ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ИЛИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ HTLV-1-АССОЦИИРОВАННОЙ МИЕЛОПАТИИ (HAM) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ HAM Российский патент 2025 года по МПК A61K39/395 A61P25/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к терапевтическому или профилактическому агенту для HTLV-1-ассоциированной миелопатии (HAM). Настоящее изобретение также относится к способу лечения HAM.

Уровень техники

HTLV-1 (вирус человеческого Т-клеточного лейкоза 1 типа) является вирусом, который заражает Т-клетки и подобные (в основном, CD4-положительные T-клетки), которые являются разновидностью лейкоцитов в крови.

T-клетки, зараженные HTLV-1, образуют хроническое воспаление в спинном мозге и в результате вызывают расстройство и дегенерацию нейронов спинного мозга, вызывая спастический паралич спинного мозга. Спастический паралич спинного мозга, вызванный клетками, зараженными HTLV-1, называют HTLV-1-ассоциированной миелопатией (также имеющей аббревиатуру HAM).

Примеры симптомов HAM включают симптомы, вызванные повреждением нейронной ткани, таким как паралич в обеих ногах, боль, дизурия и стойкая констипация. По мере прогрессирования этих симптомов пациенты становятся прикованными к инвалидной коляске или кровати. HAM является одним из заболеваний, обозначенных в Японии как трудноизлечимое. Эффективного метода лечения HAM еще не создано, и в основном практикуется симптоматическая терапия.

В качестве одного из способов лечения, было доказано, что способ лечения с использованием анти-CCR4 антитела оказывает эффект улучшения симптомов за счет уменьшения количества клеток, зараженных HTLV-1, и уменьшения воспаления спинного мозга при HAM (не патентная литература 1 и патентная литература 5).

RGMa белок является членом семейства белка RGM (репульсивной управляемой молекулы) вовлечен в управление сетчаточными или гиппокампальными нейронами, закрытие нервной трубки и подобные. Функции RGM не ограничены вышесказанным, и известно, что этот белок имеет разные функции.

Например, в патентной литературе 1 описано, что: RGM экспрессируется в полученных из костного мозга дендритных клетках (BMDC); и рецептор RGM экспрессируется в CD4⁺ T-клетках и CD11b⁺ макрофагах, и RGM связывается с рецептором RGM, тем самым улучшая активность клеточной адгезии CD4⁺ T-клеток и CD11b⁺ макрофагов. Патентная литература 1 также раскрывает, что: анти-RGM нейтрализующее антитело может снижать и клинические симптомы, и повреждение ткани в мышиных моделях множественного склероза у мышей; и антиген-специфическая и неспецифическая активация T-клетки снижается в клетках селезенки, полученной у мышей.

В патентной литературе 2 и 3 описано нейтрализующее моноклональное антитело против RGMa, селективно ингибирующее связывание RGMa с рецептором RGMa неогенином и костными морфогенетическими белками 2 и 4 (BMP-2 и BMP-4). Нейтрализующее моноклональное антитело, как сообщается, способно содействовать регенерации нервов и восстановлению нарушенных нейронных связей в центральной нервной системе человека с повреждениями и воспалением, в частности, нейродегенеративными заболеваниями, такими как множественный склероз, острое повреждение спинного мозга, травма головного мозга, хорея Хантингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и подобные.

В патентной литературе 4 описан способ определения и количественной оценки фрагмента RGMa для целей диагностики нейродегенеративных заболеваний, таких как травма головного мозга и ишемический инсульт, так как RGMa локализован в миелине центральной нервной системы, новых повреждений и зрелой рубцовой ткани человека, имеющего травму головного мозга или ишемический инсульт. В патентной литературе 4 также перечислены множественный склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Тея-Сакса, болезнь Ниманна-Пика, болезнь Гоше, синдром Гурлера, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, идиопатическое воспалительное демиелинизирующее заболевание, дефицит витамина B12, центральный миелинолиз моста, сухотка спинного мозга, поперечный миелит, болезнь Девича, прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия, неврит зрительного нерва, травма спинного мозга, травматическое повреждение мозга, инсульт, глаукома, диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна и лейкодистрофия в качестве целевых нейродегенеративных заболеваний и расстройств для определения фрагмента RGMa.

Список ссылок

Патентная литература

Патентная литература 1: Международная публикация № WO 2011/071059

Патентная литература 2: патент Японии, выложенный для всеобщего ознакомления № 2014-138599

Патентная литература 3: патент Японии, выложенный для всеобщего ознакомления № 2016-175897

Патентная литература 4: Японский перевод публикации международной заявки PCT № 2017-526930

Патентная литература 5: патент Японии, выложенный для всеобщего ознакомления № 2010-100578.

Непатентная литература

Непатентная литература 1: N Engl J Med, 2018, 378, 529-538.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Способы применения анти-CCR4 антитела, описанные в непатентной литературе 1 и патентной литературе 5 могут улучшать симптомы HAM. Однако, анти-CCR4 антитела оказывают незначительный эффект на пациентов с HAM, имеющих прогрессирующее разрушение нейронов. Следовательно, существует необходимость в лучших способах, которые могут лечить HAM.

Настоящее изобретение создано в свете этих проблем. Целью настоящего изобретения является предоставление терапевтического агента и способа лечения, которые могут лечить HAM.

Решение проблемы

Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования для достижения цели и затем завершили настоящее изобретение, обнаружив, что вещество, ингибирующее RGMa, эффективно для лечения HAM.

Более конкретно, настоящее изобретение включает следующее.

[1]

Терапевтический или профилактический агент для HTLV-1-ассоциированой миелопатии (HAM), содержащий вещество, ингибирующее RGMa.

[2]

Терапевтический или профилактический агент для HAM по [1], где ингибирующим веществом RGMa является антитело, распознающее RGMa.

[3]

Способ лечения HTLV-1-ассоциированой миелопатии (HAM), включающий введение фармакологически эффективного количества вещества, ингибирующего RGMa, пациенту с HAM, нуждающемуся в этом.

[4]

Способ лечения HAM по [3], где веществом, ингибирующим RGMa, является антитело, распознающее RGMa.

Преимущественные эффекты изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, HAM, хроническое заболевание, может быть лечено.

Краткое описание чертежей

[Фигура 1] На фигуре 1 представлена диаграмма, показывающая группы CD4-положительных T-клеток, P, D и N классифицированных согласно CADM1 и CD7, служащих как индексы для HTLV-1-зараженных клеток.

[Фигура 2] На фигуре 2 представлена диаграмма, показывающая уровень экспрессии гена RGMa в нормальных T-клетках (Норма.CD4), полученных у пациента с HAM CD4-положительных T-клеток (HAM.CD4), полученных у здоровых людей CD4-положительн/CADM1-отрицательных/CD7-положительных T-клеток (Норма.P), полученных у человека, зараженного HTLV-1 CD4-положительных/CADM1-отрицательных/CD7-положительных T-клеток (P группа), полученных у человека, зараженного HTLV-1 CD4-положительных/CADM1-положительных/CD7-положительных T-клеток (D группа), полученных у человека, зараженного HTLV-1 CD4-положительных/CADM1-положительных/CD7-отрицательных T-клеток (N группа), полученных у пациента с острым ATL CD4-положительных/CADM1-положительных/CD7-отрицательных T-клеток (Острый.N), полученных у здорового человека CD4-положительных T-клеток (Норма.CD4.1), полученных у пациента с вялотекущим ATL PBMC (Вялотекущий), полученных у пациента с хроническим ATL PBMC (Хронический) и полученных у пациента с острым ATL PBMC (Острый).

