ИНТРАТЕКАЛЬНАЯ ДОСТАВКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, КОДИРУЮЩИХ ABCD1, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АДРЕНОМИЕЛОНЕВРОПАТИИ Российский патент 2020 года по МПК A61K48/00 A61K9/50 A61P25/28 C12N15/85 C12N15/86 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США под серийным № 62/251208, поданной 5 ноября 2015 г., и предварительной заявки на патент США под серийным № 62/300691, поданной 26 февраля 2016 г. Полные раскрытия вышеупомянутых заявок включены в данный документ с помощью ссылки.

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЛИ РАЗРАБОТКА, ФИНАНСИРУЕМОЕ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА

Настоящая работа поддержана грантами № R21 NS081374-01 и R01 NS072446-01, присужденными Национальными институтами здравоохранения (National Institutes of Health). Государство имеет определенные права на настоящее изобретение.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

X-сцепленная адренолейкодистрофия (X-ALD), прогрессирующее генетическое расстройство, вызванное мутациями в гене ABCD1, который кодирует пероксисомальный транспортер ATФ-связывающей кассеты (ABCD1), ответственный за транспорт CoA-активированных жирных кислот с очень длинной цепью (VLCFA) в пероксисомы для деградации, что приводит к накоплению высоких уровней содержания насыщенных жирных кислот с очень длинной цепью (VLCFA) в плазме и тканях головного мозга и коры надпочечников. Симптомы могут начинаться в детстве или в зрелом возрасте. У взрослых пациентов с ALD в возрасте от двадцати до двадцати девяти лет, как правило, развивается адреномиелоневропатия (AMN), изнуряющее неврологическое расстройство (Engelen et al., Orphanet J Rare Dis. 2012; 7: 51). У мыши Abcd1^-/- развивается фенотип, подобный AMN, проявляющийся дегенерацией аксонов спинного мозга, а также периферической нейропатией из-за поражения нейронов спинномозговых ганглиев (DRG) (Pujol et al., Hum Mol Genet. 2002;11:499-505). Ранее сообщалось о трансдукции клеток центральной нервной системы in vitro и in vivo с использованием вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса серотипа 9 (rAAV9) для доставки гена ABCD1 человека. К сожалению, внутривенная доставка у молодых мышей связана с кардиотоксичностью в результате избыточной экспрессии трансгена. Чрезвычайно необходимы системы доставки, которые обеспечивают нетоксичные уровни ABCD1 у пациентов, страдающих X-ALD или AMN.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания и из формулы изобретения. Таким образом, другие аспекты настоящего изобретения описаны в нижеследующем раскрытии и находятся в пределах объема настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ повышения титров вектора на основе аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) в трансфицированных клетках-продуцентах, выращенных в культуре, при этом указанный способ включает стадии i) инкубирования последовательности нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1) с клетками и ii) трансфекции клеток вектором на основе AAV9, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую ABCD1 (вектор AAV9-ABCD1), где обеспечивают снижение количества mRNA ABCD1, экспрессируемой из вектора на основе AAV9, вследствие чего достигается увеличение выхода вектора AAV9-ABCD1 в клеточном лизате и/или среде, составляющее от приблизительно 1 раза до приблизительно 50 раз, по сравнению с эталонным стандартом.

В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1, представляет собой интерферирующую РНК.

В другом варианте осуществления интерферирующая РНК представляет собой shRNA или siRNA.

В еще одном варианте осуществления siRNA содержит SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления эталонный стандарт предусматривает выход вектора AAV9-ABCD1 в клеточном лизате и/или среде клеток-продуцентов, которые не инкубировали с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения X-сцепленной адренолейкодистрофии (X-ALD) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту композиции, содержащей очищенный вектор AAV9-ABCD1, полученный из клеток-продуцентов, характеризующихся повышенными титрами вектора на основе AAV9 по сравнению с эталонным стандартом.

В одном варианте осуществления композицию, содержащую очищенный вектор AAV9-ABCD1, вводят субъекту посредством интратекального введения.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения X-сцепленной адренолейкодистрофии (X-ALD) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), кодирующего представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1), где указанный вектор вводят субъекту посредством интратекального введения.

В одном варианте осуществления интратекальное введение опосредовано осмотическим насосом.

В другом варианте осуществления доза вектора составляет 0,5 X 10¹¹ к.г.

В еще одном варианте осуществления AAV представляет собой AAV9.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу доставки представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1) субъекту с X-сцепленной адренолейкодистрофией (X-ALD), включающему введение субъекту вектора, кодирующего ABCD1, где указанный вектор вводят субъекту посредством интратекального введения, и где экспрессия ABCD1 из указанного вектора в центральной нервной системе является меньшей, чем экспрессия ABCD1 из указанного вектора в периферических органах.

В одном варианте осуществления интратекальное введение опосредовано осмотическим насосом.

В другом варианте осуществления доза вектора составляет от приблизительно 1×10¹³ к.г. до приблизительно 10×10¹³ к.г.

В еще одном варианте осуществления вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

Если не указано иное, то все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Способы и материалы описаны в данном документе для применения в настоящем изобретении; также могут быть использоваться другие подходящие способы и материалы, известные из уровня техники. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для того, чтобы быть ограничивающими. Все публикации, заявки на патенты, патенты, последовательности, записи в базе данных и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены с помощью ссылки во всей своей полноте. В случае противоречия настоящее описание, в том числе определения, будет иметь преимущественную силу.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующее подробное описание, которое приводится в качестве примера, не подразумевающее однако ограничение настоящего изобретения определенными описанными вариантами осуществления, можно понять в связи с прилагаемыми фигурами, включенными в данный документ с помощью ссылки.

На фиг. 1 показаны улучшенные титры вектора AAV9-ABCD1 из трансфицированных клеток 293T, инкубированных с siRNA, специфичной для mRNA ABCD1.

На фиг. 2 показано снижение содержания белка ABCD1 в трансфицированных AAV-ABCD1 клетках, инкубированных с пулом siRNA, специфичным для mRNA ABCD1.

На фиг. 3 показаны улучшенные титры вектора AAV9-ABCD1 из трансфицированных клеток 293T, инкубированных с siRNA, специфичной для mRNA ABCD1, в клеточных лизатах и кондиционированных средах.

На фиг. 4 показано распределение rAAV9-ABCD1 после интратекальной болюсной доставки в течение 2 минут.

На фиг. 5 показано распределение rAAV9-ABCD1 после интратекальной инфузии rAAV9-ABCD1 с помощью насоса в течение 24 часов.

На фиг. 6 показана низкодозовая (0,5×10¹¹ к.г.) болюсная доставка AAV9-ABCD1 и доставка с помощью насоса.

На фиг. 7 показана более высокая экспрессия ABCD1 в периферических органах (вне CNS) через две недели после болюсной инъекции AAV9-ABCD1 по сравнению с инфузией AAV9-ABCD1 с помощью насоса.

На фиг. 8 показана карта вектора AAV9-ABCD1.

На фиг. 9 показано распределение эндогенного ABCD1 в различных органах.

На фиг. 10 показано распределение эндогенного ABCD1 в различных органах.

На фиг. 11 показана экспрессия ABCD1 после IT насоса у мыши Abcd1-/-.

