Композиции и способы активации интегринов Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 C07K16/18 A61K39/395 A61P21/00 A61P25/28 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №63/029070, поданной 22 мая 2020 г., предварительной заявки на патент США №63/009020, поданной 13 апреля 2020 г., и предварительной заявки на патент США №62/935732, поданной 15 ноября 2019 г., раскрытие каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0002] Список последовательностей, ассоциированных с настоящей заявкой, предусмотрен в текстовом формате вместо бумажной копии и настоящим включен в описание посредством ссылки. Название текстового файла, содержащего список последовательностей, является следующим: PLIA_001_05WO_SeqList_ST25.txt. Текстовый файл размером ~150414 байтов был создан 13 ноября 2020 г. и отправляется в электронном виде посредством EFS-Web.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0003] Настоящее изобретение в общем относится к композициям и способам активации гетеродимеров интегрина, которые предусматривают белок, представляющий собой интегрин бета-1, который специфически связывает белок, представляющий собой ламинин. Такие композиции и способы применимы для лечения заболеваний, связанных с нарушением функции мышц, включая мышечные дистрофии.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Клетки скелетных мышц окружены базальной мембраной, соединяющей мышечную мембрану (сарколемму) с интерстициальным внеклеточным матриксом. Базальная мембрана играет ключевую роль во время развития, а у взрослых способствует развитию, обеспечению целостности мышц, синаптогенезу и восстановлению мышц.

[0005] Мутации, влияющие на функциональность или синтез белков, участвующих во взаимодействиях внеклеточного матрикса, базальной мембраны и клеток скелетных мышц, ассоциированы с мышечными дистрофиями. В настоящее время не существует лечения ни для одной из форм мышечной дистрофии. Сообщалось о нескольких типах, которые можно выделить, основываясь на функции пораженного гена. Их можно разделить на несколько классов, наиболее важный из которых связан с мутациями в комплексе цитоскелета плазматической мембраны миофибрилл (комплексе ламинин/дистрогликан/саркогликан/дистрофин). Этот комплекс действует как рецептор ламинина, прикрепляя внеклеточный матрикс к белкам цитоскелета клеток скелетных мышц.

[0006] Наиболее распространенная форма мышечной дистрофии, составляющая примерно половину случаев, обусловлена мутациями в гене дистрофина (PNAS 1984; 81: 1189). Наличие усеченной, частично функциональной формы дистрофина приводит к симптомам, ассоциированным с мышечной дистрофией Беккера (рецессивное заболевание, сцепленное с Х-хромосомой). Более тяжелая форма наблюдается у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна (DMD) (которая составляет половину всех случаев мышечной дистрофии), у которых есть мутация, которая приводит к отсутствию белка дистрофина или к его нефункциональной форме. Заболеваемость DMD составляет приблизительно 1 случай на 3500 новорожденных мальчиков. Также считается, что мутации в гене дистрофина обуславливают истощение пула мышечных стволовых клеток (сателлитных клеток), который активируется в ответ на повреждение мышц. Мутации в гене саркогликана (саркогликанопатии) приводят к нарушению функции белкового комплекса, обеспечивающего взаимодействие между внеклеточным матриксом и мышцей посредством ламинина α2 (мерозина)-дистрогликана-дистрофина. Такие мутации также приводят к аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии, которая очень похожа на дистрофию Дюшенна (NEJM 1997; 336: 618). Мутации в α2-цепи ламинина (мерозина), хотя и редки, приводят к наиболее тяжелой форме миопатии, поскольку мышечные клетки теряют свой якорь для внеклеточного матрикса (Nat Genetics 1995; 11: 216).

[0007] Другой белок, интегрин α7β1, также связывает ламинин и белок цитоскелета и активно участвует в осуществлении биологических функций мышц, поскольку его дефицит также ассоциирован с формой мышечной дистрофии (Nat Genetics 1998; 19:94; Nat Genetics 1997; 17: 318). Два других бета-1-содержащих гетеродимера (α3β1, α6β1) связываются с ламинином, но о мышечной дистрофии, ассоциированной с мутациями в этих генах, не сообщалось. α7β1 является основным рецептором ламинина, который экспрессируется в скелетных, сердечных мышечных клетках и гладкомышечных клетках сосудов, и его дефицит приводит к задержке развития и нарушению подвижности. Считается, что интегрин α7β1 играет компенсаторную роль при мышечных дистрофиях, ассоциированных с мутациями белков, ассоциированных с дистрофином. Действительно, его экспрессия повышена в моделях мышечной дистрофии на человеке и животных (J Cell Sci 1997; 110: 2873). Дефицит интегрина α7β1 в сочетании с дефицитом дистрофина, утрофина или саркогликана приводит к еще более тяжелым формам заболевания (Hum Mol Gen 2006; 15: 989, J Cell Sci 2006; 119: 2185, J Cell Biol 2001; 152: 1207) и дополнительно вызывает дисфункцию миокарда, фиброз и кальцификацию (Circ Res 2008; 102: 1109).

[0008] Остается потребность в фармацевтическом средстве, которое может обеспечить терапевтическую пользу субъектам с дефицитом или нарушением функции комплекса ламинин/дистрогликан/саркогликан/дистрофин.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение относится к фармацевтическому средству, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1 и которое связывается с внеклеточным доменом по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство по пункту 1, где фармацевтическое средство связывается с по меньшей мере одним из следующего: связывающим ламинин доменом по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3; доменом CALF-1 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3; и доменом CALF-2 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство является агонистом интегрина α7β1 и специфически связывается с белком α7. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство не обеспечивает увеличения количества белка α7 в мышечной клетке субъекта при введении фармацевтического средства субъекту.

[0010] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело). В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению является человеческим, гуманизированным или химерным.

[0011] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает фармацевтическое средство, которое активирует по меньшей мере один из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство обеспечивает стабилизацию активной конформации по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1. В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство не связывается специфически с белком β1. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство обеспечивает увеличение адгезии миобластов к мерозину. Например, миобласт может представлять собой нормальный миобласт человека или нормальный миобласт мыши. В качестве альтернативы, миобласт может представлять собой миобласт человека или миобласт мыши, которые являются дефицитными по дистрофину, содержат мутацию в гене дистрофина или содержат нефункционирующий дистрофии. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство обеспечивает увеличение адгезии мышечной трубочки к мерозину. Например, мышечная трубочка может представлять собой нормальную мышечную трубочку человека или нормальную мышечную трубочку мыши. В качестве альтернативы, мышечная трубочка может представлять собой мышечную трубочку человека или мышечную трубочку мыши, которые являются дефицитными по дистрофину, содержат мутацию в гене дистрофина или содержат нефункционирующий дистрофии.

[0012] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1 (например, интегрина α7β1 человека), или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, где эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: (i) аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 1; (ii) 5- 10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 1; или (iii) 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[0013] В настоящем изобретении также предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, где эпитоп содержит SWWP (SEQ ID NO: 25). Кроме того, в настоящем документе предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10 или 10-15 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24. В настоящем документе дополнительно предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки R958, М976, S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 6-10 или 10-15 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления эпитоп является непрерывным. В некоторых вариантах осуществления эпитоп является прерывистым.

[0014] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, которые специфически связываются с эпитопом, раскрытым в данном документе, и содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, (i) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 15; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7; (ii) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 66; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7; или (iii) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 68; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7.

[0015] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, раскрытым в данном документе, и содержат VH-область, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL-область, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где HCDR2 предусматривает SEQ ID NO: 3; и/или где LCDR2 предусматривает SEQ ID NO: 6.

[0016] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, которые специфически связываются с эпитопом, раскрытым в данном документе, и содержат VH-область, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL-область, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, (i) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 5; (ii) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 65; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 5; (iii) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 69; или (iv) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 71.

[0017] Настоящее изобретение охватывает моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1 (например, интегрина α7β1 человека), или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; или где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3.

[0018] Настоящее изобретение также охватывает моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH), где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; или где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3.

[0019] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где: (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; (ii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; (iii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; (iv) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; или (v) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3.

[0020] Настоящее изобретение также охватывает антитело или фрагмент этого антитела, где аминокислотная последовательность VH-области предусматривает: (i) SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; (ii) SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; или (iii) SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67.

[0021] Настоящее изобретение охватывает антитело или фрагмент этого антитела, где аминокислотная последовательность VL-области предусматривает: (i) SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9; (ii) SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; (iii) SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70; или (iv) SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[0022] Настоящее изобретение также охватывает антитело или фрагмент этого антитела, где (i) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9; (ii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; (iii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; (iv) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70; или (v) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[0023] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрено моноклональное антитело, которое представляет собой агонист интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь, (i) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 19; (ii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 45, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 53; (iii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 62; или (iv) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 63

[0024] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению специфически связывается с белком α7. В некоторых случаях антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, содержащим, по существу состоящим из или состоящим из (i) аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 10; (ii) 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 10; или (iii) 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[0025] В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела по настоящему изобретению может представлять собой Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, однодоменное антитело, диатело или одноцепочечное антитело верблюдовых.

[0026] Настоящее изобретение охватывает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или фрагмент антитела, раскрытые в данном документе. В настоящем изобретении также предусмотрен вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления векторов экспрессии молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, раскрытый в данном документе. Настоящее изобретение охватывает способ получения антитела, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, причем способ предусматривает: культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, раскрытый в данном документе, в условиях, при которых молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется, обеспечивая таким образом продуцирование антитела, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела.

[0027] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтическое средство, антитело, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, или фрагмент этого антитела, и фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит дополнительное фармацевтическое средство, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1.

[0028] Настоящее изобретение охватывает способ лечения нарушения или заболевания у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства, антитела, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, или фрагмента этого антитела, с обеспечением таким образом лечения нарушения или заболевания у субъекта. Нарушение или заболевание может характеризоваться одним или более из следующего: нарушение функции интегрина α7β1 у субъекта; дефицит дистрофина у субъекта; наличие мутации в гене дистрофина у субъекта; наличием нефункционирующего дистрофина у субъекта или мышечной дисфункцией, отличной от дисфункции, обусловленной нарушением функции α7β1 или дефицитом дистрофина, мутацией в гене дистрофина или отсутствием функции дистрофина.

[0029] В некоторых вариантах осуществления мышечная дисфункция обусловлена одним или более из следующего или ассоциирована с одним или более из следующего: рак, застойная сердечная недостаточность, хроническая обструктивная болезнь легких, хроническое заболевание почек, ВИЧ-инфекция/СПИД, нервная анорексия, булимия, недостаточное питание, воздействие факторов, тошнота, диабет типа I, диабет типа II, метаболический синдром, кахексия, анемия, сердечная недостаточность, повышенное артериальное давление, рабдомиолиз, сепсис, саркопения, отсутствие физической активности, повреждения вследствие избыточной физической активности, гипотермия, гипертермия, травма, денервация, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, спинальная мышечная атрофия, алкогольная миопатия, ожоговая миопатия, инсульт, стероидная терапия или отмена стероидной терапии, дерматомиозит, синдром Гийена-Барре, невропатия, остеоартрит, инфекция, полиомиелит, полимиозит, воспаление, ревматоидный артрит, гипохолестеринемия, электротравма, тепловой удар, длительная иммобилизация, отсутствие притока крови к конечности или контакт с ядом. Способы лечения по настоящему изобретению могут дополнительно включать стадию выявления субъекта с мышечной дисфункцией.

[0030] В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани. В некоторых вариантах осуществления заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани, представляет собой мышечную дистрофию. В определенных случаях мышечная дистрофия представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна (DMD), мышечную дистрофию Беккера, мерозин-дефицитную врожденную мышечную дистрофию типа 1А или поясно-конечностную мышечную дистрофию. Способы лечения по настоящему изобретению могут дополнительно включать стадию выявления субъекта с заболеванием, сопровождающимся истощением мышечной ткани. В некоторых вариантах осуществления введение терапевтически эффективного количества фармацевтического средства, антитела, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, или фрагмента этого антитела, обеспечивает обращение, стабилизацию или замедление истощения мышечной ткани или мышечной дисфункции у субъекта. В определенных случаях введение обеспечивает улучшение мышечной функции у субъекта. В некоторых вариантах осуществления введение не обуславливает ухудшения мышечной функции у субъекта. Способы лечения по настоящему изобретению могут дополнительно включать измерение мышечной функции у субъекта после стадии введения, где скорость ухудшения мышечной функции снижается.

[0031] В некоторых вариантах осуществления введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства эффективно для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта, эффективно для лечения нарушения функции интегрина α7β1 у субъекта.

[0032] В некоторых вариантах осуществления введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства является эффективным для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта, при этом повышенная активность и/или количество интегрина α7β1 у субъекта являются эффективными для по меньшей мере частичного смягчения эффекта по меньшей мере одного из дефицита дистрофина у субъекта, наличия мутации в гене дистрофина у субъекта или наличия нефункционирующего дистрофина у субъекта.

[0033] В некоторых вариантах осуществления введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства эффективно для смягчения повреждения мышц у субъекта.

[0034] В некоторых вариантах осуществления введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства эффективно для смягчения эксцентрического повреждения мышц у субъекта.

[0035] В некоторых вариантах осуществления введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства эффективно для улучшения мышечной функции диафрагмы у субъекта.

[0036] В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно предусматривает введение субъекту одного или более других средств терапии, при этом одно или более других средств терапии направлены против мышечной дистрофии или истощения мышечной ткани. В некоторых вариантах осуществления одно или более других средств терапии предусматривают одно или более из следующего: противосудорожное средство; иммунодепрессант; антибиотик; хинин; терапия для обеспечения контроля застойной сердечной недостаточности; генная заместительная терапия; терапия на основе пропуска экзона; терапия на основе подавления нонсенс-мутации; терапия с использованием сконструированной нуклеазы; клеточная терапия с использованием клеток-предшественников мышц или стволовых клеток; активация утрофина; противовоспалительная терапия; антифибротическая терапия; стероидная терапия; блокатор миостатина; инсулиноподобный фактор роста; ингибитор фосфодиэстеразы-5; ингибитор АСЕ; индукция ангиогенеза посредством доставки фактора роста эндотелия сосудов (VEGF); подавление рецептора-приманки VEGF типа 1 (VEGFR-1 или Flt-1); физиотерапия; трудотерапия; оперативное вмешательство; ортопедическое вмешательство; логопедическая терапия; респираторная терапия; кардиостимулятор и аппарат искусственного дыхания.

[0037] Настоящее изобретение охватывает способ активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства, антитела, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, или фрагмента этого антитела, я обеспечением таким образом активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта. Настоящее изобретение также предусматривает способ усиления связывания интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства, антитела, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, или фрагмента антитела, с обеспечением таким образом связывания интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта.

[0038] В настоящем изобретении предусмотрено применение фармацевтического средства, антитела, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, или фрагмента этого антитела, в изготовлении лекарственного препарата для лечения нарушения или заболевания, характеризующихся нарушением функции интегрина α7β1 у субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0039] На ФИГ. 1 представлен график, демонстрирующий, что активация белка, представляющего собой интегрин β1, посредством антитела-агониста β1 (TS2/16) способствует адгезии миобластов человека к мерозину (ламинину). «DMD» относится к миобластам, которые характеризуются дефицитом дистрофина, характеризующимся наличием мутации в гене дистрофина или наличием нефункционирующего дистрофина.

[0040] На ФИГ. 2 представлен график, демонстрирующий, что активация белка, представляющего собой интегрин β1, посредством антитела-агониста β1 (TS2/16) способствует адгезии мышечной трубочки человека к мерозину (ламинину). «DMD» относится к миобластам, которые характеризуются дефицитом дистрофина, характеризующимся наличием мутации в гене дистрофина или наличием нефункционирующего дистрофина.

[0041] На ФИГ. 3 представлена серия графиков, демонстрирующих, что клетки, представляющие собой миобласты, экспрессируют несколько интегринов, специфических в отношении ламинина (α3β1; α6β1; α7β1 и α6β4), как измерено с помощью анализа FACS.

[0042] На ФИГ. 4 представлена серия графиков, демонстрирующих, что клетки, представляющие собой мышечные трубочки, экспрессируют несколько интегринов, специфических в отношении ламинина (α3β1; α6β1; α7β1 и α6β4), как измерено с помощью анализа FACS.

[0043] На ФИГ. 5 представлен график, демонстрирующий, что активация гетеродимера интегрина α7β1 посредством антитела-агониста β1 (TS2/16) способствует адгезии мышечной трубочки человека к мерозину (ламинину). «Антитела а3+а6» относится к комбинации ингибирующих антител к α3β1 и α6β1. «Антитела а3+а6+а7» относится к комбинации ингибирующих антител к α3β1, α6β1 и α7β1. «DMD» относится к мышечным трубочкам, которые характеризуются дефицитом дистрофина, характеризующимся наличием мутации в гене дистрофина или наличием нефункционирующего дистрофина.

[0044] На ФИГ. 6 представлены микрофотографии, на которых изображено образование мышечных трубочек из клеток С2С12 через пять дней после дифференцировки.

[0045] На ФИГ. 7 представлен график, демонстрирующий относительную экспрессию дистрофина, измеренную с помощью кПЦР (количественной ПЦР) в мышиных клетках С2С12, обработанных либо контрольной siRNA, либо siRNA, нацеливающейся на дистрофии.

[0046] На ФИГ. 8А представлен график, демонстрирующий, что активация белка, представляющего собой интегрин β1, посредством антитела-агониста β1 (TS2/16) способствует адгезии мышечной трубочки к ламинину в клетках С2С12, представляющих собой мышечные трубочки мыши, обработанных либо контрольной siRNA, либо siRNA, нацеливающейся на дистрофии.

[0047] На ФИГ. 8В представлен график, демонстрирующий, что адгезия к ламинину в основном обеспечивается интегрином α7β1 при стимуляции посредством TS2/16. «Антитела а3+а6» относится к комбинации ингибирующих антител к α3β1 и α6β1. «Антитела а3+а6+а7» относится к «комбинации» ингибирующих антител к α3β1, α6β1 и α7β1. «DMD(KD)» относится к клеткам, представляющим собой мышечные трубочки, обработанным с помощью siRNA, нацеливающейся на дистрофии. Mn2+ использовали в качестве активатора всех интегринов для достижения максимально возможного уровня адгезии клеток к мерозину.

[0048] На ФИГ. 9 представлена схема способа, с помощью которого были получены и охарактеризованы моноклональные антитела, связывающиеся с белком, представляющим собой интегрин α7β1.

[0049] На ФИГ. 10А представлен график, демонстрирующий результаты твердофазного анализа связывания в отношении активности двух активирующих антител (М10, М25) и одного блокирующего антитела (М20) к интегрину α7β1.

[0050] На ФИГ. 10В представлен график, демонстрирующий результаты анализа адгезии клеток в отношении активности двух активирующих антител (М10, М25) и одного блокирующего антитела (М20) к интегрину α7β1.

[0051] На ФИГ. 10С представлена серия графиков, демонстрирующих результаты прямых ELISA, в которых анализировали связывание антител М10 и М25 и антитела-агониста β1 (TS2/16) с интегринами, содержащими β1.

[0052] На ФИГ. 11А представлена серия графиков, демонстрирующих, что антитела М36 и М38 связываются с клеточными поверхностями, экспрессирующими интегрины α7β1. Клетки K562/имитационный контроль (трансфицированные контрольным пустым вектором), K562 α7Х2 (трансфицированные плазмидой, кодирующей cDNA интегрина α7Х2) и С2С12 тестировали в отношении связывания М36, М38 и α7 (3С12). 3С12 представляет собой положительное контрольное антитело к интегрину α7.

[0053] На ФИГ. 11В представлена серия графиков, демонстрирующих, что антитела М36 и М38 селективно связываются с интегринами α7β1 человека и мыши (Hu_a7b1 и Mu_a7b1), в отличие от интегринов α6β1 (Hu_a6b1 или α5β1 (Hu_a5b1) человека.

[0054] На ФИГ. 12А представлена схема структуры белка, представляющего собой интегрин α7, и его доменов. На этой фигуре также изображены последовательности вариабельной области X1 (SEQ ID NO: 1) и Х2 (SEQ ID NO: 10), находящиеся во внеклеточном домене белка, представляющего собой интегрин α7.

[0055] На ФИГ. 12В представлена серия графиков, демонстрирующих, что антитела М36 и М38 преимущественно связываются с клеточными поверхностями, экспрессирующими форму Х2 интегрина α7β1. Линии клеток K562, стабильно трансфицированные с помощью cDNA интегрина α7Х1 или α7Х2 человека, обозначены как K562/Hu_а7Х1 или K562/Hu_а7Х2.

[0056] На ФИГ. 13А представлен график, демонстрирующий, что антитела М36 и М38 усиливают адгезию клеток с интегрином α7β1 (K562/а7Х2) к ламинину 211 (LN211) человека. TS2/16 представляет собой антитело-агонист β1. М35 представляет собой контрольное антитело, не обладающее эффектом в отношении адгезии к ламинину.

[0057] На ФИГ. 13В представлен график, демонстрирующий, что антитела М36 и М38 усиливают адгезию мышечных трубочек мышей, в которых дистрофии был подвергнут нокдауну (KD), к ламинину.

[0058] На ФИГ. 14 представлен график, демонстрирующий, что антитела М36 и М38 обеспечивают переход интегрина α7β1 в активную конформацию. Активацию интегрина β1 выявляют с помощью моноклонального антитела 9EG7. Для корректировки конформаций интегрина перед обработкой антителом использовали различные катионы (менее активный (Mg2+, 1 мМ) и активный (Mn2+, 0,125 мМ)).

[0059] На ФИГ. 15 представлена серия графиков, демонстрирующих, что моноклональное антитело VL3VHK20TFT связывается с клетками, котрансфицированными генами субъединицы интегрина альфа 7 (ITGA7) и интегрина бета-1 (ITGB1). 3С12, 6А11, А1-1а М20 и А1-1а М24 представляют собой положительные контрольные антитела для связывания с IGTA7. Эти антитела описаны в таблице 4. Оптимальная концентрация для скрининга для каждого моноклонального антитела обведена рамкой.

[0060] На ФИГ. 16 представлен график, демонстрирующий, что Fab VL3VHK20TFT связывается с клетками, котрансфицированными генами субъединицы интегрина альфа 7 (ITGA7) и интегрина бета-1 (ITGB1). Оптимальная концентрация для скрининга Fab обведена рамкой.

[0061] На ФИГ. 17 представлен график, демонстрирующий связывание Fab VL3VHK20TFT с библиотекой клеток, котрансфицированных библиотекой мутантных вариантов ITGA7, предназначенной для аланинового сканирования.

[0062] На ФИГ. 18 представлена модель кристаллической структуры, демонстрирующая критические остатки для связывания Fab VL3VHK20TFT с субъединицей альфа 7 интегрина. Критические остатки показаны красными сферами. Вторичные остатки показаны синими сферами.

[0063] На ФИГ. 19 представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 4 при различных концентрациях VL3VHK20 TFT; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 человека; связывании 1:1.

[0064] На ФИГ. 20 представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 4 при различных концентрациях VLVH; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 человека; связывании 1:1.

[0065] На ФИГ. 21А представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 4 при различных концентрациях VL3VHK20 TFT; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 мыши; связывании 1:1.

[0066] На ФИГ. 21В представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 4 при различных концентрациях VLVH; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 мыши; связывании 1:1.

[0067] На ФИГ. 22А представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 4, для связывания VL3VHK20TFT с клеточными поверхностями, экспрессирующими интегрин α7β1.

[0068] На ФИГ. 22 В представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 4, для усиленной посредством VL3VHK20TFT адгезии клеток, экспрессирующих α7β1 человека, к ламинину.

[0069] На ФИГ. 22С представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 4, для усиленной посредством VL3VHK20TFT адгезии клеток, экспрессирующих α7β1 мыши, к ламинину.

[0070] На ФИГ. 23 представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 5, для концентрации антител в мкг/мл в зависимости от клеточного индекса (опосредованная интегрином α7β1 адгезия клеток) как для усиленной антителом мыши (VLVH), так и для усиленной гуманизированным антителом (VL3VHK20TFT) адгезии клеток, представляющих собой миобласты, к ламинину.

[0071] На ФИГ. 24 представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 6, для сокращения в зависимости от силы (нормализовано по исходному сокращению) для групп DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG, mdx/антитело-агонист в дозе 3 мг/кг и mdx/антитело-агонист в дозе 15 мг/кг.

[0072] На ФИГ. 25 представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 7, для частоты стимуляции в Гц в зависимости от силы (нормализовано по ширине мышцы, мН/мм) для групп DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG, mdx/антитело-агонист в дозе 3 мг/кг и mdx/антитело-агонист в дозе 15 мг/кг.

[0073] На ФИГ. 26 представлена гистограмма, демонстрирующая количество креатинкиназы в сыворотке крови, биомаркера повреждения мышц, в группах DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG и при обработке антителом-агонистом М36.

[0074] На ФИГ. 27 представлена гистограмма, демонстрирующая количество скелетного тропонина, биомаркера повреждения мышц, в группах DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG и при обработке антителом-агонистом М36.

[0075] На ФИГ. 28 представлена гистограмма, демонстрирующая количество О-гидроксипролина, показателя образования коллагена/фиброза в икроножной мышце, в группах DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG и при обработке антителом-агонистом М36.

[0076] На ФИГ. 29 показаны различные варианты последовательностей, полученные в результате сайт-направленного мутагенеза, осуществленного в отношении аминокислот, расположенных в CDR1 и CDR2 тяжелой цепи или CDR1 легкой цепи антитела VL3VHK20TFT. YGISF: SEQ ID NO: 26. GYTFTSYYMH: SEQ ID NO: 27. QGTSY: SEQ ID NO: 28. SGTSY: SEQ ID NO: 29. RASQSISSYLN: SEQ ID NO: 30

[0077] На ФИГ. 30 представлена гистограмма, демонстрирующая связывание с интегрином α7β1 клеточной поверхности вариантами последовательностей антител.

Связывание измеряли с помощью проточной цитометрии и нормализовали по изотипическому контролю IgG4.

[0078] На ФИГ. 31 представлена иллюстрация, изображающая внеклеточную область интегрина α7β1 и различные домены в ней. α-цепь таких интегринов, например α3, α6 и α7 (показаны), включает четыре внеклеточных домена: семилопастный «β-пропеллер», «бедренный» и два «икроножных» домена (CALF-1 и CALF-2). «Бедренный» и «икроножные» домены содержат сходные иммуноглобулиноподобные β-сэндвичевые складки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0079] В настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические средства, которые активируют гетеродимеры интегрина, содержащие белок бета-1 (β1), которые специфически связывают белок, представляющий собой ламинин. Агонист гетеродимера интегрина, содержащего белок β1, может обеспечивать терапевтическую пользу субъекту с мышечной дистрофией, ассоциированной с нарушением функции одного из белков комплекса ламинин/дистрогликан/саркогликан/дистрофин или белка, представляющего собой ламинин-α2 (мерозин).

[0080] Гетеродимеры интегрина состоят из нековалентно ассоциированных белковых субъединиц α и β и действуют в качестве рецепторов трансмембранной адгезии (Hynes, (2002) Cell 110:673-687). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство, описанное в данном документе, является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1. В определенных случаях фармацевтическое средство является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1. В других вариантах осуществления фармацевтическое средство является агонистом интегрина α7β1 и интегрина α6β1. В других вариантах осуществления фармацевтическое средство является агонистом интегрина α6β1 и интегрина α3β1. В еще других вариантах осуществления фармацевтическое средство является агонистом интегрина α7β1 и интегрина α3β1l. В одном варианте осуществления фармацевтическое средство является агонистом интегрина α7β1. В другом варианте осуществления фармацевтическое средство является агонистом интегрина α6β1. В еще другом варианте осуществления фармацевтическое средство является агонистом интегрина α3β1. В некоторых примерах белки-интегрины представляют собой белки-интегрины человека. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство не связывается специфически с белком β1.

[0081] В настоящем изобретении предусмотрено фармацевтическое средство, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1 и которое связывается с внеклеточным доменом по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство связывается с по меньшей мере одним из следующего: связывающий ламинин домен по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3; домен CALF-1 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3 и домен CALF-2 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3. Иллюстрация, изображающая внеклеточную область интегрина α7β1 и различные ее домены, включая домены CALF, представлена на ФИГ. 31.

[0082] В определенных случаях фармацевтическое средство связывается со связывающими ламинин доменами одного или более из белка α7 (SEQ ID NO: 11), белка α6 (SEQ ID NO: 12) и белка α3 (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство связывается со связывающими ламинин доменами белка α7 (SEQ ID NO: 11), белка α6 (SEQ ID NO: 12) и белка α3 (SEQ ID NO: 13)

[0083] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство связывается с доменом CALF-1 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3. Иллюстративная последовательность домена CALF-1 человека представлена в таблице 1 В. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство связывается с доменом CALF-1, содержащим SEQ ID NO: 73.

[0084] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство связывается с доменом CALF-2 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3. Иллюстративная последовательность домена CALF-2 человека представлена в таблице 1С. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство связывается с доменом CALF-2, содержащим SEQ ID NO: 74.

[0085] Настоящее изобретение относится к фармацевтическому средству, которое является агонистом интегрина α7β1 и которое специфически связывается с белком α7. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрено фармацевтическое средство, которое является агонистом интегрина α7β1 и которое специфически связывается с белком α7, при отрицательном условии, что фармацевтическое средство не обеспечивает увеличения количества белка α7 в мышечной клетке субъекта при введении фармацевтического средства субъекту.

[0086] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено фармацевтическое средство, которое обеспечивает активированное состояние гетеродимеру интегрина α7β1.

[0087] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство, описанное в настоящем документе, представляет собой антитело.

АНТИТЕЛА

[0088] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено фармацевтическое средство, которое представляет собой антитело. В одном варианте осуществления антитело специфически связывается с белком α7. В другом варианте осуществления антитело специфически связывается с белком α6. В дополнительном варианте осуществления антитело специфически связывается с белком α3.

[0089] Используемый в данном документе термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулина (Ig) и иммунологически активным частям или фрагментам молекул иммуноглобулина, т.е. к молекулам, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывает антиген (например, белок α7, белок α6 или белок α3) (вступает в иммунологическую реакцию с ним). Под «специфически связывает» или «вступает в иммунологическую реакцию с» подразумевается, что антитело вступает в реакцию с одной или более антигенными детерминантами требуемого антигена и не вступает в реакцию с другими полипептидами. В некоторых вариантах осуществления говорят, что антитело специфически связывает антиген, если оно предпочтительно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. Термин «антитело» в широком смысле относится к молекуле иммуноглобулина (Ig), обычно содержащей четыре полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, или любые их функциональный фрагмент, мутант, вариант или производное, которые сохраняют основные свойства связывания с мишенью молекулы Ig. Такие мутантные, вариантные или производные форматы антител известны в данной области техники.

[0090] В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (обозначаемую в данном документе сокращенно как HCVR или VH-область) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена: CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (обозначаемую в данном документе как LCVR или VL-область) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен - CL. VH- и VL-области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH-область и VL-область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) и класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса. Антитела IgG, IgD и IgE обычно содержат две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи и два антиген связывающих домена, каждый из которых состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL). Обычно антитела IgA состоят из двух мономеров, при этом каждый мономер состоит из двух тяжелых цепей и двух легких цепей (как и в антителах IgG, IgD и IgE); таким образом, молекула IgA содержит четыре антигенсвязывающих домена, каждый из которых также состоит из VH и VL. Некоторые антитела IgA являются мономерными в том смысле, что они состоят из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Секретируемые антитела IgM обычно состоят из пяти мономеров, при этом каждый мономер состоит из двух тяжелых цепей и двух легких цепей (как и в антителах IgG и IgE); таким образом, молекула IgM содержит десять антигенсвязывающих доменов, каждый из которых также состоит из VH и VL. Также существует форма IgM, связанного с клеточной поверхностью, и такая форма характеризуется структурой с двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями, сходной с таковой антител IgG, IgD и IgE.

[0091] Используемые в данном документе термины «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «фрагмент антитела» или «часть антитела») относятся к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, белком α7). Было показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Варианты осуществления антитела и фрагмента антитела также могут представлять собой биспецифические, триспецифические, двуспецифические или полиспецифические форматы, которые специфически связываются с двумя или более различными антигенами. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают: (i) Fab-фрагмент - моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-фрагмент одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., публикация согласно PCT WO 90/05144 A1, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки), который содержит один вариабельный домен; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Настоящее изобретение также охватывает Fab'-фрагмент. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить с помощью рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, что позволяет составить их в единую белковую цепь, в которой VL- и VH-области образуют пары с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела охватываются термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения молекулы scFv могут быть включены в слитый белок. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает одноцепочечное антитело верблюдовых. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также включены. Диатела представляют собой двухвалентные, биспецифические антитела, в которых VH- и VL-домены экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить объединение в пары двух доменов в одной цепи, таким образом вынуждая домены объединяться в пары с комплементарными доменами другой цепи и обеспечивая создание двух антигенсвязывающих сайтов (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Такие связывающие фрагменты антитела известны в данной области техники (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp.). В некоторых аспектах настоящее изобретение включает однодоменное антитело. В общем, термин «антитело», используемый в данном документе, включает «фрагмент антитела». Фрагмент антитела обычно сохраняет антигенсвязывающие свойства полноразмерного антитела.

[0092] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены антитела и фрагменты антител, которые являются агонистами интегрина α7β1 и которые содержат одну или более аминокислотных последовательностей, показанных в таблице 2 или таблице 3.

[0093] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; или где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3.

[0094] Настоящее изобретение также охватывает моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH), где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; или где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3.

[0095] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; (ii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; (iii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; (iv) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; или (v) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3.

[0096] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит последовательность HCDR1, содержащую последовательность под SEQ ID NO: 14 с аминокислотной заменой в ее восьми аминокислотных остатках, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[0097] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где аминокислотная последовательность VH-области предусматривает: (i) SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; (ii) SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; или (iii) SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67.

[0098] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[0099] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00100] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00101] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00102] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00103] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00104] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00105] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00106] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00107] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00108] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00109] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00110] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00111] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00112] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00113] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00114] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00115] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00116] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00117] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00118] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00119] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00120] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00121] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00122] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00123] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00124] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00125] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

[00126] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH), где аминокислотная последовательность VL-области предусматривает: (i) SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9; (ii) SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; (iii) SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70; или (iv) SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[00127] В настоящем изобретении дополнительно предусматривает моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (i) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9; (ii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; (iii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; (iv) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70; или (v) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[00128] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрено моноклональное антитело, которое представляет собой агонист интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь, (i) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 19; (ii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 45, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 53; (iii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 62; (iv) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 63

[00129] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1 или фрагмент этого антитела, где антитело представляет собой hIgG4-1, hIgG4-2, hIgG4-3, hIgG4-4, hIgG4-5, hIgG4-6, hIgG4-7, hIgG4-8, hIgG4-9, hIgG4-10, hIgG4-11, hIgG4-12, hIgG4-13, hIgG4-14, hIgG4-15, hIgG4-16, hIgG4-17, hIgG4-18, hIgG4-19, hIgG4-20, hIgG4-21, hIgG4-22, hIgG4-23, hIgG4-24, hIgG4-25, hIgG4-26, hIgG4-27, hIgG4-28, hIgG4-29, hIgG4-30, hIgG4-31, hIgG4-32, hIgG4-33, hIgG4-34, hIgG4-35, hIgG4-36, hIgG4-37, hIgG4-38, hIgG4-39, hIgG4-40, hIgG4-41, hIgG4-42, hIgG4-43, hIgG4-44, hIgG4-45, hIgG4-46, hIgG4-47, hIgG4-48 или hIgG4-49. Комбинации последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, образующие эти антитела, представлены в таблице 10.

[00130] В некоторых вариантах осуществления антитело к α7 или α7-связывающий фрагмент антитела содержат полипептид, имеющий одну или более аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность под одним или более из SEQ ID NO: 2-9, 14-19 и 31-72. Например, антитело к α7 или α7-связывающий фрагмент антитела могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных замен, делеций или вставок. Замены, делеций или вставки могут быть введены посредством стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез или опосредованный ПЦР мутагенез молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид антитела к α7 или α7-связывающего фрагмента антитела.

[00131] В некоторых вариантах осуществления консервативные аминокислотные замены осуществлены в одном или более положениях аминокислотных последовательностей антител или фрагментов антител, раскрытых в данном документе. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену аминокислотного остатка аминокислотным остатком, содержащим сходную боковую цепь. В определенных вариантах осуществления консервативные аминокислотные замены осуществляют только в последовательностях FR, а не в последовательностях CDR антитела или фрагмента антитела. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков, содержащих сходные боковые цепи, включая следующие: основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, аминокислотный остаток в полипептиде антитела к α7 или α7-связывающего фрагмента антитела может быть заменен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В некоторых вариантах осуществления цепочка аминокислот может быть заменена структурно сходной цепочкой, которая отличается порядком и/или составом членов семейства боковых цепей. В некоторых вариантах осуществления замена может обеспечивать замещение исходного аминокислотного остатка относительно более гидрофобным аминокислотным остатком. В некоторых вариантах осуществления замена может обеспечивать замещение исходного аминокислотного остатка относительно менее гидрофобным аминокислотным остатком. Специалисты в данной области техники смогут оценить, связывают ли антитело к α7 или α7-связывающий фрагмент антитела, содержащие полипептид, имеющий одну или более аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность под одним или более из SEQ ID NO: 2-9, 14-19 и 31-72, белок α7, с использованием известных в данной области техники способов, включая без ограничения варианты ELISA, вестерн-блоттинга, фаговый дисплей и т.д.

[00132] Расчеты гомологии или идентичности последовательностей (термины используются в данном документе взаимозаменяемо) между последовательностями могут быть выполнены следующим образом.

[00133] Чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, для обеспечения оптимального выравнивания в одну или обе из первой и второй последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот могут быть введены гэпы, и для целей сравнения могут не учитываться негомологичные последовательности). В предпочтительном варианте осуществления длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%) и еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как и в соответствующем положении во второй последовательности, тогда молекулы идентичны в этом положении (как используется в данном документе «идентичность» аминокислоты или нуклеиновой кислоты эквивалентна «гомологии» аминокислоты или нуклеиновой кислоты). Процент идентичности двух последовательностей зависит от количества идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом количества гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.

[00134] Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно выполнить с помощью математического алгоритма. В одном варианте осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453), который был включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступном на www.gcg.com), с использованием либо матрицы BLOSUM 62, либо матрицы РАМ250, и штрафа за открытие гэпа, составляющего 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штрафа за удлинение гэпа, составляющего 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В еще одном варианте осуществления процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей определяют с помощью программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступном на сайте www.gcg.com), с использованием матрицы NWSgapdna.CMP, штрафа за открытие гэпа, составляющего 40, 50, 60, 70 или 80, и штрафа за удлинение гэпа, составляющего 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Один набор параметров (и тот, который может быть использован, если практикующий врач не уверен в том, какие параметры следует применять для определения того, находится ли молекула в пределах ограничения идентичности последовательности или гомологии по настоящему изобретению) представляет собой матрицу оценки BLOSUM 62 со штрафом за открытие гэпа, составляющим 12, штрафом за удлинение гэпа, составляющим 4, и штрафом за сдвиг рамки гэпа, составляющим 5.

[00135] Процент идентичности двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей может быть определен с использованием алгоритма Meyers et al. ((1989) CABIOS 4:11-17), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы весов замен остатков РАМ120, штрафа за удлинение гэпа, составляющего 12, и штрафа за открытие гэпа, составляющего 4.

[00136] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой поликлональное антитело. Термин «моноклональное антитело» относится к популяции молекул антител, которые содержат только один вид антигенсвязывающего сайта, способного вступать в иммунологическую реакцию с конкретным эпитопом антигена. Таким образом, композиция на основе моноклонального антитела обычно проявляет одиночную аффинность связывания с конкретным белком, с которым она вступает в иммунологическую реакцию.

[00137] В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению является гуманизированным, химерным или человеческим.

[00138] В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению является гуманизированным антителом или агонистом интегрина. Термин «гуманизированное антитело», используемый в данном документе, относится к антителу, которое было сконструировано таким образом, чтобы содержать одну или более каркасных областей человека в вариабельной области вместе с отличными от человеческих (например, мышиными, крысиными или хомячьими) определяющими комплементарность областями (CDR) тяжелой и/или легкой цепи. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит полностью человеческие последовательности, за исключением CDR-областей. Гуманизированные антитела обычно менее иммуногенны для человека по сравнению с негуманизированными антителами и, таким образом, обладают терапевтической пользой в определенных ситуациях. Специалистам в данной области техники известны гуманизированные антитела, а также подходящие методики их получения. См., например, Hwang, W. Y. K., et al., Methods 36:35, 2005; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033, 1989; Jones et al., Nature, 321:522-25, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-27, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-36, 1988; Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-37, 1989; патенты США №№5225539; 5530101; 5585089; 5693761; 5693762; 6180370; и Selick et al., WO 90/07861, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать аминокислотную последовательность VH-области, которая содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4; и аминокислотную последовательность VL-области, которая содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7; и одну или более последовательностей каркасных областей человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать аминокислотную последовательность VH-области, которая содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотную последовательность VL-области, которая содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7; и одну или более последовательностей каркасных областей человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать аминокислотную последовательность VH-области, которая содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотную последовательность VL-области, которая содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7; и одну или более последовательностей каркасных областей человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать аминокислотную последовательность VH-области, которая содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотную последовательность VL-области, которая содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7; и одну или более последовательностей каркасных областей человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать аминокислотную последовательность VH-области, которая содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотную последовательность VL-области, которая содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7; и одну или более последовательностей каркасных областей человека.

[00139] В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению является химерным антителом или агонистом интегрина. Используемый в данном документе термин «химерное антитело» относится к антителу, которое было сконструировано таким образом, чтобы оно содержало по меньшей мере одну константную область человека. Например, каждая из одной или всех вариабельных областей легкой цепи(цепей) и/или одной или всех вариабельных областей тяжелой цепи(цепей) антитела мыши (например, моноклонального антитела мыши) могут быть присоединены к константной области человека, такой как без ограничения константная область IgG1 человека. Химерные антитела обычно менее иммуногенны для человека по сравнению с нехимерными антителами и, таким образом, обладают терапевтической пользой в определенных ситуациях. Специалистам в данной области техники известны химерные антитела, а также подходящие методики их получения. См., например, Cabilly et al., патент США №4816567; Shoemaker et al., патент США №4978775; Beavers et al., патент США №4975369; и Boss et al., патент США №4816397, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать VH-область, содержащую SEQ ID NO: 8; VL-область, содержащую SEQ ID NO: 9, и константную область человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать VH-область, содержащую SEQ ID NO: 16; VL-область, содержащую SEQ ID NO: 17, и константную область человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать VH-область, содержащую SEQ ID NO: 67; VL-область, содержащую SEQ ID NO: 17, и константную область человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать VH-область, содержащую SEQ ID NO: 16; VL-область, содержащую SEQ ID NO: 70, и константную область человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать VH-область, содержащую SEQ ID NO: 16; VL-область, содержащую SEQ ID NO: 72, и константную область человека.

[00140] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, могут содержать константную область иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления константная область иммуноглобулина представляет собой IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2. В некоторых вариантах осуществления константная область иммуноглобулина представляет собой IgG1, IgG2, IgG3, IgG1null, IgG4(S228P), IgA1 или IgA2. Молекула антитела или ее антиген связывающая часть могут содержать иммунологически инертную константную область. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или фрагмент этого антитела могут содержать константную область иммуноглобулина, содержащую константную область IgG1 человека дикого типа, константную область IgG1 человека, содержащую аминокислотные замены L234A, L235A и G237A, или константную область IgG1 человека, содержащую аминокислотные замены L234A, L235A, G237A и P331S. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или фрагмент этого антитела могут содержать константную область иммуноглобулина, содержащую константную область IgG2 человека дикого типа или константную область IgG4 человека дикого типа. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или фрагмент этого антитела могут содержать константную область иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность Fc-области IgG4 человека, IgG4(S228P) человека, IgG2 человека, IgG1 человека, IgG1-3M человека или IgG1-4M человека. Например, Fc-область IgG4(S228P) человека содержит следующую замену по сравнению с Fc-областью IgG4 человека дикого типа: S228P. Например, Fc-область IgG1-3М человека содержит следующие замены по сравнению с Fc-областью IgG1 человека дикого типа: L234A, L235A и G237A, тогда как Fc-область IgG1-4M человека содержит следующие замены по сравнению с Fc-областью IgG1 человека дикого типа: L234A, L235A, G237A и P331S. В некоторых вариантах осуществления положение аминокислотного остатка в константной области молекулы иммуноглобулина пронумеровано в соответствии с номенклатурой EU (Ward et al., 1995 Therap.Immunol. 2:77-94).

[00141] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела могут содержать константную область легкой цепи иммуноглобулина, которая представляет собой константную область легкой каппа-цепи или константную область легкой лямбда-цепи.

[00142] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом белка α7. В некоторых вариантах осуществления эпитоп белка α7, связываемый антителом или фрагментом антитела, является непрерывным. В некоторых вариантах осуществления эпитоп белка α7, связываемый антителом или фрагментом антитела, является прерывистым.

[00143] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с внеклеточным доменом белка α7. Вследствие посттранскрипционных модификаций белок α7 может иметь две разные внеклеточные последовательности (обозначенные «X1» и «Х2»). Область, которая является вариабельной между последовательностями X1 и Х2, расположена между гомологичными повторяющимися доменами III и IV белка α7 вблизи предполагаемого сайта связывания лиганда. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или фрагмент этого антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1, специфически связываются с областью белка α7 между гомологичными повторяющимися доменами III и IV вблизи предполагаемого сайта связывания лиганда. Последовательность X1 состоит из последовательности, по существу состоит из последовательности или содержит последовательность TARVELCAQGSADLAHLDDGPYEAGGEKEQDPRLIPVPANSYFG (SEQ ID NO: 1). Последовательность Х2 состоит из последовательности, по существу состоит из последовательности или содержит последовательность

LLFVTNIDSSDPDQLVYKTLDPADRLPGPAGDLALNSYLG (SEQ ID NO: 10). Последовательность Х2 преимущественно экспрессируется в зрелых клетках скелетных мышц. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, который содержит последовательность, состоит по существу из последовательности или состоит из последовательности под SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, который содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, который содержит последовательность, состоит по существу из последовательности или состоит из последовательности под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, который содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40 или 40-44 аминокислоты из последовательности под SEQ ID NO: 1.

[00144] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, который содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10, 10-15, 15- 20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00145] В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с доменом CALF-2 белка α7 (например, белка α7 человека).

[00146] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, где эпитоп содержит SWWP (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, где эпитоп содержит SWWP (SEQ ID NO: 25), и где эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10 или 10-15 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24, где эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10 или 10-15 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки R958, М976, S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки R958, М976, S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24, где эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 6-10 или 10-15 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00147] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, раскрытым в данном документе, и содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, (i) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 15; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7; (ii) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 66; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7; или (iii) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 68; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, раскрытым в данном документе, и содержат VH-область, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL-область, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где HCDR2 предусматривает SEQ ID NO: 3; и/или где LCDR2 предусматривает SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, которые специфически связываются с эпитопом, раскрытым в данном документе, и содержат VH-область, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL-область, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, (i) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 5; (ii) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 65; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 5; (iii) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 69; или (iv) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела специфически связываются с эпитопом, раскрытым в данном документе, и содержат VH-область, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL-область, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где CDR содержат одну или более из следующих аминокислотных последовательностей: HCDR1: SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 65, HCDR2: SEQ ID NO: 3, HCDR3: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68, LCDR1: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 71, LCDR2: SEQ ID NO: 6 и LCDR3: SEQ ID NO: 7.

[00148] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела специфически связываются с связывающим ламинин доменом (или эпитопом в связывающем ламинин домене) белка α7, белка α6 и/или белка α3. В некоторых случаях моноклональное антитело или фрагмент антитела, которые являются агонистами интегрина α7β1, специфически связываются с эпитопом белка α7, который содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из связывающего ламинин домена белка α7, белка α6 и/или белка α3.

[00149] Используемый в данном документе термин «эпитоп» включает любую белковую детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или фрагментом иммуноглобулина. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Термин «эпитоп» также относится к единице структуры, обычно связываемой парой вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) иммуноглобулина. Эпитоп может определять минимальный сайт связывания антитела и, таким образом, представлять собой мишень специфичности антитела.

[00150] Используемые в данном документе термины «иммунологическое связывание» и «свойства иммунологического связывания» относятся к нековалентным взаимодействиям того типа, которые происходят между молекулой иммуноглобулина (например, антителом) и антигеном, в отношении которого иммуноглобулин является специфичным. Сила или аффинность иммунологических связывающих взаимодействий может быть выражена в терминах константы диссоциации (K_d) взаимодействия, где меньшее значение K_d соответствует большей аффинности. Свойства иммунологического связывания выбранных полипептидов можно количественно определить с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Один из таких способов предусматривает измерение скорости образования и диссоциации комплекса антигенсвязывающий сайт/антиген, где эта скорость зависит от концентраций партнеров по комплексу, аффинности взаимодействия и геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Таким образом, как «константа скорости ассоциации» (K_on), так и «константа скорости диссоциации» (K_off) могут быть определены путем расчета концентраций и фактических скоростей ассоциации и диссоциации. (См. Nature 361:186-87 (1993)). Соотношение K_off/K_on позволяет исключить все параметры, не связанные с аффинностью, и равняется константе диссоциации K_d. (См., в целом, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Считается, что антитело по настоящему изобретению специфически связывается с эпитопом PD-L1, если равновесная константа связывания (K_d) составляет ≤10 мкМ, предпочтительно ≤10 нМ, более предпочтительно ≤10 нМ и наиболее предпочтительно от ≤100 пМ до приблизительно 1 пМ при измерении с помощью анализов, таких как анализы связывания радиолиганда или сходные анализы, известные специалистам в данной области техники.

[00151] В определенных аспектах антитело по настоящему изобретению является моновалентным или двухвалентным и содержит одну или две цепи. Функционально аффинность связывания антитела может находиться в диапазоне от 10^-5 М до 10^-12 М. Например, аффинность связывания антитела составляет от 10^-6 М до 10^-12 М, от 10^-7 М до 10^-12 М, от 10^-8 М до 10^-12 М, от 10^-9 М до 10^-12 М, от 10^-5 М до 10^-11 М, от 10^-6 М до 10^-11 М, от 10^-7 М до 10^-11 М, от 10^-8 М до 10^-11 М, от 10^-9 М до 10^-11 М, от 10^-10 М до 10^-11 М, от 10^-5 М до 10^-10 М, от 10^-6 М до 10^-10 М, от 10^-7 М до 10^-10 М, от 10^-8 М до 10^-10 М, от 10^-9 М до 10^-10 М, от 10^-5 М до 10^-9 М, от 10^-6 М до 10^-9 М, от 10^-7 М до 10^-9 М, от 10^-8 М до 10^-9 М, от 10^-5 М до 10^-8 М, от 10^-6 М до 10^-8 М, от 10^-7 М до 10^-8 М, от 10^-5 М до 10^-7 М, от 10^-6 М до 10^-7 М или от 10^-5 М до 10^-6 М.

ЭФФЕКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

[00152] Настоящее изобретение охватывает фармацевтические средства (например, антитела), которые активируют по меньшей мере один из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство стимулирует связывание интегринового комплекса с ламининами. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство обеспечивает стабилизацию активной конформации по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1.

[00153] В определенных аспектах фармацевтическое средство обеспечивает увеличение адгезии миобластов к ламинину-α2 (мерозину). В некоторых случаях миобласт представляет собой нормальный миобласт человека или нормальный миобласт мыши. В других случаях миобласт представляет собой миобласт человека или миобласт мыши, которые являются дефицитными по дистрофину, содержат мутацию в гене дистрофина или содержат нефункционирующий дистрофии.

[00154] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство обеспечивает увеличение адгезии мышечной трубочки к ламинину-α2 (мерозину). В некоторых случаях мышечная трубочка представляет собой нормальную мышечную трубочку человека или нормальную мышечную трубочку мыши. В некоторых случаях мышечная трубочка представляет собой мышечную трубочку человека или мышечную трубочку мыши, которые являются дефицитными по дистрофину, содержат мутацию в гене дистрофина или содержат нефункционирующий дистрофии.

[00155] В некоторых аспектах активация гетеродимера интегрина фармацевтическим средством может иметь один или более из следующих эффектов:

i) повышение силы связей, существующих между мышечными клетками, миобластами/мышечными трубками, и их внеклеточной средой; ii) повышение синтеза внеклеточного матрикса мышечными клетками; iii) повышение выживаемости мышечных клеток; и iv) повышение рекрутинга и миграции сателлитных клеток, которые обеспечивают регенеративную способность скелетных мышц.

МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. ВЕКТОРЫ. КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

[00156] Один аспект настоящего изобретения охватывает молекулу нуклеиновой кислоты (например, выделенную молекулу нуклеиновой кислоты), кодирующую антитело или фрагмент антитела, описанные в данном документе (или VH-область, VL-область или как VH-область, так и VL-область антитела или фрагмента антитела). В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[00157] В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; и (ii) аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и (ii) аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67; и (ii) аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и (ii) аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность VH-области, предусматривающую SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и (ii) аминокислотную последовательность VL-области, предусматривающую SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[00158] Кроме того, в данном документе предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты (например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты), кодирующая: (i) тяжелую цепь, (ii) легкую цепь или (iii) как тяжелую, так и легкую цепь антитела или фрагмента антитела, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь, предусматривает SEQ ID NO: 20 или нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 45 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, предусматривает SEQ ID NO: 21 или нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 53 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 63 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 63.

[00159] В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 18; и (ii) аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты предусматривает: (i) SEQ ID NO: 20 или нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 91%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 20; и (ii) SEQ ID NO: 21 или нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 45 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 45; и (ii) аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 53 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 91%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 18; и (ii) аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует: (i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 18; и (ii) аминокислотную последовательность легкой цепи, предусматривающую SEQ ID NO: 63 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 63.

[00160] Настоящее изобретение также охватывает вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. В определенных векторах молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с одной или более регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В некоторых случаях вектор экспрессии содержит последовательности, которые опосредуют репликацию, и содержит один или более селективных маркеров.

[00161] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, раскрытый в данном документе. Вектор экспрессии может быть трансфицирован в клетку-хозяин посредством стандартных методик. Неограничивающие примеры включают электропорацию, преципитацию с использованием фосфата кальция, трансфекцию с использованием DEAE-декстрана и т.п.

[00162] В некоторых аспектах в настоящем изобретении предусмотрен способ получения антитела или фрагмента антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1, включающий: культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, описанный в данном документе, в условиях, при которых сегмент нуклеиновой кислоты экспрессируется, обеспечивая таким образом продуцирование антитела или фрагмента антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1. Антитела к α7 и их α7-связывающие фрагменты могут быть получены любым из множества способов, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления антитела к α7 и α7-связывающие фрагменты антител могут быть получены рекомбинантным путем. Например, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие одну или более из аминокислотных последовательностей под SEQ ID NO: 2-9, 14-19 и 31-72 или их части, могут быть введены в бактериальную клетку (например, Е. coli, В. subtilis) или эукариотическую клетку (например, клетку дрожжей, таких как S. cerevisiae, или клетку млекопитающего, такую как линия клеток СНО, различные линии клеток Cos, клетка HeLa, различные линии миеломных клеток или трансформированная В-клетка или гибридома), или в систему трансляции in vitro, и транслируемый полипептид может быть выделен. В некоторых вариантах осуществления белки легкой цепи и белки тяжелой цепи антитела продуцируются в клетке с лидерной последовательностью (также называемой сигнальной последовательностью), которая удаляется при продуцировании зрелого антитела к α7 или его а7-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления лидерная последовательность представляет собой MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYG (SEQ ID NO: 22) или METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 23).

[00163] Специалисты в данной области техники смогут определить, связываются ли антитело или фрагмент, содержащие данную полипептидную последовательность, с белком α7, без излишних экспериментов с использованием стандартных методологий, таких как без ограничения вестерн-блоттинг, анализ методом ELISA и т.п.

ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

[00164] Настоящее изобретение охватывает способы и варианты применения описанных в данном документе фармацевтических средств для обеспечения терапевтической пользы субъекту с нарушением или заболеванием. В некоторых аспектах способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства (например, антитела или фрагмента антитела), описанного в данном документе (например, агониста по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1, с обеспечением таким образом лечения нарушения или заболевания у субъекта. Нарушение или заболевание может характеризоваться нарушением функции интегрина α7β1 у субъекта. Например, у субъекта может иметься мутация в гене интегрина α7β1. У субъекта может отсутствовать достаточное количество интегрина α7β1. Нарушение или заболевание может характеризоваться дефицитом дистрофина у субъекта. Нарушение или заболевание может характеризоваться наличием мутации в гене дистрофина у субъекта. Нарушение или заболевание может характеризоваться наличием нефункционирующего дистрофина у субъекта. Нарушение или заболевание может характеризоваться мышечной дисфункцией, отличной от обусловленной нарушением функции α7β1, или дефицитом дистрофина, мутацией в гене дистрофина или отсутствием функции дистрофина у субъекта.

[00165] В некоторых вариантах осуществления мышечная дисфункция у субъекта обусловлена одним или более из следующего или ассоциирована с одним или более из следующего: рак, застойная сердечная недостаточность, хроническая обструктивная болезнь легких, хроническое заболевание почек, ВИЧ-инфекция/СПИД, нервная анорексия, булимия, недостаточное питание, воздействие факторов, тошнота, диабет типа I, диабет типа II, метаболический синдром, кахексия, анемия, сердечная недостаточность, повышенное артериальное давление, рабдомиолиз, сепсис, саркопения, отсутствие физической активности, повреждения вследствие избыточной физической активности, гипотермия, гипертермия, травма, денервация, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, спинальная мышечная атрофия, алкогольная миопатия, ожоговая миопатия, инсульт, стероидная терапия или отмена стероидной терапии, дерматомиозит, синдром Гийена-Барре, невропатия, остеоартрит, инфекция, полиомиелит, полимиозит, воспаление, ревматоидный артрит, гипохолестеринемия, электротравма, тепловой удар, длительная иммобилизация, отсутствие притока крови к конечности или контакт с ядом. В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно предусматривает выявление субъекта с мышечной дисфункцией или который подвержен риску развития таковой.

[00166] В некоторых вариантах осуществления заболевание, которое можно лечить посредством способов и композиций по настоящему изобретению, представляет собой заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани. В некоторых случаях заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани, представляет собой дефицит дистрогликана, дефицит саркогликана или дефицит мерозина. В одном примере заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани, представляет собой мышечную дистрофию. Неограничивающие примеры мышечной дистрофии включают мышечную дистрофию Дюшенна (DMD), мышечную дистрофию Беккера, мерозин-дефицитную врожденную мышечную дистрофию типа 1А и поясно-конечностную мышечную дистрофию. В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно предусматривает выявление субъекта с заболеванием, сопровождающимся истощением мышечной ткани, или который подвержен риску развития такового.

[00167] В некоторых вариантах осуществления эффективность композиции по настоящему изобретению при лечении заболевания, сопровождающегося истощением мышечной ткани, может быть проанализирована с использованием модели на животном. Неограничивающие примеры моделей DMD на животных включают модель на мышах Mdx/C57BL/10 (пораженный белок: дистрофии), модель на мышах Mdx/D2 (пораженный белок: дистрофии), модель на мышах mdx-utrn-/- (пораженные белки: дистрофии и атрофии), и модель на крысе с нокаутом Mdx (пораженный белок: дистрофии). Неограничивающим примером модели поясно-конечностной мышечной дистрофии на животном является мышь Sgca-null (пораженный белок: альфа-саркогликан). Неограничивающим примером модели врожденной мышечной дистрофии типа 1А с дефицитом мерозина (MDC1A) на животном является мышь LAMA2dyw/dyw (пораженный белок: ламинин альфа2).

[00168] В некоторых вариантах осуществления введение фармацевтического средства, описанного в данном документе, нуждающемуся в этом субъекту обеспечивает обращение, стабилизацию или замедление истощения мышечной ткани или мышечной дисфункции у субъекта. В других вариантах осуществления введение фармацевтического средства, описанного в данном документе, нуждающемуся в этом субъекту не обуславливает ухудшения мышечной функции у субъекта. Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать измерение мышечной функции у субъекта после стадии введения, где скорость ухудшения мышечной функции снижается.

[00169] В некоторых вариантах осуществления Введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства может быть эффективным для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта, эффективного для лечения нарушения функции интегрина α7β1 у субъекта.

[00170] В некоторых вариантах осуществления введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства может быть эффективным для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта. Повышенная активность и/или количество интегрина α7β1 у субъекта могут быть эффективными для по меньшей мере частичного смягчения эффекта дефицита дистрофина у субъекта. Повышенная активность и/или количество интегрина α7β1 у субъекта могут быть эффективными для по меньшей мере частичного смягчения эффекта мутации в гене дистрофина у субъекта. Повышенная активность и/или количество интегрина α7β1 у субъекта могут быть эффективными для по меньшей мере частичного смягчения эффекта нефункционирующего дистрофина у субъекта.

[00171] В некоторых вариантах осуществления введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства может быть эффективным для смягчения повреждения мышц у субъекта. Например, введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства может быть эффективным для смягчения эксцентрического повреждения мышц у субъекта. Введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства может быть эффективным для улучшения мышечной функции диафрагмы у субъекта.

[00172] В нескольких вариантах осуществления способ может включать введение субъекту одного или более других средств терапии. Один или более других видов терапии могут быть направлены на мышечную дистрофию или истощение мышечной ткани, например, могут представлять собой любую общепринятую или экспериментальную терапию мышечной дистрофии. Один или более других видов терапии могут предусматривать медикаментозное лечение, хирургическое вмешательство с трансплантацией или без нее, физическое вмешательство, такое как физиотерапия, или использование медицинского устройства. Например, один или более других видов терапии могут предусматривать противосудорожное средство. Один или более других видов терапии могут предусматривать иммунодепрессант. Один или более других видов терапии могут предусматривать антибиотик. Один или более других видов терапии могут предусматривать хинин. Один или более других видов терапии могут предусматривать терапию для обеспечения контроля застойной сердечной недостаточности. Один или более других видов терапии могут предусматривать генную заместительную терапию. Один или более других видов терапии могут предусматривать терапию на основе пропуска экзона. Один или более других видов терапии могут предусматривать терапию на основе подавления нонсенс-мутации. Один или более других видов терапии могут предусматривать терапию с использованием сконструированной нуклеазы. Один или более других видов терапии могут предусматривать клеточную терапию с использованием клеток-предшественников мышц или стволовых клеток. Один или более других видов терапии могут предусматривать активацию утрофина. Один или более других видов терапии могут предусматривать противовоспалительное средство. Один или более других видов терапии могут предусматривать антифибротическое средство. Один или более других видов терапии могут предусматривать стероидную терапию. В некоторых вариантах осуществления стероидная терапия предусматривает кортикостероид или анаболический стероид. Один или более других видов терапии могут предусматривать блокатор миостатина. Один или более других видов терапии могут предусматривать инсулиноподобный фактор роста. Один или более других видов терапии могут предусматривать ингибитор фосфодиэстеразы-5; ингибитор АСЕ. Один или более других видов терапии могут предусматривать индукцию ангиогенеза посредством доставки фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Один или более других видов терапии могут предусматривать подавление рецептора-приманки VEGF типа 1 (VEGFR-1 или Flt-1). Один или более других видов терапии могут предусматривать физиотерапию, трудотерапию. Один или более других видов терапии могут предусматривать оперативное вмешательство. Один или более других видов терапии могут предусматривать ортопедическое вмешательство. Один или более других видов терапии могут предусматривать логопедическую терапию. Один или более других видов терапии могут предусматривать респираторную терапию. Один или более других видов терапии могут предусматривать кардиостимулятор. Один или более других видов терапии могут предусматривать аппарат искусственного дыхания.

[00173] В различных вариантах осуществления способ может дополнительно предусматривать введение субъекту одного или более других средств терапии. Один или более других видов терапии могут быть направлены на смягчение мышечной дистрофии. Один или более других видов терапии могут быть направлены на смягчения истощения мышечной ткани.

[00174] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать одно или более из следующего, например: противосудорожное средство, иммунодепрессант, например преднизолон и дефлазакорт, антибиотик и хинин.

[00175] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать терапию для обеспечения контроля застойной сердечной недостаточности, например дилатационной кардиомиопатии, например, с использованием противозастойных лекарственных препаратов и/или трансплантации сердца. Примеры видов терапии, которые можно использовать при застойной сердечной недостаточности, включают, например: ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) (ACE-I); блокаторы ангиотензиновых рецепторов (ARB); бета-адреноблокаторы (бета-блокаторы); гидралазин; нитраты, такие как изосорбида динитрат; антагонист альдостерона; дигоксин; диуретики, например петлевые диуретики, тиазидоподобные диуретики и калийсберегающие диуретики; антикоагулянт; антагонист рецептора вазопрессина, например кониваптан; сакубитрил/валсартан; ивабрадин; пищевая добавка железа; ограничение употребления жидкости и ограничение употребления соли.

[00176] В различных вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать один или более видов генетической терапии, например генную заместительную терапию. Например, один вид генетической терапии предусматривает замену гена дистрофина с использованием вирусных векторов. Например, аденоассоциированные вирусы со встроенными микродистрофинами были введены в модель DMD на собаках, что обеспечило в результате получение существенной пользы в отношении гистопатологии мышц. В настоящее время проводятся клинические испытания по замене дефектных генов у субъектов-людей с DMD с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусов. Примеры включают, например, rAAV2.5-CMV-Mini-dystrophy, rAAVrh74.MCK-Mini-dystrophy и rAAV1.CMV.huFollistatin344.

[00177] В некоторых вариантах осуществления один или более видов генетической терапии могут предусматривать, например, терапию на основе пропуска экзона, при которой синтетические антисмысловые олигонуклеотидные последовательности используются для обновления мутаций гена дистрофина. Определенные экзоны пропускаются во время сплайсинга пре-матричной РНК (пре-мРНК) гена дистрофина, что обеспечивает восстановление рамки считывания и частичного продуцирования внутренне усеченного белка. Терапия на основе пропуска экзона может предусматривать средства для обеспечения пропуска экзона, например: для пропуска экзона 53, такие как SRP4053 (Serapta), PRO053 (Prosensa) и NS-065/NCNP-01; для пропуска экзона 51, такие как PRO051, этеплирсен (AVI-4658) и дрисаперсен (GSK2402968); для пропуска экзона 45, такие как DS-5141, PRO045 и SRP4045; и для пропуска экзона 44, такие как PRO044. Например, PRO051, 2'-O-метилфосфоротиоатный олигорибонуклеотид, который обеспечивает пропуск экзона 51 в пре-мРНК дистрофина, был введен субъектам-людям с DMD, что привело в результате к восстановлению дистрофина на 17%-35%. Кроме того, например, этеплирсен (AVI-4658) представляет собой фосфорамидатный морфолиноолигомер, который также обеспечивает пропуск экзона 51 в пре-мРНК дистрофина.

[00178] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов генетической терапии могут предусматривать, например, терапию на основе подавления нонсенс-мутации. Приблизительно 10%-15%) случаев DMD обусловлены точечными мутациями, обеспечивающими формирование преждевременного стоп-кодона. Такие преждевременные стоп-кодоны обычно обуславливают потерю функционального белка. Распознавание таких преждевременных стоп-кодонов может быть смягчено с помощью средств для подавления нонсенс-мутации, эффективных для восстановления трансляции и продукции модифицированного белка дистрофина. Средства для подавления нонсенс-мутации могут предусматривать, например, аминогликозиды, такие как гентамицин, аталурен (Translarna) и арбекацинсульфат (NPC-14).

[00179] В различных вариантах осуществления один или более видов генетической терапии могут предусматривать, например, использование сконструированных нуклеаз, таких как CRISPR-Cas9. Например, у мышей mdx, которых обрабатывали с использованием РНК-направляемых эндонуклеаз системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами-Cas9, доставляемых посредством аденоассоциированного вируса, смягчались дистрофические изменения в волокнах скелетных мышц, кардиомиоцитах и мышечных сателлитных клетках.

[00180] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать один или более видов клеточной терапии, например терапию с использованием клеток-предшественников мышц или стволовых клеток, например перенос миобластов, внутриартериальную трансплантацию мезоангиобластов родственного донора, соответствующих по человеческому лейкоцитарному антигену, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, аллогенные мезенхимальные стволовые клетки на основе пуповинной крови и аутологичные и мононуклеарные стволовые клетки костного мозга.

[00181] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать стабилизацию мембран и активацию цитоскелетных белков. Например, активация утрофина, альфа-7-бета-1 интегрина, 110 бигликана и саркоспана обеспечивала стабилизацию сарколеммы у мышей mdx. Например, было показано, что соединения SMT С1100 и SMT022357 целенаправленно воздействуют на промотор утрофина-А и обеспечивают увеличение продукции утрофина и уменьшение дистрофических изменений в скелетной и сердечной мышцах.

[00182] В различных вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать один или более видов противовоспалительной терапии. Противовоспалительные лекарственные средства могут предусматривать, например: VBP15; гивиностат (ингибитор HDAC); пептид, представляющий собой NEMO-связывающий домен; CAT-1004 (эдасалонексент, ингибитор NF-kB); флавококсид; TAS-205 (ингибитор синтазы PDGD2); идебенон; пентоксифиллин; коэнзим Q10; N-ацетилцистеин; экстракт зеленого чая; мелатонин; пентоксифиллин и оксатомид. Например, ингибирование NF-κB с использованием пептида, представляющего собой NEMO-связывающий домен, обеспечивало в результате улучшение в отношении патологии и мышечной функции в моделях мышечной дистрофии на мышах.

[00183] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать один или более видов антифибротической терапии, например блокаторы TGF-β, такие как лозартан, блокатор рецептора ангиотензина II типа 1, который обеспечивает снижение уровня экспрессии TGF-β; лизиноприл; НТ-100 (галофугинон); FG-3019 (моноклональное антитело к CTGF) и нацеленные микроРНК.

[00184] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать виды терапии, обеспечивающие регенерацию мышц. Например, подходящие средства могут предусматривать: блокаторы миостатина, такие как АСЕ-031, MYO-029, фоллистатин, PF-06252616 и BMS-986089, или инсулиноподобный фактор роста, отдельно или дополнительно в комбинации с мезенхимальными стромальными клетками.

[00185] В различных вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать лечение мышечной ишемии, например путем ингибирования фосфодиэстеразы-5 с использованием тадалафила, силденафила и варденафила; ингибиторы АСЕ; индукцию ангиогенеза посредством доставки фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и подавление рецептора-приманки VEGF типа 1 (VEGFR-1 или Flt-1).

[00186] В некоторых вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать одно или более физических вмешательств, например: физиотерапию, трудотерапию, хирургическое вмешательство, ортопедическое вмешательство (например, голеностопный ортез), логопедическую терапию и респираторную терапию.

[00187] В нескольких вариантах осуществления один или более других видов терапии могут предусматривать одно или более медицинских устройств, например: кардиостимулятор или аппарат искусственного дыхания, такой как аппарат искусственной вентиляции легких или устройство постоянного положительного давления в дыхательных путях.

[00188] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства (например, антитела или фрагмента антитела), описанного в данном документе, с обеспечением таким образом активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта.

[00189] Настоящее изобретение также предусматривает способ усиления связывания интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства (например, антитела или фрагмента антитела), описанного в данном документе, с обеспечением таким образом усиления связывания интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта.

[00190] Используемый в данном документе термин «нуждающийся в чем-либо пациент» или «нуждающийся в чем-либо субъект» относится к пациенту или субъекту, подверженному риску развития заболевания, нарушения или состояния, которые поддаются лечению или облегчению с помощью агониста гетеродимера интегрина, содержащего белок β1, или композиции, содержащей такой агонист, предусмотренных в данном документе, или страдающему от таковых. Нуждающийся в чем-либо пациент или субъект может, например, представлять собой пациента или субъекта, у которого диагностировано заболевание, ассоциированное с нарушением функции интегрина α7β1, такое как заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани. У субъекта может иметься мутация или нарушение функции в одном из белков в комплексе ламинин/дистрогликан/саркогликан/дистрофин. В других вариантах осуществления у субъекта может иметься мутация или нарушение функции ламинина-α2 (мерозина). «Субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо.

[00191] В определенных вариантах осуществления субъект может представлять собой человека, примата, отличного от человека, свинью, лошадь, корову, собаку, кошку, мышь или крысу.

[00192] Используемый в данном документе термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству фармацевтического средства, например антитела, которое является достаточным для уменьшения или облегчения тяжести и/или продолжительности нарушения, например мышечной дистрофии или одного или более ее симптомов, предотвращения прогрессирования заболевания, обеспечения регресса заболевания, предотвращения рецидива, развития, появления или прогрессирования одного или более симптомов, ассоциированных с нарушением, выявления нарушения или усиления или улучшения профилактического или терапевтического эффекта(эффектов) другого вида терапии (например, профилактического или терапевтического средства). Эффективное количество антитела может, например, обеспечивать усиление регенерации, поддержания или восстановления мышц и/или в некоторой степени облегчение одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием, сопровождающимся истощением мышечной ткани.

[00193] В некоторых аспектах нуждающийся в этом субъект может подвергаться лечению фармацевтическим средством, описанным в данном документе, и дополнительным фармацевтическим средством, которое имеет другой механизм действия (например, заключающийся в исправлении генов, усилении регенерации мышц или уменьшении воспаления и фиброза), которое используется для лечения заболевания, сопровождающегося истощением мышечной ткани.

[00194] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение фармацевтического средства (например, антитела или фрагмента антитела), описанного в данном документе, в изготовлении лекарственного препарата для лечения нарушения или заболевания, характеризующихся нарушением функции интегрина α7β1 у субъекта. Настоящее изобретение также предусматривает применение фармацевтического средства (например, антитела или фрагмента антитела), описанного в данном документе, для лечения нарушения или заболевания, характеризующихся нарушением функции интегрина α7β1 у субъекта.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

[00195] Фармацевтические средства по настоящему изобретению (также называемые в данном документе «активными соединениями») и их производные, фрагменты, аналоги и гомологи могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения. Такие композиции обычно содержат антитело и фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтическое средство, который является агонистом интегрина α7β1. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре различных фармацевтических средства, которые являются агонистами по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1. Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые обычно не вызывают аллергических или других серьезных нежелательных реакций при введении с помощью путей, хорошо известных в данной области техники. Молекулярные объекты и композиции, одобренные регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленные в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, в частности, у людей, считаются «фармацевтически приемлемыми». Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» предназначен для включения всех без исключения растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых средств, изотонических средств и замедляющих абсорбцию средств и т.п., совместимых с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в самом последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, стандартном справочном тексте в данной области техники, который включен в данный документ посредством ссылки. Некоторые примеры таких носителей или разбавителей включают без ограничения воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% сывороточный альбумин человека. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какие-либо общепринятые среды или средства несовместимы с активным соединением, предполагается их использование в композициях. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.

[00196] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена таким образом, чтобы быть совместимой с ее предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают парентеральное, например внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное (например, ингаляция), чрескожное (т.е. местное), чресслизистое и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут предусматривать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекции, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфат натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно регулировать с помощью кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроксид натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика.

[00197] Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (при растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL® (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси) или фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко ввести шприцем. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством использования покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительным включать в композицию изотонические средства, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена посредством включения в композицию средства, замедляющего абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

[00198] Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией посредством фильтрации. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекции способами получения являются сушка в вакууме и лиофильная сушка, которые дают на выходе порошок из активного ингредиента и любого дополнительного требуемого ингредиента из его раствора, предварительно подвергнутого стерилизующей фильтрации.

[00199] Композиции для перорального применения обычно включают инертный разбавитель или пищевой носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для обеспечения перорального введения терапевтического средства активное соединение может быть объединено со вспомогательными веществами и использовано в форме таблеток, пастилок или капсул. Композиции для перорального применения также могут быть получены с использованием жидкого носителя для использования в качестве ополаскивателя для рта, где соединение в жидком носителе применяется перорально и им осуществляется полоскание и оно выплевывается или проглатывается. Фармацевтически совместимые связывающие средства и/или вспомогательные материалы могут быть включены в качестве части композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединения сходной природы: связывающее средство, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, средство для улучшения распадаемости, такое как альгиновая кислота, Primojel® или кукурузный крахмал; смазывающее средство, такое как стеарат магния; средство, способствующее скольжению, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.

[00200] Для введения путем ингаляции соединения могут доставляться в форме спрея-аэрозоля из контейнера под давлением или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например газ, такой как диоксид углерода, или небулайзера.

[00201] Системное введение также может осуществляться чресслизистыми или чрескожными способами. Для чресслизистого или чрескожного введения в составе используются пенетранты, соответствующие барьеру, проникновение через который необходимо обеспечить. Такие пенетранты широко известны в данной области техники и включают, например, средства для чресслизистого введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Чресслизистое введение можно осуществлять посредством применения назальных спреев или суппозиториев. Для чрескожного введения активные соединения составляют в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, как широко известно в данной области техники.

[00202] Фармацевтические средства также могут быть получены в форме суппозиториев (например, с общепринятыми основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректального введения.

[00203] В одном варианте осуществления активные соединения получают с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого выведения из организма, такими как в случае состава с контролируемым высвобождением, в том числе имплантатов и микроинкапсулированных систем доставки. Можно использовать биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов будут очевидны специалистам в данной области техники. Материалы также можно приобрести на рынке. Липосомальные суспензии (в том числе липосомы, нацеленные на инфицированные клетки посредством моноклональных антител к вирусным антигенам) также могут использоваться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, например как описано в патенте США №4522811.

[00204] Особенно выгодно составлять композиции для перорального или парентерального введения в виде единичной дозированной формы для обеспечения простоты введения и однородности дозировки. Единичная дозированная форма, используемая в данном документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для подлежащего лечению субъекта; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Технические характеристики единичных дозированных форм по настоящему изобретению диктуются и напрямую зависят от уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, а также от ограничений, присущих области составления таких активных соединений для лечения индивидов.

[00205] Фармацевтические композиции могут помещаться в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями по применению.

[00206] Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны толковаться как ограничивающие предмет настоящего изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в данном документе, включая без ограничения патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, настоящим прямо включены посредством ссылки во всей их полноте для любых целей. В случае, если один или более включенных документов или частей документов определяют термин, который противоречит определению этого термина в настоящей заявке, определение, которое присутствует в настоящей заявке, имеет преимущественную силу. Однако упоминание любой ссылки, статьи, публикации, патента, публикации патента и заявки на патент, цитируемых в данном, не является признанием или любой формой предположения того, что они представляют собой действительный предшествующий уровень техники или являются частью общедоступных знаний в любой стране мира, и не должно восприниматься как таковое.

[00207] В настоящем изобретении любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон отношений или диапазон целых чисел следует понимать как включающий значение любого целого числа в указанном диапазоне и, при необходимости, его доли (например, одну десятую и одну сотую доли целого числа), если не указано иное. Следует понимать, что используемые в данном документе формы единственного числа относятся к «одному или более» из перечисленных компонентов, если не указано иное. Использование альтернативы (например, «или») следует понимать как обозначение одной из, обеих альтернатив или любой их комбинации. Используемые в данном документе термины «включать» и «содержать» используются в качестве синонимов.

[00208] Настоящее изобретение будет дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем настоящего изобретения, описанный в формуле изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Агонист белка 31 обеспечивает компенсаторные эффекты в клетках с дефицитом дистрофина

[00209] Миобласты и мышечные трубочки здоровых пациентов-людей и пациентов-людей с дефицитом дистрофина обрабатывали посредством антитела-агониста β1 TS2/16 (J. Immunol, 1984, 132:3011). Анализы адгезии клеток использовали для оценки прикрепления клеток к ламинину посредством интегринов. Микропланшеты покрывали в течение ночи с помощью 10 мкг/мл мерозина при 4°С и блокировали с помощью 2% BSA/PBS на 30 мин. перед анализом. Клетки, представляющие собой миобласты или мышечные трубочки, отделяли и промывали в PBS. После этого клетки ресуспендировали в IMEM при концентрации 1,0 X 10⁶ клеток/мл и в планшет добавляли пятьдесят микролитров суспензии клеток и пятьдесят микролитров раствора антител. Планшеты инкубировали в течение одного часа при 37°С в 5% диоксиде углерода с увлажнением. Неприкрепившиеся клетки удаляли посредством центрифугирования вверх дном при 58 g в течение 5 мин. Прикрепившиеся клетки фиксировали и окрашивали с помощью 0,5% кристаллического фиолетового (в 20% метаноле и 1% формальдегиде), лунки промывали с помощью PBS. Кристаллический фиолетовый растворяли в 2% Triton-X в PBS. Относительное количество клеток в каждой лунке оценивали по поглощению при 595 нм в устройстве для считывания микропланшетов (Tecan).

[00210] Обработка посредством TS2/16 способствовала адгезии миобластов человека к мерозину (ламинину) как в нормальном контроле, так и в миобластах (ФИГ. 1) и мышечных трубочках (ФИГ. 2) с дефицитом дистрофина. Интегрин α7β1 активируется при дифференцировке в мышечные трубочки. Адгезия мышечной трубочки к мерозину может быть усилена посредством активации β1. Клетки, представляющие собой миобласты человека, экспрессируют несколько интегринов, специфических в отношении ламинина, на клеточной поверхности, как определено с помощью FACS (ФИГ. 3 и 4). Повышению адгезии клеток, опосредованному активацией β1, в основном способствовал интегрин α7β1 (ФИГ. 5), поскольку его не ингибировали функциональные блокирующие антитела к α3 и α6, но блокировало блокирующее антитело к α7.

[00211] Антитело-агонист β1 TS2/16 также усиливало адгезию мышечной трубочки к ламинину α7β1-зависимым образом в нормальных миобластах мыши, в которых осуществляли нокдаун экспрессии дистрофина с помощью siRNA. Клетки С2С12 (Nature, 1977, 270:725) представляют собой мышиные миобласты, экспрессирующие несколько интегринов, специфических в отношении ламинина. Клетки С2С12 экспрессируют на своей поверхности три рецептора ламинина (α3, α6 и α7β1) (J Cell Sci, 1996, 109: 3139). α7А активируется во время дифференцировки скелетных мышц. Уровни экспрессии α7 в клетках С2С12 увеличиваются во время дифференцировки мышц (Xiao et al. (2003) J. Biol. Chem., 278:49780-49788). Обеспечивали дифференцировку клеток C2C12 в мышечные трубочки (ФИГ. 6). Осуществляли нокдаун экспрессии дистрофина в мышечных трубочках с использованием siRNA (ФИГ. 7; Ghahramani Seno et al. (2008) Human Molecular Genetics, 17:2622-2632). TS2/16 обеспечивал усиление адгезии клеток, представляющей собой мышечную трубочку мыши, к ламинину в мышечных трубочках мыши, обработанных контрольной siRNA и siRNA, специфической в отношении дистрофина (ФИГ. 8А). Усиленная посредством TS2/16 адгезия клетки, представляющей собой мышечную трубочку мыши, к ламинину в основном была обусловлена интегрином α7β1 (ФИГ. 8В).

Пример 2. Получение антител-агонистов α7β1

[00212] Моноклональные антитела получали путем иммунизации мышей с помощью эктодомена белка, представляющего собой интегрин α7β1 человека. Общая схема процесса показана на ФИГ. 9. Гибридомы получали посредством стандартных методик. Из общего количества 9000 клонов 110 клонов были отобраны в качестве средств, связывающих интегрин α7β1. Многочисленные антитела-антагонисты (блокирующие) и четыре антитела-агониста (активирующие) были выявлены в функциональных биохимических и клеточных анализах. Эти антитела характеризовали либо как активирующие, либо как блокирующие в твердофазном анализе связывания и анализе адгезии клеток. Активирующие антитела обозначены как М10, М25, М36 и М38. На ФИГ. 10А показан пример результатов твердофазного анализа связывания, и на ФИГ. 10В показан пример результатов анализа адгезии клеток, проведенного с двумя активирующими антителами (М10, М25) и одним блокирующим антителом (М20). Активирующие антитела дополнительно характеризовали (например, с помощью ELISA или проточной цитометрии), чтобы определить, происходит ли активация посредством белка α7 или белка β1. Было обнаружено, что М10 и М25 связывают белок β1, поскольку два антитела стимулировали связывание не только с интегрином α7β1, но также с интегрином α6β1 и с интегрином αvβ1 (ФИГ. 10С).

[00213] Обнаружили, что антитела М36 и М38 связываются с клеточными поверхностями, экспрессирующими α7β1 (как человеческий (K562/α7Х2), так и мышиный (С2С12) интегрины). См. ФИГ. 11А. Связывание М36 и М38 с интегрином α7β1 человека и мыши было дозозависимым и не опосредовалось субъединицей β1 гетеродимера, поскольку М36 и М38 не связывались с интегрином α6β1 или α5β1 (ФИГ. 11В).

[00214] Белок-интегрин α7 может иметь две разные внеклеточные последовательности (обозначенные «X1» и «Х2») благодаря посттранскрипционной модификации. Последовательность вариабельной области (X1 или Х2) расположена между гомологичными повторяющимися доменами III и IV вблизи предполагаемого сайтом связывания лиганда (ФИГ. 12А). В последовательности вариабельной области Х2 содержится 40 аминокислот.Антитела М36 и М38 предпочтительно связываются с клеточными поверхностями, экспрессирующими форму α7β1 Х2 (ФИГ. 12В), которая предпочтительно экспрессируется в зрелых клетках скелетных мышц. Из-за специфичности связывания с изоформой α7Х2, а не изоформой α7Х1, сделан вывод, что М36 и М38 специфически связывают субъединицу а7Х2 гетеродимерного интегрина α7β1 (ФИГ. 12В).

[00215] Обнаружили, что антитела М36 и М38 обеспечивают усиление опосредованной интегрином α7β1 адгезии клеток K562/α7x2β1 к ламинину (LN211). Антитела М36 и М38 обеспечивали усиление адгезии клеток с интегрином α7β1 к ламинину 211 человека (ЕС50: 1,09 нМ и 1,27 нМ). См. ФИГ. 13А. Контрольное антитело М35 характеризовалось отсутствием эффекта. Антитела М36 и М38 обеспечивали усиление адгезии мышечной трубочки мыши с нокдауном дистрофина к ламинину. См. ФИГ. 13В. Этот эффект можно было обратить с помощью антитела, блокирующего α7.

[00216] Обнаружили, что антитела М36 и М38 активируют интегрин α7β1 посредством конформационного изменения. Моноклональное антитело 9EG7 селективно связывается с активированными интегринами β1 (Bazzoni et al., J Biol Chem. 1995; 270(43):25570-7). Mn2+опосредует активацию интегрина β1, и это можно выявить с помощью 9EG7 (белый столбик, ФИГ. 14). Как показано на ФИГ. 14, антитела М36 и М38 усиливают связывание 9EG7 (темно- и светло-серые столбики) по сравнению с контрольным (нефункциональным) антителом α7 (белый столбик), что указывает на изменение интегрина α7β1 в более активную конформацию.

[00217] Вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител М36 и М38 секвенировали, и обнаружили, что они идентичны. Эти последовательности представлены в таблице 2.

Пример 3. Получение и определение характеристик гуманизированных антител-агонистов α7β1

[00218] Последовательность антитела М36/М38 впоследствии гуманизировали. Последовательность антитела анализировали в отношении ее трехмерной структуры и ее строили путем гомологичного моделирования. Идентифицировали ключевые положения, обеспечивающие структуру петли CDR и интерфейс VH-VL. Было разработано множество гуманизированных вариантов как для тяжелых, так и для легких цепей. «Человечность» гуманизированных вариантов оценивали по шкале «человечности» Т20, описанной в Gao et al., (2013) ВМС Biotechnology, 13:55. Гуманизированные антитела, а также их химерные версии (вариабельные области грызунов, константные области человека) экспрессировали в масштабе 10 мл в клетках СНО (способ TunaCHO™) и очищали. Аффинность связывания каждого полученного антитела тестировали с помощью проточной цитометрии и ELISA.

[00219] Было выделено гуманизированное антитело, обозначенное как «VL3VHK20TFT». Аминокислотные и нуклеотидные последовательности различных областей VL3VHK20TFT представлены в таблице 3. VL3VHK20TFT принадлежит к изотипу IgG4 и подклассу S228P. Изотипом легкой цепи VL3VHK20TFT является каппа человека.

[00220] Условия связывания и скрининга моноклональных антител и Fab-фрагментов с использованием высокопроизводительной проточной цитометрии оптимизировали с использованием белка-мишени дикого типа, клонированного в запатентованный вектор и экспрессированного в клетках HEK-293Т. Белок-мишень представляет собой интегрин альфа-7 человека (ITGA7; UniProt ID Q13683; SEQ ID NO: 24). Связывание моноклонального антитела VL3VHK20TFT и Fab VL3VHK20TFT с клетками HEK-293Т, котрансфицированными (1:1) предшественником интегрина бета-1 (ITGB1) и субъединицей альфа 7 интегрина (ITGA7) или только вектором (отрицательный контроль), оценивали с помощью высокопроизводительной проточной цитометрии. Антитела 3С12, 6А11, A1-1a М20 и A1-1a М24 использовали в качестве положительных контролей для связывания ITGA7. Эти антитела и параметры высокопроизводительной проточной цитометрии представлены в таблице 4.

[00221] Параметры, использованные для высокопроизводительной проточной цитометрии с Fab VL3VHK20TFT, представлены в таблице 5.

[00222] Как показано на ФИГ. 15 и ФИГ. 16, mAb VL3VHK20TFT (ФИГ. 15) и Fab VL3VHK20TFT (ФИГ. 16) селективно связываются с клетками, содержащими белок-мишень ITGA7, и не связываются с клетками, которые не содержат мишень (вектор). Каждая точка на ФИГ. 15 и ФИГ. 16 представляет собой среднее значение из четырех повторностей. Оптимальную концентрацию для скрининга для каждого антитела или Fab (обведено рамкой) определяли на основе необработанных значений сигнала и расчетов отношения сигнала к фону.

[00223] Для картирования эпитопа VL3VHK20TFT конструировали библиотеку белка-мишени, предназначенную для аланинового сканирования (ITGA7; SEQ ID NO: 24). Картирование эпитопа методом шотган-мутагенеза выполняли с использованием общей процедуры, описанной в Davidson and Doranz, 2014, Immunology 143, 13-20. Вкратце, библиотека мутаций белка-мишени была создана с помощью высокопроизводительного сайт-направленного мутагенеза. Для каждого остатка отдельно осуществляли мутацию, обеспечивающую его замену на аланин, при этом для кодонов аланина осуществляли мутацию, обеспечивающую его замену на серии. Библиотеку мутантных вариантов помещали в 384-луночные микропланшеты и временно трансфицировали в клетки HEK-293Т. После трансфекции клетки инкубировали с указанными антителами (Fab VL3VHK20TFT или моноклональным антителом (mAb) 6А11) в концентрациях, предварительно определенных с использованием независимой кривой иммунофлуоресцентного титрования белка дикого типа. Антитела выявляли с помощью вторичного антитела, конъюгированного с Alexa Fluor 488, а среднее значение клеточной флуоресценции определяли с помощью платформы проточной цитометрии Intellicyt® iQue. Затронутые мутацией остатки определяли как критически важные для эпитопа Fab VL3VHK20TFT, если они не способствовали реактивности Fab VL3VHK20TFT, но способствовали реактивности эталонного mAb 6А11. Эта стратегия встречного скрининга обеспечивает исключение мутантных вариантов, которые характеризуются локальным неправильным сворачиванием или дефектом экспрессии.

[00224] Иногда при скрининге библиотеки MAb с очень высокой аффинностью не удается определить остатки, критические для связывания антител. Превращение высокоаффинного MAb в Fab обычно ослабляет связывание в достаточной степени, чтобы обеспечить возможность определения остатков, критических для связывания. В тех случаях, когда скрининг Fab в стандартных условиях все еще недостаточен для определения остатков, критических для связывания, применяются условия высокой жесткости. Эти условия включают комбинации повышенного рН, повышенного содержания соли, повышенной температуры и/или увеличенного времени промывки. Антитела, для которых требовались условия высокой жесткости, обозначены как «HS».

[00225] Связывание Fab VL3VHK20TFT и mAb 6А11 с каждым мутантным клоном в библиотеке мутантных вариантов ITGA7, предназначенной для аланинового сканирования, определяли в двух повторностях с помощью высокопроизводительной проточной цитометрии. Для каждой точки значение фоновой флуоресценции вычиталось из необработанных данных, которые затем нормализовали по реактивности антител (Ab) в отношении белка-мишени дикого типа (WT). Для каждого мутантного клона на график наносили среднее значение связывания в зависимости от экспрессии (представленной реактивностью с контролем). Для идентификации предварительных первичных критических клонов (красные круги) применяли пороговые значения (пунктирные линии), соответствующие >70% связывания WT с контрольным Ab и <20% связывания WT с тестируемыми Ab. Вторичные клоны (синие круги) выделены для клонов, которые не соответствуют установленным пороговым значениям, но чья сниженная связывающая активность и близость к критическим остаткам указывают на то, что затронутый мутацией остаток может быть частью эпитопа антитела. На ФИГ. 17 показан график, содержащий первичные критические клоны и вторичные клоны.

[00226] Остатки, критические для связывания антител, перечислены в таблице 6. Средние значения реактивности связывания (и диапазоны) указаны для всех идентифицированных критических остатков. Критические остатки для связывания Ab (S977, W978, W979, Р980) представляли собой остатки, мутации которых были отрицательными в отношении связывания с тестируемыми Ab, но положительными в отношении связывания с контрольным антителом. Определяли дополнительные вторичные остатки (R958, М976), которые не соответствовали рекомендациям по пороговым значениям, но чья сниженная связывающая активность и близость к критическим остаткам позволяли предположить, что они могут быть частью эпитопа антитела.

[00227] Критические остатки (красные сферы) визуализировали на модели кристаллической структуры белка-мишени, основанной на структуре интегрина альфа(х)бета(2) (PDB ID# 3К71 в Xie et al., 2010, et al. J. 29, 666-679), как показано на ФИГ. 18. Также показаны вторичные остатки (синие сферы), которые могут способствовать связыванию. Один остаток (R958) отсутствует на модели. Критические остатки, мутация которых приводила к наименьшей реактивности в отношении Fab VL3VHK20TFT, подчеркнуты в таблице 6. Подтвержденные критические остатки представляют собой аминокислоты, боковые цепи которых вносят наибольший энергетический вклад во взаимодействие антитело-эпитоп (Bogan and Thorn, 1998, J. Mol. Biol. 280, 1-9; Lo Conte et al., 1999, J. Mol. Biol. 285, 2177-2198.); следовательно, выделенные остатки (S977, W978, W979, P980), вероятно, вносят основной энергетический вклад в связывание.

Пример 4. Оценка антител мыши и гуманизированных антител к интегрину α7β1

[00228] Оценивали связывание антител с интегрином α7β1 человека и мыши. Обнаружили, что VLVH антитела α7β1 мыши (химера с Fc IgG4 человека, также обозначаемым как hIgG4-23 в таблице 10) и гуманизированное антитело к α7β1 VL3VHK20TFT перекрестно реагируют с интегрином α7β1 человека и мыши. Сравнение измеренных значений аффинности, приведенных в таблице 8, показывает, что гуманизированное антитело VL3VHK20TFT характеризовалось более низким значением KD в отношении связывания как с человеческим, так и с мышиным интегрином α7β1. Гуманизированное антитело характеризовалось приблизительно в 3,33 раза более низким значением KD в отношении связывания с интегрином α7β1 человека и приблизительно в 11,1 раза более низким значением KD в отношении связывания с интегрином α7β1 мыши. Эти данные показывают общее существенное улучшение аффинности гуманизированного антитела VL3VHK20TFT по сравнению с химерным антителом с Fab-областью мышиной гибридомы. На ФИГ. 19 представлен график, демонстрирующий результаты при различных концентрациях для VL3VHK20TFT; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 человека; связывание 1:1. На ФИГ. 20 представлен график, демонстрирующий результаты при различных концентрациях для VLVH; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 человека; связывание 1:1.

На ФИГ. 21А представлен график, демонстрирующий результаты при различных концентрациях для VL3VHK20 TFT; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 мыши; связывание 1:1. На ФИГ. 21А представлен график, демонстрирующий результаты при различных концентрациях для VLVH; 0,25 мкг/мл интегрина α7β1 мыши; связывание 1:1.

[00229] Связывание антител с интегрином α7β1 клеточной поверхности оценивали с помощью проточной цитометрии. Клетки K562, экспрессирующие интегрин α7β1 человека, использовали для связывания антитела VL3VHK20TFT. На ФИГ. 22А представлен график, демонстрирующий связывание антитела с клеточной поверхностью при различных концентрациях. Было обнаружено, что антитело VL3VHK20TFT обеспечивает усиление опосредованной α7β1 человека (ФИГ. 22В) и α7β1 мыши (ФИГ. 22С) адгезии к ламинину.

Пример 5. Антитело-агонист α7β1 усиливало адгезию DMD-клеток, представляющих собой миобласты, к ламинину

[00230] Способ. Мониторинг в реальном времени повторного прикрепления клеток суспензии измеряли с помощью анализа электрического импеданса с помощью устройства для определения клеток в реальном времени xCELLigence RTCA SP. DMD-клетки, представляющие собой миобласты, высевали на Е-планшеты, покрытые ламинином 211. Клетки обрабатывали антителами соответственно. Скорость прикрепления выражали в виде клеточного индекса, при этом значения выражали в виде клеточного индекса ±SD для трех лунок.

[00231] Результаты. На ФИГ. 23 представлен график, демонстрирующий концентрацию антител в мкг/мл в зависимости от клеточного индекса (опосредованная интегрином α7β1 адгезия клеток) как для усиленной антителом мыши (VLVH), так и для усиленной гуманизированным антителом (VL3VHK20TFT) адгезии клеток, представляющих собой миобласты, к ламинину. Гуманизированное антитело было приблизительно в 5 раз более эффективным, чем антитело мыши.

Пример 6. Антитело-агонист α7β1 защищает икроножную мышцу от повреждения

[00232] Способ. Формировали четыре тестовые группы мышей: DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG, mdx/антитело-агонист в дозе 3 мг/кг и mdx/антитело-агонист в дозе 15 мг/кг. Мышечную производительность измеряли in vivo с помощью системы мышечных рычагов 305С. Колено изолировали с помощью штифта, прижатого к головке большеберцовой кости, а стопу прочно фиксировали к подножке на валу двигателя. Для группы мышц подошвенного сгибателя сокращения вызывали посредством чрескожной электрической стимуляции седалищного нерва. Серию из 20 тетанических стимуляций (80 Гц, импульс 0,2 мс, продолжительность 500 мс) проводили с частотой 0,1 Гц. Стопу поворачивали против направления сокращения на 10° в течение 250 мс, что приводило к эксцентрическому сокращению.

[00233] Результаты. На ФИГ. 24 представлен график, демонстрирующий сокращение в зависимости от силы (нормализовано по исходному сокращению) для групп DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG, mdx/антитело-агонист в дозе 3 мг/кг и mdx/антитело-агонист в дозе 15 мг/кг. Сила у мышей mdx уменьшилась намного больше, чем у здоровых контрольных мышей (DBAS). Обработка антителом-агонистом интегрина α7β1 защищала от эксцентрического повреждения при обеих дозах (3 мг/кг и 15 мг/кг).

Пример 7. Антитело-агонист α7β1 обеспечивало улучшение в отношении функции диафрагмы

[00234] Способ. С использованием четырех групп мышей из примера 6 измеряли мышечную производительность in vitro с помощью системы мышечных рычагов 305С (Aurora Scientific Inc., Aurora, CAN), оснащенной горизонтальной перфузионной ванной. Всю диафрагму помещали в горизонтальную ванну системы мышечных рычагов 305С и перфузировали физиологическим буфером, оксигенированным посредством 95% О₂/5% СО₂, и выдерживали при 37°С. Серию стимуляций электрическим полем с частотой 1 Гц и 100 Гц (импульс 0,2 мс, продолжительность 100 мс) с частотой 0,01 Гц проводили посредством платиновых электродов, расположенных по бокам мышцы, чтобы убедиться, что швы натянуты и максимальное развиваемое усилие стабильно.

[00235] Результаты. На ФИГ. 25 представлен график, демонстрирующий частоту стимуляции в Гц в зависимости от силы (нормализовано по ширине мышцы, мН/мм) для групп DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG, mdx/антитело-агонист в дозе 3 мг/кг и mdx/антитело-агонист в дозе 15 мг/кг.Сила у мышей mdx уменьшилась намного больше, чем у здоровых контрольных мышей (DBAS). Обработка антителом-агонистом интегрина α7β1 обеспечивала защиту от эксцентрического повреждения при обеих дозах (3 мг/кг и 15 мг/кг).

Пример 8. Обработка антителом-агонистом α7β1 обеспечивает улучшение в отношении биомаркеров

[00236] Способ. Значения различных биомаркеров, ассоциированные с мышечным дистрофическим повреждением, измеряли у мышей, и обнаружили, что они улучшаются при обработке.

[00237] На ФИГ. 26 представлена гистограмма, демонстрирующая количество креатинкиназы в сыворотке крови, биомаркера повреждения мышц, в группах DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG и при обработке антителом-агонистом М36. Обработка антителом-агонистом М36 обеспечивала значительное снижение уровня креатинкиназы в сыворотке крови по сравнению с таковым для группы mdx/контроль IgG.

[00238] На ФИГ. 27 представлена гистограмма, демонстрирующая количество скелетного тропонина, биомаркера повреждения мышц, в группах DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG и при обработке антителом-агонистом М36. Обработка антителом-агонистом М36 обеспечивала значительное снижение уровня скелетного тропонина в сыворотке крови по сравнению с таковым для контроля mdx/IgG.

[00239] На ФИГ. 28 представлена гистограмма, демонстрирующая количество О-гидроксипролина, показателя образования коллагена/фиброза в икроножной мышце, в группах DBA2/контроль IgG, mdx/контроль IgG и при обработке антителом-агонистом М36. Обработка антителом-агонистом М36 обеспечивала существенное снижение образования коллагена/фиброза, определяемое по уровню О-гидроксипролина, по сравнению с таковым для группы mdx/контроль IgG.

Пример 9. Улучшенные свойства модифицированных антител-агонистов α7β1

[00240] Аминокислотные замены, как показано на ФИГ. 29, были получены путем сайт-направленного мутагенеза последовательностей антитела VL3VHK20TFT (исходные последовательности представлены в таблице 3) и оценивали в отношении способности снижать степень полиспецифичности антител. Как показано далее в данном документе, обнаружили, что некоторые из вариантов, которые содержат hIgG-38 в вариабельной области тяжелой цепи и hIgG-44, 45 и 46 в вариабельной области легкой цепи, сохраняют активность связывания интегрина α7β1 (ФИГ. 30). Подход на основе ELISA, в котором используются мембранные белки, представленные на поверхности бакуловирусной частицы (BVP), в качестве реагента для захвата антител со склонностью к перекрестному взаимодействию. В качестве аналитического метода для исследования гидрофобности антител использовали хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC). Было показано, что hIgG-38, 44 и 45 обладают более благоприятными биофизическими свойствами, как показано в таблице 9. Последовательности этих антител представлены в таблице 11, таблице 12 и таблице 13.

Пример 10. Дополнительные антитела-агонисты α7β1

[00241] В таблице 10 показан ряд IgG-антител-агонистов α7β1, полученных из комбинаций тяжелых цепей и легких цепей, аминокислотные последовательности которых приведены после таблицы 10.

[00242] Последовательности тяжелой цепи VHK2, VHK4, VHK11, VHK12, VHK14, VHK20, VHK22, VHK33, VHK48 и VHK51 представляют собой гуманизированные последовательности тяжелой цепи, содержащие вариацию в последовательности HCDR3. Последовательности тяжелой цепи от VHK20TFT-А до VHK20TFT-F содержат вариации в последовательностях HCDR1 и HCDR2. Последовательности легкой цепи VL1-VL10 представляют собой гуманизированные последовательности каппа-цепи. Последовательности легкой цепи VL11, VL12 и VL13 содержат вариацию в последовательности LCDR1. Последовательности, названные «VH» и «VL», представляют собой химерные молекулы, содержащие вариабельные области IgG М36 мыши и константные области IgG4 человека.

Последовательности тяжелых цепей (подчеркнутые части в каждой последовательности представляют собой по порядку HCDR1, HCDR2 и HCDR3)

VHK33

VHK20

VHK22

VHK48

VHK14

VHK7

VHK51

VHK11

VHK2

VHK4

VHK12

VH

VH3

VHK20NFA

VHK20TFT-A

VHK20TFT-B

VHK20TFT-C

VHK20TFT-D

VHK20TFT-E

VHK20TFT-F

Дополнительные области, определяющие комплементарность, тяжелых цепей (HCDR)

HCDR1

HCDR3

Последовательности легких цепей (подчеркнутые части в каждой последовательности представляют собой по порядку LCDR1, LCDR2 и LCDR3)

VL1

VL2

VL3

VL4

VL5

VL

VL6

VL7

VL8

VL9

VL10

VL11

VL12

VL13

[00243] Каждый цитируемый в данном документе документ, включая публикации, патенты, заявки на патент и опубликованные патентные заявки, полностью включен в данный документ посредством ссылки.

[00244] Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно посредством иллюстрации и примера для целей ясности понимания, специалистам в данной области техники очевидно, что будут осуществлены определенные незначительные изменения и модификации. Описание и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРОНУМЕРОВАННЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[00245] Независимо от прилагаемой формулы изобретения, в описании изложены следующие пронумерованные варианты осуществления.

[00246] 1. Фармацевтическое средство, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1l и интегрина α3β1 и которое связывается с внеклеточным доменом по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3.

[00247] 2. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 1, где фармацевтическое средство связывается с по меньшей мере одним из следующего:

связывающий ламинин домен по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3;

домен CALF-1 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3 и

домен CALF-2 по меньшей мере одного из белка α7, белка α6 и белка α3.

[00248] 3. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 1, которое является агонистом интегрина α7β1 и которое специфически связывается с белком α7.

[00249] 4. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 1, при отрицательном условии, что фармацевтическое средство не обеспечивает увеличения количества белка α7 в мышечной клетке субъекта при введении фармацевтического средства субъекту.

[00250] 5. Фармацевтическое средство по любому из вариантов осуществления 1-4, где фармацевтическое средство представляет собой антитело.

[00251] 6. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 5, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

[00252] 7. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 5, где антитело представляет собой полиспецифическое антитело.

[00253] 8. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 7, где полиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело.

[00254] 9. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 5, где антитело является человеческим, гуманизированным или химерным.

[00255] 10. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 1, где фармацевтическое средство активирует по меньшей мере один из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1.

[00256] 11. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 1, где фармацевтическое средство обеспечивает стабилизацию активной конформации по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1.

[00257] 12. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 3, где фармацевтическое средство не связывается специфически с белком β1.

[00258] 13. Фармацевтическое средство по любому из вариантов осуществления 1-12, где фармацевтическое средство обеспечивает увеличение адгезии миобластов к мерозину.

[00259] 14. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 13, где миобласт представляет собой нормальный миобласт человека или нормальный миобласт мыши.

[00260] 15. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 13, где миобласт представляет собой миобласт человека или миобласт мыши, которые характеризуются по меньшей мере одним из следующего: дефицит дистрофина, наличие мутации в гене дистрофина или наличие нефункционирующего дистрофина.

[00261] 16. Фармацевтическое средство по любому из вариантов осуществления 1-12, где фармацевтическое средство обеспечивает увеличение адгезии мышечной трубочки к мерозину.

[00262] 17. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 16, где мышечная трубочка представляет собой нормальную мышечную трубочку человека или нормальную мышечную трубочку мыши.

[00263] 18. Фармацевтическое средство по варианту осуществления 16, где мышечная трубочка представляет собой мышечную трубочку человека или мышечную трубочку мыши, которые характеризуются по меньшей мере одним из следующего: дефицит дистрофина, наличие мутации в гене дистрофина или наличие нефункционирующего дистрофина.

[00264] 19. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, где эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего:

(i) аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 1;

(ii) 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 1; или

(iii) 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00265] 20. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, где эпитоп содержит SWWP (SEQ ID NO: 25).

[00266] 21. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00267] 22. Антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 20 или 21, где эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 5-10 или 10-15 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00268] 23. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остатки R958, М976, S977, W978, W979 и Р980 из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00269] 24. Антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 23, где эпитоп содержит следующее, состоит по существу из следующего или состоит из следующего: 6-10 или 10-15 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00270] 25. Антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 20-24, где эпитоп является непрерывным.

[00271] 26. Антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 20-24, где эпитоп является прерывистым.

[00272] 27. Антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 20-26, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, (i) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 15; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7;

(ii) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 66; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7; или

(iii) где HCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 68; и/или где LCDR3 предусматривает SEQ ID NO: 7.

[00273] 28. Антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 27, где HCDR2 предусматривает SEQ ID NO: 3; и/или где LCDR2 предусматривает SEQ ID NO: 6.

[00274] 29. Антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 27 или 28,

(i) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 5;

(ii) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 65; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 5;

(iii) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 69; или

(iv) где HCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 14; и/или где LCDR1 предусматривает SEQ ID NO: 71.

[00275] 30. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3;

где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3;

где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; или

где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3.

[00276] 31. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH),

где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3;

где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; или

где аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3.

[00277] 32. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где:

(i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3;

(ii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3;

(iii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3;

(iv) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3; или

(v) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7 или их варианты, содержащие 5 или менее консервативных аминокислотных замен в LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3.

[00278] 33. Антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 30, где аминокислотная последовательность VH-области предусматривает:

(i) SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8;

(ii) SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; или

(iii) SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67.

[00279] 34. Антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 31, где аминокислотная последовательность VL-области предусматривает:

(i) SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9;

(ii) SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17;

(iii) SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70; или

(iv) SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[00280] 35. Антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 32, где

(i) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%о, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9;

(ii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17;

(iii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17;

(iv) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70; или

(v) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72.

[00281] 36. Моноклональное антитело, которое является агонистом интегрина α7β1, или фрагмент этого антитела, где антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь,

(i) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 19;

(ii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 45, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 53;

(iii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 62; или

(iv) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 63.

[00282] 37. Антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 30-36, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с белком α7.

[00283] 38. Антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 30-37, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с эпитопом белка α7, причем эпитоп белка α7 содержит аминокислотную последовательность, по существу состоит из аминокислотной последовательности или состоит из аминокислотной последовательности, предусматривающей следующее:

(i) SEQ ID NO: 10;

(ii) 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 10; или

(iii) 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 или 35-40 аминокислот из последовательности под SEQ ID NO: 24.

[00284] 39. Фармацевтическое средство по любому из вариантов осуществления 1-18 или антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 19-38, где интегрин α7β1 представляет собой интегрин α7β1 человека.

[00285] 40. Антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 19-39, где фрагмент антитела представляет собой Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, однодоменное антитело, диатело или одноцепочечное антитело верблюдовых.

[00286] 41. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 30- 40.

[00287] 42. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 41.

[00288] 43. Вектор экспрессии по варианту осуществления 42, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

[00289] 44. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по варианту осуществления 42 или 43.

[00290] 45. Способ получения антитела или фрагмента антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии по варианту осуществления 42 или 43, в условиях, эффективных для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, с обеспечением продуцирования антитела или фрагмента антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1.

[00291] 46. Фармацевтическая композиция, содержащая:

фармацевтическое средство по любому из вариантов осуществления 1-18 или антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 19-40 и фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

[00292] 47. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 46, дополнительно содержащая дополнительное фармацевтическое средство, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α3β1 и интегрина α3β1.

[00293] 48. Способ лечения нарушения или заболевания у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства по любому из вариантов осуществления 1-19 или антитела или фрагмента антитела по любому из вариантов осуществления 19-40, с обеспечением таким образом лечения нарушения или заболевания у субъекта;

где нарушение или заболевание характеризуются одним или более из следующего:

нарушение функции интегрина α7β1 у субъекта;

дефицит дистрофина у субъекта;

наличие мутации в гене дистрофина у субъекта;

наличие нефункционирующего дистрофина у субъекта или

мышечная дисфункция, отличная от дисфункции, обусловленной нарушением функции α7β1 или дефицитом дистрофина, мутацией в гене дистрофина или отсутствием функции дистрофина.

[00294] 49. Способ по варианту осуществления 48, где мышечная дисфункция обусловлена одним или более из следующего или ассоциирована с одним или более из следующего: рак, застойная сердечная недостаточность, хроническая обструктивная болезнь легких, хроническое заболевание почек, ВИЧ-инфекция/СПИД, нервная анорексия, булимия, недостаточное питание, воздействие факторов, тошнота, диабет типа I, диабет типа II, метаболический синдром, кахексия, анемия, сердечная недостаточность, повышенное артериальное давление, рабдомиолиз, сепсис, саркопения, отсутствие физической активности, повреждения вследствие избыточной физической активности, гипотермия, гипертермия, травма, денервация, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, спинальная мышечная атрофия, алкогольная миопатия, ожоговая миопатия, инсульт, стероидная терапия или отмена стероидной терапии, дерматомиозит, синдром Гийена-Барре, невропатия, остеоартрит, инфекция, полиомиелит, полимиозит, воспаление, ревматоидный артрит, гипохолестеринемия, электротравма, тепловой удар, длительная иммобилизация, отсутствие притока крови к конечности или контакт с ядом.

[00295] 50. Способ по варианту осуществления 48, где заболевание представляет собой заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани.

[00296] 51. Способ по варианту осуществления 50, где заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани, представляет собой мышечную дистрофию.

[00297] 52. Способ по варианту осуществления 51, где мышечная дистрофия представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна (DMD), мышечную дистрофию Беккера, мерозин-дефицитную врожденную мышечную дистрофию типа 1А или поясно-конечностную мышечную дистрофию.

[00298] 53. Способ по варианту осуществления 49, дополнительно предусматривающий выявление субъекта с мышечной дисфункцией.

[00299] 54. Способ по варианту осуществления 50, дополнительно предусматривающий выявление субъекта с заболеванием, сопровождающимся истощением мышечной ткани.

[00300] 55. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где введение обеспечивает обращение, стабилизацию или замедление истощения мышечной ткани или мышечной дисфункции у субъекта.

[00301] 56. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где введение обеспечивает улучшение мышечной функции у субъекта.

[00302] 57. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где введение не обуславливает ухудшения мышечной функции у субъекта.

[00303] 58. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, дополнительно включающий измерение мышечной функции у субъекта после стадии введения, где скорость ухудшения мышечной функции снижается.

[00304] 59. Способ по любому из вариантов осуществления 50-52 и 54, где введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства является эффективным для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта, эффективного для лечения нарушения функции интегрина α7β1 у субъекта.

[00305] 60. Способ по любому из вариантов осуществления 50-52 и 54, где введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства является эффективным для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта, при этом повышенная активность и/или количество интегрина α7β1 у субъекта являются эффективными для по меньшей мере частичного смягчения эффекта по меньшей мере одного из дефицита дистрофина у субъекта, наличия мутации в гене дистрофина у субъекта или наличия нефункционирующего дистрофина у субъекта.

[00306] 61. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства является эффективным для обеспечения смягчения повреждения мышц у субъекта.

[00307] 62. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства является эффективным для обеспечения смягчения эксцентрического повреждения мышц у субъекта.

[00308] 63. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства является эффективным для улучшения мышечной функции диафрагмы у субъекта.

[00309] 64. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, дополнительно включающий введение субъекту одного или более других средств терапии, при этом одно или более других средств терапии направлены против мышечной дистрофии или истощения мышечной ткани.

[00310] 65. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где одно или более других средств терапии предусматривают одно или более из следующего: противосудорожное средство; иммунодепрессант; антибиотик; хинин; терапия для обеспечения контроля застойной сердечной недостаточности; генная заместительная терапия; терапия на основе пропуска экзона; терапия на основе подавления нонсенс-мутации; терапия с использованием сконструированной нуклеазы; клеточная терапия с использованием клеток-предшественников мышц или стволовых клеток; активация утрофина; противовоспалительная терапия; антифибротическая терапия; стероидная терапия; блокатор миостатина; инсулиноподобный фактор роста; ингибитор фосфодиэстеразы-5; ингибитор АСЕ; индукция ангиогенеза посредством доставки фактора роста эндотелия сосудов (VEGF); подавление рецептора-приманки VEGF типа 1 (VEGFR-1 или Flt-1); физиотерапия; трудотерапия; оперативное вмешательство; ортопедическое вмешательство; логопедическая терапия; респираторная терапия; кардиостимулятор и аппарат искусственного дыхания.

[00311] 66. Способ активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства по любому из вариантов осуществления 1-18 или антитела или фрагмента антитела по любому из вариантов осуществления 19-40 с обеспечением таким образом активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта.

[00312] 67. Способ усиления связывания интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта, при этом способ включает

введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического средства по любому из вариантов осуществления 1-18 или антитела или фрагмента антитела по любому из вариантов осуществления 19-40 с обеспечением таким образом усиления связывание интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта.

[00313] 68. Применение фармацевтического средства по любому из вариантов осуществления 1-18 или антитела или фрагмента антитела по любому из вариантов осуществления 19-40 в изготовлении лекарственного препарата для лечения нарушения или заболевания, характеризующихся нарушением функции интегрина α7β1 у субъекта.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Pliant Therapeutics, Inc.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ АКТИВАЦИИ ИНТЕГРИНОВ

<130> 76809-20056.00

<140> US 17/098,199

<141> 2020-11-13

<150> US 63/029,070

<151> 2020-05-22

<150> US 63/009,020

<151> 2020-04-13

<150> US 62/935,732

<151> 2019-11-15

<160> 87

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Thr Ala Arg Val Glu Leu Cys Ala Gln Gly Ser Ala Asp Leu Ala His

1 5 10 15

Leu Asp Asp Gly Pro Tyr Glu Ala Gly Gly Glu Lys Glu Gln Asp Pro

20 25 30

Arg Leu Ile Pro Val Pro Ala Asn Ser Tyr Phe Gly

35 40

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr Trp

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Val Arg Gly Asp Asp

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe

1 5 10

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Ala Ala Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

His Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Ile Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Leu Leu Phe Val Thr Asn Ile Asp Ser Ser Asp Pro Asp Gln Leu Val

1 5 10 15

Tyr Lys Thr Leu Asp Pro Ala Asp Arg Leu Pro Gly Pro Ala Gly Asp

20 25 30

Leu Ala Leu Asn Ser Tyr Leu Gly

35 40

<210> 11

<211> 446

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Phe Asn Leu Asp Val Met Gly Ala Leu Arg Lys Glu Gly Glu Pro Gly

1 5 10 15

Ser Leu Phe Gly Phe Ser Val Ala Leu His Arg Gln Leu Gln Pro Arg

20 25 30

Pro Gln Ser Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Gln Ala Leu Ala Leu Pro

35 40 45

Gly Gln Gln Ala Asn Arg Thr Gly Gly Leu Phe Ala Cys Pro Leu Ser

50 55 60

Leu Glu Glu Thr Asp Cys Tyr Arg Val Asp Ile Asp Gln Gly Ala Asp

65 70 75 80

Met Gln Lys Glu Ser Lys Glu Asn Gln Trp Leu Gly Val Ser Val Arg

85 90 95

Ser Gln Gly Pro Gly Gly Lys Ile Val Thr Cys Ala His Arg Tyr Glu

100 105 110

Ala Arg Gln Arg Val Asp Gln Ile Leu Glu Thr Arg Asp Met Ile Gly

115 120 125

Arg Cys Phe Val Leu Ser Gln Asp Leu Ala Ile Arg Asp Glu Leu Asp

130 135 140

Gly Gly Glu Trp Lys Phe Cys Glu Gly Arg Pro Gln Gly His Glu Gln

145 150 155 160

Phe Gly Phe Cys Gln Gln Gly Thr Ala Ala Ala Phe Ser Pro Asp Ser

165 170 175

His Tyr Leu Leu Phe Gly Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Trp Lys Gly Thr

180 185 190

Ala Arg Val Glu Leu Cys Ala Gln Gly Ser Ala Asp Leu Ala His Leu

195 200 205

Asp Asp Gly Pro Tyr Glu Ala Gly Gly Glu Lys Glu Gln Asp Pro Arg

210 215 220

Leu Ile Pro Val Pro Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Phe Ser Ile Asp Ser

225 230 235 240

Gly Lys Gly Leu Val Arg Ala Glu Glu Leu Ser Phe Val Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Arg Ala Asn His Lys Gly Ala Val Val Ile Leu Arg Lys Asp Ser

260 265 270

Ala Ser Arg Leu Val Pro Glu Val Met Leu Ser Gly Glu Arg Leu Thr

275 280 285

Ser Gly Phe Gly Tyr Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Asn Ser Asp Gly

290 295 300

Trp Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Pro Tyr Phe Phe Glu Arg Gln Glu

305 310 315 320

Glu Leu Gly Gly Ala Val Tyr Val Tyr Leu Asn Gln Gly Gly His Trp

325 330 335

Ala Gly Ile Ser Pro Leu Arg Leu Cys Gly Ser Pro Asp Ser Met Phe

340 345 350

Gly Ile Ser Leu Ala Val Leu Gly Asp Leu Asn Gln Asp Gly Phe Pro

355 360 365

Asp Ile Ala Val Gly Ala Pro Phe Asp Gly Asp Gly Lys Val Phe Ile

370 375 380

Tyr His Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Ala Lys Pro Ser Gln Val Leu

385 390 395 400

Glu Gly Glu Ala Val Gly Ile Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Leu Ser Gly

405 410 415

Ser Leu Asp Met Asp Gly Asn Gln Tyr Pro Asp Leu Leu Val Gly Ser

420 425 430

Leu Ala Asp Thr Ala Val Leu Phe Arg Ala Arg Pro Ile Leu

435 440 445

<210> 12

<211> 445

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Phe Asn Leu Asp Thr Arg Glu Asp Asn Val Ile Arg Lys Tyr Gly Asp

1 5 10 15

Pro Gly Ser Leu Phe Gly Phe Ser Leu Ala Met His Trp Gln Leu Gln

20 25 30

Pro Glu Asp Lys Arg Leu Leu Leu Val Gly Ala Pro Arg Ala Glu Ala

35 40 45

Leu Pro Leu Gln Arg Ala Asn Arg Thr Gly Gly Leu Tyr Ser Cys Asp

50 55 60

Ile Thr Ala Arg Gly Pro Cys Thr Arg Ile Glu Phe Asp Asn Asp Ala

65 70 75 80

Asp Pro Thr Ser Glu Ser Lys Glu Asp Gln Trp Met Gly Val Thr Val

85 90 95

Gln Ser Gln Gly Pro Gly Gly Lys Val Val Thr Cys Ala His Arg Tyr

100 105 110

Glu Lys Arg Gln His Val Asn Thr Lys Gln Glu Ser Arg Asp Ile Phe

115 120 125

Gly Arg Cys Tyr Val Leu Ser Gln Asn Leu Arg Ile Glu Asp Asp Met

130 135 140

Asp Gly Gly Asp Trp Ser Phe Cys Asp Gly Arg Leu Arg Gly His Glu

145 150 155 160

Lys Phe Gly Ser Cys Gln Gln Gly Val Ala Ala Thr Phe Thr Lys Asp

165 170 175

Phe His Tyr Ile Val Phe Gly Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Trp Lys Gly

180 185 190

Ile Val Arg Val Glu Gln Lys Asn Asn Thr Phe Phe Asp Met Asn Ile

195 200 205

Phe Glu Asp Gly Pro Tyr Glu Val Gly Gly Glu Thr Glu His Asp Glu

210 215 220

Ser Leu Val Pro Val Pro Ala Asn Ser Tyr Leu Gly Phe Ser Leu Asp

225 230 235 240

Ser Gly Lys Gly Ile Val Ser Lys Asp Glu Ile Thr Phe Val Ser Gly

245 250 255

Ala Pro Arg Ala Asn His Ser Gly Ala Val Val Leu Leu Lys Arg Asp

260 265 270

Met Lys Ser Ala His Leu Leu Pro Glu His Ile Phe Asp Gly Glu Gly

275 280 285

Leu Ala Ser Ser Phe Gly Tyr Asp Val Ala Val Val Asp Leu Asn Lys

290 295 300

Asp Gly Trp Gln Asp Ile Val Ile Gly Ala Pro Gln Tyr Phe Asp Arg

305 310 315 320

Asp Gly Glu Val Gly Gly Ala Val Tyr Val Tyr Met Asn Gln Gln Gly

325 330 335

Arg Trp Asn Asn Val Lys Pro Ile Arg Leu Asn Gly Thr Lys Asp Ser

340 345 350

Met Phe Gly Ile Thr Val Lys Asn Ile Gly Asp Ile Asn Gln Asp Gly

355 360 365

Tyr Pro Asp Ile Ala Val Gly Ala Pro Tyr Asp Asp Leu Gly Lys Val

370 375 380

Phe Ile Tyr His Gly Ser Ala Asn Gly Ile Asn Thr Lys Pro Thr Gln

385 390 395 400

Val Leu Lys Gly Ile Ser Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser Ile Ala Gly Asn

405 410 415

Met Asp Leu Asp Arg Asn Ser Tyr Pro Asp Val Ala Val Gly Ser Leu

420 425 430

Ser Asp Ser Val Thr Ile Phe Arg Ser Arg Pro Val Ile

435 440 445

<210> 13

<211> 434

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu Val Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro

1 5 10 15

Gly Ser Leu Phe Gly Tyr Ser Val Ala Leu His Arg Gln Thr Glu Arg

20 25 30

Gln Gln Arg Tyr Leu Leu Leu Ala Gly Ala Pro Arg Glu Leu Ala Val

35 40 45

Pro Asp Gly Tyr Thr Asn Arg Thr Gly Ala Val Tyr Leu Cys Pro Leu

50 55 60

Thr Ala His Lys Asp Asp Cys Glu Arg Met Asn Ile Thr Val Lys Asn

65 70 75 80

Asp Pro Gly His His Ile Ile Glu Asp Met Trp Leu Gly Val Thr Val

85 90 95

Ala Ser Gln Gly Pro Ala Gly Arg Val Leu Val Cys Ala His Arg Tyr

100 105 110

Thr Gln Val Leu Trp Ser Gly Ser Glu Asp Gln Arg Arg Met Val Gly

115 120 125

Lys Cys Tyr Val Arg Gly Asn Asp Leu Glu Leu Asp Ser Ser Asp Asp

130 135 140

Trp Gln Thr Tyr His Asn Glu Met Cys Asn Ser Asn Thr Asp Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Thr Gly Met Cys Gln Leu Gly Thr Ser Gly Gly Phe Thr Gln Asn

165 170 175

Thr Val Tyr Phe Gly Ala Pro Gly Ala Tyr Asn Trp Lys Gly Asn Ser

180 185 190

Tyr Met Ile Gln Arg Lys Glu Trp Asp Leu Ser Glu Tyr Ser Tyr Lys

195 200 205

Asp Pro Glu Asp Gln Gly Asn Leu Tyr Ile Gly Tyr Thr Met Gln Val

210 215 220

Gly Ser Phe Ile Leu His Pro Lys Asn Ile Thr Ile Val Thr Gly Ala

225 230 235 240

Pro Arg His Arg His Met Gly Ala Val Phe Leu Leu Ser Gln Glu Ala

245 250 255

Gly Gly Asp Leu Arg Arg Arg Gln Val Leu Glu Gly Ser Gln Val Gly

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Ser Ala Ile Ala Leu Ala Asp Leu Asn Asn Asp Gly

275 280 285

Trp Gln Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Tyr Tyr Phe Glu Arg Lys Glu

290 295 300

Glu Val Gly Gly Ala Ile Tyr Val Phe Met Asn Gln Ala Gly Thr Ser

305 310 315 320

Phe Pro Ala His Pro Ser Leu Leu Leu His Gly Pro Ser Gly Ser Ala

325 330 335

Phe Gly Leu Ser Val Ala Ser Ile Gly Asp Ile Asn Gln Asp Gly Phe

340 345 350

Gln Asp Ile Ala Val Gly Ala Pro Phe Glu Gly Leu Gly Lys Val Tyr

355 360 365

Ile Tyr His Ser Ser Ser Lys Gly Leu Leu Arg Gln Pro Gln Gln Val

370 375 380

Ile His Gly Glu Lys Leu Gly Leu Pro Gly Leu Ala Thr Phe Gly Tyr

385 390 395 400

Ser Leu Ser Gly Gln Met Asp Val Asp Glu Asn Phe Tyr Pro Asp Leu

405 410 415

Leu Val Gly Ser Leu Ser Asp His Ile Val Leu Leu Arg Ala Arg Pro

420 425 430

Val Ile

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1 гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 14

Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3 гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 15

Val Lys Asn Asp Asn

1 5

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 19

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 20

<211> 1389

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 20

atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60

ctgagctacg gccaggtgca gctggtgcag agcggtgcgg aagtgaagaa gcccggtgcc 120

agcgtgaagg tgagctgcaa ggccagcggc tacaccttca ccaagtactg gatcaactgg 180

gtgaggcagg cacccggcca aggcctggag tggatgggca tcatctaccc cggcagcagc 240

accagcaatt acaacgagaa gttcaagacc cgagtaacca tgaccgtgga cacctccacc 300

agcaccgcct acatggagct gagcagcctg aggagcgagg acaccgcagt gtactactgc 360

gtgaagaacg acaactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tcagctctgc tagcaccaag 420

ggccccagcg tgtttcctct cgctccctgc agccggagca catccgagag caccgctgct 480

ctgggctgtc tcgtgaagga ctacttccct gaacccgtca ccgtcagctg gaatagcggc 540

gccctgacat ccggcgtcca cacattcccc gctgtcctgc agagcagcgg cctgtacagc 600

ctgagctccg tggtcaccgt gcctagcagc agcctgggaa caaagaccta cacctgcaac 660

gtggaccata agccctccaa caccaaggtg gacaagcggg tggaatccaa gtatggaccc 720

ccctgtcctc cttgccctgc tcctgaattt ctcggaggcc cctccgtctt cctgtttccc 780

cccaagccca aggacaccct gatgatctcc cggacacccg aagtcacctg cgtcgtggtg 840

gatgtcagcc aggaagatcc cgaggtgcag ttcaactggt acgtggacgg agtggaggtg 900

cataacgcca aaaccaagcc cagggaagag cagttcaaca gcacctatcg ggtcgtgtcc 960

gtgctcaccg tcctgcatca ggattggctc aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc 1020

aacaagggcc tgccctcctc catcgagaag accatctcca aggctaaggg ccaacctcgg 1080

gagccccaag tgtataccct ccctcccagc caggaggaga tgaccaagaa tcaagtgagc 1140

ctgacctgcc tcgtgaaggg attttacccc tccgacatcg ctgtggaatg ggaaagcaat 1200

ggccaacctg agaacaacta caagaccaca ccccccgtgc tggactccga tggctccttc 1260

ttcctgtaca gcaggctgac cgtggacaaa tcccggtggc aagagggaaa cgtgttcagc 1320

tgctccgtga tgcacgaggc tctccacaac cactacaccc agaagagcct ctccctgagc 1380

ctcggctag 1389

<210> 21

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь гуманизированного антитела VL3VHK20TFT

<400> 21

atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtccgcta gcgtaggcga cagggtcacc 120

atcacctgta gggccagtga gagcgtggac aactacggca tcagctttat gaactggttc 180

cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatttacg ccgccagcga cctgggcagc 240

ggcgtgccca gtaggttcag cggctccggt agcggcaccg acttcaccct gactatcagc 300

tctctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgccacc agagcaagga ggtcccctat 360

accttcggcc aaggcaccaa gttggagatc aagcggaccg tggccgcccc cagcgtgttc 420

atcttccctc ccagcgacga gcagctgaag tctggcaccg ccagcgtggt gtgcctgctg 480

aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 540

ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta cagcctgagc 600

agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaggtg 660

acccaccagg gactgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgctaa 717

<210> 22

<211> 24

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> лидерная последовательность

<400> 22

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> лидерная последовательность

<400> 23

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 24

<211> 1181

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Met Ala Gly Ala Arg Ser Arg Asp Pro Trp Gly Ala Ser Gly Ile Cys

1 5 10 15

Tyr Leu Phe Gly Ser Leu Leu Val Glu Leu Leu Phe Ser Arg Ala Val

20 25 30

Ala Phe Asn Leu Asp Val Met Gly Ala Leu Arg Lys Glu Gly Glu Pro

35 40 45

Gly Ser Leu Phe Gly Phe Ser Val Ala Leu His Arg Gln Leu Gln Pro

50 55 60

Arg Pro Gln Ser Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Gln Ala Leu Ala Leu

65 70 75 80

Pro Gly Gln Gln Ala Asn Arg Thr Gly Gly Leu Phe Ala Cys Pro Leu

85 90 95

Ser Leu Glu Glu Thr Asp Cys Tyr Arg Val Asp Ile Asp Gln Gly Ala

100 105 110

Asp Met Gln Lys Glu Ser Lys Glu Asn Gln Trp Leu Gly Val Ser Val

115 120 125

Arg Ser Gln Gly Pro Gly Gly Lys Ile Val Thr Cys Ala His Arg Tyr

130 135 140

Glu Ala Arg Gln Arg Val Asp Gln Ile Leu Glu Thr Arg Asp Met Ile

145 150 155 160

Gly Arg Cys Phe Val Leu Ser Gln Asp Leu Ala Ile Arg Asp Glu Leu

165 170 175

Asp Gly Gly Glu Trp Lys Phe Cys Glu Gly Arg Pro Gln Gly His Glu

180 185 190

Gln Phe Gly Phe Cys Gln Gln Gly Thr Ala Ala Ala Phe Ser Pro Asp

195 200 205

Ser His Tyr Leu Leu Phe Gly Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Trp Lys Gly

210 215 220

Thr Ala Arg Val Glu Leu Cys Ala Gln Gly Ser Ala Asp Leu Ala His

225 230 235 240

Leu Asp Asp Gly Pro Tyr Glu Ala Gly Gly Glu Lys Glu Gln Asp Pro

245 250 255

Arg Leu Ile Pro Val Pro Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Leu Leu Phe Val

260 265 270

Thr Asn Ile Asp Ser Ser Asp Pro Asp Gln Leu Val Tyr Lys Thr Leu

275 280 285

Asp Pro Ala Asp Arg Leu Pro Gly Pro Ala Gly Asp Leu Ala Leu Asn

290 295 300

Ser Tyr Leu Gly Phe Ser Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Val Arg Ala

305 310 315 320

Glu Glu Leu Ser Phe Val Ala Gly Ala Pro Arg Ala Asn His Lys Gly

325 330 335

Ala Val Val Ile Leu Arg Lys Asp Ser Ala Ser Arg Leu Val Pro Glu

340 345 350

Val Met Leu Ser Gly Glu Arg Leu Thr Ser Gly Phe Gly Tyr Ser Leu

355 360 365

Ala Val Ala Asp Leu Asn Ser Asp Gly Trp Pro Asp Leu Ile Val Gly

370 375 380

Ala Pro Tyr Phe Phe Glu Arg Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Val Tyr

385 390 395 400

Val Tyr Leu Asn Gln Gly Gly His Trp Ala Gly Ile Ser Pro Leu Arg

405 410 415

Leu Cys Gly Ser Pro Asp Ser Met Phe Gly Ile Ser Leu Ala Val Leu

420 425 430

Gly Asp Leu Asn Gln Asp Gly Phe Pro Asp Ile Ala Val Gly Ala Pro

435 440 445

Phe Asp Gly Asp Gly Lys Val Phe Ile Tyr His Gly Ser Ser Leu Gly

450 455 460

Val Val Ala Lys Pro Ser Gln Val Leu Glu Gly Glu Ala Val Gly Ile

465 470 475 480

Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Leu Asp Met Asp Gly Asn

485 490 495

Gln Tyr Pro Asp Leu Leu Val Gly Ser Leu Ala Asp Thr Ala Val Leu

500 505 510

Phe Arg Ala Arg Pro Ile Leu His Val Ser His Glu Val Ser Ile Ala

515 520 525

Pro Arg Ser Ile Asp Leu Glu Gln Pro Asn Cys Ala Gly Gly His Ser

530 535 540

Val Cys Val Asp Leu Arg Val Cys Phe Ser Tyr Ile Ala Val Pro Ser

545 550 555 560

Ser Tyr Ser Pro Thr Val Ala Leu Asp Tyr Val Leu Asp Ala Asp Thr

565 570 575

Asp Arg Arg Leu Arg Gly Gln Val Pro Arg Val Thr Phe Leu Ser Arg

580 585 590

Asn Leu Glu Glu Pro Lys His Gln Ala Ser Gly Thr Val Trp Leu Lys

595 600 605

His Gln His Asp Arg Val Cys Gly Asp Ala Met Phe Gln Leu Gln Glu

610 615 620

Asn Val Lys Asp Lys Leu Arg Ala Ile Val Val Thr Leu Ser Tyr Ser

625 630 635 640

Leu Gln Thr Pro Arg Leu Arg Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Pro

645 650 655

Pro Val Ala Pro Ile Leu Asn Ala His Gln Pro Ser Thr Gln Arg Ala

660 665 670

Glu Ile His Phe Leu Lys Gln Gly Cys Gly Glu Asp Lys Ile Cys Gln

675 680 685

Ser Asn Leu Gln Leu Val Arg Ala Arg Phe Cys Thr Arg Val Ser Asp

690 695 700

Thr Glu Phe Gln Pro Leu Pro Met Asp Val Asp Gly Thr Thr Ala Leu

705 710 715 720

Phe Ala Leu Ser Gly Gln Pro Val Ile Gly Leu Glu Leu Met Val Thr

725 730 735

Asn Leu Pro Ser Asp Pro Ala Gln Pro Gln Ala Asp Gly Asp Asp Ala

740 745 750

His Glu Ala Gln Leu Leu Val Met Leu Pro Asp Ser Leu His Tyr Ser

755 760 765

Gly Val Arg Ala Leu Asp Pro Ala Glu Lys Pro Leu Cys Leu Ser Asn

770 775 780

Glu Asn Ala Ser His Val Glu Cys Glu Leu Gly Asn Pro Met Lys Arg

785 790 795 800

Gly Ala Gln Val Thr Phe Tyr Leu Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ile Ser

805 810 815

Ile Glu Thr Thr Glu Leu Glu Val Glu Leu Leu Leu Ala Thr Ile Ser

820 825 830

Glu Gln Glu Leu His Pro Val Ser Ala Arg Ala Arg Val Phe Ile Glu

835 840 845

Leu Pro Leu Ser Ile Ala Gly Met Ala Ile Pro Gln Gln Leu Phe Phe

850 855 860

Ser Gly Val Val Arg Gly Glu Arg Ala Met Gln Ser Glu Arg Asp Val

865 870 875 880

Gly Ser Lys Val Lys Tyr Glu Val Thr Val Ser Asn Gln Gly Gln Ser

885 890 895

Leu Arg Thr Leu Gly Ser Ala Phe Leu Asn Ile Met Trp Pro His Glu

900 905 910

Ile Ala Asn Gly Lys Trp Leu Leu Tyr Pro Met Gln Val Glu Leu Glu

915 920 925

Gly Gly Gln Gly Pro Gly Gln Lys Gly Leu Cys Ser Pro Arg Pro Asn

930 935 940

Ile Leu His Leu Asp Val Asp Ser Arg Asp Arg Arg Arg Arg Glu Leu

945 950 955 960

Glu Pro Pro Glu Gln Gln Glu Pro Gly Glu Arg Gln Glu Pro Ser Met

965 970 975

Ser Trp Trp Pro Val Ser Ser Ala Glu Lys Lys Lys Asn Ile Thr Leu

980 985 990

Asp Cys Ala Arg Gly Thr Ala Asn Cys Val Val Phe Ser Cys Pro Leu

995 1000 1005

Tyr Ser Phe Asp Arg Ala Ala Val Leu His Val Trp Gly Arg Leu

1010 1015 1020

Trp Asn Ser Thr Phe Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Val Lys Ser Leu

1025 1030 1035

Glu Val Ile Val Arg Ala Asn Ile Thr Val Lys Ser Ser Ile Lys

1040 1045 1050

Asn Leu Met Leu Arg Asp Ala Ser Thr Val Ile Pro Val Met Val

1055 1060 1065

Tyr Leu Asp Pro Met Ala Val Val Ala Glu Gly Val Pro Trp Trp

1070 1075 1080

Val Ile Leu Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Val Leu Ala Leu

1085 1090 1095

Leu Val Leu Leu Leu Trp Lys Met Gly Phe Phe Lys Arg Ala Lys

1100 1105 1110

His Pro Glu Ala Thr Val Pro Gln Tyr His Ala Val Lys Ile Pro

1115 1120 1125

Arg Glu Asp Arg Gln Gln Phe Lys Glu Glu Lys Thr Gly Thr Ile

1130 1135 1140

Leu Arg Asn Asn Trp Gly Ser Pro Arg Arg Glu Gly Pro Asp Ala

1145 1150 1155

His Pro Ile Leu Ala Ala Asp Gly His Pro Glu Leu Gly Pro Asp

1160 1165 1170

Gly His Pro Gly Pro Gly Thr Ala

1175 1180

<210> 25

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Ser Trp Trp Pro

1

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VK CDR1

<400> 26

Tyr Gly Ile Ser Phe

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH CDR1

<400> 27

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

1 5 10

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VK CDR1

<400> 28

Gln Gly Thr Ser Tyr

1 5

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VK CDR1

<400> 29

Ser Gly Thr Ser Tyr

1 5

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VK CDR1

<400> 30

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 31

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK33

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 32

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 33

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK22

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 34

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK48

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Arg Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 35

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK14

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 36

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK7

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 37

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK51

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 38

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK11

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 39

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK2

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 40

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK4

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 41

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK12

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 42

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VH

<400> 42

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Ile Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 43

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VH3

<400> 43

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 44

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20NFA

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 45

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20TFT-A

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

His Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 46

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20TFT-B

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Asn Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 47

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20TFT-C

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Gln Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 48

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20TFT-D

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile His Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 49

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20TFT-E

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 50

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> тяжелая цепь VHK20TFT-F

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

180 185 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435

<210> 51

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL1

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 52

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL2

<400> 52

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 53

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL3

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 54

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL4

<400> 54

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 55

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL5

<400> 55

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Met Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 56

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL

<400> 56

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 57

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL6

<400> 57

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 58

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL7

<400> 58

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 59

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL8

<400> 59

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 60

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL9

<400> 60

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 61

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL10

<400> 61

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 62

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL11

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 63

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL12

<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser

20 25 30

Gly Thr Ser Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 64

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> легкая цепь VL13

<400> 64

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1 антитела

<400> 65

Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr His

1 5

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3 антитела

<400> 66

Val Lys Asn Asp Asn

1 5

<210> 67

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH антитела

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

His Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Asn Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3 антитела

<400> 68

Val Lys Asn Asp Asn

1 5

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1 антитела

<400> 69

Glu Ser Val Asp Asn Gln Gly Thr Ser Tyr

1 5 10

<210> 70

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL антитела

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 71

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1 антитела

<400> 71

Glu Ser Val Asp Asn Ser Gly Thr Ser Tyr

1 5 10

<210> 72

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL антитела

<400> 72

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser

20 25 30

Gly Thr Ser Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 73

<211> 139

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val Asp Ser Asp Gln

1 5 10 15

Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr Leu Ile Val Lys

20 25 30

Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Ile Val Ser

35 40 45

Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala

50 55 60

Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn Gln Thr Arg Gln

65 70 75 80

Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly Thr Gln Leu Leu

85 90 95

Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu Met Asp Thr Ser

100 105 110

Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu Phe Asp Lys Val

115 120 125

Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala

130 135

<210> 74

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Val Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Val

1 5 10 15

Phe Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu

20 25 30

Glu Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn

35 40 45

Gly Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr

50 55 60

Lys Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp

65 70 75 80

Gly Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile

85 90 95

Lys Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly

100 105 110

Gln Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser

115 120 125

Glu Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu Lys

130 135 140

Ile Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu

145 150 155 160

Tyr Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn

165 170 175

Gln Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile

180 185 190

Glu Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr

195 200 205

Leu Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln

210 215

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 75

Gly Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Trp

1 5

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 76

Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Asn

1 5

<210> 77

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 77

Val Arg Gly Asp Glu

1 5

<210> 78

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 78

Val Lys Asn Asp Val

1 5

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 79

Val Arg Arg Asp Asn

1 5

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 80

Val Lys Gly Asp Val

1 5

<210> 81

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 81

Val Lys Gly Asp Lys

1 5

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 82

Val Arg Arg Asp Thr

1 5

<210> 83

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 83

Val Lys Gly Asp Gln

1 5

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 84

Val Lys Gly Asp Ala

1 5

<210> 85

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 85

Val Lys Gly Asp Glu

1 5

<210> 86

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 86

Val Arg Gly Asp Glu

1 5

<210> 87

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 87

Val Lys Gly Asp Ser

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к моноклональному антителу или фрагменту этого антитела, которые связываются с интегрином α7β1, способу его получения, а также к композиции, его содержащей. Также раскрыты выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанное антитело или фрагмент этого антитела, а также вектор и клетка, ее содержащие. Изобретение эффективно для лечения нарушения или заболевания, ассоциированного с мышечной дисфункцией у субъекта. 13 н. и 29 з.п. ф-лы, 31 ил., 13 табл., 10 пр.

1. Моноклональное антитело или фрагмент этого антитела, которые связываются с интегрином α7β1, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где:

(i) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 2, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 4; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7;

(ii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7;

(iii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 66; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7;

(iv) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 76, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7;

(v) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7;

(vi) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7;

(vii) аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 27, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 15; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 5, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

2. Моноклональное антитело или фрагмент этого антитела, которые связываются с интегрином α7β1, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 69, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

3. Моноклональное антитело или фрагмент этого антитела, которые связываются с интегрином α7β1, где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где аминокислотная последовательность VH-области содержит HCDR1 под SEQ ID NO: 14, HCDR2 под SEQ ID NO: 3 и HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и аминокислотная последовательность VL-области содержит LCDR1 под SEQ ID NO: 71, LCDR2 под SEQ ID NO: 6 и LCDR3 под SEQ ID NO: 7.

4. Моноклональное антитело или фрагмент этого антитела по п. 1, где указанное моноклональное антитело является агонистом интегрина α7β1.

5. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-4, где аминокислотная последовательность VH-области предусматривает:

(i) SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16;

(ii) SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; или

(iii) SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67.

6. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-5, где аминокислотная последовательность VL-области предусматривает:

(i) SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72;

(ii) SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9;

(iii) SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; или

(iv) SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70.

7. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-6, где

(i) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 72 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 72;

(ii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9;

(iii) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17;

(iv) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 67; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 17; или

(v) аминокислотная последовательность VH-области предусматривает SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16; и аминокислотная последовательность VL-области предусматривает SEQ ID NO: 70 или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 70.

8. Моноклональное антитело или фрагмент этого антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1, где антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь,

(i) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 63;

(ii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 19;

(iii) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 45, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 53; или

(iv) где аминокислотная последовательность тяжелой цепи предусматривает SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность легкой цепи предусматривает SEQ ID NO: 62.

9. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-8, где антитело или фрагмент антитела специфически связываются с белком α7.

10. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-9, где антитело или фрагмент антитела обеспечивает увеличение адгезии миобласта или мышечной трубочки к мерозину.

11. Антитело или фрагмент антитела по п. 10, где миобласт или мышечная трубочка представляет собой:

мышечную трубочку человека или мышечную трубочку мыши, которые характеризуются по меньшей мере одним из следующего: дефицит дистрофина, наличие мутации в гене дистрофина или наличие нефункционирующего дистрофина; или

миобласт человека или миобласт мыши, которые характеризуются по меньшей мере одним из следующего: дефицит дистрофина, наличие мутации в гене дистрофина или наличие нефункционирующего дистрофина.

12. Антитело или фрагмент антитела по п. 10, где мышечная трубочка представляет собой нормальную мышечную трубочку человека или нормальную мышечную трубочку мыши.

13. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-12, где интегрин α7β1 представляет собой интегрин α7β1 человека.

14. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-12, где фрагмент антитела представляет собой Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, однодоменное антитело, диатело или одноцепочечное антитело верблюдовых.

15. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-14.

16. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или фрагмент этого антитела по любому из пп. 1-14.

17. Вектор экспрессии по п. 15, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

18. Рекомбинантная экспрессирующая клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п. 15 или 17.

19. Способ получения антитела или фрагмента этого антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1, включающий

культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии по п. 15 или 17, в условиях, эффективных для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, с обеспечением продуцирования антитела или фрагмента антитела, которые являются агонистом интегрина α7β1.

20. Фармацевтическая композиция, активирующая интегрин α7β1, которая содержит:

антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-14 и

фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

21. Фармацевтическая композиция по п. 20, дополнительно содержащая дополнительное фармацевтическое средство, которое является агонистом по меньшей мере одного из интегрина α7β1, интегрина α6β1 и интегрина α3β1.

22. Способ лечения нарушения или заболевания, ассоциированного с мышечной дисфункцией, у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 1-14 с обеспечением таким образом лечения нарушения или заболевания у субъекта;

где указанное нарушение или заболевание, ассоциированное с мышечной дисфункцией, характеризуются одним или более из следующего:

нарушение функции интегрина α7β1 у субъекта;

дефицит дистрофина у субъекта;

наличие мутации в гене дистрофина у субъекта;

наличие нефункционирующего дистрофина у субъекта или

мышечная дисфункция, отличная от дисфункции, обусловленной нарушением функции α7β1 или дефицитом дистрофина, мутацией в гене дистрофина или отсутствием функции дистрофина.

23. Способ по п. 22, где мышечная дисфункция обусловлена одним или более из следующего или ассоциирована с одним или более из следующего: рак, застойная сердечная недостаточность, хроническая обструктивная болезнь легких, хроническое заболевание почек, ВИЧ-инфекция/СПИД, нервная анорексия, булимия, недостаточное питание, воздействие факторов, тошнота, диабет типа I, диабет типа II, метаболический синдром, кахексия, анемия, сердечная недостаточность, повышенное артериальное давление, рабдомиолиз, сепсис, саркопения, отсутствие физической активности, повреждения вследствие избыточной физической активности, гипотермия, гипертермия, травма, денервация, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, спинальная мышечная атрофия, алкогольная миопатия, ожоговая миопатия, инсульт, стероидная терапия или отмена стероидной терапии, дерматомиозит, синдром Гийена-Барре, невропатия, остеоартрит, инфекция, полиомиелит, полимиозит, воспаление, ревматоидный артрит, гипохолестеринемия, электротравма, тепловой удар, длительная иммобилизация, отсутствие притока крови к конечности или контакт с ядом.

24. Способ по п. 22, где заболевание представляет собой заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани.

25. Способ по п. 24, где заболевание, сопровождающееся истощением мышечной ткани, представляет собой мышечную дистрофию.

26. Способ по п. 25, где мышечная дистрофия представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна (DMD), мышечную дистрофию Беккера, мерозин-дефицитную врожденную мышечную дистрофию типа 1A или поясно-конечностную мышечную дистрофию.

27. Способ по п. 23, дополнительно включающий выявление субъекта с мышечной дисфункцией.

28. Способ по п. 24, дополнительно включающий выявление субъекта с заболеванием, сопровождающимся истощением мышечной ткани.

29. Способ по любому из пп. 23-28, где введение обеспечивает обращение, стабилизацию или замедление истощения мышечной ткани или мышечной дисфункции у субъекта.

30. Способ по любому из пп. 23-28, где введение обеспечивает улучшение мышечной функции у субъекта.

31. Способ по любому из пп. 23-28, где введение не обуславливает ухудшения мышечной функции у субъекта.

32. Способ по любому из пп. 23-28, дополнительно включающий измерение мышечной функции у субъекта после стадии введения, где скорость ухудшения мышечной функции снижается.

33. Способ по любому из пп. 24-26 и 28, где введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела является эффективным для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта, эффективного для лечения нарушения функции интегрина α7β1 у субъекта.

34. Способ по любому из пп. 24-26 и 28, где введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела является эффективным для повышения активности и/или количества интегрина α7β1 у субъекта, при этом повышенная активность и/или количество интегрина α7β1 у субъекта являются эффективными для обеспечения по меньшей мере частичного смягчения эффекта по меньшей мере одного из следующего:

дефицит дистрофина у субъекта;

наличие мутации в гене дистрофина у субъекта или

наличие нефункционирующего дистрофина у субъекта.

35. Способ по любому из пп. 23-28, где введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела является эффективным для обеспечения смягчения повреждения мышц у субъекта.

36. Способ по любому из пп. 23-28, где введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела является эффективным для обеспечения смягчения эксцентрического повреждения мышц у субъекта.

37. Способ по любому из пп. 23-28, где введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела является эффективным для обеспечения улучшения мышечной функции диафрагмы у субъекта.

38. Способ по любому из пп. 23-28, дополнительно включающий введение субъекту одного или более других средств терапии, при этом одно или более других средств терапии направлены против мышечной дистрофии или истощения мышечной ткани.

39. Способ по любому из пп. 23-28, где одно или более других средств терапии предусматривают одно или более из следующего: противосудорожное средство; иммунодепрессант; антибиотик; хинин; терапия для обеспечения контроля застойной сердечной недостаточности; генная заместительная терапия; терапия на основе пропуска экзона; терапия на основе подавления нонсенс-мутации; терапия с использованием сконструированной нуклеазы; клеточная терапия с использованием клеток-предшественников мышц или стволовых клеток; активация утрофина; противовоспалительная терапия; антифибротическая терапия; стероидная терапия; блокатор миостатина; инсулиноподобный фактор роста; ингибитор фосфодиэстеразы-5; ингибитор ACE; индукция ангиогенеза посредством доставки фактора роста эндотелия сосудов (VEGF); подавление рецептора-приманки VEGF типа 1; подавление рецептора-1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-1) или FMS-зависимой тирозинкиназы-1 (Flt-1); физиотерапия; трудотерапия; оперативное вмешательство; ортопедическое вмешательство; логопедическая терапия; респираторная терапия; кардиостимулятор и аппарат искусственного дыхания.

40. Способ активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта, включающий

введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 1-14 с обеспечением таким образом активации интегрина α7β1 в мышечной клетке субъекта.

41. Способ усиления связывания интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта, при этом способ включает

введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 1-14 с обеспечением таким образом усиления связывания интегрина α7β1 с его лигандом в мышечной клетке субъекта.

42. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 1-14 в изготовлении лекарственного препарата для лечения нарушения или заболевания, характеризующихся нарушением функции интегрина α7β1 у субъекта.