[Фигура 3] На фигуре 3 представлена диаграмма, показывающая уровень экспрессии RGMa в полученных у пациента с HAM CD4-положительных T-клеток и полученных у здорового человека CD4-положительных T-клеток.

[Фигура 4] На фигуре 4 представлена диаграмма, показывающая результаты анализа уровня экспрессии RGM в клеточных линиях полученных у пациента с HAM PBMC.

[Фигура 5] На фигуре 5 представлена диаграмма, показывающая изменение экспрессии RGMa, связанной с экспрессией вируса HTLV-1 во время культивирования PBMC от пациента с HAM.

[Фигура 6] На фигуре 6 представлена диаграмма, показывающая уровень H3K27me3 на или рядом с -2,916 п.о. выше от места начала транскрипции гена RGMa.

[Фигура 7] На фигуре 7 представлена диаграмма, показывающая уровень мРНК гена RGMa в колонии CD4-положительных лейкозных T-клеток человека Jurkat, трансфицированных лентивирусным вектором, имеющим вставку кДНК, кодирующей HTLV-1 Tax.

[Фигура 8] На фигуре 8 представлена диаграмма, показывающая результаты анализа экспрессии белка Tax и RGMa в колонии клеток JPX-9, имеющих экспрессию индуцированного HTLV-1-tax.

[Фигура 9] На фигуре 9 представлены диаграмма, показывающая результаты действия анти-RGMa антитела на спонтанную пролиферативную активность относительно действия анти-RGMa антитела на PBMC пациента с HAM.

[Фигура 10] на фигуре 10 представлена диаграмма, показывающая результаты действия анти-RGMa антитела на изменение количества провируса HTLV-1 относительно действия анти-RGMa антитела на PBMC пациента с HAM.

[Фигура 11] На фигуре 11 представлена диаграмма, показывающая результаты действия анти-RGMa антитела на продуцирование CXCL10 относительно действия анти-RGMa антитела на PBMC пациента с HAM.

[Фигура 12] На фигуре 12 представлена диаграмма, показывающая результаты действия анти-RGMa антитела на продуцирование цитокина PBMC пациента с HAM относительно действия анти-RGMa антитела на PBMC пациента с HAM.

[Фигура 13] На фигуре 13 представлена диаграмма, показывающая, что HAM-PBMC вызывают апоптоз клеточной линии нейронов.

[Фигура 14] На фигуре 14 представлена диаграмма, показывающая результаты подавляющего действия анти-RGMa антитела на индукцию апоптоза клеточной линии нейронов клеточной линией, имеющей индуцированный HTLV-1-tax. Фигура 14(a) является графиком FACS при совместном культивировании NB-1 клеток и JPX-9 клеток (не стимулированных). Фигура 14(b) является графиком FACS при совместном культивировании NB-1 клеток и CdCl₂-стимулированных JPX-9 клеток (экспрессирующих HTLV-1-tax клеток). Фигура 14(c) является графиком FACS при добавлении контрольного антитела в условиях с фигуры 14(b). Фигура 14(d) является графиком FACS при добавлении анти-RGMa антитела в условиях с фигуры 14(b).

Описание вариантов осуществления

Ниже будут подробно описаны варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается данным вариантом осуществления, приведенным ниже. В него могут быть внесены различные изменения или модификации, не выходящие за объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение представляет терапевтический или профилактический агент для HTLV-1-ассоциированой миелопатии (HAM), содержащей вещество, ингибирующее RGMa. Веществом, ингибирующим RGMa, может быть вещество, которое ингибирует активность RGMa через воздействие на сам RGMa, или может быть вещество, которое подавляет экспрессию RGMa.

Примеры вещества, ингибирующего RGMa, включают соединения, обладающие активностью ингибирования RGMa и антитела, распознающие RGMa.

Примеры вещества, ингибирующего RGMa, также включают вещества, подавляющие экспрессию RGMa, такие как киРНК (короткая интерферирующая РНК), кшРНК (короткая шпилечная РНК), антисмысловые олигонуклеотиды и подобные, против гена, экспрессирующего RGMa.

Примеры гена RGMa включают, но не ограничены ими, ген RGMa человека, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и ген RGMa, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2. Информация о нуклеотидной последовательности гена RGMa, полученного из каждого из разных организмов, может быть получена из базы данных, такой как GenBank и подобные.

киРНК является двухцепочечной РНК, которая может подавлять экспрессию RGMa гена-мишени. Длина нуклеотидной последовательности (длина основания) киРНК не ограничена, но предпочтительно она составляет менее приблизительно 30 оснований, более предпочтительно, приблизительно 19-27 оснований, еще более предпочтительно, приблизительно 21-25 оснований.

кшРНК относится к молекуле приблизительно 20 пар оснований или более, состоящих из короткой шпилечной структуры, которая имеет интрамолекулярную двухцепочечную структуру, образованную путем содержания палиндромной нуклеотидной последовательности в части одноцепочечной РНК, и также имеющей 3'-концевой «липкий конец» ДНК. кшРНК, после введения в клетку, должна разлагаться на длину приблизительно 20 оснований в клетке и может подавлять экспрессию RGMa гена-мишени, как в киРНК.

киРНК и кшРНК могут быть химически синтезированы искусственным методом. Для киРНК и кшРНК, антисмысловые и смысловые цепи РНК могут быть синтезированы in vitro из шаблона ДНК с применением, например, T7RNA полимеразы и T7 промотора.

Антисмысловым олигонуклеотидом может быть любой нуклеотид, который является комплементарным к или гибридизируется с нуклеотидной последовательностью из менее чем приблизительно 30 последовательных оснований в ДНК последовательности гена RGMa, и может быть любой из ДНК и РНК. Антисмысловой олигонуклеотид может быть модифицирован без затруднения его функций. Антисмысловой олигонуклеотид может быть синтезирован известным способом и может быть легко синтезирован с применением, например, коммерчески доступного аппарата для синтеза ДНК.

Вещество, ингибирующее RGMa, содержащееся в терапевтическом или профилактическом агенте для HAM по настоящему изобретению, предпочтительно является антителом, распознающим RGMa. Далее по тексту, антитело, распознающее RGMa, также называется анти-RGMa антителом. Анти-RGMa антителом по настоящему изобретению может быть любое антитело, которое ингибирует активность RGMa через связывание RGMa. Его примеры включают антитела, которые связываются с RGMa, что приводит к предотвращению связывания RGMa с рецептором RGMa.

Анти-RGMa антителом по настоящему изобретению может быть моноклональное антитело или поликлональное антитело. Антитело по настоящему изобретению может иметь любые изотипы IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.

Анти-RGMa антителом по настоящему изобретению может быть, например, мышиное антитело, CDR-привитое антитело человеческого типа, химерное антитело человеческого типа, гуманизированное антитело или полное антитело человека, или может быть маленькое антитело. Одно из этих антител может использоваться отдельно, или два или несколько антител могут использоваться в комбинации.

CDR-привитым антителом человеческого типа является антитело, полученное замещение CDR антитела животного, отличного от человека, на CDR антитела человека. Химерным антителом человеческого типа является антитело, состоящее из вариабельных областей, полученных из антитела животного, отличного от человека, и постоянных областей, полученных из антитела человека. Гуманизированное антитело относится к антителу, полученному введением группы, полученной из антитела человека, в антитело животного, отличного от человека, в котором остается высоко безопасная частичная область, и концептуально включающему химерное антитело и CDR-привитое антитело человеческого типа.

В настоящем описании, "маленькое антитело" относится к фрагменту антитела или фрагменту антитела, связанному с произвольной молекулой, который распознает тот же эпитоп, что и оригинальное антитело. Конкретные примеры включают, но не ограничены ими: Fab, состоящий из VL, VH, CL и CH1 областей; F(ab')2, в котором две Fab молекулы связаны через дисульфидную связь на их шарнирных областях; Fv, состоящий из VL и VH; одноцепочечное антитело scFv, в котором VL и VH связаны через искусственный полипептидный линкер; и sdFv, Диатело и sc(Fv)2.

