КЛЕТКИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ, В КОТОРЫЕ ВВЕДЕН СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ГЕН ПОСРЕДСТВОМ ЛЕНТИВИРУСА Российский патент 2024 года по МПК C12N15/85 C12N9/64 G01N33/558 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к клеткам для измерения активности ботулинического токсина, к способу измерения активности ботулинического токсина с их использованием, и т.п.

Предшествующий уровень техники

Ботулинический токсин - это нейротоксин, вырабатываемый Clostridium botulinum, грамположительной анаэробной бактерией, которая растет в гниющих консервах и тухлом мясе. Ботулинический токсин подразделяется на восемь нейротоксинов, и среди них семь (A, B, C, D, E, F и G) могут вызывать паралич нервов. Ботулинический токсин имеет размер примерно 150 кДа и состоит из комплекса нетоксичных белков в дополнение к белку ботулинического токсина, и размер каждого комплекса может достигать максимум 900 кДа в зависимости от типа нейротоксина. Способ действия, мишень, период активности и тому подобное варьирует в зависимости от типа ботулинического токсина, но известно, что ботулинический токсин типа А является одним из наиболее смертоносных биологических агентов. Этот ботулинический токсин обладает активностью, вызывающей паралич, блокируя сигналы, индуцирующие мышечные спазмы или сокращения, и был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в 1989 году в качестве биологического средства, основанного на этой функции, и с тех пор ботулинический токсин широко используется в терапевтических и косметических целях. Ботулинический токсин используется в терапевтических целях для лечения таких заболеваний, как косоглазие, кривошея, блефароспазм, ахалазия, трещины заднего прохода и боли в спине, а также в косметических целях для устранения морщин и межбровных складок, коррекции массивного подбородка, лечения гипергидроза и тому подобного.

Терапевтическое и косметическое применение ботулинического токсина требует биологической валидации перед использованием, и такую валидацию обычно подтверждают с помощью теста LD₅₀ на мышах, то есть теста на летальность. На практике единицами измерения на этикетке фармацевтического препарата являются единицы LD₅₀ для мышей. Однако для получения статистически полезных данных о LD₅₀ у мышей существуют ограничения, которые включают не только потребность в очень большом количестве мышей, но также высокую стоимость тестирования и сложность наблюдения различий в зависимости от серотипа ботулинического токсина (опубликованная заявка на патент Кореи № 10-2012-0134154).

Следовательно, для преодоления этих недостатков существует необходимость в новом методе измерения активности ботулинического токсина, который является простым и высокочувствительным и позволяет оценить все этапы, необходимые для абсорбции ботулинического токсина, без использования животных.

Описание изобретения

Техническая проблема, решаемая изобретением

Настоящее изобретение было создано для решения проблем в соответствующей области техники, описанных выше, и его задачей является обеспечение клеток для измерения активности ботулинического токсина, способа измерения активности ботулинического токсина с их использованием, и т.п. Эти клетки являются клетками, которые сверхэкспрессируют гены SEPTIN2 или тиоредоксина (TXN) и позволяют с высокой точностью определять даже низкие дозы ботулинического токсина, поскольку можно оценить не только связывание, поглощение клетками, транслокацию в цитоплазму и протеазную активность ботулинического токсина, но также значительно улучшена чувствительность клеток к ботулиническому токсину. Также можно измерить активность фармацевтических композиций ботулинического токсина в активном фармацевтическом ингредиенте и готовом лекарственном средстве (готовой лекарственной форме).

Однако технические проблемы, которые намеревается решить настоящее изобретение, не ограничиваются теми, которые были упомянуты выше, но также и другие технические проблемы, которые не были указаны, будут понятны для средних специалистов в денной области техники, к которой относится настоящее изобретение, из следующего описания.

Техническое решение

Настоящее изобретение обеспечивает клетки для определения активности ботулинического токсина, сверхэкспрессирующие септин-2 или тиоредоксин (TXN).

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения сверхэкспрессия гена SEPTIN2 или TXN может быть обеспечена путем введения гена в клетки, предпочтительно таким способом, как трансдукция или трансфекция, но настоящее изобретение не ограничивается этим способом, при условии, что способ является общеизвестным способом введения генов в клетки. SEPTIN2 предпочтительно представляет собой ген септина-2 человека, более предпочтительно ген, экспрессирующий последовательность мРНК длиной 3726 п.н. с регистрационным номером NM_001008491.2 NCBI, но его варианты также включены в объем настоящего изобретения. В частности, SEPTIN2 может включать последовательность, имеющую гомологию последовательности 90% или более, более предпочтительно 95% или более, и наиболее предпочтительно 98% или более с последовательностью мРНК NM_001008491.2. Процент гомологии последовательности подтверждают, сопоставляя область сравнения с оптимально выровненной последовательностью, и часть нуклеотидной последовательности в области сравнения может включать добавление или делецию (то есть гэп) по сравнению с контрольной последовательностью (без добавления или делеции) для оптимального выравнивания последовательностей. Далее, TXN предпочтительно является геном TXN человека, более предпочтительно геном, экспрессирующим последовательность мРНК длиной 737 п.н. с регистрационным номером NM_003329.4 NCBI, но его варианты также включены в объем настоящего изобретения. В частности, TXN может включать последовательность, имеющую гомологию последовательности 90% или более, более предпочтительно 95% или более и наиболее предпочтительно 98% или более с последовательностью мРНК NM_003329.4. Гомологию последовательностей в % подтверждают, сопоставляя область сравнения с оптимально выровненной последовательностью, и часть нуклеотидной последовательности в области сравнения может включать добавление или делецию (то есть гэп) по сравнению с контрольной последовательностью (без добавления или делеции) для оптимального выравнивания последовательностей.

В другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения клетки характеризуются повышенной чувствительностью к интоксикации ботулиническим токсином по сравнению с клетками дикого типа из-за сверхэкспрессии гена SEPTIN2 или TXN.

В еще одном иллюстративном варианте осуществления изобретения клетки могут быть предпочтительно клетками SiMa, клетками LAN-2, клетками PC12, клетками Neuro-2a, клетками LA1-55n, клетками N18, клетками SH-SY5Y, клетками Келли, клетками NB69, клетками N1E-115, клетками BE(2)-M17, клетками SK-N-BE(2) и т.п., но не ограничиваются ими, при условии, что они представляют собой клеточную линию, которая, как известно, может быть использована для измерения активности ботулинического токсина.

В еще одном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения ботулинический токсин может быть выбран из группы, состоящей из ботулинических серотипов A, B, C, D, E, F и G.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ измерения активности ботулинического токсина, включающий этапы: (а) обработки клеток для измерения активности ботулинического токсина ботулиническим токсином и культивирования клеток; (b) лизиса культивированных клеток и сбора клеточного лизата; и (с) измерения количества продукта расщепления SNAP-25 в клеточном лизате.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения количество продукта расщепления SNAP-25 измеряют с использованием сэндвич-иммуноанализа (ИФА), Вестерн-блоттинга и т.п., но способ этим не ограничивается, при условии, что он является известным способом, используемым для обнаружения белков.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает набор для измерения активности ботулинического токсина, включающий клетки для измерения активности ботулинического токсина в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает использование клеток для измерения активности ботулинического токсина с целью определения активности ботулинического токсина.

Полезные эффекты

Поскольку клетки для измерения активности ботулинического токсина, согласно настоящему изобретению, обладают значительно улучшенной чувствительностью к ботулиническому токсину за счет сверхэкспрессии SEPTIN2 или тиоредоксина, то они позволяют измерять даже низкие дозы ботулинического токсина, что может быть подтверждено с высокой точностью. Кроме того, ожидается, что клетки смогут заменить многочисленные эксперименты на животных, поскольку можно оценить связывание, поглощение клетками, транслокацию в цитоплазму и протеазную активность ботулинического токсина. Кроме того, поскольку клетки можно использовать для измерения не только активности ботулинического токсина, но также активности фармацевтических композиций ботулинического токсина в активном фармацевтическом ингредиенте и готовой лекарственной форме, ожидается, что клетки можно легко применять в различных областях промышленности, где используется ботулинический токсин.

Описание чертежей

На фиг. 1 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее функции септина-2 и тиоредоксина (TXN).

На фиг. 2 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее векторную карту pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro.

