ЛИНИИ СКОНСТРУИРОВАННЫХ КЛЕТОК-ПРОДУЦЕНТОВ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C12N7/02 C12N15/85 C12N15/86 

Ссылка на родственные заявки

[01] Согласно настоящей заявке испрашивается преимущество и приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/833548, поданной 12 апреля 2019 года; в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/839207, поданной 26 апреля 2019 года; и в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/979483, поданной 21 февраля 2020 года, раскрытия которых полностью включены в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Список последовательностей

[02] Настоящая заявка включает список последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и, таким образом, полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 9 апреля 2020 года, называется ULP-005WO_SL.txt и имеет размер 113 Кбайт.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

[03] Эта заявка в общем относится к линиям сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков и способам получения линий сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков для увеличения титра рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[04] Векторы на основе rAAV являются одним из наиболее многообещающих носителей для генной терапии человека. Рассматривается применение векторов rAAV во многих областях генной терапии. В частности, векторы rAAV могут доставлять терапевтические гены в делящиеся и неделящиеся клетки, и эти гены могут сохраняться в течение длительных периодов без встраивания в геном клетки-мишени. Хотя системы для получения rAAV разрабатывают последние двадцать лет, некоторые проблемы еще предстоит решить. Одним ограничением системы получения rAAV является выход низкого титра частиц rAAV. Для фармацевтической разработки генных продуктов на основе rAAV на доклинической стадии требуются большие количества векторов rAAV для исследования на более крупных видах, чтобы провести полные токсикологические исследования и исследования биораспределения, полезные для прогнозирования дозировок для людей. Кроме того, поскольку существующие системы получения rAAV приводят к получению низких титров, получение достаточных уровней rAAV для использования в испытаниях на людях и в вариантах коммерческого применения является сложной задачей. Исследователи изучили множество способов получения достаточно высоких титров частиц rAAV, но все еще существует большая потребность в решении этой проблемы. В частности, существует потребность в эффективных линиях клеток, которые способны продуцировать высококачественный rAAV с получением высокого титра. Получение rAAV с высоким титром с помощью линий сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, ускоряет применение этой векторной системы для использования в генной терапии in vivo.

Сущность настоящего изобретения

[05] Настоящее раскрытие решает задачу получения улучшенных титров rAAV для применения в генной терапии путем предоставления линий клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащих клетки, в которых один или несколько генов и/или белков были модифицированы. Также в настоящем документе описаны способы идентификации одного или нескольких генов и/или белков, которые имеют отношение к выработке rAAV, и способы получения линий сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV.

[06] В настоящем документе описаны композиции и способы получения линий клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащих клетки, которые могут продуцировать более высокий титр rAAV по сравнению с контрольными родительскими клетками. Более конкретно, в настоящем документе представлены линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащие клетки, в которых модулирована экспрессия одного или нескольких генов и/или белков с получением более высокого титра rAAV по сравнению с контрольными родительскими клетками. В одном аспекте в настоящем раскрытии представлены линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащие клетки, в которых экспрессия одного или нескольких генов и/или белков снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. Например, экспрессия ATP5EP2 (псевдогена 2 субъединицы эпсилон F1 АТФ-синтазы), LINC00319 (длинной межгенной не кодирующей белок РНК 319), CYP3A7 (члена 7 подсемейства A семейства 3 цитохрома P450), ABCA10 (члена 10 подсемейства A связывающей АТФ кассеты), NOG (ноггина), RGMA (корецептора A BMP отталкивающей направляющей молекулы), SPANXN3 (члена N3 семейства SPANX), PGA5 (пепсиногена A5), MYRIP белка, взаимодействующего с миозином VIIA и Rab), KCNN2 (члена 2 подсемейства N кальций-активированного калиевого канала) и/или NALCN-AS1 (антисмысловой РНК 1 NALCN) снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[07] В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлены линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащие клетки, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[08] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлена линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащая клетки, которые были сконструированы для снижения экспрессии и/или активности продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, по сравнению с соответствующими немодифицированными родительскими клетками. В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлена линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, которая демонстрирует снижение экспрессии и/или активности полипептида или полирибонуклеотида, экспрессированного по меньшей мере из одного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1, по сравнению с соответствующей родительской линией клеток.

[09] В одном аспекте в настоящем раскрытии представлена линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, в которой экспрессию одного или нескольких генов снижают с использованием нуклеазы, двухцепочечной РНК (dsRNA), малой интерферирующей РНК (siRNA), малой шпилечной РНК (shRNA), микроРНК (miRNA) или антисмыслового РНК-олигонуклеотида (ASO).

[010] В определенных вариантах осуществления экспрессию одного или нескольких генов снижают с помощью siRNA, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-11. Например, в некоторых вариантах осуществления экспрессия ATP5EP2 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 32 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия LINC00319 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 33 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия CYP3A7 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 34 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия NOG снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 35 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия SPANXN3 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия MYRIP снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 37 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия KCNN2 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 38 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия NALCN-AS1 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 39 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия RGMA снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 40 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия PGA5 снижена, а siRNA содержит последовательность SEQ ID NO: 10 в смысловой нити и последовательность SEQ ID NO: 41 в антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления экспрессия ABCA10 снижена, а siRNA содержит последовательность SEQ ID NO: 11 в смысловой нити и последовательность SEQ ID NO: 42 в антисмысловой нити.

[011] В определенных вариантах осуществления нуклеазу, используемую для снижения экспрессии одного или нескольких генов, выбирают из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), мегануклеазы, нуклеазы на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN), или белка, ассоциированного с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR).

[012] В определенных вариантах осуществления экспрессию одного или нескольких генов снижают с использованием редактирования генома CRISPR. В некоторых вариантах осуществления пары направляющих РНК используют для нацеливания на ген для снижения и/или устранения экспрессии этого гена. В определенных вариантах осуществления экспрессию одного или нескольких генов снижают с использованием пары направляющих РНК, причем каждая направляющая РНК: (a) содержит последовательность, выбранную из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 12-15, и/или (b) нацелена на последовательность ДНК-мишени, выбранную из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 16-31. Например, в некоторых вариантах осуществления пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2, и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2, и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления каждая молекула gRNA является аналогом 2’ O-метила, содержащим 3' фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в трех концевых нуклеотидах на одном или обоих своих 5’ и 3’ концах.

[013] В определенных вариантах осуществления одну пару направляющих РНК используют для снижения экспрессии одного гена. В определенных других вариантах осуществления множество пар направляющих РНК используют для снижения экспрессии одного или нескольких генов. В определенных вариантах осуществления экспрессия одного или нескольких генов и/или активность одного или нескольких генов и/или белков снижена и/или устранена в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по сравнению с контрольной родительской линией клеток. В определенных вариантах осуществления экспрессия гена и/или активность устранена в клетках-продуцентах и/или упаковщиках rAAV по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[014] В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV является линией эукариотических клеток. В определенных вариантах осуществления линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV является линией клеток человека. В определенных вариантах осуществления линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV является линией клеток насекомых. В определенных вариантах осуществления линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV является линией клеток HeLa. В определенных других вариантах осуществления линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV является линией клеток 293 первичной почки (HEK) человека.

[015] В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно настоящему раскрытию продуцирует более высокий титр rAAV, чем контрольная линия родительских клеток. В определенных вариантах осуществления титр rAAV, полученный из клеток линии клеток-продуцентов rAAV согласно настоящему раскрытию увеличен примерно в 1,5 - примерно в 7 раз по сравнению с титром rAAV, полученным из линии клеток, содержащей контрольные родительские клетки. Также в настоящем документе описан лизат линий сконструированных клеток. В определенных вариантах осуществления более высокий титр rAAV собирают из лизата. Также в настоящем документе описаны супернатанты клеточных культур из линий сконструированных клеток. В определенных вариантах осуществления более высокий титр rAAV собирают из супернатанта клеточной культуры.

[016] Также в настоящем документе описан способ получения линии клеток-продуцентов, причем способ включает доставку вектора rAAV в клетки линии клеток-упаковщиков, в которых экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ получения линии клеток-продуцентов, причем способ включает доставку вектора rAAV в клетки линии клеток-упаковщиков, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольной родительской клеткой.

[017] Также в настоящем документе описан способ получения rAAV путем заражения вирусом-помощником клеток линии клеток-продуцентов, полученной с помощью линии клеток-упаковщиков, причем экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 в линии клеток-упаковщиков снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. В определенных вариантах осуществления экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена в линии клеток-упаковщиков по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[018] В одном аспекте в настоящем раскрытии представлен способ получения rAAV путем заражения вирусом-помощником клеток линии клеток-продуцентов, причем экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 в линии клеток-продуцентов снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ получения rAAV путем заражения вирусом-помощником клеток линии клеток-продуцентов, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 в линии клеток-продуцентов снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[019] Также в настоящем документе описан способ сбора rAAV из линий клеток-продуцентов, в которых экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольной родительской линией клеток. Также описан способ сбора rAAV из линий клеток-продуцентов, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольной родительской линией клеток. В определенных вариантах осуществления выработка rAAV из линий клеток-продуцентов согласно настоящему раскрытию повышена по сравнению с контрольной родительской линией клеток.

[020] Также в настоящем документе описан способ идентификации одного или нескольких генов, имеющих отношение к выработке rAAV, причем способ включает i.) добавление одной или нескольких добавок, которые повышают титр rAAV в линии клеток; ii.) измерение глобальной экспрессии гена в транскриптоме в линиях клеток с добавками и без добавок; iii.) получение списка генов, которые дифференциально экспрессируются между линиями клеток с добавками и без добавок; и iv.) идентификацию одного или нескольких генов, которые имеют отношение к выработке rAAV. В некоторых вариантах осуществления один или несколько идентифицированных генов отвечает за снижение выработки rAAV.

[021] Также в настоящем документе описан способ получения линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV для стимулирования повышенной выработки rAAV. В некоторых вариантах осуществления выработку rAAV повышают путем модуляции экспрессии одного или нескольких генов и/или белков, идентифицированных из списка генов, которые дифференциально экспрессируются между линиями клеток-продуцентов rAAV с добавками или без добавок. В определенных вариантах осуществления титр rAAV повышают путем модуляции экспрессии одного или нескольких генов и/или белков, идентифицированных из списка генов, которые дифференциально экспрессируются между линиями клеток-продуцентов rAAV с добавками или без добавок. В некоторых вариантах осуществления модуляция одного или нескольких генов и/или белков повышает титр rAAV по меньшей мере в 1,5 раза по сравнению с титром rAAV линии клеток без модуляции. В определенных вариантах осуществления модуляция экспрессии представляет собой снижение экспрессии одного или нескольких генов. В определенных вариантах осуществления модуляция экспрессии включает в себя снижение экспрессии одного или нескольких белки. В определенных вариантах осуществления модуляция экспрессии представляет собой устранение экспрессии одного или нескольких генов. В определенных вариантах осуществления модуляция экспрессии включает в себя устранение экспрессии одного или нескольких белки.

[022] В некоторых вариантах осуществления линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV является линией эукариотических клеток. В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия клеток человека. В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия клеток насекомых. В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия клеток HeLa. В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.

[023] Также в настоящем документе описана линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая клетки, которые были сконструированы для снижения экспрессии и/или активности продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, по сравнению с соответствующими немодифицированными родительскими клетками.

[024] В некоторых вариантах осуществления экспрессия и/или активность продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, снижена на неопределенный срок или навсегда.

[025] В некоторых вариантах осуществления линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена или частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.

[026] В некоторых вариантах осуществления линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.

[027] В некоторых вариантах осуществления линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1.

[028] В некоторых вариантах осуществления линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.

[029] В некоторых вариантах осуществления линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать частичную или полную делецию гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1.

[030] Также представлена линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков, причем указанная линия клеток демонстрирует снижение экспрессии и/или активности полипептида или полирибонуклеотида, экспрессированного по меньшей мере из одного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1, по сравнению с соответствующей родительской линией клеток.

[031] Другие особенности и преимущества раскрытия будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

[032] Если не указано иное, все публикации, ссылки, патенты и/или заявки на выдачу патента, приведенные в настоящем документе, полностью включены в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Краткое описание фигур

[033] Раскрытие можно более полностью понять со ссылкой на следующее описание.

[034] На фиг. 1 представлено схематичное изображение, показывающее способы получения клеток-продуцентов и упаковщиков rAAV, описанных в настоящем документе.

[035] На фиг. 2A-2D представлены экспериментальные данные, полученные в результате оптимизации и разработки экспериментов по нокдауну siRNA HPRT1. На фиг. 2A-2B представлены данные процентного значения нокдауна (фиг. 2A) и экспрессии белка (фиг. 2B), полученные из экспериментов по нокдауну siRNA HPRT1, проводимых в 24 лунках. На фиг. 2C-2D представлены данные процентного значения нокдауна (фиг. 2C) и экспрессии белка (фиг. 2D), полученные из экспериментов по нокдауну siRNA HPRT1, проводимых в 6 лунках.

[036] На фиг. 3A-3B представлены значения логарифмического изменения экспрессии гена, полученных в результате биоинформатического анализа данных РНК-Seq для PGA5 (фиг. 3A) и SPANXN3 (фиг. 3B), представленных в виде логарифмического изменения экспрессии гена в клетках, культивируемых в среде для культивирования клеток без добавок, относительно незараженных клеток (клеток, не зараженных вирусом-помощником) и логарифмического изменения экспрессии гена в клетках, культивируемых в среде для культивирования клеток с добавками, относительно среды для культивирования клеток без добавок. На фиг. 3C-3D представлены значения кратного изменения RT-qPCR экспрессии PGA5 (фиг. 3C) и SPANXN3 (фиг. 3D) в клетках, культивируемых в среде для культивирования клеток без добавок и с добавками, относительно незараженных клеток.

[037] На фиг. 4A-4B представлены значения кратного изменения экспрессии PGA5 (фиг. 4A) и SPANXN3 (фиг. 4B) в клонах линий клеток-продуцентов, культивируемых в среде для культивирования клеток без добавок и в среде для культивирования клеток с добавками, относительно незараженных клеток (клеток, не зараженных вирусом-помощником), которые определяют по RT-qPCR. 21C5, 3C6, 2B6 представляют собой разные клоны линии клеток-продуцентов HeLa. На фиг. 4C-4D представлено относительное кратное повышение экспрессии PGA5 (фиг. 4C) и SPANXN3 (фиг. 4D) в клонах линий клеток-продуцентов 21C5, 3C6, 2B6, культивируемых в среде для культивирования клеток с добавками, по сравнению с клонами, культивируемыми в среде для культивирования клеток без добавок.

[038] На фиг. 5A-5F показано влияние снижения экспрессии отдельных генов в разных линиях клеток-продуцентов на титры rAAV. На фигурах представлены титры полученного rAAV в копиях генома (GC) на миллилитр (мл) для линии #1 клеток-продуцентов (фиг. 5A), линии #2 клеток-продуцентов (фиг. 5B) и линии #3 клеток-продуцентов (фиг. 5C). На фиг. 5D-5F представлено кратное изменение титров rAAV, полученных из линии #1 клеток-продуцентов (фиг. 5D), линии #2 клеток-продуцентов (фиг. 5E) и линии #3 клеток-продуцентов (фиг. 5F). На фиг. 5A-5B представлено среднее значение по 3 биологическим повторам. На фиг. 5C-5F представлено среднее значение по 4 биологическим повторам.

[039] На фиг. 6 представлена блок-схема, показывающая иллюстративный метод фильтрации генов.

[040] На фиг. 7A представлены титры из 24 глубоких лунок лучших 19 клонов с нокаутом 2H5. Титр представлен в виде копий генома на мл. Контрольный образец не имеет модификации 2H5. На фиг. 7B представлено кратное изменение титра по сравнению с контролем 2H5. Титр 2H5 был принят за 1, а другие титры представлены в виде кратного увеличения по сравнению с контролем 2H5. На фиг. 7C представлены титры из 24 глубоких лунок лучших 19 клонов с нокаутом 7B12. Титр представлен в виде копий генома на мл. Контрольный образец не имеет модификации 7B12. На фиг. 7D представлено кратное изменение титра по сравнению с контролем 7B12. Титр 7B12 был принят за 1, а другие титры представлены в виде кратного повышения выше контроля 7B12.

[041] На фиг. 8A представлено 15 титров ambr® лучших пяти клонов с нокаутом 2H5. Титр представлен в виде копий генома на мл. Контрольный образец не имеет модификации 2H5. На фиг. 8B представлено кратное изменение титра по сравнению с контролем 2H5. Титр 2H5 был принят за 1, а другие титры представлены в виде кратного увеличения по сравнению с контролем 2H5. На фиг. 8C представлено 15 титров ambr® лучших четырех клонов с нокаутом 7B12. Титр представлен в виде копий генома на мл. Контрольный образец не имеет модификации 7B12. На фиг. 8D представлено кратное изменение титра по сравнению с контролем 7B12. Титр 7B12 был принят за 1, а другие титры представлены в виде кратного повышения выше контроля 7B12.

[042] На фиг. 9A-9B показано влияние на титр rAAV, полученное за счет снижения экспрессии разных комбинаций генов в двух линиях клеток-продуцентов. На фигурах представлено кратное изменение титра rAAV по сравнению с контролем, обработанным siRNA с антисмысловой мутацией. На фиг. 9A представлено кратное изменение титра по сравнению с контролем 2H5 с антисмысловой мутацией. Титр 2H5 с антисмысловой мутацией был принят за 1, а другие титры представлены в виде кратного повышения выше контроля 2H5 с антисмысловой мутацией. На фиг. 9B представлено кратное изменение титра по сравнению с контролем 7B12 с антисмысловой мутацией. Титр 7B12 с антисмысловой мутацией был принят за 1, а другие титры представлены в виде кратного повышения выше контроля 7B12 с антисмысловой мутацией.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

[043] В настоящем раскрытии описана линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая клетки, в которых модулирована экспрессия одного или нескольких генов и/или белков. модуляция экспрессии гена приводит к получению повышенного титра по сравнению с линией клеток, в которых экспрессия одного или нескольких генов и/или белков не модулирована.

[044] Если не указано иное, технические термины использованы в соответствии с обычным использованием. Определения общих терминов в молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8.

[045] Следующие определения приведены с целью понимания предмета настоящего изобретения и для создания приложенной формулы изобретения. Используемые в данном документе сокращения имеют общепринятые значения в области химии и биологии.

Определения

[046] В рамках настоящего изобретения «модуляция» или «модулировать» относится к изменению регуляции, экспрессии или активности гена и/или белка. Модуляция может представлять собой увеличение, уменьшение (снижение) или прекращение экспрессии и/или активности одного или нескольких генов и/или белков. В случае, когда модулировано множество генов и/или белков, может быть повышена вся экспрессия и/или активность генов и/или белков, или вся экспрессия и/или активность генов и/или белков может быть снижена, или экспрессия и/или активность одного или нескольких генов и/или белков может быть повышена, и других генов и/или белков может быть снижена.

[047] В рамках настоящего изобретения термин «клетка» относится к любой клетке или клеткам, способным вырабатывать рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV). В некоторых вариантах осуществления клеткой является клетка млекопитающего, например, клетка HeLa, клетка COS, клетка HEK293, клетка A549, клетка BHK или клетка Vero. В других вариантах осуществления клеткой является клетка насекомого, например, клетка Sf9, клетка Sf-21, клетка Tn-368 или клетка BTI-Tn-5B1-4 (High-Five). Термин «линия клеток» относится к клональной популяции клеток, способных продолжать деление и не подвергаться старению. Если не указано иное, термины «клетка» или «линия клеток» нужно понимать, как включающие в себя модифицированные или сконструированные варианты указанной клетки или линии клеток.

[048] В рамках настоящего изобретения термин «линия сконструированных клеток» относятся к линии клеток, которые были модифицированы одним или несколькими способами для снижения экспрессии или других свойств (например, биологической активности) одного или нескольких эндогенно экспрессированных генов и/или белков (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1) для увеличения выработки rAAV.

[049] В рамках настоящего изобретения термин «контрольные родительские клетки» относится к клеткам, которые не были модифицированы одним или несколькими способами для снижения экспрессии или других свойств (например, биологической активности) одного или нескольких эндогенно экспрессированных генов и/или белков (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1) для увеличения выработки rAAV.

[050] В рамках настоящего изобретения термин «контрольная линия родительских клеток» относится к клональной популяции контрольных родительских клеток, способных продолжать деление и не подвергаться старению.

[051] «Лизис» относится к разрушению клеток, часто посредством вирусных, ферментативных или осмотических механизмов, которое нарушает их целостность. «Лизированная клетка» представляет собой клетку, которая подверглась значительному лизису. В рамках настоящего изобретения термин «лизат» относится к текучей среде, содержащей лизированные клетки.

[052] В рамках настоящего изобретения термин «более высокий титр» означает повышенный титр по сравнению с титром, создаваемым линией немодифицированных контрольных родительских клеток и/или контрольной родительской клеткой.

[053] В рамках настоящего изобретения термин «супернатант клеточной культуры» относится к средам для культивирования клеток, в которых клетки суспендируют и/или культивируют.

[054] В рамках настоящего изобретения термин «ген» относится к единице транскрипции и регуляторным областям, которые примыкают (например, расположены перед и после) и функционально связаны с единицей транскрипции. Единица транскрипции представляет собой серию нуклеотидов, транскрибированных в молекулу РНК. Единица транскрипции может содержать кодирующую область. «Кодирующая область» представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует необработанную preRNA (то есть молекулу РНК, которая содержит как экзоны, так и интроны), которая впоследствии преобразуется в мРНК. Единица транскрипции может кодировать некодирующую РНК. Некодирующая РНК представляет собой молекулу РНК, которая не транслируется в белок. Примеры некодирующих РНК включают микроРНК. границы единицы транскрипции обычно определяет участок инициации на его 5′-конце и терминатор транскрипции на его 3-конце. «Регуляторная область» представляет собой нуклеотидную последовательность, которая регулирует экспрессию единицы транскрипции, с которой она функционально связана. Неограничивающие примеры регуляторных последовательностей включают промоторы, энхансеры, участки инициации транскрипции, участки начала трансляции, участки остановки трансляции, терминаторы транскрипции и поли(A) сигналы. Регуляторная область, расположенная перед единицей транскрипции, может называться 5′-UTR, а регуляторная область, расположенная после единицы транскрипции, может называться 3′-UTR. Регуляторные область может быть транскрибирована и быть частью необработанной preRNA.

[055] В контексте этого документа термин «мишень» или «ген-мишень» относится к любому гену, в том числе к кодирующим белки генам и генам, кодирующим некодирующие РНК (например, miRNA), который при модуляции изменяет какой-то аспект получения вируса. Гены-мишени включают эндогенные гены, вирусные гены и трансгены.

[056] Что касается обозначений генов, отдельные гены часто обозначаются множеством символов. В контексте этого документа символы генов, относятся ли они к человеку или не к человеку, могут быть обозначены заглавными или строчными буквами. Ни использование одного определенного символа, ни использование символов нижнего или верхнего регистра не предназначены для ограничения объема гена в контексте этих раскрытий. Все указанные в настоящем документе идентификационные номера генов (GeneID) получены из Национального центра биотехнологической информации «Entrez Gene» или веб-сайта KEGG, если не указано иное.

[057] Термин «примерно» использован в настоящем документе для обозначения приблизительно, ориентировочно, грубо или около. Когда термин «примерно» использован в сочетании с числовым диапазоном, он модифицирует этот диапазон, расширяя в пределах допустимых диапазонов значений границы выше и/или ниже указанных числовых значений.

[058] В рамках настоящего изобретения, будь то в переходной фразе или в основной части формулы изобретения, термины «содержат (содержит)» и «содержащий» следует интерпретировать как имеющие неограниченное значение. То есть термины следует интерпретировать как синонимы фраз «имеющий по меньшей мере» или «содержащий по меньшей мере». При использовании в контексте способа термин «содержащий» означает, что способ включает по меньшей мере перечисленные этапы, но может включать дополнительные этапы. При использовании в контексте композиции термин «содержащий» означает, что композиция имеет по меньшей мере перечисленные особенности или компоненты, но может также иметь дополнительные особенности или компоненты.

[059] С целью способствовать пониманию вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, для их описания использованы ссылки на предпочтительные варианты осуществления и конкретный язык. Терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего раскрытия. В рамках настоящего изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Если не указано иное, все процентные значения и соотношения, используемые в данном документе, являются массовыми.

[060] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области, к которой относится это раскрытие. Хотя при практическом применении или при тестировании настоящего раскрытия можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже описаны подходящие методы и материалы. Кроме того, материалы, методы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены в качестве ссылки.

Аденоассоциированный вирус (AAV)

[061] AAV представляет собой небольшой вирус с дефектом репликации без оболочки, который заражает людей и некоторые другие виды приматов. Неизвестно, чтобы AAV вызывал заболевание, и он вызывает очень слабый иммунный ответ. Векторы для генной терапии, в которых использован AAV, могут заражать как делящиеся, так и покоящиеся клетки и могут сохраняться во внехромосомном состояние без интеграции в геном клетки-хозяина. Эти особенности делают AAV привлекательным вирусным вектором для генной терапии. AAV имеет множество серологически различимых типов, в том числе серотипы AAV-1 - AAV-12, а также более 100 серотипов от не являющихся людьми приматов (См., например, Srivastava, J. Cell Biochem., 105 (1): 17-24 (2008)), и Gao et al., J. Virol., 78 (12), 6381-6388 (2004)). AAV реплицируется не автономно, и имеет жизненный цикл с латентной фазой и инфекционной фазой. В латентной фазе, после того как клетка инфицирована AAV, сайт AAV специфично интегрируется в геном хозяина в качестве провируса. Инфекционная фаза не возникает, если клетка также не заражена вирусом-помощником (например, аденовирусом (AV) или вирусом простого герпеса), который обеспечивает репликацию AAV.

[062] Геном AAV дикого типа содержит два инвертированных концевых повтора (ITR) из 145 нуклеотидов, которые содержат сигнальные последовательности, управляющие репликацией AAV, инкапсидацией и интеграцией генома. В дополнение к ITR три промотора AAV, p5, p19 и p40, управляют экспрессией двух открытых рамок считывания, кодирующих гены rep и cap. Два промотора rep в сочетании с дифференциальным сплайсингом одного интрона AAV приводят к получению из гена rep четырех белков rep (Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40). Белки rep отвечают за репликацию генома. Ген cap экспрессируется с промотора p40 и кодирует три белка капсида (VP1, VP2 и VP3), которые являются вариантами сплайсинга гена cap. Эти белки образуют капсид частицы AAV.

[063] Поскольку цис-действующие сигналы для репликации, инкапсидации и интеграции содержатся в ITR, часть или весь внутренний геном размером 4,3 т.п.н. может быть заменен чужеродной ДНК, например, экспрессионной кассетой для представляющего интерес экзогенного белка. В этом случае белки rep и cap предоставлены в транс-форме, например, в плазмиде. Для получения вектора AAV линия клеток, допускающая репликацию AAV, должна экспрессировать гены rep и cap, экспрессионную кассету, фланкированную ITR, и вспомогательные функции, обеспечиваемые вирусом-помощником, например, гены AV E1a, E1b55K, E2a, E4orf6 и VA (Weitzman et al., Adeno-associated virus biology. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols, pp. 1-23, 2011). Выработка вектора AAV может также привести к выработке частиц вируса-помощника, которые необходимо удалить или инактивировать перед использованием вектора AAV. Для получения векторов AAV подходят различные типы клеток, включая клетки HEK293, клетки COS, клетки HeLa, клетки BHK, клетки Vero, а также клетки насекомых (см., например, патенты США №№ 6156303, 5387484, 5741683, 5691176, 5688676, 8163543, публикацию США № 20020081721, публикации РСТ № WO00/47757, WO00/24916 и WO96/17947). Векторы AAV обычно продуцируются в этих типах клеток одной плазмидой, содержащей экспрессионную кассету, фланкированную ITR, и одной или несколькими дополнительными плазмидами, обеспечивающими дополнительные гены AAV и вируса-помощника.

[064] В настоящем раскрытии можно использовать AAV любого серотипа. Аналогично, предполагается, что можно использовать любой тип AV, и специалист в данной области будет способен идентифицировать типы AAV и AV, подходящие для получения из них нужного рекомбинантного вектора AAV (rAAV). Частицы AAV и AV можно очищать, например, с помощью аффинной хроматографии, градиента йодиксанола или градиента CsCl.

[065] Геном AAV дикого типа представляет собой одноцепочечную ДНК и составляет 4,7 т.п.н. Векторы AAV могут иметь одноцепочечные геномы размером 4,7 т.п.н. или больше или меньше 4,7 т.п.н., включая геномы с другим размером от 5,2 т.п.н. или с размером до 3,0 т.п.н. Кроме того, геномы векторов могут быть по существу самокомплементарными, так что внутри вируса геном является по существу двухцепочечным. Векторы AAV, содержащие геномы всех типов, подходят для использования в способе настоящего раскрытия.

