Биофармацевтические композиции и связанные с ними способы Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/00 A61P35/00 

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и полностью включен сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно изобретению, описанному здесь, предложены композиции, содержащие антигенсвязывающие белки против ВСМА (В-клеточный антиген созревания), и связанные с ними способы лечения заболеваний или расстройств, опосредованных ВСМА.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ВСМА (CD269 или TNFRSF17) является представителем суперсемейства рецепторов TNF. Он представляет собой негликозилированный интегральный мембранный рецептор лигандов BAFF и APRIL. Лиганды ВСМА могут также связываться с дополнительными рецепторами: с TACI (Transmembrane Activator and Calcium modulator and cyclophilin ligand Interactor [трансмембранный активатор, взаимодействующий с кальциевым модулятором и лигандом циклофилина]), связывающимся с APRIL и BAFF; а также с BAFF-R (рецептором BAFF или BR3), демонстрирующим ограниченную, но высокую аффинность в отношении BAFF. Вместе взятые, эти рецепторы и их соответствующие лиганды регулируют различные аспекты гуморального иммунитета, развития и гомеостаза В-клеток.

Обычно экспрессия ВСМА ограничена В-клеточной линией и, согласно сообщениям, повышена при конечной дифференцировке В-клеток. ВСМА экспрессируют человеческие плазмобласты, плазматические клетки миндалин, селезенки и костного мозга, а также В-клетки памяти, расположенные в миндалинах, и В-клетки герминативных центров, имеющие фенотип с низкой экспрессией TACI-BAFFR (Darce et al., 2007). ВСМА практически отсутствует на наивных В-клетках и В-клетках памяти (Novak et at, 2004а и b). Антиген ВСМА экспрессирован на клеточной поверхности, благодаря чему он доступен для антител, а также экспрессирован в комплексе Гольджи. Исходя из его профиля экспрессии, сигналы ВСМА, обычно связанные с выживанием и пролиферацией В-клеток, важны на поздних стадиях дифференцировки В-клеток, а также для выживания длительно живущих костномозговых плазматических клеток (O'Connor et al., 2004) и плазмобластов (Avery etal., 2003). Кроме того, поскольку ВСМА связывается с APRIL с высокой аффинностью, сигнальная система BCMA-APRIL, предположительно, доминирует на поздних стадиях дифференцировки В-клеток и, возможно, является наиболее важным физиологическим взаимодействием.

Согласно сообщениям, экспрессия ВСМА (как транскрипта, так и белка) коррелирует с прогрессированием заболевания при различных В-клеточных расстройствах, включая В-клеточные опухоли, такие как множественная миелома (ММ). ММ представляет собой клональную В-клеточную опухоль, возникающую в виде множества очагов в костном мозге перед ее распространением на циркулирующую кровь, либо de novo, либо в результате прогрессирования моноклональной гаммапатии неопределенной (или неизвестной, или неясной) значимости (MGUS). Она обычно характеризуется повышением парапротеина и активности остеокластов, а также гиперкальциемией, цитопенией, дисфункцией почек, повышением вязкости крови и периферической нейропатией. Кроме того, часто происходит снижение уровней нормальных антител и числа нейтрофилов, что приводит к жизнеугрожающей восприимчивости к инфекциям. ВСМА вовлечен в рост и выживание миеломных клеточных линий in vitro (Novak etal, 2004, и Moreaux etal., 2004).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиция, содержащая изомеризованный вариант антитела против ВСМА, где изомеризованный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ IDNO: 6, где композиция содержит 25% или менее изомеризованного варианта.

Композиция, содержащая окисленный вариант антитела против ВСМА, где окисленный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 40% или менее окисленного варианта.

Композиция, содержащая антитело против ВСМА, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 0,1-25% изомеризации по положению D103 в CDRH3.

Композиция, содержащая антитело против ВСМА, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 0,1-40% окисления по положению М34 в CDRH1.

Композиция, содержащая антитело против ВСМА, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 0,1-25% изомеризации по положению D103 в CDRH3.

Композиция, содержащая антитело против ВСМА, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 0,1-40% окисления по положению М34 в CDRH1.

Композиция, содержащая конъюгат антитела против ВСМА с лекарственным средством (ADC), где: процент DL2 составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%; процент DL4a составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%; процент DL4b составляет по меньшей мере приблизительно 5%, от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%; процент DL6 составляет по меньшей мере приблизительно 10%, от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20%; и/или DL8 составляет по меньшей мере приблизительно 1%, от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

Композиция, содержащая конъюгат антитела против ВСМА с лекарственным средством (ADC), где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 представлено схематичное изображение неоднородной смеси DL-разновидностей в композиции ADC.

На ФИГ. 2 представлено типичное описание HIC-пиков (хроматографии гидрофобного взаимодействия) для определения распределения DAR (отношение лекарственного средства к антителу) в композиции ADC.

На ФИГ. 3 показано влияние среднего DAR композиции ADC на объем опухоли в ксенотрансплантационной модели.

На ФИГ. 4 представлена типичная cIEF (электрофорез в геле с капиллярным изоэлектрическим фокусированием)-электрофореграмма белантамаба.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно изобретению, описанному здесь, предложены композиции, содержащие антигенсвязывающие белки против ВСМА, и связанные с ними способы лечения заболеваний или расстройств, опосредованных ВСМА. Следует понимать, что композиция, содержащая антитела против ВСМА, как описано здесь, может также быть названа популяцией антител против ВСМА, как описано здесь; эти фразы являются взаимоз аме няе мыми.

Антигенсвязывающие белки против ВСМА

Антигенсвязывающий белок против ВСМА в композициях, описанных здесь, может быть полезен в лечении или предотвращении различных заболеваний, опосредованных ВСМА, включая, например, опухоли, опосредованные В-клетками, такие как лимфомы и множественная миелома. Антигенсвязывающий белок против ВСМА, описанный здесь, может связываться с человеческим ВСМА, например, человеческим ВСМА, содержащим аминокислотную последовательность, которой соответствуют регистрационный номер в GenBank Q02223.2 или гены, кодирующие человеческий ВСМА, по меньшей мере на 90 процентов гомологичные или по меньшей мере на 90 процентов идентичные ему.

При использовании здесь термин «антигенсвязывающий белок» относится к антителам, фрагментам антител и другим белковым конструкциям, способным связываться с ВСМА, например, человеческим ВСМА. Антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению может содержать вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи по изобретению, которые могут быть форматированы с получением структуры естественного антитела или его функционального фрагмента или эквивалента. Таким образом, антигенсвязывающий белок по изобретению может содержать области V_H по изобретению, форматированные с получением полноразмерного антитела, (Pab')2-фрагмента, Fab-фрагмента или их эквивалента (такого как scFv, би-, три- или тетратела, TandAb и так далее) в паре с подходящей легкой цепью. Антитело может представлять собой IgG1, IgG2, IgG3, или IgG4, или IgM, IgA, IgE, или IgD, или их модифицированный вариант.Соответствующим образом может быть выбран константный домен тяжелой цепи антитела. Константный домен легкой цепи может представлять собой константный домен каппа или лямбда. Кроме того, антигенсвязывающий белок может содержать модификации всех классов, например, димеры IgG, Fc-мутанты, которые более не связываются с Fc-рецепторами или не опосредуют связывание с C1q. Антигенсвязывающий белок может также представлять собой химерное антитело описанного в WO 86/01533 типа, содержащее антигенсвязывающую область и неиммуноглобулиновую область.

В другом аспекте изобретения антигенсвязывающий белок может представлять собой dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диатело, триатело, тетратело, миниантитело или минитело. В одном аспекте настоящего изобретения антигенсвязывающий белок может представлять собой полностью человеческое, гуманизированное или химерное антитело. В другом аспекте антигенсвязывающий белок представляет собой гуманизируемое антитело. В одном аспекте изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой моноклональное антитело.

Химерные антигенные рецепторы (CAR) были разработаны как искусственные Т-клеточные рецепторы для получения Т-клеток с новой специфичностью без необходимости связывания с комплексами МНС и антигенных пептидов. Эти синтетические рецепторы могут содержать мишень-связывающий домен, соединенный с одним или более чем одним сигнальным доменом посредством гибкого линкера в единой слитой молекуле. Мишень-связывающий домен может быть использован для направления Т-клеток на определенные мишени на поверхности патологических клеток, а сигнальные домены содержат молекулярные механизмы, обеспечивающие активацию и пролиферацию Т-клеток. Гибкий линкер, проходящий через Т-клеточную мембрану (то есть образующий транс мембранный домен) может обеспечить возможность представления мишень-связывающего домена CAR на клеточной мембране. CAR могут успешно позволять перенаправлять Т-клетки против антигенов, экспрессированных на поверхности клеток различных опухолей, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena etal, 2010, Blood, 116(7): 1035-44). В одном аспекте изобретения антигенсвязывающий белок против ВСМА может включать химерный антигенный рецептор. В другом аспекте CAR может содержать связывающий домен, транс мембранный домен и внутриклеточный эффекторный домен.

Типичные антигенсвязывающие белки против ВСМА и способы их получения раскрыты в международной публикации № WO 2012/163805, полностью включенной сюда посредством ссылки. Дополнительные типичные антигенсвязывающие белки против ВСМА включают описанные в WO 2016/014789, WO 2016/090320, WO 2016/090327, WO 2016/020332, WO 2016/079177, WO 2014/122143, WO 2014/122144, WO 2017/021450, WO 2016/014565, WO 2014/068079, WO 2015/166649, WO 2015/158671, WO 2015/052536, WO 2014/140248, WO 2013/072415, WO 2013/072406, WO 2014/089335, US 2017/165373, WO 2013/154760 и WO 2017/051068, каждая из которых полностью включена сюда посредством ссылки.

В другом воплощении антигенсвязывающий белок против ВСМА, описанный здесь, может ингибировать связывание BAFF и/или APRIL с рецептором ВСМА. В другом воплощении антигенсвязывающие белки против ВСМА, описанные здесь, могут быть способны к связыванию с FcγRIIIA или способны к эффекторной функции, опосредованной FcγRIIIA.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок против ВСМА содержит антитело («антитело против ВСМА»). В другом воплощении антигенсвязывающий белок против ВСМА содержит моноклональное антитело. При использовании здесь термин «антитело» относится к молекулам с иммуноглобулиноподобным доменом (например, IgG, IgM, IgA, IgD или IgE) и может включать моноклональные, рекомбинантные, поликлональные, химерные, человеческие и гуманизированные молекулы данного типа. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием клона эукариотических клеток или прокариотических клеток, экспрессирующих антитело. Моноклональные антитела могут также быть получены с использованием эукариотической клеточной линии, которая может рекомбинантным образом экспрессировать тяжелую цепь и легкую цепь антитела, поскольку в ее клетки введены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие указанные тяжелую цепь и легкую цепь антитела. Типичные методы получения антител из различных эукариотических клеточных линий, таких как клетки яичника китайского хомячка, гибридомы или иммортализованные клетки, вырабатывающие антитела и имеющие происхождение от животного (например, человека), хорошо известны специалистам в данной области.

Антитело может иметь происхождение, например, от крысы, мыши, примата (например, яванского макака, обезьяны Старого Света или человекообразной обезьяны), человека или других источников, таких как нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулу антитела, полученные с применением молекулярно-биологических методик, известных специалистам в данной области.

Антитело может содержать константную область, которая может представлять собой константную область любого изотипа или подкласса. Константная область может представлять собой константную область изотипа IgG, например, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4 или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать одну или более чем одну модификацию, включая, например, мутантный константный домен, таким образом, что, когда антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, у этого антитела усилены эффекторные функции / ADCC и/или активация комплемента.

В одном воплощении антитело против ВСМА имеет усиленную эффекторную функцию антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активности (ADCC). Подразумевают, что при использовании здесь термин «эффекторная функция» относится к одному или более чем одному из антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активности (ADCC), ответов, опосредованных комплемент-зависимой цитотоксической активностью (CDC), Fc-опосредованного фагоцитоза и/или рециркуляции антител через FcRn-рецептор. Применительно к антителам IgG, эффекторные функции могут включать ADCC, a ADCP может быть опосредован взаимодействием константной области тяжелой цепи с семейством Fcγ-рецепторов, присутствующих на поверхности иммунных клеток. У людей они могут включать FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). Взаимодействие антигенсвязывающего белка, связанного с антигеном, и образование комплекса Fc/Fcγ может приводить к ряду эффектов, включая цитотоксичность, активацию иммунных клеток, фагоцитоз и/или высвобождение воспалительных цитокинов.

В другом воплощении антитело против ВСМА может ингибировать связывание BAFF и/или APRIL с рецептором ВСМА. В другом воплощении антитело против ВСМА может быть способно к связыванию с FcγRIIIA или может быть способно к эффекторной функции, опосредованной FcγRIIIA.

В одном воплощении композиция содержит антитело против ВСМА, содержащее две тяжелые цепи («НС») и две легкие цепи («LC») иммуноглобулина (Ig). Основная структурная единица антитела может содержать, например, тетрамер субъединиц. Каждый тетрамер может включать две пары полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-концевая часть каждой цепи может содержать вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, обеспечивающую, главным образом, распознавание антигена. Эта вариабельная область может исходно быть экспрессирована связанной с отщепляемым сигнальным пептидом. Вариабельная область без сигнального пептида может быть названа зрелой вариабельной областью. Таким образом, в одном примере зрелая вариабельная область легкой цепи может содержать вариабельную область легкой цепи без сигнального пептида легкой цепи. С-концевая часть каждой цепи может определять константную область. Константная область тяжелой цепи может обеспечивать, главным образом, эффекторную функцию.

Зрелые вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи могут образовывать связывающий сайт антитела (также называемый антигенсвязывающий сайтом). «Антигенсвязывающий сайт» относится к сайту антитела, способному специфично связываться с антигеном; он может представлять собой отдельный вариабельный домен, или он может представлять собой спаренные домены V_H/V_L, которые могут быть обнаружены на стандартном антителе. Таким образом, интактное антитело может иметь, например, два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифичных антител, эти два связывающих сайта могут быть одинаковыми. Все цепи могут демонстрировать одинаковую общую структуру относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными участками, также называемыми участками, определяющими комплементарность, или «CDR». CDR двух цепей каждой пары могут быть сориентированы посредством каркасных областей таким образом, что они могут связываться с определенным эпитопом. Таким образом, в одном примере, от N-конца к С-концу, как легкая, так и тяжелая цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

CDR определяют как аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность антитела. Они представляют собой гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. В вариабельной части иммуноглобулина присутствуют три CDR (или CDR-участка) тяжелой цепи и три CDR (или CDR-участка) легкой цепи. Таким образом, при использовании здесь «CDR» относится ко всем трем CDR тяжелой цепи, всем трем CDR легкой цепи, всем CDR тяжелой и легкой цепи или по меньшей мере к двум CDR. В одном воплощении композиция по изобретению содержит антитело против ВСМА, содержащее один или более чем один CDR по изобретению, описанные здесь, или одну или обе из вариабельных доменов тяжелой или легкой цепи по изобретению, описанных здесь.

Термины «вариант», «вариант антитела», «вариант CDR» и «вариант посттрансляционной модификации» относятся к изменению по меньшей мере одной аминокислоты в последовательности антитела. Варианты могут быть результатами посттрансляционной модификации, химического изменения или изменения последовательности посредством по меньшей мере одной делеции, замены или добавления. Некоторые посттрансляционные модификации приводят к химическому изменению, не меняющему последовательность (например, Met и окисленный Met; или Asp и изомеризованный Asp (iso-Asp); или агрегация), в то время как другие приводят к изменению последовательности, такому как превращение одного аминокислотного остатка в другой (например, превращение Asn в Asp посредством дезамидирования; или делеция лизина). Другие варианты посттрансляционных модификаций описаны ниже. Вариант последовательности антитела, содержащий изменение последовательности, может быть результатом разработанного изменения последовательности или посттрансляционной модификации. Изменение аминокислотной последовательности может представлять собой делецию, замену или дополнение.

В одном таком воплощении замены представляют собой консервативные замены. В альтернативном воплощении вариант антитела содержит по меньшей мере одну замену, сохраняя при этом каноническую структуру антигенсвязывающего белка. В одном воплощении вариант антитела представляет собой антитело, по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90% или приблизительно на 95% идентичное (то есть последовательность которого имеет соответствующую идентичность) первичной последовательности антитела. В другом воплощении вариант антитела включает антитело, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90% или приблизительно на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и/или аминокислотную последовательность тяжелой цепи, по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90% или приблизительно на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут иметь аминокислотные модификации, повышающие аффинность константного домена или его фрагмента в отношении FcRn. Увеличение периода полувыведения (то есть периода полувыведения из сыворотки) терапевтических и диагностических антител IgG и других биологически активных молекул имеет множество преимуществ, включая уменьшение вводимого количества и/или частоты введения этих молекул. В одном воплощении антигенсвязывающий белок по изобретению содержит весь константный домен IgG или его часть (часть, связывающуюся с FcRn), имеющие одну или более чем одну из следующих аминокислотных модификаций.

Например, применительно к IgG1, M252Y/S254T/T256E (обычно называемые мутациями «УТЕ») и M428L/N434S (обычно называемые мутациями «LS») увеличивают связывание с FcRn при рН 6,0 (Wang et al., 2018).

Период полувыведения может также быть увеличен мутациями T250Q/M428L, V259I/V308F/M428L, N434A и T307A/E380A/N434A (применительно к IgG1 и нумерации Kabat) (Monnet et al).

Период полувыведения и связывание с FcRn могут также быть увеличены введением мутаций Н433К и N434F (обычно называемые мутациями «HN» или «NHance») (применительно к IgG1) (WO 2006/130834).

В WO 00/42072 раскрыт полипептид, содержащий вариант Fc-области с измененной аффинностью связывания с FcRn, где полипептид содержит аминокислотную модификацию в любом одном или более чем одном из аминокислотных положений 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386,388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и 447 Fc-области (система нумерации EU).

В WO 02/060919 раскрыт модифицированный IgG, содержащий константный домен IgG, содержащий одну или более чем одну аминокислотную модификацию по сравнению с константным доменом IgG дикого типа, где период полувыведения модифицированного IgG увеличен по сравнению с периодом полувыведения IgG, имеющего константный домен IgG дикого типа, и где одна или более чем одна аминокислотная модификация присутствуют в одном или более чем одном из положений 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-435.

Shields etal. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604) применяли мутагенез с аланиновым сканированием для изменения остатков в Fc-области человеческого антитела IgG1 и затем оценивали связывание с человеческим FcRn. Положения, где замена на аланин эффективно устраняла связывание с FcRn, включают 1253, S254, Н435 и Y436. Другие положения, продемонстрировавшие менее выраженное уменьшение связывания, включают следующее: E233-G236, R255, К288, L309, S415 и Н433. Некоторые аминокислотные положения продемонстрировали улучшение связывания с FcRn при их замене на аланин; среди них следует отметить Р238, Т256, Е272, V305, Т307, Q311, D312, КЗ 17, D376, Е380, Е382, S424 и N434. Многие другие аминокислотные положения продемонстрировали незначительное улучшение (D265, N286, V303, К360, Q362 и А378) или отсутствие изменений (S239, К246, К248, D249, М252, Е258, Т260, S267, Н268, S269, D270, К274, N276, Y278, D280, V282, Е283, Н285, Т289, К290, R292, Е293, Е294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, Е318, КЗ20, К322, S324, К326, А327, Р329, Р331, ЕЗЗЗ, К334, Т335, S337, К338, К340, Q342, R344, Е345, Q345, Q347, R356, М358, Т359, К360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, Е388, N389, N390, К392, L398, S400, D401, К414, R416, Q418, Q419, N421, V422, Е430, Т437, К439, S440, S442, S444 и К447) связывания с FcRn.

Наиболее выраженный эффект применительно к улучшению связывания с FcRn был обнаружен у комбинированных вариантов. При рН 6,0 вариант E380A/N434A продемонстрировал улучшение связывания с FcRn боле чем в 8 раз относительно нативного IgG1, по сравнению с 2-кратным улучшением в случае Е380А и 3,5-кратным улучшением в случае N434A. Добавление к этому Т307А приводило к улучшению связывания в 12 раз относительно нативного IgG1. В одном воплощении антигенсвязывающий белок по изобретению содержит мутации E380A/N434A и имеет увеличенное связывание с FcRn.

В Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol.;169:5171-80) описаны случайный мутагенез и скрининг фаговых дисплейных библиотек шарнирной области человеческого IgG1 с Fc-фрагментом против мышиного FcRn. В указанной публикации раскрыт случайный мутагенез положений 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434 и 436. Основные улучшения стабильности комплекса IgG1 и человеческого FcRn происходят при замене остатков, расположенных в полосе контакта Fc-FcRn (М252, S254, Т256, Н433, N434 и Y436), и, в меньшей степени, при замене остатков на периферии, таких как V308, L309, Q311, G385, Q386, Р387 и N389. Вариант с наибольшей аффинностью в отношении человеческого FcRn был получен при комбинации мутаций M252Y/S254T/T256E («УТЕ») и H433K/N434F/Y436H и продемонстрировал повышение аффинности в 57 раз относительно IgG1 дикого типа. In vivo такой мутированный человеческий IgG1 продемонстрировал увеличение периода полувыведения из сыворотки у яванских макак приблизительно в 4 раза по сравнению с IgG1 дикого типа.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен антигенсвязывающий белок с оптимизированным связыванием с FcRn. В предпочтительном воплощении антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в Fc-области указанного антигенсвязывающего белка, где указанная модификация присутствует в аминокислотном положении, выбранном из группы, состоящей из 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 и 447 Fc-области.

