ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка содержит объект изобретения, который частично относится к предварительной заявке США № 61/546028, поданной 11 октября 2011 года, предварительной заявке США № 61/323708, поданной 13 апреля 2010 года; международной заявке № PCT/US2011/032184, поданной 12 апреля 2011 года; международной заявке № PCT/US2011/032188, поданной 12 апреля 2011 года; и PCT заявке № PCT/US2008/012398, поданной 10 октября 2008 года и опубликованной в виде международной публикации № WO 2009/058379 A2. Каждая из вышеуказанных заявок включена в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Данная заявка включает посредством ссылки перечень последовательностей, поданный с заявкой с помощью EFS-Web в виде текста, представленного под названием ”CD40L-101WO1_SL.txt”, созданного 3 октября 2012 года и имеющего размер 232 килобайта.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

[0003] Настоящее изобретение в целом относится к области миметиков антител, а именно к каркасным структурам, происходящим из третьего домена фибронектина типа III тенасцина С человека, пригодным, например, для создания продуктов, обладающих новыми характеристиками связывания. В частности, настоящее изобретение относится к CD40L-специфичным Tn3-каркасным структурам, способам получения подобных каркасных структур и способам применения для диагностики и лечения системной красной волчанки и других аутоиммунных и/или воспалительных нарушений.

Уровень техники

[0004] Настоящее изобретение относится к CD40L-специфичным белковым каркасным структурам, которые связываются с CD40L, пригодным, например, для лечения аутоиммунных и/или воспалительных нарушений.

[0005] Биомолекулы, способные к специфическому связыванию с желаемым целевым эпитопом, имеют большое значение в качестве терапевтических средств, научно-исследовательских и медицинских диагностических средств. Хорошо известным примером данного класса молекул является антитело. Антитела можно выбрать таким образом, чтобы они специфически связывались и являлись аффинными к практически любому структурному эпитопу. Однако, природные антитела представляют собой гетеротетрамерные, сложные по своей структуре молекулы, которые с трудом экспрессируются в простых эукариотических системах. В результате большинство антител получают с использованием сложных и дорогостоящих экспрессирующих систем на основе клеток млекопитающих.

[0006] Белки, имеющие относительно определенные трехмерные структуры, обычно называемые белковыми каркасными структурами, можно использовать в качестве реагентов для создания сконструированных продуктов. Одной специфической сферой, в которой используют подобные каркасные структуры, является область создания миметиков антител. Миметики антител, т.е., малые, не являющиеся антителами белковые терапевтические средства, обладающие преимуществами антител и фрагментов антител, такими как высокая аффинность связывания с мишенями и низкие иммуногенность и токсичность, избегают при этом некоторых недостатков, таких как склонность фрагментов антител к агрегации и меньшая стабильность, чем у полноразмерных IgG.

[0007] Данные недостатки можно устранить путем использования фрагментов антител, созданных путем удаления частей в нативной структуре антитела. Однако, это часто вызывает агрегацию, если аминокислотные остатки, которые в норме погружены в гидрофобное окружение, такое как граница раздела между вариабельным и константным доменом, подвергаются воздействию растворителя. Один пример миметика антитела на основе каркасной структуры основан на структуре домена фибронектина типа III (FnIII), домена, который широко распространен среди типов и классов белков, таких как белки крови млекопитающих и структурные белки. Конструирование и применение каркасных структур FnIII, полученных из третьего домена FnIII человеческого тенасцина C, описано в PCT заявках PCT/US2011/032184 и PCT/US2011/032188, обе из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

[0008] CD40L является представителем семейства молекул TNF, которые первично экспрессируются на активированных T-клетках (в том числе подтипах Th0, Th1 и Th2), и образуют гомотримеры, сходные с другими представителями данного семейства. Кроме того, обнаружили, что CD40L экспрессируется на Mast-клетках и активированных базофилах и эозинофилах. CD40L связывается с рецептором CD40 (CD40R) на антиген-презентирующих клетках (APC), что приводит к различным эффектам в зависимости от типа клетки-мишени. В целом, CD40L играет роль в качестве костимулирующей молекулы и индуцирует активацию APC в ассоциации со стимуляцией T-клеточного рецептора молекулами MHC на APC.

[0009] Передача сигнала посредством рецептора CD40 с помощью CD40L запускает каскад реакций, что приводит в результате к активации клеток, несущих рецептор CD40, и оптимальному примированию CD4+ T-клеток. Более конкретно, когнатное взаимодействие между CD40L и рецептором CD40 стимулирует дифференциацию B-клеток в антитело-секретирующие клетки и В-клетки памяти (Burkly, In Adv. Exp. Med. Bio., Vol. 489., D. M. Monroe, U. Hedner, M. R. Hoffman, C. Negrier, G. F. Savidge, and G. C. I. White, eds. Klower Academic/Plenum Publishers, 2001, p. 135). Дополнительно, взаимодействие между CD40L и рецептором CD40 стимулирует клеточно-опосредованный иммунитет посредством активации макрофагов и дендритных клеток и образования естественных клеток-киллеров, а также цитотоксических Т-лимфоцитов (смотри Burkly выше).

[0010] Было показано, что взаимодействие между CD40L и рецептором CD40 играет важную роль в нескольких экспериментально индуцированных аутоиммунных заболеваниях, таких как коллаген-индуцированный артрит, экспериментальный аллергический энцефаломиелит, оофорит, колит, медикаментозный волчаночный нефрит. В частности, было показано, что индукцию заболевания во всех из этих моделей можно блокировать CD40L-антагонистами во время введения антигена. Прекращение развития заболевания с использованием антитела, являющегося антагонистом к CD40L, также было показано в моделях спонтанного аутоиммунного заболевания на животных, включая формы инсулинозависимого диабета и волчаночный нефрит, а также заболевание "трансплантат против хозяина", трансплантацию, фиброз легких и модели заболевания атеросклерозом.

[0011] Было показано, что нарушение каскада реакций CD40L/CD40R посредством блокирования CD40L является благоприятным при многих аутоиммунно-опосредованных заболеваниях (например, но без ограничения, системная красная волчанка (SLE), ревматоидный артрит (RA), рассеянный склероз (MS), воспалительные заболевания кишечника (IBD) и отторжение аллотрансплантата. Например, лечение антителами к CD40L обеспечивает предупреждение или улучшение течения нефрита в мышиной модели коллаген-индуцированного артрита (Mohan et al. J. Immuno. 154:1470). Кроме того, антитела к CD40L обеспечивают сохранение почечной функции у мышей SNF1 с тяжелым нефритом. (Kalled et al. J. Immuno. 160:2158). Уровни CD40L тесно коррелируют с клинической тяжестью заболевания (т.е., уменьшение воспаления), и повреждением ткани-мишени как у субъектов, не относящихся к людям, так и у людей.

[0012] SLE представляет собой прогрессирующее и в ряде случаев приводящее к смерти заболевание. Различные проявления волчанки варьируют от сыпи и артрита вплоть до анемии и тромбоцитопении и даже психоза. Существует явное свидетельство, демонстрирующее, что многие механизмы иммунной системы вовлечены в воспалительный процесс, приводящий к заболеваниям почек, кожи, головного мозга и тромбозу. Одним характерным признаком SLE является утрата В-клеточной толерантности и выраженность наличия аутоантител у пациентов с этим заболеванием. При волчаночном заболевании почек аутоантитела к двухцепочечной ДНК могут образовывать комплексы антитело-нуклеосома и осаждаться на почечной клубочковой базальной мембране. Данные иммунные комплексы, в свою очередь, активируют комплемент, что может привести к гломерулонефриту.

[0013] Как было выявлено, у пациентов с SLE повышена экспрессия CD40R, а также CD40L. Усиленный костимулирующий сигнал, вероятно, способствует патологическому воспалительному ответу, выявляемому при SLE. T-клетки при SLE характеризуются спонтанным повышением активации, связанным с пониженным порогом активации на аутоантигены. Кроме того, эти клетки имеют пониженную чувствительность к дополнительной антигенной стимуляции, устойчивы к апоптозу, характеризуются увеличенной продолжительностью существования после активации и имеют множество измененных внутриклеточных сигнальных путей. После активации CD40R на APC T-клеточными CD40L, как APC, так и T-клетки становятся активными, продуцируют цитокины и при SLE способствуют продуцированию патогенных аутоантител и повреждению ткани (волчаночный нефрит). Блокирование сигнального пути CD40R/CD40L отдельно или в комбинации является эффективным при прекращении развития заболевания у предрасположенных к волчанке мышей. У пациентов с SLE гуманизированное антитело к CD40L приводило к уменьшению количества антител к двухцепочечной ДНК и В-клеток, протеинурии и облегчало тяжесть заболевания при SLE.

[0014] Однако, нацеленное воздействие на CD40L естественными антителами существенно повышало факторы опасности. Например, исследование с использованием антитела к CD40L 5c8 (BIOGEN®) у пациентов, страдающих от хронической резистентной идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) были приостановлены по причине зарегистрированных тромбоэмболических осложнений (Davidson et al. Arth Rheu, 43:S271). Кроме того, дополнительные испытания с использованием альтернативных антител, направленных против CD40L, привели к другим связанным с тромбозом осложнениям (Davis et al. Arth Rheu, 43:S281; Schuler, Transplantation, 77:717). С учетом трудностей, связанных с антагонизмом по отношению к CD40L, направляемым антителом, существует неудовлетворенная потребность в нацеленном воздействии и антагонизме по отношению к CD40L при помощи альтернативного средства, не являющегося антителом. Таким образом, направленное воздействие на CD40L при помощи каркасной структуры на основе Tn3 представляет собой эффективную альтернативу с предотвращением Fab2 и/или Fc-опосредованной агрегации тромбоцитов и последующих побочных эффектов.

[0015] Цитирование или обсуждение ссылки в данном документе не следует истолковывать как допущение того, что таковая относится к предшествующему уровню техники для настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0016] Настоящее изобретение предлагает Tn3-каркасную структуру, содержащую CD40L-специфичные мономерные субъединицы, где мономерная субъединица содержит семь бета-цепей, обозначенных A, B, C, D, E, F и G, и шесть петлевых участков, обозначенных AB, BC, CD, DE, EF и FG, и где Tn3-каркасная структура специфически связывается с CD40L. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, соединенные в тандем. В некоторых конкретных вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, которые соединены непосредственно.

[0017] В некоторых вариантах осуществления две CD40L-специфичные мономерные субъединицы соединены линкером. В других вариантах осуществления линкер содержит пептидный линкер, который может представлять собой гибкий пептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит последовательность (G_mX)_n, где X представляет собой серин (S), аланин (A), глицин (G), лейцин (L), изолейцин (I) или валин (V); m и n представляют собой целые значения; m равно 1, 2, 3 или 4; и n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143.

[0018] В некоторых вариантах осуществления связывание Tn3-каркасной структуры, содержащей две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, с CD40L улучшено по сравнению с Tn3-каркасной структурой, содержащей одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу. В других вариантах осуществления связывание Tn3-каркасной структуры, содержащей две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, с CD40L обеспечивает улучшение воздействия на мишень по сравнению с Tn3-каркасной структурой, содержащей одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу. В других вариантах осуществления улучшение связывания Tn3-каркасной структуры с CD40L представляет собой улучшение аффинности связывания, улучшение авидности связывания, или и то и другое. В конкретных вариантах осуществления аффиность связывания Tn3-каркасной структуры, содержащей две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, с CD40L и стабильность белка Tn3-каркасной структуры улучшены по сравнению с Tn3-каркасной структурой, содержащей одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу. В некоторых вариантах осуществления авидность связывания Tn3-каркасной структуры, содержащей две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, по отношению к CD40L и стабильность белка Tn3-каркасной структуры улучшены по сравнению с Tn3-каркасной структурой, содержащей одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу.

[0019] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна CD40L-специфичная мономерная субъединица в Tn3-каркасной структуре связана с линкером или гетерологичным фрагментом. В других вариантах осуществления линкер или гетерологичный фрагмент в Tn3-каркасной структуре конъюгирован с N-концом или C-концом CD40L-специфичной мономерной субъединицы. В конкретных вариантах осуществления линкер, связанный с CD40L-специфичной мономерной субъединицей в Tn3-каркасной структуре, содержит пептидный линкер, который в некоторых вариантах осуществления может представлять собой гибкий пептидный линкер. Данный пептидный линкер в определенных вариантах осуществления может содержать последовательность (G_mX)_n, где X представляет собой серин (S), аланин (A), глицин (G), лейцин (L), изолейцин (I) или валин (V); m и n представляют собой целые числа; m равно 1, 2, 3 или 4; и n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер, связанный с CD40L-специфичной мономерной субъединицей в Tn3-каркасной структуре, содержит SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143.

[0020] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит линкер, который содержит фунциональную группу. В некоторых вариантах осуществления данная функциональная группа представляет собой иммуноглобулин или его фрагмент. В конкретных вариантах осуществления данный иммуноглобулин или его фрагмент содержит Fc-домен. В некоторых вариантах осуществления данный Fc-домен не индуцирует по меньшей мере одну FcγR-опосредованную эффекторную функцию. В некоторых вариантах осуществления данная по меньшей мере одна FcγR-опосредованная эффекторная функция представляет собой ADCC.

[0021] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит по меньшей мере одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу, связанную с гетерологичным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления данный гетерологичный фрагмент содержит структуру, выбранную из группы, состоящей из следующего: белок, пептид, белковый домен, линкер, лекарственное средство, токсин, цитотоксическое средство, радиофармацевтическое средство, радионуклид, радиоактивное соединение, органический полимер, неорганический полимер, полиэтиленгликоль (PEG), биотин, альбумин, человеческий сывороточный альбумин (HSA), участок, отвечающий за связывание HSA c FcRn, антитело, домен антитела, фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, антитело на основе домена, альбумин-связывающий домен, фермент, лиганд, рецептор, связывающий пептид, каркасная структура, отличающаяся от FnIII, эпитопная метка, рекомбинантный полипептидный полимер, цитокин и комбинация двух или более из указанных фрагментов.