Анти-RGMa антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть получено способом, известным в данной области техники, с применением RGMa или его фрагмента в качестве иммуногена.

Является ли полученное антитело анти-RGMa антителом, может быть подтверждено с применением активности RGMa в качестве показателя.

Примеры RGMa включают RGMa человека, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3, и RGMa, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4. RGMa, полученный из каждого из разных организмов, может применяться в качестве иммуногена. Аминокислотная последовательность RGMa может быть получена из базы данных, известной в данной области техники, такой как Protein Data Bank и подобные.

Если анти-RGMa антителом, применяемым в настоящем изобретении, является поликлональное антитело, такое поликлональное антитело может быть получено, например, следующим образом: RGMa или его фрагмент в качестве антигена растворяют в физиологическом растворе с фосфатным буфером (также называемом ФРФБ) и смешивают, при необходимости, с подходящим количеством обычного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда. Эту смесь используют в качестве иммуногена для иммунизации млекопитающего, такого как мышь, крыса, кролик, коза, лошадь и подобные. Примеры способа иммунизации включают, но не ограничены ими, способ проведения подкожной инъекции или внутрибрюшинной инъекции один или два или несколько раз с подходящим интервалом. Затем кровь собирают у иммунизированного животного обычным способом и отделяют сыворотку. Фрагмент поликлонального антитела может быть очищен с получением поликлонального антитела.

Если анти-RGMa антитело, применяемое в настоящем изобретении, является моноклональное антитело, это моноклональное антитело может быть получен слиянием иммунных клеток, например, клеток селезенки, полученных у иммунизированного млекопитающего, с клетками миеломы с получением гибридом, и сбором антитела из культур гибридом. Также, моноклональное антитело может быть получено в виде рекомбинантного моноклонального антитела с применением методики рекомбинации генов, которая включает клонирование гена антитела из гибридомы, введение гена антитела в подходящий вектор и трансфекцию им клеток-хозяев. Альтернативно, моноклональное антитело может быть получено способом фагового дисплея.

Антитело, описанное, например, в Yamashita, T., Mueller, B.K. & Hata, K. Neogenin and repulsive guidance molecule signaling in the central nervous system. Curr. Opin. Neurobiol. 17, 29-34 (2007); патенте Японии, выложенном для всеобщего ознакомления № 2014-138599; патенте Японии, выложенном для всеобщего ознакомления № 2016-175897; Японском переводе публикации международной заявки PCT № 2017-526930; Международной публикации № WO 2016/175236; Японском переводе публикации международной заявки PCT № 2015-508061 или подобных, может применяться в качестве анти-RGMa антитела, применяемого в настоящем изобретении.

Анти-RGMa антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть получено в виде коммерчески доступного продукта производства, например, Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. (IBL), R&D Systems, Inc. или подобных.

Анти-RGMa антитело предпочтительно содержит, в качестве антигенсвязывающего домена, по меньшей мере, одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

GTTPDY (SEQ ID NO: 7);

FQATHDPLT (SEQ ID NO: 10);

ARRNEYYGSSFFDY (SEQ ID NO: 13);

LQGYIPPRT (SEQ ID NO: 16); и

модифицированной CDR аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичность последовательности к одной из этих последовательностей. Идентичность последовательности, описанной выше, предпочтительно, составляет 80% или выше, более предпочтительно, 90% или выше. В настоящем описании, каждая аминокислота представлена обычным однобуквенным кодом или трехбуквенным кодом.

Определяющая комплементарность область (CDR) относится к области, которая образует антигенсвязывающий сайт вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Эта область, также называемая гипервариабельной областью, является группой, имеющей особенно большую вариабельность аминокислотной последовательности в каждой молекуле иммуноглобулина. Каждая из легкой цепи и тяжелой цепи имеет три CDR (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3). В настоящей заявке, CDR молекулы иммуноглобулина определяют согласно системе нумерации Кэбота (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).

В антителе, определенном аминокислотными последовательностями легкой цепи и тяжелой цепи по настоящему изобретению, аминокислотные последовательности CDR прикреплены к заранее определенным последовательностям, и область, отличная от CDR, может быть изменена мутацией или подобными. Если область, отличная от CDR, имеет мутацию или подобное, гомология составляет предпочтительно 90% или выше.

Анти-RGMa антитело предпочтительно дополнительно содержит, по меньшей мере, одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14 и 15 и модифицированную CDR аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 50% идентичность последовательности к одной из этих последовательностей. Идентичность последовательности предпочтительно составляет 80% или выше, более предпочтительно, 90% или выше.

Анти-RGMa антитело более предпочтительно содержит, по меньшей мере, три CDR, выбранных из множеств вариабельных доменов CDR, представленных в таблице 1, или множеств вариабельного домена, в которых, по меньшей мере, одна из трех CDR имеет модифицированную CDR аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, 80%, более предпочтительно, 90% идентичность последовательности к исходной последовательности. Анти-RGMa антитело дополнительно предпочтительно содержит, по меньшей мере, два из множеств вариабельных доменов CDR, показанных в таблице 1. По меньшей мере, два множества вариабельного домена CDR предпочтительно являются комбинацией множества VH5F9 и множества VL5F9 или комбинации множества VH8D1 и множества VL8D1.

[Таблица 1]

Множество VH5F9 VH5F9 CDR-H1 Остатки 31-35 из SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 5 VH5F9 CDR-H2 Остатки 50-66 из SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 6 VH5F9 CDR-H3 Остатки 99-104 из SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 7 Множество VL5F9 VL5F9 CDR-L1 Остатки 24-39 из SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 8 VL5F9 CDR-L2 Остатки 55-61 из SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 9 VL5F9 CDR-L3 Остатки 94-102 из SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 10 Множество VH8D1 VH8D1 CDR-H1 Остатки 31-35 из SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 11 VH8D1 CDR-H2 Остатки 50-66 из SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 12 VH8D1 CDR-H3 Остатки 97-110 из SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 13 VL8D1set VL8D1 CDR-L1 Остатки 24-34 из SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 14 VL8D1 CDR-L2 Остатки 50-56 из SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 15 VL8D1 CDR-L3 Остатки 89-97 из SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 16

Анти-RGMa антитело может содержать каркасную область. Примеры аминокислотных последовательностей, содержащихся в каркасной области, включают SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 и 40. Одна из этих аминокислотных последовательностей может использоваться отдельно, или две или несколько из них могут быть объединены.

Анти-RGMa антитела предпочтительно содержат, по меньшей мере, один вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49; и/или, по меньшей мере, один вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 50, 51 и 52, в качестве вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи.

Сайт связывания анти-RGMa антитела при связывании с RGMa не ограничен, при условии, что сайт вызывает ингибирование RGMa. Например, если RGMa является RGMa человека, анти-RGMa антитело предпочтительно связывается с одним или несколькими пептидами, имеющими аминокислотную последовательность, представленную

EEVVNAVEDWDSQG (SEQ ID NO: 53),

NQQIDFQAFHTNAE (SEQ ID NO: 54),

PTAPETFPYET (SEQ ID NO: 55),

KLPVEDLYYQA (SEQ ID NO: 56), или

LYERTRDLPGRAAAGL (SEQ ID NO: 57).

Анти-RGMa антитело более предпочтительно связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 53 и/или SEQ ID NO: 54, и более предпочтительно, связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 53 и/или SEQ ID NO: 54, и пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 55 и/или SEQ ID NO: 56.

