Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов Советский патент 1991 года по МПК G01N1/28 

1

(21)4345976/14

(22)18.12.87

(46) 30.05.91 . Бюл. I 20

(71)Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусствен- ных органов

(72)А.Н.Пыпин и К.М.Мануйлов

(53)616-0.84.9(088.8)

(56)Петрова И.В. и др. Стандартизированные методы обследования иммунной системы человека. П., 1984.

(54)(ПОПОН ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ

(57)Изобретение относится к области

медицины, а именно к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности способа. Цель достигается тем, что инкубащда нейтрофилов проводят с предварительно инактнвирован- ными микроорганизмами. При этом для инактивации используют 10%-ный раствор гЬормалина, который смешивают с суспензией микроорганизмов в соотношении 1:10. Затем микроорганизмы перед инкубацией обрабатывают раствором анилинового черного в течение 58-60 мин при 96-98вС. Способ повышает точность определения фагоцитоза до 1%.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Выраженную на агаре Хптингера однодневную культуру микроорганизмов смывают Физиологическим раствором, доводят концентрацию микробов с помощью физраствора но стандарту мутности микробов до 1x10 р 1,0 мл и центрифугируют 35 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 5,0 мл физиологического раствора. Затем к суспензии микроорганизмов добавляют формалин до конечной концентрации 10% и выдерживают при комнатной температуре 3-4 ч.

После этого суспензию убитых Лор- малином микроорганизмов центрифуги руют 35 мин при 3000 об/мин. К осадку микробов добавляют 5,0 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и отмывают путем центрифугирования (35 мин при 3000 об/мин). Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку убитых и отмытых микроорганизмов добавляют 5,0 мл дистиллированной воды и ресуспендируют. Затем к суспензии гшкробов добавляют 1,0 мл насыщенного водного раствора анилинового черного, тщательно перемешивают и ставят в водяную баню на 60 мин при +9Н0С, перемешивая 1 раз в 10 мин. После этого суспензию микробов вьщерживают еще 30 мин при ком-1 натной температуре, а затем центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин.

Осадок окрашенных микробов трижды отмывают от лишней краски дистиллированной водой с помощью центрифугирования (при 3000 об/мин в течение

tf

С

оэ ел

00

J

5

35 сут) . К осадку окрашенных и отмытых микроорганизмов добавляют физологический раствор до первоначального объема, восстанавливая тем самым начальную ко1щентрацию микробов (1x10 в 1,0 мл), и ресуспенди- рутот. Приготовленную таким образом суспензию окрашенных микроорганизмо используют в дальнейшем для постановки реакции фагоцитоза. Хранят ее в холодильнике при +4-+6°С или в морозилке (при температуре ниже нуля) в течение длительного времени (до 6 мес и более).

Проведение реакции фагоцитоза следующее.

R силоконовую стерильную пробирку наливают 0,15 мл стабилизированной крови и добавляют к ней 0,05 мл суспензии окрашенных микроорганизмов с концентрацией 1x10 микробных тел в 1,0 мл. При этом соотношение, фагоцитов и микробов соответствует 1:60-80. Смесь инкубируют в водяной бане, периодически перемешивая, встряхивая пробирки, в течение 30 ми при +37°С. После этого каплю смеси наносят на предварительно обезжиренное смесью Никифорова предметное стекло и делают мазок. Мазок высушивают на иочдухе и фиксируют метиловым спиртом. Мазки можно окрашивать. Окрашивание мазка проводят 2%-ным водным раствором метилового зеленого в течение 15 мин. При подаче ядра фагоцитов становятся ярко-зленого цвета, цитоплазма - бледно-срого, а микробы - черного цвета.

Окрашенные мазки тщательно промывают проточной водой, а затем докрашивают О, Г/ -ным водным раствором эозина в течение 3 с, в результате чего цитоплазма фагоцита становится бледно-розового цвета, ядра клеток остаются ярко-зеленого, а микробы - черного цвета. После этого мазок промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Учет полученных результатов проводят под иммерсионной системой микроскопа. Фагоцитарную

Составитель Л Редактор И.Касарда Техред Л.Олий

5

0

5

0

5

0

5

0

активность нейтрофилов оценивают по проценту фагоцитоза (количество фагоцитирующих нейтрофилов из 100), фагоцитарному числу (среднее количество микробов, поглощенных одним нейт- рофилом), фагоцитарной емкости (число активных нейтрофилов в 1 мкл крови и абсолютному фагоцитарному показателю (общее число микроорганизмов, поглощенных всеми нейтрофилами в 1 млк кротки) .

Пример 1. Кровь от больного инкубируют с суспензией микроорганизмов, подготовленных указанным способом. Готовят мазки, которые микроскопируют, и определяют показатели фагоцитоза. Количество лейкоцитов равно 8570, нейтрофилов - 7/13, процент фагоцитоза равен 75±0,08, фагоцитарное число 6±0,01, фагоцитарная емкость 533510,107 и абсолютный фагоцитарный показатель 32009i.O,1 51.

Таким образом, предлагаемый способ повышает точность до 1% но сравнению с прототипом (20%).

Формула изобретения

Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов путем забора кропи, ее инкубации с микроорганизмами, предварительно инактилирован- ными, приготовления мазка, его окраски и определения активности по наличию микроорганизмов в клетке, о т - л и ч а ю 14 и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, инактивацию микроорганизмов проводят в течение 3-5 ч в среде, содержащей раствор формалина и суспензию микроорганизмов в соотношении 1:10, при этом перед инкубацией микроорганизмы дополнительно обрабатывают раствором анилинового черного в течение 58-60 мин при 96-98°С, а зафиксированные мазки крови последовательно окрашивают 2%-ным водным раствором метилового зеленого в течение 15-20 мин и 0,1%-ным водным раствором эозина в течение 3-5 с.

Корректор Н.Репская