[0022] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит по меньшей мере одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу, конъюгированную с PEG. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит по меньшей мере одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу, конъюгированную с альбумином. В конкретных вариантах осуществления данный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA). В других вариантах осуществления данный HSA представляет собой вариант HSA. В некоторых конкретных вариантах осуществления аминокислотная последовательность варианта HSA представляет собой SEQ ID NO: 133. В других вариантах осуществления вариант HSA имеет по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с нативным HSA или фрагментом нативного HSA. В конкретных вариантах осуществления улучшенное свойство представляет собой измененное время полужизни в плазме по сравнению с временем полужизни в плазме нативного HSA или фрагмента нативного HSA. В некоторых вариантах осуществления измененное время полужизни в плазме представляет собой более длительное время полужизни в плазме по сравнению с временем полужизни в плазме нативного HSA или фрагмента нативного HSA. В других вариантах осуществления измененное время полужизни в плазме представляет собой более короткое время полужизни в плазме по сравнению с времененем полужизни в плазме нативного HSA или фрагмента нативного HSA.

[0023] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура является слитой с вариантом HSA, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную замену в домене III HSA. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура является слитой с вариантом HSA, содержащим последовательность полноразмерного зрелого HSA (SEQ ID NO: 133 или 138) или ее фрагмент, за исключением по меньшей мере одной аминокислотной замены, пронумерованной относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, в положении, выбранном из группы, состоящей из 407, 415, 463, 500, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 и 580; где по меньшей мере одна аминокислотная замена не включает замену лизина (K) на глутаминовую кислоту (E) в положении 573, и где Tn3-каркасная структура имеет время полужизни в плазме больше, чем время полужизни в плазме Tn3-каркасной структуры, которая не является конъюгированной с таким вариантом HSA.

[0024] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура является слитой с вариантом HSA, где по меньшей мере одна аминокислотная замена, пронумерованная относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, находится в положении, выбранном из группы, состоящей из 463, 508, 523 и 524, где указанная Tn3-каркасная структура имеет более длительное время полужизни в плазме, чем время полужизни в плазме Tn3-каркасной структуры, которая не является конъюгированной с указанным вариантом HSA. В некоторых вариантах осуществления вариант HSA, содержит последовательность полноразмерного зрелого HSA (SEQ ID NO: 133 или 138) или ее фрагмент, за исключением по меньшей мере одной аминокислотной замены, пронумерованной относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, выбранной из группы, состоящей из: (a) замены лейцина (L) в положении 407 на аспарагин (N) или тирозин (Y); (b) замены валина (V) в положении 415 на треонин (T); (c) замены лейцина (L) в положении 463 на аспарагин (N); (d) замены лизина (K) в положении 500 на аргинин (R); (e) замены треонина (T) в положении 506 на тирозин (Y); (f) замены треонина (T) в положении 508 на аргинин (R); (g) замены фенилаланина (F) в положении 509 на метионин (M) или триптофан (W); (h) замены аланина (A) в положении 511 на фенилаланин (F); (i) замены аспарагиновой кислоты (D) в положении 512 на тирозин (Y); (j) замены треонина (T) в положении 515 на глутамин (Q); (k) замены лейцина (L) в положении 516 на треонин (T) или триптофан (W); (l) замены аргинина (R) в положении 521 на триптофан (W); (m) замены изолейцина (I) в положении 523 на аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (E), глицин (G), лизин (K) или аргинин (R); (n) замены лизина (K) в положении 524 на лейцин (L); (o) замены глутамина (Q) в положении 526 на метионин (M); (p) замены гистидина (H) в положении 535 на пролин (P); (q) замены аспарагиновой кислоты (D) в положении 550 на глутаминовую кислоту (E); (r) замены лизина (K) в положении 557 на глицин (G); (s) замены лизина (K) в положении 573 на фенилаланин (F), гистидин (H), пролин (P), триптофан (W) или тирозин (Y); (t) замены лизина (K) в положении 574 на аспарагин (N); (u) замены глутамина (Q) в положении 580 на лизин (K) и (v) комбинации из двух или более указанных замен, где указанная Tn3-каркасная структура имеет более длительное время полужизни в плазме, чем время полужизни Tn3-каркасной структуры, которая не является конъюгированной с указанным вариантом HSA.

[0025] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура является слитой с вариантом HSA, содержащим последовательность полноразмерного зрелого HSA (SEQ ID NO: 133 или 138) или ее фрагмент, за исключением по меньшей мере одной аминокислотной замены, пронумерованной относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, выбранной из группы, состоящей из: (a) замены лейцина (L) в положении 463 на аспарагин (N); (b) замены треонина (T) в положении 508 на аргинин (R); (c) замены изолейцина (I) в положении 523 на аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (E), глицин (G), лизин (K) или аргинин (R); (d) замены лизина (K) в положении 524 на лейцин (L) и (e) комбинации из двух или более указанных замен, где указанная Tn3-каркасная структура имеет более длительное время полужизни в плазме, чем время полужизни в плазме Tn3-каркасной структуры, которая не является конъюгированной с указанным вариантом HSA.

[0026] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит по меньшей мере две идентичные CD40L-специфичные мономерные субъединицы. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит по меньшей мере две различные CD40L-специфичные мономерные субъединицы. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура представляет собой агонист рецептора CD40L. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура представляет собой антагонист рецептора CD40.

[0027] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит по меньшей мере две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, которые специфически связываются с одним и тем же эпитопом CD40L. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит по меньшей мере две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, которые специфически связываются с различными эпитопами CD40L. В некоторых вариантах осуществления данные различные эпитопы CD40L представляют собой неперекрывающиеся эпитопы. В других вариантах осуществления данные различные эпитопы CD40L представляют собой перекрывающиеся эпитопы.

[0028] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура связывается по меньшей мере с двумя молекулами CD40L. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая связывается по меньшей мере c двумя молекулами CD40L.

[0029] В некоторых вариантах осуществления бета-цепи по меньшей мере одной CD40L-специфичной мономерной субъединицы из Tn3-каркасной структуры имеют по меньшей мере 90% идентичность последовательности с бета-цепями с SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую бета-цепь A, которая содержит SEQ ID NO: 11, или содержащую бета-цепь A, которая содержит SEQ ID NO: 11, за исключением по меньшей мере одной мутации. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую бета-цепь B, которая содержит SEQ ID NO: 12, или содержащую бета-цепь B, которая содержит SEQ ID NO: 12, за исключением по меньшей мере одной мутации. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую бета-цепь C, которая содержит SEQ ID NO: 13 или 14, или содержащую бета-цепь С, которая содержит SEQ ID NO: 13 или 14, за исключением по меньшей мере одной мутации, и где цистеин в SEQ ID NO: 13 или 14 не заменен. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую бета-цепь D, которая содержит SEQ ID NO: 15, или содержащую бета-цепь D, которая содержит SEQ ID NO: 15, за исключением по меньшей мере одной мутации.

[0030] В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую бета-цепь E, которая содержит SEQ ID NO: 16, или содержащую бета-цепь E, которая содержит SEQ ID NO: 16, за исключением по меньшей мере одной мутации. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую бета-цепь F, которая содержит SEQ ID NO: 17, или содержащую бета-цепь F, которая содержит SEQ ID NO: 17, за исключением по меньшей мере одной мутации, и где цистеин в SEQ ID NO: 17 не заменен. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую бета-цепь G, которая содержит SEQ ID NO: 18, или содержащую бета-цепь G, которая содержит SEQ ID NO: 18, за исключением по меньшей мере одной мутации.

[0031] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая содержит аминокислотную последовательность:

IEV(X_AB)_nALITW(X_BC)_nCELX₁YGI(X_CD)_nTTIDL(X_DE)_nYSI(X_EF)_nYEVSLIC(X_FG)_nKETFTT,

где X_AB, X_BC, X_CD, X_DE, X_EF и X_FG представляют собой аминокислотные остатки, присутствующие в последовательностях петель AB, BC, CD, DE, EF и FG, соответственно; X₁ представляет собой аминокислотный остаток A или T; и длина петли n представляет собой целое число от 2 до 26.

[0032] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 136, последовательность петли CD содержит SEQ ID NO: 6, и последовательность петли EF содержит SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 137. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли BC содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 и 168. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли DE содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97, 98 и 169. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли FG содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 99, 139 и 170.

[0033] В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли BC содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 и 174. В определенных вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли DE содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 и 175. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли FG содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 129, 130 и 177. В определенных вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли АВ содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и 136.

[0034] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 99. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 84, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139.

[0035] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 85, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 86, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 96 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 87, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 97 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139.

[0036] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 88, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 89, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 90, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139.

[0037] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 91, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 92, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 98, последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 93, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139.

[0038] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 100, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 101, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 119 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 102, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 120 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 103, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли АВ содержит SEQ ID NO: 136.

[0039] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 104, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 122 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 105, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 106, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли АВ содержит SEQ ID NO: 136.

[0040] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 107, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 109, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 110, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли АВ содержит SEQ ID NO: 136.

[0041] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 111, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 130. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 112, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 124 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 113, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 125 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли АВ содержит SEQ ID NO: 136.

[0042] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 114, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 115, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 126 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 116, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 127 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 117, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 128 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где последовательность петли АВ содержит SEQ ID NO: 136.

[0043] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 и 146. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая содержит аминокислотную последовательность:

где (a) X₁ представляет собой аминокислотный остаток серин (S) или лейцин (L); (b) X₂ представляет собой аминокислотный остаток аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (E); (c) X₃ представляет собой аминокислотный остаток гистидин (H), изолейцин (I), валин (V), фенилаланин (F) или триптофан (W); (d) X₄ представляет собой аминокислотный остаток аланин (A), глицин (G), глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D); (e) X₅ представляет собой аминокислотный остаток глутаминовую кислоту (E), лейцин (L), глутамин (Q), серин (S), аспарагиновую кислоту (D) или аспарагин (N); (f) X₆ представляет собой аминокислотный остаток фенилаланин (F) или тирозин (Y); (g) X₇ представляет собой аминокислотный остаток изолейцин (I), валин (V), гистидин (H), глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D); (h) X₈ представляет собой аминокислотный остаток глицин (G), триптофан (W) или валин (V); (i) X₉ представляет собой аминокислотный остаток триптофан (W), фенилаланин (F) или тирозин (Y); (j) X₁₀ представляет собой аминокислотный остаток серин (S), глутамин (Q), метионин (M) или гистидин (H); (k) X₁₁ представляет собой аминокислотный остаток триптофан (W) или гистидин (H) и (l) X₁₂ представляет собой аминокислотный остаток аргинин (R) или серин (S).

[0044] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 и 82.

[0045] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая содержит аминокислотную последовательность:

где

(a) X₁ представляет собой аминокислотный остаток лизин (K) или глутаминовую кислоту (E);

(b) X₂представляет собой аминокислотный остаток треонин (T) или изолейцин (I);

(c) X₃представляет собой аминокислотный остаток аспарагин (N) или аланин (A);

(d) X₄представляет собой аминокислотный остаток серин (S), лейцин (L), аланин (A), фенилаланин (F) или тирозин (Y);

(e) X₅представляет собой аминокислотный остаток тирозин (Y), аланин (A), глицин (G), валин (V), изолейцин (I) или серин (S);

(f) X₆представляет собой аминокислотный остаток тирозин (Y), серин (S), аланин (A) или гистидин (H);

(g) X₇представляет собой аминокислотный остаток аспарагин (N), аспарагиновую кислоту (D), гистидин (H) или тирозин (Y);

(h) X₈представляет собой аминокислотный остаток лейцин (L), фенилаланин (F), гистидин (H) или тирозин (Y);

(i) X₉представляет собой аминокислотный остаток гистидин (H), пролин (P), серин (S), лейцин (L) или аспарагиновую кислоту (D);

(j) X₁₀представляет собой аминокислотный остаток глицин (G), фенилаланин (F), гистидин (H) или тирозин (Y);

(k) X₁₁представляет собой аминокислотный остаток аланин (A) или треонин (T);

(l) X₁₂представляет собой аминокислотный остаток серин (S), аспарагин (N), глутаминовую кислоту (E), аспарагин (R) или аспарагиновую кислоту (D);

(m) X₁₃представляет собой аминокислотный остаток серин (S), глутамин (Q), треонин (T), аспарагин (N) или аланин (A);

(n) X₁₄представляет собой аминокислотный остаток пролин (P), валин (V), изолейцин (I) или аланин (A) или не является аминокислотой;

(o) X₁₅представляет собой аминокислотный остаток изолейцин (I) или не является аминокислотой;

(p) X₁₆представляет собой аминокислотный остаток глутаминовую кислоту (E) или лизин (K); и

(q) X₁₇представляет собой аминокислотный остаток серин (S) или аспарагин (N).

[0046] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 134, 135, 205, 206, 207 и 208. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 134, 135, 205, 206, 207 и 208.

[0047] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 201, 202, 203 и 204. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 201, 202, 203 и 204. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где указанная специфичность по отношению к CD40L относится к CD40L человека. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где указанная специфичность по отношению к CD40L относится к мембраносвязанному CD40L (SEQ ID NO: 1), растворимому CD40L (SEQ ID NO: 2) или его фрагменту. В некоторых конкретных вариантах осуществления Tn3-каркасная структура связывается с CD40L и предупреждает связывание CD40L с CD40.