Анти-RGMa антителом предпочтительно является антитело, связывающееся в любом положении 250-го и последующих положений в аминокислотной последовательности RGMa человека.

Анти-RGMa антитела более предпочтительно связываются с пептидом, имеющим аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54, и SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56.

Анти-RGMa антителом может быть, например, поликлональное антитело и моноклональное антитело, полученное с применением RGMa белка или его частичного фрагмента (например, фрагмента, содержащего одну или несколько из SEQ ID NO: 53-57) в качестве антигена, и иммунизации млекопитающего, такого как мышь, антигеном, химерным антителом или гуманизированным антителом, полученным с применением методики рекомбинации генов, антителом человека, полученным с применением продуцирующего антитела человека трансгенного животного, и подобного.

В настоящем изобретении, анти-RGMa антитело, при введении в качестве лекарственного средства человеку, желательно является гуманизированным антителом или антителом человека с точки зрения побочных реакций.

Анти-RGMa антителом может быть частичный фрагмент поликлонального антитела и/или моноклонального антитела, распознающего RGMa белок или его частичный фрагмент (например, фрагмент, содержащий одну или несколько из SEQ ID NO: 53-57) в качестве антигена, или может быть маленьким антителом.

Анти-RGMa антителом может быть выделенное анти-RGMa антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, а также те, которые показаны в таблице 1, где аминокислотные последовательности анти-RGMa антитела, определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (LCDR1), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (LCDR2), определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (LCDR3), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (HCDR1), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (HCDR2) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (HCDR3) содержат

LCDR1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 58),

LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 59),

LCDR3: QQLNTLP (SEQ ID NO: 60),

HCDR1: DAWMD (SEQ ID NO: 61),

HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 62) и

HCDR3: RDGAY (SEQ ID NO: 63), соответственно,

или

LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 64),

LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 65),

LCDR3: SQSTHVP (SEQ ID NO: 66),

HCDR1: TSYYWN (SEQ ID NO: 67),

HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 68) и

HCDR3: SFG, соответственно.

В каждой из CDR последовательностей, одна или несколько аминокислот могут быть замещены, удалены и/или добавлены. Например, одна или две аминокислоты могут быть замещены, удалены и/или добавлены.

Примеры анти-RGMa антитела включают антитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73 в легкой цепи и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74 в тяжелой цепи. В каждой из аминокислотных последовательностей, представленных этими SEQ ID NO, одна или несколько (1-20, 1-10 или 1-5) аминокислот могут быть замещены, удалены, добавлены или вставлены. Такое замещение, делеция или добавление могут быть введены в CDR, но предпочтительно их вводят в область, отличную от CDR.

Может применяться химерное антитело мыши/человека, имеющее постоянную область, полученную от человека. Примеры химерного антитела мыши/человека включают антитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 (вариабельная область: положения 1-107) в легкой цепи, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78 (вариабельная область: положения 1-116) в тяжелой цепи. В каждой из аминокислотных последовательностей, представленных этими SEQ ID NO, одна или несколько (1-20, 1-10 или 1-5) аминокислот могут быть замещены, удалены, добавлены или вставлены. Такие замещение, делеция или добавление могут быть введены в CDR, но предпочтительно их вводят в область, отличную от CDR.

Может применяться гуманизированное антитело, имеющее полученную от человека область, отличную от CDR. Примеры гуманизированного антитела включают антитело, имеющее аминокислотную последовательность из любой из SEQ ID NO: 70-87 (вариабельная область: вплоть до 116 остатков от N-конца) в тяжелой цепи, и аминокислотную последовательность из любой из SEQ ID NO: 88-94 (вариабельная область: 1-107остатков от N-конца) в легкой цепи. В каждой из аминокислотных последовательностей, представленных этими SEQ ID NO, одна или несколько (1-20, 1-10 или 1-5) аминокислот могут быть замещены, удалены, добавлены или вставлены. Такое замещение, делеция или добавления могут быть введены в CDR, но предпочтительно их вводят в область, отличную от CDR.

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи и аминокислотная последовательность легкой цепи могут быть произвольно объединены. Антитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84 в тяжелой цепи и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88 в легкой цепи является предпочтительным. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 84, аминокислотная последовательность, соответствующая вариабельной области тяжелой цепи, представлена SEQ ID NO: 95, и аминокислотная последовательность, соответствующая вариабельной области легкой цепи, представлена SEQ ID NO: 96.

Анти-RGMa антитело предпочтительно является выделенным анти-RGMa антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, где

вариабельная область тяжелой цепи (VH) содержит

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 95) или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность этой аминокислотной последовательности, и

вариабельная область легкой цепи (VL) содержит

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME (SEQ ID NO: 96) или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность этой аминокислотной последовательности.

Примеры анти-RGMa антитела включают антитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75 в легкой цепи и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76 в тяжелой цепи. В каждой из аминокислотных последовательностей, представленных этими SEQ ID NO, одна или несколько одна или несколько (1-20, 1-10 или 1-5) аминокислот могут быть замещены, удалены, добавлены или вставлены. Такое замещение, делеция или добавления могут быть введены в CDR, но предпочтительно их вводят в область, отличную от CDR.

Анти-RGMa антителом может быть химерное антитело мыши/человека, имеющее полученную от человека постоянную область, или может быть гуманизированным антителом, имеющим полученную от человека область, отличную от CDR.

Анти-RGMa антителом может быть выделенное анти-RGMa антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из следующих (a1)-(h1):

(a1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 99, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(b1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 103, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(c1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 104, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(d1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 105, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(e1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 106, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(f1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 107, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(g1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 108, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент, и

(h1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 109, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент.

Анти-RGMa антителом предпочтительно является антитело, которое имеет аминокислотные последовательности, упомянутые выше, и которое является гуманизированным антителом, а также, предпочтительно, имеет постоянную область IgG человека.

HAM может лечиться или предотвращаться веществом, ингибирующим RGMa, по настоящему изобретению.

Как показано в примерах ниже и на фигуре 13, смерть нейронов, т.е. повреждение и дегенерация тканей спинного мозга, вызывается клетками, полученными у пациента с HAM у пациентов с HAM.

В результате исследований авторов настоящего изобретения, как показано в примерах ниже, RGMa заметно экспрессирован в CD4-положительных T-клетках, которые являются основными HTLV-1-зараженными клетками у пациентов с HAM, демонстрируя, что экспрессия RGMa вовлечена в HAM. Результаты тестирования по ингибированию RGMa с применением анти-RGMa антитела продемонстрировали, что RGMa вовлечен в продуцирование CXCL10, IL-2 и IL-10.

CXCL10 является белком, который получают из HAM-патогенных HTLV-1-зараженных T-клеток в ответ на IFN-γ. Известно, что этот белок вызывает патологическое состояние HAM (Brain 2013), и также известно, что они сильно коррелирует со скоростью развития симптомов HAM (PLoSNegl Trop Dis 2013). Введение анти-RGMa антитела на клетки пациентов с HAM подавляет продуцирование этого CXCL10. IL-10, который является одним из цитокинов, работает на подавление воспаления. Введение анти-RGMa антитела на клетки пациентов с HAM заметно повышает продуцирование IL-10.

Для истинного терапевтического действия на HAM, требуется подавлять повреждение нейронов. HTLV-1-зараженные клетки пациентов с HAM имеют высокий уровень экспрессии HTLV-1-tax (Blood 2002), и было показано, что HTLV-1-tax является важным для образования патологического состояния (J Clin Invest 2014). В настоящем изобретении было показано, что HTLV-1-tax вызывает экспрессию RGMa, и полученные у пациента с HAM клетки, имеющие высокий уровень экспрессии RGMa, вызывать смерть нейронов, и что важно, было также показано, что вещество, ингибирующее RGMa, подавляет смерть нейронов, приписываемую клеткам, экспрессирующим HTLV-1-tax.