Фиг. 3 иллюстрирует результаты, полученные под микроскопом, подтверждающие культивирование клеточной линии 293FT в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 4 представляет собой схему, кратко отображающую способ получения клеточной линии, трансдуцированной с использованием лентивируса, согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 5 представляет собой схему способа культивирования клеточной линии и ее разделения на отдельные колонии с использованием цилиндра для клонирования в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 6 представляет собой схему, показывающую результаты, подтверждающие экспрессию белков в трансдуцированной клеточной линии методом Вестерн-блоттинга, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 7 показывает положения связывания праймеров, сконструированных для ПЦР, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 8 показывает результаты, полученные методом ПЦР, подтверждающие введение гена в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 9 представляет собой схему, иллюстрирующую принцип сэндвич-ИФА.

Фиг. 10 показывает результаты подтверждения чувствительности к ботулиническому токсину, полученные посредством сравнения степени расщепления SNAP-25 между контролем и клеточной линией, трансдуцированной геном SEPTIN2, согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 11 показывает результаты, подтверждающие чувствительность к ботулиническому токсину контрольной группы и группы трансдуцированной клеточной линии посредством соотношения исходных данных между каждой группой, согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 12 показывает результаты, подтверждающие чувствительность к ботулиническому токсину контрольной группы и группы трансдуцированной геном тиоредоксина клеточной линии посредством сравнения степени расщепления SNAP-25, согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 13 показывает результаты измерения активности фармацевтической композиции ботулинического токсина (активного фармацевтического ингредиента) с использованием трансдуцированной клеточной линии в качестве титра фармацевтической композиции ботулинического токсина (активного фармацевтического ингредиента) согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 14 показывает результаты измерения активности фармацевтической композиции ботулинического токсина (готовой лекарственной формы) с использованием трансдуцированной клеточной линии в качестве титра фармацевтической композиции ботулинического токсина (готовой лекарственной формы) согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 15 представляет схему, иллюстрирующую общий процесс создания настоящего изобретения.

Принципы изобретения

В результате интенсивных исследований способов измерения активности ботулинического токсина авторы настоящего изобретения создали клеточную линию с улучшенной чувствительностью, позволяющую измерять активность ботулинического токсина, и активность ботулинического токсина может быть стабильно измерена с ее использованием.

Используемый в настоящей заявке термин «ботулинический токсин» относится к типу ботулинического токсина, который может вырабатываться бактериями или может быть получен рекомбинантным методом, но включает любой известный тип ботулинического токсина, или любой тип ботулинического токсина, который может быть обнаружен впоследствии, включая модифицированные варианты или гибридные белки. Ботулинический токсин подразделяется на восемь нейротоксинов, и семь серотипов ботулинического токсина A, B, C, D, E, F и G могут вызывать паралич нервов. Этот белок классифицируется как белок, который включает комплекс, и белок, который не включает комплекс, и очищенный белок токсина имеет молекулярную массу 150 кДа, причем различные белки с молекулярной массой 300 кДа, 500 кДа и 900 кДа могут быть получены в зависимости от того, сформирован ли комплекс. Ботулинический токсин по настоящему изобретению может альтернативно представлять собой производное ботулинического токсина, то есть соединение, обладающее активностью ботулинического токсина, но включающее одну или несколько химических модификаций или функциональных модификаций по сравнению с природным или рекомбинантным ботулиническим токсином. Например, ботулинический токсин может представлять собой модифицированный нейротоксин (например, нейротоксин, имеющий одну или несколько аминокислотных делеций, модификаций или замен по сравнению с нейротоксином дикого типа или нейротоксином, полученным рекомбинантным путем, его производными или их фрагментами). Например, ботулинический токсин может быть модифицирован таким образом, чтобы улучшить его характеристики или уменьшить его нежелательные побочные эффекты, но все еще сохранить необходимую активность. Альтернативно, ботулинический токсин может представлять собой токсин, полученный с использованием рекомбинантной или синтетической химической технологии (например, рекомбинантный пептид, гибридизованный белок или гибридный нейротоксин, полученный из различных субъединиц или доменов серотипов ботулинического токсина (см., например, патент США № 6444209)). Ботулинический токсин также может быть частью общей молекулы, которая, как было доказано, обладает требуемой активностью ботулинического токсина, и в таких случаях он может использоваться сам по себе или как часть комбинированной или конъюгированной молекулы, например, гибридного белка. Кроме того, ботулинический токсин может быть в форме предшественника ботулинического токсина, который сам по себе может быть нетоксичным, например, нетоксичной цинковой протеазой, которая может становиться токсичной при протеолитической деградации.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки» относится ко всем эукариотическим клеткам, которые чувствительны к интоксикации ботулиническим токсином или которые способны абсорбировать ботулинический токсин. Эукариотические клетки относятся к клеткам, полученным от различных млекопитающих, таких как, например, мыши, крысы, свиньи, коровы, овцы, лошади, приматы и люди. Как используется в настоящей заявке, полученная клеточная линия является синонимом стабильной клеточной линии, бессмертной клеточной линии или трансформированной клеточной линии и относится к клеткам, отобранным для неограниченной пролиферации. Трансформированные клеточные линии, раскрытые в настоящем описании, проявляют постоянную чувствительность к активности ботулинического токсина на протяжении множества клеточных пассажей, и чувствительность к активности ботулинического токсина относится к самой низкой концентрации ботулинического токсина, при которой можно стабильно измерить сигнал, обнаруженный необработанной контрольной группой, или фоновый сигнал.

Используемый в настоящей заявке термин «вектор» или «плазмида» относится к фрагменту ДНК, молекуле нуклеиновой кислоты и т.п., которые доставляются в клетку, и вектор может реплицировать ДНК и независимо повторно формироваться в клетке-хозяине. Термин «вектор» может использоваться взаимозаменяемо с термином «носитель». «Вектор экспрессии» относится к рекомбинантной молекуле ДНК, которая включает целевую кодирующую последовательность и соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, которая необходима для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Кроме того, рекомбинантный вектор или плазмида по настоящему изобретению является общим термином для всех векторов, которые включают ген, кодирующий септин-2 или тиоредоксин, и способны к сверхэкспрессии септина-2 или тиоредоксина в клетках.

Используемый в настоящей заявке термин «набор» относится к устройству, позволяющему измерять активность ботулинического токсина путем включения клеток для измерения активности ботулинического токсина по настоящему изобретению, и может быть использовано для измерения активности ботулинического токсина, такого как непосредственно ботулинический токсин, активный фармацевтический ингредиент ботулинического токсина и конечная дозированная форма ботулинического токсина. Набор по настоящему изобретению может дополнительно включать агент для лизиса клеток, антитела и реагенты для ИФА, руководство и тому подобное, в дополнение к клеткам для измерения активности ботулинического токсина по настоящему изобретению, но может дополнительно включать что угодно, при условии, что это может быть использовано для способа измерения активности ботулинического токсина по настоящему изобретению.

Далее будут приведены предпочтительные примеры, способствующие пониманию настоящего изобретения. Однако эти примеры приведены только для того, чтобы настоящее изобретение было более понятным, и объем настоящего изобретения не ограничивается такими примерами.

Примеры

Пример 1. Культивирование клеточной линии 293FT для получения лентивируса

293FT, клеточная линия, обычно используемая для получения лентивируса, получена из клеточной линии 293F и является типичной клеточной линией, используемой для получения лентивируса и стабильно экспрессирующей большой Т-антиген SV40 посредством плазмиды pCMVSPORT6TAg.neo. Поскольку клеточная линия 293FT кодирует ген устойчивости к неомицину в составе плазмиды, клеточную линию 293 культивировали с использованием среды, включающей генетицин, который является аналогом неомицина, в течение всего периода культивирования клеток, за исключением размораживания клеток. Более конкретно, исходные клетки 293FT (Thermo, R700-07) суспендировали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco), 1X NEAA (Gibco), 2 мМ L-глутамина (Gibco) и 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco) и центрифугировали при 200×g в течение 3 минут, удаляли надосадочную жидкость и получали клетки. Полученные клетки повторно суспендировали с использованием питательной среды, а затем распределяли в 100-миллиметровую чашку для культивирования клеток и культивировали при 37°C в термостате с 5% CO₂ в течение 24 часов. После этого культуральную среду полностью удаляли и заменяли средой DMEM (Gibco) с добавлением 10% ЭТС (Gibco), 1X NEAA (Gibco), 2 мМ L-глутамина (Gibco), 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco) и 500 мкг/мл селективного антибиотика генетицина® (Gibco) и далее клетки культивировали. Затем, когда монослой клеток увеличивался до 90% или более, снова осуществляли субкультивирование. Для этого сначала удаляли имеющуюся питательную среду и чашку для культивирования клеток промывали путем добавления DPBS (фосфатно-солевого буфера Дульбекко) (Gibco) в количестве 5 мл, что составляет 50% от объема культуры. Затем удаляли DPBS, добавляли TrypLE (Gibco) в количестве 2 мл, что составляет 20% от объема культуры, и смесь подвергали реакции при 37°C в термостате с 5% CO₂ в течение 2 минут. После завершения реакции добавляли дополнительную питательную среду, а затем надосадочную жидкость удаляли центрифугированием при 800×g и 4°C в течение 2 минут. Затем, после того как клетки повторно суспендировали с использованием питательной среды, количество клеток измеряли с помощью трипанового синего (Gibco) и гематоцитометра, 2×10⁶ клеток распределяли в 100-мм чашку для культивирования клеток с 10 мл питательной среды и субкультивирование проводили каждые 3-4 дня, используя метод, описанный выше.