На фиг. 12 показана экспрессия ABCD1 после IT насоса у мыши Abcd1-/-.

На фиг. 13 показан уровень C26:0 в спинном мозге через 15 дней после IT насоса и PT болюсной инъекции.

На фиг. 14 показана экспрессия ABCD1 в различных типах клеток после IT доставки AAV9-hABCD1 с помощью насоса. SC: спинной мозг; DRG: спинномозговой ганглий; CD31: эндотелиальный маркер; GFAP: маркер астроцитов; IBA1: микроглиальный маркер; TOPRO3: контрастный краситель ядра; DRG демонстрирует картину экспрессии с неравномерным окрашиванием в нейроне и более заметным вокруг нейронов (клетки-сателлиты).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Если не указано иное, то все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае противоречия, настоящая заявка, в том числе определения, будет иметь преимущественную силу.

"Субъект" представляет собой позвоночное животное, в том числе любого представителя класса млекопитающих, в том числе людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных зоопарков, спортивных или домашних животных, таких как мышь, кролик, свинья, овца, коза, крупный рогатый скот и высшие приматы.

Используемые в данном документе термины "лечить", "осуществление лечения", "лечение" и т.п. относятся к снижению или уменьшению интенсивности X-ALD, например, адреномиелоневропатии (AMN), и/или симптомов, связанных с ней. Понятно, что, хотя это и не исключается, лечение X-ALD или AMN не требует полного устранения расстройства, состояния или симптомов, связанных с ним.

Если конкретно не указано или не очевидно из контекста, то используемый в данном документе термин "приблизительно" понимается как диапазон нормального допуска в данной области техники, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего значения. Термин "приблизительно" можно понять, как значение, находящееся в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанной величины. Если иное не ясно из контекста, то все числовые значения, представленные в данном документе, модифицируются с помощью термина приблизительно.

Используемый в данном документе термин "уменьшение экспрессии" относится к уровню экспрессии гена ABCD1 или экспрессии белка в периферических органах субъекта, который по меньшей мере приблизительно в 0,05 раза меньше (например, в 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 1000, 10000 раз или более меньше), чем уровень экспрессии гена ABCD1 или экспрессии белка в центральной нервной системе субъекта, которому вводили вектор, кодирующий ABCD1, в соответствии с описанными в данном документе способами. Термин "уменьшенная", когда он относится к экспрессии гена ABCD1 или экспрессии белка в периферических органах субъекта, также означает по меньшей мере приблизительно на 5% меньше (например, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%), чем уровень экспрессии гена ABCD1 или экспрессии белка в центральной нервной системе субъекта, которому вводили вектор, кодирующий ABCD1, в соответствии с описанными в данном документе способами. Уровни можно измерить в соответствии со стандартными способами, известными из уровня техники для определения уровней экспрессии гена или экспрессии белка.

Используемый в данном документе термин "увеличение титров вектора" относится к количеству титра из клеток-продуцентов, трансфицированных вектором, кодирующим ABCD1, которое по меньшей мере приблизительно в 0,05 раза больше (например, в 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 1000, 10000 раз или более), чем количество титра из клеток-продуцентов, которые не инкубировали с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1, в соответствии с описанными в данном документе способами. Термин "увеличенный", когда относится к количеству титра (концентрация вектора на основе AAV, часто описываемая в копиях генома на миллилитр) из клеток-продуцентов, трансфицированных вектором, кодирующим ABCD1, также означает по меньшей мере приблизительно на 5% больше (например, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%), чем количество титра из клеток-продуцентов, не инкубированных с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1, в соответствии с описанными в данном документе способами. Количество можно измерить в соответствии со стандартными способами, известными из уровня техники для определения количества геномов AAV, экспрессии трансгена или экспрессии белка.

Понятно, что диапазоны, представленные в данном документе, подразумевают все значения в пределах этого диапазона. Например, подразумевается, что диапазон от 1 до 50 включает любое количество, комбинацию количеств или меньший диапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 (а также его доли, если контекст явно не диктует иное).

Используемый в данном документе термин "контрольный уровень" относится к уровню титра в известном образце, с которым сравнивают другой тестируемый образец. Контрольный уровень можно получить, например, из клеток-продуцентов, не инкубированных с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1, или с контрольным антисмысловым олигонуклеотидом или siRNA. Контрольный уровень можно получить, например, от необработанных субъектов, у которых X-ALD отсутствует. Термин "необработанный" относится к отсутствию терапии с введением вектора, экспрессирующего трансген ABCD1.

В данном раскрытии термины "включает", "включающий", "содержащий" и "имеющий", и т.п., могут иметь значение, приписываемое им патентным законодательством США, и могут означать "в том числе", "включающий" и т.п.; аналогично, термин "состоящий фактически из" или "состоит фактически из" имеет значение, приписываемое патентным законодательством США, и этот термин является неограничивающим, допускающим присутствие более из того, что перечисляется, при условии, что основные или новые характеристики того, что перечисляется, не изменяются в присутствии более из того, что перечисляется, однако при этом исключает варианты осуществления из известного уровня техники.

Другие определения представлены в контексте на протяжении всего настоящего раскрытия.

Композиции и способы

Композиции и способы по настоящему изобретению обеспечивают лечение X-сцепленной адренолейкодистрофии (X-ALD). X-сцепленная адренолейкодистрофия представляет собой генетическое расстройство, вызванное мутациями в гене ABCD1, которое случается главным образом у мужчин и в основном поражает нервную систему и надпочечники. Миелин головного и спинного мозга разрушается (демиелинизация), что снижает функциональные возможности нервов. Кроме того, повреждение внешнего слоя надпочечников (коры надпочечников) вызывает нехватку определенных гормонов (адренокортикальная недостаточность). Существует несколько различных типов X-сцепленной адренолейкодистрофии, в том числе детская церебральная форма, адреномиелоневропатический тип (AMN) и форма под названием болезнь Аддисона. Используемый в данном документе термин "X-ALD" не включает "неонатальную адренолейкодистрофию", которая относится к расстройствам пероксисомального биогенеза спектра синдрома Цельвегера и не связана с мутациями в ABCD1. Способы диагностики или идентификации субъектов с X-ALD или AMN известны из уровня техники и могут включать измерение уровней содержания жирных кислот с очень длинной цепью (VLCFA) в плазме и/или генетическое тестирование; см., например, Engelen et al., Orphanet J Rare Dis. 2012; 7: 51; Aubourg and Chaussain, Horm Res. 2003;59 Suppl 1:104-5; Steinberg et al., Curr Protoc Hum Genet. 2008 Chapter 17:Unit 17.6; Steinberg SJ, Moser AB, Raymond GV. X-Linked Adrenoleukodystrophy. 1999 Mar 26 [обновлено 9 апреля 2015 г.]. В: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH, et al., под ред. GeneReviews® [Internet]. Сиэтл (Вашингтон): Университет штата Вашингтон, Сиэтл; 1993-2016. Доступно с: ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1315/).