Как описано выше, вещество, ингибирующее RGMa, может предотвращать индукцию воспалительного патологического состояния HAM и подавлять воспалительную реакцию, приписываемую клеткам пациента с HAM. Поэтому, посредством этого можно лечить или предотвращать HAM. Более того, вещество, ингибирующее RGMa, может не только подавлять воспалительную реакцию, уникальную для HAM, но также подавлять смерть нейронов, приписываемую клеткам, экспрессирующим HTLV-1-tax, которые являются патогенными клетками пациентов с HAM. Поэтому, посредством этого можно лечить или предотвращать HAM.

Как указано выше, вещество, ингибирующее RGMa, может лечить или предотвращать HAM. Таким образом, настоящее изобретение представляет вещество, ингибирующее RGMa, для применения в лечении HAM; фармацевтическую композицию для применения в лечении HAM; применение вещества, ингибирующего RGMa, для лечения HAM; применение вещества, ингибирующего RGMa, в производстве лекарственного средства для лечения HAM; вещество, ингибирующее RGMa, для применения в производстве лекарственного средства для лечения HAM; и способ лечения или профилактики HAM, включающий введение эффективного количества вещества, ингибирующего RGMa, субъекту, нуждающемуся в этом.

Терапевтический или профилактический агент для HAM по настоящему изобретению содержит вещество, ингибирующее RGMa, и может быть составлено соответствующим дальнейшим смешиванием его с фармацевтически приемлемым носителем и/или добавкой.

Примеры формы состава включают: пероральные агенты, такие как таблетки, таблетки с покрытием, пилюли, порошки, гранулы, капсулы, растворы, суспензии, эмульсии и подобные; и парентеральные агенты, такие как инъекции, переливания, суппозитории, мази, пластыри и подобные.

Соотношение компонентов в смеси носителя или добавки может быть соответствующим образом установлено на основе диапазона, обычно принятого в области лекарственных средств.

Примеры носителя включают, но не ограничиваются ими, воду, солевой раствор, другие водные растворители и водные или масляные основы. Примеры добавки включают, но не ограничиваются ими, эксципиенты, связующие агенты, регуляторы pH, разрыхлители, промоторы абсорбции, смазывающие агенты, красители, корригирующие вещества и ароматизаторы.

Если вещество, ингибирующее RGMa, по настоящему изобретению является антителом, распознающим RGMa, это антитело предпочтительно вводят в виде инъекции или переливания, составленного вместе с фармацевтически приемлемым носителем, парентеральным путем введения, например, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно, подкожно или местно.

Инъекция или переливание, содержащее анти-RGMa антитело, может применяться в виде раствора, суспензии или эмульсии. Например, в качестве растворителя для них могут использоваться дистиллированная вода для инъекций, солевой раствор, раствор глюкозы, изотонический раствор (например, хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит, сорбит, борная кислота, тетраборат натрия и растворы пропиленгликоля) или подобные. Один из этих растворителей можно использовать по отдельности или два или более из них можно использовать в комбинации.

Инъекция или переливание могут дополнительно содержать добавку, такую как стабилизатор, солюбилизатор, суспендирующий агент, эмульгирующий агент, успокаивающее средство, буфер, консервант, антисептик или регулятор pH.

Например, в качестве стабилизатора можно использовать альбумин, глобулин, желатин, маннит, глюкозу, декстран, этиленгликоль, пропиленгликоль, аскорбиновую кислоту, бисульфит натрия, тиосульфат натрия, натрий ЭДТК, цитрат натрия, дибутилгидрокситолуол или тому подобные.

Например, в качестве солюбилизатора можно использовать спирт (например, этанол), полиспирт (например, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль), неионное поверхностно-активное вещество (например, Полисорбат 80(R) и HCO-50) или подобные.

Например, в качестве суспендирующего агента можно использовать моностеарат глицерина, моностеарат алюминия, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, лаурилсульфат натрия или подобные.

Например, в качестве эмульгатора можно использовать аравийскую камедь, альгинат натрия, трагакант или подобные.

Например, в качестве успокаивающего агента можно использовать бензиловый спирт, хлорбутанол, сорбит или подобные.

Например, в качестве буфера можно использовать фосфатно-буферный раствор, ацетатно-буферный раствор, боратно-буферный раствор, карбонатно-буферный раствор, цитратно-буферный раствор, Трис-буферный раствор или подобные.

Например, в качестве консерванта можно использовать метил п-гидроксибензоат, этил п-гидроксибензоат, пропил п-гидроксибензоат, бутил п-гидроксибензоат, хлорбутанол, бензиловый спирт, хлорид бензалкония, дегидроацетат натрия, эдетат натрия, борную кислоту, тетраборат натрия или подобные.

Например, в качестве антисептика можно использовать хлорид бензалкония, п-гидроксибензойную кислоту, хлорбутанол или подобные.

Например, в качестве регулятора pH можно использовать хлористоводородную кислоту, гидроксид натрия, фосфорную кислоту, уксусную кислоту или подобные.

Если веществом, ингибирующим RGMa, по настоящему изобретению, является вещество, подавляющее экспрессию RGMa, такое как киРНК (коротка интерферирующая РНК), кшРНК (короткая шпилечная РНК) или антисмысловой олигонуклеотид против гена, экспрессирующего RGMa, это вещество может вводиться в форме невирусного вектора или вирусного вектора.

Если вещество, ингибирующее RGMa, имеет форму невирусного вектора, примеры способа введения могут включать способы переноса молекул нуклеиновых кислот с использованием липосом (липосомный способ, HVJ-липосомный способ, катионный липосомный способ, способ липофекции, липофектаминовый способ и подобные), способы микроинъекции и способы совместного введения молекул нуклеиновых кислот с носителями (металлическими частицами) в клетки с помощью генных пушек.

В случае введения киРНК или кшРНК в организм с использованием вирусного вектора, можно использовать вирусный вектор, такой как рекомбинантный аденовирус или ретровирус. Путем введения ДНК, экспрессирующей киРНК или кшРНК, в ДНК вирус или РНК вирус, такой как детоксифицированный ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус, вирус осповакцины, поксвирус, полиовирус, вирус Синдбис, гемагглютинирующий вирус Японии, SV40 или подобные, и заражая клетки или ткани этим рекомбинантным вирусом, ген может быть перенесен в клетки или ткани.

Полученный таким образом препарат можно вводить в эффективном количестве, например, человеку или любому из других млекопитающих, таким как крыса, мышь, кролик, овца, свинья, лошадь, кошка, собака, обезьяна и подобные для профилактики или лечения HAM.

Доза соответственно устанавливается с учетом цели, тяжести заболевания, возраста, массы тела, пола, истории болезни пациента, типа активного ингредиента и подобных.

Примеры

[Пример 1: Комплексный сравнительный анализ для выяснения патогенных механизмов и патологических состояний HAM и Т-клеточного лейкоза/лимфомы (ALT) у взрослых]

Как показано на фигуре 1, образцы HTLV-1 нонпрогрессоров подвергают анализу экспрессии мРНК по группам CD4-положительных клеток P, D и N, классифицированных согласно CADM1 и CD7, служащих в качестве показателей для HTLV-1-зараженных клеток.

Для HAM, CD4-положительные клетки и CD4-отрицательные клетки, концентрированные с магнитными шариками из мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с HAM, анализируют в 4 случаях каждые. Клетки аналогично разделяют для не зараженных HTLV-1 здоровых индивидуумов (Норма). Мононуклеарные клетки периферической крови также называют PBMC. Для ATL (каждого из вялотекущего, хронического и острого типа заболевания), используют PBMC, состоящие в основном из CD4-положительных клеток.