[0048] Настоящее изобретение также предлагает способ изменения активности в клетке, экспрессирующей CD40L, включающий приведение в контакт клетки с Tn3-каркасной структурой, где Tn3-каркасная структура связывается с CD40L и предупреждает связывание CD40L с CD40. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура связывается с CD40L с аффинностью (K_d) приблизительно 1 мкМ или менее, или приблизительно 500 нМ или менее, или приблизительно 100 нМ или менее, или приблизительно 50 нМ или менее, или приблизительно 25 нМ или менее, или приблизительно 10 нМ или менее, или приблизительно 5 нМ или менее, или приблизительно 2 нМ или менее.

[0049] В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая специфично связывается с эпитопом CD40L, содержащим аминокислоты, расположенные в положениях 142-155, 200-230 или 247-251 в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая взаимодействует с аминокислотами CD40L E142, Y146, M148, N151, L155, R200, R203 и E230. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая взаимодействует с аминокислотами CD40L R203, I204, V247, H249 и T251. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичная мономерную субъединицу, которая взаимодействует с аминокислотами CD40L E142, Y146, M148, N151, L155, которые расположены в первой молекуле CD40L, и с аминокислотами CD40L R200, R203 и E230, которые расположены во второй молекуле CD40L. В других вариантах осуществления Tn3-каркасная структура содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, которая взаимодействует с аминокислотами CD40L R203 и I204, которые расположены в первой молекуле CD40L, и с аминокислотами CD40L V247, H249 и T251, которые расположены во второй молекуле CD40L.

[0050] Настоящее изобретение также предлагает полипептиды, содержащие один или несколько CD40L-специфичных Tn3-мономеров, включая, но без ограничения, слияния сывороточного альбумина, описанные в данном документе.

[0051] Настоящее изобретение также предлагает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CD40L-специфичную Tn3-каркасную структуру, вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CD40L-специфичную Tn3-каркасную структуру, и клетку-хозяина, содержащую такой вектор. Настоящее изобретение также предлагает способ получения Tn3-каркасной структуры, включающий культивирование клетки-хозяина в условиях, при которых экспрессируется CD40L-специфичная Tn3-каркасная структура, кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты.

[0052] Настоящее изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую CD40L-специфичную Tn3-каркасную структуру и фармацевтически приемлемый наполнитель. Настоящее изобретение также предлагает способ предупреждения, лечения, уменьшения интенсивности, управления течением аутоиммунного заболевания у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей CD40L-специфичную Tn3-каркасную структуру.

[0053] Настоящее изобретение также предлагает способ снижения частоты или количества кортикостеридов, вводимых пациенту с аутоиммунным заболеванием, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей CD40L-специфичную Tn3-каркасную структуру.

[0054] Аутоиммунным заболеванием, которое подлежит лечению путем введения CD40L-специфичной Tn3-каркасной структуры, может быть очаговая алопеция, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, синдром Шегрена, псориаз, атеросклероз, диабетическая и другие ретинопатии, ретролентальная фиброплазия, возрастная макулярная дегенерация, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, тиреоидные гиперплазии (в том числе болезнь Грейвса), трансплантация ткани роговицы и другой ткани, а также хроническое воспаление, сепсис, ревматоидный артрит, перитонит, болезнь Крона, реперфузионное повреждение, септицемия, эндотоксический шок, муковисцидоз, эндокардит, псориаз, артрит (например, псориатический артрит), анафилактический шок, ишемия органа, реперфузионное повреждение, повреждение спинного мозга и отторжение аллотрансплантата, аутоиммунная тромбоцитопения, болезнь Бехчета, булезный пемфигоид, кардиомиопатия, дерматит, связанный с целиакией спру, синдром хронический усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, синдром Черджа-Стросса, рубцовый пемфигоид, CREST-синдром, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, дискоидная волчанка, идиопатическая криоглобулинемия смешанного типа, фибромиалгия-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический фиброз легких, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP), IgA-нейропатия, болезнь Стилла, красный плоский лишай, красная волчанка, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет 1 типа или иммуноопосредованный, миастения, вульгарный пемфигус, пернициозная анемия, нодозный полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит, первичная агаммаглобулинемия, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, болезнь Рейно, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, системная красная волчанка, красная волчанка, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулит, такой как герпетиформный дерматит, витилиго и гранулематоз Вегенера.

[0055] В некоторых конкретных вариантах осуществления аутоиммунное заболевание, которое подлежит лечению путем введения CD40L-специфичной Tn3-каркасной структуры, представляет собой системную красную волчанку (SLE).

[0056] Кроме того, способы лечения с помощью CD40L-специфичной Tn3-каркасной структуры могут предусматривать дополнительную терапию, такую как иммунотерапия, биологическая терапия, химиотерапия, лучевая терапия или терапия с помощью низкомолекулярного лекарственного средства.

[0057] Настоящее изобретение также предлагает белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 20, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P2₁2₁2₁-орторомбической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=85,69 Å, b=90,64 Å, c=95,56 Å. В некоторых вариантах осуществления асимметрическая единица кристалла включает тример CD40L и три молекулы Tn3-каркасной структуры. В других вариантах осуществления кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 3,2 Å или менее.

[0058] Настоящее изобретение также предлагает белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 68, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P2₁3-кубической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=b=c=97,62 Å. В некоторых вариантах осуществления асимметрическая единица кристалла содержит одну молекулу CD40L и одну молекулу Tn3-каркасной структуры. В других вариантах осуществления кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 2,7 Å или менее.

[0059] Настоящее изобретение также предлагает белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 28 или 146, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P321-пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=95,53 Å, b=93,53 Å, c=66,69 Å. В некоторых вариантах осуществления асимметрическая единица кристалла содержит одну молекулу CD40L и одну молекулу Tn3-каркасной структуры. В других вариантах осуществления кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 2,8 Å или менее.

[0060] Настоящее изобретение также предлагает белковый кристалл, содержащий две различные Tn3-каркасные структуры, состоящие из SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 28 или 146, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P2₁-кубической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=80,32 Å, b=143,48 Å, c=111,27 Å, β=98,22 Å. В некоторых вариантах осуществления асимметрическая единица кристалла содержит два тримера CD40L и шесть молекул каждой Tn3-каркасной структуры. В других вариантах осуществления кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 1,9 Å или менее.

[0061] В некоторых вариантах осуществления белковый кристалл получают с использованием диффузии паров в сидячей капле. Настоящее изобретение также предлагает способ получения белкового кристалла, предусматривающий: (a) смешивание объема раствора, содержащего Tn3-каркасную структуру, которая содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, в комплексе с CD40L, с объемом резервуарного раствора, содержащего осаждающее средство; и (b) инкубирование смеси, полученной на этапе (a) в закрытом контейнере в пригодных для кристаллизации условиях до образования белкового кристалла. В некоторых вариантах осуществления способ получения белкового кристалла предусматривает применение диффузии паров в сидячей капле.

[0062] В некоторых вариантах осуществления способ создания белкового кристалла применяют для получения кристаллов, содержащих CD40L-специфичные Tn3-мономерные субъединицы с SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 146.

[0063] Настоящее изобретение также предлагает машиночитаемый накопитель данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машиночитаемыми командами для: (a) преобразования данных в графическое трехмерное изображение структуры части белкового кристалла Tn3-каркасной структуры, содержащей CD40L-специфичную мономерную субъединицу, образующую комплекс с CD40L; и (b) обеспечения отображения указанного графического трехмерного изображения. В некоторых вариантах осуществления такая Tn3-каркасная структура содержит SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 146. В других вариантах осуществления такой белковый кристалл представляет собой

[0064] (a) белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 20, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P2₁2₁2₁-орторомбической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=85,69 Å, b=90,64 Å, c=95,56 Å;

[0065] (b) белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 68, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P2₁3-кубической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=b=c=97,62 Å; или

[0066] (c) белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 20, и Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 68, где обе Tn3-каркасные структуры находятся в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2);

[0067] (d) белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 28 или 146, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P321-пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=95,53 Å, b=93,53 Å, c=66,69 Å;

[0068] (е) белковый кристалл, содержащий две различные Tn3-каркасные структуры, состоящие из SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 28 или 146, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P2₁-кубической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=80,32 Å, b=143,48 Å, c=111,27 Å, β=98,22 Å.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0069] С целью иллюстрации настоящего изобретения в графических материалах изображены определенные варианты осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничено точными структурами и средствами из вариантов осуществления, изображенных на графических материалах.

[0070] На Фиг. 1A показано ингибирование экспрессии CD86, которая индуцирована мышиным CD40L (MuCD40L), измеренное с помощью анализа D10G4.1/PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови). Анализировали мышиную CD40L-специфичную Tn3-каркасную структуру M13, ее вариант M31 с оптимизированной аффинностью (приблизительно 20x улучшение аффинности), моноклональное антитело MR1 к CD40L, а также негативный контроль. Также показаны значения IC₅₀.

[0071] На Фиг. 1B показано ингибирование CD40L в анализе с мышиным NfkB. В данном анализе используют NIHT3T-клетки, экспрессирующие мышиный CD40R и содержащие репортерный конструкт NfkB-люцифераза. Добавление CD40L приводит к возникновению сигнала (измеряется по люциферазной активности), который ингибируется как антителом MR1 к CD40L, так и CD40L-специфичной Tn3-каркасной структурой M31.

[0072] На Фиг. 2A показано конструирование конструктов слияния CD40L-специфичных тандемных бивалентных Tn3-каркасных структур и сывороточного альбумина (SA).

[0073] На Фиг. 2B показано анализ в SDS-PAGE очищенного моновалентного конструкта M13 (CD40L-специфичный Tn3-конструкт) или тандемных бивалентных каркасных структур с линкерами, содержащими 1, 3, 5 или 7 звеньев Gly₄Ser (обозначены как GS), соединяющими две мономерные субъединицы Tn3 M13. Моновалентный конструкт M13 разгоняли на дорожке 2, димерный конструкт с 1 звеном GS (C1) разгоняли на дорожках 3 и 7, димерный конструкт с 3 звеньями GS (C2) разгоняли на дорожках 4 и 8, димерный конструкт с 5 звеньями GS (C3) разгоняли на дорожках 5 и 9, а димерный конструкт с 7 звеньями GS (C4) разгоняли на дорожках 6 и 10. Образцы разгоняли либо при невосстанавливающих условиях (дорожки 2-6), либо при восстанавливающих условиях (дорожки 7-10).

[0074] На Фиг. 2C показано конкурентное ингибирование связывания мышиного CD40L с мышиным рецептором CD40, иммобилизированном на биосенсорном чипе, под воздействием мышиных CD40L-специфичных моновалентных (M13) или бивалентных тандемных каркасных структур (M13-xGS-M13, где x составляет 1, 3, 5 или 7, соответствующих бивалентным каркасным структурам с линкерами, содержащими 1, 3, 5 или 7 звеньев Gly₄Ser). Также указана полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) для различных конструктов.

[0075] На Фиг. 2D показан ингибирующий эффект мышиных CD40L-специфичных Tn3 моновалентных (M13) и бивалентных тандемных каркасных структур на экспрессию CD86, которая индуцирована мышиными CD40L, в В-клетках. Приведены значения IC₅₀ для всех Tn3-конструктов и для антитела MR1 к мышиному CD40L.

[0076] На Фиг. 3A показаны высокие уровни экспрессии мышиной CD40L-специфичной тандемной бивалентной Tn3-каркасной структуры, слитой с мышиным сывороточным альбумином (MSA), в клетках HEK 293. Данные конструкты имеют 1 (G₄S) повтор в линкере между звеньями Tn3-каркасной структуры и 3 (G₄S) повторами в линкере между Tn3-каркасной структурой и MSA. Кроме того, данный конструкт содержит мутацию N49Q в каждой из каркасных структур M13 и M31 для удаления потенциального сайта N-связанного гликозилирования. 10 мкл культурального супернатанта, отобранного 3 или 6 дней спустя после трансфекции, разгоняли в геле в SDS-PAGE параллельно с известными количествами очищенного белка. Уровень экспрессии оценивали до 200 мг/л на 6 день после после трансфекции. Очистку осуществляли с помощью IMAC с использованием C-концевой His-метки.

[0077] На Фиг. 3B показано ингибирование экспрессии CD86, которая индуцирована мышиным CD40L (MuCD40L), измеренное с помощью клеточного анализа D10G4.1/PBMC. Анализировали CD40L-специфичную тандемную бивалентную Tn3-каркасную структуру (M13-1GS-M13), такой же конструкт, слитый с мышиным сывороточным альбумином (MSA) (M13-1GS-M13-MSA), а также моноклональное антитело MR1 к мышиному CD40L. Для всех конструктов приведены значения IC₅₀.

[0078] На Фиг. 3C показано ингибирование экспрессии CD86, которая индуцирована мышиным CD40L (MuCD40L), измеренное с помощью анализа D10G4.1/PBMC. Анализировали CD40L-специфичную тандемную бивалентную Tn3-каркасную структуру (M13-1GS-M13), слитую с мышиным сывороточным альбумином (MSA)(M13-1GS-M13-MSA), вариант каркасной структуры с созревшей аффинностью M13, конъюгированный с MSA (M31Mono-MSA), тандемная бивалентная каркасная структура, содержащая вариант M31 с оптимизированной аффинностью, конъюгированный с MSA (M31-1GS-M31-MSA), тандемную бивалентную каркасную структуру в качестве негативного контроля, которая не связывается с мышиным CD40L (D1-1GS-D1-MSA), а также моноклональное антитело MR1. Также приведены значения IC₅₀.

