществления настоящего изобретения количество диаобъемов составляет приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15.

В варианте осуществления настоящего изобретения стадии ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C. В варианте осуществления стадии ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадии ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C. В варианте осуществления стадию ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

В варианте осуществления настоящего изобретения стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C. В варианте осуществления стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C. В варианте осуществления стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

В варианте осуществления настоящего изобретения стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C. В варианте осуществления стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C. В варианте осуществления стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

1.7 Фильтрация через активированный уголь

После обработки раствора в стадии флокуляции в разделе 1.2 выше, раствор, содержащий полисахарид, может быть необязательно дополнительно осветлен в стадии фильтрации с использованием активированного угля.

В варианте осуществления раствор в разделе 1.2, дополнительно обработанный в стадии разделения твердой/жидкой фаз в разделе 1.3 (например, супернатант), дополнительно осветляют в стадии фильтрации через активированный уголь. В варианте осуществления раствор, дополнительно отфильтрованный любым способом в разделе 1.4 выше и/или в стадии фильтрации в разделе 1.5 выше, дополнительно осветляют в стадии фильтрации с использованием активированного угля. В варианте осуществления раствор, дополнительно осветленный в стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации в разделе 1.6 выше, дополнительно осветляют в стадии фильтрации с использованием активированного угля.

Стадия фильтрации с использованием активированного угля обеспечивает дополнительное удаление примесей, происходящих из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008/118752).

В варианте осуществления активированный уголь (также называемый активным древесным углем) добавляют в раствор в количестве, достаточном для поглощения большей части примесей в виде белков и нуклеиновых кислот, а затем удаляют после адсорбции примесей на активированном угле. В варианте осуществления активированный уголь добавляют в виде порошка, в виде слоя гранулированного угля, в виде спрессованного угольного блока или формованного угольного блока (см., например, активированный уголь Norit). В варианте осуществления активированный уголь добавляют в количестве приблизительно 0,1-20% (в/об), 1-15% (в/об), 1-10% (в/об), 2-10% (в/об), 3-10% (в/об), 4-10% (в/об), 5-10% (в/об), 1-5% (в/об) или 2-5% (в/об). Затем смесь перемешивают и оставляют стоять. В варианте осуществления смесь оставляют стоять приблизительно 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 минут или больше. Затем активированный уголь удаляют. Активированный уголь можно удалять, например, с помощью центрифугирования или фильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления раствор фильтруют через активированный уголь, иммобилизованный в матрице. Матрица может быть любым пористым фильтрующим материалом, проницаемым для раствора. Матрица может включать несущий материал и/или связующий материал. Несущий материал может быть синтетическим полимером или полимером природного происхождения. Подходящие синтетические полимеры могут включать полистирол, полиакриламид и полиметилметакрилат, тогда как полимеры природного происхождения могут включать целлюлозу, полисахариды и декстраны, агарозу. Как правило, полимерный несущий материал имеет форму сети волокон для обеспечения механической жесткости. Связующим материалом может быть смола. Матрица может иметь форму мембранного листа. В одном варианте осуществления активированный уголь, иммобилизованный в матрице, имеет форму проточного угольного картриджа. Картридж представляет собой автономную единицу, содержащую иммобилизованный в матрице порошкообразный активированный уголь и изготовленную в виде мембранного листа. Мембранный лист может быть закреплен в пластиковой проницаемой подложке с формированием диска.

В альтернативе мембранный лист может быть намотан по спирали. Для увеличения площади фильтрующей поверхности несколько дисков могут быть уложены друг на друга. В частности, диски, уложенные друг на друга, имеют центральную трубку для сбора и удаления обработанного углем образца из фильтра. Конфигурация установленных друг на друга дисков может иметь форму линзы.

Активированный уголь в угольном фильтре может быть получен из разного сырья, например, торфа, бурого угля, древесины или скорлупы кокосового ореха.

Любой процесс, известный в уровне техники, такой как обработка паром или химическая обработка, может использоваться для активации угля (например, активируемого фосфорной кислотой древесного угля).

В настоящем изобретении активированный уголь, иммобилизованный в матрице, может быть помещен в корпус для получения независимого фильтрующего элемента. Каждый фильтрующий элемент имеет свой впуск и выпуск для очищаемого раствора. Примерами фильтрующих элементов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, являются угольные картриджи производства Cuno Inc. (Meriden, USA) или Pall Corporation (East Hill, USA). В частности, для применения в изобретении подходят угольные фильтры CUNOzeta. Эти угольные фильтры содержат целлюлозную матрицу, в которую включен порошок активированного угля и связан смолой.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-100 микронов, приблизительно 0,05-100 микронов, приблизительно 0,1-100 микронов, приблизительно 0,2-100 микронов, приблизительно 0,3-100 микронов, приблизительно 0,4-100 микронов, приблизительно 0,5-100 микронов, приблизительно 0,6-100 микронов, приблизительно 0,7-100 микронов, приблизительно 0,8-100 микронов, приблизительно 0,9-100 микронов, приблизительно 1-100 микронов, приблизительно 1,25-100 микронов, приблизительно 1,5-100 микронов, приблизительно 1,75-100 микронов, приблизительно 2-100 микронов, приблизительно 3-100 микронов, приблизительно 4-100 микронов, приблизительно 5-100 микронов, приблизительно 6-100 микронов, приблизительно 7-100 микронов, приблизительно 8-100 микронов, приблизительно 9-100 микронов, приблизительно 10-100 микронов, приблизительно 15-100 микронов, приблизительно 20-100 микронов, приблизительно 25-100 микронов, приблизительно 30-100 микронов, приблизительно 40-100 микронов, приблизительно 50-100 микронов или приблизительно 75-100 микронов.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-50 микронов, приблизительно 0,05-50 микронов, приблизительно 0,1-50 микронов, приблизительно 0,2-50 микронов, приблизительно 0,3-50 микронов, приблизительно 0,4-50 микронов, приблизительно 0,5-50 микронов, приблизительно 0,6-50 микронов, приблизительно 0,7-50 микронов, приблизительно 0,8-50 микронов, приблизительно 0,9-50 микронов, приблизительно 1-50 микронов, приблизительно 1,25-50 микронов, приблизительно 1,5-50 микронов, приблизительно 1,75-50 микронов, приблизительно 2-50 микронов, приблизительно 3-50 микронов, приблизительно 4-50 микронов, приблизительно 5-50 микронов, приблизительно 6-50 микронов, приблизительно 7-50 микронов, приблизительно 8-50 микронов, приблизительно 9-50 микронов, приблизительно 10-50 микронов, приблизительно 15-50 микронов, приблизительно 20-50 микронов, приблизительно 25-50 микронов, приблизительно 30-50 микронов, приблизительно 40-50 микронов или приблизительно 50-50 микронов.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-25 микронов, приблизительно 0,05-25 микронов, приблизительно 0,1-25 микронов, приблизительно 0,2-25 микронов, приблизительно 0,3-25 микронов, приблизительно 0,4-25 микронов, приблизительно 0,5-25 микронов, приблизительно 0,6-25 микронов, приблизительно 0,7-25 микронов, приблизительно 0,8-25 микронов, приблизительно 0,9-25 микронов, приблизительно 1-25 микронов, приблизительно 1,25-25 микронов, приблизительно 1,5-25 микронов, приблизительно 1,75-25 микронов, приблизительно 2-25 микронов, приблизительно 3-25 микронов, приблизительно 4-25 микронов, приблизительно 5-25 микронов, приблизительно 6-25 микронов, приблизительно 7-25 микронов, приблизительно 8-25 микронов, приблизительно 9-25 микронов, приблизительно 10-25 микронов, приблизительно 15-25 микронов или приблизительно 20-25 микронов.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-10 микронов, приблизительно 0,05-10 микронов, приблизительно 0,1-10 микронов, приблизительно 0,2-10 микронов, приблизительно 0,3-10 микронов, приблизительно 0,4-10 микронов, приблизительно 0,5-10 микронов, приблизительно 0,6-10 микронов, приблизительно 0,7-10 микронов, приблизительно 0,8-10 микронов, приблизительно 0,9-10 микронов, приблизительно 1-10 микронов, приблизительно 1,25-10 микронов, приблизительно 1,5-10 микронов, приблизительно 1,75-10 микронов, приблизительно 2-10 микронов, приблизительно 3-10 микронов, приблизительно 4-10 микронов, приблизительно 5-10 микронов, приблизительно 6-10 микронов, приблизительно 7-10 микронов, приблизительно 8-10 микронов или приблизительно 9-10 микронов.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-8 микронов, приблизительно 0,05-8 микронов, приблизительно 0,1-8 микронов, приблизительно 0,2-8 микронов, приблизительно 0,3-8 микронов, приблизительно 0,4-8 микронов, приблизительно 0,5-8 микронов, приблизительно 0,6-8 микронов, приблизительно 0,7-8 микронов, приблизительно 0,8-8 микронов, приблизительно 0,9-8 микронов, приблизительно 1-8 микронов, приблизительно 1,25-8 микронов, приблизительно 1,5-8 микронов, приблизительно 1,75-8 микронов, приблизительно 2-8 микронов, приблизительно 3-8 микронов, приблизительно 4-8 микронов, приблизительно 5-8 микронов, приблизительно 6-8 микронов или приблизительно 7-8 микронов.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-5 микронов, приблизительно 0,05-5 микронов, приблизительно 0,1-5 микронов, приблизительно 0,2-5 микронов, приблизительно 0,3-5 микронов, приблизительно 0,4-5 микронов, приблизительно 0,5-5 микронов, приблизительно 0,6-5 микронов, приблизительно 0,7-5 микронов, приблизительно 0,8-5 микронов, приблизительно 0,9-5 микронов, приблизительно 1-5 микронов, приблизительно 1,25-5 микронов, приблизительно 1,5-5 микронов, приблизительно 1,75-5 микронов, приблизительно 2-5 микронов, приблизительно 3-5 микронов или приблизительно 4-5 микронов.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-2 микрона, приблизительно 0,05-2 микрона, приблизительно 0,1-2 микрона, приблизительно 0,2-2 микрона, приблизительно 0,3-2 микрона, приблизительно 0,4-2 микрона, приблизительно 0,5-2 микрона, приблизительно 0,6-2 микрона, приблизительно 0,7-2 микрона, приблизительно 0,8-2 микрона, приблизительно 0,9-2 микрона, приблизительно 1-2 микрона, приблизительно 1,25-2 микрона, приблизительно 1,5-2 микрона, приблизительно 1,75-2 микрона, приблизительно 2-2 микрона, приблизительно 3-2 микрона или приблизительно 4-2 микрона.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-1 микрон, приблизительно 0,05-1 микрон, приблизительно 0,1-1 микрон, приблизительно 0,2-1 микрон, приблизительно 0,3-1 микрон, приблизительно 0,4-1 микрон, приблизительно 0,5-1 микрон, приблизительно 0,6-1 микрон, приблизительно 0,7-1 микрон, приблизительно 0,8-1 микрон или приблизительно 0,9-1 микрон.

В варианте осуществления фильтр с активированным углем, раскрытый выше, имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,05-50 микронов, 0,1-25 микронов, 0,2-10 микронов, 0,1-10 микронов, 0,2-5 микронов или 0,25-1 микрон.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят при скорости поступающего потока в пределах 1-500 лмч, 10-500 лмч, 15-500 лмч, 20-500 лмч, 25-500 лмч, 30-500 лмч, 40-500 лмч, 50-500 лмч, 100-500 лмч, 125-500 лмч, 150-500 лмч, 200-500 лмч, 250-500 лмч, 300-500 лмч или 400-500 лмч.

В варианте осуществления стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят при скорости поступающего потока в пределах 1-200 лмч, 10-200 лмч, 15-200 лмч, 20-200 лмч, 25-200 лмч, 30-200 лмч, 40-200 лмч, 50-200 лмч, 100-200 лмч, 125-200 лмч или 150-200 лмч.

В варианте осуществления стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят при скорости поступающего потока в пределах 1-150 лмч, 10-150 лмч, 15-150 лмч, 20-150 лмч, 25-150 лмч, 30-150 лмч, 40-150 лмч, 50-150 лмч, 100-150 лмч или 125-150 лмч.

В варианте осуществления стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят при скорости поступающего потока в пределах 1-100 лмч, 10-100 лмч, 15-100 лмч, 20-100 лмч, 25-100 лмч, 30-100 лмч, 40-100 лмч или 50-100 лмч.

В варианте осуществления стадия фильтрации активированного угля проводят проводят при скорости поступающего потока в пределах 1-75 лмч, 5-75 лмч, 10-75 лмч, 15-75 лмч, 20-75 лмч, 25-75 лмч, 30-75 лмч, 35-75 лмч, 40-75 лмч, 45-75 лмч, 50-75 лмч, 55-75 лмч, 60-75 лмч, 65-75 лмч или 70-75 лмч.

В варианте осуществления стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят при скорости поступающего потока в пределах 1-50 лмч, 5-50 лмч, 7-50 лмч, 10-50 лмч, 15-50 лмч, 20-50 лмч, 25-50 лмч, 30-50 лмч, 35-50 лмч, 40-50 лмч или 45-50 лмч.

Любое целое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят при скорости поступающего потока приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 225, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 950 или приблизительно 1000 лмч.

В варианте осуществления раствор обрабатывают фильтром с активированным углем, где фильтр имеет производительность в пределах 5-1000 л/м², 10-750 л/м², 15-500 л/м², 20-400 л/м², 25-300 л/м², 30-250 л/м², 40-200 л/м² или 30-100 л/м².

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают фильтром с активированным углем, где фильтр имеет производительность приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 175, приблизительно 200, приблизительно 225, приблизительно 250, приблизительно 275, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900 или приблизительно 1000 л/м².

Если содержание нежелательных примесей превышает фиксированный порог после первой стадии фильтрации с использованием активированного угля, указанную стадию можно повторить. В варианте осуществления настоящего изобретения проводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 стадий фильтрации с использованием активированного угля. В варианте осуществления настоящего изобретения проводят 1, 2 или 3 стадии фильтрации с использованием активированного угля. В варианте осуществления настоящего изобретения проводят 1 или 2 стадии фильтрации с использованием активированного угля.

В варианте осуществления раствор обрабатывают фильтрами с активированным углем последовательно. В варианте осуществления раствор последовательно обрабатывают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фильтрами с активированным углем. В варианте осуществления раствор последовательно обрабатывают 2, 3, 4 или 5 фильтрами с активированным углем. В варианте осуществления раствор последовательно обрабатывают 2 фильтрами с активированным углем. В варианте осуществления раствор последовательно обрабатывают 3 фильтрами с активированным углем. В варианте осуществления раствор последовательно обрабатывают 4 фильтрами с активированным углем. В варианте осуществления раствор последовательно обрабатывают 5 фильтрами с активированным углем.

В варианте осуществления стадию фильтрации активированного угля проводят в однопоточном режиме.

В другом варианте осуществления стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят в режиме рециркуляции. В указанном варианте осуществления (режиме рециркуляции) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 циклов фильтрации активированного угля выполняются. В другом варианте осуществления проводят 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 циклов фильтрации с использованием активированного угля. В варианте осуществления проводят 2 или 3 цикла фильтрации с использованием активированного угля. В варианте осуществления проводят 2 цикла фильтрации с использованием активированного угля.

1.8 Необязательная дополнительная фильтрация

После обработки раствора в стадии с активированным углем в разделе 1.7 выше, полученный раствор (т.е. фильтрат) может быть необязательно дополнительно отфильтрован.

В варианте осуществления раствор подвергают микрофильтрации. В варианте осуществления микрофильтрация является тупиковой фильтрацией (перпендикулярной фильтрацией).

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-2 микрона, приблизительно 0,05-2 микрона, приблизительно 0,1-2 микрона, приблизительно 0,2-2 микрона, приблизительно 0,3-2 микрона, приблизительно 0,4-2 микрона, приблизительно 0,45-2 микрона, приблизительно 0,5-2 микрона, приблизительно 0,6-2 микрона, приблизительно 0,7-2 микрона, приблизительно 0,8-2 микрона, приблизительно 0,9-2 микрона, приблизительно 1-2 микрона, приблизительно 1,25-2 микрона, приблизительно 1,5-2 микрона или приблизительно 1,75-2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-1 микрон, приблизительно 0,05-1 микрон, приблизительно 0,1-1 микрон, приблизительно 0,2-1 микрон, приблизительно 0,3-1 микрон, приблизительно 0,4-1 микрон, приблизительно 0,45-1 микрон, приблизительно 0,5-1 микрон, приблизительно 0,6-1 микрон, приблизительно 0,7-1 микрон, приблизительно 0,8-1 микрон или приблизительно 0,9-1 микрон.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный показатель задерживания приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,45, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9 или приблизительно 2,0 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет номинальный показатель задерживания приблизительно 0,2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность 100-6000 л/м², 200-6000 л/м², 300-6000 л/м², 400-6000 л/м², 500-6000 л/м², 750-6000 л/м², 1000-6000 л/м², 1500-6000 л/м², 2000-6000 л/м², 3000-6000 л/м² или 4000-6000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность 100-4000 л/м², 200-4000 л/м², 300-4000 л/м², 400-4000 л/м², 500-4000 л/м², 750-4000 л/м², 1000-4000 л/м², 1500-4000 л/м², 2000-4000 л/м², 2500-4000 л/м², 3000-4000 л/м², 3000-4000 л/м² или 3500-4000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность 100-3750 л/м², 200-3750 л/м², 300-3750 л/м², 400-3750 л/м², 500-3750 л/м², 750-3750 л/м², 1000-3750 л/м², 1500-3750 л/м², 2000-3750 л/м², 2500-3750 л/м², 3000-3750 л/м², 3000-3750 л/м² или 3500-3750 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность 100-1250 л/м², 200-1250 л/м², 300-1250 л/м², 400-1250 л/м², 500-1250 л/м², 750-1250 л/м² или 1000-1250 л/м².

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400, приблизительно 1500, приблизительно 1600, приблизительно 1700, приблизительно 1800, приблизительно 1900, приблизительно 2000, приблизительно 2100, приблизительно 2200, приблизительно 2300, приблизительно 2400, приблизительно 2500, приблизительно 2600, приблизительно 2700, приблизительно 2800, приблизительно 2900, приблизительно 3000, приблизительно 3100, приблизительно 3200, приблизительно 3300, приблизительно 3400, приблизительно 3500, приблизительно 3600, приблизительно 3700, приблизительно 3800, приблизительно 3900, приблизительно 4000, приблизительно 4100, приблизительно 4200, приблизительно 4300, приблизительно 4400, приблизительно 4500, приблизительно 4600, приблизительно 4700, приблизительно 4800, приблизительно 4900, приблизительно 5000, приблизительно 5250, приблизительно 5500, приблизительно 5750 или приблизительно 6000 л/м².

1.9 Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция обеспечивает удаление любых примесей, которые обладают гидрофобными свойствами, таких как остаточные липополисахариды (эндотоксины), оставшиеся после предыдущих стадий очистки.

После обработки раствора в стадии флокуляции в разделе 1.2 выше, раствор, содержащий полисахарид, может быть необязательно дополнительно очищен в стадии HIC.

В варианте осуществления раствор в разделе 1.2, дополнительно обработанный в стадии разделения твердой/жидкой фаз в разделе 1.3 (например, супернатант), дополнительно очищают в стадии HIC. В варианте осуществления раствор, дополнительно отфильтрованный любым способом в разделе 1.5 выше и/или в стадии фильтрации в разделе 1.4 выше, дополнительно очищают в стадии HIC. В варианте осуществления раствор, дополнительно осветленный в стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации в разделе 1.6 выше, дополнительно очищают в стадии HIC. В варианте осуществления раствор, дополнительно осветленный в стадии фильтрации с использованием активированного угля в разделе 1.7, дополнительно очищают в стадии HIC.

В варианте осуществления раствор, дополнительно осветленный в стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации в разделе 1.6 выше, подвергается дополнительной очистке в стадии ионообменной мембранной фильтрации (IEX) и затем может быть дополнительно очищен в стадии HIC.

В варианте осуществления стадию HIC проводят при использовании гидрофобного адсорбента, выбранного, без ограничения этим, из группы, состоящей из фенилзамещенной мембраны, бутил-, фенил- и октилагарозы, бутил-, фенил-, эфир- полипропиленгликоль- и гексилзамещенной органической полимерной смолы.

В варианте осуществления гидрофобный адсорбент, используемый в стадии HIC, представляет собой фенилзамещенную мембрану, такую как мембрана SARTOBIND Phenyl или мембрану CYTIVA Phenyl Adsorber.

В варианте осуществления гидрофобный адсорбент, используемый в стадии HIC, представляет собой фенилзамещенную мембрану SARTOBIND Phenyl.

В варианте осуществления материал из предыдущей стадии (например, угольный фильтрат) обрабатывают уравновешивающим буфером с получением подвижного буфера, включающего материал, подлежащий очистке, и требуемую концентрацию соли. В варианте осуществления уравновешивающий буфер включает соль, и конечная концентрация соли (т.е. в подвижном буфере) выбрана из приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9, приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9, приблизительно 6,0, приблизительно 6,1, приблизительно 6,2, приблизительно 6,3, приблизительно 6,4, приблизительно 6,5, приблизительно 6,6, приблизительно 6,7, приблизительно 6,8, приблизительно 6,9 или приблизительно 7,0 M. В одном варианте осуществления подвижный буфер имеет pH от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0. В одном варианте осуществления pH подвижного буфера составляет приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9, приблизительно 6,0, приблизительно 6,1, приблизительно 6,2, приблизительно 6,3, приблизительно 6,4, приблизительно 6,5, приблизительно 6,6, приблизительно 6,7, приблизительно 6,8, приблизительно 6,9, приблизительно 7,0, приблизительно 7,1, приблизительно 7,2, приблизительно 7,3, приблизительно 7,4, приблизительно 7,5, приблизительно 7,6, приблизительно 7,7, приблизительно 7,8, приблизительно 7,9 или приблизительно 8,0. В варианте осуществления уравновешивающий буфер включает соль, выбранную из сульфата аммония (предпочтительно в конечной концентрации в подвижном буфере 0,5-3,0М и pH 6,0±2,0), фосфат натрия (предпочтительно в конечной концентрации в подвижном буфере 0,5-3,0М и pH 7,0±1,5), фосфат калия (предпочтительно в конечной концентрации в подвижном буфере 0,5-3,0М и pH 7,0±1,5), сульфат натрия (предпочтительно в конечной концентрации в подвижном буфере 0,1-0,75М и pH 6,0±2,0), цитрат натрия (предпочтительно в конечной концентрации в подвижном буфере 0,1-1,5М и pH 6,0±2,0) или хлорид натрия (предпочтительно в конечной концентрации в подвижном буфере 0,5-5,0М и pH 7,0±1,5).

В варианте осуществления уравновешивающий буфер включает сульфат аммония, и конечная концентрация соли в подвижном буфере составляет от приблизительно 1,0М до приблизительно 2,0М, предпочтительно приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0М.

В варианте осуществления гидрофобный адсорбент уравновешивают с использованием подвижного буфера, а затем подлежащий очистке материал в подвижном буфере пропускают через колонку или мембрану.

В варианте осуществления гидрофобный адсорбент представляет собой фенилзамещенную мембрану, и скорость потока составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 объемов мембраны в мин, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 объемов мембраны в мин, от приблизительно 0,2 до приблизительно 10 объемов мембраны в мин, от приблизительно 0,2 до приблизительно 5 объемов мембраны в мин, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 объема мембраны в мин. В варианте осуществления гидрофобный адсорбент представляет собой фенилзамещенную мембрану, и скорость потока составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0 объема мембраны в мин, предпочтительно приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9 или приблизительно 1,0 объема мембраны в мин.

В варианте осуществления HIC мембрану затем промывают подвижным буфером, и также могут дополнительно промывать водой. Выходящий поток элюата вместе с промывочным буфером собирали в качестве HIC фильтрата, и промывочную воду также собирали для анализа.

1.10 Ультрафильтрация/Диафильтрация

После обработки раствора в стадии HIC в разделе 1.9 выше и/или в дополнительной стадии фильтрации в разделе 1.8 выше, полученный раствор (т.е. фильтрат) может быть необязательно дополнительно осветлен с помощью ультрафильтрации и/или диафильтрации.

В варианте осуществления настоящего изобретения раствор (например, полученный в разделе 1.9 или 1.8 выше) обрабатывают ультрафильтрацией.

В варианте осуществления раствор обрабатывают ультрафильтрацией, и отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 1000 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 750 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 500 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 300 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 100 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 50 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 30 кДа. В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 10 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 20 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 30 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 40 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 50 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 75 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 100 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 150 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 200 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 300 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 400 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 500 кДа до 1000 кДа или приблизительно от 750 кДа до 1000 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 500 кДа, приблизительно от 10 кДа до 500 кДа, приблизительно от 20 кДа до 500 кДа, приблизительно от 30 кДа до 500 кДа, приблизительно от 40 кДа до 500 кДа, приблизительно от 50 кДа до 500 кДа, приблизительно от 75 кДа до 500 кДа, приблизительно от 100 кДа до 500 кДа, приблизительно от 150 кДа до 500 кДа, приблизительно от 200 кДа до 500 кДа, приблизительно от 300 кДа до 500 кДа или приблизительно от 400 кДа до 500 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно приблизительно от 5 кДа до 300 кДа, приблизительно от 10 кДа до 300 кДа, приблизительно от 20 кДа до 300 кДа, приблизительно от 30 кДа до 300 кДа, приблизительно от 40 кДа до 300 кДа, приблизительно от 50 кДа до 300 кДа, приблизительно от 75 кДа до 300 кДа, приблизительно от 100 кДа до 300 кДа, приблизительно от 150 кДа до 300 кДа или приблизительно от 200 кДа до 300 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 100 кДа, приблизительно от 10 кДа до 100 кДа, приблизительно от 20 кДа до 100 кДа, приблизительно от 30 кДа до 100 кДа, приблизительно от 40 кДа до 100 кДа, приблизительно от 50 кДа до 100 кДа или приблизительно от 75 кДа до 100 кДа.

В варианте осуществления отсечение по молекулярной массе мембраны, составляет приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 50 кДа, приблизительно 60 кДа, приблизительно 70 кДа, приблизительно 80 кДа, приблизительно 90 кДа, приблизительно 100 кДа, приблизительно 110 кДа, приблизительно 120 кДа, приблизительно 130 кДа, приблизительно 140 кДа, приблизительно 150 кДа, приблизительно 200 кДа, приблизительно 250 кДа, приблизительно 300 кДа, приблизительно 400 кДа, приблизительно 500 кДа, приблизительно 750 кДа или приблизительно 1000 кДа.

В варианте осуществления коэффициент концентрирования стадии ультрафильтрации составляет от приблизительно 1,5 до приблизительно 10,0. В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет от приблизительно 2,0 до приблизительно 8,0. В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет от приблизительно 2,0 до приблизительно 5,0.

В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5 или приблизительно 10,0. В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет приблизительно 2,0, приблизительно 3,0, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0 или приблизительно 6,0.

В варианте осуществления настоящего изобретения раствор (например, фильтрат, полученный в разделе 1.9 или 1.8 выше), обрабатывает диафильтрацией.

В варианте осуществления настоящего изобретения раствор, полученный после ультрафильтрации (UF), как раскрыто в настоящем разделе выше, дополнительно обрабатывают диафильтрацией (обработка UF/DF).

Диафильтрация (DF) используется для обмена продукта в требуемом буферном растворе (или только воде). В варианте осуществления диафильтрацию используют для изменения химических свойств удерживаемого раствора при постоянном объеме. Нежелательные частицы проходят через мембрану, тогда как состав потока поступающего материала изменяется до более желаемого состояния посредством добавления раствора для замены (буферный раствор, солевой раствор, буферный солевой раствор или вода).

В варианте осуществления раствором для замены является вода.

В варианте осуществления раствором для замены является солевой раствор в воде. В некоторых вариантах осуществления соль выбрана из групп, состоящих из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном варианте осуществления солью является хлорид натрия. В варианте осуществления раствором для замены является хлорид натрия в концентрации приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450 или приблизительно 500 мМ. В одном конкретном варианте осуществления раствором для замены является хлорид натрия в концентрации приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 250 или приблизительно 300 мМ. В одном конкретном варианте раствором для замены является хлорид натрия в концентрации приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90 или приблизительно 100 мМ.

В варианте осуществления раствором для замены является буферный раствор. В варианте осуществления раствором для замены является буферный раствор, где буфер выбран из группы, состоящей из N-(2-ацетамидо)аминоэтансульфоновой кислоты (ACES), соли уксусной кислоты (ацетата), N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты (ADA), 2-аминоэтансульфоновой кислоты (AES, таурина), аммиака, 2-амино-2-метил-1-пропанола (AMP), 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола AMPD, аммедиола, N-(1,1-диметил-2-гидроксиэтил)-3-амино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (AMPSO), N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES), гидрокарбоната (бикарбоната) натрия, N,N'-бис(2-гидроксиэтил)-глицина (бицина), [бис-(2-гидроксиэтил)-имино]-трис-(гидроксиметилметана) (бис-триса), 1,3-бис[трис(гидроксиметил)-метиламино]пропана (бис-трис-пропана), борной кислоты, диметиларсиновой кислоты (какодилата), 3-(циклогексиламино)-пропансульфоновой кислоты (CAPS), 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновой кислоты (CAPSO), карбоната натрия (Карбоната), циклогексиламиноэтансульфоновой кислоты (CHES), соли лимонной кислоты (цитрата), 3-[N-бис(гидроксиэтил)амино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (DIPSO), соли муравьиной кислоты (формиата), глицина, глицилглицина, N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-этансульфоновой кислоты (HEPES), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-3-пропансульфоновой кислоты (HEPPS, EPPS), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-2-гидроксипропан-сульфоновой кислоты (HEPPSO), имидазола, соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES), 3-(N-морфолино)-пропансульфоновой кислоты (MOPS), 3-(N-морфолино)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO), соли фосфорной кислоты (фосфата), пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES), пиперазин-N,N'-бис(2-гидроксипропансульфоновой кислоты) (POPSO), пиридина, соли янтарной кислоты (сукцината), 3-{[трис(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновой кислоты (TAPS), 3-[N-трис(гидроксиметил)-метиламино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (TAPSO), триэтаноламина (ТЭА), 2-[трис(гидроксиметил)метиламино]этансульфоновой кислоты (TES), N-[трис(гидроксиметил)метил]глицина (трицина) и трис(гидроксиметил)аминометана (триса).

В варианте осуществления диафильтрационный буфер выбран из группы, состоящей из соли уксусной кислоты (ацетата), соли лимонной кислоты (цитрата), соли муравьиной кислоты (формиата), соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), соли фосфорной кислоты (фосфата) и соли янтарной кислоты (сукцината). В варианте осуществления диафильтрационный буфер представляет собой соль лимонной кислоты (цитрат). В варианте осуществления диафильтрационный буфер представляет собой соль янтарной кислоты (сукцинат). В варианте осуществления диафильтрационный буфер представляет собой соль фосфорной кислоты (фосфат). В варианте осуществления указанной солью является натриевая соль. В варианте осуществления указанной солью является калиевая соль

В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 4,0-11,0, в пределах приблизительно 5,0-10,0, в пределах приблизительно 5,5-9,0, в пределах приблизительно 6,0-8,0, в пределах приблизительно 6,0-7,0, в пределах приблизительно 6,5-7,5, в пределах приблизительно 6,5-7,0 или в пределах приблизительно 6,0-7,5. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0, приблизительно 10,5 или приблизительно 11,0. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5 или приблизительно 9,0. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно приблизительно 6,5, приблизительно 7,0 или приблизительно 7,5. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,0. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,5. В варианте осуществления pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 7,0.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 100 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 100 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 100 мМ, приблизительно от 1 мМ до 100 мМ, приблизительно от 2 мМ до 100 мМ, приблизительно от 3 мМ до 100 мМ, приблизительно от 4 мМ до 100 мМ, приблизительно от 5 мМ до 100 мМ, приблизительно от 6 мМ до 100 мМ, приблизительно от 7 мМ до 100 мМ, приблизительно от 8 мМ до 100 мМ, приблизительно от 9 мМ до 100 мМ, приблизительно от 10 мМ до 100 мМ, приблизительно от 11 мМ до 100 мМ, приблизительно от 12 мМ до 100 мМ, приблизительно от 13 мМ до 100 мМ, приблизительно от 14 мМ до 100 мМ, приблизительно от 15 мМ до 100 мМ, приблизительно от 16 мМ до 100 мМ, приблизительно от 17 мМ до 100 мМ, приблизительно от 18 мМ до 100 мМ, приблизительно от 19 мМ до 100 мМ, приблизительно от 20 мМ до 100 мМ, приблизительно от 25 мМ до 100 мМ, приблизительно от 30 мМ до 100 мМ, приблизительно от 35 мМ до 100 мМ, приблизительно от 40 мМ до 100 мМ, приблизительно от 45 мМ до 100 мМ, приблизительно от 50 мМ до 100 мМ, приблизительно от 55 мМ до 100 мМ, приблизительно от 60 мМ до 100 мМ, приблизительно от 65 мМ до 100 мМ, приблизительно от 70 мМ до 100 мМ, приблизительно от 75 мМ до 100 мМ, приблизительно от 80 мМ до 100 мМ, приблизительно от 85 мМ до 100 мМ, приблизительно от 90 мМ до 100 мМ или приблизительно от 95 мМ до 100 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 50 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 50 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 50 мМ, приблизительно от 1 мМ до 50 мМ, приблизительно от 2 мМ до 50 мМ, приблизительно от 3 мМ до 50 мМ, приблизительно от 4 мМ до 50 мМ, приблизительно от 5 мМ до 50 мМ, приблизительно от 6 мМ до 50 мМ, приблизительно от 7 мМ до 50 мМ, приблизительно от 8 мМ до 50 мМ, приблизительно от 9 мМ до 50 мМ, приблизительно от 10 мМ до 50 мМ, приблизительно от 11 мМ до 50 мМ, приблизительно от 12 мМ до 50 мМ, приблизительно от 13 мМ до 50 мМ, приблизительно от 14 мМ до 50 мМ, приблизительно от 15 мМ до 50 мМ, приблизительно от 16 мМ до 50 мМ, приблизительно от 17 мМ до 50 мМ, приблизительно от 18 мМ до 50 мМ, приблизительно от 19 мМ до 50 мМ, приблизительно от 20 мМ до 50 мМ, приблизительно от 25 мМ до 50 мМ, приблизительно от 30 мМ до 50 мМ, приблизительно от 35 мМ до 50 мМ, приблизительно от 40 мМ до 50 мМ или приблизительно от 45 мМ до 50 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 25 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 25 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 25 мМ, приблизительно от 1 мМ до 25 мМ, приблизительно от 2 мМ до 25 мМ, приблизительно от 3 мМ до 25 мМ, приблизительно от 4 мМ до 25 мМ, приблизительно от 5 мМ до 25 мМ, приблизительно от 6 мМ до 25 мМ, приблизительно от 7 мМ до 25 мМ, приблизительно от 8 мМ до 25 мМ, приблизительно от 9 мМ до 25 мМ, приблизительно от 10 мМ до 25 мМ, приблизительно от 11 мМ до 25 мМ, приблизительно от 12 мМ до 25 мМ, приблизительно от 13 мМ до 25 мМ, приблизительно от 14 мМ до 25 мМ, приблизительно от 15 мМ до 25 мМ, приблизительно от 16 мМ до 25 мМ, приблизительно от 17 мМ до 25 мМ, приблизительно от 18 мМ до 25 мМ, приблизительно от 19 мМ до 25 мМ или приблизительно от 20 мМ до 25 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 15 мМ, приблизительно от 0.1 мМ до 15 мМ, приблизительно от 0.5 мМ до 15 мМ, приблизительно от 1 мМ до 15 мМ, приблизительно от 2 мМ до 15 мМ, приблизительно от 3 мМ до 15 мМ, приблизительно от 4 мМ до 15 мМ, приблизительно от 5 мМ до 15 мМ, приблизительно от 6 мМ до 15 мМ, приблизительно от 7 мМ до 15 мМ, приблизительно от 8 мМ до 15 мМ, приблизительно от 9 мМ до 15 мМ, приблизительно от 10 мМ до 15 мМ, приблизительно от 11 мМ до 15 мМ, приблизительно от 12 мМ до 15 мМ, приблизительно от 13 мМ до 15 мМ или приблизительно от 14 мМ до 15 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ до 10 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 10 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 10 мМ, приблизительно от 1 мМ до 10 мМ, приблизительно от 2 мМ до 10 мМ, приблизительно от 3 мМ до 10 мМ, приблизительно от 4 мМ до 10 мМ, приблизительно от 5 мМ до 10 мМ, приблизительно от 6 мМ до 10 мМ, приблизительно от 7 мМ до 10 мМ, приблизительно от 8 мМ до 10 мМ или приблизительно от 9 мМ до 10 мМ.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,01 мМ, приблизительно 0,05 мМ, приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 0,3 мМ, приблизительно 0,4 мМ, приблизительно 0,5 мМ, приблизительно 0,6 мМ, приблизительно 0,7 мМ, приблизительно 0,8 мМ, приблизительно 0,9 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мм, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 или приблизительно 100 мМ.

В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ, или приблизительно 50 мМ. В варианте осуществления, концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 30 мМ. В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 25 мМ. В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 20 мМ. В варианте осуществления концентрация диафильтрационного буфера является приблизительно 15 мМ. В варианте осуществления, концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 10 мМ.

В варианте осуществления раствор диафильтрационного буфера включает соль. В некоторых вариантах осуществления соль выбрана из групп, состоящих из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном варианте соль является хлоридом натрия. В одном конкретном варианте осуществления раствор диафильтрационного буфера включает хлорид натрия в концентрации приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 250 или приблизительно 300 мМ.

В варианте осуществления настоящего изобретения количество диаобъемов составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50. В варианте осуществления настоящего изобретения количество диаобъемов составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95 или приблизительно 100. В варианте осуществления настоящего изобретения количество диаобъемов составляет приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15.

В варианте осуществления настоящего изобретения стадии ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C. В варианте осуществления стадии ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадии ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C. В варианте осуществления стадию ультрафильтрации и диафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

В варианте осуществления настоящего изобретения стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C. В варианте осуществления стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C. В варианте осуществления стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

В варианте осуществления настоящего изобретения стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C. В варианте осуществления стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C. Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C. В варианте осуществления стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

1.11 Гомогенизация/доводка по размеру

Полисахарид может быть немного уменьшен в размере во время процедур очистки.

В варианте осуществления очищенный раствор полисахарида согласно настоящему изобретению (например, полученный с помощью ультрафильтрации и/или диафильтрации в разделе 1.10) не доводят по размеру.

В варианте осуществления полисахарид может быть гомогенизирован с помощью методов доводки по размеру. Может использоваться механическая или химическая доводка по размеру. Химический гидролиз можно проводить с использованием, например, уксусной кислоты. Механическую доводку по размеру можно проводить при использовании гомогенизации высокого давления.

Таким образом, в варианте осуществления очищенный раствор полисахарида, полученный с помощью ультрафильтрации и/или диафильтрации в разделе 1.10, доводят по размеру до целевой молекулярной массы.

При использовании в настоящем документе термин "молекулярная масса" полисахарида относится к молекулярной массе, вычисленной, например, с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) в сочетании с детектором многоуглового рассеяния лазерного излучения (MALLS).