Пример 2. Селекция гена и конструирование кодирующей плазмиды для получения клеточных линий, чувствительных к интоксикации BoNT/A

Как показано на фиг. 1, известно, что септин-2 (SEPT2) служит для защиты BoNT/A от деградации в клетках, а тиоредоксин (TXN) служит для расщепления дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями BONT/A. Чтобы обеспечить сверхэкспрессию двух белков в клетках, по заказу OriGene Technologies, Inc. была получена плазмида pLenti-ORF (SEPTIN2: RC224864L3, TXN: RC208876L3), в которой гены, кодирующие каждый белок, были встроены в вектор pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro. Для получения септина-2 использовали аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (последовательность ДНК SEQ ID NO: 10), а для получения тиоредоксина использовали аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (последовательность ДНК SEQ ID NO: 12). Векторная карта pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro показана на фиг. 2. После того, как пробирку, содержащую лиофилизированную плазмиду pLenti-ORF, центрифугировали при 5000×g в течение 3 минут, в нее добавляли 100 мкл дистиллированной воды и полученную смесь набирали пипеткой, а затем хранили в морозильнике при температуре -20°C до использования.

Для получения бактериального штамма, трансформированного плазмидой pLenti-ORF, плазмиду размораживали при комнатной температуре и 100 мкл компетентных клеток (RBC Bioscience) размораживали при 4°C. Затем компетентные клетки обрабатывали 2 мкл размороженной плазмиды, проводили реакцию при 4°C в течение 10 минут, затем подвергали тепловому шоку при 37°C в течение 1 минуты, добавляли 700 мкл бульона LB и культивировали клетки в термостате-шейкере при 37°C в течение 15 минут. После завершения культивирования в чашку с агаром LB добавляли 20 мкл культурального раствора с добавлением 34 мкг/мл хлорамфеникола и равномерно распределяли с помощью шпателя. Чашку с агаром, обработанную бактериями, инкубировали в термостате при температуре 37°C в течение 16 часов. Затем каждую колонию, образовавшуюся на чашке с агаром, инокулировали в 1,5 мл бульона LB с добавлением хлорамфеникола и культивировали при встряхивании в термостате при 37°C в течение 16 часов. После завершения культивирования культуральный раствор центрифугировали при 13000 об/мин в течение 1 минуты для удаления надосадочной жидкости, а оставшийся осадок использовали для очистки плазмиды в соответствии с предоставленным протоколом с использованием набора для очистки плазмидной ДНК DNA-spin™ (iNtRON). Затем базовая последовательность очищенной плазмиды была проанализирована Cosmogenetech Co., Ltd. Последовательности праймеров, используемые для нуклеотидного секвенирования, приведены в таблице 1. В результате секвенирования было подтверждено, что SEPTIN2 точно соответствует регистрационному номеру NM_001008491.2 NCBI, а TXN точно соответствует NM_003329.4, и благодаря этому было подтверждено конструирование плазмиды, в которую обычно встраивают SEPTIN2 или TXN, то есть ген-мишень.

Таблица 1

Название Последовательность праймера (5' -> 3') SEQ ID NO: SEPTIN2 V2 AGAGCTCGTTTAGTGAA 1 SEPTIN2-600F GGATGAAATTGAAGAACATA 2 TXN V2 AGAGCTCGTTTAGTGAA 3

Для массового получения плазмиды pLenti-ORF 500 мкл культурального раствора штамма, трансформированного плазмидой, инокулировали в 100 мл бульона LB с добавлением 34 мкг/мл хлорамфеникола, а затем культивировали со встряхиванием при 37°C в течение 16 часов. Затем культуральный раствор переносили в центрифужный флакон объемом 500 мл (Nalgene) и центрифугировали при 6000×g и 4°C в течение 15 минут, а надосадочную жидкость удаляли. Затем плазмиду очищали из осадка с использованием набора HiSpeed Plasmid Midi (Qiagen). Очищенную плазмиду количественно определяли с помощью спектрофотометра Life Science UV/Vis DU730 (Beckman Coulter). Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2

Ген A260 A280 Отношение 260/280 Концентрация ДНК (нг/мкл) TXN 1,119 0,595 1,880 559 SEPTIN2 1,059 0,562 1,884 529

Пример 3. Получение лентивируса путем трансфекции клеточной линии 293FT

2,5×10⁶ клеток клеточной линии 293FT, которая представляет собой клеточную линию с высокой эффективностью продуцирования лентивируса, подвергнутые субкультивированию таким же образом, как в Примере 1, были распределены в 100-миллиметровой чашке для культивирования клеток. Затем под микроскопом было подтверждено, что монослой клеток достиг 40-50%. Результаты показаны на фиг. 3. Затем для трансфекции в пробирку объемом 1,5 мл добавляли 1,5 мл opti-MEM (Gibco) и 5 мкг плазмиды pLenti-ORF и перемешивали. Далее добавляли 6 мкг упаковывающей плазмиды с концентрацией 0,5 мкг/мкл (OriGene), содержащейся в дистиллированной воде, и смесь перемешивали, а затем добавляли 33 мкл TurboFectin (OriGene) с перемешиванием. После того, как перемешанному раствору давали прореагировать при комнатной температуре в течение 15 минут, чашку для культивирования клеток полностью обрабатывали перемешанным раствором и инкубировали в течение 2 дней. Затем собирали надосадочную среду, содержащий вирус, и хранили при температуре 4°C, и добавляли свежую среду, а затем клетки снова культивировали в течение 1 дня. Затем надосадочную среду снова собирали и смешивали со средой, собранной накануне, и полученную смесь фильтровали с использованием фильтра с размером пор 0,45 мкм (шприцевой фильтр, Sartorius AG) и хранили при температуре 4°C до использования.

Пример 4. Получение трансдуцированной клеточной линии с использованием лентивируса

4×10⁶ клеток клеточной линии SiMa (DSMZ, ACC164), субкультивированных таким же образом, как в Примере 1, распределяли в 60-миллиметровую чашку для культивирования клеток, в которую добавляли 4 мл культуральной среды RPMI1640 (Gibco) с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина (Gibco) и 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco), и культивировали в течение 16 часов. Затем, после удаления культурального раствора 1 мл раствора лентивируса, полученного таким же образом, как в Примере 3, и 3 мл свежей культуральной среды перемешивали и добавляли к клеткам, а также добавляли полибрен (Sigma-Aldrich) для получения конечной концентрации 8 мкг/мл и клетки культивировали. На следующий день культуральный раствор удаляли, добавляли свежую среду, а затем снова инкубировали в течение 1 дня и заменяли свежей питательной средой с добавлением 1 мкг/мл пуромицина (Sigma-Aldrich). После этого отбирали только трансдуцированные пуромицин-резистентные клетки при замене питательной среды на питательную среду, содержащую пуромицин, с интервалом в 3-4 дня. Способ получения клеточной линии, трансдуцированной с использованием лентивируса, схематично показан на фиг. 4.

Затем, чтобы разделить культивируемые клеточные линии на отдельные колонии, использовали цилиндр для клонирования (Sigma-Aldrich) для физического разделения пространства в чашке для культивирования, как показано на фиг. 5. Более конкретно, среду, используемую для культивирования, удаляли, клетки обрабатывали 3 мл DPBS и промывали, к каждой колонии прикрепляли цилиндр для клонирования и отдельно извлекали только DPBS в цилиндре. Затем каждый цилиндр для клонирования обрабатывали 50 мкл trypLE и оставляли для реакции в термостате с 5% CO₂ при 37°C в течение 3 минут. Затем пипеткой смешивали trypLE и раствор клеточной смеси и вносили в 96-луночный планшет, содержащий 150 мкл культуральной среды с добавлением 1 мкг/мл пуромицина. Затем клеточная линия была обозначена в порядке внесения. После этого клетки размножали и культивировали в соответствии с процедурой выращивания клеток.

