КОМБИНАЦИЯ ПОКСВИРУСА, КОДИРУЮЩЕГО ПОЛИПЕПТИДЫ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА, И IL-2 С АНТИТЕЛОМ К PD-L1 Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61P35/00 A61K39/395 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к комбинации а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и б) антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, для применения в лечение ВПЧ-положительного рака, при котором первое введение указанного поксвируса проводят за 5-10 дней до первого введения указанного антитела против PD-L1, и осуществляют последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1.

Предшествующий уровень техники

Вирус папилломы человека (ВПЧ) является наиболее часто диагностируемой инфекцией, передающейся половым путем. Она ассоциирована с остроконечными кондиломами, аногенитальными (цервикальными, вагинальными, Бульварными, пенильными, анальными) и плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями и злокачественными новообразованиями, а также с плоскоклеточным раком области головы и шеи (SCCHN).

ВПЧ представляет собой небольшой вирус на основе дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), состоящей приблизительно из 7900 пар оснований. Геном ВПЧ кодирует последовательности ДНК шести ранних (Е) белков, связанных с регуляцией вирусных генов и трансформацией клеток, двух поздних белков, формирующих оболочку вируса, и область регуляторных последовательностей ДНК, известную как длинная контрольная область или вышестоящая регуляторная область (Palefsky JM и Holly ЕА, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. (1995) 4(4): 415-428).

Генотипы ВПЧ можно условно разделить на такие «высокого риска» (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68) и «низкого риска» (6, 11, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 61, 72, 73 и 81) в зависимости от их злокачественного потенциала. Типы 16 и 18 являются наиболее часто встречающимися типами ВПЧ при раке, при этом тип 16 обнаруживается, например, примерно у 50% пациентов с раком шейки матки. Помимо рака шейки матки, ВПЧ также вызывает рак анального канала и полового члена. Существует также приблизительно в 2-3 раза повышенный риск развития орофарингеального рака у пациентов, инфицированных подтипами ВПЧ высокого риска (онкогенными): генотипом ВПЧ-16, а также ВПЧ-18, 31 или 33. Опухоли, ассоциированные с ВПЧ, преимущественно возникают у основания языка или в области миндалин, хотя небольшой процент опухолей других локализаций также является ВПЧ-положительным. Остается непонятным, почему орофарингеальная область является более восприимчивой к трансформации ВПЧ, чем другие участки.

Обзор опубликованных клинических исследований, как несравнительных когортных исследований, так и рандомизированных, продемонстрировал положительную реакцию на ВПЧ в диапазоне от 20 до 60% случаев орофарингеального рака (Ihloff A.S. и др., Oral Oncol. (2010) 46(10): 705-711).

Инфекция ВПЧ высокого риска не только связана с различными видами рака, но также известно, что она участвует в канцерогенезе ВПЧ-положительных видов рака. В частности, исследования показывают, что инфекция ВПЧ высокого риска является независимым фактором риска развития SCCHN и должна рассматриваться наряду с традиционными факторами риска, такими как злоупотребление табаком или алкоголем.

Было показано, что механизмы, связывающие ВПЧ-инфекцию с канцерогенезом, ассоциируются с двумя вирусными белками Е6 и Е7. Е6 и Е7, которые описываются как онкопротеины, поскольку они обладают способностью нарушать нормальный контроль репликации инфицированных клеток путем ингибирования ключевых факторов регуляции. Онкобелок Е6 связывается и индуцирует разрушение белка-супрессора опухоли р53 посредством опосредованного убиквитином процесса, нарушая путь р53, что приводит к неконтролируемому прогрессированию клеточного цикла (Chung СН и Gillison ML, Clin Cancer Res. (2009) 15(22): 6758-6762). Белок E7 ВПЧ связывается и ингибирует белок ретинобластомы (pRb), предотвращая ингибирование этим белком фактора транскрипции E2F, что приводит к потере контроля над клеточным циклом. Кроме того, функциональная инактивация Rb приводит к усилению активности белка р16. p16 кодируется геном-супрессором опухоли CDKN2A и регулирует активность комплексов циклин D-CDK4/6, которые фосфорилируют Rb, что приводит к высвобождению фактора транскрипции E2F, который инициирует развитие клеточного цикла.

Против инфекции ВПЧ были разработаны две профилактические вакцины: одна представляет собой четырехвалентную вакцину (Гардасил), а другая является двухвалентной вакциной (Церварикс). Обе вакцины являются одобренными для профилактики инфекции ВПЧ и заболеваний, связанных с ВПЧ, у субъектов, которые ранее не подвергались воздействию ВПЧ.

Однако на сегодняшний день только несколько противоопухолевых вакцин против ВПЧ-положительного рака, в частности SCCHN, прошли клиническую проверку. Запускаемая с помощью вакцины и долговременная персистенция специфических для опухоли иммунных клеток являются целями, которые должны реализовывать противоопухолевые вакцины, чтобы быть клинически полезными при ВПЧ-положительном раке, в частности SCCHN.

TG4001 (соответствует исследовательскому наименованию MVATG8042) представляет собой терапевтическую рекомбинантную вакцину/иммунотерапевтический продукт, который основывается на неразмножающемся высокоаттенуированном векторе осповакцины, модифицированном вирусе осповакцины Анкара (MVA), геном которого представляет собой одну линейную двухцепочечную молекулу ДНК размером примерно 178 пар оснований, который содержит встроенные трансгены, кодирующие три белка: онкобелки Е6 и Е7 ВПЧ, модифицированные для устранения их онкогенного потенциала, и человеческий интерлейкин-2 (IL-2) в качестве адъюванта.

TG4001 был клинически исследован в гинекологических условиях. Среди 5 проведенных исследований фазы II четыре включали пациенток с предраковыми поражениями, в частности, с интраэпителиальной неоплазией шейки матки (CIN) степени 2/3 и интраэпителиальной неоплазией вульвы (VIN) степени 3, а одно исследование включало пациенток с раком шейки матки. Два исследования фазы II с участием 21 (TG4001.07) и 206 (NV25025) пациенток с CIN степени 2/3, ассоциированной с ВПЧ-16, продемонстрировали доказательство концепции, в соответствии с которой TG4001 обладает более высокой активностью и эффективностью по сравнению с плацебо с точки зрения гистологического разрешения и частоты ответов, а также очищения от вирусов. Доза, которая использовалась в этих исследованиях фазы II у пациенток с CIN степени 2/3, ассоциированной с ВПЧ-16, составляла 5×10⁷ бляшкообразующих единиц (БОЕ) при подкожном введении. Что касается профиля безопасности, то было продемонстрировано, что терапевтический вакцинный продукт хорошо переносится (не наблюдалось значительной токсичности), при этом наиболее частыми побочными эффектами были реакции в месте введения.

Общий профиль безопасности TG4001, который основывается на данных, полученных от 313 субъектов (либо здоровых добровольцев, либо пациентов с CIN 2/3, карциномой шейки матки или VIN, получавших TG4001 в виде монотерапии или в комбинации с иммуномодулятором имиквимодом, внутримышечно или подкожно) показывает, что TG4001 хорошо переносится до самой высокой испытанной дозы 5×10⁷ БОЕ, вводимой пациентам либо еженедельно, либо каждые 3-7 недель, с максимальным количеством инъекций 6. В соответствии со своим иммуностимулирующим действием введение TG4001 вызывало возникновение реакций в месте инъекции у большинства пациентов, подвергшихся лечению. Большинство из этих явлений были от легкой до умеренной степени интенсивности.

PD-1 представляет собой негативный регулятор активности Т-клеток, который ограничивает активность Т-клеток на различных стадиях иммунного ответа при взаимодействии со своими двумя лигандами, PD-L1 и PD-L2. При взаимодействии с лигандом с помощью фосфатазной активности PD-1 ингибирует пути передачи сигналов киназы, которые обычно приводят к активации Т-клеток. В клиническую разработку был введен ряд антител, которые нарушают ось PD-1. Также считается, что PD-L1 оказывает отрицательное воздействие на Т-клетки, взаимодействуя с В7, а антитела, блокирующие PD-L1, предотвращают это взаимодействие. Ингибиторы иммунных контрольных точек также усиливают функцию инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), что усиливает противоопухолевый иммунитет в микроокружении опухоли. Наличие TIL коррелирует с лучшим прогнозом при многих типах рака. Таким образом, было показано, что TIL PD-L1+ являются индикаторами ответа на блокаду иммунных контрольных точек, а отсутствие TIL может быть прогностическим маркером отсутствия ответа на блокаду PD-1/L1 (Herbst R.S. и др., Nature. (2014) 515(7528): 563-567).

Антитела против PD-L1 были клинически исследованы при лечении различных солидных форм рака, и было обнаружено, что они обеспечивают клиническую пользу при различных видах рака (Brahmer J.R. и др., N Engl J Med. (2012) 366(26): 2455-2465).

Авелумаб представляет собой человеческое антитело против лиганда запрограммированной смерти-1 (PD-L1). В доклинических моделях было показано, что авелумаб задействует функции как адаптивного, так и врожденного иммунитета. Блокируя взаимодействие PD-L1 с рецепторами PD-1, авелумаб, как было показано в доклинических моделях, снимает подавление опосредованного Т-клетками противоопухолевого иммунного ответа. Также было показано, что авелумаб индуцирует опосредованный естественными клетками-киллерами непосредственный лизис опухолевых клеток посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) in vitro. Авелумаб в комбинации с акситинибом показан в США для лечения первой линии пациентов с прогрессирующим почечно-клеточным раком (RCC). Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) также предоставило ускоренное разрешение на применение авелумаба для лечения (I) взрослых и детей старше 12 лет с метастатической клеточной карциномой Меркеля (mMCC) и (II) пациентов с локально прогрессирующей или метастатической уротелиальной карциномой (mUC), у которых наблюдается прогрессирование заболевания во время или после химиотерапии при использовании платины, или у которых заболевание прогрессирует в течение 12 месяцев неоадъювантного или адъювантного лечения с помощью химиотерапии на основе платины.

Авелумаб показал приемлемый профиль безопасности у онкологических больных. Предупреждения и меры предосторожности для авелумаба включают иммуноопосредованные побочные реакции (такие, как пневмонит и гепатит [включая случаи со смертельным исходом], колит, эндокринопатии, нефрит и почечную дисфункцию, а также другие побочные реакции [которые могут быть тяжелыми и включают случаи со смертельным исходом]), реакции, связанные с инфузией, тяжелые сердечно-сосудистые осложнения (МАСЕ) и эмбриофетальную токсичность.

В настоящее время продолжаются клинические испытания применения авелумаба при ВПЧ-положительном раке, таком как SCCHN, но результаты на данном этапе не опубликованы.

Несмотря на результаты, полученные при использовании TG4001 в случае предраковых поражений, или при раке с применением только антител против PD-L1, новые методы лечения по-прежнему являются крайне необходимыми для повышения противоопухолевой эффективности и доли ответивших на терапию пациентов. Соответственно, все еще существует потребность в разработке новых терапевтических возможностей для лечения рака. В частности, существует потребность в способах лечения рака, которые улучшают эффективность (а) векторов на основе поксвируса, кодирующих, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, или (б) антител против PD-L1 при одном или более видах рака. Настоящее изобретение относится к комбинированному продукту для лечения ВПЧ-положительного рака для удовлетворения вышеуказанной потребности.

Ингибиторы иммунных контрольных точек, включая антитела к PD-L1, были предложены для комбинации со многими другими типами противоопухолевой терапии, включая иммунотерапию на основе вакцин, таких как поксвирусные векторы. В большинстве случаев эксперименты проводились на животных моделях рака, не связанного с инфекцией ВПЧ, при этом также не осуществляли специального анализа токсичности исследуемой комбинации (WO 2016/128542, WO 2015/175334, WO 2015/069571, Remy-Ziller и др., Hum Vaccin Immunother. (2018) 14(1): 140-145). Два клинических испытания фазы II (NCT03353675 и NCT02823990) при использовании комбинации TG4010 (вектор MVA, кодирующий MUC1 и интерлейкин-2) и ниволумаба (антитело против PD-1) в лечении немелкоклеточного рака легких (NSCLL) продолжаются (Oliveres H. и др., J Thorac Dis. (2018) 10 (Suppl 13): S1602-S1614), но результаты испытаний пока не были опубликованы.

В контексте ВПЧ-положительных видов рака также были предложены комбинации различных вакцин, предназначенных для стимуляции иммунного ответа против антигенов ВПЧ, включая вирусные вакцины, и ингибиторов иммунных контрольных точек (Gildener-Leapman и др., Oral Oncol. (2014)), 50(9): 780-4; WO 2015/103602; Rice и др., Cancer Gene Ther. (2015) 22(9): 454-62; WO 2016/071306; US 2017/051019; US 2019/142933). На сегодняшний день не было раскрыто экспериментальных данных, свидетельствующих о приемлемом профиле токсичности и улучшенной терапевтической эффективности против ВПЧ-положительного рака комбинации вирусной вакцины, кодирующей антигены ВПЧ, и антитела против PD-L1. Сообщалось о продолжающемся клиническом испытании фазы Ib/II (NCT03260023), в котором сочетали TG4001 и авелумаб для лечения ВПЧ-положительного SCCHN (Lin и др., Front Oncol. (2018) 8: 532), но результаты исследования еще не опубликованы.

Краткое изложение сущности изобретения

В контексте настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что комбинирование вектора на основе поксвируса, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ), и иммуностимулирующий цитокин, предпочтительно TG4001, и антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент, предпочтительно авелумаб, при использовании специфической схемы введения у пациентов с ВПЧ-положительным раком приводит к приемлемой токсичности и улучшению иммунного ответа на полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ. В частности, несмотря на иммуностимулирующий эффект как авелумаба, так и TG4001 (живой вектор), не наблюдалось взаимодействия между двумя продуктами, приводящего к неприемлемой токсичности, чего нельзя было разумно ожидать. В частности, ввиду иммуностимулирующего действия обоих продуктов взаимодействие между ними, которое могло привести к неприемлемой токсичности, находилось под угрозой, в частности, с учетом того факта, что Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) приостановило клинические испытания в исследовании, сочетающем вакцину против листерии с антителом против PD-L1, после смерти пациента от осложнений в связи с побочными эффектами (NCT02291055). Это исследование предполагало, что вакцина (другой тип живого вектора) могла усилить известный побочный эффект ингибитора иммунных контрольных точек. Кроме того, при применении комбинации наблюдались многообещающие благоприятные иммунные изменения (включая индукцию иммунного ответа на полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ, увеличение количества CD8T-клеток и снижение количества CD4 регуляторных Т-клеток как в в кровеносной системе, так и в опухолевой ткани, а также активацию генов, связанных с «горячим», а не «холодным» профилем опухоли и с лучшим прогнозом), чего никогда не наблюдалось ни при одном способе лечения, взятыми отдельно.

Потенцирование может быть аддитивным или синергетическим. Потенцирующий эффект комбинированной терапии является, по крайней мере, аддитивным. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что комбинация (а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и (б) антитела против PD-L1 приводит к улучшенному лечению. Первоначальные результаты клинических испытаний показывают, что комбинированная терапия была эффективной при лечении рака, такого как рецидивирующий/метастатический ВПЧ-16 положительный рак (см. Пример 1), и что комбинированная терапия хорошо переносится (см. Пример 1). Более того, при этом наблюдали эффекты, которые присущие каждому из двух способов лечения комбинацией (см. Пример 1), что демонстрирует, по крайней мере, аддитивный потенцирующий эффект комбинированной терапии.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к комбинации:

а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и

б) антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента,

для лечения ВПЧ-положительного рака или ВПЧ-положительных предраковых интраэпителиальных повреждений,

где первое введение указанного поксвируса осуществляют за 5-10 дней до первого введения указанного антитела против PD-L1, и осуществляют последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения ВПЧ-положительного рака или ВПЧ-положительных предраковых интраэпителиальных повреждений у субъекта, который в этом нуждается, включающему введение указанному субъекту комбинации:

а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и

б) антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента,

где первое введение указанного поксвируса осуществляют за 5-10 дней перед первым введением указанного антитела против PD-L1, и проводят последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1.

Настоящее изобретение также относится к применению комбинации:

а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и

б) антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента,

для производства лекарственного средства для лечения ВПЧ-положительного рака или ВПЧ-положительных предраковых интраэпителиальных повреждений,

где первое введение указанного поксвируса осуществляют за 5-10 дней перед первым введением указанного антитела против PD-L1, и проводят последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1.

Настоящее изобретение также относится к применению комбинации:

а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и

б) антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента,

для лечения ВПЧ-положительного рака или ВПЧ-положительных предраковых интраэпителиальных повреждений,

где первое введение указанного поксвируса осуществляют за 5-10 дней перед первым введением указанного антитела против PD-L1, и проводят последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1.

В указанной комбинации, способе или применении указанный поксвирус предпочтительно представляет собой вирус осповакцины, более предпочтительно модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), который предпочтительно кодирует закрепленные на мембране ВПЧ (предпочтительно ВПЧ-16) неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 и интерлейкин 2 человека (IL-2). Наиболее предпочтительно, когда указанный поксвирус представляет собой вирус MVA, кодирующий закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2. Каждая доза поксвируса, которая вводится субъекту, предпочтительно составляет от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ, более предпочтительно приблизительно 5×10⁷ БОЕ. Каждую дозу поксвируса, которая вводится субъекту, предпочтительно вводят подкожно.

В указанной комбинации, способе или применении указанное антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно обесепчивает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). Структурно указанное антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно содержит тяжелую цепь, которая включает три участка, которые определяют комплементарность и имеют аминокислотные последовательности SEQ ID No: 1, 2 и 3, и легкую цепь, которая включает три участка, определяющие комплементарность, которые имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6. Более предпочтительно, когда указанное антитело против PD-L1 содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 или 8, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Наиболее предпочтительно, когда указанное антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб. Каждая доза указанного антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента предпочтительно составляет примерно 10 мг/кг или примерно 800 мг. Каждую дозу указанного антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента предпочтительно вводят внутривенно, более предпочтительно путем внутривенной инфузии.

Нацеленное терапевтическое применение представляет собой лечение ВПЧ-положительного рака, предпочтительно ВПЧ-положительного орофарингеального рака, рака шейки матки, влагалища, анального канала, вульвы, полового члена, слизистых оболочек или немеланомного рака кожи, или ВПЧ-положительных предраковых интраэпителиальных повреждений. Рак или предраковые внутриэпителиальные повреждения предпочтительно являются ВПЧ-16 положительными, и рак, в частности, может представлять собой ВПЧ-16 положительную плоскоклеточную карциному головы и шеи (ВПЧ-16+SCCHN). Рак-мишень также предпочтительно представляет собой рецидивирующий и/или метастатический ВПЧ-положительный рак (предпочтительно, рецидивирующий и/или метастатический ВПЧ-16 положительный рак, наиболее предпочтительно рецидивирующий и/или метастатический ВПЧ-16 положительный SCCHN).

Комбинация (а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и (б) антитело против PD-L1 могут обеспечиваться в одной или отдельных дозированных формах. Комбинацию вводят в соответствии со специальной схемой введения, которая включает первое введение указанного поксвируса за 5-10 дней перед первым введением указанного антитела против PD-L1 и последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 и последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1. Предпочтительно, когда последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 проводят до тех пор, пока прогрессирует заболевание. Более предпочтительно, когда комбинацию вводят в соответствии со следующей схемой введения:

а) первая доза от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ указанного поксвируса вводится

подкожно, а затем последующие дозы поксвируса от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ вводятся подкожно до тех пор, пока прогрессирует заболевание:

• еженедельно в течение 6 недель,

• один раз каждые 2 недели до 6 месяцев, и

• каждые 12 недель для последующих доз поксвируса;

б) первая доза приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 800 мг антитела против PD-L1 вводится внутривенно через 5-10 дней после первой дозы поксвируса, с последующими дозами антитела против PD-L1, которые составляют приблизительно 10 мг/кг или примерно 800 мг, указанные дозы вводятся внутривенно каждые 2 недели до тех пор, пока прогрессирует заболевание.

Особенно предпочтительный вариант осуществления в соответствии с изобретением заключается в следующем:

а) указанный поксвирус представляет собой вирус MVA, который кодирует закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2,

б) указанное антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб, и

в) указанный поксвирус и антитело к PD-L1 вводят в соответствии со следующей схемой введения:

I) вирус MVA, кодирующий закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2, вводят подкожно в дозе 5×10⁷ БОЕ еженедельно в течение 6 недель, затем один раз каждые 2 недели до 6-го месяца, затем каждые 12 недель до тех пор, пока прогрессирует заболевание,

II) авелумаб вводят путем внутривенной инфузии в дозе примерно 10 мг/кг или примерно 800 мг каждые 2 недели, начиная с 8-го дня до тех пор, пока прогрессирует заболевание.