В некоторых вариантах осуществления очищенный полисахарид доводят до молекулярной массы от приблизительно 5 кДа до приблизительно 4000 кДа. В других таких вариантах осуществления очищенный полисахарид доводят до молекулярной массы от приблизительно 10 кДа до приблизительно 4000 кДа. В других таких вариантах осуществления очищенный полисахарид доводят до молекулярной массы от приблизительно 50 кДа до приблизительно 4000 кДа. В далее таких вариантах осуществления полисахарид очищенный полисахарид доводят до молекулярной массы от приблизительно 50 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 3500 кДа; приблизительно 100 кДа до приблизительно 3000 кДа; приблизительно 100 кДа до приблизительно 2500 кДа; приблизительно 100 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа; или от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа. В других таких вариантах осуществления очищенный полисахарид доводят до молекулярной массы от приблизительно 250 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 3500 кДа; приблизительно 300 кДа до приблизительно 3000 кДа; приблизительно 300 кДа до приблизительно 2500 кДа; приблизительно 300 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 750 кДа; или от приблизительно 500 кДа до приблизительно 600 кДа.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В некоторых вариантах осуществления очищенный полисахарид доводят до молекулярной массы приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 15 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 25 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 35 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 45 кДа, приблизительно 50 кДа, приблизительно 75 кДа, приблизительно 90 кДа, приблизительно 100 кДа, приблизительно 150 кДа, приблизительно 200 кДа, приблизительно 250 кДа, приблизительно 300 кДа, приблизительно 350 кДа, приблизительно 400 кДа, приблизительно 450 кДа, приблизительно 500 кДа, приблизительно 550 кДа, приблизительно 600 кДа, приблизительно 650 кДа, приблизительно 700 кДа, приблизительно 750 кДа, приблизительно 800 кДа, приблизительно 850 кДа, приблизительно 900 кДа, приблизительно 950 кДа, приблизительно 1000 кДа, приблизительно 1250 кДа, приблизительно 1500 кДа, приблизительно 1750 кДа, приблизительно 2000 кДа, приблизительно 2250 кДа, приблизительно 2500 кДа, приблизительно 2750 кДа, приблизительно 3000 кДа, приблизительно 3250 кДа, приблизительно 3500 кДа, приблизительно 3750 кДа или приблизительно 4000 кДа.

В предпочтительном варианте осуществления очищенные полисахариды представляют собой капсульный полисахарид серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F или 33F S. pneumoniae, где капсульный полисахарид имеет молекулярную массу, попадающую в один из диапазонов или имеющую примерно такой размер, как описано в настоящем документе выше.

1.12 Стерилизующая фильтрация

В варианте осуществления очищенный раствор полисахарида согласно изобретению подвергают стерилизующей фильтрации.

Таким образом, в варианте осуществления после стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации в разделе 1.10 необязательно может следовать стадия стерилизующей фильтрации.

В варианте осуществления после стадии гомогенизации/доводки по размеру в разделе 1.11, если таковую проводят, необязательно может следовать стадия стерилизующей фильтрации.

В варианте осуществления после любой из стадий в разделах 1.2-1.9 необязательно может следовать стадия стерилизующей фильтрации.

В варианте осуществления стерилизующая фильтрация является тупиковой фильтрацией (перпендикулярной фильтрацией). В варианте осуществления стерилизующая фильтрация является тангенциальной фильтрацией.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-0,2 микрона, приблизительно 0,05-0,2 микрона, приблизительно 0,1-0,2 микрона или приблизительно 0,15-0,2 микрона.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,15 или приблизительно 0,2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,2 микрона.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет производительность приблизительно 25-1500 л/м², 50-1500 л/м², 75-1500 л/м², 100-1500 л/м², 150-1500 л/м², 200-1500 л/м², 250-1500 л/м², 300-1500 л/м², 350-1500 л/м², 400-1500 л/м², 500-1500 л/м², 750-1500 л/м², 1000-1500 л/м² или 1250-1500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет производительность приблизительно 25-1000 л/м², 50-1000 л/м², 75-1000 л/м², 100-1000 л/м², 150-1000 л/м², 200-1000 л/м², 250-1000 л/м², 300-1000 л/м², 350-1000 л/м², 400-1000 л/м², 500-1000 л/м² или 750-1000 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет производительность 25-500 л/м², 50-500 л/м², 75-500 л/м², 100-500 л/м², 150-500 л/м², 200-500 л/м², 250-500 л/м², 300-500 л/м², 350-500 л/м² или 400-500 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет производительность 25-300 л/м², 50-300 л/м², 75-300 л/м², 100-300 л/м², 150-300 л/м², 200-300 л/м² или 250-300 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет производительность 25-250 л/м², 50-250 л/м², 75-250 л/м², 100-250 л/м² или 150-250 л/м², 200-250 л/м².

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии стерилизующей фильтрации, где фильтр имеет производительность 25-100 л/м², 50-100 л/м² или 75-100 л/м².

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В варианте осуществления раствор обрабатывают в стадии микрофильтрации, где фильтр имеет производительность приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400 или приблизительно 1500 л/м².

1.13 Готовый материал

Полисахарид в итоге может быть изготовлен в виде жидкого раствора. Полисахарид может быть дополнительно обработан (например, лиофилизирован в виде высушенного порошка, см. WO2006/110381). Таким образом, в варианте осуществления полисахарид представляет собой высушенный порошок.

В варианте осуществления полисахарид представляет собой лиофилизированную лепешку.

2. Применения очищенных полисахаридов

Полисахарид, очищенный способом согласно настоящему изобретению, может применяться в качестве антигена. Простые полисахариды используются в качестве антигенов в вакцинах (см. 23-валентную неконъюгированную пневмококковую полисахаридную вакцину PNEUMOVAX).

Полисахарид, очищенный способом согласно настоящему изобретению, также может быть конъюгирован с белком(ами)-носителем с получением гликоконъюгата.

2.1. Гликоконъюгаты

Полисахарид, очищенный способом согласно настоящему изобретению, может быть конъюгирован с белком(ами)-носителем с получением гликоконъюгата.

В рамках изобретения термин 'гликоконъюгат' означает сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем. В одном варианте осуществления сахарид соединен непосредственно с белком-носителем. Во втором варианте осуществления сахарид соединен с белком-носителем через спейсер/линкер.

Как правило, ковалентное конъюгирование сахаридов с носителями повышает иммуногенность сахаридов, так как превращает их из T-независимых антигенов в T-зависимые антигены, обеспечивая, таким образом, примирование иммунологической памяти. Конъюгация особенно полезна в случае педиатрических вакцин.

Очищенные полисахариды согласно способу изобретения могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы сделать их способными реагировать (например, с линкером или непосредственно с белком-носителем), а затем включены в гликоконъюгаты, как дополнительно описано в настоящем документе.

Очищенный полисахарид может быть доведен до целевой молекулярной массы перед конъюгированием, т.е. способами, описанными в разделе 1.11 выше. Таким образом, в варианте осуществления очищенный полисахарид доводят по размеру перед конъюгированием. В одном варианте осуществления очищенный полисахарид, как раскрыто в настоящем документе, может быть доведен по размеру перед конъюгированием для получения олигосахарида. Олигосахариды содержат небольшое количество повторяющихся звеньев (обычно 5-15 повторяющихся звеньев), и обычно их получают путем доводки полисахарида до нужного размера (например, с помощью гидролиза).

Впрочем, предпочтительно, чтобы сахарид, используемый для конъюгирования, представлял собой полисахарид. Высокомолекулярные полисахариды способны индуцировать определенные иммунные ответы антител благодаря эпитопам, присутствующим на антигенной поверхности. Выделение и очистка полисахаридов с высокой молекулярной массой предпочтительно рассматриваются для применения в конъюгатах согласно настоящему изобретению.

Таким образом, в одном варианте осуществления полисахарид доведен по размеру и остается полисахаридом.

В одном варианте осуществления полисахарид не доводят по размеру.

В некоторых вариантах осуществления очищенный полисахарид перед конъюгированием (после доводки по размеру или не доведенный по размеру) имеет молекулярную массу от 5 кДа до 4000 кДа. В других подобных вариантах осуществления очищенный полисахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах осуществления очищенный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа. В далее таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; 100 кДа до 3000 кДа; 100 кДа до 2500 кДа; 100 кДа до 2250 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2250 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 250 кДа до 3500 кДа; от 250 кДа до 3000 кДа; от 250 кДа до 2500 кДа; от 250 кДа до 2000 кДа; от 250 кДа до 1750 кДа; от 250 кДа до 1500 кДа; от 250 кДа до 1250 кДа; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 750 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 4000 кДа; от 300 кДа до 3500 кДа; 300 кДа до 3000 кДа; 300 кДа до 2500 кДа; 300 кДа до 2250 кДа; от 300 кДа до 2000 кДа; от 300 кДа до 1750 кДа; от 300 кДа до 1500 кДа; от 300 кДа до 1250 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 750 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3500 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2500 кДа; от 500 кДа до 2250 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1750 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1250 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 750 кДа; или от 500 кДа до 600 кДа.

Любое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

В некоторых вариантах осуществления очищенный полисахарид имеет молекулярную массу приблизительно 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 25 кДа, 30 кДа, 35 кДа, 40 кДа, 45 кДа, 50 кДа, 75 кДа, 90 кДа, 100 кДа, 150 кДа, 200 кДа, 250 кДа, 300 кДа, 350 кДа, 400 кДа, 450 кДа, 500 кДа, 550 кДа, 600 кДа, 650 кДа, 700 кДа, 750 кДа, 800 кДа, 850 кДа, 900 кДа, 950 кДа, 1000 кДа, 1250 кДа, 1500 кДа, 1750 кДа, 2000 кДа, 2250 кДа, 2500 кДа, 2750 кДа, 3000 кДа, 3250 кДа, 3500 кДа, 3750 кДа или 4000 кДа.

В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным сахаридом (полисахаридом или олигосахаридом).

В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из Escherichia coli. В варианте осуществления, очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из Escherichia coli, входящей в группу энтеровирулентной Escherichia coli (группу EEC), такой как Escherichia coli - энтеротоксигенная (ETEC), Escherichia coli - энтеропатогенная (EPEC), Escherichia coli - энтерогеморрагическая O157:H7 (EHEC) или Escherichia coli - энтероинвазивная (EIEC). В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из уропатогенной Escherichia coli (UPEC).

В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из серотипа Escherichia coli, выбранного из группы, состоящей из серотипов O157:H7, O26:H11, O111:H- и O103:H2. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из серотипа Escherichia coli, выбранного из группы, состоящей из серотипов O6:K2:H1 и O18:K1:H7. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из серотипа Escherichia coli, выбранного из группы, состоящей из серотипов O45:K1, O17:K52:H18, O19:H34 и O7:K1. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из серотипа Escherichia coli O104:H4. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из серотипа Escherichia coli O1:K12:H7. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из Escherichia coli serotypeO127:H6. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из серотипа Escherichia coli O139:H28. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из серотипа Escherichia coli O128:H2.

В другом варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из Neisseria meningitidis. В варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из N. meningitidis серогруппы A (MenA), N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), N. meningitidis серогруппы Y (MenY), N. meningitidis серогруппы X (MenX) или N. meningitidis серогруппы C (MenC).

В другом варианте осуществления очищенный полисахарид является капсульным полисахаридом из Klebsiella pneumoniae. В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O1 (O1), K. pneumoniae серогруппы O2 (O2), K. pneumoniae серогруппы O2ac (O2ac), K. pneumoniae серогруппы O3 (O3), K. pneumoniae серогруппы O4 (O4), K. pneumoniae серогруппы O5 (O5), K. pneumoniae серогруппы O7 (O7), K. pneumoniae серогруппы O8 (O8) или K. pneumoniae серогруппы O9 (O9). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O1 (O1). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O2 (O2). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O2ac (O2ac). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O3 (O3). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O4 (O4). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O5 (O5). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O7 (O7). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O8 (O8). В варианте осуществления источником бактериальных капсульных полисахаридов является K. pneumoniae серогруппы O9 (O9).

Любая подходящая реакция конъюгирования может использоваться с любым подходящим линкером при необходимости. См., например, страницы 17-22 WO2007116028.

Очищенные олигосахариды или полисахариды, описанные в настоящем документе, химически активируют с целью получения сахаридов, способных к реакции с белком-носителем.

В варианте осуществления гликоконъюгат получают путем восстановительного аминирования.

Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление (активацию) очищенного сахарида, (2) восстановление активированного сахарида и белка-носителя (например, CRM₁₉₇, DT, TT или PD) с образованием гликоконъюгата (см., например, WO2015110941, WO2015110940).

Как указано выше, перед окислением может быть выполнено доведение полисахарида до целевого диапазона молекулярной массы (MW). Может использоваться механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты. В варианте осуществления размер очищенного полисахарида уменьшают с помощью механической гомогенизации.

В варианте осуществления очищенный полисахарид или олигосахарид конъюгируют с белком-носителем в процессе, включающем стадию:

(a) реакции указанного очищенного полисахарида или олигосахарида с окислителем;

(b) необязательной остановки реакции окисления путем добавления гасителя;

(c) смешивания активированного полисахарида или олигосахарида стадии (a) или (b) с белком-носителем; и

(d) реакции смешанного активированного полисахарида или олигосахарида и белка-носителя с восстановителем с образованием гликоконъюгата.

После стадии окисления (a) сахарид считается активированным и называется "активированный полисахарид или олигосахарид".

Стадия окисления (a) может включать реакцию с периодатом. В целях настоящего изобретения термин "периодат" включает как периодат, так и иодную кислоту; термин также включает и метапериодат (IO₄^-) и ортопериодат (IO₆^5-), и различные соли периодата (например, периодат натрия и периодат калия).

В предпочтительном варианте осуществления окислителем является периодат натрия. В варианте осуществления периодат, используемый для окисления, является метапериодатом. В варианте осуществления периодат, используемый для окисления, является метапериодатом натрия.

Стадия окисления (a) может включать реакцию со стабильным нитроксильным или нитроксидным радикальным соединением, таким как пиперидин-N-окси или пирролидин-N-окси-соединения, в присутствии окислителя для селективного окисления первичных гидроксильных групп указанного полисахарида или олигосахарида с получением активированного сахарида, содержащего альдегидные группы (см. WO2014097099). В одном аспекте указанным стабильным нитроксильным или нитроксидным радикальным соединением является любое, раскрытое на странице 3, строке 14 до страницы 4, строки 7 в WO2014097099, а окислителем является любой, раскрытый на страницы 4 строке 8-15 в WO2014097099. В одном аспекте указанным стабильным нитроксильным или нитроксидным радикальным соединением является 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO), а окислителем является N-хлорсукцинимид (NCS).

В одном варианте осуществления гаситель является таким, как раскрыто в WO2015110941 (см. страницу 30, строки 3-26).

В одном варианте осуществления реакцию восстановления (d) проводят в водном растворителе. В одном варианте осуществления реакцию восстановления (d) проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления реакцию восстановления (d) проводят в растворителе ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФА (диметилформамиде).

В одном варианте осуществления восстановителем является цианоборогидрид натрия, триацетоксиборогидрид натрия, борогидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминобораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeⁱPrN-BH₃, бензиламин-BH₃ или 5-этил-2-метилпиридинборан (PEMB). В предпочтительном варианте осуществления восстановителем является цианоборогидрид натрия.

В конце реакции восстановления в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые можно блокировать при использовании подходящего кэпирующего реагента. В одном варианте осуществления таким кэпирующим реагентом является борогидрид натрия (NaBH₄).

После конъюгирования с белком-носителем гликоконъюгат может быть очищен (обогащен по отношению к количеству конъюгата сахарида-белка) с помощью различных методов, известных специалисту в данной области. Такие методы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрацию в тангенциальном потоке, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию гидрофобного взаимодействия) и глубинную фильтрацию.

В одном варианте осуществления гликоконъюгат получают при использовании химии цианилирования.

В одном варианте осуществления очищенный полисахарид или олигосахарид активируют бромцианом. Активация соответствует цианилированию гидроксильных групп полисахарида или олигосахарида. Активированный полисахарид или олигосахарид затем соединяют напрямую или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе.

В одном варианте осуществления очищенный полисахарид или олигосахарид активируют тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного эфира. Активированный полисахарид или олигосахарид затем соединяют напрямую или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе.

В одном варианте осуществления спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида или олигосахарида, который может быть связан с носителем через тиоэфирную связь, получаемую после реакции с малеимид-активированным белком-носителем (например, при использовании N-[γ-малеимидобутирокси]сукцинимидного эфира (GMBS)) или галоацетилированным белком-носителем (например, с использованием иодацетимида, N-сукцинимидилбромацетата (SBA; SIB), N-сукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоата (SIAB), сульфосукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоата (сульфо-SIAB), N-сукцинимидилиодацетата (SIA) или сукцинимидил-3-[бромацетамидо]пропионата (SBAP)). Предпочтительно цианатный эфир (необязательно полученный с помощью химии CDAP) связывают с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), а амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) при использовании карбодиимидной химии (например, с EDAC или EDC) через карбоксильную группу на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В одном варианте осуществления гликоконъюгат получают при использовании бисэлектрофильных реагентов, таких как карбонилдиимидазол (CDI) или карбонилдитриазол (CDT). В таком варианте осуществления реакцию конъюгирования предпочтительно проводят в апротонных растворителях, таких как ДМФА или ДМСО, напрямую или с использованием бифункциональных линкеров (см., например, WO2011041003).

В одном варианте осуществления гликоконъюгат получают способом получения гликоконъюгатов, как описано в WO 2014027302. Полученный гликоконъюгат включает сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через двухвалентный гетеробифункциональный спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). В альтернативном варианте гликоконъюгат получают способом получения гликоконъюгатов, раскрытым в WO2015121783.

В других подходящих методиках конъюгирования используются карбодиимиды (например, EDC - гидрохлорид (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, EDC плюс сульфо-NHS, CMC - 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид, DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид или DIC - диизопропилкарбодиимид).

В одном варианте осуществления полисахарид или олигосахарид конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Линкер необязательно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим, например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную карбоксильную группу, 2 реакционноспособные аминогруппы или две реакционноспособные карбоксильные группы. Линкер содержит, например, от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10 атомов углерода. Возможным линкером является дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Другие линкеры включают B-пропионамидо (WO 00/10599), нитрофенилэтиламин, галогеналкилгалогенид, гликозидные связи (US 4673574, US 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (US 4459286).

Белок-носитель

Компонентом гликоконъюгата является белок-носитель, с которым конъюгируют очищенный полисахарид или олигосахарид. Термины "белковый носитель" или "белок-носитель" или "носитель" в настоящем документе могут использоваться попеременно. Белки-носители должны поддаваться стандартным процедурам конъюгирования.

В предпочтительном варианте осуществления белок-носитель гликоконъюгата выбран из группы, состоящей из следующего: DT (дифтерийный токсин), TT (столбнячный токсоид) или C-фрагмент TT, CRM₁₉₇ (нетоксичный, но антигенно идентичный вариант дифтерийного токсина), другие мутанты DT (такие как CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. (1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844), CRM9, CRM102, CRM103 или CRM107; и другие мутации, описанные в публикации Nicholls and Youle, Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc. (1992); делеция или мутация Glu-148 с заменой на Asp, Gln или Ser, и/или Ala 158 с заменой на Gly, и другие мутации, раскрытые в патентах США 4,709,017 и 4,950,740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534, а также другие мутации, раскрытые в патентах США 5,917,017 и 6,455,673, или фрагмент, раскрытый в патенте США 5,843,711, пневмококковый пневмолизин (ply) (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-2713), в том числе ply, обезвреженный каким-либо образом, например, dPLY-GMBS (WO 2004/081515, WO 2006/032499) или dPLY-формол, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (последовательности PhtA, PhtB, PhtD или PhtE раскрыты в WO 00/37105 и WO 00/ 39299), а также слитые конструкции белков Pht, например, слитые PhtDE, слитые PhtBE, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/054007, WO 2009/000826), OMPC (менингококковый белок наружной мембраны), который обычно выделяют из Neisseria meningitidis серогруппы B (EP0372501), PorB (из N. meningitidis), PD (D белок Haemophilus influenzae; см., например, ЕР0594610 В) или их иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР0378881, ЕР0427347), белки теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшные белки (WO 98/58668, ЕР0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы CD4+ T-клеток человека из разных антигенов, происходящих из патогенов (Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi и др. (2004) Infect lmmun 72:4884-4887), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), захватывающие железо белки (WO 01/72337), токсин A или B Clostridium difficile (WO 00/61761), трансферрин-связывающие белки, пневмококковый адгезивный белок (PsaA), рекомбинантный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (в частности, его нетоксичные мутанты (такие как экзотоксин A с заменой глутаминовой кислоты 553 (Douglas et al. (1987) J. Bacteriol. 169(11)):4967-4971)). Другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин моллюска Megathura crenulata (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенный белковый продукт из туберкулина (PPD) также можно использовать в качестве белков-носителей. Другие подходящие белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как холерный анатоксин (например, как описано в WO 2004/083251), LT Escherichia coli, ST E. coli и экзотоксин A из P. aeruginosa.

В предпочтительном варианте осуществления белок-носитель гликоконъюгата независимо выбран из группы, состоящей из мутантов TT, DT, DT (таких как CRM₁₉₇), D белка H. influenzae, слитых белков PhtX, PhtD, PhtDE (в частности, описанных в WO 01/98334 и WO 03/054007), обезвреженного пневмолизина, PorB, белка N19, PspA, OMPC, токсина A или B C. difficile и PsaA.

В одном варианте осуществления белком-носителем гликоконъюгата является DT (дифтерийный анатоксин). В другом варианте осуществления белком-носителем гликоконъюгата является TT (столбнячный анатоксин).

В другом варианте осуществления белком-носителем гликоконъюгата является PD (D белок H. influenzae; см., например, EP0594610 B).

В предпочтительном варианте осуществления очищенный полисахарид или олигосахарид конъюгирован с белком CRM₁₉₇. Белок CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, однако иммунологически не отличается от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцируется Corynebacterium diphtheriae, инфицированными нетоксигенным фагом β197^tox-, созданным в результате нитрозогуанидинового мутагенеза токсигенного коринефага бета (Uchida et al. (1971) Nature New Biology 233:8-11). Белок CRM₁₉₇ имеет ту же молекулярную массу, что и дифтерийный токсин, но отличается от него заменой одного основания (гуанина на аденин) в структурном гене. Эта единственная замена основания приводит к замене аминокислоты (глицина на глутаминовую кислоту) в зрелом белке и устраняет токсические свойства дифтерийного токсина. Белок CRM₁₉₇ является безопасным и эффективным носителем сахаридов, зависимым от T-клеток. Дополнительные подробности касательно CRM₁₉₇ и его получения можно найти, например, в патенте США 5,614,382.

В одном варианте осуществления очищенный полисахарид или олигосахарид конъюгирован с белком CRM₁₉₇ или A-цепью CRM₁₉₇ (см. CN103495161). В одном варианте осуществления очищенный полисахарид или олигосахарид конъюгирован с A-цепью CRM₁₉₇, полученной при экспрессии генетически рекомбинантной E. coli (см. CN103495161).

Предпочтительно соотношение белка-носителя к полисахариду или олигосахариду в гликоконъюгате составляет от 1:5 до 5:1; например, от 1:0,5 до 4:1, от 1:1 до 3,5:1, от 1,2:1 до 3:1, от 1,5:1 до 2,5:1; например, от 1:2 до 2,5:1 или от 1:1 до 2:1 (в/в). В одном варианте осуществления соотношение белка-носителя к полисахариду или олигосахариду в гликоконъюгате составляет приблизительно 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1.

После конъюгирования с белком-носителем гликоконъюгат может быть очищен (обогащен по отношению к количеству конъюгата сахарид-белок) с помощью различных методов, известных специалистам в данной области техники. Такие методы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрацию в тангенциальном потоке, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию гидрофобного взаимодействия) и глубинную фильтрацию.

Композиции могут включать небольшое количество свободного носителя. Когда данный белок-носитель присутствует в композиции согласно изобретению в свободной и в конъюгированной форме, неконъюгированная форма предпочтительно составляет не больше 5% от общего количества белка-носителя в композиции в целом и более предпочтительно присутствует на уровне меньше 2% по весу.

2.2 Иммуногенные композиции

В варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей любой из очищенных полисахаридов и/или гликоконъюгатов, раскрытых в настоящем документе.

В варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей любой из гликоконъюгатов, раскрытых в настоящем документе.

В варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей от 1 до 25 различных гликоконъюгатов, раскрытых в разделе 2.1.

В варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей от 1 до 25 гликоконъюгатов из разных серотипов S. pneumoniae (1-25 пневмококковых конъюгатов). В одном варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей гликоконъюгаты из 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 разных серотипов S. pneumoniae. В одном варианте осуществления иммуногенные композиции включает гликоконъюгаты из 16 или 20 разных серотипов S. pneumoniae. В варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентные композиции пневмококковых конъюгатов. В варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 14, 15, 16, 17, 18 или 19-валентные композиции пневмококковых конъюгатов. В варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 16-валентную композицию пневмококковых конъюгатов. В варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 19-валентную композицию пневмококковых конъюгатов. В варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 20-валентную композицию пневмококковых конъюгатов.

В одном варианте осуществления указанная иммуногенная композиция включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления указанная иммуногенная композиция дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F.

В одном варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 6А и 19А.

В одном варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 3.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 22F и 33F.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 8, 10А, 11А, 12F и 15B.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотип 2.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипы 9 Н.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипы 17F.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 20.

В варианте осуществления иммуногенная композиция изобретения включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 8, 10А, 11А, 12F, 15B, 22F и 33F.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 2.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 9Н.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 17F.

В варианте осуществления любая из иммуногенных композиций выше дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 20.

Впрочем, в предпочтительном варианте осуществления каждый из сахаридов индивидуально конъюгирован с разными молекулами белкового носителя (с каждой молекулой белкового носителя конъюгирован только один тип сахарида). В указанном варианте осуществления капсульные сахариды считаются индивидуально конъюгированными с белком-носителем. Предпочтительно все гликоконъюгаты указанных выше иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с белком-носителем.

В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F конъюгирован с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F конъюгирован с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15B конъюгирован с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F конъюгирован с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 10А конъюгирован с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 11А конъюгирован с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 8 конъюгирован с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6B, 9B, 14, 18C, 19F и 23F конъюгированы с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F конъюгированы с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгатов из S. pneumoniae серотипов 6A и 19A конъюгированы с CRM₁₉₇. В варианте осуществления любой из вышеуказанных иммуногенных композиций гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 3 конъюгирован с CRM₁₉₇.

В варианте осуществления все гликоконъюгаты любой из вышеуказанных иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

В варианте осуществления гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипы 1, 4, 5, 6B, 7F, 9B, 14 и/или 23F любой из вышеуказанных иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с PD.

В варианте осуществления гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 18C любой из вышеуказанных иммуногенных композиций конъюгирован с TT.

В варианте осуществления гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F любой из вышеуказанных иммуногенных композиций конъюгирован с DT.

В варианте осуществления гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9B, 14 и/или 23F любой из вышеуказанных иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с PD, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 18C конъюгирован с TT, и гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

В варианте осуществления вышеуказанные иммуногенные композиции включают от 8 до 20 различных серотипов S. pneumoniae.

В варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей от 1 до 5 гликоконъюгатов из разных серогрупп N. meningitidis (1-5 менингококковых конъюгатов). В одном варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей гликоконъюгаты из 1, 2, 3, 4 или 5 разных серогрупп N. meningitidis. В одном варианте осуществления иммуногенные композиции включают 4 или 5 разных N. meningitidis. В варианте осуществления иммуногенная композиция является 1, 2, 3, 4 или 5-валентной композицией менингококковых конъюгатов. В варианте осуществления иммуногенная композиция является 2-валентной композицией менингококковых конъюгатов. В варианте осуществления иммуногенная композиция является 4-валентной композицией менингококковых конъюгатов. В варианте осуществления иммуногенная композиция является 5-валентной композицией менингококковых конъюгатов.

В варианте осуществления иммуногенная композиция включает конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы C (MenC).

В варианте осуществления иммуногенный композиция включает конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы A (MenA), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы C (MenC).

В варианте осуществления иммуногенные композиции включают конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы C (MenC).

В варианте осуществления иммуногенная композиция включает конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы A (MenA), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы C (MenC) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы X (MenX).

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, могут дополнительно включать по меньшей мере один, два или три адъюванта. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, могут дополнительно включать один адъювант. Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Антигены могут действовать, прежде всего, как система доставки, прежде всего как иммуномодулятор, или могут обладать сильные сторонами обоих. Подходящие адъюванты включают такие, которые подходят для применения у млекопитающих, включая человека.

Примеры известных подходящих адъювантов типа систем доставки, которые можно применять у человека, включают, без ограничения перечисленными, квасцы (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия), фосфат кальция, липосомы, эмульсии масло в воде, такие как MF59 (4,3% в/об сквалена, 0,5% в/об полисорбата 80 (Tween 80), 0,5% в/об сорбитан триолеата (Span 85)), эмульсии вода в масле, такие как Montanide, а также микрочастицы или наночастицы поли(D,L-лактид-ко-гликолида) (PLG).

В одном варианте осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, включают в качестве адъюванта соли алюминия (квасцы) (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия). В предпочтительном варианте осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, включают фосфат алюминия или гидроксид алюминия в качестве адъюванта.

Дополнительные иллюстративные адъюванты для повышения эффективности иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе, включают, без ограничения этим: (1) составы эмульсий типа "масло в воде" (с или без других специфических иммуностимулирующих средств, таких как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки), такие как, например: (а) SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% Tween 80, 5% плюроник-блокированного полимера L121, и thr-MDP, либо микрофлюидизированный в субмикронной эмульсии, либо обработанный на вортексе с получением эмульсии, содержащей частицы большого размера, и (b) адъювантная система RIBI™ (RAS) (RibiImmunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или больше компонентов бактериальной клеточной стенки, таких как монофосфорилипид A (MPL), димиколат трегалозы (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (DETOX™); (2) могут использоваться сапониновые адъюванты, такие как QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), ABISCO® (Isconova, Sweden) или ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia), или полученные из них частицы, такие как комплексы ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), которые могут не содержать дополнительный детергент (например, WO 00/07621); (3) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (4) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (например, WO 99/44636)), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-КСФ), фактор некроза опухоли (ФНО) и т.д.; (5) монофосфориллипид A (MPL) или 3-O-деацилированный MPL (3dMPL) (см., например, GB-2220221, EP0689454), необязательно по существу без квасцов при использовании с пневмококковыми сахаридами (см., например, WO 00/56358); (6) комбинации 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями масло в воде (см., например, ЕР0835318, ЕР0735898, ЕР0761231); (7) полиоксиэтиленовый эфир или сложный полиоксиэтиленовый эфир (см., например, WO 99/52549); (8) поверхностно-активное вещество на основе сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана в комбинации с октоксинолом (например, WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество на основе полиоксиэтиленалкилового простого или сложного эфира в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (например, WO 01/21152); (9) сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, CpG олигонуклеотид) (например, WO 00/62800); (10) иммуностимулятор и частица соли металла (см., например, WO 00/23105); (11) сапонин и эмульсия типа масло в воде (например, WO 99/11241); (12) сапонин (например, QS21) +3dMPL +IM2 (необязательно со стерином) (например, WO 98/57659); (13) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие средства для повышения эффективности композиции. Мурамилпептиды включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-25-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутарнинил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (MTP-PE) и т.д.

В варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, включают CpG олигонуклеотид в качестве адъюванта.

Иммуногенные композиции могут быть изготовлены в жидкой форме (т.е. в виде растворов или суспензий) или в лиофилизированной форме. Жидкие составы можно с преимуществом вводить непосредственно из их упакованной формы и, таким образом, они идеально подходят для инъекций без необходимости восстановления в водной среде, как требуется в случае лиофилизированных композиций согласно изобретению.

Изготовление иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению может быть осуществлено с применением известных способов. Например, отдельные полисахариды и/или конъюгаты могут быть включены в составы с физиологически приемлемым растворителем для приготовления композиции. Примеры таких растворителей включают, без ограничения этим, воду, забуференный физраствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

В настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция, включающая любую из комбинаций полисахарида или гликоконъюгатов, раскрытых в настоящем документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или разбавитель.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению находится в жидкой форме, предпочтительно в водной жидкой форме.

Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут включать одно или больше из буфера, соли, двухвалентного катиона, неионогенного детергента, криопротектора, такого как сахар, и антиоксиданта, такого как поглотитель свободных радикалов или хелатообразователь, или их любые комбинации.

В одном варианте осуществления иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению включают буфер. В одном варианте осуществления указанный буфер имеет pKa от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,5. В некоторых вариантах осуществления буфер является фосфатным, сукцинатным, гистидиновым или цитратным буфером. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой сукцинат в конечной концентрации от 1 мМ до 10 мМ. В одном конкретном варианте осуществления конечная концентрация сукцинатного буфера составляет приблизительно 5 мМ.

В одном варианте осуществления иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению включают соль. В некоторых вариантах осуществления соль выбрана из групп, состоящих из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном варианте соль представляет собой хлорид натрия. В одном конкретном варианте осуществления иммуногенные композиции согласно изобретению включают 150 мМ хлорида натрия.

В одном варианте осуществления иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению включают поверхностно-активное вещество. В одном варианте осуществления поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20 (TWEEN™ 20), полисорбата 40 (TWEEN™ 40), полисорбата 60 (TWEEN™ 60), полисорбата 65 (TWEEN™ 65), полисорбата 80 (TWEEN™ 80), полисорбата 85 (TWEEN™ 85), TRITON™ N-101, TRITON™ X-100, октоксинола 40, ноноксинола-9, триэтаноламина, триэтаноламин полипептид олеата, полиоксиэтилена-660 гидроксистеарата (ПЭГ-15, Solutol H 15), полиоксиэтилен-35-рицинолеата (CREMOPHOR® EL), соевого лецитина и полоксамера. В одном конкретном варианте осуществления поверхностно-активным веществом является полисорбат 80. В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 80 в составе составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 80 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 80 в составе составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 80 по массе (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 80 в составе составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 80 по массе (в/в). В других вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 80 в составе составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 80 (в/в). В другом варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 80 в составе составляет 1% полисорбата 80 (в/в).

В одном конкретном варианте поверхностно-активным веществом является полисорбат 40. В некотором указанном варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 40 в составе составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 40 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 40 в составе составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 40 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 40 в составе составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 40 по весу (в/в). В других вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 40 в составе составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 40 (в/в). В другом варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 40 в составе составляет 1% полисорбата 40 (в/в).

В одном конкретном варианте поверхностно-активным веществом является полисорбат 60. В некотором указанном варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 60 в составе составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 60 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 60 в составе составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 60 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 60 в составе составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 60 по весу (в/в). В других вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 60 в составе составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 60 (в/в). В другом варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 60 в составе составляет 1% полисорбата 60 (в/в).

В одном конкретном варианте поверхностно-активным веществом является полисорбат 65. В некотором указанном варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 65 в составе составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 65 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 65 в составе составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 65 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 65 в составе составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 65 по весу (в/в). В других вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 65 в составе составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 65 (в/в). В другом варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 65 в составе составляет 1% полисорбата 65 (в/в).

В одном конкретном варианте поверхностно-активным веществом является полисорбат 85. В некотором указанном варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 85 в составе составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 85 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 85 в составе составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 85 по весу (в/в). В некоторых указанных вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 85 в составе составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 85 по весу (в/в). В других вариантах осуществления конечная концентрация полисорбата 85 в составе составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 85 (в/в). В другом варианте осуществления конечная концентрация полисорбата 85 в составе составляет 1% полисорбата 85 (в/в).

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция изобретения имеет pH 5,5-7,5, более предпочтительно pH 5,6-7,0, еще более предпочтительно pH 5,8-6,0.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен контейнер, заполненный любой из иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе. В одном варианте осуществления контейнер выбран из группы, состоящей из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, мешка, банки, ампулы, картриджа и шприц-ручки одноразового применения. В некоторых вариантах контейнер силиконизирован.

В варианте осуществления контейнер согласно настоящему изобретению изготовлен из стекла, металлов (например, стали, нержавеющей стали, алюминия и т.д.) и/или полимеров (например, термопластов, эластомеров, термоэластопластов). В варианте осуществления контейнер согласно настоящему изобретению изготовлен из стекла.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен шприц, заполненный любой из иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления шприц силиконизирован и/или изготовлен из стекла.

Типичная доза иммуногенной композиции согласно изобретению для инъекции имеет объем от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, еще более предпочтительно объем приблизительно 0,5 мл.

2.3 Применение в качестве антигенов

Полисахарид, очищенный способом согласно настоящему изобретению, а также конъюгаты, раскрытые в настоящем документе, могут применяться в качестве антигенов. Например, они могут быть частью вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления полисахариды, очищенные способом согласно настоящему изобретению, или гликоконъюгаты, полученные с применением указанных полисахаридов, предназначены для применения с целью создания иммунного ответа у субъекта. В одном аспекте субъектом является млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, бычьи или собака. В одном аспекте субъектом является человек.

В одном варианте осуществления полисахариды, очищенные способом согласно настоящему изобретению, гликоконъюгаты, полученные с применением указанных полисахаридов, или иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в вакцине.

В одном варианте осуществления полисахариды, очищенные способом согласно настоящему изобретению, гликоконъюгаты, полученные с применением указанных полисахаридов, или иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в качестве лекарственного препарата.

Иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, могут применяться в различных терапевтических или профилактических способах для предупреждения, лечения или облегчения бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта. В частности, иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, могут применяться для предупреждения, лечения или облегчения инфекции, заболевания или состояния, вызванного S. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis, Haemophilus influenzae типа b, E. coli, Neisseria meningitidis, S. agalactiae или Klebsiella pneumoniae, у субъекта.

Таким образом, в одном аспекте изобретения предложен способ предупреждения, лечения или облегчения инфекции, заболевания или состояния, ассоциированного с S. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis, Haemophilus influenzae типа b, E. coli, Neisseria meningitidis, S. agalactiae или Klebsiella pneumoniae, у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению (в частности, иммуногенной композиции, включающей соответствующий полисахарид или его гликоконъюгат).

В одном варианте осуществления изобретения предложен способ индукции иммунного ответа против S. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis, Haemophilus influenzae типа b, E. coli, Neisseria meningitidis, S. agalactiae или Klebsiella pneumoniae, у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению (в частности, иммуногенной композиции, включающей соответствующий полисахарид или его гликоконъюгат).

В одном варианте осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в качестве вакцины. В таких вариантах осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, могут применяться для предупреждения инфекции, вызванной S. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis, Haemophilus influenzae типа b, E. coli, Neisseria meningitidis или S. agalactiae, у субъекта. Таким образом, в одном аспекте изобретения предложен способ предупреждения инфекции, вызванной S. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis, Haemophilus influenzae типа b, E. coli, Neisseria meningitidis, S. agalactiae или Klebsiella pneumoniae, у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению.

В одном аспекте субъектом является млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, бычье или собака. В одном аспекте субъектом является человек.

Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут применять для защиты или лечения человека, подверженного инфекции, вызванной S. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis, Haemophilus influenzae типа b, E. coli, Neisseria meningitidis, S. agalactiae или Klebsiella pneumoniae, посредством введения иммуногенных композиций системным путем или через слизистую оболочку. В одном варианте осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно или подкожно. В одном варианте осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят путем внутримышечной, внутрибрюшинной, внутрикожной или подкожной инъекции. В одном варианте осуществления иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.

В некоторых случаях требуется всего лишь одна доза иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, однако при некоторых обстоятельствах, таких как состояния выраженного иммунодефицита, могут вводить вторую, третью или четвертую дозу. После первичной вакцинации субъекты могут получать одну или больше повторных иммунизаций с соответствующими интервалами.