Пример 5. Подтверждение получения трансдуцированных клеточных линий

5.1. Проверка экспрессии интродуцированного белка

Для подтверждения того, что трансдуцированная клеточная линия, полученная, как раскрыто в Примере 4, первично экспрессирует белок, использовали Вестерн-блоттинг. Более конкретно, среду из чашки для культивирования клеток диаметром 100 мм, после масштабирования и культивирования удаляли, и клетки промывали, используя 5 мл DPBS при 4°C. Затем после удаления DPBS клетки обрабатывали 200 мкл буфера для лизиса RIPA (iNtRON) с добавлением cOmplete™ и коктейля ингибиторов протеаз, не содержащего ЭДТА (Roche). Клеточный лизат переносили в пробирку объемом 1,5 мл с помощью лопатки для снятия клеток (SPL) и проводили реакцию без перемешивания при температуре 4°C в течение 20 минут. Затем, после центрифугирования при 17000 об/мин и 4°C в течение 30 минут надосадочную жидкость переносили в новую пробирку объемом 1,5 мл. Содержание белка в надосадочной жидкости определяли количественно с помощью набора для анализа белка Pierce™ BCA (Thermo Fisher), отбор проб проводили с использованием 4-кратного буфера для образцов Лэммли (Bio-Rad), а затем проводили нагревание при 100°C в течение 10 минут, чтобы приготовить образец для Вестерн-блоттинга. Затем проводили Вестерн-блоттинг с использованием 15% полиакриламидного геля. Белки в образце разделяли по размеру с помощью электрофореза и переносили на мембрану Immobilon-PPVDF (Merck) при 100 В течение 1 часа. Паттерн экспрессии белка был подтвержден окрашиванием мембраны, на которую белки были полностью перенесены, с помощью Ponceau S (Sigma-Aldrich). Затем мембрану погружали в 0,1% полисорбат 20 в PBS (PBST) и промывали 4 раза с использованием цифрового орбитального шейкера (DAIHAN Scientific) в течение 5 минут каждый раз для удаления красителя, и к ней добавляли блокирующий буфер (5% BSA PBST) и блокирование проводили при комнатной температуре в течение 1 часа с использованием цифрового орбитального шейкера. Метки Myc и DDK экспрессируются на С-конце экспрессируемого белка при экспрессии гена-мишени в векторе PLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro, то есть встроенного гена. Затем мембрану, для которой блокирование было завершено, обрабатывали первым антителом, которое специфически связывается с меткой Myc (Myc-tag, Cell Signaling Technology, 2278S, 1:1000 об./об. в 2% BSA PBST), и проводили реакцию при 4°C в течение 16 часов с использованием цифрового орбитального шейкера. Мембрану, на которой была завершена реакция, погружали в PBST, промывали 4 раза по 5 минут каждый с использованием цифрового орбитального шейкера, затем обрабатывали вторым антителом (конъюгат антитела к белкам кролика и пероксидазы хрена, Abcam, ab6721, 1:10000 об./об. в PBST) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого мембрану погружали в PBST и промывали 4 раза по 5 минут каждый раз с использованием цифрового орбитального шейкера, обрабатывали субстратом для Вестерн-блоттинга Pierce ECL (Thermo Fisher) и проводили детекцию белков с помощью ImageQuant LAS 500 (Cytiva). Результаты показаны на фиг. 6.

Как показано на фиг. 6, было подтверждено, что белок тиоредоксин или белок септин-2 экспрессировался в трансдуцированной клеточной линии SiMa. Однако в клеточной линии SEPTIN2-1 были обнаружены другие неидентифицированные полосы в дополнение к септину-2.

5.2. Подтверждение интродукции гена

Для подтверждения введения гена-мишени в трансдуцированную клеточную линию, полученную, как раскрыто в Примере 4, выделяли геномную ДНК из клеточной линии, а затем введенный ген амплифицировали с использованием ПЦР. Праймер для ПЦР был разработан для обеспечения возможности различения трансдуцированного гена и эндогенного гена с использованием последовательности 3'-конца, которую имеют только трансдуцированные гены, и затем произведен по заказу Cosmogenetech Co., Ltd. Последовательности праймеров, используемые для ПЦР, приведены в таблице 3. Как показано на фиг. 7, прямой праймер для амплификации гена TXN или SEPTIN2 был разработан для связывания с 5'-концевой последовательностью каждого гена, а обратный праймер, общий для двух генов, был разработан для связывания с последовательностью DDK-tag. Кроме того, праймеры (GH20 и GH21), способные амплифицировать ген бета-глобина, были использованы в качестве положительного контроля.

Таблица 3

Цель Название Последовательность праймера (5' -> 3') SEQ ID NO: ПЦР TXN прямой CTTTTCAGGAAGCCTTGG 4 SEPTIN2 прямой GTCTAAGCAACAGCCAAC 5 DDK обратный (общий) CTTATCGTCGTCATCCTTG 6 Положительный контроль GH20 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 7 GH21 GGAAAATAGACCAATAGGCAG 8

Для осуществления ПЦР, когда трансдуцированные клеточные линии SiMa-TXN-3, SiMa-SEPTIN2-1, SiMa-SEPTIN2-2 и SiMa-SEPTIN2-3 помещали каждую в чашку для культивирования клеток, содержащую питательную среду с добавлением 1 мкг/мл пуромицина, и монослой клеток достигал примерно 80%, геномную ДНК из каждой клеточной линии экстрагировали в соответствии с предоставленным протоколом с использованием набора для очистки геномной ДНК Wizard® (Promega), и экстрагированную геномную ДНК количественно определяли с помощью спектрофотометра Life Science UV/Vis DU730 (Beckman Coulter). Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4

Клеточная линия Отношение 260/280 Концентрация ДНК (нг/мкл) SiMa-TXN-3 1,937 1072,0 SiMa-SEPTIN2-1 1,830 887,5 SiMa-SEPTIN2-2 1,939 947,0 SiMa-SEPTIN2-3 1,916 1053,0

Затем после приготовления образца для ПЦР путем смешивания 50 нг геномной ДНК, 25 мкл 2X Platinum SuperFi PCR Master Mix и по 2,5 мкл каждого из 10 мкМ прямого и обратного праймеров и добавления дистиллированной воды до получения конечного объема в 50 мкл, проводили ПЦР. Условия проведения ПЦР приведены в таблице 5.

Таблица 5

Цикл Процедура Температура (°C) Время 1 Денатурация 95 30 секунд 30 Денатурация 95 30 секунд Отжиг 50 30 секунд Элонгация 72 1 минута 30 секунд 1 Элонгация 72 5 минут 1 Хранение 4 В течение ночи

После завершения ПЦР образец подвергали электрофорезу с использованием 1,5% (масс./об.) ДНК-агарозного геля, смешанного с 0,01 об.% EcoDye™ Nucleic Acid Staining Solution (Biofact), и набора EcoDye™ (Biofact) и Mupid-One (Advance), который представляет собой набор для электрофореза. Электрофорез проводили при 100 В в течение 35 минут и визуализировали с помощью Gel Documentation System LSG1000 (iNtRON). Результаты показаны на фиг. 8.

Как показано на фиг. 8, было подтверждено, что ген бета-глобина, соответствующий положительному контролю, и ген TXN, содержащий трансдуцированную DDK-метку, оба были успешно амплифицированы в клеточной линии SiMa-TXN-3. Кроме того, было подтверждено, что все гены SEPTIN2, включая трансдуцированную DDK-метку, были амплифицированы в каждой клеточной линии SiMa-SEPTIN2-1, SiMa-SEPTIN2-2 и SiMa-SEPTIN2-3. С помощью полученных результатов было показано успешное получение трансдуцированной клеточной линии, сверхэкспрессирующей введенный ген.