Комбинация, способ или применение в соответствии с изобретением предпочтительно индуцируют положительный иммунный ответ против рака или предракового поражения у субъекта, подвергающегося лечению. Примечательно, что в системе кровообращения комбинация для применения в соответствии с изобретением предпочтительно:

• увеличивает количество циркулирующих CD8 и/или CD4 Т-клеток, специфичных к полипептиду Е6 и/или Е7 ВПЧ, и/или

• снижает долю циркулирующих регуляторных Т-клеток. Аналогичным образом, в опухолевой ткани комбинация, способ или применение в соответствии с изобретением предпочтительно:

увеличивает инфильтрацию опухолевой ткани специфическими для полипептида Е6 и/или Е7 ВПЧ CD8 и/или CD4 Т-клетками, и/или

уменьшает инфильтрацию опухолевой ткани регуляторными Т-клетками.

Описание фигур

Фигура 1. Изменение размеров опухоли при комбинированном лечении. (А) Наилучшее изменение размера опухоли: % изменения от базового уровня (от расчетной суммы) на 43-й день у отдельных пациентов, которых подвергали лечению комбинацией TG4001 при DL1 (уровень дозы 1) 5×10⁶ БОЕ (серый цвет) или DL2 (уровень дозы 2) 5×10⁷ БОЕ (заштрихованный серый) с авелумабом при дозе 10 мг/кг в соответствии со схемой введения, описанной в Примере 1. Частичный ответ (ЧО) в соответствии с RECIST v1.1 обозначен *(Б). Индивидуальное горизонтальное изменение: % изменения от базового уровня (от расчетной суммы) у индивидуальных пациентов, которые получали комбинацию TG4001 при DL1 (5х10⁶ БОЕ, пунктирная линия) или DL2 (5×10⁷ БОЕ, сплошная линия) с авелумабом в дозе 10 мг/кг в соответствии со схемой введения, описанной в Примере 1, в различные моменты времени. Указаны пороговые значения для прогрессирующего заболевания (ПЗ: ≥ +20%), стабильного заболевания (-30% < СЗ < +20%) и частичного ответа (ЧО: ≤ -30%). Также указывается тип ВПЧ-16 положительного рака для каждого пациента.

Фигура 2. Стимуляция Т-клеточного иммунитета с помощью комбинированного лечения. Соотношение CD8/CD3 (А) или соотношение Treg (CD4 Foxp3)/CD8 (Б) в опухолевых иммунных инфильтратах на базовом уровне и на 43-й день, на основе иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания образцов опухоли FFPE (зафиксированная формалином и залитая парафином) у отдельных пациентов.

Фигура 3. Анализ изменения экспрессии генов в опухолевой ткани в процессе лечения. Экспрессию панели из 770 генов, связанных с иммунным ответом, оценивали на базовом уровне и после лечения (43-й день). Вулканные диаграммы (графики рассеяния для большого массива данных) изменений экспрессии генов активации Т-клеток (А), цитотоксических клеток (Б), защиты от патогенов (В) и функции NK-клеток (Г) после и до лечения. На каждом графике рассеяния для большого массива данных черные точки соответствуют генам указанной категории.

Фигура 4. Анализ изменения экспрессии генов в опухолевой ткани в процессе лечения. (А) Представление категорий генов, включенных в генетические отпечатки, ранее описанные как Immunosign® 15 и Immunosign® 21 (Galon и др., Immunity (2013) 39(1): 11-26; Marabelle и др., Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) 32-я ежегодная встреча и предконференционная программа (SITC 2017) 8-12 ноября 2017 г. в отеле Gaylord National Hotel & Convention Center в National Harbor, Maryland. Poster P250. Постер P250). (Б) Вулканные диаграммы изменений в генах Immunosign® 15 (Б) и Immunosign® 21 (В). На каждой вулканной диаграмме черные точки соответствуют генам указанного отпечатка.

Фигура 5. Изменения в иммунных инфильтратах у пациента 0101006. (А) CD3, CD8 или CD4 Foxp3 Т-клетки/мм² в опухолевых иммунных инфильтратах на базовом уровне и на 43-й день. (Б). Процент Т-клеток CD8 вблизи клеток, экспрессирующих PD-L1, в зависимости от расстояния в мкм между клетками, экспрессирующими PD-L1, и Т-клетками CD8.

Фигура 6. Анализ изменения экспрессии генов в опухолевой ткани во время лечения пациента 0101006. Экспрессия генов, связанных с процессингом и презентацией антигена (А), генов, связанных с защитным ответом на вирус (Б), Толл-подобных рецепторов (В) и Immunosign® 21 гена (Г).

Фигура 7. Влияние характеристик заболевания/пациента на частоту объективных ответов (ЧОО). Для каждой характеристики представлено отношение рисков (ОР), 95% доверительный интервал и р-значение. Генитальный = вульварный/вагинальный. ОР выше 1 указывает на то, что наличие характеристики связано с худшей ЧОО, в то время как ОР ниже 1 указывает на то, что наличие характеристики связано с лучшим ЧОО. Значение p<0,05 указывает на то, что характеристика значительным образом связана с худшим или лучшим ЧОО. Было обнаружено, что только одна характеристика (наличие метастазов в печень) значительно связана с ухудшением ЧОО (в рамке).

Фигура 8. Влияние заболевания / характеристик пациента на выживаемость без прогрессирования (ВБПЗ). Для каждой характеристики представлены значения отношения рисков (ОР), 95% доверительный интервал и р-значение. Генитальный = вульварный/вагинальный. ОР больше 1 указывает, что наличие характеристики связано с худшей ВБПЗ, в то время как значение ОР ниже 1 указывает, что наличие характеристики связано с лучшей ВБПЗ. Значение p<0,05 указывает на то, что характеристика в значительной мере ассоциирована с худшей или лучшей ВБПЗ. Было обнаружено, что две характеристики (наличие метастазов в печени и рак анального канала) в значительной степени связаны с ухудшением ВБПЗ, в то время как одна характеристика (вовлечение лимфатических узлов) в значительной степени связана с улучшением ВБПЗ (все три характеристики обведены рамкой).

Фигура 9. Наилучшее изменение размера опухоли у 23 пациентов без метастазов в печень из объединенных фазы Ib и фазы II: наилучшее изменение в % от базового уровня (от расчетной суммы) у отдельных пациентов, получавших комбинацию TG4001 в DL2 (5×10⁷ БОЕ) с авелумабом в дозе 10 мг/кг в соответствии со схемой введения, описанной в Примере 1. Прогрессирующее заболевание (ПЗ) обозначено черным, стабильное заболевание (СЗ) - светло-серым, частичный ответ (ЧО) - темно-серым и полный ответ (ПО) - средне-серым.

Фигура 10. Лучшее изменение размера опухоли у 9 пациентов с метастазами в печень из объединенных фазы Ib и фазы II: лучшее изменение в % от базового уровня (от расчетной суммы) у отдельных пациентов, получавших комбинацию TG4001 в DL2 (5×10⁷ БОЕ) с авелумабом в дозе 10 мг/кг в соответствии со схемой введения, описанной в Примере 1. Прогрессирующее заболевание (ПЗ) показано черным, а стабильное заболевание (СЗ) - светло-серым.

Фигура 11. График рассеяния для большого массива данных, показывающий кратное изменение для «Да» против «Нет» (поражение печени) в зависимости от р-значения линейной модели популяции базового уровня (визит к врачу). Названы гены с наиболее высокой дифференциальной экспрессией.

Подробное описание изобретения

Общие определения

Термины «какой-либо» или «один» используются в данной заявке в том смысле, что они означают «по крайней мере, один», «по крайней мере, первый», «один или более» или «множество» упомянутых соединений или стадий, если контекст не требует иного. Таким образом, термин включает как одно/одну из указанных соединений или стадий, так и более чем одно/одну из указанных соединений или стадий.

Термин «примерно» или «приблизительно», который используется в данной заявке взаимозаменяемо, означает в пределах 5%, предпочтительно в пределах 4% и более предпочтительно в пределах 2% от заданного значения или диапазона. В контексте настоящего раскрытия каждый раз, когда речь идет о приблизительном значении X как «приблизительно X», вариант осуществления, в котором значение равно X, также рассматривается в контексте изобретения.

Термин «и/или» везде, где бы он не использовался в данном описании, включает значение «и», «или» и «все или любая другая комбинация элементов, связанных указанным термином». Например, «рецидивирующий и/или метастатический» означает рецидивирующий или метастатический, или как рецидивирующий, так и метастатический.

Используемый в данной заявке термин «комбинация» относится к любой возможной комбинации двух или более компонентов (например, по крайней мере, поксвируса и антитела к PD-L1, описанных в данной заявке). В частности, «комбинация» может относиться к (I) продукту, который состоит из двух или более регулируемых компонентов, которые физически, химически или иным образом объединены или смешаны и воспроизведены как единое целое; (II) двум или более отдельным продуктам, упакованным вместе в одну упаковку или как единое целое, которое состоит из лекарственного средства и устройства, устройства и биологических продуктов; (III) лекарственному средству, устройству или биологическому продукту, упакованным отдельно, которые в соответствии с планом исследования или предлагаемой маркировкой предназначены для использования только с утвержденным индивидуально указанным лекарственным средством, устройством или биологическим продуктом, когда оба являются необходимыми для достижения предполагаемого использования, предписания или эффекта, и когда после одобрения предлагаемого продукта потребуется изменить маркировку одобренного продукта, например, чтобы отразить изменения предполагаемого использования, лекарственной формы, силы действия, пути введения или значительного изменения дозы; или (IV) любому исследуемому лекарственному средству, устройству или биологическому продукту, упакованным отдельно, которые в соответствии с предлагаемой маркировкой предназначены для использования только с другим индивидуально указанным исследуемым лекарственным средством, устройством или биологическим продуктом, если оба они необходимы для достижения предполагаемого использования, показания или эффекта.

Используемый в данной заявке термин «комбинированная терапия», «в сочетании с» или «в соединении с» обозначает любую форму сопутствующего, параллельного, одновременного, последовательного или прерывистого лечения, по крайней мере, с двумя различными модальностями лечения (т.е. соединениями, компонентами, средствами целенаправленного воздействия или терапевтическими агентами). Как таковые, термины относятся к применению одной модальности лечения перед, во время или после введения субъекту другой модальности лечебного воздействия. Модальности в комбинации можно вводить в любом порядке. Терапевтически активные модальности вводят вместе (например, одновременно в одних и тех же или отдельных композициях, препаратах или стандартных дозированных формах) или по отдельности (например, в один и тот же день или в разные дни и в любом порядке в соответствии с приемлемым протоколом дозирования для отдельных композиций, составов или стандартных лекарственных форм) способом и в соответствии с режимом дозирования, предписанным медицинским работником или регулирующим органом. В общем случае, каждая модальность лечения будет вводиться в дозе и/или в соответствии с графиком, определенном для этого способа лечения. Необязательно, в комбинированной терапии можно использовать три или более модальностей. Кроме того, комбинированная терапия, предусмотренная в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться в сочетании с другими видами лечения. Например, другое противораковое лечение может быть выбрано из группы, состоящей из химиотерапии, хирургического вмешательства, лучевой терапии (облучения) и/или гормональной терапии, наряду с другими видами лечения, связанными с существующим на данный момент стандартом ухода за субъектом.

Термин «включающий» (и любая форма включения, такая как «включает» и «включают»), «имеющий» (и любая форма наличия, такая как «имеет» и «имеют»), «имеющий в составе» (и любые форма включения, такая как «имеет в своем составе» и «имеют в своем составе») или «содержащий» (и любая форма включения, такая как «содержит» и «содержат»), в каждом случае, который используется в настоящем документе, при использовании для определения продуктов, композиций и способов, являются открытыми и не исключают дополнительные, неупомянутые элементы или этапы способа. Таким образом, полипептид «содержит» аминокислотную последовательность, когда аминокислотная последовательность может быть частью конечной аминокислотной последовательности полипептида. «Состоящий в основном из» будет означать исключение других компонентов или этапов, имеющих существенное значение. Таким образом, композиция, состоящая в основном из перечисленных компонентов, не будет исключать следов примесей и фармацевтически приемлемых носителей, но будет исключать другие активные ингредиенты. Полипептид «состоит в основном из» аминокислотной последовательности в том случае, когда такая аминокислотная последовательность присутствует необязательно только с несколькими дополнительными аминокислотными остатками. «Состоящий из» означает исключение более чем микропримесей других компонентов или стадий. Например, полипептид «состоит из» аминокислотной последовательности, когда полипептид не содержит каких-либо аминокислот, кроме указанной аминокислотной последовательности. В контексте настоящего изобретения каждый раз, когда продукт, способ или применение указывается как «содержащий» что-либо, воплощение, в котором указанный продукт или способ состоит по существу из того же самого или состоит из того же самого, это также предполагается в контексте изобретения.

Термин «мутант», «аналог» или «вариант», как используется в данном описании, относится к компоненту (полипептиду или нуклеиновой кислоте), который демонстрирует одну или несколько модификаций по отношению к его нативному аналогу. Могут быть предусмотрены любые модификации, включая замену, вставку и/или делецию одного или нескольких нуклеотидных/аминокислотных остатков. Когда предполагается несколько мутаций, они могут касаться последовательных остатков и/или непоследовательных остатков. Мутации могут быть получены с помощью ряда способов, известных специалистам в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез (например, при использовании системы in vitro мутагенеза Sculptor™ Amersham, Les Ullis, Франция), ПЦР-мутагенез, перестановка ДНК и методы химического синтеза (например, те, которые приводят к получению синтетической молекулы нуклеиновой кислоты). Предпочтительными являются аналоги, которые сохраняют степень идентичности последовательностей, по крайней мере 80%, предпочтительно, по крайней мере 85%, более предпочтительно, по крайней мере 90%, и даже более предпочтительно, по крайней мере 91%, по крайней мере 92%, по крайней мере 93%, по крайней мере 94%, по крайней мере 95%, по крайней мере 96%, по крайней мере 97%, по крайней мере, 98%, или по крайней мере 99% идентичности с последовательностью нативного аналога. В общем случае термин «идентичность» относится к соответствию аминокислоты аминокислоте или к соответствию нуклеотида нуклеотиду между двумя последовательностями полипептидов или нуклеиновых кислот. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей, принимая во внимание количество пробелов, которые необходимо ввести для оптимального глобального выравнивания (т.е. оптимального выравнивания обеих полноразмерных последовательностей) и длины каждого пробела. В данной области техники доступны различные компьютерные программы и математические алгоритмы для определения процента идентичности между последовательностями аминокислот или нуклеиновых кислот.

Термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «полинуклеотид» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо и определяют полимер полидезоксирибонуклеотидов (ДНК) любой длины (например, кДНК, геномная ДНК, плазмиды, векторы, вирусные геномы, изолированная ДНК, зонды, праймеры и любая их смесь) или полирибонуклеотиды (РНК) (например, мРНК, антисмысловая РНК, малая интерферирующая РНК) или смешанные полирибо-полидезоксирибонуклеотиды. Они охватывают одно- или двухцепочечные, линейные или кольцевые, природные или синтетические, модифицированные или немодифицированные полинуклеотиды. Более того, полинуклеотид может содержать неприродные нуклеотиды и может прерываться ненуклеотидными компонентами.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» относятся к полимерам аминокислотных остатков, которые содержат, по крайней мере, девять или более аминокислот, связанных пептидными связями. Полимер может быть линейным, разветвленным или циклическим и может включать природные аналоги и/или аналоги аминокислот, он может быть также прерван не-аминокислотами. В качестве общего указания, если аминокислотный полимер состоит более чем из 50 аминокислотных остатков, его далее называют полипептидом или белком, тогда как если он состоит из 50 аминокислот или менее, его называют «пептидом».

Термин «субъект» в общем случае относится к организму, для которого необходим или может быть полезен любой продукт и способ в соответствии с изобретением. Как правило, организм представляет собой млекопитающее. Желательно, когда субъектом является человек, у которого было диагностировано патологическое состояние или риск его возникновения, такое как инфекционное заболевание, вызванное или связанное с патогенным организмом, или пролиферативное заболевание, такое как рак. Термины «субъект» и «пациент» могут использоваться как взаимозаменяемые применительно к человеческому организму и охватывают мужчин и женщин. Субъектом лечения может быть новорожденный, младенец, молодой человек или взрослый.

Термины «лечение» и «терапия», которые используются в настоящей заявке, относятся к набору гигиенических, фармакологических, хирургических и/или физических средств, которые применяются для излечения и/или облегчения заболевания и/или симптомов с целью решения проблемы со здоровьем. Термины «лечение» и «терапия» включают профилактические и лечебные способы, поскольку они оба направлены на поддержание и/или восстановление здоровья человека или животного. Независимо от происхождения симптомов, заболевания и инвалидности введение подходящего лекарственного средства для облегчения и/или лечения проблемы со здоровьем следует интерпретировать как форму лечения или терапии в контексте данной заявки.

Поксвирусный вектор

Комбинация, способ или применение в соответствии с изобретением содержат в качестве первого компонента поксвирусный вектор, кодирующий, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ), и иммуностимулирующий цитокин.

Таким образом, термины «вектор на основе поксвируса» или «поксвирусный вектор» должны пониматься в характерном смысле как такие, которые включают нуклеиновокислотный вектор (например, поксвирусный вектор на основе ДНК), включающий по сути один элемент генома поксвируса и который может быть упакован в частицу поксвируса, а также образующиеся из него частицы поксвируса. Термины «поксвирус», «поксвирионы», «частицы поксвируса» и «частица вектора на основе поксвируса», которые используются взаимозаменяемо для обозначения поксвирусных частиц, которые образуются при трансдукции вектора нуклеиновой кислоты в соответствующую клетку или клеточную линию при подходящих условиях, которые допускают образование поксвирусных частиц. Термин «инфекционный» относится к способности поксвирусного вектора инфицировать и проникать в клетки хозяина или субъекта. Поксвирусные векторы могут быть репликационно компетентными или репликационно селективными (например, сконструированными для лучшей репликации или селективности в специфических клетках-хозяевах) или могут быть генетически инактивированными, чтобы быть дефектными по репликации или могут иметь нарушения репликации.

Тип поксвируса

Как используется в данной заявке, термин «поксвирус» относится к вирусу, который относится к семейству Poxviridae с предпочтением для подсемейства Chordopoxvirinae, направленному на позвоночного хозяина, который включает следующие роды, такие, как Orthopoxvirus, Capripoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Leporipoxvirus и Suipoxvirus. Orthopoxviruses являются предпочтительными в контексте настоящего изобретения, предпочтительными также являются представители рода Avipoxviruses, которые включают Canarypoxvirus (например, ALVAC) и Fowlpoxvirus (например, вектор FP9).

В предпочтительном воплощении комбинации, способа или применения в соответствии с изобретением поксвирус принадлежит к роду Orthopoxvirus и даже в большей степени относится к видам вируса осповакцины (VV). Вирусы осповакцины представляют собой большие сложные оболочечные вирусы с линейным геномом из двухцепочечной ДНК длиной примерно 200 п. о., которая кодирует многочисленные вирусные ферменты и факторы, позволяющие вирусу реплицироваться независимо от механизма клетки-хозяина. Существуют две различные инфекционные вирусные частицы: внутриклеточная IMV (для внутриклеточного зрелого вириона), окруженная одной липидной оболочкой, которая остается в цитозоле инфицированных клеток до лизиса, и EEV с двойной оболочкой (для внеклеточного вириона с оболочкой), который отпочковывается от инфицированной клетки.

Особенно подходящим поксвирусом в контексте настоящего изобретения является MVA (модифицированный вирус осповакцины Анкара) благодаря его высокоаттенуированному фенотипу, более выраженному ответу интеферона типа 1, который генерируется при заражении, по сравнению с неаттенуированными векторами, и доступности последовательности его генома (см., например, Genbank под регистрационным номером U94848).

Е6 и E7 полипептиды ВПЧ

Поксвирус (предпочтительно VV, более предпочтительно MVA) в соответствии с комбинацией, способом и применением в соответствии с настоящим изобретением кодирует, по крайней мере полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин.

Было идентифицировано более 100 генотипов ВПЧ, которые были классифицированы как серотипы «низкого» (HP) и «высокого риска» (BP) в зависимости от их онкогенного потенциала. НР-ВПЧ вызывает доброкачественные опухоли у инфицированных субъектов, тогда как BP-ВПЧ несет высокий риск злокачественного прогрессирования. Продукты, которые кодируются Е6 и Е7 генами BP генотипов ВПЧ участвуют в онкогенной трансформации инфицированных клеток, предположительно, посредством связывания этих вирусных белков с клеточными продуктами гена-супрессора опухоли р53 и ретинобластомы (Rb), соответственно (рассмотрено у Howley, 1996, Papillomaviruses and their replication, стр. 2045-2076, в BN Fields, DM Knipe и PM Howley (ред.), Virology, 3-е изд. Lippincott-Raven Press, New York, NY). Аминокислотные остатки, участвующие в связывании нативного полипептида Е6 ВПЧ-16 с р53, были четко отделены от остатков от 118 до 122 (+1, который представляет собой первый остаток Met или от остатков от 111 до 115, начиная с предпочтительно используемого второго остатка Met) (Crook и др., Cell (1991) 67, 547-556) и тех, которые участвуют в связывании нативного полипептида Е7 ВПЧ-16 с Rb и расположены от остатков 21 до 26 (Heck и др., Proc. Natl. Acad., Sci. USA (1992) 89, 4442-4446).