В варианте осуществления схема вакцинации иммуногенной композицией согласно настоящему изобретению представляет собой схему с введением однократной дозы.

В одном варианте осуществления схема вакцинации иммуногенной композицией согласно настоящему изобретению представляет собой схему с введением многократных доз.

3. Сахариды, полученные из E. coli

В одном варианте осуществления сахарид продуцирует рекомбинантная грамотрицательная бактерия. В одном варианте осуществления сахарид продуцируется в рекомбинантной клетке E. coli. В одном варианте осуществления сахарид продуцируется в рекомбинантной клетке Salmonella. Примеры бактерий включают E. coli O25K5H1, E. coli BD559, E. coli GAR2831, E. coli GAR865, E. coli GAR868, E. coli GAR869, E. coli GAR872, E. coli GAR878, E. coli GAR896, E. coli GAR896, E. coli GAR896, E. coli GAR1902, E. coli O25a ETC NR-5, E. coli O157:H7:K-, Salmonella enterica серотипа Typhimurium штамм LT2, E. coli GAR2401, Salmonella enterica серотипа Enteritidis CVD 1943, Salmonella enterica серотипа Typhimurium CVD 1925, Salmonella enterica серотипа Paratyphi A CVD 1902 и Shigella flexneri CVD 1208S. В одном варианте осуществления бактерией не является E. coli GAR2401. Этот генетический подход к продукции сахаридов обеспечивает эффективную продукцию молекул O-полисахаридов и O-антигенов в качестве компонентов вакцины.

Термин "белок wzz" при использовании в настоящем документе относится к полипептиду, определяющему длину цепи, такому как, например, wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz₁ и wzz₂. Номера доступа в GenBank для иллюстративных последовательностей генов wzz являются следующими: AF011910 для E4991/76, AF011911 для F186, AF011912 для M70/1-1, AF011913 для 79/311, AF011914 для Bi7509- 41, AF011915 для C664-1992, AF011916 для C258-94, AF011917 для C722-89 и AF011919 для EDL933. Номера доступа в GenBank для последовательностей генов G7 и Bi316-41 wzz - U39305 и U39306 соответственно. Дополнительные номера доступа в GenBank для иллюстративных последовательностей генов wzz являются следующими: NP_459581 для Salmonella enterica подвида enterica серовара Typhimurium штамма LT2 FepE; AIG66859 для штамма E. coli O157:H7 EDL933 FepE; NP_461024 для Salmonella enterica подвида enterica серовара Typhimurium штамма LT2 WzzB, NP_416531 для E. coli K-12 субштамма MG1655 WzzB, NP_415119 для E. coli K-12 субштамма MG1655 FepE. В предпочтительных вариантах осуществления белок семейства wzz является любым из белков wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2, наиболее предпочтительно wzzB, более предпочтительно fepE.

Иллюстративные последовательности wzzB включают:

>O25b 2401 WzzB

MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQEQVTKPQVQQTEDVTQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSSNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK (SEQ ID NO: 20)

>O25a:K5:H1 WzzB

MRVENNNVSGQNNDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQDEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK (SEQ ID NO: 21)

>O25a ETEC ATCC WzzB

MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVVVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSFAFSALAETLDNQKEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEDAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNLALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIENLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNSK (SEQ ID NO: 22)

>K12 W3110 WzzB

MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEREKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPMLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK (SEQ ID NO: 23)

>Salmonella LT2 WzzB

MTVDSNTSSGRGNDPEQIDLIELLLQLWRGKMTIIVAVIIAILLAVGYLMIAKEKWTSTAIITQPDAAQVATYTNALNVLYGGNAPKISEVQANFISRFSSAFSALSEVLDNQKEREKLTIEQSVKGQALPLSVSYVSTTAEGAQRRLAEYIQQVDEEVAKELEVDLKDNITLQTKTLQESLETQEVVAQEQKDLRIKQIEEALRYADEAKITQPQIQQTQDVTQD™FLLGSDALKSMIQNEATRPLVFSPAYYQTKQTLLDIKNLKVTADTVHVYRYVMKPTLPVRRDSPKTAITLVLAVLLGGMIGAGIVLGRNALRSYKPKAL (SEQ ID NO: 24)

Иллюстративные последовательности FepE включают:

>O25b GAR2401 FepE

MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKSFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISTLVVKESLENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKAHVNDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGGVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (SEQ ID NO: 15)

>O25a:K5:H1 FepE

MSSLNIKQGSEAHFPEYPLASPSNNEIDLLNLIEVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDPLDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDESALYTSWTLSFTAPTSEEAQKVLAGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKTNINDVNFTPFKYQLRPSLPVKKDGQGKAIIVILSALVGGMVACGGVLLRHAMASRKQDAMMADHLV (SEQ ID NO: 16)

>O25a ETEC ATCC FepE

MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKSFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISTLVVKESLENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKAHVNDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGGVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (SEQ ID NO: 17)

>O157 FepE

MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKMKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKANINDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGSVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (SEQ ID NO: 18)

>Salmonella LT2 FepE

MPSLNVKQEKNQSFAGYSLPPANSHEIDLFSLIEVLWQAKRRILATVFAFACVGLLLSFLLPQKWTSQAIVTPAESVQWQGLERTLTALRVLDMEVSVDRGSVFNLFIKKFSSPSLLEEYLRSSPYVMDQLKGAQIDEQDLHRAIVLLSEKMKAVDSNVGKKNETSLFTSWTLSFTAPTREEAQKVLAGYIQYISDIVVKETLENIRNQLEIKTRYEQEKLAMDRVRLKNQLDANIQRLHYSLEIANAAGIKRPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGISRKLEIEKGVTDVAEIDGDLRNRQYHVEQLAAMNVSDVKFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIIILAALIGGMMACGGVLLRHAMVSRKMENALAIDERLV (SEQ ID NO: 19)

В некоторых вариантах осуществления модифицированный сахарид (модифицированный по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа) может быть получен путем экспрессии (необязательно оверэкспрессии) белка семейства wzz (например, fepE) из грамотрицательной бактерии в грамотрицательной бактерии и/или путем выключения (т.е. репрессии, делеции, удаления) второго гена wzz (например, wzzB) с получением высокомолекулярных сахаридов, таких как липополисахариды, содержащие промежуточные или длинные цепи О-антигена. Например, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (необязательно оверэкспрессии) wzz2 и выключения wzz1. Или, в альтернативном варианте, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (необязательно оверэкспрессии) wzzfepE и выключения wzzB. В другом варианте осуществления модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (необязательно оверэкспрессии) wzzB, но выключения wzzfepE. В другом варианте осуществления модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии fepE. Предпочтительно белок семейства wzz получают из штамма, который гетерологичен по отношению к клетке-хозяину.

В одном аспекте изобретение относится к сахаридам, полученным при экспрессии белка семейства wzz, предпочтительно fepE, в грамотрицательной бактерии с образованием высокомолекулярных сахаридов, содержащих промежуточные или длинные цепи О-антигена, которые увеличены по меньшей мере на 1, 2, 3, 4 или 5 повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. В одном аспекте изобретение относится к сахаридам, продуцируемым грамотрицательной бактерией в культуре, которая экспрессирует (необязательно оверэкспрессирует) белок семейства wzz (например, wzzB) из грамотрицательной бактерии с образованием высокомолекулярных сахаридов, содержащих промежуточные или длинные цепи О-антигена, которые увеличены по меньшей мере на 1, 2, 3, 4 или 5 повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим О-антигеном дикого типа. См. описание О-полисахаридов и О-антигенов ниже в отношении дополнительных иллюстративных сахаридов, содержащих увеличенное количество повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующими сахаридами дикого типа. Требуемой длиной цепи является такая длина цепи, которая обеспечивает улучшенную или максимальную иммуногенность в контексте данной вакцинной конструкции.

В другом варианте осуществления сахарид включает любую Формулу, выбранную из Таблицы 1, где количество повторяющихся звеньев n в сахариде больше, чем количество повторяющихся звеньев в соответствующем О-полисахариде дикого типа на 1, 2, 3, 4. , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или больше повторяющихся звеньев. Предпочтительно сахарид включает увеличение по меньшей мере на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. Способы определения длины сахаридов известны в уровне техники. Такие способы включают ядерный магнитный резонанс, масс-спектроскопию и эксклюзионную хроматографию.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к сахариду, продуцируемому в рекомбинантной клетке-хозяине E. coli, где ген эндогенного регулятора длины О-антигена wzz (например, wzzB) делетирован и заменен (вторым) геном wzz из грамотрицательной бактерии, гетерологичной по отношению к рекомбинантной клетке-хозяину E. coli (например, fepE Salmonella), с образованием высокомолекулярных сахаридов, таких как липополисахариды, содержащие промежуточные или длинные цепи О-антигена. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка-хозяин E. coli включает ген wzz из Salmonella, предпочтительно из Salmonella enterica.

В одном варианте осуществления клетка-хозяин включает гетерологичный ген белка семейства wzz в виде стабильно поддерживаемого плазмидного вектора. В другом варианте осуществления клетка-хозяин включает гетерологичный ген белка семейства wzz в качестве интегрированного гена в хромосомной ДНК клетки-хозяина. Способы стабильной экспрессии плазмидного вектора в клетке-хозяине E. coli и способы интеграции гетерологичного гена в хромосому клетки-хозяина E. coli известны в уровне техники. В одном варианте осуществления клетка-хозяин включает гетерологичные гены О-антигена в качестве стабильно поддерживаемого плазмидного вектора. В другом варианте осуществления клетка-хозяин включает гетерологичные гены О-антигена в качестве интегрированного гена в хромосомной ДНК клетки-хозяина. Способы стабильной экспрессии плазмидного вектора в клетке-хозяине E. coli и клетке-хозяине Salmonella известны в уровне техники. Способы интеграции гетерологичного гена в хромосому клетки-хозяина E. coli и клетки-хозяина Salmonella известны в уровне техники.

В одном аспекте рекомбинантную клетку-хозяин культивируют в среде, которая содержит источник углерода. Источники углерода для культивирования E. coli известны в уровне техники. Примеры источников углерода включают сахароспирты, многоатомные спирты, альдольные сахара или кетосахара, в том числе, без ограничения, арабинозу, целлобиозу, фруктозу, глюкозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, рамнозу, раффинозу, сорбит, сорбозу, сахарозу, трегалозу, пируват, сукцинат и метиламин. В предпочтительном варианте среда включает глюкозу. В некоторых вариантах осуществления среда включает многоатомный спирт или альдольный сахар, например маннит, инозит, сорбозу, глицерин, сорбит, лактозу и арабинозу, в качестве источника углерода. Все источники углерода могут добавлять в среду до начала культивирования, либо их могут добавлять поэтапно или непрерывно во время культивирования.

Иллюстративная культуральная среда для рекомбинантной клетки-хозяина включает компонент, выбранный из любого из KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрата натрия, Na₂SO₄, аспарагиновой кислоты, глюкозы, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O. Предпочтительно среда включает KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрат натрия, Na₂SO₄, аспарагиновую кислоту, глюкозу, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.

Среда при использовании в настоящем документе может быть твердой или жидкой, синтетической (т.е. искусственной) или природной и может включать достаточное количество питательных веществ для культивирования рекомбинантной клетки-хозяина. Предпочтительно среда является жидкой средой.

В некоторых вариантах осуществления среда может дополнительно включать подходящие неорганические соли. В некоторых вариантах осуществления среда может дополнительно включать микроэлементы. В некоторых вариантах осуществления среда может дополнительно включать факторы роста. В некоторых вариантах осуществления среда может дополнительно включать дополнительный источник углерода. В некоторых вариантах осуществления среда может дополнительно включать подходящие неорганические соли, микроэлементы, факторы роста и дополнительный источник углерода. Неорганические соли, микроэлементы, факторы роста и дополнительные источники углерода, подходящие для культивирования E. coli, известны в уровне техники.

В некоторых вариантах осуществления среда при необходимости может включать дополнительные компоненты, такие как пептон, N-Z амин, ферментативный соевый гидролизат, дополнительный дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, дополнительные источники углерода и различные витамины. В некоторых вариантах осуществления среда не включает такие дополнительные компоненты, как пептон, N-Z амин, ферментативный соевый гидролизат, дополнительный дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, дополнительные источники углерода и различные витамины.

Иллюстративные примеры подходящих дополнительных источников углерода включают, без ограничения, другие углеводы, такие как глюкозу, фруктозу, маннит, крахмал или гидролизат крахмала, гидролизат целлюлозы и мелассу; органические кислоты, такие как уксусную кислоту, пропионовую кислоту, молочную кислоту, муравьиную кислоту, яблочную кислоту, лимонную кислоту и фумаровую кислоту; и спирты, такие как глицерин, инозит, маннит и сорбит.

В некоторых вариантах осуществления среда дополнительно включает источник азота. Источники азота, подходящие для культивирования E. coli, известны в уровне техники. Иллюстративные примеры подходящих источников азота включают, без ограничения, аммиак, включая газообразный аммиак и водный раствор аммиака; аммониевые соли неорганических или органических кислот, такие как хлорид аммония, нитрат аммония, фосфат аммония, сульфат аммония и ацетат аммония; мочевину; нитратные или нитритные соли и другие азотсодержащие материалы, включая аминокислоты в чистом или неочищенном виде, мясной экстракт, пептон, рыбную муку, рыбный гидролизат, кукурузный экстракт, гидролизат казеина, гидролизат соевого жмыха, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, этанол-дрожжевой дистиллят, соевую муку, жмых от хлопковых семян и т.п.

В некоторых вариантах осуществления среда включает неорганическую соль. Иллюстративные примеры подходящих неорганических солей включают, без ограничения, соли калия, кальция, натрия, магния, марганца, железа, кобальта, цинка, меди, молибдена, вольфрама и других микроэлементов, а также фосфорную кислоту.

В некоторых вариантах осуществления среда включает соответствующие факторы роста. Иллюстративные примеры подходящих микроэлементов, факторов роста и т.п. включают, без ограничения, кофермент A, пантотеновую кислоту, пиридоксин-HCl, биотин, тиамин, рибофлавин, флавинмононуклеотид, флавинаденин-динуклеотид, DL-6,8-тиоктовую кислоту, фолиевую кислоту, витамин B12, другие витамины, аминокислоты, такие как цистеин и гидроксипролин, основания, такие как аденин, урацил, гуанин, тимин и цитозин, тиосульфат натрия, п- или r-аминобензойную кислоту, ниацинамид, нитрилоацетат и т.п., либо в виде чистых или частично очищенных химических соединений, либо в виде природных материалов. Количества могут быть определены эмпирически специалистом в данной области в соответствии со способами и методиками, известными в данной области.

В другом варианте осуществления модифицированный сахарид (по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа), описанный в настоящем документе, получают синтетическим путем, например, in vitro. Синтетическое получение или синтез сахаридов может позволить избежать дорогостоящего и трудоемкого процесса производства. В одном варианте осуществления сахарид синтезируются синтетическим путем, например, при использовании стратегии последовательного гликозилирования или комбинации последовательного гликозилирования и стратегии [3+2]-блок-синтеза из защищенных надлежащим образом моносахаридных промежуточных соединений. Например, тиогликозиды и производные гликозилтрихлорацетимидаты могут использоваться в качестве доноров гликозила при гликозилировании. В одном варианте осуществления сахарид, который синтезирован синтетически in vitro, имеет структуру, идентичную сахариду, полученному рекомбинантными способами, такими как манипуляция с белком семейства wzz, описанным выше.

Полученный (с помощью рекомбинантных или синтетических средств) сахарид имеет структуру, происходящую из любого серотипа E. coli, включая, например, любой из следующих серотипов E. coli: O1 (например, O1A, O1B, and O1C), O2, O3, O4 (например, O4:K52 и O4:K6), O5 (например, O5ab и O5ac (штамм 180/C3)), O6 (например, O6:K2; K13; K15 и O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18 (например, O18A, O18ac, O18A1, O18B и O18B1), O19, O20, O21, O22, O23 (например, O23A), O24, O25 (например, O25a и O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45 (например, O45 и O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D1, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73 (например, O73 (штамм 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 и O187.

Отдельные полисахариды обычно очищают (обогащают по отношению к количеству конъюгата полисахарида-белка) способами, известными в уровне техники, такими как, например, диализ, операции концентрирования, операции диафильтрации, фильтрация в тангенциальном потоке, осаждение, элюирование, центрифугирование, преципитация, ультрафильтрация, глубинная фильтрация и/или колоночная хроматография (ионообменная хроматография, мультимодальная ионообменная хроматография, ДЭАЭ и хроматография гидрофобного взаимодействия). Полисахариды предпочтительно очищают способом, который включает фильтрацию в тангенциальном потоке.

Очищенные полисахариды могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы сделать их способными реагировать (например, напрямую с белком-носителем или через линкер, такой как спейсер eTEC), а затем включены в гликоконъюгаты согласно изобретению, как дополнительно описано в настоящем документе.

В одном предпочтительном варианте осуществления сахарид согласно изобретению получен из серотипа E. coli, где серотипом является O25a. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O25b. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O1A. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O2. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O6. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O17. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O15. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O18A. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является О75. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O4. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O16. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O13. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O7. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O8. В другом предпочтительном варианте осуществления серотипом является O9.

При использовании в настоящем документе ссылка на любой из перечисленных выше серотипов относится к серотипу, который охватывает структуру повторяющегося звена (O-звена, как описано ниже), известную в данной области, и является уникальной для соответствующего серотипа. Например, термин серотип "O25a" (также известный в данной области как серотип "O25") относится к серотипу, который охватывает Формулу O25, показанную в Таблице 1. В качестве другого примера, термин серотип "O25b" относится к серотипу, который охватывает Формулу O25b, показанную в Таблице 1.

При использовании в настоящем документе серотипы указаны в настоящем документе родовым обозначением, если не указано иное, таким образом, например, термин "Формула "O18" в общем виде относится к Формуле O18A, Формуле O18ac, Формуле 18A1, Формуле O18B и Формуле O18B1.

При использовании в настоящем документе термин "O1" в общем виде относится к разновидностям Формулы, которые включают родовое обозначение "O1" в названии формулы в соответствии с Таблицей 1, такой как любая из Формулы O1A, Формулы O1A1, Формулы O1B и Формулы O1C, каждая из которых показана в Таблице 1. Таким образом, "серотип O1" в общем виде относится к серотипу, который охватывает любую из Формулы O1A, Формулы O1A1, Формулы O1B и Формулы O1C.

При использовании в настоящем документе термин "O6" в общем виде относится к разновидностям Формулы, которые включают родовое обозначение "O6" в названии Формулы в соответствии с Таблицей 1, такой как любая из Формулы O6:K2; K13; K15; и O6:K54, каждая из которых показана в Таблице 1. Таким образом, "серотип O6" в общем виде относится к серотипу, который охватывает любую из формул O6:K2; K13; K15; и O6:K54.

Другие примеры терминов, которые в общем виде относятся к разновидностям Формулы, которые включают родовое обозначение в названии Формулы в соответствии с Таблицей 1, включают: "O4", "O5", "O18" и "O45".

При использовании в настоящем документе термин "O2" относится к формуле O2, показанной в таблице 1. Термин "O2-O-антиген" относится к сахариду, который охватывает Формулу O2, показанную в Таблице 1.

При использовании в настоящем документе ссылка на О-антиген из серотипа, указанного выше, относится к сахариду, который охватывает формулу, отмеченную соответствующим названием серотипа. Например, термин "О-антиген O25B" относится к сахариду, который охватывает Формулу O25B, показанную в Таблице 1.

В качестве другого примера термин "O1-О-антиген" в общем виде относится к сахариду, который охватывает Формулу, включающую термин "O1", такую как Формула O1А, Формула O1А1, Формула O1В и Формула O1С, каждая из которых показана в Таблице 1.

В качестве другого примера термин "О6-О-антиген" в общем виде относится к сахариду, который охватывает Формулу, включающую термин "О6", такую как Формула О6:K2; Формула O6:K13; Формула O6:K15 и Формула O6:K54, каждая из которых показана в Таблице 1.

O-ПОЛИСАХАРИД

При использовании в настоящем документе термин "O-полисахарид" относится к любой структуре, включающей O-антиген, при условии, что структура не включает целую клетку или Липид A. Например, в одном варианте осуществления O-полисахарид включает липолисахарид, где Липид A не связан. Стадия удаления Липида A известна в уровне техники и включает, в качестве примера, термическую обработку с добавлением кислоты. Иллюстративный процесс включает обработку 1% уксусной кислотой при 100°C в течение 90 минут. Этот процесс объединяют с процессом выделения Липида A при его удалении. Иллюстративный процесс выделения Липида A включает ультрацентрифугирование.

В одном варианте осуществления O-полисахарид относится к структуре, состоящей из O-антигена, и в таком случае O-полисахарид является синонимом термина O-антиген. В одном предпочтительном варианте осуществления O-полисахарид относится к структуре, включающей повторяющиеся звенья O-антигена без центрального сахарида. Таким образом, в одном варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R1. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R2. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R3. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R4. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli K12. В другом предпочтительном варианте осуществления O-полисахарид относится к структуре, включающей O-антиген и центральный сахарид. В другом варианте осуществления O-полисахарид относится к структуре, включающей O-антиген, центральный сахарид и молекулу KDO.

Способы очистки О-полисахарида, который включает центральный олигосахарид, от ЛПС известны в уровне техники. Например, после очистки ЛПС очищенный ЛПС может быть гидролизован путем нагревания в 1% (об/об) уксусной кислоте в течение 90 минут при 100 градусах Цельсия с последующим ультрацентрифугированием при 142000 g в течение 5 часов при 4 градусах Цельсия. Супернатант, содержащий О-полисахарид, подвергают лиофильной сушке и хранят при 4 градусах Цельсия. В некоторых вариантах осуществления описана делеция генов синтеза капсулы для обеспечения простой очистки О-полисахарида.

О-полисахарид может быть выделен способами, включающими, без ограничения этим, мягкий кислотный гидролиз для удаления липида A из ЛПС. Другие варианты осуществления могут включать применение гидразина в качестве реагента для получения О-полисахарида. Получение ЛПС может быть выполнено с помощью известных в данной области способов.

В некоторых вариантах осуществления O-полисахариды, очищенные из штаммов грамотрицательных бактерий дикого типа, модифицированных или аттенуированных, которые экспрессируют (необязательно оверэкспрессируют) белок Wzz (например, wzzB), предназначены для применения в конъюгатных вакцинах. В предпочтительных вариантах осуществления O-полисахаридную цепь очищают из штамма грамотрицательных бактерий, экспрессирующего (необязательно оверэкспрессирующего) белок wzz, для применения в качестве вакцинного антигена в виде конъюгата или в виде комплексной вакцины.

В одном варианте осуществления O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая увеличена приблизительно в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз, 16 раз, 17 раз, 18 раз, 19 раз, 20 раз, 21 раз, 22 раза, 23 раза, 24 раза, 25 раз, 26 раз, 27 раз, 28 раз, 29 раз, 30 раз, 31 раз, 32 раза, 33 раза, 34 раза, 35 раз, 36 раз, 37 раз, 38 раз, 39 раз, 40 раз, 41 раз, 42 раза, 43 раза, 44 раза, 45 раз, 46 раз, 47 раз, 48 раз, 49 раз, 50 раз, 51 раз, 52 раза, 53 раза, 54 раза, 55 раз, 56 раз, 57 раз, 58 раз, 59 раз, 60 раз, 61 раз, 62 раза, 63 раза, 64 раза, 65 раз, 66 раз, 67 раз, 68 раз, 69 раз, 70 раз, 71 раз, 72 раза, 73 раза, 74 раза, 75 раз, 76 раз, 77 раз, 78 раз, 79 раз, 80 раз, 81 раз, 82 раза, 83 раза, 84 раза, 85 раз, 86 раз, 87 раз, 88 раз, 89 раз, 90 раз, 91 раз, 92 раза, 93 раза, 94 раза, 95 раз, 96 раз, 97 раз, 98 раз, 99 раз, 100 раз или больше по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая увеличена по меньшей мере в 1 раз и не больше чем в 5 раз по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. В другом варианте осуществления O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая увеличена по меньшей мере в 2 раза и не больше чем в 4 раза по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. Увеличение молекулярной массы O-полисахарида по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа предпочтительно связано с увеличением количества повторяющихся звеньев O-антигена. В одном варианте осуществления увеличение молекулярной массы O-полисахарида обусловлено белком семейства wzz.

В одном варианте осуществления O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая увеличена приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 кДа или больше по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. В одном варианте осуществления O-полисахарид изобретения имеет молекулярную массу, которая увеличена по меньшей мере на 1 и не больше чем на 200 кДа по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 5 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 12 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 15 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 18 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 21 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 22 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 30 и не больше чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 1 и не больше чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 5 и не больше чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 12 и не больше чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 15 и не больше чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 1 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 5 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 12 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 15 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 18 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 30 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 90 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 12 и не больше чем на 85 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 70 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 60 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 50 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 49 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 48 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 47 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 10 и не больше чем на 46 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 45 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 44 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 43 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 42 кДа. В одном варианте осуществления молекулярная масса увеличена по меньшей мере на 20 и не больше чем на 41 кДа. Такое увеличение молекулярной массы O-полисахарида по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа предпочтительно связано с увеличением количества повторяющихся звеньев O-антигена. В одном варианте осуществления увеличение молекулярной массы O-полисахарида обусловлено белком семейства wzz.

В другом варианте осуществления O-полисахарид включает любую Формулу, выбранную из Таблицы 1, где количество повторяющихся звеньев n в O-полисахариде больше, чем количество повторяющихся звеньев в соответствующем O-полисахариде дикого типа на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или больше повторяющихся звеньев. Предпочтительно сахарид включает увеличение по меньшей мере на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа.

O-АНТИГЕН

О-антиген является компонентом липополисахарида (ЛПС) во внешней мембране грамотрицательных бактерий. О-антиген находится на клеточной поверхности и является вариабельным компонентом клетки. Вариабельность О-антигена служит основой для серотипирования грамотрицательных бактерий. Существующая схема серотипирования E. coli включает О-полисахариды 1-181.

О-антиген включает олигосахаридные повторяющиеся звенья (О-звенья), структура дикого типа которых обычно содержит от двух до восьми остатков широкого спектра сахаров. О-звенья иллюстративных О-антигенов E. coli показаны в Таблице 1. О-звенья иллюстративных О-антигенов K. pneumoniae показаны в Таблице 1а.

В одном варианте осуществления сахарид согласно изобретению может быть одним олигосахаридным звеном. В одном варианте осуществления сахарид согласно изобретению представляет собой одно повторяющееся олигосахаридное звено соответствующего серотипа. В таких вариантах осуществления сахарид может включать структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.

В одном варианте осуществления сахарид согласно изобретению может быть олигосахаридами. Олигосахариды содержат небольшое количество повторяющихся звеньев (обычно 5-15 повторяющихся звеньев), и обычно их получают путем синтеза или гидролиза полисахаридов. В таких вариантах осуществления сахарид может включать структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.

Предпочтительно все сахариды согласно настоящему изобретению и в иммуногенных композициях согласно настоящему изобретению являются полисахаридами. Высокомолекулярные полисахариды могут индуцировать некоторые гуморальные иммунные ответы благодаря эпитопам, присутствующим на антигенной поверхности. Выделение и очистка полисахаридов с высокой молекулярной массой предпочтительно рассматриваются для применения в конъюгатах, композициях и способах согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления количество повторяющихся O-звеньев в каждом отдельном полимере O-антигена (и, следовательно, длина и молекулярная масса полимерной цепи) зависит от регулятора длины цепи wzz, белка внутренней мембраны. Разные белки wzz придают разные диапазоны модальной длины (от 4 до >100 повторяющихся единиц). Термин "модальная длина" относится к количеству повторяющихся O-звеньев. Грамотрицательные бактерии часто имеют два разных белка Wzz, которые обеспечивают две различные модальных длины цепей OAg: одну более длинную, а другую более короткую. Экспрессия (необязательно оверэкспрессия) белков семейства wzz (например, wzzB) в грамотрицательных бактериях может позволить манипулировать длиной О-антигена, изменять или смещать бактериальную продукцию О-антигенов некоторых диапазонов длин и обеспечивать повышение продукции высокомолекулярных липополисахаридов с высоким выходом. В одном варианте осуществления "малая" модальная длина при использовании в настоящем документе относится к небольшому количеству повторяющихся O-звеньев, например 1-20. В одном варианте осуществления "большая" модальная длина при использовании в настоящем документе относится к количеству повторяющихся O-звеньев больше 20 и максимумально до 40. В одном варианте осуществления "очень большая" модальная длина при использовании в настоящем документе относится больше чем к 40 повторяющимся O-звеньям.

В одном варианте осуществления получаемый сахарид увеличен по меньшей мере на 10 повторяющихся звеньев, 15 повторяющихся звеньев, 20 повторяющихся звеньев, 25 повторяющихся звеньев, 30 повторяющихся звеньев, 35 повторяющихся звеньев, 40 повторяющихся звеньев, 45 повторяющихся звеньев, 50 повторяющихся звеньев, 55 повторяющихся звеньев, 60 повторяющихся звеньев, 65 повторяющихся звеньев, 70 повторяющихся звеньев, 75 повторяющихся звеньев, 80 повторяющихся звеньев, 85 повторяющихся звеньев, 90 повторяющихся звеньев, 95 повторяющихся звеньев или 100 повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа.

В другом варианте осуществления сахарид согласно изобретению увеличен на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или больше повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. Предпочтительно сахарид включает увеличение по меньшей мере на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа.

Способы определения количества повторяющихся звеньев в сахариде также известны из уровня техники. Например, количество повторяющихся звеньев (или "n" в Формуле) можно вычислить путем деления молекулярной массы полисахарида (без молекулярной массы центрального сахарида или остатка KDO) на молекулярную массу повторяющегося звена (т.е. молекулярную массу структуры в соответствующей Формуле, показанной, например, в Таблице 1, которая теоретически может быть вычислена как сумма молекулярной массы каждого моносахарида в Формуле). Молекулярная масса каждого моносахарида в Формуле известна из уровня техники. Молекулярная масса повторяющегося звена Формулы O25b, например, составляет приблизительно 862 Да. Молекулярная масса повторяющегося звена Формулы O1a, например, составляет приблизительно 845 Да. Молекулярная масса повторяющегося звена Формулы O2, например, составляет приблизительно 829 Да. Молекулярная масса повторяющегося звена Формулы O6, например, составляет приблизительно 893 Да. При определении количества повторяющихся звеньев в конъюгате при вычислении учитывают молекулярную массу белка-носителя и отношение белка:полисахарида. Как определено в настоящем документе, "n" относится к количеству повторяющихся звеньев (представленных в скобках в Таблице 1) в молекуле полисахарида. Как известно из уровня техники, в биологических макромолекулах повторяющиеся структуры могут чередоваться с областями несовершенных повторов, такими как, например, отсутствующие ветвления. Кроме того, из уровня техники известно, что полисахариды, выделенные и очищенные из природных источников, таких как бактерии, могут быть гетерогенными по размеру и ветвлению. В таком случае n может представлять собой среднее или медианное значение n для молекул в популяции.

В одном варианте осуществления O-полисахарид имеет увеличение по меньшей мере одного повторяющегося звена O-антигена по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. Повторяющиеся звенья O-антигенов показаны в Таблице 1 и Таблице 1a. В одном варианте осуществления O-полисахарид включает в общей сложности 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или больше повторяющихся звеньев. Предпочтительно сахарид в общей сложности содержит от по меньшей мере 3 до не больше чем 80 повторяющихся звеньев. В другом варианте осуществления O-полисахарид увеличен на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или больше повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. В одном варианте осуществления сахарид включает O-антиген, где n в любой из формул O-антигена (такой как, например, Формулы, показанные в Таблице 1) представляет собой целое число, равное по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 и не больше чем 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 или 50. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть скомбинированы с определением диапазона. Иллюстративные диапазоны включают, например, от по меньшей мере 1 до не больше чем 1000; от по меньшей мере 10 до не больше чем 500; и от по меньшей мере 20 до не больше чем 80, предпочтительно не больше чем 90. В одном предпочтительном варианте осуществления n составляет от по меньшей мере 31 до не больше чем 90. В предпочтительном варианте осуществления n равно 40-90, более предпочтительно 60-85.

В одном варианте осуществления сахарид включает O-антиген, где n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 1 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 5 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 10 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 25 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 50 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 75 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 100 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 125 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 150 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 175 и не больше чем 200. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 1 и не больше чем 100. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 5 и не больше чем 100. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 10 и не больше чем 100. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 25 и не больше чем 100. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 50 и не больше чем 100. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 75 и не больше чем 100. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 1 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 5 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 10 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 20 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 25 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 30 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 40 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 50 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 30 и не больше чем 90. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 85. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 75. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 70. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 60. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 50. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 49. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 48. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 47. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 35 и не больше чем 46. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 36 и не больше чем 45. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 37 и не больше чем 44. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 38 и не больше чем 43. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 39 и не больше чем 42. В одном варианте осуществления n в любой из Формул O-антигена равно по меньшей мере 39 и не больше чем 41.

Например, в одном варианте осуществления n в сахариде равно 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 или 90, наиболее предпочтительно 40. В другом варианте осуществления n равно от по меньшей мере 35 до не больше чем 60. Например, в одном варианте осуществления n является любым из 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 и 60, предпочтительно 50. В другом предпочтительном варианте осуществления n равно от по меньшей мере 55 до не больше чем 75. Например, в одном варианте осуществления n равно 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69, наиболее предпочтительно 60.

Структура сахарида может быть определена с помощью методов и инструментов, известных в данной области, таких как, например, ЯМР, в том числе 1D, 1H и/или 13C, 2D TOCSY, DQF-COSY, NOESY и/или HMQC.

В некоторых вариантах осуществления очищенный полисахарид перед конъюгированием имеет молекулярную массу от 5 кДа до 400 кДа. В других таких вариантах осуществления сахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 400 кДа; от 5 кДа до 400 кДа; от 5 кДа до 300 кДа; от 5 кДа до 200 кДа; от 5 кДа до 150 кДа; от 10 кДа до 100 кДа; от 10 кДа до 75 кДа; от 10 кДа до 60 кДа; от 10 кДа до 40 кДа; от 10 кДа до 100 кДа; 10 кДа до 200 кДа; от 15 кДа до 150 кДа; от 12 кДа до 120 кДа; от 12 кДа до 75 кДа; от 12 кДа до 50 кДа; от 12 и 60 кДа; от 35 кДа до 75 кДа; от 40 кДа до 60 кДа; от 35 кДа до 60 кДа; от 20 кДа до 60 кДа; от 12 кДа до 20 кДа; или от 20 кДа до 50 кДа. В других вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 7 кДа до 15 кДа; от 8 кДа до 16 кДа; от 9 кДа до 25 кДа; от 10 кДа до 100; от 10 кДа до 60 кДа; от 10 кДа до 70 кДа; от 10 кДа до 160 кДа; от 15 кДа до 600 кДа; от 20 кДа до 1000 кДа; от 20 кДа до 600 кДа; от 20 кДа до 400 кДа; от 30 кДа до 1000 кДа; от 30 кДа до 60 кДа; от 30 кДа до 50 кДа или от 5 кДа до 60 кДа. Любое целое число в любом из приведенных выше диапазонов рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

При использовании в настоящем документе термин "молекулярная масса" полисахарида или конъюгата белка-носителя-полисахарида относится к молекулярной массе, вычисленной с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) в сочетании с детектором многоуглового рассеяния лазерного излучения (MALLS).

Размер полисахарида может немного уменьшиться в ходе обычных процедур очистки. Кроме того, как описано в настоящем документе, полисахарид может быть подвергнут методам доводки размера перед конъюгированием. Может использоваться механическая или химическая доводка размера. Химический гидролиз может быть выполнен с использованием уксусной кислоты. Механическая доводка размера может быть выполнена с помощью гомогенизации высокого давления. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией).

†β-D-6dmanHep2Ac - 2-O-ацетил-6-дезокси-β-D-манно-гептопиранозил.

‡β-D-Xulf - β-D-трео-пентофуранозил.

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ОЛИГОСАХАРИД

Центральный олигосахарид расположен между липидом A и внешней областью О-антигена в ЛПС E. coli дикого типа. В частности, центральный олигосахарид является частью полисахарида, которая включает связь между О-антигеном и липидом A в E. coli дикого типа. Эта связь включает кетозидную связь между полукетальной функциональной группой внутреннего остатка 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO) и гидроксильной группой остатка GlcNAc липида А. Область центрального олигосахарида демонстрирует высокую степень подобия среди штаммов E. coli дикого типа. Обычно она включает ограниченное количество сахаров. Центральный олигосахарид включает внутреннюю центральную область и внешнюю центральную область.

В частности, внутренний центр состоит в основном из остатков L-глицеро-D-манно-гептозы (гептозы) и KDO. Внутренний центр является высококонсервативным. Остаток KDO включает следующую Формулу KDO:

Внешняя область центрального олигосахарида демонстрирует более высокую вариацию, чем внутренняя центральная область, причем различия в этой области определяют отличие пяти хемотипов в E. coli: R1, R2, R3, R4 и K-12. HepII является последним остатком внутреннего центрального олигосахарида. Тогда как все олигосахариды внешнего центра имеют общую структурную тему с (гексоза)₃ углеводным скелетом и двумя остатками боковой цепи, порядок гексоз в основной цепи, а также природа, положение и связь остатков боковой цепи могут варьировать. Структуры олигосахаридов внешнего центра R1 и R4 обладают высоким подобием, различаясь только одним β-связанным остатком.

Центральные олигосахариды E. coli дикого типа в уровне техники подразделяют по структурам дистального олигосахарида на пять различных хемотипов: E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 и E. coli K12.

В предпочтительном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, включают гликоконъюгаты, в которых O-полисахарид включает центральный олигосахарид, связанный с О-антигеном. В одном варианте осуществления композиция индуцирует иммунный ответ, по меньшей мере, против любого из центральных хемотипов E. coli E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 и E. coli K12. В другом варианте осуществления композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против двух центральных хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против трех центральных хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против четырех центральных хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления композиция индуцирует иммунный ответ против всех пяти центральных хемотипов E. coli.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, включают гликоконъюгаты, в которых O-полисахарид не включает центральный олигосахарид, связанный с О-антигеном. В одном варианте осуществления такая композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против любого из центральных хемотипов E. coli E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 и E. coli K12, несмотря на то что гликоконъюгат содержит О-полисахарид, который не включает центральный олигосахарид.

Серотипы E. coli могут быть охарактеризованы в соответствии с одним из пяти хемотипов. В Таблице 2 перечислены типовые серотипы, охарактеризованные в соответствии с хемотипом. Серотипы, выделенные жирным шрифтом, представляют собой серотипы, которые чаще всего связаны с указанным центральным хемотипом. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против любого из центральных хемотипов E. coli E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 и E. coli K12, который включает иммунный ответ против любого из соответствующих соответствующих серотипов E. coli.