Пример 6. Оценка биологической активности BoNT/A методом сэндвич-ИФА

6.1. Приготовление лизата клеток SiMa-SEPTIN2-3, обработанных BoNT/A

Для подтверждения возможности клеточной системы использоваться для оценки биологической активности ботулинического токсина сначала был приготовлен лизат клеток, обработанных ботулиническим токсином. Для обработки клеток ботулиническим токсином клеточную линию SiMa в качестве контроля помещали в 96-луночный планшет, содержащий среду RPMI1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 мм L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в концентрации 1,2×10⁵ клеток/100 мкл/лунку, а клеточную линию SiMa-SEPTIN2-3 в качестве экспериментальной группы помещали в 96-луночный планшет, содержащий среду RPMI1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 мм L-глутамина, 1% пенициллин-стрептомицина и 1 мкг/мл пуромицина в концентрации 1,2×10⁵ клеток/100 мкл/лунку. После того, как каждую клеточную линию распределяли и культивировали в течение 2 дней, среду удаляли, клеточную линию обрабатывали 100 мкл среды для дифференцировки с добавлением среды 1X B-27™ Plus Supplemen (Gibco), 1X N-2 Supplement (Gibco), 2 мМ L-глутамина и 25 мкг/мл трисиалоганглиозида GT1B (Matreya) и культивировали в течение 2 дней для индукции дифференцировки. После 2 дней дифференцировки среду удаляли, комплекс BoNT/A последовательно разводили в 1,35 раза в RPMI1640 с добавлением 1X B-27™ Plus Supplement, 1X N-2 Supplement и 0,25% человеческого сывороточного альбумина (GC Corp.) и добавляли в каждую лунку до получения конечного объема в 100 мкл. После обработки клеток ботулиническим токсином и культивирования в течение 4 дней клетки подвергали лизису путем удаления среды и обработки каждой лунки 110 мкл буфера для лизиса, дополненного коктейлем ингибиторов протеаз (50 мМ HEPES (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 1% Triton X-100). Затем клеточный лизат переносили в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 17000 об/мин и 4°C в течение 5 минут для получения надосадочной жидкости, тем самым подготавливая клеточный лизат для использования в сэндвич-ИФА.

6.2. Определение EC₅₀ с помощью сэндвич-ИФА

Поскольку известно, что ботулинический токсин серотипа А (BoNT/A) воздействует на пресинапс нервно-мышечного соединения, вызывая расщепление ассоциированной с синаптосомой молекулы белка массой 25 кДа (SNAP-25), связанной с пресинаптической клеточной мембраной, был разработан метод сэндвич-иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием расщепленного SNAP-25 на основе этого принципа, и было получено каждое антитело, способное распознавать интактный SNAP-25. Сэндвич-ИФА схематично показан на фиг. 9.

После расщепления мышиного синаптосомного белка массой 25 кДа (SNAP-25, аминокислоты 183-197) моноклональное антитело (Mybiosource, MBS312597), представляющее собой иммобилизованное антитело, которое специфически связывается с расщепленным SNAP-25, разбавляли до концентрации 0,2 об.% с использованием 0,1 М натрий-карбонатного покрывающего буфера (рН 9,6), каждую лунку прозрачного иммунологического нестерильного 96-луночного планшета с плоским дном (Thermo Fisher) обрабатывали 100 мкл антитела и проводили реакцию без перемешивания при 4°C в течение 16 часов. После этого антитела, не связавшиеся с лунками, удаляли, и лунки трижды промывали, используя 200 мкл 0,1% полисорбата 20 в PBS (PBST). Затем каждую лунку обрабатывали 200 мкл блокирующего буфера (5% BSA PBST) и помещали в шейкер при комнатной температуре и 75 об/мин на 1 час. Через 1 час блокирующий буфер удаляли, клетки трижды промывали, используя 200 мкл PBST, добавляли 90 мкл клеточного лизата, полученного, как раскрыто в Примере 6.1, и клетки подвергали реакции в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 2 часов. Затем клеточный лизат удаляли и лунки трижды промывали 200 мкл PBST. Далее, после разведения антитела против SNAP-25 (Sigma-Aldrich, S9684), которое является детектирующим антителом, до концентрации 0,1 об.% с использованием блокирующего буфера, в каждую лунку помещали 100 мкл разведенного антитела и проводили реакцию в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 1 часа. После этого все несвязанные антитела удаляли путем трехкратной промывки с использованием 200 мкл PBST и конъюгат антитела к белкам кролика с пероксидазой хрена (Abcam, ab6721), которое является вторым антителом, разбавляли до 0,01 об.% с использованием блокирующего буфера, и в каждую лунку помещали 100 мкл раствора разведенного антитела и проводили реакцию в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 1 часа. Затем после трехкратной промывки с использованием 200 мкл PBST раствор TMB из набора субстратов для пероксидазы TMB EIA (Bio-Rad) и раствор перекиси водорода смешивали в соотношении 9:1, и в каждую лунку вносили 50 мкл смешанного раствора, а затем проводили реакцию в термостате при температуре 37°C в течение 30 минут. Затем, после внесения в каждую лунку 50 мкл 2 н серной кислоты, измеряли оптическую плотность (ОП450) при 450 нм с помощью ридера микропланшетов SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices). Кривая зависимости доза-эффект (четыре параметра) была построена на основе полученных исходных данных с использованием GraphPad Prism версии 7.00 (GraphPad Software, Inc.) и значения EC₅₀ были рассчитаны на основе результатов внутреннего теста на активность у мышей. После этого все эксперименты повторяли по меньшей мере три раза и результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Результаты показаны на фиг. 10.

Как показано на фиг. 10, было установлено, что значение EC₅₀ клеточной линии SiMa, которая является контрольной, составило 7,35 Ед/мл (0,49 пМ), а значение EC₅₀ SEPTIN2-3-трансдуцированной клеточной линии составило 5,38 Ед/мл (0,36 пМ). Таким образом, было подтверждено, что чувствительность может быть улучшена за счет сверхэкспрессии SEPTIN2.

Кроме того, чтобы более детально выявить разницу в чувствительности между клеточными линиями, сравнивали степени реакции клеточных линий на одну и ту же обработку ботулиническим токсином путем деления значения ОП450 нм для каждой группы клеточных линий SiMa на значение ОП450 нм для каждой группы клеточных линий SEPTIN2-3. Результаты показаны на фиг. 11.

Как показано на фиг. 11, было установлено, что значение ОП450_SEPTIN2/ОП450_WT в отсутствие обработки токсином равно 1, тогда как значение в присутствии обработки токсином увеличивается приблизительно до 1,7, что указывает на разницу в чувствительности к токсину между клеточными линиями. Таким образом, было подтверждено, что трансдуцированная клеточная линия, сверхэкспрессирующая ген SEPTIN2, обладает повышенной чувствительностью к ботулиническому токсину по сравнению с контролем (диким типом).

6.3. Приготовление лизата клеток SiМа-тиоредоксина, обработанных BoNT/A

Для подтверждения возможности клеточной системы использоваться для оценки биологической активности ботулинического токсина сначала был приготовлен лизат клеток, обработанных ботулиническим токсином. Для обработки клеток ботулиническим токсином клеточную линию SiMa в качестве контроля помещали в 96-луночный планшет, содержащий среду RPMI1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина, в концентрации 8×10⁴ клеток/100 мкл/лунку, а клеточную линию SiMa-TXN3 в качестве экспериментальной группы помещали в 96-луночный планшет, содержащий среду RPMI1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 1 мкг/мл пуромицина в концентрации 8×10⁴ клеток/100 мкл/лунку. После того как каждую клеточную линию распределяли и культивировали в течение 2 дней, среду удаляли, клеточную линию обрабатывали 100 мкл среды для дифференцировки с добавлением 1X B-27™ Plus Supplement (Gibco), 1X N-2 Supplement (Gibco), 2 мМ L-глутамина и 25 мкг/мл трисиалоганглиозида GT1B (Matreya) и культивировали в течение 2 дней для индукции дифференцировки. После 2 дней дифференцировки среду удаляли, готовили комплекс BoNT/A в RPMI1640 в концентрациях 0, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 и 2000 (пМ) и, наконец, в каждую лунку добавляли по 100 мкл каждого из комплексов. После обработки клеток ботулиническим токсином и культивирования в течение 4 дней клетки лизировали путем удаления среды и обработки каждой лунки 110 мкл литического буфера (50 мМ HEPES (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 1% Triton X-100) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз. Затем клеточный лизат переносили в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 17000 об/мин и 4°C в течение 5 минут для получения надосадочной жидкости, тем самым подготавливая клеточный лизат для использования в сэндвич-ИФА.