Проводят анализ экспрессии клеток на основе одноцветного микрочипа производства Agilent Technologies Inc.

В результате комплексного сравнительного анализа связанных с нервами молекул было обнаружено, что RGMa заметно экспрессируется в CD4-положительных клетках пациента с HAM.

Общие данные экспрессии гена получают для Нормальных T-клеток в 4 случаях (Норма.CD4), полученных у пациента с HAM CD4-положительных T-клеток в 4 случаях (HAM.CD4), полученных у здорового человека CD4-положительных/CADM1-отрицательных/CD7-положительных T-клеток в 3 случаях (Норма.P), полученных у зараженного HTLV-1 человека CD4-положительных/CADM1-отрицательных/CD7-положительных T-клеток в 5 случаях (P группа), полученных у зараженного HTLV-1 человека CD4-положительных/CADM1-положительных/CD7-положительных T-клеток в 5 случаях (D группа), полученных у зараженного HTLV-1 человека CD4-положительных/CADM1-положительных/CD7-отрицательных T-клеток в 5 случаях (N группа), полученных у пациента с острым ATL CD4-положительных/CADM1-положительных/CD7-отрицательных T-клеток в 3 случаях (Острый.N), полученных у здорового человека CD4-положительных T-клеток в 21 случае (Норма.CD4.1), полученных у пациента с вялотекущим ATL PBMC в 3 случаях (Вялотекущий), полученных у пациента с ATL PBMC в 20 случаях (Хронический) и полученных у пациента с острым ATL PBMC в 26 случаях (Острый) с применением микрочипа Human Gene Expression 4×44K Microarray от Agilent Technologies Inc., и нормализуют с медианным значением для нанесения уровня RGMa гена на график.

На график наносят значения Log₂ интенсивности флуоресценции из чипа. В группе полученных у пациента с HAM CD4-положительных T-клеток, уровень экспрессии оценивают со значительным отличием от всех других групп (P <0,05). График показан на фигуре 2.

[Пример 2: Анализ экспрессии гена в CD4-положительных у пациента с HAM]

CD4-положительные T-клетки отделяют от PBMC, выделенных из периферической крови пяти пациентов с HAM с применением набора для выделения CD4+ человека (MiltenyiBiotec) и используют в качестве популяции клеток, содержащих большое количество HTLV-1-зараженных клеток. Также, CD4-положительные T-клетки отделяют из PBMC четырех здоровых индивидуумов и используют в качестве контрольной группы.

Суммарную РНК выделяют из отделенных CD4-положительных T-клеток, и кДНК получают с применением ReverTra Ace (Toyobo Co., Ltd.). Полученную кДНК используют для анализа разницы уровня экспрессии RGMa для полученных у пациента с HAM CD4-положительных T-клеток и полученных у здоровых людей CD4-положительных T-клеток с применением ПЦР в реальном времени. 18s рРНК используют в качестве внутреннего контроля.

Результаты анализа показаны на графике на фигуре 3. На графике HD-CD4+ относится к контрольной группе, и HAM-CD4+ относится к группе пациентов с HAM.

[Пример 3: Анализ RGMa-экспрессирующих клеток в PBMC]

Полученные у пациента с HAM PBMC обрабатывают Fc блоком с применением Clear Back (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. (MBL)). Затем туда добавляют анти-CD3-PECy7 (Tonbo Biosciences, Inc. (TONBO)), анти-CD4-FITC (eBioscience, Inc.) и анти-CD14-PE (eBioscience, Inc.) антитела, и клетки окрашивают при 4°C в течение 30 минут.

После промывания окрашенных антителами PBMC, проводят FACS сортировку с применением Aria IIIu (Becton, Dickinson and Company (BD)) для отделения и выделения CD3-положительных CD4-отрицательных клеток (CD3+CD4-), CD3-положительных CD4-положительных клеток (CD3+CD4+), CD3-отрицательных CD14-отрицательных клеток (CD3-CD14-) и CD3-отрицательных CD14-положительных клеток (CD3-CD14+).

Суммарную РНК выделяют из выделенных клеток каждого типа, и кДНК получают с применением ReverTra Ace (Toyobo Co., Ltd.). Полученную кДНК применяют для анализа разницы между уровнем экспрессии RGMa между видами клеток с применением ПЦР в реальном времени. 18s рРНК применяют в качестве внутреннего контроля. Результаты анализа показаны на графике на фигуре 4.

Среди HAM-PBMC, CD3-положительные CD4-положительные клетки (CD3+CD4+), насыщенные зараженными клетками, были обнаружены как имеющие наибольшую экспрессию RGMa.

[Пример 4: Изменение экспрессии RGMa, связанной с культурой полученных у пациента с HAM PBMC]

PBMC от двух пациентов с HAM суспендируют в среде (среда RPMI1640 (Wako), содержащая 10% ФРФБ (Gibco)), инокулируют при 1e5 клеток/лунку в 10 лунок 96-луночного круглодонного планшета, и затем культивируют в течение 1, 3, 5 или 7 дней.

Суммарную РНК экстрагируют из PBMC в день 0, когда культивирование не поводят, а также из PBMC, культивированных в каждый период, и кДНК получают с применением ReverTra Ace (Toyobo Co., Ltd.). Известно, что полученные у пациента с HAM PBMC сверхэкспрессируют вирус HTLV-1 при культивировании. Полученные кДНК применяют для анализа изменений в экспрессии RGMa, связанной с культивированием PBMC от пациента с HAM, т.е., связанной с экспрессией вируса, с применением ПЦР в реальном времени. 18s рРНК применяют в качестве внутреннего контроля. Результаты анализа показаны на графике на фигуре 5.

[Пример 5: Анализ уровня H3K27me3 на всем промоторе]

Уровень H3K27me3 на всем промоторе получают из нормальных T-клеток в 3 случаях (Норма T клетка), полученных у пациента с НАМ CD4-положительных T-клеток в 4 случаях (HAM) и полученных у пациента с острым ATL PBMC в 3 случаях (ATL) с применением SurePrint G3 Human Promoter 2×400K Microarray от Agilent Technologies Inc., и нормализуют. Затем уровень H3K27me3 на или рядом с -2,916 п.о. выше точки начала транскрипции RGMa гена показывают на графике.

График показан на фигуре 6. На графике, показаны значения Log₂ интенсивности флуоресценции из чипа. На чертеже, HAM50 и HAM123, соответственно, относятся к пациентам с HAM, от которых получены CD4-положительные T-клетки. Было выдвинуто предположение, что подавление экспрессии гена RGMa удаляется в полученных у пациента с НАМ CD4-положительных T-клетках.

[Пример 6: Количественная оценка уровня мРНК гена RGMa]

Клеточную линию CD4-положительн T-клеток лейкоза человека Jurkat трансфицируют лентивирусным вектором, имеющим вставку кДНК, кодирующей HTLV-1 Tax. Уровень мРНК гена RGMa измеряют в течение 3 дней после трансфекции количественной РВ-ПЦР. мРНК гена RPL19 также измеряют и используют в качестве внутреннего стандарта.

Количественные результаты показаны на графике на фигуре 7. Было выдвинуто предположение, что HTLV-1 вирус вызывает экспрессию RGMa.

[Пример 7: Tax-зависимая индукция экспрессии RGMa в клеточной линии JPX-9 клеток, имеющих экспрессию HTLV-1-tax]

JPX9 клетки культивируют в течение 24 часов в среде (среде RPMI1640, содержащей 10% ФРФБ). Туда добавляют хлорид кадмия (CdCl2; NacalaiTesque, Inc.), который вызывает экспрессию HTLV-1-tax, с конечной концентрацией 20 мкМ, затем культивируют в течение 1, 2 или 3 дней. Обработанные хлоридом кадмия и не обработанные JPX9 клетки анализируют FACS на экспрессию Tax и RGMa.

Обработанные хлоридом кадмия и не обработанные JPX9 клетки промывают и пермеабилизируют с применением Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit (eBioscience, Inc.). Затем туда добавляют анти-Tax-FITC антитела (Lt-4; любезно предоставленными профессором Танака из University of The Ryukyus), и клетки обрабатывают при 4°C в течение 1 часа для окрашивания белка Tax, экспрессированного в клетках. Окрашенный белок Tax определяют анализом FACS с применением Canto II.

Обработанные хлоридом кадмия и не обработанные JPX9 клетки промывают. Туда добавляют анти-RGMa антитела (производства Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. (IBL)), и клетки обрабатывают при 4°C в течение 30 минут. Затем клетки промывают, и туда добавляют анти-мышиные IgG-PE антитела (BioLegend, Inc.) и подвергают взаимодействию при 4°C в течение 30 минут для окрашивания белка RGMa, экспрессированного в JPX9. Окрашенный белок RGMa определяют анализом FACS с применением Canto II.

Фигура 8 показывает результаты анализа экспрессии белка Tax и RGMa.

[Пример 8: Исследование действия анти-RGMa антитела на PBMC пациента с HAM]

(Действие анти-RGMa антитела на спонтанную пролиферативную активность)

PBMC четырех пациентов с HAM суспендируют в среде (среде RPMI1640, содержащей 10% ФРФБ) и инокулируют при 1e5 клеток/лунку в 96-луночный круглодонный планшет. Туда добавляют анти-RGMa антитела (производства R&D Systems, Inc.) с конечной концентрацией 10 мкг/мл и общим объемом 0,1 мл культурального раствора, и клетки культивируют при 37°C в условиях 5% CO₂ в течение 7 дней в культуральном растворе.

Группу без добавления (Среда), группу с добавлением той же концентрации нормального IgG козы (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (Норма IgG) и группу с добавлением 1 мкг/мл преднизолона (PSL) (Funakoshi Co., Ltd.) используют в качестве контролей.

Через 6 дней после начала культивирования, в каждую лунку добавляют 1 мкКи ³H-тимидина и клетки культивируют при 37°C в условиях 5% CO₂ в течение 16 часов. Затем культивированные клетки адсорибруют на стеклянный фильтр (Printed Filtermat A, PerkinElmer Inc.) с применением коллектора клеток (Tomtec MH3, PerkinElmer Inc.) и сушат. Затем фильтр пропитывают твердым сцинтиллятором Meltilex-A (PerkinElmer Inc.). Количество ³H-тимидина, поглощенной клетками, измеряют с применением MicroBeta (WALLAC MicroBetaTriLux 1450-021). Среднее количество импульсов ³H-тимидина в группе «Среда» PBMC пациентов с HAM определяют как 100%. Относительное значение для каждой группы рассчитывают для определения среднего поглощения ³H-тимидина для четырех пациентов с HAM. Результаты показаны на фигуре 9.

(Действие анти-RGMa антитела на изменение в количестве HTLV-1 провируса)

PBMC от четырех пациентов с HAM суспендируют в среде (среда RPMI1640, содержащая 10% ФРФБ) и инокулируют при 1e5 клеток/лунку в 96-луночный круглодонный планшет. Туда добавляют анти-RGMa антитела (производства R&D Systems, Inc.) с конечной концентрацией 10 мкг/мл и общим объемом 0,1 мл культурального раствора, и клетки культивируют при 37°C в условиях 5% CO₂ в течение 7 дней в культуральном растворе.

Группу без добавления (Среда), группу с добавлением той же концентрации нормального IgG козы (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (Норма IgG) и группу с добавлением 1 мкг/мл преднизолона (PSL) (Funakoshi Co., Ltd.) используют в качестве контролей.

Через 7 дней от начала культивирования, геномную ДНК экстрагируют из масс клеток, из которых супернатант удаляют центрифугированием. Экстрагированную геномную ДНК применяют для измерения количества HTLV-1 провируса (доли зараженных клеток) с применением ПЦР в реальном времени.

Количество HTLV-1 провируса в группе «Среда» PBMC пациентов с HAM определяют как 100%. Относительное значения количества HTLV-1 провируса в каждой группе рассчитывают для определения среднего количества HTLV-1 провируса у четырех пациентов с HAM. Результаты показаны на фигуре 10.

(Действие анти-RGMa антитела на продуцирование CXCL10)

Для анализа действия анти-RGMa антитела на продуцирование CXCL10 в РВМС пациента с НАМ, PBMC от четырех пациентов с HAM суспендируют в среде (среда RPMI1640, содержащая 10% ФРФБ) и инокулируют при 1e5 клеток/лунку в 96-луночный круглодонный планшет. Туда добавляют анти-RGMa антитела (производства R&D Systems, Inc.) с конечной концентрацией 10 мкг/мл и общим объемом 0,1 мл культурального раствора, и клетки культивируют при 37°C в условиях 5% CO₂ в течение 7 дней в культуральном растворе.

Группу без добавления (Среда), группу с добавлением той же концентрации нормального IgG козы (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (Норма IgG) и группу с добавлением 1 мкг/мл преднизолона (PSL) (Funakoshi Co., Ltd.) используют в качестве контролей.

Через 7 дней от начала культивирования, культуральный раствор центрифугируют, и выделяют только культуральный супернатант. Концентрацию CXCL10 в культуральном супернатанте измеряют проточным цитометром FACS Canto II (BD Biosciences) с применением набора Cytokine Beads Array (BD Biosciences).

Концентрацию CXCL10 в культуральном растворе группы «Среда» определяют как 100%. Относительное значение количества концентрации CXCL10 в культуральном растворе каждой группы рассчитывают для определения средней концентрации CXCL10 у четырех пациентов с HAM. Результаты показаны на фигуре 11.

(Действие анти-RGMa антитела на продуцирование цитокина в РВМС пациента с НАМ)

Для анализа действия анти-RGMa антитела на продуцирование разных цитокинов в РВМС пациента с НАМ, PBMC от четырех пациентов с HAM суспендируют в среде (среда RPMI1640, содержащая 10% ФРФБ) и инокулируют при 1e5 клеток/лунку в 98-луночный круглодонный планшет. Туда добавляют анти-RGMa антитела (производства R&D Systems, Inc.) с конечной концентрацией 10 мкг/мл и общим объемом 0,1 мл культурального раствора, и клетки культивируют при 37°C в условиях 5% CO₂ в течение 7 дней в культуральном растворе.

Группу без добавления (Среда), группу с добавлением той же концентрации нормального IgG козы (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (Норма IgG) и группу с добавлением 1 мкг/мл преднизолона (PSL) (Funakoshi Co., Ltd.) используют в качестве контролей.

Через 7 дней от начала культивирования, культуральный раствор центрифугируют, и выделяют только культуральный супернатант. Концентрацию IFNγ, TNF, IL-2 и IL-10 в культуральном супернатанте измеряют проточным цитометром FACS Canto II (BD Biosciences) с применением набора Cytokine Beads Array (BD Biosciences).

Концентрацию каждого цитокина в культуральном растворе группы «Среда» определяют как 100%. Относительное значение количества концентрации цитокина в каждых условиях культивирования рассчитывают для определения среднего значения у четырех пациентов с HAM.

[Пример 9: Индукция апоптоза в клеточной линии нейронов посредством HAM-PBMC]

Клеточную линию нейронов NB-1 или SK-N-AS инокулируют в 6-луночный планшет и культивируют в течение 24 часов. Затем туда добавляют РВМС здорового индивидуума или пациента с НАМ и совместно культивируют. Через 48 часов после начала совместного культивирования, добавленные PBMC удаляют вместе со средой. После промывания ФРФБ, клеточные линии нейронов выделяют.

Каждую из выделенных клеточных линий анализируют способом TUNEL (MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct (MBL)), который специфически определяет клетки, в которых фрагментация ДНК происходит посредством апопотоза. Результаты анализа показаны на фигуре 13. Ось X на гистограмме соответствует интенсивности положительности фрагментации ДНК. HAM-полученные клетки в значительной степени вызывают апоптоз клеточных линий нейронов по сравнению с HD-полученными.

Более конкретно, смерть клеток анализируют согласно следующей <Методике эксперимента>.

<Методика эксперимента>

Клеточные линии нейронов NB-1 и SK-N-AS инокулируют в 6-луночный планшет и культивируют в течение 24 часов.

Затем туда добавляют HD- или HAM-PBMC (в количестве в два раза больше количества инокулированных клеточных линий нейронов) и культивируют в течение 48 часов.

Затем клетки фиксируют с применением 4% параформальдегида и пермеабилизируют 70% этанолом.

Для проведения мечения конца ника ДНК, клетки суспендируют в 20 мкл раствора TdT (TdT буфер II:TdT:FITC-dUTP=18:1:1) из MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct (MBL) и подвергают взаимодействию при 37°C в течение 60 минут, затем проводят FACS анализ.

[Пример 10: Подавляющее действие анти-RGMa антитела на апоптоз клеточной линии нейронов, вызванный колонией экспрессирующих HTLV-1 Tax T-клеток]

Клеточную линию NB-1 инокулируют в 6-луночный планшет и культивируют в течение 24 часов. Затем туда добавляют не стимулированные JPX9 (JPX9(-)) или JPX9, имеющие экспрессию Tax, вызванную 20 мкМ хлорида кадмия в течение 24 часов (JPX9(+CdCl2)) и совместно культивируют. Также, нормальное IgG2b мыши (MBL) или анти-RGMa антитело (IBL) добавляют в сокультуры NB-1 клеток и (JPX9(+CdCl₂) с конечной концентрацией 10 мкг/мл. Через 48 часов от начала совместного культивирования, добавленные JPX9 удаляют вместе со средой. После промывания ФРФБ, клеточные линии нейронов выделяют. Каждую из выделенных клеточных линий анализируют способом TUNEL (MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct (MBL)), который специфически определяет клетки, в которых фрагментация ДНК происходит посредством апопотоза. Результаты анализа показаны на фигуре 14. Ось X на гистограмме соответствует интенсивности положительности фрагментации ДНК.

Более конкретно, смерть клеток анализируют согласно <Методике эксперимента>.

<Методика эксперимента>

Клеточные линии нейронов NB-1 инокулируют в 6-луночный планшет и культивируют в течение 24 часов.

Затем JPX9(-) или JPX9(+CdCl₂) добавляют к NB-1 клеткам и совместно культивируют. Количество JPX9(-) или JPX9(+CdCl₂) клеток было в два раза больше количества инокулированных NB-1. JPX9(+CdCl₂) промывают три раза 10 мл среды для удаления хлорида кадмия и затем добавляют в NB-1 клетки.

Затем нормальный IgG2b мыши (MBL) или анти-RGMa антитела (IBL) добавляют к сокультурам NB-1 клеток и (JPX9(+CdCl₂) с конечной концентрацией 10 мкг/мл и культивируют в течение 48 часов.

Затем клетки фиксируют с применением 4% параформальдегида и пермеабилизируют 70% этанолом и окрашивают добавлением анти-CD45-V450 антитела.

Для проведения мечения конца ника ДНК, клетки суспендируют в 20 мкл раствора TdT (TdT буфер II:TdT:FITC-dUTP=18:1:1) из MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct (MBL) и подвергают взаимодействию при 37°C в течение 60 минут, затем проводят FACS анализ.

Все цитируемые здесь публикации, патентная литература и не патентная литература полностью включены в настоящий документ посредством.

Группа изобретений относится к медицине. Предложено применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками. Группа изобретений характеризует применение различных антител, распознающих RGMa по указанному назначению. Изобретение обеспечивает подавление смерти нейронов, приписываемой клеткам, экспрессирующим HTLV-1-tax, что может найти применение в лечении HTLV-1-ассоциированой миелопатии (HAM). 7 н.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 10 пр.

1. Применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками, где антитело, распознающее RGMa, или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с одним или более пептидами, имеющими аминокислотную последовательность SEQ IN NO: 53, 54, 55, 56 или 57.

2. Применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками, где антитело, распознающее RGMa, или его антигенсвязывающий фрагмент связываются в любом положении 250-го и последующих положений в аминокислотной последовательности RGMa человека.

3. Применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками, где аминокислотные последовательности анти-RGMa антитела или его антигенсвязывающего фрагмента определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (LCDR1), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (LCDR2), определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (LCDR3), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (HCDR1), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (HCDR2) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (HCDR3) содержат

LCDR1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 58),

LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 59),

LCDR3: QQLNTLP (SEQ ID NO: 60),

HCDR1: DAWMD (SEQ ID NO: 61),

HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 62) и

HCDR3: RDGAY (SEQ ID NO: 63), соответственно,

или

LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 64),

LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 65),

LCDR3: SQSTHVP (SEQ ID NO: 66),

HCDR1: TSYYWN (SEQ ID NO: 67),

HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 68) и

HCDR3: SFG, соответственно.

4. Применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками, где аминокислотные последовательности анти-RGMa антитела или его антигенсвязывающего фрагмента определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (LCDR1), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (LCDR2), определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (LCDR3), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (HCDR1), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (HCDR2) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (HCDR3) представляют собой

LCDR1: SEQ ID NO: 8,

LCDR2: SEQ ID NO: 9,

LCDR3: SEQ ID NO: 10,

HCDR1: SEQ ID NO: 5,

HCDR2: SEQ ID NO: 6, и

HCDR3: SEQ ID NO: 7, соответственно,

или

LCDR1: SEQ ID NO: 14,

LCDR2: SEQ ID NO: 15,

LCDR3: SEQ ID NO: 16,

HCDR1: SEQ ID NO: 11,

HCDR2: SEQ ID NO: 12, и

HCDR3: SEQ ID NO: 13, соответственно.

5. Применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками, где антитело, распознающее RGMa, или его антигенсвязывающий фрагмент, выбирают из следующих (a1)-(h1):

(a1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 99, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(b1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 103, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(c1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 104, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(d1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 105, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(e1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 106, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(f1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 107, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент,

(g1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 108, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент, и

(h1) анти-RGMa антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 97, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98 и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 109, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 101 и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102, или его антигенсвязывающий фрагмент.

6. Применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность этой аминокислотной последовательности, и

вариабельная область легкой цепи (VL) антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96 или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность этой аминокислотной последовательности.

7. Применение антитела, распознающего RGMa, или его антигенсвязывающего фрагмента для подавления апоптоза нейронов, вызванного экспрессирующими HTLV-1 Tax клетками, где антитело, распознающее RGMa, или его антигенсвязывающий фрагмент имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84 или аминокислотную последовательность, в которой от 1 до 20 аминокислот замещены, удалены, добавлены или вставлены из SEQ ID NO: 84 в тяжелую цепь, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88 или аминокислотную последовательность, в которой от 1 до 20 аминокислот замещены, удалены, добавлены или вставлены из SEQ ID NO: 88 в легкую цепь.