ПНЕВМОКОККОВЫЕ ПОВЕРХНОСТНЫЕ БЕЛКИ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/315 C12N15/31 A61K39/09 A61P31/04 

Область техники

Настоящее изобретение относится к пневмококковому поверхностному белку A (PspA) и к вакцине, содержащей PspA.

Предшествующий уровень техники

Пневмококк, как и вирус гриппа, представляет собой важный с клинической точки зрения заразный патоген верхних дыхательных путей, и он ассоциирован со средним отитом, пневмонией, бектеримией, менингитом и тому подобными. Пневмококк вызывает тяжелые заболевания, включая смерть как детей, так и взрослых.

В последние годы в качестве средства для защиты против инфекции, вызванной таким пневмококком, были разработаны 7-валентная, 10-валентная и 13-валентная полисахаридные пневмококковые конъюгатные вакцины (PCV7, PCV10 и PCV13) для взрослых, и они вводились пациентам посредством внутримышечной инъекции. Однако поскольку независимый от Т-клеток полисахарид в данных вакцинах на основе полисахаридов имеет низкую иммуногенность, вакцины на основе полисахаридов с трудом индуцируют иммунный ответ у детей и демонстрируют защитные эффекты только против пневмококков с капсульным серотипом. Кроме того, проблематичным является то, что, поскольку вакцины, введенные посредством внутримышечной инъекции, главным образом, индуцируют системные антитела против IgG, данные вакцины не могут индуцировать иммунный ответ слизистой на пневмококки.

Пневмококковый поверхностный белок A (PspA, от англ. pneumococcal surface protein А), существующий на поверхностном слое пневмококка, был известен как белок, имеющий высокую иммуногенность, и рассматривался как многообещающий кандидат вакцин (непатентная литература 1 и непатентная литература 2). PspA присутствует почти на всех типах пневмококков, и вакцины на основе PspA индуцируют антитела, провоцирующие перекрестные реакции у мышей и людей (непатентная литература 3 - непатентная литература 5). Кроме того, специфичные в отношении PspA антитела слизистой и системные антитела индуцируются у детенышей мышей (через организм матери) и взрослых мышей, и данная индукция антитела опосредуется ответом цитокинов Th1 и Th2 Т-кпеток CD4⁺. Вышеупомянутые данные свидетельствуют о том, что PspA может представлять собой кандидатную пневмококковую вакцину, эффективную не только для взрослых, но также и для детей.

PspA классифицируется на три семейства (т.е. семейства 1-3) и дополнительно классифицируется на шесть подгрупп, именуемых «клады» (т.е. клады 1-6). Среди них пневмококковый штамм, имеющий PspA, классифицируемый в семейство 1, составляет приблизительно 95% от ранее подтвержденных штаммов, и PspA, классифицируемый в семейство 1, является особенно важным в качестве кандидатной вакцины.

PspA, происходящий из штамма D39, известный в качестве универсального антигена пневмококка, представляет собой репрезентативный антиген вакцины, классифицированный в семейство 1, кладу 2. PspA, происходящий из штамма D39, имеет высокую антигенность и высокую способность индуцировать антитело, нейтрализующее пневмококк. Однако PspA, происходящий из штамма D39, легко дезаминировался около нейтрального интервала рН и был проблематичным в показателях безопасности.

Список цитирований Непатентная литература

Непатентная литература 1: Berry et al., Infect Immun 57: 2037-2042, 1989

Непатентная литература 2: McDaniel et al., J Exp Med 165: 381-394, 1987

Непатентная литература 3: Briles et al., Infect Immun 68: 796-800, 2000

Непатентная литература 4: Nguyen et al., Vaccine 29: 5731-5739, 2011

Непатентная литература 5: McCool et al., J Exp Med 195: 359-365, 2002

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая проблема

Рассматривая вышеупомянутые обстоятельства, целью настоящего изобретения является предложение мутанта PspA, происходящего из D39, который не подвергается дезаминированию и сохраняет стабильность в качестве молекулы даже около нейтрального интервала рН.

Решение проблемы

Авторы настоящего изобретения проанализировали аминокислотные последовательности дезаминированного PspA, происходящего из D39, согласно способу МС/МС (тандемная масс-спектрометрия). В результате, авторы изобретения открыли, что мутация генерируется в одной аминокислоте PspA, происходящего из D39 дикого типа.

В отношении данного положения аминокислоты было выяснено, что только аспарагин (Asn) в положении 254 конкретно заменяется аспарагиновой кислотой (Asp) во всей аминокислотной последовательности зрелого PspA, происходящего из D39 дикого типа, как изложено в SEQ ID NO: 1. PspA (N254D), в котором в положении 254 зрелого PspA, происходящего из D39, наблюдается замена на аспарагиновую кислоту, является крайне стабильным, и его антигенность и способность индуцировать нейтрализующее антитело не изменяется. Кроме того, такое изменение аминокислоты не было обнаружено, например, в PspA пневмококкового штамма EF3296, принадлежащего к семейству 2, кладе 3, или в PspA пневмококкового штамма EF5668, принадлежащего к семейству 2, кладе 4.

На основе вышеупомянутых данных было осуществлено настоящее изобретение.

В частности, настоящее изобретение включает следующие (1)-(5).

(1) Белок из следующих (а) или (b):

(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 2, и имеющий антигенную активность пневмококковой вакцины, и белок, по существу идентичный данному белку; или

(b) белок, являющийся частью аминокислотной последовательности, как изложено в SEQ ID NO: 2, где аспарагиновая кислота в положении 254 содержится в данной части, и имеющий антигенную активность пневмококковой вакцины, и белок, являющийся по существу идентичным данному белку.

(2) Белок согласно (1) выше, где часть аминокислотной последовательности, как изложено в SEQ ID NO: 2, характеризуется тем, что она является областью α-спирали.

(3) Белок согласно (2) выше, где данный белок отличается тем, что он является полной аминокислотной последовательностью или частью аминокислотной последовательности, как изложено в SEQ ID NO: 3.

(4) ДНК, кодирующая белок по любому из (1)-(3) выше.

(5) Пневмококковая вакцина, содержащая белок по любому из (1)-(3) выше в качестве антигена или части антигена.

Преимущественные эффекты изобретения

Согласно настоящему изобретению антиген пневмококковой вакцины является стабильным в том виде, в котором предложена молекула. В частности, в процессе очистки в ионообменной хроматографии и т.д., проводящейся при продукции традиционного PspA фармацевтического уровня качества, происходящего из пневмококка D39, пик элюции в некоторых случаях делился на две части, и последний пик представлял собой дезаминированную форму. Антиген, предложенный настоящим изобретением, может демонстрировать, что может быть получен препарат, который является крайне стабильным в процессе очистки и в последующем состоянии консервации.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой изображение, схематически показывающее структуру белка PspA.

Фиг. 2 показывает результаты, полученные подтверждением молекулярного изменения PspA 1-3 с течением времени при заданных значениях рН (рН 6,5; рН 7,0; рН 7,5; рН 8,0 и рН 8,5) согласно PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле) в нативных условиях. А: маркер (500 мг); В: рН 7,0 (контроль в сутки 0); С: рН 6,5; D: рН 7,0; Е: рН 7,5; F: рН 8,0 и G: рН 8,5.

Фиг. 3 показывает результаты анализа с использованием пептидных карт PspA 1-3 и PspA 1-3 LB. Стрелка показывает пик, специфично генерированный в PspA 1-3 LB.

Фиг. 4 демонстрирует результаты, полученные сравнением эффектов назальной вакцины на основе наногеля с использованием PspA 1-3 LB, с эффектами назальных вакцин на основе наногеля с использованием других антигенов PspA.

Описание воплощений

Согласно настоящему изобретению предложен белок, который сохраняет антигенность и способность индуцировать нейтрализующее антитело, которые являются эквивалентным антигенности и способности белка PspA, происходящего из D39 дикого типа, и он является превосходящим белок PspA, происходящий из D39 дикого типа, в показателях стабильности в виде молекулы (например, невероятность мутации аминокислоты и т.д.) (именуемый далее «белок PspA по настоящему изобретению»).

То есть, первое воплощение настоящего изобретения относится к белку PspA по настоящему изобретению, который представляет собой белок из следующих (а) или (b):

(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 2, и имеющий антигенную активность пневмококковой вакцины, и белок, по существу идентичный данному белку; или

(b) белок, являющийся частью аминокислотной последовательности, как изложено в SEQ ID NO: 2, в котором аспарагиновая кислота в положении 254 содержится в данной части, и имеющий антигенную активность пневмококковой вакцины, и белок, по существу идентичный данному белку.

Настоящий белок PspA содержит сигнальную последовательность (например, положения аминокислот 1-31 №доступа GenBank: ABJ54172 (происходящий из штамма D39)) и область α-спирали (например, положения аминокислот 32-319 № доступа GenBank: ABJ54172), пролинбогатую область (например, положения аминокислот 320-402 № доступа GenBank: ABJ54172), холинсвязывающую область и С-концевую хвостовую область, с его N-концевой стороны (см. Фиг. 1). Сигнальная последовательность отщепляется с образованием зрелого PspA (который состоит из области α-спирали, пролинбогатой области, холинсвязывающей области и С-концевой хвостовой области).

В одном воплощении настоящего изобретения «антигенная активность пневмококковой вакцины» означает активность, индуцирующую иммунитет (гуморальный иммунитет и/или кпеточноопосредованный иммунитет) для защиты живого организма от атаки пневмококком. Имеет ли или нет определенный белок «антигенную активность пневмококковой вакцины» может быть легко подтверждено специалистом в данной области (например, это может быть подтверждено способом, описанным в «4. Трансназальная иммунизация мышей» в Примерах).

Термин «белок», использованный в (а) выше, означает «белок, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 2, и имеющий антигенную активность пневмококковой вакцины», тогда как термин «белок», использованный в (b) выше, означает «белок, являющийся частью аминокислотной последовательности, как изложено в SEQ ID NO: 2, в котором аспарагиновая кислота в положении 254 содержится в данной части, и имеет антигенную активность пневмококковой вакцины».

В одном воплощении настоящего изобретения фраза «белок, по существу идентичный данному белку» означает белок, состоящий из аминокислотной последовательности, содержащей делецию (исключая аспарагиновую кислоту в положении 254), замену (исключая аспарагиновую кислоту в положении 254), вставку или присоединение одной или нескольких аминокислот (предпочтительно примерно от 1 до 30, более предпочтительно примерно от 1 до 10 и, кроме того, предпочтительно от 1 до 5 аминокислот) в аминокислотной последовательности «белка», как описано выше, где «белок» имеет активность в качестве антигена пневмококковой вакцины.

Иначе в одном воплощении настоящего изобретения фраза «белок, по существу идентичный данному белку» означает белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую идентичность аминокислот приблизительно 60% или больше, предпочтительно 70% или больше, более предпочтительно приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% и наиболее предпочтительно приблизительно 99% относительно аминокислотной последовательности «белка», как описано выше, где аминокислота в положении 254 представляет собой аспарагиновую кислоту, и «белок» имеет активность в качестве антигена пневмококковой вакцины.

Фраза «часть аминокислотной последовательности, как изложено в SEQ ID NO: 2», использованная в (b) выше, предпочтительно означает область, например, содержащую часть или всю область α-спирали (содержащую аспарагиновую кислоту в положении 254) и часть или всю пролинбогатую область, и, например, может представлять собой белок, состоящий из аминокислот, как изложено в SEQ ID NO: 3.

Второе воплощение настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте (ДНК и т.д.), кодирующей «белок PspA по настоящему изобретению». Белок PspA по настоящему изобретению может быть приготовлен получением нуклеиновой кислоты, кодирующей саму себя из библиотеки кДНК или тому подобных, включением данной нуклеиновой кислоты в подходящий экспрессионный вектор, трансформацией или трансфекцией подходящих клеток-хозяев экспрессионным вектором и затем культивированием данных клеток-хозяев в подходящей среде таким образом, что обеспечивается экспрессия данными клетками белка PspA по настоящему изобретению, который затем очищается.

Примеры клеток-хозяев, которые могут использоваться в данном документе для экспрессии белка PspA, могут включать бактериальные клетки (например, штамм В Escherichia coli, штамм KI2 Е. coli, Corynebacterium ammoniagenes, С. glutamicum, Serratia liquefaciens, Streptomyces lividans, Pseudomonas putida и т.д.), плесени (например, Peniciliium camembertii, Acremonium chrysogenum и т.д.), животные клетки, растительные клетки, клетки насекомых/бакуловирус и клетки дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и т.д.). Белок PspA может экспрессироваться в данных клетках.

В качестве экспрессионного вектора для осуществления экспрессии белка PspA можно использовать подходящий вектор для разных типов клеток-хозяев. Примеры такого экспрессионного вектора, который можно использовать в данном документе, могут включать: pBR322, pBR325, pUC118 или рЕТ (хозяева Escherichia coli); pEGF-C и pEGF-N (хозяева животные клетки); pVL1392 и pVL1393 (хозяева клетки насекомых, бакуловирусные векторы); и pG-1, Yep13 или pPICZ (хозяева дрожжевые клетки). Данные экспрессионные векторы имеют репликатор, селективный маркер и промотор, которые являются подходящими для индивидуальных векторов, и также могут иметь, по мере необходимости, энхансер, последовательность терминатора транскрипции (терминатор), сайт связывания рибосомы, сигнал полиаденилирования и тому подобное. Кроме того, для того, чтобы облегчать очистку экспрессируемого полипептида, в экспрессионный вектор может быть вставлена нуклеотидная последовательность для слияния метки FLAG, His метки и метки НА, метки GST и тому подобных и осуществления их экспрессии.

Такой экспрессионный вектор может быть получен способом, известным специалисту в данной области, и можно использовать имеющийся в продаже набор, сообразно обстоятельствам.

При экстракции экспрессируемого белка PspA из культивируемой клеточной массы или культивируемых клеток такую клеточную массу или культивируемые клетки отбирают известным способом после завершения культивирования, и данную клеточную массу или культивируемые клетки затем суспендируют в подходящем буферном растворе. Затем клеточную массу или культивируемые клетки разрушают, например, ультразвуком, лизоцимом и/или замораживанием-оттаиванием, и затем получают растворимый экстракт центрифугированием или фильтрованием. В частности, при использовании культивируемых клеток в качестве хозяев желательно применяют способ получения белка PspA, экспрессируемого в супернатанте культуры, посредством выделения супернатанта. Интересующий белок можно получать из полученного экстракта или супернатанта культуры посредством объединения подходящим образом известных способов разделения/очистки друг с другом. Примеры известных способов разделения/очистки могут включать: способы с применением растворимости, такие как высаливание и способ осаждения растворителем; способы, главным образом, с использованием различия в молекулярной массе, такие как способ диализа, способ ультрафильтрации, способ гель-фильтрации и SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия); способы с применением различия в электрическом заряде, такие как ионообменная хроматография; способы с применением специфической аффинности, такие как аффинная хроматография (например, смола, в которой глутатиону дают связываться с носителем, используется в случае, где полипептиду дают экспрессироваться совместно с меткой GST; смола Ni-NTA или смола на основе Со используется в случае, где полипептиду дают экспрессироваться совместно с His меткой; смола на основе антитела против НА используется в случае, где полипептиду дают экспрессироваться совместно с меткой НА; и смола, связывающаяся с антителом против FLAG, или тому подобная используется в случае, где полипептиду дают экспрессироваться совместно с меткой FLAG); способы применения разницы в гидрофобности, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой; и способы с применением разницы в изоэлектрической точке, такие как способ изоэлектрофокусировки.

Третье воплощение настоящего изобретения относится к вакцине для подавления инфекции, вызванной пневмококками, содержащей белок PspA по настоящему изобретению в качестве антигена (также именуемой далее «пневмококковая вакцина по настоящему изобретению»).

Белок PspA по настоящему изобретению, содержащийся в пневмококковой вакцине по настоящему изобретению, может содержаться один. Однако настоящий белок PspA также может содержаться в настоящей пневмококковой вакцине в виде слияния с целым или с частью белка PspA, отличного от белка PspA по настоящему изобретению (включая белок PspA, принадлежащий к отличному семейству и/или другой кладе) (см., например, WO 2018102774 и т.д.).

Пневмококковая вакцина по настоящему изобретению может содержать один или несколько типов адъювантов, таких как, например, полный адъювант Фрейнда или неполный адъювант Фрейнда, холерный токсин, термолабильный токсин Е. coli, гидроксид алюминия, калиевые квасцы, сапонин или его производное, мурамилдипептид, минеральное масло или растительное масло, новасом или неионный блоксополимер и DEAE декстран. Кроме того, пневмококковая вакцина по настоящему изобретению также может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Такой фармацевтически приемлемый носитель должен быть соединением, которое не влияет на здоровье животного, подлежащего вакцинации. Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой, например, стерилизованную воду или буфер.

Пневмококковая вакцина по настоящему изобретению может вводиться согласно обычному способу активной иммунизации. Настоящая пневмококковая вакцина может вводиться либо посредством инъекции, либо способом через слизистую, таким как пероральное или трансназальное введение. Кроме того, пневмококковая вакцина может вводиться один раз или много раз, в эффективном количестве для предупреждения или лечения пневмококковой инфекции (т.е. в достаточном количестве для индуцирования иммунитета для атаки пневмококков в живом организме) согласно подходящему способу для лекарственной формы. Данная пневмококковая вакцина может вводиться посредством внутрикожного, подкожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного, перорального введения или введения через слизистую (введение в нос или подъязычное введение). Кроме того, пневмококковая вакцина по настоящему изобретению также может использоваться смешанной с другими антигенными компонентами.

Доза и число доз настоящей пневмококковой вакцины может изменяться, в зависимости от субъекта введения. Пневмококковая вакцина, содержащая несколько десятков мкг антигена, вводится субъекту несколько раз с частотой от одного раза в неделю до одного раза в несколько недель, таким образом, что она может индуцировать защитный иммунитет субъекта.

Кроме того, пневмококковая вакцина по настоящему изобретению может содержать наногель таким образом, что она становится подходящей для введения через нос. В одном воплощении настоящего изобретения термин «наногель» используется для обозначения полимерных гелевых наночастиц, в которые добавляют гидрофобный холестерин в качестве боковой цепи гидрофильного полисахарида (например, пуллулана). Такой наногель можно получать согласно известному способу, такому как способ, описанный, например, в международной публикации WO 2000/012564.

В частности, во-первых, углеводороду, содержащему гидроксильную группу, имеющему от 12 до 50 атомов углерода, или стерину дают взаимодействовать с диизоцианатным соединением, представленным OCN-R₁ NCO (где представляет углеводородную группу, имеющую от 1 до 50 атомов углерода), с получением гидрофобного соединения, содержащего изоцианатную группу, с которой взаимодействует одна молекула углеводорода, содержащего гидроксильную группу, имеющего от 12 до 50 атомов углерода, или стерин. Полученному гидрофобному соединению, содержащему изоцианатную группу, дают взаимодействовать с полисахаридом с получением полисахарида, содержащего гидрофобную группу, содержащую углеводородную группу, имеющую от 12 до 50 атомов углерода или стерильную группу. Затем полученный продукт очищают в растворителе на основе кетона с получением полисахарида, содержащего гидрофобную группу, с высокой чистотой.

В качестве полисахарида в данном документе может использоваться пуллулан, амилопектин, амилоза, декстран, гидроксиэтилдекстран, маннан, леван, инулин, хитин, хитозан, ксилоглюкан, водорастворимая целлюлоза и т.д., и пуллулан является особенно предпочтительным.

Примеры наногеля, используемого в третьем воплощении настоящего изобретения, могут включать пуллулан, несущий катионную холестерильную группу (именуемый как «сСНР») и его производное. сСНР имеет структуру, в которой 1-10 холестеринов, предпочтительно один-несколько холестеринов участвуют в замещении на 100 моносахаридов в пуллулане, имеющем молекулярную массу от 30000 до 200000, например, имеющем молекулярную массу 100000. Кроме того, сСНР, используемый в настоящем изобретении, может быть заряжен, сообразно обстоятельствам, в показателях количества замещенных холестеринов, в зависимости от размера антигена или степени гидрофобности. Кроме того, для того чтобы изменить степень гидрофобности СНР, к СНР может быть добавлена алкильная группа (имеющая приблизительно от 10 до 30, предпочтительно от 12 до 20 атомов углерода). Наногель, используемый в настоящем изобретении, имеет диаметр частиц от 10 до 40 нм и предпочтительно от 20 до 30 нм. Наногели уже широко распространились на рынке, и также можно использовать такие имеющиеся в продаже наногелевые продукты.

Наногель, используемый в воплощении настоящего изобретения, представляет собой наногель, в который вводится функциональная группа, имеющая положительный заряд, такая как, например, аминогруппа, таким образом, что вакцина может вторгаться в поверхность отрицательно заряженной слизистой носа. В качестве способа введения аминогруппы в наногель можно применять способ с использованием холестеринпуллулана с добавленной аминогруппой (CHPNH₂). В частности, СНР, высушенный при пониженном давлении, растворяют в диметилсульфоксиде (DMSO), и затем добавляют к полученному раствору под током воздуха с азотом 1,1'-карбонилдиимидазол, с последующим проведением реакции при комнатной температуре в течение нескольких часов. Затем в реакционный раствор постепенно добавляется этилендиамин, и полученную смесь затем перемешивают в течение нескольких часов - нескольких десятков часов. Полученный реакционный раствор диализируют против дистиллированной воды в течение нескольких суток. После завершения диализа данный реакционный раствор лиофилизируют с получением опалесцентного твердого вещества. Степень замещения этилендиамина может оцениваться с использованием анализа элементов, Н-ЯМР (Н-ядерный магнитный резонанс) и т.д.

Пневмококковая вакцина по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемые известные стабилизаторы, антисептики, антиоксиданты и т.д. Данные стабилизаторы могут включать желатин, декстран и сорбит. Данные антисептики могут включать тиомерсал и β-пропиолактон. Данный антиоксидант может представлять собой α-токоферол.

Четвертое воплощение настоящего изобретения относится к способу предупреждения инфекционных заболеваний, вызванных пневмококками, включающему введение пациенту пневмококковой вакцины по настоящему изобретению.

В данном документе термин «предупреждать» означает, что у пациента, который может быть инфицирован пневмококком, инфекция предупреждается ранее и, посредством этого, предупреждение представляет собой обработку с целью предупреждения ранее начала пневмококковой инфекции.

Раскрытия всех публикаций, процитированных в настоящем описании, включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Кроме того, когда перевод настоящего описания включает термины в единственном числе, данные термины включают не только предметы в единственном числе, но также предметы во множественном числе, если из контекста явно не определяется иное.

Ниже настоящее изобретение будет дополнительно описываться в следующих примерах. Однако данные примеры являются лишь иллюстративными примерами воплощений настоящего изобретения и, таким образом, не подразумевают ограничение объема настоящего изобретения.

Примеры

1. Нативный PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле)

Экспрессионной системе Escherichia coli и т.д. давали экспрессировать разные типы белков PspA, а именно PspA 1-1 (SEQ ID NO: 5), PspA 1-2 (SEQ ID NO: 6), PspA 1-3 (SEQ ID NO: 4) и PspA 1-3 LB (SEQ ID NO: 3) (см. WO2018102774 относительно подробностей). Экспрессируемые белки PspA экстрагировали согласно обычному неденатурирующему способу и очищали согласно LDS (додецилсульфат лития)-РАСЕ с использованием ионообменной хроматографии, бутилсефарозы и тому подобного, пока они не становились гомогенными.

Во-первых, молекулы PspA 1-3 суспендировали в 2 мг/мл PBS немедленно после очистки и затем доводили до заданных значений рН (рН 6,5; рН 7,0; рН 8,0 и рН 8,5) с использованием 0,5 М NaH₂PO₄ или 0,5 М Na₂HP₄, с последующей консервацией при 25°С в течение заданного периода времени (в течение 1 суток, 2 суток и 5 суток). С использованием 10 мкл (1,0 мкг/полосу) каждого образца проводили электрофорез с использованием нативного PAGE при 200 В в течение 60 минут, и затем осуществляли окрашивание кумасси синим (BioRad). Кроме того, используемый в данном документе гель представлял собой 7,5% Mini-Protein TGX Gel 12 well (BioRad), используемый в данном документе раствор для обработки представлял собой буфер для нативных образцов для белковых гелей (BioRad), и используемый в данном документе электрофорезный буфер представлял собой 10х предварительно смешанный электрофорезный буфер (BioRad).

Посредством осуществления обработки при данных условиях в LDS-PAGE все образцы демонстрировали одну полосу, и кажущаяся молекулярная масса не изменялась (данные не показаны), тогда как при нативном PAGE формировалась полоса с высокой подвижностью через 5 суток после завершения обработки, независимо от рН (стрелка на Фиг. 2). Белок, соответствующий данной полосе, был определен как PspA 1-3 LB. Хотя данные и не показаны, это явление наблюдали в PspA 1-1 и PspA 1-2 сразу после очистки. С другой стороны, данное явление не наблюдали в PspA 2 (полученном из штамма EF3296) и PspA 3 (полученном из штамма EF5668). Таким образом, считается, что данное явление конкретно происходит у PspA, происходящего из пневмококкового штамма D39.

2. Пептидная карта

Для того чтобы определять молекулярное изменение от PspA 1-3 до PspA 1-3 LB добавляли 10 мкг трипсина (Sigma, уровень качества для секвенирования) к PspA 1-3 и PspA 1-3 LB (по 0,5 мг/мл каждого) сразу после очистки таким образом, что обработку расщеплением проводили при 37°С в течение 24 часов при рН 8,5, и затем 50 мкл обработанного образца вводили в систему ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (Waters С18, 1,7 мкм, 2,1×100 мм). Таким образом, анализ проводили при температуре разделения 50°С посредством 110 мин элюции линейным градиентом 0,1% TFA (100%) и 0,1% TFA - 40% ацетонитрил (55%) при скорости 0,2 мл/мин и 220 нм (выявление).

В результате выявляли пик с другим временем элюции (Фиг. 3). Следовательно, настоящий пик фракционировали и затем подвергали анализу N-конца с использованием секвенатора белка PPSQ-21A (Shimadzu). В результате в PspA 1-3 LB наблюдали последовательность AAEENDNVE (SEQ ID NO: 7). Данные результаты свидетельствовали о том, что в аминокислотной последовательности PspA 1-3 LB вероятно случалось бы специфичное дезаминирование.

3. Дезаминирование аминокислотной последовательности PspA 1-3 LB

Затем для анализа всей аминокислотной последовательности PspA 1-3 LB осуществляли такое же расщепление трипсином, что и описанное в п. 2 выше, и затем проводили анализ последовательности с использованием ЖХ-МС/МС (СВЭЖХ (сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография) HPLC acquity (Waters: С4, 1,7 мкм, 2,1×100 мм) - MS: Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo) MS1: Orbitrap, MS2: ионная ловушка.

В результате идентифицировали последовательность из 208 аминокислотных остатков (69%) в 302 аминокислотных остатка, и также был проведен полный анализ МС (интактная форма: 33569,03 и одна дезаминированная форма: 33569,93). Поскольку полученные значения согласовались с индивидуальными теоретическими значениями, было сделано заключение о том, что возможность появления отличного от N254D дезаминирования была крайне низкой.

4. Трансназальная иммунизация мышей

4-1. Способ

4-1-1. Образование наногеля, содержащего антиген (получение вакцины) Наногель сСНР и каждый белок PspA (PspA 1-1, PspA 1-2, PspA 1-3 и PspA 1-3 LB) смешивали друг с другом в молярном соотношении 1:1, и полученную смесь затем инкубировали с использованием термоблока при 40°С в течение 1 часа.

4-1-2. Трансназальная иммунизация мышей

Каждый раствор cCHP-PspA трансназально вводили 7-недельным самкам мышей Balb/c. В отношении одной дозы антигена, введенного на мышь, каждой мыши вводили 10 мкг антигена в показателях количества каждого белка PspA. Такую трансназальную иммунизацию проводили всего три раза с интервалами 1 неделя.

4-1-3. Получение образцов сыворотки от иммунизированных мышей

Для того чтобы измерять PspA-специфичный IgG в сыворотке, который увеличивался через 1 неделю после последней иммунизации, из глазничных вен иммунизированных мышей отбирали кровь. Отобранный образец крови центрифугировали при 4°С при 7000 об./мин, и затем выделяли супернатант и использовали в качестве образца сыворотки.

4-1-4. Измерение антигенспецифичного IgG

Планшет ELISA покрывали каждым антигеном до конечной концентрации 1 мкг/мл, и после завершения реакции, осуществляемой в течение ночи, промывали лунки. Для того чтобы избегать неспецифичной реакции, лунки блокировали PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), содержащим 1% BSA (бычий сыворотчный альбумин), при 25°С в течение 1 часа и дополнительно промывали. Затем образцы сыворотки получали серийным разведением от 2⁸, и каждый из полученного таким образом образца сыворотки добавляли в лунки с последующим проведением реакции при 25°С в течение 2 часов. После этого лунки промывали, затем добавляли в лунки антитело против мышиного IgG, меченое HRP (пероксидаза хрена), с последующим проведением реакции при 25°С в течение 1,5 часа. После дополнительной промывки добавляли раствор ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) в качестве субстрата HRP для развития окрашивания. Сразу после завершения реакции с 2 н. серной кислотой измеряли поглощение (450 нм) с использованием микропланшет-ридера, и титр антител затем рассчитывали согласно анализу конечной точки.

4-1. Результаты

Обнаружили, что посредством трансназального введения cCHP-PspA 1-1, cCHP-PspA 1-2, cCHP-PspA 1-3 или cCHP-PspA 1-3 LB мышам в сыворотке мышей индуцировался IgG, специфичный к каждому антигену. Кроме того, не было большого различия среди индивидуальных антигенов PspA (Фиг. 4).

Промышленная применимость

Пневмококковый поверхностный белок по настоящему изобретению и его часть можно использовать в качестве антигена пневмококковой вакцины.

Соответственно, ожидается, что настоящее изобретение будет использоваться в области предупредительной медицины в отношении инфекционных заболеваний.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> The University of Tokyo

HanaVax Inc.

<120> ПНЕВМОКОККОВЫЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ БЕЛОК А

<130> TPRU0403UVT

<150> JP2019- 65362

<151> 2019-03-29

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 588

<212> Белок

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 1

Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala

20 25 30

Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu

35 40 45

Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser

50 55 60

Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met

85 90 95

Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn

100 105 110

Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr

115 120 125

Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala

145 150 155 160

Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala

165 170 175

Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu

180 185 190

Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe

195 200 205

Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser

210 215 220

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asn Asn Val

245 250 255

Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu

275 280 285

Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Pro

290 295 300

Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro

305 310 315 320

Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp

325 330 335

Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn

340 345 350

Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala

355 360 365

Pro Lys Thr Gly Trp Lys Gln Glu Asn Gly Met Trp Tyr Phe Tyr Asn

370 375 380

Thr Asp Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Asn Asn Gly Ser Trp

385 390 395 400

Tyr Tyr Leu Asn Ser Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr

405 410 415

Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly

420 425 430

Trp Ala Lys Val Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala

435 440 445

Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn

450 455 460

Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Ala Lys Val Asn Gly Ser Trp

465 470 475 480

Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr

485 490 495

Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly

500 505 510

Trp Ala Lys Val Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala

515 520 525

Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Gly Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Glu

530 535 540

Ala Ser Gly Ala Met Lys Ala Ser Gln Trp Phe Lys Val Ser Asp Lys

545 550 555 560

Trp Tyr Tyr Val Asn Gly Leu Gly Ala Leu Ala Val Asn Thr Thr Val

565 570 575

Asp Gly Tyr Lys Val Asn Ala Asn Gly Glu Trp Val

580 585

<210> 2

<211> 588

<212> Белок

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 2

Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala

20 25 30

Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu

35 40 45

Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser

50 55 60

Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met

85 90 95

Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn

100 105 110

Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr

115 120 125

Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala

145 150 155 160

Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala

165 170 175

Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu

180 185 190

Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe

195 200 205

Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser

210 215 220

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asp Asn Val

245 250 255

Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu

275 280 285

Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Pro

290 295 300

Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro

305 310 315 320

Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp

325 330 335

Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn

340 345 350

Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala

355 360 365

Pro Lys Thr Gly Trp Lys Gln Glu Asn Gly Met Trp Tyr Phe Tyr Asn

370 375 380

Thr Asp Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Asn Asn Gly Ser Trp

385 390 395 400

Tyr Tyr Leu Asn Ser Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr

405 410 415

Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly

420 425 430

Trp Ala Lys Val Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala

435 440 445

Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn

450 455 460

Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Ala Lys Val Asn Gly Ser Trp

465 470 475 480

Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr

485 490 495

Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly

500 505 510

Trp Ala Lys Val Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala

515 520 525

Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Gly Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Glu

530 535 540

Ala Ser Gly Ala Met Lys Ala Ser Gln Trp Phe Lys Val Ser Asp Lys

545 550 555 560

Trp Tyr Tyr Val Asn Gly Leu Gly Ala Leu Ala Val Asn Thr Thr Val

565 570 575

Asp Gly Tyr Lys Val Asn Ala Asn Gly Glu Trp Val

580 585

<210> 3

<211> 302

<212> Белок

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 3

Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala

20 25 30

Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu

35 40 45

Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser

50 55 60

Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met

85 90 95

Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn

100 105 110

Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr

115 120 125

Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala

145 150 155 160

Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala

165 170 175

Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu

180 185 190

Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe

195 200 205

Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser

210 215 220

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asp Asn Val

245 250 255

Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu

275 280 285

Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu

290 295 300

<210> 4

<211> 302

<212> Белок

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 4

Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala

20 25 30

Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu

35 40 45

Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser

50 55 60

Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met

85 90 95

Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn

100 105 110

Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr

115 120 125

Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala

145 150 155 160

Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala

165 170 175

Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu

180 185 190

Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe

195 200 205

Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser

210 215 220

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asn Asn Val

245 250 255

Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu

275 280 285

Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu

290 295 300

<210> 5

<211> 384

<212> Белок

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 5

Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala

20 25 30

Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu

35 40 45

Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser

50 55 60

Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met

85 90 95

Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn

100 105 110

Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr

115 120 125

Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala

145 150 155 160

Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala

165 170 175

Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu

180 185 190

Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe

195 200 205

Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser

210 215 220

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asn Asn Val

245 250 255

Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu

275 280 285

Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro

290 295 300

Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro

305 310 315 320

Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro

325 330 335

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro

340 345 350

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys

355 360 365

Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr

370 375 380

<210> 6

<211> 356

<212> Белок

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 6

Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala

20 25 30

Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu

35 40 45

Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser

50 55 60

Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met

85 90 95

Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn

100 105 110

Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr

115 120 125

Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala

145 150 155 160

Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala

165 170 175

Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu

180 185 190

Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe

195 200 205

Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser

210 215 220

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asn Asn Val

245 250 255

Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu

275 280 285

Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro

290 295 300

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro

305 310 315 320

Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro

325 330 335

Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu

340 345 350

Thr Pro Lys Thr

355

<210> 7

<211> 9

<212> Белок

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 7

Ala Ala Glu Glu Asn Asp Asn Val Glu

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к антигенным пневмококковым белкам, и может быть использовано в медицине для вакцинирования против пневмококковой инфекции. Предложены происходящий из штамма Streptococcus pneumoniae D39 мутант пневмококкового поверхностного белка A (PspA) с заменой N254D, кодирующая его ДНК и вакцина, его содержащая. Изобретение обеспечивает получение мутанта PspA, который не подвергается дезаминированию и сохраняет стабильность в качестве молекулы даже около нейтрального интервала рН, при этом его антигенность и способность индуцировать нейтрализующее антитело не изменяется. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

1. Белок, имеющий антигенную активность пневмококковой вакцины, по следующим (а) или (b):

(а) белок, имеющий аминокислотную последовательность как изложено в SEQ ID NO: 3; или

(b) белок, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную (а) по аминокислотам на 90% или более, где аминокислота, соответствующая положению 254 в SEQ ID NO: 3, является аспарагиновой кислотой.

2. ДНК, кодирующая белок по п.1.

3. Пневмококковая вакцина, содержащая эффективное количество белка по п.1 в качестве антигена и фармацевтически приемлемый носитель.