[0079] На Фиг. 4A показаны фармакокинетические данные по отношению к нескольким мышиным CD40L-специфичных конструктам у мышей, определенные с помощью ELISA. Для каждого конструкта указаны значения полужизни в плазме (t_1/2).

[0080] На Фиг. 4B показаны фармакокинетические данные для 342-HSA, специфичного по отношению к CD40L человека, и варианта 342-HSA, содержащего замену Leu в положении 463 на Asn (L463N) и замену Lys в положении 524 на Leu (K524L), у яванского макака, определенные с помощью ELISA.

[0081] На Фиг. 5A показано созревание B-клеток в зародышевых центрах (GC) в анализе после иммунизации бараньими эритроцитами (SRBC). Анализировали моноклональное антитело MR1 к CD40L.

[0082] На Фиг. 5B показано созревание B-клеток в зародышевых центрах (GC) в анализе после иммунизации бараньими эритроцитами (SRBC). Анализировали моновалентный и бивалентный конструкты, полученные из M31, слитые с MSA. В качестве негативного контроля использовали бивалентный конструкт D1-D1, конъюгированный с MSA.

[0083] На Фиг. 5C показано созревание B-клеток на периферии (не в GC) в анализе после иммунизации бараньими эритроцитами (SRBC). Анализировали моновалентный и бивалентный конструкты, полученные из M31, слитые с MSA. В качестве негативного контроля использовали бивалентный конструкт D1-D1, конъюгированный с MSA.

[0084] На Фиг. 5D показан процент (% CD4) и число (#CD4) CD4-положительных клеток в анализе после иммунизации бараньими эритроцитами (SRBC). Анализировали моновалентный и бивалентный конструкты, полученные из M31, слитые с MSA, а также моноклональные антитела MR1 к CD40L. В качестве негативного контроля использовали бивалентный конструкт D1-D1, конъюгированный с MSA.

[0085] На Фиг. 5E показан процент (% CD44hi) и число (#CD44hi) CD44hi-положительных клеток в анализе после иммунизации бараньими эритроцитами (SRBC). Анализировали моновалентный и бивалентный конструкты, полученные из M31, слитые с MSA, а также моноклональные антитела MR1 к CD40L. В качестве негативного контроля использовали бивалентный конструкт D1-D1, конъюгированный с MSA.

[0086] На Фиг. 5F показано количество IgG к SRBC в анализе после иммунизации бараньими эритроцитами (SRBC). Анализировали моновалентный и бивалентный конструкты, полученные из M31, слитые с MSA. В качестве негативного контроля использовали бивалентный конструкт D1-D1, конъюгированный с MSA.

[0087] На Фиг. 5G показаны титры IgM к KLH в модели KLH-специфичного T-клеточно-зависимого гуморального иммунного ответа (TDAR). Анализировали моновалентный и бивалентный конструкты, полученные из 342, слитые с HSA.

[0088] На Фиг. 5H показаны титры IgG к KLH в модели KLH-специфичного T-клеточно-зависимого гуморального иммунного ответа (TDAR). Анализировали моновалентный и бивалентный конструкты, полученные из 342, слитые с HSA.

[0089] На Фиг. 6A показан ингибирующий эффект моновалентных мономерных Tn3-каркасных структур 309 и 311, специфичных по отношению к CD40L человека, на экспрессию CD86 человека, которая индуцирована CD40L, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1.

[0090] На Фиг. 6B показан ингибирующий эффект моновалентных мономерных Tn3-каркасных структур 309 и 311, специфичных по отношению к CD40L человека, на пролиферацию В-клеток, стимулированную CD40L человека.

[0091] На Фиг. 6C показан ингибирующий эффект моновалентных мономерных Tn3-каркасных структур 309 и 311, специфичных по отношению к CD40L человека, на количество плазматических клеток при совместном культивировании T/B-клеток. Также с помощью FACS было показано, что Tn3-каркасная структура 309 связывается с активированными первичными T-клетками (данные не показаны). Каркасную структуру D1 ("Neg Tn3") использовали в качестве контроля. Также в качестве контролей использовали два моноклональных антитела к CD40L, обозначенных aCD40L(RE) и aCD40L(Bio) (моноклональное антитело Biogen 5c8 к CD40L человека).

[0092] На Фиг. 7A показано, что моновалентные Tn3-каркасные структуры 309 и 311, специфичные по отношению к CD40L человека, имеют сходные биофизические характеристики. Обе каркасные структуры являются монодисперсными, как определено с помощью SEC.

[0093] На Фиг. 7B показано, что моновалентные Tn3-каркасные структуры 309 и 311, специфичные по отношению к CD40L человека, имеют сходные биофизические характеристики. Обе каркасные структуры характеризуются сходной термостабильностью, так как исходная Tn3-каркасная структура (обозначена Tn3 (дикий тип) на графическом изображении), как измерено при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC).

[0094] На Фиг. 8A показано ингибирование экспрессии CD86, которая индуцирована CD40L человека, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1. Анализировали моновалентные (311) и бивалентные (311_3GS и 311_7GS) Tn3-каркасные структуры, специфичные по отношению к CD40L человека. Показаны значения IC₅₀ для каждого конструкта.

[0095] На Фиг. 8B показано ингибирование экспрессии CD86, которая индуцирована CD40L человека, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1. Анализировали моновалентные (309) и бивалентные (309_3GS и 309_7GS) Tn3-каркасные структуры, специфичные по отношению к CD40L человека, также как моноклональное антитело Biogen 5c8 к CD40L человека. Показаны значения IC₅₀ для каждого конструкта и антитела.

[0096] На Фиг. 9A показано конструирование типичной тандемной бивалентной Tn3-каркасной структуры, специфичной по отношению к CD40L человека, слитой с человеческим сывороточным альбумином (HSA). “GGGGG” (SEQ ID NO: 148) и “GGGGA” (SEQ ID NO: 149) представляют собой линкеры, альтернативные по отношению к линкерам "GGGGS" (SEQ ID NO: 147).

[0097] На Фиг. 9B показана тестовая очистка из 293F-клеток на колонке IEX. Плечевая фракция (<10% основного пика) содержит O-гликозилированный белок, соединенный с остатками серина, присутствующими в линкерах.

[0098] На Фиг. 9С показано ингибирование экспрессии CD86, которая индуцирована CD40L человека, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1. Анализировали бивалентную Tn3-каркасную структуру (309), специфичную по отношению к CD40L человека, такую же каркасную структуру, слитую с HSA, а также моноклональное антитело Biogen 5c8 к CD40L человека.

[0099] На Фиг. 9D показано ингибирование экспрессии CD86, которая индуцирована CD40L человека, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1. Тестировали три бивалентные (309) Tn3-каркасные структуры, специфичные по отношению к CD40L человека. Три (G₄S) повтора присутствовали в линкере между субъединицами, специфичными по отношению к CD40L человека (309 в данном примере), тогда как линкер между субъединицами 309 и HSA варьировал от 1 до 3 (G₄S) повторов. Также анализировали моноклональное антитело Biogen 5c8 к CD40L человека.

[0100] На Фиг. 10A показано влияние мутации в петлевых последовательностях в 309 (левая панель) и 311 (правая панель) на связывание CD40L. На связывание указывает усиление сигнала в анализе связывания. WT представляет собой вариант с первоначальной лидерной последовательностью (исходной Tn3-последовательностью), где BC, DE и FG означает варианты, в которых петлевую последовательность BC, DE или FG изменяли к исходной Tn3-последовательности, как представлено в тенасцине C человека.

[0101] На Фиг. 10B показаны профили ингибирования панели каркасных структур с оптимизированной аффинностью, определенные по экспрессии CD86, которая индуцирована CD40L человека, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1. Мономеры из клона 309 Tn3, специфичного по отношению к CD40L человека, были оптимизированы по аффинности. Оптимизированные по аффинности мономеры обозначены как клон 340 - клон 349. В конструкте клон 309wtFG целая петля FG была заменена на петлю FG исходной Tn3-каркасной структуры. Также анализировали моноклональное антитело 5c8 к CD40L.

[0102] На Фиг. 10С показаны профили ингибирования, определенные по экспрессии CD86, которая индуцирована CD40L человека, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1. Показаны профиль мономера 311 Tn3, специфичного по отношению к CD40L человека, его вариант K4E, а также негативный контроль.

[0103] На Фиг. 10D показаны профили ингибирования, определенные по экспрессии CD86, которая индуцирована CD40L человека, в CD19-положительных PBMC человека, стимулированных клетками Jurkat D1.1. Показаны профили мономера 311K4E Tn3, специфичного по отношению к CD40L человека, мономера с оптимизированной аффиностью 311K4E_12, а также моноклонального антитела 5c8 к CD40L. Также представлены IC₅₀ для двух конструктов и антитела.

[0104] На Фиг. 11A и Фиг. 11B показаны множественные выравнивания последовательностей исходной CD40L-специфичной Tn3-каркасной структуры 309, варианта 309FGwt, а также вариантов 340-349 с оптимизированной аффинностью. Аминокислотные остатки 1-42 показаны на Фиг. 11A, а аминокислотные остатки 43-83 показаны на Фиг. 11B. Варианты петель затемнены. Консенсусная аминокислотная последовательность представлена ниже множественного выравнивания последовательностей. Выровненные последовательности соответствуют аминокислотным последовательностям клонов 309 Tn3-каркасной структуры (SEQ ID NO: 20), 309FGwt (SEQ ID NO: 22), 340 (SEQ ID NO: 24), 341 (SEQ ID NO: 26), 342 (SEQ ID NO: 28), 343 (SEQ ID NO: 30), 344 (SEQ ID NO: 32), 345 (SEQ ID NO: 34), 346 (SEQ ID NO: 36), 347 (SEQ ID NO: 38), 348 (SEQ ID NO: 40) и 349 (SEQ ID NO: 42).

[0105] На Фиг. 12A и Фиг. 12B показаны множественные выравнивания последовательностей исходной CD40L-специфичной Tn3-каркасной структуры 311, варианта 311K4E, а также вариантов 311K4E_1 - 311K4E_21 с оптимизированной аффинностью. Аминокислотные остатки 1-44 показаны на Фиг. 12A, а аминокислотные остатки 45-87 показаны на Фиг. 12B. Варианты петель затемнены. Аминокислотные вариации вне затемненных петель помещены в рамку. Консенсусная последовательность представлена ниже множественного выравнивания последовательностей. Выровненные последовательности соответствуют аминокислотным последовательностям клонов 311 Tn3-каркасной структуры (SEQ ID NO: 44), 311K4E (SEQ ID NO: 46), 311K4E_1 (SEQ ID NO: 48), 311K4E_2 (SEQ ID NO: 50), 311K4E_2 (SEQ ID NO: 52), 311K4E_3 (SEQ ID NO: 54), 311K4E_4 (SEQ ID NO: 56), 311K4E_5 (SEQ ID NO: 58), 311K4E_7 (SEQ ID NO: 60), 311K4E_8 (SEQ ID NO: 62), 311K4E_9 (SEQ ID NO: 64), 311K4E_10 (SEQ ID NO: 66), 311K4E_11 (SEQ ID NO: 68), 311K4E_12 (SEQ ID NO: 70), 311K4E_13 (SEQ ID NO: 72), 311K4E_14 (SEQ ID NO: 74), 311K4E_15 (SEQ ID NO: 76), 311K4E_16 (SEQ ID NO: 78), 311K4E_19 (SEQ ID NO: 80), 311K4E_20 (SEQ ID NO: 82) и 311K4E_21 (SEQ ID NO: 84).

[0106] На Фиг. 13 показан анализ ингибирования NfkB человека, в котором используют клетки HEK293, экспрессирующие рецептор CD40 человека и содержащие репортерный конструкт NfkB-люцифераза. Добавление CD40L человека приводит к возникновению сигнала (измеряется по люциферазной активности), который ингибируется молекулой, связывающей CD40L. Анализировали CD40L-специфичные каркасные структуры 340 и 342 из Tn3, а также моноклональное антитело 5c8 к CD40L.

[0107] На Фиг. 14 показано связывание Tn3-каркасных структур, специфичных по отношению CD40Lчеловека, с CD4+ T-клетками человека, активированными антителом к CD3/28 в течение 24 ч. Анализировали моновалентную каркасную структуру 342, слитую с HSA (обозначена 342-HSA) и бивалентную каркасную структуру 342, слитую с HSA (342-342-HSA).

[0108] На Фиг. 15 показано ингибирование первичной T/B-клеточной пролиферации у человека в день 3. Анализировали моновалентную каркасную структуру 340, слитую с HSA (340-HSA), моновалентную каркасную структуру 342, слитую с HSA (342-HSA), а также бивалентную каркасную структуру 342, слитую с HSA (342-342-HSA). Показаны значения IC₅₀ для каждого конструкта.

[0109] На Фиг. 16A показан агрегационный анализ с использованием отмытых тромбоцитов. На графике показан иллюстративный позитивный контроль ADP-индуцированной агрегации для донора (три верхних записанных кривых, соответственно) ADP: 0,5 мкМ, 1 мкМ и 2 мкМ вместе с иммунным комплексом (IC) из моноклонального антитела 5c8 (600 нМ) и растворимого CD40L человека (200 нМ).

[0110] На Фиг. 16B показан агрегационный анализ с использованием отмытых тромбоцитов. На графике показан недостаток агрегации, если использовали преформированные иммунные комплексы из бивалентных каркасных структур 309-309 (не являются слитыми с HSA) и растворимого CD40L человека. Концентрацию CD40L человека (растворимая форма) поддерживали постоянной при 600 нМ, а концентрацию конструктов каркасных структур изменяли от 200 нМ до 800 нМ.