В контексте настоящего изобретения поксвирус (предпочтительно VV, более предпочтительно MVA) предпочтительно кодирует, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ BP, предпочтительно выбранные из ВПЧ-16, ВПЧ-18, ВПЧ-30, ВПЧ-31, ВПЧ-33, ВПЧ-35, ВПЧ-39, ВПЧ-45, ВПЧ-51, ВПЧ-52, ВПЧ-56, ВПЧ-58, ВПЧ-59, ВПЧ-66, ВПЧ-68, ВПЧ-70 и ВПЧ-85, более предпочтительно из ВПЧ-16 и ВПЧ-18, и наиболее предпочтительным является, когда указанный ВПЧ BP представляет собой ВПЧ-16.

Источники папилломавируса включают, но без ограничения таковыми, биологические образцы (например, биологические образцы, срезы тканей, образцы биопсии и культуры тканей, взятые у субъекта, подвергшегося воздействию папилломавируса), культивируемые клетки (например, клетки CaSki, доступные в АТСС), а также рекомбинантные материалы, имеющиеся в депозитарных учреждениях, в коммерческих каталогах или описанные в литературе. Нуклеотидные последовательности ряда геномов папилломавирусов и аминокислотные последовательности кодируемых полипептидов являются описанными в литературе и доступны в специализированных банках данных, например, Genbank. В качестве общей информации, геном ВПЧ-16 является доступным в Genbank под номерами доступа NC_01526 и K02718; ВПЧ-18 под номерами NC_001357 и Х05015; ВПЧ-31 под номером J04353; ВПЧ-33 под номером М12732; ВПЧ-35 под номером NC_001529; ВПЧ-39 под номером NC_001535; ВПЧ-45 под номером Х74479; ВПЧ-51 под номером NC_001533; ВПЧ-52 под номером NC_001592; ВПЧ-56 под номером Х74483; ВПЧ-58 под номером D90400; ВПЧ-59 под номером NC_001635; ВПЧ-68 под номерами Х67160 и М73258; ВПЧ-70 под номером U21941; и ВПЧ-85 под номером AF131950.

В целях иллюстрации, аминокислотные последовательности нативных полипептидов Е6 и Е7 ВПЧ-16 приведены соответственно в SEQ ID NO: 10-11.

Как определено выше в связи с термином «полипептид», «полипептид папилломавируса» включает нативные, модифицированные полипептиды папилломавируса и их пептиды. В частности, настоящее изобретение охватывает применение/экспрессию нативного(ых) полипептида(ов) Е6 и Е7 ВПЧ, а также их аналогов (например, их фрагментов, таких как пептиды и модифицированные полипептиды), в частности, когда нативный полипептид проявляет нежелательные свойства (например, онкогенные или трансформирующие свойства, цитотоксичность и др.). Например, чтобы обойти онкогенность полипептидов Е6 и Е7 ВПЧ, можно использовать или экспрессировать неонкогенные аналоги, демонстрирующие пониженную способность связывать р53 и Rb, соответственно.

Приемлемые полипептиды Е6 для применения в соответствии с настоящим изобретением включают неонкогенные мутанты, которые являются дефектными по связыванию с продуктом клеточного гена-супрессора опухоли р53. Репрезентативные примеры неонкогенных полипептидов Е6 описаны в данной области техники (см., например, WO 1999/03885). Предпочтительные модификации в этом контексте включают делецию в Е6 ВПЧ-16 одного или нескольких аминокислотных остатков, расположенных от положения приблизительно 118 до положения приблизительно 122 (+1, представляющий первый остаток метионина нативного полипептида Е6 ВПЧ-16), с особым предпочтение делеции остатков 118-122 (CPEEK) в Е6 ВПЧ-16 (см., например, SEQ ID NO: 12) или делеции остатков 113-117 (NPAEK) в Е6 ВПЧ-18.

Приемлемые полипептиды Е7 для использования в соответствии с настоящим изобретением включают неонкогенные мутанты, которые дефектны по связыванию с продуктом клеточного гена-супрессора опухоли Rb. Репрезентативные примеры неонкогенных полипептидов Е7 описаны в данной области техники (см., например, WO 1999/03885). Предпочтительные модификации в этом контексте включают делецию в Е7 ВПЧ-16 одного или нескольких аминокислотных остатков, расположенных от положения приблизительно 21 до положения приблизительно 26 (+1, представляющий собой первую аминокислоту нативного полипептида Е7 ВПЧ-16, с особым предпочтением для делеции в Е7 ВПЧ-16 остатков с 21 по 26 (DLYCYE) (см., например, SEQ ID NO: 13) или делеции в Е7 ВПЧ-18 остатков с 24 по 28 (DLLCH).

Полипептиды Е6 и/или Е7 ВПЧ (предпочтительно ВПЧ-16) для применения в изобретении могут быть дополнительно модифицированы для закрепления на мембране, повышая эффективную мембранную презентацию полипептида(ов) на поверхности экспрессирующей клетки-хозяина. Этого можно достичь путем слияния полипептида(ов) Е6 и/или Е7 ВПЧ (предпочтительно ВПЧ-16) с сигнальным пептидом и пептидом, который закрепляется на мембране. Такие пептиды являются известными в данной области техники. Вкратце, сигнальные пептиды обычно присутствуют на N-конце презентируемых на мембране или секретируемых полипептидов и инициируют их прохождение в эндоплазматический ретикулум (ЭР). Они содержат от 15 до 35 по существу гидрофобных аминокислот, которые затем удаляются специфичной эндопептидазой, локализованной в ЭР, с образованием зрелого полипептида. Закрепленные на мембране пептиды обычно обладают высокой гидрофобностью по своей природе и служат для закрепления полипептидов на клеточной мембране (см., например, Branden и Tooze, 1991, в Introduction to Protein Structure стр. 202-214, NY Garland). Выбор сигнальных и закрепленных на мембране пептидов, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, огромен. Они могут быть независимо получены из любого секретируемого или прикрепленного к мембране полипептида (например, клеточного или вирусного полипептида), такого как гликопротеин вируса бешенства, гликопротеин оболочки вируса ВИЧ или F-белок вируса кори, или могут быть синтетическими. Предпочтительным местом встраивания сигнального пептида является N-конец ниже кодона инициации трансляции, а местом встраивания пептида, который закрепляется на мембране, является С-конец, например, непосредственно выше стоп-кодона. При необходимости можно использовать линкерный пептид для соединения сигнального пептида и/или пептида, который закреплен на мембране, с кодируемым полипептидом.

Поксвирус для комбинированного лечения в соответствии с изобретением предпочтительно кодирует ВПЧ (предпочтительно ВПЧ-16), которые закреплены на мембране, и неонкогенные полипептиды Е6 и Е7, а также человеческий интерлейкин 2 (IL-2).

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид Е6 ВПЧ, который кодируется поксвирусом (предпочтительно VV, более педпочтительно MVA), в составе комбинации для применения в соответствии с изобретением представляет собой закрепленный на мембране и неонкогенный вариант Е6 ВПЧ-16 с делецией в Е6 ВПЧ-16 из остатков 118-122 (CPEEK), в частности, вариант Е6 ВПЧ-16 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид Е7 ВПЧ, который кодируется поксвирусом (предпочтительно VV, более предпочтительно MVA) комбинации, для применения в соответствии с изобретением представляет собой закрепленный на мембране и неонкогенный вариант Е7 ВПЧ-16 с делецией в Е7 ВПЧ-16 остатков с 21 по 26 (DLYCYE), в частности, вариант Е7 ВПЧ-16 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13. В особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид Е6 ВПЧ, который кодируется поксвирусом (предпочтительно VV, более предпочтительно MVA), комбинации для применения в соответствии с изобретением представляет собой закрепленный на мембране и неонкогенный вариант Е6 ВПЧ-16 с делецией в Е6 ВПЧ-16 остатков 118-122 (CPEEK), в частности, вариант Е6 ВПЧ-16 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, и полипептид Е7 ВПЧ, который кодируется поксвирусом (предпочтительно VV, более предпочтительно MVA), комбинации для применения в соответствии с изобретением представляет собой закрепленный на мембране и неонкогенный вариант Е7 ВПЧ-16 с делецией в Е7 ВПЧ-16 остатков с 21 по 26 (DLYCYE), в частности, вариант Е7 ВПЧ-16 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13.

Приемлемые промоторы для управления экспрессией вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующего цитокина, который кодируется поксвирусным вектором, содержащимся в комбинации, способе или применении в соответствии с изобретением, предпочтительно представляют собой промоторы поксвируса, например, промоторы вируса осповакцины 7.5К, H5R, ТК, р.28, р.11 или K1L. Синтетические промоторы также являются приемлемыми, как и химерные промоторы между поздним промотором и ранним промотором. Такие промоторы являются хорошо известными в данной области техники. Предпочтительно, когда экспрессия как полипептидов Е6, так и Е7 ВПЧ находится под контролем промотора р7.5 вируса осповакцины, а экспрессия иммуностимулирующего цитокина (например, человеческого IL-2) - под контролем промотора pH5R вируса осповакцины.

Иммуностимуляторный цитокин

В дополнение, по крайней мере, к полипептидам Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) (предпочтительно таким, которые были описаны выше), поксвирус (предпочтительно VV, более предпочтительно MVA) комбинации, способа или применения в соответствии с изобретением дополнительно кодируют иммуностимулирующий цитокин.

Как используется в данной заявке, термин «иммуностимулирующий цитокин» относится к цитокину, который обладает способностью стимулировать иммунную систему специфическим или неспецифическим образом. В данной области техники известно большое количество цитокинов, которые обладают способностью оказывать иммуностимулирующее действие. Примеры подходящих иммуностимулирующих цитокинов в контексте настоящего изобретения включают, без ограничения таковыми, как интерлейкины (например, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-24), хемокины (например, CXCL10, CXCL9, CXCL11), интерфероны (например, IFNα, IFNβ, IFNγ), фактор некроза опухоли (TNF), колониестимулирующие факторы (например, GM-CSF, C-CSF, M-CSF), факторы роста (трансформирующий фактор роста TGF, фактор роста фибробластов FGF, сосудисто-эндотелиальные факторы роста VEGF и подобные им). Предпочтительно, иммуностимулирующий цитокин представляет собой интерлейкин или колониестимулирующий фактор (например, GM-CSF). Более предпочтительный иммуностимулирующий цитокин представляет собой интерлейкин 2 (IL-2), наиболее предпочтительно человеческий IL-2.

Предпочтительные поксвирусы

Предпочтительный поксвирус в комбинации, способе или применении в соответствии с изобретением представляет собой вирус MVA, кодирующий закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2, более предпочтительно представленный TG4001 под своим исследовательским названием MVATG8042, как описано в WO 1999/03885.

Антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент

Комбинация, способ или применение в соответствии с изобретением содержат в качестве второго компонента антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент

Термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, которая является способной к специфическому связыванию с антигеном, например, углеводом, полинуклеотидом, липидом, полипептидом и т.д., посредством, по крайней мере, одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В контексте данного изобретения «антитело» (или «Ab») используется в самом широком смысле и включает встречающиеся в природе антитела, а также антитела, созданные человеком, включая полноразмерные антитела или их функциональные фрагменты или аналоги, которые способны связывать антиген, такой как PD-L1 (сохраняя, таким образом, антигенсвязывающую часть). Антитело, которое используется в изобретении, может иметь любое происхождение, например, может быть человеческим, гуманизированным, иметь происхождение от животного (например, антитело грызуна или верблюда) или быть химерным. Оно может быть таким любого изотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM и т.д.).

Кроме того, оно может быть гликозилированным или негликозилированным. Термин «антитело» также включает биспецифические или мультиспецифические антитела, в случае если они обладают специфичностью связывания с антигеном, таким как PD-L1. Как используется в данной заявке, термин «антитело» охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также, если не указано иное, любой антигенсвязывающий фрагмент или фрагмент антитела, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание, слитые белки, содержащие антигенсвязывающую часть (например, конъюгаты антитело-лекарственное средство), любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена, композиции антител с полиэпитопной специфичностью и полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела). Однако предпочтительными являются интактные, т.е. нефрагментированные моноклональные антитела.

Для иллюстративных целей полноразмерные антитела представляют собой гликопротеины, которые содержат две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (VH) и константного участка тяжелой цепи (СН), состоящего из трех доменов CH1, СН2 и СН3 (необязательно с шарнирной областью между СН1 и СН2). Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (VL) и константного участка легкой цепи, которая содержит один домен CL. Каждая область VH и VL включает три гипервариабельных участка, которые называются участками, определяющими комплементарность (CDR), и перемежаются с более консервативными участками, которые называются каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Участки CDR тяжелой и легкой цепей обычно определяют специфичность связывания.

CDR антитела определяются аминокислотной последовательностью его тяжелой и легкой цепей на основе с критериев, известных специалисту в данной области техники. Были предложены различные способы определения CDR, при этом часть аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой или легкой цепи антитела, которая определяется как CDR, варьирует в зависимости от выбранного метода. В настоящем описании все CDR определены в соответствии с определением AbM, которое используется программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecular AbM (см., например, последовательности CDR авелумаба в WO 2013/079174).

Антитело может быть моноклональным антителом, человеческим антителом, химерным, гуманизированным антителом и/или человеческим антителом и может включать человеческий константный участок. Константные участки антител могут быть изменены, например, подвергнуты мутациям, для модификации свойств антитела (например, для увеличения или уменьшения одного или нескольких из следующих факторов: связывание с рецептором Fc, гликозилирование антитела, количество остатков цистеина, функция эффекторной клетки или функция комплемента).

В контексте настоящего изобретения используется моноклональное антитело. Как используется в данной заявке, термин «моноклональное антитело» относится к композиции, которая содержит молекулы антител, обладающих идентичной и уникальной антигенной специфичностью. Молекулы антител, которые присутствуют в композиции, вероятно, различаются с точки зрения их посттрансляционных модификаций и, в частности, с точки зрения их структур гликозилирования или их изоэлектрической точки, но все они кодируются одними и теми же последовательностями тяжелой и легкой цепей и, таким образом, имеют до любой посттрансляционной модификации одну и ту же белковую последовательность. Определенные различия в белковых последовательностях, которые связаны с посттрансляционными модификациями (например, расщепление С-концевого лизина тяжелой цепи, дезамидирование остатков аспарагина и/или изомеризация остатков аспартата), тем не менее, могут существовать между различными молекулами антител, присутствующими в составе композиции. Моноклональное антитело может быть получено при использовании гибридомной технологии или с помощью способов, которые не используют гибридомную технологию (например, с помощью рекомбинантных методов). Моноклональные антитела человека могут быть получены при использовании трансгенных мышей, которые несут гены иммуноглобулинов человека, вместо мышиной системы. Спленоциты этих трансгенных мышей, которые подвергают иммунизации представляющим интерес антигеном, используют для получения гибридом, которые секретируют моноклональные антитела человека со специфическим сродством к эпитопам белка человека.

Для лечения людей, что является предпочтительным вариантом осуществления изобретения, антитело к PD-L1 должно быть химерным, гуманизированным или полностью человеческим, таким образом, ограничивая или предотвращая иммунные ответы, направленные против частей антитела к PD-L1, которые не являются человеческими. Антитело может представлять собой антитело, в котором вариабельный участок или его часть, например, CDR, получают в организме, отличном от человека, например, у крысы или мыши. Химерные, CDR-привитые и гуманизированные антитела входят в объем настоящего изобретения. Антитела, полученные в организме, отличном от человека, например, у крысы или мыши, а затем модифицированные, например, в вариабельном каркасном участке или в константном участке, для снижения антигенности у человека, входят в объем данного изобретения.

Как используется в данной заявке, термин «химерное антитело» относится к антителу, которое содержит один или несколько элемент(ов) одного вида и один или несколько элемент(ов) другого вида, например, нечеловеческое антитело, содержащее участок константного участка (Fc) иммуноглобулина человека. Химерные антитела могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, известными в данной области техники.

Как используется в данной заявке, термин «гуманизированное антитело» относится к нечеловеческому (например, мышиному, верблюжьему, крысиному и т.д.) антителу, белковая последовательность которого была модифицирована для повышения его сходства с человеческим антителом (т.е. такого, которое естественным образом вырабатывается у человека). Антитело можно гуманизировать способами, известными в данной области техники. Например, моноклональное антитело, разработанное для использования у человека, можно гуманизировать, заменив один или несколько остатков FR-участков, чтобы они выглядели как последовательность человеческого иммуноглобулина, тогда как подавляющее большинство остатков вариабельных областей (в частности, CDR) не являются модифицированными и соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина. Для общей информации, количество этих аминокислотных замен в участках FR обычно составляет не более 20 в каждом вариабельном участке VH или VL. В другом примере, гуманизированное антитело или антитело с привитым CDR будет иметь, в случае необходимости, один или два, но обычно все три реципиентных CDR (тяжелых и/или легких цепей иммуноглобулина), замененных донорным CDR. Антитело может быть заменено по какой-то причине частью CDR, не принадлежащей человеку, или только некоторые из CDR могут быть заменены CDR, не принадлежащими человеку. Необходимо только заменить ряд CDR, необходимых для связывания гуманизированного антитела с антителом к PD-L1. Желательно, когда донором будет выступать антитело грызуна, например, крысиное или мышиное антитело, а реципиентом будет человеческий каркасный участок или консенсусный каркасный участок человека. Обычно иммуноглобулин, который обеспечивает CDR, называют «донором», а иммуноглобулин, обеспечивающий каркасный участок, называют «акцептором». В одном варианте осуществления донорный иммуноглобулин представляет собой нечеловеческий иммуноглобулин (например, такой грызуна). Акцепторный каркасный участок представляет собой тот, который встречается в природе (например, человеческий) каркасный участок или консенсусный каркасный участок, или последовательность примерно на 85% или более, предпочтительно на 90%, 95%, 99% или выше, идентичную им. Гуманизированные антитела или антитела с привитыми CDR могут быть получены путем прививки CDR или замены CDR, при этом могут быть заменены одна, две или все CDR цепи иммуноглобулина. См., например, патент US 5225539, в котором описан способ прививки CDR, который можно использовать для получения гуманизированных антител в соответствии с настоящим изобретением.

Как используется в данной заявке, «человеческое антитело» относится к антителу, в котором не только константные (как в химерных антителах) и FR (как в гуманизированных антителах) участки имеют человеческое происхождение, но и целые аминокислотные последовательности тяжелой и легкие цепи имеют происхождение от последовательностей иммуноглобина зародышевой линии человека. Такие антитела человека могут быть получены, например, от трансгенных животных, в антитела которых были встроены последовательности иммуноглобина зародышевой линии человека, или из библиотек антител человека.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» любого антитела относится к части интактного антитела, которая связывается с антигеном. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать определяющие антиген вариабельные участки интактного антитела. Антигенсвязывающий фрагмент может быть сконструирован для использования в комбинации в соответствии с изобретением. Репрезентативные примеры включают без ограничения Fab, Fab', F(ab')2, dAb, Fd, Fv, scFv, dis-scFv, диатело и любые другие искусственные антитела. Например, «фрагмент, связывающий PD-L1» любого антитела к PD-L1 относится к части интактного антитела, которая связывается с антигеном PD-L1. Более конкретно, следующие антигенсвязывающие фрагменты полноразмерного антитела к PD-L1 можно использовать в комбинации, способе или применении в соответствии с изобретением:

(I) Fab фрагмент является представленным моновалентным фрагментом, который состоит из VL, VH, CL и СН1 доменов;

(II) F(ab')2 фрагмент является представленным бивалентным фрагментом, который включает 2 Fab фрагмента, связанные, по крайней мере, одним дисульфидным мостиком в шарнирном участке;

(III) Fd фрагмент состоит из VH и СН1 доменов;

(IV) Fv фрагмент состоит из VL и VH доменов одного плеча антитела,

(V) dAb фрагмент состоит из единичного фрагмента вариабельного домена (VH или VL домена);

(VI) единичная цепочка Fv (scFv), которая включает два домена фрагмента Fv, VL и VH, которые являются слитыми вместе, необязательно, вместе с линкером, для создания единичной цепочки белка; и

(VII) любое другое искусственное антитело.