Кроме того, в различных публикациях описаны способы получения физиологически активных молекул с модифицированным периодом полувыведения посредством введения в эти молекулы полипептида, связывающегося с FcRn (WO 97/43316, US 5869046, US 5747035, WO 96/32478 и WO 91/14438), или посредством слияния этих молекул с антителами, у которых аффинность связывания с FcRn сохранена, а аффинность в отношении других Fc-рецепторов значительно снижена (WO 99/43713), или слияния с доменами антител, связывающимися с FcRn (WO 00/09560, US 4703039).

Варианты Fc с повышенной аффинностью в отношении FcRn для улучшения как цитотоксичности, так и периода полувыведения антитела были определены во время скрининга при рН 6,0. Выбранные варианты IgG могут быть получены как молекулы с низкой степенью фукозилирования. Полученные варианты дольше сохранялись в сыворотке hFcRn-мышей, а также сохраняли усиленную ADCC (Monnet etal). Типичные варианты включают (применительно к IgG1 и нумерации Kabat):

P230T/V303A/K322R/N389T/F404L/N434S;

P228R/N434S;

Q311R/K334R/Q342E/N434Y;

C226G/Q386R/N434Y;

T307P/N389T/N434Y;

P230S/N434S;

P230T/V305A/T307A/A378V/L398P/N434S;

P230T/P387S/N434S;

P230Q/E269D/N434S;

N276S/A378V/N434S;

T307A/N315D/A330V/382V/N389T/N434Y;

T256N/A378V/S383N/N434Y;

N315D/A330V/N36 ID/АЗ 87V/N434Y;

V259I/N315D/M428L/N434Y;

P230S/N315D/M428L/N434Y;

F241L/V264E/T307P/A378V/H433R;

T250A/N389K/N434Y;

V305 A/N315D/A330V/P395 A/N434Y;

V264E/Q386R/P396L/N434S/K439R;

E294del/T307P/N434Y (где «del» обозначает делецию).

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, включающий стадии: (а) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано здесь, где ген FUT8 рекомбинантной клетки-хозяина, кодирующий альфа-1,6-фукозилтрансферазу, инактивирован; и (б) выделения антигенсвязывающего белка. Такие способы получения антигенсвязывающих белков могут быть осуществлены, например, с применением технологической системы POTELLIGENT, доступной от BioWa, Inc. (Принстон, штат Нью-Джерси), где клетки CHOK1SV без функциональной копии гена FUT8 продуцируют моноклональные антитела с усиленной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью (ADCC), повышенной относительно идентичного моноклонального антитела, полученного в клетке с функциональным геном FUT8. Аспекты технологической системы POTELLIGENT описаны в US 7214775, US 6946292, WO 0061739 и WO 0231240, все из которых включены сюда посредством ссылки. Специалисты в данной области также определят другие подходящие системы и способы получения антигенсвязывающих белков, таких как антитела.

Антитело может быть выделено и очищено обычными методиками очистки белков. Например, антитело может быть выделено непосредственно из культуральной среды. Выделение из клеточной культуральной среды может быть проведено осветлением, например, центрифугированием и/или глубинной фильтрацией. После выделения антитела проводят очистку для обеспечения адекватной степени чистоты. Таким образом, в одном аспекте предложена клеточная культуральная среда, содержащая антитело, описанное здесь. В одном воплощении клеточная культуральная среда содержит клетки СНО.

Затем антитело может быть очищено из клеточной культуральной среды. Это может включать сбор надосадочной жидкости клеточной культуры, приведение надосадочной жидкости клеточной культуры в контакт с очищающей средой (например, смолой с белком А или смолой с белком G для связывания молекул антитела) и элюирование молекул антитела из очищающей среды с получением элюата. Таким образом, в одном аспекте предложен элюат, содержащий антитело, описанное здесь.

При очистке могут быть применены одна или более чем одна стадия хроматографии, например, одна или более чем одна хроматографическая смола, и/или одна или более чем одна стадия фильтрации. Например, для очистки композиции может быть применена аффинная хроматография с использованием смол, таких как смола с белком A, G или L. Альтернативно или дополнительно, для очистки композиции может быть использована ионообменная смола, такая как катионообменная смола.

Альтернативно, стадии очистки включают стадию смолы для аффинной хроматографии с последующей стадией катионообменной смолы.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит CDR1 вариабельной области тяжелой цепи («CDRH1»), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. В одном воплощении CDR1 вариабельной области тяжелой цепи («CDRH1») содержит аминокислотную последовательность с одним аминокислотным изменением («вариант») аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи («CDRH2»), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В одном воплощении CDR2 вариабельной области тяжелой цепи («CDRH2») содержит аминокислотную последовательность с одним аминокислотным изменением («вариант») аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит CDR3 вариабельной области тяжелой цепи («CDRH3»), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3. В одном воплощении CDR3 вариабельной области тяжелой цепи («CDRH3») содержит аминокислотную последовательность с одним аминокислотным изменением («вариант») аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит CDR1 вариабельной области легкой цепи («CDRL1»), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4. В одном воплощении CDL1 вариабельной области легкой цепи («CDR1») содержит аминокислотную последовательность с одним аминокислотным изменением («вариант») аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит CDR2 вариабельной области легкой цепи («CDRL2»), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5. В одном воплощении CDL2 вариабельной области легкой цепи («CDR2») содержит аминокислотную последовательность с одним аминокислотным изменением («вариант») аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит CDR3 вариабельной области легкой цепи («CDRL3»), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6. В одном воплощении CDL3 вариабельной области легкой цепи («CDR3») содержит аминокислотную последовательность с одним аминокислотным изменением («вариант») аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит: CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1; CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3; CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4; CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5; и/или CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит вариабельную область тяжелой цепи («V_H»), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит вариабельную область легкой цепи («V_L»), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит V_H, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7; и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит область тяжелой цепи («НС»), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит область легкой цепи («LC»), содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит НС, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, и LC, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.

«Процент идентичности» между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваемой аминокислотной последовательностью представляет собой значение идентичности («Identities»), выраженное в процентах, рассчитанное алгоритмом BLASTP, когда рассматриваемая аминокислотная последовательность на 100% перекрывается с запрашиваемой аминокислотной последовательностью после проведения попарного BLASTP-выравнивания. Такое попарное BLASTP-выравнивание между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваемой аминокислотной последовательностью проводят с применением настроек алгоритма BLASTP по умолчанию, доступных на интернет-сайте Национального центра биотехнологической информации, с отключенным фильтром областей малой сложности. Важно, что запрашиваемая последовательность может быть описана аминокислотной последовательностью, определенной здесь в одном или более чем одном пункте формулы изобретения.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8.

В одном воплощении антитело против ВСМА содержит белантамаб, содержащий НС с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9, и LC с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10.

Последовательности антител могут быть определены по системе нумерации Kabat (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987). Альтернативно, они могут быть определены с применением системы нумерации Chothia (Al-Lazikani etal, (1997) JMB 273,927-948), контактным методом определения (MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) или любым другим установленным методом нумерации остатков антитела и определения CDR, известным специалисту в данной области. Другие системы нумерации последовательностей антител, доступные специалисту в данной области, включают метод «AbM» (университет Бата) и «контактный» метод (университетский колледж Лондона). В завершение, последовательности антитела могут быть пронумерованы последовательно.

При указании номера применительно к аминокислоте, описанной здесь, последовательности могут быть пронумерованы методом Kabat или методом последовательной нумерации. Если прямо не указано иное, номера конкретных аминокислот описаны здесь по системе последовательной нумерации. В данном описании термины «CDR», «CDRL1», «CDRL2», «CDRL3», «CDRH1», «CDRH2», «CDRH3» соответствуют нумерации Kabat. Аминокислотные остатки последовательностей вариабельных областей и последовательностей полноразмерного антитела пронумерованы последовательно для обозначения любого положения варианта последовательности антитела или положения варианта посттрансляционной модификации, такого как изомеризованный вариант (например, D103), дезамидированный вариант (например, N388) или окисленный вариант (например, М34).

Ссылка на положение в CDR (например, М34 или D103) указывает на номер положения применительно к последовательности полноразмерного антитела (последовательная нумерация). Таким образом, следует понимать, что М34 CDRH1 относится к четвертому остатку SEQ ID NO: 1, то есть, как подчеркнуто: NYWMH (SEQ ID NO: 1). В равной степени, D103 CDRH3 относится к пятому остатку SEQ ID NO: 3, то есть, как подчеркнуто: GAIYDGYDVLDN (SEQ ID NO: 3).

В одном аспекте композиция содержит вариант антитела, содержащий изменение одной или более чем одной аминокислоты в первичной последовательности.

В одном воплощении композиция содержит антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10 с аминокислотным изменением аспарагиновой кислоты (D) на аспарагин (N), например, D103N в CDRH3 (то есть D99N по нумерации Kabat).

В другом воплощении композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и содержит аминокислотное изменение аспарагиновой кислоты (D) на аспарагин (N), например, D103N в CDRH3.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и содержит аминокислотное изменение аспарагиновой кислоты (D) на аспарагин (N), например, D103N в CDRH3.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 50% или более, 75% или более или 90% или более антител в смеси содержат D103NbCDRH3.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 50% или более, 75% или более или 90% или более антител в смеси содержат D103N в CDRH3.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 50% или более, 75% или более или 90% или более белантамаба содержат D103N в CDRH3.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб, содержащий по меньшей мере один вариант антитела с применением системы нумерации Kabat, выбранный из группы, состоящей из G27Y, S30T, А93Т, A24G, K73T, M48I, V67A, F71Y, D99N, M4L и К45Е.

Продукты посттрансляционной модификации

«Продукт посттрансляционной модификации» антитела, описанного здесь, представляет собой композицию антитела, где вся композиция или ее часть содержит «посттрансляционную модификацию». Посттрансляционные модификации представляют собой химические изменения антитела, которые могут быть результатом продукции антитела в клетке-хозяине, предшествующих и последующих стадий его получения и/или хранения (например, эффектом воздействия света, температуры, рН, воды или взаимодействия с эксципиентом и/или первичной упаковкой). Таким образом, получение и хранение антитела могут влиять на свойства композиции по изобретению. Типичные посттрансляционные модификации включают изменения последовательности антитела («вариант антитела», как описано выше), отщепление определенных лидерных последовательностей, добавление различных сахарных группировок при различных паттернах гликозилирования, неферментативное гликирование, дезамидирование, окисление, перестановки дисульфидных связей и другие цистеиновые варианты, такие как свободные сульфгидрилы, рацемизированные дисульфиды, тиоэфиры и трисульфидные связи, изомеризацию, отщепление С-концевого лизина и/или циклизацию N-концевого глутамина.

В одном примере продукт посттрансляционной модификации включает «родственную примесь», содержащую химическое изменение, приводящее к снижению функции и/или активности. В другом примере продукт посттрансляционной модификации включает «родственное вещество», содержащее химическое изменение, не приводящее к снижению функции и/или активности. Применительно к антителам, описанным здесь, родственные примеси включают изомеризованные варианты и окисленные варианты. Применительно к антителам, описанным здесь, родственные вещества включают дезамидированные варианты, варианты с гликозилированием, варианты с С-концевым отщеплением и варианты с N-концевым пироглутаматом.

В одном воплощении композиция содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, содержащие одну или более чем одну функциональную посттрансляционную модификацию. В другом воплощении композиция содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 и легкую цепь SEQ ID NO: 10, содержащие одну или более чем одну функциональную посттрансляционную модификацию.

Процент варианта, представленный здесь, выражен как процент от общего количества антитела в композиции (например, в «популяции» антител). Например, 40% или менее окисленного варианта относится к общему количеству 100% антитела в композиции, 40% из которого окислено. Например, 25% или менее изомеризованного варианта относится к общему количеству 100% антитела в композиции, 25% из которого изомеризовано.

Гликирование представляет собой посттрансляционную модификацию, включающую неферментативное химическое взаимодействие между восстанавливающим сахаром, таким как глюкоза, и свободной аминогруппой белка, и обычно происходит по эпсилон-амину боковых цепей лизина или на N-конце белка. Гликирование может происходить во время получения и/или хранения в присутствии восстанавливающих сахаров.

Дезамидирование, которое может, например, происходить во время получения и/или хранения, может представлять собой ферментативную реакцию или химическую реакцию. Дезамидирование может происходить посредством простого химического взаимодействия в результате внутримолекулярной циклизации, где амидный азот следующей аминокислоты в цепи нуклеофильно атакует рассматриваемый амид (N+1 атакует N) с образованием сукцинимидного промежуточного соединения. Дезамидирование может приводить, в первую очередь, к превращению аспарагина (N) в изоаспарагиновую кислоту (изоаспартат) и аспарагиновую кислоту (аспартат) (D) в соотношении приблизительно 3:1. Таким образом, эта реакция дезамидирования может быть связана с изомеризацией аспартата (D) с образованием изоаспартата. Как дезамидирование аспарагина, так и изомеризация аспартата могут включать промежуточный сукцинимид. В значительно меньшей степени, возможно аналогичное дезамидирование глутаминовых остатков. Дезамидирование может происходить в CDR, в Fab-области (в области, не являющейся CDR) или в Fc-области. Изомеризация представляет собой превращение аспартата (D) в изоаспартат, включающее промежуточный сукцинимид.

Окисление может происходить во время получения и/или хранения (то есть в окислительных условиях) и приводит к ковалентной модификации белка, вызванной непосредственно активными формами кислорода или косвенно взаимодействием с вторичными побочными продуктами окислительного стресса. Окислению подвержены, в первую очередь, метиониновые остатки, но возможно также окисление триптофановых и свободных цистеиновых остатков. Окисление может происходить в CDR, в Fab-области (не являющейся CDR) или в Fc-области.

Перестановка дисульфидных связей возможна в условиях получения и/или хранения. При определенных обстоятельствах возможно неправильное разрушение или образование дисульфидных связей, что приводит к появлению неспаренных цистеиновых остатков (-SH). Эти свободные (неспаренные) сульфгидрилы (-SH) могут способствовать перестановкам.

Образование тиоэфира и рацемизация дисульфидной связи могут происходить в основных условиях при получении или хранении посредством бета-элиминации дисульфидных связей с образованием цистеиновых остатков через дегидроаланиновое и персульфидное промежуточные соединения. Последующее образование поперечных сшивок дегидроаланина и цистеина может приводить к образованию тиоэфирной связи, или свободные цистеиновые остатки могут повторно образовывать дисульфидную связь со смесью D- и L-цистеина.

Трисульфиды могут быть результатом введения атома серы в дисульфидную связь (Cys-S-S-S-Cys), и их образование может быть обусловлено присутствием сероводорода в культуре клеток-продуцентов.

N-конце вые глутамин (Q) и глутамат (глутаминовая кислота) (Е) в тяжелой цепи и/или легкой цепи могут образовывать пироглутамат (pGlu) посредством циклизации. Образование pGlu может происходить в продукционном биореакторе, а также, например, неферментативно в зависимости от рН и температуры на стадиях обработки и хранения. Циклизация N-концевых Q или Е часто происходит в естественных человеческих антителах.

Отщепление С-концевого лизина представляет собой ферментативную реакцию, катализируемую карбоксипептидазами, и часто происходит в рекомбинантных и естественных человеческих антителах. Варианты этого процесса включают удаление лизина из одной или обеих тяжелых цепей клеточными ферментами рекомбинантной клетки-хозяина. Введение субъекту/пациенту-человеку с высокой долей вероятности приводит к удалению любого оставшегося С-концевого лизина.

Настоящее изобретение охватывает антитела, которые могли быть подвергнуты одной или более чем одной посттрансляционной модификации, описанной здесь, или прошли одну или более чем одну посттрансляционную модификацию, описанную здесь. Типичные композиции могут содержать смесь антител (1) с и без посттрансляционных модификаций (1 или более) или (2) с посттрансляционными модификациями более чем одного типа, описанными здесь.

Композиция может содержать смесь вариантов антител и вариантов с посттрансляционными модификациями. Например, композиция антитела может содержать один или более чем один, например, два или более, из вариантов с окислением, вариантов с дезамидированием, изомеризованных вариантов, вариантов с N-концевым пироглутаматом и вариантов с отщеплением С-концевого лизина.

Например, в одном воплощении композиция может содержать смесь антител, где 10% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10 и 90% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10 с отщеплением С-концевого лизина.

В другом типичном воплощении композиция может содержать смесь антител, где 10% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10, 90% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10 с отщеплением С-концевого лизина и в этих 100% всех антител смеси до 100% N-концевого глутамина циклизованы с образованием пироглутамата.

В другом типичном воплощении композиция может содержать смесь антител, где 10% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10, 90% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10 с отщеплением С-концевого лизина и в этих 100% всех антител смеси до 100% содержат N-конце в ой пироглутамат и до 23% изомеризованы по D103 в CDRH3.

В еще одном типичном воплощении композиция содержит смесь антител, где 20% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10, 80% антител в смеси содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и 10 с вариантом N103 в CDRH3 и в этих 100% всех антител смеси до 37% антител окислены по аминокислоте М34 CDRH1.

В одном воплощении посттрансляционная модификация, описанная здесь, не приводит к существенному изменению аффинности связывания с антигеном, биологической активности, фармакокинетики (ФК) / фармакодинамики (ФД), агрегации, иммуногенности и/или связывания с Fc-рецептором, за исключением случаев, указанных и описанных как родственная примесь.

«Функция» или «активность», как описано здесь, определены как одно или более чем одно из (1) связывания с ВСМА, (2) связывания с FcγRIIIa и/или (3) связывания с FcRn. В одном воплощении «сниженная функция» или «сниженная активность» означает, что связывание с ВСМА, связывание с FcγRIIIa или связывание с FcRn снижено на некоторый процент по сравнению с эталонным стандартом и является значимым с учетом вариабельности анализа. Например, сниженная функция или активность могут быть описаны как снижение на 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более или 50% или более.

В одном воплощении антитело против ВСМА включает антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и содержащее все посттрансляционные модификации антитела, если они есть.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и все посттрансляционные модификации, если они есть.

Варианты антитела обычно наблюдают при анализе композиции антител методиками разделения по заряду, такими как электрофорез в геле с изоэлектрическим фокусированием (IEF), электрофорез в геле с капиллярным изоэлектрическим фокусированием (cIEF), катионообменная хроматография (СЕХ) и анионообменная хроматография (АЕХ).

Посттрансляционные модификации могут приводить к увеличению или уменьшению суммарного заряда антитела и к снижению или повышению значения pi, что приводит к кислым вариантам и основным вариантам (совместно называемым «заряженными вариантами») по сравнению с главной изоформой. Главная изоформа представляет собой популяцию антител, элюируемых в виде основного пика на хроматограммах. При анализе антител с применением методов на основе IEF кислые разновидности представляют собой варианты с меньшей наблюдаемой pI, а основные разновидности представляют собой варианты с большей наблюдаемой pI. При анализе методами на основе хроматографии кислые разновидности и основные разновидности определяют, исходя из их времени удержания относительно основного пика. Кислые разновидности представляют собой варианты, элюируемые раньше основного пика при СЕХ или позже основного пика при АЕХ, в то время как основные разновидности представляют собой варианты, элюируемые позже основного пика при СЕХ или раньше основного пика при АЕХ. Эти методы позволяют отделить главную изоформу антитела от кислой изоформы (кислого варианта) и от основной изоформы (основного варианта). Заряженный вариант может быть выявлен различными методами, такими как ионообменная хроматография, например, HPLC с WCX-10 (слабая катионообменная хроматография) или IEF (изоэлектрическое фокусирование). Процент заряженного варианта может быть определен с применением капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF). Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (cIEF) применяли для измерения pi достарлимаба и разделения заряженных вариантов (см. Фиг. 1). Данный метод можно применять для определения количества кислых и основных разновидностей как процента от общей площади пиков. Термины «разновидность», «изоформа», «форма» и «пик» использованы взаимозаменяемо для обозначения главной формы и заряженных вариантов (кислого варианта и основного варианта).

В одном воплощении композиция содержит кислый вариант антитела, где кислый вариант содержит CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 1-70% кислого варианта.

В одном аспекте композиция содержит 70% или менее кислого варианта. В одном воплощении композиция содержит 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 35% или менее или 30% или менее кислого варианта. Альтернативно, композиция содержит 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-35% или 10-30% кислого варианта. Альтернативно, композиция содержит 20-70%, 20-60%, 20-50%, 20-40%, 20-35% или 20-30% кислого варианта. Альтернативно, композиция содержит приблизительно 60%, приблизительно 50%, приблизительно 40%, приблизительно 35%, приблизительно 30%, приблизительно 25% или приблизительно 20% кислого варианта.

В одном аспекте композиция содержит основный вариант антитела, где основный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 1-30% основного варианта.

В одном аспекте композиция содержит 30% или менее основного варианта. В одном воплощении композиция содержит 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее или 5% или менее основного варианта. В одном воплощении композиция содержит 1-30%, 1-25%, 1-20%, 1-15%, 1-10% или 1-5% основного варианта. Альтернативно, композиция содержит приблизительно 15%, приблизительно 10% или приблизительно 5% основного варианта.

В одном аспекте композиция содержит главную изоформу антитела, где главная изоформа содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 1-90% главной изоформы.

В одном аспекте композиция содержит 1% или более главной изоформы. В одном воплощении композиция содержит 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 55% или более, 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более или 90% или более главной изоформы. В одном воплощении композиция содержит 10-90%, 20-90%, 30-90%, 40-90%, 50-90% или 60-90% главной изоформы. В одном воплощении композиция содержит 10-80%, 20-80%, 30-80%, 40-80%, 50-80% или 60-80% главной изоформы. Альтернативно, композиция содержит приблизительно 80%, приблизительно 75%, приблизительно 70%, приблизительно 65%, приблизительно 60%, приблизительно 50% или приблизительно 55% главной изоформы.

Процент кислого варианта, процент основного варианта и процент главной изоформы могут быть определены с применением капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF). Следует понимать, что эти воплощения с изоформами / заряженными вариантами можно комбинировать с любым одним из или комбинацией вариантов антител, описанных здесь.

В одном аспекте композиция содержит заряженный вариант антитела, который содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 70% или менее кислого варианта, и/или 30% или менее основного варианта, и/или 1% или более главной изоформы.

В одном аспекте композиция содержит антитело, содержащее изомеризационную посттрансляционную модификацию («изомеризация» или «изомеризованный») или «изомеризованный вариант». Вариант может содержать изомеризованный аминокислотный остаток в последовательности тяжелой цепи и/или последовательности легкой цепи, такой как CDR последовательности тяжелой цепи и/или CDR последовательности легкой цепи. Изомеризованный вариант может присутствовать в одной или обеих цепях из тяжелой цепи или легкой цепи. Результатом изомеризационной посттрансляционной модификации является изоаспартат и/или сукцинимид-аспартат.В одном примере изомеризация аспарагиновой кислоты (Asp) может быть определена с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием), как описано здесь. Следует понимать, что эти воплощения с изомеризованными вариантами можно комбинировать с признаками антител, описанными здесь.

В одном воплощении композиция содержит изомеризованный вариант антитела против ВСМА, где изомеризованный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 25% или менее изомеризованного варианта.

В одном аспекте композиция содержит популяцию антител против ВСМА, включающую:

антитела, содержащие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 (CDRH1), SEQ ID NO: 2 (CDRH2) и SEQ ID NO: 3 (CDRH3), и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4 (CDRL1), SEQ ID NO: 5 (CDRL2) и SEQ ID NO: 6 (CDRL3); и

их изомеризованные варианты, составляющими 25% или менее указанной популяции антител.

В другом воплощении композиция содержит изомеризованный вариант антитела против ВСМА, где изомеризованный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 25% или менее изомеризованного варианта по аминокислоте D103 в CDRH3.

В одном воплощении композиция содержит изомеризованный вариант антитела против ВСМА, где изомеризованный вариант содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 25% или менее изомеризованного варианта.

Альтернативно, изомеризованный вариант содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 11, 12, 13 или 14.

В одном воплощении композиция содержит антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10 и содержащее изомеризацию в последовательности тяжелой цепи или последовательности легкой цепи, например, изомеризацию по аминокислоте D103 в CDRH3.

В другом воплощении композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и изомеризацию по меньшей мере в одном из шести CDR-участков, например, изомеризацию по аминокислоте D103 в CDRH3.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и содержит изомеризацию в последовательности тяжелой цепи или последовательности легкой цепи, например, изомеризацию по аминокислоте D103 в CDRH3.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 25% или менее, 23% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 0,1-25%, 0,1-20%, 0,1-15%, 0,1-10%, 0,1-8%, 0,1-7%, 1-6%, 2-6%, 3-6%, приблизительно 4%, приблизительно 5% или приблизительно 6% антител в смеси изомеризованы по аминокислоте D103 в CDRH3. В одном воплощении композиция, содержащая 25% или менее или 23% или менее изомеризации по положению D103 в CDRH3, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 25% или менее, 23% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 0,1-25%, 0,1-20%, 0,1-15%, 0,1-10%, 0,1-8%, 0,1-7%, 1-6%, 2-6%, 3-6%, приблизительно 4%, приблизительно 5% или приблизительно 6% антител в смеси изомеризованы по аминокислоте D103 в CDRH3. В одном воплощении композиция, содержащая 25% или менее или 23% или менее изомеризации по положению D103 в CDRH3, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА.

В другом воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 25% или менее, 23% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 0,1-25%, 0,1-20%, 0,1-15%, 0,1-10%, 0,1-8%, 0,1-7%, 1-6%, 2-6%, 3-6%, приблизительно 4%, приблизительно 5% или приблизительно 6% белантамаба изомеризованы по аминокислоте D103 в CDRH3. В одном воплощении белантамаб, содержащий 25% или менее или 23% или менее изомеризации по положению D103 в CDRH3, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА.

В одном воплощении композиция содержит изомеризованный вариант антитела против ВСМА, где изомеризованный вариант содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 25% или менее изомеризованного варианта.

В одном примере изомеризация аспарагиновой кислоты (Asp) может быть определена с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием). В одном примере образец, содержащий композицию, описанную здесь, может быть денатурирован, например, в 6 М гуанидине-HCl, до концентрации, например, 4,2 мкг/мкл. Затем может быть проведено восстановление дисульфидных связей, например, с использованием 50 мМ DTT на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Затем может быть добавлен, например, йодацетат, например, 100 мМ, и может быть проведено его взаимодействие со свободными цистеиновыми остатками, например, на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в образце может быть проведена замена буфера, например, с использованием центрифужных колонок BioRad (номер по каталогу 7326221), перед расщеплением, например, 0,5%-м трипсином на протяжении 15 минут при 37°С. Полученные пептиды могут затем быть загружены на колонку для ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) с обращенной фазой и могут быть элюированы с использованием воды и градиента ацетонитрила, например, в 0,1%-й трифторуксусной кислоте, с применением UPLC. Затем может быть проведено выявление пептидов с использованием УФ-детектора и масс-спектрометра (например, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL). Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов могут быть использованы для расчета уровней изомеризации посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

В одном аспекте композиция содержит антитело, содержащее окислительную посттрансляционную модификацию («окисление» или «окисленный») или «окисленный вариант». Вариант может содержать окисленный аминокислотный остаток в последовательности тяжелой цепи и/или последовательности легкой цепи, такой как CDR последовательности тяжелой цепи и/или CDR последовательности легкой цепи. Окисленный вариант может присутствовать в одной или обеих цепях из тяжелой цепи или легкой цепи. Следует понимать, что эти воплощения с окисленными вариантами можно комбинировать с признаками антител, описанными здесь.

В одном воплощении композиция содержит окисленный вариант антитела против ВСМА, где окисленный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 40% или менее окисленного варианта.

В одном аспекте композиция содержит популяцию антител против ВСМА, включающую:

антитела, содержащие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 (CDRH1), SEQ ID NO: 2 (CDRH2) и SEQ ID NO: 3 (CDRH3), и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4 (CDRL1), SEQ ID NO: 5 (CDRL2) и SEQ ID NO: 6 (CDRL3); и

их окисленные варианты, составляющие 40% или менее указанной популяции антител.

В одном воплощении окисленный вариант содержит окисление в одном или более чем одном CDR. В другом воплощении окисленный вариант содержит окисление по метиониновому и/или триптофановому остатку в любой из SEQ ID NO: 1-6.

В другом воплощении композиция содержит окисленный вариант антитела против ВСМА, где окисленный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 40% или менее окисленного варианта по аминокислоте М34 в CDRH1.

В одном воплощении композиция содержит окисленный вариант белантамаба, где окисленный вариант содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 40% или менее окисленного варианта.

В одном воплощении композиция содержит антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10 и содержащее окисление в последовательности тяжелой цепи, например, окисление по аминокислоте М34 (CDRH1), М256 и/или М432.

В другом воплощении композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и содержит окисление в последовательности тяжелой цепи, например, окисление по аминокислоте М34 (CDRH1), М256 и/или М432.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и содержит окисление в последовательности тяжелой цепи, например, окисление по аминокислоте М34 (CDRH1), М256 и/или М432.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 40% или менее, 35% или менее, 30%, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 2,5% или менее, 2% или менее, 0,1-40%, 0,1-35%, 0,1-30%, 0,1-25%, 0,1-20%, 0,1-15%, 0,1-10%, 0,1-7,5%, 0,1-5%, 0,1-2,5%, 0,1-2%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2% или приблизительно 5% антител в смеси окислены по аминокислоте М34. В одном воплощении композиция, содержащая 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА. В другом воплощении композиция, содержащая 37% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 40% или менее, 35% или менее, 30%, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 2,5% или менее, 2% или менее, 0,1-40%, 0,1-35%, 0,1-30%, 0,1-25%, 0,1-20%, 0,1-15%, 0,1-10%, 0,1-7,5%, 0,1-5%, 0,1-2,5%, 0,1-2%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2% или приблизительно 5% антител в смеси окислены по аминокислоте М34. В одном воплощении композиция, содержащая 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА. В другом воплощении композиция, содержащая 37% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА.

В другом воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 40% или менее, 35% или менее, 30%, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 2,5% или менее, 2% или менее, 0,1-40%, 0,1-35%, 0,1-30%, 0,1-25%, 0,1-20%, 0,1-15%, 0,1-10%, 0,1-7,5%, 0,1-5%, 0,1-2,5%, 0,1-2%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2% или приблизительно 5% белантамаба окислены по аминокислоте М34. В одном воплощении белантамаб, содержащий 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА. В другом воплощении белантамаб, содержащий 37% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА.

В одном воплощении композиция содержит окисленный вариант антитела против ВСМА, где окисленный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 90% или менее варианта, окисленного в Fc-области.

В одном воплощении антитело содержит окисление по метиониновому и/или триптофановому остатку в Fc-области последовательности тяжелой цепи и/или Fc-области последовательности легкой цепи. В некоторых воплощениях окисленный вариант содержит одно или комбинацию из окисления по положению М256 и/или М432 Fc-области последовательности тяжелой цепи.

В другом воплощении композиция содержит окисленный вариант антитела против ВСМА, где окисленный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 90% или менее варианта, окисленного по М256 и/или М432.

В одном воплощении композиция содержит окисленный вариант белантамаба, где окисленный вариант содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 90% или менее варианта, окисленного в Fc-области.

Альтернативно, окисленный вариант содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 11, 12, 13 или 14.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 0,1-90%, 0,1-80%, 0,1-70%, 0,1-65%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20%, 0,1-10%, 1-10%, 1-5%, 2-10%, 2-4%, приблизительно 2%, приблизительно 3% или приблизительно 4% антител в смеси окислены по аминокислоте М256. В одном воплощении композиция, содержащая 90% или менее или 89% или менее окисления по положению М256 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcγRIIIA. В другом воплощении композиция, содержащая 65% или менее или 64% или менее окисления по положению М256 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcRn.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 0,1-90%, 0,1-80%, 0,1-70%, 0,1-65%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20%, 0,1-10%, 1-10%, 1-5%, 2-10%, 2-4%, приблизительно 2%, приблизительно 3% или приблизительно 4% антител в смеси окислены по аминокислоте М256. В одном воплощении композиция, содержащая 90% или менее или 89% или менее окисления по положению М256 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcγRIIIA. В другом воплощении композиция, содержащая 65% или менее или 64% или менее окисления по положению М256 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcRn.

В другом воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 0,1-90%, 0,1-80%, 0,1-70%, 0,1-65%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20%, 0,1-10%, 1-10%, 1-5%, 2-10%, 2-4%, приблизительно 2%, приблизительно 3% или приблизительно 4% белантамаба в смеси окислены по аминокислоте М256. В одном воплощении белантамаб, содержащий 90% или менее или 89% или менее окисления по положению М256 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcγRIIIA. В другом воплощении белантамаб, содержащий 65% или менее или 64% или менее окисления по положению М256 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcRn.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 86% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 2,5% или менее, 2% или менее, 0,1-86%, 0,1-70%, 0,1-60%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20%, 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2% или приблизительно 3% антител в смеси окислены по аминокислоте М432. В одном воплощении композиция, содержащая 86% или менее окисления по положению М432 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcγRIIA. В другом воплощении композиция, содержащая 60% или менее окисления по положению М432 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcRn.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 86% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 2,5% или менее, 2% или менее, 0,1-86%, 0,1-70%, 0,1-60%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20%, 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2% или приблизительно 3% антител в смеси окислены по аминокислоте М432. Композиция, содержащая 86% или менее окисления по положению М432 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcγRIIIA. В другом воплощении композиция, содержащая 60% или менее окисления по положению М432 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcRn.

В другом воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 86% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 7,5% или менее, 5% или менее, 2,5% или менее, 2% или менее, 0,1-86%, 0,1-70%, 0,1-60%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20%, 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2% или приблизительно 3% белантамаба окислены по аминокислоте М432. В одном воплощении белантамаб, содержащий 86% или менее окисления по положению М432 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcγRIIIa. В другом воплощении белантамаб, содержащий 60% или менее окисления по положению М432 тяжелой цепи, сохраняет 70% или более связывания с FcRn.

В одном примере окисление может быть определено с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием). В одном примере образец, содержащий композицию, описанную здесь, может быть денатурирован, например, в 6 М гуанидине-HCl, до концентрации, например, 4,2 мкг/мкл. Затем может быть проведено восстановление дисульфидных связей, например, с использованием 50 мМ DTT на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Затем может быть добавлен, например, йодацетат, например, 100 мМ, и может быть проведено его взаимодействие со свободными цистеиновыми остатками, например, на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в образце может быть проведена замена буфера, например, с использованием центрифужных колонок BioRad (номер по каталогу 7326221), перед расщеплением, например, 0,5%-м трипсином на протяжении 15 минут при 37°С.Полученные пептиды могут затем быть загружены на колонку для ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) с обращенной фазой и могут быть элюированы с использованием воды и градиента ацетонитрила, например, в 0,1%-й трифторуксусной кислоте, с применением UPLC. Затем может быть проведено выявление пептидов с использованием УФ-детектора и масс-спектрометра (например, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL). Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов используют для расчета уровней окисления посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

В одном аспекте композиция содержит антитело, содержащее дезамидирующую посттрансляционную модификацию («дезамидирование» или «дезамидированный») или «дезамидированный вариант». В одном воплощении антитело содержит дезамидирование аспарагинового остатка в CDR последовательности тяжелой цепи и/или CDR последовательности легкой цепи. В другом воплощении антитело содержит дезамидирование аспарагинового остатка в CDR последовательности тяжелой цепи. В одном воплощении антитело содержит дезамидирование аспарагинового остатка в Fc-области последовательности тяжелой цепи и/или Fc-области последовательности легкой цепи. Дезамидированный вариант может присутствовать в одной или обеих цепях из тяжелой цепи или легкой цепи. Следует понимать, что эти воплощения с дезамидированными вариантами можно комбинировать с признаками антител, описанными здесь. В некоторых воплощениях дезамидированный вариант содержит одно или комбинацию из дезамидирования по положению N388 и/или N393 Fc-области последовательности тяжелой цепи.

В одном воплощении дезамидированный вариант содержит дезамидированный остаток, выбранный из остатка аспарагиновой кислоты, остатка сукцинимид-аспарагиновой кислоты или остатка изоаспарагиновой кислоты.

В одном воплощении композиция содержит антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10 и содержащее дезамидирование в последовательности тяжелой цепи, например, дезамидирование по аминокислоте N388 и/или N393.

В одном воплощении композиция содержит дезамидированный вариант антитела против ВСМА, где дезамидированный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит до 100% дезамидированного варианта.

В другом воплощении композиция содержит дезамидированный вариант антитела против ВСМА, где окисленный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит до 100% варианта, дезамидированного по N388 и/или N393.

В одном воплощении композиция содержит дезамидированный вариант белантамаба, где дезамидированный вариант содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит до 100% дезамидированного варианта. В другом воплощении композиция содержит дезамидированный вариант, содержащий последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 и легкую цепь SEQ ID NO: 10.

В другом воплощении композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и содержит дезамидирование в последовательности тяжелой цепи, например, дезамидирование по аминокислоте N388 и/или N393.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и содержит дезамидирование в последовательности тяжелой цепи, например, дезамидирование по аминокислоте N388 и/или N393.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 100% или менее, 75% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 2% или менее, 0,1-100%, 0,1-75%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20% или 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5% или приблизительно 10% антител в смеси дезамидированы по аминокислоте N388.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 100% или менее, 75% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 2% или менее, 0,1-100%, 0,1-75%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20% или 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5% или приблизительно 10% антител в смеси дезамидированы по аминокислоте N388.

В другом воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 100% или менее, 75% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 2% или менее, 0,1-100%, 0,1-75%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20% или 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5% или приблизительно 10% белантамаба дезамидированы по аминокислоте N388.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 100% или менее, 85% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 2% или менее, 0,1-100%, 0,1-75%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20% или 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5% или приблизительно 10% антител в смеси дезамидированы по аминокислоте N393.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 100% или менее, 85% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 2% или менее, 0,1-100%, 0,1-75%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20% или 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5% или приблизительно 10% антител в смеси дезамидированы по аминокислоте N393.

В другом воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 100% или менее, 85% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 2% или менее, 0,1-100%, 0,1-75%, 0,1-50%, 0,1-40%, 0,1-30%, 0,1-20% или 0,1-10%, 0,1-5%, 0,1-3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5% или приблизительно 10% белантамаба дезамидированы по аминокислоте N393.

В одном примере дезамидирование может быть определено с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием). В одном примере образец, содержащий композицию, описанную здесь, может быть денатурирован, например, в 6 М гуанидине-HCl, до концентрации, например, 4,2 мкг/мкл. Затем может быть проведено восстановление дисульфидных связей, например, с использованием 50 мМ DTT на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Затем может быть добавлен, например, йодацетат, например, 100 мМ, и может быть проведено его взаимодействие со свободными цистеиновыми остатками, например, на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в образце может быть проведена замена буфера, например, с использованием центрифужных колонок BioRad (номер по каталогу 7326221), перед расщеплением, например, 0,5%-м трипсином на протяжении 15 минут при 37°С. Полученные пептиды могут затем быть загружены на колонку для ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) с обращенной фазой и могут быть элюированы с использованием воды и градиента ацетонитрила, например, в 0,1%-й трифторуксусной кислоте, с применением UPLC. Затем может быть проведено выявление пептидов с использованием УФ-детектора и масс-спектрометра (например, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL). Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов используют для расчета уровней дезамидирования посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

В одном воплощении посттрансляционная модификация представляет собой вариант последовательности антитела. Типичные варианты посттрансляционной модификации последовательности антитела включают превращение аспарагина (N) в аспарагиновую кислоту (D), N-концевой пироглутамат и/или отщепление С-концевого лизина.

В одном примере варианты антитела, например, N103D в CDRH3, могут быть определены с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием). В одном примере образец, содержащий композицию, описанную здесь, может быть денатурирован, например, в 6 М гуанидине-HCl, до концентрации, например, 4,2 мкг/мкл. Затем может быть проведено восстановление дисульфидных связей, например, с использованием 50 мМ DTT на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Затем может быть добавлен, например, йодацетат, например, 100 мМ, и может быть проведено его взаимодействие со свободными цистеиновыми остатками, например, на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в образце может быть проведена замена буфера, например, с использованием центрифужных колонок BioRad (номер по каталогу 7326221), перед расщеплением, например, 0,5%-м трипсином на протяжении 15 минут при 37°С. Полученные пептиды могут затем быть загружены на колонку для ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) с обращенной фазой и могут быть элюированы с использованием воды и градиента ацетонитрила, например, в 0,1%-й трифторуксусной кислоте, с применением UPLC. Затем может быть проведено выявление пептидов с использованием УФ-детектора и масс-спектрометра (например, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL). Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов используют для расчета уровней варианта антитела, например, N103D в CDRH3, посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

В одном аспекте композиция содержит антитело, содержащее посттрансляционную модификацию с образованием N-концевой пироглутаминовой кислоты («пироглутаминовая кислота») в аминокислотной последовательности тяжелой цепи. В одном воплощении композиция содержит антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10 и содержащее пироглутаминовую кислоту на N-конце тяжелой цепи.

В другом воплощении композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и содержит пироглутаминовую кислоту на N-конце тяжелой цепи.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и содержит пироглутаминовую кислоту на N-конце тяжелой цепи.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 25% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 100% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее или 50% или менее антител в смеси содержат N-концевую пироглутаминовую кислоту в аминокислотной последовательности тяжелой цепи.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 25% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 100% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее или 50% или менее антител в смеси содержат N-концевую пироглутаминовую кислоту в аминокислотной последовательности тяжелой цепи.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 25% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 100% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее или 50% или менее белантамаба содержат N-концевую пироглутаминовую кислоту в аминокислотной последовательности тяжелой цепи.

В одном примере N-концевая пироглутаминовая кислота может быть определена с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием). В одном примере образец, содержащий композицию, описанную здесь, может быть денатурирован, например, в 6 М гуанидине-HCl, до концентрации, например, 4,2 мкг/мкл. Затем может быть проведено восстановление дисульфидных связей, например, с использованием 50 мМ DTT на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Затем может быть добавлен, например, йодацетат, например, 100 мМ, и может быть проведено его взаимодействие со свободными цистеиновыми остатками, например, на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в образце может быть проведена замена буфера, например, с использованием центрифужных колонок BioRad (номер по каталогу 7326221), перед расщеплением, например, 0,5%-м трипсином на протяжении 15 минут при 37°С. Полученные пептиды могут затем быть загружены на колонку для ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) с обращенной фазой и могут быть элюированы с использованием воды и градиента ацетонитрила, например, в 0,1%-й трифторуксусной кислоте, с применением UPLC. Затем может быть проведено выявление пептидов с использованием УФ-детектора и масс-спектрометра (например, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL). Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов используют для расчета уровней пироглутаминовой кислоты посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

В одном аспекте композиция содержит антитело, содержащее посттрансляционную модификацию с отщеплением С-концевого лизина в аминокислотной последовательности тяжелой цепи. В одном воплощении композиция содержит антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10 и содержащее отщепление С-концевого лизина тяжелой цепи.

В другом воплощении композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и содержит отщепление С-концевого лизина тяжелой цепи.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и содержит отщепление С-концевого лизина тяжелой цепи.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где приблизительно 25% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 100% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее или 50% или менее антител в смеси содержат отщепление С-концевого лизина.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где приблизительно 25% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 100% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее или 50% или менее антител в смеси содержат отщепление С-концевого лизина тяжелой цепи.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб, где приблизительно 25% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 100% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее или 50% или менее белантамаба содержат отщепление С-концевого лизина тяжелой цепи.

В одном примере отщепление С-концевого лизина кислота может быть определено с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием). В одном примере образец, содержащий композицию, описанную здесь, может быть денатурирован, например, в 6 М гуанидине-HCl, до концентрации, например, 4,2 мкг/мкл. Затем может быть проведено восстановление дисульфидных связей, например, с использованием 50 мМ DTT на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Затем может быть добавлен, например, йодацетат, например, 100 мМ, и может быть проведено его взаимодействие со свободными цистеиновыми остатками, например, на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в образце может быть проведена замена буфера, например, с использованием центрифужных колонок BioRad (номер по каталогу 7326221), перед расщеплением, например, 0,5%-м трипсином на протяжении 15 минут при 37°С. Полученные пептиды могут затем быть загружены на колонку для ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) с обращенной фазой и могут быть элюированы с использованием воды и градиента ацетонитрила, например, в 0,1%-й трифторуксусной кислоте, с применением UPLC. Затем может быть проведено выявление пептидов с использованием УФ-детектора и масс-спектрометра (например, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL). Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов используют для расчета уровней отщепления С-концевого лизина посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

В одном аспекте композиция содержит антитело, содержащее гликозилирующую посттрансляционную модификацию («гликозилирующая модификация») или вариант с гликозилированием. Типичные гликозилирующие модификации включают изменения экспрессии GO, Gl, GO-GlcNac, G2 и сиалирования антитела. В одном воплощении композиция содержит антитело, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10 и содержащее гликозилирующую модификацию.

В другом воплощении композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и содержит вариант с гликозилированием.

В другом воплощении антитело против ВСМА включает белантамаб и содержит вариант с гликозилированием.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичных аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и/или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит: GO на уровне приблизительно 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более, 50% или более, 55% или более, 60% или более, 0-100%, 1-100%, 30-100%, 40-90%, 50-80% или 55-80%; G1 на уровне приблизительно 2,5% или более, 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 50% или более, 0-100%, 1-100%, 0-50%, 1-50%, 1-40%, 1-35% или 8-31%; G0-GlcNac на уровне приблизительно 5% или менее, 7,5% или менее, 10% или менее, 15% или менее, 20% или менее, 25% или менее, 30% или менее, 40% или менее, 50% или менее, 75% или менее, 0-100%, 0,5-100%, 0-50%, 0,5-50%, 0,5-25%, 0,5-10%, 0,5-7,5% или 0,9-5,3%; G2 на уровне 0-100%, 1-100% или 39-92%; и/или G0-2GlcNac на уровне 0-100%, 1-100% или 38-88%.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, содержащих CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит: GO на уровне приблизительно 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более, 50% или более, 55% или более, 60% или более, 0-100%, 1-100%, 30-100%, 40-90%, 50-80% или 55-80%; G1 на уровне приблизительно 2,5% или более, 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 50% или более, 0-100%, 1-100%, 0-50%, 1-50%, 1-40%, 1-35% или 8-31%; G0-GlcNac на уровне приблизительно 5% или менее, 7,5% или менее, 10% или менее, 15% или менее, 20% или менее, 25% или менее, 30% или менее, 40% или менее, 50% или менее, 75% или менее, 0-100%, 0,5-100%, 0-50%, 0,5-50%, 0,5-25%, 0,5-10%, 0,5-7,5% или 0,9-5,3%; G2 на уровне 0-100%, 1-100% или 39-92%; и/или G0-2GlcNac на уровне 0-100%, 1-100% или 38-88%.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб, где композиция содержит: G0 на уровне приблизительно 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более, 50% или более, 55% или более, 60% или более, 0-100%, 1-100%, 30-100%, 40-90%, 50-80% или 55-80%; G1 на уровне приблизительно 2,5% или более, 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 50% или более, 0-100%, 1-100%, 0-50%, 1-50%, 1-40%, 1-35% или 8-31%; G0-GlcNac на уровне приблизительно 5% или менее, 7,5% или менее, 10% или менее, 15% или менее, 20% или менее, 25% или менее, 30% или менее, 40% или менее, 50% или менее, 75% или менее, 0-100%, 0,5-100%, 0-50%, 0,5-50%, 0,5-25%, 0,5-10%, 0,5-7,5% или 0,9-5,3%; G2 на уровне 0-100%, 1-100% или 39-92%; и/или G0-2GlcNac на уровне 0-100%, 1-100% или 38-88%.

В одном воплощении композиция содержит смесь антител, где 100% афукозилированы. В другом воплощении композиция содержит смесь антител, где 0% фукозилированы.

В одном примере гликозилирующие модификации и полученный профиль могут быть определены с применением разделения ультраэффективной жидкостной хроматографией (UPLC) с жидкостной хроматографией гидрофильного взаимодействия (HILIC) и флуоресцентным выявлением. В одном примере композиция, описанная здесь, например, содержащая белантамаб, может быть разбавлена водой до концентрации 10 мкг/мкл, и затем может быть проведено высвобождение гликанов из композиции, например, содержащей белантамаб, посредством ферментативного расщепления ферментом PNGase F (Пептид^-Гликозидаза F) с использованием набора PNGase F Kit от New England BioLabs (номер по каталогу P0705L). Высвобождение гликанов возможно под действием PNGase F с их последующим мечением антраниламидом (Sigma-Aldrich, номер по каталогу А89804). Затем меченные гликаны могут быть очищены для удаления избытка раствора, использованного при мечении, с применением стадии, включающей колонки для HILIC; гликаны могут быть загружены, отмыты водой и элюированы ацетонитрилом. Затем меченные гликаны могут быть разделены с использованием колонки Waters Glycan ВЕН Amide (номер по каталогу 186004742) на Waters Acquity UPLC с градиентом формиата аммония / муравьиной кислоты и ацетонитрила. Затем может быть проведено выявление гликанов, например, флуоресцентное выявление с возбуждением при 365 нм и эмиссией при 438 нм. Количественное определение гликанов может быть проведено, например, делением площади под кривой гликана на общую площадь под кривыми всех выявленных гликанов.

В одном аспекте композиция содержит антитела, представляющие собой агрегированные антитела (разновидности с высокой молекулярной массой (HMW)), также называемые здесь «агрегированными вариантами». Агрегированные антитела могут включать димеры или структуры более высокого порядка, образованные мономерами антител и их субъединицами. Агрегированные варианты могут представлять собой, например, ковалентные или нековалентные, восстанавливаемые или невосстанавливаемые и видимые или невидимые невооруженным глазом агрегаты антитела, раскрытого здесь. Агрегированные или фрагментированные варианты можно охарактеризовать и отличить от антитела по их размеру. Например, распределение композиции антитела по размеру может быть определено с применением эксклюзионной хроматографии (SEC), такой как SE-HPLC.

В одном аспекте композиция содержит агрегированный вариант антитела, где агрегированный вариант содержит последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQIDNCvl, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 10% или менее агрегированного варианта.

Композиция антитела может содержать 10% или менее агрегированного варианта, например, 7,5% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее или 1% или менее агрегированного варианта. В другом воплощении композиция может содержать 1-10%, 1-5%, 1-4%, 1-3% или 1-2% агрегированного варианта. Альтернативно, композиция содержит более 1% и менее 10% агрегированного варианта. Альтернативно, композиция может содержать приблизительно 7,5%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1%, агрегированного варианта.

Фрагментированные варианты («вариант-фрагмент») представляют собой варианты, содержащие часть полноразмерного антитела. Например, такие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и отдельные вариабельные домены иммуноглобулинов.

В одном аспекте композиция содержит вариант-фрагмент антитела, где вариант-фрагмент содержит последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 10% или менее варианта-фрагмента.

Композиция антитела может содержать 10% или менее фрагментированных антител, например, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее или 1% или менее фрагментированных антител. В другом воплощении композиция может содержать 0,5-10%, 0,5-5%, 0,5-4%, 0,5-3%, 0,5-2%, 0,5-1,5% или 0,5-1% фрагментированных антител. Альтернативно, композиция может содержать приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2%, приблизительно 1% или приблизительно 0,5% фрагментированных антител.

Композиция может содержать любое одно или комбинацию из кислого варианта, основного варианта, варианта с изомеризацией, варианта с окислением, варианта с дезамидированием, варианта с N-концевой пироглутаминовой кислотой, варианта с отщеплением С-концевого лизина и/или любой процент вариантов с гликозилирующими модификациями и/или агрегированных и/или фрагментированных вариантов, как описано здесь.

В одном воплощении композиция имеет 70% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА, 70% или более связывания с FcγRIIIa и/или 70% или более связывания с FcRn.

В другом воплощении композиция имеет приблизительно 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более или 95% или более специфичного связывания с антигеном ВСМА. В другом воплощении композиция имеет приблизительно 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более связывания с FcγRIIIa. В другом воплощении композиция имеет приблизительно 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более связывания с FcRn.

В другом воплощении композиция имеет специфичное связывание с антигеном в диапазоне приблизительно от 70% до 130%, связывание с FcγRIIIa в диапазоне от приблизительно 70% до 130% и/или связывание с FcRn в диапазоне от приблизительно 70% до 130%.

В различных воплощениях композиция имеет специфичное связывание с антигеном в диапазоне от приблизительно 75% до приблизительно 125%, от приблизительно 80% до приблизительно 120%, от приблизительно 90% до приблизительно 110%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или 100%, приблизительно 110%, приблизительно 120% или приблизительно 130%. В некоторых воплощениях композиция имеет связывание с FcγRIIIa в диапазоне от приблизительно 75% до приблизительно 125%, от приблизительно 80% до приблизительно 120%, от приблизительно 90% до приблизительно 110%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 100%, приблизительно 105% или приблизительно 110%. В некоторых воплощениях композиция имеет связывание с FcRn в диапазоне от приблизительно 75% до приблизительно 125%, от приблизительно 80% до приблизительно 120%, от приблизительно 90% до приблизительно 110%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 100%, приблизительно 105%, приблизительно 110%.

В другом воплощении композиция, содержащая вариант, имеет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% активности белантамаба, имеющего 100%-ю активность. В одном аспекте композиция содержит вариант, который содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция имеет по меньшей мере 70% активности композиции, содержащей последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9, 11, 12, 13 или 14, последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10 и любое одно или комбинацию из (1) до 23% изомеризации по положению D103 и/или (2) до 37% окисления по положению М34.

В другом аспекте композиция содержит вариант, который содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция имеет по меньшей мере 70% активности композиции, содержащей последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9, 11, 12, 13 или 14, последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10 и любое одно или комбинацию из (1) до 23% изомеризации по положению D103, (2) до 37% окисления по положению М34, (3) до 64% окисления по положению М256, (4) до 61% окисления по положению М432, (5) до 100% дезамидирования по положению N388 и/или (6) до 100% дезамидирования по положению N393. В еще одном аспекте композиция содержит вариант, который содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ IDNO: 6, где композиция имеет по меньшей мере 70% активности композиции, содержащей последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9, 11, 12, 13 или 14, последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10 и любое одно или комбинацию из (1) до 23% изомеризации по положению D103, (2) до 37% окисления по положению М34, (3) до 64% окисления по положению М256, (4) до 61% окисления по положению М432, (5) до 100% дезамидирования по положению N388, (6) до 100% дезамидирования по положению N393, (7) до 100% отщепления С-концевого лизина НС и/или (8) до 100% N-концевой пироглутаминовой кислоты НС.

В одном примере связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряют с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Белантамаб мафодотин может быть разбавлен до 10 мкг/мл с использованием PBST, введен и захвачен белком А, иммобилизованным на сенсорном чипе СМ5. Затем ВСМА может быть введен и связан с захваченным белантамабом мафодотином. После этого FcγRIIIa может быть введен и связан с захваченным белантамабом мафодотином. Функциональные концентрации белантамаба мафодотина при связывании с ВСМА и FcγRIIIa могут быть рассчитаны по эталонной калибровочной кривой и выражены как концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa, соответственно. Общую концентрацию белантамаба мафодотина в образце определяют заранее по оптической плотности при 280 нм. Активность специфичного связывания (%) может быть рассчитана делением концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa на концентрацию, определенную по оптической плотности при 280 нм.

Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с антигенсвязывающим белком против ВСМА, например, с белантамабом, может быть измерено с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Белантамаб может быть захвачен FcRn, иммобилизованным на сенсорном чипе с нитрилотриуксусной кислотой (NTA). Концентрация образца при связывании с FcRn может быть определена интерполяцией ответа связывания на калибровочную кривую. Активность специфичного связывания (%) рассчитывают делением концентрации при связывании с FcRn на общую концентрацию белка.

Помимо других способов, известных специалистам в данной области, связывание антигенсвязывающего белка против ВСМА, например, белантамаба мафодотина, с ВСМА и FcγRIIIa может быть измерено с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В одном примере проводят введение белантамаба мафодотина и его захват белком А, иммобилизованным на сенсорном чипе СМ5. Затем проводят введение ВСМА и его связывание с захваченным белантамабом мафодотином. После этого проводят введение FcγRIIIa и его связывание с захваченным белантамабом мафодотином. Функциональные концентрации белантамаба мафодотина при связывании с ВСМА и FcγRIIIa могут быть рассчитаны по эталонной калибровочной кривой и выражены как концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa, соответственно. Общая концентрация белантамаба мафодотина в образце может быть определена заранее по оптической плотности при 280 нм. Активность специфичного связывания (%) может быть рассчитана делением концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa на концентрацию, определенную по оптической плотности, например, при 280 нм.

В определенных воплощениях на связывание с FcRn влияют среднее DAR или процент DL. В другом воплощении среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с FcRn. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL влияют на связывание с FcRn. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с FcRn. В одном воплощении среднее DAR или процент DL могут ослаблять связывание с FcRn.

Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с антигенсвязывающим белком против ВСМА, например, с белантамабом мафодотином, может быть измерено с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Белантамаб мафодотин может быть захвачен FcRn, иммобилизованным на сенсорном чипе с нитрилотриуксусной кислотой (NTA). Концентрация образца при связывании с FcRn может быть определена интерполяцией ответа связывания на калибровочную кривую. Активность специфичного связывания (%) рассчитывают делением концентрации при связывании с FcRn на общую концентрацию белка.

Когда антигенсвязывающий белок против ВСМА включает белантамаб мафодотин, в SPR-методах, описанных здесь применительно к специфичному связыванию с антигеном и связыванию с FcγRIIIa и FcRn, может быть использован эталонный стандарт белантамаба или белантамаба мафодотина. Эталонный стандарт белантамаба или белантамаба мафодотина может быть использован в анализах для получения данных о пригодности систем и сопоставимости образцов с целью подтверждения надлежащего соблюдения методов. Эталонный стандарт позволяет построить калибровочную кривую, и концентрации образцов интерполируют по этой кривой. Например, эталонный стандарт может представлять собой композицию, содержащую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10.

Композиция антитела, содержащая антитело и варианты антитела, описанные выше, сохраняет специфичное связывание с антигеном, и/или связывание с FcRn, и/или связывание с FcγRIIIa, и/или активность. Например, композиция антитела, содержащая антитело, варианты антитела и варианты с посттрансляционными модификациями, описанные выше, имеет более 0,70 специфичного связывания с антигеном ВСМА, и/или более 70% связывания с FcRn, и/или 70% связывания с FcγRIIIa, и/или более 70% активности. Таким образом, эти уровни (%) вариантов в композиции антитела могут быть допустимыми, не оказывая существенного влияния на функцию (то есть, не приводя к снижению активности). В одном воплощении «сниженная функция» или «сниженная активность» означают, что связывание с ВСМА, или связывание с FcRn, или связывание с FcγRIIIa, или активность снижены на некоторый процент по сравнению с эталонным стандартом и это снижение значимо с учетом вариабельности анализа. Например, сниженная функция или активность могут быть описаны как снижение на 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более или 50% или более.

В другом воплощении эталонный стандартный образец представляет собой композицию, содержащую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 80% или более отщепления С-концевого лизина тяжелой цепи и 100% или менее N-концевой пироглутаминовой кислоты тяжелой цепи. В другом воплощении эталонный стандартный образец представляет собой композицию, содержащую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 80% или более отщепления С-концевого лизина тяжелой цепи, 100% или менее N-концевой пироглутаминовой кислоты тяжелой цепи и 7% или менее изомеризации по аминокислоте D103 в CDRH3. В другом воплощении эталонный стандартный образец представляет собой композицию, содержащую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 80% или более отщепления С-концевого лизина тяжелой цепи, 100% или менее N-концевой пироглутаминовой кислоты тяжелой цепи, 7% или менее изомеризации по аминокислоте D103 в CDRH3 и 5% или менее окисления по аминокислотам М34, М256 и/или М432. В другом воплощении эталонный стандартный образец представляет собой композицию, содержащую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 80% или более отщепления С-концевого лизина тяжелой цепи, 100% или менее N-концевой пироглутаминовой кислоты тяжелой цепи, 7% или менее изомеризации по аминокислоте D103 в CDRH3, 5% или менее окисления по аминокислотам М34, М256 и/или М432 и 2% или менее дезамидирования по аминокислотам N388 и/или N393. В другом воплощении эталонный стандартный образец представляет собой композицию, содержащую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 80% или более отщепления С-концевого лизина тяжелой цепи, 100% N-концевой пироглутаминовой кислоты тяжелой цепи, 7% или менее изомеризации по аминокислоте D103 в CDRH3, 5% или менее окисления по положению М34 и М432 и 2% или менее дезамидирования по аминокислотам N388 и/или N393.

Конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC)

Конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC) являются новым классом активных противораковых агентов, которые недавно продемонстрировали существенную клиническую эффективность. ADC состоят из цитотоксического агента, химически связанного с антителом через линкер. Предположительно, в результате ряда событий, включая связывание с антигеном на поверхности клетки, эндоцитоз, перемещение в лизосому, расщепление ADC, высвобождение активного агента, прерывание клеточных процессов (например, митоза) и апоптоз, ADC могут разрушать раковые клетки, обладающие сверхэкспрессией белков клеточной поверхности. ADC сочетают свойства моноклональных антител, обусловленные их направленным действием на антигены, с сильными противоопухолевыми эффектами цитотоксических агентов. Например, в 2011 г. было получено разрешение надзорных органов на применение ADCETRIS® (ADC антитела против CD30 и ММАЕ) для лечения рефрактерной лимфомы Ходжкина и системной анапластической лимфомы.

ADC используют для местной доставки цитотоксических агентов, то есть лекарственных средств, уничтожающих клетки или ингибирующих рост или пролиферацию клеток, при лечении рака (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu etal. (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; патент США №4,975,278). ADC позволяют проводить направленную доставку лекарственной группировки в опухоль и обеспечивать ее внутриклеточное накопление в опухоли в тех случаях, когда системное введение неконъюгированных лекарственных средств может привести к неприемлемым уровням токсичности в отношении нормальных клеток наряду с опухолевыми клетками, которые необходимо устранить (Baldwin et al, Lancet (Mar. 15, 1986) pp.603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al, eds) pp.475-506. Согласно сообщениям, в этих методиках могут быть использованы как поликлональные антитела, так и моноклональные антитела (Rowland et al, (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Токсины, используемые в конъюгатах антител с токсинами, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler etal. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler etal. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтансиноиды (ЕР 1391213; Liu etal. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman etal. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342).

В одном воплощении антигенсвязывающий белок против ВСМА представляет собой конъюгат антитела с лекарственным средством («ADC против ВСМА»), содержащий антитело или фрагмент антитела, конъюгированные с одним или более чем одним цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, лекарственное средство, ростингибирующий агент, токсин (например, белковый токсин, токсин, обладающий ферментативной активностью, бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоконъюгат).

В одном воплощении ADC против ВСМА имеет следующую общую структуру:

ABP-((линкер)_n-Ctx)_m,

где:

АВР представляет собой антигенсвязывающий белок, антитело или фрагмент антитела;

линкер либо отсутствует, либо представляет собой любой расщепляемый или нерасщепляемый линкер;

Ctx представляет собой любой цитотоксический агент, описанный здесь;

n представляет собой 0, 1, 2 или 3; и

m представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.

В типичных воплощениях токсины, обладающие ферментативной активностью, и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модессина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин или трихотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г. Для получения радиоконъюгированных антител доступны множество радионуклидов, включая, например, ²¹¹At, ²¹²Bi, ¹³¹L ¹³¹bi, ⁹⁰Y или ¹⁸⁶Re.

Антитело против ВСМА или его фрагменты по настоящему изобретению могут также быть конъюгированы с одним или более чем одним цитотоксическим агентом, включая, без ограничения, калихеамицин, майтансиноиды, доластатины, ауристатины, трихотецен и СС1065, или с производными этих токсинов, обладающими токсинной активностью. Подходящие цитотоксические агенты включают, например, ауристатин, включая довалин-валин-долаизолейцин-долапролин-фенилаланин (MMAF) и монометилауристатин Е (ММАЕ), а также сложноэфирные формы ММАЕ, агент, связывающийся с малой бороздкой ДНК, агент, алкилирующий малую бороздку ДНК, ендиин, лекситропсин, дуокармицин, таксан, включая паклитаксел и доцетаксел, пуромицин, доластатин, майтансиноид и алкалоид барвинка. Конкретные цитотоксические агенты включают топотекан, морфолинодоксорубицин, ризоксин, цианоморфолинодоксорубицин, доластатин-10, эхиномицин, комбретастатин, калихеамицин, майтансин, DM-1, DM-4, нетропсин. Другие подходящие цитотоксические агенты включают антитубулиновые агенты, такие как ауристатин, алкалоид барвинка, подофиллотоксин, таксан, производное баккатина, криптофизин, майтансиноид, комбретастатин или доластатин. Антитубулиновый агент включает диметилвалин-валиндолаизолейцин-долапролин-фенилаланин-и-фенилендиамин (AFP), MMAF, ММАЕ, ауристатин Е, винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин, VP-16, камптотецин, паклитаксел, доцетаксел, эпотилон А, эпотилон В, нокодазол, колхицины, колцемид, эстрамустин, цемадотин (cemadotin), дискодермолид, майтансин, DM-1, DM-4 или элеутеробин.

В одном воплощении ADC против ВСМА содержит антитело против ВСМА, связанное с ММАЕ или MMAF:

Типичные линкеры включают расщепляемые и нерасщепляемые линкеры. Расщепляемый линкер может быть подвержен расщеплению при внутриклеточных условиях. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, такой как лизосомальная протеаза или эндосомалъная протеаза. В типичных воплощениях линкер может представлять собой дипепшдный линкер, такой как валин-цитруллиновый (val-cit) или фенилаланин-лизиновый (phe-lys) линкер. Другие подходящие линкеры включают, например, линкеры, гидролизуемые при рН менее 5,5, такие как гидразоновый линкер. Дополнительные подходящие расщепляемые линкеры включают, например, дисулъфидные линкеры. Типичные линкеры включают 6-малеимидокапроил (МС), малеимидопропаноил (MP), валин-цитруллин (val-cit), аланин-фенилаланин (ala-phe), n-аминобензилоксикарбонил (РАВ), N-сукцимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) и N-сукцимидил-(4-йодацетил)аминобензоат (SIAB).

В одном воплощении линкер может содержать таолореактивный малеимид, капроиловый спейсер, дипептид валин-5-цитруллин, п-аминобензилоксикарбонил, саморасщепляемую фрагментирующую группу или протеазоустойчивый мал еими докапроил.

В другом воплощении ADC против ВСМА содержит антитело против ВСМА, связанное с ММАЕ или MMAF МС-линкером, как показано в следующих структурах:

ADC против ВСМА, описанный здесь, может содержать любое антитело против ВСМА, описанное здесь, с любым цитотоксическим агентом, описанным здесь.

В одном воплощении ADC против ВСМА содержит антитело против ВСМА, содержащее: CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 93%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1; CDB.H2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; CDB.H3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3; CDEL1, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4; CDBJL2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5; и/или CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6; и конъюгирован с ММАЕ или MMAF.

В еще одном воплощении ADC против ВСМА содержит антитело против ВСМА, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и конъюгированное с MMAF или ММАЕ.

В одном воплощении ADC против ВСМА содержит антитело против ВСМА, содержащее: V_H, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7; и/или V_L, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8; и конъюгирован с ММАЕ или MMAF.

В еще одном воплощении ADC против ВСМА содержит антитело против ВСМА, содержащее V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, и конъюгированное с MMAF или ММАЕ.

В одном воплощении ADC против ВСМА содержит антитело против ВСМА, содержащее: НС, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9; и/или LC, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10; и конъюгирован с MMAF или ММАЕ.

В еще одном воплощении ADC против ВСМА представляет собой белантамаб мафодотин, который содержит антитело против ВСМА, содержащее НС с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9, и LC с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10, и конъюгированное с MMAF.

Получение ADC и определение их характеристик

В определенных природных IgG1 молекулы содержат по 16 дисульфидных связей (32 цистеина или 32 сульфгидрильные группы). В определенных аспектах антитело может быть восстановлено таким образом, что только четыре межцепочечные дисульфидные связи будут восстановлены и конъюгированы с цитотоксическим агентом, что позволяет получить до восьми сайтов присоединения для цитотоксического агента. Иными словами, лекарственная нагрузка («DL»), то есть число цитотоксических агентов на молекулу антитела, может варьировать от 0 до 8 и описана здесь как DLO, DL2 (включая DL2a и DL2b), DL4 (включая DL4a, DL4b и DL4c), DL6 (включая DL6a и DL6b) и DL8.

Процесс конъюгации может приводить к неоднородности присоединения лекарственного средства к антителу в данной композиции ADC, варьируя как по (1) числу лекарственных средств, связанных с каждой молекулой антитела, так и по (2) расположению цитотоксического агента. Это может приводить к композиции ADC с различными DL-разновидностями, как показано на ФИГ. 1. При использовании здесь термин «композиция ADC» относится к композиции, содержащей неоднородную смесь разновидностей антитела с различной лекарственной нагрузкой («DL»). (См., например, ФИГ. 2.) Среднее отношение лекарственного средства к антителу во всей неоднородной композиции ADC названо здесь «средним DAR» или «DAR». Например, композиция ADC может содержать смесь разновидностей антитела, каждая из которых имеет свою собственную DL (некоторые разновидности в смеси представляют собой DL2, некоторые разновидности в смеси представляют собой DL4, некоторые разновидности в смеси представляют собой DL6, и некоторые разновидности в смеси представляют собой DL8), и среднее DAR во всей композиции может составлять приблизительно 4.

В другом воплощении для описания процента конкретных DL-разновидностей в неоднородной композиции ADC может быть использован термин «процент DL» (например, процент DL2 составляет от приблизительно 10% до приблизительно 30% всей неоднородной композиции ADC).

В определенных аспектах изобретения лекарственные средства могут быть конъюгированы с антителами через сульфгидрильные группы антител. Сульфгидрильные группы могут представлять собой сульфгидрильные группы цистеиновых боковых цепей. Цистеиновые остатки могут присутствовать в антителе естественным образом (например, межцепочечные дисульфиды) или могут быть введены другими способами, например, мутагенезом. Способы конъюгации лекарственных средств с сульфгидрильными группами антител хорошо известны в данной области (см., например, патент США №№7,659,241, 7,498,298, международные публикации №№ WO 2011/130613, WO 2014/152199, WO 2015/077605 и Bioconjugate Chem. 2005, 16, 1282-1290). Перед конъюгацией антитела обычно восстанавливают для обеспечения доступности сульфгидрильных групп для конъюгации. Антитела могут быть восстановлены с применением условий, известных в данной области. Восстанавливающие условия представляют собой условия, которые обычно не приводят к сколько-нибудь существенной денатурации антитела и обычно не влияют на аффинность связывания антитела с антигеном.

В одном аспекте изобретения восстанавливающий агент, используемый на стадии восстановления, представляет собой ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил)фосфин) и ТСЕР добавляют, например, в избытке на 30 минут при комнатной температуре. Например, 250 мкл 10 мм раствора ТСЕР при рН 7,4 легко восстановят межцепочечные дисульфиды в 1-100 мкг антитела за 30 минут при комнатной температуре. Тем не менее, могут быть использованы другие восстанавливающие агенты и условия. Примеры условий взаимодействия включают температуры от 5°С до 37°С в диапазоне рН от 5 до 8.

Существуют различные методы расчета процента DL-разновидностей и/или среднего DAR в композиции ADC, известные специалистам в данной области. Например, неоднородность ADC, связанных через цистеин, обычно измеряют хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC), позволяющей разделять DL-разновидности по числу связанных лекарственных средств. Также разработаны LC-MS-анализы для оценки распределения DL. Типичные методы расчета распределения лекарственной нагрузки в композиции ADC приведены, например, в Journal of Chromatography В 1060 (2017) 182-189.

Например, DL0 не имеет лекарственной нагрузки на антителе. В случае DL2, например, лекарственная нагрузка составляет два. В одном воплощении сайтами конъюгации в случае DL2 являются LC С214 и НС 224. В случае DL4, например, лекарственная нагрузка составляет четыре. В одном воплощении сайтами конъюгации в случае DL4a являются LC С214, НС 224, LC С214 и НС 224. В одном воплощении сайтами конъюгации в случае DL4b являются LC С230, НС 233, LC С230 и НС 233. В случае DL6, например, лекарственная нагрузка составляет шесть. В одном воплощении сайтами конъюгации в случае DL6 являются LC С214, НС 224, LC С230, НС 233, LC С230 и НС 233. В случае DLS, например, лекарственная нагрузка составляет восемь. В одном воплощении сайтами конъюгации в случае DLS являются LC С214, НС 224, LC С214, НС 224, LC С230, НС 233, LC С230 и НС 233.

В одном воплощении процент конкретных DL-разновидностей (например, процент DL0, процент DL2, процент DL4a, процент DL4b, процент DL6, процент DLS) может быть определен разделением отдельных DL-разновидностей с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), расчетом площади под кривой для каждого DL-пика и делением каждого DL-пика на общую площадь под кривой для всех DL-разновидностей вместе взятых. В одном воплощении среднее DAR может быть рассчитано, исходя из площади под кривой каждой DL-разновидности с применением следующей формулы:

где:

%DL Componentx представляет собой % DL-компонентах;

A_X представляет собой площадь пика X;

X представляет собой А₀, A₁, А₂, A₃, А_4а, A_4b, А₅, А₆, A₈ и А₁₀;

А₀, A₁, А₂, A₃, A_4a, A_4b, А₅, А₆, A₈ и А₁₀ представляют собой площади пиков DL0, DL1, DL2, DL3, DL4a, DL4b, DL5, DL6, DL8 и DL10 (включая только пики DL (0,08%) или более).

В одном воплощении процент конкретных DAR-подразновидностей (например, процент DL2a среди всех DL2) определяют, получая конкретную DL-разновидность с применением комбинации аналитических методик, которая может включать HIC, невосстанавлиЕающие методы разделения и масс-спектрометрические методики.

В одном воплощении композиция ADC против ВСМА имеет среднее DAR от приблизительно 2 до приблизительно 7, от приблизительно 2 до приблизительно 6, от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7, от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,0, от приблизительно 2,1 до приблизительно 4,6, от приблизительно 2,1 до приблизительно 4,1, от приблизительно 2,1 до приблизительно 3,5, от приблизительно 2,1 до приблизительно 3,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,7, от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 4,6, от приблизительно 3,0 до приблизительно 4,1, от приблизительно 3,0 до приблизительно 3,5, от приблизительно 3,5 до приблизительно 5,7, от приблизительно 3.5 до приблизительно 5,0, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,6, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,1, от приблизительно 3,8 до приблизительно 4,5, от приблизительно 4,1 до приблизительно 5,7, от приблизительно 4,1 до приблизительно 5,0, от приблизительно 4,1 до приблизительно 4,6, от приблизительно 4.6 до приблизительно 5,7, от приблизительно 4,6 до приблизительно 5,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,7, приблизительно 2,1, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,1, приблизительно 4,6, приблизительно 5,0 или приблизительно 5,7.

В другом воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где среднее DAR составляет от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7, от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6, от приблизительно 3,8 до приблизительно 4,5 или приблизительно 4.

В одном воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 2 до приблизительно 6, от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7, от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6 или от приблизительно 3,8 до приблизительно 4,5.

В одном воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 2 до приблизительно 6, от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7, от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6 или от приблизительно 3,8 до приблизительно 4,5.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин, где среднее DAR составляет от приблизительно 2 до приблизительно 6, от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7, от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6 или от приблизительно 3,8 до приблизительно 4,5.

В одном воплощении процент DL0-разновидности в композиции ADC против ВСМА составляет приблизительно 10% или менее, приблизительно 5% или менее, от приблизительно 1%до приблизительно 10%, от приблизительно 1%до приблизительно 5% или от приблизительно 2,8% до приблизительно 4,7%.

В одном воплощении процент DL2-разновидностей в композиции ADC против ВСМА составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, от приблизительно 15,8% до приблизительно 26,3%, от приблизительно 15% до приблизительно 27%, от приблизительно 15% до приблизительно 32% или от приблизительно 10% до приблизительно 40%.

В одном воплощении процент ОЬ4а-разновидности в композиции ADC против ВСМА составляет по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, от приблизительно 35,5% до приблизительно 37,9%, от приблизительно 35% до приблизительно 38%, от приблизительно 30% до приблизительно 40% или от приблизительно 20% до приблизительно 50%. В другом воплощении BL4a-разновидность является доминирующей разновидностью в композиции ADC против ВСМА и составляет приблизительно 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более или 90% или более всех разновидностей вместе взятых.

В одном воплощении процент BL4b-разновидности в композиции ADC против ВСМА составляет по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 7%, от приблизительно 7,1% до приблизительно 8,5%, от приблизительно 7% до приблизительно 9%, от приблизительно 5% до приблизительно 10% или от приблизительно 1% до приблизительно 15%.

В одном воплощении процент DL66-разновидностей в композиции ADC против ВСМА составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 14%, от приблизительно 14,0% до приблизительно 19,1%, от приблизительно 14% до приблизительно 20%, от приблизительно 10% до приблизительно 20% или от приблизительно 5% до приблизительно 30%.

В одном воплощении процент DL8-разновидности в композиции ADC против ВСМА составляет по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 6%, от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0%, от приблизительно 4% до приблизительно 15% или от приблизительно 1% до приблизительно 20%.

В одном воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В одном воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В одном воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин, где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

При использовании здесь термин «нежелательные DAR-разновидности» относится к любым DAR-разновидностям, присутствие которых в готовой композиции нежелательно и которые могут оказывать отрицательное влияние на определенные свойства (например, связывание с мишенью, эффективность, безопасность и так далее) готовой лекарственной формы. В одном воплощении нежелательной DAR-разновидностью является DL0, то есть антитело, не связанное с цитотоксическим агентом после конъюгации. В одном воплощении процент DL0 в композиции ADC меньше или равен приблизительно 15%, приблизительно 14%, приблизительно 13%, приблизительно 12%, приблизительно 11%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2%, приблизительно 1% или приблизительно 0,5%. В другом воплощении процент DL0 в композиции ADC составляет от приблизительно 1% до приблизительно 10%, от приблизительно 2% до приблизительно 5% или от приблизительно 2,0% до приблизительно 4,8%.

В одном воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%.

В одном воплощении композиция содержит ADC против ВСМА, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В определенных воплощениях среднее DAR или процент DL влияют на ингибирование роста клеток и/или объема опухоли. В определенных воплощениях среднее DAR не влияет на ингибирование роста клеток и/или объема опухоли. В другом воплощении по мере повышения среднего DAR или процента DL происходит усиление ингибирования роста клеток и/или уменьшение объема опухоли. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и по мере повышения среднего DAR или процента DL в композиции происходит усиление ингибирования роста раковых клеток и/или уменьшение объема опухоли.

Относительная активность ингибирования роста клеток может быть определена измерением жизнеспособности клеток клеточной линии (например, линии клеток множественной миеломы) после инкубации с композицией, описанной здесь (например, с белантамабом мафодотином). Жизнеспособность клеток может быть измерена с применением анализа жизнеспособности клеток, известного специалистам в данной области. Дозозависимость (полумаксимальная эффективная концентрация или ЕС₅₀) может быть определена с применением логистической модели нелинейной регрессии. Для определения относительной активности может быть рассчитано отношение ЕС₅₀ эталонного стандарта к ЕС₅₀ образца, содержащего композицию.

В одном воплощении композиция имеет относительную активность ингибирования роста клеток от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,3 или от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,1. В другом воплощении композиция имеет среднее DAR от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7 и относительную активность ингибирования роста клеток от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,3. В другом воплощении композиция имеет среднее DAR от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0 или от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,6 и относительную активность ингибирования роста клеток от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,1. В другом воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин со средним DAR от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0 или от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,6 и имеет относительную активность ингибирования роста клеток от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,1.

В определенных воплощениях среднее DAR или процент DL влияют на ADCC-активность. В другом воплощении среднее DAR или процент DL не влияют на ADCC-активность. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL влияют на ADCC-активность. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL не влияют на ADCC-активность.

Относительная ADCC-активность может быть измерена, например, инкубацией белантамаба мафодотина, клеток (например, клеток множественной миеломы) и NK-клеток (эффекторных клеток). Безотносительно теории, белантамаб мафодотин связывается с ВСМА, экспрессированным на поверхности клеток, а Fc-область антитела связывается с FcγRIIIa на эффекторных клетках через их FcγRIIIa-рецептор. Связывание с этими рецепторами на поверхности эффекторных клеток приводит к синтезу и секреции цитокинов (IFNg) и высвобождению гранул (перфорин и гранзимы), проникающих в цитоплазму клеток-мишеней. Гранзимы запускают в клетках-мишенях сигнальные события, приводящие к гибели этих клеток посредством апоптоза. Источником NK-клеток могут быть мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), которые могут быть выделены из цельной человеческой крови. Затем может быть добавлен BATDA (бис-(ацетоксиметил)-2,2':6',2''-терпиридин-6,6''-дикарбоксилат) для проникновения через мембраны клеток-мишеней и мечения клеток. После цитолиза этот лиганд можно сочетать с раствором DELFIA Europium Solution с получением высоко флуоресцентного и стабильного хелата (EuTDA). Измеренный сигнал прямо коррелирует с количеством лизированных клеток. ADCC-активность может затем быть выражена как отношение значения ЕС₅₀ образца к ЕС₅₀ эталонного стандарта.

В одном воплощении композиция имеет относительную ADCC-активность от приблизительно 0,70 до приблизительно 1,30 или от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,1. В другом воплощении композиция имеет среднее DAR от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7 и относительную ADCC-активность от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,3. В другом воплощении композиция имеет среднее DAR от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0 или от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,6 и относительную ADCC-активность от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,1. В другом воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин со средним DAR от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0 или от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,6 и имеет относительную ADCC-активность от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,1.

В определенных воплощениях среднее DAR или процент DL влияют на связывание с ВСМА. В другом воплощении среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с ВСМА. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL влияют на связывание с ВСМА. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с ВСМА. В одном воплощении среднее DAR или процент DL могут ослаблять связывание с ВСМА.

В одном воплощении композиция имеет относительное специфичное связывание с антигеном ВСМА 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более. В другом воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и имеет относительное специфичное связывание с антигеном ВСМА более 85% или более 90%. В другом воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин, имеет среднее DAR от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7, или от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0, или от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,6 и имеет относительное специфичное связывание с антигеном ВСМА более 85% или более 90%.

В определенных воплощениях среднее DAR или процент DL влияют на связывание с FcγRIIIa. В другом воплощении среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с FcγRIIIa. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL влияют на связывание с FcγRIIIa. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с FcγRIIIa. В одном воплощении среднее DAR или процент DL могут ослаблять связывание с FcγRIIIa.

В одном воплощении композиция имеет относительное связывание с FcγRIIIa 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более. В другом воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и имеет относительное связывание с FcγRIIIa более 85% или более 90%. В другом воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин, имеет среднее DAR от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7, или от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0, или от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,6 и имеет относительное связывание с FcγRIIIa более 85% или более 90%.

Помимо других способов, известных специалистам в данной области, связывание антигенсвязывающего белка против ВСМА, например, белантамаба мафодотина, с ВСМА и FcγRIIIa может быть измерено с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В одном примере проводят введение белантамаба мафодотина и его захват белком А, иммобилизованным на сенсорном чипе CMS. Затем проводят введение ВСМА и его связывание с захваченным белантамабом мафодотином. После этого проводят введение FcγRIIIa и его связывание с захваченным белантамабом мафодотином. Функциональные концентрации белантамаба мафодотина при связывании с ВСМА и FcγRIIIa могут быть рассчитаны по эталонной калибровочной кривой и выражены как концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa, соответственно. Общая концентрация белантамаба мафодотина в образце может быть определена заранее по оптической плотности при 280 нм. Активность специфичного связывания (%) может быть рассчитана делением концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa на концентрацию, определенную по оптической плотности, например, при 280 нм.

В определенных воплощениях на связывание с FcRn влияют среднее DAR или процент DL. В другом воплощении среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с FcRn. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL влияют на связывание с FcRn. В еще одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин и среднее DAR или процент DL не влияют на связывание с FcRn. В одном воплощении среднее DAR или процент DL могут ослаблять связывание с FcRn.

Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с антигенсвязывающим белком против ВСМА, например, с белантамабом мафодотином, может быть измерено с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Белантамаб мафодотин может быть захвачен FcRn, иммобилизованным на сенсорном чипе с нитрилотриуксусной кислотой (NTA). Концентрация образца при связывании с FcRn может быть определена интерполяцией ответа связывания на калибровочную кривую. Активность специфичного связывания (%) рассчитывают делением концентрации при связывании с FcRn на общую концентрацию белка.

Когда антигенсвязывающий белок против ВСМА включает белантамаб мафодотин, в SPR-методах, описанных здесь применительно к специфичному связыванию с антигеном и связыванию с FcγRIIIa и FcRn, может быть использован эталонный стандарт белантамаба или белантамаба мафодотина. Эталонный стандарт белантамаба или белантамаба мафодотина может быть использован в анализах для получения данных о пригодности систем и сопоставимости образцов с целью подтверждения надлежащего соблюдения методов. Эталонный стандарт позволяет построить калибровочную кривую, и концентрации образцов интерполируют по этой кривой. Например, эталонный стандарт может представлять собой композицию, содержащую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, с известным содержанием DL и/или средним DAR.

Типичные эталонные стандарты могут включать образцы белантамаба мафодотина с известными компонентами/количествами

DL-разновидностей и/или средним DAR.

Фармацевтические композиции

Композиция, описанная здесь, может быть представлена в форме фармацевтической композиции. «Фармацевтическая композиция» может содержать композицию, описанную здесь (то есть активный ингредиент), и один или более чем один фармацевтически приемлемый эксципиент.Эксципиент (эксципиенты) должен быть приемлемым в совместимости с другими ингредиентами состава, возможности его использования в фармацевтическом составе, безвредности для его реципиента и/или отсутствия отрицательного влияния на эффективность активного ингредиента.

При использовании здесь «фармацевтически приемлемый эксципиент» может включать все и любые растворители, разбавители, носители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и/или агенты, задерживающие всасывание. Примеры фармацевтически приемлемых эксципиентов включают одно или более из буферных агентов, воды, физиологического раствора, забуференного фосфатом физиологического раствора, декстрозы, глицерина, этанола и тому подобного, а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительным включить в композицию: изотонические агенты, например, полиолы, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия; консерванты; сорастворители; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; комплексы металлов (например, белковые комплексы Zn²⁺); биоразлагаемые полимеры; и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий или калий.