[0111] На Фиг. 16С показан агрегационный анализ с использованием отмытых тромбоцитов. На графике показан недостаток агрегации при использовании преформированных иммунных комплексов из моновалентных каркасных структур 342, слитых с HSA, и растворимого CD40L человека. Концентрацию CD40L человека (растворимая форма) поддерживали постоянной при 600 нМ, а концентрацию конструктов каркасных структур изменяли от 100 нМ до 400 нМ. На графике также показана быстрая агрегация, индуцированная иммунным комплексом из моноклонального антитела Biogen 5c8 и растворимого CD40L человека.

[0112] На Фиг. 17A показано ленточное представление кристаллической структуры растворимого CD40L в комплексе с CD40L-специфичной мономерной Tn3-каркасной структурой 309. CD40L образует тример (полипептиды A, B и C). Каждая каркасная структура 309 (полипептиды D, E и F обведены кругом) осуществляет контакт с двумя полипептидами CD40L. Перечислены специфичные контакты между мономерной каркасной структурой 309 и первым и вторым полипептидами CD40L. Это вид "сверху вниз" данной структуры.

[0113] На Фиг. 17B показано ленточное представление кристаллической структуры растворимого CD40L в комплексе с CD40L-специфичной мономерной Tn3-каркасной структурой 311K4E_12. CD40L образует тример (полипептиды A, B и C). Каждая мономерная каркасная структура 311K4E_12 (полипептиды D, E и F обведены кругом) осуществляет контакт с двумя полипептидами CD40L. Перечислены специфичные контакты между каждой мономерной каркасной структурой 311K4E_12 и первым и вторым полипептидами CD40L. Это вид "сверху вниз" данной структуры.

[0114] На Фиг. 17С показано ленточное представление, которое демонстрирует, что каркасные структуры 311K4E_12 и 309 (обведены кругом) связываются с различными эпитопами, расположенными в различных частях тримерного комплекса CD40L. Обе каркасные структуры связываются в одном и том же кармане для того, чтобы взаимодействовать с рецептором CD40. Это "вид сбоку" данной структуры.

[0115] На Фиг. 17D показано ленточное представление структуры кристалла растворимого CD40L в комплексе с CD40L-специфичной мономерной Tn3-каркасной структурой 342. Показаны лишь один CD40L и одна мономерная каркасная структура 342. Перечислены специфичные контакты между мономерной каркасной структурой 342 и первыми полипептидами CD40L.

[0116] На Фиг. 17E показано ленточное представление, которое демонстрирует, что каркасные структуры 342 и 311K4E_12 могут одновременно связываться с различными эпитопами, расположенными в различных частях тримерного комплекса CD40L. Обе каркасные структуры связываются в одной и той же бороздке, которая будет взаимодействовать с рецептором CD40. Это "вид сбоку" данной структуры.

[0117] На Фиг. 18A показано расположение контактов между аминокислотами в CD40L-специфичной мономерной Tn3-каркасной структуре 311K4E_12 (SEQ ID NO: 68) и тримером, образованным растворимой молекулой CD40L (SEQ ID NO: 2), как показано на Фиг. 17A. Каждая каркасная структура осуществляет контакт с 2 молекулами CD40L. Показана последовательность CD40L (SEQ ID NO: 2). Пунктирная подчеркивающая линия = цитоплазматический домен; сплошная подчеркивающая линия = сигнальный якорный мембранный белок типа II; двойная подчеркивающая линия = область, совместно кристаллизированная с Tn3-каркасной структурой; затемнение = остатки на 1-м CD40L, которые контактируют с Tn3; ненасыщенное затемнение = остатки на 2-м CD40L, которые контактируют с Tn3.

[0118] На Фиг. 18B показано расположение контактов между аминокислотами CD40L-специфичной мономерной Tn3-каркасной структуры 309 и тримера CD40L, как показано на Фиг. 17B. Каждая каркасная структура осуществляет контакт с 2 молекулами CD40L. Показана последовательность CD40L (SEQ ID NO: 2). Пунктирная подчеркивающая линия = цитоплазматический домен; сплошная подчеркивающая линия = сигнальный якорный мембранный белок типа II; двойная подчеркивающая линия = область, совместно кристаллизированная с Tn3-каркасной структурой; затемнение = остатки на 1-м CD40L, которые контактируют с Tn3; ненасыщенное затемнение = остатки на 2-м CD40L, которые контактируют с Tn3; остатки в двойной рамке контактируют с петлей FG из каркасной структуры 309, которая, по всей видимости, не является консервативной в клонах, имеющих петлю FG дикого типа.

[0119] Фиг. 19. На панели A показана иллюстративная хроматограмма элюирования Tn3-каркасной структуры (309 или 311K4E_12), CD40L и комплекса между ними в колонке для гель-хроматографии Superdex 200 10/300 GL. На панели B показаны кристаллы комплекса 309-CD40L. Кристаллы демонстрируют увеличение размеров до 0,15 × 0,15 × 0,1 мм. На панели C показаны кристаллы комплекса 311K4E_12-CD40L.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0120] Прежде чем продолжить описание настоящего изобретения более подробно, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными композициями или стадиями процесса, поскольку таковые могут изменяться. Следует отметить, что употребляемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Выражения “один или несколько” и “по меньшей мере один” могут употребляться в данном документе взаимозаменяемо.

[0121] Кроме того, выражение “и/или” там, где оно употребляется в данном документе, следует рассматривать как конкретное раскрытие каждого из двух указанных признаков или компонентов с другим или без него. Таким образом, выражение "и/или" при употреблении в данном документе в такой фразе, как "А и/или В", должно включать "А и В", "А или В", "А" (отдельно) и "В" (отдельно). Аналогично, выражение "и/или", при употреблении в такой фразе, как "А, В и/или С" должно охватывать каждый из следующих вариантов осуществления: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно) и С (отдельно).

[0122] Если не определено иначе, все технические и научные выражения, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист с обычной квалификацией в области техники, к которой относится это раскрытие. Например, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press и the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, обеспечивают специалиста общим словарем многих выражений, используемых в настоящем изобретении.

[0123] Единицы измерения, префиксы и символы обозначены в их форме, принятой в Système International de Unites (SI). Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, то аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от амино к карбокси. Приведенные в данном документе заголовки не ограничивают различные аспекты или варианты осуществления настоящего раскрытия, которые могут обеспечиваться ссылкой на описание в целом. Соответственно, выражения, которые приведены непосредственно ниже, более полно определены посредством ссылки на описание во всей его полноте.

[0124] Ясно, что какие бы варианты осуществления ни описывались в данном документе формулировкой "содержащий", другие аналогичные варианты осуществления, описываемые выражениями "состоящий из" и/или "практически состоящий из", также представлены.

[0125] В данном документе аминокислоты указаны либо с помощью их общеизвестных трехбуквенных символов, либо с помощью однобуквенных символов, рекомендованных Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды указаны с помощью их общепринятых однобуквенных кодов.

[0126] Выражение "эпитоп", как используется в данном документе, относится к белковой детерминанте, способной связываться с каркасной структурой по настоящему изобретению. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним теряется в присутствии денатурирующих растворителей.

[0127] Выражения "домен фибронектина типа III (FnIII)," "FnIII-домен" и "FnIII-каркасная структура" относятся к полипептидам, гомологичным домену фибронектина типа III, имеющим по меньшей мере 7 бета-цепей, которые расположены между двумя бета-складчатыми слоями, которые сами по себе упакованы между собой с образованием кора белка, и дополнительно содержащим доступные для растворителя петли, соединяющие бета-цепи друг с другом. Имеется по меньшей мере три таких петли на каждом краю бета-складчатого сэндвича, где край представляет собой границу белка, перепендикулярную направлению бета-цепей. В конкретных вариантах осуществления FnIII-домен содержит 7 бета-цепей, обозначенных A, B, C, D, E, F и G, соединенных с шестью петлевыми участками, обозначенными AB, BC, CD, DE, EF и FG, где петлевой участок соединен с каждой бета-цепью.

[0128] Выражение "Tn3-каркасная структура", как используется в данном документе, относится к молекулам, содержащим по меньшей мере одну FnIII-каркасную структуру, где бета-цепь A содержит SEQ ID NO: 11, бета-цепь B содержит SEQ ID NO: 12, бета-цепь С содержит SEQ ID NO: 13 или 14, бета-цепь D содержит SEQ ID NO: 15, бета-цепь Е содержит SEQ ID NO: 16, бета-цепь F содержит SEQ ID NO: 17, и бета-цепь G содержит SEQ ID NO: 18, где по меньшей мере одна петля представляет собой не встречающийся в природе вариант петель в “исходной Tn3-каркасной структуре.” В конкретных вариантах осуществления одна или несколько бета-цепей Tn3-модуля включают по меньшей мере одну аминокислотную замену, за исключение того, что остатки цистеина в бета-цепи C (например, цистеин в SEQ ID NO: 13 или 14) и бета-цепях F (SEQ ID NO: 17) не заменены.

[0129] Выражение “исходный Tn3”, как используется в данном документе, относится к FnIII-каркасной структуре, содержащей SEQ ID NO: 3, т.е термально стабилизированная и созданная по методике цистеиновой инженерии FnIII-каркасная структура, полученная из 3-го FnIII-домена тенасцина C человека.

[0130] Выражения "мультимер" или "мультимерная каркасная структура" относятся к молекуле, которая содержит по меньшей мере две FnIII-каркасные структуры в комплексе. Каркасные структуры, образующие мультимерную каркасную структуру могут быть соединены посредством линкера, что позволяет каждой каркасной структуре функционировать независимо.

[0131] Выражения "мономер","мономерная субъединица" или "мономерная каркасная структура" относятся к молекуле, которая содержит только одну FnIII-каркасную структуру.

[0132] Выражение "CD40L-специфичная мономерная субъединица", как используется в данном документе, относится к Tn3-мономеру, происходящему из "исходного Tn3", где Tn3-мономер специфически связывается с CD40L или его фрагментом, например, растворимой формой CD40L.

[0133] Выражение "ДНК" относится к последовательности из двух или более ковалентно связанных, встречающихся в природе или модифицированных дезоксирибонуклеотидов.

[0134] Выражение "белок слияния" относится к белку, который содержит в своем составе (i) одну или несколько каркасных структур по настоящему изобретению, соединенных со (ii) вторым отличным белком (т.е "гетерологичный" белок).

Таблица 1. Последовательности и SEQ ID NO компонентов "исходной Tn3''

Название/Краткое описание Последовательность SEQ
ID NO Tn3 IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
(цис-остатки дисульфидной связи подчеркнуты) 3 3-ий FnIII из тенасцина C, петля AB (Tn3) KDVTDTT 4 3-ий FnIII из тенасцина C, петля BC (Tn3) FKPLAEIDG 5 3-ий FnIII из тенасцина C, петля CD (Tn3) KDVPGDR 6 3-ий FnIII из тенасцина C, петля DE (Tn3) TEDENQ 7 3-ий FnIII из тенасцина C, петля EF (Tn3) GNLKPDTE 8 3-ий FnIII из тенасцина C, петля FG (Tn3) RRGDMSSNPA 9 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь A (Tn3) RLDAPSQIEV 10 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь A (Tn3)
N-концевое усечение IEV 11 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь B (Tn3) ALITW 12 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь C (вариант Tn3) CELAYGI 13 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь C (Tn3) CELTYGI 14 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь D (Tn3) TTIDL 15 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь E (Tn3) YSI 16 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь F (Tn3) YEVSLIC 17 3-ий FnIII из тенасцина C, бета-цепь G (Tn3) KETFTT 18

[0135] Выражение "гетерологичный фрагмент" используют в данном документе для указания добавления структуры к Tn3-каркасной структуре по настоящему изобретению, где структура, как правило, не является частью FnIII-домена. Иллюстративные гетерологичные фрагменты включают белки, пептиды, белковые домены, линкеры, лекарственные средства, токсины, радиофармацевтические средства, радиоактивные соединения, органические и неорганические полимеры, а также любые другие структуры, которые могут обеспечивать активность, не свойственную FnIII-домену самому по себе, в том числе, но без ограничения, полиэтиленгликоль (PEG), цитотоксическое средство, радионуклид, радиофармацевтическое средство, биотин, домен димеризации (например, домен "лейциновая застежка"), человеческий сывороточный альбумин (HSA) или его часть, отвечающая за связывание с FcRn, домен или фрагмент антитела (например, вариабельный домен антитела, CH1-домен, Скаппа-домен, Слямбда-домен, CH2- или CH3-домен), одноцепочечное антитело, антитело на основе домена, альбумин-связывающий домен, молекула IgG, фермент, лиганд, рецептор, связывающий пептид, каркасная структура, отличающаяся от FnIII, эпитопная метка, полимер на основе рекомбинантного полипептида, цитокин и тому подобные.

[0136] Выражение "линкер", как используется в данном документе, относится к любому молекулярному ансамблю, который объединяет или соединяет две или более каркасные структуры. Линкер может быть молекулой, которая функционирует в качестве "спейсера" между модулями в каркасной структуре, или также может быть молекулой с дополнительной функцией (т.е "функциональный фрагмент"). Молекула, включенная в определение "гетерологичного фрагмента", также может функционировать в качестве линкера.

[0137] Выражения "соединенный" и "слитый" используют взаимозаменямо. Данные выражения относятся к объединению двух или более каркасных структур, гетерологичных фрагментов или линкеров с помощью любых средств, включающих химическое конъюгирование или рекомбинантные способы.