Таблица 2: Центральный хемотип и соответствующий серотип E. coli Центральный хемотип Серотип R1 O25a, O6, O2, O1, O75, O4, O16, O8, O18, O9, O13, O20, O21, O91 и O163. R2 O21, O44, O11, O89, O162, O9 R3 O25b, O15, O153, O21, O17, O11, O159, O22 O86, O93 R4 O2, O1, O86, O7,O102, O160, O166 K-12 O25b, O16

В некоторых вариантах осуществления композиция включает сахарид, включающий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R1, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O25a, Формулу O6, Формулу O2, Формулу O1, Формулу O75, Формулу O4, Формулу O16, Формулу O8, Формулу O18, Формулу O9, Формулу O13, Формулу O20, Формулу O21, Формулу O91 и Формулу O163, где n равно 1-100. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R1.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает сахарид, включающий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R1, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O25a, Формулу O6, Формулу O2, Формулу O1, Формулу O75, Формулу O4, Формулу O16, Формулу O18, Формулу O13, Формулу O20, Формулу O21, Формулу O91 и Формулу O163, где n равно 1-100, предпочтительно 31-100, более предпочтительно 35-90, наиболее предпочтительно 35-65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R1 в сахариде.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает сахарид, включающий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R2, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O21, Формулу O44, Формулу O11, Формулу O89, Формулу O162 и Формулу O9, где n равно 1-100, предпочтительно 31-100, более предпочтительно 35-90, наиболее предпочтительно 35-65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R2.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает сахарид, включающий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R3, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O25b, Формулу O15, Формулу O153, Формулу O21, Формулу O17, Формулу O11, Формулу O159, Формулу O22, Формулу O86 и Формулу O93, где n равно 1-100, предпочтительно 31-100, более предпочтительно 35-90, наиболее предпочтительно 35-65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R3.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает сахарид, включающий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R4, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O2, Формулу O1, Формулу O86, Формулу O7, Формулу O102, Формулу O160 и Формулу O166, где n равно 1-100, предпочтительно 31-100, более предпочтительно 35-90, наиболее предпочтительно 35-65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R4.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает сахарид, включающий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип K-12 (например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O25b, и сахарида, имеющего Формулу O16), где n равно 1-1000, предпочтительно 31-100, более предпочтительно 35-90, наиболее предпочтительно 35-65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает центральный фрагмент E. coli K-12.

В некоторых вариантах осуществления сахарид включает центральный сахарид. Таким образом, в одном варианте осуществления O-полисахарид дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R1. В другом варианте осуществления O-полисахарид дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R2. В другом варианте осуществления O-полисахарид дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R3. В другом варианте осуществления O-полисахарид дополнительно включает центральный фрагмент E. coli R4. В другом варианте осуществления O-полисахарид дополнительно включает центральный фрагмент E. coli K12.

В некоторых вариантах осуществления сахарид не включает центральный сахарид. Таким образом, в одном варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R1. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R2. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R3. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli R4. В другом варианте осуществления O-полисахарид не включает центральный фрагмент E. coli K12.

САХАРИД И/ИЛИ ПОЛИПЕПТИД ИЛИ ИХ ФРАГМЕНТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Klebsiella pneumoniae является грамотрицательным патогеном, который, как известно, вызывает инфекции мочевыводящих путей, бактериемию и сепсис. В одном аспекте любая из композиций, раскрытых в настоящем документе, может дополнительно включать по меньшей мере один сахарид, который представляет собой или получен из по меньшей мере одного серотипа K. pneumoniae, выбранного из O1 (и d-Gal-III вариантов), O2 (и d-Gal-III вариантов), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 и O12. В предпочтительном варианте осуществления любая из композиций, раскрытых в настоящем документе, может дополнительно включать полипептид, полученный из K. pneumoniae, выбранный из полипептида, полученного из фимбриального белка K. pneumoniae типа 1 или его иммуногенного фрагмента; и полипептид, полученный из фимбриального белка K. pneumoniae типа III или его иммуногенного фрагмента.

Как известно из уровня техники, антигены K. pneumoniae O1 и O2 содержат гомополимерные звенья галактозы (или галактаны). Каждый из антигенов K. pneumoniae O1 и O2 содержит звенья D-галактана I (иногда называемые повторяющимся звеном O2a), однако антигены O1 отличаются тем, что антигены O1 имеют структуру кэпа D-галактана II. D-галактан III (d-Gal-III) является вариантом D-галактана I. В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющееся звено [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]. В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющееся звено [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]. В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющееся звено [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→] и повторяющееся звено [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]. В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющееся звено →3)-β-D-Galf-(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-(1→] (называемое повторяющимся звеном D-Gal-III).

В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O2, включает повторяющееся звено [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→] (которое может быть компонентом антигена K. pneumoniae серотипа O2a). В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O2, включает повторяющееся звено [→3)-β-D-GlcpNAc-(1→5)-β-D-Galf-(1→] (которое может быть компонентом антигена K. pneumoniae серотипа O2c). В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O2, включает модификацию повторяющегося звена O2a с добавлением боковой цепи (1→4)-связанных остатков Galp (которое может быть компонентом антигена K. pneumoniae O2afg). В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O2, включает модификацию повторяющегося звена O2a с добавлением боковой цепи (1→2)-связанных остатков Galp (которое может быть компонентом антигена K. pneumoniae O2aeh).

Без ограничения механизмом или теорией, структура полисахарида O-антигена K. pneumoniae серотипов O3 и O5, как раскрыто в уровне техники, идентична структуре серотипов E. coli O9a (Формула O9a) и O8 (Формула O8), соответственно.

В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O4, включает повторяющееся звено [→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]. В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O7, включает повторяющееся звено [→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]. В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из серотипа K. pneumoniae O8, включает такую же структуру повторяющегося звена, как K. pneumoniae O2a, но при этом является нестехиометрически O-ацетилированным. В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из серотипа K. pneumoniae O12, включает дисахаридное повторяющееся звено [α-Rhap-(1→3)-β-GlcpNAc].

Таблица 1a. Серогруппы/серотипы K. pneumoniae и фрагменты O-звена Серогруппа/
Серотип Структура фрагмента (O-звено) Структура фрагмента, указанная в настоящем документе как: O1 [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]_n Формула K.O1.1 O1 [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]_n Формула K.O1.2 O1 [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]_n и
[→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]_n Формула K.O1.3 O1 [→3)-β-D-Galf-(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)] -α-D-Galp-(1→]_n Формула K.O1.4 O2 [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→]_n Формула K.O2.1 O2 [→3)-β-D-GlcpNAc-(1→5)-β-D-Galf-(1→]_n Формула K.O2.2 O2 Модификация [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→]_n путем присоединения боковой цепи (1→4)-связанных остатков Galp Формула K.O2.3 O2 Модификация [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→]_n путем присоединения боковой цепи (1→2)-связанных остатков Galp Формула K.O2.4 O3 [→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→]_n Формула K.O3 O4 [→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]_n Формула K.O4 O5 [→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-β-d-Man-(1→]_n Формула K.O5 O7 [→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]_n Формула K.O7 O12 [α-Rhap-(1→3)-β-GlcpNAc]_n Формула K.O12 O8 [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→]_n - нестехиометрически O-ацетилированный Формула K.O8

При использовании в настоящем документе термин "приблизительно" означает в пределах статистически значимого диапазона значения, такого как установленный диапазон концентраций, временные рамки, молекулярная масса, температура или рН. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, обычно в пределах 20%, более типично в пределах 10% и еще более типично в пределах 5% или в пределах 1% от заданного значения или диапазона. Иногда такой диапазон может находиться в пределах экспериментальной ошибки, типичной для стандартных методов, используемых для измерения и/или определения заданного значения или диапазона. Допустимая вариация, охватываемая термином "приблизительно", будет зависеть от конкретной изучаемой системы и может быть легко оценена средним специалистом в данной области. В каждом случае, когда в данной заявке указан диапазон, каждое число в пределах диапазона также рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

Термины "включающий", "включать" и "включет" в настоящем документе предусмотрены авторами изобретения для необязательной замены терминами "состоящий по существу из", "состоит по существу из", "состоящий из" и "состоит из" соответственно в каждом случае.

"Иммуногенное количество", "иммунологически эффективное количество", "терапевтически эффективное количество", "профилактически эффективное количество" или "доза", каждый из которых используется в настоящем документе взаимозаменяемо, обычно относится к такому количеству антигена или иммуногенной композиции, которое является достаточным, чтобы вызвать иммунный ответ, клеточный (T-клеточный) и/или гуморальный ответ (B-клеточный или образование антител), измеряемый с помощью стандартных анализов, известных специалисту в данной области.

Любое целое число в любом из диапазонов настоящего документа рассматривается как вариант осуществления изобретения.

Все ссылки или заявки на патенты, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством отсылки.

Изобретение иллюстрируется сопровождающими примерами. Приведенные ниже примеры осуществляют с использованием стандартных методов, которые хорошо известны и являются обычными для специалистов в данной области, за исключением случаев, когда подробно описано иное. Примеры являются иллюстративными, но не ограничивают изобретение.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: ШТАММЫ E. COLI И S. ENTERICA

Клинические штаммы и производные перечислены в Таблице 3. Дополнительные референсные штаммы включали: O25K5H1, клинический штамм серотипа O25a; и штамм LT2 S. enterica серовара Typhimurium.

В штаммах E. coli были сделаны нокауты генов, удаляющие целевую открытую рамку считывания, но оставляющие короткую усеченную последовательность.

Гидролизованная цепь O-антигена и центральные сахара обозначены далее как O-полисахарид (OPS) для простоты.

Таблица 3 Штаммы E. coli Штамм Другое обозначение штамма Генотип Серотип GAR2401 PFEEC0100 wt (изолят из крови) O25b '2401ΔwzzB -- ΔwzzB O25b '2401ΔAraAΔ(OPS) -- ΔAraA Δ(rflB-wzzB) OPS- O25K5H1 PFEEC0101 wt O25a O25K5H1ΔwzzB ΔwzzB O25a D559 -- W3110 ΔAraAΔfhuAΔrecA OPS- BD559ΔwzzB -- W3110ΔAraA ΔfhuAΔrecAΔwzzB OPS- BD559Δ(OPS) -- BD559 Δ(rflB-wzzB) OPS- GAR2831 PFEEC0102 wt (изолят из крови) O25b GAR865 PFEEC0103 wt (изолят из крови) O2 GAR868 PFEEC0104 wt (изолят из крови) O2 GAR869 PFEEC0105 wt (изолят из крови) O15 GAR872 PFEEC0106 wt (изолят из крови) O1 GAR878 PFEEC0107 wt (изолят из крови) O75 GAR896 PFEEC0108 wt (изолят из крови) O15 GAR1902 PFEEC0109 wt (изолят из крови) O6 Atlas187913 PFEEC0068 wt (изолят из крови) O25b Штамм LT2 Salmonella enterica серовара Typhimurium -- wt N/A

ПРИМЕР 2: ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ WZZB, FEPE И O-АНТИГЕНА

Таблица 4. Олигонуклеотидные праймеры Название Последовательность праймера Комментарии LT2wzzB_S GAAGCAAACCGTACGCGTAAAG (SEQ ID NO: 1) на основе Genbank GCA_000006945.2 штамм LT2 Salmonella enterica серовара Typhimurium LT2wzzB_AS CGACCAGCTCTTACACGGCG (SEQ ID NO: 2) O25bFepE_S GAAATAGGACCACTAATAAATACACAAATTAATAAC (SEQ ID NO: 3) на основе Genbank GCA_000285655.3
штамм O25b EC958 сборка ST131 и O25b данные GAR2401 WGS O25bFepE_A ATAATTGACGATCCGGTTGCC (SEQ ID NO: 4) wzzB P1_S Gctatttacgccctgattgtcttttgt (SEQ ID NO: 5) на основе последовательности штамма E. coli K-12, Genbank MG1655 NC_000913.3 или W3110 сборка GCA_000010245.1 wzzB P2_AS ATTGAGAACCTGCGTAAACGGC (SEQ ID NO: 6) wzzB P3_S TGAAGAGCGGTTCAGATAACTTCC (SEQ ID NO: 7) (УДФ-глюкозо-6-дегидрогеназа) wzzB P4_AS CGATCCGGAAACCTCCTACAC (SEQ ID NO: 8)
(Фосфорибозил-АМФ-циклогидролаза/
Фосфорибозил-АТФ-пирофосфогидролаза) O157 FepE_S GATTATTCGCGCAACGCTAAACAGAT (SEQ ID NO: 9) E. coli O157 fepE (на основе штамма Genbank EDL933 GCA_000732965.1) O157 FepE_AS TGATCATTGACGATCCGGTAGCC (SEQ ID NO: 10) pBAD33_adaptor_S CGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGGTTTAAACCCAAGCAACAGATCGGCGTCGTCGGTATGGA (SEQ ID NO: 11) Адаптер содержит центральный сайт PmeI и обладает гомологией с консервативными последовательностями промотора оперона 5' OAg и 3' гена gnd pBAD33_adaptor_AS AGCTTCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGGGTTTAAACCACGCTACCGCCCCTGGCTTTACAGCTACCGAGCT (SEQ ID NO: 12) JUMPSTART_r GGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTG (SEQ ID NO: 13) Универсальный Jumpstart (промотор оперона OAg) gnd_f CCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG (SEQ ID NO: 14) Универсальный антисмысловой праймер к 3' OAg (gnd) оперону

ПРИМЕР 3: ПЛАЗМИДЫ

Плазмидные векторы и субклоны перечислены в Таблице 5. ПЦР-фрагменты, несущие различные гены wzzB и fepE E. coli и Salmonella, амплифицировали с очищенной геномной ДНК и субклонировали в высококопийную плазмиду, поставляемую в наборе для клонирования Invitrogen PCR®Blunt. Эта плазмида основана на репликоне pUC. Праймеры P3 и P4 использовались для амплификации генов wzzB E. coli с их нативным промотором и предназначены для связывания с областями в проксимальных и дистальных генах, кодирующих УДФ-глюкозо-6-дегидрогеназу и фосфорибозиладениннуклеотидгидролазу соответственно (аннотированные в Genbank MG1655 NC_000913.3). ПЦР-фрагмент, содержащий ген и промотор fepE Salmonella, амплифицировали с использованием ранее описанных праймеров. Аналогичные праймеры к fepE E. coli подбирали на основе доступных геномных последовательностей из Genbank или собственных полногеномных данных (в случае GAR2401 и O25K5H1). Низкокопийную плазмиду pBAD33 использовали для экспрессии генов биосинтеза О-антигена под контролем арабинозного промотора. Плазмиду сначала модифицировали для облегчения клонирования (по методу Гибсона) длинных ПЦР-фрагментов, амплифицированных при использовании универсальных праймеров, гомологичных 5'-промотору и 3'-гену 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (gnd) (Таблица 5).

Таблица 5. Плазмиды Название Репликон Маркер устойчивости Комментарии PCR®Blunt II TOPO pUC KanR Вектор для ПЦР-клонирования Invitrogen pBAD33 P15a CamR Арабинозный индуцируемый вектор pBAD33-OAg P15a CamR Вектор для клонирования OAg оперона по Гибсону pBAD33-O25b P15a CamR Плазмида экспрессии O25b OAg pBAD33-O21 P15a CamR Плазмида экспрессии O21 OAg pBAD33-O16 P15a CamR Плазмида экспрессии O16 OAg pBAD33-O75 P15a CamR Плазмида экспрессии O75 OAg pBAD33-O1 P15a CamR Плазмида экспрессии O1 OAg pBAD33-O2 P15a CamR Плазмида экспрессии O2 OAg pTOPO-O25b 2401 wzzB pUC KanR гДНК матрица GAR 2401 pTOPO-O25b 2401 fepE pUC KanR pTOPO-K12 wzzB pUC KanR гДНК матрица штамма K-12 E. coli pTOPO-O25a wzzB pUC KanR гДНК матрица штамма O25K5H1 E. coli O25a pTOPO-O25a fepE pUC KanR pTOPO-Salmonella LT2 wzzB pUC KanR гДНК матрица штамма LT2 Salmonella enterica серовара Typhimurium pTOPO-Salmonella LT2 fepE pUC KanR pTOPO-O25a ETEC wzzB pUC KanR гДНК штамма O25a ETEC, приобретенная в ATCC ("NR-5" E2539-C1) pTOPO-O25a ETEC fepE pUC KanR pTOPO-O157fepE pUC KanR гДНК штамма O157:H7:K- Shigella токсин, приобретенная в ATCC (EDL933 #43895D-5)

ПРИМЕР 4: Очистка O-антигена

Ферментационную среду обрабатывали уксусной кислотой до конечной концентрации 1-2% (конечный рН 4,1). Экстракцию OAg и делипидирование проводили при нагревании обработанной кислотой среды до 100°C в течение 2 часов. В конце кислотного гидролиза смесь охлаждали до окружающей температуры и добавляли 14% NH₄OH до конечного pH 6,1. Нейтрализованную среду центрифугировали и собирали центрифугат. К центрифугату добавляли CaCl₂ в фосфате натрия и инкубировали полученную суспензию в течение 30 минут при комнатной температуре.

Твердую фазу удаляли с помощью центрифугирования и концентрировали центрифугат в 12 раз при использовании мембраны 10 кДа с двумя последующими диафильтрациями против воды. Затем концентрат, содержащий OAg, очищали при использовании угольного фильтра. Фильтрат после угольного фильтра разбавляли 1:1 (об/об) 4,0М сульфатом аммония. Конечная концентрация сульфата аммония составляла 2М. Затем фильтрат после угольного фильтра, обработанный сульфатом аммония, очищали при использовании мембраны с 2М сульфатом аммония в качестве подвижного буфера. OAg собирали в фильтрате. В случае длинного OAg фильтрат HIC концентрировали, а затем заменяли буфер на воду (20 диаобъемов) при использовании мембраны 5 кДа. В случае короткого (нативного) OAg полисахарида MWCO дополнительно снижали для увеличения выхода.

В еще одном варианте осуществления твердую фазу удаляли с помощью центрифугирования и концентрировали центрифугат в 12 раз при использовании мембраны 10 кДа с двумя последующими диафильтрациями против воды или 20-25 мМ Трис-буфера, который содержал 20-25 мМ NaCl, рН 7,2-7. Затем фильтрат, который содержал OAg, очищали с помощью угольного фильтра. Фильтрат после угольного фильтра дополнительно очищали с помощью ионообменной (IEX) мембранной хроматографии. Затем фильтрат IEX разбавляли 1:1 (об/об) 4,0 М сульфатом аммония. Конечная концентрация сульфата аммония составляла 2М. Фильтрат IEX, обработанный сульфатом аммония, дополнительно очищали при использовании мембраны HIC с 2М сульфатом аммония в качестве подвижного буфера. OAg собирали в фильтрате. Фильтрат HIC концентрировали, а затем заменяли буфер на воду (20 диаобъемов) при использовании мембраны 5 кДа.

Краткое описание ПРИМЕРОВ 5-17: Примеры, проиллюстрированные в настоящем документе, демонстрируют основанный на платформе способ очистки всех серотипов полисахаридов О-антигенов (также относится к О-антигену или О-Ag), которые могут содержать внутренние/внешние олигосахариды.

Способ очистки, описанный в настоящем документе, можно применять как к полисахаридам O-Ag с короткой и с длинной цепью. Большая часть приведенных в настоящем документе Примеров относится к O-Ag с длинной цепью, за исключением Примеров 10 и 11, которые представляют собой O-Ag с короткой цепью для E. coli серотипа O8 и O9 соответственно.

ПРИМЕР 5: СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ПОЛИСАХАРИДОВ О-АНТИГЕНА E. COLI

1. Высвобождение О-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза по окончании ферментации с высвобождением O-Ag из липополисахаридов (LPS). Это было выполнено при обработке неочищенной суспензии культуры клеток серотипа O25b уксусной кислотой до конечной концентрации 1,0% (об/об), которая доводила рН до приблизительно 4,0. Затем кислотную среду нагревали до температуры 100°C и инкубировали в течение 2,0 часа. После высвобождения продукта партию охлаждали до окружающей температуры 20-30°С.

Для дальнейшего уточнения условий высвобождения O-Ag O25b разработали план эксперимента (DOE) для изучения влияния pH, температуры и времени выдерживания на %KDO, концентрацию, молекулярную массу (MW) и O-ацетат. Факторы, проверенные в исследовании DOE, показаны в Таблице 1-1. Следует отметить, что начальная концентрация, верхняя граница KDO и верхняя граница O-ацетата для этого исследования были установлены на уровне 3,5 мг/мл, 2% и 1,0 мМ соответственно.

Таблица 1-1: Факторы DOE, проверенные в исследовании кислотного гидролиза O25b Фактор Диапазон pH 3,0-5,0 Температура (°C) 80-100 Время выдерживания (часы) 1,0-4,0

Оценивали прогнозируемые ответы концентрации, %KDO и O-ацетата в точках времени 1,0, 2,0, 2,5 и 4,0 часа соответственно. Молекулярная масса во всех условиях была постоянной, около 50-54 кДа, за исключением условий температуры 80°C, когда MW была большой. Вероятно, это было связано с неполным высвобождением продукта, когда O-Ag мог связываться с клеточными компонентами или другими неспецифическими поверхностными полисахаридами. Таким образом, модель DOE не могла дать прогнозируемый ответ для MW в этих условиях. В точке времени 4,0 часа в диапазоне не было %KDO.

На основании такого результата DOE, условия кислотного гидролиза устанавливали при pH 3,8±0,1, температуре 95±5°C и времени выдерживания 2,0 часа. Эти условия высвобождения использовали для всех других серотипов полисахаридов O-Ag в последующих примерах.

2. Флокуляция

Основной целью данного этапа является осаждение клеточного дебриса, белков клетки-хозяина и нуклеиновых кислот из среды ферментации, содержащей высвобожденный продукт. Это также повышает эффективность последующей операции осветления. Подкисленную среду после высвобождения продукта в Стадии 1 обрабатывали 10% раствором квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), а затем доводили рН до 3,2 серной кислотой. Флокулированную суспензию инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Затем супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могли остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на первичную очистку UFDF-1.

В качестве альтернативы подкисленную среду нейтрализовали до рН 6,0-7,0. Нейтрализованный фильтрат центрифугировали при 12000 g в течение 30 минут. Нейтрализованный супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм. Нейтрализованный фильтрат можно хранить при температуре 4°C не меньше одной недели без какого-либо отрицательного влияния на качество продукта. Когда партия будет готова к очистке, нейтрализованный фильтрат подвергают процессу флокуляции, описанному в предыдущем абзаце. В последующих стадиях очистки, показанных в данном примере, используется этот способ флокуляции, если не указано иное.

Было проведено сравнение хроматографических профилей эВЭЖХ для нейтрализованного фильтрата, содержащего продукт, и глубинного фильтрата после флокуляции. Согласно результатам по показателю преломления (RI) и результатам по УФ детектированию при 280 нм, на стадии флокуляции было удалено значительное количество остававшихся примесей из ферментационной среды.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Глубинный фильтрат, полученный в описанной выше Стадии 2, дополнительно очищают посредством ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) с использованием 10 кДа мембраны Sartocon Hydrosart. Количество обрабатываемого глубинного фильтрата обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представлял собой 20 мМ цитрата/0,1 М NaCl, рН 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мМ Трис/20 мМ NaCl, рН 7,2. Число диаобъемов составляло 10 для обеих стадий диафильтрации. Концентрат после UFDF собирали и исследовали. Профили проводимости и УФ во время операции UFDF показали, что большая часть примесей с малой MW, а также связанных с УФ-сигналом примесей была удалена во время первой диафильтрации, о чем свидетельствовало значительное падение УФ-сигналов от фильтрата. Првели сравнение хроматограмм эВЭЖХ глубинного фильтрата и концентрата UFDF-1 как для RI, так и для УФ-детектирования.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клеток-хозяев, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенных примесей (см. WO 2008118752). Угольный фильтр 3М R32SP используется при загрузке примерно 150 г O-Ag из концентрата UFDF-1 на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади фильтра. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем фильтр промывали буфером, и фильтрат, включая промывку, которая содержала продукт, собирали в виде фильтрата после угля.

Хроматограммы эВЭЖХ для концентрата UFDF и фильтрата после угля показывают, что примеси, связанные с RI и UV280, были удалены, а угольный фильтрат стал визуально бесцветным.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была первоначально разработана для О-антигенов серотипов O2 и O6 для удаления неспецифических отрицательно заряженных примесей (см. Примеры 6 и 15). Таким образом, при изучении свойств электростатического взаимодействия этих молекул с помощью мембранной ионообменной хроматографии (IEX) можно удалять примеси неспецифических для серотипа вне- или внутриклеточных полисахаридов.

Используемая в данной операции IEX мембрана представляет собой мембранную кассету NatriFlo производства Millipure. В альтернативе можно использовать мембрану Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Во всех представленных здесь примерах для мембранной IEX хроматографии использовали мембрану NatriFlo (указанную далее как HD-Q), если не указано иное.

Сначала мембрану уравновешивали 20 мМ Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Угольный фильтрат с предыдущей стадии пропускали через мембрану со скоростью 30-40 мл/мин с приблизительно 200-250 мг O-Ag в угольном фильтрате на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером, а затем промывали высокосолевым буфером 20 мМ Трис/1,0 М NaCl, рН 7,2. Профили проводимости и UV280 мембранного IEX хроматографического анализа. В этом профиле УФ-сигнал показал пик, элюируемый во время промывки с высокой концентрацией соли, что указывает на содержание неизвестной отрицательно заряженной примеси, которая присутствовала в угольном фильтрате.

Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, IEX фильтрата и выходящей промывки с высокой концентрацией соли показывают, что хроматограмма промывки с высокой концентрацией соли показала небольшой пик при том же времени удерживания, что и пик продукта. Это говорит о том, что это неизвестное вещество имеет более высокую ионную силу, чем O-Ag O25b.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция обеспечивала удаление любых примесей, которые обладали гидрофобными характеристиками, такие как остаточный липид A, оставшийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Угольный фильтрат со стадии 4 обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония (AS). Угольный фильтрат, обработанный AS, пропускали через HIC мембрану со скоростью потока 40 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в виде HIC фильтрата, и промывочную воду также собирали для анализа. В альтернативе эта стадия HIC фильтрации также может быть выполнена с фильтратом IEX после Стадии 4.

Проанализировали хроматографический анализ AKTA Avant для HIC очистки. Продукт присутствовал в выходящем элюате, и пик, показанный в водной промывке, представлял собой неустановленную гидрофобную родственную примесь, которая связывалась на HIC мембране. Хроматограммы эВЭЖХ для угольного фильтрата и фильтрата HIC показывают, что небольшой передний полупик примеси, который присутствует в угольном фильтрате, был удален на стадии HIC фильтрации.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

В этой отдельной операции продукт концентрируется до нужной концентрации, а сульфат аммония заменяется требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечением по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации при использовании воды в количестве ~20 диаобъемов (DV). Скорость поперечного потока и ™P для операции UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 л/ч и 0,5-1,0 бар соответственно. Анализировали проводимость и сигналы UV280 фильтрата в зависимости от DV во время диафильтрации. После 10 DV проводимость достигала устойчивого состояния, что указывает на завершение замены буфера.

Проводили сравнение хроматограмм эВЭЖХ для HIC фильтрата и полностью очищенного O25b O-Ag после UFDF-2. В Таблице 1-2 ниже приведены качественные характеристики конечного очищенного O-Ag O25b.

Таблица 1-2 Качественные характеристики очищенного O25b O-Ag Чистота по данным эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 44,0 Остаточный белок (%) 0,21 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,05 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,1 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 6. ОЧИСТКА О-АНТИГЕНА E.COLI СЕРОТИПА O6

1. Высвобождение О-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после завершения процесса ферментации с высвобождением O-Ag из липополисахаридов (ЛПС). На основании исследований DOE, проведенных для O25b (см. Пример 5), для кислотного гидролиза использовали следующие условия: pH 3,8±0,1, температура 95±5°C и время выдерживания 2,0 часа. Использовали уксусную кислоту и проводили эту стадию в ферментере.

2. Флокуляция

Основной целью данной стадии является осаждение клеточного дебриса, белков клеток-хозяев и нуклеиновых кислот из среды, содержащей продукт. Это также повышает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию проводили для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), а затем доводили рН до 3,2 серной кислотой. Флокулированную суспензию инкубируют при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтруют через 0,2 мкм фильтр или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

Было проведено сравнение хроматографических профилей эВЭЖХ для подкисленного бульона, содержащего продукт, и глубинного фильтрата после флокуляции. Показатель преломления (RI) и УФ-детектирование при 280 указывают, что на стадии флокуляции было удалено значительное количество оставшихся примесей из ферментационной среды.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Глубинный фильтрат после Стадии 2 выше дополнительно очищают с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании 10 кДа мембранной кассеты Sartocon Hydrosart. Количество обрабатываемого материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1 М NaCl, рН 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мМ Трис/20 мМ NaCl, рН 7,2. Количество диаобъемов составляет 20 и 10 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Сравнение хроматограмм эВЭЖХ глубинного фильтрата и концентрата UFDF-1 показывает, что большая часть примесей с малой MW, а также связанных с УФ-сигналом примесей была удалена во время диафильтрации. Однако на хроматограмме RI наблюдали большой передний полупик примеси, связанный с пиком продукта.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клеток-хозяев, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенных примесей (см. WO 2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP используется при загрузке примерно 150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем фильтр промывали буфером и собирали фильтрат/промывочный раствор, содержащий продукт. Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата показывают, что примеси, связанные с RI и UV280, были удалены, а угольный фильтрат буквально стал бесцветным. Однако передний полупик примеси все еще присутствует в угольном фильтрате.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрану HD-Q сначала уравновешивали 20 мМ Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 100-250 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером, а затем промывали высокосолевым буфером, 20 мМ Трис/1,0 М NaCl, рН 7,2.

Хроматограммы эВЭЖХ для угольного фильтрата и IEX фильтрата показывают, что большой передний полупик, связанный с пиком продукта, был удален из угольного фильтрата.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX из предыдущей стадии обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, а также промывочную воду собирали для анализа.

Хроматограммы эВЭЖХ фильтрата HIC показывают, что небольшой передний полупик примеси, который присутствует в угольном фильтрате, был удален на стадии фильтрации HIC.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония с предыдущей стадии очистки HIC требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа Sartocon Hydrosart производства Sartorius.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бар соответственно.

Проводили сравнение хроматограмм эВЭЖХ фильтрата HIC и полностью очищенного O-Ag O6 после UFDF-2. В Таблице 2-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O6.

Таблица 2-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O6 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 45,5 Остаточный белок (%) 0,2 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,03 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,07 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 7. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O75

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинали с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе результатов DOE для O-Ag серотипа O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования, которая содержит продукт. Это также повышает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию в данном примере выполняли для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2. Количество диаобъемов составляет 10 и 15 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Проводили сравнение хроматограмм эВЭЖХ нейтрализованного фильтрата, глубинного фильтрата после флокуляции и концентрата после UFDF-1. Эффективность флокуляции и UFDF-1 для удаления белков клетки-хозяина и примесей с малой MW была продемонстрирована с помощью RI и UV280 хроматограмм.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что значительное количество связанных с УФ-сигналом примесей с малой MW было удалено.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрану IEX сначала уравновешивали 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 200-250 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером, а затем промывали высокосолевым буфером 20 мм Трис/1,0M NaCl, pH 7,2.

Профили проводимости и УФ хроматографического анализа на IEX мембране анализировали. В этом профиле УФ-сигнал показал пик в высокосолевой промывке, что указывает на присутствие в угольном фильтрате неизвестной отрицательно заряженной примеси.

Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, фильтрата IEX и высокосолевой промывки указывают, что образец высокосолевой элюции показал двойной пик под пиком продукта

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа.

Хроматограммы эВЭЖХ фильтрата IEX, фильтрата HIC, промывочной воды HIC и очищенного O-Ag O75 указывают, что образец промывочной воды также показал пик, элюирующийся с таким же временем удерживания, как и продукт в эВЭЖХ, что указывает на вероятное присутствие небольшого количества неизвестного вещества, обладающего более высокой гидрофобностью, в фильтрате IEX.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бар соответственно. Концентрат после UFDF-1 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Анализировали профиль эВЭЖХ для полностью очищенного O-Ag O75. В Таблице 3-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O75.

Таблица 3-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O75 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 53,4 Остаточный белок (%) 0,30 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,04 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,12 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 8. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O1

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе результатов DOE, полученных для O-Ag серотипа O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для всех серотипов O-антигенов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования, которая содержит продукт. Это также повышает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию в данном примере выполняли для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

Проводили сравнение хроматограмм эВЭЖХ нейтрализованного фильтрата и глубинного фильтрата после флокуляции. Эти данные указывают, что значительное количество примесей было удалено на стадии флокуляции.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2. Количество диаобъемов составляет 10 и 15 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Хроматограммы эВЭЖХ глубинного фильтрата и концентрата после UFDF-1 были проанализированы. Эффективность флокуляции и UFDF-1 для удаления белков клетки-хозяина и примесей с малой MW была продемонстрирована с помощью RI и UV280 хроматограмм.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. После фильтрации угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывку, которые содержали продукт, объединяли как угольный фильтрат.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что хроматографический профиль RI не сильно изменился, но при этом значительное количество связанных с УФ-сигналом и окрашенных примесей были удалены.

5. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза, и гарантирует, что уровень эндотоксина будет оставаться на минимальном уровне. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. С угольный фильтрат обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS угольный фильтрат фильтровали через мембрану HIC при скорости потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата и HIC фильтрата показывают, что никакого поддающегося обнаружению улучшения согласно профилям эВЭЖХ не было, однако уровень эндотоксина был значительно снижен (см. Таблицу 4-1 ниже).

6. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании мембраны Sartocon Hydrosart на 5 кДа производства Sartorius.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бар соответственно. Концентрат после UFDF-1 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Анализировали профиль эВЭЖХ для полностью очищенного O-Ag O1. В Таблице 4-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O1.

Таблица 4-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O1 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 38,0 Остаточный белок (%) 0,33 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,06 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,05 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 9. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА 15

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для серотипа O-Ag O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования, которая содержит продукт. Это также улучшает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию в данном примере выполняли для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1. Было проведено сравнение хроматограмм эВЭЖХ для нейтрализованного фильтрата и глубинного фильтрата после флокуляции.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2. Количество диаобъемов составляет 10 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Реальный эксперимент UFDF показал, что большая часть примесей с малой MW, а также связанных с УФ-сигналом примесей была удалена во время диафильтрации, что также подтверждалось на хроматограммах эВЭЖХ концентрата после UFDF-1. Эффективность флокуляции и UFDF-1 для удаления белков клетки-хозяина и примесей с малой MW была продемонстрирована с помощью RI и UV280 хроматограмм.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что значительное количество примесей с малой MW было удалено.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 200-250 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером, а затем промывали высокосолевым буфером, 25 мм Трис/1,0М NaCl, pH 7,5.

Профили проводимости и УФ хроматографического анализа на IEX мембране анализировали. В этом профиле УФ-сигнал показал пик в высокосолевой промывке, что указывает на присутствие в угольном фильтрате неизвестной отрицательно заряженной примеси. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, фильтрата IEX и высокосолевой промывки, элюата указывают, что образец высокосолевой элюции показал малый двойной пик с таким же временем удерживания, как у продукта.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматографические профили УФ и проводимости фильтрации на HIC мембране были проанализированы. Присутствовал малый видимый пик, наблюдаемый на стадии промывки водой, что указывает на незначительное количество неустановленного вещества, связавшегося на HIC мембране.

Хроматограммы эВЭЖХ фильтрата IEX, фильтрата HIC, промывочной воды HIC и очищенного O-Ag O15 указывают, что образец промывочной воды показал двойной пик, который элюировался незадолго до продукта в эВЭЖХ, что указывает на присутствие некоторого неизвестного вещества в потоке HD-Q.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бар, соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Сигналы проводимости и UV280 фильтрата в зависимости от DV во время диафильтрация указывают, что после 10 DV проводимость достигала устойчивого состояния, указывая на завершение замены буфера. Анализировали профили эВЭЖХ для полностью очищенного O-Ag O15. В Таблице 5-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O15.

Таблица 5-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O15 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 56,0 Остаточный белок (%) 0,0023 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,001 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,04 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 10. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O8

1. Высвобождение O-антигена

Серотип O8 представляет собой короткоцепочечный O-антиген, и его молекулярная масса, как предполагают, будет составлять в пределах 10-15 кДа. Однако описанный в общем виде процесс очистки также относится ко всем короткоцепочечныму O-Ag E. coli. Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для O-Ag серотипа O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования, которая содержит продукт. Это также улучшает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию в данном примере выполняли для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2. Число диаобъемов составляет 10 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Были проанализированы хроматограммы эВЭЖХ концентрата после UFDF-1.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Были проанализированы хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата. То, что пик продукта уменьшился после фильтрации через уголь, указывает на механизм неспецифической адсорбции, на который был рассчитан угольный фильтр. Тем не менее, окрашенные примеси были по большей части удалены.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo (HD-Q). В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 200-250 г O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером, а затем промывали высокосолевым буфером, 20 мм Трис/1,0М NaCl, pH 7,2.

Профили проводимости и УФ хроматографического анализа на IEX мембране анализировали. В этом профиле УФ-сигнал показал пик в высокосолевой промывке, что указывает на присутствие в угольном фильтрате неизвестной отрицательно заряженной примеси.

Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, фильтрата IEX и высокосолевой промывки, элюата указывают, что образец высокосолевой элюции показал малый двойной пик с таким же временем удерживания, как у продукта.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматографические профили УФ и проводимости фильтрации на HIC мембране были проанализированы. Присутствовал видимый пик, наблюдаемый на стадии промывки водой, что указывает на незначительное количество неустановленного гидрофобного вещества, связавшегося на HIC мембране.

Хроматограммы эВЭЖХ фильтрата IEX, фильтрата HIC, промывки водой HIC и очищенного O-Ag O8 указывают, что образец промывочной воды показал двойной пик, который элюировался незадолго до продукта в эВЭЖХ, что указывает на присутствие только очень малого количества неизвестного вещества в потоке HD-Q.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 200 лмч и 0,5 бара соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Анализировали профили эВЭЖХ для полностью очищенного O-Ag O8. В Таблице 6-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O8.

Таблица 6-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O8 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 11,5 Остаточный белок (%) 0,08 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,02 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,96 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 11. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O9

1. Высвобождение O-антигена

Серотип O9 также является короткоцепочечным O-антигеном, и его молекулярная масса, как предполагают, будет составлять в пределах 10-15 кДа. Использовали описанный в общем виде процесс очистки. Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для серотипа O-Ag O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования, которая содержит продукт. Это также повышает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию проводили для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1. Проводили сравнение хроматографических профилей эВЭЖХ для нейтрализованного фильтрата и глубинного фильтрата.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2. Количество диаобъемов составляет 10 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Были проанализированы хроматограммы эВЭЖХ концентрата после UFDF-1.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата были проанализированы. То, что пик продукта уменьшился после угольной фильтрации, указывает на механизм неспецифической адсорбции, на который был рассчитан угольный фильтр. Тем не менее, окрашенные примеси были по большей части удалены.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 200-250 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером, а затем промывали высокосолевым буфером, 20 мм Трис/1,0М NaCl, pH 7,2.

Профили проводимости и УФ хроматографического анализа на IEX мембране анализировали. В этом профиле УФ-сигнал показал пик в высокосолевой промывке, что указывает на присутствие в угольном фильтрате неизвестной отрицательно заряженной примеси. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, фильтрата IEX и высокосолевой промывки, элюата указывают, что образец высокосолевой элюции показал малый пик с таким же временем удерживания, как у продукта.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматографические профили УФ и проводимости фильтрации на мембране HIC анализировали.

Хроматограммы эВЭЖХ фильтрата IEX, фильтрата HIC, промывки водой HIC и очищенного O-Ag O8 указывают, что образец промывочной воды не показал видимого пика при детектировании RI, что указывает на отсутствие гидрофобного вещества в потоке IEX.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 200 лмч и 0,5 бара соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Анализировали профили эВЭЖХ для полностью очищенного O-Ag O9. В Таблице 7-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O9.