Точная природа эксципиента или другого вещества может зависеть от пути введения, который может быть, например, пероральным, ректальным, назальным, местным (включая трансбуккальный и сублингвальный), вагинальным, парентеральным (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, интратекальный и эпидуральный) и внутриопухолевым. Следует понимать, что предпочтительный эксципиент может варьировать в зависимости, например, от состояния реципиента и от заболевания, подлежащего лечению.

Смесь эксципиентов и концентрация каждого из них вместе образуют «фармацевтический состав» (или «состав»). Состав может быть представлен в жидкой форме или в лиофилизированной форме. Композиция в жидком составе может быть помещена в контейнеры и заморожена. В определенных воплощениях аликвоты замороженного состава, содержащего композицию, могут быть лиофилизированы. Лиофилизат может быть восстановлен добавлением воды или другого водного раствора с получением восстановленного состава, содержащего композицию.

В некоторых воплощениях антигенсвязывающий белок против ВМСА присутствует в составе в концентрации по меньшей мере приблизительно 10 мг/мл или по меньшей мере приблизительно 20 мг/мл. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий белок против ВМСА присутствует в составе в концентрации от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл или от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл. В определенных воплощениях концентрация антигенсвязывающего белка против ВМСА в составе составляет приблизительно 20 мг/мл, приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл, приблизительно 60 мг/мл или приблизительно 100 мг/мл. В одном воплощении антигенсвязывающий белок против ВМСА присутствует в жидком составе в концентрации приблизительно 20 мг/мл или приблизительно 25 мг/мл. В другом воплощении антигенсвязывающий белок против ВМСА присутствует в лиофилизированном составе в концентрации приблизительно 50 мг/мл или приблизительно 60 мг/мл. В еще одном воплощении антигенсвязывающий белок против ВМСА присутствует в восстановленном составе в концентрации приблизительно 50 мг/мл.

В определенных воплощениях буферный агент представляет собой цитратный буфер. Цитратный буфер может быть получен, например, с использованием системы конъюгат-кислота / конъюгат-основание (цитрат натрия / лимонная кислота) или титрованием раствора цитрата натрия с использованием HCl. В определенных воплощениях концентрация цитратного буфера составляет от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ. В предпочтительных воплощениях концентрация цитратного буфера составляет 25 мМ. В некоторых воплощениях буферный агент представляет собой гистидиновый буфер в концентрации от приблизительно 5 мМ до приблизительно 35 мМ.

Буферный агент может быть использован для содействия поддержанию предпочтительных диапазонов рН. В определенных воплощениях рН состава составляет от приблизительно 5,5 до приблизительно 7 или от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5, предпочтительно рН 6,2.

В некоторых воплощениях состав содержит полиол. В некоторых воплощениях полиол представляет собой сахар и, предпочтительно, невосстанавливающий сахар. В некоторых воплощениях невосстанавливающий сахар представляет собой трегалозу. В некоторых воплощениях состав содержит трегалозу в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В еще одном воплощении состав содержит приблизительно 200 мМ трегалозы.

В одном воплощении состав содержит хелатирующий агент.В другом воплощении хелатирующий агент представляет собой ЭДТА. В определенных воплощениях состав содержит ЭДТА в концентрации от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ. В еще одном воплощении состав содержит ЭДТА в концентрации 0,05 мМ.

В некоторых воплощениях состав содержит поверхностно-активное вещество. «Поверхностно-активные вещества» представляют собой поверхностно-активные агенты, которые могут оказывать свое действие на поверхностях раздела твердой и твердой фаз, твердой и жидкой фаз, жидкой и жидкой фаз и жидкой и воздушной фаз благодаря своему химическому составу, включающему как гидрофильные, так и гидрофобные группы. Поверхностно-активные вещества могут снижать концентрацию белков в разбавленных растворах на границе воздушной и водной фаз и/или водной и твердой фаз, где возможны адсорбция белков и, потенциально, их агрегация. Поверхностно-активные вещества могут связываться с гидрофобными границами раздела фаз в белковых составах. Некоторые потенциально приемлемые неионные поверхностно-активные вещества содержат полисорбатные или полиэфирные группы. Полисорбаты 20 и 80 являются подходящими поверхностно-активными стабилизаторами в составах по изобретению. В некоторых воплощениях состав содержит от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80. В еще одном воплощении состав содержит приблизительно 0,02% полисорбата 20 или полисорбата 80. В предпочтительном воплощении состав содержит приблизительно 0,02% полисорбата 80.

Один аспект изобретения относится к составу, содержащему от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл антигенсвязывающего белка против ВСМА, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ буферного агента, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ полиола при рН в диапазоне от 5,5 до 6,5.

В одном воплощении состав содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл антигенсвязывающего белка против ВСМА, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

В одном воплощении композиция содержит антитело в составе, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где состав содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл антитела, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

В одном воплощении композиция содержит антитело в составе, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, и где состав содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл антитела, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

В одном воплощении композиция содержит антитело в составе, где антитело представляет собой белантамаб и где состав содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл белантамаба, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

В одном воплощении композиция содержит ADC в составе, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксин представляет собой ММАЕ или MMAF и где состав содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл ADC, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

В одном воплощении композиция содержит ADC в составе, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксин представляет собой MMAF или ММАЕ и где состав содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл ADC, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

В одном воплощении композиция содержит ADC в составе, где ADC представляет собой белантамаб мафодотин и где состав содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл белантамаба мафодотина, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно ОД мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

В одном воплощении композиция содержит белантамаб мафодотин в составе, содержащем приблизительно 20 мг/мл, приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл или 60 мг/мл белантамаба мафодотина, 25 мМ цитратного буфера, 200 мМ трегалозы, 0,05 мМ динатриевой соли ЭДТА, 0,02% полисорбата или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

«Стабильный» состав представляет собой состав, в котором белок по существу сохраняет свою физическую и/или химическую стабильность во время изготовления, транспортировки, хранения и введения. Стабильность можно измерять при выбранной температуре на протяжении выбранного периода времени. Например, в случае продукта, хранимого при рекомендуемой температуре от 2°С до 8°С, состав стабилен при комнатной температуре, при приблизительно 30°С или при 40°С на протяжении по меньшей мере 1 месяца и/или стабилен при температуре приблизительно от 2 до 8°С на протяжении по меньшей мере 1 года и, предпочтительно, на протяжении по меньшей мере 2 лет.В качестве индикатора стабильности белка может быть использована, например, степень агрегации при хранении. Таким образом, «стабильный» состав может представлять собой состав, в котором в форме агрегатов представлены, например, менее чем приблизительно 10% и, предпочтительно, менее чем приблизительно 5% белка. В данной области доступны различные аналитические методики оценки стабильности белков, и их обзор приведен, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991), и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993).

В определенных аспектах изобретения состав позволяет сохранять стабильность композиции при замораживании, размораживании и/или перемешивании.

В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на изделие, например, набор, включающее контейнер, содержащий композицию в составе, описанном здесь. В одном аспекте предложено инъекционное устройство, содержащее состав. Инъекционное устройство может включать шприц-ручку или автоинъектор. В одном воплощении состав представлен в предварительно заполненном шприце.

Способы лечения и композиции для применения

Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить терапевтический способ лечения расстройств или заболеваний, связанных с В-клетками, таких как заболевания, опосредованные антителами или плазматическими клетками, или плазмоклеточные злокачественные новообразования (например, такие виды рака, как множественная миелома), или другого заболевания, которое можно лечить антигенсвязывающим белком против ВСМА. В частности, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить композиции, содержащие антигенсвязывающие белки против ВСМА, например, антитела против ВСМА, специфично связывающиеся с ВСМА (например, человеческим ВСМА) и модулирующие (то есть ингибирующие или блокирующие) взаимодействие между ВСМА и его лигандами, такими как BAFF и/или APRIL, при лечении заболеваний и расстройств, отвечающих на модуляцию этого взаимодействия.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта (например, пациента-человека) с расстройствами или заболеваниями, связанными с В-клетками, такими как заболевания, опосредованные антителами или плазматическими клетками, или плазмоклеточные злокачественные новообразования (например, такие виды рака, как множественная миелома), где такой способ включает стадию введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества композиции антигенсвязывающего белка против ВСМА, описанной здесь.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения пациента с раком, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции антигенсвязывающего белка против ВСМА, описанной здесь.

При использовании здесь термины «рак» и «опухоль» использованы взаимозаменяемо и, как в форме единственного числа, так и в форме множественного числа, относятся к клеткам, прошедшим трансформацию, такую как злокачественная трансформация, что делает их патологическими для организма-хозяина. Первичные раковые клетки можно легко отличить от нераковых клеток хорошо известными методиками, в частности при гистологическом исследовании. При использовании здесь определение раковой клетки включает не только первичную раковую клетку, но и любую клетку, имеющую происхождение от раковой клетки-предшественника. Это включает раковые клетки метастазов и культуры и клеточные линии, имеющие происхождение от раковых клеток, in vitro. Применительно к типу рака, обычно проявляющегося как солидная опухоль, опухоль, «поддающаяся клиническому обнаружению», представляет собой опухоль, которая может быть обнаружена по опухолевой массе, например, такими методиками как компьютерная томография (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), рентгенологическое исследование, ультразвуковое исследование или пальпация при физикальном обследовании, и/или которая может быть обнаружена вследствие экспрессии одного или более чем одного опухолеспецифичного антигена в образце, который может быть получен у пациента. Опухоли могут представлять собой гемопоэтический (или гематологический) рак (или рак крови), например, виды рака, имеющие происхождение от клеток крови или иммунных клеток, которые могут быть названы «гемобластозами». Конкретные примеры клинических состояний, в основе которых лежат гематологические опухоли, включают: лейкозы, такие как хронический миелоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз и острый лимфоцитарный лейкоз; плазмоклеточные злокачественные новообразования, такие как множественная миелома, MGUS (моноклональная гаммапатия неопределенной (или неизвестной, или неясной) значимости) и макроглобулинемия Вальденстрема; лимфомы, такие неходжкинская лимф ома, лимф ома Ходжкина; и тому подобное.

Рак может представлять собой любой рак, при котором есть аномальное количество бластных клеток или пролиферация нежелательных клеток или который диагностирован как гематологический рак, включая как лимфоидные, так и миелоидные злокачественные новообразования. Миелоидные злокачественные новообразования включают, без ограничения, острый миелоидный (или миелоцитарный, или миелогенный, или миелобластный) лейкоз (недифференцированный или дифференцированный), острый промиелоидный (или промиелоцитарный, или промиелогенный, или промиелобластный) лейкоз, острый миеломоноцитарный (миеломонобластный) лейкоз, острый моноцитарный (или монобластный) лейкоз, эритролейкоз и мегакариоцитарный (или мегакариобластный) лейкоз. Вместе взятые, эти лейкозы могут быть названы острым миелоидным (или миелоцитарный, или миелогенным) лейкозом (ОМЛ). Миелоидные злокачественные новообразования также включают миелопролиферативные расстройства (МПР), которые включают, без ограничения, хронический миелогенный (или миелоидный) лейкоз (ХМЛ), хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ), эссенциальную тромбоцитопению (или тромбоцитоз) и истинную полицитемию (polcythemia vera, PCV). Миелоидные злокачественные новообразования также включают, среди прочего, миелодисплазию (или миелодиспластический синдром, или МДС), который может быть назван рефрактерной анемией (РА), рефрактерной анемией с избытком бластов (РАИБ), рефрактерной анемией с избытком бластов в фазе трансформации (РАИБтр), а также миелофиброз (МФ) с или без миелоидной метаплазии неясной этиологии.

Гемопоэтические виды рака также включают лимфоидные злокачественные новообразования, которые могут поражать лимфатические узлы, селезенку, костный мозг, периферическую кровь и/или внеузловые ткани. Лимфоидные виды рака включают В-клеточные злокачественные новообразования, включающие, без ограничения, В-клеточные неходжкинские лимфомы (В-НХЛ). В-НХЛ могут быть индолентными (или низкой степени злокачественности), промежуточной степени злокачественности (или агрессивными) или высокой степени злокачественности (очень агрессивными). Индолентные В-клеточные лимфомы включают: фолликулярную лимфому (ФЛ); лимфому из малых лимфоцитов (ЛМЛ); лимфому маргинальной зоны (ЛМЗ), включая узловую ЛМЗ, внеузловую ЛМЗ, селезеночную ЛМЗ и селезеночную ЛМЗ с ворсинчатыми лимфоцитами; лимфоплазмоцитарную лимфому (ЛПЛ); и лимфому из лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT или внеузловая маргинальная зона). В-НХЛ промежуточной степени злокачественности включают лимфому из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) с или без лейкемизации, диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), фолликулярную крупноклеточную (3 степени или ЗВ степени) лимфому и первичную медиастинальную лимфому (ПМЛ). В-НХЛ высокой степени злокачественности включают лимфому Беркитта (ЛБ), лимфому, подобную лимфоме Беркитта, мелкоклеточную лимфому с нерассеченными ядрами (SNCCL) и лимфобластную лимфому. Другие В-НХЛ включают иммунобластную лимфому (или иммуноцитому), первичную выпотную лимфому, ВИЧ-ассоциированные (или СПИД-связанные) лимфомы и посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (ПТЛР) или посттрансплантационную лимфому. В-клеточные злокачественные новообразования также включают, без ограничения, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ), макроглобулинемию Вальденстрема (MB), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов (ЛБГЛ), острый лимфоидный (или лимфоцитарный, или лимфобластный) лейкоз и болезнь Кастлемана. НХЛ могут также включать, среди прочего, Т-клеточные неходжкинские лимфомы (Т-НХЛ), включающие, без ограничения, Т-клеточную неходжкинскую лимфому без дополнительных уточнений (БДУ), периферическую Т-клеточную лимфому (ПТКЛ), анапластическую крупноклеточную лимфому (АККЛ), ангиоиммунобластное лимфоидное расстройство (AILD), назальную лимфому из натуральных клеток-киллеров (NK-клеток) / Т-клеток, гамма/дельта-лимфому, Т-клеточную лимфому кожи, грибовидный микоз и синдром Сезари.

Гемопоэтические виды рака также включают лимфому (или болезнь) Ходжкина, включая классическую лимфому Ходжкина, нодально-склеротическую лимфому Ходжкина, смешанноклеточную лимфому Ходжкина, лимфому Ходжкина с преобладанием лимфоцитов (LP), узловую LP-лимфому Ходжкина и лимфому Ходжкина с лимфоцитарным истощением. Гемопоэтические виды рака также включают плазмоклеточные заболевания или виды рака, такие как множественная миелома (ММ), включая вялотекущую ММ, моноклональная гаммапатия неопределенной (или неизвестной, или неясной) значимости (MGUS), плазмоцитома (костная, внекостномозговая), лимфоплазмоцитарная лимфома (ЛПЛ), макроглобулинемия Вальденстрема, плазмоклеточный лейкоз и первичный амилоидоз (AL-амилоидоз). Гемопоэтические виды рака могут также включать другие виды рака из дополнительных кроветворных клеток, включая полиморфноядерные лейкоциты (или нейтрофилы), базофилы, эозинофилы, дендритные клетки, тромбоциты, эритроциты и натуральные клетки-киллеры. Ткани, содержащие кроветворные клетки, называемые здесь «кроветворными тканями», включают костный мозг, периферическую кровь, тимус и периферические лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани слизистых оболочек (такие как лимфоидные ткани кишечника), миндалины, пейеровы бляшки и червеобразный отросток, и лимфоидные ткани других слизистых оболочек, например, бронхиальной выстилки.

В одном воплощении рак выбран из группы, состоящей из колоректального рака (КРР), рака желудка, пищевода, шейки матки, мочевого пузыря, молочной железы, головы и шеи, яичника, меланомы, почечноклеточного рака (ПКР), плоскоклеточного РП, немелкоклеточного рака легкого, мезотелиомы, рака поджелудочной железы и рака предстательной железы.

Подразумевают, что при использовании здесь термин «лечение» и его производные включают терапевтическое лечение и лекарственную терапию. Применительно к конкретному состоянию, лечение означает: (1) уменьшение степени выраженности состояния или одного или более чем одного из биологических проявлений состояния; (2) воздействие на (а) одну или более чем одну точку в биологическом каскаде, приводящем к состоянию или обуславливающем его, или (б) одно или более чем одно из биологических проявлений состояния; (3) уменьшение степени выраженности одного или более чем одного из симптомов, эффектов или побочных эффектов, связанных с состоянием, или одного или более чем одного из симптомов, эффектов или побочных эффектов, связанных с состоянием или его лечением; (4) замедление прогрессирования состояния или одного или более чем одного из биологических проявлений состояния; и/или (5) излечение указанного состояния или одного или более чем одного из биологических проявлений состояния посредством устранения или снижения до уровней, не поддающихся обнаружению, одного или более чем одного из биологических проявлений состояния на период времени, рассматриваемый как состояние ремиссии данного проявления без дополнительного лечения в периоде ремиссии. Специалисту в данной области будет ясно, какую продолжительность времени рассматривать как ремиссию применительно к конкретному заболеванию или состоянию.

В-клеточные расстройства можно разделить на дефекты развития В-клеток / образования иммуноглобулинов (например, иммунодефицита) и чрезмерную/неконтролируемую пролиферацию (например, лимфомы, лейкозы). При использовании здесь В-клеточное расстройство относится к заболеваниям обоих типов, и предложены способы лечения В-клеточных расстройств композициями, описанными здесь.

В определенном аспекте заболевание или расстройство представляет собой множественную миелому (ММ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), солитарную плазмоцитому (костную, внекостномозговую), амилоидоз (AL-амилоидоз), вялотекущую множественную миелому (BMM/SMM), солитарную плазмоцитому (костную, внекостномозговую) или макроглобулинемию Вальденстрема.

Также предусмотрено профилактическое лечение (профилактическая терапия). Специалисту в данной области будет ясно, что «предотвращение» не является абсолютным термином. В медицине «предотвращение» понимают как термин, относящийся к профилактическому введению лекарственного средства для существенного снижения вероятности или степени тяжести состояния или его биологического проявления или для задержки начала такого состояния или его биологического проявления. Профилактическая терапия уместна, например, когда у субъекта, предположительно, повышен риск развития рака, например, когда у субъекта есть явный онкологический наследственный анамнез или когда субъект подвержен воздействию канцерогена.

«Субъект» или «пациент» использованы здесь взаимозаменяемо и определены широко, включая любое лицо, нуждающееся в лечении, например, лицо, нуждающееся в лечении рака. Субъект может включать млекопитающее. В одном воплощении субъект представляет собой пациента-человека. Субъект, нуждающийся в лечении рака, может включать пациентов с различными стадиями, включая вновь диагностированное, рецидивирующее, рефрактерное, прогрессирующее заболевание, ремиссию и другие. Субъект, нуждающийся в лечении рака, может также включать пациентов, прошедших трансплантацию стволовых клеток, или пациентов, которым трансплантация не показана или противопоказана.

Может быть проведен предварительный скрининг субъектов с целью отбора для лечения композициями, описанными здесь. В одном воплощении перед лечением композициями, описанными здесь, проводят анализ образца от субъекта на предмет экспрессии ВСМА.

У субъектов может быть проведен по меньшей мере один курс предшествующей терапии рака до лечения композициями по настоящему изобретению. В одном воплощении до лечения композициями по настоящему изобретению у субъекта были проведены по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6 или по меньшей мере 7 курсов предшествующей терапии рака.

В одном воплощении у субъекта вновь диагностированный рак и до лечения композициями по настоящему изобретению у него не было проведено ни одного (0) курса предшествующей терапии рака.

Композиции по изобретению могут быть введены любым подходящим путем введения. Для некоторых состояний подходящие пути введения включают пероральный, ректальный, назальный, местный (включая трансбуккальный и сублингвальный), вагинальный и парентеральный (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, интратекальный и эпидуральный) и внутриопухолевый. Следует понимать, что предпочтительный путь введения может варьировать в зависимости, например, от состояния реципиента и от вида рака, подлежащего лечению.

В определенных воплощениях композицию по изобретению вводят как фармацевтическую композицию.

При использовании здесь термин «введение» предназначен для обозначения доставки композиций, описанных здесь, для решения терапевтической задачи. Композиции можно вводить с некоторым интервалом введения на протяжении периода, достаточного для достижения полезного клинического эффекта. Композиция может быть введена субъекту таким образом, чтобы направить терапию на определенное место.

В некоторых воплощениях композицию вводят инъекцией. Таким образом, в одном аспекте предложено инъекционное устройство, содержащее композицию, фармацевтическую композицию или состав по изобретению. Инъекционное устройство может включать шприц-ручку или автоинъектор.

При использовании здесь термин «терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная доза» относится к количеству, эффективному в предотвращении, или лечении, или облегчении симптома расстройства, опосредованного В-клетками. Терапевтически эффективные количества и схемы лечения обычно определяют эмпирически, и они могут зависеть от таких факторов, как возраст, масса тела и состояние здоровья пациента и заболевание или расстройство, подлежащие лечению. Такие факторы входят в сферу компетенции лечащего врача.

Специалисты в данной области легко определят подходящую терапевтически эффективную дозу композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА. Подходящие дозы композиций, описанных здесь, могут быть рассчитаны для пациентов, исходя из их массы тела, например, подходящие дозы могут входить в диапазон от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг, например, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг, например, от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг, или, например, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, например, от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг.

В одном воплощении терапевтически эффективная доза композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА, входит в диапазон от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 4,6 мг/кг.В еще одном воплощении терапевтически эффективная доза композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА, составляет 0,03 мг/кг, 0,06 мг/кг, 0,12 мг/кг, 0,24 мг/кг, 0,48 мг/кг, 0,96 мг/кг, 1,92 мг/кг, 3,4 мг/кг или 4,6 мг/кг.В еще одном воплощении терапевтически эффективная доза композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА, составляет 1,9 мг/кг, 2,5 мг/кг или 3,4 мг/кг.

В определенных воплощениях композиция может быть введена субъекту совместно с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим агентом. В другом воплощении композиция может быть введена субъекту совместно с одним или более чем одним дополнительным противораковым терапевтическим агентом. Дополнительный противораковый терапевтический агент может включать, без ограничения, другие иммуномодулирующие лекарственные средства, терапевтические антитела (например, антитело против CD38, такое как даратумумаб), терапевтические CAR-T-агенты, BiTE, ингибиторы HDAC, ингибиторы протеасом (например, бортезомиб), противовоспалительные соединения и иммуномодулирующие имидные лекарственные средства (IMiD) (например, талидомид и его аналоги).

«Совместное введение» (или «совместное проведение») включает введение двух или более разных фармацевтических композиций (или проведение двух или более разных видов лечения (например, лучевой терапии)), вводимых субъекту посредством их комбинирования в одной фармацевтической композиции или в раздельных фармацевтических композициях. Таким образом, совместное введение включает введение в одно и то же время в одной фармацевтической композиции, содержащей два или более фармацевтических агента, или введение двух или более разных композиций одному и тому же субъекту в одно и то же или в разное время.

В одном аспекте изобретения согласно изобретению предложен способ лечения В-клеточного заболевания или расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, посредством введения терапевтически эффективной дозы любой из композиций, содержащих антигенсвязывающий белок против ВСМА, как описано здесь.

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей ADC против ВСМА, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей ADC против ВСМА, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей ADC против ВСМА, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В еще одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей белантамаб мафодотин, где среднее DAR составляет от 3,4 до приблизительно 4,6.

В еще одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения множественной миеломы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей белантамаб мафодотин, где среднее DAR составляет от 3,4 до приблизительно 4,6.

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей ADC против ВСМА, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей ADC против ВСМА, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей ADC против ВСМА, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В еще одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей белантамаб мафодотин, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В еще одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения множественной миеломы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей белантамаб мафодотин, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В одном аспекте согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения множественной миеломы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения множественной миеломы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей белантамаб, где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В одном аспекте согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения множественной миеломы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ лечения множественной миеломы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективной дозы композиции, содержащей белантамаб, где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В одном аспекте изобретения согласно изобретению предложена композиция, содержащая антигенсвязывающий белок против ВСМА, как описано здесь, для применения в лечении В-клеточного заболевания или расстройства.

В одном воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая ADC против ВСМА, как описано здесь, для применения в лечении рака, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая ADC против ВСМА, как описано здесь, для применения в лечении рака, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая ADC против ВСМА, как описано здесь, для применения в лечении рака, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая белантамаб мафодотин, для применения в лечении рака, где среднее DAR составляет от 3,4 до приблизительно 4,6.

В еще одном воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая белантамаб мафодотин, для применения в лечении множественной миеломы, где среднее DAR составляет от 3,4 до приблизительно 4,6.

В одном воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая ADC против ВСМА, как описано здесь, для применения в лечении рака, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая ADC против ВСМА, как описано здесь, для применения в лечении рака, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая ADC против ВСМА, как описано здесь, для применения в лечении рака, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая белантамаб мафодотин, для применения в лечении рака, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 26%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38%, DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% и/или процент DL8 составляет от приблизительно 6% до приблизительно 12%.

В еще одном воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая белантамаб мафодотин, для применения в лечении множественной миеломы, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В одном аспекте согласно изобретению предложена композиция, содержащая антитело, для применения в лечении рака, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В одном аспекте согласно изобретению предложена композиция, содержащая антитело, для применения в лечении множественной миеломы, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В еще одном воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая белантамаб мафодотин, для применения в лечении множественной миеломы, где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В одном аспекте согласно изобретению предложена композиция, содержащая антитело, для применения в лечении рака, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В одном аспекте согласно изобретению предложена композиция, содержащая антитело, для применения в лечении множественной миеломы, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В еще одном воплощении согласно изобретению предложена композиция, содержащая белантамаб мафодотин, для применения в лечении множественной миеломы, где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В одном аспекте изобретения предложено применение композиции в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении В-клеточных заболеваний или расстройств.

В одном воплощении предложено применение композиции, содержащей ADC против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей ADC против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей ADC против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей белантамаб мафодотин, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где среднее DAR составляет от 3,4 до приблизительно 4,6.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей белантамаб мафодотин, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении множественной миеломы, где среднее DAR составляет от 3,4 до приблизительно 4,6.

В одном воплощении предложено применение композиции, содержащей ADC против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей ADC против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей ADC против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF и где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей ADC против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В другом воплощении предложено применение композиции, содержащей белантамаб мафодотин, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В еще одном воплощении предложено применение композиции, содержащей белантамаб мафодотин, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении множественной миеломы, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%, процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20% и/или DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

В одном аспекте предложено применение композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В одном воплощении предложено применение композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения при множественной миеломе, где композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В еще одном воплощении предложено применение композиции, содержащей белантамаб, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении множественной миеломы, где композиция содержит 25% или менее изомеризации по положению D103 тяжелой цепи в CDRH3.

В одном аспекте предложено применение композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака, где композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В одном воплощении предложено применение композиции, содержащей антигенсвязывающий белок против ВСМА, в изготовлении лекарственного средства для применения при множественной миеломе, где композиция содержит антитело, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

В еще одном воплощении предложено применение композиции, содержащей белантамаб, в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении множественной миеломы, где композиция содержит 40% или менее окисления по положению М34 тяжелой цепи (CDRH1).

Все патентные и литературные источники, раскрытые здесь, прямо и полностью включены сюда посредством ссылки.

Изобретение, описанное здесь, включает следующее.

1. Композиция, содержащая изомеризованный вариант антитела против ВСМА, где изомеризованный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 25% или менее изомеризованного варианта.

2. Композиция, содержащая окисленный вариант антитела против ВСМА, где окисленный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 40% или менее окисленного варианта.

3. Композиция, содержащая антитело против ВСМА, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 0,1-25% изомеризации по положению D103 в CDRH3.

4. Композиция, содержащая антитело против ВСМА, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 0,1-40% окисления по положению М34 в CDRH1.

5. Композиция, содержащая антитело против ВСМА, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 0,1-25% изомеризации по положению D103 в CDRH3.

6. Композиция, содержащая антитело против ВСМА, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичное аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 0,1-40% окисления по положению М34 в CDRH1.

7. Композиция по любому из п.п. 1-6, содержащая 65% или менее окисления по положению М256 тяжелой цепи и/или 60% или менее окисления по положению М432 тяжелой цепи.

8. Композиция по любому из п.п. 1-7, содержащая вариант антитела, содержащий по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из дезамидирования тяжелой цепи по положению N388 и/или N393, D103 на N103 в CDRH3, отщепления С-концевого лизина и превращения N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту.

9. Композиция по любому из п.п. 1-8, содержащая по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из 100% или менее дезамидирования по положению N388 и/или N393, 100% или менее N103 в CDRH3, 100% или менее отщепления С-концевого лизина и 100% или менее превращения N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту.

10. Композиция по любому из п.п. 1-9, содержащая любой процент гликоформ G0, G1, G2, G0-GlcNac или G0-2GlcNac.

11. Композиция по любому из п.п. 1-10, где антитело против ВСМА представляет собой белантамаб.

12. Композиция по любому из п.п. 1-11, где антитело против ВСМА конъюгировано с цитотоксическим агентом с получением конъюгата антитела с лекарственным средством.

13. Композиция по любому из п.п. 1-12, где антитело против ВСМА представляет собой белантамаб мафодотин.

14. Композиция по п.п. 12-13, где: процент DL2 составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%; процент DL4a составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%; процент DL4b составляет по меньшей мере приблизительно 5%, от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%; процент DL6 составляет по меньшей мере приблизительно 10%, от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20%; и/или DL8 составляет по меньшей мере приблизительно 1%, от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

15. Композиция по п.п. 12-14, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

16. Композиция по п.п. 12-15, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из п.п. 1-16 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

18. Состав, содержащий фармацевтическую композицию по п. 17, содержащую от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл антигенсвязывающего белка против ВСМА, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

19. Состав по п. 18, содержащий приблизительно 20 мг/мл, приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл или приблизительно 60 мг/мл белантамаба мафодотина, 25 мМ цитратного буфера, 200 мМ трегалозы, 0,05 мМ динатриевой соли ЭДТА, 0,02% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

20. Способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п.п. 1-16.

21. Композиция по п.п. 1-14 для применения в лечении рака.

22. Применение композиции по п.п. 1-16 в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака.

23. Композиция, содержащая конъюгат антитела против ВСМА с лекарственным средством (ADC), где: процент DL2 составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%; процент DL4a составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%; процент DL4b составляет по меньшей мере приблизительно 5%, от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%; процент DL6 составляет по меньшей мере приблизительно 10%, от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20%; и/или DL8 составляет по меньшей мере приблизительно 1%, от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

24. Композиция по п. 23, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6.

25. Композиция по п. 23 или 24, где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 10% до приблизительно 20% и DL8 составляет от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

26. Композиция по п. 23 или 24, где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% и DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0%.

27. Композиция по п.п. 23-26, где среднее отношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7.

28. Композиция по п.п. 23-26, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

29. Композиция по п.п. 23-26, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,8 до приблизительно 4,5.

30. Композиция, содержащая конъюгат антитела против ВСМА с лекарственным средством (ADC), где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%.

31. Композиция по п. 30, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, CDRH3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, CDRL1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6.

32. Композиция по п. 30 или 31, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 5%.

33. Композиция по п.п. 30-32, где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 32%, процент DL4a составляет от приблизительно 30% до приблизительно 40%, процент DL4b составляет от приблизительно 5% до приблизительно 10%, процент DL6 составляет от приблизительно 10% до приблизительно 20% и DL8 составляет от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

34. Композиция по п.п. 30-32, где процент DL2 составляет от приблизительно 15% до приблизительно 27%, процент DL4a составляет от приблизительно 35% до приблизительно 38%, процент DL4b составляет от приблизительно 7% до приблизительно 9%, процент DL6 составляет от приблизительно 14% до приблизительно 20% и DL8 составляет от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0%.

35. Композиция по п.п. 30-34, где среднее отношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7.

36. Композиция по п.п. 30-34, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,4 до приблизительно 4,6.

37. Композиция по п.п. 30-34, где среднее DAR составляет от приблизительно 3,8 до приблизительно 4,5.

38. Композиция по п.п. 23-37, где антитело содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8.

39. Композиция по п.п. 23-38, где антитело представляет собой белантамаб.

40. Композиция по п.п. 23-37, где цитотоксический агент представляет собой ММАЕ или MMAF.

41. Композиция по п.п. 21-40, где ADC против ВСМА представляет собой белантамаб мафодотин.

42. Композиция по п.п. 23-41, где процент DL определен путем разделения отдельных DL-разновидностей с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), рассчета площади под кривой для каждого DL-пика и проводения деления каждого DL-пика на общую площадь под кривой для всех DL-разновидностей вместе взятых.

43. Композиция по п. 42, где среднее DAR рассчитано, исходя из площади под кривой каждой DL-разновидности с применением следующей формулы:

где:

%DL Componentx представляет собой % DL-компонентах;

A_X представляет собой площадь пика X;

X представляет собой А₀, A₁, А₂, A₃, A_4a, A_4b, А₅, А₆, A₈ и А₁₀;

А₀, A₁, А₂, A₃, A_4a, A_4b, А₅, А₆, A₈ и А₁₀ представляют собой площади пиков DL0, DL1, DL2, DL3, DL4a, DL4b, DL5, DL6, DL8 и DL10 (включая только пики DL (0,08%) или более).

44. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по п.п. 23-43 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

45. Состав, содержащий фармацевтическую композицию по п. 44, содержащую от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл антигенсвязывающего белка против ВСМА, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

46. Состав по п. 45, содержащий приблизительно 20 мг/мл, приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл или приблизительно 60 мг/мл белантамаба мафодотина, 25 мМ цитратного буфера, 200 мМ трегалозы, 0,05 мМ динатриевой соли ЭДТА, 0,02% полисорбата 20 или полисорбата 80 при рН от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.

47. Способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п.п. 23-43.

48. Композиция по п.п. 23-43 для применения в лечении рака.

49. Применение композиции по п.п. 23-43 в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении рака.

50. Композиция, содержащая кислый вариант антитела, где кислый вариант содержит CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 1-70% кислого варианта.

51. Композиция, содержащая кислый вариант антитела, где кислый вариант содержит CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 70% или менее кислого варианта.

52. Композиция, содержащая основный вариант антитела, где основный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 1-30% основного варианта.

53. Композиция, содержащая основный вариант антитела, где основный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 30% или менее основного варианта.

54. Композиция, содержащая главную изоформу антитела, где главная изоформа содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 1-90% главной изоформы.

55. Композиция, содержащая главную изоформу антитела, где главная изоформа содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 1% или более главной изоформы.

56. Композиция, содержащая заряженный вариант антитела, который содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRH2 SEQ ID NO: 2 и CDRH3 SEQ ID NO: 3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, где композиция содержит 70% или менее кислого варианта, и/или 30% или менее основного варианта, и/или 1% или более главной изоформы.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Определение процента DL-разновидностей и среднего PAR в композиции ADC

Для Примеров 2-9 процент DL и среднее DAR рассчитывали следующим образом.

Процент конкретных DL-разновидностей (например, процент DL0, процент DL2, процент DL4a, процент DL4b, процент DL6, процент DL8) определяли разделением отдельных DL-разновидностей с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) (как показано на ФИГ. 2), расчетом площади под кривой для каждого DL-пика и делением каждого DL-пика на общую площадь под кривой для всех DL-разновидностей вместе взятых.

Среднее DAR для каждого образца рассчитывали, исходя из площади под кривой каждой DL-разновидности с применением следующей формулы:

где:

%DL Componentx представляет собой % DL-компонентах;

A_X представляет собой площадь пика X;

X представляет собой А₀, A₁, А₂, A₃, A_4a, A_4b, А₅, А₆, A₈ и А₁₀;

А₀, A₁, А₂, A₃, A_4a, A_4b, А₅, A₆, A₈ и А₁₀ представляют собой площади пиков DL0, DL1, DL2, DL3, DL4a, DL4b, DL5, DL6, DL8 и DL10 (включая только пики DL (0,08%) или более).

Эталонные стандарты, которые были использованы в Примерах 2-8 и могут также быть использованы для других экспериментов, включают образцы, представленные в Таблице 1.

Пример 2: Влияние среднего PAR на ингибирование роста клеток

Ингибирование роста клеток белантамабом мафодотином определяли, измеряя жизнеспособность клеток NCI-H929, клеточной линии человеческой множественной миеломы, после 48 часов инкубации с белантамабом мафодотином. Жизнеспособность клеток измеряли с применением технологии CellTiter Glo от Promega. Повышение концентрации белантамаба мафодотина пропорционально соответствовало снижению люминесцентного сигнала CellTiter Glo. Дозозависимость (ЕС₅₀) определяли посредством SoftMax Pro с применением 4-параметрической логистической модели нелинейной регрессии. Для определения относительной активности рассчитывали отношение ЕС₅₀ эталонного стандарта 132371424 к ЕС₅₀ образца. Результаты представлены в Таблице 2.

Пример 3: Влияние среднего PAR на АРСС-активность

Инкубировали белантамаб мафодотин, клетки множественной миеломы и NK-клетки (эффекторные клетки). Безотносительно теории, белантамаб мафодотин связывался с ВСМА, экспрессированным на поверхности клеток множественной миеломы, а Fc-область антитела связывалась с FcγRIIIa на эффекторных клетках через их FcγRIIIa-рецептор. Связывание с этими рецепторами на поверхности эффекторных клеток приводило к синтезу и секреции цитокинов (IFNg) и высвобождению гранул (перфорин и гранзимы), проникающих в цитоплазму клеток-мишеней. Гранзимы запускали в клетках-мишенях сигнальные события, приводившие к гибели этих клеток посредством апоптоза. Источником NK-клеток были мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделяемые из цельной человеческой крови. Затем к 1 мл клеток NCI-H929, клеточной линии человеческой множественной миеломы, добавляют 10 мкл ацетоксиметилового эфира лиганда, усиливающего флуоресценцию, BATDA (бис-(ацетоксиметил)-2,2':6',2''-терпиридин-6,6''-дикарбоксилат) (Perkin-Elmer, номер по каталогу С136-100), проникавшего через мембраны клеток. Сложноэфирные связи в BATDA гидролизуют с получением гидрофильного лиганда (TDA), который более не способен проходить через клеточную мембрану. Меченные клетки добавляли к различным количествам белантамаба мафодотина и эффекторных клеток (РВМС). Происходит лизис клеток с высвобождением TDA. После цитолиза этот лиганд сочетали с 200 мкл раствора DELFIA Europium Solution (Perkin-Elmer, номер по каталогу С135-100) с получением высоко флуоресцентного и стабильного хелата (EuTDA). Измеренная флуоресценция прямо коррелировала с количеством лизированных клеток при ее измерении флуоресцентным устройством для прочтения планшетов. ADCC-активность белантамаба мафодотина выражали как отношение значения ЕС₅₀ образца к ЕС₅₀ эталонного стандарта 132371424. Результаты представлены в Таблице 3.

Пример 4: Влияние среднего PAR на связывание с ВСМА и связывание с FcγRIIIa

Связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Белантамаб мафодотин разбавляли до 10 мкг/мл с использованием PBST, вводили и захватывали белком А, иммобилизованным на сенсорном чипе СМ5. Затем проводили введение ВСМА и его связывание с захваченным белантамабом мафодотином. После этого проводили введение FcγRIIIa и его связывание с захваченным белантамабом мафодотином. Функциональные концентрации белантамаба мафодотина при связывании с ВСМА и FcγRIIIa рассчитывали по эталонной калибровочной кривой (эталонный стандарт 132371424) и выражали как концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa, соответственно. Общую концентрацию белантамаба мафодотина в образце определяли заранее по оптической плотности при 280 нм. Активность специфичного связывания (%) рассчитывали делением концентрации при связывании с ВСМА или FcγRIIIa на концентрацию, определенную по оптической плотности при 280 нм. Результаты представлены в Таблице 4.

Пример 5: Влияние среднего PAR на объем опухоли

Проводили подкожную имплантацию клеточной линии множественной миеломы в боковые части туловища мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Начиная приблизительно с 15 суток после этого, все опухоли измеряли с использованием штангенциркульной системы, отмечая длину и ширину опухоли у каждой мыши для расчета объема опухоли (объем равен произведению длины и удвоенной ширины, умноженному на 0,5). При достижении среднего объема опухоли приблизительно 200 мм³ мышей рандомизировали по группам и вводили им белантамаб мафодотин из образцов с одним из средних DAR два раза в неделю на протяжении 2 недель. Таким образом измеряли все опухоли и отдельных мышей подвергали эвтаназии при достижении ими среднего размера опухоли 2,0 мм³ или на 60 сутки, в зависимости от того, какое из этих условий наступало раньше. Дизайн исследования представлен в Таблице 5, а результаты показаны на ФИГ. 3.

Пример 6: Влияние DL-разновидностей на связывание с ВСМА, связывание с FcγRIIIa и связывание с FcRn

Образцы белантамаба мафодотина, содержащие конкретные DL-разновидности, получали сбором отдельных пиков HIC-хроматограммы. Связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 4.

Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с белантамабом мафодотином измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Проводили разведение образцов и захват белантамаба мафодотина FcRn, иммобилизованным на сенсорном чипе с нитрилотриуксусной кислотой (NTA). Концентрацию образца при связывании с FcRn определяли интерполяцией ответа связывания на калибровочную кривую. Активность специфичного связывания (%) рассчитывали делением концентрации при связывании с FcRn на общую концентрацию белка. Результаты представлены в Таблице 6.

Использовали эталонный стандарт 162397940.

Пример 7: Влияние DL-разновидностей на ингибирование роста клеток

Образцы конкретных DL-разновидностей белантамаба мафодотина получали, как в Примере 7. Ингибирование роста клеток определяли, как в Примере 2. Использовали эталонный стандарт 162397940. Результаты представлены в Таблице 7.

Пример 8: Влияние DL-разновидностей на ADCC-активность

Белантамаб мафодотин связывался с ВСМА, экспрессированным на поверхности клеток множественной миеломы. Fc-область белантамаба мафодотина связывалась с FcγRIIIa (CD 16а) на эффекторных Т-клетках Jurkat (Promega, номер по каталогу G7102, BioCat #140011), модифицированных для стабильной экспрессии (1) человеческих FcγRIIIa-рецепторов, высокоаффинный вариант VI58, и (2) репортерного гена люциферазы, слитого с промотором ниже последовательностей активации NFAT. При связывании антитела одновременно с клетками Н929 и эффекторными клетками активация пути NFAT приводит к транскрипции репортерного гена люциферазы и экспрессии люциферазы светлячка в эффекторных клетках. После добавления люминесцентного субстрата (люциферазная аналитическая система Bio-Glo™, Promega, номер по каталогу G7940) и лизиса клеток люциферазу, синтезированную вследствие активации NFAT, измеряют в относительных единицах люминесценции (Relative Luminescent Units, RLU) с использованием устройства для прочтения планшетов. В этом анализе белантамаб мафодотин добавляли дозозависимым образом; таким образом, дозозависимость (полумаксимальную эффективную концентрацию или ЕС₅₀) определяли с применением логистической модели нелинейной регрессии. Для определения относительной активности рассчитывали отношение ЕС₅₀ эталонного стандарта к ЕС₅₀ образца. Использовали эталонный стандарт 162397940. Результаты представлены в Таблице 8.

Пример 9: Среднее DAR и процент DL-разновидностей в нескольких сериях

белантамаба мафодотина

Изготавливали несколько (19) серий белантамаба мафодотина. Для каждой серии рассчитывали среднее DAR и процент DL-разновидностей, как описано в Примере 1. Результаты представлены в Таблицах 9-12.

Пример 10: Дизайн исследования ускоренной деградации белантамаба мафодотина

Сводные данные по дизайну исследований для Примеров 11-18 представлены в Таблице 13.

Пример 11: Окислительные условия

Для получения образцов с окислительным стрессом образцы белантамаба мафодотина разбавляли до 10 мг/мл и добавляли перекись водорода, таким образом, что молярное отношение перекиси водорода к белантамабу мафодотину составляло 500:1. Образцы гасили метионином и проводили замену буфера с использованием фильтра с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 3 кДа.

Дезамидирование и окисление определяли с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием). Образец денатурировали в 6 М гуанидине-HCl до концентрации 4,2 мкг/мкл. Затем проводили восстановление дисульфидных связей с использованием 50 мМ DTT на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Добавляли йодацетат, 100 мМ, и проводили его взаимодействие со свободными цистеиновыми остатками на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в образце проводили замену буфера с использованием центрифужных колонок BioRad (номер по каталогу 7326221) перед расщеплением трипсином от Worthington (номер по каталогу TRTPCK) при 0,5% трипсина на протяжении 15 минут при 37°С.Полученные пептиды загружали на колонку для ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) с обращенной фазой от Waters (номер по каталогу 186003687) и элюировали водой и градиентом ацетонитрила в 0,1%-й трифторуксусной кислоте с использованием системы Acquity UPLC от Waters. Проводили выявление пептидов с использованием УФ-детектора и масс-спектрометра, такого как LTQ Orbitrap XL от Thermo Scientific. Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов использовали для расчета уровней дезамидирования или окисления посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

Связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 4. Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с белантамабом мафодотином измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 6.

Использовали эталонный стандарт 182407660А. Сводные данные по результатам показаны в Таблице 14 и Таблице 15.

Экстраполируя данные об окислении по НС Met 34, до 37% окисления могут приводить к по меньшей мере 70%-й активности специфичного связывания с антигеном. Это рассчитано исходя из линейной зависимости для образцов, в которых анализировали окисление по М34 в моменты времени «О» (0,2-0,4%) и «24 часа» (45,1-45,5%), когда активность специфичного связывания с антигеном составляла 88-99% и 62-68%, соответственно.

Экстраполируя данные об окислении по НС Met 256, до 89% окисления могут приводить к по меньшей мере 70%-й активности специфичного связывания с FcγRIIIa. Это рассчитано исходя из линейной зависимости для образцов, в которых анализировали окисление по положению М256 в моменты времени «0» (2,9-3,5%) и «24 часа» (98,3-98,7%), когда активность специфичного связывания с FcγRIIIa составляла 89-99% и 66-70%, соответственно. Экстраполируя данные об окислении по НС Met 256, до 64% окисления могут приводить к по меньшей мере 70%-й активности специфичного связывания с FcRn. Это рассчитано исходя из линейной зависимости для образцов, в которых анализировали окисление по положению М256 в моменты времени «0» (2,9-3,5%) и «24 часа» (98,3-98,7%), когда активность специфичного связывания с FcRn составляла 93-97% и 52-57%, соответственно.

Экстраполируя данные об окислении по НС Met 432, до 86% окисления могут приводить к по меньшей мере 70%-й активности специфичного связывания с FcγRIIIa. Это рассчитано исходя из линейной зависимости для образцов, в которых анализировали окисление по положению М432 в моменты времени «0» (0,4-0,6%) и «24 часа» (94,8-95,2%), когда активность специфичного связывания с FcγRIIIa составляла 88-99% и 66-70%, соответственно. Экстраполируя данные об окислении по НС Met 432, до 61% окисления могут приводить к по меньшей мере 70%-й активности специфичного связывания с FcRn. Это рассчитано исходя из линейной зависимости для образцов, в которых анализировали окисление по положению М432 в моменты времени «0» (0,4-0,6%) и «24 часа» (94,8-95,2%), когда активность специфичного связывания с FcRn составляла 93-97% и 52-57%, соответственно.

Пример 12: Химическое стрессовое воздействие: высокий рН (воздействие основанием)

Для получения образцов с высоким рН образцы белантамаба мафодотина разбавляли 4 мМ трис-буфером, корректируя рН до 9. Образцы разводили далее до 10 мг/мл и инкубировали при 25°С / 50% RH до 21 суток.

Дезамидирование, изомеризацию и окисление определяли с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием), как описано в Примере 11. Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов использовали для расчета уровней дезамидирования, изомеризации или окисления посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

Связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 4. Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с белантамабом мафодотином измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как в Примере 6.

Использовали эталонный стандарт 182407660А. Результаты показаны в Таблице 16 и Таблице 17.

Предположительно, дезамидирование НС Asn 388 и НС Asn 393 может превысить отмеченные уровни 10,3% и 14,5%, соответственно, не оказывая никакого влияния на специфичное связывание с антигеном, специфичное связывание с FcγRIIIa и специфичное связывание с FcRn.

Пример 13: Химическое стрессовое воздействие: низкий рН (воздействие кислотой)

Для получения образцов с низким рН образцы белантамаба мафодотина разбавляли цитратным буфером, корректируя рН до 5. Образцы разводили далее до 10 мг/мл и инкубировали при 25°С / 50% RH до 21 суток.

Изомеризацию, дезамидирование и окисление определяли с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием), как описано в Примере 11. Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов использовали для расчета уровней изомеризации, дезамидирования или окисления посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

Связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 4. Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с белантамабом мафодотином измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как в Примере 6.

Использовали эталонный стандарт 182407660А. Результаты показаны в Таблице 18 и Таблице 19.

Пример 14: Температурное стрессовое воздействие: повышенная температура

Для получения образцов, подверженных температурному стрессовому воздействию, образцы белантамаба мафодотина разбавляли в буфере для приготовления состава до 10 мг/мл и инкубировали при 40°С / 75% RH до 28 суток.

Изомеризацию, дезамидирование и окисление определяли с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием), как описано в Примере 11. Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов использовали для расчета уровней изомеризации, дезамидирования или окисления посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

Связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 4. Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с белантамабом мафодотином измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как в Примере 6.

Использовали эталонный стандарт 182407660А. Результаты показаны в Таблице 20 и Таблице 21.

Экстраполируя данные об изомеризации по НС Asp 130, до 23% изомеризации могут приводить к по меньшей мере 70%-й активности специфичного связывания с антигеном. Это рассчитано исходя из линейной зависимости для образцов, в которых анализировали изомеризацию по положению D103 в моменты времени «0» (4,1-4,4%) и «28 суток» (28,7-29,3%), когда активность специфичного связывания с антигеном составляла 88-99% и 55-62%, соответственно.

Пример 15: Воздействие светом

Для получения образца, подверженного воздействию света, образцы белантамаба мафодотина разбавляли до 10 мг/мл, помещали в стеклянные флаконы и переносили в камеру для оценки светоустойчивости Сагоп при 25°С для различных степеней воздействия света, как показано в Таблице 10.

Окисление, дезамидирование и изомеризацию определяли с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием), как описано в Примере 11. Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов использовали для расчета уровней окисления, дезамидирования или изомеризации посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

Связывание белантамаба мафодотина с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 4.

Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с белантамабом мафодотином измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как в Примере 6.

Использовали эталонный стандарт 182407660А. Результаты показаны в Таблице 22 и Таблице 23.

Пример 16: С-концевое отщепление и N-концевая пироглутаминовая кислота

Несколько серий белантамаба анализировали на предмет уровней N-концевой пироглутаминовой кислоты и С-концевого отщепления с применением тандемной масс-спектрометрии с триптическим пептидным картированием (LC-MS/MS с пептидным картированием), как описано в Примере 11. Полученные ионные хроматограммы немодифицированного и модифицированного пептидов использовали для расчета уровней С-концевого отщепления и N-концевой пироглутаминовой кислоты посредством деления площади под кривой модифицированного пептида на общую площадь под кривыми модифицированного и немодифицированного пептидов.

Связывание белантамаба с ВСМА и FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Примере 4. Связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) с белантамабом измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как в Примере 6.

Использовали эталонные стандарты 122368059 и 172405900. Результаты представлены в Таблицах 24-25.

Пример 17: Гликозилирование

Несколько серий белантамаба анализировали на предмет паттернов гликозилирования. Профили определяли с применением разделения ультраэффективной жидкостной хроматографией (UPLC) с жидкостной хроматографией гидрофильного взаимодействия (HILIC) и флуоресцентным выявлением. Образцы разбавляли водой до концентрации 10 мкг/мкл, и проводили высвобождение гликанов из белантамаба посредством ферментативного расщепления ферментом PNGase F с использованием набора PNGase F Kit от New England BioLabs (номер по каталогу P0705L). Гликаны, высвобожденные под действием PNGase F, метили антраниламидом (Sigma-Aldrich, номер по каталогу А89804). Затем меченные гликаны очищали для удаления избытка раствора, использованного при мечении, с применением стадии, включавшей колонки для HILIC; гликаны загружали, отмывали водой и элюировали ацетонитрилом. Затем меченные гликаны разделяли с использованием колонки Waters Glycan ВЕН Amide (номер по каталогу 186004742) на Waters Acquity UPLC с градиентом формиата аммония / муравьиной кислоты и ацетонитрила. Проводили флуоресцентное выявление гликанов с возбуждением при 365 нм и эмиссией при 438 нм. Количественное определение гликанов проводили делением площади под кривой гликана на общую площадь под кривыми всех выявленных гликанов.

Использовали эталонный стандарт 122368059. Результаты представлены в Таблицах 26-27.

Пример 18: Гликоинжиниринг

Определяли влияние образцов белантамаба с повышенным содержанием гликанов на ADCC-активность и связывание. ADCC-активность измеряли, как в Примере 3. Связывание с ВСМА и FcγRIIIa определяли, как в Примере 4.

В экспериментах с галактозилированием гликозилирование измеряли восстанавливающей LC-MS. Образец разбавляли до 1 мг/мл, добавляли 50 мкл 1 М DTT и проводили взаимодействие при 25°С или 37°С на протяжении 30 минут перед анализом на масс-спектрометре, который мог включать Micromass Q-TOF. Тяжелые и легкие цепи разделяли с применением эксклюзионной хроматографии с изократическим потоком воды, ацетонитрила и трифторуксусной кислоты. Спектры каждой из тяжелых и легких цепей суммировали и подвергали деконволюции с применением программного обеспечения MaxEnt от Waters. Определяли основные гликоформы и их относительное количество оценивали по числу сигналов или по площади под кривой. Результаты представлены в Таблицах 28-29.

Пример 19: Приемлемые диапазоны

Приемлемые диапазоны (активность 70-130%) определяли с использованием данных, представленных в Таблицах 11-18 для первой и последней временных точек (21 сутки или 28 сутки, в зависимости от условий). Данные по связыванию наносили на график против относительного процента соответствующей посттрансляционной модификации для определения зависимости. Используя эту информацию, рассчитывали прогнозируемый уровень каждой посттрансляционной модификации для по меньшей мере 70%-го связывания. Результаты этой экстраполяции представлены в Таблице 30. Отмеченные тенденции, в целом, отражают зависимости, наблюдаемые для белантамаба или белантамаба мафодотина.

Пример 20: Сводные данные по продуктам деградации

Ниже представлены сводные данные по распространенности продуктов деградации, наблюдаемых при различных условиях ускоренной деградации, не оказывающей влияния на активность белантамаба мафодотина (Таблица 31).

Пример 21

Сводные данные по дизайну исследования ускоренной деградации белантамаба в Примерах 21-26 представлены в Таблице 32. Методы были в целом сходны с описанными выше в Примерах 11-18 для белантамаба мафодотина (если не указано иное).

Пример 22: Белантамаб в окислительных условиях

Через 24 часа окисление НС М256 возрастало с приблизительно 2% до приблизительно 98%, а окисление М432 возрастало с приблизительно 1% до приблизительно 96%. По результатам SPR было отмечено снижение специфичного связывания с FcγRIIIa на 21-25% и снижение связывания с FcRn на 10-18%. Вероятно, окисление в Fc снижает активность связывания белантамаба с FcγRIIIa и FcRn. Через 24 часа окисление НС М34 в CDR1 возрастало с приблизительно 0,3% до 47,7-48,5%, не приводя к изменениям связывания с антигеном, превышающим вариабельность анализа. Уровни окисления цистеина и триптофана в данном исследовании были низкими, и других значимых посттрансляционных модификаций выявлено не было. Пример 23: Белантамаб после воздействия основанием Через 28 суток был отмечен рост изомеризации по НС D103 с приблизительно 3,5% до приблизительно 6,5%. Рост дезамидирования по НС N31 с 0,1% до приблизительно 2,5%, рост дезамидирования по НС N388 с приблизительно 2,0% до приблизительно 10% и рост дезамидирования по НС N393 с приблизительно 1,7% до приблизительно 18,5% через 28 суток. Кроме того, после стрессового воздействия на белантамаб посредством рН 9 на протяжении 28 суток был также отмечен рост окисления по НС М256 с приблизительно 2,2% до приблизительно 3,7%. cIEF-анализ продемонстрировал повышение кислого варианта с приблизительно 25% до приблизительно 62% и снижение основного варианта с приблизительно 9% до приблизительно 4,5% (см. Таблицу 33 ниже). Все наблюдаемые изменения специфичного связывания с антигеном, FcγRIIIa и FcRn не превышали вариабельности анализа; таким образом, после стрессового воздействия посредством рН 9,0 на протяжении 28 суток белантамаб продемонстрировал сопоставимое связывание при SPR.

Пример 24: Белантамаб после воздействия кислотой

Через 28 суток фрагментация возрастала с 0,8% до 2,3-2,7%. Через 28 суток были отмечены повышение образования сукцинимида по НС D103 с 0,2% до 4,0% и повышение изомеризации по НС D103 с приблизительно 3,5% до приблизительно 5,8%. Помимо изомеризации аспарагиновой кислоты, после стрессового воздействия на белантамаб посредством рН 3,5 на протяжении 28 суток был также отмечен рост окисления по НС М256 с приблизительно 2,2% до приблизительно 3,7%. cIEF-анализ продемонстрировал повышение кислого варианта с приблизительно 25% до приблизительно 28% и повышение основного варианта с приблизительно 9% до приблизительно 13% (см. Таблицу 34 ниже). Все наблюдаемые изменения специфичного связывания с антигеном, FcγRIIIa и FcRn не превышали вариабельности анализа; таким образом, после стрессового воздействия посредством рН 3,5 на протяжении 28 суток белантамаб продемонстрировал сопоставимое связывание при SPR.

Пример 25: Белантамаб после температурного воздействия

Через 28 суток фрагментация возрастала с 0,8% до 2,2-2,3%. % агрегатов не менялся. Через 28 суток были отмечены повышение образования сукцинимида по НС D103 с 0,2% до 2,2% и повышение изомеризации по НС D103 с приблизительно 3,5% до приблизительно 29%. Помимо изомеризации аспарагиновой кислоты, после стрессового температурного воздействия на белантамаб на протяжении 28 суток были также отмечены рост окисления по НС М256 с приблизительно 2,2% до приблизительно 5,3% и рост окисления по НС М432 с приблизительно 1% до 2%. Рост дезамидирования по НС N329 с приблизительно 0% до приблизительно 7%, рост дезамидирования по НС N388 с приблизительно 2,0% до приблизительно 2,5% и рост дезамидирования по НС N393 с приблизительно 1,7% до приблизительно 2,6% через 28 суток. Через 28 суток специфичное связывание с антигеном было снижено на 63-67%, что соответствует росту изомеризации по НС D103, которая, как было показано, влияет на связывание с антигеном. Отмеченные изменения специфичного связывания с FcγRIIIa и FcRn не превышали вариабельности анализа.

Пример 26: Белантамаб после воздействия света

Фрагментация возрастала с 0,8% до 1,5% при 1,5Х ICH, а агрегация возрастала с приблизительно 1% до 6,5-7,5%. Рост окисления по НС М34 с приблизительно 0,3% до 1,6-2,1%, рост окисления по НС М256 с приблизительно 2,2% до 18,4-25,1% и рост окисления по НС М432 с приблизительно 1% до 13,7-19,5% при 1,5Х ICH. cIEF-анализ продемонстрировал повышение кислого варианта с приблизительно 25% до приблизительно 34% и отсутствие изменений по основному варианту (см. Таблицу 35 ниже). Все наблюдаемые изменения специфичного связывания с антигеном, FcγRIIIa и FcRn не превышали вариабельности анализа; таким образом, после стрессового воздействия посредством рН 3,5 на протяжении 28 суток белантамаб продемонстрировал сопоставимое связывание при SPR.

В исследовании ускоренной деградации белантамаба были получены результаты, сходные с результатами исследования ускоренной деградации белантамаба мафодотина, представленными выше, за тем единственным исключением, что до 48,5% окисления по НС М34 не приводили к изменениям связывания с антигеном, которые превышали бы вариабельность анализа.

Следует отметить, что данные по cIEF белантамаба мафодотина не показаны, поскольку лекарственная нагрузка влияет на зарядный профиль, в то время как в случае белантамаба cIEF позволяет эффективно отделять кислый и основной варианты от главной разновидности (см. Фиг. 4).

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GLAXOSMITHKLINE INTELLECTUAL PROPERTY

DEVELOPMENT LIMITED

<120> БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ СПОСОБЫ

<130> PU66806

<150> 62/883,451

<151> 2019-08-06

<150> 62/948,432

<151> 2019-12-16

<150> 62/984,110

<151> 2020-03-02

<160> 14

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Asn Tyr Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 9

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 12

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 13

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 14

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Искусственно синтезированная последовательность

<400> 14

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser

1 5 10 15

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr Trp

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлена композиция, предназначенная для изготовления лекарственного средства для лечения расстройств или заболеваний, связанных с B-клетками, содержащая изомеризованный вариант антитела против BCMA, где композиция содержит 0,1-25% изомеризованного варианта изоаспартата по положению 103 в CDRH3 тяжелой цепи исходя из общего количества 100% антитела в композиции. А также раскрыты: фармацевтическая композиция для лечения расстройств или заболеваний, связанных с B-клетками и фармацевтический состав для лечения расстройств или заболеваний, связанных с B-клетками, содержащий фармацевтическую композицию. Изобретение применяют для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных ВСМА. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 35 табл, 26 пр.

1. Композиция, предназначенная для изготовления лекарственного средства для лечения расстройств или заболеваний, связанных с B-клетками, содержащая изомеризованный вариант антитела против BCMA (B-клеточный антиген созревания), где изомеризованный вариант содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 или 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10, где композиция содержит 0,1-25% изомеризованного варианта изоаспартата по положению 103 в CDRH3 тяжелой цепи исходя из общего количества 100% антитела в композиции.

2. Композиция по п. 1, содержащая 0,1-40% окисленного варианта окси-М по положению 34 в CDRH1 тяжелой цепи исходя из общего количества 100% антитела в композиции.

3. Композиция по любому из пп. 1, 2, содержащая 65% или менее окисления по положению M256 тяжелой цепи и/или 60% или менее окисления по положению M432 тяжелой цепи исходя из общего количества 100% антитела в композиции.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, содержащая вариант антитела, содержащий по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из дезамидирования тяжелой цепи по положению N388 и/или N393, D103 на N103 в CDRH3, отщепления C-концевого лизина и превращения N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, содержащая по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из 100% или менее дезамидирования по положению N388 и/или N393, 100% или менее N103 в CDRH3, 100% или менее отщепления C-концевого лизина и 100% или менее превращения N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту исходя из общего количества 100% антитела в композиции.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, содержащая любой процент гликоформ G0, G1, G2, G0-GlcNac или G0-2GlcNac.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, где антитело против BCMA представляет собой белантамаб.

8. Композиция по любому из пп. 1-7, где антитело против BCMA конъюгировано с цитотоксическим агентом с получением конъюгата антитела с лекарственным средством.

9. Композиция по любому из пп. 1-8, где антитело против BCMA представляет собой белантамаб мафодотин.

10. Композиция по пп. 8, 9, где: процент DL2 составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 15% до приблизительно 27% или от приблизительно 15% до приблизительно 32%; процент DL4a составляет по меньшей мере приблизительно 30%, от приблизительно 35% до приблизительно 38% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%; процент DL4b составляет по меньшей мере приблизительно 5%, от приблизительно 7% до приблизительно 9% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%; процент DL6 составляет по меньшей мере приблизительно 10%, от приблизительно 14% до приблизительно 20% или от приблизительно 10% до приблизительно 20%; и/или DL8 составляет по меньшей мере приблизительно 1%, от приблизительно 6,0% до приблизительно 12,0% или от приблизительно 4% до приблизительно 15%.

11. Композиция по пп. 8-10, где среднее DAR (отношение лекарственного средства к антителу) составляет от приблизительно 2,1 до приблизительно 5,7.

12. Композиция по пп. 8-11, где процент DL0 меньше или равен приблизительно 10% или приблизительно 5%.

13. Фармацевтическая композиция для лечения расстройств или заболеваний, связанных с B-клетками, содержащая композицию по пп. 1-12 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

14. Композиция по пп. 1-12 или фармацевтическая композиция по п. 13 для лечения рака.

15. Фармацевтический состав для лечения расстройств или заболеваний, связанных с B-клетками, содержащий фармацевтическую композицию по п. 13, содержащий от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл антигенсвязывающего белка против BCMA, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ цитратного буфера, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ трегалозы, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 0,1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% полисорбата 20 или полисорбата 80 при pH от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,5.