Способы получения антител, их фрагментов и аналогов являются известными в данной области техники (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies A Laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY). В одном варианте осуществления такое антитело может быть получено в организме животного-хозяина при использовании антигена PD-L1 (предпочтительно, антигена PD-L1 человека для применения у человека). Альтернативно, его можно получить из гибридом (см., например, Kohler и Milstein, Nature (1975) 256: 495-7), рекомбинантных методов (например, при использовании методов фагового дисплея), синтеза пептидов и ферментативного расщепления. Фрагменты антител могут быть получены с помощью рекомбинантной технологии, как описано в данной заявке. Они также могут быть получены путем протеолитического расщепления ферментами, такими как папаин, для получения Fab-фрагментов, или пепсина для получения F(ab')2-фрагментов. Аналоги (или их фрагменты) могут быть получены обычными методами молекулярной биологии (ПЦР, методы мутагенеза). При необходимости такие фрагменты и аналоги могут быть проверены на функциональность таким же образом, как и интактные антитела (например, с помощью стандартного анализа ELISA).

PD-1 и PD-L1

Белок 1 запрограммированной смерти клетки (PD-1) является частью суперсемейства генов иммуноглобулина (Ig) и членом семейства CD28. Он представляет собой трансмембранный белок типа 1 с молекулярной массой 55 кДа, который экспрессируется на клетках, контактирующих с антигеном (например, активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках). В нормальных условиях он действует путем ограничения активности Т-клеток во время воспалительной реакции, тем самым защищая нормальные ткани от разрушения. Для PD-1 были идентифицированы два лиганда, соответственно PD-L1 (лиганд 1 запрограммированной смерти клетки) и PD-L2 (лиганд 2 запрограммированной смерти клетки). PD-L1 был идентифицирован в 20-50% случаев рака человека. Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводило к уменьшению инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, уменьшению пролиферации, опосредованной Т-клеточным рецептором, и уклонению раковых клеток от иммунного ответа. Полноразмерная аминокислотная последовательность PD-1 представлена в UniProtKB под номером доступа Q15116.

Антитело против PD-L1 в комбинации, способе или применении в соответствии с данным изобретение распознает PD-L1 человека, для которого дополнительная информация (включая известные аминокислотные последовательности) также доступна в базе данных UniProtKB под регистрационным номером Q9NZQ7.

Функциональные характеристики антитела к PD-L1

Термин «антитело к PD-L1» относится к антителу, которое способно специфически связывать PD-L1 с достаточной аффинностью, так что антитело блокирует связывание PD-L1 с PD-1 и, таким образом, является полезным в качестве терапевтического агента для нацеливания PD-L1 (например, авелумаба). В частности, антитело к PD-L1 означает антитело, которое блокирует связывание PD-L1, который экспрессируется на раковой клетке, с PD-1.

Термин «антителозависимая клеточная цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig связывается с Fc-рецепторами (FcR), которые присутствуют на определенных цитотоксических клетках (например, естественных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), позволяют этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью и впоследствии уничтожать клетку-мишень цитотоксинами. Антитела вооружают цитотоксические клетки и являются необходимыми для уничтожения клетки-мишени в соответствии с этим механизмом. Первичные клетки для опосредования ADCC, природные клетки-киллеры (NK-клетки), экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия Fc на гемопоэтических клетках подсуммирована в Таблице 3 на странице 464 Ravetch и Kinet, Annu Rev Immunol (1991) 9: 457-92. Таким образом, антитело против PD-L1, которое содержит ADCC-компетентный Fc-участок, может повышать эффективность данной терапии, способствуя ADCC лизису раковых клеток. Антитело против PD-L1 в комбинации, способе или применении в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, опосредует ADCC. В частности, используют полноразмерное антитело, которое содержит функциональный участок Fc. Участок Fc, возможно, может быть модифицирован (на уровне аминокислот или гликозилирования) для дальнейшего улучшения способности ADCC (такие модификации, в частности, включают одну или несколько замен в Fc и/или сниженное фукозилирования, которые хорошо известны в данной области техники). Тем не менее такое антитело против PD-L1, которое опосредует ADCC, не является токсичным или не проявляет повышенной токсичности.

Структурные характеристики антитела к PD-L1

Примеры моноклональных антител, которые связываются с PD-L1 человека и могут быть использованы в комбинации для применения в соответствии с настоящим изобретением, описаны в WO 2007/005874, WO 2010/036959, WO 2010/077634, WO 2010/089411, WO 2013/019906, WO 2013/079174, WO 2014/100079, WO 2015/061668 и US 8,552,154, US 8,779,108 и US 8,383,796. Специфические моноклональные антитела против PD-L1 человека, которые являются полезными в качестве антитела к PD-L1 в комбинации для применения в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, но без ограничения, авелумаб (MSB0010718C), дурвалумаб (MEDI4736, сконструированное каппа-моноклональное антитело IgG1 с тройными мутациями в домене Fc для устранения ADCC), атезолизумаб (MPLDL3280A), MPDL3280A (антитело к PD-L1, сконструированное с помощью IgG1) и BMS-936559 (полностью человеческое моноклональное антитело против PD-L1 на основе IgG4).

Авелумаб и атезолизумаб являются уникальными среди используемых в настоящее время антител к PD-L1 тем, что они являются полностью человеческими IgG с немутированным участком Fc. Таким образом, авелумаб содержит участок Fc, компетентный в отношении антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), которая, как было показано, опосредует ADCC (Boyerinas и др., Cancer Immunol Res. (2015) 3(10): 1148-1157). Антитело, которое содержит ADCC-компетентный Fc-участок, может повысить эффективность терапии в соответствии с настоящим изобретением, способствуя лизису ADCC раковых клеток.

В одном варианте осуществления антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, которая включает три определяющих комплементарность участка, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 (авелумаб H-CDR1: SYIMM), SEQ ID NO: 2 (H-CDR2 авелумаба: SIYPSGGITFYADTVKG) и SEQ ID NO: 3 (H-CDR3 авелумаба: IKLGTVTTVDY), а также легкую цепь, которая содержит три определяющих комплементарность участка, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 (авелумаб L-CDR1: TGTSSDVGGYNYVS), SEQ ID NO: 5 (L-CDR2 авелумаба: DVSNRPS) и SEQ ID NO:6 (L-CDR3 авелумаба: SSYTSSSTRV). Поскольку известно, что участки CDR, в частности, вовлечены в распознавание антигена, ожидается, что такое антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент будут иметь такое же связывание с PD-L1, что и авелумаб.

Часто наблюдается, что в процессе выработки антител отщепляется С-концевой лизин (К) тяжелой цепи. Эта модификация не влияет на связывание антитело-антиген. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело к PD-L1 содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, в которой С-концевой лизин (К) отсутствует (тяжелая цепь авелумаба: или последовательность SEQ ID NO: 8, в которой присутствует лизин (K) и легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (легкая цепь авелумаба:

Предпочтительные антитела к PD-L1

Предпочтительно, антитело против PD-L1 в составе комбинации для применения в соответствии с изобретением представляет собой авелумаб или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент со структурным сходством с авелумабом. Авелумаб, его последовательность и многие его свойства описаны в WO 2013/079174, где он обозначен как А09-246-2, имеющий последовательности тяжелой и легкой цепей в соответствии с SEQ ID NO: 32 и 33 (соответствует в данном документе SEQ ID NO: 7 и 9). Противоопухолевое действие авелумаба имеет два основных механизма: во-первых, PD-L1 на опухолевых клетках может взаимодействовать с PD-1 или В7-1 на активированных Т-клетках. Было показано, что эти взаимодействия значительно подавляют активность Т-клеток. Таким образом, блокирование взаимодействия PD-L1 с PD-1 или В7-1 с помощью антитела к PD-L1 может освободить Т-клетки от иммуносупрессии и привести к элиминации опухолевых клеток Т-клетками. Во-вторых, опухолевые клетки могут экспрессировать на своей поверхности более высокие уровни PD-L1 по сравнению с нормальными тканями. Будучи полностью человеческим моноклональным антителом IgG1, авелумаб обладает потенциалом ADCC. При связывании с PD-L1 на опухолевых клетках и связывании их Fc-части с Fc-гамма рецепторами на лейкоцитах авелумаб может запускать ADCC, направленную на опухоль.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело против PD-L1 содержит 6 CDR авелумаба (SEQ ID NO: 1-6) и блокирует взаимодействие между PD-1 человека и PD-L1 человека. Предпочтительно, когда указанное антитело к PD-L1 дополнительно опосредует ADCC. Более педпочтительно, когда указанное антитело против PD-L1 представляет собой IgG антитело, при этом особое предпочтение отдается IgG1 антителу.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к PD-L1 содержит аминокислотные последовательности тяжелой (SEQ ID NO: 7 или 8) и легкой (SEQ ID NO: 9) цепей авелумаба и блокирует взаимодействие между PD-1 человека и PD-L1 человека. Предпочтительно, когда указанное антитело против PD-L1 дополнительно опосредует ADCC. Более предпочтительно, когда указанное антитело против PD-L1 представляет собой IgG антитело, при этом особое предпочтение отдается IgG1 антителу.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб.

Рак или предраковые повреждения, которые подвергаются лечению

Термин «рак» относится к группе заболеваний, которые можно определить как любой аномальный злокачественный рост ткани, который не обладает физиологической функцией и возникает в результате неконтролируемой, обычно быстрой клеточной пролиферации и обладает потенциалом проникать или распространяться на другие части тела. Термин «предраковое поражение» относится к доброкачественному поражению с участием аномальных клеток, которые связаны с повышенным риском развития рака.

В одном аспекте изобретения таргетированное терапевтическое применение представляет собой лечение ВПЧ-положительного рака или предраковых интраэпителиальных поражений.

Как используется в данной заявке, термины «ВПЧ-положительный рак» и «ВПЧ-положительные предраковые интраэпителиальные повреждения», соответственно, относятся к раку или предраковым внутриэпителиальным поражениям, вызванным или связанным с ВПЧ-инфекцией, в которых может быть определено присутствие вируса ВПЧ.

ВР-ВПЧ продуцируют 2 онкопротеина, Е6 и Е7, которые являются необходимыми для репликации вируса благодаря их активности, стимулирующей пролиферацию, и играют ключевую роль в злокачественной трансформации. Онкобелок Е6 связывает белок-супрессор опухоли р53 и индуцирует его деградацию посредством убиквитин-опосредованного процесса, нарушая путь р53, что приводит к неконтролируемому развитию клеточного цикла. Белок Е7 ВПЧ связывает и расщепляет белок ретинобластомы (pRb), предотвращая его ингибирование фактора транскрипции E2F, что приводит к потере контроля над клеточным циклом. Кроме того, функциональная инактивация Rb приводит к усилению активности белка р16. р16 кодируется геном-супрессором опухоли CDKN2A и регулирует активность комплексов Cyclin D-CDK4/6, которые фосфорилируют Rb, что приводит к высвобождению фактора транскрипции E2F, который инициирует развитие клеточного цикла. ВПЧ-положительные опухоли характеризуются высокими уровнями экспрессии р16 (Nevins J.R., Hum Mol Genet. (2001) 10(7): 699-703).

Присутствие вируса ВПЧ может быть обнаружено различными методами, которые основаны на обнаружении ДНК ВПЧ, РНК ВПЧ, онкобелков ВПЧ, или опосредованно путем поиска измененной экспрессии клеточных белков, такой как сверхэкспрессия белка р16. Белок р16 может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии (ИГХ), и, поскольку несколько исследований показали очень высокую корреляцию (>90%) с ВПЧ-позитивностью в орофарингеальных опухолях, он был предложен в качестве клинически полезного суррогатного маркера (Mellin Dahlstrand H. и др., Anticancer Res. (2005) 25(6С): 4375-4383. Присутствие ВПЧ (и, таким образом, ВПЧ-положительного характера рака или предраковых внутриэпителиальных поражений) можно также определить путем обнаружения (1) ДНК ВПЧ, (2) постинтеграционной транскрипции вирусной мРНК Е6 и/или Е7, (3) вирусных онкопротеинов Е6 и Е7 или (4) измененной экспрессии клеточных белков, такой как сверхэкспрессия белка р16 (Kim и др., J Pathol Clin Res. (2018) 4(4): 213-226).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, с учетом того, что ВПЧ-16 представляет собой основной ВР-ВПЧ, который обнаруживается при ВПЧ-положительных раковых заболеваниях, ВПЧ-статус раковых или предраковых поражений определяют путем обнаружения ДНК Е7 ВПЧ-16 с помощью ПЦР при использовании специфических для ВПЧ-16 праймеров. В более предпочтительном варианте осуществления ДНК экстрагируют из образца опухоли (например, фиксированного образца опухоли, такого как образец опухоли, фиксированный формалином, или фиксированного формалином и залитого парафином (FFPE) образца опухоли) от субъекта, которого подвергают лечению с помощью традиционных способов, ДНК Е7 ВПЧ-16 затем амплифицируют с помощью ПЦР при использовании специфических праймеров для ВПЧ-16. Если обнаружена амплификация (например, с помощью иммунофлуоресцентных средств, таких как SYBR green или другие), то образец считается положительным по ВПЧ-16. Если амплификация этим методом не обнаруживается, то ДНК Е7 ВПЧ амплифицируют с помощью ПЦР при использовании консенсусных праймеров, которые способны амплифицировать около 50 генотипов ВПЧ, затем амплифицированные последовательности подвергают секвенированию по Сэнгеру. Полученные последовательности затем позволяют подтвердить негативность, идентифицировать пациентов, у которых качество образца не позволило получить результат при ПЦР первой линии, или выявить позитивных пациентов с более редкими генотипами.

Предпочтительные ВПЧ-положительные виды рака включают ВПЧ-положительный орофарингеальный рак, рак шейки матки, влагалища, анального канала, вульвы, полового члена, слизистой оболочки или немеланомный рак кожи. Среди ВПЧ-положительных видов орофарингеального рака предпочтительным является плоскоклеточный рак головы и шеи (SCCHN).

В объединенном промежуточном анализе клинических испытаний фазы Ib и фазы II изобретатели показали, что ВПЧ-положительный рак анального канала в значительной степени связан с более низкой выживаемостью без прогрессирования заболевания (ВБПЗ, см. Фигуру 8), что на самом деле связано с более высокой распространенностью метастазов в печень у пациентов с анальным раком, а не анального рака как такового. Действительно, некоторые пациенты с анальным раком, но без метастазов в печень (однако с другими метастазами) реагируют на лечение. Таким образом, среди ВПЧ-положительных видов рака, и, в частности, тех, которые перечислены выше, ВПЧ-положительный рак предпочтительно не является ВПЧ-положительным раком анального канала из-за его более высокого преобладания метастазирования в печень, и, в частности, не анального рака с метастазами в печень, и, таким образом, предпочтительно выбранным из ВПЧ-положительного орофарингеального рака (в частности, SCCHN), рака шейки матки, влагалища, вульвы, полового члена, слизистой оболочки или немеланомного рака кожи.

В противовес этому, авторы изобретения также наблюдали высокую частоту ответа у ВПЧ-положительных пациентов с вульварным/вагинальным раком (см. Таблицу 11), а также недостоверную тенденцию ассоциации ВПЧ-положительного генитального рака (имеется в виду вульварный/вагинальный рак) с лучшей частотой объективного ответа (ЧОО, см. Фигуру 7) и ВБПЗ (см. Фигуру 8). Таким образом, среди ВПЧ-положительных видов рака предпочтение отдается ВПЧ-положительным видам Бульварного и вагинального рака.

Предпочтительные ВПЧ-положительные предраковые интраэпителиальные повреждения включают цервикальную интраэпителиальную неоплазию (CIN) 2 или 3 степени и вульварную интраэпителиальную неоплазию (VIN) 2 или 3 степени. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN) представляет собой предраковое поражение, которое может существовать на любой из трех стадий: CIN1, CIN2 или CIN3. При отсутствии лечения CIN2 или CIN3 (вместе именуемые CIN2+) могут прогрессировать до рака шейки матки. Точно так же внутриэпителиальная вульварная неоплазия (VIN) является предраковым поражением, которое может существовать на любой из трех стадий: VIN1, VIN2 или VIN3. При отсутствии лечения VIN2 или VIN3 (вместе именуемые VIN2+) могут прогрессировать до Бульварного рака.

Рак или предраковые интраэпителиальные поражения, которые подвергаются лечению, являются положительными по BP-ВПЧ, что предпочтительно соответствует ВР-ВПЧ, где Е6 и Е7 полипептиды ВПЧ кодируются базовой формой поксвируса. Рак или предраковые интраэпителиальные поражения, которые подвергаются лечению, являются положительными по ВР-ВПЧ, выбранному из ВПЧ-16, ВПЧ-18, ВПЧ-30, ВПЧ-31, ВПЧ-33, ВПЧ-35, ВПЧ-39, ВПЧ-45, ВПЧ-51, ВПЧ-52, ВПЧ-56, ВПЧ-58, ВПЧ-59, ВПЧ-66, ВПЧ-68, ВПЧ-70 и ВПЧ-85, более предпочтительно из ВПЧ-16 и ВПЧ-18, и наиболее предпочтительно рак или предраковые интраэпителиальные поражения, которые подвергаются лечению, являются положительными по ВПЧ-16. Когда рак или предраковые интраэпителиальные поражения, которые подвергаются лечению, являются положительными в отношении ВПЧ-16, поксвирус предпочтительно кодирует полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 (более предпочтительно их близкие неонкогенные варианты, как раскрыто выше).

В предпочтительном варианте осуществления таргетированное терапевтическое применение, таким образом, представляет собой ВПЧ16-положительный рак (предпочтительно, не ВПЧ16-положительный рак анального канала с метастазами в печень или, в более общем случае, не ВПЧ16-положительный рак анального канала, из-за его высокого преобладания метастазирования в печень) или ВПЧ16-положительные предраковые интраэпителиальные поражения и рак могут быть выбраны из ВПЧ16-положительного орофарингеального рака (в частности, SCCHN), рака шейки матки, влагалища, вульвы, полового члена, слизистой оболочки или немеланомного рака кожи. В предпочтительных вариантах осуществления рак может быть выбран из ВПЧ 16-положительного плоскоклеточного рака головы и шеи (ВПЧ-16+ SCCHN), ВПЧ 16-положительного Бульварного рака и ВПЧ16-положительного вагинального рака. В этом случае поксвирус (предпочтительно MVA) кодирует полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 (более предпочтительно их неонкогенные варианты, как раскрыто выше).

В дополнение к своей ВПЧ-положительной природе целевой рак также предпочтительно представляет собой рецидивирующий и/или метастатический ВПЧ-положительный рак (более предпочтительно рецидивирующий и/или метастатический ВПЧ-16 положительный рак, наиболее предпочтительно рецидивирующий и/или метастатический ВПЧ-16 положительный SCCHN). Как используется в данной заявке, термин «рак» охватывает все первичные или рецидивирующие и/или метастатические виды рака. «Первичный рак» означает рак, растущий в базовом анатомическом участке (органе или ткани), где началось развитие опухоли и продолжилось образование раковой массы. «Рецидивирующий рак» означает рак, который рецидивировал (возобновился), обычно после периода, в течение которого рак не мог быть обнаружен. Раковые клетки от первичного рака могут распространяться на другие части тела и формировать новый или «метастатический рак» (который также называется вторичным раком).

Действительно, рецидивирующий и/или метастатический рак обычно ассоциируется с худшим прогнозом и более низкой реакцией на лечение, и новые комбинированные методы лечения этих видов рака являются особенно необходимы. Метастазы могут поражать различные органы, включая лимфатические узлы, легкие, кости и печень.

В объединенном промежуточном анализе клинических испытаний фазы Ib и фазы II изобретатели неожиданно показали, что метастазы в лимфатических узлах в значительной степени связаны с улучшением ВБПЗ (см. Фигура 8). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный ВПЧ-положительный рак представляет собой ВПЧ-положительный (предпочтительно ВПЧ16-положительный) метастатический рак с метастазами в лимфатические узлы.

Кроме того, они также обнаружили, что метастазы в легкие и кости, как ни странно, не связаны со снижением ЧОО или ВБПЗ (см. Фигуру 8). Изобретатели фактически показали, что только один тип метастазов в значительной степени связан с более низким ЧОО и ВБПЗ: метастазы в печени и, в частности, когда у пациента есть мультифокальные метастазы в печени, в частности, в двух отдельных долях. Было высказано предположение, что наличие метастазов в печени связано с более низким ответом на лечение антителом к PD-L1, в основном, при раке легких или у пациентов со смешанным раком (Sridhar S., и др., Clin Lung Cancer 2019; е601-е608; Bilen M. и др. ВМС Cancer. 2019; 19: 857; Reck M. и др. Lancet Respir Med 2019; 7: 387-401). Тем не менее, такие наблюдения были сделаны в отношении лечения, которое не включало комбинации с поксвирусным вектором, кодирующим, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ), и иммуностимулирующий цитокин, и, таким образом, перенос на конкретное лечение в соответствии с изобретение не мог быть ожидаемым.

Более того, при ВПЧ-положительных опухолях таких наблюдений не было сделано, и транспозиции в такие специфические опухоли также нельзя было ожидать. Принимая во внимание наблюдения авторов изобретения в отношении значительной связи метастазов в печени с более низкими ЧОО и ВБПЗ, а также отсутствие связи метастазов в легких или костях с более низкими ЧОО и ВБПЗ и связи метастазов в лимфатических узлах с более высокими ВБПЗ, ВПЧ-положительный рак может предпочтительно быть ВПЧ-16 положительным раком (предпочтительно, ВПЧ-16-положительным раком), например, орофарингеальным раком, раком шейки матки, влагалища, анального канала, вульвы, полового члена, слизистых оболочек или немеланомным раком кожи) без многоочагового метастазирования в печень (предпочтительно, без метастазов в печень) и, в частности, метастатический ВПЧ-положительный (предпочтительно ВПЧ-16 положительный) рак (например, рак ротоглотки, шейки матки, влагалища, анального канала, вульвы, полового члена, слизистых оболочек или немеланомный рак кожи) без мультифокального метастазирования в печень (предпочтительно без метастазов в печень).

Более предпочтительно, когда ВПЧ-положительный рако может предпочтительно представлять собой ВПЧ-положительный (предпочтительно, ВПЧ16 положительный) рак без метастазов в печень и с метастазами в лимфатические узлы.

Дозы и пути введения

«Введение» лекарственного средства пациенту (и грамматические эквиваленты этого слова) относится к прямому введению, которое может быть введением пациенту медицинским работником или может быть самостоятельным введением и/или непрямым введением, что может быть действием в соответствии с назначением лекарственного средства. Например, врач, который инструктирует пациента о самостоятельном введении лекарства или обеспечивает пациента рецептом на лекарство для введения лекарства пациенту.

«Доза» и «дозировка» относятся к конкретному количеству активного или терапевтического агента для введения. Такие количества включаются в «лекарственную форму», которая относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве унифицированных доз для людей и других млекопитающих, причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного агента, рассчитанное для получения желаемого начала приема, переносимости и терапевтических эффектов в сочетании с одним или несколькими подходящими фармацевтическими наполнителями, такими как носители или адъюванты.

«Фармацевтически приемлемый адъювант» относится к любому и всем веществам, которые усиливают иммунный ответ организма на антиген. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых адъювантов представляют собой: квасцы, неполный адъювант Фрейнда, MF59, синтетические аналоги дцРНК, такие как поли(I:С), бактериальный липополисахарид, бактериальный флагеллин, имидазолхинолины, олигодезоксинуклеотиды, содержащие специфические мотивы CpG, фрагменты бактериальных клеточных стенок, такие как мурамилдипептид и Quil-A®.

«Фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемый разбавитель» означают любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие всасывание, совместимые с фармацевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ является хорошо известным в данной области техники. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, без ограничения объема настоящего изобретения включают: дополнительные буферные агенты; консерванты; сорастворители; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); биоразлагаемые полимеры, такие как полиэфиры; солеобразующие противоионы, такие как натрий, многоатомные сахарные спирты; аминокислоты, такие как аланин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин, лизин, орнитин, лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота и треонин; органические сахара или сахарные спирты, такие как лактитол, стахиоза, манноза, сорбоза, ксилоза, рибоза, рибит, миоинозитоза, миоинозитол, галактоза, галактитол, глицерин, циклитолы (например, инозитол), полиэтиленгликоль; восстановители, содержащие серу, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или другие иммуноглобулины; и гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон. Другие фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, такие как описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences 16-ое изд., Osol, А. ред. (1980) также могут быть включены в фармацевтическую композицию, описанную в данной заявке, при условии, что они не будут оказывать отрицательного воздействия на желаемые характеристики фармацевтической композиции.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству поксвируса, описанного в данной заявке (предпочтительно VV, более предпочтительно MVA, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ и иммуностимулирующий цитокин, такой как TG4001, описанный в WO 1999/03885 под его исследовательским названием MVATG8042), и/или антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент (такой, как авелумаб), обладающие терапевтическим эффектом и способные лечить рак или предраковые поражения. В случае рака, например, прогрессирующей солидной злокачественной опухоли, терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли или нагрузку; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять, а в некоторых вариантах осуществления останавливать) раковые метастазы, ингибировать, в некоторой степени, рост опухоли; облегчать до некоторой степени один или более симптомов, ассоциированных с раком; и/или приводить к благоприятному ответу, такому как повышенная выживаемость без прогрессирования заболевания (ВБПЗ), выживаемость без признаков заболевания (ВДС) или общая выживаемость (ОВ), полный ответ (ПО), частичный ответ (ЧО) или, в некоторых случаях, стабильное заболевание (СЗ), сокращение стадии прогрессирования заболевания (ПЗ), сокращение времени до прогрессирования заболевания (ВДП) или любая их комбинация. В той мере, в какой лекарственное средство может предотвратить рост и/или уничтожить существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. В случае предраковых поражений терапевтически эффективное количество лекарственного средства может ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять, а в некоторых вариантах осуществления останавливать) развитие в рак. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическая доза используется у субъектов до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

«Единичная дозированная форма», как используется в данной заявке, относится к физически дискретной единице терапевтического состава, подходящей для субъекта, которого подвергают лечению. Однако следует понимать, что решение об использовании композиций поксвирусного вектора и антител к PD-L1, описанных в данной заявке, будет приниматься лечащим врачом в рамках здравого медицинского заключения. Конкретный уровень эффективной дозы для любого конкретного субъекта или организма будет зависеть от множества факторов, включая подвергающееся лечению расстройство и тяжесть расстройства; активность конкретного используемого активного агента; используемой конкретной композиции; возраста, массы тела, общего состояние здоровья, пола и диеты субъекта; времени введения и скорости выведения используемого конкретного активного агента; продолжительности лечения; лекарственных средства и/или дополнительных методов лечения, используемых в комбинации или одновременно с конкретным(и) используемым(и) соединением(ями), и подобные факторы, которые являются хорошо известными в области медицины.

Поксвирус

В комбинации, способе или применении в соответствии с данным изобретением поксвирус, который кодирует, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ), и иммуностимулирующий цитокин (предпочтительно вирус MVA, кодирующий закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16, и человеческий IL-2, представленный TG4001, описанный в WO 1999/03885 под его исследовательским названием MVATG8042), вводят предпочтительно в дозе от 10⁶ до 10⁸ БОЕ, более предпочтительно от 5×10⁶ до 8×10⁷ БОЕ, наиболее предпочтительно от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ, в высшей степени предпочтительно от 4×10⁷ до 6×10⁷ БОЕ, в частности, в высшей степени предпочтительно приблизительно 5×10⁷ БОЕ.

В комбинации, способе или применении в соответствии с данным изобретением поксвирус, кодирующий, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ), и иммуностимулирующий цитокин (предпочтительно вирус MVA, кодирующий закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16, и человеческий IL-2, представленный TG4001, описанным в WO 1999/03885 под его исследовательским названием MVATG8042), в дальнейшем вводят подкожным, внутримышечным, внутриопухолевым или внутривенным путем. Особенно предпочтительным путем введения является подкожный путь.

Антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент В комбинации, способе или применении в соответствии с изобретением антитело против PD-L1 (в частности, антитело, которое содержит, по крайней мере, 6 CDR или тяжелую и легкую цепи, например, авелумаба) вводят в следующей дозе:

В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективное количество антитела против PD-L1 (например, авелумаба) или его антигенсвязывающего фрагмента вводят в комбинациях, способах или применении в соответствии с изобретением. Терапевтически эффективное количество является достаточным для лечения одного или нескольких симптомов ВПЧ-положительного рака. В некоторых вариантах осуществления, в которых в комбинированной терапии используется антитело против PD-L1, режим дозирования будет включать введение антитела к PD-L1 в дозе приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мг/кг веса тела при интервалах приблизительно 7 дней (±2 дня), приблизительно 14 дней (±2 дня), приблизительно 21 день (±2 дня) или приблизительно 30 дней (±2 дня) в течении периода лечения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество антитела против PD-L1 (например, авелумаба) или его антигенсвязывающего фрагмента составляет примерно от 5 до 20 мг/кг, более предпочтительно от 5 до 15 мг/кг, наиболее предпочтительно 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб, и терапевтически эффективное количество авелумаба составляет примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления авелумаб вводят один раз каждые две недели. В некоторых вариантах осуществления авелумаб вводят в 1 и 15 дни 28-дневного цикла. Фармакокинетические исследования показали, что доза авелумаба 10 мг/кг обеспечивает превосходное заполнение рецепторов с предсказуемым профилем фармакокинетики (Heery и др., 2015. Proc ASCO Annual Meeting: реферат 3055). Эта доза хорошо переносится, при этом также наблюдались признаки противоопухолевой активности, в том числе стойкие ответы.

В некоторых вариантах осуществления антитело против PD-L1 (например, авелумаб) вводится в фиксированной дозе приблизительно 80, 150, 160, 200, 240, 250, 300, 320, 350, 400, 450, 480, 500, 550, 560, 600, 640, 650, 700, 720, 750, 800, 850, 880, 900, 950, 960, 1000, 1040, 1050, 1100, 1120, 1150, 1200, 1250, 1280, 1300, 1350, 1360, 1400, 1440, 1500, 1520, 1550 или 1600 мг, предпочтительно 800 мг, 1200 мг или 1600 мг при интервалах приблизительно 7 дней (±2 дня), приблизительно 14 дней (±2 дня), приблизительно 21 день (±2 дня) или приблизительно 30 дней (±2 дня) в течение периода лечения, упомянутого выше или ниже. В предпочтительном варианте осуществления антитело против PD-L1 (например, авелумаб) вводят один раз в неделю, каждые две недели или каждые три недели в дозе приблизительно от 400 до 1600 мг, более предпочтительно приблизительно от 800 до 1600 мг, наиболее предпочтительно приблизительно от 800 до 1200 мг, в высшей степени предпочтительно приблизительно 800 мг. В особенно предпочтительном варианте осуществления антитело против PD-L1 (например, авелумаб) вводят в дозе приблизительно 800 мг каждые 2 недели.

В комбинации, способе или применении в соответствии с изобретением антитело против PD-L1 (в частности, антитело, которое содержит, по крайней мере, 6 CDR или их тяжелые и легкие цепи, например, авелумаб) предпочтительно вводят внутривенно (например, в виде внутривенной инфузии) или подкожно. Более предпочтительно, когда антитело против PD-L1 (в частности, антитело, которое содержит, по крайней мере, 6 CDR или их тяжелые и легкие цепи, например, авелумаб) вводят в виде внутривенной инфузии. Наиболее предпочтительно, когда антитело против PD-L1 (в частности, антитело, которое содержит, по крайней мере, 6 CDR или их тяжелые и легкие цепи, например, авелумаб) вводят в течение 50-80 минут, наиболее предпочтительно в виде приблизительно одночасовой внутривенной инфузии.

В одном варианте осуществления изобретения авелумаб представляет собой стерильный, прозрачный и бесцветный раствор, предназначенный для внутривенного введения. Содержимое флаконов с авелумабом является апирогенным и не содержит бактериостатических консервантов. Авелумаб рецептируют в виде раствора с концентрацией 20 мг/мл и поставляют в одноразовых стеклянных флаконах, закупоренных резиновой пробкой и запаянных алюминиево-полипропиленовой откидной крышкой. Для целей введения авелумаб необходимо разводить 0,9% раствором хлорида натрия (физиологический раствор). Во время введения используется трубка со встроенным 0,2-микронным фильтром с низким связыванием белка, изготовленная из полиэфирсульфона (ПЭС).

Количество и частота введения комбинации

В одном аспекте изобретения комбинация:

а) вектора на основе поксвируса, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, предпочтительно вирус MVA, который кодирует закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2, более предпочтительно TG4001, и

б) антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент, предпочтительно авелумаб,

вводят в соответствии со специфическими схемами введения, в которых первое введение указанного поксвируса проводят за 5-10 дней до первого введения указанного антитела против PD-L1, а также проводят последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1.

Другими словами, схема введения, которая используется для комбинации, способа или применения в соответствии с изобретением, включает, по крайней мере:

• первое введение указанного поксвируса,

• которое осуществляют за 5-10 дней до первого введения указанного антитела против PD-L1, и

• последующие введения указанного поксвируса и антитела против - PD-L1.

В схеме введения, которая используется для комбинации, способа или применения в соответствии с изобретением, первое введение указанного поксвируса проводят перед первым введением указанного антитела против PD-L1. Не привязываясь к какой-либо теории, такая схема сначала стимулирует иммунный ответ против ВПЧ при первом введении поксвируса, а затем усиливает этот иммунный ответ против ВПЧ путем первого введения антитела против PD-L1 (за счет снижения иммунной супрессии благодаря PD-1/PD-L1 в микроокружении опухоли), не оказывая влияния на начальное размножение поксвируса. Отсутствие введения антитела против PD-L1 в течение 5-10 дней после первого введения поксвируса предотвращает потенциальное усиление антипоксвирусного иммунного ответа. Последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 поддерживают иммунный ответ против ВПЧ.

Таким образом, в комбинации, способе или применении в соответствии с изобретением первое введение поксвируса осуществляют примерно за 5-10 дней (т.е. за 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, предпочтительно за 1 неделю) перед первым введением указанного антитела против PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинированный режим включает следующие этапы: (а) под руководством или контролем врача субъект получает поксвирусный вектор, кодирующий, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ и иммуностимулирующий цитокин, приблизительно за 5-10 дней до первого получение антитела против PD-L1; и (б) под руководством или контролем врача субъект получает антитело против PD-L1. В некоторых вариантах осуществления комбинированный режим включает введение субъекту антитела против PD-L1 приблизительно через 5-10 дней после того, как субъект получил первое введение поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ и иммуностимулирующий цитокин.

Количество и частота последующих введений указанного поксвируса и антитела против PD-L1 могут варьировать. Однако, что касается их количества, то последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 осуществляются до тех пор, пока комбинированное лечение приводит к благоприятным эффектам у подвергаемого лечению субъекта, не вызывая при этом неприемлемой токсичности.

В одном варианте осуществления последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 можно проводить до тех пор, пока прогрессирует заболевание, которое определяется в соответствии с критериями RECIST v1.1. (Eisenhauer ЕА. и др., Eur J Cancer. (2009) 45(2): 228-47).

«Прогрессирование заболевания», «прогрессирующее заболевание» или «заболевание, которое прогрессировало» относятся к появлению еще одного нового поражения или опухоли и/или однозначному прогрессированию существующих нецелевых поражений, как определено в руководстве RECIST v1.1. Прогрессирование заболевания, прогрессирующее заболевание или заболевание, которое прогрессировало, также могут относиться к росту опухоли более чем на 20 процентов с момента начала лечения либо к увеличению массы, либо к распространению опухоли.

"RECIST" означает «Критерии оценки ответа при солидных опухолях». Руководство, критерии или стандарт RECIST описывает стандартный подход к измерению солидных опухолей и определению для объективной оценки изменения размера опухоли для использования в клинических исследованиях рака у взрослых и рака и детей. RECIST v1.1 означает версию 1.1 пересмотренного руководства RECIST.

В других вариантах осуществления последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 можно проводить до тех пор, пока у пациента наблюдаются благоприятные биологические эффекты (см. специальный раздел ниже).

Что касается частоты введений, то предпочтительно используются следующие графики:

Частота последующих введений поксвируса может варьировать от приблизительно 1 недели до приблизительно 3 месяцев. Кроме того, частота введения поксвируса может не быть постоянной в течение всего периода лечения, а может меняться. Предпочтительно, когда частота последующих введений поксвируса со временем снижается.

В частности, при осуществлении первого введения поксвируса от 4 до 8 (т.е. 4, 5, 6, 7 или 8, предпочтительно 6) введений поксвируса каждые 5-10 дней (включая каждые 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, предпочтительно на еженедельной основе) можно вводить вначале (необязательно, с особым предпочтением для однократного первого введения поксвируса с последующими 5 введениями поксвируса на еженедельной основе («первая группа введений поксвируса»).

Затем за этой первой группой введений поксвируса может следовать вторая группа последующих введений поксвируса с меньшей частотой. Предпочтительно, когда вторая группа последовательных введений поксвируса включает от 6 до 10 (т.е. 6, 7, 8, 9 или 10, предпочтительно 8) последовательных введений поксвируса каждые 1-3 недели (включая каждые 1, 2 или 3 недели, предпочтительно каждые 2 недели) (необязательно, с особым предпочтением для последующих введений поксвируса каждые 2 недели вплоть до 6-го месяца) («вторая группа введений поксвируса»).

После этой второй группы введений поксвируса может следовать третья группа последующих введений поксвируса с еще более низкой частотой. Предпочтительно, когда эта третья группа последующих введений поксвируса может осуществляться каждые 10-14 недель (в том числе каждые 10, 11, 12, 13 или 14 недель, предпочтительно каждые 12 недель) до тех пор, пока прогрессирует заболевание (или, необязательно, до тех пор, пока, по крайней мере, присутствует один из биологических эффектов, описанных в данной заявке ниже) («третья группа введений поксвируса»).

В особенно предпочтительном воплощении поксвирус вводится:

ο на еженедельной основе в течение 6 недель,

ο каждые 2 недели вплоть до 6 месяцев, и

ο каждые 12 недель до тех пор, пока прогрессирует заболевание (или,

необязательно, так долго, пока, по крайней мере, один из биологических эффектов, описанных в данной заявке, будет присутствовать).

Частота введения антитела против PD-L1 (включая первое введение и последующие введения) предпочтительно составляет от 1 до 3 недель (включая каждую неделю или каждые 2 или 3 недели, предпочтительно каждые 2 недели).

Антитело против PD-L1 предпочтительно следует вводить до тех пор, пока прогрессирует заболевание (или, необязательно, до тех пор, пока присутствует, по крайней мере, один из биологических эффектов, описанных в данной заявке ниже).

В особенно предпочтительном варианте осуществления антитело против PD-L1 вводят каждые 2 недели до тех пор, пока прогрессирует заболевание (или, необязательно, до тех пор, пока присутствует один из биологических эффектов, описанных в данной заявке ниже).

Предпочтительные схемы введения

В предпочтительном варианте осуществления комбинацию вводят в соответствии со следующей схемой введения:

а) первая доза от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ указанного поксвируса (предпочтительно, вируса MVA, кодирующего закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2, более предпочтительно TG4001, как описано, например, в WO 1999/03885 под его исследовательским названием MVATG8042) вводится подкожно, а затем до тех пор, пока прогрессирует заболевание, вводят подкожно последующие дозы поксвируса от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ:

• на еженедельной основе в течение 6 недель,

• один раз каждые 2 недели вплоть до 6 месяцев, и

• каждые 12 недель для последующих доз поксвируса;

б) первая доза приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 800 мг антитела против PD-L1 (предпочтительно антитела, которое содержит, по крайней мере, 6 CDR или их тяжелые и легкие цепи, например, авелумаб, более предпочтительно авелумаб) вводится внутривенно через 5-10 дней после введения первой дозы поксвируса, и последующая доза антитела против PD-L1 приблизительно 10 г/кг или приблизительно 800 мг вводится внутривенно каждые 2 недели до тех пор, пока прогрессирует заболевание.

Даже в более предпочтительном воплощении изобретения комбинацию вводят в соответствии со следующей схемой введения:

а) первая доза приблизительно 5×10⁷ БОЕ указанного вируса MVA, кодирующего закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2 (предпочтительно TG4001, как описано, например, в WO 1999/03885 под его исследовательским названием MVATG8042) вводится подкожно, а затем до тех пор, пока прогрессирует заболевание, вводят подкожно последующие дозы MVA, составляющие приблизительно 5×10⁷ БОЕ:

• на еженедельной основе в течение 6 недель,

• один раз каждые 2 недели вплоть до 6 месяцев, и

• каждые 12 недель для последующих доз поксвируса;

б) первая доза приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 800 мг авелумаба вводится внутривенно через 1 неделю после первой дозы поксвируса, и последующие дозы авелумаба приблизительно 10 г/кг или приблизительно 800 мг вводятся внутривенно каждые 2 недели до тех пор, пока прогрессирует заболевание.

Биологические эффекты комбинированного лечения и биомаркеры

Изобретатели неожиданно обнаружили, что сочетание (а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, в частности, TG4001 (вирус MVA, кодирующий закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16) и человеческий IL-2) и (б) антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности, авелумаб, у ВПЧ-положительных онкологических больных приводит к снижению подавления опухолевого иммунитета и улучшению противоопухолевого ответа, характеризующегося:

• индукцией повышения иммунного ответа против полипептидов Е6 и Е7 ВПЧ-16;

• в отношении опухоли:

ο увеличение инфильтратов иммунных клеток, предпочтительно CD3 Т-клеток, увеличение количества CD8 Т-клеток и их доли среди CD3 Т-клеток (увеличение соотношения CD8/CD3) и/или снижение количества регуляторных CD4 Т-клеток и/или сочетанное увеличение CD8 Т-клеток и снижение регуляторных CD4 Т-клеток (Treg), что приводит к снижению соотношения Treg/CD8; и/или

ο повышение экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках;

• в отношении кровеносной системы:

ο повышение количества CD8 Т-клеток; и/или

ο снижение количества регуляторных CD4 Τ клеток; и/или

• значительное реструктурирование экспрессии в опухолевых клетках, которое характеризуется:

ο повышением экспрессии генов активации Т-клеток, генов цитотоксических генов, генов защиты от патогена и функциональных генов естественных клеток-киллеров (NK-клеток);

ο повышение экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, включающей CXCL10, CXCL11, IRF1, GZMK, GZMA, CD3D, PRF1, ТВХ21, CXCR3, STAT1, CD69, CCL2, GZMB, CD3G, ICOS, CD8A, STAT4, GZMM, CCR2, CD3E и IL15; и/или

ο повышение экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, включающей CXCL13, GNLY, GZMH, IFNG, CXCL9, CCL5 и ITGAE, и/или снижение экспрессии одного или более, выбранных из VEGFA, IHH, IL17A, PROM1, REN, PF4, TSLP и LAG3.

Если не указано иное, то все сравнения увеличения или уменьшения проводятся по сравнению с базовым уровнем (т.е. до того, как пациенту будет назначена комбинированная терапия).

Таким образом, в варианте комбинированной терапии указанная комбинация индуцирует индукцию или усиление иммунного ответа против белков Е6 и Е7 ВПЧ-16. Иммунный ответ против белков Е6 и Е7 ВПЧ-16 можно измерить любым приемлемым способом, известным в данной области техники. Подходящие методы могут быть основаны на обнаружении ответов CD8 и/или CD4 Т-клеток против белков Е6 и Е7 ВПЧ-16, включая секрецию цитокинов (в частности, гамма-интерферона (IFNγ), интерлейкина-2 (IL-2) и фактора некроза опухоли альфа (TNFα)), и цитотоксичность. Секреция цитокинов может быть измерена in vitro в образце мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) при использовании обычных анализов, таких как ELISA или ELISPOT. Цитотоксичность также может быть измерена in vitro при использовании обычных анализов. В предпочтительном варианте осуществления измеренный иммунитет против белков Е6 и Е7 ВПЧ-16 будет представлять собой секрецию IFNγ с помощью РВМС и будет измеряться при использовании ELISA, иммуноокрашивания с помощью проточной цитометрии или ELISPOT, предпочтительно методики ELISPOT.

В другом воплощении комбинированной терапии указанная комбинация индуцирует в опухоли:

• повышение инфильтратов иммунных клеток, предпочтительно повышение CD3 Т-клеток, более предпочтительно увеличение количества CD8 Т-клеток, и наиболее предпочтительно повышение соотношения CD8/CD3 клеток; и/или

• снижение количества регуляторных CD4 Т-клеток (Treg), более предпочтительно снижение соотношения Treg/CD3.

Наиболее предпочтительно, когда указанная комбинация индуцирует снижение соотношения Treg/CD8 в опухоли. Такое снижение соотношения Treg/CD8 свидетельствует об уменьшении иммуносупрессии в опухоли и о стимуляции противоракового иммунного ответа.

Внутри опухоли инфильтраты иммунных клеток и, в частности, количество Т-клеток CD3, Т-клеток CD8 и Т-клеток CD4 (Treg) можно охарактеризовать любым подходящим методом, известным в данной области техники. Т-клетки характеризуются поверхностной экспрессией CD3 и подразделяются на две подгруппы в зависимости от их сопутствующей поверхностной экспрессии либо CD8, либо CD4. Среди CD4 Т-клеток те, которые дополнительно экспрессируют Foxp3, считаются регуляторными CD4 Т-клетками (Treg). Количество CD3 Т-клеток (клеток CD3+), CD8 Т-клеток (клеток CD3+CD8+) и CD4 Т-клеток (клеток Treg, CD3+CD4+Foxp3+) можно измерить при использовании любого подходящего метода, известного в данной области техники, до (на базовом уровне) и после лечения и последующего их сравнения. Соотношение CD8/CD3, соотношение Treg/CD3 и соотношение Treg/CD8 затем можно легко рассчитать.

Как используется в данной заявке, термин экспрессия CD3, CD8, CD4 и Foxp3 означает любой определяемый уровень экспрессии белков CD3, CD8, CD4 и Foxp3 на клеточной поверхности или мРНК CD3, CD8, CD4 и Foxp3 в клетке или ткани. Экспрессию белков CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3 на клеточной поверхности можно обнаружить с помощью диагностических антител к CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3 в иммуногистохимическом (ИГХ) анализе среза опухолевой ткани или с помощью проточной цитометрии, в зависимости от типа образца. В качестве альтернативы, экспрессия белков CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3 опухолевыми клетками может быть обнаружена с помощью ПЭТ-визуализации при использовании связывающего агента (например, фрагмента антитела, аффитела и т.п.), который специфически связывается с CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3. Методы обнаружения и измерения экспрессии мРНК (или кДНК) CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3 включают ПЦР с обратной транскриптазой, количественную ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени (количественная ОТ-ПЦР) и гибридизацию на микрочипах. В опухоли экспрессия CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3 может быть обнаружена с помощью диагностических антител к CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3 в иммуногистохимическом (ИГХ) анализе среза опухолевой ткани. Увеличение/уменьшение выявляют, когда число, экспрессия или соотношение после лечения при использовании комбинированной терапии выше/ниже, чем до лечения (на базовом уровне).

В другом варианте комбинированной терапии указанная комбинация индуцирует повышение экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках. «Экспрессия PD-L1», как используется в данной заявке, означает любой определяемый уровень экспрессии белка PD-L1 на клеточной поверхности или мРНК PD-L1 внутри клетки или ткани. Экспрессию белка PD-L1 можно обнаружить с помощью диагностического антитела к PD-L1 в иммуногистохимическом (ИГХ) анализе среза опухолевой ткани или с помощью проточной цитометрии, в зависимости от типа образца. В качестве альтернативы, экспрессия белка PD-L1 опухолевыми клетками может быть обнаружена с помощью ПЭТ-визуализации при использовании связывающего агента (например, фрагмента антитела, аффитела и т.п.), который специфически связывается с PD-L1. Методы обнаружения и измерения экспрессии мРНК (или кДНК) PD-L1 включают ОТ-ПЦР, количественную ОТ-ПЦР в реальном времени (количественная ОТ-ПЦР) и гибридизацию на микрочипах. В опухоли экспрессия PD-L1 может быть обнаружена с помощью диагностического антитела к PD-L1 в иммуногистохимическом (ИГХ) анализе среза опухолевой ткани. Увеличение выявляют, когда экспрессия PD-L1 после лечения комбинированной терапией выше, чем до лечения (на базовом уровне). Высокий уровень экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках был связан с лучшим клиническим ответом на лечение антителами против PD-L1.

В другом воплощении комбинированной терапии указанная комбинация индуцирует в системе кровообращения:

• увеличение количества CD8 Т-клеток, предпочтительно увеличение соотношения CD8/CD3; и/или

• снижение количества регуляторных CD4 Т-клеток (Treg), более предпочтительно снижение соотношения Treg/CD3.

В системе кровообращения экспрессия CD3, CD8, CD4 и Foxp3 может быть измерена при использовании любого подходящего метода, известного в данной области техники, до (на базовом уровне) и после лечения, где уровни экспрессии сравнивают. Подходящие способы включают такие же, как описано выше, для измерения экспрессии CD3, CD8, CD4 и Foxp3 в опухоли, но с предпочтением для обнаружения экспрессии CD3, CD8, CD4 и Foxp3 при использовании диагностических CD3, CD8, CD4 и/или Foxp3 антител методом проточной цитометрии. Соотношение CD8/CD3, соотношение Treg/CD3 и соотношение Treg/CD8 затем можно легко рассчитать.

Предпочтительно, увеличение количества CD8 Т-клеток наблюдается как в системе кровообращения, так и внутри опухоли. Аналогичным образом, снижение количества регуляторных CD4 Т-клеток наблюдается как в системе кровообращения, так и внутри опухоли. Более того, как увеличение числа CD8 Т-клеток, так и снижение количества регуляторных CD4 Т-клеток предпочтительно наблюдается в системе кровообращения и/или внутри опухоли, более предпочтительно как в кровообращении, так и внутри опухоли.

Кроме того, на молекулярном уровне изобретатели также неожиданно обнаружили изменения экспрессии генов, которые согласуются с праймированием врожденного и адаптивного иммунитета и переходом от «холодного» профиля опухоли к «горячему» профилю опухоли. «Холодная опухоль» определяется как опухоль без или с очень ограниченными иммунными инфильтратами, в частности, инфильтратами Т-клеток. На молекулярном уровне «холодная опухоль» характеризуется низким уровнем экспрессии генов, связанных с наличием инфильтратов иммунных клеток и, в частности, генов, которые связаны с активацией Т-клеток, дифференцировкой Т-клеток, привлечением Т-клеток, адгезией Т-клеток, цитотоксичностью, защитой от патогенов и функцией природных клеток-киллеров (NK-клеток). В противовес этому, «горячая опухоль» определяется как опухоль со значительными иммунными инфильтратами, в частности, инфильтратами Т-клеток. На молекулярном уровне «горячая опухоль» характеризуется высоким уровнем экспрессии генов, связанных с наличием инфильтратов иммунных клеток, и в частности, генов, связанных с активацией Т-клеток, дифференцировкой Т-клеток, привлечением Т-клеток, адгезией Т-клеток, цитотоксичностью, защитой от патогенов и функцией NK-клеток. Сдвиг от профиля «холодной опухоли» к профилю «горячей опухоли» считается как такой, который индуцирован лечением, когда лечение приводит к значительному увеличению иммунных инфильтратов, в частности, инфильтратов Т-клеток. На молекулярном уровне это выражается в увеличении уровня экспрессии одного или нескольких генов, связанных с активацией Т-клеток, дифференцировкой Т-клеток, привлечением Т-клеток, адгезией Т-клеток, цитотоксичностью, защитой от патогенов и/или функцией NK-клеток, эти уровни увеличиваются по сравнению с теми, которые были до лечения. Горячие опухоли с большей вероятностью реагируют на терапевтическое вмешательство и более последовательно связаны с улучшением клинического исхода для пациента. Напротив, холодная опухоль связана с небольшой иммунореактивностью, плохой реакцией на терапевтическое вмешательство и, вероятно, имеет быстрое неблагоприятное клиническое течение.

В частности, используя панель из 770 генов, связанных с иммунным ответом на рак, изобретатели смогли продемонстрировать изменения в экспрессии генов в опухоли по сравнению с базовым уровнем и на 43-ий день после начала комбинированного лечения. Такие вариации включают увеличение экспрессии нескольких генов активации Т-клеток, генов цитотоксических клеток, генов защиты от патогенов и генов функции NK-клеток. Изменения также включают увеличение генных сигнатур, известных как Immunosign®CR 15 и Immunosign®CR 21 от HalioDX, которые, как считается, отражают естественную иммунную активность в опухоли и вокруг нее и, следовательно, скорее всего иммунное состояние опухоли, которое считается холодным, ассоциируется с плохим прогнозом, а горячее - с лучшим прогнозом (Galon J. и др., Immunity (2013) 39(1): 11-26; Marabelle А. и др., Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) 32^nd Annual Meeting & Pre-Conference Programs (SITC 2017) 8-12 ноября 2017 года в Gaylord National Hotel & Convention Center in National Harbor, Maryland. Poster P250).

Более подробно, Immunosign®CR 15 представляет собой алгоритм, объединяющий данные об экспрессии генов, связанных с цитотоксичностью Т-клеток, дифференцировкой Т-клеток, привлечением Т-клеток, адгезией Т-клеток, иммунной ориентацией, подавлением ангиогенеза, иммунным коингибированием и раковыми стволовыми клетками: CXCL13, GNLY, GZMH, IFNG, CXCL9, CCL5, ITGAE, VEGFA, IHH, IL17A, PROM1, REN, PF4, TSLP, LAG3. В контексте настоящего изобретения увеличение уровня экспрессии любого из CXCL13, GNLY, GZMH, IFNG, CXCL9, CCL5 и ITGAE и/или снижение уровня экспрессии любого из VEGFA, IHH, IL17A, PROM1, REN, PF4, TSLP и LAG3 рассматриваются как переход к более горячему статусу опухоли, благоприятному для лечения рака.

Immunosign®CR 21 представляет собой алгоритм, объединяющий данные экспрессии генов, связанных с цитотоксичностью Т-клеток, активацией Т-клеток, привлечением Т-клеток и ориентацией Th1: CXCL10, CXCL11, IRF1, GZMK, GZMA, CD3D, PRF1, ТВХ21, CXCR3, STAT1, CD69, CCL2, GZMB, CD3G, ICOS, CD8A, STAT4, GZMM, CCR2, CD3E и IL15. В контексте настоящего изобретения повышение уровня экспрессии любого из этих генов рассматривается как переход к более горячему статусу опухоли, благоприятному для лечения рака.

Таким образом, в одном из аспектов изобретения комбинированная терапия индуцирует повышенную экспрессию в одной или нескольких из следующих категорий генов (которые неожиданно были обнаружены изобретателями как такие, которые активируются комбинированной терапией):

(I) повышение экспрессии, по крайней мере, одного гена, связанного с активацией Т-клеток, предпочтительно выбранного из следующей группы: CD47, RPS6, CD80, IL18R1, CD7, PSEN2, TNFSF14, DPP4, STAT4, CCR1, FOXP3, CTLA4, LAG3, CD86, LILRB1, IL13, CD1C, EOMES, CCR4, CD3G, FAS, IL12B, IL18RAP, CD1D, CXCR3, TIGIT, IL4, IL12A, IFNG, CD70, CD2, CD3E, CD8A, CD8B, IL12RB2, CD5, CCR5, TBX21, IL12RB1, IRF4, ADA, CD274, LCK, F2RL1, ICOSLG, CXCL11, CXCL10, IDO1, CX3CL1, IRF1, SOCS1, IL18, SLC11A1, EGR1, ITGA1, CXCR4, CXCL9, PTPRC, LCP1, TNFRSF14, PSEN1, MAF, TP53, IL4R, STAT6, IL13RA1 и IFNGR1, и необязательно IL21R генов;

(II) повышение экспрессии, по крайней мере, одного гена, связанного с активацией цитотоксической функции Т-клеток, предпочтительно выбранного из группы GZMM, GZMH, GZMK, GNLY, GZMB, PRF1, GZMA, HLA-C и HLA-A генов;

(III) повышение экспрессии, по крайней мере, одного гена защиты от патогена, предпочтительно выбранного из группы CD8A, CTSG, PRG2, CCL22, IL1B, PRF1, GNLY, CXCL10, TYK2 и OAS3 генов;

(IV) повышение экспрессии, по крайней мере, одного гена функции NK клеток, предпочтительно выбранного из группы KLRC1, KLRB1, KLRC2, IL12B, KIR3DL1, KLRF1, KLRG1, NCR1, KLRK1, IL12A и KLRD1 генов;

(V) повышение экспрессии комбинации любых генов из категорий генов (I), (II), (III) и/или (IV), предпочтительно комбинации генов, включающей, по крайней мере, один ген из каждой категории упомянутых выше категорий генов.

В другом аспекте изобретения, альтернативно или в дополнение к экспрессии генов категорий от (I) до (V), как приведено выше, комбинированная терапия индуцирует повышенную экспрессию одного или более из следующих генов (присутствуют в сигнатуре Immunosign® 21): CXCL10, CXCL11, IRF1, GZMK, GZMA, CD3D, PRF1, TBX21, CXCR3, STAT1, CD69, CCL2, GZMB, CD3G, ICOS, CD8A, STAT4, GZMM, CCR2, CD3E и IL15. В частности, комбинированная терапия может индуцировать экспрессию одного или более из следующих генов (см. Фигуру 6Г): CXCL10, CXCL11, IRF1, GZMK, GZMA, CD3D, PRF1, ТВХ21 и CXCR3.

В другом аспекте изобретения, альтернативно или в дополнение к экспрессии генов категорий (I)-(V) и/или генов сигнатуры Immunosign® 21, как указано выше, комбинированная терапия индуцирует повышенную или пониженную экспрессию в одном или нескольких из следующих генов (присутствующих в сигнатуре Immunosign® 15), а именно:

• повышенную экспрессию одного или более из следующих генов: CXCL13, GNLY, GZMH, IFNG, CXCL9, CCL5 и ITGAE, и/или

• сниженную экспрессию одного или более из следующих генов: VEGFA, IHH, IL17A, PROM1, REN, PF4, TSLP и LAG3.

В приведенных выше вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии раскрытых категорий генов или конкретных генов, которые представляют интерес, может быть измерен при использовании любого подходящего метода, известного в данной области техники, до (на базовом уровне) и после лечения, после чего уровни экспрессии сравниваются. Уровень экспрессии можно определить путем измерения либо уровня экспрессии мРНК (или кДНК), либо белка. Предпочтительно, уровень экспрессии мРНК (или кДНК) измеряется с помощью таких методов, как ОТ-ПЦР, количественная ОТ-ПЦР в реальном времени (количественная ОТ-ПЦР в реальном времени) и гибридизация на микрочипах.

Описанные выше биологические эффекты комбинированной терапии также можно использовать в качестве биомаркеров до или во время проведения комбинированной терапии.

В одном варианте осуществления их можно, в частности, использовать в качестве биомаркеров во время проведения комбинированной терапии для принятия решения о продолжении или прекращении комбинированной терапии у пациента.

В варианте осуществления, в котором биомаркеры используются для принятия решения о продолжении или прекращении комбинированной терапии у пациента, последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 можно проводить до тех пор, пока комбинированное лечение индуцирует или усиливает иммунный ответ против белков Е6 и Е7 ВПЧ-16.

В другом варианте осуществления можно проводить последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 до тех пор, пока комбинированное лечение вызывает:

• повышение инфильтратов иммунных клеток (с предпочтением для повышения инфильтратов CD3 Т-клеток, более предпочтительно повышение инфильтратов CD8 Т клеток) в опухоли; и/или

• снижение количества регуляторных CD4 Т-клеток в опухоли.

В другом варианте осуществления изобретения можно проводить последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 до тех пор, пока комбинированное лечение вызывает повышение экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках.

В другом варианте осуществления последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 можно проводить до тех пор, пока комбинированное лечение вызывает в системе кровообращения:

• повышение количества CD8 Т-клеток, предпочтительно повышение соотношения CD8/CD3; и/или

• снижение количества регуляторных CD4 Т-клеток (Treg), более предпочтительно снижение соотношения Treg/CD3.

В другом варианте осуществления последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 можно проводить до тех пор, пока комбинированное лечение вызывает повышенную экспрессию в одной или нескольких из следующих категорий генов (неожиданно изобретатели обнаружили, что они активируются при использовании комбинированной терапии):

(I) повышение экспрессии, по крайней мере, одного гена, который относится к активации Т-клеток, предпочтительно выбранного из тех, которые раскрыты выше;

(II) повышение экспрессии, по крайней мере, одного гена, который относится к активации функции Т-клеток, предпочтительно выбранного из тех, которые раскрыты выше;

(III) повышение экспрессии, по крайней мере, одного гена защиты от патогенов, предпочтительно выбранного из тех, которые раскрыты выше;

(IV) повышение экспрессии, по крайней мере, гена функции NK-клеток, предпочтительно выбранного из тех, которые раскрыты выше;

(V) повышение экспрессии любой комбинации генов из категории генов (I), (II), (III) и/или (IV), предпочтительно комбинации генов, включающей, по крайней мере, один ген каждой из упомянутых выше категорий генов.

В другом варианте осуществления, в качестве альтернативы или в дополнение к экспрессии генов категорий (I)-(V), как указано выше, можно проводить последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 до тех пор, пока комбинированное лечение вызывает повышенную экспрессию в одном или более из следующих генов (присутствуют в сигнатуре Immunosign® 21): CXCL10, CXCL11, IRF1, GZMK, GZMA, CD3D, PRF1, TBX21, CXCR3, STAT1, CD69, CCL2, GZMB, CD3G, ICOS, CD8A, STAT4, GZMM, CCR2, CD3E и IL15. В частности, последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 можно проводить до тех пор, пока комбинированное лечение вызывает повышенную экспрессию одного или нескольких из следующих генов (см. Фигуру 6Г): CXCL10, CXCL11, IRF1, GZMK, GZMA, CD3D, PRF1, ТВХ21 и CXCR3.

В другом варианте осуществления изобретения, в качестве альтернативы или в дополнение к экспрессии генов категорий (I)-(V) и/или генов сигнатуры Immunosign® 21, указанных выше, последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1 можно проводить до тех пор, пока комбинированное лечение вызывает повышенную или пониженную экспрессию одного или нескольких из следующих генов (присутствующих в сигнатуре Immunosign® 15), а именно:

• повышенная экспрессия одного или более из следующих генов: CXCL13, GNLY, GZMH, IFNG, CXCL9, CCL5 и ITGAE, и/или

• сниженная экспрессия одного или более из следующих генов: VEGFA, IHH, IL17A, PROM1, REN, PF4, TSLP и LAG3.