[0138] Выражения "домен" или "белковый домен" относятся к участку белка, который могут укладываться в стабильную трехмерную структуру, часто независимо от остальной части белка, и которые могут быть наделены конкретной функцией. Данная структура обеспечивает определенную функцию, ассоциированную с функцией домена в пределах первоначального белка, например, ферментативная активность, образование узнающего мотива для другой молекулы или обеспечение необходимыми структурными компонентами белка для его существования в конкретной среде белков. В пределах как семейства белков, так и суперсемейств родственных белков белковые домены могут представлять собой эволюционно консервативные области. При описании компонентов мультимерной каркасной структуры выражения "домен", "мономерная каркасная структура", "мономерная субъединица" и "модуль" можно использовать взаимозаменяемо. Под “нативным FnIII-доменом” подразумевают любой нерекомбинантный FnIII-домен, который закодирован в живом организме.

[0139] "Последовательность белка" или "аминокислотная последовательность" означает линейное представление аминокислотных составляющих элементов в полипептиде в направлении от амино-конца до карбокси-конца, в котором остатки, которые граничат друг с другом в представлении являются смежными в первичной структуре полипептида.

[0140] Выражение "нуклеиновая кислота" относится к любым двум или более ковалентно связанным нуклеотидам, или аналогам нуклеотидов, или производным. Как используется в данном документе, данное выражение без ограничения включает ДНК, РНК и ПНК. “Нуклеиновая кислота” и “полинуклеотид” используют в данном документе взаимозаменяемо.

[0141] Выражение "полинуклеотид" предназначено для охвата единичной нуклеиновой кислоты, а также множественных нуклеиновых кислот, и относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкту, например, информационной РНК (иРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). Выражение "выделенная" нуклеиновая кислота или полинуклеотид относится к молекуле нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которую удалили из ее нативного окружения. Например, рекомбинатный полинуклеотид, кодирующий, к примеру, каркасную структуру по настоящему изобретению, входящий в состав вектора, считают выделенным для целей настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клетках-хозяевах или очищенные (частично или в значительной степени) полинуклеотиды в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты полинуклеотидов по настоящему изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетически. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или иметь в своем составе регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции.

[0142] Выражение "фармацевтически приемлемый" относится к соединению или белку, которое можно вводить животному (например, млекопитающему) без существенных нежелательных медицинских последствий.

[0143] Выражение "физиологически приемлемый носитель" относится к носителю, который не характеризуется существенным вредным воздействием на хозяина, подлежащего обработке, и который сохраняет терапевтические свойства соединения, с которым его вводят. Одним иллюстративным физиологически приемлемым носителем является физиологический солевой раствор. Другие физиологически приемлемые носители и их составы, известные специалисту в данной области техники, и описанные, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa., включены в данный документ посредством ссылки.

[0144] Под "полипептидом" подразумевают любую последовательность из двух или более аминокислот, линейно связанных амидными связями (пептидными связями), вне зависимости от длины, посттрансляционной модификации или функции. "Полипептид", "пептид" и "белок" используют в данном документе взаимозаменяемо. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды или олигопептиды включены в определение "полипептида", и выражение "полипептид" можно использовать вместо или взаимозаменяемо с любым из данных выражений. Выражение "полипептид" также предназначено для обозначения продуктов пост-экспрессионных модификаций полипептида, включая, но без ограничения, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, получение производных с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление или модификацию с помощью не встречающихся в природе аминокислот. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или создан с помощью рекомбинантной технологии, но не обязательно осуществляется трансляция из определенной последовательности нуклеиновой кислоты. Полипептид может быть получен любым способом, в том числе химическим синтезом.

[0145] Также в качестве полипептидов по настоящему изобретению предусмотрены фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеприведенных полипептидов и любые их комбинации. Варианты могут быть встречающимися в природе или не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты можно получить при помощи методик мутагенеза, известных в данной области техники. Варианты полипептидов могут включать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или добавления. Также в качестве "производных" включены те пептиды, которые содержат одну или несколько встречающихся в природе аминокислотных производных двадцати стандартных аминокислот.

[0146] Под "рандомизированной" или "мутированной" подразумевают включение одной или нескольких аминокислотных изменений, в том числе делеции, замены или добавления, относительно матричной последовательности. Под "рандомизированием" или "внедрением мутации" подразумевают процесс введения в последовательность такого аминокислотного изменения. Рандомизация или мутация может быть достигнута посредством преднамеренного, слепого или спонтанного изменения последовательности, обычно всей кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, и ее можно осуществить с помощью любой методики, например, ПЦР, ПЦР с использованием ошибающейся полимеразы или химического синтеза ДНК. Выражения “рандомизирование”, “рандомизированный”, “внедрение мутации”, “мутированный” и тому подобные используют взаимозаменяемо в данном документе.

[0147] Под “когнатным” или "когнатным немутированным белком" подразумевают белок, который является идентичным по последовательности варианту белка, за исключением аминокислотных мутаций, введенных в вариант белка, где вариант белка является рандомизированным или мутированным.

[0148] Под выражением "РНК" подразумевают последовательность из двух или более ковалентно связанных, встречающихся в природе или модифицированных рибонуклеотидов. Один пример модифицированной РНК, включенный в рамки данного выражения, представляет собой фосфоротиоатную РНК.

[0149] Выражения "каркасная структура по настоящему изобретению" или "каркасные структуры по настоящему изобретению", как используется в данном документе, относятся к мультимерным Tn3-каркасным структурам, а также мономерным Tn3-каркасным структурам. Выражение “мишень” относится к соединению, узнаваемому специфической каркасной структурой по настоящему изобретению. Выражения “мишень” и “антиген” используются взаимозаменяемо в данном документе. Выражение "специфичность", как используется в данном документе, например, в выражениях "специфически связывается" или "специфическое связывание", относится к относительной аффинности, при помощи которой Tn3-каркасная структура по настоящему изобретению связывается с одним или несколькими антигенами посредством одного или нескольких антиген-связывающих доменов, и тому, что связывание предусматривает некоторую комплементарность между одним или несколькими антиген-связывающими доменами и одним или несколькими антигенами. Согласно данному определению говорят, что Tn3-каркасная структура по настоящему изобретению "специфически связывается" с эпитопом, когда она связывается с данным эпитопом более легко, чем если бы она связывалась со случайным, неродственным эпитопом.

[0150] Каркасная структура со “зрелой аффинностью” представляет собой каркасную структуру с одним или несколькими изменениями, обычно в петле, результатом чего является улучшение аффинности Tn3-каркасной структуры по отношению к эпитопу в сравнении с исходной Tn3-каркасной структурой, которая не имеет такого изменения(ий).

[0151] Выражение "аффинность", как используется в данном документе, относится к измерению силы связывания конкретной Tn3-каркасной структуры по настоящему изобретению с отдельным эпитопом.

[0152] Выражение "авидность", как используется в данном документе, относится к общей стабильности комплекса между популяцией Tn3-каркасных структур по настоящему изобретению и определенным эпитопом, т.е функционально объединенная сила связывания множества Tn3-каркасных структур с антигеном. Авидность относится как к аффинности отдельных антиген-связывающих доменов в отношении конкретных эпитопов, так и также к валентности каркасной структуры по настоящему изобретению.

[0153] Выражение "воздействие на мишень" относится к связыванию Tn3-каркасной структуры по настоящему изобретению с одной или несколькими мишенями и к биологическим эффектам, являющимся результатом такого связывания. В этом отношении, множественные единицы, связывающие антиген, в Tn3-каркасной структуре могут взаимодействовать с рядом мишеней и/или эпитопов и, например, физически сближать две мишени, инициировать каскады метаболических реакций посредством взаимодействия с отдельными мишенями и т.д. В отношении CD40L, "воздействие на мишень" относится к эффекту, достигнутому, например, путем усиления, стимуляции или активации одной или нескольких биологических активностей CD40L.

[0154] Выражение "валентность", как используется в данном документе, относится к числу потенциальных антиген-связывающих модулей, например, числу FnIII-модулей в каркасной структуре по настоящему изобретению. Если Tn3-каркасная структура по настоящему изобретению содержит более одного антиген-связывающего модуля, каждый связывающий модуль может специфически связываться с тем же эпитопом или другим эпитопом в той же мишени или других мишенях.

[0155] Выражение "дисульфидная связь", как используется в данном документе, включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиоловую группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиоловой группой.

[0156] Выражение “иммуноглобулин” и "антитело" включает различные широкие классы полипептидов, которые могут биохимически отличаться. Специалисты в данной области примут во внимание, что тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон. Именно природа этой цепи определяет "класс" антитела как IgG, IgM, IgA, IgG или IgE, соответственно. Модифицированные версии каждого из данных классов без труда различит специалист в данной области техники. Как используется в данном документе, выражение "антитело" включает, но без ограничения, интактное антитело, модифицированное антитело, VL- или VL-домен, CHl-домен, Скаппа-домен, Слямбда-домен, Fc-домен (см. ниже), CH2- или CH3-домен.

[0157] Как используется в данном документе, выражение "Fc-домен" относится к части константной области антитела. Традиционно, выражение Fc-домен относится к продукту расщепления протеазой (например, папаином), охватывающему парные CH2, CH3 и шарнирную области антитела. В контексте данного раскрытия выражение Fc-домен или Fc относится к любому полипептиду (или нуклеиновой кислоте, кодирующей такой полипептид), независимо от способа получения, который охватывает все или часть CH2, CH3 и шарнирной областей полипептида в составе иммуноглобулина.

[0158] Как используется в данном документе, выражение "модифицированное антитело" включает синтетические формы антитела, измененные таким образом, что они не являются встречающимися в природе, например, антитела, которые содержат по меньшей мере части двух тяжелых цепей, но не две полные тяжелые цепи (как, например, антитела с удаленным доменом или минитела); мультиспецифические формы антител (например, биспецифические, триспецифические и т.д.), измененные так, чтобы связываться с двумя или более антигенами или с различными эпитопами отдельного антигена. Кроме того, выражение "модифицированное антитело" включает поливалентные формы антител (например, трехвалентные, четырехвалентные и т.д антитела к трем или более копиям одного и того же антигена). (См., например, Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, eds., 2010, Springer Protocols, Springer).

[0159] Выражение “время полужизни in vivo” используют в его нормальном значении, т.е время, при котором 50% биологической активности полипептида все еще обнаруживают в теле/органе-мишени, или время, при котором активность полипептида представляет собой 50% от его исходного значения. В качестве альтернативы, к определению функционального времени полужизни in vivo, можно определить "время полужизни в сыворотке", т.е время, при котором 50% полипептидных молекул циркулируют в плазме или кровотоке до очищения. Определение времени полужизни в сыворотке зачастую является более простым, чем определение функционального времени полужизни in vivo, и показатель времени полужизни в сыворотке обычно является хорошим признаком показателя фунционального времени полужизни. Альтернативные выражения для времени полужизни в сыворотке включают "время полужизни в плазме," время полувыведения из кровотока, время полувыведения из крови, сывороточный клиренс, плазматический клиренс и время полувыведения. Функциональность, подлежащую сохранению, обычно выбирают из прокоагулянтной, протеолитической, кофактор-связывающей, рецептор-связывающей активности или другого типа биологической активности, связанной с конкретным белком.

[0160] Выражение "повышено" в отношении функционального времени полужизни in vivo или времени полужизни в плазме используют для указания того, что относительное время полужизни полипептида представляет собой статистически значимое повышение относительно такового для контрольной молекулы (например, немодифицированный полипептид), как это определено в сопоставимых условиях.

[0161] Выражение "понижено" в отношении функционального времени полужизни in vivo или времени полужизни в плазме используют для указания того, что относительное время полужизни полипептида представляет собой статистически значимое понижение относительно такового для контрольной молекулы (например, немодифицированный полипептид), как это определено в сопоставимых условиях.

[0162] Выражение "экспрессия", как используется в данном документе, относится к способу, с помощью которого исходя из гена продуцируется биохимическое вещество, например, каркасная структура по настоящему изобретению или ее фрагмент. Способ предусматривает любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничения, нокдаун гена, а также как транзиентную экспрессию, так и стабильную экспрессию. Он включает, без ограничений, транскрипцию гена в одну или несколько иРНК и трансляцию таких иРНК в один или несколько полипептидов. Если конечный желаемый продукт представляет собой биохимическое вещество, экспрессия включает создание таких биохимических веществ и любых предшественников.

[0163] “Продукт экспрессии” может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например, информационную РНК, полученную посредством транскрипции гена, либо полипептид. Продукты экспрессии, описываемые в данном документе, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и т.п.

[0164] Выражение "вектор" или "вектор экспрессии" применяют в данном документе для обозначения векторов, применяемых в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителей для введения в клетку и экспрессии желаемого гена в клетке-хозяине. Как известно специалистам в данной области техники, такие векторы можно без труда выбрать из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. Как правило, векторы, совместимые с настоящим изобретением, как правило, будут содержать селектируемый маркер, соответствующие сайты рестрикции для облегчения клонирования желаемого гена и обладать способностью проникать в эукариотические или прокариотические клетки и/или реплицироваться в них.

[0165] Выражение "клетки-хозяева" относится к клеткам, которые содержат векторы, сконструированные с помощью методик рекомбинантных ДНК и кодирующие по меньшей мере один гетерологичный ген. В описаниях способов выделения продукта экспрессии из рекомбинантных хозяев выражения "клетка" и "культура клеток" используют взаимозаменяемо для указания источника продукта экспрессии, если четко не указано иное, т.е извлечение продукта экспрессии из "клеток" означает либо извлечение из отцентрифугированных цельных клеток, либо извлечение из культуры клеток, содержащих как среду, так и суспендированные клетки.

[0166] Выражения "лечить" или "лечение", как используются в данном документе, относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, где целью является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как прогрессирование воспалительного заболевания или состояния. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но без ограничения, облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (либо частичную, либо полную), либо поддающуюся, либо не поддающуюся обнаружению.

[0167] Выражение "лечение" может также означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в случае без получения лечения. К тем, кто нуждается в лечении, относятся те, у кого уже есть состояние или нарушение, а также те, кто склонен иметь состояние или нарушение, или те, у кого нужно предотвратить состояние или нарушение.

[0168] Выражения "субъект", "индивидуум" "животное", "пациент" или "млекопитающее" относятся к любому индивидууму, пациенту или животному, в частности, субъекту-млекопитающему, для которого необходимы диагностирование, прогнозирование или терапия. Субъекты-млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных и зоопарковых, используемых в спорте или комнатных животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и т.д.

[0169] Выражение “CD40L”, как используется в данном документе, относится без ограничений к CD40L, экспрессированному на поверхности T-клеток, рекомбинантно экспрессированному CD40L, CD40L, экспрессированному в E.coli и очищенному из них или других пригодных систем экспрессии рекомбинантных белков, негликозилированному CD40L и растворимым фрагментам CD40L. Как используется в данном документе, "CD40L" также относится к MegaCD40L. MegaCD40L™ представляет собой высокоактивный конструкт, в котором два тримерных CD40-лиганда искусственно соединены через коллагеновый домен домен из ACRP30/адипонектина. Данный конструкт очень эффективно стимулирует естественную мембранносвязанную агрегацию CD40L in vivo. Он обеспечивает простую и в равной степени эффективную альтернативу комбинациям [CD40L+энхансер] (Alexis biochemicals). Выражение "CD40L" относится к мономерным формам CD40L, а также к олигомерным формам, например, тримерный CD40L.

[0170] Выражение “CD40L” относится как к полноразмерному CD40L, так и к растворимым фрагментам, например, формам внеклеточного домена CD40L, возникающим в результате протеолиза. Аминокислотные последовательности мембранносвязанных и растворимых форм CD40L человека (Swissprot: P29965) показаны в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно.

[0171] Выражения “CD40L-антагонист” или “антагонист” используют в самом широком смысле, и они охватывают любую молекулу, которая частично или полностью ингибирует, снижает или инактивирует одну или несколько биологических активностей CD40L и его биологически активных вариантов in vitro, in situ или in vivo. К примеру, CD40L-антагонист может функционировать для того, чтобы частично или полностью ингибировать, снижать или инактивировать одну или несколько биологических активностей одной или нескольких молекул CD40L или одной или нескольких молекул CD40L, связанных с CD40 или другими мишенями, in vivo, in vitro или in situ, как результат его связывания с CD40L.

[0172] Выражение “CD40L-агонист” или “агонист” используют в самом широком смысле, и оно охватывает любую молекулу, которая частично или полностью усиливает, стимулирует или активирует одну или несколько биологических активностей CD40L и его биологически активных вариантов in vitro, in situ или in vivo. К примеру, CD40L-агонист может функционировать для того, чтобы частично или полностью усиливать, стимулировать или активировать одну или несколько биологических активностей одной или нескольких молекул CD40L или одной или нескольких молекул CD40L, связанных с CD40R или другими мишенями, in vivo, in vitro или in situ, как результат его связывания с CD40L.

[0173] Выражение “кристалл”, как используется в данном документе, относится к одной форме твердого состояния вещества, в которой атомы упорядочены в структуру, которая периодически повторяется в трех координатах, как правило, с образованием кристаллической решетки.

[0174] Выражение “симметрия пространственной структуры”, как используется в данном документе, относится к полной симметрии кристалла, которая объединяет симметрию переноса кристаллической решетки с симметрией точечной группы. “Пространственная группа” обозначается заглавной буквой, идентифицирующей группу кристаллической решетки (P, A, F и т.д), за которой следует символ точечной группы, в котором элементы вращения и отражения расширены для включения осей винтовой симметрии и плоскостей скользящего отражения. Заметьте, что точечная группа симметрии для данной пространственной группы может быть определена удалением символа центрировки ячейки пространственной группы и замещением всех осей винтовой симметрии осями сходной симметрии и замещением всех плоскостей скользящего отражения плоскостями зеркального отражения. Точечная группа симметрии для пространственной группы описывает истинную симметрию ее обратной кристаллической решетки.

[0175] Выражение “базисная ячейка”, как используется в данном документе, означает атомы в кристалле, которые упорядочены в кристалле в регулярно повторяющуюся структуру, в которой наименьшая повторяющаяся единица называется базисной ячейкой. Целостную структуру можно воссоздать из данных о базисной ячейке, которая характеризуется тремя размерностями (a, b и c) и тремя углами (α, β, и γ). Величины a и b представляют собой размерности сторон основания ячейки, а γ представляет собой угол между двумя этими сторонами. Величина с представляет собой высоту базисной ячейки. Углы α и β описывают углы между основанием и вертикальными сторонами базисной ячейки.

[0176] Выражение “машиночитаемый накопитель данных”, как используется в данном документе, означает материал для хранения информации, закодированный машиночитаемыми командами, где устройство программируют с использованием команд для использования таких данных и оно способно отображать данные в необходимом формате, например, графическом трехмерном представлении молекул или молекулярных комплексов.

[0177] Выражение “дифракционная рентгенограмма” означает рентгенограмму, полученную в результате рассеяния рентгеновского излучения периодическим ансамблем молекул или атомов в кристалле. Рентгеноструктурная кристаллография представляет собой методику, в которой используется тот факт, что рентгеновское излучение рассеивается кристаллами. Рентгеновское излучение характеризуется определенной длиной волны (в диапазоне в ангстремах, приблизительно 10^-8 см), подлежащей рассеиванию облаком электронов атома сопоставимого размера. Исходя из дифракционной рентгенограммы, полученной в результате рассеяния рентгеновского излучения периодическим ансамблем молекул или атомов в кристалле можно воссоздать распределение электронной плотности. Дополнительную фазовую информацию можно получить либо из данных дифракции, либо из дополняющих экспериментов по дифракции для завершения воссоздания (фазовая проблема в кристаллографии). Модель прогрессивно встроена в экспериментальную плотность электронов, уточненную относительно данных для получения точной молекулярной структуры. Рентгеновская структура координат определяет уникальную конфигурацию точек в пространстве. Специалисты в данной области поймут, что совокупность структурных координат для белка или комплекса белок-лиганд или его части определяет относительную совокупность точек, что в свою очередь определяет конфигурацию в трех измерениях. Сходную или идентичную конфигурацию можно определить с помощью совершенно различного набора координат, при условии, что расстояния и углы между координатами остаются практически одинаковыми. Кроме того, конфигурацию точек можно определить путем увеличения или уменьшения расстояний между координатами посредством скалярного множителя с сохранением при этом практически таких же углов.

[0178] Выражение “кристаллическая структура”, как используется в данном документе, относится к пространственной или кристаллической сборке повторяющихся атомных или молекулярных единиц в кристаллическом материале. Кристаллическую структуру кристаллического материала можно определить с помощью способов рентгеноструктурной кристаллографии, см., например, “Principles of Protein X-Ray Crystallography” by Jan Drenth, Springer Advanced Texts in Chemistry, Springer Verlag, 2nd ed., February 199, ISBN: 0387985875, и “Introduction to Macromolecular Crystallography” by Alexander McPherson, Wiley-Liss, Oct. 18, 2002, ISBN: 0471251224.

[0179] Выражение “эффекторная функция” относится к таковым биологическим активностям антитела или фрагмента антитела, присущим Fc-участку (нативный Fc-участок или вариант аминокислотной последовательности Fc-участка) антитела, и которые изменяются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q и комплементзависимая цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающая регуляция клеточных поверхностных рецепторов (например, рецепторов B-клеток) и активация B-клеток.

[0180] Выражение “антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность” или “ADCC” относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig связывается с Fc-рецепторами (FcR), представленными на определенных цитотоксических клетках (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), что дает возможность данным цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с антиген-несущей клеткой-мишенью и в дальнейшем уничтожать клетки-мишени с помощью цитотоксинов.

[0181] Выражение “Fc-рецептор” или “FcR” описывает рецептор, который связывается с Fc-участком антитела. FcR может быть нативной последовательностью FcR человека. FcR может связывать IgG-антитело (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и подвергнутые альтернативному сплайсингу формы данных рецепторов. Выражение также включает неонатальный рецептор FcRn.

[0182] Выражение “консенсусная последовательность” относится к белковой последовательности, которая демонстрирует наиболее часто встречающиеся аминокислоты в конкретном положении после множественного выравнивания последовательностей. Консенсусная последовательность представляет собой способ представления результатов множественного выравнивания последовательностей при сравнении друг с другом родственных последовательностей. Консенсусная последовательность показывает, какие остатки являются наиболее распространенными при выравнивании в каждом положении, и степень вариабельности в каждом положении.

Введение

[0183] CD40L (также известный как CD154, CD40-лиганд, gp39 или TBAM) представляет собой 33 кДа мембранный гликопротеин типа II (Swiss-ProtAcc-No P29965). Дополнительно, существуют более короткие 18 кДа растворимые формы CD40L (также известны как sCD40L или растворимый CD40L). Эти растворимые формы CD40L получают с помощью протеолитического процессинга мембраносвязанного белка, но клеточная активность растворимой разновидности является слабой при отсутствии олигомеризации более высокого порядка (например, тримеризации).

[0184] Настоящее изобретение предлагает семейство рекомбинантных, не встречающихся в природе белковых каркасных структур (Tn3-каркасные структуры), способных связываться с CD40L. В частности, белки, описанные в данном документе, можно использовать для выявления определенных петель, которые являются аналогичными по отношению к участкам, определяющим комплементарность ("CDR") вариабельного участка антител. Эти петли могут подвергаться рандомизации или перегруппровке с ограничениями для получения разнообразия, обеспечивающего способность к связыванию с множеством соединений-мишеней. Tn3-каркасные структуры можно использовать в виде мономеров или составить в мультимерные каркасные структуры, способные к связыванию с CD40L.

[0185] В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает средства для CD40L-специфичного связывания, которые пригодны для предупреждения, уменьшения интенсивности, выявления, диагностики или контроля заболеваний, как, например, но без ограничения, аутоиммунное заболевание. В других конкретных вариантах осуществления CD40L-специфичные Tn3-каркасные структуры по настоящему изобретению пригодны для лечения аутоиммунных заболеваний и состояний. В некоторых вариантах осуществления, аутоиммунные заболевания могут включать, но без ограничения, системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит (RA), рассеянный склероз (MS), воспалительное заболевание кишечника (IBD) и отторжение аллотрансплантата.

[0186] Tn3-каркасные структуры по настоящему изобретению содержат CD40L-специфичные мономерные субъединицы, происходящие из третьего FnIII-домена тенасцина C человека, в которых сконструировали по меньшей мере одну не встречающуюся в природе внутримолекулярную дисульфидную связь. Мономерные субъединицы, которые составляют Tn3-каркасные структуры по настоящему изобретению, точно уложены независимо друг от друга с сохранением их специфичности связывания и аффинности, и каждая из мономерных каркасных структур сохраняет свои функциональные свойства. Если мономерные субъединицы собраны в мультимерные Tn3-каркасные структуры с высокой валентностью, мономерные субъединицы точно уложены независимо друг от друга с сохранением их специфичности связывания и аффинности, и каждый из мономеров сохраняет свои функциональные свойства.

[0187] Tn3-каркасные структуры по настоящему изобретению, содержащие более одной мономерной субъединицы, могут связываться со множеством эпитопов, например, (i) связываться со множеством эпитопов в одной мишени, (ii) связываться с одним эпитопом во множестве мишеней, (iii) связываться со множеством эпитопов, расположенных на различных субъединицах одной мишени, или (iv) связываться со множеством эпитопов на множестве мишеней с повышением, таким образом, авидности.

[0188] Кроме того, в связи с возможностью варьировать расстояние между множеством мономеров посредством линкеров мультимерные Tn3-каркасные структуры являются способными к связыванию со множеством молекул-мишеней на поверхности (или на одной и той же клетке/поверхности, или на различных-клетках/поверхностях). Вследствие их способности связываться одновременно с более, чем одной мишенью, мультимерную Tn3-каркасную структуру по настоящему изобретению можно использовать для модуляции множества каскадов реакций, перекрестного связывания с рецепторами на поверхности клетки, связывания поверхностных клеточных рецепторов на отдельных клетках и/или связывания молекул-мишеней или клеток с субстратом.

[0189] Дополнительно, настоящее изобретение предлагает каркасные структуры со зрелой аффинностью, где аффинность каркасной структуры для конкретной мишени модулируют посредством мутации. Также, настоящее изобретение предлагает способы получения каркасных структур по настоящему изобретению, а также способы конструирования каркасных структур с желаемыми физико-химическими, фармакологическими или иммунологическими свойствами. Более того, настоящее изобретение предлагает применения таких каркасных структур и способы терапевтического, профилактического и диагностического применения.

Структурный мотив FnIII

[0190] Tn3-каркасные структуры по настоящему изобретению основаны на структуре модуля фибронектина (FnIII) типа III, домена, широко распространенного среди всех трех надцарств живых организмов и вирусов и во множестве классов белков. В конкретных вариантах осуществления каркасные структуры по настоящему изобретению происходят из третьего FnIII-домена тенасцина C человека (см. международную заявку №, международную заявку № PCT/US2008/012398, опубликованную в качестве WO 2009/058379; PCT/US2011/032184, опубликованную в качестве WO 2011/130324; и международную заявку № PCT/US2011/032188, опубликованную в качестве WO2011130328).

[0191] В одном конкретном варианте осуществления Tn3-каркасные структуры по настоящему изобретению содержат CD40L-специфичную мономерную субъединицу, происходящую из исходной Tn3-каркасной структуры. Общая трехмерная укладка мономера тесно связана с таковой у наименьшего функционального фрагмента антитела, вариабельного участка тяжелой цепи (VH), который в однодоменных антителах, полученных от верблюдов и верблюдовых (например, лам), содержит целую антиген-распознающую единицу.