Мутации в гене ABCD1 вызывают X-сцепленную адренолейкодистрофию. Ген ABCD1 кодирует белок адренолейкодистрофии (ALDP), который участвует в транспорте жирных кислот с очень длинной цепью (VLCFA) в пероксисомы. Мутации гена ABCD1 приводят к дефициту ALDP. Когда этого белка не достаточно, транспорт и последующий распад VLCFA нарушается, что вызывает аномально высокие уровни содержания этих жиров в организме. Накопление VLCFA может быть токсичным для коры надпочечников и миелина.

Перспективной терапией является коррекция генетического дефекта с помощью генной терапии. Целенаправленная специфическая доставка гена ABCD1 в CNS необходима для предотвращения токсичности в периферических органах. Этого можно достичь, например, с помощью введения вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), кодирующего ABCD1, посредством интратекального введения.

Последовательность, кодирующая кДНК ABCD1, и ее экспрессированный белок хорошо известны и могут быть найдены, например, в Genbank под номерами доступа NG_009022.2 и NP_000024.2.

Термин "AAV" означает аденоассоциированный вирус и может использоваться для обозначения самого рекомбинантного вирусного вектора или его производных. Термин охватывает все подтипы, серотипы и псевдотипы, а также как природные, так и рекомбинантные формы, за исключением случаев, когда требуется иное. Используемый в данном документе термин "серотип" относится к AAV, который идентифицируется и отличается от других AAV на основе его серологии, например, существует одиннадцать серотипов AAV, AAV1-AAV11, и данный термин охватывает псевдотипы с теми же свойствами. Многие из этих серотипов имеют уникальные биологические свойства по сравнению с другими серотипами AAV (например, связывание рецептора клеточной поверхности, внутриклеточная миграция). Так, например, серотипы AAV5 включают в себя AAV с биологическими свойствами AAV5, например, псевдотипированный AAV, содержащий капсид AAV5 и геном AAV, который не извлечен или не получен из AAV5, или геном, который является химерным.

Термин "вектор на основе AAV" относится к вирусной частице, состоящей по меньшей мере из одного капсидного белка AAV и инкапсидированного полинуклеотида. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, такой как трансген, который должен быть доставлен в клетку млекопитающего), то он может быть назван "rAAV (рекомбинантный AAV)". "Капсидный белок" AAV включает капсидный белок AAV дикого типа, а также модифицированные формы капсидного белка AAV, которые структурно и/или функционально способны упаковывать геном AAV и связываться по меньшей мере с одним специфичным клеточным рецептором, который может отличаться от рецептора, используемого AAV дикого типа. Модифицированный капсидный белок AAV включает химерный капсидный белок AAV, такой как белок, имеющий аминокислотные последовательности из двух или более серотипов AAV, например, капсидный белок, образованный из части капсидного белка из AAV5, слитого или связанного с частью капсидного белка из AAV2, и капсидный белок AAV, имеющий метку или другой детектируемый капсидный пептид, не принадлежащий AAV, или белок, слитый или связанный с капсидным белком AAV, например, часть молекулы антитела, которая связывает рецептор трансферрина, может быть рекомбинантно слита с капсидным белком AAV-2.

Клетки, способные продуцировать AAV, известны из уровня техники и включают без ограничения клетки 293, клетки HeLa и клетки насекомых.

В определенных вариантах осуществления способы получения высоких титров AAV можно использовать для максимального увеличения введения ABCD1. Трансфицированные клетки-продуценты, выращенные в культуре, можно инкубировать с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1) и ii) трансфицировать вектор на основе AAV, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ABCD1, в клетки (например, вектор AAV9-ABCD1). Количество mRNA ABCD1, экспрессируемой из вектора на основе AAV, снижено, увеличивая тем самым выход вектора AAV-ABCD1 в клеточном лизате и/или среде от приблизительно 1 раза до приблизительно 50 раз по сравнению с эталонным стандартом. В определенных вариантах осуществления выход вектора AAV-ABCD1 в клеточном лизате и/или среде увеличивается приблизительно в 4 раза. Титры вектора можно определить в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. Как правило, это выполняют с использованием дот-блота или количественной ПЦР для измерения геномов AAV. В общем случае выход вектора на основе AAV может составлять от приблизительно 1×10¹⁰ копий генома/мл (к.г./мл) до приблизительно 1×10¹⁶ к.г./мл из клеточных лизатов и из среды.

В конкретных вариантах осуществления эталонный стандарт предусматривает выход вектора AAV-ABCD1 в клеточном лизате и/или среде клеток-продуцентов, которые не инкубировали с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1.

Этого можно достичь, например, путем предоставления антисмыслового олигонуклеотида, который является комплементарным mRNA ABCD1. Другими последовательностями нуклеиновых кислот для применения при осуществлении способов по настоящему изобретению, которые являются комплементарными mRNA ABCD1, могут быть те, которые ингибируют посттранскрипционный процессинг ABCD1, такие как интерферирующая РНК, в том числе без ограничения shRNA или siRNA, или антагомир.

Последовательности, кодирующие mRNA ABCD1, хорошо известны и могут быть найдены, например, в Genbank под номерами доступа NM_000033.3.

Антисмысловые олигонуклеотиды обычно предназначены для блокирования экспрессии целевой ДНК или РНК путем связывания с мишенью и остановки экспрессии на уровне транскрипции, трансляции или сплайсинга. Антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению представляют собой комплементарные последовательности нуклеиновой кислоты, предназначенные для гибридизации в жестких условиях с mRNA ABCD1. Таким образом, выбраны олигонуклеотиды, которые в достаточной степени комплементарны мишени, т. е. достаточно хорошо и с достаточной специфичностью гибридизуются с обеспечением требуемого эффекта.

В контексте настоящего изобретения гибридизация означает образование водородной связи, которое может представлять собой образование водородной связи согласно Уотсону-Крику, Хугстину или обращенной водородной связи согласно Хугстину между комплементарными нуклеозидами или нуклеотидными основаниями. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидами, которые образуют пары в результате образования водородных связей. Термин "комплементарный", используемый в данном документе, относится к способности к точному спариванию двух нуклеотидов. Например, если нуклеотид в определенном положении олигонуклеотида способен к образованию водородных связей с нуклеотидом в том же положении молекулы ДНК или РНК, то считается, что олигонуклеотид и ДНК или РНК комплементарны друг другу в данном положении. Олигонуклеотид и ДНК или РНК комплементарны друг другу в случае если достаточное количество соответствующих положений в каждой молекуле занято нуклеотидами, которые могут образовывать водородные связи друг с другом. Таким образом, "специфично гибридизуемый" и "комплементарный" являются терминами, которые свидетельствуют о достаточной степени комплементарности или точного спаривания, вследствие чего стабильное и специфичное связывание происходит между олигонуклеотидом и целевой ДНК или РНК.