Все ссылки, которые цитируются в данной заявке, включены посредством ссылки в раскрытие настоящего изобретения.

Следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Результаты фазы Ib клинического исследования NCT03260023

В NCT03260023 комбинация TG4001 и авелумаба при ВПЧ16-положительном R/M (для рецидивирующего и/или метастатического) рака оценивалась с точки зрения безопасности, эффективности и иммунологического ответа. В данном примере представлены предварительные данные фазы Ib.

Материалы и методы

Схема исследования и лечения

Мультицентровое, открытое, одногрупповое исследование со схемой 3+3 для фазы Ib, в котором два разных уровня доз (DL) TG4001 (DL1 5×10⁶ БОЕ и DL2 5×10⁷ БОЕ) сочетаются с авелумабом в дозе 10 мг/кг. Для фазы II TG4001 вводили при DL2.

TG4001 вводили подкожно (п/к) еженедельно в дни 1, 8, 15, 22, 29 и 36, затем один раз каждые 2 недели (начиная с 36-го дня) до 6-го месяца (с 1-го дня исследуемого лечения), после чего один раз каждые 12 недель до тех пор, пока прогрессировало заболевание, наблюдали неприемлемую токсичность или исключения пациента из исследования по любой причине, в зависимости от того, что наступит раньше. Авелумаб вводили внутривенно (в/в инфузия) каждые 2 недели, начиная с 8-го дня (через неделю после введения первой дозы TG4001), до тех пор, пока прогрессировало заболевание, наблюдали неприемлемую токсичность или исключения пациента из исследования по любой причине, в зависимости от того, что произойдет раньше.

Конечные точки исследования и оценка

Безопасность и эффективность комбинации TG4001 и авелумаба, иммунные параметры (Т-клеточный ответ, изменения в инфильтратах и экспрессия генов, связанных с иммунитетом).

Ответ опухоли оценивали с помощью RECIST v1.1 (Eisenhauer ЕА. и др., Eur J Cancer (2009) 45(2):228-47). Образцы РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) собирали продольно, а образцы тканей брали в начале исследования и на 43-й день.

Популяция исследования

Ключевые критерии включения:

• Метастатический или рефрактерный/рецидивирующий (M/R) рак ВПЧ-16+, включая орофарингеальный SCCHN рак, рак шейки матки, вульвы, влагалища, полового члена и анальный рак.

• Позитивность по ВПЧ-16 определяли в центральной лаборатории путем обнаружения ДНК Е7 ВПЧ-16 методом ПЦР при использовании специфических праймеров для ВПЧ-16.

• До двух предшествующих линий системной терапии для лечения метастатического или рецидивирующего заболевания

• Статус производительности ECOG 0 или 1

Ключевые критерии исключения:

• Предшествующее лечение при использовании иммунотерапии рака, включая противораковые вакцины, любые антитела, нацеленные на корегуляторные белки Т-клеток, такие как антитела против PD L1, против PD 1 или против CTLA-4.

• Метастазы в ЦНС

• Длительное лечение системными кортикостероидами

Измерение размера опухоли

Опухолевый ответ оценивали с помощью компьютерной томографии (КТ) (или магнитно-резонансной томографии (МРТ)). Предпочтительно, КТ (или МРТ) головы и шеи, грудной клетки, живота и всех других известных очагов заболевания были выполнены в течение 21 дня до начала исследуемого лечения. Пациентов оценивали каждые 6 недель от начала лечения до тех пор, пока прогрессировало заболевание, или в течение 9 месяцев после начала исследуемого лечения, в зависимости от того, что произошло раньше. После 9 месяцев лечения оценки проводились каждые 12 недель до тех пор наблюдали задокументированное прогрессирование. Все измерения были записаны в метрической системе исчисления (мм).

На базовом уровне опухолевые поражения и лимфатические узлы были классифицированы как поддающиеся измерению (минимальный размер не менее 10 мм или лимфатический узел >15 мм) или не поддающиеся измерению (небольшие поражения <10 мм, не поддающиеся измерению поражения (например, плевральный выпот) или лимфатический узел <15 мм). Пациенты, которые были допущены к участию в исследовании, имели, по крайней мере, одно поражение, поддающееся измерению с помощью КТ/МРТ. Были зарегистрированы все целевые поражения (все поддающиеся измерению поражения (узловые или неузловые) вплоть до максимум 5 поражений в целом) и нецелевые поражения (все остальные поражения, поддающиеся измерению или нет). Для оценки реакции опухоли рассчитывали сумму самых длинных диаметров (SLD) для всех поражений-мишеней (и короткую ось для узловых поражений) на базовом уровне и на протяжении всего периода исследования. При каждой оценке ответ сначала оценивали отдельно для целевых поражений и нецелевых поражений, выявленных на базовом уровне. Затем эти оценки использовались для расчета общей реакции поражения с учетом целевых и нецелевых поражений, а также наличия или отсутствия новых поражений:

- Полный ответ (ПО): исчезновение всех целевых поражений. Любые патологические лимфатические узлы (целевые или нецелевые) должны иметь уменьшение по короткой оси до <10 мм.

- Частичный ответ (ЧО): уменьшение суммы диаметров очагов поражения, по крайней мере, на 30%, принимая за основу базовую сумму диаметров.

- Прогрессирующее заболевание (ПЗ): увеличение, по крайней мере, на 20% суммы диаметров целевых поражений и новых поражений, принимая за основу наименьшую сумму в исследовании (включая оценку базового уровня). В дополнение к относительному увеличению на 20%, сумма также должна демонстрировать абсолютное увеличение, по крайней мере, на 5 мм. Появление одного или нескольких новых поражений также считается прогрессированием.

- Стабильное заболевание (СЗ): не существует ни достаточного уменьшения, чтобы квалифицировать ПО, ни достаточного увеличения, чтобы квалифицировать ПЗ.

- Не оценивалось (НО): прогрессирование не было зарегистрировано, и одно или более поражений мишеней не оценивались или оценивались при использовании метода, отличного от базового. Единственным исключением является случай, когда сумма наибольших диаметров, поддающихся оценке поражений-мишеней, уже квалифицируется как ПЗ. В этом случае целевой ответ будет представлять собой ПЗ.

Поддающиеся оценке опухолевого ответа пациенты включали всех пациентов, которые имели, по крайней мере, одно поддающееся оценке базовое и одно оцениваемое после КТ сканирование на 6-й неделе после начала исследуемого лечения с наилучшей оценкой общего ответа, отличной от «неизвестно» в соответствии с критериями оценки RECIST 1.1. Пациентам были назначены дозы обоих ИЛП (исследуемых лекарственных препаратов: TG4001+авелумаб) с соблюдением минимального воздействия, за исключением случаев прогрессирования или смерти пациента из-за основного заболевания до или во время первой оценки.

Данные в отношении иммунитета

Образцы были взяты у пациентов, которые дали согласие, в соответствии со всеми этическими принципами, относящимися к исследованиям на людях, и после одобрения Институциональным наблюдательным советом. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли при использовании градиента плотности на слое Ficoll®. Вкратце, гепаринизированную кровь смешивали с фосфатно-солевым буфером и средой Ficoll®. Затем смесь центрифугировали при 2300 g в течение 20 минут. Слой РВМС собирали, разбавляли забуференным физиологическим раствором и центрифугировали в течение 10 мин. при 1300 g для удаления оставшегося раствора Ficoll®. Клетки ресуспендировали в забуференном солевом растворе и центрифугировали. Затем клеточный осадок ресуспендировали в среде для хранения IMDM (среда Дюльбекко, модифицированная по методу Исков) с 10% ДМСО и 20% сыворотки человека), распределяли по криопробиркам и замораживали в контейнере при использованием изопропилового спирта.

Образцы тканей были получены с помощью стандартной биопсии толстой при использовании иглы 18G или выше. Срезы образцов толщиной 4 мкм (иммуногистохимия) или 10 мкм (анализ экспрессии генов) перед обработкой фиксировали формалином в заливали парафином.

ELISPOT анализ ответа Т-клеток против ВПЧ

У пациентов, которые участвовали в исследовании фазы I, количество клеток, продуцирующих IFN-γ, определяли с помощью ELISpot после фазы размножения in vitro в течение 5 дней. Вкратце, после оттаивания клетки подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток NC200 и высевали при 2Е+06 клеток на 500 мкл на лунку 24-луночных культуральных планшетов в среду X-VIVO-15, содержащую 2% раствор заменителя сыворотки CTS, и в присутствии или при отсутствии стимулирующих антигенов (пулы пептидов Е6 или Е7 в концентрации 2 мкг/мл на пептид или пул смеси контрольных пептидов в концентрации 1 мкг/мл). На 5-й день клетки собирали, подсчитывали и высевали при 2Е+05 клеток на лунку планшетов ELISpot IFN-γ в четырех повторностях. После 24-часовой инкубации планшеты ELISpot вскрывали в соответствии с инструкциями производителя, затем высушивали перед подсчетом пятен с помощью автоматического считывающего устройства для ELISPOT.

У пациентов из исследования фазы II метод был модифицирован для повышения специфичности. Клетки, которые продуцируют IFN-γ, количественно определяли с помощью ELISpot. Вкратце, РВМС собирали путем венепункции у пациентов в день 0, день 1 (до вакцинации) и день 43 (после вакцинации) в пробирки ПХТ (полихлортерфенил) и отправляли в центральную лабораторию (PPD) для экстракции центрифугированием в градиенте фиколла. Клетки промывали, подсчитывали и помещали в пробирки, содержащие 10×10⁶ клеток. Клетки замораживали и хранили в жидком азоте перед анализом.

Клетки размораживали и стимулировали в течение ночи с помощью среды (отрицательный контроль), пулом пептидов Е6 (PepTivator, Miltenyi Biotech), пулом пептидов Е7 (PepTivator, Miltenyi Biotech) или CEF (PepTivator, Miltenyi Biotech; положительный контроль: EBV, CMV, Flu). Затем клетки высевали на планшеты, покрытые анти-IFN-γ, и инкубировали (1×10⁵ клеток/лунку) перед выявлением. РВМС, собранные у пациента до и после пептидной вакцинации и известные как такие, которые развивают Т-клеточный ответ, использовали в каждом анализе в качестве контроля анализа. Для каждого состояния осуществляли три повторности. После инкубации в течение ночи планшеты ELISpot вскрывали в соответствии с инструкциями производителя, затем высушивали перед подсчетом пятен с помощью автоматического считывающего устройства ELISPOT. Пациентов считали положительными по антигену, когда положительные и отрицательные контроля соответствовали ожиданиям, и когда количество пятен антигена было выше, чем отрицательный контроль плюс 2-кратный коэффициент вариации анализа.

Иммуногистохимия для оценки иммунопоказателя

Фиксированные формалином залитые в парафин срезы ткани толщиной 4 мкм использовали для характеристики иммунного состояния опухоли. Последовательные срезы из одного и того же ядра биопсии использовали для всех анализов у данного пациента в начале исследования и на 43-й день. Первый срез каждой серии использовался для подтверждения опухолевой природы при осмотре патологоанатомом ткани после окрашивания гематоксилином и эозином. Окрашивание CD3 и CD8 проводили на последовательных срезах в соответствии со следующей прописью: осуществляли выделение антигена с помощью Трис основного буфера (рН=8) в течение 60 мин., гасили активность эндогенной пероксидазы, инкубировали с антителом против CD8 в течение 32 мин. при 37°С и с антителом против CD3 в течение 20 мин. при 37°С; выявление осуществляли с помощью набора Ultraview Universal DAB IHC Detection Kit и контрастного окрашивания гематоксилином Майера. В качестве первичных антител, которые использовали для окрашивания иммунных клеток, использовали следующие: кроличьи моноклональные антитела против человеческого CD3 VMS (клон 2GV6 Ventana), мышиные моноклональные антитела против человеческого CD8 (клон С8/144, Dako®). Цифровые изображения окрашенных срезов тканей получали при 20-кратном увеличении и разрешении 0,45 мкм/пиксель. Количественную оценку CD8- и CD3-положительных клеток в опухоли и в инвазивном крае проводили на основе цифрового сканирования всего предметного стекла при использовании модуля Immunoscore®, разработанного HalioDx (Марсель, Франция).

Мультиспецифическая гистологическая оценка CD3/CD8/PD-L1 и CD3/CD4/FOXP3

Предметные стекла FFPE толщиной 4 мм депарафинизировали, регидратировали в градиенте этанола, заканчивая промывкой дистиллированной водой, и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 20 минут. Извлечение антигена проводили с помощью микроволновой обработки в растворе для извлечения антигена. В каждом из циклов окрашивания блокирование белков проводили при использовании бессывороточного раствора Protein Block в течение 15 мин. и первичные антитела против CD3 (полученные от Ventana, как указано выше), антитела против CD4 (мышиные моноклональные антитела против CD4 человека; клон UMAB64 Clinisciences) и антитела против FoxP3 (мышиное моноклональное анти-человеческое антитело FOXP3; клон 236А/Е7; AbCam) или антитела против CD3, антитела против CD8 и антитела против PDL-1 инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем проводили инкубацию с мышиными или кроличьими антителами, мечеными пероксидазой хрена, при комнатной температуре в течение 15 минут с последующей инкубацией с флуорофорами в течение 10 минут. После этого все срезы контрастно окрашивали при использовании флуоресцентного красителя ДАПИ в течение 5 минут перед сканированием всего среза и количественной оценкой при использовании запатентованного программного обеспечения для цифровой патологии, разработанного HalioDx. Результаты были сведены в таблицу и нанесены на график при использовании программного пакета Graphpad Prism.

Анализ изменения генной экспрессии в опухолевой ткани в ходе эксперимента: мультиплексный тест экспрессии генов иммунного ответа

Технологию Nanostring nCounter использовали для измерения относительных уровней экспрессии иммунных генов в микроокружении опухоли на фиксированной формалином опухолевой ткани (толщина 10 мкм). После экстракции общую РНК (300 нг) анализировали на цифровом анализаторе nCounter и подвергали гибридизации с панелью иммунного профилирования Pan-cancer в соответствии с инструкциями производителя. Панель содержит 770 генов, включая ключевые контрольные точки, хемокины, цитокины и связанные с ними контрольные гены. Контроль качества и нормализацию данных осуществляли с помощью пакета программ nSolver. Измеренные значения экспрессии нормализовали к среднему геометрическому уровней экспрессии генов «домашнего хозяйства» с самым низким коэффициентом вариации (% CV). Статистический анализ был выполнен при использовании модуля расширенного анализа nSolver и программного пакета R. Immunosign® был определен при использовании коммерчески доступного запатентованного алгоритма, разработанного HalioDx.

ПРИМЕР 1А: Фаза исследования Ib и результаты

Популяция исследования

В это исследование были включены девять пациентов (4 женщины и 5 мужчин), которые подвергались лечению при использовании либо 5×10⁶ БОЕ (DL1), либо 5×10⁷ БОЕ (DL2) TG4001 в комбинации с авелумабом в дозе 10 мг/кг в соответствии с терапевтической схемой, описанной выше. Таблица 1 иллюстрирует демографические данные и характеристики пациентов на базовом уровне.

Базовые характеристики пациентов были следующими: средний возраст 57,8 года (диапазон 39-78), наличие различных типов ВПЧ16-положительных видов рака (анального, цервикального, орофарингеального и вагинального) преимущественно плоскоклеточного происхождения. На базовом уровне у всех пациентов были обнаружены отдаленные метастазы.

Краткая характеристика связанных с лечением побочных эффектов

Уровень безопасности оценивался по сообщениям о побочных эффектах (ПЭ) и при использовании лабораторных исследований, физических исследований, электрокардиограммы (ЭКГ) и основных показателей состояния организма в различные моменты времени. Побочные эффекты и лабораторные отклонения оценивались в соответствии с Общими критериями токсичности для побочных эффектов Национального института рака (NCI-CTCAE). Токсичность оценивали в соответствии с NCI-CTCAE, версия 4.03. Данные о побочных эффектах, подлежащих рассмотрению, были обобщены по уровню доз и являются представленными в Таблице 2 ниже.

Как иллюстрируется в Таблице 2, все пациенты испытывали, по крайней мере, один побочный эффект. В частности, наблюдали в общей сложности 68 побочных эффектов у 9 пациентов: 23 в случае DL1 и 45 в случае DL2. Лечение при использовании комбинации TG4001 и авелумаба было хорошо переносимым. Действительно, серьезных побочных эффектов (СПЭ), связанных с лечением, не наблюдалось, и только два явления 3-й степени наблюдались у одного пациента, получавшего DL1 (5×10⁶ БОЕ).

Изменения размеров опухоли

Изменения размеров опухоли при комбинированном лечении представлено на Фигурах 1А и 1 В. Как было проиллюстрировано ранее, большинство пациентов, которые были вовлечены в эксперимент и подвергнуты лечению DL2 имели уменьшенный или стабилизированный размер опухоли.

Количество случаев частичного ответа (ЧО), стабильного заболевания (СЗ) и прогрессирующего заболевания (ПЗ) в процессе клинического исследования, оценивали в соответствии с RECIST 1.1 критериями, а также представляли в Таблице 3, приведенной ниже.

Результаты, приведенные в Таблице 3 и на Фигурах 1А и 1Б показывают, что комбинированное лечение способно стабилизировать заболевание или вызвать частичный ответ у двух третей всех пациентов. Эффективность оказалась лучше при более высоких дозах DL2 TG4001 (5×10⁷ БОЕ), со стабильным заболеванием или частичным ответом примерно у 83% пациентов.

Данные в отношении иммунитета

Специфический ответ Т-клеток против ВПЧ

У четырех пациентов оценивали ответы ELISPOT против Е6 и Е7 ВПЧ-16 на 43-й день. Ответы ELISPOT представлены в Таблице 4, приведенной ниже.

н/о: не определяли; -: наблюдали 0 пятен; =: наблюдали <10 пятен; +: наблюдали 10-100 пятен; ++: наблюдали >100 пятен.

Таблица 4 показывает, что 3 из 4 пациентов, к которым применяли ELISPOT, имели Е6 или Е7 рективные Т-клетки в день 43.

Изменения в отношении TIL при лечении

Соотношение CD8/CD3 и соотношение Treg (CD4 FoxP3)/CD8 в базовой точке исследования и на 43-й день представлены на Фигурах 2А и 2В, они показывают, что период лечения был связан с общим увеличением инфильтратов соотношения CD8/CD3 и снижением Treg (CD4 FoxP3)/CD8, что дает возможность предположить более благоприятный иммунный профиль (повышение иммуностимуляторных CD8 Т-клеток и снижение иммуносупрессорных Treg).

Экспрессия PD-L1 на TIL и опухолевых клетках при лечении

Экспрессию PD-L1 оценивали на TIL и опухолевых клетках в базовый момент времени и на 43-й день (а также на 85-й день для одного пациента) у 7 пациентов, 5 из которых подлежали оценке как на базовом уровне, так и на 43-й день. Результаты представлены в Таблице 5, представленной ниже.

Результаты Таблицы 5 показывают, что у 4 из 5 пациентов, подлежащих оценке как на базовом уровне, так и на 43-й день, наблюдалось значительное увеличение экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках на 43-й день, что, как ожидается, коррелирует с повышенной склонностью к ответу на иммунотерапевтическое лечение.

Анализ изменения генной экспрессии в опухолевой ткани в процессе лечения

Чтобы изучить изменения экспрессии генов в опухолевой ткани, вызванные терапией, оценивали экспрессию панели из 770 генов, связанных с иммунным ответом, на базовом уровне и после лечения (43-й день). В частности, изучалась экспрессия генных сигнатур, ранее описанных как Immunosign® 15 и Immunosign® 21 (Galon и др., Immunity (2013) 9(1): 11-26; Marabelle и др., Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) 32^nd Annual Meeting & Pre-Conference Programs (SITC 2017) on November 8-12, 2017., the Gaylord National Hotel & Convention Center in National Harbor, Maryland. Poster P250).

График рассеяния для большого массива данных изменений экспрессии генов и сигнальных путей, идентифицированных как сверхэкспрессированные после и до лечения, представлен на Фигурах 3 и 4. Черные точки представляют собой соответствующие гены, которые участвуют в указанном механизме (например, активация Т-клеток на Фигуре 3А и т.д.), уровень экспрессии, коррелирующий с положением в логарифмической шкале (сверхэкспрессия справа от нулевого значения и пониженная экспрессия слева от нулевого значения).

На Фигуре 3 показано, что пути, связанные с ответом на вирусную вакцину (защита от патогенов, см. Фигуру 3 В) и активацией противоопухолевого иммунитета (активация Т-клеток, функция цитотоксических клеток и натуральных клеток-киллеров, см. Фигуры 3А, 3Б и 3Г), были сверхэкспрессированы во время лечения.