[066] Как обсуждалось выше, AAV требует совместного заражения вирусом-помощником, чтобы войти в инфекционную фазу своего жизненного цикла. К вирусам-помощникам относятся аденовирус (AV) и вирус простого герпеса (HSV), и существуют системы для продуцирования AAV в клетках насекомых с использованием бакуловируса. Также было высказано предположение, что вирусы папилломы также могут обеспечивать вспомогательную функцию для AAV (см., например, Hermonat et al., Molecular Therapy 9, S289 - S290 (2004)). К вирусам-помощникам относятся любые вирусы, способные создавать и обеспечивать репликацию AAV. AV представляет собой вирус без оболочки с ядерной ДНК с геномом двухцепочечной ДНК размером примерно 36 т.п.н. AV способен спасать латентный провирус AAV в клетке, предоставляя гены E1a, E1b55K, E2a, E4orf6 и VA и обеспечивая репликацию и инкапсидацию AAV. HSV - это семейство вирусов, которые имеют относительно большой двухцепочечный линейный ДНК-геном, заключенный в икосаэдрический капсид, который заключен в липидную двухслойную оболочку. HSV заразны и легко передаются. Следующие белки репликации HSV-1 были идентифицированы как необходимые для репликации AAV: комплекс геликаза/примаза (UL5, UL8 и UL52) и связывающий ДНК белок ICP8, кодируемый геном UL29, с другими белками, усиливающими вспомогательную функцию. Система упаковки AAV служит двум целям: она позволяет обойти проблему процесса трансфекции и предоставить технологию производства, основанную на использовании одной или нескольких вспомогательных функций.

Получение rAAV

[067] Общие принципы rAAV можно посмотреть в другом месте (См., например, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 3:533-539; и Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., 158:97-129). В общих словах, чтобы обеспечить получение rAAV, клетке нужно обеспечить ITR AAV, которые могут, например, фланкировать интересующую гетерологичную нуклеотидную последовательность, функции генов rep и cap AAV, а также дополнительные вспомогательные функции. Их можно доставить в клетку с использованием любого количества подходящих плазмид или векторов. Дополнительные вспомогательные функции могут быть обеспечены, например, с помощью аденовирусной (AV) инфекции, плазмиды, несущей все необходимые гены вспомогательной функции AV, или других вирусов, таких как HSV или бакуловирус. Любые гены, функции генов или генетический материал, необходимый для выработки rAAV клеткой, могут временно существовать внутри клетки, или их можно стабильно вводить в геном клетки. Способы получения rAAV, подходящие для использования со способами согласно настоящему раскрытию, включают способы, раскрытые в Clark et al., Human Gene Therapy 6:1329-1341 (1995), Martin et al., Human Gene Therapy Methods 24:253-269 (2013), Thorne et al., Human Gene Therapy 20:707-714 (2009), Fraser Wright, Human Gene Therapy 20:698-706 (2009) и Virag et al., Human Gene Therapy 20:807-817 (2009). Двумя основными подходами к системам получения AAV являются линия клеток-упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) и линия клеток-продуцентов аденоассоциированного вируса (rAAV).

Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV)

[068] Линию клеток-упаковщиков rAAV можно получить путем обеспечения клеточной экспрессии генетических элементов AAV, описанных в данном документе. Стабильная трансфекция клеточной линии (например, HEK293, HeLa) плазмидой, кодирующей гены rep и cap AAV, может привести к получению линии клеток-упаковщиков. Эту линию клеток-упаковщиков rAAV можно совместно инфицировать двумя разными аденовирусами (вирусом-помощником и гибридным вирусом, содержащим элементы генной терапии AAV) с образованием частиц rAAV. Альтернативно, стабильная трансфекция клеток-упаковщиков плазмидой, содержащей вектор rAAV, или их инфицирование вектором rAAV приводит к линии клеток-продуцентов rAAV. Заражение клеток-продуцентов вирусом-помощником приводит к получению rAAV. На фиг. 1 представлены линии клеток-продуцентов и упаковщиков.

[069] В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия линия клеток-упаковщиков rAAV, имеющих функции генов rep и cap AAV, сконструирована для повышения титра rAAV.

[070] В одном аспекте в настоящем раскрытии представлена линия клеток-упаковщиков rAAV, содержащая клетки, в которых экспрессия одного или нескольких генов и/или белков снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. Например, экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[071] В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлена линия клеток-упаковщиков rAAV, содержащая клетки, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[072] В других вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлена линия клеток-продуцентов rAAV, содержащая клетки, в которых экспрессия одного или нескольких генов и/или белков снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. Например, экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. В некоторых вариантах осуществления линия клеток-продуцентов rAAV согласно настоящему раскрытию была сконструирована для снижения экспрессии гена KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3.

[073] В определенных вариантах осуществления линия клеток согласно настоящему раскрытию может быть в форме суспензии или прилипания.

[074] В определенных вариантах осуществления линия клеток согласно настоящему раскрытию (например, линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV) является линией клеток млекопитающих (например, линией клеток HeLa, первичной почки (HEK) 293 человека, COS, A549 или Vero). В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия клеток насекомых (например, Sf9, Sf-21, Tn-368 или BTI-Tn-5B1-4).

Способ получения линии клеток-продуцентов rAAV

[075] В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ получения линии клеток-продуцентов путем доставки вектора rAAV в линию сконструированных клеток-упаковщиков rAAV, содержащую клетки, в которых экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными клетками.

[076] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ получения линии клеток-продуцентов путем доставки вектора rAAV в линию сконструированных клеток-упаковщиков rAAV, содержащую клетки, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

Добавки

[077] В рамках настоящего изобретения термин «добавки» относится к любому соединению или другому материалу, химического или биологического происхождения, который можно использовать в средах для культивирования клеток для повышения титров rAAV или для анализа повышения титров rAAV. Неограничивающие примеры добавок включают аминокислоты, соли, металлы, сахара, липиды, нуклеиновые кислоты, гормоны, витамины, жирные кислоты, белки, ферменты, нуклеозиды, метаболиты, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, неорганические соли и полимеры. В определенных вариантах осуществления одна или несколько добавок, добавленных в линию клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно настоящему раскрытию, представляют собой аналог глюкокортикоида. В определенных вариантах осуществления одна или несколько добавок, добавленных в линию клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, представляют собой дексаметазон, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, кортизон, преднизон, будезонид и/или триамцинолон.

[078] В определенных вариантах осуществления концентрация аналога глюкокортикоида в растворе для увеличения титра rAAV может быть больше или равна 1 мкМ, больше или равна 0,1 мкМ, больше или равна 0,01 мкМ, от 0 до 1 мкМ, от 0 до 0,1 мкМ, от 0 до 0,01 мкМ, от 0,01 до 1 мкМ или от 0,01 до 0,1 мкМ.

[079] В рамках настоящего изобретения «линия клеток с добавками» относится к линии клеток (например, к линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV), в которую добавили одну или несколько добавок (например, аналогов глюкокортикоидов) для повышения титра rAAV. В рамках настоящего изобретения термины «линия клеток без добавок» относится к линии клеток (например, линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV), не подвергнутых воздействию добавки или добавок для повышения титра rAAV. В рамках настоящего изобретения термины «не содержащий добавок» и «без добавок» использованы взаимозаменяемо для ссылки на условия культивирования, когда линию клеток (например, линию клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, не подвергают воздействию добавки или добавок для повышения титра rAAV.

Способ идентификации одного или нескольких генов, имеющих отношение к выработке rAAV

[080] Настоящее раскрытие частично направлено на способ идентификации одного или нескольких генов, которые имеют отношение к выработке rAAV, путем сравнения картины глобальной экспрессии генов в линиях клеток с добавками и без добавок.

[081] Термин «глобальная экспрессия гена» хорошо известен в данной области (см. Wang Z. et al, Nature Reviews Genetics, 10(1), 57-63 (2009)). Термин «глобальная экспрессия гена» относится к одному или нескольким наборам данных, которые содержат информацию, касающуюся разных аспектов экспрессии гена. Набор данных необязательно содержит информацию, касающуюся: наличия транскриптов-мишеней в клетке или в полученных из клетки образцах; относительных и абсолютных избыточных уровнях транскриптов-мишеней; возможности разных вариантов обработки (например, добавления добавок) для модуляции экспрессии конкретных генов; и возможности разных вариантов обработки (например, добавление добавок) для изменения экспрессии конкретных генов до разных уровней.

[082] Термин «дифференциально экспрессированные» хорошо известен в данной области (см. Wang Z. et al, Nature Reviews Genetics, 10(1), 57-63 (2009), Ozsolak, F. et al Nature Reviews Genetics, 12(2), 87-98 (2011), Han, Y. et al Bioinformatics and Biology Insights, 9, 29-46 (2015)).

[083] В определенных вариантах осуществления к линии клеток (например, линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV) согласно настоящему раскрытию добавляют одну или несколько добавок, которые повышают выработку rAAV. В некоторых вариантах осуществления образцы РНК извлекают из одной или нескольких линий клеток (с добавками и без добавок) с использованием любого из хорошо известных методов. Например, общая РНК может быть очищена из клеток с использованием выделения на основе диоксида углерода в совместимом с автоматизацией 96-луночном формате, таком как платформа очистки Rneasy® (Qiagen, Inc.; Valencia, Calif.).

[084] Характер экспрессии гена в экспрессированных образцах РНК можно оценивать с помощью одного (или обоих) качественных и количественных измерений. В некоторых вариантах осуществления полезно количественно оценивать уровень экспрессии гена относительно других продуктов экспрессии и/или относительно контрольной последовательности. Одним из удобных и широко применимых методов определения относительной экспрессии является сравнение экспрессии одного или нескольких интересующих генов с экспрессией контролирующего гена, такого как ген домашнего хозяйства (например, HPRT1, HSP70 или β-актин).

[085] Для того, чтобы удостовериться, что наблюдаемые данные экспрессии, например, изменение профиля экспрессии гена в ответ на одну или несколько обработок (например, добавление добавок) биологического образца (например, линий клеток с добавками и без добавок), являются значимыми, и, например, это не просто результат экспериментального шума или неоднородности популяции, оценка распределения вероятностей может быть построена для каждой генетической и фенотипической конечной точки в каждом биологическом образце. Построение предполагаемого распределения популяции включает в себя проведение множества независимых экспериментов для каждой обработки, например, все эксперименты проводят в двух, трех, четырех повторах и тому подобное. Данные экспрессии из нескольких биологических образцов (например, линий клеток с добавками и без добавок) могут быть сгруппированы или кластеризированы с использованием многомерной статистики. Анализ данных может дать список генов, которые дифференциально экспрессируются в ответ на обработку, например, между линиями клеток с добавками и без добавок. Список дифференциально экспрессируемых генов может быть отфильтрован с использованием различных методологий фильтрации генов для идентификации одного или нескольких генов, которые полезны для увеличения выработки rAAV.

[086] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие направлено на способы идентификации одного или нескольких генов из списка генов, дифференциально экспрессированных между линиями клеток с добавками и без добавок, которые имеют отношение к выработке rAAV. В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия эукариотических клеток. В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия клеток человека. В определенных вариантах осуществления линией клеток является линия клеток HeLa или линия клеток HEK293. В определенных вариантах осуществления глобальную экспрессию гена измеряют в разных линиях клеток (например, между линиями клеток HeLa без добавок и HeLa с добавками, между линиями клеток HEK 293 без добавок и HEK 293 с добавками, между линиями клеток HeLa без добавок и HEK 293 с добавками, между линиями клеток HeLa без добавок и HEK 293 без добавок, между линиями клеток HeLa с добавками и HEK 293 с добавками) для идентификации одного или нескольких генов, которые имеют отношение к выработке rAAV. В определенных вариантах осуществления данные о глобальной экспрессии гена из HEK 293 с добавками и HeLa с добавками можно комбинировать и сравнивать с комбинированными данными о глобальной экспрессии гена из линии клеток HEK 293 без добавок и HeLa без добавок для идентификации одного или нескольких генов, которые имеют отношение к выработке rAAV.

[087] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ получения линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV для стимулирования повышенной выработки rAAV. В некоторых вариантах осуществления выработку rAAV повышают путем модуляции экспрессии одного или нескольких генов и/или белков, идентифицированных из списка генов, которые дифференциально экспрессируются между линиями клеток-продуцентов rAAV с добавками или без добавок. В определенных вариантах осуществления титр rAAV повышают путем модуляции экспрессии одного или нескольких генов и/или белков, идентифицированных из списка дифференциально экспрессированных генов между линиями клеток-продуцентов rAAV с добавками или без добавок. В некоторых вариантах осуществления титр rAAV увеличен по меньшей мере в 1,5 раза (например, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 20 раз или 30 раз) по сравнению с титром rAAV, продуцируемым линией клеток без модуляции экспрессии соответствующего гена (генов) и/или белка (белков).

Модулированные Гены и/или Белки

[088] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен список генов, которые при модуляции (индивидуально или в комбинациях) в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV усиливают выработку rAAV.

[089] Псевдоген 2 субъединицы эпсилон F1 АТФ-синтазы (также известный как ATP5EP2) кодирует митохондриальный белок, подобный субъединице эпсилон АТФ-синтазы. ATP5EP2 представляет собой митохондриальную мембрану АТФ-синтазы, которая продуцирует АТФ из АДФ в присутствии протонного градиента через мембрану, который создается комплексами переноса электронов дыхательной цепи. Примеры последовательностей ATP5EP2 человека доступны в виде эталонной последовательности НМ_006886,4 (SEQ ID NO: 43) или NG_053163,1 (SEQ ID NO: 44) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[090] Длинная межгенная не кодирующая белок РНК 319 (также известная как LINC00319) представляет собой РНК-ген и относится к классу некодирующих РНК. Было показано, что длинные некодирующие РНК (lncRNA) играют важную регуляторную роль в патогенезе и прогрессировании множества видов рака. Примеры последовательностей LINC00319 доступны в виде эталонной последовательности НМ_194309 (SEQ ID NO: 45) или NR_026960.1 (SEQ ID NO: 46) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[091] Член 7 подсемейства A семейства 3 цитохрома P450 (также известный как CYP3A7) представляет собой ген, который кодирует элемент суперсемейства цитохрома P450 ферментов, которые участвуют в метаболизме лекарственных средств и синтезе холестерина, стероидов и других липидов. Этот фермент гидроксилирует тестостерон и дегидроэпиандростерон-3-сульфат, который участвует в образовании эстриола во время беременности. Этот ген является частью кластера родственных генов на хромосоме 7q21.1. Примеры последовательностей CYP3A7 доступны в виде эталонной последовательности НМ_000765 (SEQ ID NO: 47) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[092] Член 10 подсемейства A связывающей АТФ кассеты (также известный как ABCA10) кодирует ассоциированный с мембраной белок, который относится к члену суперсемейства переносчиков связывающей АТФ кассеты. Белки ABC переносят различные молекулы через внеклеточные и внутриклеточные мембраны. гены ABC делятся на семь отдельных подсемейств (ABC1, MDR/TAP, MRP, ALD, OABP, GCN20 и White). ABCA10 представляет собой член субсемейства ABC1. Члены субсемейства ABC1 составляют единственное крупное подсемейство ABC, встречающееся исключительно у многоклеточных эукариот. Этот ген сгруппирован среди четырех других членов семейства ABC1 на 17q24. Примеры последовательностей ABCA10 доступны в виде эталонной последовательности НМ_080282,3 (SEQ ID NO: 48) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[093] Ноггин (также известный как NOG) кодирует секретируемый полипептид, который связывает и инактивирует элементы сигнальных белков суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета), такие как костный морфогенетический белок-4 (BMP4). Не связывая себя теорией, считается, что диффундируя через внеклеточные матрицы более эффективно, чем члены суперсемейства TGF-бета, этот белок может играть основную роль в создании морфогенных градиентов. NOG, по-видимому, обладает плейотропным эффектом как на ранней стадии развития, так и на более поздних стадиях. Примеры последовательностей NOG доступны в виде эталонной последовательности НМ_005450,4 (SEQ ID NO: 49) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[094] Корецептора A BMP отталкивающей направляющей молекулы (также известный как RGMA) представляет собой ген, который кодирует член семейства отталкивающих направляющих молекул. Кодируемый белок представляет собой заякоренный гликозилфосфатидилинозитол гликопротеин, который функционирует как белок, направляющий аксоны в центральной нервной системе развивающегося и взрослого человека. Этот белок также может функционировать в качестве супрессора опухоли в некоторых видах рака. Примеры последовательностей RGMA доступны в виде эталонной последовательности НМ_020211,2 (SEQ ID NO: 50) или НМ_001166283,1 (SEQ ID NO: 51) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[095] Член N3 семейства SPANX (белок спермы, связанный с ядром на Х-хромосоме) (также известный как SPANXN3) представляет собой кодирующий белок ген. Примеры последовательностей SPANXN3 доступны в эталонной последовательности НМ_001009609 (SEQ ID NO: 52) в базе данных нуклеотидов NCBI (нуклеотидная последовательность).

[096] Пепсиноген-5, Группа I (также известный как PGA5 или пепсиноген A) кодирует предшественник белка расщепляющего фермента пепсина, член семейства эндопептидаз пептидазы A1. Кодируемый предшественник секретируют главные клетки желудка, и его подвергают автокаталитическому расщеплению в кислых условиях с образованием активного фермента, который участвует в переваривании пищевых белков. Этот ген находится в кластере связанных генов на хромосоме 11, каждый из которых кодирует один из множества пепсиногенов. Примеры последовательностей PGA5 доступны в виде эталонной последовательности НМ_014224,4 (SEQ ID NO: 53) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[097] Белок, взаимодействующий с миозином VIIA и Rab (также известный как MYRIP) кодирует эффекторный белок Rab, участвующий в переносе меланосомы, которая служит связью между связанным с меланосомой RAB27A и моторными белками MYO5A и MYO7A. Этот эффекторный белок Rab функционирует в качестве якорного белка протеинкиназы A (AKAP) и может выступать в качестве каркасного белка, который связывает PKA с компонентами механизма экзоцитоза, то облегчает экзоцитоз, в том числе высвобождение инсулина. Примеры последовательностей MYRIP доступны в виде эталонной последовательности НМ_015460 (SEQ ID NO: 54) или НМ_001284423,1 (SEQ ID NO: 55) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[098] Ген члена 2 подсемейства N кальций-активированного калиевого канала (также известный как KCNN2) представляет собой член семейства KCNN генов калиевого канала. Кодируемый белок представляет собой встроенный мембранный белок, который образует независимый от напряжения кальций-активированный канал с тремя другими связывающими кальмодулин субъединицами. альтернативный сплайсинг этого гена приводит к множеству вариантов транскриптов. Примеры последовательностей KCNN2 доступны в виде эталонной последовательности НМ_170775,2 (SEQ ID NO: 56) или НМ_001278204,1 (SEQ ID NO: 57) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[099] Антисмысловая РНК 1 NALCN (также известная как NALCN-AS1) представляет собой РНК-ген и относится к классу некодирующих РНК. Примеры последовательности NALCN-AS1 доступны в виде эталонной последовательности NW_011332700,1 (SEQ ID NO: 58) или NR_047687,1 (SEQ ID NO: 59) в базе данных нуклеотидов (нуклеотидных последовательностей) NCBI.

[0100] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлена линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащая клетки, в которых экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[0101] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлена линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащая клетки, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

[0102] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен список генов, которые при индивидуальной модуляции в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV усиливают выработку rAAV по сравнению с контрольной родительской линией клеток. В некоторых аспектах модуляция разных комбинаций генов в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV увеличивает выработку rAAV. В некоторых аспектах модуляция экспрессии по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 или по меньшей мере 11 генов в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV приводит к увеличению выработки rAAV по сравнению с контрольной родительской линией клеток.

Способы модуляции одного или нескольких генов и/или белков

[0103] Модуляцию (например, снижение) экспрессии или активности гена (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 или NALCN-AS1) можно обеспечить с помощью разных механизмов, в том числе, но без ограничения, изменения одного или нескольких следующих элементов: 1) количества копий гена, 2) транскрипции или трансляции гена, 3) стабильности или долговечности транскрипта, 4) количества копий мРНК или miRNA, 5) доступности некодирующей РНК или участка-мишени некодирующей РНК, 6) положения или степени посттрансляционных модификаций белка или 7) активности белка. Инструменты, которые можно использовать для модуляции экспрессии гена, включают, но без ограничения, нуклеазу, двухцепочечную РНК (dsRNA), малую интерферирующую РНК (siRNA), малую шпилечную РНК (shRNA), микроРНК (miRNA), антисмысловой РНК-олигонуклеотид (ASO), разрыв гена или частичную или полную делецию гена.

Нуклеаза

[0104] В определенных вариантах осуществления модуляцию гена обеспечивают с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN). Синтетические ZFN состоят из домена связывания цинкового пальца, слитого, например, с доменом расщепления ДНК FokI. ZFN могут быть разработаны/сконструированы для редактирования генома клеток, в том числе, но без ограничения, нокаута или нокина экспрессии гена у широкого диапазона организмов. для конструирования генома в широком диапазоне типов клеток также можно использовать мегануклеазы, нуклеазы на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN) или белки, ассоциированные с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR) (например, нуклеазы Cas) и триплексы. Описанные реагенты можно использовать для нацеливания на промоторы, кодирующие белки области (экзоны), интроны, 5′ и 3′ UTR и многое другое.

Молекулы Двухцепочечных РНК (dsRNA) для Модуляции

[0105] В определенных вариантах осуществления молекулы двухцепочечной РНК (dsRNA) можно использовать для модуляции экспрессии одного или нескольких генов в линии клеток, описанных в настоящем документе (например, линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV). молекулы dsRNA можно разработать в качестве антагонистов одного или нескольких генов путем нацеливания соответствующей последовательности РНК на основе гомологии последовательности. Такие dsRNA могут представлять собой малые интерферирующие РНК (siRNA), малые шпилечные РНК (shRNA) или микро-RNA (miRNA). Последовательность такой dsRNA будет содержать комплементарный участок мРНК, кодирующий один или несколько генов, подлежащих модулированию. Этот участок может быть на 100% комплементарным участку-мишени внутри мРНК, но также можно использовать более низкие уровни комплементарности (например, 90% или более или 95% или более). Обычно процентное значение комплементарности определяют по длине непрерывных остатков нуклеиновых кислот. молекула dsRNA согласно раскрытию может, например, иметь по меньшей мере 80% комплементарность с участком-мишенью внутри мРНК, измеренным на протяжении по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или более остатков нуклеиновых кислот. В некоторых случаях молекула dsRNA имеет по меньшей мере 80% комплементарность с участком-мишенью мРНК по всей длине молекулы dsRNA.

[0106] Другим нацеленным на ген реагентом, который использует пути РНК-интерференции (RNAi), является малая шпилечная РНК, также именуемая shRNA. shRNA, доставляемые в клетки, например, посредством экспрессионных конструкций (например, плазмид, лентивирусов), обладают способностью обеспечения продолжительного снижения экспрессии гена нерегулируемым или регулируемым образом, в зависимости от типа используемого промотора. В одном варианте осуществления геном лентивирусной частицы модифицируют так, чтобы он включал одну или несколько экспрессионных кассет shRNA, которые нацелены на интересующий ген (или гены). Такие лентивирусы могут заражать клетку, устойчиво встраивать их вирусный геном в геном хозяина и экспрессировать shRNA нерегулируемым, регулируемым или (в случае экспрессии множества shRNA) нерегулируемым и регулируемым образом. Поэтому в некоторых вариантах осуществления shRNA можно разработать для нацеливания на индивидуальные варианты отдельного гена или множества членов семейства близко родственных генов. Отдельная shRNA может модулировать наборы мишеней, имеющих аналогичные или дублирующие функции или мотивы последовательности. Специалисту будет понятно, что лентивирусные конструкции также могут содержать клонированную ДНК или экспрессионные конструкции ORF.

[0107] В вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, для модуляции функции гена можно использовать нацеленные на ген реагенты в том числе малую интерферирующую РНК (siRNA), а также микроРНК (miRNA). siRNA и miRNA могут иметь большой диапазон химических модификаций, уровни комплементарности с интересующим транскриптом-мишенью и конструкции (см. патент США № 8188060) для повышения стабильности, клеточной доставки, специфичность и функциональность. Кроме того, такие реагенты можно разработать для нацеливания на разные области гена (в том числе 5′ UTR, открытую рамку считывания, 3′ UTR мРНК) или (в некоторых случаях) на промоторные/энхансерные области геномной ДНК, кодирующей интересующий ген. Модуляция гена (например, снижение экспрессии гена, нокдаун) можно обеспечивать путем введения (в клетку) отдельной siRNA или miRNA или множества siRNA или наборов miRNA, нацеленных на разные области одного и того же транскрипта мРНК. доставку синтетической siRNA/miRNA можно обеспечивать с помощью любого количества способов в том числе, но без ограничения 1) самодоставки, 2) опосредованной липидами доставки, 3) электропорации или 4) экспрессионных систем на основе вектора/плазмиды. Вводимая молекула РНК может называться экзогенной нуклеотидной последовательностью или полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления siRNA можно разработать для нацеливания на индивидуальные варианты отдельного гена или множество членов семейства близко родственных генов.

[0108] siRNA можно использовать для снижения экспрессии одного или нескольких генов (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1). В некоторых вариантах осуществления siRNA, которая содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-11 или ее вариант, используют для снижения экспрессии гена-мишени.

Таблица 1: последовательности siRNA, используемые для снижения экспрессии генов.

SEQ ID NO: Ген-мишень Последовательность siRNA* SEQ ID NO 1 и 32 ATP5SEP2 Смысловая: GCAACAGCGUAAAAAUUGUtt (SEQ ID NO: 1)
Антисмысловая: ACAAUUUUUACGCUGUUGCca
(SEQ ID NO: 32) SEQ ID NO 2 и 33 LINC00319 Смысловая: CGGUGUCCACAGUCCUUGAtt
(SEQ ID NO: 2)
Антисмысловая: UCAAGGACUGUGGACACCGgt
(SEQ ID NO: 33) SEQ ID NO 3 и 34 CYP3A7 Смысловая: CAAGAAAAGUUAUAAGUUUtt
(SEQ ID NO: 3)
Антисмысловая: AAACUUAUAACUUUUCUUGga
(SEQ ID NO: 34) SEQ ID NO 4 и 35 NOG Смысловая: CGGAGGAAGUUACAGAUGUtt
(SEQ ID NO: 4)
Антисмысловая: ACAUCUGUAACUUCCUCCGca
(SEQ ID NO: 35) SEQ ID NO 5 и 36 SPANXN3 Смысловая: AGAUGCAAGAGGUACCAAAtt
(SEQ ID NO: 5)
Антисмысловая: UUUGGUACCUCUUGCAUCUca
(SEQ ID NO: 36) SEQ ID NO 6 и 37 MYRIP Смысловая: GGUGUCGGAUGAUUUAUCAtt
(SEQ ID NO: 6)
Антисмысловая: UGAUAAAUCAUCCGACACCtg
(SEQ ID NO: 37) SEQ ID NO 7 и 38 KCNN2 Смысловая: GAAGCUAGAACUUACCAAAtt
(SEQ ID NO: 7)
Антисмысловая: UUUGGUAAGUUCUAGCUUCct
(SEQ ID NO: 38) SEQ ID NO 8 и 39 NALCN-AS1 Смысловая: GGAUGUCUUUCCUAGGAGAtt
(SEQ ID NO: 8)
Антисмысловая: UCUCCUAGGAAAGACAUCCaa
(SEQ ID NO: 39) SEQ ID NO 9 и 40 RGMA Смысловая: CGCUCAUCGACAAUAAUUAtt
(SEQ ID NO: 9)
Антисмысловая: UAAUUAUUGUCGAUGAGCGgc
(SEQ ID NO: 40) SEQ ID NO 10 и 41 PGA5 Смысловая: CACUUUAGAUGUAUCUAAUtt
(SEQ ID NO: 10)
Антисмысловая: AUUAGAUACAUCUAAAGUGgg
(SEQ ID NO: 41) SEQ ID NO 11 и 42 ABCA10 Смысловая: GGAGCAUAAAGUAGACCGAtt
(SEQ ID NO: 11)
Антисмысловая: UCGGUCUACUUUAUGCUCCtt
(SEQ ID NO: 42)

*последовательности siRNA (смысловые и антисмысловые), используемые для снижения экспрессии генов. Нуклеотиды нижнего регистра в последовательностях представляют собой 3` выступ.

[0109] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии ATP5EP2, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 32 в антисмысловой нити.

[0110] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии LINC00319, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 33 в антисмысловой нити.

[0111] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии CYP3A7, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 34 в антисмысловой нити.

[0112] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии NOG, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 35 в антисмысловой нити.

[0113] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии SPANXN3, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36 в антисмысловой нити.

[0114] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии MYRIP, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 37 в антисмысловой нити.

[0115] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии KCNN2, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 38 в антисмысловой нити.

[0116] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии NALCN-AS1, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 39 в антисмысловой нити.

[0117] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии RGMA, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 40 в антисмысловой нити.

[0118] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии PGA5, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 41 в антисмысловой нити.

[0119] В некоторых вариантах осуществления siRNA, используемая для снижения экспрессии ABCA10, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11 или ее вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 42 в антисмысловой нити.

Антисмысловой РНК-олигонуклеотид (ASO)

[0120] Антисмыслового РНК-олигонуклеотида (ASO), можно использовать для модуляции экспрессии одного или нескольких генов в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV. Обычно, ASO используют для снижения экспрессии одного или нескольких генов. Используя известные методы и на основе знания последовательности одного или нескольких генов, подлежащих модулированию, можно разработать молекулы ASO для противодействия одному или нескольким генам путем нацеливания соответствующей РНК на основе гомологии последовательности. Последовательность ASO может иметь нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной участку-мишени мРНК или lncRNA, полученного из одного или нескольких генов. Этот участок может быть на 100% комплементарным участку-мишени внутри мРНК или lncRNA, но также можно использовать более низкие уровни комплементарности (например, 90% или более или 95% или более).

[0121] В некоторых вариантах осуществления ASO может быть антисмысловой РНК-олигонуклеотид, в котором по меньшей мере одной нуклеозидной связью последовательности является фосфоротиоатная связь, фосфородитиоатная связь, фосфотриэфирная связь, алкилфосфонатная связь, аминоалкилфосфотриэфирная связь, алкиленфосфонатная связь, фосфинатная связь, фосфорамидатная связь и аминоалкилфосфорамидатная связь, тиофосфорамидатная связь, тионоалкилфосфонатная связь, тионоалкилфосфотриэфирная связь, тиофосфатная связь, селенофосфатная связь или боранофосфатная связь. В отдельном варианте осуществления по меньшей мере одной межнуклеозидной связью последовательности антисмыслового РНК-олигонуклеотида является фосфоротиоатная связь. В некоторых вариантах осуществления все межнуклеозидные связи последовательности антисмыслового РНК-олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.

Геномное Редактирование CRISPR

[0122] В некоторых вариантах осуществления модуляцию экспрессии гена в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV проводят с использованием геномного редактирования CRISPR. геномное редактирование CRISPR обычно включает в себя два отдельных компонента: (1) направляющую РНК и (2) эндонуклеазу, конкретно ассоциированную с CRISPR (Cas) нуклеазу (например, Cas9). Направляющая РНК представляет собой комбинацию эндогенной бактериальной crRNA и tracrRNA в виде одного транскрипта химерной направляющей РНК (gRNA). Не связывая себя теорией, считается, что, когда gRNA и Cas экспрессируются в клетке, геномная последовательность-мишень может модифицироваться или навсегда разрушаться.

[0123] Комплекс gRNA/Cas привлекается в последовательность-мишень путем спаривания оснований между последовательностью gRNA и комплементом последовательности ДНК-мишени в гене для снижения экспрессии (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 или NALCN-AS1). для успешного связывания Cas геномная последовательность-мишень также должна содержать правильную последовательность мотива, смежного с протоспейсером (PAM), непосредственно после последовательности-мишени. Связывание комплекса gRNA/Cas помещает Cas в геномную последовательность-мишень в одном или более генах согласно настоящему раскрытию, так что Cas дикого типа может разрезать обе цепи ДНК, вызвая двухцепочечный разрыв. Его можно восстановить с помощью одного из двух общих путей репарации: (1) пути репарации ДНК через негомологичное соединение концов или (2) пути репарации, направляемой гомологией. Путь негомологичной репарации может приводить к инсерциям/делециям при разрыве двойной цепи, что может приводить к сдвигам рамки и/или преждевременным стоп-кодонам, эффективно нарушающим открытую рамку считывания гена-мишени. Путь репарации, направляемой гомологией, требует наличия матрицы для репарации, которую используют для фиксации разрыва двойной цепи.

[0124] Для геномного редактирования CRISPR можно использовать любую подходящую пару gRNA. Обычно пару gRNA используют для снижения экспрессии одного или нескольких генов (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1). В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пару gRNA используют для модуляции (например, снижения или устранения/нокаута) экспрессии ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.

[0125] Пару gRNA можно сконструировать с использованием известных методов и на основе знания последовательности одного или нескольких генов, подлежащих модулированию, обычно с использованием любой общедоступной подходящей компьютерной программы. Нокаутированные клетки-продуценты и/или упаковщики можно получать с использованием любого подходящего метода, причем в данной области известны стандартные методы, и коммерчески доступны подходящие наборы.

[0126] Пары gRNA можно доставлять в линию клеток-продуцентов раскрытия с помощью любого подходящего средства. Подходящие методы известны в данной области и включают использование плазмиды, вирусных и бактериальных векторов для доставки пар gRNA в линию клеток-продуцентов. Обычно пару gRNA доставляют с использованием плазмиды ДНК.

[0127] Пары gRNA можно использовать для снижения экспрессии одного или нескольких генов (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1). для модуляции экспрессии гена можно использовать множество пар gRNA. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пары gRNA используют для снижения экспрессии по меньшей мере одного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 или NALCN-AS1. для модуляции экспрессии KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 можно использовать множество пар gRNA. В некоторых вариантах осуществления gRNA могут быть модифицированными для повышения эффективности редактирования за счет повышения связывания с участком мишени и ингибирования разрушения нуклеазы. В определенных вариантах осуществления эти модификации могут представлять собой аналоги 2’ O-метила и 3’ фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в трех концевых нуклеотидах на обоих 5’ и 3’ концах gRNA. Иллюстративные последовательности ДНК-мишеней, на которые нацелены пары gRNA, используемые для модуляции экспрессии одного или нескольких генов, могут содержать любую из нуклеотидных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 16-31, перечисленных в таблице 2, или их варианты.

Таблица 2: Иллюстративные последовательности областей-мишеней пар gRNA (SEQ ID NO: 12-15) и последовательности ДНК-мишеней (SEQ ID NO: 16-31)

SEQ ID NO: Последовательность KCNN2 SEQ ID NO: 12 UUGCCACUACAGCUACCACC SEQ ID NO: 13 CCAAUGUACUCAGGGAAACA SEQ ID NO: 14 AGUCCACCAAAGUGUUUGCU SEQ ID NO: 15 AAAGGAGUCUGCUUACUUAC KCNN2 SEQ ID NO: 16 TTGCCACTACAGCTACCACC SEQ ID NO: 17 CCAATGTACTCAGGGAAACA SEQ ID NO: 18 AGTCCACCAAAGTGTTTGCT SEQ ID NO: 19 AAAGGAGTCTGCTTACTTAC RGMA SEQ ID NO: 20 CTTCTCGTAATGGCAGATCT SEQ ID NO: 21 GCACTTGAGGATCTTGCACG SEQ ID NO: 22 GAGGTCCTCTATGCCATGGA SEQ ID NO: 23 CCATACCCATCCATCCAGCT SPANXN3 SEQ ID NO: 24 CCCATGTGAAGGACCTTCAA SEQ ID NO: 25 GTTCTTCAAACTCTGTTCGG SEQ ID NO: 26 GAAGGCGTAGACTTATCTGA SEQ ID NO: 27 AGCCAACTTCCAGCACCAAT LINC00319 SEQ ID NO: 28 GGGCAATGGACCTTCTGCCT SEQ ID NO: 29 GGCTGCGGGGCAGAGGGCAA SEQ ID NO: 30 CGGGCAGGCTGCGGGGCAGA SEQ ID NO: 31 ACGGGCAGGCTGCGGGGCAG

[0128] Например, пары gRNA, используемые для нацеливания на KCNN2, могут содержать последовательность, выбранную из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 12-15 (представленных в таблице 2). В некоторых вариантах осуществления пара gRNA, используемая для нацеливания на KCNN2, содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления пара gRNA, используемая для нацеливания на KCNN2, содержит первую молекулу gRNA, содержащую или имеющую последовательность SEQ ID NO: 14, и вторую молекулу gRNA, содержащую или имеющую последовательность SEQ ID NO: 15.

[0129] В некоторых вариантах осуществления молекула gRNA для нацеливания на KCNN2 представляет собой аналог 2’ O-метила, содержащий 3’ фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в трех концевых нуклеотидах на одном или обоих его 5’ и 3’ концах, и содержит последовательность SEQ ID NO: 12, 13, 14 или 15.

[0130] Вариантная последовательность gRNA может иметь по меньшей мере 80% идентичность последовательности с последовательностью согласно настоящему раскрытию при измерении любой подходящей длины последовательности. Обычно процентное значение идентичности последовательностей определяют по длине смежных нуклеиновых кислот. Вариант последовательность gRNA согласно настоящему раскрытию может, например, иметь по меньшей мере 80% идентичность последовательности с последовательностью согласно настоящему раскрытию при измерении по меньшей мере на протяжении 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24 или более остатков нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления вариантная молекула gRNA имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательностей с молекулой gRNA согласно настоящему раскрытию по всей длине вариантной молекулы gRNA. В некоторых вариантах осуществления вариантная молекула gRNA согласно настоящему раскрытию может быть вариантом одной или нескольких молекул gRNA, области-мишени которых комплементарны последовательности-мишени одной из SEQ ID NO: 16-30. Пары gRNA согласно настоящему раскрытию могут содержать вариант одной или обеих из двух последовательностей gRNA в паре, нацеленной на ген, например, ген, выбранный из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1. Например, вариант пары gRNA, содержащий первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, может содержать 1) первую молекулу gRNA, содержащую вариант последовательности SEQ ID NO: 12, 2) вторую молекулу gRNA, содержащую вариант последовательности SEQ ID NO: 13 или 3) и ту и другую.

Модуляция на Уровне Белков

[0131] В другом варианте осуществления модуляция экспрессии и/или активности гена происходит на уровне белка (например, полипептида). Например, снижение функции гена на уровне белков можно обеспечить с помощью способов, включая, но без ограничения, нацеливание на белок малой молекулы, пептида, аптамера, дестабилизирующих доменов или другие способы, которые могут, например, снижать активность или повышать скорость разрушения продукта гена. Альтернативно, экспрессированный белок может быть модифицирован для снижения или устранения биологической активности посредством сайт-направленного мутагенеза и/или включения миссенс или бессмысловых мутаций. В некоторых вариантах осуществления малую молекулу, которая связывает, например, активный участок и ингибирует функцию белка-мишени, можно добавить, например, в среды для культивирования клеток и, тем самым, ввести в клетку-паковщик и/или продуцент. Альтернативно, функцию белка-мишени можно модулировать путем введения, например, пептида в клетку (например, клетку-паковщик и/или продуцент), что, например, предотвращает взаимодействия белок-белок (см. Shangary et. al., (2009) Annual Review of Pharmacology and Toxicology 49:223). Такие пептиды можно вводить в клетку (например, клетку-паковщик и/или продуцент), например, путем трансфекции или электропорации или с помощью экспрессионной конструкции. Альтернативно, пептиды можно вводить в клетку (например, клетку-паковщик и/или продуцент) путем добавления (например, посредством коньюгации) одного или нескольких фрагментов, которые облегчают клеточную доставку, или суперзаряженных молекул для повышения самодоставки. Методы экспрессии пептида включают, но без ограничения, слияние пептида с каркасом или присоединение сигнальной последовательности для стабилизации или направления пептида в, соответственно, интересующее положение или компартмент. В определенных вариантах осуществления линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV содержит клетки, которые были сконструированы для снижения экспрессии и/или активности продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, с использованием любого из вышеуказанных способов.

Влияние модуляции на экспрессию одного или нескольких генов и/или белков

[0132] В определенных вариантах осуществления способы модуляции, описанные в настоящем раскрытии, можно использовать для получения линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, которая продуцирует высокие титры rAAV. В определенных вариантах осуществления способы модуляции, описанные в настоящем раскрытии, могут приводить к значительному снижению экспрессии одного или нескольких генов (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1) и/или значительному снижению активности белка, экспрессируемого одним или несколькими генами (например, к снижению на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20% или большему снижению). В определенных вариантах осуществления экспрессию гена-мишени снижают от примерно 40% до примерно 100% (например, от примерно 40% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 85%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 75%, от примерно 40% до примерно 70%, от примерно 40% до примерно 65%, от примерно 40% до примерно 60%, от примерно 40% до примерно 55%, от примерно 40% до примерно 50%, от примерно 40% до примерно 45%, от примерно 45% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 55% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 65% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 75% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 85% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 95% до примерно 100%; или примерно на 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 100%).

[0133] В определенных вариантах осуществления способы модуляции, описанные в настоящем раскрытии, могут приводить к значительному снижению активности белка или РНК, экспрессируемой геном-мишенью (например, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1). Например, способы, описанные в настоящем документе, могут приводить к по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20% или большему снижению активности белка или РНК, экспрессируемой геном-мишенью. В определенных вариантах осуществления активность белка гена-мишени или РНК снижают от примерно 40% до примерно 100% (например, от примерно 40% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 85%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 75%, от примерно 40% до примерно 70%, от примерно 40% до примерно 65%, от примерно 40% до примерно 60%, от примерно 40% до примерно 55%, от примерно 40% до примерно 50%, от примерно 40% до примерно 45%, от примерно 45% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 55% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 65% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 75% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 85% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 95% до примерно 100%; или примерно на 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 100%). Кроме того, модуляция одного или нескольких генов может приводить к модуляции множества генов (например, посредством miRNA).

[0134] В определенных вариантах осуществления способы модуляции, описанные в настоящем раскрытии, могут приводить к значительному снижению экспрессии продукта гена (например, продукта гена ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1) (например, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20% или большему снижению). В определенных вариантах осуществления экспрессию продукта гена снижают от примерно 40% до примерно 100% (например, от примерно 40% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 85%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 75%, от примерно 40% до примерно 70%, от примерно 40% до примерно 65%, от примерно 40% до примерно 60%, от примерно 40% до примерно 55%, от примерно 40% до примерно 50%, от примерно 40% до примерно 45%, от примерно 45% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 55% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 65% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 75% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 85% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 95% до примерно 100%; или примерно на 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 100%).

[0135] В определенных вариантах осуществления способы модуляции, описанные в настоящем раскрытии, могут приводить к значительному снижению экспрессии полипептида или полирибонуклеотида, экспрессированного по меньшей мере из одного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 (например, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20% или большему снижению). В определенных вариантах осуществления экспрессию полипептида или полирибонуклеотида снижают от примерно 40% до примерно 100% (например, от примерно 40% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 85%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 75%, от примерно 40% до примерно 70%, от примерно 40% до примерно 65%, от примерно 40% до примерно 60%, от примерно 40% до примерно 55%, от примерно 40% до примерно 50%, от примерно 40% до примерно 45%, от примерно 45% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 55% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 65% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 75% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 85% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 95% до примерно 100%; или примерно на 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 100%).

[0136] В определенных вариантах осуществления способы модуляции, описанные в настоящем раскрытии, могут приводить к значительному снижению активности полипептида или полирибонуклеотида, экспрессированного по меньшей мере из одного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 (например, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20% или большему снижению). В определенных вариантах осуществления активность экспрессированного полипептида или полирибонуклеотида снижают от примерно 40% до примерно 100% (например, от примерно 40% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 85%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 75%, от примерно 40% до примерно 70%, от примерно 40% до примерно 65%, от примерно 40% до примерно 60%, от примерно 40% до примерно 55%, от примерно 40% до примерно 50%, от примерно 40% до примерно 45%, от примерно 45% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 55% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 65% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 75% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 85% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 95% до примерно 100%; или примерно на 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 100%).

[0137] В определенных вариантах осуществления снижение экспрессии и/или активности одного или нескольких генов, белков или РНК в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV сохраняется в течение примерно 5 дней (например, примерно 6 часов, примерно 12 часов, примерно 1 дня, примерно 2 дней, примерно 3 дней, примерно 4 дней, примерно 5 дней, примерно 6 дней, примерно 7 дней, примерно 8 дней, примерно 9 дней, примерно 10 дней или более).

[0138] В определенных вариантах осуществления сохранение снижения экспрессии и/или активности одного или нескольких генов, белков или РНК в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV предполагается на неопределенный срок или навсегда, например, за счет использования разрыва гена или частичной или полной делеции гена.

[0139] В определенных вариантах осуществления снижение экспрессии и/или активности одного или нескольких генов, белков или РНК в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV сохраняется в течение по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пятьхи, по меньшей мере десяти, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40 или более посевов линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV при культивировании.

Влияние модуляции на выработку rAAV

[0140] Модуляция одного или нескольких генов и/или белков в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV может приводить к повышению титра rAAV. В некоторых вариантах осуществления модуляция приводит к повышению титра rAAV, полученного из линий клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, примерно в 1,5-примерно в 7 раз (например, примерно 1,5-примерно 6,5, примерно 1,5-примерно 6, примерно 1,5-примерно 5,5, примерно 1,5-примерно 5, примерно 1,5-примерно 4,5, примерно 1,5-примерно 4, примерно 1,5-примерно 3,5, примерно 1,5-примерно 3,0, примерно 1,5-примерно 2,5, примерно 1,5-примерно 2,0, примерно 2-примерно 7, примерно 2,5-примерно 7, примерно 3-примерно 7, примерно 3,5-примерно 7, примерно 4-примерно 7, примерно 4,5-примерно 7, примерно 5-примерно 7, примерно 5,5-примерно 7, примерно 6 - примерно 7, примерно 6,5-примерно 7 или примерно 1,5, примерно 2,0, примерно 2,5, примерно 3,0, примерно 3,5, примерно 4,0, примерно 4,5, примерно 5,0, примерно 5,5, примерно 6,0, примерно 6,5 или примерно 7,0 раз). В некоторых вариантах осуществления титр rAAV, полученный из линий клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, увеличен по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 раз, по меньшей мере 6 раз, по меньшей мере 7 раз, по меньшей мере 8 раз, по меньшей мере 9 раз, по меньшей мере 10 раз, по меньшей мере 15 раз, по меньшей мере 20 раз или более. Любое повышение титра rAAV, обусловленное модуляцией одного или нескольких генов и/или белков, можно сравнивать с титром rAAV, полученным из контрольной линии родительских клеток.

[0141] В некоторых вариантах осуществления модуляция одного или нескольких генов и/или белков в линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV может повышать получение титра rAAV в течение по меньшей мере 2 дней, по меньшей мере 5 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере 40 дней, по меньшей мере 50 дней, по меньшей мере 60 дней, по меньшей мере 70 дней, по меньшей мере 80 дней, по меньшей мере 90 дней, по меньшей мере 100 дней или более.

Способы получения rAAV

[0142] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии описан способ получения rAAV из линий клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, которые были сконструированы для модуляции экспрессии одного или нескольких генов, белков или некодирующих РНК. В определенных вариантах осуществления rAAV получают путем заражения клеток линии клеток-продуцентов rAAV, полученной путем доставки вектора rAAV в линию сконструированных клеток-упаковщиков rAAV. В определенных вариантах осуществления rAAV получают путем заражения клеток линии клеток-продуцентов rAAV, в которых была модулирована экспрессия одного или нескольких генов, белков или некодирующих РНК. В определенных вариантах осуществления выработка rAAV из линии сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV повышена по сравнению с контрольной родительской линией клеток.

[0143] В определенных вариантах осуществления клетки линии сконструированных клеток-упаковщиков заражены вирусом-помощником (например, аденовирусом (AV) или вирусом простого герпеса), который обеспечивает репликацию rAAV. В некоторых вариантах осуществления клетки линии сконструированных клеток-продуцентов заражены вирусом-помощником (например, аденовирусом (AV) или вирусом простого герпеса).

Способы сбора rAAV

[0144] частицы rAAV можно получить из сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV путем лизиса клеток. Лизис сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV можно осуществить способами, в которых химически или ферментативно обрабатывают клетки для высвобождения инфекционных вирусных частиц. Эти способы включают использование нуклеаз, таких как бензoназа или ДНКаза, протеазы, такие как трипсин, или детергентов или поверхностно-активных веществ. Также можно использовать физическое разрушение, такое как гомогенизация или измельчение, или применение давления посредством ячейки под давлением микрофлюидизатора, или циклов замораживания-оттаивания. В определенных вариантах осуществления для сбора частиц rAAV можно использовать лизаты из сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV.

[0145] В определенных вариантах осуществления супернатант клеточной культуры можно собирать из сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV без необходимости лизиса клеток. В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия сконструированы клетки-продуценты и/или упаковщики rAAV секретируют частицы rAAV, которые можно собирать из супернатанта клеточной культуры без необходимости лизиса клеток. В определенных вариантах осуществления линия сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV имеет более высокий титр rAAV, чем титр контрольной линии родительских клеток, так что больше rAAV собирают из линии сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по сравнению с контрольной родительской линией клеток.

[0146] После сбора частиц rAAV может быть необходимо очищать образец, содержащий rAAV, для удаления, например, клеточного дебриса, образующегося в результате лизиса клеток. Способы минимальной очистки частиц AAV известны в данной области. Двумя иллюстративными методами очистки являются очистка с использованием хлорида цезия (CsCl) и йодиксанола в градиенте плотности. Оба метода описаны в Strobel et al., Human Gene Therapy Methods., 26 (4): 147-157 (2015). Минимальную очистку также можно выполнить с помощью аффинной хроматографии с использованием, например, аффинной смолы AVB Sepharose (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden). Способы очистки AAV с использованием аффинной смолы AVB Sepharose описаны, например, в Wang et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 2: 15040 (2015). После очистки частицы rAAV можно отфильтровать и хранить при температуре ≤-60°C.

[0147] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ сбора частиц rAAV, которые получены из линии сконструированных клеток-упаковщиков rAAV после совместного заражения двумя разными аденовирусами.

[0148] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ сбора частиц rAAV, которые получены после заражения линии клеток-продуцентов rAAV, полученной из линии сконструированных клеток-упаковщиков rAAV.

[0149] В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии представлен способ сбора частиц rAAV, которые получены после заражения линии сконструированных клеток-продуцентов rAAV вирусом-помощником.

Количественная оценка частиц rAAV

[0150] Количественная оценка частиц rAAV осложнена тем, что заражение AAV не приводит к цитопатическим эффектам in vitro, и поэтому анализы бляшек нельзя использовать для определения инфекционных титров. Однако частицы rAAV можно количественно определить с помощью ряда методов, включая количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) (Clark et al. Hum. Gene Ther. 10, 1031-1039 (1999)), дот-блотгибридизация (Samulski et al. J. Virol. 63, 3822-3828 (1989)) и по оптической плотности высокоочищенных векторных препаратов (Sommer et al. Mol. Ther. 7, 122-128 (2003)). Частицы, устойчивые к ДНКазе (DRP), можно количественно определять с помощью количественной полимеразной цепной реакции с уменьшенной экспрессией гена (qPCR) (DRP-qPCR) в режиме реального времени в термоциклере (например, в термоциклере с блок форматом 96 лунок iCycler iQ (Bio-Rad, Hercules, CA)). Образцы, содержащие частицы rAAV, можно инкубировать в присутствии ДНКазы I (100 ед/мл; Promega, Madison, WI) при 37°C в течение 60 мин с последующим расщеплением K (Invitrogen, Carlsbad, CA) (10 ед/мл) при 50°C в течение 60 мин, а затем денатурировать при 95°C в течение 30 мин. Используемый набор праймер-зонд должен быть специфичным к ненативному участку генома вектора rAAV, например, интересующей поли(A) последовательности белка. Продукт PCR можно амплифицировать с использованием любого подходящего набора параметров цикла в зависимости от длины и состава праймеров, зонда и амплифицированной последовательности. Альтернативные протоколы раскрыты, например, в Lock et al. Human Gene Therapy Methods 25(2): 115-125 (2014).

[0151] Амплификацию вирусного генома также можно измерить с использованием методов qPCR, аналогичных функциям, описанным выше. Однако для количественной оценки общей амплификации генома в клетках-продуцентах собирают только внутриклеточные образцы, и образцы не обрабатывают ДНКазой I для измерения как упакованных, так и неупакованных вирусных геномов. Амплификацию вирусного генома можно рассчитать для каждой клетки-хозяина путем одновременного измерения гена домашнего хозяйства клетки-хозяина, например, РНКазы P.

[0152] Инфекционность частиц rAAV можно определять с использованием анализа TCID50 (50% инфекционной дозы культуры ткани), как описано, например, в Zhen et al., Human Gene Therapy 15:709-715 (2004). В этом анализе частицы вектора rAAV серийно разбавляют и используют для совместного заражения линии клеток, экспрессирующих Rep/Cap вместе с частицами AV в 96-луночных планшетах. Через 48 часов после заражения из инфицированной и контрольной лунок извлекают общую клеточную ДНК. Затем измеряют репликацию вектора rAAV с использованием qPCR с трансген-специфическим зондом и праймерами. Инфекционность TCID50 на миллилитр (TCID50/мл) рассчитывают по уравнению Кербера с использованием соотношений лунок, положительных по AAV при 10-кратных серийных разведениях.

Терапевтические Варианты применения

[0153] rAAV, полученный из линий сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, описанных в настоящем документе, можно использовать, например, для генной терапии у млекопитающих. rAAV, полученный из сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, можно использовать для применения в генной терапии ex vivo и/или in vivo. rAAV, полученный из сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, можно использовать, например, для доставки малых молекул (например, siRNA или sgRNA), пептидов и/или белков.

[0154] В некоторых вариантах осуществления rAAV, полученный из линий сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, можно использовать для лечения заболевания или расстройства у нуждающегося в этом субъекта-человека. В определенных вариантах осуществления rAAV, полученный из линий сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, можно вводить в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

[0155] Любой подходящий способ или путь можно использовать для введения rAAV или содержащей rAAV композиции, полученной из линий сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков, описанных в настоящем документе. Пути введения включают, например, системный, пероральный, ингаляционный, интраназальный, интратрахеальный, внутриартериальный, внутриглазный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный и другие парентеральные пути введения. В некоторых вариантах осуществления rAAV или композицию, содержащую rAAV, полученный из линии сконструированных клеток-продуцентов и/или упаковщиков, вводят внутривенно.

[0156] Практика раскрытия будет более понятна из предшествующих примеров, которые представлены в данном документе только для иллюстративных целей и никоим образом не должны рассматриваться как ограничение раскрытия.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Разработка протоколов нокдауна

[0157] Эксперименты по нокдауну siRNA оптимизировали и разрабатывали для 6-луночного и 24-луночного форматов путем нокдауна гена домашнего хозяйства, HPRT1. Эксперименты, проводимые в 24 лунках, оценивали на основе множества факторов, таких как плотность посева, условия культивирования клеток (например, процентное значение диоксида углерода (CO₂), процентное значение фетальной бычьей сыворотки (FBS)), соотношение между реагентами для трансфекции (Lipofectamine® RNAiMax) и siRNA («Соотношение»), время инкубации и концентрация siRNA. Коммерчески доступные siRNA, разработанные для нокдауна гена HPRT1, использовали для оптимизации экспериментальных условий. Клетки-продуценты HeLa трансфицировали различными концентрациями siRNA с использованием Lipofectamine® RNAiMax в соответствии с инструкциями производителя. Процентное значение снижения экспрессии HPRT1 определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Оптимизированный 24-луночный метод нокдауна siRNA допускает нокдаун высоко экспрессированного гена, HPRT1, более чем на 80% по сравнению с исходным контролем. Как показано на фиг. 2A-D, клетки, посеянные по 1×105 клеток на лунку, в соотношении 1:5 между реагентом для трансфекции и siRNA, 8 нМ siRNA, показали наивысшую эффективность нокдауна. На фиг. 2A показано влияние различных используемых концентраций/соотношений siRNA на процентное значение нокдауна HPRT1. На фиг. 2B показано влияние различных используемых концентраций/соотношений siRNA на процентное значение экспрессии HPRT1. для оптимизации 6-луночного протокола тестировали две разные концентрации siRNA. Тестировали плотность посева 5×104, 8×104 и 1×105 для данных, представленных на фиг. 2A и 2B. На фиг. 2C показано влияние различных концентраций siRNA на процентное значение нокдауна HPRT1. На фиг. 2D показано влияние различных концентраций siRNA на процентное значение экспрессии HPRT1. Все эксперименты проводил в трех повторениях.

Пример 2: Секвенирование РНК

Восемь трехлитровых биореакторов работали в производственных условиях с добавками и без добавок в двух разных линиях клеток-продуцентов HeLaS3. два дополнительных биореактора работали без аденовируса 5 (Ad5) в качестве неинфицированного контроля. В таблице 3 приведены подробности об условиях биореактора и уровнях выработки.

Таблица 3: Условия биореактора и уровни выработки.

Состояние Линия клеток Уровень Выработки Плотность посева Базовая Среда Добавка (добавки) Ad5 1 21C5 Без регулировки выработки 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell - нет 2 21C5 Низкий 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell - 200 MOI 3 21C5 Низкий 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell - 200 MOI 4 21C5 Средний 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell + 200 MOI 5 21C5 Средний 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell + 200 MOI 6 21C5 Высокий 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell + 200 MOI 7 2B6 Без регулировки выработки 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell - нет 8 2B6 Низкий 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell - 200 MOI 9 2B6 Средний 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell + 200 MOI 10 2B6 Высокий 0,7×10⁶ клеток/мл 90% DMEM/10% Ex-Cell + 200 MOI

Сокращения, используемые в таблице 3: добавление одной или нескольких добавок обозначено (+); отсутствие одной или нескольких добавок обозначено (-); MOI- множественность заражения.

[0158] Через 30 часов после заражения Ad5 образцы отбирали для RNA-Seq. Образцы промывали один раз PBS, и осадок клеток хранили при -80°C до готовности для отправки. Экстракцию РНК и синтез кДНК экстрагированной РНК проводили способами, хорошо известными в данной области. Перед секвенированием подготовку библиотеки проводили с использованием коммерчески доступных наборов для подготовки библиотеки RNA-Seq. Секвенирование РНК проводили с использованием коммерчески доступных платформ для секвенирования Illumina. Полученные данные картировали в геноме человека, геном Ad5 и геном AAV2 с использованием методов картирования, хорошо известных в данной области. Отбрасывали любые данные, картированные в геноме Ad5. Еще один раунд секвенирования проводили для обогащения данных, картированных в геноме человека. Дифференциальные анализы проводили с использованием данных, полученных посредством секвенирования РНК (см. Таблицу 4).

Таблица 4: Дифференциальные анализы

Дифференциальный анализ # Условие Регулирования Экспериментальное Условие 1 PCL1; Без выработки PCL1*; Выработка (N.S.) 2 PCL1; Без выработки PCL2; Без выработки 3 PCL1; Без выработки PCL1; Выработка (S) 4 PCL1; Выработка (N.S.) PCL1; Выработка (S) 5 PCL1; Выработка (N.S.) PCL1; Выработка (S) 6 PCL1; Выработка (N.S.) PCL2; Выработка (N.S.) 7 PCL2; Без выработки PCL2; Выработка (N.S.) 8 PCL2; Без выработки PCL2; Выработка (S) 9 PCL2; Без выработки PCL2; Выработка (S) 10 PCL1; Выработка (S) PCL2; Выработка (S) 11 PCL2; Выработка (S) PCL2; Выработка (S) 12 PCL1; Выработка (S) PCL1; Выработка (S) 13 PCL1; Выработка (S) PCL1; Выработка (S)

* PCL1- линия клеток-продуцентов 1; PCL2- линия клеток-продуцентов 2; Без выработки - незараженные контрольные клетки; Выработка (N.S.)- зараженные Ad5 клетки, культивируемые в условиях без добавок; Выработка (S)- зараженные Ad5 клетки, культивируемые в условиях с добавками.

[0159] В этом примере дифференциальный анализ экспрессии рассчитывали как логарифмическое изменение (LogFC) уровней мРНК в экспериментальных условиях по сравнению с контрольными условиями. Гены с повышенной экспрессией экспрессировали как положительное LogFC, а гены с пониженной экспрессией экспрессировали как отрицательное LogFC. Статистически значимыми считались дифференциально экспрессируемыми генами, имеющими значение p ≤ 0,05. В каждом дифференциальном анализе от сотен до тысяч генов имели значительную повышенную или пониженную регуляцию. Критерий фильтрации установлен (см., например, на фиг. 6) и применяется для снижения набора данных до управляемого количества генов для оценки. Наборы генов выравнивали и перемещали в критерии фильтрациим, как описано в примере 6.

Пример 3: Проверка результатов, полученных в результате секвенирования РНК, посредством RT-qPCR

[0160] Небольшой набор генов был выбран для проверки данных секвенирования РНК. Результаты RNA-Seq подтверждали с использованием анализа RT-qPCR по методикам, хорошо известным в данной области. для анализа данных использовали способ ΔΔCt. RT-qPCR независимо подтвердила тенденции, наблюдаемые в данных RNA-Seq. На фиг. 3A-B представлены значения логарифмического изменения экспрессии гена, полученные в результате биоинформатического анализа данных RNA-Seq для PGA5 (фиг. 3A) и SPANXN3 (фиг. 3B). На оси X показаны условия (с добавками (дифференциальный анализ # 5, как описано в таблице 4) по сравнению с условиями без добавок (дифференциальный анализ #1, как описано в таблице 4)), в которых выращивали линии клеток-продуцентов, а на оси y представлены логарифмические изменения (LogFC) экспрессии гена. Логарифмическое изменение PGA5 (фиг. 3A) и SPANXN3 (фиг. 3B) экспрессии в клетках, культивируемых в среде для культивирования клеток без добавок, представлено относительно соответствующей экспрессии гена в незараженных клетках (клетках, не зараженных вирусом-помощником). Логарифмическое изменение PGA5 (фиг. 3A) и SPANXN3 (фиг. 3B) экспрессии в клетках, культивируемых в среде для культивирования клеток с добавками, представлено относительно соответствующей экспрессии гена в клетках, культивируемых в среде для культивирования клеток без добавок.

[0161] Экспрессию гена PGA5 и SPANXN3 в линиях клеток-продуцентов, выращенных в условиях с добавками и без добавок, также оценивали по RT-qPCR с использованием способов, хорошо известных в данной области. На фиг. 3C-D представлены значения кратного изменения RT-qPCR при экспрессии PGA5 (фиг. 3C) и SPANXN3 (фиг. 3D) в клетках, культивируемых в среде для культивирования клеток без добавок и с добавками, относительно незараженных клеток (клеток, не зараженных вирусом-помощником). На фиг. 3A-D показано, что данные, полученные в результате qPCR и секвенирования РНК, имеют такой же тренд.

Пример 4: Проверка результатов, полученных в результате секвенирования РНК, посредством RT-qPCR в разных клонах линии клеток-продуцентов

[0162] Результаты секвенирование РНК дополнительно проверяли путем проведения экспериментов RT-qPCR на РНК, выделенной из разных клонов линии клеток-продуцентов HeLa S3. На фиг. 4A-B представлены значения кратного изменения экспрессии PGA5 (фиг. 4A) и SPANXN3 (фиг. 4B) в клонах линий клеток-продуцентов, культивируемых в среде для культивирования клеток без добавок и в среде для культивирования клеток с добавками, относительно незараженных клеток (клеток, не зараженных вирусом-помощником), которые определяют по RT-qPCR. 21C5, 3C6 и 2B6 представляют собой разные клоны линии клеток-продуцентов HeLa. На фиг. 4C-D представлено относительное кратное повышение экспрессии PGA5 (фиг. 4C) и SPANXN3 (фиг. 4D) в клонах линий клеток-продуцентов 21C5, 3C6 и 2B6, культивируемых в среде для культивирования клеток с добавками, по сравнению с клонами, культивируемыми в среде для культивирования клеток без добавок. Эти результаты дополнительно подтверждают биоинформационные данные секвенирование РНК и RT-qPCR, описанное в примере 3.

Пример 5: Влияние нокдауна генов на титр rAAV

[0163] Эксперименты по нокдауну проводили путем индивидуального нокдауна генов в линиях клеток-продуцентов HeLa на основе оптимизированного протокола, обсуждавшегося в примере 1. Нуклеотидные последовательности siRNA были разработаны для каждого гена (см. Таблицу 1).

[0164] Установленное условие плотности посева составило 1×105, 8 нМ siRNA и соотношение siRNA:RNAiMAX 1:5. Выработку AAV индуцировали через 24 часа после снижения экспрессии генов, а rAAV собирали спустя 72 часа после заражения. Титр определяли для каждого образца и сравнивали с контролем не нацеленной антисмысловой siRNA. Этот эксперимент проводили независимо три раза, результаты усредняли, и проводили статистический анализ. На фиг. 5A-5C показано влияние siRNA отдельных генов в линиях 1-3 клеток-продуцентов, соответственно, на абсолютный титр rAAV (КГ/мл; GC= копии генома). На фиг. 5D-5F представлено кратное повышение титра rAAV с помощью siRNA отдельных генов в разных линиях 1-3 клеток-продуцентов, соответственно.

[0165] Как показано на фиг. 5A-5F, снижение экспрессии KCNN2, LINC00319, RGMA или SPANXN3 в линиях клеток-продуцентов приводило к статистически значимым в 2-4 раза более высоким титрам rAAV по сравнению с антисмысловым контролем. Через три линии клеток-продуцентов, эти четыре гена показали статистически значимое положительное влияние на титр при нокдауне. Эти результаты показывают, что эти гены являются отличными мишенями для более постоянных модификаций, таких как нокауты CRISPR/Cas9.

Пример 6: Метод фильтрации генов

[0166] Для фильтра 1 были выровнены гены из дифференциального анализа 1 и 7 (как описано в таблице 3). дифференциальный анализ для 1 и 7 выявил гены, которые подвергают повышенной или пониженной регуляции при добавлении аденовируса 5 в условиях без добавок. В анализе 1 рассмотрены клетки из линии клеток-продуцентов 21C5 (линии клеток-продуцентов 1, PCL1). В анализе 7 рассмотрены клетки из 2B6 (линии клеток-продуцентов 2, PCL2). В списке генов после этого фильтра 1 идентифицированы гены, которые не были специфичными для линии клеток, и это выравнивание обеспечило в общей сложности 9149 генов, которые были общими для двух линий клеток-продуцентов.

[0167] Для фильтра 2 гены из фильтра 1 выравнивали с генами, представленными в дифференциальном анализе 5. В анализе 5 рассмотрены гены, которые подвергают повышенной или пониженной регуляции в клетках из линии клеток-продуцентов 21C5 (PCL1) в условиях с добавками, по сравнению с условиями без добавок. целью этого дифференциального анализа было определение результатов выработки в условиях с добавками относительно выработки в условиях без добавок. целью выравнивания набора генов из фильтра 1 с дифференциальным анализом 5 была идентификация генов в условиях повышенной производительности, которые 1) не являются побочным продуктом улучшенных условий выработки 2) являются потенциально значимыми для двух разных линий клеток. После выравнивания 374 генов были перемещены вперед.

[0168] Для фильтра 3 только гены, которые имели большое пороговое значение LogFc >2 LogFC ±, были перемещены вперед. Это было сделано для обеспечения высокого уровня повышающей/понижающей регуляции в продвигаемых вперед генах и для того, чтобы дать определенную степень уверенности, что выбранные гены не являются артефактами RNA-Seq. После фильтра 77 генов были перемещены вперед.

[0169] Для фильтра 4 сохраняли только гены, которые показали как повышающую регуляцию в дифференциальном анализе 1 и дифференциальном анализе 5, так и понижающую регуляцию в дифференциальном анализе 1 и дифференциальном анализе 5. Например, один из 77 генов должен демонстрировать повышающую регуляцию из дифференциального анализа 1 и дальнейшую повышающую регуляцию в дифференциальном анализе 5 или понижающую регуляцию в дифференциальном анализе 1 и дальнейшую понижающую регуляцию в дифференциальном анализе 5. целью этого фильтра была гарантия, что для оцениваемых генов условия с высоким титром не оказывают антагонистического эффекта на регуляцию этого конкретного гена по сравнению с условиями с низким титром. После фильтрации оставалось одиннадцать генов для оценки. Иллюстративная блок-схема, показывающая иллюстративный метод фильтрации генов, показана на фиг. 6 (использовано сокращение: LogFC= логарифмическое изменение).

[0170] В таблице 5 представлены данные Log2FC из каждого сравнения в процессе фильтрации важных генов для продуктивности.

Таблица 5: Данные Log2FC

Ген Дифференциальный анализ 7 Дифференциальный анализ 1 Дифференциальный анализ 5 ATP5EP2 2,409 -1,1 -7,511 LINC00319 -4,382 -1,432 -6,58 CYP3A7 -8,018 -3,149 -2,814 ABCA10 -4,257 -2,025 -3,131 NOG -5,585 -1,468 -2,814 SPANXN3 4.99 6,238 2,423 PGA5 8,153 6,019 2,519 MYRIP 2,045 2,771 2,175 KCNN2 3,656 2,807 2,066 NALCN-AS1 4,558 2,639 2,024 RGMA 2,764 2,303 2,03

Пример 7: Нокаут Гена KCNN2

[0171] В этом примере две существующие высокооптимизированные линии моноклональных клеток-продуцентов HeLa (PCL) - 2H5 и 7B12 - были генетически модифицированы для нокаута гена KCNN2 (ранее идентифицированного в скрининге RNA-Seq, описанном в настоящем документе), который кодирует кальций-активированный белок калиевого канала, SK2.

[0172] KCNN2 был нокаутирован в клетках 2H5 или 7B12 HeLa с использованием селектируемого маркера eGFP. Подозреваемые нокауты KCNN2 обогащали для экспрессии eGFP и высевали в 96-луночных планшетах. Обеспечивали формирование колоний клеток, собирали геномную ДНК, и проводили ПЦР для амплификации области, содержащей нокаут. Продукт ПЦР секвенировали по Сэнгеру, и файлы секвенирования анализировали на наличие вставок/делеций. Увеличивали клоны 2H5 и 7B12 с высокой вероятностью нокаута для дальнейшего тестирования.

[0173] Лучшие клоны переносили в бессывороточную суспензионную культуру. Продуктивность клонов по сравнению с родительской линией оценивали с помощью выработки rAAV в 24 глубоких лунках. Клоны высевали из расчета 2×10⁵ клеток/мл в 3 мл культуры и инфицировали Ad5 при множественности заражения (MOI) 50. Через четыре дня после заражения собирали rAAV и оценивали титр. Кратное увеличение титра нормализовали к родительскому контролю. Лучшие клоны показали увеличение титра в 1,5-2,7 раза по сравнению с контрольными образцами. Титры 2H5 находились в диапазоне 2,46×10⁹-4,98×10¹⁰ КГ/мл (фиг. 7A). Когда титры были нормализованы к родительскому контролю, наблюдали кратное увеличение в диапазоне 1,2-2,7 раза (фиг. 7B). Титры 7B12 варьировались от 4,33×10⁸ до -1,88×10¹⁰ КГ/мл (фиг. 7C). Когда титры были нормализованы к родительскому контролю, было замечено увеличение в диапазоне 1,5-2,6 раза (фиг. 7D). Затем клоны с минимальным увеличением в 1,5 раза масштабировали в культуре во встряхиваемых колбах и инокулировали в ambr®15 для получения высокой плотности посева и получения rAAV с добавкой. Клетки высевали по 1,5×10⁶ клеток/мл и заражали Ad5 при MOI 50. rAAV собирали через четыре дня после заражения и оценивали титр. Кратное увеличение титра нормализовали к родительскому контролю. Лучшие клоны показали увеличение титра в 1,5-2,3 раза по сравнению с контрольными образцами. Титры 2H5 находились в диапазоне 1,5×10¹¹-3,82×10¹¹ КГ/мл (фиг. 8A). Когда титры были нормализованы к родительскому контролю, наблюдали кратное увеличение в 1,3-2,3 раза (фиг. 8B). Титры 7B12 находились в диапазоне 2,62×10¹⁰-1,35×10¹¹ КГ/мл (фиг. 8C). Когда титры были нормализованы к родительскому контролю, наблюдали кратное увеличение в 1,2-1,5 раза (фиг. 8D).

[0174] Эти данные устанавливают, что снижение или устранение экспрессии одного или нескольких генов, описанных в данном документе (например, посредством нокаута гена) в продуцирующих AAV клетках, можно использовать для увеличения выработки rAAV из сконструированных клеток.

Пример 8: Мультикомбинаторные нокдауны siRNA

[0175] В этом примере проводили мультикомбинационный нокдаун генов, ранее идентифицированных при описанном в настоящем документе скрининг RNA-Seq, с использованием siRNA для определения, будет ли одновременное нацеливание на несколько генов оказывать аддитивное влияние на титр.

[0176] Мультикомбинационные нокдауны проводили с использованием модификации способов, описанных в примере 5. Вкратце, клетки трансфицировали с использованием 8 нМ каждой siRNA и сохранением соотношения siRNA:RNAiMAX 1:5. Выработку AAV индуцировали через 24 часа после снижения экспрессии генов, и rAAV собирали спустя 72 часа после заражения. Титр определяли для каждого образца и сравнивали с контролем не нацеленной антисмысловой siRNA.

[0177] В этом примере провели нокдаун KCNN2 в комбинации с панелью других ранее описанных siRNA. Кроме того, провели нокдаун RGMA и SPANXN3 в комбинации друг с другом. В 2H5 комбинация нокдаунов показала диапазон повышения титра в 4,6-11,4 раз по сравнению с антисмысловым контролем (фиг. 9A). В 7B12 комбинация нокдаунов показала диапазон повышения титра в 3,4-9,7 раз по сравнению с антисмысловым контролем (фиг. 9B). Каждая комбинация показала повышения титра; однако не все комбинации были лучше только нокдауна KCNN2. Нокдаун KCNN2 привел к повышению в 5,3 раз в 2H5 (фиг. 9A) и повышению 5,1 раз в 7B12 (фиг. 9B).

[0178] Эти данные показывают, что дополнительное повышение выработки rAAV можно обеспечить посредством прямого нацеливания на множество областей генома с созданным высоким титром rAAV с получением моноклональных PCL.

Пронумерованные варианты осуществления

1. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая клетки, в которых экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

2. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 1, содержащая клетки, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

3. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 1 или 2, в которой экспрессию снижают с использованием нуклеазы, двухцепочечной РНК (dsRNA), малой интерферирующей РНК (siRNA), малой шпилечной РНК (shRNA), микроРНК (miRNA) или антисмыслового РНК-олигонуклеотида (ASO).

4. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно любому варианту осуществления 1-3, в которой экспрессию снижают с помощью siRNA, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1-11.

5. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия ATP5EP2 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 32 в антисмысловой нити.

6. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия LINC00319 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 33 в антисмысловой нити.

7. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия CYP3A7 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 34 в антисмысловой нити.

8. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия NOG снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 35 в антисмысловой нити.

9. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия SPANXN3 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36 в антисмысловой нити.

10. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия MYRIP снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 37 в антисмысловой нити.

11. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия KCNN2 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 38 в антисмысловой нити.

12. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия NALCN-AS1 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 39 в антисмысловой нити.

13. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия RGMA снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 40 в антисмысловой нити.

14. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия PGA5 снижена, а siRNA содержит последовательность SEQ ID NO: 10 в смысловой нити и последовательность SEQ ID NO: 41 в антисмысловой нити.

15. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 4, в которой экспрессия ABCA10 снижена, а siRNA содержит последовательность SEQ ID NO: 11 в смысловой нити и последовательность SEQ ID NO: 42 в антисмысловой нити.

16. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 3, в котором нуклеазу выбирают из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), мегануклеазы, нуклеазы на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN), или белка, ассоциированного с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR).

17. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно одному из вариантов осуществления 1-16, в которой экспрессию снижают с использованием редактирования генома CRISPR.

18. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 17, в которой экспрессию снижают с использованием пары направляющих РНК, причем каждая направляющая РНК:

(a) содержит последовательность, выбранную из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 12-15, и/или

(b) нацелена на последовательность ДНК-мишени, выбранную из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 16-31.

19. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 18, в которой пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2, и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13.

20. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 18, в которой пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2, и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15.

21. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 19 или 20, в которой каждая молекула gRNA является аналогом 2’ O-метила, содержащим 3' фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в трех концевых нуклеотидах на одном или обоих своих 5’ и 3’ концах.

22. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно любым из вариантов осуществления 1-21, в которой экспрессия гена устранена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

23. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно любым из вариантов осуществления 1-22, причем линией клеток является линия клеток человека.

24. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков согласно варианту осуществления 23, причем линией клеток человека является линия клеток HeLa или линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.

25. Линия клеток согласно любым из вариантов осуществления 1-24, причем линией клеток является линия клеток-упаковщиков rAAV.

26. Линия клеток согласно любым из вариантов осуществления 1-24, причем линией клеток является линия клеток-продуцентов rAAV.

27. Линия клеток согласно варианту осуществления 26, в которой титр rAAV увеличен примерно в 1,5 - примерно в 7 раз по сравнению с титром rAAV, полученным из линий клеток, содержащей контрольные родительские клетки.

28. Лизат линии клеток согласно любым из вариантов осуществления 1-27.

29. Супернатант клеточной культуры из линий клеток согласно любым из вариантов осуществления 1-27.

30. Способ получения линии клеток-продуцентов, причем способ включает доставку рекомбинантного аденоассоциированного вирусного (rAAV) вектора в клетки линии клеток-упаковщикова согласно варианту осуществления 25.

31. Способ получения rAAV, причем способ включает заражение клеток линии клеток-продуцентов, полученной способом согласно варианту осуществления 30 вирусом-помощником.

32. Способ получения rAAV, причем способ включает заражение клеток линии клеток-продуцентов согласно варианту осуществления 26 вирусом-помощником.

33. Способ согласно варианту осуществления 31 или 32, в котором rAAV собирают из линий клеток-продуцентов.

34. Способ по любому из вариантов осуществления 31-33, в котором выработка rAAV повышена по сравнению с контрольной родительской линией клеток.

35. Способ идентификации одного или нескольких генов, имеющих отношение к выработке rAAV, причем способ включает:

добавление одной или нескольких добавок, которые повышают титр rAAV в линии клеток;

измерение глобальной экспрессии гена в транскриптоме в линиях клеток с добавками и без добавок;

получение списка генов, которые дифференциально экспрессируются между линиями клеток с добавками и без добавок; и

идентификацию одного или нескольких генов, которые имеют отношение к выработке rAAV.

36. Способ согласно варианту осуществления 35, в котором одна или несколько добавок, добавленных в линию клеток, включают дексаметазон, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, кортизон, преднизон, будезонид или триамцинолон.

37. Способ получения линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV для стимулирования повышенной выработки rAAV, причем способ включает модуляцию экспрессии одного или нескольких генов, идентифицированных с использованием способа согласно варианту осуществления 35.

38. Способ по любому из вариантов осуществления 35-37, в котором линией клеток является линия клеток-упаковщиков rAAV.

39. Способ по любому из вариантов осуществления 35-37, в котором линией клеток является линия клеток-продуцентов rAAV.

40. Способ согласно варианту осуществления 39, в котором линия клеток-продуцентов rAAV увеличивает титр rAAV по меньшей мере в 1,5 раза больше титра rAAV, вырабатываемого линией клеток-продуцентов rAAV без модуляции экспрессии соответствующих одного или нескольких генов.

41. Способ по любому из вариантов осуществления 37-40, в котором модуляция экспрессии включает в себя снижение экспрессии одного или нескольких генов.

42. Способ по любому из вариантов осуществления 37-40, в котором модуляция экспрессии включает в себя устранение экспрессии одного или нескольких генов.

43. Способ по любому из вариантов осуществления 30-42, в котором линией клеток является линия клеток человека.

44. Способ согласно варианту осуществления 43, в котором линией клеток человека является линия клеток HeLa или линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.

45. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая клетки, которые были сконструированы для снижения экспрессии и/или активности продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, по сравнению с соответствующими немодифицированными родительскими клетками.

46. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно варианту осуществления 45, в которой экспрессия и/или активность продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, снижена на неопределенный срок или навсегда.

47. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно варианту осуществления 46, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена или частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.

48. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно варианту осуществления 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.

49. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно варианту осуществления 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1.

50. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно варианту осуществления 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.

51. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV согласно варианту осуществления 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать частичную или полную делецию гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1.

52. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), причем указанная линия клеток демонстрирует снижение экспрессии и/или активности полипептида или полирибонуклеотида, экспрессированного по меньшей мере из одного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1, по сравнению с соответствующей родительской линией клеток.

Включение посредством ссылки

[0179] Раскрытие каждого из патентных документов и научных статей, упоминаемых в настоящем документе, полностью включено посредством ссылки для всех целей.

Эквиваленты

[0180] Изобретение может быть реализовано в других конкретных формах без отклонения от сути или его основных характеристик. Следовательно, вышеупомянутые варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие изобретение, описанное в настоящем документе. Таким образом, объем изобретения указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в предшествующем описании, и все изменения, которые подпадают под значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, предназначены для включения в нее.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана линия клеток-упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая множество клеток, в которых экспрессия KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками. Также описаны способ получения линии клеток-продуцентов rAAV и способ получения rAAV. Технический результат заключается в получении улучшенных титров rAAV для применения в генной терапии путем предоставления линий клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV, содержащих клетки, в которых один или несколько генов и/или белков были модифицированы. 6 н. и 38 з.п. ф-лы, 30 ил., 5 табл., 8 пр.

1. Линия клеток-упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая множество клеток, в которых экспрессия KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

2. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 1, где экспрессия KCNN2, RGMA, LINC00319 и SPANXN3 во множестве клеток снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

3. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 1 или 2, в которой экспрессию снижают с использованием нуклеазы, двухцепочечной РНК (dsRNA), малой интерферирующей РНК (siRNA), малой шпилечной РНК (shRNA), микроРНК (miRNA) или антисмыслового РНК-олигонуклеотида (ASO).

4. Линия клеток-упаковщиков rAAV по любому из пп. 1-3, в которой экспрессию снижают с помощью siRNA, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1-11.

5. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия KCNN2 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 38 в антисмысловой нити.

6. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия RGMA во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 40 в антисмысловой нити.

7. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия ATP5EP2 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 32 в антисмысловой нити.

8. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия LINC00319 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 33 в антисмысловой нити.

9. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия CYP3A7 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 34 в антисмысловой нити.

10. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия NOG во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 35 в антисмысловой нити.

11. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия SPANXN3 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36 в антисмысловой нити.

12. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия MYRIP во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 37 в антисмысловой нити.

13. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия NALCN-AS1 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 39 в антисмысловой нити.

14. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия PGA5 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 41 в антисмысловой нити.

15. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 4, в которой экспрессия ABCA10 во множестве клеток снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 42 в антисмысловой нити.

16. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 3, в которой нуклеазу выбирают из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), мегануклеазы, нуклеазы на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN), и белка, ассоциированного с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR).

17. Линия клеток-упаковщиков rAAV по любому из пп. 1-16, в которой экспрессию снижают с использованием редактирования генома CRISPR.

18. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 17, в которой для редактирования генома CRISPR используют пары направляющих РНК (gRNA), причем каждая gRNA:

(a) содержит последовательность, выбранную из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 12-15, и/или

(b) нацелена на последовательность ДНК-мишени, выбранную из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 16-31.

19. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 18, в которой пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2 во множестве клеток и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13.

20. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 18, в которой пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2 во множестве клеток и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15.

21. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 19 или 20, в которой каждая молекула gRNA представляет собой аналог 2’ O-метила, содержащий 3’ фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в трех концевых нуклеотидах на одном или обоих его 5’ и 3’ концах.

22. Линия клеток-упаковщиков rAAV по любому из пп. 1-21, в которой экспрессия гена во множестве клеток устранена по сравнению с контрольными родительскими клетками.

23. Линия клеток-упаковщиков rAAV по любому из пп. 1-22, в которой линией клеток является линия клеток человека.

24. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 23, в которой линией клеток человека является линия клеток HeLa или линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.

25. Линия клеток-упаковщиков rAAV по любому из пп. 1-24, в которой титр rAAV увеличен примерно в 1,5-7 раз по сравнению с титром rAAV, полученным из линии клеток, содержащей контрольные родительские клетки.

26. Способ получения линии клеток-продуцентов rAAV, причем способ включает доставку rAAV вектора во множество клеток линии клеток-упаковщиков rAAV по любому из пп. 1-25.

27. Способ получения rAAV, причем способ включает заражение клеток линии клеток-продуцентов rAAV, полученной способом по п. 26, вирусом-помощником.

28. Способ по п. 26 или 27, в котором rAAV собирают из линий клеток-продуцентов rAAV.

29. Способ по п. 27 или 28, в котором выработка rAAV повышена по сравнению с контрольной родительской линией клеток.

30. Способ по любому из пп. 26-29, в котором линией клеток-упаковщиков и/или клеток-продуцентов rAAV является линия клеток человека.

31. Способ по п. 30, в котором линией клеток человека является линия клеток HeLa или линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.

32. Линия клеток-упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая множество сконструированных клеток, у которых снижена экспрессия и/или активность продукта гена, экспрессированного из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и/или NALCN-AS1, по сравнению с соответствующими немодифицированными родительскими клетками.

33. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 32, в которой экспрессия и/или активность продукта гена, экспрессированного из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и/или NALCN-AS1, снижена на неопределенный срок или навсегда.

34. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 33, причем множество сконструированных клеток содержит разрыв гена или частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и/или NALCN-AS1.

35. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 34, причем множество сконструированных клеток содержит разрыв гена по меньшей мере в одном из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и/или NALCN-AS1.

36. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 34, причем множество сконструированных клеток содержит разрыв гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и NALCN-AS1.

37. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 34, причем множество сконструированных клеток содержит частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и/или NALCN-AS1.

38. Линия клеток-упаковщиков rAAV по п. 34, причем множество сконструированных клеток содержит частичную или полную делецию гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и NALCN-AS1.

39. Линия клеток-упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая множество сконструированных клеток, которые демонстрируют снижение экспрессии и/или активности полипептида или полирибонуклеотида, экспрессированного по меньшей мере из одного из KCNN2, RGMA, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, SPANXN3, PGA5, MYRIP и NALCN-AS1, по сравнению с соответствующей родительской линией клеток.

40. Линия клеток-упаковщиков по любому из пп. 32-39, где линия клеток-упаковщиков rAAV, дополнительно стабильно трансфицирована плазмидой, содержащей вектор rAAV, или инфицирована вектором rAAV с получением линии клеток-продуцентов rAAV.

41. Способ получения rAAV, включающий инфицирование клеток линии клеток-продуцентов rAAV, созданных способом по п. 40, вирусом-помощником.

42. Способ по п. 41, в котором rAAV собирают из линии клеток-продуцентов rAAV.

43. Способ по любому из пп.41 или 42, в котором линией клеток-упаковщиков и/или клеток-продуцентов rAAV является линия клеток человека.

44. Способ по п. 43, в котором линией клеток человека является линия клеток HeLa или линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.