Таблицы 7-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O9 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 11,0 Остаточный белок (%) 0,08 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,15 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,1 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 12. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O21

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для серотипа O-Ag O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования, которая содержит продукт. Это также повышает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию в данном примере выполняли для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 25 мМ Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5. Количество диаобъемов составляет 18 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Реальный анализ UFDF указывает, что большинство примесей с малой MW, а также связанных с УФ-сигналом примесей, был удалено во время диафильтрации. Хроматограммы эВЭЖХ концентрата после UFDF-1 были проанализированы. Эффективность флокуляции и UFDF-1 для удаления белков клетки-хозяина и примесей с малой MW была продемонстрирована с помощью RI и UV280 хроматограмм.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R55SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что значительное количество связанных с УФ-сигналом примесей, имевших малую MW, было удалено.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 150-200 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером и в двух стадиях промывки, первой с использованием буфера 25 мМ Трис/25 мМ NaCl, pH7,5, и второй с использованием высокосолевого буфера, 25 мм Трис/1,0М NaCl, pH 7,5.

Профили проводимости и УФ хроматографического анализа на IEX мембране показали, что на мембране были связаны некоторые неизвестные отрицательно заряженные примеси, которые впоследствии были удалены во время ступенчатого элюирования.

Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, IEX фильтрата и элюата 1-й и 2-й ступенчатой промывки соответственно показали, что два элюата из образцов ступенчатой промывки показали другие профили (на RI и УФ-хроматограммах) по сравнению с продуктом.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматограмма эВЭЖХ фильтрата HIC была проанализирована.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бара соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Сигналы проводимости и UV280 фильтрата в зависимости от DV во время диафильтрации показали, что после 10 DV проводимость достигала устойчивого состояния, что указывает на завершение замены буфера. Были проанализированы профили эВЭЖХ полностью очищенного O-Ag O21. В Таблице 8-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O21.

Таблица 8-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O21 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 37,8 Остаточный белок (%) 0,36 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,16 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,13 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 13. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O4

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для O-Ag серотипа O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования, которая содержит продукт. Это также повышает эффективность последующего процесса осветления. Флокуляцию в данном примере выполняли для нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1. Хроматограммы эВЭЖХ нейтрализованного фильтрата и глубинного фильтрата были проанализированы.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 25 мМ Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5. Количество диаобъемов составляет 18 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Хроматограммы эВЭЖХ концентрата после UFDF-1 были проанализированы.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R55SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ для UFDF концентрат и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что значительное количество связанных с УФ-сигналом примесей, имеющих малую MW, были удалены.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 150-200 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером и в двух стадиях промывки, первая - буфером 20 мМ Трис/25 мМ NaCl, pH7,5, и вторая - высокосолевым буфером 25 мМ Трис/1,0М NaCl, pH 7,5. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата и фильтрата IEX были проанализированы.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат собирали вместе с промывкой как фильтрат HIC, и промывочную воду также собирали для анализа.

Профили проводимости и УФ для мембранной HIC хроматографии указывают, что гидрофобные примеси были связаны на мембране HIC и впоследствии смыты водой. Хроматограмма эВЭЖХ для фильтрата HIC и промывок HIC была проанализирована.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бар, соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Профили эВЭЖХ для полностью очищенного O-Ag O4 были проанализированы. В Таблице 9-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O4.

Таблица 9-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O4 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 52,6 Остаточный белок (%) 0,17 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,04 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,19 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 14. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O2

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для серотипа O25b O-Ag (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Флокуляцию проводили из нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5. Количество диаобъемов составляет 18 для каждой стадии диафильтрации соответственно. В 10-1 показаны профили УФ и проводимости для UFDF-1, и, как можно видеть, большая часть связанных с УФ-синалом примесей с малой молекулярной массой была удалена в ходе первой диафильтрации. Хроматограммы эВЭЖХ концентрата после UFDF-1 были проанализированы.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M используется при загрузке приблизительно 75-125 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что фильтрация через уголь была очень эффективной при удалении остаточных окрашенных примесей и примесей с малой MW.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 50-100 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером и в двух стадиях промывки, первая - буфером 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH7,5, и вторая - высокосолевым буфером 25 мм Трис/1,0М NaCl, pH 7,5. Профили УФ и проводимости для мембранной хроматографии IEX были проанализированы. Как было показано, присутствовал пик, элюирующийся в цикле высокосолевой промывки, что указывает на присутствие небольшого количества примесей, которые были связаны на мембране. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата и фильтрата IEX были проанализированы.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 1,2М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат собирали вместе с промывкой как фильтрат HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматограмма эВЭЖХ фильтрата HIC была проанализирована.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бара соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Профили эВЭЖХ полностью очищенного O-Ag O2 были проанализированы. В Таблице 10-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O2 O-Ag.

Таблица 10-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O2 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 46,1 Остаточный белок (%) 0,23 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,05 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 3,2 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 15. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O11

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для O-Ag серотипа O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Флокуляцию проводили из нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5. Количество диаобъемов составляет 18 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Профили УФ и проводимости для UFDF-1 указывают, что большая часть связанных с УФ-сигналом примесей, имеющих малую молекулярную масса, была удалена в ходе первой диафильтрации. Хроматограммы эВЭЖХ концентрата после UFDF-1 были проанализированы.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R55SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали. Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что фильтрация через уголь была очень эффективной при удалении остаточных окрашенных примесей и примесей с малой MW.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 100-125 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером и в двух стадиях промывки, первая - буфером 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5, и вторая - высокосолевым буфером 25 мм Трис/1,0М NaCl, pH 7,5. Профили УФ и проводимости для мембранной хроматографии IEX были проанализированы. Как было показано, присутствовал пик, элюирующийся в стадии высокосолевой промывки, что указывает на присутствие неизвестной примеси, связанной на мембране. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, фильтрата IEX и 2 образцов высокосолевой промывки были проанализированы.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат собирали вместе с промывкой как фильтрат HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматограмма эВЭЖХ фильтрата HIC была проанализирована.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз с последующей диафильтрацией в воде с количеством диаобъемов ~20 (DV). Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Профили эВЭЖХ полностью очищенного O-Ag O11 были проанализированы. В Таблице 11-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O11.

Таблица 11-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O11 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 40,2 Остаточный белок (%) 0,35 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,14 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,36 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 16. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI СЕРОТИПА O18

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для O-Ag серотипа O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Флокуляция

Флокуляцию проводили из нейтрализованного фильтрата после кислотного гидролиза, описанного в Примере 5 в разделе "Флокуляция". К нейтрализованному фильтрату добавляли 10% раствор квасцов до конечной концентрации 2% (в/об), после чего pH доводили до 3,2 серной кислотой. Суспензию после флокуляции инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1. В 12-1 показаны хроматограммы эВЭЖХ нейтрализованного фильтрата и глубинного фильтрата после флокуляции.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 20-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 25 мм Трис/25 мМ NaCl, pH 7,5. Количество диаобъемов составляет 18 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Сравнение хроматограмм эВЭЖХ глубинного фильтрата и концентрата после UFDF-1 было проанализировано.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R55SP используется при загрузке приблизительно 200-250 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата, а также угольной массы, которая включала промывку, показали, что фильтрация через уголь была очень эффективной при удалении остаточных окрашенных примесей и примесей с малой MW.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim. Мембрану сначала уравновешивали 20 мм Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 100-150 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером и в двух стадиях промывки, первая - буфером 25 мМ Трис/25 мМ NaCl, pH 7,4, и вторая высокосолевым буфером 25 мМ Трис/1,0М NaCl, pH 7,4. Хроматограммы эВЭЖХ фильтрата IEX (верхняя хроматограмма) были проанализированы.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат собирали вместе с промывкой как фильтрат HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Профили проводимости и UV280 HIC хроматографии были проанализированы. Небольшое количество гидрофобных веществ было связано на мембране HIC и затем было смыто водой. Хроматограмма эВЭЖХ фильтрата HIC и промывки HIC была проанализирована.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300 лмч и 0,5-1,0 бара соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Профили эВЭЖХ полностью очищенного O-Ag O18 были проанализированы. В Таблице 12-1 ниже приведены качественные показатели полностью очищенного O-Ag O18.

Таблица 12-1 Качественные показатели очищенного O-Ag O18 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 52,9 Остаточный белок (%) 0,38 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,04 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,024 Структурная идентификация ЯМР Соответствует

ПРИМЕР 17. ОЧИСТКА O-АНТИГЕНА E. COLI БЕЗ ФЛОКУЛЯЦИИ

Чтобы дополнительно продемонстрировать надежность способа очистки полисахаридов О-антигена E. coli, описанного в предыдущих 12 примерах, в данном примере было показано, что такой же способ очистки был так же эффективен для потока исходного сырья без применения раствора квасцов в качестве флокулянта. Серотипы O2 и O6 и O25b O-Ag использовались для демонстрации этого способа осветления.

1. Высвобождение O-антигена

Процесс начинается с кислотного гидролиза после процесса ферментации с целью высвобождения O-Ag из липолисахаридов (ЛПС). На основе этих результатов DOE, полученных для O-Ag серотипа O25b (см. Пример 5), условия, используемые для кислотного гидролиза для O-антигенов всех серотипов, представляют собой pH 3,8±0,1, температуру 95±5°C и время инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере.

2. Обработка кислотой для серотипа O25b

После кислотного гидролиза партию охлаждали до окружающей температуры. Затем pH доводили до 3,2 серной кислотой и инкубировали партию при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант показал небольшую мутность в отличие от флокулированной партии, и затем мутную надосадочную жидкость фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Полученный глубинный фильтрат выглядел прозрачным, и был подвергнут последующим стадиям очистки, которые включают UFDF-1, угольную фильтрацию, мембранную хроматографию IEX, HIC-фильтрацию и UFDF-2, описанные в Примерах 5-16.

В Таблице 13-1 показано сравнение качественных показателей O-Ag O25b, очищенного со стадией флокуляции квасцами и без нее.

Таблица 13-1 Качественные показатели O-Ag O25b, очищенного со стадией флокуляции квасцами и без нее. Очистка с квасцами Очистка без квасцов Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% >99,9% Молекулярная масса (кДа) 52,9 49,8 Остаточный белок (%) 0,38 0,23 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,04 0,08 Эндотоксин (ЕЭ/мг) <0,024 0,68 Структурная идентификация ЯМР Соответствует Соответствует

3. Обработка кислотой для серотипа O2 и O6

Обработку кислотой для O-Ag серотипа O2 и O6 проводили для нейтрализованного фильтрата, который был получен способом, описанным в Разделе один в Примере 5. pH нейтрализованного фильтрата доводили до 3,2, после чего партию инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часов с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант в обоих серотипах снова показал небольшое помутнение по сравнению с соответствующим флокулированным раствором. Однако после того как супернатант был отфильтрован через 0,2 мкм фильтр, полученный фильтрат стал визуально прозрачным. Затем глубинный фильтрат был подвергнут последующим стадиям очистки, включающим UFDF-1, фильтрацию через уголь, мембранную IEX хроматографию, HIC фильтрацию и UFDF-2, описанные в Примерах 5-16.

В Таблицах 13-2 и 13-3 показано сравнение качественных показателей O-Ag O2 и O6, соответственно, очищенных со стадией флокуляции квасцами и без нее.

Таблица 13-2 Качественные показатели очищенного O-Ag O2 Очистка с квасцами Очистка без квасцов Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% >99,9% Молекулярная масса (кДа) 46,1 46,2 Остаточный белок (%) 0,23 0,15 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,05 0,023 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 3,2 2,19 Структурная идентификация ЯМР Соответствует Соответствует

Таблица 13-3 Качественные показатели очищенного O-Ag O6 Очистка с квасцами Очистка без квасцов Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% >99,9% Молекулярная масса (кДа) 45,5 46,0 Остаточный белок (%) 0,2 <0,18 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,03 0,036 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,07 0,17 Структурная идентификация ЯМР Соответствует Соответствует

ПРИМЕР 18: Способы очистки полисахарида N. meningitidis серогруппы A (Nm-A poly)

1. Флокуляция и осветление

Процесс начинается с культуры клеток Neisseria meningitidis, которую подвергают термической обработке при 55°C в течение одного часа для высвобождения полисахаридов с поверхности клетки. Затем клеточную среду, содержащую высвобожденный продукт, подвергают флокуляции. Основным назначением этой стадии является осаждение клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования. Это также повышает эффективность последующей операции осветления.

Флокуляция достигается путем добавления 5М раствора CaCl₂ в ферментационную среду до конечной концентрации CaCl₂ 0,2М. Раствор, обработанный CaCl₂, инкубировали при 50-70°C в течение одного часа при осторожном перемешивании. После инкубирования партию охлаждали до окружающей температуры, а затем центрифугировали при 15000 g в течение 30 минут при 20°C. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Осветленный фильтрат поступал на первичную очистку UFDF-1.

2. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Осветленный фильтрат из Стадии 1 выше дополнительно очищают с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембраны Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обрабатываемого осветленного фильтрата обычно составляет ~55 г полисахаридов на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем концентрирования раствора в 10-15 раз и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буферы, используемые в этой стадии, представляли собой 25 мМ цитрата/50М NaCl, рН 6,0, для первой диафильтрации, с последующей второй диафильтрацией с использованием 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Количество диаобъемов (DV) для двух стадий диафильтрации составляло 10 и 20 соответственно. Концентрат после UFDF собирали и анализировали. Профили проводимости и УФ во время анализа UFDF указывают, что большая часть примесей с малой молекулярной массой, а также связанных с УФ-сигналом примесей с малой молекулярной массой были удалены во время диафильтрации, о чем свидетельствует значительное падение УФ-сигналов хроматограмм пермеата и эВЭЖХ осветленного фильтрата и концентрата UFDF-1.

3. Угольная фильтрация

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенных примесей (см. WO 2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP использовали при загрузке приблизительно 300-600 г Nm-A-poly из концентрата UFDF-1 на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр промывали буфером для диафильтрации 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, в количестве приблизительно 20 литров на м² площади фильтра. Затем концентрат из UFDF-1 фильтровали через угольный фильтр со скоростью потока 50-75 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем фильтр промывали буфером, а фильтрат, включая промывку, которая содержала продукт, собирали в виде угольного фильтрата.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата показали, что примеси, связанные с RI и UV280, были удалены, а угольный фильтрат стал на вид бесцветным.

4. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляла любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточные липополисахариды (эндотоксины). Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl. Угольный фильтрат со стадии 3 обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 1,5 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали подвижным буфером с 1,5М сульфата аммония (AS). Обработанный AS угольный фильтрат пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 0,2-1,0 объема мембраны (MV) в минуту. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в виде фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа.

Хроматографический анализ AKTA Avant для HIC очистки был проанализирован. Продукт присутствовал в элюате, а пик, наблюдаемый в промывочной воде, представлял собой неустановленную гидрофобную родственную примесь, которая связывалась на HIC мембране. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата и фильтрата HIC показывают, что гидрофобная примесь была удалена на стадии HIC фильтрации.

5. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 10 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10-15 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов ~10-20 (DV). Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 100-500 лмч и 0,5-1,5 бара соответственно. Сигналы проводимости и UV280 фильтрата в зависимости от DV во время диафильтрации анализировали. После 10 DV проводимость достигала стационарного состояния, что свидетельствовало о завершении замены буфера.

Сравнение хроматограмм эВЭЖХ фильтрата HIC и полностью очищенного Nm_A полисахарида после UFDF-2, подвергнутого фильтрации 0,2 мкм. В Таблице 14 приведены качественные показатели полностью очищенного Nm_A полисахарида.

Таблица 14. Качественные показатели очищенного Nm_A полисахарида Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 33,8 Остаточный белок (%) 0,0 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,0 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,87 ЕЭ/мг

ПРИМЕР 19: Способы очистки полисахарида N. meningitidis серогруппы C (Nm-C poly)

1. Флокуляция и осветление

Процесс начинается с клеточной культуры Neisseria meningitidis, которую подвергали термической обработке при 55°C в течение одного часа с целью высвобождения полисахаридов с поверхности клетки. Затем клеточную среду, содержащую высвобожденный продукт, подвергали флокуляции. Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования. Это также повышает эффективность последующей операции осветления.

Это достигается путем добавления концентрированного раствора CaCl₂ в ферментационную среду и доведения конечной концентрации CaCl₂ до 0,3М. Обработанный CaCl₂ раствор инкубировали при 50°C в течение одного часа с осторожным перемешиванием. После инкубирования партию охлаждали до окружающей температуры, а затем центрифугировали при 12000-14000 g в течение 30 минут при 20°C. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Осветленный фильтрат поступал на первичную очистку UFDF-1.

2. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Затем осветленный фильтрат со Стадии 1 выше очищали с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембраны Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного осветленного фильтрата обычно составляет ~40 г полисахаридов на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-15-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 25 мМ цитрата/50M NaCl, pH 6,0, с последующей второй диафильтрацией в воде или других требуемых буферах. Количество диаобъемов составляет 10-20 для обеих стадий диафильтрации. Концентрат после UFDF собирали и анализировали. Профили проводимости и УФ во время анализа UFDF изучали для подтверждения, что большая часть примесей с малой MW, а также связанных с УФ-сигналом примесей была удалена во время первой диафильтрации, что свидетельствует о значительном снижении УФ-сигналов пермеата. Проводили сравнение хроматограмм эВЭЖХ осветленного фильтрата и концентрата UFDF-1, для RI и для УФ-детектирования.

3. Ионообменная (IEX) хроматография

Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой мембранную кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim.

Мембрана сначала уравновешивали 20 мм Трис, pH 8,0, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Угольный фильтрат из предыдущей стадии доводили до концентрации Трис 20 мМ и пропускали через мембрану при скорости потока 0,2-1,0 мВ/минуты приблизительно с 70 мг полисахарида на мл MV. Затем мембрану промывали 10-30 MV уравновешивающего буфера. Элюирование проводили в линейном градиенте от 50% высокосолевого буфера 20 мМ Трис/1,0М NaCl, pH 8,0, в количестве приблизительно 13 MV, а затем 15 MV до 100% высокосолевого буфера. Фракции элюции, соответствовавшие двум пикам элюции, объединены отдельно и проанализированы ЭВЭЖХ. Примесь с высокой молекулярной массой, показанная в UFDF-1, захватывалась на мембране IEX и удалялась во время первого элюирования. Вторая часть элюирования содержит главным образом продукт.

4. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточные липополисахариды (эндотоксины). Фенилзамещенную мембрану Sartobind использовали для стадии HIC. Элюатом IEX хроматографии обрабатывали 4,0М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 1,5М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали подвижным буфером с 1,5M сульфатом аммония (AS). Обработанный AS элюат IEX пропускали через мембрану HIC при скорости потока 0,2-1,0 объема мембраны (MV) в минуту, затем мембрану HIC промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа.

Хроматографический анализ AKTA Avant для очистки HIC был проанализирован. Продукт присутствовал в потоке элюата, а пик, наблюдаемый в промывочной воде, представлял собой неопределенную гидрофобную родственную примесь, которая связывалась на мембране HIC.

5. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Этот стадия выполняется при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 10 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10-15 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 100-500 лмч и 0,5-1,5 бара соответственно. Сигналы проводимости и UV280 пермеата в зависимости от DV во время диафильтрации были проанализированы. После 10 DV проводимость достигала устойчивого состояния, что указывало на завершение замены буфера. Полностью очищенный полисахарид Nm_C после UFDF-2 подвергали 0,2 мкм фильтрации. В Таблице 15 приведены качественные показатели полностью очищенного полисахарида Nm_C.

Таблица 15. качественные показатели очищенного полисахарида Nm_C Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 154,9 Остаточный белок (%) 0,0 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,0 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,18

ПРИМЕР 20: Способы очистки полисахарида N. meningitidis серогруппы W (Nm-W poly)

1. Флокуляция и осветление

Процесс начинается с культуры клеток Neisseria meningitidis, которую подвергали термической обработке до 55°C в течение одного часа с целью высвобождения полисахаридов с поверхности клетки. Затем клеточную среду, содержащую высвобожденный продукт, подвергали флокуляции. Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования. Это также повышает эффективность последующей операции осветления.

Это достигается путем добавления 5M раствора CaCl₂ в ферментационную среду с доведением конечной концентрации CaCl₂ до 0,2М. Обработанный CaCl₂ раствор инкубировали при 50°C в течение одного часа с осторожным перемешиванием. После инкубирования партию охлаждали до окружающей температуры, а затем центрифугировали при 14000 g в течение 30 минут при 20°C. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Осветленный фильтрат поступал на первичную очистку UFDF-1.

2. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Затем осветленный фильтрат со Стадии 1 выше очищали с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембраны Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного осветленного фильтрата составляет приблизительно 84 г полисахаридов на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-15-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представлял собой 25 мМ цитрата/50M NaCl, pH 6,0, с последующей второй диафильтрацией в воде или других требуемых буферах. Количество диаобъемов составляет 10 для первой диафильтрации и 20 для второй диафильтрации соответственно. Концентрат после UFDF собирали и анализировали. Профили проводимости и УФ во время анализа UFDF указывают, что большая часть примесей с малой MW, а также связанных с УФ-сигналом примесей была удалена во время первой диафильтрации, что свидетельствует о значительном снижении УФ-сигналов пермеата.

3. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP использовали при загрузке приблизительно 1000 г Nm-W poly из концентрата UFDF-1 на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, затем буфером для диафильтрации в количестве приблизительно 20 литров буфера на м² площади фильтра. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 60 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем фильтр промывали буфером, а фильтрат, включая промывку, которые содержали продукт, собирали в виде угольного фильтрата.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата показали, что RI, связанные с сигналом UV280 и имеющие малую молекулярную массу примеси были удалены с помощью угольного фильтра. Угольный фильтрат стал на вид бесцветным.

4. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточные липополисахариды (эндотоксины). Фенилзамещенную мембрану Sartobind использовали для стадии HIC. Угольный фильтрат со Стадии 3 обрабатывали 4,0М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 1,5-2,0М. Количество полисахаридов Nm_W, нанесенных на мембрану HIC, составляло приблизительно 30-116 мг на мл объема мембраны (MV). Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали подвижным буфером с сульфатом аммония (AS). Обработанный AS угольный фильтрат пропускали через мембрану HIC при скорости потока 0,2-1,0 объема мембраны (MV) в минуту. Затем мембрану HIC промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа.

Хроматографический анализ AKTA Avant для очистки HIC был проанализирован. Продукт присутствовал в потоке элюата, а пик, наблюдаемый в промывочной воде, представлял собой неопределенную гидрофобную родственную примесь, которая связывалась на мембране HIC. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата и фильтрата HIC указывают, что гидрофобная примесь была удалена в стадии фильтрации HIC.

5. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 10 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10-15 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~10-20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 100-500 лмч и 0,5-1,5 бара соответственно. Сигналы проводимости и UV280 пермеата в зависимости от DV во время диафильтрации были проанализированы. После 10 DV проводимость достигала устойчивого состояния, что указывало на завершение замены буфера.

Сравнение хроматограмм эВЭЖХ фильтрата HIC и полностью очищенного полисахарида Nm_W после UFDF-2 подвергся 0,2 мкм фильтрации. В Таблице 16 приведены качественные показатели полностью очищенного полисахарида Nm_W.

Таблица 16. Качественные показатели очищенного полисахарида Nm_W Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 216,8 Остаточный белок (%) 0,0 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,0 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,7 ЕЭ/мг

ПРИМЕР 21: Способы очистки полисахарида N. meningitidis серогруппы Y (Nm-Y poly)

1. Флокуляция и осветление

Процесс начинается с клеточной культуры Neisseria meningitidis, которую подвергали термической обработке до 55°C в течение одного часа с целью высвобождения полисахаридов с поверхности клетки. Затем клеточную среду, содержащую высвобожденный продукт, подвергали флокуляции. Главная цель этой стадии состоит в осаждении клеточного дебриса, белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина из среды культивирования. Это также повышает эффективность последующей операции осветления.

Это достигается путем добавления 5M раствора CaCl₂ в ферментационную среду с доведением конечной концентрации CaCl₂ до 0,2M. Обработанный CaCl₂ раствор инкубировали при 50-70°C в течение одного часа с осторожным перемешиванием. После инкубирования партию охлаждали до окружающей температуры, а затем центрифугировали при 15000 g в течение 40 минут при 20°C. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Осветленный фильтрат поступал на первичную очистку UFDF-1.

2. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Затем осветленный фильтрат со Стадии 1 выше очищали с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембраны Sartocon Hydrosart на 10 кДа. Количество обработанного осветленного фильтрата составляет приблизительно 20 г полисахаридов на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-15-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представлял собой 25 мМ цитрата/50M NaCl, pH 6,0, с последующей второй диафильтрацией в 20 мМ Трис-HCl/0,1M NaCl, pH 8,0. Количество диаобъемов составляло 12 для первой диафильтрации и 25 для второй диафильтрации соответственно. Концентрат после UFDF собирали и анализировали. Профили проводимости и УФ во время анализа UFDF указывают, что большая часть примесей с малой MW, а также связанных с УФ-сигналом примесей была удалена во время первой диафильтрации, что свидетельствует о значительном снижении УФ-сигналов пермеата.

3. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP использовали при загрузке приблизительно 885 г Nm-Y poly из концентрата UFDF-1 на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, затем буфером для диафильтрации в количестве приблизительно 20 литров буфера на м² площади фильтра. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 72 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем фильтр промывали буфером, а фильтрат, включая промывку, которые содержали продукт, собирали в виде угольного фильтрата.

Хроматограммы эВЭЖХ концентрата UFDF и угольного фильтрата показали, что RI, связанные с UV280 и имеющие малую молекулярную массу примеси были удалены с помощью угольного фильтра. Угольный фильтрат стал на вид бесцветным.

4. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточные липополисахариды (эндотоксины). Фенилзамещенную мембрану Sartobind использовали для стадии HIC. Угольный фильтрат со Стадии 3 обрабатывали 4,0М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 1,75М. Количество полисахаридов Nm_Y, нанесенных на мембрану HIC, составляло приблизительно 40 мг на мл объема мембраны (MV). Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали подвижным буфером с сульфатом аммония (AS). Обработанный AS угольный фильтрат пропускали через мембрану HIC при скорости потока 0,2-1,0 объема мембраны (MV) в мин. Затем мембрану HIC промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа.

Хроматографический анализ AKTA Avant для очистки HIC был проанализирован. Продукт присутствовал в потоке элюата, а пик, наблюдаемый в промывочной воде, представлял собой неопределенную гидрофобную родственную примесь, которая связывалась на мембране HIC. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата и фильтрата HIC показывают, что гидрофобная родственная примесь была удалена в стадии фильтрации HIC.

5. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 10 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10-15 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~25. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 300-400 лмч и 0,5-1,5 бара соответственно. Сигналы проводимости и UV280 пермеата в зависимости от DV во время диафильтрации были проанализированы. После 10 DV проводимость достигала устойчивого состояния, что указывало на завершение замены буфера.

Сравнение хроматограмм эВЭЖХ фильтрата HIC и полностью очищенного полисахарида Nm_Y, после того как UFDF-2 подвергали 0,2 мкм фильтрации. В Таблице 17 приведены качественные показатели полностью очищенного полисахарида Nm_Y.

Таблица 17. Качественные показатели очищенного полисахарида Nm_Y Чистота согласно эВЭЖХ >99,9% Молекулярная масса (кДа) 247,0 Остаточный белок (%) 0,0 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,0 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 0,35 ЕЭ/мг

ПРИМЕР 22: Описания очистки полисахаридов O-антигена Klebsiella

1. Высвобождение O-антигена

O-антигены Klebsiella O1 и O2 (Kleb O-Ag) представляют собой короткоцепочечный O-антиген, и его молекулярная масса, как предполагают, будет составлять в пределах 8,0-16,0 кДа. Процесс очистки, описанный в Примерах 5-17 для O-Ag E. coli, также применим к Kleb O-Ag. После ферментации O-антиген O1 и O2 Klebsiella высвобождается из липолисахарида (ЛПС) в результате кислотного гидролиза при pH 3,8±0,1, температуре 95°C±5°C и времени инкубирования 2,0 часа. Эту стадию проводили в ферментере. Такие условия вызывают расщепление кислото-лабильной связи между липидом-A и центральным олигосахаридом ЛПС (см. Пример 5).

2. Флокуляция

После высвобождения Kleb O-Ag, как описано в стадии 1 выше, среду охлаждают до окружающей температуры и обрабатывают 10% раствором квасцов до конечной концентрации 2,0% (в/об), а затем доводят pH до 3,2. Эта стадия флокуляции осаждает клеточный дебрис, белки и нуклеиновые кислоты клетки-хозяина. После флокуляции суспензию инкубировали при окружающей температуре в течение 1,0 часа с последующим центрифугированием при 12000-14000 g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм или другой подходящий глубинный фильтр для удаления любых мелких частиц, которые могут остаться в растворе. Глубинный фильтрат направляли на следующую стадию UFDF-1.

3. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1)

Очистку начинали с глубинного фильтрата (со стадии 2 выше) с помощью ультрафильтрации и диафильтрации (UFDF) при использовании мембранной кассеты Sartocon Hydrosart на 10 кДа или на 5 кДа. Количество обработанного материала обычно составляет 15-30 литров на м² площади мембраны. Целями этой операции являются: (i) уменьшение объема путем 10-20-кратного концентрирования раствора и (ii) замена буфера путем замены ферментационной среды нужным буфером посредством диафильтрации. Буфер, используемый в этой стадии, представляет собой 20 мМ цитрата/0,1М NaCl, pH 6,0, с последующим использованием второго буфера 20 мМ Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2. Количество диаобъемов составляет 10-18 для каждой стадии диафильтрации соответственно. Хроматограммы эВЭЖХ концентрата после UFDF-1 были проанализированы.

4. Фильтрация через уголь

Эта отдельная операция снижает уровень примесей из клетки-хозяина, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также окрашенные примеси (см. WO2008118752). Угольный фильтр 3M R32SP используется при загрузке приблизительно 100-150 г O-Ag на м² площади угольного фильтра. Угольный фильтр сначала промывали водой, а затем буфером для диафильтрации из расчета примерно 20 литров буфера на м² площади мембраны. Затем концентрат после UFDF-1 фильтровали при скорости потока 50 лмч (литров на м² в час) в однопоточном режиме. Затем угольный фильтр промывали буфером. Фильтрат и промывочный буфер, которые содержали продукт, собирали.

Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата были проанализированы. То, что пик продукта уменьшился после угольной фильтрации, указывает на неспецифический механизм адсорбции, на который был рассчитан угольный фильтр. Тем не менее, окрашенные примеси по большей части были удалены.

5. Мембранная IEX хроматография

Эта стадия была разработана для удаления неспецифической отрицательно заряженной примеси (см. раздел Мембранная IEX хроматография в Примере 5). Мембрана IEX, используемая в данном примере, представляет собой кассету Millipure's NatriFlo. В альтернативе также может использоваться мембрана Sartobind Q производства Sartorius Stedim или Emphaze AEX Hybrid Purifier производства 3M. Мембрану сначала уравновешивали 20 мМ Трис/20 мМ NaCl, pH 7,2, обычно 20-30 объемов мембраны (MV). Затем угольный фильтрат наносили на мембрану в количестве приблизительно 75-250 мг O-Ag на мл MV. Выходящий элюат или фильтрат, который содержал продукт, собирали. Мембрану промывали уравновешивающим буфером, а затем промывали высокосолевым буфером 20 мМ Трис/1,0М NaCl, pH 7,2.

Профили проводимости и УФ хроматографического анализа на IEX мембране анализировали. В этом профиле УФ-сигнал показал пик в высокосолевой промывке, что указывает на присутствие в угольном фильтрате неизвестной отрицательно заряженной примеси. Хроматограммы эВЭЖХ угольного фильтрата, фильтрата IEX и высокосолевой промывки, элюата указывают, что образец высокосолевой элюции, образец высокосолевой промывки содержали примесь с большой молекулярной массой.

6. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

Эта отдельная операция удаляет любые примеси с гидрофобными свойствами, такие как остаточный липид A, сохраняющийся после стадии кислотного гидролиза. Для стадии HIC использовали мембрану Sartobind Phenyl 150 мл. Фильтрат IEX обрабатывали 4,0 М раствором сульфата аммония (AS) до конечной концентрации 2,0 М. Фенилзамещенную мембрану сначала уравновешивали рабочим буфером с 2,0 М сульфата аммония. Обработанный AS фильтрат IEX пропускали через мембрану HIC со скоростью потока 40-60 мл/мин. Затем HIC мембрану промывали подвижным буфером с последующей промывкой водой. Выходящий элюат вместе с промывочным буфером собирали в качестве фильтрата HIC, и промывочную воду также собирали для анализа. Хроматографические профили УФ и проводимости для фильтрации мембраны HIC.

Хроматограммы эВЭЖХ фильтрата IEX, фильтрата HIC, промывочной воды HIC и очищенного O-Ag O8 указывают, что образец промывочной воды не показал видимого пика при детектировании RI, что указывает на отсутствие гидрофобного родственного вещества в потоке IEX.

7. Ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2)

Эта отдельная операция концентрирует продукт до нужной концентрации и заменяет сульфат аммония требуемым буфером или водой для конъюгирования. Эту стадию проводят при использовании фильтра с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа.

Фильтрат HIC концентрировали в ~10 раз, а затем подвергали диафильтрации с использованием воды в количестве диаобъемов (DV) ~20. Скорость поперечного потока и ™P для цикла UFDF-2 обычно устанавливали на уровне 200 лмч и 0,5 бара соответственно. Концентрат после UFDF-2 собирали вместе с промывкой. Конечный пул фильтровали через 0,2 мкм фильтр.

Хроматограммы эВЭЖХ O-Ag после высвобождения в среде и полностью очищенного K_p O-Ag в четырех вариантах после очистки показывают, что процесс очистки на основе платформы, разработанный для O-Ag E. coli, является эффективным для получения продукта высокого качества (ФИГ. 1-4).

В Таблице 18 представлены качественные показатели очищенного K_p O-Ag, прдуцированного нативным штаммом K_p.

Таблица 18. Качественные показатели очищенных O-Ag O1 и O2 Klebsiella O1V1 O1V2 O2V1 O2V2 Чистота согласно эВЭЖХ >99,9 >99,9 >99,9 >99,9 Молекулярная масса (кДа) 8,6 16,1 8,0 12,1 Остаточный белок (%) 0,43 0,13 1,19 0,76 Остаточная нуклеиновая кислота (%) 0,14 0,05 0,14 0,06 Эндотоксин (ЕЭ/мг) 4,3 1,1 0,38 0,15 Структурная идентификация ЯМР Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует

Дополнительные варианты осуществления изобретения представлены в следующих пронумерованных пунктах:

пункт 1. Способ очистки бактериального полисахарида из раствора, включающего указанный полисахарид вместе с примесями, где указанный способ включает стадию флокуляции.

пункт 2. Способ по пункту 1, где флокулянт включает поливалентный катион.

пункт 3. Способ по пункту 2, где указанный поливалентный катион выбран из группы, состоящей из алюминия, железа, кальция и магния.

пункт 4. Способ по пункту 2, где указанный флокулянт является смесью по меньшей мере двух поливалентных катионов, выбранных из группы, состоящей из алюминия, железа, кальция и магния.

пункт 5. Способ по пункту 2, где указанный флокулянт является смесью по меньшей мере трех поливалентных катионов, выбранных из группы, состоящей из алюминия, железа, кальция и магния.

пункт 6. Способ по пункту 2, где указанный флокулянт является смесью четырех поливалентных катионов, состоящих из алюминия, железа, кальция и магния.

пункт 7. Способ по пункту 1, где флокулянт включает агент, выбранный из группы, состоящей из квасцов (например, калиевых квасцов, натриевых квасцов или аммонийных квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, полиэтиленимина (ПЭИ), алюмината натрия, хлорида кальция и силиката натрия.

пункт 8. Способ по пункту 1, где флокулянт выбран из группы, состоящей из квасцов (например, калиевых квасцов, натриевых квасцов или аммонийных квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, алюмината натрия и силиката натрия.

пункт 9. Способ по пункту 1, где флокулянтом является полиэтиленимин (ПЭИ).

пункт 10. Способ по пункту 1, где флокулянт включает квасцы.

пункт 11. Способ по пункту 1, где флокулянтом являются квасцы.

пункт 12. Способ по пункту 1, где флокулянт включает калиевые квасцы.

пункт 13. Способ по пункту 1, где флокулянтом являются калиевые квасцы.

пункт 14. Способ по пункту 1, где флокулянт включает натриевые квасцы.

пункт 15. Способ по пункту 1, где флокулянтом являются натриевые квасцы.

пункт 16. Способ по пункту 1, где флокулянт включает аммонийные квасцы.

пункт 17. Способ по пункту 1, где флокулянтом являются аммонийные квасцы.

пункт 18. Способ по пункту 1, где флокулянт представляет собой смесь двух агентов, выбранных из группы, состоящей из квасцов (например, калиевых квасцов, натриевых квасцов или аммонийных квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, полиэтиленимина (ПЭИ), алюмината натрия и силиката натрия. В варианте осуществления флокулянт выбран из группы, состоящей из квасцов (например, калиевых квасцов, натриевых квасцов или аммонийных квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, алюмината натрия и силиката натрия.

пункт 19. Способ по пункту 1, где флокулянт представляет собой смесь трех агентов, выбранных из группы, состоящей из квасцов (например, калиевых квасцов, натриевых квасцов или аммонийных квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, полиэтиленимина (ПЭИ), алюмината натрия и силиката натрия.

пункт 20. Способ по пункту 1, где флокулянт представляет собой смесь четырех агентов, выбранных из группы, состоящей из квасцов (например, калиевых квасцов, натриевых квасцов или аммонийных квасцов), оксихлорида алюминия, сульфата алюминия, оксида кальция, гидроксида кальция, сульфата железа (II) (железного купороса), хлорида железа (III) (хлорного железа), полиакриламида, модифицированных полиакриламидов, polyDADMAC, алюмината натрия и силиката натрия.

пункт 21. Способ по пункту 1, где флокулянт включает агент, выбранный из группы, состоящей из хитозана, рыбьего клея, семян Moringa oleifera (хренного дерева), желатина, семян Strychnos potatorum (ореха нирмали), гуаровой камеди и альгинатов (например, экстрактов бурых водорослей). В варианте осуществления флокулянт выбран из группы, состоящей из хитозана, рыбьего клея, семян Moringa oleifera (хренного дерева), желатина, семян Strychnos potatorum (ореха нирмали), гуаровой камеди и альгинатов (например, экстрактов бурых водорослей).

пункт 22. Способ по пункту 1, где флокулянтом является агент, выбранный из группы, состоящей из хитозана, рыбьего клея, семян Moringa oleifera (хренного дерева), желатина, семян Strychnos potatorum (ореха нирмали), гуаровой камеди и альгинатов (например, экстрактов бурых водорослей). В варианте осуществления флокулянт выбран из группы, состоящей из хитозана, рыбьего клея, семян Moringa oleifera (хренного дерева), желатина, семян Strychnos potatorum (ореха нирмали), гуаровой камеди и альгинатов (например, экстрактов бурых водорослей).

пункт 23. Способ по любому из пунктов 1-22, где концентрация флокулянта составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 20% (в/об).

пункт 24. Способ по любому из пунктов 1-22, где концентрация флокулянта составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 10% (в/об).

пункт 25. Способ по любому из пунктов 1-22, где концентрация флокулянта составляет от приблизительно 1 до приблизительно 5% (в/об).

пункт 26. Способ по любому из пунктов 1-22, где концентрация флокулянта составляет приблизительно 0,1, приблизительно 0,25, приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5 или приблизительно 10% (в/об).

пункт 27. Способ по любому из пунктов 1-22, где концентрация флокулянта составляет приблизительно 10,5, приблизительно 11,0, приблизительно 11,5, приблизительно 12,0, приблизительно 12,5, приблизительно 13,0, приблизительно 13,5, приблизительно 14,0, приблизительно 14,5, приблизительно 15,0, приблизительно 15,5, приблизительно 16,0, приблизительно 16,5, приблизительно 17,0, приблизительно 17,5, приблизительно 18,0, приблизительно 18,5, приблизительно 19,0, приблизительно 19,5 или приблизительно 20,0% (в/об)

пункт 28. Способ по любому из пунктов 1-22, где концентрация флокулянта составляет приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5 или приблизительно 5,0% (в/об).

пункт 29. Способ по любому из пунктов 1-22, где используется концентрация флокулянта приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5 или приблизительно 4,0% (в/об).

пункт 30. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от нескольких секунд (например, 1-10 секунд) до приблизительно одного месяца.

пункт 31. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 2 секунд до приблизительно двух недель.

пункт 32. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 1 минуты до приблизительно одной недели.

пункт 33. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 1 минуты, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 часа, приблизительно 22 часов, приблизительно 23 часов или приблизительно 24 часов до приблизительно двух дней.

пункт 34. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

пункт 35. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

пункт 36. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 15 минут до приблизительно 3 часов.

пункт 37. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода от приблизительно 30 минут до приблизительно 120 минут.

пункт 38. Способ по любому из пунктов 1-29, где флокулянт добавляют в течение периода приблизительно 2 секунд, приблизительно 10 секунд, приблизительно 30 секунд, приблизительно 1 минуты, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3,0 часа, приблизительно 3,5 часа, приблизительно 4,0 часа, приблизительно 4,5 часа, приблизительно 5,0 часа, приблизительно 5,5 часа, приблизительно 6,0 часа, приблизительно 6,5 часа, приблизительно 7,0 часа, приблизительно 7,5 часа, приблизительно 8,0 часа, приблизительно 8,5 часа, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 часа, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 30 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 42 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 3 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней или приблизительно 15 дней.

пункт 39. Способ по любому из пунктов 1-38, где флокулянт добавляют без перемешивания.

пункт 40. Способ по любому из пунктов 1-38, где флокулянт добавляют при перемешивании.

пункт 41. Способ по любому из пунктов 1-38, где флокулянт добавляют при легком перемешивании.

пункт 42. Способ по любому из пунктов 1-38, где флокулянт добавляют при энергичном перемешивании.

пункт 43. Способ по любому из пунктов 1-42, где раствор выдерживают в течение некоторого времени для осаждения хлопьев перед последующей обработкой.

пункт 44. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от нескольких секунд (например, 2-10 секундами) до приблизительно 1 минуты.

пункт 45. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания по меньшей мере приблизительно 2, по меньшей мере приблизительно 3, по меньшей мере приблизительно 4, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 35, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 55, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 65, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 75, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 85, по меньшей мере приблизительно 90, по меньшей мере приблизительно 95, по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 105, по меньшей мере приблизительно 110, по меньшей мере приблизительно 115, по меньшей мере приблизительно 120, по меньшей мере приблизительно 125, по меньшей мере приблизительно 130, по меньшей мере приблизительно 135, по меньшей мере приблизительно 140, по меньшей мере приблизительно 145, по меньшей мере приблизительно 150, по меньшей мере приблизительно 155 или по меньшей мере приблизительно 160 минут.

пункт 46. Способ по пункту 1-43, где время отстаивания составляет меньше недели.

пункт 47. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 120, приблизительно 140, приблизительно 160, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320, приблизительно 1380, приблизительно 1440 минут, приблизительно двух дней, приблизительно трех дней, приблизительно четырех дней, приблизительно пяти дней или приблизительно шести дней до 1 недели.

пункт 48. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от нескольких секунд (например, 1-10 секундами) до приблизительно одного месяца.

пункт 49. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 2 секунд до приблизительно двух недель.

пункт 50. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 1 минуты до приблизительно одной недели.

пункт 51. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 1 минуты, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 часа, приблизительно 22 часов, приблизительно 23 часов или приблизительно 24 часов до приблизительно двух дней.

пункт 52. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

пункт 53. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов до приблизительно одного дня.

пункт 54. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 15 минут до приблизительно 3 часов.

пункт 55. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 30 минут до приблизительно 120 минут.

пункт 56. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания приблизительно 10 секунд, приблизительно 30 секунд, приблизительно 1 минуты, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут, приблизительно 160 минут, приблизительно 170 минут, приблизительно 3 часа, приблизительно 3,5 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 4,5 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 5,5 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 6,5 часа, приблизительно 7 часов, приблизительно 7,5 часа, приблизительно 8 часов, приблизительно 8,5 часа, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 30 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 42 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней или приблизительно 15 дней.

пункт 57. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 60, приблизительно 90, приблизительно 120, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320, приблизительно 1380 или приблизительно 1440 минут до двух дней.

пункт 58. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 5 минут до приблизительно одного дня.

пункт 59. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания от приблизительно 5 минут до приблизительно 120 минут.

пункт 60. Способ по любому из пунктов 1-43, где стадию флокуляции проводят со временем отстаивания приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут или приблизительно 160 минут.

пункт 61. Способ по любому из пунктов 43-60, где стадию отстаивания проводят без перемешивания.

пункт 62. Способ по любому из пунктов 43-60, где стадию отстаивания проводят при перемешивании.

пункт 63. Способ по любому из пунктов 43-60, где стадию отстаивания проводят при легком перемешивании.

пункт 64. Способ по любому из пунктов 43-60, где стадию отстаивания проводят при энергичном перемешивании.

пункт 65. Способ по любому из пунктов 1-64, где указанную стадию флокуляции проводят при кислотном pH.

пункт 66. Способ по любому из пунктов 1-64, где указанную стадию флокуляции проводят при pH ниже 7,0, 6,0, 5,0 или 4,0.

пункт 67. Способ по любому из пунктов 1-64, где указанную стадию флокуляции проводят при pH между 7,0 и 1,0.

пункт 68. Способ по любому из пунктов 1-64, где указанную стадию флокуляции проводят при pH от 5,5 до 2,5, от 5,0 до 2,5, от 4,5 до 2,5, от 4,0 до 2,5, от 5,5 до 3,0, от 5,0 до 3,0, от 4,5 до 3,0, от 4,0 до 3,0, от 5,5 до 3,5, от 5,0 до 3,5, от 4,5 до 3,5 или от 4,0 до 3,5.

пункт 69. Способ по любому из пунктов 1-64, где указанную стадию флокуляции проводят при pH приблизительно 5,5, приблизительно 5,0, приблизительно 4,5, приблизительно 4,0, приблизительно 3,5, приблизительно 3,0, приблизительно 2,5, приблизительно 2,0, приблизительно 1,5 или приблизительно 1,0.

пункт 70. Способ по любому из пунктов 1-64, где указанную стадию флокуляции проводят при pH приблизительно 4,0, приблизительно 3,5, приблизительно 3,0 или приблизительно 2,5.

пункт 71. Способ по любому из пунктов 1-64, где указанную стадию флокуляции проводят при pH приблизительно 3,5.

пункт 72. Способ по любому из пунктов 65-71, где указанный кислотный pH получают при подкислении раствора кислотой.

пункт 73. Способ по любому из пунктов 65-71, где указанный кислотный pH получают при подкислении раствора кислотой, выбранной из группы, состоящей из HCl, H₃PO₄, лимонной кислоты, уксусной кислоты, азотистой кислоты и серной кислоты.

пункт 74. Способ по любому из пунктов 65-71, где указанный кислотный pH получают при подкислении раствора аминокислотой.

пункт 75. Способ по любому из пунктов 65-71, где указанный кислотный pH получают при подкислении раствора аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина, аланина и глутамата.

пункт 76. Способ по любому из пунктов 65-71, где указанный кислотный pH получают при подкислении раствора серной кислотой.

пункт 77. Способ по любому из пунктов 65-71, где кислоту добавляют при перемешивании.

пункт 78. Способ по любому из пунктов 65-71, где кислоту добавляют при легком перемешивании.

пункт 79. Способ по любому из пунктов 65-71, где кислоту добавляют при энергичном перемешивании.

пункт 80. Способ по любому из пунктов 1-79, где добавление флокулянта производят при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C.

пункт 81. Способ по любому из пунктов 1-79, где добавление флокулянта производят при температуре приблизительно 4°C, приблизительно 5°C, приблизительно 6°C, приблизительно 7°C, приблизительно 8°C, приблизительно 9°C, приблизительно 10°C, приблизительно 11°C, приблизительно 12°C, приблизительно 13°C, приблизительно 14°C, приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, приблизительно 18°C, приблизительно 19°C, приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C или приблизительно 30°C.

пункт 82. Способ по любому из пунктов 1-79, где добавление флокулянта производят при температуре приблизительно 20°C.

пункт 83. Способ по любому из пунктов 1-79, где добавление флокулянта производят при температуре от приблизительно 30°C до приблизительно 95°C.

пункт 84. Способ по любому из пунктов 1-79, где добавление флокулянта производят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 85. Способ по любому из пунктов 1-79, где добавление флокулянта производят при температуре приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 86. Способ по любому из пунктов 1-79, где добавление флокулянта производят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 87. Способ по любому из пунктов 43-86, где стадию отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C.

пункт 88. Способ по любому из пунктов 43-86, где стадию отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 4°C, приблизительно 5°C, приблизительно 6°C, приблизительно 7°C, приблизительно 8°C, приблизительно 9°C, приблизительно 10°C, приблизительно 11°C, приблизительно 12°C, приблизительно 13°C, приблизительно 14°C, приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, приблизительно 18°C, приблизительно 19°C, приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C или приблизительно 30°C.

пункт 89. Способ по любому из пунктов 43-86, где стадию отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 20°C.

пункт 90. Способ по любому из пунктов 43-86, где стадию отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 30°C до приблизительно 95°C.

пункт 91. Способ по любому из пунктов 43-86, где стадию отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 92. Способ по любому из пунктов 43-86, где стадию отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 93. Способ по любому из пунктов 43-86, где стадию отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 94. Способ по любому из пунктов 72-93, где стадию подкисления, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C.

пункт 95. Способ по любому из пунктов 72-93, где стадию подкисления, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 4°C, приблизительно 5°C, приблизительно 6°C, приблизительно 7°C, приблизительно 8°C, приблизительно 9°C, приблизительно 10°C, приблизительно 11°C, приблизительно 12°C, приблизительно 13°C, приблизительно 14°C, приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, приблизительно 18°C, приблизительно 19°C, приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C или приблизительно 30°C.

пункт 96. Способ по любому из пунктов 72-93, где стадию подкисления, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 20°C.

пункт 97. Способ по любому из пунктов 72-93, где стадию подкисления, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 30°C до приблизительно 95°C.

пункт 98. Способ по любому из пунктов 72-93, где стадию подкисления, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 99. Способ по любому из пунктов 72-93, где стадию подкисления, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 100. Способ по любому из пунктов 72-93, где стадию подкисления, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 101. Способ по любому из пунктов 1-79, где стадию добавления флокулянта и отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C.

пункт 102. Способ по любому из пунктов 1-79, где стадию добавления флокулянта и отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 4°C, приблизительно 5°C, приблизительно 6°C, приблизительно 7°C, приблизительно 8°C, приблизительно 9°C, приблизительно 10°C, приблизительно 11°C, приблизительно 12°C, приблизительно 13°C, приблизительно 14°C, приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, приблизительно 18°C, приблизительно 19°C, приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C или приблизительно 30°C.

пункт 103. Способ по любому из пунктов 1-79, где стадию добавления флокулянта и отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 20°C.

пункт 104. Способ по любому из пунктов 1-79, где стадию добавления флокулянта и отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 30°C до приблизительно 95°C.

пункт 105. Способ по любому из пунктов 1-79, где стадию добавления флокулянта и отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 106. Способ по любому из пунктов 1-79, где стадию добавления флокулянта и отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 107. Способ по любому из пунктов 1-79, где стадию добавления флокулянта и отстаивания, если таковая присутствует, проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 108. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадию добавления флокулянта и подкисления проводят при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C.

пункт 109. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадию добавления флокулянта и подкисления проводят при температуре приблизительно 4°C, приблизительно 5°C, приблизительно 6°C, приблизительно 7°C, приблизительно 8°C, приблизительно 9°C, приблизительно 10°C, приблизительно 11°C, приблизительно 12°C, приблизительно 13°C, приблизительно 14°C, приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, приблизительно 18°C, приблизительно 19°C, приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C или приблизительно 30°C.

пункт 110. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадию добавления флокулянта и подкисления проводят при температуре приблизительно 20°C.

пункт 111. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадию добавления флокулянта и подкисления проводят при температуре от приблизительно 30°C до приблизительно 95°C.

пункт 112. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадию добавления флокулянта и подкисления проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 113. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадию добавления флокулянта и подкисления проводят при температуре приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 114. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадию добавления флокулянта и подкисления проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 115. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадии добавления флокулянта, отстаивания и подкисления проводят при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C.

пункт 116. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадии добавления флокулянта, отстаивания и подкисления проводят при температуре приблизительно 4°C, приблизительно 5°C, приблизительно 6°C, приблизительно 7°C, приблизительно 8°C, приблизительно 9°C, приблизительно 10°C, приблизительно 11°C, приблизительно 12°C, приблизительно 13°C, приблизительно 14°C, приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, приблизительно 18°C, приблизительно 19°C, приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C или приблизительно 30°C.

пункт 117. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадии добавления флокулянта, отстаивания и подкисления проводят при температуре приблизительно 20°C.

пункт 118. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадии добавления флокулянта, отстаивания и подкисления проводят при температуре от приблизительно 30°C до приблизительно 95°C.

пункт 119. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадии добавления флокулянта, отстаивания и подкисления проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 120. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадии добавления флокулянта, отстаивания и подкисления проводят при температуре приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 121. Способ по любому из пунктов 72-79, где стадии добавления флокулянта, отстаивания и подкисления проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 122. Способ по любому из пунктов 1-71, 80-93 или 101-107, где стадия флокуляции включает добавление флокулянта без регулирования pH.

пункт 123. Способ по любому из пунктов 1-122, где стадия флокуляции включает добавление флокулянта, регулирование pH и отстаивание раствора.

пункт 124. Способ по пункту 123, где флокулянт добавляют перед регулированием pH.

пункт 125. Способ по пункту 123, где pH регулируют перед добавлением флокулянта.

пункт 126. Способ по пункту 123, где pH регулируют перед добавлением флокулянта и отстаиванием раствора.

пункт 127. Способ по пункту 123, где флокулянт добавляют и остаивают раствор перед регулированием pH.

пункт 128. Способ по любому из пунктов 1-127, где после флокуляции суспензию осветляют с помощью декантации, седиментации, фильтрации или центрифугирования.

пункт 129. Способ по любому из пунктов 1-127, где после флокуляции суспензию осветляют с помощью декантации.

пункт 130. Способ по любому из пунктов 1-127, где после флокуляции суспензию осветляют с помощью гидроциклона.

пункт 131. Способ по любому из пунктов 1-127, где после флокуляции суспензию осветляют с помощью седиментации.

пункт 132. Способ по любому из пунктов 1-127, где после флокуляции суспензию осветляют с помощью флотации.

пункт 133. Способ по любому из пунктов 1-127, где после флокуляции суспензию осветляют с помощью фильтрации.

пункт 134. Способ по любому из пунктов 1-127, где после флокуляции суспензию осветляют с помощью центрифугирования.

пункт 135. Способ по любому из пунктов 127-134, где содержащий полисахарид раствор собирают для хранения.

пункт 136. Способ по любому из пунктов 127-134, где содержащий полисахарид раствор собирают для дополнительной обработки.

пункт 137. Способ по любому из пунктов 127-134, где содержащий полисахарид раствор хранят, а затем дополнительно обрабатывают.

пункт 138. Способ по любому из пунктов 134-137, где указанное центрифугирование является непрерывным центрифугированием.

пункт 139. Способ по любому из пунктов 134-137, где указанное центрифугирование является центрифугированием в роторе с качающимися стаканами.

пункт 140. Способ по любому из пунктов 134-139, где суспензию центрифугируют при приблизительно 1000 g, приблизительно 2000 g, приблизительно 3000 g, приблизительно 4000 g, приблизительно 5000 g, приблизительно 6000 g, приблизительно 8000 g, приблизительно 9000 g, приблизительно 10000 g, приблизительно 11000 g, приблизительно 12000 g, приблизительно 13000 g, приблизительно 14000 g, приблизительно 15000 g, приблизительно 16000 g, приблизительно 17000 g, приблизительно 18000 g, приблизительно 19000 g, приблизительно 20000 g, приблизительно 25000 g, приблизительно 30000 g, приблизительно 35000 g, приблизительно 40000 g, приблизительно 50000 g, приблизительно 60000 g, приблизительно 70000 g, приблизительно 80000 g, приблизительно 90000 g, приблизительно 100000 g, приблизительно 120000 g, приблизительно 140000 g, приблизительно 160000 g или приблизительно 180000 g.

пункт 141. Способ по любому из пунктов 134-139, где суспензию центрифугируют при приблизительно 8000 g, приблизительно 9000 g, приблизительно 10000 g, приблизительно 11000 g, приблизительно 12000 g, приблизительно 13000 g, приблизительно 14000 g, приблизительно 15000 g, приблизительно 16000 g, приблизительно 17000 g, приблизительно 18000 g, приблизительно 19000 g, приблизительно 20000 g или приблизительно 25000 g.

пункт 142. Способ по любому из пунктов 134-139, где суспензию центрифугируют при приблизительно от 5000 g до приблизительно 25000 g.

пункт 143. Способ по любому из пунктов 134-139, где суспензию центрифугируют при приблизительно от 8000 g до приблизительно 20000 g.

пункт 144. Способ по любому из пунктов 134-139, где суспензию центрифугируют при приблизительно от 10000 g до приблизительно 15000 g.

пункт 145. Способ по любому из пунктов 134-139, где суспензию центрифугируют при приблизительно от 10000 g до приблизительно 12000 g.

пункт 146. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 105, по меньшей мере 110, по меньшей мере 115, по меньшей мере 120, по меньшей мере 125, по меньшей мере 130, по меньшей мере 135, по меньшей мере 140, по меньшей мере 145, по меньшей мере 150, по меньшей мере 155 или по меньшей мере 160 минут.

пункт 147. Способ по пункту 146, где суспензию центрифугируют меньше 24 часов.

пункт 148. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 120, приблизительно 140, приблизительно 160, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно в 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320 или приблизительно 1380 минут до 1440 минут.

пункт 149. Предпочтительно суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 60, приблизительно 90, приблизительно 120, приблизительно 180, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480 или приблизительно 540 минут до приблизительно 600 минут.

пункт 150. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 3 часов.

пункт 151. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 120 минут.

пункт 152. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут или приблизительно 155 минут до приблизительно 160 минут.

пункт 153. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение от приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут или приблизительно 55 минут до приблизительно 60 минут.

пункт 154. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 120, приблизительно 140, приблизительно 160, приблизительно 180, приблизительно 220, приблизительно 240, приблизительно 300, приблизительно 360, приблизительно 420, приблизительно 480, приблизительно 540, приблизительно 600, приблизительно 660, приблизительно 720, приблизительно 780, приблизительно 840, приблизительно 900, приблизительно 960, приблизительно 1020, приблизительно 1080, приблизительно 1140, приблизительно 1200, приблизительно 1260, приблизительно 1320, приблизительно 1380 минут или приблизительно 1440 минут.

пункт 155. Способ по любому из пунктов 134-145, где суспензию центрифугируют в течение приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 65 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 75 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 85 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 95 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 105 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 115 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 125 минут, приблизительно 130 минут, приблизительно 135 минут, приблизительно 140 минут, приблизительно 145 минут, приблизительно 150 минут, приблизительно 155 минут или приблизительно 160 минут.

пункт 156. Способ по любому из пунктов 134-138 или 140-155, где указанное центрифугирование является непрерывным центрифугированием, а скорость подачи составляет в пределах 50-5000 мл/мин, 100-4000 мл/мин, 150-3000 мл/мин, 200-2500 мл/мин, 250-2000 мл/мин, 300-1500 мл/мин, 300-1000 мл/мин, 200-1000 мл/мин, 200-1500 мл/мин, 400-1500 мл/мин, 500-1500 мл/мин, 500-1000 мл/мин, 500-2000 мл/мин, 500-2500 мл/мин или 1000-2500 мл/мин.

пункт 157. Способ по любому из пунктов 134-138 или 140-155, где указанное центрифугирование является непрерывным центрифугированием, а скорость подачи составляет приблизительно 10, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, приблизительно 1000, приблизительно 1050, приблизительно 1100, приблизительно 1150, приблизительно 1200, приблизительно 1250, приблизительно 1300, приблизительно 1350, приблизительно 1400, приблизительно 1450, приблизительно 1500, приблизительно 1650 приблизительно 1700, приблизительно 1800, приблизительно 1900, приблизительно 2000, приблизительно 2100, приблизительно 2200, приблизительно 2300, приблизительно 2400, приблизительно 2500, приблизительно 2600, приблизительно 2700, приблизительно 2800, приблизительно 2900, приблизительно 3000, приблизительно 3250, приблизительно 3500, приблизительно 3750 приблизительно 4000, приблизительно 4250, приблизительно 4500 или приблизительно 5000 мл/мин.

пункт 158. Способ по любому из пунктов 1-157, где содержащий полисахарид раствор фильтруют.

пункт 159. Способ по пункту 158, где указанная фильтрация выбрана из группы, состоящей из глубинной фильтрации, фильтрации через активированный уголь, гель-фильтрации, диафильтрации и ультрафильтрации.

пункт 160. Способ по пункту 158, где указанная стадия фильтрации является диафильтрацией.

пункт 161. Способ по пункту 160, где указанная фильтрация является фильтрацией в тангенциальном потоке.

пункт 162. Способ по пункту 158, где указанная фильтрация является глубинной фильтрацией.

пункт 163. Способ по пункту 162, где кострукция глубинного фильтра выбрана из группы, состоящей из кассет, картриджей, фильтров с глубоким слоем (например, песочного фильтра) и линзообразных фильтров.

пункт 164. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-100 микрон, приблизительно 0,05-100 микрон, приблизительно 0,1-100 микрон, приблизительно 0,2-100 микрон, приблизительно 0,3-100 микрон, приблизительно 0,4-100 микрон, приблизительно 0,5-100 микрон, приблизительно 0,6-100 микрон, приблизительно 0,7-100 микрон, приблизительно 0,8-100 микрон, приблизительно 0,9-100 микрон, приблизительно 1-100 микрон, приблизительно 1,25-100 микрон, приблизительно 1,5-100 микрон, приблизительно 1,75-100 микрон, приблизительно 2-100 микрон, приблизительно 3-100 микрон, приблизительно 4-100 микрон, приблизительно 5-100 микрон, приблизительно 6-100 микрон, приблизительно 7-100 микрон, приблизительно 8-100 микрон, приблизительно 9-100 микрон, приблизительно 10-100 микрон, приблизительно 15-100 микрон, приблизительно 20-100 микрон, приблизительно 25-100 микрон, приблизительно 30-100 микрон, приблизительно 40-100 микрон, приблизительно 50-100 микрон или приблизительно 75-100 микрон.

пункт 165. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-75 микрон, приблизительно 0,05-75 микрон, приблизительно 0,1-75 микрон, приблизительно 0,2-75 микрон, приблизительно 0,3-75 микрон, приблизительно 0,4-75 микрон, приблизительно 0,5-75 микрон, приблизительно 0,6-75 микрон, приблизительно 0,7-75 микрон, приблизительно 0,8-75 микрон, приблизительно 0,9-75 микрон, приблизительно 1-75 микрон, приблизительно 1,25-75 микрон, приблизительно 1,5-75 микрон, приблизительно 1,75-75 микрон, приблизительно 2-75 микрон, приблизительно 3-75 микрон, приблизительно 4-75 микрон, приблизительно 5-75 микрон, приблизительно 6-75 микрон, приблизительно 7-75 микрон, приблизительно 8-75 микрон, приблизительно 9-75 микрон, приблизительно 10-75 микрон, приблизительно 15-75 микрон, приблизительно 20-75 микрон, приблизительно 25-75 микрон, приблизительно 30-75 микрон, приблизительно 40-75 микрон или приблизительно 50-75 микрон.

пункт 166. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-50 микрон, приблизительно 0,05-50 микрон, приблизительно 0,1-50 микрон, приблизительно 0,2-50 микрон, приблизительно 0,3-50 микрон, приблизительно 0,4-50 микрон, приблизительно 0,5-50 микрон, приблизительно 0,6-50 микрон, приблизительно 0,7-50 микрон, приблизительно 0,8-50 микрон, приблизительно 0,9-50 микрон, приблизительно 1-50 микрон, приблизительно 1,25-50 микрон, приблизительно 1,5-50 микрон, приблизительно 1,75-50 микрон, приблизительно 2-50 микрон, приблизительно 3-50 микрон, приблизительно 4-50 микрон, приблизительно 5-50 микрон, приблизительно 6-50 микрон, приблизительно 7-50 микрон, приблизительно 8-50 микрон, приблизительно 9-50 микрон, приблизительно 10-50 микрон, приблизительно 15-50 микрон, приблизительно 20-50 микрон, приблизительно 25-50 микрон, приблизительно 30-50 микрон, приблизительно 40-50 микрон или приблизительно 50-50 микрон.

пункт 167. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-25 микрон, приблизительно 0,05-25 микрон, приблизительно 0,1-25 микрон, приблизительно 0,2-25 микрон, приблизительно 0,3-25 микрон, приблизительно 0,4-25 микрон, приблизительно 0,5-25 микрон, приблизительно 0,6-25 микрон, приблизительно 0,7-25 микрон, приблизительно 0,8-25 микрон, приблизительно 0,9-25 микрон, приблизительно 1-25 микрон, приблизительно 1,25-25 микрон, приблизительно 1,5-25 микрон, приблизительно 1,75-25 микрон, приблизительно 2-25 микрон, приблизительно 3-25 микрон, приблизительно 4-25 микрон, приблизительно 5-25 микрон, приблизительно 6-25 микрон, приблизительно 7-25 микрон, приблизительно 8-25 микрон, приблизительно 9-25 микрон, приблизительно 10-25 микрон, приблизительно 15-25 микрон или приблизительно 20-25 микрон.

пункт 168. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-10 микрон, приблизительно 0,05-10 микрон, приблизительно 0,1-10 микрон, приблизительно 0,2-10 микрон, приблизительно 0,3-10 микрон, приблизительно 0,4-10 микрон, приблизительно 0,5-10 микрон, приблизительно 0,6-10 микрон, приблизительно 0,7-10 микрон, приблизительно 0,8-10 микрон, приблизительно 0,9-10 микрон, приблизительно 1-10 микрон, приблизительно 1,25-10 микрон, приблизительно 1,5-10 микрон, приблизительно 1,75-10 микрон, приблизительно 2-10 микрон, приблизительно 3-10 микрон, приблизительно 4-10 микрон, приблизительно 5-10 микрон, приблизительно 6-10 микрон, приблизительно 7-10 микрон, приблизительно 8-10 микрон или приблизительно 9-10 микрон.

пункт 169. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-8 микрон, приблизительно 0,05-8 микрон, приблизительно 0,1-8 микрон, приблизительно 0,2-8 микрон, приблизительно 0,3-8 микрон, приблизительно 0,4-8 микрон, приблизительно 0,5-8 микрон, приблизительно 0,6-8 микрон, приблизительно 0,7-8 микрон, приблизительно 0,8-8 микрон, приблизительно 0,9-8 микрон, приблизительно 1-8 микрон, приблизительно 1,25-8 микрон, приблизительно 1,5-8 микрон, приблизительно 1,75-8 микрон, приблизительно 2-8 микрон, приблизительно 3-8 микрон, приблизительно 4-8 микрон, приблизительно 5-8 микрон, приблизительно 6-8 микрон или приблизительно 7-8 микрон.

пункт 170. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-5 микрон, приблизительно 0,05-5 микрон, приблизительно 0,1-5 микрон, приблизительно 0,2-5 микрон, приблизительно 0,3-5 микрон, приблизительно 0,4-5 микрон, приблизительно 0,5-5 микрон, приблизительно 0,6-5 микрон, приблизительно 0,7-5 микрон, приблизительно 0,8-5 микрон, приблизительно 0,9-5 микрон, приблизительно 1-5 микрон, приблизительно 1,25-5 микрон, приблизительно 1,5-5 микрон, приблизительно 1,75-5 микрон, приблизительно 2-5 микрон, приблизительно 3-5 микрон или приблизительно 4-5 микрон.

пункт 171. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-2 микрон, приблизительно 0,05-2 микрон, приблизительно 0,1-2 микрон, приблизительно 0,2-2 микрон, приблизительно 0,3-2 микрон, приблизительно 0,4-2 микрон, приблизительно 0,5-2 микрон, приблизительно 0,6-2 микрон, приблизительно 0,7-2 микрон, приблизительно 0,8-2 микрон, приблизительно 0,9-2 микрон, приблизительно 1-2 микрон, приблизительно 1,25-2 микрон, приблизительно 1,5-2 микрон, приблизительно 1,75-2 микрон, приблизительно 2-2 микрон, приблизительно 3-2 микрон или приблизительно 4-2 микрон.

пункт 172. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-1 микрон, приблизительно 0,05-1 микрон, приблизительно 0,1-1 микрон, приблизительно 0,2-1 микрон, приблизительно 0,3-1 микрон, приблизительно 0,4-1 микрон, приблизительно 0,5-1 микрон, приблизительно 0,6-1 микрон, приблизительно 0,7-1 микрон, приблизительно 0,8-1 микрон или приблизительно 0,9-1 микрон.

пункт 173. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-163, где глубинный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,05-50 микрон, 0,1-25 микрон, 0,2-10 микрон, 0,1-10 микрон, 0,2-5 микрон или 0,25-1 микрон.

пункт 174. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-2500 л/м², 5-2500 л/м², 10-2500 л/м², 25-2500 л/м², 50-2500 л/м², 75-2500 л/м², 100-2500 л/м², 150-2500 л/м², 200-2500 л/м², 300-2500 л/м², 400-2500 л/м², 500-2500 л/м², 750-2500 л/м², 1000-2500 л/м², 1500-2500 л/м² или 2000-2500 л/м².

пункт 175. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-1000 л/м², 5-1000 л/м², 10-1000 л/м², 25-1000 л/м², 50-1000 л/м², 75-1000 л/м², 100-1000 л/м², 150-1000 л/м², 200-1000 л/м², 300-1000 л/м², 400-1000 л/м², 500-1000 л/м² или 750-1000 л/м².

пункт 176. Способ по любому из пунктов 155-156 или 159-170, где глубинный фильтр имеет производительность 1-750 л/м², 5-750 л/м², 10-750 л/м², 25-750 л/м², 50-750 л/м², 75-750 л/м², 100-750 л/м², 150-750 л/м², 200-750 л/м², 300-750 л/м², 400-750 л/м² или 500-750 л/м².

пункт 177. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-500 л/м², 5-500 л/м², 10-500 л/м², 25-500 л/м², 50-500 л/м², 75-500 л/м², 100-500 л/м², 150-500 л/м², 200-500 л/м², 300-500 л/м² или 400-500 л/м².

пункт 178. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-400 л/м², 5-400 л/м², 10-400 л/м², 25-400 л/м², 50-400 л/м², 75-400 л/м², 100-400 л/м², 150-400 л/м², 200-400 л/м² или 300-400 л/м².

пункт 179. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-300 л/м², 5-300 л/м², 10-300 л/м², 25-300 л/м², 50-300 л/м², 75-300 л/м², 100-300 л/м², 150-300 л/м² или 200-300 л/м².

пункт 180. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-200 л/м², 5-200 л/м², 10-200 л/м², 25-200 л/м², 50-200 л/м², 75-200 л/м², 100-200 л/м² или 150-200 л/м².

пункт 181. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-100 л/м², 5-100 л/м², 10-100 л/м², 25-100 л/м², 50-100 л/м² или 75-100 л/м².

пункт 182. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-173, где глубинный фильтр имеет производительность 1-50 л/м², 5-50 л/м², 10-50 л/м² или 25-50 л/м².

пункт 183. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-182, где скорость подачи составляет в пределах 1-1000 лмч (литров/м²/час), 10-1000 лмч, 25-1000 лмч, 50-1000 лмч, 100-1000 лмч, 125-1000 лмч, 150-1000 лмч, 200-1000 лмч, 250-1000 лмч, 300-1000 лмч, 400-1000 лмч, 500-1000 лмч, 600-1000 лмч, 700-1000 лмч, 800-1000 лмч или 900-1000 лмч.

пункт 184. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-182, где скорость подачи составляет в пределах 1-500 лмч, 10-500 лмч, 25-500 лмч, 50-500 лмч, 100-500 лмч, 125-500 лмч, 150-500 лмч, 200-500 лмч, 250-500 лмч, 300-500 лмч или 400-500 лмч.

пункт 185. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-182, где скорость подачи составляет в пределах 1-400 лмч, 10-400 лмч, 25-400 лмч, 50-400 лмч, 100-400 лмч, 125-400 лмч, 150-400 лмч, 200-400 лмч, 250-400 лмч или 300-400 лмч.

пункт 186. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-182, где скорость подачи составляет в пределах 1-250 лмч, 10-250 лмч, 25-250 лмч, 50-250 лмч, 100-250 лмч, 125-250 лмч, 150-250 лмч или 200-250 лмч.

пункт 187. Способ по любому из пунктов 158-159 или 162-182, где скорость подачи составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 210, приблизительно 220, приблизительно 230, приблизительно 240 приблизительно 250, приблизительно 260, приблизительно 270, приблизительно 280, приблизительно 290, приблизительно 300, приблизительно 310, приблизительно 320, приблизительно 330, приблизительно 340, приблизительно 350, приблизительно 360, приблизительно 370, приблизительно 380, приблизительно 390, приблизительно 400, приблизительно 425, приблизительно 450, приблизительно 475, приблизительно 500, приблизительно 525, приблизительно 550, приблизительно 575, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950 или приблизительно 1000 лмч.

пункт 188. Способ по любому из пунктов 158-187, где фильтрат подвергают микрофильтрации.

пункт 189. Способ по пункту 188, где указанная микрофильтрация является тупиковой фильтрацией.

пункт 190. Способ по пункту 188, где указанная микрофильтрация является тангенциальной микрофильтрацией.

пункт 191. Способ по любому из пунктов 188-190, где микрофильтрационный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-2 микрон, приблизительно 0,05-2 микрон, приблизительно 0,1-2 микрон, приблизительно 0,2-2 микрон, приблизительно 0,3-2 микрон, приблизительно 0,4-2 микрон, приблизительно 0,45-2 микрон, приблизительно 0,5-2 микрон, приблизительно 0,6-2 микрон, приблизительно 0,7-2 микрон, приблизительно 0,8-2 микрон, приблизительно 0,9-2 микрон, приблизительно 1-2 микрон, приблизительно 1,25-2 микрон, приблизительно 1,5-2 микрон или приблизительно 1,75-2 микрон.

пункт 192. Способ по любому из пунктов 188-190, где микрофильтрационный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-1 микрона, приблизительно 0,05-1 микрона, приблизительно 0,1-1 микрона, приблизительно 0,2-1 микрона, приблизительно 0,3-1 микрона, приблизительно 0,4-1 микрона, приблизительно 0,45-1 микрона, приблизительно 0,5-1 микрона, приблизительно 0,6-1 микрона, приблизительно 0,7-1 микрона, приблизительно 0,8-1 микрона или приблизительно 0,9-1 микрона.

пункт 193. Способ по любому из пунктов 188-190, где микрофильтрационный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,45, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9 или приблизительно 2 микрона.

пункт 194. Способ по любому из пунктов 188-190, где микрофильтрационный фильтр имеет номинальное задерживание приблизительно 0,45 микрона.

пункт 195. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-5000 л/м², 200-5000 л/м², 300-5000 л/м², 400-5000 л/м², 500-5000 л/м², 750-5000 л/м², 1000-5000 л/м², 1500-5000 л/м², 2000-5000 л/м², 3000-5000 л/м² или 4000-5000 л/м².

пункт 196. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-2500 л/м², 200-2500 л/м², 300-2500 л/м², 400-2500 л/м², 500-2500 л/м², 750-2500 л/м², 1000-2500 л/м², 1500-2500 л/м² или 2000-2500 л/м².

пункт 197. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-1500 л/м², 200-1500 л/м², 300-1500 л/м², 400-1500 л/м², 500-1500 л/м², 750-1500 л/м² или 1000-1500 л/м².

пункт 198. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-1250 л/м², 200-1250 л/м², 300-1250 л/м², 400-1250 л/м², 500-1250 л/м², 750-1250 л/м² или 1000-1250 л/м².

пункт 199. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-1000 л/м², 200-1000 л/м², 300-1000 л/м², 400-1000 л/м², 500-1000 л/м² или 750-1000 л/м².

пункт 200. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-750 л/м², 200-750 л/м², 300-750 л/м², 400-750 л/м² или 500-750 л/м².

пункт 201. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-600 л/м², 200-600 л/м², 300-600 л/м², 400-600 л/м² или 400-600 л/м².

пункт 202. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-500 л/м², 200-500 л/м², 300-500 л/м² или 400-500 л/м².

пункт 203. Способ по любому из пунктов 188-194, где микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, приблизительно 1000, приблизительно 1050, приблизительно 1100, приблизительно 1150, приблизительно 1200, приблизительно 1250, приблизительно 1300, приблизительно 1350, приблизительно 1400, приблизительно 1450, приблизительно 1500, приблизительно 1550, приблизительно 1600, приблизительно 1650, приблизительно 1700, приблизительно 1750, приблизительно 1800, приблизительно 1850, приблизительно 1900, приблизительно 1950, приблизительно 2000, приблизительно 2050, приблизительно 2100, приблизительно 2150, приблизительно 2200, приблизительно 2250, приблизительно 2300, приблизительно 2350, приблизительно 2400, приблизительно 2450 или приблизительно 2500 л/м².

пункт 204. Способ по любому из пунктов 158-203, где фильтрат дополнительно обрабатывают с помощью ультрафильтрации и/или диафильтрации.

пункт 205. Способ по любому из пунктов 158-203, где фильтрат дополнительно обрабатывают с помощью ультрафильтрации.

пункт 206. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах от приблизительно 5 кДа до 1000 кДа.

пункт 207. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 750 кДа.

пункт 208. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 500 кДа.

пункт 209. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 300 кДа.

пункт 210. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 100 кДа.

пункт 211. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 50 кДа.

пункт 212. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 30 кДа.

пункт 213. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 10 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 20 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 30 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 40 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 50 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 75 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 100 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 150 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 200 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 300 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 400 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 500 кДа до 1000 кДа или приблизительно от 750 кДа до 1000 кДа.

пункт 214. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 500 кДа, приблизительно от 10 кДа до 500 кДа, приблизительно от 20 кДа до 500 кДа, приблизительно от 30 кДа до 500 кДа, приблизительно от 40 кДа до 500 кДа, приблизительно от 50 кДа до 500 кДа, приблизительно от 75 кДа до 500 кДа, приблизительно от 100 кДа до 500 кДа, приблизительно от 150 кДа до 500 кДа, приблизительно от 200 кДа до 500 кДа, приблизительно от 300 кДа до 500 кДа или приблизительно от 400 кДа до 500 кДа.

пункт 215. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе составляет от 5 кДа до 300 кДа, приблизительно от 10 кДа до 300 кДа, приблизительно от 20 кДа до 300 кДа, приблизительно от 30 кДа до 300 кДа, приблизительно от 40 кДа до 300 кДа, приблизительно от 50 кДа до 300 кДа, приблизительно от 75 кДа до 300 кДа, приблизительно от 100 кДа до 300 кДа, приблизительно от 150 кДа до 300 кДа или приблизительно от 200 кДа до 300 кДа.

пункт 216. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 100 кДа, приблизительно от 10 кДа до 100 кДа, приблизительно от 20 кДа до 100 кДа, приблизительно от 30 кДа до 100 кДа, приблизительно от 40 кДа до 100 кДа, приблизительно от 50 кДа до 100 кДа или приблизительно от 75 кДа до 100 кДа.

пункт 217. Способ по любому из пунктов 204-205, где отсечение по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 50 кДа, приблизительно 60 кДа, приблизительно 70 кДа, приблизительно 80 кДа, приблизительно 90 кДа, приблизительно 100 кДа, приблизительно 110 кДа, приблизительно 120 кДа, приблизительно 130 кДа, приблизительно 140 кДа, приблизительно 150 кДа, приблизительно 200 кДа, приблизительно 250 кДа, приблизительно 300 кДа, приблизительно 400 кДа, приблизительно 500 кДа, приблизительно 750 кДа или приблизительно 1000 кДа.

пункт 218. Способ по любому из пунктов 204-217, где коэффициент концентрирования стадии ультрафильтрации составляет от приблизительно 1,5 до приблизительно 10.

пункт 219. Способ по любому из пунктов 204-217, где коэффициент концентрирования составляет от приблизительно 2 до приблизительно 8.

пункт 220. Способ по любому из пунктов 204-217, где коэффициент концентрирования составляет от приблизительно 2 до приблизительно 5.

пункт 221. Способ по любому из пунктов 204-217, где коэффициент концентрирования составляет приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5 или приблизительно 10,0.

пункт 222. Способ по любому из пунктов 204-217, где коэффициент концентрирования составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5 или приблизительно 6.

пункт 223. Способ по любому из пунктов 204-222, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C.

пункт 224. Способ по любому из пунктов 204-222, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 225. Способ по любому из пунктов 204-222, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 226. Способ по любому из пунктов 204-222, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 227. Способ по любому из пунктов 158-226, где фильтрат после ультрафильтрации обрабатывают с помощю диафильтрации.

пункт 228. Способ по пункту 227, где раствором для замены является вода.

пункт 229. Способ по пункту 227, где раствором для замены является солевой раствор в воде.

пункт 230. Способ по пункту 229, где соль выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации.

пункт 231. Способ по пункту 229, где солью является хлорид натрия.

пункт 232. Способ по пункту 229, где раствором для замены является хлорид натрия в концентрации приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 110 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 140 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 160 мМ, приблизительно 170 мМ, приблизительно 180 мМ, приблизительно 190 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 300 мМ, приблизительно 350 мМ, приблизительно 400 мМ, приблизительно 450 мМ или приблизительно 500 мМ.

пункт 233. Способ по пункту 227, где раствором для замены является буферный раствор.

пункт 234. Способ по пункту 227, где раствором для замены является буферный раствор, где буфер выбран из группы, состоящей из N-(2-ацетамидо)аминоэтансульфоновой кислоты (ACES), соли уксусной кислоты (ацетата), N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты (ADA), 2-аминоэтансульфоновой кислоты (AES, таурина), аммиака, 2-амино-2-метил-1-пропанола (AMP), 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола AMPD, аммедиола, N-(1,1-диметил-2-гидроксиэтил)-3-амино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (AMPSO), N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES), гидрокарбоната (бикарбоната) натрия, N,N'-бис(2-гидроксиэтил)-глицина (бицина), [бис-(2-гидроксиэтил)-имино]-трис-(гидроксиметилметана) (бис-триса), 1,3-бис[трис(гидроксиметил)-метиламино]пропана (бис-трис-пропана), борной кислоты, диметиларсиновой кислоты (какодилата), 3-(циклогексиламино)-пропансульфоновой кислоты (CAPS), 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновой кислоты (CAPSO), карбоната натрия (карбоната), циклогексиламиноэтансульфоновой кислоты (CHES), соли лимонной кислоты (цитрата), 3-[N-бис(гидроксиэтил)амино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (DIPSO), соли муравьиной кислоты (формиата), глицина, глицилглицина, N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-этансульфоновой кислоты (HEPES), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-3-пропансульфоновой кислоты (HEPPS, EPPS), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-2-гидроксипропан-сульфоновой кислоты (HEPPSO), имидазола, соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES), 3-(N-морфолино)-пропансульфоновой кислоты (MOPS), 3-(N-морфолино)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO), соли фосфорной кислоты (фосфата), пиперазин-N, N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES), пиперазин-N,N'-бис(2-гидроксипропансульфоновой кислоты) (POPSO), пиридина, соли янтарной кислоты (сукцината), 3-{[трис(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновой кислоты (TAPS), 3-[N-трис(гидроксиметил)-метиламино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (TAPSO), триэтаноламина (ТЭА), 2-[трис(гидроксиметил)метиламино]этансульфоновой кислоты (TES), N-[трис(гидроксиметил)метил]глицина (трицина) и трис(гидроксиметил)аминометана (триса).

пункт 235. Способ по пункту 227, где раствором для замены является буферный раствор, где буфер выбран из группы, состоящей из соли уксусной кислоты (ацетата), соли лимонной кислоты (цитрата), соли муравьиной кислоты (формиата), соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), соли фосфорной кислоты (фосфата) и соли янтарной кислоты (сукцината).

пункт 236. Способ по пункту 227, где раствором для замены является буферный раствор, где буфером является соль лимонной кислоты (цитратом).

пункт 237. Способ по пункту 227, где раствором для замены является буферный раствор, где буфером является соль янтарной кислоты (сукцинатом).

пункт 238. Способ по любому из пунктов 234-237, где указанная соль является натриевой солью.

пункт 239. Способ по любому из пунктов 234-237, где указанная соль является калиевой солью.

пункт 240. Способ по любому из пунктов 233-239, где pH диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 4,0-11,0, приблизительно 5,0-10,0, приблизительно 5,5-9,0, приблизительно 6,0-8,0, приблизительно 6,0-7,0, приблизительно 6,5-7,5, приблизительно 6,5-7,0 или приблизительно 6,0-7,5.

пункт 241. Способ по любому из пунктов 233-239, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0, приблизительно 10,5 или приблизительно 11,0.

пункт 242. Способ по любому из пунктов 233-239, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5 или приблизительно 9,0.

пункт 243. Способ по любому из пунктов 226-231, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,5, приблизительно 7,0 или приблизительно 7,5.

пункт 244. Способ по любому из пунктов 233-239, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 7,0.

пункт 245. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ до 100 мМ, от приблизительно 0,1 мМ до 100 мМ, от приблизительно 0,5 мМ до 100 мМ, от приблизительно 1 мМ до 100 мМ, от приблизительно 2 мМ до 100 мМ, от приблизительно 3 мМ до 100 мМ, от приблизительно 4 мМ до 100 мМ, от приблизительно 5 мМ до 100 мМ, от приблизительно 6 мМ до 100 мМ, от приблизительно 7 мМ до 100 мМ, от приблизительно 8 мМ до 100 мМ, от приблизительно 9 мМ до 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до 100 мМ, от приблизительно 11 мМ до 100 мМ, от приблизительно 12 мМ до 100 мМ, от приблизительно 13 мМ до 100 мМ, от приблизительно 14 мМ до 100 мМ, от приблизительно 15 мМ до 100 мМ, от приблизительно 16 мМ до 100 мМ, от приблизительно 17 мМ до 100 мМ, от приблизительно 18 мМ до 100 мМ, от приблизительно 19 мМ до 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до 100 мМ, от приблизительно 35 мМ до 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до 100 мМ, от приблизительно 45 мМ до 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до 100 мМ, от приблизительно 55 мМ до 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до 100 мМ, от приблизительно 65 мМ до 100 мМ, от приблизительно 70 мМ до 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до 100 мМ, от приблизительно 85 мМ до 100 мМ, от приблизительно 90 мМ до 100 мМ или от приблизительно 95 мМ до 100 мМ.

пункт 246. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно от 0,01 мМ до 50 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 50 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 50 мМ, приблизительно от 1 мМ до 50 мМ, приблизительно от 2 мМ до 50 мМ, приблизительно от 3 мМ до 50 мМ, приблизительно от 4 мМ до 50 мМ, приблизительно от 5 мМ до 50 мМ, приблизительно от 6 мМ до 50 мМ, приблизительно от 7 мМ до 50 мМ, приблизительно от 8 мМ до 50 мМ, приблизительно от 9 мМ до 50 мМ, приблизительно от 10 мМ до 50 мМ, приблизительно от 11 мМ до 50 мМ, приблизительно от 12 мМ до 50 мМ, приблизительно от 13 мМ до 50 мМ, приблизительно от 14 мМ до 50 мМ, приблизительно от 15 мМ до 50 мМ, приблизительно от 16 мМ до 50 мМ, приблизительно от 17 мМ до 50 мМ, приблизительно от 18 мМ до 50 мМ, приблизительно от 19 мМ до 50 мМ, приблизительно от 20 мМ до 50 мМ, приблизительно от 25 мМ до 50 мМ, приблизительно от 30 мМ до 50 мМ, приблизительно от 35 мМ до 50 мМ, приблизительно от 40 мМ до 50 мМ или приблизительно от 45 мМ до 50 мМ.

пункт 247. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно от 0,01 мМ до 25 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 25 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 25 мМ, приблизительно от 1 мМ до 25 мМ, приблизительно от 2 мМ до 25 мМ, приблизительно от 3 мМ до 25 мМ, приблизительно от 4 мМ до 25 мМ, приблизительно от 5 мМ до 25 мМ, приблизительно от 6 мМ до 25 мМ, приблизительно от 7 мМ до 25 мМ, приблизительно от 8 мМ до 25 мМ, приблизительно от 9 мМ до 25 мМ, приблизительно от 10 мМ до 25 мМ, приблизительно от 11 мМ до 25 мМ, приблизительно от 12 мМ до 25 мМ, приблизительно от 13 мМ до 25 мМ, приблизительно от 14 мМ до 25 мМ, приблизительно от 15 мМ до 25 мМ, приблизительно от 16 мМ до 25 мМ, приблизительно от 17 мМ до 25 мМ, приблизительно от 18 мМ до 25 мМ, приблизительно от 19 мМ до 25 мМ или приблизительно от 20 мМ до 25 мМ.

пункт 248. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 0,01 мМ до 15 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 15 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 15 мМ, приблизительно от 1 мМ до 15 мМ, приблизительно от 2 мМ до 15 мМ, приблизительно от 3 мМ до 15 мМ, приблизительно от 4 мМ до 15 мМ, приблизительно от 5 мМ до 15 мМ, приблизительно от 6 мМ до 15 мМ, приблизительно от 7 мМ до 15 мМ, приблизительно от 8 мМ до 15 мМ, приблизительно от 9 мМ до 15 мМ, приблизительно от 10 мМ до 15 мМ, приблизительно от 11 мМ до 15 мМ, приблизительно от 12 мМ до 15 мМ, приблизительно от 13 мМ до 15 мМ или приблизительно от 14 мМ до 15 мМ.

пункт 249. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно от 0,01 мМ до 10 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 10 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 10 мМ, приблизительно от 1 мМ до 10 мМ, приблизительно от 2 мМ до 10 мМ, приблизительно от 3 мМ до 10 мМ, приблизительно от 4 мМ до 10 мМ, приблизительно от 5 мМ до 10 мМ, приблизительно от 6 мМ до 10 мМ, приблизительно от 7 мМ до 10 мМ, приблизительно от 8 мМ до 10 мМ или приблизительно от 9 мМ до 10 мМ.

пункт 250. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,01 мМ, приблизительно 0,05 мМ, приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 0,3 мМ, приблизительно 0,4 мМ, приблизительно 0,5 мМ, приблизительно 0,6 мМ, приблизительно 0,7 мМ, приблизительно 0,8 мМ, приблизительно 0,9 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 или приблизительно 100 мМ.

пункт 251. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ или приблизительно 50 мМ.

пункт 252. Способ по любому из пунктов 233-244, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 10 мМ.

пункт 253. Способ по любому из пунктов 233-252, где раствор для замены включает хелатообразователь.

пункт 254. Способ по любому из пунктов 233-252, где раствор для замены включает хелатообразователь на основе квасцов.

пункт 255. Способ по любому из пунктов 233-252, где раствор для замены включает хелатообразователь, выбранный из групп, состоящих из этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин-N,N',N'-триуксусной кислоты (ЭДТА-ОН), гидроксиэтилендиаминтриуксусной кислоты (ГЭДТА), этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1,2-циклогександиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (CyDTA), диэтилентриамин-N,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты (DTPA), 1,3-диаминопропан-2-ол-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (DPTA-OH), этилендиамин-N,N'-бис(2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA), этилендиамин-N,N'-дипропионовой кислоты дигидрохлорид (EDDP), этилендиамин-тетракис(метиленсульфоновой кислоты) (EDTPO), нитрилотрис(метиленфосфоновой кислоты) (NTPO), иминодиуксусной кислоты (IDA), гидроксииминодиуксусной кислоты (HIDA), нитрилотриуксусной кислоты (NTP), триэтилентетрамингексауксусной кислоты (TTHA), димеркаптоянтарной кислоты (DMSA), 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновой кислоты (DMPS), альфа-липоевой кислоты (ALA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), тиаминтетрагидрофурфурил-дисульфида (TTFD), димеркапрола, пеницилламина, дефероксамина (DFOA), деферасирокса, фосфонатов, соли лимонной кислоты (цитрата) и их комбинации.

пункт 256. Способ по любому из пунктов 233-255, где раствор для замены включает хелатообразователь, выбранный из групп, состоящих из этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин-N,N',N'-триуксусной кислоты (ЭДТА-ОН), гидроксиэтилендиаминтриуксусной кислоты (ГЭДТА), этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1,2-циклогександиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (CyDTA), диэтилентриамин-N,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты (DTPA), 1,3-диаминопропан-2-ол-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (DPTA-OH), этилендиамин-N,N'-бис(2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA), соли лимонной кислоты (цитрата) и их комбинаций.

пункт 257. Способ по любому из пунктов 233-254, где раствор для замены включает этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) в качестве хелатообразователя.

пункт 258. Способ по любому из пунктов 233-254, где раствор для замены включает соль лимонной кислоты (цитрат) в качестве хелатообразователя.

пункт 259. Способ по любому из пунктов 233-254, где раствор для замены включает цитрат натрия в качестве хелатообразователя.

пункт 260. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 1 до 500 мМ.

пункт 261. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 2 до 400 мМ.

пункт 262. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 400 мМ.

пункт 263. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 200 мМ.

пункт 264. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 100 мМ.

пункт 265. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 50 мМ.

пункт 266. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 30 мМ.

пункт 267. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 0,01 мМ, приблизительно 0,05 мМ, приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 0,3 мМ, приблизительно 0,4 мМ, приблизительно 0,5 мМ, приблизительно 0,6 мМ, приблизительно 0,7 мМ, приблизительно 0,8 мМ, приблизительно 0,9 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 21 мМ, приблизительно 22 мМ, приблизительно 23 мМ, приблизительно 24 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 26 мМ, приблизительно 27 мМ, приблизительно 28 мМ, приблизительно 29 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 31 мМ, приблизительно 32 мМ, приблизительно 33 мМ, приблизительно 34 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 36 мМ, приблизительно 37 мМ, приблизительно 38 мМ, приблизительно 39 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 или приблизительно 100 мМ.

пункт 268. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 мМ или приблизительно 100 мМ.

пункт 269. Способ по любому из пунктов 253-258, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ или приблизительно 50 мМ.

пункт 270. Способ по любому из пунктов 233-269, где раствор для замены включает соль.

пункт 271. Способ по пункту 270, где соль выбрана из групп, состоящих из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации.

пункт 272. Способ по пункту 270, где солью является хлорид натрия.

пункт 273. Способ по любому из пунктов 270-272, где раствор для замены включает хлорид натрия в концентрации приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 250 или приблизительно 300 мМ.

пункт 274. Способ по любому из пунктов 227-273, где количество диаобъемов составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50.

пункт 275. Способ по любому из пунктов 227-273, где количество диаобъемов составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95 или приблизительно 100.

пункт 276. Способ по любому из пунктов 227-273, где количество диаобъемов составляет приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15.

пункт 277. Способ по любому из пунктов 227-276, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C.

пункт 278. Способ по любому из пунктов 227-276, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 279. Способ по любому из пунктов 227-276, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 280. Способ по любому из пунктов 227-276, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 281. Способ по любому из пунктов 204-277, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C.

пункт 282. Способ по любому из пунктов 204-277, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 283. Способ по любому из пунктов 204-277, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 284. Способ по любому из пунктов 204-277, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре приблизительно 50°C.

пункт 285. Способ по любому из пунктов 1-284, где раствор, содержащий полисахарид (например, супернатант, фильтрат или концентрат), обрабатывают в стадии фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 286. Способ по любому из пунктов 285, где активированный уголь добавляют в форме порошка, в виде слоя гранулированного угля, в виде спрессованного угольного блока или формованного угольного блока (см., например, активированный уголь Norit).

пункт 287. Способ по пункту 286, где активированный уголь добавляют в количестве приблизительно 0,1-20% (в/об), 1-15% (в/об), 1-10% (в/об), 2-10% (в/об), 3-10% (в/об), 4-10% (в/об), 5-10% (в/об), 1-5% (в/об) или 2-5% (в/об).

пункт 288. Способ по любому из пунктов 286-287, где смесь перемешивают и оставляют стоять.

пункт 289. Способ по любому из пунктов 286-287, где смесь перемешивают и оставляют стоять на приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 45, приблизительно 60, приблизительно 90, приблизительно 120, приблизительно 180, приблизительно 240 минут или больше.

пункт 290. Способ по любому из пунктов 286-289, где активированный уголь затем удаляют.

пункт 291. Способ по любому из пунктов 286-290, где активированный уголь удаляют с помощью центрифугирования или фильтрации.

пункт 292. Способ по пункту 285, где раствор фильтруют через активированный уголь, иммобилизованный в матрице.

пункт 293. Способ по пункту 285, где указанная матрица представляет собой пористый фильтрующий материал, проницаемый для раствора.

пункт 294. Способ по любому из пунктов 292-293, где указанная матрица включает материал-носитель.

пункт 295. Способ по любому из пунктов 292-293, где указанная матрица включает связующий материал.

пункт 296. Способ по любому из пунктов 294-295, где указанный материал-носитель является синтетическим полимером.

пункт 297. Способ по любому из пунктов 294-295, где указанный материал-носитель является полимером природного происхождения.

пункт 298. Способ по пункту 296, где указанные синтетические полимеры включают любое из полистирола, полиакриламида или полиметилметакрилата.

пункт 299. Способ по пункту 296, где указанные синтетические полимеры выбраны из группы, состоящей из полистирола, полиакриламида и полиметилметакрилата.

пункт 300. Способ по пункту 297, где указанный полимер природного происхождения включает любое из целлюлозы, полисахарида, декстрана или агарозы.

пункт 301. Способ по пункту 297, где указанный полимер природного происхождения выбран из группы, состоящей из целлюлозы, полисахарида, декстрана и агарозы.

пункт 302. Способ по любому из пунктов 294-301, где указанный полимерный материал-носитель, если такой присутствует, имеет форму сети волокон для обеспечения механической жесткость.

пункт 303. Способ по любому из пунктов 294-302, где указанный связующий материал, если такой присутствует, является смолой.

пункт 304. Способ по любому из пунктов 292-303, где указанная матрица имеет форму мембранного листа.

пункт 305. Способ по любому из пунктов 292-304, где активированный уголь, иммобилизованный в матрице, имеет форму проточного угольного картриджа.

пункт 306. Способ по любому из пунктов 304, где мембранный лист намотан по спирали.

пункт 307. Способ по любому из пунктов 292-306, где несколько дисков уложены друг на друга.

пункт 308. Способ по пункту 307, где уложенные диски имеют линзобразную конфигурацию.

пункт 309. Способ по любому из пунктов 292-308, где активированный уголь в угольном фильтре получен из торфа, бурого угля, древесины или скорлупы кокосового ореха.

пункт 310. Способ по любому из пунктов 292-309, где активированный уголь, иммобилизованный в матрице, помещен в корпус с формированием независимого фильтрующего элемента.

пункт 311. Способ по любому из пунктов 292-310, где фильтры с активированным углем включают целлюлозную матрицу, в которой заключен порошок активированного угля и связан смолой на месте.

пункт 312. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-100 микрон, приблизительно 0,05-100 микрон, приблизительно 0,1-100 микрон, приблизительно 0,2-100 микрон, приблизительно 0,3-100 микрон, приблизительно 0,4-100 микрон, приблизительно 0,5-100 микрон, приблизительно 0,6-100 микрон, приблизительно 0,7-100 микрон, приблизительно 0,8-100 микрон, приблизительно 0,9-100 микрон, приблизительно 1-100 микрон, приблизительно 1,25-100 микрон, приблизительно 1,5-100 микрон, приблизительно 1,75-100 микрон, приблизительно 2-100 микрон, приблизительно 3-100 микрон, приблизительно 4-100 микрон, приблизительно 5-100 микрон, приблизительно 6-100 микрон, приблизительно 7-100 микрон, приблизительно 8-100 микрон, приблизительно 9-100 микрон, приблизительно 10-100 микрон, приблизительно 15-100 микрон, приблизительно 20-100 микрон, приблизительно 25-100 микрон, приблизительно 30-100 микрон, приблизительно 40-100 микрон, приблизительно 50-100 микрон или приблизительно 75-100 микрон.

пункт 313. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-50 микрон, приблизительно 0,05-50 микрон, приблизительно 0,1-50 микрон, приблизительно 0,2-50 микрон, приблизительно 0,3-50 микрон, приблизительно 0,4-50 микрон, приблизительно 0,5-50 микрон, приблизительно 0,6-50 микрон, приблизительно 0,7-50 микрон, приблизительно 0,8-50 микрон, приблизительно 0,9-50 микрон, приблизительно 1-50 микрон, приблизительно 1,25-50 микрон, приблизительно 1,5-50 микрон, приблизительно 1,75-50 микрон, приблизительно 2-50 микрон, приблизительно 3-50 микрон, приблизительно 4-50 микрон, приблизительно 5-50 микрон, приблизительно 6-50 микрон, приблизительно 7-50 микрон, приблизительно 8-50 микрон, приблизительно 9-50 микрон, приблизительно 10-50 микрон, приблизительно 15-50 микрон, приблизительно 20-50 микрон, приблизительно 25-50 микрон, приблизительно 30-50 микрон, приблизительно 40-50 микрон или приблизительно 50-50 микрон.

пункт 314. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-25 микрон, приблизительно 0,05-25 микрон, приблизительно 0,1-25 микрон, приблизительно 0,2-25 микрон, приблизительно 0,3-25 микрон, приблизительно 0,4-25 микрон, приблизительно 0,5-25 микрон, приблизительно 0,6-25 микрон, приблизительно 0,7-25 микрон, приблизительно 0,8-25 микрон, приблизительно 0,9-25 микрон, приблизительно 1-25 микрон, приблизительно 1,25-25 микрон, приблизительно 1,5-25 микрон, приблизительно 1,75-25 микрон, приблизительно 2-25 микрон, приблизительно 3-25 микрон, приблизительно 4-25 микрон, приблизительно 5-25 микрон, приблизительно 6-25 микрон, приблизительно 7-25 микрон, приблизительно 8-25 микрон, приблизительно 9-25 микрон, приблизительно 10-25 микрон, приблизительно 15-25 микрон или приблизительно 20-25 микрон.

пункт 315. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-10 микрон, приблизительно 0,05-10 микрон, приблизительно 0,1-10 микрон, приблизительно 0,2-10 микрон, приблизительно 0,3-10 микрон, приблизительно 0,4-10 микрон, приблизительно 0,5-10 микрон, приблизительно 0,6-10 микрон, приблизительно 0,7-10 микрон, приблизительно 0,8-10 микрон, приблизительно 0,9-10 микрон, приблизительно 1-10 микрон, приблизительно 1,25-10 микрон, приблизительно 1,5-10 микрон, приблизительно 1,75-10 микрон, приблизительно 2-10 микрон, приблизительно 3-10 микрон, приблизительно 4-10 микрон, приблизительно 5-10 микрон, приблизительно 6-10 микрон, приблизительно 7-10 микрон, приблизительно 8-10 микрон или приблизительно 9-10 микрон.

пункт 316. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-8 микрон, приблизительно 0,05-8 микрон, приблизительно 0,1-8 микрон, приблизительно 0,2-8 микрон, приблизительно 0,3-8 микрон, приблизительно 0,4-8 микрон, приблизительно 0,5-8 микрон, приблизительно 0,6-8 микрон, приблизительно 0,7-8 микрон, приблизительно 0,8-8 микрон, приблизительно 0,9-8 микрон, приблизительно 1-8 микрон, приблизительно 1,25-8 микрон, приблизительно 1,5-8 микрон, приблизительно 1,75-8 микрон, приблизительно 2-8 микрон, приблизительно 3-8 микрон, приблизительно 4-8 микрон, приблизительно 5-8 микрон, приблизительно 6-8 микрон или приблизительно 7-8 микрон.

пункт 317. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-5 микрон, приблизительно 0,05-5 микрон, приблизительно 0,1-5 микрон, приблизительно 0,2-5 микрон, приблизительно 0,3-5 микрон, приблизительно 0,4-5 микрон, приблизительно 0,5-5 микрон, приблизительно 0,6-5 микрон, приблизительно 0,7-5 микрон, приблизительно 0,8-5 микрон, приблизительно 0,9-5 микрон, приблизительно 1-5 микрон, приблизительно 1,25-5 микрон, приблизительно 1,5-5 микрон, приблизительно 1,75-5 микрон, приблизительно 2-5 микрон, приблизительно 3-5 микрон или приблизительно 4-5 микрон.

пункт 318. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-2 микрона, приблизительно 0,05-2 микрона, приблизительно 0,1-2 микрона, приблизительно 0,2-2 микрона, приблизительно 0,3-2 микрона, приблизительно 0,4-2 микрона, приблизительно 0,5-2 микрона, приблизительно 0,6-2 микрона, приблизительно 0,7-2 микрона, приблизительно 0,8-2 микрона, приблизительно 0,9-2 микрона, приблизительно 1-2 микрона, приблизительно 1,25-2 микрона, приблизительно 1,5-2 микрона, приблизительно 1,75-2 микрона, приблизительно 2-2 микрона, приблизительно 3-2 микрона или приблизительно 4-2 микрона.

пункт 319. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,01-1 микрон, приблизительно 0,05-1 микрон, приблизительно 0,1-1 микрон, приблизительно 0,2-1 микрон, приблизительно 0,3-1 микрон, приблизительно 0,4-1 микрон, приблизительно 0,5-1 микрон, приблизительно 0,6-1 микрон, приблизительно 0,7-1 микрон, приблизительно 0,8-1 микрон или приблизительно 0,9-1 микрон.

пункт 320. Способ по любому из пунктов 285-311, где фильтр с активированным углем имеет номинальный размер пор в микронах в пределах приблизительно 0,05-50 микрон, 0,1-25 микрон, 0,2-10 микрон, 0,1-10 микрон, 0,2-5 микрон или 0,25-1 микрон.

пункт 321. Способ по любому из пунктов 285-320, где фильтр с активированным углем работает при скорости подачи в пределах 1-500 лмч, 10-500 лмч, 15-500 лмч, 20-500 лмч, 25-500 лмч, 30-500 лмч, 40-500 лмч, 50-500 лмч, 100-500 лмч, 125-500 лмч, 150-500 лмч, 200-500 лмч, 250-500 лмч, 300-500 лмч или 400-500 лмч.

пункт 322. Способ по любому из пунктов 285-320, где фильтр с активированным углем работает при скорости подачи в пределах 1-200 лмч, 10-200 лмч, 15-200 лмч, 20-200 лмч, 25-200 лмч, 30-200 лмч, 40-200 лмч, 50-200 лмч, 100-200 лмч, 125-200 лмч или 150-200 лмч.

пункт 323. Способ по любому из пунктов 285-320, где фильтр с активированным углем работает при скорости подачи в пределах 1-150 лмч, 10-150 лмч, 15-150 лмч, 20-150 лмч, 25-150 лмч, 30-150 лмч, 40-150 лмч, 50-150 лмч, 100-150 лмч или 125-150 лмч.

пункт 324. Способ по любому из пунктов 285-320, где фильтр с активированным углем работает при скорости подачи в пределах 1-100 лмч, 10-100 лмч, 15-100 лмч, 20-100 лмч, 25-100 лмч, 30-100 лмч, 40-100 лмч или 50-100 лмч.

пункт 325. Способ по любому из пунктов 285-320, где фильтр с активированным углем работает при скорости подачи в пределах 1-75 лмч, 5-75 лмч, 10-75 лмч, 15-75 лмч, 20-75 лмч, 25-75 лмч, 30-75 лмч, 35-75 лмч, 40-75 лмч, 45-75 лмч, 50-75 лмч, 55-75 лмч, 60-75 лмч, 65-75 лмч или 70-75 лмч.

пункт 326. Способ по любому из пунктов 285-320, где фильтр с активированным углем работает при скорости подачи в пределах 1-50 лмч, 5-50 лмч, 7-50 лмч, 10-50 лмч, 15-50 лмч, 20-50 лмч, 25-50 лмч, 30-50 лмч, 35-50 лмч, 40-50 лмч или 45-50 лмч.

пункт 327. Способ по любому из пунктов 285-320, где фильтр с активированным углем работает при скорости подачи в пределах приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 225, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 950 или приблизительно 1000 лмч.

пункт 328. Способ по любому из пунктов 285-327, где раствор обрабатывают фильтром с активированным углем, где фильтр имеет производительность в пределах 5-1000 л/м², 10-750 л/м², 15-500 л/м², 20-400 л/м², 25-300 л/м², 30-250 л/м², 40-200 л/м² или 30-100 л/м².

пункт 329. Способ по любому из пунктов 285-327, где раствор обрабатывают фильтром с активированным углем, где фильтр имеет производительность приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 175, приблизительно 200, приблизительно 225, приблизительно 250, приблизительно 275, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900 или приблизительно 1000 л/м².

пункт 330. Способ по любому из пунктов 285-329, где выполняют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 стадий фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 331. Способ по любому из пунктов 285-329, где выполняют 1, 2 или 3 стадии фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 332. Способ по любому из пунктов 285-329, где выполняют 1 или 2 стадии фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 333. Способ по любому из пунктов 285-332, где раствор обрабатывают фильтрами с активированным углем, расположенными последовательно.

пункт 334. Способ по любому из пунктов 285-332, где раствор обрабатывают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фильтрами с активированным углем, расположенными последовательно.

пункт 335. Способ по любому из пунктов 285-332, где раствор обрабатывают 2, 3, 4 или 5 фильтрами с активированным углем, расположенными последовательно.

пункт 336. Способ по любому из пунктов 285-332, где раствор обрабатывают 2 фильтрами с активированным углем, расположенными последовательно.

пункт 337. Способ по любому из пунктов 285-332, где раствор обрабатывают 3 фильтрами с активированным углем, расположенными последовательно.

пункт 338. Способ по любому из пунктов 285-332, где раствор обрабатывают 4 фильтрами активированного угля последовательно.

пункт 339. Способ по любому из пунктов 285-332, где раствор обрабатывают 5 фильтрами с активированным углем, расположенными последовательно.

пункт 340. Способ по любому из пунктов 285-339, где стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят в однопоточном режиме.

пункт 341. Способ по любому из пунктов 285-339, где стадию фильтрации с использованием активированного угля проводят в режиме рециркуляции.

пункт 342. Способ по пункту 341, где выполняют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 циклов фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 343. Способ по пункту 341, где выполняют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 циклов фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 344. Способ по пункту 341, где выполняют 2 или 3 цикла фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 345. Способ по пункту 341, где выполняют 2 цикла фильтрации с использованием активированного угля.

пункт 346. Способ по любому из пунктов 285-345, где фильтрат дополнительно фильтруют.

пункт 347. Способ по любому из пунктов 285-345, где фильтрат подвергают микрофильтрации.

пункт 348. Способ по пункту 347, где указанная микрофильтрация является тупиковой фильтрацией (перпендикулярной фильтрацией).

пункт 349. Способ по пункту 347, где указанная микрофильтрация является тангенциальной микрофильтрацией.

пункт 350. Способ по любому из пунктов 347-349, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-2 микрон, приблизительно 0,05-2 микрон, приблизительно 0,1-2 микрон, приблизительно 0,2-2 микрон, приблизительно 0,3-2 микрон, приблизительно 0,4-2 микрон, приблизительно 0,45-2 микрон, приблизительно 0,5-2 микрон, приблизительно 0,6-2 микрон, приблизительно 0,7-2 микрон, приблизительно 0,8-2 микрон, приблизительно 0,9-2 микрон, приблизительно 1-2 микрон, приблизительно 1,25-2 микрон, приблизительно 1,5-2 микрон или приблизительно 1,75-2 микрон.

пункт 351. Способ по любому из пунктов 347-349, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-1 микрона, приблизительно 0,05-1 микрона, приблизительно 0,1-1 микрона, приблизительно 0,2-1 микрона, приблизительно 0,3-1 микрона, приблизительно 0,4-1 микрона, приблизительно 0,45-1 микрона, приблизительно 0,5-1 микрона, приблизительно 0,6-1 микрона, приблизительно 0,7-1 микрона, приблизительно 0,8-1 микрона или приблизительно 0,9-1 микрона.

пункт 352. Способ по любому из пунктов 347-349, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,45, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9 или приблизительно 2,0 микрона.

пункт 353. Способ по любому из пунктов 343-345, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,2 микрона.

пункт 354. Способ по любому из пунктов 347-353, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-6000 л/м², 200-6000 л/м², 300-6000 л/м², 400-6000 л/м², 500-6000 л/м², 750-6000 л/м², 1000-6000 л/м², 1500-6000 л/м², 2000-6000 л/м², 3000-6000 л/м² или 4000-6000 л/м².

пункт 355. Способ по любому из пунктов 347-353, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-4000 л/м², 200-4000 л/м², 300-4000 л/м², 400-4000 л/м², 500-4000 л/м², 750-4000 л/м², 1000-4000 л/м², 1500-4000 л/м², 2000-4000 л/м², 2500-4000 л/м², 3000-4000 л/м², 3000-4000 л/м² или 3500-4000 л/м².

пункт 356. Способ по любому из пунктов 347-353, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-3750 л/м², 200-3750 л/м², 300-3750 л/м², 400-3750 л/м², 500-3750 л/м², 750-3750 л/м², 1000-3750 л/м², 1500-3750 л/м², 2000-3750 л/м², 2500-3750 л/м², 3000-3750 л/м², 3000-3750 л/м² или 3500-3750 л/м².

пункт 357. Способ по любому из пунктов 347-353, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет производительность 100-1250 л/м², 200-1250 л/м², 300-1250 л/м², 400-1250 л/м², 500-1250 л/м², 750-1250 л/м² или 1000-1250 л/м².

пункт 358. Способ по любому из пунктов 347-353, где указанный микрофильтрационный фильтр имеет производительность приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400, приблизительно 1500, приблизительно 1600, приблизительно 1700, приблизительно 1800, приблизительно 1900, приблизительно 2000, приблизительно 2100, приблизительно 2200, приблизительно 2300, приблизительно 2400, приблизительно 2500, приблизительно 2600, приблизительно 2700, приблизительно 2800, приблизительно 2900, приблизительно 3000, приблизительно 3100, приблизительно 3200, приблизительно 3300, приблизительно 3400, приблизительно 3500, приблизительно 3600, приблизительно 3700, приблизительно 3800, приблизительно 3900, приблизительно 4000, приблизительно 4100, приблизительно 4200, приблизительно 4300, приблизительно 4400, приблизительно 4500, приблизительно 4600, приблизительно 4700, приблизительно 4800, приблизительно 4900, приблизительно 5000, приблизительно 5250, приблизительно 5500, приблизительно 5750 или приблизительно 6000 л/м².

пункт 359. Способ по любому из пунктов 1-358, где содержащий полисахарид раствор или фильтрат дополнительно очищают с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия.

пункт 360. Способ по пункту 359, где хроматографию гидрофобного взаимодействия проводят с использованием гидрофобного адсорбента, выбранного из группы, состоящей из фенилзамещенной мембраны, бутилагарозы, фенилагарозы, октилагарозы, смолы бутилорганического полимера, смолы фенилорганического полимера, смолы эфирного органического полимера, смолы полипропиленгликоль органического полимера и смолы гексилорганического полимера.

пункт 361. Способ по пункту 360, где хроматографию гидрофобного взаимодействия проводят с использованием фенилзамещенной мембраны.

пункт 362. Способ по пункту 361, где хроматографию гидрофобного взаимодействия проводят с использованием фенилзамещенной мембраны Sartobind® или мембраны Cytiva® Phenyl Adsorber.

пункт 363. Способ по любому из пунктов 359-362, где содержащий полисахарид раствор или фильтрат обрабатывают уравновешивающим буфером, включающим соль, с получением подвижного буфера с концентрацией соли, выбранной из приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9, приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9, приблизительно 6,0, приблизительно 6,1, приблизительно 6,2, приблизительно 6,3, приблизительно 6,4, приблизительно 6,5, приблизительно 6,6, приблизительно 6,7, приблизительно 6,8, приблизительно 6,9 или приблизительно 7,0М.

пункт 364. Способ по пункту 363, где pH подвижного буфера составляет от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0.

пункт 365. Способ по пункту 364, где pH подвижного буфера составляет приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9, приблизительно 6,0, приблизительно 6,1, приблизительно 6,2, приблизительно 6,3, приблизительно 6,4, приблизительно 6,5, приблизительно 6,6, приблизительно 6,7, приблизительно 6,8, приблизительно 6,9, приблизительно 7,0, приблизительно 7,1, приблизительно 7,2, приблизительно 7,3, приблизительно 7,4, приблизительно 7,5, приблизительно 7,6, приблизительно 7,7, приблизительно 7,8, приблизительно 7,9 или приблизительно 8,0.

пункт 366. Способ по пункту 363-365, где соль выбрана из сульфата аммония, фосфата натрия, фосфата калия, сульфата натрия, цитрата натрия или хлорида натрия.

пункт 367. Способ по пункту 363, где подвижный буфер включает сульфат аммония в концентрации, составляющей от приблизительно 0,5М до приблизительно 3,0М при pH 6,0±2,0.

пункт 368. Способ по пункту 367, где подвижный буфер включает сульфат аммония в концентрации, составляющей приблизительно от 1,0М до 2,0М при pH приблизительно 6,0.

пункт 369. Способ по пункту 363, где подвижный буфер включает фосфат натрия в концентрации, составляющей от приблизительно 0,5М до приблизительно 3,0М при pH 7,0±1,5.

пункт 370. Способ по пункту 363, где подвижный буфер включает фосфат калия в концентрации, составляющей от приблизительно 0.5М до приблизительно 3,0М при pH 7,0±1,5.

пункт 371. Способ по пункту 363, где подвижный буфер включает сульфат натрия в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1М до приблизительно 0,75М при pH 6,0±2,0.

пункт 372. Способ по пункту 363, где подвижный буфер включает цитрат натрия в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1М до приблизительно 1,5М при pH 6,0±2,0.

пункт 373. Способ по пункту 363, где подвижный буфер включает хлорид натрия в концентрации, составляющей от приблизительно 0,5М до приблизительно 5,0М при pH 7,0±1,5.

пункт 374. Способ по любому из пунктов 363-373, где гидрофобный адсорбент уравновешивают подвижным буфером.

пункт 375. Способ по любому из пунктов 360-374, где гидрофобный адсорбент представляет собой фенилзамещенную мембрану, а скорость потока составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 объемов мембраны в минуту, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 объемов мембраны в минуту, от приблизительно 0,2 до приблизительно 10 объемов мембраны в минуту, от приблизительно 0,2 до приблизительно 5 объемов мембраны в минуту или от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 объема мембранным в минуту.

пункт 376. Способ по пункту 375, где скорость потока составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0 объема мембраны в минуту.

пункт 377. Способ по пункту 376, где скорость потока составляет приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9 или приблизительно 1,0 объема мембраны в минуту.

пункт 378. Способ по любому из пунктов 363-375, где гидрофобный адсорбент промывают подвижным буфером.

пункт 379. Способ по любому из пунктов 285-378, где фильтрат дополнительно осветляют с помощью ультрафильтрации и/или диафильтрации.

пункт 380. Способ по любому из пунктов 285-378, где фильтрат дополнительно осветляют с помощью ультрафильтрации.

пункт 381. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 1000 кДа.

пункт 382. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 750 кДа.

пункт 383. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 500 кДа.

пункт 384. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 300 кДа.

пункт 385. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 100 кДа.

пункт 386. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 50 кДа.

пункт 387. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 10 кДа до 30 кДа.

пункт 388. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 10 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 20 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 30 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 40 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 50 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 75 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 100 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 150 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 200 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 300 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 400 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 500 кДа до 1000 кДа или приблизительно от 750 кДа до 1000 кДа.

пункт 389. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 500 кДа, приблизительно от 10 кДа до 500 кДа, приблизительно от 20 кДа до 500 кДа, приблизительно от 30 кДа до 500 кДа, приблизительно от 40 кДа до 500 кДа, приблизительно от 50 кДа до 500 кДа, приблизительно от 75 кДа до 500 кДа, приблизительно от 100 кДа до 500 кДа, приблизительно от 150 кДа до 500 кДа, приблизительно от 200 кДа до 500 кДа, приблизительно от 300 кДа до 500 кДа или приблизительно от 400 кДа до 500 кДа.

пункт 390. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 300 кДа, приблизительно от 10 кДа до 300 кДа, приблизительно от 20 кДа до 300 кДа, приблизительно от 30 кДа до 300 кДа, приблизительно от 40 кДа до 300 кДа, приблизительно от 50 кДа до 300 кДа, приблизительно от 75 кДа до 300 кДа, приблизительно от 100 кДа до 300 кДа, приблизительно от 150 кДа до 300 кДа или приблизительно от 200 кДа до 300 кДа.

пункт 391. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны составляет в пределах приблизительно от 5 кДа до 100 кДа, приблизительно от 10 кДа до 100 кДа, приблизительно от 20 кДа до 100 кДа, приблизительно от 30 кДа до 100 кДа, приблизительно от 40 кДа до 100 кДа, приблизительно от 50 кДа до 100 кДа или приблизительно от 75 кДа до 100 кДа.

пункт 392. Способы по пунктам 379 или 380, где отсечение по молекулярной массе указанной ультрафильтрационной мембраны, составляет приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 50 кДа, приблизительно 60 кДа, приблизительно 70 кДа, приблизительно 80 кДа, приблизительно 90 кДа, приблизительно 100 кДа, приблизительно 110 кДа, приблизительно 120 кДа, приблизительно 130 кДа, приблизительно 140 кДа, приблизительно 150 кДа, приблизительно 200 кДа, приблизительно 250 кДа, приблизительно 300 кДа, приблизительно 400 кДа, приблизительно 500 кДа, приблизительно 750 кДа или приблизительно 1000 кДа.

пункт 393. Способы по любому из пунктов 379-381, где коэффициент концентрирования указанного стадии ультрафильтрации, от приблизительно 1,5 до приблизительно 10,0.

пункт 394. Способы по любому из пунктов 379-381, где коэффициент концентрирования указанного стадии ультрафильтрации, от приблизительно 2,0 до приблизительно 8,0.

пункт 395. Способы по любому из пунктов 379-381, где коэффициент концентрирования указанного стадии ультрафильтрации, от приблизительно 2,0 до приблизительно 5,0.

пункт 396. Способы по любому из пунктов 379-381, где коэффициент концентрирования указанной стадии ультрафильтрации составляет приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5 или приблизительно 10,0. В варианте осуществления коэффициент концентрирования составляет приблизительно 2,0, приблизительно 3,0, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0 или приблизительно 6,0.

пункт 397. Способ по любому из пунктов 379-396, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C.

пункт 398. Способ по любому из пунктов 379-396, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 399. Способ по любому из пунктов 379-396, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 400. Способ по любому из пунктов 379-396, где указанную стадию ультрафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 401. Способ по любому из пунктов, 379-396, где фильтрат после ультрафильтрации обрабатывают с помощью диафильтрации.

пункт 402. Способ по пункту 401, где раствором для замены является вода.

пункт 403. Способ по пункту 401, где раствором для замены является солевой раствор в воде.

пункт 404. Способ по пункту 403, где соль выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации.

пункт 405. Способ по пункту 403, где солью является хлорид натрия.

пункт 406. Способ по пункту 403, где раствор для замены является хлоридом натрия в концентрации приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 110 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 140 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 160 мМ, приблизительно 170 мМ, приблизительно 180 мМ, приблизительно 190 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 300 мМ, приблизительно 350 мМ, приблизительно 400 мМ, приблизительно 450 мМ или приблизительно 500 мМ.

пункт 407. Способ по пункту 401, где раствором для замены является буферный раствор.

пункт 408. Способ по пункту 401, где раствором для замены является буферный раствор, где буфер выбран из группы, состоящей из N-(2-ацетамидо)аминоэтансульфоновой кислоты (ACES), соли уксусной кислоты (ацетата), N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты (ADA), 2-аминоэтансульфоновой кислоты (AES, таурина), аммиака, 2-амино-2-метил-1-пропанола (AMP), 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола AMPD, аммедиола, N-(1,1-диметил-2-гидроксиэтил)-3-амино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (AMPSO), N, N-бис-(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES), гидрокарбоната (бикарбоната) натрия, N,N'-бис(2-гидроксиэтил)-глицина (бицина), [бис-(2-гидроксиэтил)-имино]-трис-(гидроксиметилметана) (бис-триса), 1,3-бис[трис(гидроксиметил)-метиламино]пропана (бис-трис-пропана), борной кислоты, диметиларсиновой кислоты (какодилата), 3-(циклогексиламино)-пропансульфоновой кислоты (CAPS), 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновой кислоты (CAPSO), карбоната натрия (карбоната), циклогексиламиноэтансульфоновой кислоты (CHES), соли лимонной кислоты (цитрата), 3-[N-бис(гидроксиэтил)амино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (DIPSO), соли муравьиной кислоты (формиата), глицина, глицилглицина, N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-этансульфоновой кислоты (HEPES), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-3-пропансульфоновой кислоты (HEPPS, EPPS), N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-2-гидроксипропан-сульфоновой кислоты (HEPPSO), имидазола, соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES), 3-(N-морфолино)-пропансульфоновой кислоты (MOPS), 3-(N-морфолино)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO), соли фосфорной кислоты (фосфата), пиперазин-N, N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES), пиперазин-N,N'-бис(2-гидроксипропансульфоновой кислоты) (POPSO), пиридина, соли янтарной кислоты (сукцината), 3-{[трис(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновой кислоты (TAPS), 3-[N-трис(гидроксиметил)-метиламино]-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (TAPSO), триэтаноламина (ТЭА), 2-[трис(гидроксиметил)метиламино]этансульфоновой кислоты (TES), N-[трис(гидроксиметил)метил]глицина (трицина) и трис(гидроксиметил)аминометана (триса).

пункт 409. Способ по пункту 401, где раствором для замены является буферный раствор, где буфер выбран из группы, состоящей из соли уксусной кислоты (ацетата), соли лимонной кислоты (цитрата), соли муравьиной кислоты (формиата), соли яблочной кислоты (малата), соли малеиновой кислоты (малеата), соли фосфорной кислоты (фосфата) и соли янтарной кислоты (сукцината).

пункт 410. Способ по пункту 401, где раствором для замены является буферный раствор, где буфером является соль лимонной кислоты (цитрат).

пункт 411. Способ по пункту 401, где раствором для замены является буферный раствор, где буфером является соль янтарной кислоты (сукцинат).

пункт 412. Способ по пункту 401, где раствором для замены является буферный раствор, где буфером является соль фосфорной кислоты (фосфат).

пункт 413. Способ по любому из пунктов 408-412, где указанной солью является натриевая соль.

пункт 414. Способ по любому из пунктов 408-412, где указанной солью является калиевая соль.

пункт 415. Способ по пункту 401, где раствором для замены является буферный раствор, где буфером является фосфат калия.

пункт 416. Способ по любому из пунктов 401-415, где pH диафильтрационного буфера составляет в пределах приблизительно 4,0-11,0, в пределах приблизительно 5,0-10,0, в пределах приблизительно 5,5-9,0, в пределах приблизительно 6,0-8,0, в пределах приблизительно 6,0-7,0, в пределах приблизительно 6,5-7,5, в пределах приблизительно 6,5-7,0 или в пределах приблизительно 6,0-7,5.

пункт 417. Способ по пункту 401-415, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0, приблизительно 10,5 или приблизительно 11,0.

пункт 418. Способ по любому из пунктов 401-415, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5 или приблизительно 9,0.

пункт 419. Способ по любому из пунктов 401-415, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,5, приблизительно 7,0 или приблизительно 7,5.

пункт 420. Способ по любому из пунктов 401-415, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,0.

пункт 421. Способ по любому из пунктов 401-415, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 6,5.

пункт 422. Способ по любому из пунктов 401-415, где pH диафильтрационного буфера составляет приблизительно 7,0

пункт 423. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 100 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 100 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 100 мМ, приблизительно от 1 мМ до 100 мМ, приблизительно от 2 мМ до 100 мМ, приблизительно от 3 мМ до 100 мМ, приблизительно от 4 мМ до 100 мМ, приблизительно от 5 мМ до 100 мМ, приблизительно от 6 мМ до 100 мМ, приблизительно от 7 мМ до 100 мМ, приблизительно от 8 мМ до 100 мМ, приблизительно от 9 мМ до 100 мМ, приблизительно от 10 мМ до 100 мМ, приблизительно от 11 мМ до 100 мМ, приблизительно от 12 мМ до 100 мМ, приблизительно от 13 мМ до 100 мМ, приблизительно от 14 мМ до 100 мМ, приблизительно от 15 мМ до 100 мМ, приблизительно от 16 мМ до 100 мМ, приблизительно от 17 мМ до 100 мМ, приблизительно от 18 мМ до 100 мМ, приблизительно от 19 мМ до 100 мМ, приблизительно от 20 мМ до 100 мМ, приблизительно от 25 мМ до 100 мМ, приблизительно от 30 мМ до 100 мМ, приблизительно от 35 мМ до 100 мМ, приблизительно от 40 мМ до 100 мМ, приблизительно от 45 мМ до 100 мМ, приблизительно от 50 мМ до 100 мМ, приблизительно от 55 мМ до 100 мМ, приблизительно от 60 мМ до 100 мМ, приблизительно от 65 мМ до 100 мМ, приблизительно от 70 мМ до 100 мМ, приблизительно от 75 мМ до 100 мМ, приблизительно от 80 мМ до 100 мМ, приблизительно от 85 мМ до 100 мМ, приблизительно от 90 мМ до 100 мМ или приблизительно от 95 мМ до 100 мМ.

пункт 424. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 50 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 50 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 50 мМ, приблизительно от 1 мМ до 50 мМ, приблизительно от 2 мМ до 50 мМ, приблизительно от 3 мМ до 50 мМ, приблизительно от 4 мМ до 50 мМ, приблизительно от 5 мМ до 50 мМ, приблизительно от 6 мМ до 50 мМ, приблизительно от 7 мМ до 50 мМ, приблизительно от 8 мМ до 50 мМ, приблизительно от 9 мМ до 50 мМ, приблизительно от 10 мМ до 50 мМ, приблизительно от 11 мМ до 50 мМ, приблизительно от 12 мМ до 50 мМ, приблизительно от 13 мМ до 50 мМ, приблизительно от 14 мМ до 50 мМ, приблизительно от 15 мМ до 50 мМ, приблизительно от 16 мМ до 50 мМ, приблизительно от 17 мМ до 50 мМ, приблизительно от 18 мМ до 50 мМ, приблизительно от 19 мМ до 50 мМ, приблизительно от 20 мМ до 50 мМ, приблизительно от 25 мМ до 50 мМ, приблизительно от 30 мМ до 50 мМ, приблизительно от 35 мМ до 50 мМ, приблизительно от 40 мМ до 50 мМ или приблизительно от 45 мМ до 50 мМ.

пункт 425. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 25 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 25 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 25 мМ, приблизительно от 1 мМ до 25 мМ, приблизительно от 2 мМ до 25 мМ, приблизительно от 3 мМ до 25 мМ, приблизительно от 4 мМ до 25 мМ, приблизительно от 5 мМ до 25 мМ, приблизительно от 6 мМ до 25 мМ, приблизительно от 7 мМ до 25 мМ, приблизительно от 8 мМ до 25 мМ, приблизительно от 9 мМ до 25 мМ, приблизительно от 10 мМ до 25 мМ, приблизительно от 11 мМ до 25 мМ, приблизительно от 12 мМ до 25 мМ, приблизительно от 13 мМ до 25 мМ, приблизительно от 14 мМ до 25 мМ, приблизительно от 15 мМ до 25 мМ, приблизительно от 16 мМ до 25 мМ, приблизительно от 17 мМ до 25 мМ, приблизительно от 18 мМ до 25 мМ, приблизительно от 19 мМ до 25 мМ или приблизительно от 20 мМ до 25 мМ.

пункт 426. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 15 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 15 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 15 мМ, приблизительно от 1 мМ до 15 мМ, приблизительно от 2 мМ до 15 мМ, приблизительно от 3 мМ до 15 мМ, приблизительно от 4 мМ до 15 мМ, приблизительно от 5 мМ до 15 мМ, приблизительно от 6 мМ до 15 мМ, приблизительно от 7 мМ до 15 мМ, приблизительно от 8 мМ до 15 мМ, приблизительно от 9 мМ до 15 мМ, приблизительно от 10 мМ до 15 мМ, приблизительно от 11 мМ до 15 мМ, приблизительно от 12 мМ до 15 мМ, приблизительно от 13 мМ до 15 мМ или приблизительно от 14 мМ до 15 мМ.

пункт 427. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно от 0,01 мМ до 10 мМ, приблизительно от 0,1 мМ до 10 мМ, приблизительно от 0,5 мМ до 10 мМ, приблизительно от 1 мМ до 10 мМ, приблизительно от 2 мМ до 10 мМ, приблизительно от 3 мМ до 10 мМ, приблизительно от 4 мМ до 10 мМ, приблизительно от 5 мМ до 10 мМ, приблизительно от 6 мМ до 10 мМ, приблизительно от 7 мМ до 10 мМ, приблизительно от 8 мМ до 10 мМ или приблизительно от 9 мМ до 10 мМ.

пункт 428. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,01 мМ, приблизительно 0,05 мМ, приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 0,3 мМ, приблизительно 0,4 мМ, приблизительно 0,5 мМ, приблизительно 0,6 мМ, приблизительно 0,7 мМ, приблизительно 0,8 мМ, приблизительно 0,9 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 или приблизительно 100 мМ.

пункт 429. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ или приблизительно 50 мМ.

пункт 430. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 30 мМ.

пункт 431. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 25 мМ.

пункт 432. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 20 мМ.

пункт 433. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 15 мМ.

пункт 434. Способ по любому из пунктов 407-422, где концентрация диафильтрационного буфера составляет приблизительно 10 мМ.

пункт 435. Способ по любому из пунктов 401-434, где раствор для замены включает хелатообразователь.

пункт 436. Способ по любому из пунктов 401-434, где раствор для замены включает хелатообразователь на основе квасцов.

пункт 437. Способ по любому из пунктов 401-434, где раствор для замены включает хелатообразователь, выбранный из групп, состоящих из этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин-N,N',N'-триуксусной кислоты (ЭДТА-ОН), гидроксиэтилендиаминтриуксусной кислоты (ГЭДТА), этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1,2-циклогександиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (CyDTA), диэтилентриамин-N, N,N',N",N"-пентауксусной кислоты (DTPA), 1,3-диаминопропан-2-ол-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (DPTA-OH), этилендиамин-N,N'-бис(2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA), этилендиамин-N,N'-дипропионовой кислоты дигидрохлорид (EDDP), этилендиамин-тетракис(метиленсульфоновой кислоты) (EDTPO), нитрилотрис(метиленфосфоновой кислоты) (NTPO), иминодиуксусной кислоты (IDA), гидроксииминодиуксусной кислоты (HIDA), нитрилотриуксусной кислоты (NTP), триэтилентетрамингексауксусной кислоты (TTHA), димеркаптоянтарной кислоты (DMSA), 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновой кислоты (DMPS), альфа-липоевой кислоты (ALA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), тиаминтетрагидрофурфурил-дисульфида (TTFD), димеркапрола, пеницилламина, дефероксамина (DFOA), деферасирокса, фосфонатов, соли лимонной кислоты (цитрата) и их комбинаций.

пункт 438. Способ по любому из пунктов 401-434, где раствор для замены включает хелатообразователь, выбранный из групп, состоящих из этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин-N,N',N'-триуксусной кислоты (ЭДТА-ОН), гидроксиэтилендиаминтриуксусной кислоты (ГЭДТА), этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1,2-циклогександиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (CyDTA), диэтилентриамин-N,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты (DTPA), 1,3-диаминопропан-2-ол-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (DPTA-OH), этилендиамин-N,N'-бис(2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA), соли лимонной кислоты (цитрата) и их комбинаций.

пункт 439. Способ по любому из пунктов 401-434, где раствор для замены включает этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) в качестве хелатообразователя.

пункт 440. Способ по любому из пунктов 401-434, где раствор для замены включает соль лимонной кислоты (цитрат) в качестве хелатообразователя.

пункт 441. Способ по любому из пунктов 401-434, где раствор для замены включает цитрат натрия в качестве хелатообразователя.

пункт 442. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 1 до 500 мМ.

пункт 443. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 2 до 400 мМ.

пункт 444. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 400 мМ.

пункт 445. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 200 мМ.

пункт 446. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 100 мМ.

пункт 447. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 50 мМ.

пункт 448. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет от 10 до 30 мМ.

пункт 449. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 0,01 мМ, приблизительно 0,05 мМ, приблизительно 0,1 мМ, приблизительно 0,2 мМ, приблизительно 0,3 мМ, приблизительно 0,4 мМ, приблизительно 0,5 мМ, приблизительно 0,6 мМ, приблизительно 0,7 мМ, приблизительно 0,8 мМ, приблизительно 0,9 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 21 мМ, приблизительно 22 мМ, приблизительно 23 мМ, приблизительно 24 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 26 мМ, приблизительно 27 мМ, приблизительно 28 мМ, приблизительно 29 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 31 мМ, приблизительно 32 мМ, приблизительно 33 мМ, приблизительно 34 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 36 мМ, приблизительно 37 мМ, приблизительно 38 мМ, приблизительно 39 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 или приблизительно 100 мМ.

пункт 450. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 55 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 65 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 мМ или приблизительно 100 мМ.

пункт 451. Способ по любому из пунктов 435-441, где концентрация хелатообразователя в растворе для замены составляет приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ или приблизительно 50 мМ.

пункт 452. Способ по любому из пунктов 407-451, где раствор для замены включает соль.

пункт 453. Способ по пункту 452, где соль выбрана из групп, состоящих из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации.

пункт 454. Способ по пункту 452, где солью является хлорид натрия.

пункт 455. Способ по любому из пунктов 432-434, где раствор для замены включает хлорид натрия в концентрации 1 приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 250 или приблизительно 300 мМ.

пункт 456. Способ по любому из пунктов 401-455, где количество диаобъемов составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50.

пункт 457. Способ по любому из пунктов 401-455, где количество диаобъемов составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95 или приблизительно 100.

пункт 458. Способ по любому из пунктов 401-455, где количество диаобъемов составляет приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15.

пункт 459. Способ по любому из пунктов 401-458, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C.

пункт 460. Способ по любому из пунктов 401-458, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 461. Способ по любому из пунктов 401-458, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 462. Способ по любому из пунктов 401-458, где указанную стадию диафильтрации проводят при температуре приблизительно 50°C.

пункт 463. Способ по любому из пунктов 379-458, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 90°C.

пункт 464. Способ по любому из пунктов 379-458, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, при температуре от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C, при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 55°C, при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C или при температуре от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C.

пункт 465. Способ по любому из пунктов 379-458, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре приблизительно 20°C, приблизительно 21°C, приблизительно 22°C, приблизительно 23°C, приблизительно 24°C, приблизительно 25°C, приблизительно 26°C, приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, приблизительно 29°C, приблизительно 30°C, приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C, приблизительно 45°C, приблизительно 46°C, приблизительно 47°C, приблизительно 48°C, приблизительно 49°C, приблизительно 50°C, приблизительно 51°C, приблизительно 52°C, приблизительно 53°C, приблизительно 54°C, приблизительно 55°C, приблизительно 56°C, приблизительно 57°C, приблизительно 58°C, приблизительно 59°C, приблизительно 60°C, приблизительно 61°C, приблизительно 62°C, приблизительно 63°C, приблизительно 64°C, приблизительно 65°C, приблизительно 66°C, приблизительно 67°C, приблизительно 68°C, приблизительно 69°C, приблизительно 70°C, приблизительно 71°C, приблизительно 72°C, приблизительно 73°C, приблизительно 74°C, приблизительно 75°C, приблизительно 76°C, приблизительно 77°C, приблизительно 78°C, приблизительно 79°C или приблизительно 80°C.

пункт 466. Способ по любому из пунктов 379-458, где указанные стадии ультрафильтрации и диафильтрации, если их обе проводят, выполняют при температуре приблизительно 50°C.

пункт 467. Способ по любому из пунктов 379-466, где указанный очищенный раствор полисахарида гомогенизируют путем доводки по размеру.

пункт 468. Способ по любому из пунктов 379-466, где указанный очищенный раствор полисахарида подвергают механической доводке по размеру.

пункт 469. Способ по любому из пунктов 379-466, где указанный очищенный раствор полисахарида подвергают фрагментации при гомогенизации высокого давления.

пункт 470. Способ по любому из пунктов 379-466, где указанный очищенный раствор полисахарида подвергают химическому гидролизу.

пункт 471. Способ по любому из пунктов 379-470, где указанный очищенный раствор полисахарида доводят до целевой молекулярной массы.

пункт 472. Способ по любому из пунктов 379-471, где указанный очищенный раствор полисахарида доводят до молекулярной массы от приблизительно 5 кДа до приблизительно 4000 кДа.

пункт 473. Способ по любому из пунктов 379-471, где указанный очищенный раствор полисахарида доводят до молекулярной массы от приблизительно 10 кДа до приблизительно 4000 кДа.

пункт 474. Способ по любому из пунктов 379-471, где указанный очищенный раствор полисахарида доводят до молекулярной массы от приблизительно 50 кДа до приблизительно 4000 кДа.

пункт 475. Способ по любому из пунктов 379-471, где указанный очищенный раствор полисахарида доводят до молекулярной массы от приблизительно 50 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа; или от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа. В других подобных вариантах осуществления очищенный полисахарид доводят до молекулярной массы от приблизительно 250 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа; от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 4000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 3500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 3000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 2250 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1750 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1500 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1250 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1000 кДа; от приблизительно 500 кДа до приблизительно 750 кДа; или от приблизительно 500 кДа до приблизительно 600 кДа.

пункт 476. Способ по любому из пунктов 379-471, где указанный очищенный раствор полисахарида доводят до молекулярной массы приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 15 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 25 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 35 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 45 кДа, приблизительно 50 кДа, приблизительно 75 кДа, приблизительно 90 кДа, приблизительно 100 кДа, приблизительно 150 кДа, приблизительно 200 кДа, приблизительно 250 кДа, приблизительно 300 кДа, приблизительно 350 кДа, приблизительно 400 кДа, приблизительно 450 кДа, приблизительно 500 кДа, приблизительно 550 кДа, приблизительно 600 кДа, приблизительно 650 кДа, приблизительно 700 кДа, приблизительно 750 кДа, приблизительно 800 кДа, приблизительно 850 кДа, приблизительно 900 кДа, приблизительно 950 кДа, приблизительно 1000 кДа, приблизительно 1250 кДа, приблизительно 1500 кДа, приблизительно 1750 кДа, приблизительно 2000 кДа, приблизительно 2250 кДа, приблизительно 2500 кДа, приблизительно 2750 кДа, приблизительно 3000 кДа, приблизительно 3250 кДа, приблизительно 3500 кДа, приблизительно 3750 кДа или приблизительно 4000 кДа.

пункт 477. Способ по любому из пунктов 1-746, где указанный очищенный раствор полисахарида стерильно фильтруют.

пункт 478. Способ по пункту 477, где указанная стерилизующая фильтрация является тупиковой фильтрацией.

пункт 479. Способ по пункту 477, где указанная стерилизующая фильтрация является тангенциальной фильтрацией.

пункт 480. Способ по любому из пунктов 477-479, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания в пределах приблизительно 0,01-0,2 микрона, приблизительно 0,05-0,2 микрона, приблизительно 0,1-0,2 микрона или приблизительно 0,15-0,2 микрона.

пункт 481. Способ по любому из пунктов, 477-479, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,15 или приблизительно 0,2 микрона.

пункт 482. Способ по любому из пунктов 477-479, где фильтр имеет номинальный диапазон задерживания приблизительно 0,2 микрона.

пункт 483. Способ по любому из пунктов 477-482, где фильтр имеет производительность приблизительно 25-1500 л/м², 50-1500 л/м², 75-1500 л/м², 100-1500 л/м², 150-1500 л/м², 200-1500 л/м², 250-1500 л/м², 300-1500 л/м², 350-1500 л/м², 400-1500 л/м², 500-1500 л/м², 750-1500 л/м², 1000-1500 л/м² или 1250-1500 л/м².

пункт 484. Способ по любому из пунктов 477-482, где фильтр имеет производительность приблизительно 25-1000 л/м², 50-1000 л/м², 75-1000 л/м², 100-1000 л/м², 150-1000 л/м², 200-1000 л/м², 250-1000 л/м², 300-1000 л/м², 350-1000 л/м², 400-1000 л/м², 500-1000 л/м² или 750-1000 л/м².

пункт 485. Способ по любому из пунктов 477-482, где фильтр имеет производительность 25-500 л/м², 50-500 л/м², 75-500 л/м², 100-500 л/м², 150-500 л/м², 200-500 л/м², 250-500 л/м², 300-500 л/м², 350-500 л/м² или 400-500 л/м².

пункт 486. Способ по любому из пунктов 477-482, где фильтр имеет производительность 25-300 л/м², 50-300 л/м², 75-300 л/м², 100-300 л/м², 150-300 л/м², 200-300 л/м² или 250-300 л/м².

пункт 487. Способ по любому из пунктов 477-482, где фильтр имеет производительность 25-250 л/м², 50-250 л/м², 75-250 л/м², 100-250 л/м² или 150-250 л/м², 200-250 л/м².

пункт 488. Способ по любому из пунктов 477-482, где фильтр имеет производительность 25-100 л/м², 50-100 л/м² или 75-100 л/м².

пункт 489. Способ по любому из пунктов 477-482, где фильтр имеет производительность приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400 или приблизительно 1500 л/м².

пункт 490. Способ по любому из пунктов 1-489, где полученный очищенный полисахарид присутствует в жидком растворе.

пункт 491. Способ по любому из пунктов 1-489, где полученный очищенный полисахарид представляет собой высушенный порошок.

пункт 492. Способ по любому из пунктов 1-489, где полученный очищенный раствор полисахарида лиофилизируют.

пункт 493. Способ по любому из пунктов 1-489 или 492, где полученный очищенный раствор полисахарида представляет собой лиофилизированную лепешку.

пункт 494. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид, субкапсульный полисахарид или липополисахарид.

пункт 495. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид.

пункт 496. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Staphylococcus aureus.

пункт 497. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид 5 типа из Staphylococcus aureus.

пункт 498. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид 8 типа из Staphylococcus aureus.

пункт 499. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Enterococcus faecalis.

пункт 500. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Haemophilus influenzae типа b.

пункт 501. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Neisseria meningitidis.

пункт 502. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из N. meningitidis серогруппы A (MenA), N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), N. meningitidis серогруппы Y (MenY), N. meningitidis серогруппы X (MenX) или N. meningitidis серогруппы C (MenC).

пункт 503. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из N. meningitidis серогруппы A (MenA).

пункт 504. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135).

пункт 505. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из N. meningitidis серогруппы (MenY).

пункт 506. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из N. meningitidis серогруппы (MenX).

пункт 507. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из N. meningitidis серогруппы (MenC).

пункт 508. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Escherichia coli.

пункт 509. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Streptococcus agalactiae (стрептококка группы B (GBS)).

пункт 510. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из капсульного полисахарида из GBS типов Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII и VIII.

пункт 511. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из штамма Escherichia coli из группы энтеровирулентной Escherichia coli (EEC Group).

пункт 512. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из штамма Escherichia coli из группы энтеровирулентной Escherichia coli (EEC Group), такой как Escherichia coli - энтеротоксигенная (ETEC), Escherichia coli - энтеропатогенная (EPEC), Escherichia coli - O157:H7 энтерогеморрагическая (EHEC) или Escherichia coli - энтероинвазивная (EIEC). В варианте осуществления источником бактериального капсульного полисахарида является уропатогенная Escherichia coli (UPEC).

пункт 513. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli, выбранного из группы, состоящей из серотипов O157:H7, O26:H11, O111:H- и O103:H2.

пункт 514. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli, выбранного из группы, состоящей из серотипов O6:K2:H1 и O18:K1:H7.

пункт 515. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli, выбранного из группы, состоящей из серотипов O45:K1, O17:K52:H18, O19:H34 и O7:K1.

пункт 516. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli O104:H4.

пункт 517. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli O1:K12:H7.

пункт 518. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli O127:H6.

пункт 519. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli O139:H28.

пункт 520. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Escherichia coli O128:H2.

пункт 521. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae.

пункт 522. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Steptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 29, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 72 и 73.

пункт 523. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Steptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 29, 31, 33F, 35B, 35F, 38, 72 и 73.

пункт 524. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Steptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из серотипов 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F и 33F.

пункт 525. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 1.

пункт 526. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 2.

пункт 527. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 3.

пункт 528. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 4.

пункт 529. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 5.

пункт 530. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 6A.

пункт 531. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 6B.

пункт 532. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 6C.

пункт 533. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 7F.

пункт 534. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 8.

пункт 535. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 9V.

пункт 536. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 9N.

пункт 537. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 10A.

пункт 538. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 11A.

пункт 539. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 12F.

пункт 540. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 14.

пункт 541. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 15A.

пункт 542. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 15B.

пункт 543. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 15C.

пункт 544. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 16F.

пункт 545. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 17F.

пункт 546. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 18C.

пункт 547. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 19A.

пункт 548. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 19F.

пункт 549. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 20.

пункт 550. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 20A.

пункт 551. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 20B.

пункт 552. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 22F.

пункт 553. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 23A.

пункт 554. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 23B.

пункт 555. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 23F.

пункт 556. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 24B.

пункт 557. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 24F.

пункт 558. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 29.

пункт 559. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 31.

пункт 560. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 33F.

пункт 561. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 34.

пункт 562. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 35B.

пункт 563. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 35F.

пункт 564. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 38.

пункт 565. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 72.

пункт 566. Способ по любому из пунктов 1-493, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из Steptococcus pneumoniae серотипа 73.

пункт 567. Очищенный бактериальный полисахарид получен способом по любому из пунктов 1-566.

пункт 568. Очищенный бактериальный полисахарид, получаемый способом по любому из пунктов 1-566.

пункт 569. Очищенный бактериальный полисахарид, полученный способом по любому из пунктов 1-566 для применения в качестве антигена.

пункт 570. Очищенный бактериальный полисахарид, полученный способом по любому из пунктов 1-566, конъюгированный с белком-носителем.

пункт 571. Очищенный бактериальный полисахарид, полученный способом по любому из пунктов 1-566, дополнительно конъюгированный с белком-носителем.

пункт 572. Гликоконъюгат очищенного бактериального полисахарида, полученный способом по любому из пунктов 1-566.

пункт 573. Иммуногенная композиция, включающая любой из очищенных полисахаридов по любому из пунктов 567-568.

пункт 574. Иммуногенная композиция, включающая гликоконъюгат по любому из пунктов 571-572.

пункт 575. Иммуногенная композиция, включающая любой гликоконъюгат, раскрытый в настоящем документе.

пункт 576. Иммуногенная композиция, включающая любую комбинацию гликоконъюгатов, раскрытых в настоящем документе.

пункт 577. Способ очистки капсульного полисахарида из N. meningitidis серогруппы A (MenA), N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), N. meningitidis серогруппы Y (MenY), N. meningitidis серогруппы X (MenX) или N. meningitidis серогруппы C (MenC) из раствора, включающего указанный полисахарид вместе с примесями, где указанный способ включает стадию флокуляции и стадию хроматографии.

пункт 578. Способ по пункту 577, где стадия хроматографии является стадией хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC).

пункт 579. Способ по пункту 578, где указанная стадия HIC соответствует определению в пунктах 359-378.

пункт 580. Способ по пункту 578 и любому из пунктов 2-493.

пункт 581. Способ по любому из пунктов 578-5809, где указанный бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из N. meningitidis серогруппы A (MenC).

пункт 582. Способ согласно пункту 581, где способ дополнительно включает стадию ионообменной хроматографии перед стадией HIC.

пункт 583. Способ согласно пункту 582, где способ не включает стадию фильтрации с использованием активированного угля.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Pfizer Inc.

Chu, Ling

<120> ОЧИСТКА ПОЛИСАХАРИДОВ

<130> PC72592A

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; LT2wzzB_S

<400> 1

gaagcaaacc gtacgcgtaa ag

22

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; LT2wzzB_AS

<400> 2

cgaccagctc ttacacggcg

20

<210> 3

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O25bFepE_S

<400> 3

gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac

36

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O25bFepE_A

<400> 4

ataattgacg atccggttgc c

21

<210> 5

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P1_S

<400> 5

gctatttacg ccctgattgt cttttgt

27

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P2_AS

<400> 6

attgagaacc tgcgtaaacg gc

22

<210> 7

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P3_S

<400> 7

tgaagagcgg ttcagataac ttcc

24

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P4_AS

<400> 8

cgatccggaa acctcctaca c

21

<210> 9

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O157 FepE_S

<400> 9

gattattcgc gcaacgctaa acagat

26

<210> 10

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O157 FepE_AS

<400> 10

tgatcattga cgatccggta gcc

23

<210> 11

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; pBAD33_adaptor_S

<400> 11

cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg

60

tcggtatgga

70

<210> 12

<211> 78

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; pBAD33_adaptor_AS

<400> 12

agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg

60

ctttacagct accgagct

78

<210> 13

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; JUMPSTART_r

<400> 13

ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg

30

<210> 14

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; gnd_f

<400> 14

ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg

30

<210> 15

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 15

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 16

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 16

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 17

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 17

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 18

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 18

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 19

<211> 378

<212> БЕЛОК

<213> Salmonella enterica

<400> 19

Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu

20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val

85 90 95

Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser

100 105 110

Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly

145 150 155 160

Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr

165 170 175

Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln

180 185 190

Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn

195 200 205

Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp

210 215 220

Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His

225 230 235 240

Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr

245 250 255

Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu

260 265 270

Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr

275 280 285

Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val

290 295 300

Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe

305 310 315 320

Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly

325 330 335

Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala

340 345 350

Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu

355 360 365

Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val

370 375

<210> 20

<211> 325

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 20

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Glu Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Glu Gln Val Thr Lys Pro Gln Val Gln Gln Thr Glu Asp Val Thr

210 215 220

Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Ile

225 230 235 240

Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Gln

245 250 255

Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Leu

260 265 270

Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Arg

275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320

Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 21

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 21

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Asp Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 22

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 22

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Lys Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Asp Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ser Lys

325

<210> 23

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 23

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Glu Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 24

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Salmonella enterica

<400> 24

Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr

35 40 45

Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu

65 70 75 80

Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile

85 90 95

Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln

115 120 125

Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala

145 150 155 160

Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys

165 170 175

Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp

195 200 205

Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr

210 215 220

Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile

225 230 235 240

Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln

245 250 255

Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp

260 265 270

Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg

275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu

325

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ очистки полисахарида, полученного из грамотрицательных бактерий, из раствора, включающего указанный полисахарид и примеси после ферментации, включающий a) кислотный гидролиз или тепловую обработку; b) флокуляцию; с) первую ультрафильтрацию/диафильтрацию; d) угольную фильтрацию; e) хроматографию; и f) вторую ультрафильтрацию/диафильтрацию, где хроматография на стадии е) включает мембранную хроматографию (IEX), хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC) и как IEX, так и HIC. Изобретение обеспечивает получение полисахарида с высокой степенью чистоты, а также низким содержанием остаточных белков, нуклеиновых кислот и эндотоксинов. 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 18 табл., 22 пр.

1. Способ очистки полисахарида, полученного из грамотрицательных бактерий, из раствора, включающего указанный полисахарид и примеси после ферментации, где указанный способ включает последовательное выполнение следующих стадий:

a) кислотный гидролиз или тепловая обработка;

b) флокуляция;

с) первая ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-1);

d) угольная фильтрация;

e) хроматография; и

f) вторая ультрафильтрация/диафильтрация (UFDF-2),

где хроматография на стадии е) включает мембранную хроматографию (IEX), хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC) и как IEX, так и HIC.

2. Способ по п.1, , где хроматография на стадии е) включает IEX.

3. Способ по п.1, где хроматография на стадии е) включает HIC.

4. Способ по п.1, где хроматография на стадии е) включает как IEX, так и HIC.

5. Способ по п.1, где стадия а) включает кислотный гидролиз с использованием уксусной кислоты.

6. Способ по п.1, где стадия а) включает кислотный гидролиз при температуре 90°С или выше.

7. Способ по п.1, где флокуляция на стадии b) включает использование алюминия.

8. Способ по п.1, где флокуляция на стадии b) включает использование кальция.

9. Способ по п.1, где угольная фильтрация на стадии d) включает последовательное использование нескольких фильтров с активированным углем.

10. Способ по п.1, где бактерия представляет собой любую из Neisseria, Escherichia или Klebsiella.

11. Способ по п.10, где бактерия представляет собой Neisseria meningitidis, Escherichia coli или Klebsiella pneumoniae.

12. Способ по п.11, где бактерией является Escherichia coli, включающая полисахарид, имеющий структуру, выбранную из любой из Формулы O1A, Формулы O1A1, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6:K2, Формулы O6:K13, Формулы O6:K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O9a, Формулы O10, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы 20ab, Формулы 20ac, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O28, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O52, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы 62D1, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O83, Формулы O86, Формулы O88, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O111, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O119, Формулы O121, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O136, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O147, Формулы O149, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O164, Формулы O167, Формулы O172 или Формулы O173, где указанные структуры полисахаридов показаны в таблице 1.

13. Способ по п.12, где бактерией является Klebsiella pneumoniae, включающая полисахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы K.O1.1, Формулы K.O1.2, Формулы K.O1.3, Формулы K.O1.4, Формулы K.O2.1, Формулы K.O2.2, Формулы K.O2.3, Формулы K.O2.4, Формулы K.O3, Формулы K.O4, Формулы K.O5, Формулы K.O7, Формулы K.O12 или Формулы K.O8, где указанные структуры полисахаридов показаны в Таблице 1a.