Кроме того, на Фигуре 4А представлено описание категорий генов, включенных в генные сигнатуры, которые ранее были описанные как Immunosign® 15 и Immunosign® 21, а на Фигурах 4Б и 4В показано, что многие гены Immunosign® 15 и Immunosign® 21 сигнатур сверхэкспрессировались во время лечения.

Наблюдаемые изменения экспрессии генов согласуются с активацией врожденного и адаптивного иммунитета и переходом к более «горячему» опухолевому профилю, который более последовательно связан с улучшением клинического исхода для пациента.

Изучение случая пациентки 0101006

Более подробные данные представлены для пациентки 0101006, которая страдала раком шейки матки.

Изменения иммунных инфильтратов:

У пациентки 0101006 наблюдали опухоль с низким уровнем инфильтрации, умеренной экспрессией PD-L1 на опухолевых клетках и инфильтрирующих иммунных клетках, а также низкую пространственную колокализация между клетками CD8 и опухолевыми клетками, экспрессирующими PD-L1. Все эти особенности согласуются с холодным типом опухоли на базовом уровне.

Изменения в иммунных инфильтратах представлены на Фигуре 5, а экспрессия PD-L1 на TIL и опухолевых клетках на базовом уровне и на 43-й день показаны в Таблице 6, представленной ниже.

Фигура 5 и Таблица 6 показывают, что на день 43 опухоль была значительно более инфильтрирована с более чем 4-кратным повышением инфильтрации CD3, 3-кратным увеличением инфильтрации CD8 и удвоением опухолевой и иммунной экспрессии PD-L1. Достоверных изменений уровня инфильтрации иммуносупрессорными клетками в процессе лечения не наблюдалось.

Кроме того, анализ цифровой патологии образца показал, что инфильтрированные CD8 были сгруппированны вокруг PD-L1-положительных опухолевых клеток (Фигура 5В), что предполагает более благоприятный профиль ответа на блокаду контрольной точки.

Изменения в экспрессии генов:

Профиль экспрессии генов в опухолевой ткани пациентки также выявил значительные изменения в течение периода лечения, как показано на цветовой карте 770 связанных с иммунитетом генов (данные не представлены).

Анализ изменений экспрессии генов дополнительно показывает сильное повышение экспрессии генов, которые связаны с процессингом и презентацией антигена (Фигура 6А), реакцией на вирус (Фигура 6Б) и экспрессией Toll-подобных рецепторов (Фигура 6В). Активация этих путей согласуется с развитием адаптивного ответа против вирусной вакцины.

Кроме того, 9 генов сигнатуры Immunosign® 21 были сильно сверхэкспрессированы (Фигура 6Д), что свидетельствует о переходе от иммунно-исключенного фенотипа к «горячему» типу опухоли, которая, вероятно, будет получать пользу от иммунотерапевтического вмешательства.

Выводы

Предварительные результаты фазы Ib исследования NCT03260023 показывают, что:

• Комбинация TG4001 и авелумаба безопасна и хорошо переносится при обоих уровнях дозы TG4001, исследованных у пациентов с ВПЧ-положительным раком, получавших несколько предшествующих линий лечения.

• Комбинация обеспечивает многообещающие отклики эффективности на DL2 и оценивается в текущей части фазы П.

• Лечение связано с изменениями в микроокружении опухоли, которые, вероятно, изменяют течение патологии, переводя опухоль из холодного состояния в более горячее иммунное состояние даже у пациентов, ранее получавших интенсивное лечение.

• Это может быть особенно полезным для пациентов, которые имеют фенотипом опухоли с «иммунным исключением», как показано в отдельном клиническом случае. Эти результаты свидетельствуют о том, что комбинация (а) поксвирусного вектора, кодирующего, по крайней мере, полипептиды Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин и (б) антитела против PD-L1, безопасна, является хорошо переносимой и эффективной (по крайней мере, аддитивная эффективность) в лечении пациентов с ВПЧ-положительными видами рака.

ПРИМЕР 1Б: Фаза II исследования и объединенный промежуточный анализ

Характеристики пациента/заболевания

Для фазы II TG4001 вводили при DL2. DL2 использовали в рекомендуемой для фазы II дозе после завершения фазы Ib и подтверждали результатами, которые показали, что комбинация TG4001 и авелумаба безопасна, а в отношении характера и тяжести зарегистрированных ПЭ не наблюдалось никакой разницы между DL1 и DL2. Для промежуточного анализа, запланированного в соответствии с протоколом, в это исследование были включены 25 пациентов, из которых 3 не подлежали оценке ответа опухоли. Из 22 пациентов, подлежащих оценке, у 11 пациентов (50%) был выявлен рак анального канала, у 4 пациентов (18,2%) - рак шейки матки, у 4 пациентов (18,2%) - вагинальный/вульварный рак и у 3 пациентов (13,6%) - орофарингеальный рак. Перед включением в промежуточный анализ было добавлено еще 7 пациентов, из которых 1 пациент не подлежал оценке реакции опухоли. Из 6 поддающихся оценке пациентов у 4 пациентов (66,6%) был обнаружен рак анального канала, а у 1 пациента - орофарингеальный рак (16,6%) и рак шейки матки (16,6), соответственно.

Для анализа подгрупп пациентов, которых подвергали лечению на фазе Ib при использовании DL2 (уровень дозы 2) TG4001 (N=6), объединяли с пациентами, которые получали лечение на фазе II (N=28, как обсуждалось ранее). Из 6 пациентов, которые получали лечение на фазе Ib, у 4 пациентов (66,6%) был орофарингеальный рак, а у 1 пациентки наблюдался вагинальный рак (16,6%) и цервикальний рак (16,6), соответственно. Из объединенного набора данных (N=34) у 15 пациентов (44,1%) был выявлен рак анального канала, у 8 пациентов (23,5%) наблюдался орофарингеальный рак, у 6 пациентов (17,6%) наблюдался цервикальный рак и у 5 пациентов (14,7%) наблюдался вагинальный вульварный рак. Значение ответа опухоли на лечение в соответствии с результатами объективной оценки (ЧОО) составляло 20,6%.

Объединенная популяция пациентов была разделена в соответствии с наличием метастазов в печень (вес. % против вес, как показано в Таблице 7, по характеристикам заболевания (Таблица 8) и по предшествующему химиотерапевтическому лечению (Таблица 9).

В Таблице 7 представлен обзор в зависимости от пола и общего состояния (ОС) для подгрупп пациентов с метастазами в печень и без них. В частности, подгруппа пациентов без метастазов в печень включала 23 пациента (непеченочные пациенты), тогда как подгруппа пациентов с метастазами в печень составляла 11 пациентов (печеночные пациенты).

Что касается характеристик заболевания в объединенном наборе данных (N=34), как показано в Таблице 8, у 15 пациентов был обнаружен анальный рак, у 8 пациентов был обнаружен орофарингеальный рак, у 6 пациентов был рак шейки матки и у 5 пациентов наблюдали вагинальный/вульварный рак. Ответ опухоли на лечение по результатам объективной оценки составлял 20,6%.

Корреляция характеристик пациентов/заболеваний с ЧОО и ВБПЗ

На основании вышеуказанных стратификаций была оценена корреляция каждой характеристики пациента/заболевания с ответом опухоли по результатам объективной оценки (ЧОО) или выживаемостью без прогрессирования заболевания (ВБПЗ).

Корреляции характеристик каждого пациента/заболевания с ЧОО и ВБПЗ представлены на Фигурах 7 и 8, соответственно.

Что касается ЧОО, то было обнаружено, что только одна характеристика заболевания (обведена рамкой на Фигуре 7) была определена как такая, которая значительно коррелирует с ухудшением ЧОО: наличие метастазов в печени (см. и р-значение 0,012).

Что касается ВБПЗ, то было обнаружено, что три характеристики значительно коррелируют с ухудшением или улучшением ВБПЗ (они обведены рамкой на Фигуре 8):

• наличие метастазов в печени, достоверно коррелирующих с ухудшением ВБПЗ (см. Фигуру 8, которая показывает ОР (отношение рисков) 4,390, 95% интервал 1,728-11,152 и значение p 0,002),

• рак анального канала, достоверно коррелирующий с ухудшением ВБПЗ (см. Фигуру 8, которая показывает ОР (отношение рисков) 3,214, 95% интервал 1,269-8,143 и значение p 0,014), и

• наличие метастазов в лимфатических узлах, что значительно коррелирует с лучшей ВБПЗ (см. Фигуру 8, которая показывает ОР 0,388, 95% интервал 0,151-0,998 и значение p 0,049).

Что касается ассоциации анального рака с более низким значением ВБПЗ, то следует отметить, что эта связь может быть косвенно объяснена более высокой распространенностью метастазов в печени у пациентов с анальным раком. Действительно, ответы были зарегистрированы у пациентов с анальным раком с метастазами не в печень, а в другие органы.

Кроме того, в отношении ВБПЗ, хотя и не было выявлено значимого (р=0,073) количества пациентов, которых подвергали анализу в объединенном промежуточном анализе, однако наблюдалась тенденция к корреляции генитального (вульварного/вагинального) рака и лучшей ВБПЗ.

Таким образом, единственной характеристикой, значимо коррелирующей как с ЧОО, так и с ВБПЗ, было наличие метастазов в печени, что значительно коррелировало с ухудшением ЧОО и ВБПЗ.

Таким образом, эта стратификация была изучена более тщательно.

В приведенной ниже Таблице 10 дополнительно показано распределение пациентов с метастазами в печень или без них в зависимости от параметров эффективности (ответ RECIST1.1, стабильное заболевание через 12 недель, прогрессирование до/через 12 недель и среднее значение ВБПЗ), а также показано, что при лечении с применением комбинированного лечения пациенты без метастазов в печень имеют более высокий ответ и стадию заболевания через 12 недель, меньшее прогрессирование до/через 12 недель и более высокое среднее значение ВБПЗ, чем пациенты с метастазами в печень.

Фигура 9 является графическим представлением наилучшего изменения размера опухоли у 23 пациентов в соответствии с объединенными промежуточными результатами фазы Ib и фазы II без метастазов в печень, Фигура 10 представляет такое же графическое представление для 9 пациентов в соответствии с объединенными промежуточными результатами фазы Ib и фазы II с метастазами в печень.

В Таблице 11, приведенной ниже, показано распределение пациентов с метастазами в печень или без них в зависимости от типа первичной опухоли (анальная, орофарингеальная, шейная, вульварная/вагинальная) и показано, что независимо от первичной опухоли у пациентов без метастазов в печень наблюдается более высокий ответ, чем у пациентов с метастазами в печень (у этих пациентов не наблюдалось ответа, независимо от первичной опухоли). Таблица 11 также показывает высокий уровень ответа для пациентов с вагинальным/вульварным раком без метастазов в печень (66,7%), хотя этот высокий уровень следует принимать с осторожностью из-за небольшого числа проанализированных пациентов (всего 3).

Данные в отношении иммунитета

Специфические ответы Т-клеток против ВПЧ

11 пациентов подлежали оценке в отношении ответов ELISPOT против Е6 и Е7 ВПЧ-16 на 43-й день. Таблица 12 иллюстрирует, что у 7 из 11 пациентов после вакцинации был обнаружен определяемый с помощью ELISPOT ответ ех vivo. Ни у одного из пациентов не было ранее существовавшего ответа в этих экспериментальных условиях до вакцинации. Ответы ELISPOT представлены в Таблице 12, приведенной ниже.

н/о: не определяли; -: 0 нет ответа; +: > базового уровня +2 СЗ, ++: > базового уровня + наблюдали 3 пятна СЗ.

Иммунный инфильтрат

Наблюдения, сделанные во время фазы 1 исследования, были подтверждены на фазе 2 увеличением количества генов, связанных с сигнатурами Immunosign®, и увеличением инфильтратов CD3-положительных клеток.

Транскриптомный анализ

Транскриптомный анализ опухолей, взятых у пациентов с метастазами опухоли в печень или без них, осуществляли так, как описано в разделе «Материалы и методы».

Изобретатели смогли продемонстрировать вариации экспрессии генов в печеночных метастазах. Примечательно, как показано в Таблице 13 и на Фигуре 11, гены ST6GAL1 (р<0,001) и НАМР (р<0,0001) были сверхэкспрессированы (изменение Log2 на 2,74 и 7,15, соответственно). Гены, ассоциированные с путем комплемента, были сверхэкспрессированы, включая С8А (изменение Log2 на 6,71; р<0,001), С8В (изменение Log2 на 7,25; р<0,001), СЗ (изменение Log2 на 3,41; р<0,001), С6 (изменение Log2 на 3,41; р<0,001). изменение 5,87; р<0,001) и С2 (изменение Log2 2,06; р<0,001).

T6GAL1 был ассоциирован с агрессивностью при многих видах рака, и известно, что НАМР регулирует активность иммунных клеток посредством изменения метаболизма железа.

Влияние комплемента на иммунитет против рака остается спорным, было показано, что высокая экспрессия пути комплемента оказывает цитотоксическое влияние на иммунные клетки, включая эффекторные CD4 и CD8. Это представляет интерес, с учетом того, что печень является основным местом синтеза и регуляции факторов комплемента.

Кроме того, также были представлены цитокины, связанные с воспалением, которые могут способствовать созданию иммуносупрессивной среды опухоли. Эта иммуносупрессия является губительной для эффекторных иммунных клеток и может способствовать ускользанию опухоли от иммунитета и прогрессированию заболевания. Таким образом, эти уникальные транскриптомные особенности согласуются с резистентностью к иммунологическому вмешательству у пациентов с метастазами в печень.

В завершение, клинические наблюдения за пациентами выявили метастазы в печени в качестве определяющего фактора ответа на лечение и клинического исхода. Геномные данные показали, что метастазы опухоли в печень характеризуются экспрессией генов и путей, связанных с подавлением иммунной системы или агрессивностью опухоли.

Заключение

Таким образом, объединенный промежуточный анализ фазы Ib и фазы II показывает, что наличие метастазов в печени связано со снижением ЧОО и более коротким ВБПЗ. Действительно, при стратификации пациентов по наличию или отсутствию метастазов в печень в подгруппе пациентов без метастазов в печень (N=23) наблюдался ЧОО 30,4% по сравнению с 0% в подгруппе пациентов с метастазами в печень. (N=11). Точно так же среднее значение ВБПЗ у пациентов без метастазов в печень (N=23) составляло 5,6, тогда как среднее значение ВБПЗ у пациентов с метастазами в печень (N=11) составляло всего 1,4.

Кроме того, объединенный промежуточный анализ фазы Ib и фазы II также показывает, что анальный рак связан с более низким значением ВБП из-за более высокой распространенности метастазов в печень у пациентов с анальным раком, в то время как вульварный/вагинальный рак демонстрировал тенденцию к более высокому значению ВБПЗ.

Наконец, метастазирование в лимфатические узлы было связано с лучшими показателями ВБПЗ.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ лечения ВПЧ-положительного рака или предраковых интраэпителиальных повреждений комбинацией поксвирусного вектора и антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном из вариантов реализации комбинация включает поксвирусный вектор, кодирующий по крайней мере полипептиды E6 и E7 папилломавируса человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и антитело против лиганда запрограммированной смерти PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения ВПЧ-положительного рака или предраковых интраэпителиальных повреждений. 14 з.п. ф-лы, 11 ил., 13 табл., 2 пр.

1. Способ лечения ВПЧ-положительного рака или предаковых интраэпителиальных повреждений комбинацией:

a) поксвирусного вектора, кодирующего по крайней мере полипептиды E6 и E7 папилломавируса человека (ВПЧ) и иммуностимулирующий цитокин, и

б) антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента,

где первое введение указанного поксвируса осуществляют за 5-10 дней перед первым введением указанного антитела против PD-L1 и проводят последующие введения указанного поксвируса и антитела против PD-L1.

2. Способ по п. 1, где указанный поксвирус представляет собой вирус осповакцины, предпочтительно модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA).

3. Способ по п. 1 или 2, где указанный поксвирус кодирует закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды E6 и E7 ВПЧ-16 и человеческий интерлейкин 2 (IL-2).

4. Способ по любому из пп. 1-3, где указанное антитело против PD-L1 опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанное антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, которая включает три участка, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и легкую цепь, которая включает три участка, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6; предпочтительно, где указанное антитело против PD-L1 включает тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или 8, и легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанное антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанный ВПЧ-положительный рак представляет собой ВПЧ-положительный орофарингеальный, цервикальный, вагинальный, анальный, вульварный, пенильный рак, рак слизистой оболочки или немеланомный рак кожи или где указанные предраковые интраэпителиальные поражения представляют собой интраэпителиальную неоплазию (CIN) 2 или 3 степени или вульварную внутриэпителиальную неоплазию (VIN) 2 или 3 степени; предпочтительно, когда указанный ВПЧ-положительный рак является выбранным из ВПЧ-положительного вульварного и вагинального рака.

8. Способ по п. 7, где указанный рак является ВПЧ-16 положительным, предпочтительно, когда указанный рак представляет собой ВПЧ-16 положительную плоскоклеточную карциному головы и шеи (ВПЧ-16+ SCCHN) или ВПЧ-16 положительный вульварный или вагинальный рак.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где указанный ВПЧ-положительный рак представляет собой ВПЧ-положительный рак без мультифокальных метастазов в печень, предпочтительно указанный ВПЧ-положительный рак представляет собой ВПЧ-положительный рак без метастазов в печень.

10. Способ по любому из пп. 7-9, где указанный ВПЧ-положительный рак является рецидивирующим и/или метастатическим ВПЧ-положительным раком; предпочтительно указанный ВПЧ-положительный метастатический рак представляет собой ВПЧ-положительный метастатический рак с метастазами в лимфатические узлы.

11. Способ по п. 10, где указанный ВПЧ-положительный метастатический рак представляет собой ВПЧ-положительный метастатический рак без мультифокальных метастазов в печень, предпочтительно, когда указанный ВПЧ-положительный рак представляет собой ВПЧ-положительный метастатический рак без метастазов в печень.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где каждое введение указанного поксвируса осуществляется при использовании дозы от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где комбинация вводится в соответствии со следующей схемой введения:

a) первая доза от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ указанного поксвируса вводится подкожно, а последующие дозы поксвируса от 3×10⁷ до 7×10⁷ БОЕ вводятся подкожно до тех пор, пока прогрессирует заболевание:

• еженедельно в течение 6 недель,

• один раз каждые 2 недели до 6 месяцев и

• каждые 12 недель для последующих доз поксвирусов;

б) первая доза приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 800 мг антитела против PD-L1 вводится внутривенно через 5-10 дней после первой дозы поксвируса с последующими дозами антитела против PD-L1, которые составляют приблизительно 10 мг/кг или примерно 800 мг, которые вводятся внутривенно каждые 2 недели до тех пор, пока прогрессирует заболевание.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где:

а) указанный поксвирус представляет собой MVA вирус, который кодирует закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды E6 и E7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2,

б) указанное антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб и

в) указанный поксвирус и антитело против PD-L1 вводятся в соответствии со следующей схемой введения:

(I) MVA вирус, который кодирует закрепленные на мембране неонкогенные полипептиды E6 и E7 ВПЧ-16 и человеческий IL-2, вводят подкожно при дозе 5×10⁷ БОЕ на еженедельной основе в течение 6 недель, потом один раз каждые 2 недели вплоть до 6 месяцев и каждые 12 недель после этого до тех пор, пока прогрессирует заболевание,

(II) авелумаб вводят путем внутривенной инфузии при дозе приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 800 мг каждые 2 недели, начиная от дня 8 до тех пор, пока прогрессирует заболевание.

15. Способ по любому из пп. 1-14, где указанная комбинация индуцирует:

• повышение иммунного ответа против полипептидов E6 и E7 ВПЧ-16;

• в отношении опухоли:

• повышение инфильтратов иммунных клеток, предпочтительно увеличение соотношения CD8/CD3; и/или

• снижение количества регуляторных CD4 T-клеток, предпочтительно снижение соотношения Treg/CD8; и/или

• повышение экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках;

• в системе кровообращения:

• повышение количества CD8 T-клеток; и/или

• снижение количества регуляторных CD4 T-клеток; и/или

• значительное ремоделирование генной экспрессии в опухолевых клетках, которое характеризуется:

• повышением экспрессии генов активации T-клеток, генов цитотоксических клеток, генов защиты от патогена и генов функционирования естественных клеток-киллеров (NK-клеток);

• повышением экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, которая включает: CXCL10, CXCL11, IRF1, GZMK, GZMA, CD3D, PRF1, TBX21, CXCR3, STAT1, CD69, CCL2, GZMB, CD3G, ICOS, CD8A, STAT4, GZMM, CCR2, CD3E и IL15; и/или

• повышением экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, которая включает: CXCL13, GNLY, GZMH, IFNG, CXCL9, CCL5 и ITGAE, и/или снижением экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, которая включает VEGFA, IHH, IL17A, PROM1, REN, PF4, TSLP и LAG3.