Из уровня техники известно, что комплементарная последовательность нуклеиновой кислоты не должна быть на 100% комплементарной таковой в ее целевой нуклеиновой кислоте, чтобы быть способной подвергаться специфичной гибридизации. Комплементарная последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению способна подвергаться специфичной гибридизации в том случае, когда связывание последовательности с целевой молекулой ДНК или РНК мешает нормальному функционированию целевой ДНК или РНК, вызывая потерю активности, и при этом имеет место достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифичного связывания последовательности с нецелевыми последовательностями в условиях, при которых требуется специфичное связывание, т. е. в физиологических условиях в случае анализов in vivo или терапевтического лечения, и в случае анализов in vitro в условиях, когда анализы проводятся в условиях подходящей жесткости. Например, жесткая концентрация соли обычно будет составлять менее чем приблизительно 750 мМ NaCl и 75 мМ цитрата натрия трехзамещенного, предпочтительно менее чем приблизительно 500 мМ NaCl и 50 мМ цитрата натрия трехзамещенного и более предпочтительно менее чем приблизительно 250 мМ NaCl и 25 мМ цитрата натрия трехзамещенного. Гибридизацию с низкой жесткостью можно получить в отсутствие органического растворителя, например формамида, в то время как гибридизацию с высокой жесткостью можно получить в присутствии по меньшей мере приблизительно 35% формамида и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50% формамида. Жесткие температурные условия обычно предусматривают температуры по меньшей мере приблизительно 30°С, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 37°С и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 42°С. Специалистам в данной области техники хорошо известны различные дополнительные параметры, такие как время гибридизации, концентрация детергента, например додецилсульфата натрия (SDS), и включение или исключение носителя ДНК. Различные уровни жесткости достигаются путем комбинирования этих различных условий по мере необходимости. В предпочтительном варианте осуществления гибридизация будет происходить при 30°С в 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления гибридизация будет происходить при 37°С в 500 мМ NaCl, 50 мМ цитрата натрия трехзамещенного, 1% SDS, 35% формамиде и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (ssDNA). В наиболее предпочтительном варианте осуществления гибридизация будет происходить при 42°С в 250 мМ NaCl, 25 мМ цитрата натрия трехзамещенного, 1% SDS, 50% формамиде и 200 мкг/мл ssDNA. Полезные варианты этих условий будут очевидны специалистам в данной области техники.

Для большинства применений стадии промывки, которые следуют за гибридизацией, также будут варьироваться по жесткости. Условия жесткости промывки могут определяться концентрацией соли и температурой. Как и выше, жесткость промывки можно повысить за счет снижения концентрации соли или повышения температуры. Например, жесткая концентрация соли для стадий промывки будет предпочтительно составлять менее чем приблизительно 30 мМ NaCl и 3 мМ цитрата натрия трехзамещенного и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 15 мМ NaCl и 1,5 мМ цитрата натрия трехзамещенного. Жесткие температурные условия для стадий промывки обычно предусматривают температуру по меньшей мере приблизительно 25°С, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 42°С и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 68°С. В предпочтительном варианте осуществления стадии промывки будут происходить при 25°С в 30 мМ NaCl, 3 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 0,1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления стадии промывки будут происходить при 42°С в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 0,1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления стадии промывки будут происходить при 68°С в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 0,1% SDS. Дополнительные варианты этих условий будут очевидны специалистам в данной области техники. Методы гибридизации хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Нью-Йорк, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Нью-Йорк) и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк.

Предпочтительно, чтобы антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению содержали по меньшей мере 80% комплементарность последовательности к целевой области в пределах нуклеиновой кислоты-мишени, более того, чтобы они содержали 90% комплементарность последовательности и еще более предпочтительно содержали 95% комплементарность последовательности к целевой области в пределах последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, на которую они нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов антисмыслового олигонуклеотида являются комплементарными, а следовательно будут специфично гибридизироваться с целевой областью, будет представлять 90-процентную комплементарность. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени можно определить по стандартной методике с использованием базовых инструментов поиска локального выравнивания (программы BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). Антисмысловые и другие соединения по настоящему изобретению, которые гибридизуются с mRNA ABCD1, идентифицируют посредством экспериментов, и репрезентативные последовательности этих соединений идентифицированы в данном документе ниже как предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA ABCD1, может представлять собой интерферирующую РНК, в том числе без ограничения shRNA или siRNA. Интерферирующая РНК включает без ограничения малую интерферирующую РНК ("siRNA") и малую РНК-шпильку ("shRNA"). Способы построения интерферирующих РНК хорошо известны из уровня техники. Например, интерферирующую РНК можно собрать из двух отдельных олигонуклеотидов, где одна нить представляет собой смысловую нить, а другая представляет собой антисмысловую нить, где антисмысловая и смысловая нити являются самокомплементарными (т.е. каждая нить содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в другой нити, например, где антисмысловая нить и смысловая нить образуют дуплексную или двухнитевую структуру); антисмысловая нить содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части (т. е. нежелательный ген), и смысловая нить содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части. В качестве альтернативы, интерферирующую РНК собирают из одного олигонуклеотида, где самокомплементарные смысловые и антисмысловые области связаны с помощью линкера(-ов) на основе нуклеиновой кислоты или на основе не нуклеиновой кислоты. Интерферирующая РНК может представлять собой полинуклеотид со вторичной структурой дуплекса, асимметричного дуплекса, шпильки или асимметричной шпильки, имеющим самокомплементарные смысловые и антисмысловые области, где антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в отдельной молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, и смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части. Интерферирующим может являться кольцевой однонитевой полинуклеотид, имеющий две или более петлевые структуры и стержень, содержащий самокомплементарные смысловые и антисмысловые области, где антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, и смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, и где кольцевой полинуклеотид может процессироваться как in vivo, так и in vitro с получением активной молекулы siRNA, способной опосредовать РНК-интерференцию.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения кодирующая область интерферирующей РНК кодирует самокомплементарную молекулу РНК, имеющую смысловую область, антисмысловую область и область петли. Такая молекула РНК при экспрессии ожидаемо образует структуру "шпильки" и упоминается в данном документе как "shRNA". Область петли обычно имеет длину от приблизительно 2 до приблизительно 10 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления область петли имеет длину от приблизительно 6 до приблизительно 9 нуклеотидов. В одном из таких вариантов осуществления настоящего изобретения длина смысловой области и антисмысловой области составляет от приблизительно 15 до приблизительно 20 нуклеотидов. В результате пост-транскрипционного процессинга малая РНК-шпилька превращается в siRNA в процессе расщепления, опосредованном ферментом Dicer, который является представителем семейства РНКазы III. Затем siRNA способна ингибировать экспрессию гена, с которым разделяет гомологию. Более подробно см. Brummelkamp et al., Science 296:550-553, (2002); Lee et al, Nature Biotechnol., 20, 500-505, (2002); Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol 20:497-500, (2002); Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958, (2002); Paul, Nature Biotechnol, 20, 505-508, (2002); Sui, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(6), 5515-5520, (2002); Yu et al. Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, (2002).

Реакция расщепления целевой РНК, управляемая siRNA, имеет высокую степень специфичности. В целом, предпочтительной для ингибирования является siRNA, содержащая нуклеотидные последовательности, идентичные части гена-мишени (т. е. ABCD1). Однако 100% идентичность последовательности между siRNA и геном-мишенью для осуществления настоящего изобретения не требуется. Таким образом, настоящее изобретение имеет то преимущество, что оно способно допускать вариации последовательности, которые можно ожидать из-за генетической мутации, полиморфизма штаммов или эволюционной дивергенции. Например, было обнаружено, что последовательности siRNA со вставками, делециями и одиночными точечными мутациями относительно целевой последовательности также эффективны для ингибирования. В качестве альтернативы, эффективными для ингибирования могут быть последовательности siRNA с заменами или вставками аналогов нуклеотидов.

В еще одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA ABCD1, представляет собой антагомир. Антагомиры представляют собой однонитевые, двухнитевые, частично двухнитевые и со структурой шпильки химически модифицированные олигонуклеотиды, которые нацелены на микроРНК. Предпочтительно, антагомир, представленный в настоящем изобретении, включает в себя нуклеотидную последовательность, достаточно комплементарную для гибридизации с целевой последовательностью miRNA размером приблизительно от 10 до 25 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 20 нуклеотидов.

В определенных вариантах осуществления антагомиры представляют собой РНК-подобные олигонуклеотиды, которые содержат различные модификации для защиты от РНКаз и для фармакологических свойств, таких как усиленное поглощение тканями и клетками. Антагомир может отличаться от нормальной РНК наличием полного 2'-О-метилирования сахара, фосфоротиоатного каркаса и холестеринового фрагмента на 3'-конце. Фосфоротиоатные модификации обеспечивают защиту от РНКазной активности, и их липофильность способствует усиленному поглощению тканями. В предпочтительном варианте осуществления антагомир включает в себя шесть фосфоротиоатных модификаций каркаса; два фосфоротиоата расположены на 5'-конце и четыре на 3'-конце. Антагомиры по настоящему изобретению также могут быть модифицированы по их длине или иным образом по числу нуклеотидов, составляющих антагомир.

Последовательности нуклеиновой кислоты, используемые для осуществления настоящего изобретения, будь то РНК, кДНК, геномная ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, могут быть выделены из множества источников, созданы методами генной инженерии, амплифицированы и/или экспрессированы/образованы рекомбинантно. Рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот могут быть индивидуально выделены или клонированы и проверены в отношении требуемой активности. Можно использовать любую рекомбинантную систему экспрессии, в том числе, например, системы экспрессии in vitro, на основе клеток бактерий, грибов, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.

Последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть вставлены в векторы доставки и экспрессированы из единиц транскрипции в пределах векторов (например, векторов на основе AAV). Рекомбинантные векторы могут представлять собой ДНК-плазмиды или вирусные векторы. Образование векторной конструкции можно осуществлять с использованием любых подходящих методов генной инженерии, хорошо известных из уровня техники, включая без ограничения стандартные методы ПЦР, синтез олигонуклеотидов, расщепление рестриктазой, лигирование, трансформацию, очистку плазмид и секвенирование ДНК, например, как описано в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. (1997)) и "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)). Как будет очевидно специалисту в данной области техники, для переноса нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в клетки имеется множество подходящих векторов. Выбор подходящего вектора для доставки нуклеиновых кислот и оптимизация условий для вставки выбранного вектора экспрессии в клетку входят в сферу компетенции специалиста в данной области техники без необходимости чрезмерного экспериментирования. Вирусные векторы содержат нуклеотидную последовательность, имеющую последовательности для получения рекомбинантного вируса в упаковывающей клетке. Вирусные векторы, экспрессирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, могут быть сконструированы на основе вирусных каркасов, в том числе без ограничения ретровируса, лентивируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса, поксвируса или альфавируса. Рекомбинантные векторы, способные экспрессировать нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, могут доставляться, как описано в данном документе, и сохраняться в клетках-мишенях (например, стабильных трансформантах).

Последовательности нуклеиновой кислоты, используемые для осуществления настоящего изобретения, можно синтезировать in vitro с помощью хорошо известных методов химического синтеза, как описано, например, в Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; патенте США № 4458066.

Последовательностям нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно придать устойчивость к нуклеолитическому расщеплению, например, путем встраивания модификации, например нуклеотидной модификации. Например, последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению содержат фосфоротиоатную по меньшей мере первую, вторую или третью межнуклеотидную связь на 5'- или 3'-конце нуклеотидной последовательности. В качестве другого примера, последовательность нуклеиновой кислоты может включать 2'-модифицированный нуклеотид, например, 2'-дезокси, 2'-дезокси-2'-фтор, 2'-O-метил, 2'-O-метоксиэтил (2'-O-MOE), 2'-O-аминопропил (2'-O-AP), 2'-O-диметиламиноэтил (2'-O-DMAOE), 2'-O-диметиламинопропил (2'-O-DMAP), 2'-O-диметиламиноэтилоксиэтил (2'-O-DMAEOE) или 2'-O--N-метилацетамидо (2'-O--NMA). В качестве другого примера, последовательность нуклеиновой кислоты может включать по меньшей мере один 2'-O-метил-модифицированный нуклеотид, и в некоторых вариантах осуществления все нуклеотиды включают 2'-O-метильную модификацию.

Методы манипулирования нуклеиновыми кислотами, используемые для осуществления настоящего изобретения, например, такие как субклонирование, зонды для мечения (например, мечение случайными праймерами с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т. п. хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

Недавно было определено, что введение вектора ABCD1, обеспечиваемое внутривенным (IV) или интрацеребровентрикулярным (ICV) введением, вызывает кардиотоксичность. Интратекальное введение представляет собой путь введения, включающий инъекцию требуемых средств в субарахноидальное пространство позвоночного канала, обеспечивая тем самым наличие средств в спинномозговой жидкости (CSF). При использовании интратекального введения экспрессия ABCD1 из вектора внутри центральной нервной системы является меньшей, чем экспрессия ABCD1 из вектора в периферических органах, таких как сердце. Избыточная экспрессия ABCD1 в периферических органах может приводить к токсичности, и следовательно интратекальное введение векторов ABCD1 предусматривает улучшенный способ терапии X-ALD, например для AMN.

В некоторых вариантах осуществления интратекальное введение осуществляют посредством насоса. Насос может представлять собой хирургически имплантированный осмотический насос. В определенных вариантах осуществления осмотический насос имплантируют в субарахноидальное пространство позвоночного канала для облегчения интратекального введения.

В определенных вариантах осуществления субъекты-люди получают однократное лечение интратекально доставленным вектором (например, на основе AAV9), содержащим ABCD1, в количестве от приблизительно 1×10¹³ к. г. до приблизительно 10×10¹³ к. г. в течение периода времени, составляющего приблизительно 24 часов.

Медленная непрерывная интратекальная инфузия AAV9-hABCD1 может быть увеличена в отношении людей с использованием осмотически управляемого насоса, такого как имплантат DUROS^®, ALZA Corporation (Маунтин Вью, Калифорния). См. также J.C. Wright, J. Culwell, Long-term controlled delivery of therapeutic agents by the osmotically driven DUROS^® implant, в: M.J. Rathbone, J. Hadgraft, M.S. Roberts (Eds.), Modified-Release Drug Delivery Technology, Informa Healthcare, New York, 2008, pp. 143-149.

Осмотические устройства для доставки и их составные части описаны, например, в патентах США №№ 5609885; 5728396; 5985305; 5997527; 6113938; 6132420; 6156331; 6217906; 6261584; 6270787; 6287295; 6375978; 6395292; 6508808; 6544252; 6635268; 6682522; 6923800; 6939556; 6976981; 6997922; 7014636; 7207982; 7112335; 7163688; публикациях заявок на патент США №№ 2005-0175701, 2007-0281024 и 2008-0091176.

Устройство для доставки DUROS^® обычно состоит из цилиндрического резервуара, который содержит осмотический двигатель, поршень и лекарственную форму. Резервуар закрывают на одном конце с помощью контролируемо водопроницаемой мембраны и закрывают на другом конце с помощью регулятора диффузии, через который лекарственная форма высвобождается из резервуара для лекарственного средства. Поршень отделяет лекарственную форму от осмотического двигателя и при этом используется уплотнитель, чтобы предотвратить попадание воды из отсека осмотического двигателя в резервуар для лекарственного средства. Регулятор диффузии предназначен, в сочетании с лекарственной формой, для предотвращения попадания жидкости организма в резервуар для лекарственного средства через отверстие.

Устройство DUROS^® высвобождает терапевтическое средство с заданной скоростью, основанной на принципе осмоса. Внеклеточная жидкость поступает в устройство DUROS^® через полупроницаемую мембрану непосредственно в солевой двигатель, который расширяется для приведения в действие поршня с медленной и равномерной скоростью подачи. Движение поршня заставляет лекарственную форму высвобождаться через отверстие или выходное отверстие с заданной интенсивностью. В одном варианте осуществления настоящего изобретения резервуар устройства DUROS^® загружают суспензионным составом по настоящему изобретению, содержащим например 1×10¹¹ к. г. AAV9-hABCD1, где устройство способно доставлять суспензионный состав субъекту в течение длительного периода времени с заданной терапевтически эффективной скоростью подачи.

В практике осуществления настоящего изобретения могут использоваться другие имплантируемые устройства для доставки лекарственных средств, и при этом они могут включать в себя регулируемые имплантируемые насосы, которые обеспечивают постоянный поток, регулируемый поток или программируемый поток соединения, например, доступные от Codman & Shurtleff, Inc. (Рейнхам, Массачусетс), Medtronic, Inc. (Миннеаполис, Миннесота) и Tricumed Medinzintechnik GmbH (Германия).

Настоящее изобретение дополнительно описано с помощью следующих иллюстративных неограничивающих примеров, которые обеспечивают лучшее понимание настоящего изобретения и его многочисленных преимуществ.

ПРИМЕРЫ

Нижеследующие примеры иллюстрируют некоторые варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что различные модификации, добавления, замены и т. п. могут осуществляться без изменения сущности или объема настоящего изобретения, и такие модификации и варианты охватываются объемом настоящего изобретения, как определено в нижеследующей формуле изобретения. Нижеследующие примеры никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Получение AAV9-ABCD1 в присутствии siRNA, специфичной для mRNA ABCD1, улучшает титры вектора на основе AAV из трансфицированных клеток 293T.

Ранее наблюдался высокий уровень гибели клеток/цитопатических эффектов при получении AAV9-ABCD1, вероятно из-за избыточной экспрессии белка ABCD1 в клетках-продуцентах. Эта токсичность снижала выход вектора на основе AAV. Чтобы уменьшить токсичность и улучшить выход вектора, на mRNA ABCD1 целенаправленно воздействовали с использованием пула siRNA.

Упаковку AAV выполняли следующим образом. 1-1,5×10⁷ клеток 293T высевали на 15 см чашки и культивировали в течение ночи.

Таблица 1. Среда для упаковки и сбора DMEM с высоким содержанием глюкозы, HEPES DMEM 10% FBS 1% p/s DMEM 2% FBS 1% p/s 2,5 мM буфер Hepes 2 M CaCl 2x буфер Hebs, pH 7,04-7,047 PBS Трипсин NaCl, 50 мM HEPES, 1,5 мM Na₂HPO₄ 5 мM EDTA

На 2-й день получали смесь для трансфекции следующим образом.

Таблица 2. Смесь для трансфекции Пробирка A Пробирка B Конструкция вектора, 10 мкг 2x Hebs 780 мкл Аденовирус-помощник, 26 мкг ^**Серотипическая плазмида, 12 мкг 2 M CaCl 96,9 2,5 мM Hepes до 780 мкл Общий объем 780 мкл Общий объем 780 мкл

Пробирку A и пробирку B объединяли по каплям при встряхивании в течение 1 минуты. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавляли 1,5 мл вирусной смеси на 15 см чашку, распределяя по каплям по поверхности чашки. Чашки наклоняли для равномерного перемешивания и инкубировали в течение ночи. На 3-й день среду заменяли на DMEM 2% FBS 1% p/s. На 5-й день половину объема среды чашки удаляли из каждой чашки. Клетки собирали из чашек путем промывки оставшейся средой или осторожно с помощью скребка для клеток. Клетки центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли. Клетки разрыхляли, слегка ударяя по дну пробирки, и повторно суспендировали в 1 мл EDTA PBS на чашку с клетками и центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут. Клетки повторно суспендировали в 1 мл лизирующего буфера на чашку и факультативно хранили при -80°C. После градиентной очистки, вирус подвергали замене буфера на PBS, количественно определяли с помощью qPCR и использовали для проведения экспериментов.

В день высевания клеток 293T клетки трансфицировали пулом siRNA, специфичной для mRNA ABCD1, или нецеленаправленно воздействующей контрольной siRNA. Другим контролем был вектор на основе AAV9, кодирующий GFP (AAV9-GFP), в присутствии siRNA ABCD1. На следующий день оба образца трансфицировали плазмидами на основе AAV для получения AAV9-ABCD1.

Протокол siRNA имел несколько стадий.

1. Из исходного раствора приготовить 5 мкМ объединенного (25% каждой из 4 siRNA) раствора siRNA в 1× siRNA-буфере (GE Healthcare) или другого подходящего раствора без РНКаз.

2. В отдельных пробирках разбавить siRNA (100 мкл в пробирке 1) и подходящий реагент для трансфекции DharmaFECT (30 мкл в пробирке 2) бессывороточной средой DMEM до объема 2 мл, соответственно.

3. Аккуратно перемешать содержимое каждой пробирки с помощью осторожного перемешивания в пипетке. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.

4. Добавить содержимое пробирки 1 в пробирку 2 для получения общего объема 4 мл. Смешать путем осторожного перемешивания в пипетке и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре. К 4 мл добавить 12 мл полной DMEM (10% FBS).

5. Добавить 4 мл повторно суспендированных в полной среде клеток 293T, которые находятся в концентрации 3,75e6 клеток/мл (всего 1,5E7 клеток), к 16 мл смеси для трансфекции из стадии 4 (конечная концентрация siRNA 25 нМ).

6. Высеять в 15 см чашку и инкубировать 24 ч.

7. Заменить среду на полную DMEM 10% FBS за 1 ч до трансфекции фосфатом кальция с помощью плазмид на основе AAV.

8. Действовать по стандартному протоколу получения и очистки AAV.

Через три дня после трансфекции клетки собирали, лизировали и определяли выход вектора (в копиях генома) с помощью qPCR следующим образом.

Таблица 3. Материалы для qPCR F2: cctcgactgtgccttctag (SEQ ID NO: 1) R2: tgcgatgcaatttcctcat (SEQ ID NO: 2) Зонд: 5'FAM-tgccagccatctgttgtttgcc-MGB (SEQ ID NO: 3) Вода без нуклеаз F- и R-праймеры qPCR Зонд TM FAM Мастер-микс TaqMan Fast universal PCR ПЦР-планшеты для 7500 (Fast) Qpcr Пленка для ПЦР-планшета

Протокол qPCR имеет несколько стадий:

1. Разбавить вектор 1:100-1:1000 в воде без нуклеаз и встряхивать. Использовать в qPCR.

2. Использовать плазмиду 675.5 (5999 п. о.) в качестве стандарта копии генома (к. г. ). Создать стандарт из 10⁷-10² к. г. /мл.

3. Приготовить мастер-микс в количестве, достаточном для измерения стандартов и образцов в трех повторах. Мастер-микс включает в себя 2 мкл H₂O, 1,2 мкл смеси праймеров (F и R=5 мкл каждого 100 мкМ исходного раствора в 90 мкл воды), 1 мкл смеси праймеров (F и R=6 мкл каждого 100 мкМ исходного раствора в 88 мкл воды), 0,8 мкл зонда TM FAM 2,5 мкM, 1 мкл зонда TM FAM 2 мкM (4 мкл 100 мкM исходного раствора +196 мкл воды) и 5 мкл TaqMan Fast universal PCR Master Mix 2x.

4. Смешать и отмерить 9 мкл в лунки планшета.

5. Добавить 1 мкл матрицы, разбавленной в воде.

6. Запрограммировать аппарат 7500 для следующих параметров термоциклирования, где стадия 1 имеет 1 повтор, 95°C:20, и стадия 2 имеет 40 повторов, 95°C:03; 60°C:30.

7. Проанализировать данные. Наклон для стандарта должен составлять ~ -3,3.

Выход определяли как относительный титр, в котором образец AAV9-GFP устанавливали произвольно на 100%, а остальные два образца нормализовали к этому значению. Получение AAV9-ABCD1 в присутствии пула siRNA против mRNA ABCD1 улучшало титр (и выход) вектора примерно в 4 раза по сравнению с контрольной siRNA (фиг. 1).

Таблица 4. siRNA, целенаправленно воздействующие на ABCD1 SEQ ID NO: 4 CGGAUCAUGUCGUCGUACA SEQ ID NO: 5 CGGAGGAGAUCGCCUUCUA SEQ ID NO: 6 GUUCAGCGCUGUCACUUCA SEQ ID NO: 7 GAACGCCUGUGGUAUGUUA

Клетки 293T трансфицировали контрольной siRNA (фигура 2, дорожки 1, 2), пулом siRNA против mRNA ABCD1 (фигура 2, дорожки 3-6) или не трансфицировали (фигура 2, дорожка 7, "нормальный" относится к эндогенным уровням белка ABCD1 в клетках 293T). Плазмиду AAV-ABCD1 (фигура 2, дорожки 1-4) или плазмиду AAV-GFP (фигура 2, дорожка 5, 6) трансфицировали на следующий день. Спустя три дня клеточные лизаты подвергали электрофорезу на геле SDS PAGE и проводили иммуноблоттинг белка ABCD1 для оценки нокдауна siRNA. Для контроля загрузки выполняли блоттинг с актином. Значения 8 с и 1 с относятся к 8-секундной и 1-секундной экспозиции рентгенографической пленки, соответственно. siRNA ABCD1 снижает уровень избыточной экспрессии ABCD1 по сравнению с контрольной siRNA.

Клетки 293T оставляли нетрансфицированными (без siRNA) или трансфицировали контрольной siRNA или пулом siRNA против mRNA ABCD1. На следующий день клетки трансфицировали плазмидами на основе AAV для получения AAV9-ABCD1. На 3-й день после трансфекции плазмид на основе AAV проводили qPCR для определения количества вектора (g.c.) в клеточном лизате и в средах трансфицированных клеток. Наблюдали увеличение выхода вектора AAV9-ABCD1 примерно в 3-4 раза как в клеточном лизате, так и в средах (фигура 3).

Пример 2. Интратекальная доставка rAAV9-ABCD1 с помощью осмотического насоса на мышиной модели адреномиелоневропатии приводила к более равномерной и повсеместной доставке гена в CNS

Самокомплементарный AAV9 GFP (scAAV9GFP) и rAAV9, кодирующий ABCD1 (rAAV9-ABCD1), доставляли мышам Abcd1-/- интратекально (IT) либо в виде болюса в течение 2 мин, либо с помощью осмотического насоса в течение 24 часов с инъекцией PBS в качестве плацебо-контроля. Через две недели после инъекции мышей умерщвляли и перфузировали 4% PFA. Затем ткани собирали, делали срезы и окрашивали для иммунофлуоресцентного анализа.

scAAV9-GFP, доставленный IT с помощью осмотического насоса, приводил к повсеместной экспрессии в типичных для CNS типах клеток и DRG дозозависимым образом. Спинной мозг и DRG характеризовались более высокой экспрессией по сравнению с головным мозгом, но экспрессия GFP также была обнаружена в периферических органах (печень, сердце и надпочечники), причем наибольшая экспрессия наблюдалась при 3×10¹¹ к.г.

Аналогичную картину распределения белка ABCD1 обнаружили после доставки rAAV9-ABCD1 с помощью интратекального насоса. В целом, более высокие дозы (2×10¹¹ к.г. и 1×10¹¹ к.г.) приводили к более выраженной экспрессии в CNS и периферических органах по сравнению с более низкой дозой (0,5×10¹¹ к.г.). Для сравнения, интратекальная болюсная доставка в течение 2 минут приводила к наибольшему уровню экспрессии ABCD1 в грудной области, однако даже более высокая доза (1×10¹¹ к.г.) не приводила к более повсеместной доставке в шейную и поясничную области (фиг. 4).

Примечательно, что повсеместная экспрессия ABCD1 в CNS обнаруживалась как раз после низкой дозы непосредственной интратекальной болюсной инъекции 0,5×10¹¹ к. г. (фиг. 5). Например, болюсная доставка и доставка с помощью насоса 0,5×10¹¹ к.г. показали аналогичную экспрессию ABCD1 в шейном отделе спинного мозга, тогда как ткань сердца продемонстрировала более высокую экспрессию после болюсной инъекции (фиг. 6). Был сделан вывод о том, что та же доза, доставляемая насосом, приводила к более высокой экспрессии в головном и спинном мозге вдали от участка инъекции и сравнительно меньшей утечке в периферические органы по сравнению с болюсной инъекцией (фигура 7). Предоставление rAAV9-ABCD1 в дозе, составлявшей 0,5×10¹¹ к.г., при интрацеребровентрикулярном введении приводило к улучшению поведения у мышей Abcd1-/-, несмотря на локализованную экспрессию в головном мозге. Следовательно, можно достичь еще более высокой эффективности при этой дозе с использованием доставки с помощью описанного интратекального насоса. При дозе 1×10¹¹ к.г., вводимой посредством интратекального насоса, экспрессия ABCD1 в центральной нервной системе превышала в приблизительно в 3 раза экспрессию ABCD1 в центральной нервной системе необработанного субъекта, у которого X-ALD отсутствовала (например, дикого типа). Важно отметить, что экспрессия ABCD1 в периферических органах была приблизительно на 90% меньше, чем экспрессия ABCD1 в периферических органах необработанного субъекта, у которого X-ALD отсутствовала (см. фигуру 11, где экспрессию белка в разных типах тканей в Вестерн-блотах нормализовали к эндогенным уровням дикого типа).

В заключение, rAAV9-опосредованный перенос гена ABCD1 посредством интратекального осмотического насоса приводил к более равномерной и повсеместной доставке генов в CNS с уменьшенной утечкой в системную циркуляцию по сравнению с интратекальной болюсной инъекцией.

Пример 3. rAAV9-опосредованный перенос гена ABCD1 посредством интратекального осмотического насоса приводил к снижению уровней C26:0 в спинном мозге

C26:0 являлся биохимическим признаком адреномиелоневропатии. Чтобы оценить наличие свободных жирных кислот с очень длинной цепью (VLCFA) после опосредованной AAV9 доставки гена, проводили анализ липидов в образцах спинного мозга. Приводятся абсолютные значения C26:0 и C24:0, а также отношения C26:0/C22:0. Установлено, что rAAV9-опосредованный перенос гена ABCD1 посредством интратекального осмотического насоса (1×10¹¹ к.г.) приводил к 20% снижению уровней C26:0 в спинном мозге (фиг. 13). Уровни после доставки с помощью интратекального осмотического насоса сравнимы с уровнями после интратекального болюсного введения, однако при этом отсутствует утечка в системный кровоток.

Дополнительно проводили визуализацию с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и конфокальной микроскопии. Для визуализации срезов ткани, срезы спинного мозга (16 мкм) нарезали при -25°С с использованием криостата (Leica) и хранили при -80°C. Срезы окрашивали антителом мыши к ABCD1 человека, а затем совместно окрашивали антителом кролика к GFAP (Dako, Карпинтерия, Калифорния), антителом кролика к IBA1 (Wako, Ричмонд, Вирджиния) и антителом кролика к CD31 (Abcam), соответственно, с целью локализации типа клеток. Для контрастирования ядра в качестве флуоресцентного красителя использовали TOPRO-3 (Thermo Fisher Scientific). Срезы визуализировали с помощью конфокального лазерного микроскопа и подсчитывали трансдуцированные клетки. Посчеты трансдуцированных клеток ABCD1 каждого типа клеток задокументированы в изображениях с увеличением 20× и 40× (для микроглии). rAAV9-опосредованный перенос гена ABCD1 посредством интратекального осмотического насоса (1×10¹¹ к.г.) нацелен главным образом на астроциты, эндотелиальные клетки и некоторые нейроны в спинном мозге (фиг. 14). Внутри спинальных ганглиев он нацелен как на клетки-сателлиты, так и на нейроны (фиг. 14).

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Понятно, что несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, предшествующее описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем настоящего изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> The General Hospital Corporation

<120> ИНТРАТЕКАЛЬНАЯ ДОСТАВКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, КОДИРУЮЩИХ ABCD1, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АДРЕНОМИЕЛОНЕВРОПАТИИ

<130> 29539-0219WO1

<140> PCT/US2016/060375

<141> 2016-11-03

<150> 62/251,208

<151> 2015-11-05

<150> 62/300,691

<151> 2016-02-26

<160> 7

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер, созданный синтетическим путем

<400> 1

cctcgactgt gccttctag 19

<210> 2

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер, созданный синтетическим путем

<400> 2

tgcgatgcaa tttcctcat 19

<210> 3

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер, созданный синтетическим путем

<400> 3

tgccagccat ctgttgtttg cc 22

<210> 4

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> siRNA, целенаправленно воздействующая на ABCD1

<400> 4

cggaucaugu cgucguaca 19

<210> 5

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> siRNA, целенаправленно воздействующая на ABCD1

<400> 5

cggaggagau cgccuucua 19

<210> 6

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> siRNA, целенаправленно воздействующая на ABCD1

<400> 6

guucagcgcu gucacuuca 19

<210> 7

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> siRNA, целенаправленно воздействующая на ABCD1

<400> 7

gaacgccugu gguauguua 19

<---

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ увеличения титров вектора на основе аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) в трансфицированных клетках-продуцентах, выращенных в культуре. Предложены способы лечения X-сцепленной адренолейкодистрофии (X-ALD) у субъекта, нуждающегося в этом. Предложен способ доставки представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1) субъекту с X-ALD, предусматривающий введение субъекту вектора, содержащего NM_000033.3. Предложенная группа изобретений обеспечивает доставку последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих abcd1, для лечения X-ALD. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 пр., 14 ил.

1. Способ увеличения титров вектора на основе аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) в трансфицированных клетках-продуцентах, выращенных в культуре, при этом указанный способ предусматривает стадии:

i) инкубирования последовательности нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1), с клетками, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или их комбинацию, и

ii) трансфицирования клеток вектором на основе AAV9, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую ABCD1 (вектор AAV9-ABCD1), где обеспечивают снижение количества mRNA ABCD1, экспрессируемой из вектора на основе AAV9, вследствие чего достигается увеличение выхода вектора AAV9-ABCD1 в клеточном лизате и/или среде, составляющее от 1 раза до 50 раз, по сравнению с эталонным стандартом,

где эталонный стандарт предусматривает выход вектора AAV9-ABCD1 в клеточном лизате и/или среде клеток-продуцентов, которые не инкубировали с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1.

2. Способ по п. 1, где последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна mRNA, кодирующей ABCD1, представляет собой интерферирующую РНК.

3. Способ по п. 2, где интерферирующая РНК представляет собой shRNA или siRNA.

4. Способ лечения X-сцепленной адренолейкодистрофии (X-ALD) у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту композиции, содержащей очищенный вектор AAV9-ABCD1, полученный из клеток-продуцентов способом по п. 1.

5. Способ по п. 4, где композицию, содержащую очищенный вектор AAV9-ABCD1, вводят субъекту посредством интратекального введения.

6. Способ лечения X-сцепленной адренолейкодистрофии (X-ALD) у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), кодирующего представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1), содержащего NM_000033.3, где указанный вектор вводят субъекту посредством интратекального введения, и где вектор вводится в дозе от 1×10¹³ к.г. до 10×10¹³ к.г.

7. Способ по п. 6, где интратекальное введение опосредовано осмотическим насосом.

8. Способ по п. 6, где AAV представляет собой AAV9.

9. Способ доставки представителя 1 надсемейства D АТФ-связывающей кассеты (ABCD1) субъекту с X-сцепленной адренолейкодистрофией (X-ALD), предусматривающий введение субъекту вектора, содержащего NM_000033.3, где указанный вектор вводят субъекту посредством интратекального введения, и где экспрессия ABCD1 из указанного вектора в центральной нервной системе больше, чем экспрессия ABCD1 из указанного вектора в периферических органах, и где вектор вводят в дозе от 1х10¹³ копий генома (к.г.) до 10х10¹³ к.г.

10. Способ по п. 9, где экспрессия ABCD1 из указанного вектора в центральной нервной системе превышает в 3 раза экспрессию ABCD1 в центральной нервной системе необработанного субъекта, у которого X-ALD отсутствует.

11. Способ по п. 10, где экспрессия ABCD1 из указанного вектора в периферических органах является на 90% меньшей, чем экспрессия ABCD1 в периферических органах необработанного субъекта, у которого X-ALD отсутствует.