[0192] Tn3-мономерные субъединицы по настоящему изобретению и нативный FnIII-домен из тенасцина C характеризуются одинаковой третичной структурой, называемой структура "бета-сэндвич" с тремя бета-цепями (A, B, и E) с одной стороны и четырьмя бета-цепями (C, D, F и G) с другой стороны, соединенными шестью петлевыми участками. Эти петлевые участки обозначены в соответствии с бета-цепями, соединенными с N- и C-концами каждой петли. Соответственно, петля AB расположена между бета-цепями A и B, петля BC расположена между бета-цепями B и C, петля CD расположена между бета-цепями C и D, петля DE расположена между бета-цепями D и E, петля EF расположена между бета-цепями E и F, и петля FG расположена между бета-цепями F и G. FnIII-домены содержат открытую для растворителя петлю, толерантную к рандомизации, что облегчает образование различных пулов белковых каркасных структур, способных связываться со специфическими мишенями с высокой аффинностью.

[0193] В одном аспекте настоящего изобретения Tn3-мономерные субъединицы, подвергнутые прямой перегруппировке, конструируют для рандомизации одной или нескольких петель, которые аналогичны участкам, определяющим комплементарность (CDR), в вариабельном участке антитела. Такой принцип прямой перегруппировки в результате приводит к получению антителоподобных молекул с высокими аффинностями к мишеням, представляющим интерес, например, CD40L.

[0194] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления Tn3-каркасные структуры, описанные в данном документе, можно использовать для выявления открытых петель (например, предварительно рандомизированные петли и выбранные на основе мишени для связывания) для прямой перегруппировки молекул, которые связываются с такими введенными петлями. Этот тип отбора можно осуществлять для идентификации молекул для узнавания применительно к любой отдельной CDR-подобной петле или, в качестве альтернативы, для узнавания двух или трех CDR-подобных петель, объединенных в нелинейном эпитоп-связывающем фрагменте. Группа из трех петель (обозначенных BC, DE и FG), которые могут обеспечивать мишень-специфическое связывание, уложена между цепями B и C; цепями D и E и бета-цепями F и G, соответственно. Петли BC, DE и FG третьего FnIII-домена тенасцина C человека имеют длину 9, 6 и 10 аминокислотных остатков, соответственно. Длина этих петель находится в узком пределе когнатных антиген-распознающих петель, обнаруженных в тяжелых цепях антител, и составляет 7-10, 4-8 и 4-28 аминокислот в длину, соответственно. Подобным образом, вторая группа петель, петли AB, CD и EF (7, 7 и 8 аминокислот в длину, соответственно) уложены между бета-цепями A и B; бета-цепями C и D и бета-цепями E и F, соответственно.

[0195] После того, как рандомизированы и отобраны по высокой аффинности связывания с мишенью, петли в Tn3-мономерной каркасной структуре могут образовывать контакты с мишенями, эквивалентные контактам когнатных CDR-петель у антител. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления петли AB, CD и EF рандомизированы и отобраны по высокой аффинности связывания с одной или несколькими мишенями, например, CD40L. В некоторых вариантах осуществления данный способ рандомизации и отбора можно осуществлять параллельно с рандомизацией петель BC, DE и FG, при этом в других вариантах осуществления данный способ рандомизации и отбора проводят последовательно.

CD40L-специфичные мономерные субъединицы

[0196] Настоящее изобретение предлагает CD40L-специфичные рекомбинантные, не встречающиеся в природе Tn3-каркасные структуры, содержащие множество доменов с бета-цепями, связанными со множеством петлевых участков, где в один или несколько указанных петлевых участков вносят изменения путем делеции, замены или добавления по меньшей мере одной аминокислоты из когнатных петель в Tn3 дикого типа (SEQ ID NO: 3) (см. Таблицу 1).

[0197] Для получения улучшенных CD40L-специфичных Tn3-мономерных субъединиц с новыми характеристиками связывания исходный Tn3 подвергают добавлениям, делециям или заменам аминокислот. Будет понятно, что при сравнении последовательности CD40L-специфичной Tn3-мономерной субъединицы с последовательностью исходной Tn3 используют одинаковое определение бета-цепей и петель. В некоторых вариантах осуществления CD40L-специфичные Tn3-мономерные субъединицы по настоящему изобретению содержат аминокислотную последовательность:

IEV(X_AB)_nALITW(X_BC)_nCELX₁YGI(X_CD)_nTTIDL(X_DE)_nYSI(X_EF)_nYEVSLIC(X_FG)_nKETFTT,

где

(a) X_AB, X_BC, X_CD, X_DE, X_EF, и X_FG представляют собой аминокислотные остатки, присутствующие в последовательностях петель AB, BC, CD, DE, EF и FG, соответственно;

(b) X₁ представляет собой аминокислотный остаток аланин (A) или треонин (T); и

(c) длина петли n представляет собой целое число от 2 до 26.

Таблица 2. Последовательности петли Tn3-клонов, использованные в данных исследованиях

Клон Петля AB
SEQ ID NO Петля BC
SEQ ID NO Петля CD
SEQ ID NO Петля DE
SEQ ID NO Петля EF
SEQ ID NO Петля FG
SEQ ID NO* ИСХОДНЫЙ Tn3 Tn3 4 5 6 7 8 9 СЕМЕЙСТВО 309 309FGwt 4 83 6 94 8 9 309 4 83 6 94 8 99 340 4 84 6 95 8 9 341 4 85 6 94 8 9 342 4 86 6 96 8 9 343 4 87 6 97 8 9 344 4 88 6 95 8 9 345 4 89 6 94 8 9 346 4 90 6 94 8 9 347 4 91 6 95 8 9 348 4 92 6 98 8 9 349 4 93 6 94 8 9 Консенсусная последовательность 309FGwt 4 168 6 169 8 170 СЕМЕЙСТВО 311** 311 4 100 6 118 8 129 311K4E 136 100 6 118 137 129 311K4E_1 136 101 6 119 8 129 311K4E_2 136 102 6 120 8 129 311K4E_3† 136 103 6 121 8 129 311K4E_4† 136 104 6 122 8 129 311K4E_5† 136 105 6 121 8 129 311K4E_7 136 106 6 123 8 129 311K4E_8† 136 107 6 123 8 129 311K4E_9 136 108 6 118 8 129 311K4E_10† 136 109 6 123 8 129 311K4E_11 136 110 6 121 8 129 311K4E_12† 136 111 6 123 8 130 311K4E_13 136 108 6 121 8 129 311K4E_14 136 112 6 124 8 129 311K4E_15 136 113 6 125 8 129 311K4E_16 136 114 6 118 8 129 311K4E_19 136 115 6 126 8 129 311K4E_20 136 116 6 127 8 129 311K4E_21 136 117 6 128 8 129 консенсусная последовательность 311 173 174 6 175 176 177

† Клоны, содержащие бета-цепь C, имеющую последовательность CELAYGI (SEQ ID NO: 14), при этом все другие клоны содержат бета-цепь C, имеющую последовательность CELTYGI (SEQ ID NO: 13).

* В некоторых вариантах в семействе 309, например, 342, петлю FG можно заменить на SEQ ID NO: 139.

^** В некоторых вариантах в семействе 311 петлю BC можно сконструировать с заменой тирозина в положении 21. Специально предусмотрено, что замещающие аминокислотные остатки могут иметь малую боковую цепь.

[0198] В некоторых вариантах осуществления CD40L-специфичные Tn3-мономерные субъединицы по настоящему изобретению состоят из аминокислотной последовательности:

IEV(X_AB)_nALITW(X_BC)_nCELX₁YGI(X_CD)_nTTIDL(X_DE)_nYSI(X_EF)_nYEVSLIC(X_FG)_nKETFTT,

где

(a) X_AB, X_BC, X_CD, X_DE, X_EF и X_FG представляют собой аминокислотные остатки, присутствующие в последовательностях петель AB, BC, CD, DE, EF и FG, соответственно;

(b) X₁ представляет собой аминокислотный остаток аланин (A) или треонин (T); и

(c) длина петли n представляет собой целое число от 2 до 26.

[0199] В одном варианте осуществления бета-цепи CD40L-специфичной Tn3-мономерной каркасной структуры имеют по меньшей мере 90% идентичность последовательности с бета-цепями исходной Tn3-каркасной структуры (SEQ ID NO: 3). Для вычисления такого процента идентичности последовательности аминокислотные последовательности выравнивают с помощью способов, известных в данной области техники. Процент идентичности аминокислотной последовательности определяют как соотношение между (a) числом аминокислот, расположенных в бета-цепях, которые идентичны в выравнивании последовательности, и (b) общим числом аминокислот, расположенных в бета-цепи.

[0200] В одном варианте осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 136. В другом варианте осуществления последовательность петли CD содержит SEQ ID NO: 6. В другом варианте осуществления последовательность петли EF содержит SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 137. В одном варианте осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 136. В другом варианте осуществления последовательность петли CD состоит из SEQ ID NO: 6. В другом варианте осуществления последовательность петли EF состоит из SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 137.

[0201] В одном варианте осуществления последовательность петли BC содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 и 93. В другом варианте осуществления последовательность петли BC состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 и 93.

[0202] В одном варианте осуществления последовательность петли DE содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 и 98. В другом варианте осуществления последовательность петли DE состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 и 98.

[0203] В одном варианте осуществления последовательность петли FG содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 99 и 139. В другом варианте осуществления последовательность петли FG состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 99 и 139.

[0204] В одном варианте осуществления последовательность петли BC содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 и 117. В другом варианте осуществления последовательность петли BC состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 и 117.

[0205] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли DE содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 и 128. В других вариантах осуществления последовательность петли DE состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 и 128.

[0206] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли FG содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 129 и 130. В других вариантах осуществления последовательность петли FG состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 129 и 130.

[0207] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0208] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 99. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 99.

[0209] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 84, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 84, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0210] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 85, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 85, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0211] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 86, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 96 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 86, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 96 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0212] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 87, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 97 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 87, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 97 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0213] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 88, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 88, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0214] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 89, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 89, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0215] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 90, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 90, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0216] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 91, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 91, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 95 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0217] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 92, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 98 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 92, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 98 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0218] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 93, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 93, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 94 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 9 или 139.

[0219] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 168, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 169 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 170. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 168, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 169 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 170.

[0220] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 100, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 100, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0221] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136 последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 101, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 119 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 101, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 119 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0222] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 102, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 120 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 102, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 120 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0223] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 103, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 103, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0224] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 104, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 122 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 104, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 122 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0225] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 105, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 105, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0226] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 106, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 106, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0227] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 107, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 107, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0228] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0229] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 109, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 109, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0230] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 110, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 110, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0231] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 111, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 130. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 111, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 123 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 130.

[0232] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 121 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0233] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 112, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 124 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 112, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 124 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0234] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 113, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 125 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 113, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 125 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0235] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 114, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 114, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 118 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0236] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 115, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 126 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 115, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 126 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0237] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 116, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 127 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 116, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 127 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0238] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли AB содержит SEQ ID NO: 136, последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 117, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 128 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129. В других вариантах осуществления последовательность петли AB состоит из SEQ ID NO: 136, последовательность петли ВС состоит из SEQ ID NO: 117, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 128 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 129.

[0239] В некоторых вариантах осуществления последовательность петли BC содержит SEQ ID NO: 174, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 175 и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 177. В других вариантах осуществления последовательность петли BC состоит из SEQ ID NO: 174, последовательность петли DE состоит из SEQ ID NO: 175 и последовательность петли FG состоит из SEQ ID NO: 177.

[0240] В некоторых вариантах осуществления CD40L-специфичная мономерная субъединица содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 и 146. В других вариантах осуществления CD40L-специфичная мономерная субъединица состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 и 146.

[0241] В некоторых вариантах осуществления CD40L-специфичная мономерная субъединица содержит SEQ ID NO: 28 или 146. В других вариантах осуществления CD40L-специфичная мономерная субъединица состоит из SEQ ID NO: 28 или 146.

[0242] В некоторых вариантах осуществления CD40L-специфичные Tn3-мономерные субъединицы по настоящему изобретению содержат аминокислотную последовательность:

где

(a) X₁ представляет собой аминокислотный остаток серин (S) или лейцин (L);

(b) X₂ представляет собой аминокислотный остаток аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (E);

(c) X₃ представляет собой аминокислотный остаток гистидин (H), изолейцин (I), валин (V), фенилаланин (F) или триптофан (W);

(d) X₄ представляет собой аминокислотный остаток аланин (A), глицин (G), глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D);

(e) X₅ представляет собой аминокислотный остаток глутаминовую кислоту (E), лейцин (L), глутамин (Q), серин (S), аспарагиновую кислоту (D) или аспарагин (N);

(f) X₆ представляет собой аминокислотный остаток фенилаланин (F) или тирозин (Y);

(g) X₇ представляет собой аминокислотный остаток изолейцин (I), валин (V), гистидин (H), глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D);

(h) X₈ представляет собой аминокислотный остаток глицин (G), триптофан (W) или валин (V);

(i) X₉ представляет собой аминокислотный остаток триптофан (W), фенилаланин (F) или тирозин (Y);

(j) X₁₀ представляет собой аминокислотный остаток серин (S), глутамин (Q), метионин (M) или гистидин (H);

(k) X₁₁ представляет собой аминокислотный остаток триптофан (W) или гистидин (H); и

(l) X₁₂ представляет собой аминокислотный остаток аргинин (R) или серин (S).

[0243] В некоторых вариантах осуществления CD40L-специфичные Tn3-мономерные субъединицы по настоящему изобретению состоят из аминокислотной последовательности: