АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ ТОЛЬКО ТЯЖЕЛЫЕ ЦЕПИ, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С CD19 Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет по преимущество по предварительной заявке на патент США № 62/701281, поданной 20 июля 2018 г., описание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который был подан в электорнном виде в формате ASCII и настоящим включен полностью в описание посредством отсылки. Указанная копия ASCII, созданная 4 сентября 2019, названа TNO-0013-WO_SL.txt и имеет размер 26,773 байт.

Область техники

Данное изобретение относится к антителам человека, содержащим только тяжелые цепи, (например, UniAbs^TM), которые связываются с CD19. Данное изобретение также относится к способам получения таких антител, к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие такие антитела, и их применению для лечения В-клеточных расстройств, которые характеризуются экспрессией CD19.

Уровень техники

CD19

CD19, также известный как поверхностный антиген B4 B-лимфоцитов (UniProt P15391), представляет собой рецептор клеточной поверхности, который экспрессируется на всех B-клетках человека, но не обнаруживается на плазматических клетках. CD19 представляет собой трансмембранный белок, который рекрутирует цитоплазматические сигнальные белки к мембране и работает в составе комплекса CD19/CD21, снижая порог сигнальных путей B-клеточного рецептора. CD19 имеет относительно большой цитоплазматический хвост из 240 аминокислот. Внеклеточные Ig-подобные домены разделены потенциально дисульфид-связанным не-Ig-подобным доменом и сайтами присоединения N-связанных углеводов. Цитоплазматический хвост содержит по меньшей мере девять остатков тирозина возле С-конца, некоторые из которых, как было показано, фосфорилированы. Наряду с CD20 и CD22 ограниченная экспрессия CD19 в линии B-клеток делает его привлекательной мишенью для терапевтического лечения В-клеточных злокачественных новообразований. Было описано множество моноклональных антител и конъюгатов антитело-лекарственное средство, специфичных к CD19 (например, Naddafi et al. 2015, PMC4644525). Кроме того, Т-клетки с химерным антигенным рецептора к CD19 были одобрены для лечения лейкоза (например, Sadelain et al. 2017, PMID: 29245005).

Антитела, содержащие только тяжелые цепи

В обычном антителе IgG, ассоциация тяжелой цепи и легкой цепи частично обусловлена гидрофобным взаимодействием между константной областью легкой цепи и константным доменом CH1 тяжелой цепи. В областях тяжелой цепи каркаса 2 (FR2) и каркаса 4 (FR4) имеются дополнительные остатки, которые также способствуют этому гидрофобному взаимодействию между тяжелой и легкой цепями.

Известно, однако, что сыворотка верблюдовых (подгруппа Tylopoda, которая включает верблюдов, дромадеров и лам) содержит основной тип антител, состоящих исключительно из парных H-цепей (антитела, содержащие только тяжелые цепи, или UniAbs^TM). UniAbs^TM Camelidae (Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca и Lama vicugna) имеют уникальную структуру, состоящую из одного вариабельного домена (VHH), шарнирной области и двух константных доменов (CH2 и CH3), которые высокогомологичны доменам СН2 и СН3 классических антител. Данные UniAbs^TM не имеют первого домена константной области (CH1), который присутствует в геноме, но удаляется во время процессинга мРНК. Отсутствие домена CH1 объясняет отсутствие легкой цепи в UniAbs^TM, поскольку этот домен является местом закрепления константного домена легкой цепи. Такие UniAbs^TM естественным образом эволюционировали для придания антигенсвязывающей специфичности и высокой аффинности тремя CDR из обычных антител, или их фрагментов (Muyldermans, 2001; J Biotechnol 74:277–302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111–124). Хрящевые рыбы, такие как акулы, также выработали особый тип иммуноглобулина, обозначенный как IgNAR, который лишен легких полипептидных цепей и полностью состоит из тяжелых цепей. Молекулами IgNAR можно манипулировать с помощью молекулярной инженерии для получения вариабельного домена полипептида с одной тяжелой цепью (vNAR) (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).

Способность антител, содержащих только тяжелые цепи, лишенных легкой цепи, связывать антиген была установлена в 1960-х года (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). Тяжелая цепь иммуноглобулина, физически отделенная от легкой цепи, сохранила 80% антигенсвязывающей активности относительно тетрамерного антитела. Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790 продемонстрировали, что удаление домена CH1 из перегруппированного гена µ мыши приводит к получению антитела, содержащего только тяжелые цепи, лишенного легкой цепи, в клеточной культуре млекопитающих. Вырабатываемые антитела сохраняли специфичность связывания VH и эффекторные функции.

Антитела, содержащие только тяжелые цепи, с высокой специфичностью и аффинностью могут создаваться против различных антигенов посредством иммунизации (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), а часть VHH может быть легко клонирована и экспрессирована в дрожжах (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Их уровни экспрессии, растворимости и стабильности значительно выше, чем у классических фрагментов F(ab) или Fv (Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)).

Мыши, у которых λ (лямбда) локус легкой (L)-цепи и/или λ и κ (каппа) локусы L-цепи были функционально подвергнуты сайленсингу, и антитела, продуцируемые такими мышами, описаны в патентах США № 7541513 и 8367888. Рекомбинантное продуцирование антител, содержащих только тяжелую цепь, у мышей и крыс было описано, например, в WO2006008548; публикации заявки на патент США № 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology; 109(1), 93-101; Brüggemann et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26(5):377-90; и Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271–3283. Получение нокаутных крыс с помощью микроинъекций эмбрионам цинк-пальцевой нуклеазы описано в Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433. Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи, и трансгенные грызуны, содержащие гетерологичный локус тяжелой цепи, продуцирующий такие антитела, описаны в патентах США № 8883150 и 9365655. Структуры CAR-T, содержащие однодоменные антитела в качестве связывающего (нацеливающего) домена, описаны, например, в Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641 и Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386.

Сущность изобретения

Аспекты изобретения относятся к антителам, содержащим только тяжелые цепи, включая, без ограничения, UniAbs^TM, с аффинностью связывания к CD19. Дальнейшие аспекты изобретения относятся к способам получения таких антител, композициям, содержащим такие антитела, и их применению для лечения В-клеточных расстройств, которые характеризуются экспрессией CD19.

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое связывается с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) CDR1, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-6; и/или (b) CDR2, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7-12; и/или (c) CDR3, имеющую две или менее замен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 присутствуют в каркасе человека. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, дополнительно содержит последовательность константной области тяжелой цепи в отсутствие последовательности СН1.

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержит: (а) последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6; и/или (b) последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7–12; и/или (c) последовательность CDR3 SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержит: (а) последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6; и (b) последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7–12; и (c) последовательность CDR3 SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержит: (а) последовательность CDR1 SEQ ID NO: 4, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 10 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелую цепь, содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 14-21. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14-21. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое связывается с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (а) последовательность CDR1 формулы:

G F X₁ F S X₂ X₃ W (SEQ ID NO: 22)

где X₁ представляет собой T или S; X₂ представляет собой S или N; X₃ представляет собой Y или F; и (b) последовательность CDR2 формулы:

X₄ X₅ X₆ X₇ G S X₈ X₉ (SEQ ID NO: 23)

где X₄ представляет собой I или M; X₅ представляет собой N, S или K; X₆ представляет собой Q или K; X₇ представляет собой D или A; X₈ представляет собой D или E; X₉ представляет собой K или E; и (c) последовательность CDR3 ASGVYSFDY (SEQ ID NO: 13).

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое связывается с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека, причем последовательности CDR представляют собой последовательности, имеющие две или менее замены в последовательности CDR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-13.

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека, причем последовательности CDR выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-13.

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое связывается с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) последовательность CDR1 SEQ ID NO: 4, последовательность CDR2 из SEQ ID NO: 10 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 13 в каркасе VH человека.

В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, является мультиспецифичным. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, является биспецифичным. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, имеет аффинность связывания с двумя различными белками CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, имеет аффинность связывания с двумя разными эпитопами на одном и том же белке CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, имеет аффинность связывания с эффекторной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, имеет аффинность связывания с Т-клеточным антигеном. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, имеет аффинность связывания с CD3. В некоторых вариантах осуществления описанное выше антитело, содержащее только тяжелые цепи, имеет формат CAR-T.

Аспекты изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим антитело, содержащее только тяжелые цепи, как описано в данном документе.

Аспекты изобретения относятся к способам лечения В-клеточного расстройства, характеризующегося экспрессией CD19, включающим введение субъекту с таким расстройством антитела или фармацевтической композиции, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ДККЛ). В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ). В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой неходжкинскую лимфому (НХЛ). В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой системную красную волчанку (СКВ). В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой ревматоидный артрит (РА). В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой рассеянный склероз (РС).

Аспекты изобретения относятся к полинуклеотидам, кодирующим антитело, описанное в данном документе, векторам, содержащим такие полинуклеотиды, и клеткам, содержащим такие векторы.

Аспекты изобретения относятся к способам получения описанного в данном документе антитела, включающим выращивание описанной в данном документе клетки в условиях, благоприятных для экспрессии антитела, и выделение антитела из клетки и/или среды для культивирования клеток, в которой выращивают клетку.

Аспекты изобретения относятся к способам получения антитела, описанным в данном документе, включающим иммунизацию животного UniRat при помощи CD19 и идентификацию CD19-связывающих последовательностей тяжелой цепи.

Аспекты изобретения относятся к способам лечения, включающим введение нуждающемуся в этом человеку эффективной дозы антитела или фармацевтической композиции, как описано в данном документе.

Аспекты изобретения относятся к применению антитела или фармацевтической композиции, как описано в данном документе, при приготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства у нуждающегося в этом индивидуума.

Аспекты изобретения относятся к набору для лечения заболевания или расстройства у нуждающемуся в этом индивидуума содержащему антитело или фармацевтическую композицию, как описано в данном документе, и инструкции по применению. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный реагент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный реагент включает химиотерапевтическое лекарственное средство.

Данные и другие аспекты будут дополнительно объяснены в остальной части описания, включая примеры.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показаны уникальные аминокислотные последовательности CDR антитела к CD19, содержащего только тяжелые цепи.

На Фиг. 2 показаны аминокислотные последовательности вариабельного домена антитела к CD19, содержащего только тяжелые цепи.

На Фиг. 3 показаны аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 антитела к CD19, содержащего только тяжелые цепи.

На Фиг. 4 показана биологическая активность антитела к CD19, содержащего только тяжелые цепи.

На Фиг. 5А представлен график, изображающий процент специфического лизиса в зависимости от концентрации антител.

Фиг. 5B представлена схематическая иллюстрация биспецифичного антитела к CD19xCD3 в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения.

На Фиг. 6 представлен график, изображающий ответ в отношении связывания белка в виде зависимости от времени.

На Фиг. 7 представлен график, изображающий опухолевую нагрузку в виде зависимости от времени (дни после имплантации) для эксперимента на опухолевой модели.

На Фиг. 8 представлен график, изображающий лизис клеток-мишеней (цитотоксичность) в виде зависимости от концентрации антител.

На Фиг. 9 представлен график, изображающий концентрацию высвобожденных цитокинов в виде зависимости от концентрации антитела.

Детальное описание предпочтительных вариантов осуществления

При практической реализации данного изобретения применяют, если не указано иное, стандартные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы полностью описаны в литературе, например, в “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); и Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).

Когда приводится диапазон значений, следует понимать, что данное изобретение охватывает каждое промежуточное значение с точностью до десятого знака нижнего предела, если в контексте явно не указано иное, между верхним и нижним пределом этого диапазона, а также любое другое указанное или промежуточное значение в таком указанном диапазоне. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны и также включены в данное изобретение с учетом любого специальным образом исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба этих включенных предела, также включены в данное изобретение.

Если не указано иное, остатки антител в данном документе нумеруются в соответствии с системой нумерации Kabat (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Для обеспечения полного понимания данного изобретения в нижеследующем подробном описании изложены многочисленные конкретные детали. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что данное изобретение может применяться на практике и без одной или более указанных конкретных деталей. В других случаях общеизвестные отличительные признаки и процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники, не были описаны во избежание затруднения понимания изобретения.

Все приведенные в данном документе ссылки, включая патентные заявки и публикации, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.I. Определения

Под термином "содержащий" подразумевается, что перечисленные элементы требуются для композиции/способа/набора, однако для формирования композиции/способа/набора и тому подобного в рамках формулы изобретения могут быть включены и другие элементы.

Под термином «состоящий по существу из» подразумевается ограничение рамок описанной композиции или способа указанными материалами или поэтапными действиями, не оказывающими существенного влияния на основную и новую характеристику (-и) объекта изобретения.

Под термином «состоящий из» подразумевается исключение любого элемента, поэтапного действия или ингредиента, не указанного в формуле изобретения, из композиции, способа или набора.

Остатки антител в данном документе пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat и системой нумерации EU. Система нумерации Kabat в общем случае используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). «Система нумерации EU» или «индекс EU» в общем случае используется для обозначения остатка в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, описанный в Kabat et al., выше). «Индекс EU по Kabat» относится к нумерации аминокислотных остатков антитела человека IgG1 EU. Если не указано иное, то в данном документе ссылки на номера остатков в вариабельном домене антител означают нумерацию остатков согласно системе нумерации Kabat. Если не указано иное, то в данном документе ссылки на номера остатков в константном домене антител означают нумерацию остатков согласно системе нумерации EU.

Антитела, также называемые иммуноглобулинами, как правило, содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, где N-концевой домен тяжелой и легкой цепей является вариабельным по последовательности, поэтому, как правило, его называют доменом вариабельной области или вариабельным доменом тяжелый цепи (VH) или вариабельным доменом легкой цепи (VH). Эти два домена, как правило, связываются с образованием области специфического связывания, хотя, как будет обсуждаться в данном документе, специфическое связывание также может быть получено с вариабельными последовательностями только тяжелых цепей, а в данной области техники известный и используются различные неприродные конфигурации антител.

«Функциональное» или «биологически активное» антитело или антигенсвязывающая молекула (включая антитела, содержащие только тяжелые цепи и мультиспецифичные (например, биспецифичные) трехцепочечные антителоподобные молекулы (TCA), описанные в данном документе), является молекулой, способной оказывать одно или более своих природных активностей действий в структурных, регуляторных, биохимических или биофизических событиях. Например, функциональное антитело или другая связывающая молекула, например, TCA, может обладать способностью специфически связывать антиген, а связывание может, в свою очередь, вызывать или изменять клеточное или молекулярное событие, такое как передача сигнала или ферментативная активность. Функциональное антитело или другая связывающая молекула, например, TCA, также может блокировать лигандную активацию рецептора или действовать в качестве агониста или антагониста. Способность антитела или другой связывающей молекулы, например, TCA, проявлять одну или более своих природных активностей, зависит от нескольких факторов, включая правильный фолдинг и сборку полипептидных цепей.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мономеры, димеры, мультимеры, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), антитела, содержащие только тяжелые цепи, трехцепочечные антитела, одноцепочечный Fv (scFv), наноантитела и т. д., а также включают фрагменты антител, если они проявляют желаемую биологическую активность (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов.

Термин «антитело» может относиться к полноразмерной тяжелой цепи, полноразмерной легкой цепи, интактной молекуле иммуноглобулина; или иммунологически активной части любого из этих полипептидов, то есть к полипептиду, который содержит антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывает антиген представляющей интерес мишени или ее часть, причем такие мишени включают, но не ограничиваются ими, раковые клетки или клетки, которые вырабатывают аутоиммунные антитела, связанные с аутоиммунным заболеванием. Описанный в данном документе иммуноглобулин может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина, включая сконструированные подклассы с измененными Fc-частями, которые обеспечивают снижение или усиление активности эффекторных клеток. Иммуноглобулины могут быть получены из любых видов. В одном аспекте иммуноглобулин имеет преимущественно человеческое происхождение.

Термин «моноклональное антитело» в данном документе относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени однородных антител, то есть отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением мутаций, происходящих по естественным причинам, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты на антигене. Моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al. (1975) Nature 256:495, также могут быть получены, например, способами получения рекомбинантного белка (см., например, патент США № 4816567).

Термин «вариабельный», в контексте данного документа, в связи с антителами относится к тому факту, что последовательности некоторых частей вариабельных доменов антитела сильно различаются у разных антител и вносят вклад в связывание и специфичность каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. В то же время вариабельность не является равномерно распределенной по вариабельным доменам антител. Она сосредоточена в трех сегментах вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, называемых гипервариабельными областями. Более консервативные фрагменты вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Вариабельные домены нативных легких и тяжелых цепей содержат по четыре FR, преимущественно принимающих конфигурацию β-листа и соединенных тремя гипервариабельными областями, образующими петли, соединяющие структуры β-типа, а в некоторых случаях, являющиеся их частью. Гипервариабельные области каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости при помощи FR и, вместе с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, например, участие антитела в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ).

Термин «гипервариабельная область» при применении в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область, как правило, содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из остатков «гипервариабельной петли» 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). «Каркасная область» или остатки «FR», как определено в данном документе, представляют собой остатки гипервариабельной области, отличные от остатков вариабельного домена.

Примерные обозначения CDR показаны в данном документе, однако специалист в данной области техники поймет, что обычно используется ряд определений CDR, включая определение Kabat (см. «Zhao et al. A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions». Mol Immunol. 2010;47:694–700), которое основано на изменчивости последовательности и является наиболее часто используемым. Определение Chothia основано на расположении областей структурных петель (Chothia et al. «Conformations of immunoglobulin hypervariable regions». Nature. 1989; 342:877–883). Интересующие альтернативные определения CDR включают, без ограничения, те, которые раскрыты Honegger, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool.” J Mol Biol. 2001;309:657–670; Ofran et al. «Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes». J Immunol. 2008;181:6230–6235; Almagro «Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires». J Mol Recognit. 2004;17:132–143; и Padlanet al. «Identification of specificity-determining residues in antibodies». Faseb J. 1995;9:133–139., содержание каждого из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Термины «антитело, содержащее только тяжелые цепи», «антитело, состоящее из тяжелых цепей» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся в самом широком смысле к антителам, в которых отсутствует легкая цепь обычного антитела. Термины, в частности, включают, без ограничения, гомодимерные антитела, содержащие антигенсвязывающий домен VH и константные домены CH2 и CH3, в отсутствие домена CH1; функциональные (антигенсвязывающие) варианты таких антител, растворимые варианты VH, Ig-NAR, содержащие гомодимер одного вариабельного домена (V-NAR) и пяти C-подобных константных доменов (C-NAR), и их функциональные фрагменты; и растворимые однодоменные антитела (sUniDabs^TM). В одном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена вариабельной области, состоящего из каркаса 1, CDR1, каркаса 2, CDR2, каркаса 3, CDR3 и каркаса 4. В другом варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена по меньшей мере части шарнирной области и доменов CH2, и CH3. В другом варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена по меньшей мере части шарнирной области и домена CH2. В дополнительном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелую цепь, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена CH3. Антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых домен СН2 и/или СН3 укорочен, также включены в данный документ. В дополнительном варианте осуществления тяжелая цепь состоит из антигенсвязывающего домена и по меньшей мере одного домена СН (СН1, СН2, СН3 или СН4), но без шарнирной области. В дополнительном варианте осуществления тяжелая цепь состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере одного домена CH (CH1, CH2, CH3 или CH4) и по меньшей мере части шарнирной области. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может быть в форме димера, в котором две тяжелые цепи дисульфидно связаны друг с другом, ковалентно или нековалентно связаны друг с другом. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может принадлежать к подклассу IgG, но также в данном документе включены антитела, относящиеся к другим подклассам, таким как подкласс IgM, IgA, IgD и IgE. В конкретном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи имеет подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности подтип IgG1. В одном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, относится к подтипу IgG4, где один или более доменов CH модифицированы для изменения эффекторной функции антитела. В одном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, относится к подтипу IgG1, где один или более доменов CH модифицированы для изменения эффекторной функции антитела. Модификации доменов CH, которые изменяют эффекторную функцию, дополнительно описаны в данном документе. Неограничивающие примеры антител, содержащих тяжелые цепи, описаны, например, в WO2018/039180, описание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, в данном документе используются в качестве связывающего (нацеливающего) домена химерного антигенного рецептора (CAR). Определение, в частности, включает антитела человека, содержащие только тяжелые цепи, называемые UniAbs^TM, продуцируемые трансгенными крысами с иммуноглобулином человека (UniRat^TM). Вариабельные области (VH) UniAbs^TM называют UniDabs^TM, и являются универсальными строительными блоками, которые могут быть связаны с Fc-областями или сывороточным альбумином для разработки новых терапевтических средств с мультиспецифичностью, повышенной эффективностью и увеличенным периодом полужизни. Поскольку гомодимерные UniAbs^TM лишены легкой цепи и, следовательно, домена VL, антиген распознается одним единственным доменом, то есть вариабельным доменом (антигенсвязывающим доменом) тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи (VH).

Используемый в данном документе термин «интактная цепь антитела» представляет собой цепь, содержащую полноразмерную вариабельную область и полноразмерную константную область (Fc). Интактное «обычное» антитело содержит интактную легкую цепь и интактную тяжелую цепь, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, шарнир, CH2 и CH3 для секретируемого IgG. Другие изотипы, такие как IgM или IgA, могут иметь разные домены CH (включая, например, домен CH4). Константные домены могут представлять собой константные домены нативной последовательности (например, константные домены человеческой нативной последовательности) или их варианты аминокислотной последовательности. Интактное антитело может иметь одну или более «эффекторных функций», которые относятся к той биологической активности, которая присуща константной области Fc (Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области с вариантной аминокислотной последовательностью) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; и снижение количества рецепторов клеточной поверхности. Варианты константной области включают те, которые изменяют эффекторный профиль, связывание с Fc-рецепторами и т.п.

В зависимости от аминокислотной последовательности Fc (константного домена) их тяжелых цепей, антитела и различные антигенсвязывающие белки могут быть определены в разные классы. Существует пять основных классов Fc-областей тяжелой цепи: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на «подклассы» (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, и IgA2. Константные домены Fc, которые соответствуют различным классам антител, могут обозначаться как α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Формы Ig включают шарнирные модификации или бесшарнирные формы (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). Легкие цепи антител от любых видов позвоночных можно отнести к одному из двух типов, называемых κ (каппа) и λ (лямбда), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

«Функциональная Fc-область» обладает «эффекторной функцией» Fc-области с нативной последовательностью. Неограничивающие примеры эффекторных функций включают связывание C1q; КЗЦ; связывание с Fc-рецептором; АЗКЦ; АЗКФ; подавление рецепторов на поверхности клетки (например, рецептора B-клетки) и т.д. Такие эффекторные функции, как правило, требуют, чтобы область Fc взаимодействовала с рецептором, например, рецепторы FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB-рецепторы и рецептор FcRn с низкой аффинностью; и могут быть оценены с помощью различных анализов, известных в данной области техники. «Мертвый» или «подвергнутый сайленсингу» Fc представляет собой Fc, который был мутирован для сохранения активности в отношении, например, продления периода полужизни в сыворотке, но который не активирует высокоаффинный Fc-рецептор или который имеет сниженную аффинность к Fc-рецептору.

«Fc-область с нативной последовательностью» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, встречающейся в природе. Человеческие Fc-области с нативной последовательностью включают, например, Fc-область человеческого IgG1 с нативной последовательностью (не-A- и A-аллотипы); область Fc человеческого IgG2 с нативной последовательностью; Fc-область человеческого IgG3 с нативной последовательностью; и Fc-область человеческого IgG4 с нативной последовательностью, а также их природные варианты.

«Вариант Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности Fc-области с нативной последовательностью в силу по меньшей мере одной модификации аминокислоты, предпочтительно одной или более аминокислотных замен. Предпочтительно вариант Fc-области имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-областью с нативной последовательностью или с Fc-областью исходного полипептида, например, от около одной до около десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных замен в Fc-области с нативной последовательностью или в Fc-области исходного полипептида. Вариант Fc-области в данном документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере около 80% гомологией с Fc-областью с нативной последовательностью и/или с Fc-областью исходного полипептида, и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% гомологии с ними, более предпочтительно по меньшей мере около 95% гомологии с ним.

Варианты последовательностей Fc могут содержать три аминокислотные замены в области CH2 для снижения связывания FcγRI в положениях 234, 235, и 237 согласно индексу EU (см. Duncan et al., (1988) Nature 332:563). Две аминокислотные замены в сайте связывания комплемента C1q в положениях 330 и 331 согласно индексу EU снижают фиксацию комплемента (см. Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) и Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). Замена на остатки человеческого IgG1 или IgG2 в положениях 233-236 и остатки IgG4 в положениях 327, 330 и 331 значительно снижает АЗКЦ и КЗЦ (см., например, Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; и Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604). Аминокислотная последовательность человеческого IgG1 (UniProtKB № P01857) представлена в данном документе как SEQ ID NO: 26. Аминокислотная последовательность человеческого IgG4 (UniProtKB № P01861) представлена в данном документе как SEQ ID NO: 27. Подвергнутый сайленсингу IgG1 описан, например, в Boesch, A.W., et al., «Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions». MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27, описание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки.

Возможны и другие варианты Fc, включая, без ограничения, вариант, в котором удалена область, способная образовывать дисульфидную связь, или в котором удалены определенные аминокислотные остатки на N-конце нативного Fc, или остаток метионина добавлен к нему. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления одна или более Fc-частей связывающего соединения могут содержать одну или более мутаций в шарнирной области для устранения дисульфидной связи. В еще одном варианте шарнирная область Fc может быть удалена полностью. В еще одном варианте связывающее соединение может содержать вариант Fc.

Кроме того, вариант Fc может быть сконструирован для удаления или существенного снижения эффекторных функций путем замены (мутации), удаления или добавления аминокислотных остатков для осуществления связывания комплемента или связывания Fc-рецептора. Например, без ограничения, делеция может происходить в сайте связывания комплемента, таком как сайт связывания C1q. Способы получения таких производных последовательностей Fc-фрагмента иммуноглобулина описаны в международных патентных публикациях №№ WO 97/34631 и WO 96/32478. Кроме того, Fc-домен может быть модифицирован фосфорилированием, сульфированием, ацилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием, ацетилированием, амидированием и т.п.

Термин «антитело, содержащее Fc-область» относится к антителу, которое содержит Fc-область. С-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с системой нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, во время очистки антитела или рекомбинантной конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. Соответственно, антитело, имеющее Fc-область согласно данному изобретению, может включать антитело с или без K447.

Аспекты изобретения включают связывающие соединения, имеющие мультиспецифичные конфигурации, которые включают, без ограничения, биспецифичные, триспецифичные и т.д. Большое разнообразие способов и конфигураций белков известно и используется для получения биспецифичных моноклональных антителах (бсмкАт), триспецифичных антителах, и т.п.

Были разработаны различные способы получения поливалентных искусственных антител путем рекомбинантного слияния вариабельных доменов двух или более антител. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигенсвязывающий домен на полипептиде соединены полипептидным линкером. Одним неограничивающим примером такого полипептидного линкера является GS-линкер, имеющий аминокислотную последовательность из четырех остатков глицина, за которыми следует один остаток серина, и в котором последовательность повторяется n раз, где n представляет собой целое число от 1 до около 10, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 (SEQ ID NO: 30). Неограничивающие примеры таких линкеров включают GGGGS (SEQ ID NO: 24) (n = 1) и GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 25 ) (n = 2). Также можно использовать другие подходящие линкеры, которые описаны, например, в Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65 (10): 1357-69, описание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки.

Термин «трехцепочечная антителоподобная молекула» или «ТСА» используется в данном документе для обозначения антителоподобных молекул, содержащих, состоящих по существу или состоящих из трех полипептидных субъединиц, две из которых содержат, состоят по существу из или состоят из одной тяжелой и одной легкой цепи моноклонального антитела, или функциональных антигенсвязывающих фрагментов таких цепей антитела, содержащих антигенсвязывающую область и по меньшей мере один домен СН. Данная пара тяжелая цепь/легкая цепь обладает специфичностью связывания для первого антигена. Третья полипептидная субъединица содержит, состоит по существу или состоит из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего Fc-часть, содержащую домены CH2 и/или CH3, и/или CH4, в отсутствие домена CH1, и один или более антигенсвязывающих доменов (например, одну вариабельную область тяжелой цепи («одиночная конфигурация») или два антигенсвязывающих домена (например, две вариабельные области одной тяжелой цепи) в «тандемной конфигурации», где два антигенсвязывающих домена связаны вместе посредством линкерной последовательности, как описано выше), которая связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп первого антигена, при этом такой связывающий домен происходит от или имеет последовательность, идентичную вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела. Части такой вариабельной области могут кодироваться сегментами гена V_H и/или V_L, сегментами гена D и J_H, или сегментами гена J_L. Вариабельная область может кодироваться реаранжированными генными сегментами V_HDJ_H, V_LDJ_H, V_HJ_L или V_LJ_L. В белке TCA используется антитело, содержащее только тяжелые цепи, как определено выше.

В соединении, связывающем ТСА, используется «антитело, содержащее только тяжелые цепи», или «антитело с только тяжелыми цепями», или «полипептид, содержащий только тяжелые цепи», которые, как используется в данном документе, означают одноцепочечное антитело, содержащее константные области тяжелой цепи CH2 и/или CH3, и/или CH4, но без домена CH1. В одном варианте осуществления антитело, содержащей только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена (например, вариабельной области одной тяжелой цепи в одиночной или тандемной конфигурации), по меньшей мере части шарнирной области и доменов CH2 и CH3.

В другом варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена CH2. В дополнительном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена CH3. Антитела, содержащие тяжелые цепи, у которых домен СН2 и/или СН3 укорочен, также включены в данный документ. В другом варианте осуществления тяжелая цепь состоит из антигенсвязывающего домена и по меньшей мере одного домена CH (CH1, CH2, CH3 или CH4), но без шарнирной области. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может быть в форме димера, в котором две тяжелые цепи связаны дисульфидной связью, другие в противном случае ковалентно или нековалентно связаны друг с другом, и может необязательно включать асимметричную границу взаимодействия между двумя или более доменами CH, чтобы облегчить правильное спаривание между полипептидными цепями. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может принадлежать к подклассу IgG, но сюда также включены антитела, принадлежащие к другим подклассам, таким как подкласс IgM, IgA, IgD и IgE. В конкретном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности подтипу IgG1 или подтипу IgG4. Неограничивающие примеры соединения, связывающего ТСА, описаны, например, в WO2017/223111 и WO2018/052503, описания которых полностью включены в данный документ посредством ссылки.

Антитела, состоящий только из тяжелых цепей составляют около четверти антител IgG, продуцируемых животными семейства верблюдовых, например, верблюдами и ламами (Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). Эти антитела образованы двумя тяжелыми цепями, но лишены легких цепей. Как следствие, вариабельный участок связывания антигена называется доменом VHH, и он представляет собой наименьший естественный, интактный антигенсвязывающий сайт, имеющий длину всего около 120 аминокислот (Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). Антитела, содержащие только тяжелые цепи, с высокой специфичностью и аффинностью могут создаваться против различных антигенов посредством иммунизации (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), а часть VHH может быть легко клонирована и экспрессирована в дрожжах (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Их уровни экспрессии, растворимости и стабильности значительно выше, чем у классических фрагментов F(ab) или Fv (Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). Также было показано, что у акул есть один VH-подобный домен в своих антителах, называемый VNAR. (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).

Термины «CD19» и «кластер дифференцировки 19» в контексте данного документа относятся к молекуле, экспрессируемой во всех фазах развития В-клеток до терминальной дифференцировки в плазматические клетки. Термин «CD19» включает белок CD19 человека и любого вида животных, отличных от человека, и, в частности, включает CD19 человека, а также CD19 млекопитающих, отличных от человека.

Используемый в данном документе термин «CD19 человека» включает любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD19 человека (UniProt P15391) независимо от их источника или способа получения. Таким образом, «CD19 человека» включает CD19 человека, естественно экспрессируемый клетками, и CD19, экспрессируемый в клетках, трансфицированных геном CD19 человека.

Термины «антитело к CD19, содержащее только тяжелые цепи», «антитело к CD19, состоящее только из тяжелых цепей», «анти-CD19 антитело, содержащее только тяжелые цепи» и «антитело к CD19, состоящее только тяжелые цепи» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, содержащего только тяжелые цепи, как определено выше, для иммуноспецифического связывания с CD19, включая CD19 человека, как определено выше. Определение включает, без ограничения, антитела человека, содержащие только тяжелые цепи, продуцируемые трансгенными животными, такими как трансгенные крысы или трансгенные мыши, экспрессирующие иммуноглобулин человека, включая UniRats^TM, продуцирующие антитела UniAb^TM к CD19 человека, как определено выше.

«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» относительно эталонной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимальной идентичности последовательностей, но без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может осуществляться различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программные обеспечения BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить параметры, подходящие для выравнивания последовательностей, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания сравниваемых последовательностей по всей длине. Однако для целей данного изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей генерируются с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2.

«Выделенным» антителом является такое, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонента его естественной среды. Загрязняющий компонент естественного окружения представляет собой вещества, которые влияют на диагностическое или терапевтическое применение антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до более 95% по массе антитела, как определено методом Лоури, и наиболее предпочтительно более 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, используя секвенатор с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности (SDS-PAGE) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием красителя Кумасси синего или, предпочтительнее, красителя на основе серебра. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент естественной среды антитела будет отсутствовать. Обычно, однако, выделенное антитело будет получено с помощью по меньшей мере одного этапа очистки.

Антитела согласно данному изобретению включают мультиспецифичные антитела. Мультиспецифичные антитела имеют более чем одну специфичность связывания. Термин «мультиспецифичный», в частности, включает «биспецифичный» и «триспецифичный», а также аффинность независимого специфического связывания высшего порядка, такую как полиэпитопная специфичность высшего порядка, а также тетравалентные антитела и фрагменты антител. Термины «мультиспецифичное антитело», «мультиспецифичное антитело, содержащее только тяжелые цепи», «мультиспецифичное антитело, состоящее из тяжелых цепей», «мультиспецифичное UniAb^TM» и «мультиспецифичное связывающее соединение» используются в данном документе в самом широком смысле и охватывают все антитела с более чем одной специфичностью связывания. Мультиспецифичные антитела к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению, в частности, включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с одним единственным эпитопом на белке CD19, таким как человеческий CD19, и с эпитопом на другом белке, таком как, например, белок CD3 (т.е. двухвалентные и монопаратопные). Мультиспецифичные антитела к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению, в частности, включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с двумя или более неперекрывающимися эпитопами на белке CD19, таком как человеческий CD19 (т.е. двухвалентные и бипаратопные). Мультиспецифичные антитела к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению также конкретно включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с эпитопом белка CD19, таким как человеческий CD19, и эпитопом другого белка, такого как, например, белок CD3, такой как человеческий CD3 (т.е. двухвалентные и бипаратопные). Мультиспецифичные антитела к CD19 тяжелой цепи согласно данному изобретению также конкретно включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с двумя или более неперекрывающимися или частично перекрывающимися эпитопами на белке CD19, таком как белок CD19 человека, и с эпитопом на другом белок, такой как, например, белок CD3, такой как белок CD3 человека (т.е. трехвалентный и бипаратопный).

Антитела согласно изобретению включают моноспецифичные антитела, имеющие одну специфичность связывания. Моноспецифичные антитела, в частности, включают антитела, обладающие одной специфичностью связывания, а также антитела, содержащие более одной единицы связывания, имеющие одинаковую специфичность связывания. Термины «моноспецифичное антитело», «моноспецифичное антитело, содержащее только тяжелые цепи», «моноспецифичное антитело, состоящее из тяжелых цепей» и «моноспецифичное UniAb^TM» используются в данном документе в самом широком смысле и охватывают все антитела с одной специфичностью связывания. Моноспецифичные антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению, в частности, включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с одним эпитопом белка CD19, таким как человеческий CD19 (моновалентные и моноспецифические). Моноспецифичные антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению также конкретно включают антитела, имеющие более одной связывающей единицы (например, поливалентные антитела), иммуноспецифически связывающиеся с эпитопом на белке CD19, таком как человеческий CD19. Например, моноспецифичное антитело в соответствии с вариантами осуществления изобретения может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую два антигенсвязывающих домена, в котором каждый антигенсвязывающий домен связывается с одним и тем же эпитопом на белке CD19 (т.е. двухвалентное и моноспецифичное).

«Эпитоп» представляет собой участок на поверхности молекулы антигена, с которым связывается одна молекула антитела. Обычно антиген имеет несколько или много разных эпитопов и вступает в реакцию со многими различными антителами. Термин, в частности, включает линейные эпитопы и конформационные эпитопы.

«Эпитопное картирование» представляет собой процесс идентификации сайтов связывания или эпитопов антител на их целевых антигенах. Эпитопы антител могут быть линейными или конформационными эпитопами. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот в белке. Конформационные эпитопы образуются из аминокислот, которые являются прерывистыми в последовательности белка, но которые объединяются при сворачивании белка в его трехмерную структуру.

Термин «полиэпитопная специфичность» относится к способности специфически связываться с двумя или более различными эпитопами на одной или разных мишенях. Как отмечено выше, данное изобретение, в частности, включает антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, с полиэпитопной специфичностью, то есть антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, связывающиеся с двумя или более непересекающимися эпитопами на белке CD19, таком как CD19 человека. Термин «неперекрывающийся эпитоп(ы)» или «неконкурентный эпитоп(ы)» антигена определяется в данном документе как означающий эпитоп(ы), которые распознаются одним членом пары антигенспецифичных антител, но не другим членом. Пары антител или антигенсвязывающие области, нацеленные на один и тот же антиген на мультиспецифичном антителе, распознающие неперекрывающиеся эпитопы, не конкурируют за связывание с этим антигеном и способны связывать этот антиген одновременно.

Антитело связывает «по существу тот же эпитоп», что и эталонное антитело, когда два антитела распознают идентичные или стерически перекрывающиеся эпитопы. Наиболее широко используемыми и быстрыми способами для определения того, связываются ли два эпитопа с идентичными или стерически перекрывающимися эпитопами, являются анализы конкурентного связывания, которые могут быть сконфигурированы во всем количестве различных форматов с использованием либо меченого антигена, либо меченого антитела. Обычно антиген иммобилизуют в 96-луночном планшете, и способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют с использованием радиоактивных или ферментных меток.

Термин «валентный», в контексте данного документа, относится к указанному количеству сайтов связывания в молекуле антитела.

«Моновалентное» антитело имеет один сайт связывания. Таким образом, моновалентное антитело также является моноспецифичным.

«Поливалентное» антитело имеет два или более сайтов связывания. Таким образом, термины «двухвалентный», «трехвалентный» и «четырехвалентный» относятся к наличию двух сайтов связывания, трех сайтов связывания и четырех сайтов связывания, соответственно. Таким образом, биспецифичное антитело согласно изобретению является по меньшей мере двухвалентным и может быть трехвалентным, четырехвалентным или иным образом поливалентным. Бивалентное антитело в соответствии с вариантами осуществления изобретения может иметь два сайта связывания с одним и тем же эпитопом (т.е. двухвалентное, монопаратопное) или с двумя разными эпитопами (т.е. двухвалентное, бипаратопное).

Известно большое разнообразие способов и конфигураций белка и используется для получения биспецифичных моноклональных антител (BsMAB), триспецифичных антител и тому подобного.

Термин «биспецифичная трехцепочечная антителоподобная молекула» или «ТСА» используется в данном документе для обозначения антителоподобных молекул, включающих, состоящих по существу или состоящих из трех полипептидных субъединиц, две из которых содержат, состоят по существу из или состоят из одной тяжелой и одной легкой цепи моноклонального антитела, или функциональных антигенсвязывающих фрагментов таких цепей антитела, содержащие антигенсвязывающую область и по меньшей мере один домен СН. Данная пара тяжелая цепь/легкая цепь обладает специфичностью связывания для первого антигена. Третья полипептидная субъединица содержит, состоит по существу или состоит из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего Fc-участок, содержащий домены СН2 и/или СН3, и/или СН4, в отсутствие домена СН1, и антигенсвязывающий домен, который связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп первого антигена, причем такой связывающий домен происходит из или имеет идентичность последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела. Части такой вариабельной области могут кодироваться сегментами гена V_H и/или V_L, сегментами гена D и J_H, или сегментами гена J_L. Вариабельная область может кодироваться реаранжированными генными сегментами V_HDJ_H, V_LDJ_H, V_HJ_L или V_LJ_L. В белке TCA используется антитело, содержащее только тяжелые цепи, как определено выше.

Термин «химерный антигенный рецептор» или «CAR» используется в данном описании в самом широком смысле для обозначения сконструированного рецептора, который прививает желаемую специфичность связывания (например, антигенсвязывающую область моноклонального антитела или другого лиганда) к охватывающему мембрану и внутриклеточному сигнальному доменам. Как правило, рецептор используется для прививки специфичности моноклонального антитела на Т-клетку для создания химерных антигенных рецепторов (CAR). (Dai et al., J Natl Cancer Inst, 2016; 108(7):djv439; и Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370–383.).

Термин «антитело человека» используется в данном документе для включения антител, которые имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В данном документе, антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина человека зародышевой линии, например, мутации, введенные случайным или специфичным для сайта мутагенезом in vitro или с помощью соматической мутации in vivo. Термин «человеческое антитело», в частности, включает антитела, содержащие только тяжелые цепи, имеющие последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, продуцируемые трансгенными животными, такими как трансгенные крысы или мыши, в частности UniAbs^TM, продуцируемые UniRats^TM, как определено выше.

Под «химерным антителом» или «химерным иммуноглобулином» подразумевается молекула иммуноглобулина, содержащая аминокислотные последовательности по меньшей мере из двух разных локусов Ig, например, трансгенное антитело, содержащее часть, кодируемую локусом Ig человека, и часть, кодируемую локусом Ig крысы. Химерные антитела включают трансгенные антитела с нечеловеческими Fc-областями или искусственными Fc-областями, и человеческие идиотипы. Такие иммуноглобулины могут быть выделены из животных согласно изобретению, которые были сконструированы для получения таких химерных антител.

Используемый в данном документе термин «эффекторная клетка» относится к иммунной клетке, которая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в отличие от когнитивной и активационной фаз иммунного ответа. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы и выполняют специфические иммунные функции. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка, такая как естественная клетка-киллер, способна индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). Например, моноциты и макрофаги, которые экспрессируют FcR, участвуют в специфическом уничтожении клеток-мишеней и представлении антигенов другим компонентам иммунной системы или связываются с клетками, которые представляют антигены. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка может осуществлять фагоцитоз антигена-мишени или клетки-мишени.

«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют рецепторы, такие как рецепторы Т-клеток или FcR, и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно, такие клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют эффекторную функцию АЗКЦ. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют АЗКЦ, включают, естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; причем NK-клетки являются предпочтительными. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника, например, из крови или МКПК, как описано в данном документе.

Термин «иммунная клетка» используется в данном документе в самом широком смысле, включая, без ограничения, клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоциты (такие как В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Т-клетки (ЦТЛ)), клетки-киллеры, естественные клетки-киллеры (NK), макрофаги, моноциты, эозинофилы, полиморфно-ядерные клетки, такие как нейтрофилы, гранулоциты, тучные клетки и базофилы.

«Эффекторные функции» антитела относятся к той биологической активности, которая относится к Fc-области (Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области с вариантной аминокислотной последовательностью) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность АЗКЦ; фагоцитоз; подавление рецепторов поверхности клетки, (например, B-клеточный рецептор, BCR) и т.д.

«Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и «АЗКЦ» соответствуют опосредованной клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, клетки Natural Killer (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на целевой клетке и, таким образом, приводят к лизису клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие АЗКЦ, естественные клетки-киллеры, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки активности АЗКЦ представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ АЗКЦ in vitro, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеары периферической крови (МКПК) и натуральные клетки-киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнения, АЗКЦ-активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, в животной модели, например, согласно описанию в публикации Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Комплементзависимая цитотоксичность» или «КЗЦ» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с распознаваемым антигеном. Для оценки активации комплемента, может быть выполнен анализ КЗЦ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

«Аффинность связывания» относится к силе суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом) и ее связывающим партнером (например, антигеном). Если не указано иное, используемый в данном документе термин «аффинность связывания» относится к действительной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие в соотношении 1:1 между членами связывающей пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y в целом можно выразить константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена общепринятыми способами, известными в данной области техники. Низкоаффинные антитела обычно связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела, как правило, связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными.

Используемый в данном документе термин «Kd» или «значение Kd» относится к константе диссоциации, определенной методом интерферометрии BioLayer, с использованием прибора Octet QK384 (Fortebio Inc., Menlo Park, CA) в режиме кинетики. Например, анти-мышиные Fc-сенсоры загружают со слитым Fc-антигеном мыши и затем погружают в лунки, содержащие антитела, для измерения зависимых от концентрации скоростей (kon). Скорости диссоциации антител (koff) измеряются на последнем этапе, когда сенсоры погружают в лунки, содержащие только буфер. Kd представляет собой соотношение koff/kon. (Подробнее см. Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009).

Термины «лечение», «лечить» и тому подобное используются в данном документе для обозначения достижения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптомов и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного явления, связанного с этим заболеванием. Используемый в данном документе термин «лечение» охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего и включает: (а) предотвращение появления заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого это заболевание еще не диагностировано; (b) подавление заболевания, то есть прекращение его развития; или (c) облегчение заболевания, т.е. вызывание регресса заболевания. Терапевтическое средство можно вводить до, во время или после начала заболевания или травмы. Лечение текущего заболевания, при котором лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы пациента, представляет особый интерес. Такое лечение желательно проводить до полной потери функции в пораженных тканях. Терапия субъекту может быть введена во время симптоматической стадии заболевания, и в некоторых случаях после симптоматической стадии заболевания.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество активного агента, которое необходимо для придания терапевтического эффекта у субъекта. Например, «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество, которое вызывает, ослабляет или иным образом вызывает улучшение патологических симптомов, прогрессирования заболевания или физиологических состояний, связанных с заболеванием, или которое повышает устойчивость к расстройству.

Термины «В-клеточные новообразования» или «зрелые В-клеточные новообразования» в контексте данного изобретения включают, но не ограничиваются ими, все лимфолейкозы и лимфомы, хронический лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, пролимфоцитарный лейкоз, лимфобластный лейкоз из В-клеток-предшественников, лейкоз волосковых клеток, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, В-клеточную пролимфоцитарную лимфому, В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому из мантийных клеток, лимфому Беркитта, фолликулярную лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ДККЛ), множественную миелому, лимфоплазмацитарную лимфому, лимфому маргинальной зоны селезенки, плазмоклеточное новообразование, например, плазомклеточную миелому, плазмоцитому, болезнь отложения моноклональных иммуноглобулинов, болезнь тяжелых цепей, MALT-лимфому, узловую B-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, внутрисосудистую крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфоматоидный гранулематоз, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, волосатоклеточный лейкоз, первичную выпотную лимфому и СПИД-связанную неходжкинскую лимфому.

Термин «характеризуется экспрессией CD19» в широком смысле относится к любому заболеванию или расстройству, при котором экспрессия CD19 связана или вовлечена в один или более патологических процессов, которые характерны для данного заболевания или расстройства. Такие расстройства включают, но не ограничиваются ими, В-клеточные новообразования.

Термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения млекопитающего, которого оценивают на предмет лечения и/или которое подвергается лечению. В одном варианте осуществления млекопитающее является человеком. Термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» охватывают, без ограничения, индивидуумов, имеющих злокачественное новообразование, индивидуумов с аутоиммунными заболеваниями, патогенными инфекциями и тому подобное. Субъектами могут быть люди, но также могут быть и другие млекопитающие, в частности те млекопитающие, которые могут быть использованы в качестве лабораторных моделей заболеваний человека, например, мышь, крыса и т. д.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к составу, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности активного ингредиента быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться композиция. Такие составы являются стерильными. «Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества» (носители, адьюванты) являются таковыми, которые резонно могут вводиться субъекту-млекопитающему и обеспечивать эффективную дозу используемого активного ингредиента.

«Стерильная» композиция является асептической или свободной от, или практически не содержит любых живых микроорганизмов и их спор. «Замороженная» композиция является композицией при температуре ниже 0ºC.

«Стабильная композиция» является таковой, в которой белок практически полностью сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность во время хранения. Предпочтительно, композиция практически полностью сохраняет свою физическую или химическую стабильность, а также свою биологическую активность. Период хранения в общем выбран на основании срока годности композиции. Разнообразные техники для измерения стабильности белка известны в данной области техники и рассмотрены, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993). Стабильность может быть измерена при выбранной температуре для выбранного периода времени. Стабильность может быть оценена качественно и/или количественно различными способами, включая оценку образования агрегатов (например, с использованием эксклюзионной хроматографии, путем измерения мутности и/или путем визуального контроля); путем оценки неоднородности заряда с помощью катионообменной хроматографии, изоэлектрического фокусирования изображения (icIEF) или электрофореза в капиллярной зоне; анализ N-концевой или C-концевой последовательности; масс-спектрометрический анализ; анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия для сравнения восстановленного и интактного антитела; анализ пептидной карты (например, триптический или LYS-C); оценку биологической активности или антигенсвязывающей функции антитела; и т.п. Нестабильность может включать в себя одно или более из: агрегации, дезамидирования (например, Asn дезамидирование), окисление (например, окисление Met), изомеризации (например, изомеризаци Asp), отсечение / гидролиз / фрагментация (например, фрагментация шарнирной области), образование сукцинимида, неспаренный цистеин (ы), удлинение N-конца, обработка C-конца, различия гликозилирования, и т.п.

II. Подробное описание

Антитела к CD19

Данное изобретение относится к семейству тесно связанных антител, содержащих только тяжелые цепи, которые связываются с CD19 человека. Антитела этого семейства содержат набор последовательностей CDR, как определено в данном документе и показано на Фиг. 1, и проиллюстрированы предоставленными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 14-21, приведенными на Фиг. 2. Семейства антител обеспечивают ряд преимуществ, которые благоприятствуют применению их в качестве клинического(-их) терапевтического(-их) агента(-ов). Антитела включают членов с диапазоном аффинностей связывания, позволяющих выбирать конкретную последовательность с желаемой аффинностью связывания.

Подходящее антитело может быть выбрано из представленных в данном документе, для разработки и терапевтического или другого применения, включая, без ограничения, использование в качестве биспецифичного, например, как показано на Фиг. 5В, или триспецифичного антитела или части структуры CAR-T. Определение аффинности к белку-кандидату может быть выполнено с использованием способов, известных в данной области техники, таких как измерения Biacore. Члены семейства антител могут иметь аффинность к CD19 с Kd от около 10^-6 до около 10^-11, включая, без ограничения: от около 10^-6 до около 10^-10; от около 10^-6 до около 10^-9; от около 10^-6 до около 10^-8; от около 10^-8 до около 10^-11; от около 10^-8 до около 10^-10; от около 10^-8 до около 10^-9; от около 10^-9 до около 10^-11; от около 10^-9 до около 10^-10; или любое значение в этих диапазонах. Выбор аффинности может быть подтвержден биологической оценкой в отношении модуляции, например, блокирования, биологической активности CD19, включая анализы in vitro, доклинические модели и клинические испытания, а также оценку потенциальной токсичности.Члены семьи антител, описанные в данном документе, не являются перекрестно-реактивными с CD19 белком яванского макака, но могут быть сконструированными для обеспечения перекрестной-реактивности с белком CD19 яванского макака или белками CD19 других видов животных, при необходимости. Семейство CD19-специфичных антител в данном документе включает домен VH, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека. Последовательности CDR могут быть расположены, например, в области около аминокислотных остатков 26-35; 53-59; и 98-117 для CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, предоставленных иллюстративных последовательностей вариабельной области, указанных в SEQ ID NO: 14-21. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что последовательности CDR могут находиться в других положениях, если выбрана другая каркасная последовательность, хотя, как правило, порядок последовательностей остается неизменным.

Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 антител к CD19 согласно данному изобретению могут быть охвачены следующими структурными формулами, где X обозначает вариабельную аминокислоту, которая может представлять собой любую из конкретных аминокислот, указанных ниже.

CDR1

G F X₁ F S X₂ X₃ W (SEQ ID NO: 22)

где X₁ представляет собой T или S;

X₂ представляет собой S или N; и

X₃ представляет собой Y или F.

CDR2

X₄ X₅ X₆ X₇ G S X₈ X₉ (SEQ ID NO: 23)

где X₄ представляет собой I или M;

X₅ представляет собой N, S или K;

X₆ представляет собой Q или K;

X₇ представляет собой D или A;

X₈ представляет собой D или E, и

X₉ представляет собой K или E.

CDR3

ASGVYSFDY (SEQ ID NO: 13)

Иллюстративные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 показаны на Фиг. 1 и Фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению содержит последовательность CDR1 любой из SEQ ID NO: 1-6. В конкретном варианте осуществления последовательность CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению содержит последовательность CDR2 любой из SEQ ID NO: 7-12. В конкретном варианте осуществления последовательность CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 10.

Антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению содержат последовательность CDR3 SEQ ID NO: 13.

В дополнительном варианте осуществления антитело к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 4; последовательность CDR2 SEQ ID NO: 10; и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 13.

В дополнительных вариантах осуществления антитело к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению содержит любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 14-21 (Фиг. 2).

В еще одном варианте осуществления антитело к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах осуществления последовательность CDR в антителе к CD19, содержащее только тяжелые цепи, согласно данному изобретению, содержит одну или две аминокислотные замены относительно последовательности CDR1, CDR2 и/или CDR3 или набора последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 в любой из SEQ ID NO: 1-13 (Фиг. 1). В некоторых вариантах осуществления антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, будут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи с по меньшей мере около 85% идентичности, по меньшей мере 90% идентичности, по меньшей мере 95% идентичности, по меньшей мере 98% идентичности, или по меньшей мере 99% идентичности с любыми последовательностями вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 21 (показанные на Фиг. 2).

В некоторых вариантах осуществления предлагаются биспецифичные или мультиспецифичные антитела, которые могут иметь любую из конфигураций, обсуждаемых в данном документе, включая, без ограничения, биспецифичную трехцепочечную антителоподобную молекулу. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело может содержать по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, обладающую специфичностью связывания для CD19, и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую специфичность связывания для белка, отличного от CD19. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело может содержать пару тяжелая цепь/легкая цепь, которая обладает специфичностью связывания для первого антигена, и тяжелую цепь из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего Fc-часть, содержащую СН2 и/или СН3 и/или домены СН4, в отсутствие домена СН1, и антигенсвязывающего домена, который связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп первого антигена. В одном конкретном варианте осуществления биспецифичное антитело содержит пару тяжелая цепь/легкая цепь, которая обладает специфичностью связывания для антигена на эффекторной клетке (например, белок CD3 на Т-клетке), а тяжелая цепь из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержит антигенсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания для CD19.

В некоторых вариантах осуществления, когда белок согласно изобретению представляет собой биспецифичное антитело, одно плечо антитела (один связывающий фрагмент) является специфичным для CD19 человека, в то время как другой фрагмент может быть специфичным для клеток-мишеней, ассоциированных с опухолью антигенов, целевых антигенов, например, интегринов и т. д., антигенов патогенов, белков контрольных точек и тому подобное. Клетки-мишени конкретно включают раковые клетки, включая, без ограничения, клетки из гематологических опухолей, например, В-клеточных опухолей, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления белок согласно изобретению содержит любую из последовательностей Fc-области, представленных ниже, которая соответствует нативной последовательности человеческого IgG1, нативной последовательности человеческого IgG4, вариантной последовательности человеческого IgG1, которая была сконструирована для снижения одной или более эффекторных функций, и вариантной последовательности человеческого IgG4, которая была сконструирована для снижения одной или более эффекторных функций.

Таблица 1: Последовательности Fc-областей человеческих IgG1 и IgG4.

Человеческий IgG1
(UniProt № P01857) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 26) Человеческий IgG4
(UniProt № P01861) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO: 27) Человеческий IgG1 с молчащей мутацией (Fc-область) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 28) Человеческий IgG4 с молчащей мутацией (Fc-область) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO: 29)

Различные форматы биспецифичных антител находятся в пределах объема изобретения, включая без ограничения одноцепочечные полипептиды, двухцепочечные полипептиды, трехцепочечные полипептиды, четырехцепочечные полипептиды и кратные им полипептиды. Биспецифичные антитела в данном документе, в частности, включают биспецифичные антитела Т-клеткам, связывающиеся с CD19, который селективно экспрессируются на зрелых В-клетках, и CD3 (антитела к CD19 x CD3). Такие антитела индуцируют сильное опосредованное Т-клетками уничтожение клеток, экспрессирующих CD19.

Получение антител к CD19, содержащих только тяжелые цепи

Антитела, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению могут быть получены при помощи методов, известных в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, в данном случае продуцируются трансгенными животными, включая трансгенных мышей и крыс, предпочтительно крыс, у которых эндогенные гены иммуноглобулина нокаутированы или отключены. В предпочтительном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению продуцируются в UniRat™. UniRat™ имеют молчащие гены собственного эндогенного иммуноглобулина и используют транслокус тяжелой цепи иммуноглобулина человека для экспрессии разнообразного, естественно оптимизированного репертуара полностью человеческих HCAb. В то время как эндогенные локусы иммуноглобулина у крыс могут быть нокаутированы или подвергнуты сайленсингу с использованием различных технологий, в UniRat™ для инактивации эндогенного J-локуса тяжелой цепи крысы, локуса Cκ легкой цепи и локуса Cλ легкой цепи была использована технология цинкового пальца (эндо) нуклеазы (ZNF). Конструкции ZNF для микроинъекции в ооциты могут продуцировать нокаутные (KO) линии IgH и IgL. Подробнее см., например, Geurts et al., 2009, Science 325:433. Characterization of Ig heavy chain knockout rats has been reported by Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941. Преимущества технологии ZNF заключаются в том, что негомологичное присоединение конца для подавления гена или локуса посредством делеций размером до нескольких т.п.н. также может обеспечить сайт-мишень для гомологичной интеграции (Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67). Человеческие антитела, содержащие только тяжелые цепи, продуцируемые в UniRat ™, называются UniAbs^TM и могут связывать эпитопы, которые нельзя атаковать с помощью обычных антител. Их высокая специфичность, сродство и небольшой размер делают их идеальными для моно- и поли-специфичных применений.

В дополнение к UniAbs^TM, в частности, в данный документ включены антитела, содержащие только тяжелые цепи, лишенные верблюжьего каркаса и мутаций VHH, и их функциональные области VH. Такие антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно, например, продуцировать у трансгенных крыс или мышей, которые содержат полностью человеческие генные локусы, содержащие только тяжелые цепи, как описано, например, в WO 2006/008548, но также можно использовать других трансгенных млекопитающих, таких как кролик, морская свинка, крыса, предпочтительными являются крысы и мыши. Антитела, содержащие только тяжелые цепи, включая их функциональные фрагменты VHH или VH, также могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК путем экспрессии кодирующей нуклеиновой кислоты в подходящем эукариотическом или прокариотическом хозяине, включая, например, клетки млекопитающих (например, клетки СНО), кишечную палочку или дрожжи.

Домены антител, содержащих только тяжелые цепи, сочетают в себе преимущества антител и низкомолекулярных лекарственных средств: могут быть моно- или мультивалентными; имеют низкую токсичность; и экономически выгодны в производстве. Из-за их небольшого размера эти домены легко вводить, включая пероральное или местное введение, они характеризуются высокой стабильностью, включая желудочно-кишечную стабильность; и их период полужизни может быть адаптирован к желаемому применению или показаниям. Кроме того, домены VH и VHH HCAb могут быть получены экономически эффективным способом.

В конкретном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению, включая UniAbs^TM, имеют нативный аминокислотный остаток в первом положении области FR4 (аминокислотное положение 101 согласно системе нумерации Kabat), замещенный другим аминокислотным остатком который способен разрушать экспонированный на поверхности гидрофобный пэтч, содержащий или связанный с нативным аминокислотным остатком в этом положении. Такие гидрофобные пэтчи обычно скрыты на границе с константной областью легкой цепи антитела, но становятся открытыми для поверхности в HCAb и, по меньшей мере, частично, для нежелательной агрегации и ассоциации легкой цепи HCAb. Замещенный аминокислотный остаток предпочтительно является заряженным и, более предпочтительно, является положительно заряженным, таким как лизин (Lys, K), аргинин (Arg, R) или гистидин (His, H), предпочтительно аргинин (R). В предпочтительном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, полученные от трансгенных животных, содержат мутацию Trp-Arg в положении 101. Полученные HCAb предпочтительно имеют высокую антигенсвязывающую аффинность и растворимость в физиологических условиях в отсутствие агрегации.

В рамках данного изобретения были идентифицированы человеческие антитела IgG, содержащие только тяжелые цепи, к CD19 с уникальными последовательностями от животных UniRat^TM (UniAb^TM), которые связывают CD19 человека в ИФА связывания белка и клеток (рекомбинантный внеклеточный домен CD19). Выявленные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) (см. Фиг. 2) являются положительными в отношении связывания белка CD19 человека и/или в отношении связывания с CD19+ клетками, и все они отрицательны в отношении связывания с клетками, которые не экспрессируют CD19.

Описанные в данном документе антитела связывают CD19-положительные линии клеток лимфомы Беркитта Daudi (ATCC® CCL-213^TM), Raji (ATCC® CCL-86 ™) и Ramos (ATCC® CRL-1596 ™), а некоторые обладают перекрестной реактивностью с белком CD19 яванского макака. Кроме того, они могут быть сконструированы для обеспечения перекрестной реактивности с белком CD19 любых видов животных, если это желательно.

Антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, такие как UniAbs^TM, в данном документе могут иметь аффинность к CD19 с Kd от около 10^-6 до около 10^-11, в том числе, без ограничения: от около 10^-6 до около 10^-10; от около 10^-6 до около 10^-9; от около 10^-6 до около 10^-8; от около 10^-8 до около 10^-11; от около 10^-8 до около 10^-10; от около 10^-8 до около 10^-9; от около 10^-9 до около 10^-11; от около 10^-9 до около 10^-10; или любое значение в этих диапазонах. Выбор аффинности может быть подтвержден биологической оценкой в отношении модуляции, например, блокирования, биологической активности CD19, включая анализы in vitro, доклинические модели и клинические испытания, а также оценку потенциальной токсичности.

Антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые связываются с неперекрывающимися эпитопами на белке CD19, например, UniAbs^TM, можно идентифицировать с помощью анализов конкурентного связывания, таких как иммуноферментные анализы (ИФА) или анализы конкурентного связывания с помощью проточной цитометрии. Например, можно использовать конкуренцию между известными антителами, связывающимися с антигеном-мишенью, и представляющим интерес антителом. Используя этот подход, можно разделить набор антител на те, которые конкурируют с эталонным антителом, и те, которые не конкурируют. Неконкурентные антитела идентифицируются как связывающиеся с отдельным эпитопом, который не перекрывается с эпитопом, связанным с эталонным антителом. Часто одно антитело иммобилизуется, антиген связывается, а второе меченое (например, биотинилированное) антитело тестируется в ИФА на способность связывать захваченный антиген. Его также можно проводить с использованием платформ поверхностного плазмонного резонанса (SPR), включая ProteOn XPR36 (BioRad, Inc), Biacore 2000 и Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences), и томограф MX96 SPR (Ibis technologies BV), а также на биослойные интерферометрические платформы, такие как Octet Red384 и Octet HTX (ForteBio, Pall Inc). Для дальнейших деталей смотрите примеры в данном документе.

Как правило, антитело «конкурирует» с эталонным антителом, если оно вызывает снижение связывания эталонного антитела с антигеном-мишенью на около 15-100%, что определено стандартными методами, такими как анализы конкурентного связывания, описанные выше. В различных вариантах осуществления относительное ингибирование составляет по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или выше.

Фармацевтические композиции, применения и способы лечения.

Другим аспектом данного изобретения является предложение фармацевтических композиций, содержащих одно или более антител согласно данному изобретению в смеси с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемые носители, используемые в данном документе, например, но не ограничиваются ими, адъюванты, твердые носители, вода, буферы или другие носители, используемые в данной области для хранения терапевтических компонентов или их комбинаций.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело, содержащее только тяжелые цепи, (например, UniAb^TM), которое связывается с CD19. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит мультиспецифичное (включая биспецифичное) антитело, содержащее только тяжелые цепи, (например, UniAb^TM) со специфичностью связывания для двух или более неперекрывающихся эпитопов на белке CD19. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит мультиспецифичное (включая биспецифичное) антитело, содержащее только тяжелые цепи, (например, UniAb^TM) со специфичностью связывания с CD19 и со специфичностью связывания с мишенью связывания на эффекторной клетке (например, мишенью связывания на Т-клетке, такой как, например, белок CD3 на Т-клетке).

Фармацевтические композиции антител, используемые в соответствии с данным изобретением, получают для хранения путем смешивания белков, имеющих желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), например, в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN ™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Фармацевтические композиции для парентерального введения предпочтительно стерильны и по существу изотоничны и произведены согласно условиям правил производства и контроля качества лекарственных средств (GMP). Фармацевтические композиции могут быть предложены в единичной дозированной форме (например, дозированной форме для единичного введения). Состав зависит от выбранного пути введения. Антитела, описанные в данном документе, могут вводиться посредством внутривенной инъекции или инфузии, или подкожно. Для инъекционного введения, антитела, описанные в данном документе, могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически-совместимых буферах для уменьшения дискомфорта в месте инъекции. Раствор может содержать носители, эксципиенты или стабилизаторы как описано выше. В качестве альтернативы, антитела могут быть лиофилизированы для смешивания с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед использованием.

Составы антител описаны, например, в патенте США № 9034324. Подобные составы могут быть использованы для антител, содержащих только тяжелые цепи, включая UniAbs^TM, согласно данному изобретению. Составы антител для подкожного введения описаны, например, в патентах US20160355591 и US20160166689.

Способы применения

Антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, мультиспецифичные антитела и фармацевтические композиции, описанные в данном документе, можно применять для лечения заболеваний и патологических состояний, характеризующихся экспрессией CD19, включая, без ограничения, патологические состояния и заболевания, описанные далее в данном документе.

CD19 представляет собой рецептор клеточной поверхности, который экспрессируется на всех В-клетках человека, но не обнаруживается на плазматических клетках. Он имеет относительно большой цитоплазматический хвост из 240 аминокислот. Внеклеточные Ig-подобные домены разделены потенциально дисульфид-связанным не-Ig-подобным доменом и сайтами присоединения N-связанных углеводов. Цитоплазматический хвост содержит по меньшей мере девять остатков тирозина возле С-конца, некоторые из которых, как было показано, фосфорилированы. Наряду с CD20 и CD22 ограниченная экспрессия CD19 в линии B-клеток делает его привлекательной мишенью для терапевтического лечения В-клеточных злокачественных новообразований. Из-за его наблюдаемой экспрессии в ряде гематологических злокачественных новообразований, CD19 является многообещающей мишенью для терапии на основе антител.

В одном аспекте антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, (например, UniAbs^TM) и фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут быть использованы для лечения гематологических злокачественных опухолей, характеризующихся экспрессией CD19, включая, без ограничения, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ДККЛ), неходжкинскую лимфому, B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) и B-клеточный острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ).

Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ДККЛ или ДВККЛ) является наиболее распространенной формой неходжкинской лимфомы среди взрослых (Blood 1997 89 (11): 3909-18), с оценкой ежегодной заболеваемости от 7 до 8 случаев на 100000 человек в год в США и Великобритании. Она характеризуется как агрессивный рак, который может возникнуть практически в любой части тела. Причины ДККЛ не совсем понятны, и он могут быть вызваны нормальными B-клетками, а также злокачественной трансформацией других типов клеток лимфомы или лейкоза. Подходы к лечению обычно включают химиотерапию и облучение, и в результате общая пятилетняя выживаемость составляет в среднем около 58 % для взрослых. Хотя некоторые моноклональные антитела продемонстрировали перспективность лечения ДККЛ, последовательная клиническая эффективность еще не была окончательно продемонстрирована. Поэтому существует большая потребность в новых способах лечения, включая иммунотерапию, для лечения ДККЛ.

В другом аспекте антитела к CD19, содержащие только тяжелые цепи, (например, UniAbs^TM) и фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут быть использованы для лечения аутоиммунных расстройств, характеризующихся вызывающими заболевание В-клетками, которые экспрессируют CD19, включая, без ограничения, системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА) и рассеянный склероз (РС).

Эффективные дозы композиций согласно данному изобретению для лечения заболевания варьируются в зависимости от многих различных факторов, включая способы введения, место назначения, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, вводятся ли другие лекарственные препараты, и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Как правило, пациент представляет собой человека, но отличные от человека млекопитающие также могут поддаваться лечению, например, домашние животные, такие как собаки, кошки, лошади и т.д., лабораторные млекопитающие, такие как кролики, мыши, крысы и т.д., и тому подобное. Для оптимизации безопасности и эффективности можно подбирать лекарственные дозировки.

Уровни дозировки могут быть легко определены обычным квалифицированным врачом и могут быть изменены при необходимости, например, при необходимости изменения реакции субъекта на терапию. Количество действующего вещества, которое можно комбинировать с материалами носителя для получения единичной лекарственной формы, варьируется в зависимости от хозяина, который поддается лечению, и конкретного способа введения. Стандартные лекарственные формы обычно содержат от около 1 мг до около 500 мг действующего вещества.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическая дозировка агента может составлять от около 0,0001 до 100 мг/кг и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг от массы тела хозяина. Например, дозировка может составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в пределах 1-10 мг/кг. Примерный режим лечения включает введение один раз каждые две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев. Терапевтические вещества согласно данному изобретению обычно вводят несколько раз. Интервалы между однократными дозами могут быть еженедельными, ежемесячными или ежегодными. Интервалы также могут быть нерегулярными, на что указывает измерение уровня терапевтического вещества в крови пациента. Альтернативно, терапевтические вещества согласно данному изобретению можно вводить в виде композиции с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полувыведения полипептида у пациента.

Как правило, композиции готовят в виде инъекционных препаратов, либо в виде жидких растворов, либо суспензий; также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, подходят для внутривенного или подкожного введения, непосредственно или после восстановления из твердой (т.е. лиофилизированной) композиции. Препарат также может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы или микрочастицы, такие как полилактид, полигликолид или сополимер, для усиления адъювантного эффекта, как описано выше. Langer, Science 249: 1527, 1990 и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Вещества согласно данному изобретению можно вводить в форме депо-инъекции или препарата имплантата, который может быть составлен таким образом, чтобы обеспечить длительное или пульсирующее высвобождение действующего вещества. Фармацевтические композиции, как правило, составлены как стерильные, практически изотонические и полностью соответствующие всем нормам Правил производства и контроля качества лекарственных средств (GMP) Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.

Токсичность антител и структур антител, описанных в данном документе, может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, путем определения LD50 (доза, летальная для 50% популяции) или LD100 (доза, летальная для 100% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектом является терапевтическим показателем. Данные, полученные из этих анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы при составлении диапазона доз, который не токсичен для применения у людей. Дозировка антител, описанных в данном документе, предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают эффективную дозу с небольшой токсичностью или без нее. Дозировка может варьироваться в пределах данного диапазона в зависимости от используемой дозы и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны индивидуально врачом с учетом состояния пациента.

Композиции для введения обычно содержат антитело или другой абляционный агент, растворенный в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Могут быть использованы различные водные носители, например, забуференный солевой раствор и тому подобное. Данные растворы являются стерильными и, как правило, не содержат нежелательных веществ. Данные композиции могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными способами стерилизации. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения их к физиологическим условиям, такие как регулирующие рН агенты и буферные агенты, регулирующие токсичность агенты и тому подобное, например ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и тому подобное. Концентрация активного агента в данных составах может варьироваться в широких пределах и будет выбираться в основном на основе объемов жидкости, вязкости, массы тела и тому подобного в соответствии с конкретным выбранным способом введения и потребностями пациента (например, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980) и Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)).

Также в объем изобретения входят наборы, содержащие активные агенты и их составы согласно изобретению и инструкции по их применению. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный компонент, например, химиотерапевтический препарат и др. Наборы, как правило, включают этикетку, указывающую на предполагаемое применение содержимого набора. Термин «этикетка», используемый в данном документе, включает любые письменные или записанные материалы, поставляемые в комплекте или вместе с ним, или иным образом сопровождающие набор.

Теперь, когда изобретение полностью описано, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от сущности или объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Связывание CD19 клеток

Связывание с CD19-положительными клетками оценивали с помощью проточной цитометрии (Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore) с использованием линии клеток Daudi (ATCC). Вкратце, 100000 клеток-мишеней окрашивали серией разведений очищенного UniAbs^TM в течение 30 минут при 4 °С. После инкубации клетки дважды промывали буфером для проточной цитометрии (1X PBS, 1 % БСА, 0,1 % NaN₃) и окрашивали козьим F(ab’)₂ антителом к человеческому IgG, конъюгированным с R-фикоэритрином (РЕ) (Southern Biotech, кат. № 2042-09) для обнаружения связанных с клетками антител. После 20-минутной инкубации при 4°С клетки дважды промывали буфером для проточной цитометрии и затем измеряли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) с помощью проточной цитометрии. Значения EC50 рассчитывали с использованием GraphPad Prism 7. Связывание с CD19-положительными клетками яванского макака определяли с использованием того же протокола со следующими модификациями: клетки-мишени представляли собой клетки CHO, стабильно трансфицированные для экспрессии внеклеточного домена CD19 яванского макака, и каждое антитело тестировали в одной концентрации (~ 1,7 мкг/мл) поэтому значения EC50 не были рассчитаны.

Пример 1. Генетически сконструированные крысы, экспрессирующие антитела, содержащие только тяжелые цепи

Локус IgH человека и крысы был сконструирован и собран из нескольких частей. Это включало модификацию и объединение генов С-области крысы ниже J_H человека, а затем добавление выше области V_H6 –D-сегмента человека. Два BAC с отдельными кластерами генов V_H человека [BAC6 и BAC3] затем совместно вводили с помощью BAC, называемого Georg, кодирующим собранную и модифицированную область, включающую V_H6 человека, все D, все J_H, и модифицированный Cγ2a/1/2b (ΔC_H1) крысы.

Были получены трансгенные крысы, несущие искусственные локусы иммуноглобулинов тяжелой цепи в неупорядоченной конфигурации. В генах IgG2a(ΔC_H1)., IgG1(ΔC_H1)., IgG2b(ΔC_H1) отсутствует сегмент C_H1. Гены константной области IgE, IgA и 3’-энхансер были включены в BAC Georg. ОТ-ПЦР и анализ сыворотки (ИФА) трансгенных крыс выявили продуктивную перестройку локусов трансгенных иммуноглобулинов и экспрессию в сыворотке только антител, содержащие только тяжелые цепи, различных изотипов. Трансгенные крысы скрещивались с крысами с мутированными эндогенными локусами тяжелой цепи и легкой цепи, ранее описанными в публикации патента США 2009/0098134 A1. Анализ таких животных продемонстрировал инактивацию экспрессии тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина крысы и высокий уровень экспрессии антител, содержащих только тяжелые цепи, с вариабельными областями, кодируемыми генами V, D и J человека. Иммунизация трансгенных крыс приводила к получению сывороточных ответов с высоким титром антигенспецифичных антител, содержащих только тяжелые цепи. Эти трансгенные крысы, экспрессирующие антитела, содержащие только тяжелые цепи, с областью VDJ человека, были названы UniRats^TM.

Пример 2. Иммунизация

ДНК-иммунизация CD19.

Шесть животных UniRat были иммунизированы в соответствии со стандартным протоколом иммунизации на основе ДНК с использованием вектора экспрессии, который содержит последовательность CD19. После иммунизации в течение 45 дней у крыс собирали сыворотку для определения сывороточных титров.

Пример 3. Связывание с CD19-экспрессирующими линиями клеток

На Фиг.4 приведена активность связывания с мишенью описанных антител к CD19, содержащих только тяжелые цепи, (HCAb). В столбце 1 показан ИН клона HCAb. В столбце 2 показано связывание с клетками Raji, измеренное в виде кратности сигнала по отношению к фоновому сигналу СИФ. В столбце 3 показано связывание с клетками Ramos, измеренное в виде кратности сигнала по отношению к фоновому сигналу СИФ. В столбце 4 показано связывание с клетками СНО, стабильно экспрессирующими человеческий CD19, измеренное в виде кратности сигнала по отношению к фоновому сигналу СИФ. В столбце 5 показано связывание с клетками СНО, которые не экспрессируют белок CD19, измеренное в виде кратности сигнала по отношению к фоновому сигналу СИФ.

Пример 4. Опосредованное биспецифичным антителами уничтожение человеческих опухолевых клеток Daudi путем перенаправления активированных Т-клеток

CD19-положительную линию опухолевых клеток метили красителем и инкубировали с возрастающими количествами биспецифичных антител в присутствии предварительно активированных Т-клеток человека. Биспецифичное антитело состоит из связывающего плеча к CD3, спаренного со связывающим доменом VH CD19, которое показано на Фиг. 5B (ИН клона: 334354). Два биспецифичных антитела к CD22xCD3 в том же формате были включены в качестве положительных контролей. Антитело отрицательного контроля содержит связывающий домен VH, который не связывается с CD19. CD22-отрицательные клетки K562 не проявляли специфического лизиса (данные не представлены).

Пример 5. Связывание белка CD19

Кинетические эксперименты для определения аффинности антигенов и антител проводили на приборе Biacore T100. мкАт к пятигистидиновой метке связывали с биосенсорным чипом CM7 с использованием стандартного связывания по амино-группам. Acro CD19 (20-291) с гистидиновой меткой (партия C52P2-7C1F1-GJ) растворяли в 200 мкл воды, затем разбавляли 1/100 и захватывали на чипе с мкАт к гистидину. Клон ИН № 334354 был протестирован при 3,6 мкМ как наивысшей концентрации в серии 3-кратных разведений. Данные соответствовали модели взаимодействия 1: 1, как показано на Фиг. 6.

Пример 6. Опухолевые модели

Описание процедур. Мышам линии NOG внутривенно прививали меченные люциферазой опухолевые клетки человека. Человеческие МКПК инъецировали через 5 суток после приживления опухоли, а на 6-й день вводили антитела. Мышам вводили внутривенные инъекции антител к CD19xCD3 и отрицательного контроля (отриц. контр.) четыре раза в неделю по 10 мкг на дозу. Опухолевую нагрузку оценивали каждые 2-4 дня на срок до 1 месяца.

Выбор животных и видов. Эксперименты проводили на мышах линии NOG, которым трансплантировали 15 миллионов человеческих МКПК.

Размеры выборки. 5 или более животных в группе подвергались воздействию опухолей и получали лечение антителам к CD19xCD3 или контрольными антителами. В целом прошлые биохимические и физиологические исследования продемонстрировали, что размер выборки из n = 4-6 животных обеспечивает адекватную статистическую мощность (т. е. 80% -ную мощность) для определения величины эффекта 1,6 станд. откл. между условиями лечения с использованием двухвыборочного t- теста с двусторонним уровнем значимости 0,05. Антитела к CD19xCD3 статистически значимо снижали рост опухоли в животных моделях, как продемонстрировано данными на Фиг. 7.

Пример 7. Модель цитотоксичности in vitro

CD19-положительную (CD19+) линию опухолевых клеток метили красителем и инкубировали с возрастающими количествами биспецифичных антител (CD19xCD3) в присутствии предварительно активированных Т-клеток. После инкубации в течение 6 часов анализировали флуоресценцию от высвобождения красителя. Биспецифичное антитело состоит из связывающего плеча к CD3 (семейство F2B), спаренного со связывающим доменом VH к CD19 (334354), как схематически изображено на Фиг. 5B. Были включены два других биспецифичных антитела: а) связывающее плечо к CD3 (семейство F1F), спаренное со связывающим доменом VH к CD19 (334354) и b) Blincyto. Результаты представлены на Фиг. 8, и демонстрируют, что процент лизиса клеток-мишеней увеличивается в зависимости от концентрации для всех биспецифичных антител, которые были протестированы. Процент лизиса клеток-мишеней увеличивался с большей скоростью в зависимости от концентрации антител для CD19(Id334354)xCD3F2B and CD19(Id334354)xCD3F1F, по сравнению с Blincyto. Максимальный лизис был одинаковым для CD19(Id334354)xCD3F2B, CD19(Id334354)xCD3F1F, и Blincyto.

Пример 8. Цитокиновая модель in vitro

CD19-положительную (CD19 +) линию опухолевых клеток инкубировали с возрастающими количествами биспецифичных антител (CD19xCD3) в присутствии покоящихся Т-клеток в течение 24. Супернатанты после инкубации собирали и измеряли в отношении цитокинов. Биспецифичное антитело состоит из связывающего плеча к CD3 (семейство F2B), спаренного со связывающим доменом VH к CD19 (334354), как схематически изображено на Фиг. 5B. Были включены два других биспецифичных антитела: а) связывающее плечо к CD3 (семейство F1F), спаренное со связывающим доменом VH к CD19 (334354) и b) Blincyto. Результаты представлены на Фиг. 9, и демонстрируют, что количество высвобождаемых цитокинов варьировалось для каждого антитела и увеличивалось в зависимости от концентрации. В частности, биспецифичное антитело CD19(Id 334354)xCD3F2B продемонстрировало самый низкий уровень высвобождения цитокинов. Blincyto продемонстрировало более высокий уровень высвобождения цитокинов в зависимости от концентрации антител, а биспецифичное антитело CD19(Id 334354)xCD3F1F продемонстрировало самые высокие уровни высвобождения цитокинов. Максимальная продукция цитокинов была наивысшей для CD19(Id334354)xCD3F1F, за которой следует Blincyto, и самой низкой для CD19(Id334354)xCD3F2B.

Хотя в данном описании были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления данного изобретения, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что такие варианты осуществления представлены только в качестве примера. Множество вариаций, изменений и замен будут очевидны специалистам в данной области техники без отхода от объема и сущности данного изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты осуществления данного изобретения, описанные в данном документе, могут применяться при практической реализации данного изобретения. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем изобретения и, что таким образом охватываются способы и структуры в пределах объема данной формулы изобретения и их эквивалентов.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> TENEOTWO, INC., US.

<120> АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ ТОЛЬКО ТЯЖЕЛЫЕ ЦЕПИ, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С

CD19

<130> TNO-0013-WO

<140> PCT/US2019/042633

<141> 19.07.2019

<150> 62/701281

<151> 20.07.2018

<160> 30

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Trp

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 4

Gly Phe Ser Phe Ser Asp Phe Trp

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 5

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 7

Ile Asn Gln Asp Gly Ser Asp Lys

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 8

Met Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 9

Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 10

Ile Ser Gln Ala Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 11

Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 12

Ile Asn Lys Ala Gly Ser Glu Glu

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 13

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 14

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Gln Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Asp Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Met Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Leu

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gln Ala Gly Ser Glu Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala His Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Asn Lys Ala Gly Ser Glu Glu Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Glu Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Val Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /заменить="Ser"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> /заменить="Asn"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> /заменить="Phe"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(8)

<223> /примечание="Вариантные остатки, приведенные в

последовательности, не являются

предпочтительными по сравнению с приведенными в сносках

для вариантных положений"

<400> 22

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> /заменить="Met"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> /заменить="Ser" или "Lys"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /заменить="Lys"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> /заменить="Ala"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> /заменить="Glu"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)..(8)

<223> /заменить="Glu"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(8)

<223> /примечание="Вариантные остатки, приведенные в

последовательности, не являются

предпочтительными по сравнению с приведенными в сносках

для вариантных положений"

<400> 23

Ile Asn Gln Asp Gly Ser Asp Lys

1 5

<210> 24

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

пептид»

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 330

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 26

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 27

<211> 327

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 27

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 28

<211> 330

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 29

<211> 327

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 29

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 30

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(50)

<223> /примечание=«Эта последовательность может охватывать 1–10

повторяющихся единиц «Gly Gly

Gly Gly Ser’»

<400> 30

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser

50

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу, содержащему только тяжелые цепи, которое связывается с CD19. Также раскрыты мультиспецифичное антитело, которое связывается с CD19 и имеет аффинность связывания с CD3, фармацевтическая композиция, содержащая указанные антитела, способ лечения заболеваний и состояний, характеризующихся экспрессией CD19, в том числе В-клеточного расстройства, применение указанных антител для лечения В-клеточного расстройства и набор для лечения заболевания или расстройства, которые характеризуются экспрессией CD19. Изобретение обеспечивает антитела, содержащие только тяжелые цепи, с аффинностью связывания к CD19. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 8 пр.

1. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое связывается с CD19, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 10 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 13.

2. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, по п. 1, в котором указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 присутствуют в человеческом каркасе.

3. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, по п. 1, которое содержит последовательность константной области тяжелой цепи в отсутствие последовательности CH1.

4. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, по любому из пп. 1-3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17.

5. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, по любому из пп.1-3, содержащее последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17.

6. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, которое связывается с CD19, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:

последовательность CDR1 SEQ ID NO: 4, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 10 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 13 в каркасе VH человека.

7. Мультиспецифичное антитело, которое связывается с CD19 и имеет аффинность связывания с CD3, содержащее антитело, содержащее только тяжелые цепи, по любому из пп. 1-6 и связывающее CD3 плечо.

8. Мультиспецифичное антитело, по п. 7, которое является биспецифичным.

9. Мультиспецифичное антитело по п. 7, которое имеет аффинность связывания с эффекторной клеткой.

10. Мультиспецифичное антитело по п. 7, которое имеет аффинность связывания с Т-клеточным антигеном.

11. Фармацевтическая композиция для лечения В-клеточных расстройств, которые характеризуются экспрессией CD19, содержащая антитело по любому из пп. 1-10 в эффективном количестве.

12. Способ лечения В-клеточного расстройства, характеризующегося экспрессией CD19, включающий введение субъекту с указанным расстройством антитела по любому из пп. 1-10 или фармацевтической композиции по п. 11.

13. Способ по п. 12, в котором расстройство представляет собой диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДККЛ).

14. Способ по п. 12, в котором расстройство представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ).

15. Способ по п. 12, в котором расстройство представляет собой неходжкинскую лимфому (НХЛ).

16. Способ по п. 12, в котором В-клеточное расстройство представляет собой системную красную волчанку (СКВ).

17. Способ по п. 12, в котором расстройство представляет собой ревматоидный артрит (РА).

18. Способ по п. 12, в котором расстройство представляет собой рассеянный склероз (РС).

19. Способ лечения заболеваний и состояний, характеризующихся экспрессией CD19, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективной дозы антитела по любому из пп. 1-10 или фармацевтической композиции по п. 11.

20. Применение антитела по любому из пп. 1-10 при получении фармацевтической композиции для лечения B-клеточных расстройств, которые характеризуются экспрессией CD19.

21. Антитело по любому из пп. 1-10 или фармацевтическая композиция по п. 11 для применения в лечении B-клеточных расстройств, которые характеризуются экспрессией CD19.

22. Набор для лечения заболевания или расстройства, которые характеризуются экспрессией CD19, у нуждающегося в этом индивидуума, содержащий антитело по любому из пп. 1-10 или фармацевтическую композицию по п. 11 и инструкции по применению.

23. Набор по п. 22, дополнительно содержащий по меньшей мере один дополнительный реагент.

24. Набор по п. 23, в котором по меньшей мере один дополнительный реагент включает химиотерапевтическое лекарственное средство.