6.4. Определение EC₅₀ с помощью сэндвич-ИФА

Чувствительность трансдуцированной клеточной линии, сверхэкспрессирующей ген TXN, к ботулиническому токсину была подтверждена с использованием клеточного лизата из Примера 6.3 таким же образом, как и в Примере 6.2. Результаты показаны на фиг. 12.

Данные, приведенные на фиг. 12, подтверждают, что трансдуцированная клеточная линия, сверхэкспрессирующая ген тиоредоксина, обладает повышенной чувствительностью к ботулиническому токсину по сравнению с контролем (диким типом).

Пример 7. Оценка биологической активности фармацевтической композиции BoNT/A (активный фармацевтический ингредиент)

Для подтверждения возможности клеточной системы для оценки биологической активности ботулинического токсина также использоваться и применительно к фармацевтической композиции ботулинического токсина (активному фармацевтическому ингредиенту), был проведен сэндвич-ИФА с применением клеточной линии SiMa-SEPTIN2-3. Более конкретно, клеточную линию SiMa-SEPTIN2-3 помещали в 96-луночный планшет, содержащий среду RPM1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 1 мкг/мл пуромицина, в концентрации 1,2×10⁵ клеток/100 мкл/лунку. Затем, после культивирования клеточной линии в течение 2 дней среду удаляли, клеточную линию обрабатывали 100 мкл среды для дифференцировки с добавлением 1X B-27™ Plus Supplement, 1X N-2 Supplement, 2 мМ L-глутамина и 25 мкг/мл трисиалоганглиозида GT1B и культивировали в течение 2 дней для индукции дифференцировки. После 2 дней дифференцировки среду удаляли, комплекс BoNT/A (комплекс ATGC-100 ботулинического токсина, который является активным фармацевтическим ингредиентом, из которого удаляли другие вещества, такие как раствор консерванта) последовательно разбавляли в 1,55 раза в RPMI1640 с добавлением 1X B-27™ Plus Supplement и 1X N-2 Supplement, и клетки обрабатывали комплексом в различных концентрациях. После обработки клеток ботулиническим токсином и культивирования в течение 4 дней клетки лизировали путем удаления среды и обработки каждой лунки 110 мкл буфера для лизиса (50 мМ HEPES (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 1% Triton X-100) с добавлением коктейля из ингибиторов протеаз. Затем клеточный лизат переносили в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 17000 об/мин и 4°C в течение 5 минут для получения надосадочной жидкости, тем самым подготавливая клеточный лизат для использования в сэндвич-ИФА.

Затем, после расщепления мышиного синаптосомного белка массой 25 кДа (SNAP-25, аминокислоты 183-197) моноклональное антитело (Mybiosource), которое представляет собой антитело захвата, специфически связывающееся с расщепленным SNAP-25, разбавляли до концентрации 0,8 об.% с использованием 0,1 М натрий-карбонатного покрывающего буфера (рН 9,6), каждую лунку прозрачного иммунологического нестерильного 96-луночного планшета с плоским дном (Thermo Fisher) обрабатывали 100 мкл антитела и проводили реакцию без перемешивания при 4°C в течение 16 часов. После этого антитела, не связанные с лунками, удаляли и лунки трижды промывали, используя 200 мкл 0,1% полисорбата 20 в PBS (PBST). Затем каждую лунку обрабатывали 200 мкл блокирующего буфера (5% BSA PBST) и помещали в шейкер при комнатной температуре и 75 об/мин на 2 часа. Через 2 часа блокирующий буфер удаляли, добавляли 90 мкл полученного клеточного лизата и смесь подвергали реакции в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 2 часов. После этого клеточный лизат удаляли, и клетки трижды промывали 200 мкл PBST. Затем, после разведения антитела против SNAP-25 (Sigma-Aldrich, S9684), которое является проявляющим антителом, до концентрации 0,1 об.% с использованием блокирующего буфера, в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенного антитела и проводили реакцию в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 1 часа. После этого все несвязанные антитела удаляли путем трехкратной промывки с использованием 200 мкл PBST, конъюгат антитела к белкам кролика и пероксидазы хрена (Abcam, ab6721), который является вторым антителом, разбавляли до 0,01 об.% с использованием блокирующего буфера, в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора разведенного антитела и проводили реакцию в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 1 часа. Затем, после того как лунки были трижды промыты с использованием 200 мкл PBST, в каждую лунку вносили 100 мкл раствора TMB (ThermoFisher, 34028), а затем проводили реакцию при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем, после внесения в каждую лунку 100 мкл 2 н серной кислоты, измеряли поглощение (ОП450) при 450 нм с помощью ридера микропланшетов SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices). Кривая зависимости доза-эффект (четыре параметра) была построена на основе полученных исходных данных с использованием GraphPad Prism версии 7.00 (GraphPad Software, Inc.) и значения EC₅₀ были рассчитаны на основе результатов внутреннего теста на активность у мышей. Результаты показаны на фиг. 13.

Как показано на фиг. 13, было подтверждено, что степень расщепления SNAP-25 увеличивается в зависимости от дозы ботулинического токсина. Также было подтверждено, что значение EC₅₀ составило 16,98 ЕД/мл.

Пример 8. Оценка биологической активности фармацевтической композиции BoNT/A (готовая лекарственная форма)

Для подтверждения возможности клеточной системы для оценки биологической активности ботулинического токсина также использоваться и применительно к фармацевтической композиции ботулинического токсина (готовой лекарственной форме), был проведен сэндвич-ИФА с использованием клеточной линии SiMa-SEPTIN2-3. Более конкретно, клеточную линию SiMa-SEPTIN2-3 помещали в 96-луночный планшет, содержащий среду RPM1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 1 мкг/мл пуромицина в концентрации 1,2×10⁵ клеток/100 мкл/лунку. Затем, после культивирования клеточной линии в течение 2 дней, среду удаляли, клеточную линию обрабатывали 100 мкл среды для дифференцировки с добавлением 1X B-27™ Plus, 1X N-2, 2 мМ L-глутамина и 25 мкг/мл трисиалоганглиозида GT1B и культивировали в течение 2 дней для индукции дифференцировки. После 2 дней дифференцировки среду удаляли, готовую лекарственную форму BoNT/A (ATGC-100) последовательно разводили в 1,4 раза в RPMI1640 с добавлением 1X B-27™ Plus и 1X добавки N-2 и клетки обрабатывали BoNT/A в различных концентрациях. После обработки клеток ботулиническим токсином и культивирования в течение 4 дней клетки лизировали путем удаления среды и обработки каждой лунки 110 мкл буфера для лизиса (50 мм HEPES (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 1% Triton X-100) с добавлением коктейля из ингибиторов протеаз. Затем клеточный лизат переносили в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 17000 об/мин и 4°C в течение 5 минут для получения надосадочной жидкости, тем самым подготавливая клеточный лизат для использования в сэндвич-ИФА.

Затем, после расщепления мышиного синаптосомного белка массой 25 кДа (SNAP-25, аминокислоты 183-197) моноклональное антитело (Mybiosource), которое представляет собой антитело захвата, специфически связывающееся с расщепленным SNAP-25, разбавляли до концентрации 0,8 об.% с использованием 0,1 М натрий-карбонатного покрывающего буфера (рН 9,6), каждую лунку прозрачного иммунологического нестерильного 96-луночного планшета с плоским дном (Thermo Fisher) обрабатывали 100 мкл разведенного антитела и проводили реакцию без перемешивания при 4°C в течение 16 часов. После этого антитела, не связанные с лунками, удаляли, и лунки трижды промывали, используя 200 мкл 0,1% полисорбата 20 в PBS (PBST). Затем каждую лунку обрабатывали 200 мкл блокирующего буфера (5% BSA PBST) и помещали в шейкер при комнатной температуре и 75 об/мин на 2 часа. Через 2 часа блокирующий буфер удаляли, добавляли 90 мкл полученного клеточного лизата и смесь подвергали реакции в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 2 часов. Затем клеточный лизат удаляли и клетки трижды промывали 200 мкл PBST. Затем, после разведения антитела против SNAP-25 (Sigma-Aldrich, S9684), которое является проявляющим антителом, до концентрации 0,1 об.% с использованием блокирующего буфера, в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенного антитела и проводили реакцию в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 1 часа. После этого все несвязанные антитела удаляли путем трехкратной промывки с использованием 200 мкл PBST, конъюгат антитела к белкам кролика с пероксидазой хрена (Abcam, ab6721), который является вторым антителом, разбавляли до 0,01 об.% с использованием блокирующего буфера, в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора разведенного антитела и проводили реакцию в шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин в течение 1 часа. Затем, после того как лунки были трижды промыты с использованием 200 мкл PBST, в каждую лунку вносили 100 мкл раствора TMB (ThermoFisher, 34028), а затем проводили реакцию при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем после внесения в каждую лунку 100 мкл 2 н. серной кислоты измеряли оптическую плотность (ОП450) при 450 нм с помощью ридера микропланшетов SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices). Кривая зависимости доза-эффект (четыре параметра) была построена на основе полученных исходных данных с использованием GraphPad Prism версии 7.00 (GraphPad Software, Inc.) и значения EC₅₀ были рассчитаны на основе результатов внутреннего теста на активность у мышей. Результаты показаны на фиг. 14.

Как показано на фиг. 14, было подтверждено, что степень расщепления SNAP-25 увеличивается в зависимости от дозы ботулинического токсина. Также было подтверждено, что значение EC₅₀ составило 5,42 ЕД/мл.

Приведенные выше результаты, как представлено на фиг. 15, подтверждают, что при использовании клеточной линии, сверхэкспрессирующей ген SEPTIN2 или TXN, с использованием лентивируса по настоящему изобретению, активность не только ботулинического токсина, но также фармацевтической композиции ботулинического токсина, то есть активного фармацевтического ингредиента и готовой лекарственной формы, может быть легко измерена на клеточной основе, и чувствительность клеточной системы может быть значительно улучшена. Следовательно, ожидается, что клеточная линия по настоящему изобретению может быть применена в различных областях промышленности, где используется ботулинический токсин.

Приведенное выше описание настоящего изобретения предназначено для иллюстрации и специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение, поймут, что настоящее изобретение может быть легко модифицировано в другие конкретные формы без изменения технической сущности или существенных признаков настоящего изобретения. Следовательно, нужно понимать, что вышеописанные варианты осуществления являются только примерными во всех аспектах и не являются ограничивающими.

Промышленная применимость

Поскольку клетки для измерения активности ботулотоксина по настоящему изобретению обладают значительно улучшенной чувствительностью к ботулиническому токсину, они могут широко использоваться в различных областях промышленности для измерения активности ботулинического токсина, а также фармацевтической композиции ботулинического токсина (активного фармацевтического ингредиента или готовой лекарственной формы), заменяя многочисленные эксперименты на животных.

--->

Перечень последовательностей

<110> ATGC CO., LTD.

<120> Cells sensitive to botulinum toxin via lentivirus-mediated

genomic integration

<130> MPCT22-024

<150> KR 10-2021-0066040

<151> 2021-05-24

<150> KR 10-2022-0063008

<151> 2022-05-23

<160> 12

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEPTIN2 V2

<400> 1

agagctcgtt tagtgaa 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEPTIN2-600F

<400> 2

ggatgaaatt gaagaacata 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TXN V2

<400> 3

agagctcgtt tagtgaa 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TXN forward

<400> 4

cttttcagga agccttgg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEPTIN2 forward

<400> 5

gtctaagcaa cagccaac 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DDK reverse

<400> 6

cttatcgtcg tcatccttg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GH20

<400> 7

gaagagccaa ggacaggtac 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GH21

<400> 8

ggaaaataga ccaataggca g 21

<210> 9

<211> 361

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Met Ser Lys Gln Gln Pro Thr Gln Phe Ile Asn Pro Glu Thr Pro Gly

1 5 10 15

Tyr Val Gly Phe Ala Asn Leu Pro Asn Gln Val His Arg Lys Ser Val

20 25 30

Lys Lys Gly Phe Glu Phe Thr Leu Met Val Val Gly Glu Ser Gly Leu

35 40 45

Gly Lys Ser Thr Leu Ile Asn Ser Leu Phe Leu Thr Asp Leu Tyr Pro

50 55 60

Glu Arg Val Ile Pro Gly Ala Ala Glu Lys Ile Glu Arg Thr Val Gln

65 70 75 80

Ile Glu Ala Ser Thr Val Glu Ile Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Arg

85 90 95

Leu Thr Val Val Asp Thr Pro Gly Tyr Gly Asp Ala Ile Asn Cys Arg

100 105 110

Asp Cys Phe Lys Thr Ile Ile Ser Tyr Ile Asp Glu Gln Phe Glu Arg

115 120 125

Tyr Leu His Asp Glu Ser Gly Leu Asn Arg Arg His Ile Ile Asp Asn

130 135 140

Arg Val His Cys Cys Phe Tyr Phe Ile Ser Pro Phe Gly His Gly Leu

145 150 155 160

Lys Pro Leu Asp Val Ala Phe Met Lys Ala Ile His Asn Lys Val Asn

165 170 175

Ile Val Pro Val Ile Ala Lys Ala Asp Thr Leu Thr Leu Lys Glu Arg

180 185 190

Glu Arg Leu Lys Lys Arg Ile Leu Asp Glu Ile Glu Glu His Asn Ile

195 200 205

Lys Ile Tyr His Leu Pro Asp Ala Glu Ser Asp Glu Asp Glu Asp Phe

210 215 220

Lys Glu Gln Thr Arg Leu Leu Lys Ala Ser Ile Pro Phe Ser Val Val

225 230 235 240

Gly Ser Asn Gln Leu Ile Glu Ala Lys Gly Lys Lys Val Arg Gly Arg

245 250 255

Leu Tyr Pro Trp Gly Val Val Glu Val Glu Asn Pro Glu His Asn Asp

260 265 270

Phe Leu Lys Leu Arg Thr Met Leu Ile Thr His Met Gln Asp Leu Gln

275 280 285

Glu Val Thr Gln Asp Leu His Tyr Glu Asn Phe Arg Ser Glu Arg Leu

290 295 300

Lys Arg Gly Gly Arg Lys Val Glu Asn Glu Asp Met Asn Lys Asp Gln

305 310 315 320

Ile Leu Leu Glu Lys Glu Ala Glu Leu Arg Arg Met Gln Glu Met Ile

325 330 335

Ala Arg Met Gln Ala Gln Met Gln Met Gln Met Gln Gly Gly Asp Gly

340 345 350

Asp Gly Gly Ala Leu Gly His His Val

355 360

<210> 10

<211> 8138

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEPTIN2 expression construct sequence

<400> 10

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat cgcgttgaca 240

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020

cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080

gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140

tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200

gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260

attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320

gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380

aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440

aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500

aagtaagacc accgcacagc aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat 1560

atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta 1620

ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga 1680

ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca 1740

atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat 1800

ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag 1860

cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg 1920

atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg 1980

agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa 2040

attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa 2100

aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac 2160

ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt 2220

ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca 2280

ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa 2340

gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atcggcactg 2400

cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg 2460

gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac 2520

taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag 2580

cagagatcca gtttggttag taccgggccc gctctagaca tgtccaatat gaccgccatg 2640

ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 2700

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 2760

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 2820

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 2880

tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 2940

ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 3000

attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata 3060

gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 3120

ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca 3180

aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 3240

tcagaatttt gtaatacgac tcactatagg gcggccggga attcgtcgac tggatccggt 3300

accgaggaga tctgccgccg cgatcgccat gtctaagcaa cagccaactc agtttataaa 3360

tccagaaaca cctggctatg ttggatttgc aaacctcccc aatcaagttc accgaaaatc 3420

agtgaaaaaa ggttttgagt tcacactgat ggtggtcggt gaatcaggtc taggaaaatc 3480

gactctcata aacagcctat tcctaactga tctgtaccca gaaagagtca tacctggagc 3540

agcagaaaaa attgaaagaa ctgtccagat tgaggcttca actgttgaaa ttgaagagcg 3600

aggggtcaag ctacgcctga cagtggtaga tacccctggc tatggtgacg ctatcaactg 3660

cagagattgt tttaagacaa ttatctccta tattgatgag caatttgaga ggtacctgca 3720

tgacgagagc ggcttgaaca ggcggcacat cattgataat agggtgcatt gttgctttta 3780

ctttatttca ccttttggac atggacttaa gcccttagat gtggcgttta tgaaggcaat 3840

acacaacaag gtgaatattg tgcctgtcat tgcaaaagct gacactctca ccctgaagga 3900

acgggagcgg ctgaagaaaa ggattctgga tgaaattgaa gaacataaca tcaaaatcta 3960

tcacttacct gatgcagaat cagatgaaga tgaagatttt aaagagcaga ctagacttct 4020

caaggctagc atcccattct ctgtggttgg atccaatcag ttgattgaag ccaaaggaaa 4080

gaaggtcaga ggccgcctct acccctgggg tgttgtggaa gtggagaacc cagagcacaa 4140

tgactttctg aagctgagaa ccatgctcat cacccacatg caggatctcc aggaggtgac 4200

ccaggacctt cattatgaaa acttccgttc tgagagactc aagagaggcg gcaggaaagt 4260

ggagaatgag gacatgaata aagaccagat cttgctggaa aaagaagctg agctccgccg 4320

catgcaagag atgattgcaa ggatgcaggc gcagatgcag atgcagatgc agggcgggga 4380

tggcgatggc ggggctctcg ggcaccacgt gacgcgtacg cggccgctcg agcagaaact 4440

catctcagaa gaggatctgg cagcaaatga tatcctggat tacaaggatg acgacgataa 4500

ggtttgggta ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga 4560

ggagaaccct ggacctatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga 4620

cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca 4680

caccgtcgat ccggatcgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac 4740

gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt 4800

ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat 4860

ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc 4920

gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca 4980

gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg 5040

ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg 5100

cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg 5160

caagcccggt gcctgatgta cacccaaacg gccggccgcg gtctgtacaa gtaggattcg 5220

tcgagggacc taataacttc gtatagcata cattatacga agttatacat gtttaagggt 5280

tccggttcca ctaggtacaa ttcgatatca agcttatcga taatcaacct ctggattaca 5340

aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 5400

acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 5460

ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 5520

gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 5580

cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 5640

tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 5700

tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 5760

ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt 5820

cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga 5880

gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atcgataccg tcgacctcga tcgagaccta 5940

gaaaaacatg gagcaatcac aagtagcaat acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg 6000

ctagaagcac aagaggagga ggaggtgggt tttccagtca cacctcaggt acctttaaga 6060

ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg 6120

gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatatccttg atctgtggat ctaccacaca 6180

caaggctact tccctgattg gcagaactac acaccagggc cagggatcag atatccactg 6240

acctttggat ggtgctacaa gctagtacca gttgagcaag agaaggtaga agaagccaat 6300

gaaggagaga acacccgctt gttacaccct gtgagcctgc atgggatgga tgacccggag 6360

agagaagtat tagagtggag gtttgacagc cgcctagcat ttcatcacat ggcccgagag 6420

ctgcatccgg actgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 6480

ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 6540

gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 6600

gtgtggaaaa tctctagcag catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 6660

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 6720

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 6780

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 6840

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 6900

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 6960

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 7020

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 7080

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 7140

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 7200

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 7260

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 7320

tcacgttaag ggattttggt catgattacg ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt 7380

gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa 7440

tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg 7500

gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg 7560

gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt 7620

caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt 7680

attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt 7740

gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacggaac tccggatgag 7800

cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct 7860

ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt ctggttatag gtacattgag 7920

caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg 7980

tatatccagt gatttttttc tccatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 8040

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 8100

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgac 8138

<210> 11

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp

1 5 10 15

Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys

35 40 45

Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp

50 55 60

Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe

65 70 75 80

Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

85 90 95

Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val

100 105

<210> 12

<211> 7370

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Thioredoxin expression construct sequence

<400> 12

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat cgcgttgaca 240

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020

cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080

gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140

tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200

gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260

attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320

gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380

aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440

aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500

aagtaagacc accgcacagc aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat 1560

atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta 1620

ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga 1680

ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca 1740

atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat 1800

ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag 1860

cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg 1920

atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg 1980

agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa 2040

attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa 2100

aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac 2160

ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt 2220

ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca 2280

ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa 2340

gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atcggcactg 2400

cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg 2460

gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac 2520

taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag 2580

cagagatcca gtttggttag taccgggccc gctctagaca tgtccaatat gaccgccatg 2640

ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 2700

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 2760

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 2820

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 2880

tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 2940

ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 3000

attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata 3060

gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 3120

ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca 3180

aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 3240

tcagaatttt gtaatacgac tcactatagg gcggccggga attcgtcgac tggatccggt 3300

accgaggaga tctgccgccg cgatcgccat ggtgaagcag atcgagagca agactgcttt 3360

tcaggaagcc ttggacgctg caggtgataa acttgtagta gttgacttct cagccacgtg 3420

gtgtgggcct tgcaaaatga tcaagccttt ctttcattcc ctctctgaaa agtattccaa 3480

cgtgatattc cttgaagtag atgtggatga ctgtcaggat gttgcttcag agtgtgaagt 3540

caaatgcatg ccaacattcc agttttttaa gaagggacaa aaggtgggtg aattttctgg 3600

agccaataag gaaaagcttg aagccaccat taatgaatta gtcacgcgta cgcggccgct 3660

cgagcagaaa ctcatctcag aagaggatct ggcagcaaat gatatcctgg attacaagga 3720

tgacgacgat aaggtttggg taggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc 3780

tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc 3840

cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc 3900

cgccacgcgc cacaccgtcg atccggatcg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga 3960

actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc 4020

cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat 4080

cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg 4140

cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc 4200

gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc 4260

cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta 4320

cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg 4380

gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgatg tacacccaaa cggccggccg cggtctgtac 4440

aagtaggatt cgtcgaggga cctaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac 4500

atgtttaagg gttccggttc cactaggtac aattcgatat caagcttatc gataatcaac 4560

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 4620

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 4680

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 4740

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 4800

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 4860

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 4920

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 4980

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 5040

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 5100

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgacctc 5160

gatcgagacc tagaaaaaca tggagcaatc acaagtagca atacagcagc taccaatgct 5220

gattgtgcct ggctagaagc acaagaggag gaggaggtgg gttttccagt cacacctcag 5280

gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa 5340

aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg 5400

atctaccaca cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccagggatc 5460

agatatccac tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagca agagaaggta 5520

gaagaagcca atgaaggaga gaacacccgc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg 5580

gatgacccgg agagagaagt attagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac 5640

atggcccgag agctgcatcc ggactgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc 5700

tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga 5760

gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga 5820

cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agcatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 5880

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 5940

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 6000

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 6060

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 6120

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 6180

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 6240

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 6300

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 6360

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 6420

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 6480

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 6540

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgatta cgccccgccc tgccactcat 6600

cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca caaacggcat 6660

gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 6720

tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 6780

aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 6840

aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 6900

aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 6960

tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga 7020

actccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 7080

gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat 7140

aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata 7200

tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatact cttccttttt caatattatt 7260

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 7320

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 7370

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клетке для измерения активности ботулинического токсина, сверхэкспрессирующей SEPTIN2 или тиоредоксин (TXN). Также раскрыты способ измерения эндопептидазной активности ботулинического токсина с использованием указанной клетки и набор для измерения активности ботулинического токсина, содержащий указанную клетку. Изобретение эффективно для измерения активности ботулинического токсина посредством определения степени расщепления SNAP-25. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 15 ил., 5 табл., 8 пр.

1. Клетка для измерения активности ботулинического токсина, сверхэкспрессирующая септин-2 или тиоредоксин (TXN), отличающаяся тем, что ген SEPTIN2 или TXN трансдуцирован и сверхэкспрессируется, причем клетка представляет собой любую клетку, выбранную из группы, состоящей из клеток SiMa, клеток LAN-2, клеток PC12, клеток Neuro-2a, клеток LA1-55n, клеток N18, клеток SH-SY5Y, клеток Келли, клеток NB69, клеток N1E-115, клеток BE(2)-M17 и клеток SK-N-BE(2).

2. Клетка по п. 1, которая обладает повышенной чувствительностью к интоксикации ботулиническим токсином по сравнению с клеткой дикого типа.

3. Клетка по п. 1, где ботулинический токсин представляет собой любой, выбранный из группы, состоящей из серотипов ботулинического токсина A, B, C, D, E, F и G.

4. Способ измерения эндопептидазной активности ботулинического токсина посредством определения степени расщепления SNAP-25, включающий следующие стадии:

(а) обработку клетки по любому из пп. 1-3 ботулиническим токсином и культивирование клетки;

(b) лизис культивируемой клетки и сбор клеточного лизата и

(c) измерение количества продукта расщепления SNAP-25 в клеточном лизате.

5. Способ по п. 4, в котором количество продукта расщепления SNAP-25 измеряют с использованием сэндвич-иммуноанализа (ИФА) или Вестерн-блоттинга.

6. Набор для измерения активности ботулинического токсина, отличающийся тем, что набор содержит клетку по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента.