КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-STING АГОНИСТ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 2024 года по МПК A61K47/68 A61P35/00 

1. Список последовательностей

Настоящая заявка содержит Список последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в настоящий текст в полном объеме посредством ссылки. Указанный файл ASCII, созданный 17 июля 2020 г., имеет название 400160_005US_SL_ST25.txt и размер 44502 байта.

2. Область техники

Настоящее изобретение, среди прочего, касается применения STING агонистов в конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC, от англ. «antibody-drug conjugate») для иммунотерапии; композиций, содержащих ADC, способов получения ADC и способов применения ADC для лечения рака.

3. Предпосылки создания изобретения

Путь, чувствительный по отношению к цитоплазматической ДНК, играет важную роль в инициировании и поддержании иммунного ответа против злокачественных опухолей, помимо его главной функции, состоящей в защите хозяина от заражения ДНК-содержащими микробами. Цитоплазматическая ДНК из поврежденных опухолевых клеток запускает активацию фермента, называемого циклической АМФ-ГМФ синтазой (cGAS), который синтезирует 2’3’-циклический АМФ-ГМФ (cGAMP). Как эндогенный лиганд, cGAMP связывает и активирует ER адаптерный белок Стимулятор Генов Интерферона (STING), и приводит к выбросу интерферонов и воспалительных цитокинов, выработке и созреванию антигенпредставляющих клеток, и в конечном итоге - к противоопухолевому иммунному ответу, осуществляемому Т клетками и клетками-естественными киллерами (NK). Ряд STING агонистов, которые схожи с cGAMP, но обладают улучшенными терапевтическими свойствами, находятся в разработке для применения в иммунотерапии рака. Хотя эти лекарственные препараты являются многообещающими для лечения ряда солидных опухолей, у них есть очевидные ограничения. Этим соединениям необходимо внутриопухолевое введение, из-за того, что они способны вызывать системный цитокиновый ответ при иных локализациях инъекции. Даже при внутриопухолевой инъекции все-таки может возникать нежелательный цитокиновый ответ из-за быстрой утечки в периферические ткани. Короткий контакт этих соединений с иммунными клетками в окружении опухоли также снижает их эффективность. Поэтому есть острая потребность в новых терапевтических средствах, которые могут специфично доставлять STING агонист в окружение опухоли и обладают продолжительным временем удерживания.

4. Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении описаны определенные циклические динуклеотиды (ЦДН), которые могут конъюгироваться с антителами или антиген-связывающими фрагментами, нацеленными на специфичные антигены в микроокружении пораженных клеток или тканей. Например, антитела или их антиген-связывающие фрагменты могут связываться с раковыми антигенами, присутствующими на клетках в микроокружении опухоли, таких как опухолевые клетки или иммунные клетки. ЦДН по настоящему изобретению оказывают агонистическое действие на STING, тем самым стимулируя иммунную систему. Когда ЦДН по настоящему изобретению конъюгированы с антителами, нацеленными на антигены в пораженной клетке или ткани, они обеспечивают достаточное время контакта с ЦДН в микроокружении пораженных клеток или тканей, в то же время уменьшая вредные побочные эффекты, связанные с большой утечкой ЦДН в периферические ткани.

В одном аспекте в настоящем изобретении описаны конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), имеющие структуру формулы I:

(Формула I) Ab-[-L-(D)_m]_n

где:

“D” представляет собой ЦДН (например, описанный в настоящей заявке ЦДН, такой как имеющий формулу II);

“Ab” представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном;

“L” в каждом случае независимо представляет собой линкер, связывающий один или более D с Ab;

“m” это количество D, связанных с данным линкером; и

“n” это число линкеров, связанных с Ab.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описаны ADC, имеющие структуру формулы Ia:

(Формула Ia) Ab-[-L-D]_n

где:

“D” представляет собой ЦДН (например, описанный в настоящей заявке ЦДН, такой как имеющий формулу II);

“Ab” представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном;

“L” в каждом случае независимо представляет собой линкер, связывающий D с Ab; и

“n” это количество D, связанных с Ab через линкер (L).

В другом аспекте в настоящем изобретении описаны специфические ЦДН (D), которые можно вводить как таковые или как часть ADC формулы I. Эти ЦДН могут иметь структуру формулы II:

Формула II

где

R¹ представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный гидроксильной, тиольной, амино-, C_1-6алкиламино- или -ПЭГ-OH группой;

R³ и R⁴ независимо представляют собой атом водорода, галоген, C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил или C_2-6 алкинил, где C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил и C_2-6 алкинил независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидроксиалкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы;

R², R⁵ и R⁶ независимо представляют собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил или C_3-6 алкинил-O-, где C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил и C_3-6 алкинил-O- независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидроксиалкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R⁶ и R⁵ вместе представляют собой =CH₂; или R⁶ и R⁴ вместе образуют мостик через кольцо, содержащее V², выбранный из этилена, -O-CH₂- и -NH-CH₂-;

V¹ и V² независимо представляют собой O, S или CH₂;

BG¹, начинающийся от атома углерода в кольце, содержащем V¹, и BG², начинающийся от атома углерода в кольце, содержащем V², независимо представляют собой -O-P(O)R^p-O-, -O-P(S)R^p-O-, -O-P(O)R^p-S-, -O-P(S)R^p-S-, -S-P(O)R^p-O-, -S-P(S)R^p-O-, -S-P(O)R^p-S-, -S-P(S)R^p-S- или -NH-SO₂-NH-; где

R^p в каждом случае независимо представляет собой гидроксил, тиол, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_3-6 алкенил-O-, C_3-6 алкинил-O-, -ПЭГ-OH, борано-группу (-BH₃⁻) или -NR’R”, где C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_3-6 алкенил-O- и C_3-6 алкинил-O- независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидроксиалкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; и

R’ и R” независимо представляют собой атом водорода или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R’ и R”, вместе присоединенные к одному атому азота, образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо;

R^a1, R^b1, R^a2 и R^b2 независимо представляют собой атом водорода или C_1-3 алкил; и

B¹ и B² независимо выбраны из:

и ,

где

V³ представляет собой O или S, в частности O;

Z¹, Z², Z³, Z⁴, Z⁵ и Z⁶ в каждом случае независимо представляют собой CR^z или N;

Z^a представляет собой O (за исключением случаев, когда Z⁵ представляет собой N) или NR’; где

R^z в каждом случае независимо представляет собой атом водорода, галоген, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил, C_3-6 алкинил-O-, -NO₂, -CN, -C(O)C_1-6 алкил, -CO₂H, -CO₂C_1-6 алкил, -S(O)C_1-6 алкил, -S(O)₂C_1-6 алкил, -C(O)NR’, -C(O)NR’R”, -SO₂NR’R”, -OC(O)C_1-6 алкил, -NR’C(O)C_1-6 алкил, -N(R’)C(O)NR’R”, -N(R’)SO₂NR’R”, -N(R)SO₂C_1-6 алкил или -OC(O)NR’R”, где

C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил и C_3-6 алкинил-O- в каждом случае независимо необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; и

R’ и R” в каждом случае независимо представляют собой атом водорода или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R’ и R”, присоединенные к одному и тому же атому азота, вместе образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении описаны способы получения ADC формулы I путем конъюгирования ЦДН формулы II с антителом через линкер. ЦДН формулы II может быть конъюгирован с антителом через расщепляемый или нерасщепляемый линкер. В частных вариантах осуществления ЦДН высвобождается в опухолевых клетках, раковых иммунных клетках или в микроокружении опухоли посредством расщепления линкера.

В ADC формулы I, где ЦДН (D) имеет формулу II, ЦДН может быть ковалентно связан с линкером (L) по гидроксильной, тиольной, амино-группе, C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе в R¹ положении ЦДН формулы II.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения ЦДН формулы II имеет формулу IIe:

Формула IIe

где R¹, R⁵ и R⁶; R^P; и B¹ и B² имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения ЦДН формулы II имеет формулу IIk:

Формула IIk

где

W, X, Y и Z независимо представляют собой CH или N; и

R^P в каждом случае независимо имеет значение, указанное выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана композиция, содержащая ЦДН и основание, где ЦДН представляет собой соединение формулы II, такой как изображенная выше формула IIe или IIk, или изображенная ниже формула IIn или IIo. В некоторых из таких вариантов осуществления композиция состоит из ЦДН и основания. В некоторых вариантах осуществления основание представляет собой аминное основание, такое как пиридин. В некоторых из таких вариантов осуществления композиция является безводной.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана композиция, содержащая ЦДН и линкер или сшивающий агент, или линкер и сшивающий агент вместе, где ЦДН представляет собой соединение формулы II, такой как изображенная выше формула IIe или IIk, или изображенная ниже формула IIn или IIo, и где сшивающий агент обеспечивает сочетание (coupling) ЦДН с линкером, например, посредством генерирования активированного эфира на линкере. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит апротонный полярный растворитель. В некоторых вариантах осуществления композиция является безводной.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описано соединение, которое представляет собой циклический динуклеотид (ЦДН), связанный с линкером (L), формулы L-ЦДН. В некоторых вариантах осуществления ЦДН связан с линкером L через тиоэфирную, амидную, сложноэфирную, карбаматную, карбонатную, мочевинную, дисульфидную группу или простую эфирную группу, в особенности через амидную, карбаматную или дисульфидную группу. В некоторых вариантах осуществления ЦДН имеет формулу II, такую как изображенная выше формула IIe или IIk, или изображенная ниже формула IIm, IIn или IIo, и ЦДН связан с L по тиольной группе, амино-группе или C_1-6 алкиламино группе в R¹ формулы II, и L содержит сайт, способный связываться с комплементарным сайтом на антителе.

В одном варианте осуществления ADC формулы I имеет структуру, отвечающую формуле III:

Формула III

где переменные W, X, Y, Z, R^P и n имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В одном варианте осуществления ADC формулы I имеет структуру, отвечающую формуле IV:

Формула IV

где переменные W, X, Y, Z, R^P и n имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В одном варианте осуществления ADC формулы I или III получен из ЦДН (D), имеющего следующую структуру (ЦДН-A):

или его фармацевтически приемлемой соли. Следует понимать, что выражение “получен из” означает, что аминная (-NH₂) функциональная группа в R¹ положении ЦДН ковалентно связана с соответствующим положением в линкере. Например, в некоторых вариантах осуществления амино-группа ковалентно связана с карбонильным фрагментом в линкере, формируя тем самым амидную или карбаматную связь.

В другом варианте осуществления ADC формулы I или IV получен из ЦДН (D), имеющего следующую структуру (ЦДН-B):

или его фармацевтически приемлемой соли. Следует понимать, что выражение “получен из” означает, что тиольная (-SH) функциональная группа в R¹ положении ЦДН ковалентно связана с соответствующим положением в линкере. Например, в некоторых вариантах осуществления тиольная группа ЦДН ковалентно связана с тиольной группой в линкере, формируя тем самым дисульфидную связь.

В другом варианте осуществления ADC формулы I или III получен из ЦДН (D), имеющего следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом варианте осуществления ADC формулы I или III получен из ЦДН (D), имеющего следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом варианте осуществления ADC формулы I или III получен из ЦДН (D), имеющего следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антиген-связывающий фрагмент ADC формулы I, III или IV нацелен на специфический антиген, который экспрессируется на опухолевых клетках или иммунных клетках в микроокружении опухоли. В частных вариантах осуществления антитело или антиген-связывающий фрагмент ADC формулы I, III или IV нацелен на рецептор PD-L1. В других частных вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфично связывается с опухолевым антигеном, имеющим отношение к раку, который представляет собой рецептор фактора роста (GFR). В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген, имеющий отношение к раку, представляет собой GFR из семейства EGFR/ErbB/HER.

В одном аспекте в настоящем изобретении описаны способы вызывания иммунного ответа у субъекта (например, человека) путем введения терапевтически эффективного количества ADC формулы I, III или IV. Например, ADC формулы I, III или IV можно применять для индуцирования выработки интерферона-β (IFNβ) у человека.

ADC формулы I, III или IV можно применять в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими агентами. Дополнительный терапевтический агент(ы) можно вводить до, одновременно или после введения дополнительного терапевтического агента(-ов). В частном варианте осуществления ADC формулы I, III или IV можно применять в комбинации с ингибитором иммунных контрольных точек. Например, ADC формулы I, III или IV можно вводить с ингибитором PD-1, PD-L1 или CTLA-4, или с их комбинацией.

В другом варианте осуществления ADC формулы I, III или IV можно вводить со свободным ЦДН, который не конъюгирован с антителом или антиген-связывающим фрагментом формулы I. В таких случаях свободный ЦДН может быть таким же или отличаться от ЦДН, конъюгированного с антителом в ADC формулы I, III или IV.

5. Краткое описание чертежей

На Фиг. 1A-1D показаны структурные характеристики и активность ADCI. На Фиг. 1A изображена химическая структура ADCI. На Фиг. 1B и 1C показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG и человеческих клеток THP1-Lucia ISG, соответственно. На Фиг. 1D показано развитие опухоли у C57BL6 мышей с B16-F10 опухолью при указанном лечении. Взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A1.

На Фиг. 2A-2C показаны структурные характеристики и активность ADCII. На Фиг. 2A изображена химическая структура ADCII. На Фиг. 2B и 2C показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG и человеческих клеток THP1-Lucia ISG, соответственно.

На Фиг. 3A-3B показаны структурные характеристики и активность ADCIII. На Фиг. 3A изображена химическая структура ADCIII. На Фиг. 3B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG. Взятое в качестве образца для сравнения анти-EGFR антитело представляет собой Ab-B1.

На Фиг. 4A-4F показаны структурные характеристики и активность ADCIV. На Фиг. 4A изображена химическая структура ADCIV. На Фиг. 4B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG (кратность изменения в сравнении с клетками, которые стимулировали фосфатно-солевым буфером PBS). На Фиг. 4C и 4D показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. На Фиг. 4E и 4F показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. Взятое в качестве образца для сравнения анти-EGFR антитело представляет собой Ab-B1, и взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A3.

На Фиг. 5A-5B показаны структурные характеристики и активность ADCV. На Фиг. 5A изображена химическая структура ADCV. На Фиг. 5B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG. Взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A3.

На Фиг. 6A-6F показаны структурные характеристики и активность ADCVI. На Фиг. 6A изображена химическая структура ADCVI. На Фиг. 6B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG. На Фиг. 6C и 6D показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. Взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A2. На Фиг. 6E и 6F показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении.

На Фиг. 7A-7F показаны структурные характеристики и активность ADCVII. На Фиг. 7A изображена химическая структура ADCVII. На Фиг. 7B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG (кратность изменения в сравнении с клетками, которые стимулировали фосфатно-солевым буфером PBS). На Фиг. 7C и 7D показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. I.p. (интраперитонеальные) инъекции осуществляли в дни 7, 11 и 15. На Фиг. 7E и 7F показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. I.p. инъекции осуществляли в дни 7, 11 и 15. Взятое в качестве образца для сравнения анти-EGFR антитело представляет собой Ab-B2, и взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A3.

На Фиг. 8A-8D показаны структурные характеристики и активность ADCVIII. На Фиг. 8A изображена химическая структура ADCVIII. На Фиг. 8B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG. На Фиг. 8C и 8D показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. I.p. инъекции осуществляли в дни 7, 11 и 15. Взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A3.

На Фиг. 9A-9D показаны структурные характеристики и активность ADCIX. На Фиг. 9A изображена химическая структура ADCIX. На Фиг. 9B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG. На Фиг. 9C и 9D показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. I.p. инъекции осуществляли в дни 6, 9 и 13. Взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A3.

На Фиг. 10A-10E показаны структурные характеристики и активность ADCX. На Фиг. 10A изображена химическая структура ADCX. На Фиг. 10B показан потенциал IFN-стимулирующей активности в анализе с репортерным геном люциферазы с использованием мышиных клеток RAWLucia ISG. На Фиг. 10C и 10D показано развитие и выживание опухоли, соответственно, у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. I.p. инъекции осуществляли в дни 6, 10 и 13. Взятое в качестве образца для сравнения анти-HER2 антитело представляет собой Ab-C1 (трастузумаб), и взятое в качестве образца для сравнения анти-PDL1 антитело представляет собой Ab-A3. На Фиг. 10E показано развитие опухоли у EGFR-экспрессирующих C57BL6 мышей с B16F10 опухолью при указанном лечении. I.p. и внутриопухолевые (i.t.) инъекции осуществляли в дни 7 и 11.

6. Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении описаны конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), каждый из которых содержит антитело, один или более циклических динуклеотидов (ЦДН), и один или более линкеров, которые соединяют один или более ЦДН с антителом. ADC по настоящему изобретению способны оказывать агонистическое действие и/или связываться с STING и вызывать иммунный ответ.

6.1. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC)

В некоторых вариантах осуществления ADC по настоящему изобретению имеют структуру формулы I:

(Формула I) Ab-[-L-(D)_m]_n

где:

“D” представляет собой ЦДН (например, ЦДН описанный в настоящей заявке, такой как имеющий формулу II);

“Ab” представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном;

“L” в каждом случае независимо представляет собой линкер, связывающий один или более D с Ab;

“m” это количество D, связанных с данным линкером; и

“n” это число линкеров, связанных с Ab.

В некоторых вариантах осуществления формулы I m представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 10, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых случаях m находится в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, или от 1 до 10, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, или от 1 до 6. В других вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, в которых m находится в определенном диапазоне значений, например m находится в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, или от 1 до 10, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, или от 1 до 6. В некоторых вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, таких? что более 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% ADC в этой смеси имеют значение m равное 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, таких, что более 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% ADC в этой смеси имеют значение m в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, или от 1 до 10, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, или от 1 до 6.

В других вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, и m заменен на “m_cp”, который представляет собой среднее значение m для данной смеси, т.е. среднее число ЦДН, связанных с данным линкером (L) в смеси, которое можно вычислить делением общего числа ЦДН, связанных с антителом, на общее число ЦДН-содержащих линкеров (L) в смеси. В таких вариантах осуществления m_cp представляет собой целое или нецелое число в диапазоне от 1 до 10, например в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, или от 1 до 9, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, или от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления формулы I n представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 20, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В некоторых случаях n находится в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, или от 1 до 8. В других вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, в которых n находится в определенном диапазоне значений, например n находится в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, или от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, таких, что более 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% ADC в этой смеси имеют значение n равное 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В некоторых вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, таких? что более 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% ADC в этой смеси имеют значение n в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, или от 1 до 10.

В других вариантах осуществления Формула I описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, и n заменен “n_cp”, который представляет собой среднее значение n для данной смеси, т.е. среднее число линкеров (L), связанных с данным антителом (Ab) в смеси, которое можно вычислить делением общего числа линкеров (L), связанных с антителом, на общее число линкер-содержащих антител (Ab) в смеси. В таких вариантах осуществления n_cp представляет собой целое или нецелое число в диапазоне от 1 до 20, например в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, или от 1 до 10.

В некоторых вариантах осуществления m равен 1, и в этом случае ADC имеет 1:1 соотношение линкера к ЦДН и может быть представлен формулой Ia:

(Формула Ia) Ab-[-L-D]_n

где:

“D” представляет собой ЦДН (например, ЦДН описанный в настоящей заявке, такой как имеющий формулу II);

“Ab” представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном;

“L” в каждом случае независимо представляет собой линкер, связывающий один или более D с Ab; и

“n” это количество D, связанных с Ab через линкер (L).

В некоторых вариантах осуществления формулы Ia n представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 20, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В некоторых случаях n находится в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, или от 1 до 8. В других вариантах осуществления Формула Ia описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, в которых n находится в определенном диапазоне значений, например n находится в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, или от 1 до 8. В некоторых вариантах осуществления Формула Ia описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, таких, что более 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% ADC в этой смеси имеют значение n равное 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В некоторых вариантах осуществления Формула Ia описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, таких, что более 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% ADC в этой смеси имеют значение n в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, или от 1 до 8.

В других вариантах осуществления Формула Ia описывает ADC в виде смеси нескольких ADC, и n заменен “n_cp”, который представляет собой среднее значение n для данной смеси, т.е. среднее число линкеров (L), связанных с данным антителом (Ab) в смеси, которое можно вычислить делением общего числа линкеров (L), связанных с антителом, на общее число линкер-содержащих антител (Ab) в смеси. В таких вариантах осуществления n_cp представляет собой целое или нецелое число в диапазоне от 1 до 20, например в диапазоне от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, от 1 до 10, от 1 до 11, от 1 до 12, от 1 до 13, от 1 до 14, от 1 до 15, от 1 до 16, от 1 до 17, от 1 до 18, от 1 до 19, или от 1 до 20, например от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 1 до 6, от 1 до 7, от 1 до 8, от 1 до 9, или от 1 до 10.

ADC по настоящему изобретению являются “модульными” по своей природе, то есть каждый из них содержит модульные компоненты Ab, L и D. В настоящем изобретении описаны различные частные неограничивающие варианты осуществления и примеры этих модульных компонентов. Модули всех частных вариантов осуществления, описанных в настоящем изобретении, можно комбинировать друг с другом, как если бы каждая отдельная комбинация была в явном виде описана отдельно.

Квалифицированному специалисту в данной области будет также понятно, что различные описанные в настоящем изобретении ADC могут быть в форме солей и, в некоторых частных вариантах осуществления - в виде фармацевтически приемлемых солей.

6.2. Циклические динуклеотиды (ЦДН)

ЦДН, применяющиеся по настоящему изобретению, содержат два нуклеозида, соединенные двумя мостиковыми группами. В некоторых вариантах осуществления ЦДН представляют собой 2’3’-ЦДН, то есть каждый нуклеозид включает циклический 5-углеродный сахар (пентозу), где первый нуклеозид связан по 2’-положению своего сахара с 5’-положением сахара второго нуклеозида, например посредством мостиковой группы, с образованием 2’-5’ связки, и второй нуклеозид связан по 3’-положению своего сахара с 5’-положением сахара первого нуклеозида, например посредством мостиковой группы, с образованием 3’-5’ связки. Примеры подходящих 2’3’-ЦДН включают 2’3’-cGAMP и его аналоги или производные, включая фармацевтически приемлемые соли. ЦДН приведенной ниже формулы II представляют собой 2’3’-ЦДН.

В других вариантах осуществления ЦДН представляют собой 3’3’-ЦДН, где первый нуклеотид связан со вторым нуклеотидом, например посредством мостиковой группы, 3’-5’ связкой, аналогично описанному выше, и второй нуклеотид связан с первым нуклеотидом, например посредством мостиковой группы, также 3’-5’ связкой аналогично описанному выше. Примеры подходящих 3’3’-ЦДН включают 3’3’-cGAMP и его аналоги или производные, включая фармацевтически приемлемые соли.

В других вариантах осуществления ЦДН представляют собой 2’2’-ЦДН, где первый нуклеотид связан со вторым нуклеотидом, например посредством мостиковой группы, 2’-5’ связкой, аналогично описанному выше, и второй нуклеотид связан с первым нуклеотидом, например, посредством мостиковой группы, также 2’-5’ связкой аналогично описанному выше. Примеры подходящих 2’2’-ЦДН включают 2’2’-cGAMP и его аналоги или производные, включая фармацевтически приемлемые соли.

В других вариантах осуществления ЦДН представляют собой 3’2’-ЦДН, где первый нуклеотид связан со вторым нуклеотидом, например посредством мостиковой группы, 3’-5’ связкой, аналогично описанному выше, и второй нуклеотид связан с первым нуклеотидом, например посредством мостиковой группы, 2’-5’ связкой аналогично описанному выше. Примеры подходящих 3’2’-ЦДН включают 3’2’-cGAMP и его аналоги или производные, включая фармацевтически приемлемые соли.

6.2.1. Нуклеозиды

В некоторых случаях каждый нуклеозид в ЦДН содержит нуклеиновое основание, которое независимо от остальных может представлять собой пиримидиновое основание или пуриновое основание. Например, каждое нуклеиновое основание может представлять собой каноническое нуклеиновое основание (такое как аденин, гуанин, тимин, урацил или цитозин) или неканоническое, модифицированное неприродное нуклеиновое основание (такое как ксантин, гипоксантин, 7-метилгуанин, 5,6-дигидроурацил, 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, 1-метилцитозин, 2,6-диаминопурин, 6,8-диаминопурин, 2-аминоимидазо[1,2a][1,3,5]триазин-4(1H)-он, 6-амино-5-нитропиридин-2-он, изо-гуанин, изо-цитозин, 5-(2,4-диаминопиримидин), 4-тиоурацил, псевдоурацил и т.д.). Подходящие нуклеиновые основания включают описанные ниже для переменных B¹ и B².

В некоторых случаях ЦДН содержит два нуклеозида, которые содержат два пиримидиновых основания или два пуриновых основания, или одно пиримидиновое основание и одно пуриновое основание. В некоторых вариантах осуществления два нуклеозида содержат два пуриновых основания, таких как an аденин и гуанин, два аденина или два гуанина, в частности аденин и гуанин или два аденина. Следует понимать, что указание определенного нуклеинового основания или другой химической структуры (например, “аденин”) говорит о том, что оно охватывает как каноническое нуклеиновое основание, так и его модифицированные варианты.

В некоторых вариантах осуществления ЦДН содержит два нуклеозида, каждый из которых включает циклический 5-углеродный сахар (пентозу), такую как D- или L-рибоза или деоксирибоза, D- или L-арабиноза, D- или L-ликсоза, D- или L-ксилоза, или их модифицированные формы. В некоторых случаях одна из пентоз в ЦДН (например, рибоза) соединена с линкером (L) в 3’-положении сахара, например через C_1-6 алкильную группу (например, C_2-6 алкильную группу) в 3’-положении, и эта C_1-6 алкильная группа необязательно замещена гидроксильной, тиольной, амино-, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой; гидроксильной, тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; или тиольной или амино-группой. В других вариантах осуществления одна из пентоз в ЦДН (например, рибоза) соединена с линкером (L) в 2’-положении сахара, например через C_1-6 алкильную группу (например, C_2-6 алкильную группу) в 2’ положении, и эта C_1-6 алкильная группа необязательно замещена гидроксильной, тиольной, амино-, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой; гидроксильной, тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; или тиольной или амино-группой. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен к ЦДН путем замены протона в гидроксильной, тиольной, амино-группе, C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе.

Приведенные ниже описания группы в 3’-положении пентозы применимы также к группе в 2’-положении пентозы.

В некоторых случаях группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C_1-6 алкильную группу, такую как C_2-6 алкильная группа, замещенную гидроксилом, такую как -этилен-OH, -пропилен-OH, -бутилен-OH или -пентилен-OH. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в гидроксильной группе в одной из перечисленных выше групп.

В некоторых случаях группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C_1-6 алкильную группу, такую как C_2-6 алкильная группа, замещенную тиольной группой, такую как -этилен-SH, -пропилен-SH, -бутилен-SH или -пентилен-SH. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в тиольной группе в одной из перечисленных выше групп.

В некоторых случаях группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C_1-6 алкильную группу, такую как C_2-6 алкильная группа, замещенную амино-группой, такую как -этилен-NH₂, -пропилен-NH₂, -бутилен-NH₂ или -пентилен-NH₂. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в амино-группе в одной из перечисленных выше групп.

В некоторых вариантах осуществления группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C_1-6 алкильную группу, такую как C_2-6 алкильная группа, замещенную C_1-6 алкиламино-группой, такую как -этилен-N(C_1-6 алкил)H, -пропилен-N(C_1-6 алкил)H, -бутилен-N(C_1-6 алкил)H или -пентилен-N(C_1-6 алкил)H. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в C_1-6 алкиламино-группе в одной из перечисленных выше групп.

В некоторых вариантах осуществления группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C_1-6 алкильную группу, такую как C_2-6 алкильная группа, замещенную -ПЭГ-OH группой, такую как -этилен-ПЭГ-OH, -пропилен-ПЭГ-OH, -бутилен-ПЭГ-OH или -пентилен-ПЭГ-OH. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в терминальном гидроксиле -ПЭГ-OH группы. Следует понимать, что “ПЭГ” означает полимерный полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид или полиоксиэтилен, содержит повторяющиеся фрагменты -(O-CH₂-CH₂)x- и имеет средний молекулярный вес от 200 до 10000 г/моль, например от 200, 400, 800, 1000, 2000 или 4000 до 5000, 6000 8000 или 10000 г/моль, включая диапазоны от 400 до 8000 г/моль, от 400 до 2000 г/моль, от 5000 до 10000 г/моль, от 1000 до 4000 г/моль, от 1000 до 6000 г/моль или от 2000 до 6000 г/моль, включая значения меньше 4000, 5000 или 6000 г/моль.

В некоторых случаях группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C_2-3 алкильную группу, замещенную гидроксильной группой, тиольной группой, амино-группой, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой, такую как -этилен-OH, -пропилен-OH, -этилен-SH, -пропилен-SH, -этилен-NH₂, -пропилен-NH₂, -этилен-N(C_1-6 алкил)H, -пропилен-N(C_1-6 алкил)H, -этилен-ПЭГ-OH или -пропилен-ПЭГ-OH. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в гидроксильной, тиольной, амино-группе или C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе в одной из перечисленных выше групп.

В некоторых случаях группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C₂ алкильную группу (этильную группу), замещенную гидроксильной группой, тиольной группой, амино-группой, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой, такую как -этилен-OH, -этилен-SH, -этилен-NH₂, -этилен-N(C_1-6 алкил)H или -этилен-ПЭГ-OH. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в гидроксильной, тиольной, амино-группе или C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе в одной из перечисленных выше групп.

В некоторых случаях группа в 3’-положении пентозы (например, рибозы) представляет собой C₃ алкильную группу (пропильную группу), замещенную гидроксильной группой, тиольной, амино-группой, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой, такую как -пропилен-OH, -пропилен-SH, -пропилен-NH₂, -пропилен-N(C_1-6 алкил)H или -пропилен-ПЭГ-OH. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен путем замены протона в гидроксильной, тиольной, амино-группе или C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе в одной из перечисленных выше групп.

В некоторых вариантах осуществления одна из пентоз в ЦДН (например, рибоза) соединена с линкером (L) в 3’-положении сахара через замещенную метильную группу в 3’-положении, при этом метильная группа замещена, например, гидроксильной, тиольной, амино-группой, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой; гидроксильной, тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; тиольной или амино-группой; или тиольной группой. В некоторых вариантах осуществления линкер (L) присоединен к ЦДН путем замены протона в гидроксильной, тиольной, амино-группе, C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе.

В некоторых вариантах осуществления ЦДН содержит два нуклеозида, каждый из которых включает рибозу, где одна из рибоз соединена с линкером (L) через C_2-6 алкильную группу (такую как C₂ алкильная, C₃ алкильная или C_2-3 алкильная группа) в 3’-положении рибозного цикла, при этом C_2-6 алкильная группа необязательно замещена гидроксильной, тиольной, амино-группой, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой; гидроксильной, тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; или тиольной или амино-группой; где линкер (L) присоединен к ЦДН путем замены протона в гидроксильной, тиольной, амино-группе, C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе.

В некоторых вариантах осуществления ЦДН содержит два нуклеозида, каждый из которых включает рибозу, где одна из рибоз соединена с линкером (L) через замещенную этильную группу в 3’-положении рибозного цикла, при этом этильная группа замещена, например, гидроксильной, тиольной, амино-группой, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой; гидроксильной, тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой; или тиольной или амино-группой; где линкер (L) присоединен к ЦДН путем замены протона в гидроксильной, тиольной, амино-группе, C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе.

В некоторых вариантах осуществления ЦДН содержит два нуклеозида, каждый из которых включает рибозу, где одна из рибоз соединена с линкером (L) через замещенную этильную группу в 3’-положении рибозного цикла, выбранную из -CH₂CH₂-OH, -CH₂CH₂-SH и -CH₂CH₂-NH₂, в частности из -CH₂CH₂-SH и -CH₂CH₂-NH₂; где линкер (L) присоединен к ЦДН путем замены протона в гидроксильной, тиольной или амино-группе.

6.2.2. Мостиковые группы

Как следствие своей циклической структуры, ЦДН включают две мостиковые группы, которые соединяют описанные выше нуклеозиды, формируя макроцикл ЦДН. В некоторых вариантах осуществления мостиковые группы независимо включают от 2 до 5 атомов в мостике между двумя сахарами нуклеозидов, например 3 атома. Например, -O-P(=O)(OH)-O- может являться мостиковой группой, при этом следует понимать, что сахара соединены по терминальным атомам кислорода, и в мостике содержится три атома. Мостиковые группы независимо могут включать только гетероатомы в составе мостика, гетератомы и атомы углерода в составе мостика, или только атомы углерода в составе мостика.

В некоторых случаях мостиковые группы представляют собой двухвалентные фосфатные или тиофосфатные группы или их модифицированные варианты, например -O-P(=O)(OH)-O- или -O-P(=O)(SH)-O-. Например, две мостиковые группы могут быть независимо выбраны из -O-P(O)R^P-O-, -O-P(S)R^P-O-, -O-P(O)R^P-S-, -O-P(S)R^P-S-, -S-P(O)R^P-O-, -S-P(S)R^P-O-, -S-P(O)R^P-S- или -S-P(S)R^P-S-, где R^P имеет приведенное ниже значение. В некоторых вариантах осуществления R^P в описанных выше мостиковых группах в каждом случае независимо выбран из гидроксила или тиола.

Следует понимать, что когда обе мостиковые группы представляют собой фосфатные группы или их модифицированные варианты, то каждая мостиковая группа в комбинации с описанным выше нуклеозидом представляет собой нуклеотид, а оба набора мостиковых групп и нуклеозидов дают циклический динуклеотид. Тем не менее ЦДН по настоящему изобретению необязательно ограничены мостиковыми группами, являющимися фосфатными группами.

6.2.3. Частные варианты ЦДН

В настоящем изобретении описаны ЦДН (D), которые можно вводить как таковые или как часть ADC формулы I. В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую изображенной ниже формуле II. Следует понимать, что ссылка на формулу I включает также ссылку на подформулу Ia. Аналогично, ссылка на формулу II включает также ссылки на ее подформулы, такие как Формула IIa, IIb и т.д. Формула II имеет структуру:

Формула II

где

R¹ представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный гидроксильной, тиольной, амино-, C_1-6 алкиламино- или -ПЭГ-OH группой;

R³ и R⁴ независимо представляют собой атом водорода, галоген, C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил или C_2-6 алкинил, где C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил и C_2-6 алкинил независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы;

R², R⁵ и R⁶ независимо представляют собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил или C_3-6 алкинил-O-, где C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил и C_3-6 алкинил-O- независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R⁶ и R⁵ вместе представляют собой =CH₂; или R⁶ и R⁴ вместе образуют мостик через кольцо, содержащее V², выбранный из этилена, -O-CH₂- и -NH-CH₂-;

V¹ и V² независимо представляют собой O, S или CH₂;

BG¹, начинающийся от атома углерода в кольце, содержащем V¹, и BG², начинающийся от атома углерода в кольце, содержащем V², независимо представляют собой -O-P(O)R^p-O-, -O-P(S)R^p-O-, -O-P(O)R^p-S-, -O-P(S)R^p-S-, -S-P(O)R^p-O-, -S-P(S)R^p-O-, -S-P(O)R^p-S-, -S-P(S)R^p-S-, -NH-P(O)R^p-O-, -O-P(O)R^p-NH-, -NH-P(S)R^p-O-, -O-P(S)R^p-NH- или -NH-SO₂-NH-; где

R^p в каждом случае независимо представляет собой гидроксил, тиол, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_3-6 алкенил-O-, C_3-6 алкинил-O-, -ПЭГ-OH, борано-группу (-BH₃⁻), или -NR’R”, где C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_3-6 алкенил-O- и C_3-6 алкинил-O- независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; и

R’ и R” независимо представляют собой атом водорода или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R’ и R”, присоединенные к одному и тому же атому азота, вместе образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо;

R^a1, R^b1, R^a2 и R^b2 независимо представляют собой атом водорода или C_1-3 алкил; и

B¹ и B² независимо выбраны из:

и , где

V³ представляет собой O или S, в частности O;

Z¹, Z², Z³, Z⁴, Z⁵ и Z⁶ в каждом случае независимо представляют собой CR^z или N;

Z^a представляет собой O (за исключением случаев, когда Z⁵ представляет собой N) или NR’; где

R^z в каждом случае независимо представляет собой атом водорода, галоген, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил, C_3-6 алкинил-O-, -NO₂, -CN, -C(O)C_1-6 алкил, -CO₂H, -CO₂C_1-6 алкил, -S(O)C_1-6 алкил, -S(O)₂C_1-6 алкил, -C(O)NR’, -C(O)NR’R”, -SO₂NR’R”, -OC(O)C_1-6 алкил, -NR’C(O)C_1-6 алкил, -N(R’)C(O)NR’R”, -N(R’)SO₂NR’R”, -N(R)SO₂C_1-6 алкил или -OC(O)NR’R”, где

C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил и C_3-6 алкинил-O- в каждом случае независимо необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; и

R’ и R” в каждом случае независимо представляют собой атом водорода или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R’ и R”, присоединенные к одному и тому же атому азота, вместе образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых случаях когда ЦДН (D) формулы II ковалентно связан с линкером (L) в ADC формулы I или Ia, ЦДН ковалентно связан с линкером через гидроксил, тиол, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу или -ПЭГ-OH группу в положении R¹.

В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-6 алкил, замещенный гидроксильной, тиольной, амино-, C_1-6 алкиламино- или -ПЭГ-OH группой. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-6 алкил, замещенный гидроксильной, тиольной, амино- или C_1-6 алкиламино-группой. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-6 алкил, замещенный тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-6 алкил, замещенный тиольной или амино-группой. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-6 алкил, замещенный тиольной группой. В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-6 алкил, замещенный амино-группой. В любых из этих вариантов осуществления R¹ может представлять собой C_2-4 алкил, такой как C_2-3 алкил, замещенный гидроксильной группой, тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой.

В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-4 алкил, замещенный гидроксильной группой. В некоторых таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₂ алкил, замещенный гидроксильной группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₃ алкил, замещенный гидроксильной группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₄ алкил, замещенный гидроксильной группой.

В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-4 алкил, замещенный амино-группой (-NH₂). В некоторых таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₂ алкил, замещенный амино-группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₃ алкил, замещенный амино-группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₄ алкил, замещенный амино-группой.

В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-4 алкил, замещенный тиольной (-SH) группой. В некоторых таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₂ алкил, замещенный тиольной группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₃ алкил, замещенный тиольной группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₄ алкил, замещенный тиольной группой.

В некоторых вариантах осуществления R¹ представляет собой C_2-4 алкил, замещенный C_1-6 алкиламино-группой. В некоторых таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₂ алкил, замещенный метиламино-группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₃ алкил, замещенный метиламино-группой. В других таких вариантах осуществления R¹ представляет собой C₃ алкил, замещенный метиламино-группой.

В некоторых вариантах осуществления R³ и R⁴ независимо представляют собой атом водорода, галоген, C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил или C_2-6 алкинил, где C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил и C_2-6 алкинил являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления R³ и R⁴ независимо представляют собой атом водорода, C_1-6 алкил или C_2-6 алкинил, где C_1-6 алкил и C_2-6 алкинил являются незамещенными.

В некоторых вариантах осуществления один из R³ и R⁴ представляет собой атом водорода, а другой представляет собой галоген, C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил или C_2-6 алкинил, где C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил и C_2-6 алкинил независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы. В некоторых вариантах осуществления один из R³ и R⁴ представляет собой атом водорода, а другой представляет собой галоген, C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил или C_2-6 алкинил, где C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил и C_2-6 алкинил являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления один из R³ и R⁴ представляет собой атом водорода, а другой представляет собой C_1-6 алкил или C_2-6 алкинил, где C_1-6 алкил и C_2-6 алкинил являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления R³ и R⁴ оба представляют собой атом водорода.

В некоторых вариантах осуществления R² представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы. В некоторых вариантах осуществления R² представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления R² представляет собой атом водорода или галоген, такой как фтор. В некоторых вариантах осуществления R² представляет собой атом водорода.

В некоторых вариантах осуществления R⁵ и R⁶ независимо представляют собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы. В некоторых вариантах осуществления R⁵ и R⁶ независимо представляют собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления R⁵ и R⁶ независимо представляют собой атом водорода, галоген или гидроксил. В некоторых вариантах осуществления R⁵ и R⁶ вместе представляют собой =CH₂.

В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил или C_3-6 алкинил-O-, где C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил и C_3-6 алкинил-O- независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы. В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, _1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, _1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы. В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой атом водорода, галоген (такой как фтор или хлор), гидроксил или незамещенную C_1-6 алкокси-группу (такую как метокси-группа). В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой галоген, такой как фтор или хлор. В некоторых случаях R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой гидроксил. В других вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой незамещенную C_1-6 алкокси-группу, такую как метокси-группа.

В некоторых вариантах осуществления R⁶ представляет собой атом водорода, и R⁵ представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил или C_3-6 алкинил-O-, где C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группа, C_2-6 алкенил, C_3-6 алкенил-O-, C_2-6 алкинил и C_3-6 алкинил-O- независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы. В некоторых вариантах осуществления R⁶ представляет собой атом водорода, и R⁵ представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа независимо могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы. В некоторых вариантах осуществления R⁶ представляет собой атом водорода, и R⁵ представляет собой атом водорода, галоген, гидроксил, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкил или C_1-6 алкокси-группу, где C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления R⁶ представляет собой атом водорода, и R⁵ представляет собой атом водорода, галоген (такой как фтор или хлор), гидроксил или незамещенную C_1-6 алкокси-группу (такую как метокси-группа). В некоторых вариантах осуществления R⁶ представляет собой атом водорода, и R⁵ представляет собой галоген, такой как фтор или хлор. В некоторых случаях R⁶ представляет собой атом водорода, и R⁵ представляет собой гидроксил. В других вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой незамещенную C_1-6 алкокси-группу, такую как метокси-группа.

В некоторых вариантах осуществления один из R⁵ и R⁶ представляет собой атом водорода, а другой представляет собой галоген, такой как фтор. В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода, и R⁶ представляет собой галоген, такой как фтор. В некоторых вариантах осуществления R⁶ представляет собой атом водорода, и R⁵ представляет собой галоген, такой как фтор.

В некоторых случаях R⁵ и R⁶ оба представляют собой атом водорода или галоген, например, R⁵ и R⁶ оба представляют собой атом водорода, или R⁵ и R⁶ оба представляют собой галоген, такой как фтор.

В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой атом водорода. В других вариантах осуществления R⁵ представляет собой гидроксил. В других вариантах осуществления R⁵ представляет собой галоген. Например, R⁵ может представлять собой фтор, бром или хлор.

В некоторых вариантах осуществления R⁶ представляет собой атом водорода. В других вариантах осуществления R⁶ представляет собой гидроксил. В других вариантах осуществления R⁶ представляет собой метокси-группу. В других вариантах осуществления R⁶ представляет собой галоген. Например, R⁶ может представлять собой фтор, бром или хлор.

В некоторых вариантах осуществления V¹ и V² независимо представляют собой O или S. В некоторых вариантах осуществления V¹ и V² независимо представляют собой O или CH₂. В некоторых вариантах осуществления V¹ и V² оба представляют собой O. В некоторых вариантах осуществления V¹ и V² оба представляют собой S. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из V¹ и V² представляет собой O. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из V¹ и V² представляет собой S. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из V¹ и V² представляет собой CH₂.

В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² независимо представляют собой -O-P(O)R^P-O- или -O-P(S)R^P-O-. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из BG¹ и BG² представляет собой -O-P(O)R^P-O-. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из BG¹ и BG² представляет собой -O-P(S)R^P-O-. В некоторых вариантах осуществления BG¹ представляет собой -O-P(O)R^P-O-, и BG² представляет собой -O-P(S)R^P-O-. В некоторых вариантах осуществления BG¹ представляет собой -O-P(O)R^P-O-, и BG² представляет собой -O-P(S)R^P-O-. В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -O-P(O)R^P-O-.

В некоторых вариантах осуществления R^p в каждом случае независимо представляет собой гидроксил, тиол, C_1-6 алкил, борано-группу (-BH₃⁻) или -NR’R”. В некоторых вариантах осуществления R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол. В некоторых вариантах осуществления R^P представляет собой гидроксил. В некоторых вариантах осуществления R^P представляет собой тиол. В некоторых вариантах осуществления один R^P представляет собой гидроксил, и другой представляет собой тиол.

В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -O-P(O)R^P-O-, и R^p в каждом случае независимо представляет собой гидроксил, тиол, C_1-6 алкил, борано-группу (-BH₃⁻) или -NR’R”. В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -O-P(O)R^P-O-, и R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол. В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -O-P(O)R^P-O-, и R^P представляет собой гидроксил. В других вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -O-P(O)R^P-O- и R^P представляет собой тиол. В некоторых вариантах осуществления BG¹ представляет собой -O-P(O)R^P-O-, где R^P представляет собой гидроксил, и BG² представляет собой-O-P(O)R^P-O-, где R^P представляет собой тиол. В других вариантах осуществления BG¹ представляет собой-O-P(O)R^P-O-, где R^P представляет собой тиол, и BG² представляет собой -O-P(O)R^P-O-, где R^P представляет собой гидроксил.

В некоторых случаях по меньшей мере один из BG¹ и BG² представляет собой -NH-P(O)R^P-O-, -O-P(O)R^P-NH-, -NH-P(S)R^P-O- или -O-P(S)R^P-NH-. В некоторых случаях по меньшей мере один из BG¹ и BG² представляет собой -NH-P(O)R^P-O- или -O-P(O)R^P-NH-. В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -NH-P(O)R^P-O- или -O-P(O)R^P-NH-. В некоторых случаях по меньшей мере один из BG¹ и BG² представляет собой -NH-P(O)R^P-O-, -O-P(O)R^P-NH-, -NH-P(S)R^P-O- или -O-P(S)R^P-NH-; и R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол. В некоторых случаях по меньшей мере один из BG¹ и BG² представляет собой -NH-P(O)R^P-O- или -O-P(O)R^p-NH-; и R^p в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол. В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -NH-P(O)R^P-O- или -O-P(O)R^p-NH-; и R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол. В некоторых вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -NH-P(O)R^P-O- или -O-P(O)R^P-NH-; и R^P представляет собой гидроксил. В других вариантах осуществления BG¹ и BG² оба представляют собой -NH-P(O)R^P-O- или -O-P(O)R^P-NH-; и R^P представляет собой тиол.

В некоторых вариантах осуществления когда R^P представляет собой -NR’R”, R’ и R” независимо представляют собой атом водорода или незамещенный C_1-6 алкил, или R’ и R”, вместе присоединенные к одному атому азота, образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо, такое как морфолин, пирролидин или пиперазин.

В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² представляют собой одинаковое нуклеиновое основание. В других вариантах осуществления B¹ и B² представляют собой разные нуклеиновые основания. В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² оба представляют собой пуриновое нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² оба представляют собой пиримидиновое нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления B¹ представляет собой пуриновое нуклеиновое основание, и B² представляет собой пиримидиновое нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления B¹ представляет собой пиримидиновое нуклеиновое основание, и B² представляет собой пуриновое нуклеиновое основание.

В некоторых случаях B¹ и B² независимо выбраны из аденина, гуанина, тимина, урацила и цитозина, а также их модифицированных вариантов. В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² оба представляют собой аденин или его модифицированный вариант. В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² оба представляют собой гуанин или его модифицированный вариант. В некоторых вариантах осуществления B¹ представляет собой гуанин или его модифицированный вариант, и B² представляет собой аденин или его модифицированный вариант. В некоторых вариантах осуществления B¹ представляет собой аденин или его модифицированный вариант, и B² представляет собой гуанин или его модифицированный вариант.

В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² независимо выбраны из:

и , где

Z¹, Z², Z³, Z⁴, Z⁵ и Z⁶ в каждом случае независимо представляют собой CR^z или N;

Z^a представляет собой O (за исключением случаев, когда Z⁵ представляет собой N) или NR’; где

R^z в каждом случае независимо представляет собой атом водорода, галоген, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, -C(O)C_1-6 алкил, -CO₂H, -CO₂C_1-6 алкил, -C(O)NR’, -C(O)NR’R”, -OC(O)C_1-6 алкил, -NR’C(O)C_1-6 алкил, -N(R’)C(O)NR’R” или -OC(O)NR’R”, где

C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа в каждом случае независимо необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; и

R’ и R” в каждом случае независимо представляют собой атом водорода или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R’ и R”, присоединенные к одному и тому же атому азота, вместе образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления для B¹ и B², один или оба случая Z¹ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂). В некоторых вариантах осуществления один или оба случая Z⁵ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂). В некоторых вариантах осуществления один или оба случая Z¹ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂), и один или оба случая Z⁵ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂). В некоторых вариантах осуществления оба случая Z¹ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂), и оба случая Z⁵ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂).

В некоторых вариантах B¹ и B² Z³ представляет собой CR^z (такой как CH или CNH₂). В некоторых вариантах осуществления Z³ представляет собой CR^z (такой как CH или CNH₂), и один или оба случая Z¹ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂). В некоторых вариантах осуществления Z³ представляет собой CR^z (такой как CH или CNH₂), и один или оба случая Z⁵ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂). В некоторых вариантах осуществления Z³ представляет собой CR^z (такой как CH или CNH₂), оба случая Z¹ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂), и оба случая Z⁵ представляют собой CR^z (такой как CH или CNH₂).

В некоторых случаях для B¹ и B², Z^a представляет собой NR’, такой как NH или NC_1-6 алкил. В других вариантах осуществления Z^a представляет собой O.

В некоторых вариантах осуществления один или оба Z² представляют собой N. В некоторых вариантах осуществления Z⁴ представляет собой N. В некоторых вариантах осуществления один или оба Z² представляют собой N, и Z⁴ представляет собой N. В некоторых вариантах осуществления оба Z² представляют собой N, и Z⁴ представляет собой N.

В некоторых вариантах осуществления один или оба Z⁶ представляют собой N. В некоторых вариантах осуществления Z⁴ представляет собой N. В некоторых вариантах осуществления один или оба Z⁶ представляют собой N, и Z⁴ представляет собой N. В некоторых вариантах осуществления оба Z⁶ представляют собой N, и Z⁴ представляет собой N. В некоторых вариантах осуществления один или оба Z⁶ представляют собой N, и один или оба Z² представляют собой N. В некоторых вариантах осуществления оба Z⁶ представляют собой N, и оба Z² представляют собой N.

В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² независимо выбраны из:

и , где

Z¹, Z³ и Z⁵ в каждом случае независимо представляют собой CR^z или N;

Z^a представляет собой O (за исключением случаев, когда Z⁵ представляет собой N) или NR’; где

R^z в каждом случае независимо представляет собой атом водорода, галоген, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу,-C(O)C_1-6 алкил, -CO₂H, -CO₂C_1-6 алкил, -C(O)NR’, -C(O)NR’R”, -OC(O)C_1-6 алкил, -NR’C(O)C_1-6 алкил, -N(R’)C(O)NR’R” или -OC(O)NR’R”, где

C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа в каждом случае независимо необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; и

R’ и R” в каждом случае независимо представляют собой атом водорода или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R’ и R” присоединенные к одному и тому же атому азота, вместе образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² независимо выбраны из:

и , где

Z^a представляет собой NR’; где

R^z в каждом случае независимо представляет собой атом водорода, галоген, азидо-группу, амино-группу, C_1-6 алкиламино-группу, ди(C_1-6 алкил)амино-группу, C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси-группу, -C(O)C_1-6 алкил, -CO₂H, -CO₂C_1-6 алкил, -C(O)NR’, -C(O)NR’R”, -OC(O)C_1-6 алкил, -NR’C(O)C_1-6 алкил, -N(R’)C(O)NR’R” или -OC(O)NR’R”, где

C_1-6 алкил и C_1-6 алкокси-группа в каждом случае независимо необязательно замещены одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; и

R’ и R” в каждом случае независимо представляют собой атом водорода или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из галогена, тиола, гидроксила, карбоксила, C_1-6 алкокси-группы, C_1-6 гидрокси-алкокси-группы, -OC(O)C_1-6 алкила, -N(H)C(O)C_1-6 алкила, -N(C_1-3 алкил)C(O)C_1-6 алкила, амино-группы, C_1-6 алкиламино-группы, ди(C_1-6 алкил)амино-группы, оксо-группы и азидо-группы; или R’ и R”, присоединенные к одному и тому же атому азота, вместе образуют C_3-5 гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления B¹ и B² независимо выбраны из:

и.

В некоторых вариантах осуществления R^a1, R^b1, R^a2 и R^b2 все представляют собой атом водорода. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из R^a1, R^b1, R^a2 и R^b2 представляет собой C_1-3 алкил, такой как метил. В некоторых случаях R^a1 и R^a2 представляют собой C_1-3 алкил, такой как метил. В некоторых вариантах осуществления один из R^a1, R^b1, R^a2 и R^b2 представляет собой C_1-3 алкил, такой как метил.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIa:

Формула IIa

где R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶; V¹ и V²; BG¹ и BG²; и B¹ и B² имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIa R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIa R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIb:

Формула IIb

где R¹, R⁵ и R⁶; V¹ и V²; BG¹ и BG²; и B¹ и B² имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIb R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIb R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIc:

Формула IIc

где R¹, R⁵ и R⁶; BG¹ и BG²; и B¹ и B² имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIc R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIc R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IId:

Формула IId

где R¹, R⁵, R⁶ и R^P; V¹ и V²; и B¹ и B² имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IId R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IId R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIe:

Формула IIe

где R¹, R⁵, R⁶ и R^P; и B¹ и B² имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIe R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIe R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIf:

Формула IIf

где

Y и Z независимо представляют собой CH или N; и

R¹, R⁵, R⁶, R^P и B¹ имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIf R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIf R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIg:

Формула IIg

где

W и X независимо представляют собой CH или N; и

R¹, R⁵, R⁶, R^P и B² имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIg R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIg R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIh:

Формула IIh

где

W, X, Y и Z независимо представляют собой CH или N; и

R¹, R⁵, R⁶ и R^P имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIh R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIh R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIi:

Формула IIi

где

W, X, Y и Z независимо представляют собой CH или N; и

R¹, R⁵, R⁶ и R^P имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIi R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIi R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIj:

Формула IIj

где

W, X, Y и Z независимо представляют собой CH или N; и

R¹, R⁵, R⁶ и R^P имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIj R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIj R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIk:

Формула IIk

где

W, X, Y и Z независимо представляют собой CH или N; и

R¹ и R^P имеют значения, указанные выше для формулы II;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах формулы IIk R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, тиольной группой или амино-группой. В некоторых вариантах формулы IIk R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой.

В некоторых случаях ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIm:

Формула IIm

где

R¹ представляет собой C_2-4 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой или амино-группой;

X и Z независимо представляют собой CH или N;

R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIn:

Формула IIn

где

X и Z независимо представляют собой CH или N; и

R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления ЦДН имеет структуру, отвечающую формуле IIo:

Формула IIo

где

X и Z независимо представляют собой CH или N; и

R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления в формулах IId-k и IIm-o оба случая R^P представляют собой гидроксил. В некоторых вариантах осуществления в формулах IId-k и IIm-o оба случая R^P представляют собой тиол. В некоторых вариантах осуществления в формулах IId-k и IIm-o в случае R^P, соответствующем BG¹ (верхний левый R^P), представляет собой гидроксил, и в случае R^P, соответствующем BG2 (нижний правый R^P), представляет собой тиол. В некоторых вариантах осуществления в формулах IId-k и IIm-o в случае R^P, соответствующем BG¹, представляет собой тиол, и в случае R^P, соответствующем BG2, представляет собой гидроксил.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру (ЦДН-A):

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру (ЦДН-B):

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном варианте осуществления ЦДН имеет следующую структуру

или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении описаны способы получения ADC формулы I путем конъюгирования ЦДН формулы II (например, ЦДН-A или ЦДН-B) с антителом через линкер. ЦДН формулы II могут быть конъюгированы с антителом через расщепляемый или нерасщепляемый линкер. В частных вариантах осуществления ЦДН высвобождается в опухолевой клетке, раковой иммунной клетке или микроокружении опухоли при расщеплении линкера.

В ADC формулы I, где ЦДН (D) имеет формулу II (например, ЦДН-A или ЦДН-B), ЦДН может быть ковалентно связан с линкером (L) по гидроксильной, тиольной, амино-группе, C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе в R¹ в ЦДН формулы II. Следует понимать, что ЦДН Формулы II может также быть не связан с линкером (L) или ADC и может вводиться описанными в настоящем тексте способами, в отдельности или в комбинации с ADC по настоящему изобретению, в комбинации с другими активными агентами (такими как иммуно-онкологические агенты, такие как ингибиторы иммунных контрольных точек, включая анти-PD1, анти-PD-L1 и анти-CTLA-4 антитела), или в комбинации и с ADC по настоящему изобретению, и с другими активными агентами (такими как иммуно-онкологические агенты).

ЦДН формулы II (например, ЦДН-A или ЦДН-B) способны оказывать агонистическое действие на STING при использовании в отдельности или в качестве компонента ADC формулы I. В частных вариантах осуществления ЦДН могут быть конъюгированы с антителом или антиген-связывающим фрагментом через линкер. Как описано в настоящем тексте, ЦДН могут ковалентно связаваться с линкером по химической реакции между гидроксилом, амино-группой, тиолом, C_1-6 алкиламино-группой или -ПЭГ-OH группой в R¹ в ЦДН формулы II и соответствующей группой в линкере. Иначе говоря, в некоторых вариантах осуществления ЦДН соединяется с линкером (L) одной из следующих связок по R¹ в ЦДН: R¹-O-L, R¹-NH-L, R¹-S-L, R¹-N(C_1-6 алкил)-L или R¹-ПЭГ-O-L, где R¹ представляет собой остаток R¹ фрагмента за исключением гидроксила, амино-группы, тиола, C_1-6 алкиламино-группы или -ПЭГ-OH группы в R¹. Частные варианты антител, антиген-связывающих фрагментов и линкеров описаны ниже.

6.3. Антитела и Антиген-связывающие фрагменты

При использовании в настоящем тексте термин “антитело” означает молекулу иммуноглобулина, которая специфично связывается с определенным антигеном-мишенью. Антитела могут иметь человеческое или нечеловеческое происхождение. Антитела могут быть конъюгированы с ЦДН, описанными в Разделе 6.2, через линкер. Антитела могут быть поликлональными, моноклональными, генетически модифицированными и/или иным образом модифицироваными. Антитела, входящие в состав ADC по настоящему изобретению, подходят для введения людям, например, в качестве гуманизированных антител или полностью человеческих антител.

Антитела имеют тяжелые и легкие цепочки, содержащие гипервариабельные участки, известные как области, определяющие комплементарность (CDR), которые осуществляют связывание антитела с целевым антигеном. Антитела обычно имеют тяжелую цепочку, содержащую вариабельный участок (VH), имеющий три CDR, а именно VH CDR#1, VH CDR#2 и VH CDR#3, и легкую цепочку, содержащую вариабельный участок (VL) имеющий три CDR, а именно VL CDR#1, VL CDR#2 и VL CDR#3. Частные варианты осуществления ADC по настоящему изобретению включают (но не ограничиваются только ими) такие, которые содержат антитела и/или антиген-связывающие фрагменты, включающие эти примеры CDR и/или последовательности VH и/или VL.

Антитела, входящие в состав ADC по настоящему изобретению, могут быть в форме полноразмерных антител, которые могут представлять собой или являться производными любого изотипа антител, включая например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM или IgY. В некоторых вариантах осуществления антитело, входящее в состав ADC, представляет собой IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). В некоторых вариантах осуществления антитела содержат всю или часть константной области антитела.

Антитела, входящие в состав ADC по настоящему изобретению, могут представлять собой биспецифические антитела, антитела с двойным вариабельным доменом, многоцепочечные или одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, верблюжьи антитела, scFv-Fc антитела, суррогатные антитела (включая сурргатные легкоцепочечные конструкции) и т.п.

ADC по настоящему изобретению могут содержать полноразмерные (интактные) молекулы антител, а также антиген-связывающие фрагменты. При использовании в настоящем тексте термин “фрагмент” означает участок интактного антитела, который содержит меньше остатков аминокислот, чем интактное антитело. При использовании в настоящем тексте термин “антиген-связывающий фрагмент” означает полипептидный фрагмент антитела, который осуществляет связывание с антигеном или конкурирует с интактным антителом за связывание с антигеном. Подходящие примеры антиген-связывающих фрагментов включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, dAb, Fd или изолированную область, определяющую комплементарность (CDR), имеющую достаточную для связывания структуру. Как известно квалифицированному специалисту в данной области, фрагменты могут быть получены методами генетической инженерии или путем химической или ферментативной обработки интактного антитела или цепочки антитела, или рекомбинантными методами.

Антитела или их антиген-связывающие фрагменты не ограничены каким-то определенным способом их генерирования или получения, и могут быть получены с помощью хорошо известных методик, таких как методы с использованием гибридомы, рекомбинантные методы, технологии фагового дисплея, трансгенные животные, или их комбинации.

6.4. Целевые антигены и антитела

Антитела или их антиген-связывающие фрагменты, входящие в состав ADC по настоящему изобретению, специфично связываются с одним или более антигенами, ассоциированными с опухолевыми или иммунными клетками, относящимися к раку.

В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с раковыми опухолевыми или иммунными клетками, представляет собой со-ингибирующую молекулу T-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфично связываются с антигеном, ассоциированным с опухолью, выбранным из PD-L1, PD-L2, CD47, CD80, CD86, HVEM, UL144, CD155, CD112, CD113, галектин-1, галектин-3, галектин-9, CD48, LIGHT, BTLA и CD160. В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с опухолью, представляет собой молекулу, которая связывается с T-клеточной молекулой, выбранной из BTLA, Tim-3, PD-1, CTLA-4, TIGIT, CD244 и CD223.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-PD-L1 антитело, такое как атезолизумаб, дурвалумаб, авелумаб, или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную им последовательность аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-CD47 антитело, такое как Hu5F9-G4, IBI188, CC-90002, ZL1201, TTI-621, AO-176, антитело SGN-CD47M, антиген-связывающий домен ALX148, или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную им последовательность аминокислот.

В других вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфично связывается с раковым опухолевым антигеном, который представляет собой рецептор фактора роста (GFR). В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой GFR из семейства EGFR/ErbB/HER. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген выбран из EGFR/HER1 (ErbB1), HER2/c-Neu (ErbB2), Her3 (ErbB3) и Her4 (ErbB4) рецептора. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой GFR из семейства IGFR. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой IGF1R или IGF2R рецептор. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой GFR из семейства TGF-βR (TβR). В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой TβR I или TβR II рецептор. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой GFR из семейства VEGFR. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой VEGFR1, VEGFR2 или VEGFR3 рецептор. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой GFR из семейства PDGFR. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой PDGFR-α или PDGFR-β рецептор. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой GFR из семейства FGFR. В некоторых вариантах осуществления раковый опухолевый антиген представляет собой FGFR1, FGFR2, FGFR3 или FGFR4 рецептор.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-EGFR/HER1 (ErbB1) антитело, такое как цетуксимаб, панитумумаб, нецитумумаб или их антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную им последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-HER2 (ErbB2) антитело, такое как трастузумаб, пертузумаб или их антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную им последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-VEGFR2 антитело, такое как рамуцирумаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-PDGFR-α антитело, такое как оларатумаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот.

В других вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфично связываются с антигеном, ассоциированным с лимфомой. В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с лимфомой, представляет собой CD20, CD30, CD19/CD3, CD22 или CD33.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-CD20 антитело, такое как ритуксимаб, ибритумомаб, офатумумаб, обинутузумаб или их антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную им последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-CD30 антитело, такое как брентуксимаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-CD19/CD3 антитело, такое как блинатумомаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-CD22 антитело, такое как инотузумаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-CD33 антитело, такое как гемтузумаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот.

В других вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфично связываются с антигеном, ассоциированным с миеломой. В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с лимфомой, представляет собой SLAMF7 или CD38.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-SLAMF7 антитело, такое как элотузумаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-CD38 антитело, такое как даратумумаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот.

В других вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфично связываются с антигеном, ассоциированным с бластомой. В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с бластомой, представляет собой GD2.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-GD2 антитело, такое как динутуксимаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную им последовательность аминокислот.

В других вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфично связывается с RANK лигандом.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой анти-RANK лиганд антитело, такое как денозумаб или его антиген-связывающий фрагмент, или антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие эквивалентную ему последовательность аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело, которое связывается с антигеном, который преимущественно экспрессируется или сверхэкспрессируется в раковых клетках, такой как PD-L1 и EGFR.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело, которое связывается с антигеном, который вырабатывается микробом, инфицирующим клетки человека.

При использовании в настоящем тексте “α” и “анти” используются взаимозаменяемо, например, когда описывается “анти-PD-L1” антитело или “α-PD-L1” антитело.

При использовании в настоящем тексте названия белков с дефисом используются взаимозаменяемо с их названиями без дефиса (например, “PD-L1” и “PDL1” используются взаимозаменяемо).

При использовании в настоящем тексте нумерация аминокислотных остатков в иммуноглобулинах осуществляется согласно Eu системе нумерации, если не указано иное.

6.5. Линкеры

В ADC по настоящему изобретению ЦДН связан с антителом или антиген-связывающим фрагментом через многоатомный линкер. Линкеры связывают ЦДН с антителом или антиген-связывающим фрагментом путем образования ковалентной связки с ЦДН по одному положению в линкере, и ковалентной связки с антителом или антиген-связывающим фрагментом по другому положению в линкере. Линкеры могут быть одновалентными по отношению к ЦДН (например, в Формуле Ia), так что они ковалентно связывают один ЦДН с одним сайтом в антителе или его фрагменте. Линкеры могут быть также поливалентными по отношению к ЦДН (например, в Формуле I, когда m > 1), так что они ковалентно связывают более одного ЦДН с одним сайтом в антителе или его фрагменте. При использовании в настоящем тексте выражение “линкер” включает неконъюгированные, частично конъюгированные (т.е. только с ЦДН или Ab) и полностью конъюгированные формы линкера (т.е. и с ЦДН, и с Ab). В частных вариантах осуществления фрагменты, содержащие функциональные группы в антителе и линкере, которые формируют ковалентную связку между антителом и линкером, конкретно проиллюстрированы как RX и RY, соответственно.

Линкеры, связывающие ЦДН с антителом или его фрагментом, могут быть длинными, короткими, подвижными, жесткими, гидрофильными или гидрофобными по своей природе, или могут включать сегменты с разными характеристиками. В данной области известен широкий ряд линкеров, которые можно применять для связывания лекарственных препаратов с антителами или их фрагментами в составе ADC. Эти линкеры, а также другие линкеры, можно применять для связывания ЦДН с антителом или антиген-связывающим фрагментом ADC по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления линкеры содержат 2-100, 2-75, 2-50, 2-25, 2-10, 5-100, 5-75, 5-50, 5-25, 5-10, 10-100, 10-75, 10-50 или 10-25 атомов в цепочке, которая соединяет ЦДН с антителом или антиген-связывающим фрагментом (включая любые атомы на концах линкера, которые могут приходить из ЦДН или антитела или антиген-связывающего фрагмента). Аналогично, линкеры, использующиеся в ЦДН-конъюгированных линкерах (как описано ниже), также могут содержать 2-100, 2-75, 2-50, 2-25, 2-10, 5-100, 5-75, 5-50, 5-25, 5-10, 10-100, 10-75, 10-50 или 10-25 в цепочке, которая соединяет ЦДН с сайтом в линкере, способным конъюгироваться с комплементарным сайтом в антителе или антиген-связывающем фрагменте.

Линкер может быть химически устойчивым к внеклеточному окружению и плазме крови, или может включать связки, которые целенаправленно являются неустойчивыми и могут высвобождать ЦДН во внеклеточное пространство или в микроокружение опухоли.

В некоторых вариантах осуществления линкеры включают связки, которые специально предназначены для высвобождения ЦДН при интернализации ADC в клетку. В некоторых частных вариантах осуществления линкеры включают связки, которые специально предназначены для расщепления и/или иного специфичного или неспецифичного разрушения в клетках.

Число ЦДН, связанных с антителом или его антиген-связывающим фрагментом в ADC, может варьироваться (так называемое “соотношение лекарственное средство/антитело” или “DAR”) и ограничивается числом доступных сайтов для присоединения в антителе или его антиген-связывающем фрагменте и числом ЦДН, связанных с одним линкером. В ADC, которые включают более одного ЦДН, каждый ЦДН может быть одинаковым или отличающимся. При условии, что ЦДН не показывает неприемлемой степени агрегации в используемых условиях применения и/или хранения, настоящим изобретением охватываются ADC с DAR равным 10 или даже выше. В некоторых вариантах осуществления ADC по настоящему изобретению могут иметь DAR в диапазоне от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5 или от 1 до 4. В некоторых вариантах осуществления ADC по настоящему изобретению могут иметь DAR в диапазоне от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5 или от 2 до 4. В некоторых частных вариантах осуществления ADC могут иметь значение DAR равное 1, 2, 3 или 4. В других частных вариантах осуществления ADC могут иметь значение DAR равное 5, 6, 7, или 8. В некоторых частных вариантах осуществления ADC могут иметь значение DAR, равное 1.

Для примера и без какого-либо ограничения ниже описаны некоторые расщепляемые и нерасщепляемые линкеры, которые могут входить в состав ADC по настоящему изобретению.

6.5.1. Расщепляемые линкеры

В некоторых вариантах осуществления линкер способен расщепляться in vivo в ходе химических или ферментативных процессов, высвобождая ЦДН. В некоторых случаях ЦДН отщепляется от линкера с высвобождением того же самого ЦДН, который был до конъюгирования с линкером. В других вариантах осуществления высвобожденный ЦДН представляет собой ЦДН, являющийся модификацией ЦДН, изначально присоединенного с линкером, при этом модифицированный ЦДН содержит остаточную функциональную группу от линкера, но сохраняет эффективность или даже демонстрирует повышенную эффективность по сравнению с изначальным ЦДН. В целом, расщепляемые линкеры содержат одну или более химических связей, которые являются химически или ферментативно расщепляемыми, в то время как остальная часть линкера является нерасщепляемой.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер содержит химически лабильную группу. Химически лабильные группы имеют разные свойства в плазме и цитоплазматических компартментах, например, их свойства в кислой среде эндосом и лизосом отличаются от свойств в условиях высокой концентрации тиолов (например, глутатиона) в цитозоле. В некоторых вариантах осуществления стабильность в плазме линкера, содержащего химически лабильную группу, можно повысить или понизить путем вариации стерических затруднений вокруг химически лабильной группы с помощью заместителей.

В некоторых вариантах осуществления химически лабильная группа в расщепляемом линкере представляет собой кислотно-лабильную группу. Кислотно-лабильная группа сохраняется неизменной при циркуляции в крови при нейтральном значении pH и претерпевает гидролиз в кислых условиях, высвобождая ЦДН, например в кислом микроокружении опухоли или при нейтрализации в эндосомальных (pH 5.0-6.5) и лизосомальных (pH 4.5-5.0) клеточных компартментах. Этот рН-зависимый механизм высвобождения расщепляемого линкера можно оптимизировать путем химической модификации, например различными заместителями для регулировки высвобождения ЦДН при определенном значении pH. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер содержит кислотно-лабильную группу, такую как гидразон, гидразин, цис-акотинил, ацеталь, ортоэфирную или иминную группу. В некоторых вариантах осуществления кислотно-лабильная группа расщепляется в микроокружении опухоли, в эндосомах опухолевой или иммунной клетки, в лизосомах опухолевой или иммунной клетки, в кислом внутриклеточном компартменте опухолевой или иммунной клетки, или в их комбинациях. В некоторых вариантах осуществления кислотно-лабильная группа не расщепляется в микроокружении опухоли, в эндосомах опухолевой или иммунной клетки, в лизосомах опухолевой или иммунной клетки и/или в кислом внутриклеточном компартменте опухолевой или иммунной клетки. Расщепляемость кислотно-лабильной группы может определяться рН-чувствительностью полностью конъюгированного линкера в ADC. Кислотно-лабильные линкеры могут содержать дополнительные сайты расщепления, например, дополнительные кислотно-лабильные сайты расщепления и/или ферментативно-лабильные сайты расщепления.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер содержит дисульфидную группу. Дисульфидные группы предназначены для высвобождения лекарственного средства при интернализации в клетку, где в цитозоле более восстанавливающая среда, по сравнению со внеклеточной средой. Расщепление дисульфидных связей обычно требует присутствия цитозольного тиол-кофактора, такого как (восстановленный) глутатион (GSH), так что дисульфид-содержащие линкеры достаточно стабильны в кровеносной системе и селективно высвобождают лекарство в цитозоле. Внутриклеточный фермент белок-дисульфидизомераза или похожие ферменты, способные расщеплять дисульфидные связи, также могут участвовать в расщеплении дисульфида. Опухолевые клетки могут индуцировать гипоксическое состояние из-за нарушенного кровотока, что приводит к повышенной восстановительной активности фермента и еще более высоким концентрациям глутатиона.

ADC с примерами дисульфид-содержащих линкеров включают следующие формулы:

(V) (VI) (VII)

где

D представляет собой ЦДН (например, ЦДН-A или ЦДН-B);

S в S-D берется из ЦДН, NH в Ab-NH берется из Ab, S в Ab-S берется из Ab;

Ab представляет собой антитело или его связывающий фрагмент;

“n” представляет собой количество D, связанных с Ab через линкер; и

R в каждом случае независимо представляет собой атом водорода или C_1-3 алкил.

В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой структуру

, где NH в *-NH может браться из Ab, и представляет собой точку присоединения линкера напрямую или косвенно к ЦДН (например, по гидроксилу, амино-группе, тиолу и т.д. в R¹ из ЦДН, например, ЦДН-A или ЦДН-B). В некоторых вариантах осуществления представляет собой точку прямого присоединения линкера к тиолу в R¹ группе ЦДН, где S, связанная с , является частью тиола из R¹ группы.

Другой тип расщепляемого линкера в ADC по настоящему изобретению представляет собой ферментативно расщепляемый линкер. Такие линкеры обычно представляют собой пептиды или включают пептидные участки, и могут быть более устойчивыми в плазме и внеклеточном пространстве, чем химически лабильные линкеры. Пептидные связи в целом устойчивы в плазме крови вследствие более высокого уровня рН, чем в лизосомах, и присутствия эндогенных ингибиторов лизосомальных протеолитических ферментов. Высвобождение ЦДН из ADC может происходить при воздействии лизосомальных протеаз, например, катепсина и плазмина, которые могут присутствовать в повышенных концентрациях в некоторых опухолевых клетках. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептид расщепляется лизосомальным ферментом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептид расщепляется катепсином (например, катепсином B) или плазмином.

Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области, протеолитическое расщепление пептидного линкера, напрямую присоединенного к ЦДН, может дать аддукт аминокислоты и ЦДН при гидролизе амидной связи. Таким образом, ADC по настоящему изобретению включают также ферментативно расщепляемый линкер, который представляет собой саморасщепляющийся линкер, пространственно разделяющий ЦДН от сайта расщепления. Применение саморасщепляющегося линкера позволяет отщеплять полностью активный, химически немодифицированный ЦДН формулы II при гидролизе амидной связи.

Одним охватываемым саморасщепляющимся линкером по настоящему изобретению является бифункциональная группа из пара-аминобензилового спирта, которая по одному концу связана через бензильную гидроксильную группу с аминной группой ЦДН, функционализированной карбаматом, а по другом концу связана через амино-группу с образованием амидной связи с пептидом (PABC группа). При протеазном расщеплении пептида, получаемый ЦДН активирован, что приводит к реакции 1,6-элиминирования, которая высвобождает немодифицированный ЦДН, диоксид углерода и остатки линкера. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер содержит PABC группу. Дополнительно охватываемыми саморасщепляющимися линкерами являются описанные в литературе гетероциклические варианты PABC (см., например, US 7,989,434, который включен в настоящий текст посредством ссылки).

В некоторых вариантах осуществления ферментативно расщепляемый линкер представляет собой непептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления непептидный линкер является пептидомиметиком. В некоторых вариантах осуществления непептидный линкер расщепляется специфичными для опухоли протеазами. В некоторых вариантах осуществления непептидный линкер расщепляется специфичными для опухоли протеазами, имеющими повышенную концентрацию в опухолях и/или микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления непептидный линкер расщепляется катепсином B. В некоторых вариантах осуществления непептидный линкер представляет собой циклобутан-1,1-дикарбоксамид.

В некоторых вариантах осуществления ферментативно расщепляемый линкер представляет собой линкер на основе β-глюкуроновой кислоты. Расщепление β-глюкуронид гликозидной связи может осуществляться лизосомальным ферментом β-глюкуронидазой, которая содержится в лизосомах и сверхэкспрессирована в некоторых типах опухолей, при этом она обладает низкой активностью вне клеток.

Расщепляемые линкеры могут включать нерасщепляемые участки или сегменты, и/или расщепляемые сегменты или участки можно включать в нерасщепляемый линкер, делая его расщепляемым. Исключительно в качестве примера, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и родственные ему полимеры могут содержать расщепляемые группы в своем скелете. Например, полиэтиленгликолевый или полимерный линкер может содержать одну или более расщепляемых групп, таких как дисульфид, гидразин, гидразон, дипептид или циклобутан-1,1-дикарбоксамид.

В некоторых вариантах осуществления линкер содержит ферментативно расщепляемый пептидный фрагмент, например, линкер, имеющий формулу VIIIa, VIIIb, VIIIc, VIIId, VIIIe, VIIIf или VIIIg:

(VIIIa) (VIIIb) (VIIIc) (VIIId) (VIIIe) (VIIIf) (VIIIg)

где:

“пептид” представляет собой пептид или цепь пептидомиметика (проллюстрировано в направлении N→C и не показаны карбоксильный и аминный “концы”), расщепляемые лизосомальным ферментом;

T представляет собой цепь (например, полимерную цепь), содержащую один или более этиленгликолевых фрагментов или алкиленовую цепь, или их комбинации;

R^a выбран из атома водорода, C_1-6 алкила, сульфоната и метилсульфоната;

R^b выбран из атома водорода, , , , , , , , и ;

n представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 10, например от 3 до 6, в частности 5;

p представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 5;

q представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 5, в частности 3;

w равен 0 или 1, и -S- в *-S- может быть из Ab;

x равен 0 или 1, и NH в *-NH может быть из Ab;

y равен 0 или 1; и NH в *-NH может быть из Ab;

z равен 0 или 1;

представляет собой точку присоединения линкера напрямую или не напрямую к ЦДН (например, по гидроксилу, амино-группе, тиолу и т.д. в R¹ в ЦДН, например, ЦДН-A или ЦДН-B); и

* представляет собой точку присоединения к остальной части линкера или напрямую или не напрямую к антителу;

или его соль.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” в формулах VIIIa-d представляет собой следующую структуру:

, где терминальный -NH- может быть из Ab, если x, y и w равны 0.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” в формуле VIIIe представляет собой следующую структуру:

, где w равен 1.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” в формулах VIIIa-g содержит 2-20 аминокислотных остатков, например 2-15, 2-10, 2-7 или 2-5 остатков, включая тетрапептид, трипептид или дипептид. В частных вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” представляет собой дипептид, такой как дипептид, выбранный из: Ala-Ala, Ala-(D)Asp, Ala-Cit, Ala-Lys, Ala-Val, Asn-Cit, Asp-Cit, Asn-Lys, Asn-(D)Lys, Asp-Val, Cit-Ala, Cit-Asn, Cit-Asp, Cit-Cit, Cit-Lys, Cit-Ser, Cit-Val, Glu-Val, PhenylGly-(D)Lys, His-Val, Ile-Cit, Ile-Pro, Ile-Val, Leu-Cit, Lys-Cit, Me3Lys-Pro, Met-Lys, Met-(D)Lys, Phe-Arg, Phe-Cit, Phe-Lys, Pro-(D)Lys, Ser-Cit, Trp-Cit, Val-Ala, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Val-Cit, Val-Glu, Val-Lys, и их соли. В некоторых вариантах осуществления дипептид представляет собой Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” представляет собой трипептид, такой как Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” представляет собой тетрапептид, такой как Gly-Phe-Leu-Gly или Ala-Leu-Ala-Leu.

В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу VIIIa и имеет следующую структуру:

, где “пептид” представляет собой Glu-Val-Cit.

В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу VIIIc и имеет следующую структуру:

, где “пептид” представляет собой Val-Cit.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” в формуле VIIId представляет собой дипептид, такой как дипептид, выбранный из: Ala-Ala, Ala-(D)Asp, Ala-Cit, Ala-Lys, Ala-Val, Asn-Cit, Asp-Cit, Asn-Lys, Asn-(D)Lys, Asp-Val, Cit-Ala, Cit-Asn, Cit-Asp, Cit-Cit, Cit-Lys, Cit-Ser, Cit-Val, Glu-Val, PhenylGly-(D)Lys, His-Val, Ile-Cit, Ile-Pro, Ile-Val, Leu-Cit, Lys-Cit, Me3Lys-Pro, Met-Lys, Met-(D)Lys, Phe-Arg, Phe-Cit, Phe-Lys, Pro-(D)Lys, Ser-Cit, Trp-Cit, Val-Ala, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Val-Cit, Val-Glu, Val-Lys, и их соли. В некоторых вариантах осуществления дипептид в формуле VIIId представляет собой Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” в формуле VIIId представляет собой трипептид, такой как Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или “пептид” в формуле VIIId представляет собой тетрапептид, такой как Gly-Phe-Leu-Gly или Ala-Leu-Ala-Leu.

В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу VIIId и имеет следующую структуру:

, где “пептид” представляет собой Val-Cit.

В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу VIIIe и имеет следующую структуру:

, где “пептид” представляет собой .

6.5.2. Группы, использующиеся для присоединения линкеров к антителам

Различные присоединяющие группы можно использовать для присоединения синтонов линкер-ЦДН к антителам с получением ADC. Присоединяющие группы в синтоне линкер-ЦДН обычно являются электрофильными по своей природе. В некоторых вариантах осуществления присоединяющая группа выбрана из малеимидной группы; активированного дисульфида, такого как DSDM, SPDB или сульфо-SPDB; активного сложного эфира, такого как NHS-эфир или HOBt-эфир; галогенформиата, ацилгалогенида и алкил или бензил галогенида, такого как галогенацетамид. В некоторых вариантах осуществления получающаяся связка между линкером (L) и антителом (Ab) представляет собой тиоэфир, амид, сложный эфир, карбамат, карбонат, мочевинную группу, дисульфид или простой эфир.

Для ADC по настоящему изобретению охватываются также “самостабилизирующиеся” малеимиды и “мостиковые дисульфиды”. Пример “самостабилизирующейся” малеимидной группы описан в US 2013/0309256, включенном в настоящий текст посредством ссылки. Примеры “мостиковых дисульфидов” описаны в работе Badescu et al., 2014, Bioconjugate Chem. 25:1124-1136, и WO 2013/085925, каждый из которых включен в настоящий текст посредством ссылки.

6.5.3. ADC с катепсин-расщепляемыми линкерами

Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ЦДН (например, ЦДН-A или ЦДН-B) и антитела, составляющие ADC по настоящему изобретению, соединены через катепсин-расщепляемый линкер. В одном таком варианте осуществления, ADC имеет структуру, отвечающую формуле III:

Формула III

где переменные W, X, Y, Z, R^P и n имеют значения, указанные выше для формул I и II. В изображенном выше схематическом виде, представляет собой ковалентную связку катепсин-расщепляемого линкера с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (Ab).

В одном варианте осуществления пирролидин-2,5-диновая группа в линкере формулы III соединена по своему 3-положению с антителом (Ab) по тиольной группе. Например, пирролидин-2,5-дион может быть ковалентно соединен по своему 3-положению с антителом через цистеиновый остаток в антителе. Образующийся ADC имеет структуру, отвечающую формуле IIIa:

Формула IIIa

где переменные W, X, Y, Z, R^P и n имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В одном варианте осуществления ADC имеет следующую структуру:

.

6.5.4. ADC с глутатион-расщепляемыми линкерами

Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ЦДН (например, ЦДН-A или ЦДН-B) и антитела, составляющие ADC по настоящему изобретению, соединены через глутатион-расщепляемый линкер. В одном таком варианте осуществления, ADC имеет структуру, отвечающую формуле IV:

Формула IV

где переменные W, X, Y, Z, R^P и n имеют значения, указанные выше в формулах I и II. В изображенном выше схематическом виде, представляет собой ковалентную связку глутатион-расщепляемого линкера с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (Ab).

В одном варианте осуществления карбонильная группа линкера в формуле IV может быть ковалентно связана с антителом через остаток лизина или другой аминокислоты в антителе, имеющей боковую цепь с амино-группой, так что образуется амидная связь с амино-группой у связи, соединенной с карбонильной группой. Образующийся ADC имеет структуру, отвечающую формуле IVa:

Формула IVa

где переменные W, X, Y, Z, R^P и n имеют значения, указанные выше в формулах I и II.

В одном варианте осуществления ADC имеет следующую структуру:

.

6.6. Способы получения конъюгатов антитело-лекарственное средство

В целом, ADC формулы I можно получить по следующей схеме:

Ab-R^X + R^Y-L-(D)_m → (Формула I) Ab-[-L-(D)_m]_n

где Ab, L, D, m и n имеют значения, указанные выше для формулы I, и RX и RY представляют собой комплементарные группы, способные образовывать ковалентные связки друг с другом.

Соответственно, ADC формулы Ia можно получить по следующей схеме:

Ab-R^X + R^Y-L-D → (Формула Ia) Ab-[-L-D]_n

где Ab, L, D и n имеют значения, указанные выше для формулы I, и RX и RY представляют собой комплементарные группы, способные образовывать ковалентные связки друг с другом, как описано выше.

Природа групп RX и RY зависит от химии, используемой для связывания синтона RY-L-(D)m или RY-L-D с антителом. Синтоны обычно связывают с боковыми цепями аминокислотных остатков в антителе, включая, например, свободную тиольную группу доступного цистеинового остатка или первичную амино-группу доступного лизинового остатка. В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой группу в боковой цепи аминокислоты в антителе, такую как амино-группа или тиольная группа. В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой амино-группу в боковой цепи аминокислоты, такой как лизин, 5-гидроксилизин, орнитин или статин, в частности лизин. В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой тиольную группу в боковой цепи аминокислоты, такой как цистеин или гомоцистеин, в частности цистеин. В таких связках свободные тиольные группы можно получить, сначала полностью или частично восстанавливая антитело для разрушения межцепочечных дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками. Ряд функциональных групп RY и соответствующих химических реакций можно применять для образования связок с тиольными группами, и они включают, в качестве неограничивающих примеров, малеимиды и галогенацетилы.

ADC по настоящему изобретению охватывают также сконструированные антитела с мутациями по одному или более кодонам, ведущими к разрыву одного или более дисульфидных мостиков, и они включают, в качестве неорганичивающего примера, мутацию одного цистеинового остатка в межцепочечном дисульфидном мостике с остатком серина, что дает свободную тиольную группу от неспаренного цистеина. ADC по настоящему изобретению охватывают также сконструированные антитела с мутациями по одному или более кодонам, ведущими к вставке остатка, содержащего тиольную группу для конъюгирования с линкером, и они включают, в качестве неорганичивающего примера, мутацию одного или более цистеиновых остатков или включение дополнительных цистеиновых остатков в последовательность аминокислот в антителе или его антиген-связывающем фрагменте.

В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой тиол, например от цистеинового остатка в антителе, и RY представляет собой группу, выбранную из галогенацетила, малеимида, азиридина, акрилоила, винилсульфона, пиридил дисульфида, TNB-тиола и алкилирующего или арилирующего агента. В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой тиольную группу, например от цистеинового остатка в антителе, и RY представляет собой малеимидную группу. В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой первичную амино-группу лизинового остатка. Ряд функциональных групп RY и соответствующих химических реакций можно применять для образования связок с лизином, и они включают, в качестве неограничивающих примеров, NHS-эфиры и изотиоцианаты.

В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой амин, например от лизинового остатка в антителе, и RY представляет собой группу, способную алкилировать или ацилировать этот амин. В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой амин, например от лизинового остатка в антителе, и RY представляет собой группу, выбранную из изотиоцианата, изоцианата, ацилазида, NHS-эфира, сульфонилхлорида, альдегида, глиоксаля, эпоксида, оксирана, карбоната, арилгалогенида, имидоэфира, карбодиимида, ангидрида и фторфенилового эфира. В некоторых вариантах осуществления RX представляет собой амин, например от лизинового остатка в антителе, и RY представляет собой NHS-эфир.

Для ADC по настоящему изобретению химия процесса конъюгирования не ограничивается доступными группами в боковой цепи. Антитело может быть сконструировано так, чтобы содержать аминокислотные остатки для конъюгирования, и они включают, в качестве неорганичивающих примеров, превращение в боковых цепях таких групп как амино-группы в другие подходящие группы, такие как тиольные группы, путем присоединения к амину подходящей малой молекулы. Например, боковую цепь, содержащую первичную амино-группу аминокислоты, можно превратить в тиол-содержащую боковую цепь, такую как -NH-C_1-6 алкил-SH, включая -NH-CH₂-CH₂-SH, где -NH- приходит из первичной амино-группы.

Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области, число ЦДН, связанных с молекулой антитела, может варьироваться, что дает гетерогенный препарат ADC, в котором некоторые антитела содержат один присоединенный ЦДН, некоторые два, некоторые три и т.д. (а некоторые не содержат ни одного). Степень гетерогенности, среди прочих факторов, зависит от химии процесса, использующегося для связывания с ЦДН. Например, когда IgG1 антитело восстанавливается, давая тиольные группы для присоединения, часто образуются гетерогенные смеси антител, содержащих 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 связанных ЦДН на молекулу. Кроме того, регулируя мольное соотношение RX и RY, можно получать ADC, содержащие 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 связанных ЦДН на молекулу. Поэтому следует понимать, что в зависимости от контекста указанные соотношения препарат/антитело (DAR) могут представлять собой средние значения для набора ADC. Например, “DAR3” означает гетерогенный препарат ADC, в котором среднее соотношение препарат/антитело равно 3, например, смесь ADC, имеющих равные количества DAR2 и DAR4.

Чистоту можно оценить различными способами, известными в данной области. Как частный пример, ADC препарат можно анализировать методом ВЭЖХ, гидрофобного обмена, ионообменной, гель-проникающей или другими видами хроматографии, и степень чистоты оценивают по анализу площадей соответствующих пиков.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения ADC, включающего (a) конюъюгирование одного или более ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) с линкером (например, описанным в настоящей заявке L) с получением линкера, связанного с одним или более ЦДН; и (b) конюъюгирование линкера, связанного с одним или более ЦДН, с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (например, описанным в настоящей заявке Ab) с получением ADC.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения ADC, включающего (b) конюъюгирование линкера, связанного с одним или более ЦДН (т.е. ЦДН формулы II и, например, описанного в настоящей заявке L), с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (например, описанным в настоящей заявке Ab) с получением ADC.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения линкеров, связанных с одним или более ЦДН, включающего (a) конюъюгирование одного или более ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) с линкером (например, описанным в настоящей заявке L) с получением линкеров, связанных с одним или более ЦДН.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения ADC, включающего (a) конюъюгирование одного или более линкеров (например, описанных в настоящей заявке L) с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (например, описанным в настоящей заявке Ab) с получением антитела, связанного с линкером; и (b) конюъюгирование одного или более ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) с антителом, связанным с линкером, с получением ADC.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения ADC, включающего (b) конюъюгирование одного или более ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) с антителом или его антиген-связывающим фрагментом, связанным с линкером (например, одним или более L, описанными в настоящей заявке, и, например, описанным в настоящей заявке Ab), с получением ADC.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения антитела, связанного с линкером, включающего (a) конюъюгирование одного или более линкеров (например, описанных в настоящей заявке L) с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (например, описанным в настоящей заявке Ab) с получением антитела, связанного с линкером.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения ADC, включающего (a) конюъюгирование ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) с линкером (например, описанным в настоящей заявке L) с получением ЦДН-связанного линкера; и (b) конюъюгирование нескольких ЦДН-связанных линкеров с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (например, описанным в настоящей заявке Ab) с получением ADC.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение касается способа получения ADC, включающего (a) конюъюгирование нескольких линкеров (например, описанных в настоящей заявке L) с антителом или его антиген-связывающим фрагментом (например, описанным в настоящей заявке Ab) с получением антитела, связанного с линкером; и (b) конюъюгирование одного или более ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) с антителом, связанным с линкером, с получением ADC.

6.6.1. Композиции ЦДН для работы с ЦДН до конюъюгирования

Как описано выше, ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II, такие как ЦДН-A или ЦДН-B) можно конъюгировать с линкером (например, описанным в настоящей заявке L), получая линкеры, связанные с одним или более ЦДН, или их можно конъюгировать с антителом, связанным с линкером (например, один или более описанных в настоящей заявке L и, например, описанное в настоящей заявке Ab), получая ADC. Поэтому в настоящей заявке описаны ЦДН композиции, которые облегчают очистку, сушку или обращение с ЦДН, применяющимися на этих стадиях конъюгирования.

В этом контексте в настоящем изобретении описана композиция ЦДН, содержащая ЦДН формулы II (включая подформулы формулы II, такие как Формула IIa, IIb и т.д.) и основание, такое как аминное основание. В некоторых вариантах осуществления аминное основание является жидким при комнатной температуре и давлении, такое как пиридин, пиперидин, пирролидин, морфолин, лутидин (например, 2,6-лутидин), триэтиламин (ТЭА) или диизопропилэтиламин (DIPEA), в частности пиридин. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН, содержащая ЦДН и основание, представляет собой безводную композицию, содержащую менее 100, 50, 25 или 10 м.д. воды. Композицию ЦДН, содержащую ЦДН и основание, можно сушить путем упаривания в высоком вакууме перед использованием на стадии конъюгирования.

В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН формулы II, такой как Формула IIk, IIm, IIn или IIo, и аминное основание, такое как пиридин. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН формулы II, имеющий амино-группу в положении R¹, и аминное основание, такое как пиридин. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН формулы IIn или IIo (и опционально имеющий амино-группу в положении R¹), и аминное основание, такое как пиридин. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит описанный в настоящей заявке ЦДН-A или его фармацевтически приемлемую соль, и аминное основание, такое как пиридин, и опционально является безводной. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит описанный в настоящей заявке ЦДН-B или его фармацевтически приемлемую соль, и аминное основание, такое как пиридин, и опционально является безводной.

В настоящем изобретении также описана композиция ЦДН, которая представляет собой водный раствор, содержащий ЦДН формулы II (включая подформулы формулы II, такие как Формула IIa, IIb и т.д.) и буфер, позволяющий установить значение рН в диапазоне от 5 до 10, включая диапазон от 5 до 8, такое как pH 5, 5,5, 5,8, 6, 6,2, 6,5, 7, 7,5 или 8, включая любые диапазоны pH в рамках этих значений pH как границ, такие как диапазон от 5 до 7. В некоторых вариантах осуществления буфер позволяет установить значение pH равное 6 +/- 0,2. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН представляет собой водный раствор, содержащий ЦДН формулы II, имеющий тиольную группу в положении R¹, такой как Формула IIo, и буфер, позволяющий установить значение pH равное 6 +/- 0,2, такой как фосфатный буфер. В частных вариантах осуществления композиция ЦДН представляет собой водный раствор, содержащий ЦДН формулы IIo и буфер, позволяющий установить значение pH равное 6 +/- 0,2, такой как фосфатный буфер. В одном варианте осуществления ЦДН композиция представляет собой водный раствор, содержащий ЦДН-B или его фармацевтически приемлемую соль и буфер, позволяющий установить значение pH равное 6 +/- 0,2, в частности фосфатный буфер.

6.6.2. Композиции ЦДН для конъюгирования ЦДН с линкером

Получение описанного выше линкера, связанного с ЦДН (т.е. содержащего ЦДН формулы II, такой как ЦДН-A или ЦДН-B, связанный с линкером, например, описанным в настоящей заявке L), может включать получение одной или более композиций ЦДН для конъюгирования ЦДН с линкером.

В этом контексте, в настоящем изобретении описана композиция ЦДН, содержащая ЦДН формулы II (включая подформулы формулы II, такие как Формула IIa, IIb и т.д.) и линкер (например, описанный в настоящей заявке L) или сшивающий агент, или как линкер, так и сшивающий агент, где сшивающий агент обеспечивает сочетание ЦДН с линкером. В некоторых вариантах осуществления сшивающий агент способен активировать линкер для сочетания с ЦДН, например путем формирования активированного сложного эфира на линкере, так что ЦДН затем способен реагировать с активированным сложным эфиром на линкере, осуществляя конъюгирование ЦДН с линкером. Примеры подходящих сшивающих агентов включают гидроксибензотриазол (HOBt), N-гидроксисукцинимид (NHS), дициклогексилкарбодиимид (DCC), диизопропилкарбодиимид (DIC), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) и гексафторфосфат азабензотриазол тетраметилурония (HATU). В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН дополнительно содержит апротонный полярный растворитель, такой как диметилформамид (ДМФА), диметилацетамид (ДМА), ацетонитрил или тетрагидрофуран (ТГФ), в частности ДМФА. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН, содержащая ЦДН и линкер или сшивающий агент (или оба из них), представляет собой безводную композицию, содержащую менее 100, 50, 25 или 10 м.д. воды.

В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН формулы II, такой как формула IIk, IIm, IIn или IIo (и содержащий амино- или тиольную группу в положении R¹), и линкер (например, описанный в настоящей заявке L) или сшивающий агент, или линкер и сшивающий агент вместе. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН формулы II, имеющий амино- или тиольную группу в положении R¹, и линкер или сшивающий агент, или линкер и сшивающий агент вместе. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН формулы IIn или IIo (и опционально содержащий амино- или тиольную группу в положении R¹), и линкер или сшивающий агент, или линкер и сшивающий агент вместе. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит описанный в настоящей заявке ЦДН-A или ЦДН-B, или его фармацевтически приемлемую соль, и линкер или сшивающий агент, или линкер и сшивающий агент вместе, и опционально - описанный выше апротонный полярный растворитель. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН-A или ЦДН-B или его фармацевтически приемлемую соль, линкер и апротонный полярный растворитель. В некоторых вариантах осуществления композиция ЦДН содержит ЦДН-A или ЦДН-B или его фармацевтически приемлемую соль, сшивающий агент и апротонный полярный растворитель.

6.6.3. Линкеры, связанные с ЦДН

Как описано выше, линкеры, связанные с ЦДН, могут быть полезными интермедиатами в получении ADC по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, содержит ЦДН формулы II (например, ЦДН-A или ЦДН-B), конъюгированный с линкером, например, с описанным в настоящей заявке L. Например, линкер, связанный с ЦДН, может иметь формулу L-ЦДН, где L включает сайт, способный связываться с комплементарным сайтом в антителе или в антиген-связывающемся фрагменте, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как Формулы IIk, IIm, IIn и IIo), и где ЦДН ковалентно связан с линкером по гидроксильной, тиольной, амино-группе, C_1-6 алкиламино-группе или -ПЭГ-OH группе в положении R¹ формулы II.

В некоторых вариантах осуществления ЦДН и линкер в линкере, связанном с ЦДН, соединены через тиоэфирную, амидную, сложноэфирную, карбаматную, карбонатную, мочевинную, дисульфидную группу или простую эфирную группу, в особенности через амидную, карбаматную или дисульфидную группу. Например, в некоторых вариантах осуществления ЦДН и линкер в линкере, связанном с ЦДН, соединены через амидную группу. В таких вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, может иметь формулу L-C(O)NH-ЦДН или L-C(O)N(C_1-6 алкил)-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой, любая из которых формирует аминную часть амидной группы в формуле. В одном таком варианте осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет формулу L-C(O)NH-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_2-3 алкил, такой как этил, замещенный амино-группой, которая формирует аминную часть амидной группы в формуле.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет структуру, отвечающую формуле IXa:

Формула IXa

где R^L представляет собой остальную часть линкера L, и переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В других вариантах осуществления ЦДН и линкер в линкере, связанном с ЦДН, соединены через карбаматную группу. В таких вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, может иметь формулу L-OC(O)NH-ЦДН или L-OC(O)N(C_1-6 алкил)-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой, любая из которых формирует аминную часть карбаматной группы в формуле. В одном таком варианте осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет формулу L-OC(O)NH-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_2-3 алкил, такой как этил, замещенный амино-группой, которая формирует аминную часть карбаматной группы в формуле.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет структуру, отвечающую формуле IXb:

Формула IXb

где R^L представляет собой остальную часть линкера L, и переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет следующую структуру:

где переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В других вариантах осуществления ЦДН и линкер в линкере, связанном с ЦДН, соединены через мочевинную группу. В таких вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, может иметь формулу L-NHC(O)NH-ЦДН или L-NHC(O)N(C_1-6 алкил)-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой, любая из которых формирует правую аминную часть мочевинной группы в формуле. В одном таком варианте осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет формулу LNHC(O)NH-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_2-3 алкил, такой как этил, замещенный амино-группой, которая формирует правую аминную часть мочевинной группы в формуле.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет структуру, отвечающую формуле IXc:

Формула IXc

где R^L представляет собой остальную часть линкера L, и переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В других вариантах осуществления ЦДН и линкер в линкере, связанном с ЦДН, соединены через сложноэфирную группу. В таких вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, может иметь формулу L-C(O)O-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный гидроксилом или -ПЭГ-OH группой, любая из которых формирует спиртовую часть сложноэфирной группы в формуле. В одном таком варианте осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет формулу L-C(O)O-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_2-3 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, которая формирует спиртовую часть сложноэфирной группы в формуле.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет структуру, отвечающую формуле IXd:

Формула IXd

где R^L представляет собой остальную часть линкера L, и переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В других вариантах осуществления ЦДН и линкер в линкере, связанном с ЦДН, соединены через карбонатную группу. В таких вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, может иметь формулу L-OC(O)O-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный гидроксилом или -ПЭГ-OH группой, любая из которых формирует правую спиртовую часть карбонатной группы в формуле. В одном таком варианте осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет формулу L-OC(O)O-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIn), где R¹ в формуле II представляет собой C_2-3 алкил, такой как этил, замещенный гидроксильной группой, который формирует правую спиртовую часть карбонатной группы в формуле.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет структуру, отвечающую формуле IXe:

Формула IXe

где R^L представляет собой остальную часть линкера L, и переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В других вариантах осуществления ЦДН и линкер в линкере, связанном с ЦДН, связаны через дисульфидную группу. В таких вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, может иметь формулу L-S-S-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIo), где R¹ в формуле II представляет собой C_1-6 алкил, такой как C_2-6 алкил или C_2-3 алкил, замещенный тиольной группой, которая формирует правую часть дисульфидной группы в формуле. В одном таком варианте осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет формулу LS-S-ЦДН, где ЦДН имеет формулу II (включая подформулы, такие как формулы IIk, IIm и IIo), где R¹ в формуле II представляет собой C_2-3 алкил, такой как этил, замещенный тиольной группой, которая формирует правую часть дисульфидной группы в формуле.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет структуру, отвечающую формуле IXf:

Формула IXf

где R^L представляет собой остальную часть линкера L, и переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

В некоторых вариантах осуществления линкер, связанный с ЦДН, имеет следующую структуру:

где переменные W, X, Y, Z и R^P имеют значения, указанные выше для формул I и II.

6.7. Фармацевтические композиции и лекарственные препараты

ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению могут быть в форме фармацевтической композиции, содержащей ADC или ЦДН и один или более носителей, вспомогательных компонентов и/или разбавителей. Композиции могут быть приготовлены для фармацевтического применения для людей и могут включать фармацевтически приемлемый носитель, такой как водный, необязательно буферный, раствор, суспензию или дисперсию. Композиции могут также представлять собой лиофилизованные твердые композиции, предназначенные для разведения перед использованием.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть в любой подходящей форме, и их можно вводить пациенту различными способами, например внутривенно, внутрь опухоли, подкожно, внутримышечно, перорально, интраназально, интратекально, чрезкожно, наружно или местно. Способ введения в каждом случае зависит от конкретного антитела и/или ADC, субъекта, природы и степени тяжести заболевания и физического состояния субъекта. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция вводится внутривенно, внутрь опухоли, подкожно или внутримышечно в форме жидкого препарата.

В некоторых вариантах осуществления ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению, включая их фармацевтические композиции, вводят системно, например подкожно, интраперитонеально, внутримышечно или внутривенно, в частности внутривенно. В других вариантах осуществления ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению, включая их фармацевтические композиции, вводят локально в сайт опухоли, например внутрь опухоли или в микроокружение опухоли.

В настоящем изобретении также описаны ЦДН формулы II (включая подформулы формулы II, такие как формула IIa, IIb и т.д.) для применения в изготовлении лекарственных средств для терапии, таких как средства для промотирования иммунного ответа и/или для лечения рака у субъекта, включая один или более описанных ниже видов рака, и в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими средствами, как описано ниже.

6.8. Способы лечения

В некоторых вариантах осуществления ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) или ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II, такой как ЦДН-A или ЦДН-B) могут применяться в терапии. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается фармацевтических композиций по настоящему изобретению, содержащих ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) или ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) для применения в терапии.

ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению можно применять в отдельности или в комбинации друг с другом и/или с другими терапевтическими средствами. Как показано в описанных ниже примерах, ADC и ЦДН способны промотировать иммунный ответ при введении субъекту. Например, ADC и ЦДН по настоящему изобретению, в отдельности или в комбинации, способны индуцировать интерферон-β (IFNβ) у человека. Способность ADC и ЦДН по настоящему изобретению промотировать иммунный ответ приписывают, в том числе, их способности оказывать агонистическое действие на STING. ADC способны доставлять ЦДН по настоящему изобретению (например, соединение формулы II) в целевые опухолевые или раковые иммунные клетки, или в микроокружение опухоли, запуская активацию STING и соответствующего иммунного ответа. Конъюгирование ЦДН с антителом или его антиген-связывающим фрагментом, который связывается с антигеном в опухолевых или раковых иммунных клетках, нацелено на доставку ЦДН и пролонгирование и усиление иммунного ответа.

ADC по настоящему изобретению способны промотировать иммунный ответ, который сильнее, чем у неконъюгированного ЦДН или антитела, содержащего ADC. Неожиданно было обнаружено, что ADC по настоящему изобретению способны промотировать иммунный ответ, который сильнее, чем аддитивный иммунный ответ неконъюгированного ЦДН и антитела, содержащего ADC. Другими словами, при конъюгировании ЦДН по настоящему изобретению со специфическим иммунотерапевтическим антителом может быть достигнут синергетический эффект. В других вариантах осуществления, как описано в настоящем тексте, ЦДН по настоящему изобретению можно также вводить не как часть ADC.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения описаны способы индуцирования или промотирования иммунного ответа у субъекта, включающие введение эффективного количества ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I). В другом аспекте в настоящем изобретении описаны способы индуцирования или промотирования иммунного ответа у субъекта, включающие введение эффективного количества ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II). И в другом аспекте в настоящем изобретении описаны способы индуцирования или промотирования иммунного ответа у субъекта, включающие введение эффективного количества ADC по настоящему изобретению в комбинации с ЦДН по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления ADC и/или ЦДН вводят млекопитающим, нуждающимся в этом. В частных вариантах осуществления ADC и/или ЦДН вводят людям, нуждающимся в этом.

В частных вариантах осуществления ADC или ЦДН по настоящему изобретению применяют для лечения рака. Например, ADC или ЦДН по настоящему изобретению можно применять для лечения рака легких, костей, поджелудочной железы, кожи, головы, шеи, матки, яичников, желудка, кишечника, груди, пищевода, тонкого кишечника, толстого кишечника, эндокринной системы, щитовидной железы, паращитовидной железы, надпочечников, мочеточника, простаты, пениса, яичка, уретры, мочевого пузыря, почки или печени. Другие виды рака, которые можно лечить с помощью ADC или ЦДН по настоящему изобретению, включают рак прямой кишки; рак анального отверстия; карциному фаллопиевых труб, эндометрия, шейки матки, вагины, вульвы, почечной лоханки и почечных клеток; саркому мягких тканей; миксому; рабдомиому; фиброму; липому; тератому; холангиокарциному; гепатобластому; ангиосаркому; гемагиому; гепатому; фибросаркому; хондросаркому; миелому; хронический или острый лейкоз; лимфоцитарную лимфому; первичную лимфому ЦНС; новообразования ЦНС; опухоли оси позвоночника; плоскоклеточную карциному; синовиальную саркому; злокачественную мезотелиому плевры; глиому ствола мозга; аденому гипофиза; аденому бронха; хондроматозную гамартому; мезотелиому; болезнь Ходжкина; или комбинацию одного или более из перечисленных выше видов рака.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения описаны способы лечения рака у субъекта, включающие введение фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I). В другом аспекте в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта, включающие введение фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят млекопитающим, нуждающимся в этом. В частных вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят людям, нуждающимся в этом.

В другом аспекте в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта путем введения фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) с по меньшей мере одним дополнительным противораковым средством субъекту (например, человеку). ADC и одно или более дополнительных противораковых средств можно вводить совместно или по отдельности, и при введении по отдельности введение может происходить одновременно или последовательно, в любом порядке и любым приемлемым путем, в виде раздельных или объединенных фармацевтических композиций. В некоторых вариантах осуществления дополнительное противораковое средство усиливает экспрессию целевого антигена антитела или его антиген-связывающего фрагмента в ADC формулы I. Количество ADC и другого фармацевтически активного противоракового средства (средств) и относительный тайминг введения выбирают в соответствии с целью достижения целевого комбинированного терапевтического эффекта.

В некоторых случаях в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта путем введения фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II) с по меньшей мере одним дополнительным противораковым средством субъекту (например, человеку). ЦДН и одно или более дополнительных противораковых средств можно вводить совместно или по отдельности, и при введении по отдельности введение может происходить одновременно или последовательно, в любом порядке и любым приемлемым путем, в виде раздельных или объединенных фармацевтических композиций. Количество ЦДН и другого фармацевтически активного противоракового средства (средств) и относительный тайминг введения выбирают в соответствии с целью достижения целевого комбинированного терапевтического эффекта.

Комбинацию ADC или ЦДН по настоящему изобретению и одного или более противораковых средств можно вводить совместно в составе одной фармацевтической композиции. Альтернативно, ADC или ЦДН и одно или более противораковых средств могут находиться в составе раздельных препаратов. Когда они находятся в составе раздельных препаратов, они могут входить в состав любых приемлемых композиций, составленных по принципам, известным квалифицированным в данной области специалистам.

Соответственно, ADC или ЦДН по настоящему изобретению можно применять с другими терапевтическими методами лечения рака, например с противоопухолевой терапией, комбинированной терапией с ингибиторами иммунных контрольных точек, другими химиотерапевтическими, гормональными агентами, антителами, а также хирургическими методами и/или методами лучевой терапии, в частности с радиационной терапией.

В одном варианте осуществления ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) или ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II), или ADC и ЦДН по настоящему изобретению вместе, применяются в комбинации с ингибитором иммунных контрольных точек для лечения рака. Ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как гуманизированные антитела к PD-1, PD-L1 и CTLA4, недавно показали себя очень успешно в лечении нескольких типов метастатического рака, включая меланому, немелкоклеточный рак легких, почечно-клеточный рак и рак мочевого пузыря (Sharma and Allison, 2015, Science 348, 56). Однако, до сих пор только небольшой процент раковых пациентов получает реальную пользу от терапии ингибиторами иммунных контрольных точек, частично из-за того, что недостаточное число противоопухолевых иммунных клеток, таких как CD8 Т-клетки, генерируется и/или инфильтруется в опухоли. Как показано в описанных в настоящем тексте примерах, комбинация ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению и ингибитора иммунных контрольных точек способна работать синергетически на излечение видов рака, устойчивых к монотерапии ингибиторами иммунных контрольных точек.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта путем введения фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) или ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II), или ADC и ЦДН по настоящему изобретению вместе, в комбинации с ингибитором PD-L1. Примеры ингибиторов PD-L1, которые можно применять в комбинации с ADC по настоящему изобретению, включают (но не ограничиваются только ими) атезолизумаб (Tecentriq®), авелумаб (Bavencio®), дурвалумаб (Imfinzi®), BMS-936559 и CK-301. В некоторых вариантах осуществления ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению не вводят в комбинации с ингибитором PD-L1, включая перечисленные выше.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта путем введения фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) или ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II), или ADC и ЦДН по настоящему изобретению вместе, в комбинации с ингибитором PD-1. Примеры ингибиторов PD-L1, которые можно применять в комбинации с ADC по настоящему изобретению, включают (но не ограничиваются только ими) пембролизумаб (Keytruda®), ниволумаб (Opdivo®), цемиплимаб (Libtayo®), AMP-224, AMP-514 и PDR001. В некоторых вариантах осуществления ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению изобретению не вводят в комбинации с ингибитором PD-L1, включая перечисленные выше.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта путем введения фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) или ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II), или ADC и ЦДН по настоящему изобретению вместе, в комбинации с ингибитором CTLA-4. Примеры ингибиторов CTLA-4, которые можно применять в комбинации с ADC по настоящему изобретению, включают (но не ограничиваются только ими) ипилмумаб (Yervoy®) и тремелимумаб. В некоторых вариантах осуществления ADC и/или ЦДН по настоящему изобретению не вводят в комбинации с ингибитором CTLA-4, включая перечисленные выше.

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта путем введения фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) или ЦДН по настоящему изобретению (т.е. ЦДН формулы II), или ADC и ЦДН по настоящему изобретению вместе, с одним или более ингибиторами полимеризации тубулина, такими как дитерпеноиды и алкалоиды барвинка; координационные комплексы платины; алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты, оксазафосфоринаны, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазепариазены; антибиотики, такие как антрациклины, актиномицины и блеомицины; ингибиторы топоизомеразы II, такие как эпиподофиллотоксины; антиметаболиты, такие как аналоги пурина и пиримидина и антифолатные соединения; ингибиторы топоизомеразы I, такие как кампотецины; гормоны и аналоги гормонов; ингибиторы пути передачи сигнала; ингибиторы ангиогенеза; иммунотерапевтические средства; проапоптозные средства; и/или ингибиторы сигналов клеточного цикла.

ADC формулы I можно применять, например, для лечения рака или для индуцирования или промотирования иммунного ответа, в комбинации со STING агонистом, который не конъюгирован с антителом или антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления STING агонист, который не конъюгирован с антителом или антиген-связывающим фрагментом, представляет собой ЦДН, такой как один из описанных в настоящем тексте, т.е. 2’3’-ЦДН. В других вариантах осуществления STING агонист представляет собой 3’3’-ЦДН, 2’2’-ЦДН или 3’2’-ЦДН. В некоторых вариантах осуществления STING агонист представляет собой бензофеноновый аналог. В других вариантах осуществления STING агонист представляет собой димерный аминобензимидазол. Примеры STING агонистов, неконъюгированных с антителом или антиген-связывающим фрагментом, которые можно применять в комбинации с ADC по настоящему изобретению, включают IMSA101, ADU-S100 (MIW815), BMS-986301, CRD5500, CMA (10-карбоксиметил-9-акриданон), diABZI STING агонист-1 (например, CAS No.: 2138299-34-8), DMXAA (ASA404/вадимезан), E7766, GSK-532, GSK-3745417, MK-1454, MK-2118, SB-11285, SRCB-0074, TAK-676 и TTI-10001. STING агонист можно вводить до, одновременно или после введения ADC формулы I.

ADC формулы I можно применять, например, для лечения рака или для индуцирования или промотирования иммунного ответа, в комбинации со “свободным” ЦДН который не конъюгирован с антителом или антиген-связывающим фрагментом формулы I. Свободный ЦДН можно вводить до, одновременно или после введения ADC формулы I. В таких случаях свободный ЦДН может быть таким же или отличаться от ЦДН, конъюгированного с антителом в ADC формулы I. Свободный ЦДН может представлять собой cGAMP, например 2’3’-cGAMP или его аналог или производное, или его фармацевтически приемлемую соль. В других вариантах осуществления свободный ЦДН представляет собой 3’3’-cGAMP, 2’2’-cGAMP, 3’2’-cGAMP или его аналог или производное, или его фармацевтически приемлемую соль.

Соответственно, в настоящем изобретении описаны способы лечения рака у субъекта путем введения фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по настоящему изобретению (т.е. ADC формулы I) с по меньшей мере одним ЦДН, который не конъюгирован с антителом (“свободный ЦДН”). ADC формулы I и свободный ЦДН можно вводить вместе или по отдельности, и при раздельном введении введение может осуществляться одновременно или последовательно, в любом порядке, любым приемлемым способом по отдельности или в комбинации.

В одном варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

В другом варианте осуществления свободный ЦДН, который вводят в комбинации с ADC формулы I, представляет собой изображенное ниже соединение или его фармацевтически приемлемую соль:

.

7. Примеры

Описанные ниже Примеры, которые подчеркивают определенные отличительные свойства и характеристики иллюстративных вариантов ЦДН, ADC и способов применения этих ADC для лечения пациентов, приведены исключительно для иллюстрации и не являются ограничивающими.

Аббревиатуры

¹H-ЯМР Спектроскопия протонного ядерного магнитного резонанса ¹⁹F-ЯМР Спектроскопия ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹⁹F ³¹P-ЯМР Спектроскопия ядерного магнитного резонанса на ядрах ³¹P G Гуанин A Аденин A^Bz 6N-бензоиладенин Gib 2N-изобутирил Bz Бензоил ДХУК Дихлоруксусная кислота ДХМ Дихлорметан DMOCP 2-хлор-5,5-диметил-1,3,2-диоксафосфинан 2-оксид DMT 4,4' -диметокситритил DMTCl 4,4' -диметокситритил хлорид PBS Фосфатно-солевой буфер Py. Пиридин TBS трет-бутилдиметилсилил TrCl Трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид IBX 2-иодоксибензойная кислота LAH Литийалюминий гидрид ДМФА Диметилформамид NMM N-Метилморфолин Et₃N Триэтиламин

Пример 1. Получение ЦДН-A

Ниже на Схемах A1 и A2 изображен синтез ЦДН (“ЦДН-A”) по настоящему изобретению. Ниже описаны синтез и характеризация ЦДН и его синтетических интермедиатов.

Синтез интермедиата 19 из 1

Схема A1. Синтез интермедиата 19

Схема A1. Синтез интермедиата 19 (продолжение)

Стадия 1: Синтез (3aR,5R,6S,6aR)-5-(гидроксиметил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-ола

Раствор (2R,4S,5R)-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2,3,4-триола (100 г, 0,67 моль) в ацетоне (2,6 л), содержащий H₂SO₄ (конц., 184,00 г, 1,88 моль, 100 мл, 2,8 экв.), перемешивали при 20°С в течение 1 часа. Раствор Na₂CO₃ (130 г, 1,23 моль, 1,8 экв.) в H₂O (600 мл) осторожно добавляли при 0^oC. Полученную смесь перемешивали еще 2,5 часа, затем добавляли вторую порцию Na₂CO₃ (70 г, 0,66 моль). Через 0,5 часа осадок отделяли фильтрованием и промывали ацетоном (0,5 л × 3). Фильтрат упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, ДХМ:MeOH = от 10:1 до 5:1), получая (3aR,5R,6R)-5-(гидроксиметил)-2,2-диметил-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-ол (53,5 г, 0,28 моль, 85% выход) в виде желтого масла. (МС: [M+Na]+ 213,0).

Стадия 2: Синтез 3aR,5R,6S,6aR)-2,2-диметил-5-((тритилокси)метил) тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-ола

В раствор (3aR,5R,6R)-5-(гидроксиметил)-2,2-диметил-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d] [1,3]диоксол-6-ола (125 г, 0,66 моль) в пиридине (600 мл) добавляли TrCl (219,9 г, 0,79 моль, 1,2 экв.). После 16 часов при 60°C, смесь охлаждали и упаривали. Остаток разделяли между CH₂Cl₂ (400 мл) и водн. NaHCO₃ (насыщ., 800 мл). Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (600 мл × 2). Объединенные органические слои сушили над Na₂SO₄, фильтровали, упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 10:1 до 5:1), получая (3aR,5R,6R)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-ол (250 г, 0,58 моль, 88% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+Na]+ 455,0).

Стадия 3: Синтез (3aR,5R,6aS)-2,2-диметил-5-((тритилокси)метил) дигидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6(3aH)-она

В раствор (3aR,5R,6R)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро [2,3-d][1,3]диоксол-6-ола (250 г, 0,58 моль) в CH₃CN (1,5 л) добавляли IBX (323 г, 1,2 моль, 2,00 экв.). Полученную смесь перемешивали при 90°C в течение 6 часов. После охлаждения смесь фильтровали. Фильтрат упаривали и получали (3aR,5R,6aS)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,6a-дигидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-он (240 г, 0,56 моль, 96,5% выход) в виде светло-желтого масла. (МС: [M+Na]+ 453,0).

Стадия 4: Синтез (E)-метил-2-((3aR,5S,6aR)-2,2-диметил-5-((тритилокси) метил)фуро[2,3-d][1,3]диоксол-6(3aH,5H,6aH)-илиден)ацетата

В смесь NaH (14,5 г, 0,36 моль, 60% в масле, 1,3 экв.) и ТГФ (1,00 л) добавляли метил 2-диметоксифосфорилацетат (66 г, 0,36 моль, 52,4 мл, 1,3 экв.) по каплям при 0°C в течение 15 минут. Полученную смесь перемешивали при той же температуре 45 минут, затем добавляли по каплям раствор (3aR,5R,6aS)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,6a-дигидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-она (120 г, 0,28 моль, 1 экв.) в ТГФ (500 мл). После 15 часов при 25°C, реакцию гасили добавлением NH₄Cl (насыщ., 50 мл) при 0°C. Полученную смесь упаривали и разделяли между насыщенным раствором хлорида натрия (500 мл) и CH₂Cl₂ (500 мл x 3). Объединенные органические слои сушили над Na₂SO₄, фильтровали, упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/ этилацетат = от 15:1 до 5:1), получая метил (2E)-2-[(3aR,5S,6aR)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,6a-дигидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-илиден]ацетат (65 г, 0,53 моль, 96% выход) в виде светло-желтого масла. (МС: [M+Na]+ 509,0).

Стадия 5: Синтез метил 2-((3aR,5S,6R,6aR)-2,2-диметил-5-((тритилокси) метил)тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-ил)ацетата

В раствор метил (2E)-2-[(3aR,5S,6aR)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,6a-дигидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-илиден]ацетата (260 г, 0,53 моль) в EtOAc (700 мл) добавляли Pd/C (10% на угле, 10 г) в атмосфере азота. Суспензию дегазировали и продували водородом 3 раза. Полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода (20 фунт/кв.дюйм) при 25°C в течение 16 часов. Катализатор отделяли фильтрованием. Фильтрат упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 15:1 до 10:1), получая метил 2-[(3aR,5S,6S)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-ил]ацетат (210 г, 0,43 моль, 80,4% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+Na]+ 511,1).

Стадия 6: Синтез 2-((3aR,5S,6R,6aR)-2,2-диметил-5-((тритилокси)метил) тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-6-ил)этанола

В смесь LiAlH₄ (15,5 г, 0,41 моль, 2 экв.) и ТГФ (500 мл) медленно добавляли раствор метил 2-[(3aR,5S,6S)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d] [1,3]диоксол-6-ил]ацетата (100 г, 0,20 моль) в ТГФ (20 мл) при 0°C. После перемешивания в течение 2,5 часов при 25°C, реакцию гасили добавлением воды (15 мл) и NaOH (водн., 15%, 15 мл) при 0°C. Полученный сырой продукт сушили над Na₂SO₄, фильтровали, упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 5:1 до 2:1), получая 2-[(3aR,5S,6S)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро [2,3-d][1,3]диоксол-6-ил]этанол (80 г, 0,35 моль, 85% выход) в виде светло-желтого масла.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ= 7,43 - 7,35 (м, 6H), 7,25 - 7,18 (м, 6H), 7,18 - 7,11 (м, 3H), 5,82 (д, J = 3,8 Гц, 1H), 4,62 (т, J = 4,2 Гц, 1H), 3,86 (тд, J = 3,5, 10,2 Гц, 1H), 3,61 - 3,47 (м, 2H), 3,37 (дд, J = 2,8, 10,7 Гц, 1H), 3,02 (дд, J = 4,1, 10,7 Гц, 1H), 2,13 (тт, J = 4,8, 9,9 Гц, 1H), 1,73 - 1,62 (м, 2H), 1,42 (с, 3H), 1,40 - 1,31 (м, 1H), 1,26 (с, 3H). MS: [M+Na]+ 483,2.

Стадия 7: Синтез (3aR,5S,6R,6aR)-6-(2-(бензилокси)этил)-2,2-диметил-5-((тритилокси)метил)тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксола

В смесь NaH (27,1 г, 0,68 моль, 60% в масле, 4,00 экв.) и ТГФ (500 мл) добавляли по каплям раствор 2-[(3aR,5S,6S)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро [2,3-d][1,3]диоксол-6-ил]этанола (78 г, 0,17 моль) в ТГФ (200 мл) при -20°C в течение 5 минут. После добавления смесь перемешивали при 25°C в течение 2 часов. BnBr (60,3 мл, 0,51 моль, 3,00 экв.) добавляли по каплям. Полученную смесь перемешивали при 80°C в течение 14 часов. После охлаждения до 0°C, реакцию гасили добавлением водн. NH₄Cl (насыщ., 20 мл), разбавляли водой (400 мл) и экстрагировали дихлорметаном (400 мл x 3). Объединенные органические слои сушили над Na₂SO₄, фильтровали, упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 15:1 до 5:1), получая (3aR,5S,6S)-6-(2-бензилоксиэтил)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол (90 г, 0,16 моль, 97% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+Na]+ = 573,1).

Стадия 8: Синтез (3aR,5S,6R,6aR)-6-(2-(бензилокси)этил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-5-ил)метанола

В раствор (3aR,5S,6S)-6-(2-бензилоксиэтил)-2,2-диметил-5-(тритилоксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксола (90 г, 0,16 моль) в CH₂Cl₂ (300 мл) добавляли CHCl₂COOH (30 мл, 0,16 моль, 1,00 экв.). После 3 часов при 25°C, реакционную смесь нейтрализовывали водным раствором NaHCO₃ (насыщ., 500 мл) до pH~7,0 при 0°C. Полученный сырой продукт экстрагировали дихлорметаном (100 мл x 3). Объединенные органические слои сушили над MgSO₄, фильтровали, упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 5:1 до 2:1), получая [(3aR,5S,6S)-6-(2-бензилоксиэтил)-2,2-диметил-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-5-ил]метанол (44 г, 0,14 моль, 87% выход) в виде желтого масла.

Стадия 9: Синтез (3aR,5S,6R,6aR)-6-(2-(бензилокси)этил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-5-ил)метил бензоата

В раствор [(3aR,5S,6S)-6-(2-бензилоксиэтил)-2,2-диметил-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро [2,3-d][1,3]диоксол-5-ил]метанола (62 г, 0,2 моль) в CH₂Cl₂ (200 мл) добавляли BzCl (35 мл, 0,3 моль, 1,50 экв.) и Et₃N (55,7 мл, 0,4 моль, 2 экв.). После 1 часа при 25°C, реакционную смесь упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/ этилацетат = от 15:1 до 10:1), получая [(3aR,5S,6S)-6-(2-бензилоксиэтил)-2,2-диметил-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-5-ил]метил бензоат (80 г, 0,19 моль, 97% выход) в виде светло-желтого масла. (МС: [M+Na]+ 435,1).

Стадия 10: Синтез ((2S,3S,4R)-3-(2-(бензилокси)этил)-4,5-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил бензоата

В смесь [(3aR,5S,6S)-6-(2-бензилоксиэтил)-2,2-диметил-3a,5,6,6a-тетрагидрофуро[2,3-d][1,3]диоксол-5-ил]метил бензоата (20 г, 49 ммоль) и H₂O (6 мл) добавляли HOAc (28 мл, 10 экв.). Полученную смесь перемешивали при 100°C в течение 5 часов. После охлаждения реакционную смесь нейтрализовывали водным раствором NaHCO₃ (насыщ., 2 л) и экстрагировали дихлорметаном (400 мл x 3). Объединенные органические слои упаривали и получали [(2S,3R,5R)-3-(2-бензилоксиэтил)-4,5-дигидрокси-тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоат (17,5 г, 47 ммоль, 96% выход) в виде светло-желтого масла, который использовали в следующей стадии без очистки. (МС: [M+ Na]+ 395,1).

Стадия 11: Синтез (3R,4R,5S)-5-((бензоилокси)метил)-4-(2-(бензилокси)этил) тетрагидрофуран-2,3-диил ацетата

В раствор [(2S,3R,5R)-3-(2-бензилоксиэтил)-4,5-дигидрокси-тетрагидрофуран-2-ил] метил бензоата (70 г, 0,19 моль) в пиридине (300 мл) добавляли Ac₂O (0,75 моль, 70,4 мл, 4,0 экв.). Полученную смесь перемешивали при 60°C в течение 4 часов. После охлаждения до 25°C, реакционную смесь нейтрализовывали водным раствором NaHCO₃ (насыщ.) до pH~7 и экстрагировали дихлорметаном (300 мл x 3). Органические слои упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 10:1 до 5:1), получая [(2S,3S,5S)-4,5-диацетокси-3-(2-бензилоксиэтил)тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоат (80 г, 93% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+ Na]+ 479,1).

Стадия 12: Синтез ((2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-(бензилокси)этил)-5-(2-изобутирамидо-6-оксо-1H-пурин-9(6H)-ил)тетрагидрофуран-2-ил)метил бензоата

В раствор 2-метил-N-(6-оксо-1,9-дигидропурин-2-ил)пропанамида (18,9 г, 85,4 ммоль, 1,30 экв.) в CH₃CN (300 мл) добавляли BSA (84,5 мл, 341,7 ммоль, 5,2 экв.) при 20°C. После перемешивания при 65°C в течение 0,5 часа, смесь охлаждали и упаривали. Остаток растворяли в MeCN (600 мл), затем добавляли раствор [(2S,3S,5S)-4,5-диацетокси-3-(2-бензилоксиэтил)тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (30 г, 65,7 ммоль) в MeCN (150 мл) и TMSOTf (17,8 мл, 98,6 ммоль, 1,5 экв.) при -15°C. Полученную смесь перемешивали при 65°C в течение 15 часов. После охлаждения смесь упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 5:1 до 1:1), получая ((2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-(бензилокси)этил)-5-(2-изобутирамидо-6-оксо-1H-пурин-9(6H)-ил) тетрагидрофуран-2-ил)метил бензоат (30 г, 48,6 ммоль, 74% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 618,1).

1H-ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ = 12,00 (с, 1H), 9,11 (с, 1H), 7,92 - 7,84 (м, 2H), 7,82 - 7,76 (м, 1H), 7,58 (т, J = 7,1 Гц, 1H), 7,46 - 7,37 (м, 2H), 7,27 - 7,16 (м, 5H), 5,90 - 5,85 (м, 1H), 5,74 (д, J = 5,3 Гц, 1H), 4,78 - 4,61 (м, 2H), 4,55 - 4,38 (м, 3H), 3,55 (т, J = 5,8 Гц, 2H), 3,23 - 3,14 (м, 1H), 2,47 (спт, J = 6,9 Гц, 1H), 2,22 - 2,10 (м, 3H), 1,83 (кв, J = 6,1 Гц, 2H), 1,17 (дд, J = 6,9, 8,9 Гц, 6H).

Стадия 13: Синтез ((2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-гидроксиэтил)-5-(2-изобутирамидо-6-оксо-1H-пурин-9(6H)-ил)тетрагидрофуран-2-ил)метил бензоата

В раствор [(2S,3S,5R)-4-ацетокси-3-(2-бензилоксиэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (25 г, 40,5 ммоль) в EtOH (500 мл) добавляли Pd/C (38 г, 10% на угле) и HOAc (25,00 мл, 437,1 ммоль, 11 экв.) в атмосфере N₂. Полученную суспензию продували водородом 3 раза и перемешивали в атмосфере водорода (40 фунт/кв.дюйм) 48 часов при 50°C. После охлаждения реакционную смесь фильтровали. Фильтрат упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 5:1 до 2:1), получая [(2S,3S,5R)-4-ацетокси-3-(2-гидроксиэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоат (20 г, 37,9 ммоль, 94% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 528,3).

Стадия 14: Синтез [(2S,3R,5R)-4-ацетокси-3-(2-иодэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата

В раствор [(2S,3R,5R)-4-ацетокси-3-(2-гидроксиэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (3 г, 5,69 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (90 мл) добавляли имидазол (1,16 г, 17,06 ммоль, 3 экв.) и трифенилфосфин (4,47 г, 17,06 ммоль, 3 экв.) в один прием, затем медленно добавляли раствор I₂ (2,60 г, 10,24 ммоль, 1,8 экв.) в ТГФ (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 16 часов, гасили насыщенным водным раствором Na₂SO₃ (8 мл) и упаривали, получая остаток. Остаток растворяли в этилацетате (80 мл) и промывали водой (80 мл). Водный слой экстрагировали этилацетатом (150 мл x 3). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄ и упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 1:1 до 1:3), получая [(2S,3R,5R)-4-ацетокси-3-(2-иодэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил] тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоат (2,3 г, 64% выход) в виде желтого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 638,2).

Стадия 15: Синтез [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-азидоэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата

В раствор [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-иодэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (3,8 г, 5,96 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (40 мл) добавляли NaN₃ (2,52 г, 38,75 ммоль, 6,5 экв.) и H₂O (10 мл). Полученную смесь перемешивали при 50°C в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором Na₂CO₃ (50 мл) и экстрагировали этилацетатом (100 мл x 3). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄ и упаривали при пониженном давлении, получая [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-азидоэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоат (2 г, 61% выход) в виде желтого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 553,1).

Стадия 16: Синтез N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-азидоэтил)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида

В раствор [(2S,3R,5R)-4-ацетокси-3-(2-азидоэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (2,55 г, 4,62 ммоль, 1 экв.) в EtOH (220 мл) добавляли водн. NaOH (2M, 23 мл, 10 экв.) при 0°C. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре 0,5 часа. В реакционную смесь добавляли HCOOH, устанавливая pH = 7~8 при 0°C, и смесь упаривали при пониженном давлении, получая остаток. Остаток очищали методом преп-ВЭЖХ (0,1%ТФУК в MeCN и воде, 0%~70%), получая N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-азидоэтил)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил) тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамид (1,6 г, 3,94 ммоль, 85% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+407,1).

Стадия 17: Синтез N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-[[бис(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-3-гидрокси-тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида

В раствор N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-азидоэтил)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил) тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида (1,6 г, 3,94 ммоль) в пиридине (15 мл) добавляли DMTCl (1,60 г, 4,72 ммоль, 1,2 экв.). Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 3 часов. Реакционную смесь гасили добавлением MeOH (10 мл) при 25°C. Полученную смесь упаривали при пониженном давлении, получая остаток в виде желтого масла. Остаток очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 1/1 до EtOH/этилацетат = 1:250), получая N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-[[бис(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-3-гидрокси-тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамид (950 мг, 1,34 ммоль, 34% выход) в виде желтого твердого вещества. (МС: [M+1]+709,4).

Стадия 18: Синтез [(2R,3R,4R,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-(гидроксиметил)-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты

В раствор N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-[[бис(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-3-гидрокситетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида (700 мг, 988 мкмоль) в пиридине (6 мл) добавляли дифенил фосфит (809,5 мг, 3,46 ммоль, 664 мкл, 3,5 экв.). После 1 часа при 25°C, добавляли ДХМ (5 мл) и Et₃N (3 мл), и смесь перемешивали при 25°C ещё 1,5 часа. Полученную смесь упаривали, и остаток разделяли между ДХМ (20 мл) и водным раствором. NaHCO₃ (5%, 20 мл). Органическую фазу упаривали, получая сырой интермедиат, который заново растворяли в смеси H₂O (3 мл) и 2,2-дихлоруксусной кислоты (382 мг, 2,96 ммоль, 243 мкл, 3 экв.) в ДХМ (10 мл). Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 0,5 часов. Реакцию гасили добавлением Et₃N (3,0 мл), затем смесь упаривали, получая остаток. Остаток очищали на обращенно-фазной колонке (0,1% ТЭА в MeCN и воде, 0%~70%), получая [(2R,3R,4R,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-(гидроксиметил)-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил] тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновую кислоту (400 мг, 82% выход, 95% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 471,0).

Синтез ЦДН-A из интермедиата 19

Схема A2. Синтез ЦДН-A

Стадия 1: Синтез [(2R,3R,4R,5R)-2-[[[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-(гидроксиметил)-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]окси-(2-цианоэтокси)фосфорил]оксиметил]-5-(6-бензамидопурин-9-ил)-4-[трет-бутил(диметил)силил]окси-тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты

В раствор [(2R,3R,4R,5R)-5-(6-бензамидопурин-9-ил)-4-[трет-бутил(диметил)силил] окси-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты (400 мг, 727,8 мкмоль) в CH₃CN (3 мл) добавляли раствор тетразола (0,45M в MeCN, 6,47 мл, 4 экв.). Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 5 минут. Добавляли N-[9-[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-[[бис(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-3-[2-цианоэтокси-(диизопропиламино)фосфанил]окситетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамид (595 мг, 655 мкмоль, 0,9 экв.). После 0,5 часа при 25°C, добавляли 2-гидроперокси-2-метил-пропан (197 мг, 2,18 ммоль, 209 мкл, 3 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение 0,5 часов. Затем добавляли 2,2-дихлоруксусную кислоту (938 мг, 7,28 ммоль, 598 мкл, 10 экв.) в ДХМ (10 мл). Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 25 минут и гасили насыщенным водным раствором Na₂SO₃ (2,0 мл), затем добавляли пиридин (2,0 мл) для нейтрализации. Полученную смесь упаривали, получая остаток. Остаток очищали на обращенно-фазной колонке (0,1% ТЭА в MeCN и воде, 0%~70%), получая [(2R,3R,4R,5R)-2-[[[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-(гидроксил-метил)-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]окси-(2-цианоэтокси) фосфорил]оксиметил]-5-(6-бензамидопурин-9-ил)-4-[трет-бутил(диметил)силил]окси-тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновую кислоту (600 мг, 62% выход, 80% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 1071,5).

Стадия 2: Синтез N-[9-[(27S,28R,29R,30R,31R,32R,33R,34R)-29-(2-азидоэтил)-32-[трет-бутил(диметил)силил]окси-67,68-дигидрокси-33-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]-67,68-диоксо-59,60,61,62,63,64-гексаокса-67,68-дифосфатрициклооктадекан-34-ил]пурин-6-ил]бензамида

В раствор [(2R,3R,4R,5S)-4-(2-азидоэтил)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-бензамидопурин-9-ил)-4-[трет-бутил(диметил)силил]окси-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ил]окси-(2-цианоэтокси)фосфорил]оксиметил]-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты (400 мг, 373,48 мкмоль) в пиридине (9 мл) добавляли 2-хлор-5,5-диметил-1,3,2-диоксафосфинан 2-оксид (345 мг, 1,87 ммоль, 5 экв.). После 15 минут при 25°C, добавляли I₂ (379 мг, 1,49 ммоль, 4 экв.) и H₂O (13,5 мг, 747,0 мкмоль, 13,5 мкл, 2 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение 0,5 часа. Реакцию гасили насыщенным водным раствором NaHCO₃ (2,0 мл) и насыщенным водным раствором Na₂SO₃ (2,0 мл). После упаривания остаток растворяли в CH₃CN (10 мл) и добавляли 2-метилпропан-2-амин (10 мл). Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 1 часа. Реакционную смесь упаривали, получая остаток. Остаток очищали на обращенно-фазной колонке (0,1% ТЭА в MeCN и воде, 0%~70%), получая N-[9-[(27S,28R,29R,30R,31R,32R,33R, 34R)-29-(2-азидоэтил)-32-[трет-бутил(диметил)силил]окси-67,68-дигидрокси-33-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]-67,68-диоксо-59,60,61,62,63,64-гексаокса-67,68-дифосфатрициклооктадекан-34-ил]пурин-6-ил]бензамид (350 мг, 310 мкмоль, 83% выход, 90% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 1016,4).

Стадия 3: Синтез 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-аминопурин-9-ил)-21-(2-азидоэтил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-54,55-дигидрокси-54,55-диоксо-46,47,48,49,50,51-гексаокса-54,55-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-она

N-[9-[(27S,28R,29R,30R,31R,32R,33R,34R)-29-(2-азидоэтил)-32-[трет-бутил(диметил) силил]окси-67,68-дигидрокси-33-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]-67,68-диоксо-59,60,61,62,63,64-гексаокса-67,68-дифосфатрициклооктадекан-34-ил]пурин-6-ил]бензамид (300 мг, 295 мкмоль) растворяли в MeNH₂/EtOH (5M, 2,95 мл), и смесь перемешивали при 25°C в течение 2 часов. Полученную смесь упаривали, получая остаток. Остаток очищали на обращенно-фазной колонке (0,1% ТЭА в MeCN и воде, 0%~35%), получая 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-аминопурин-9-ил)-21-(2-азидоэтил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-54,55-дигидрокси-54,55-диоксо-46,47,48,49,50,51-гексаокса-54,55дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-он (160 мг, 52% выход, 80% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 842,3).

Стадия 4: Синтез 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-21-(2-аминоэтил)-26-(6-аминопурин-9-ил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-52,53-дигидрокси-52,53-диоксо-44,45,46,47,48,49-гексаокса-52,53-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-она

В раствор 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-аминопурин-9-ил)-21-(2-азидоэтил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-54,55-дигидрокси-54,55-диоксо-46,47,48,49,50,51-гексаокса-54,55-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-она (100 мг, 118,8 мкмоль) в MeOH (8 мл) добавляли Pd/C (30 мг, 10% чистота) в один прием, и смесь перемешивали при 25°C в атмосфере водорода (10 фунт/кв.дюйм) 5 часов. Полученную смесь фильтровали, и фильтрат упаривали, получая остаток. Остаток очищали на обращенно-фазной колонке (0,1% ТЭА в MeCN и воде, 0%~30%), получая 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R, 23R,24R,25R,26R)-21-(2-аминоэтил)-26-(6-аминопурин-9-ил)-24-[трет-бутил(диметил)силил] окси-52,53-дигидрокси-52,53-диоксо-44,45,46,47,48,49-гексаокса-52,53-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-он (70 мг, 77,2 мкмоль, 65% выход, 90% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 816,5).

Стадия 5: Синтез 2-амино-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-16-(2-аминоэтил)-20-(6-аминопурин-9-ил)-17,45,46-тригидрокси-45,46-диоксо-39,40,41,42,43,44-гексаокса-45,46-дифосфатрициклооктадекан-21-ил]-1H-пурин-6-она (ЦДН-A)

В раствор 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-21-(2-аминоэтил)-26-(6-аминопурин-9-ил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-52,53-дигидрокси-52,53-диоксо-44,45,46,47,48,49-гексаокса-52,53-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-она (35 мг, 42,9 мкмоль) в MeOH (3 мл) добавляли NH₄F (127 мг, 3,43 ммоль, 80 экв.) в один прием, и смесь перемешивали при 70°C в течение 0,25 часов. После охлаждения до комнатной температуры, смесь упаривали, получая остаток. Остаток очищали на обращенно-фазной колонке (0,1% HCOOH в MeCN и воде, 0%~30%), получая 2-амино-9-[(14S,15R,16R,17R,18S, 19R,20R,21R)-16-(2-аминоэтил)-20-(6-аминопурин-9-ил)-17,45,46-тригидрокси-45,46-диоксо-39,40,41,42,43,44-гексаокса-45,46-дифосфатрициклооктадекан-21-ил]-1H-пурин-6-он (ЦДН-A, 8,6 мг, 11,9 мкмоль, 28% выход, 97% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 702,0).

1H ЯМР (D2O+буфер, 400 МГц): δ (м.д.) 8,19 (с, 1H), 8,18 (с, 1H),7,76 (с, 1H), 6,08 (с, 1H), 5,83-5,81 (м, 1H), 5,71-5,67 (м, 1H), 5,03-5,01 (м, 1H), 4,42-4,37 (м, 2H), 4,30-4,28 (м, 1H), 4,18-4,16 (м, 1H), 4,07-4,01 (м, 2H), 3,13-3,11 (м, 2H), 2,68-2,66 (м, 1H), 2,33-2,30 (м, 1H), 1,85-1,83 (м, 1H). 31P ЯМР (D2O+буфер): δ (м.д.) -1,15,-2,47.

Пример 2. Получение ЦДН-B

Ниже на схемах B1 и B2 изображен синтез ЦДН (“ЦДН-B”) по настоящему изобретению. Синтез и характеризация этого ЦДН и используемых синтетических интермедиатов описаны ниже.

Синтез интермедиата 29 из интермедиата 14

Схема B1: Синтез интермедиата 29

Стадия 1: Синтез [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-хлорэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата

В раствор [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-гидроксиэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (19 г, 36,0 ммоль) в ДМФА (100 мл) добавляли PPh₃ (23,6 г, 90,0 ммоль, 2,5 экв.) и CCl₄ (17,3 мл, 180,1 ммоль, 5 экв.). После перемешивания в течение 16 часов при 25°C, реакцию гасили добавлением насыщенного водного раствора NaHCO₃ (150 мл) и экстрагировали этилацетатом (80 мл × 2). Объединенные органические слои упаривали и очищали методом колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат = от 10:1 до 1:1), получая [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-хлорэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоат (13 г, 23,8 ммоль, 66% выход) в виде светло-желтого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 546,2).

Стадия 2: Синтез [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-ацетилсульфанилэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата

В раствор [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-хлорэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (15 г, 27,5 ммоль) в ДМФА (100 мл) добавляли AcSK (7,84 г, 68,7 ммоль, 2,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 16 часов. После охлаждения, реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (200 мл) и промывали водным раствором NaHCO₃ (насыщ., 200 мл). Органический слой упаривали, получая [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-ацетилсульфанилэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоат (16 г) в виде светло-желтого масла, которое использовали в следующей стадии без очистки. (МС: [M+1]+ 586,3).

Стадия 3: Синтез N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил)-4-(2-сульфанилэтил)тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида

В раствор [(2S,3R,4R,5R)-4-ацетокси-3-(2-ацетилсульфанилэтил)-5-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-2-ил]метил бензоата (16 г, 27,3 ммоль) в EtOH (160 мл) добавляли NaOH (2 M, 68,3 мл, 5 экв.) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 0,5 часа. Значение рН доводили до 7 добавлением HOAc. Полученную смесь упаривали в вакууме, удаляя большую часть растворителя. Выпавший коричневый осадок отделяли и добавляли к нему ДХМ/МТБЭ (1/100, об./об., 200 мл). После фильтрования фильтрат упаривали, получая N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил)-4-(2-сульфанилэтил)тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамид (11 г, неочищенный, ~10% дисульфида) в виде коричневого твердого вещества, которое использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. (МС: [M+1]+ 398,1).

Стадия 4: Синтез N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-гидрокси-5-[[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-4-[2-[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида

В раствор N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил)-4-(2-сульфанилэтил) тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида (11 г, 27,7 ммоль) в пиридине (110 мл) добавляли DMTCl (28,1 г, 83,0 ммоль, 3 экв.). После 16 часов при 25°C, реакцию гасили водным раствором NaHCO₃ (насыщ., 200 мл) и экстрагировали этилацетатом (200 мл x 2). Органическую фазу сушили над Na₂SO₄, фильтровали и очищали методом хроматографии на силикагеле, используя как элюент смесь ПЭ:EE (ЭА:EtOH = 3:1) = от 10:1 до ~ 2:1, получая N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-гидрокси-5-[[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-4-[2-[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метил] сульфанилэтил]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамид (14 г, 47,0% выход, 93% чистота) в виде светло-желтого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 1002,5).

Стадия 5: Синтез [(2R,3R,4R,5S)-5-(гидроксиметил)-4-[2-[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты

В раствор N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-гидрокси-5-[[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-4-[2-[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метил] сульфанилэтил]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2-ил]-2-метил-пропанамида (12 г, 8,4 ммоль) в пиридине (120 мл) добавляли феноксифосфоноилоксибензол (7,51 мл, 29,3 ммоль, 3,5 экв.) при 25°C. Через 1 час добавляли Et₃N/H₂O (100 мл, 1:1). Через 0,5 часа смесь экстрагировали этилацетатом (200 мл x 2). Органическую фазу упаривали и затем растворяли в водной AcOH (80%, 120 мл). Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 1 часа. Реакционную смесь нейтрализовывали добавлением насыщенного водного раствора Na₂CO₃ при 0°C до pH~7. Полученную смесь напрямую очищали на обращенно-фазной колонке (CH₃CN/H₂O, 0~60%) и получали [(2R,3R,4R,5S)-5-(гидроксиметил)-4-[2-[(3-метоксифенил)-(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновую кислоту (4,2 г, 5,5 ммоль, 65% выход) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 764,4).

Синтез ЦДН-B из интермедиата 29

Схема B2. Синтез ЦДН-B

Стадия 1: Синтез [(2R,3R,4R,5S)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-бензамидопурин-9-ил)-4-[трет-бутил(диметил)силил]окси-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ил]окси-(2-цианоэтокси)фосфорил]оксиметил]-4-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил] сульфанилэтил]-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты

В раствор [(2R,5S)-4-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-5-(гидроксиметил)-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты (0,75 г, 0,98 ммоль) в 1H-тетразоле (0,45 M в MeCN, 22,50 мл, 10 экв.) добавляли N-[9-[(2R,3R,4R,5R)-5-[[бис(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-3-[трет-бутил(диметил)силил]окси-4-[2-цианоэтокси-(диизопропиламино)фосфанил]окси-тетрагидрофуран-2-ил]пурин-6-ил]бензамид (1,1 г, 1,1 ммоль, 1,1 экв.). Через 1 час добавляли TBHP (0,43 мл, 65% в декане, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 0,5 часа. Реакцию гасили добавлением водного раствора бисульфита натрия (33%, 4 мл) при 0°C и экстрагировали этилацетатом (100 мл x 2). Органическую фазу упаривали и растворяли в водной AcOH (80%, 20 мл). Через 1 час реакционную смесь нейтрализовывали водным раствором Na₂CO₃ (насыщ.) при 0°C. Полученную смесь очищали на обращенно-фазной колонке (CH₃CN/H₂O, нейтральные условия, 0~60%), получая [(2R,3R,4R,5S)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-бензамидопурин-9-ил)-4-[трет-бутил(диметил)силил]окси-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ил]окси-(2-цианоэтокси)фосфорил]оксиметил]-4-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновую кислоту (0,79 г, 48% выход, 80% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 1364,0).

Стадия 2: Синтез N-[9-[(47S,48R,49R,50R,51R,52R,53R,54R)-49-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-52-[трет-бутил(диметил)силил]окси-87,88-дигидрокси-53-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]-87,88-диоксо-77,78,79,80,81,82-гексаокса-87,88-дифосфатрициклооктадекан-54-ил]пурин-6-ил]бензамида

В раствор [(2R,3R,4R,5S)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-бензамидопурин-9-ил)-4-[трет-бутил (диметил)силил]окси-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ил]окси-(2-цианоэтокси) фосфорил]оксиметил]-4-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-2-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты (0,79 г, 0,58 ммоль) в пиридине (16 мл) добавляли 2-хлор-5,5-диметил-1,3,2-диоксафосфинан 2-оксид (0,7 г, 3,8 ммоль, 6,5 экв.). Через 0,5 часа добавляли CCl₄ (3,2 г, 20,6 ммоль, 1,98 мл, 35,5 экв.), H₂O (0,16 мл, 8,79 ммоль) и NMM (0,79 мл). Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 0,5 часа, затем выливали ее в водный раствор NaHSO₃ (насыщ., 10 мл). Через 5 минут медленно добавляли водный раствор NaHCO₃ (насыщ., 20 мл). Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (30 мл x 2). Органическую фазу упаривали и растворяли в CH₃CN (8 мл) и tBuNH₂ (8 мл). Через 0,5 часа смесь упаривали и очищали на обращенно-фазной колонке (CH₃CN/H₂O, нейтральные условия, 0~40%), получая N-[9-[(47S,48R,49R,50R,51R,52R,53R,54R)-49-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил] сульфанилэтил]-52-[трет-бутил(диметил)силил]окси-87,88-дигидрокси-53-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]-87,88-диоксо-77,78,79,80,81,82-гексаокса-87,88-дифосфатрициклооктадекан-54-ил]пурин-6-ил]бензамид (0,5 г, 60% выход, 90,8% чистота) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 1309,8).

Стадия 3: Синтез 2-амино-9-[(39S,40R,41R,42R,43R,44R,45R,46R)-46-(6-аминопурин-9-ил)-41-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-44-[трет-бутил(диметил)силил]окси-74,75-дигидрокси-74,75-диоксо-64,65,66,67,68,69-гексаокса-74,75-дифосфатрициклооктадекан-45-ил]-1H-пурин-6-она

Смесь N-[9-[(47S,48R,49R,50R,51R,52R,53R,54R)-49-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-52-[трет-бутил(диметил)силил]окси-87,88-дигидрокси-53-[2-(2-метилпропаноиламино)-6-оксо-1H-пурин-9-ил]-87,88-диоксо-77,78,79,80,81,82-гексаокса-87,88-дифосфатрициклооктадекан-54-ил]пурин-6-ил]бензамида (500 мг, 0,38 ммоль) и спиртового раствора метиламина (10 мл, 30%) перемешивали при 25°C в течение 4 часов. Реакционную смесь упаривали в вакууме. Остаток очищали на обращенно-фазной колонке (CH₃CN/H₂O, нейтральные условия, 0~30%), получая 2-амино-9-[(39S,40R,41R,42R,43R,44R, 45R,46R)-46-(6-аминопурин-9-ил)-41-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-44-[трет-бутил(диметил)силил]окси-74,75-дигидрокси-74,75-диоксо-64,65,66,67,68,69-гексаокса-74,75-дифосфатрициклооктадекан-45-ил]-1H-пурин-6-он (220 мг, 48% выход, 95% чистота) в виде белого твердого вещества.

Стадия 4: Синтез 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-аминопурин-9-ил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-51,52-дигидрокси-51,52-диоксо-21-(2-сульфанилэтил)-43,44,45,46,47,48-гексаокса-51,52-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-она

В раствор 2-амино-9-[(39S,40R,41R,42R,43R,44R,45R,46R)-46-(6-аминопурин-9-ил)-41-[2-[бис(4-метоксифенил)-фенил-метил]сульфанилэтил]-44-[трет-бутил(диметил)силил] окси-74,75-дигидрокси-74,75-диоксо-64,65,66,67,68,69-гексаокса-74,75-дифосфатрициклооктадекан-45-ил]-1H-пурин-6-она (190 мг, 0,17 ммоль) в ДХМ (4 мл) добавляли 2,2-дихлоруксусную кислоту (0,8 мл, 9,74 ммоль, 58 экв.). Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 1 часа и нейтрализовывали смесью вода/ Et₃N (1:1, об./об., 3 мл) при 0°C. Полученную смесь упаривали и очищали на обращенно-фазной колонке (CH₃CN/H₂O, содержит 0,05% ТЭА, от 0% до 40%), получая 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R, 23R,24R,25R,26R)-26-(6-аминопурин-9-ил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-51,52-дигидрокси-51,52-диоксо-21-(2-сульфанилэтил)-43,44,45,46,47,48-гексаокса-51,52-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-он (36 мг, 25% выход, 98% чистота, соль с ТЭА) в виде белого твердого вещества. (МС: [M+1]+ 833,3).

Стадия 5: Синтез 2-амино-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-20-(6-аминопурин-9-ил)-17,44,45-тригидрокси-44,45-диоксо-16-(2-сульфанилэтил)-38,39,40,41, 42,43-гексаокса-44,45-дифосфатрициклооктадекан-21-ил]-1H-пурин-6-она (ЦДН-B)

В раствор 2-амино-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-аминопурин-9-ил)-24-[трет-бутил(диметил)силил]окси-51,52-дигидрокси-51,52-диоксо-21-(2-сульфанилэтил)-43,44,45,46,47,48-гексаокса-51,52-дифосфатрициклооктадекан-25-ил]-1H-пурин-6-она (36 мг, 0,043 ммоль) в MeOH (4 мл) добавляли NH₄F (0,16 г, 4,32 ммоль, 100 экв.). Полученную смесь перемешивали при 70°C в течение 1 часа, упаривали и очищали на обращенно-фазной колонке (CH₃CN/H₂O, содержит 0,05% муравьиной кислоты, от 0% до 30%), получая 2-амино-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-20-(6-аминопурин-9-ил)-17,44,45-тригидрокси-44,45-диоксо-16-(2-сульфанилэтил)-38,39,40,41,42,43-гексаокса-44,45-дифосфатрициклооктадекан-21-ил]-1H-пурин-6-он (ЦДН-B, 7 мг, 22,5% выход, 99,8% чистота) в виде белого твердого вещества.

1H ЯМР (400 МГц, D2O) δ = 8,25 (с, 1H), 8,19 (с, 1H), 7,77 (с, 1H), 6,10 (с, 1H), 5,80 (д, J = 8,3 Гц, 1H), 5,67 (кв, J = 8,2 Гц, 1H), 5,05 - 4,98 (м, 1H), 4,43 (д, J = 9,0 Гц, 1H), 4,36 (д, J = 12,1 Гц, 1H), 4,31 (ушир.с, 1H), 4,18 (д, J = 11,7 Гц, 1H), 4,08 - 3,97 (м, 2H), 3,11 (кв, J = 7,2 Гц, 1H), 2,79 - 2,66 (м, 2H), 2,62 - 2,51 (м, 1H), 2,28 - 2,13 (м, 1H), 1,84 - 1,73 (м, 1H), 1,19 (т, J = 7,3 Гц, 1H). 31P ЯМР: -0,951, -2,201. МС: [M+1]+ 718,9.

Пример 3. Получение мишень-связывающихся антител

Анти-PD-L1 антитела

Ab-A1 (mu-anti-PDL1): Экспрессирующие векторы, кодирующие мышиное античеловеческое PDL1 антитело AbA1 (mu-anti-PDL1), имеющее тяжелую цепь SEQ ID NO:3 и легкую цепь SEQ ID NO:5, получали клонированием кДНК, кодирующих последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO:1 и последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO:2 в отдельные pFUSEssCHIgmG2a (константная область тяжелой цепи мышиного IgG2a) и pFUSE2ss-CLIg-mk (константная область мышиной легкой цепи каппа) экспрессирующие векторы, соответственно. VH и VL последовательности в Ab-A1 имеют в своей основе атезолизумаб.

Ab-A2 (mu-anti-PDL1-cys): Экспрессирующие векторы, кодирующие мышиное античеловеческое PDL1 антитело AbA2 (mu-anti-PDL1-cys), имеющее тяжелую цепь SEQ ID NO:4 и легкую цепь SEQ ID NO:5, получали по методике, аналогичной получению Ab-A1. VH и VL последовательности в Ab-A2 имеют в своей основе атезолизумаб. Константная область тяжелой цепи Ab-A2 имеет две мутации относительно мышиного IgG2a дикого типа, где первая представляет собой замену лейцина на фенилаланин в положении 234 в CH2 домене (т.е. L234F, нумерация согласно последовательности мышиного IgG2a дикого типа, соответствующей последовательности человеческого IgG1, по Eu нумерации), и вторая представляет собой замену серина на цистеин в положении 239 в CH2 домене, чтобы создать дополнительный остаток цистеина для конъюгирования (т.е. S239C, по той же системе нумерации).

Последовательности тяжелых цепей античеловеческого PD-L1 антитела Ab-A1 и AbA2 показаны ниже как SEQ ID NO:3 и 4, соответственно. Вариабельная область тяжелой цепи подчеркнута в каждой последовательности, она одинакова для обоих и соответствует SEQ ID NO:1. Мутации L234F и S239C CH2 домена в SEQ ID NO:4 для Ab-A2 выделены жирным шрифтом и скобками {}.

Тяжелая цепь в Ab-A1 (SEQ ID NO:3)

SKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

Тяжелая цепь в Ab-A2 (SEQ ID NO:4)

Последовательность легких цепей в анти-человеческом PD-L1 антителе Ab-A1 и Ab-A2 показана ниже как SEQ ID NO:5. Вариабельная область легкой цепи подчеркнута в последовательности и соответствует SEQ ID NO:2.

Легкая цепь в Ab-A1 и Ab-A2 (SEQ ID NO:5)

Ab-A3 (rt-anti-PDL1): Крысиное антимышиное PD-L1 антитело Ab-A3, содержащее константную область тяжелой цепи крысиного IgG2b, приобретали у коммерческого поставщика BioXcell (BE0101).

Анти-EGFR антитела

Ab-B1 (mu-anti-EGFR): Мышиное античеловеческое EGFR антитело Ab-B1, содержащее константную область тяжелой цепи мышиного IgG2a, приобретали у коммерческого поставщика BioXcell (BE0279).

Ab-B2 (mu-anti-EGFR-cys): Экспрессирующие векторы, кодирующие мышиное античеловеческое EGFR антитело AbB2, имеющее тяжелую цепь SEQ ID NO:8 и легкую цепь SEQ ID NO:9, получали клонированием кДНК, кодирующих последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:6 и последовательность вариабельной области легкой (VL) цепи SEQ ID NO:7 в отдельные pFUSEssCHIgmG2a (константная область тяжелой цепи мышиного IgG2a) и pFUSE2ss-CLIg-mk (константная область мышиной легкой цепи каппа) экспрессирующие векторы, соответственно. VH и VL последовательности Ab-B2 имеют в своей основе цетуксимаб. CH2 домен тяжелой цепи Ab-B2 содержит мутации L234F и S239C относительно мышиного IgG2a дикого типа, как описано выше для Ab-A2.

Последовательность тяжелой цепи античеловеческого EGFR антитела Ab-B2 показана ниже как SEQ ID NO:8. Вариабельная область тяжелой цепи подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:6. Мутации L234F и S239C в CH2 домене выделены жирным шрифтом и скобками {}.

Тяжелая цепь в Ab-B2 (SEQ ID NO:8)

Последовательность легкой цепи в Ab-B2 показана ниже как SEQ ID NO:9. Вариабельная область подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:7.

Легкая цепь в Ab-B2 (SEQ ID NO:9)

Ab-B3 (hu-anti-EGFR): Экспрессирующие векторы, кодирующие мышино-человеческое химерное античеловеческое EGFR антитело AbB3, имеющее тяжелую цепь SEQ ID NO:12 и легкую цепь SEQ ID NO:13, получали клонированием кДНК, кодирующих последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:10 плюс константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, и последовательность вариабельной области легкой (VL) цепи SEQ ID NO:11 плюс константную область легкой цепи человеческого Ig-каппа, в отдельные pcDNA3.4 экспрессирующие векторы. Последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи в Ab-B2 имеют в своей основе цетуксимаб.

Последовательность тяжелой цепи античеловеческого EGFR антитела Ab-B3 показана ниже как SEQ ID NO:12. Вариабельная область тяжелой цепи подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:10.

Тяжелая цепь в Ab-B3 (SEQ ID NO:12)

Последовательность легкой цепи в Ab-B3 показана ниже как SEQ ID NO:13. Вариабельная область подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:11.

Легкая цепь в Ab-B3 (SEQ ID NO:13)

Ab-B4 (hu-anti-EGFR-A/C,V/C): Экспрессирующий вектор, кодирующий человеческое античеловеческое EGFR антитело AbB4, имеющее тяжелую цепь SEQ ID NO:16 и легкую цепь SEQ ID NO:17, получали клонированием кДНК, кодирующих последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:14 плюс константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, и последовательность вариабельной области легкой (VL) цепи SEQ ID NO:15 плюс константную область легкой цепи модифицированного человеческого Ig-каппа в отдельные pcDNA3.4 экспрессирующие векторы. Последовательности VH и VL в Ab-B4 имеют в своей основе цетуксимаб, при этом VH имеет мутацию замены аланина на цистеин в положении 109, соседнем с CH1 доменом (т.е. A109C). Легкая цепь в Ab-B4 имеет мутацию замены валина на цистеин в положении 205 (т.е. V205C).

Последовательность тяжелой цепи античеловеческого EGFR антитела Ab-B4 показана ниже как SEQ ID NO:16. Вариабельная область тяжелой цепи подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:14. Мутация A109C выделена жирным шрифтом и скобками {}.

Тяжелая цепь в Ab-B4 (SEQ ID NO:16)

Последовательность легкой цепи в Ab-B4 показана ниже как SEQ ID NO:17. Вариабельная область подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:15. Мутация V205C выделена жирным шрифтом и скобками {}.

Легкая цепь в Ab-B4 (SEQ ID NO:17)

Анти-HER2 антитела

Ab-C1 (анти-HER2): Гуманизированное античеловеческое HER2 антитело Ab-C1 покупали у коммерческого поставщика как трастузумаб (Herceptin®).

Последовательность тяжелой цепи античеловеческого HER2 антитела Ab-C1 показана ниже как SEQ ID NO:20. Вариабельная область тяжелой цепи подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:18.

Тяжелая цепь в Ab-C1 (SEQ ID NO:20)

Последовательность легкой цепи в Ab-C1 показана ниже как SEQ ID NO:21. Вариабельная область подчеркнута и соответствует SEQ ID NO:19.

Легкая цепь в Ab-C1 (SEQ ID NO:21)

Анти-CD47 антитела

Ab-D1 (rt-anti-CD47): Крысиное антимышиное CD47 антитело Ab-D1, имеющее константную область тяжелой цепи крысиного IgG2b, покупали у коммерческого поставщика BioXcell (BE0270).

Экспрессирование и очистка

Плазмиды, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь мишень-связывающихся антител, трансфецировали в CHO клетки для экспрессирования антител с помощью ExpiFectamine™ CHO Transfection Kit (ThermoFisher Scientific, Cat No: A29129) по методике производителя. Общее количество плазмид для трансфецирования составляло 0,5 мкг/мл CHO клеток, а соотношение плазмид для тяжелой цепи и легкой цепи составляло 2:3. Через шесть дней после трансфецирования CHO клетки отделяли центрифугированием, отфильтровывали от среды, затем наносили на бусины с белком A (HiTrap Protein A HP, GE, Cat No: 17-0403-01) и элюировали 0,1 M раствором глицина (pH 3.0). Элюированные фракции антител объединяли и упаривали до 1 мл, затем заменяли буфер на PBS разделением по размеру (ENrich Sec650, Bio-Rad, Cat No: 780-1650) перед помещением на хранение при -80°C.

Пример 4. Получение ЦДН-A ADC

Синтез ЦДН-A-линкер

ЦДН-A (27 мг, 0,0385 ммоль) упаривали совместно с пиридином (3 x 3 мл) и сушили в вакууме перед использованием. Добавляли 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил (4-нитрофенил) карбонат (54 мг, 0,0732 ммоль, 2,0 экв.), HOBt (5,2 мг, 0,0385 ммоль, 1,0 экв.) и ДМФА (2,5 мл). При перемешивании добавляли DIPEA (67 мкл, 0,385 ммоль, 10 экв.). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере N₂ в течение 42 часов. Реакционную смесь разбавляли смесью растворителей: этилацетат (25 мл), трет-бутилметиловый эфир (75 мл) и уксусная кислота (30 мкл, 0,521 ммоль). Твердый осадок отделяли центрифугированием и промывали трет-бутилметиловым эфиром (3 × 75 мл), получая 44 мг сырого продукта. 20 мг полученного сырого продукта дополнительно очищали на обращенно-фазной колонке (CH₃CN/H₂O, 0.1% муравьиной кислоты, от 0% до 30%), получая целевой продукт (7 мг, 31% выход, 97% чистота). (МС: [M-1]- 1298,2).

Конъюгирование антител с ЦДН-A

Восстановление дисульфидов в антителе: Мишень-связывающиеся антитела сначала восстанавливают трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин гидрохлоридом (TCEP) (2,3 мольных эквивалентов TCEP) при комнатной температуре в течение 1,5 часов, и 40 мольными эквивалентами TCEP при 37°C в течение 2 часов. Избыток TCEP удаляли с помощью обессоливающей колонки (HiTrap Desalting column, GE, Cat. No: 29048684).

Повторное окисление шарнирных цистеинов: Шарнирные цистеины в восстановленном антителе были заново окислены 200 мольными эквивалентами дегидроаскорбиновой кислоты (DHA, 0,5 M в ДМСО) при 37°C в течение 4 часов. Повторное окисление было проведено с помощью SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях. Избыток DHA удаляли с помощью центрифужного фильтра с номинальным отсечением по молекулярному весу 30 кДа (Amicon Ultra-15, Merck Millipore, Cat No: UFC903024).

Конъюгирование с ЦДН-A: (Тип I для восстановленного антитела) Реакционную смесь с восстановленным антителом охлаждали при 4°С в течение 20 минут. Добавляли ЦДН-A-Линкер (4,8 мольных эквивалента относительно антитела) в гистидиновом буфере (20 мМ, pH 7,4) и инкубировали при 4°С в течение 80 минут. (Тип II для вновь окисленного антитела) Вновь окисленное антитело смешивали с 10 мольными эквивалентами ЦДН-A-линкер и инкубировали при комнатной температуре 4 часа. После конъюгирования реакцию гасили N-ацетилцистеином, и избыток ЦДН-A-линкер и N-ацетилцистеина удаляли на 5-миллилитровой обессоливающей колонке (GE) под контролем FPLC системы в фосфатно-солевом буфере (PBS). Полученные ADC упаривали и хранили при 4°C.

Измерение DAR

Для определения DAR в ADC, содержащих ЦДН-A в качестве ЦДН, определяли соотношение OD260/OD280 на УФ-спектрометре и сравнивали со стандартной кривой, построенной по смесям ЦДН-A и антитела с известными пропорциями. Как показано ниже в таблице, значение DAR в примерах ADC находилось в диапазоне от 1 до 6,3. Значение DAR в ADC с использованием Ab-A2 антитела (mu-anti-PDL1-cys), содержащего дополнительный цистеин после замены, было выше, чем при использовании Ab-A1 антитела дикого типа (mu-anti-PDL1).

Таблица 1: Примеры ЦДН-A ADC

ADC Ab Примечание по Ab ЦДН DAR ADC-IV Ab-B1 mu-anti-EGFR (BioXcell BE0279) ЦДН-A 1 ADC-V Ab-A3 rt-anti-PDL1 (BioXcell BE0101) ЦДН-A 1 ADC-VI Ab-A2 mu-anti-PDL1-cys ЦДН-A 2~4 ADC-VII Ab-B2 mu-anti-EGFR-cys ЦДН-A 2 ADC-VIII Ab-B3 hu-anti-EGFR ЦДН-A 6,3 ADC-IX Ab-B4 hu-anti-EGFR-A/C,V/C ЦДН-A 3 ADC-X Ab-C1 hu-anti-HER2 (трастузумаб) ЦДН-A 4,8 ADC-XI Ab-D1 rt-anti-CD47 (BioXCell BE0270) ЦДН-A 2,5

Пример 5. Получение ЦДН-B ADC

Синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил 4-(пиридин-2-илдисульфанеил) пентаноата (линкер I)

В раствор 4-(пиридин-2-илдисульфанеил)пентановой кислоты (24 мг, 0,1 ммоль) и NHS (14 мг, 0,12 ммоль) в ДМА добавляли EDC (HCl-соль, 61 мг, 0,32 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После фильтрования фильтрат упаривали и очищали на колонке (MeOH/ДХМ = от 0% до 10%), получая 2,5-диоксопирролидин-1-ил 4-(пиридин-2-илдисульфанеил)пентаноат в виде белого твердого вещества (8 мг, 23,5%). (МС: [M+1]+ 341,1).

Конъюгирование антител с ЦДН-B

0,2 мл 3 мМ раствора 2-амино-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-20-(6-аминопурин-9-ил)-17,44,45-тригидрокси-44,45-диоксо-16-(2-сульфанилэтил)-38,39,40,41,42,43-гексаокса-44,45дифосфатрициклооктадекан-21-ил]-1H-пурин-6-она в фосфатном буфере pH 6,0 смешивали с 0,2 мл 2 мМ 2,5-диоксопирролидин-1-ил 4-(пиридин-2-илдисульфанеил)пентаноата в ДМА. После инкубирования при комнатной температуре в течение ночи, добавляли 3,6 мг мишень-связывающегося антитела в 2 мл PBS и инкубировали при комнатной температуре еще 2 часа. Полученную смесь упаривали, и полученный конъюгат очищали на 5-миллилитровой обессоливающей колонке под контролем FPLC системы, уравновешенной фосфатно-солевым буфером (PBS). Полученные ADC упаривали и хранили при 4°C.

Измерение DAR

Для высвобождения ЦДН-B из ADC, добавляли DTT к ADC до финальной концентрации 10 мМ, инкубировали при 95°C в течение 5 минут и пропускали через фильтр с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Фильтрат разбавляли и добавляли к THP1-Lucia ISG клеткам, проницаемость мембраны которых была искусственно увеличена добавлением 0,5 нМ перфринголизина (PFO). Через 16 часов измеряли активность люциферазы, вычисляли концентрацию активных соединений, высвобожденных из ADC, и вычисляли значения DAR сравнением со стандартными кривыми. Как показано ниже в таблице, значение DAR для примеров ADC находилось в диапазоне от 0,33 до 1,66.

Таблица 2: Примеры ЦДН-B ADC

ADC Ab Примечание по Ab ЦДН DAR ADC-I Ab-A1 mu-anti-PDL1 ЦДН-B 1,66 ADC-II Ab-A3 rt-anti-PDL1 (BioXcell BE0101) ЦДН-B 0,36 ADC-III Ab-B1 mu-anti-EGFR (BioXcell BE0279) ЦДН-B 0,33

Пример 6. Клеточная активность ADC с ЦДН-A и ЦДН-B

Интерферон-стимулирующая активность

Две линии репортерных клеток, мышиные макрофаги RAWLucia ISG и человеческие моноциты THP1-Lucia ISG, использовали для оценки активности ADC. Обе линии клеток содержат интерферон-стимулируемые реагирующие элементы (ISRE), связанные с ISG54 минимальным промотером. ADC в разных концентрациях (0,3, 1,0 и/или 3 мкМ) добавляли к репортерным клеткам и инкубировали 16 часов. Активность люциферазы, соответствующую индуцированной экспрессии интерферона, сравнивали с серийными разведениями стандартного соединения (cGAMP).

ADC-I - ADC-XI показали эффективную интерферон-стимулирующую активность разной силы, как показано в таблице 3. Приведенное значение “cGAMP эквивалент” означает концентрацию cGAMP (мкМ), необходимую для достижения того же уровня ответа, который обеспечивается действием 1 мкМ ADC.

Таблица 3: Сила интерферон-стимулирующей активности в репортерных клетках

ADC мышиные RAW-Lucia ISG
(cGAMP эквивалент) человеческие THP1-Lucia ISG
(cGAMP эквивалент) ADC-I 89 28 ADC-II 3,4 4,2 ADC-III ~7 0,58 ADC-IV ~10 слабо ADC-V ~10 слабо ADC-VI >100 слабо ADC-VII 3,1 не определено ADC-VIII 33 не определено ADC-IX 31 не определено ADC-X 10 не определено ADC-XI 3 не определено

Все ADC показали высокую интерферон-стимулирующую активность в тесте на мышиных RAWLucia ISG репортерных клетках (Таблица 3). ADC-I и ADC-VI имели самую высокую эффективность (Фиг. 1B и 6B, соответственно), затем следовали ADC-VIII, ADC-IX (Фиг. 8B и 9B, соответственно), затем ADC-IV, ADC-V и ADC-X (Фиг. 4B, 5B и 10, соответственно), и затем ADC-III (Фиг. 3B), ADC-II (Фиг. IIB) и ADC-XI. Как показано на Фиг. 3B, 4B, 5B и 6B, добавление ADC по настоящему изобретению продемонстрировало синергизм интерферон-стимулирующей активности в сравнении с добавлением только антитела или только ЦДН, или с суммарным значением для антитела и агониста.

Конъюгаты ЦДН-A с антителом также продемонстрировали интерферон-стимулирующую активность в тесте на человеческих моноцитах THP1-Lucia ISG в качестве репортерных клеток (Таблица 3). Из числа протестированных наибольшую эффективность показал ADC-I (Фиг. 1C), за ним следовали ADC-II (Фиг. 1C) и ADC-III.

Активность ADC-VIII и ADC-IX дополнительно тестировали на линии клеток THP1-lucia ISG, устойчиво экспрессирующих человеческий EGFR. Оба ADC показали высокую интерферон-стимулирующую активность на этих клетках (Таблица 4). Приведенное значение “cGAMP эквивалент” означает концентрацию cGAMP (нМ), необходимую для достижения того же уровня ответа, который обеспечивается действием 1 нМ ADC. EC₅₀ - это концентрация полумаксимального эффекта.

Таблица 4: Активность ADC-VIII и ADC-IX на THP1-EGFR-lucia ISG клетках

ADC cGAMP эквивалент EC50 ADC-VIII 977 11,7 нМ ADC-IX 912 8,2 нМ

Пример 7. Противоопухолевая эффективность ADC с ЦДН-A и ЦДН-B

Противоопухолевую эффективность некоторых ADC тестировали на мышиных сингенных опухолевых моделях B16F10 метастатической меланомы, человеческого EGFR-трансфецированного B16F10 (B16F10-EGFR), и человеческой HER2-трансфецированной карциномы легкого Льюиса (LLC1-HER2). Вкратце, 10⁶ опухолевых клеток, находящихся в фазе логарифмического роста, в 100 мкл PBS инъецировали подкожно C57BL6 мышам в правую боковую поверхность. Спустя 4-6 дней, когда объем опухоли составлял 50-100 мм³, мышей заново распределяли в группы по размеру их опухолей и вводили интраперитонеально 50 - 200 мкг ADC или неконъюгированное антитело, неконъюгированный ЦДН, или PBS плацебо в качестве контроля (подробности см. в подписях к Фигурам).

Отслеживали объем опухолей и выживание мышей. ADC-IV, ADC-VI, ADC-VII, ADC-VIII и ADC-IX показали высокую противоопухолевую эффективность и по уменьшению объема, и по выживаемости, и они оба являются потенциальными кандидатами для применения в лечении опухолей у людей. Было показано, что ADCX замедляет развитие опухоли. ADC-I также показал замедление развития опухоли, но наблюдалась токсичность.

Объем опухоли

У мышей с опухолью B16F10 введение ADCI (анти-PDL1-ЦДН-B) замедляло развитие опухоли в сравнении с плацебо, анти-PDL1 антителом в отдельности, ЦДН-B в отдельности, и комбинацией анти-PDL1 антитела и неконъюгированного ЦДН-B (Фиг. 1C).

У мышей с опухолью B16F10-EGFR введение ADCIV (анти-EGFR-ЦДН-A) замедляло развитие опухоли и уменьшало объем опухоли в сравнении с плацебо или введением анти-PDL1 антитела (Фиг. 4C и 4E). Введение для сравнения анти-EGFR антитела плюс неконъюгированный ЦДН не остановило рост опухоли (Фиг. 4C), что говорит об улучшении эффективности при использовании ADC для таргетированной доставки ЦДН. Когда ADCIV комбинировали с анти-PDL1 антителом, наблюдалось полное подавление роста опухоли (Фиг. 4E), что говорит об улучшении эффективности при комбинировании ЦДН ADC с ингибиторами иммунных контрольных точек.

У мышей с опухолью B16F10-EGFR введение ADC-VI (анти-PDL1-ЦДН-A) интраперитонеально в дозировке 200 мкг (Фиг. 6C) или внутрь опухоли в дозировке 10 мкг или 50 мкг (Фиг. 6D) предотвращало рост опухоли. В течение двух недель после введения ADCVI, B16F10-EGFR опухоли показали полную ремиссию, в то время как введение анти-PDL1 антитела в отдельности или плацебо не остановило рост опухоли.

У мышей с опухолью B16F10-EGFR введение ADC-VII (анти-EGFR-ЦДН-A) привело к значительному снижению роста опухоли в сравнении с введением плацебо или введением анти-PDL1 антитела (Фиг. 7C и 7E). Введение для сравнения анти-EGFR антитела плюс неконъюгированный ЦДН не остановило рост опухоли (Фиг. 7C), что говорит об улучшении эффективности при использовании ADC для таргетированной доставки ЦДН. Усиление подавления опухоли наблюдалось, когда ADC-VII комбинировали с анти-PDL1 антителом, в то время как введение анти-PDL1 антитела в отдельности или плацебо не остановило рост опухоли (Фиг. 7E), что говорит об улучшении эффективности при комбинировании ЦДН ADC с ингибиторами иммунных контрольных точек.

У мышей с опухолью B16F10-EGFR введение ADCVIII (анти-EGFR-ЦДН-A) привело к значительному снижению роста опухоли (Фиг. 8C). Этот эффект усиливался, когда ADC-VIII комбинировали с анти-PDL1 антителом, в то время как введение анти-PDL1 антитела в отдельности или плацебо не остановило рост опухоли, что говорит об улучшении эффективности при комбинировании ЦДН ADC с ингибиторами иммунных контрольных точек.

У мышей с опухолью B16F10-EGFR введение ADC-IX (анти-EGFR-ЦДН-A) привело к снижению роста опухоли, и схожий эффект наблюдался, когда ADC-IX комбинировали с анти-PDL1 антителом (Фиг. 9C). Введение анти-PDL1 антитела в отдельности или плацебо не остановило рост опухоли.

У мышей с опухолью LLC1-HER2 введение ADC-X (анти-HER2-ЦДН-A) уменьшало рост опухоли в двух раздельных тестах на мышах (Фиг. 10C и 10E), в то время как введение анти-PDL1 антитела в отдельности или плацебо не остановило рост опухоли. Введение для сравнения анти-HER2 антитела плюс неконъюгированный ЦДН не остановило рост опухоли, что говорит об улучшении эффективности при использовании ADC для таргетированной доставки ЦДН. На Фиг. 10E дополнительно показано, что внутриопухолевое введение ADC-X в дозировке 30 мкг привело к полной ремиссии опухоли.

Выживаемость

Отслеживали выживаемость мышей с B16F10-EGFR или LLC1-HER2 опухолями. Введение ADCIV (анти-EGFR-ЦДН-A) увеличивало время выживания у мышей с опухолью B16F10-EGFR (3/5 в День 37, Фиг. 4D; 0/5 в День 39, Фиг. 4F) по сравнению с введением анти-PDL1 антитела в отдельности (0/5 в День 26, Фиг. 4D; 0/5 в День 29, Фиг. 4F) и введением плацебо (0/5 в День 23, Фиг. 4D; 0/5 в День 20, Фиг. 4F). Выживаемость после введения ADC-IV превзошла выживаемость при сравнительном введении анти-EGFR антитела плюс неконъюгированный ЦДН (0/5 в День 34, Фиг. 4D), что говорит об улучшении эффективности при использовании ADC для таргетированной доставки ЦДН. Комбинированное введение ADC-IV с анти-PDL1 антителом повышало выживаемость до 80% мышей (4/5 в День 42), что говорит об улучшении эффективности при комбинировании ЦДН ADC с ингибиторами иммунных контрольных точек.

Введение ADC-VI (анти-PDL1-ЦДН-A) интраперитонеально приводило к полному выживанию мышей с опухолью B16F10-EGFR (5/5 в День 43), по сравнению с введением анти-PDL1 антитела в отдельности (0/5 в День 29) или введением плацебо (0/5 в День 27) (Фиг. 6D). Аналогично, введение ADC-VI внутрь опухоли приводило к полному выживанию мышей с опухолью (Фиг. 6F).

Введение ADCVII (анти-EGFR-ЦДН-A) увеличивало выживаемость мышей с опухолью B16F10-EGFR в конечной точке эксперимента (2/5 в День 36, На Фиг. 7D и 7F) по сравнению с введением анти-PDL1 антитела в отдельности (0/5 в День 27, Фиг. 7F) или введением плацебо (0/5 в День 23, На Фиг. 7D и 7F). Выживаемость после введения ADC-VII превзошла выживаемость при сравнительном введении анти-EGFR антитела плюс неконъюгированный ЦДН (0/5 в День 22, Фиг. 7D), что говорит об улучшении эффективности при использовании ADC для таргетированной доставки ЦДН. Комбинированное введение ADC-VII с анти-PDL1 антителом повышало выживаемость до 60% мышей (3/5 в День 36, Фиг. 7F) по сравнению с ADC-VII, что говорит об улучшении эффективности при комбинировании ЦДН ADC с ингибиторами иммунных контрольных точек.

Введение ADCVIII (анти-EGFR-ЦДН-A) увеличивало выживаемость мышей с опухолью B16F10-EGFR (1/5 в День 35) по сравнению с введением анти-PDL1 антитела в отдельности (0/5 в День 27) или введением плацебо (0/5 в День 25) (Фиг. 8D). Комбинированное введение ADC-VIII и анти-PD-L1 антитела повышало выживаемость до 80% мышей (4/5 в День 35), что говорит об улучшении эффективности при комбинировании ЦДН ADC с ингибиторами иммунных контрольных точек.

Введение ADCIX (анти-EGFR-ЦДН-A) увеличивало выживаемость мышей с опухолью B16F10-EGFR (3/5 в День 30) по сравнению с введением анти-PDL1 антитела в отдельности (0/5 в День 23) или введением плацебо (0/5 в День 19) (Фиг. 9D). Комбинированное введение ADC-IX и анти-PD-L1 антитела повышало выживаемость до 60% мышей (3/5 в День 30), что говорит об улучшении эффективности при комбинировании ЦДН ADC с ингибиторами иммунных контрольных точек.

Введение ADCX (анти-HER2-ЦДН-A) увеличивало время выживания мышей с опухолью LLC1-HER2 (0/5 в День 41) по сравнению с введением плацебо (0/5 в День 32) (Фиг. 10D). Время выживания после введения ADC-X превзошло выживаемость при сравнительном введении анти-HER2 антитела плюс неконъюгированный ЦДН (0/5 в День 32), что говорит об улучшении эффективности при использовании ADC для таргетированной доставки ЦДН.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ImmuneSensor Therapeutics, Inc.

The Board of Regents of the University of Texas System

<120> КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-STING АГОНИСТ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

В ИММУНОТЕРАПИИ

<130> 400160-005WO

<150> US 63/019,212

<151> 2020-05-01

<150> US 62/876,590

<151> 2019-07-19

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 448

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu

245 250 255

Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro

260 265 270

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

275 280 285

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val

290 295 300

Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu

340 345 350

Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys

355 360 365

Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn

370 375 380

Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys

405 410 415

Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly

420 425 430

Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 448

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Phe Leu Gly Gly Pro Cys

225 230 235 240

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu

245 250 255

Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro

260 265 270

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

275 280 285

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val

290 295 300

Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu

340 345 350

Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys

355 360 365

Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn

370 375 380

Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys

405 410 415

Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly

420 425 430

Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 5

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 6

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 7

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 8

<211> 449

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 8

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Phe Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Cys Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser

245 250 255

Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp

260 265 270

Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr

275 280 285

Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val

290 295 300

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu

305 310 315 320

Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr

355 360 365

Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr

370 375 380

Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys

405 410 415

Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu

420 425 430

Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 9

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 9

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 10

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 11

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 12

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 13

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 14

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Cys

115

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 15

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 16

<211> 449

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 16

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 17

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 17

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 450

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<---

Изобретение относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство, содержащим циклический динуклеотид формулы IIk, являющийся STING агонистом, конъюгированный с антителом, способам их получения и их применения. 7 н. и 32 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), имеющий структуру формулы Ia:

(Формула Ia) Ab-[-L-D]_n

где:

“Ab” представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, которые связываются с антигеном, ассоциированным с опухолевыми или иммунными клетками, относящимися к раку;

“L” в каждом случае независимо представляет собой линкер, связывающий один или более D с Ab;

“D” представляет собой лекарственное средство;

“n” это количество D, связанных с Ab через линкер (L),

причем ADC отличается тем, что указанное лекарственное средство представляет собой циклический динуклеотид (ЦДН), имеющий структуру формулы IIk:

где

W и Y представляют собой CH;

X и Z представляют собой N;

R¹ представляет собой C_2-4 алкил, замещенный тиольной группой, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой;

R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол;

или его фармацевтически приемлемую соль;

где ЦДН (D) ковалентно связан с линкером (L) по тиольной группе, амино-группе или C_1-6 алкиламино-группе в R¹ положении ЦДН.

2. ADC по п. 1, где R¹ представляет собой C_2-4 алкил, замещенный амино-группой.

3. ADC по п. 1, где R¹ представляет собой C_2-4 алкил, замещенный тиольной группой.

4. ADC по п. 1, где ADC получен из структуры формулы IIn:

Формула IIn

или его фармацевтически приемлемой соли.

5. ADC по п. 1, где ADC получен из структуры формулы IIo:

Формула IIo

или его фармацевтически приемлемой соли.

6. ADC по п. 1, где ADC имеет структуру, отвечающую формуле III:

Формула III.

7. ADC по п. 1, где ADC имеет структуру, отвечающую формуле IV:

Формула IV.

8. ADC по п. 1, где ADC получен из ЦДН, имеющего следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемой соли.

9. ADC по п. 1, где ADC получен из ЦДН, имеющего следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемой соли.

10. ADC по любому из пп. 1-9, где L содержит один или более расщепляемых линкеров.

11. ADC по любому из пп. 1-10, где L связан с Ab через малеимидную группу, активированный дисульфид, активный сложный эфир, галогенформиат, галоидангидрид, алкилгалогенид или бензилгалогенид.

12. ADC по любому из пп. 1-11, имеющий ковалентную связку, образованную между L и Ab через тиольную группу или первичную амино-группу на Ab.

13. ADC по п. 1, где ADC имеет следующую структуру:

14. ADC по п. 1, где ADC имеет следующую структуру:

.

15. ADC по любому из пп. 1-14, где Ab представляет собой антитело, которое связано с PD-L1, CD47, антигеном, предпочтительно экспрессируемым или сверхэкспрессируемым в раковых клетках, или антигеном, полученным от микроба, который инфицирует клетки человека.

16. ADC по любому из пп. 1-14, где Ab представляет собой антитело, которое связано с антигеном, который представляет собой рецептор фактора роста (GFR).

17. ADC по п. 16, где GFR представляет собой EGFR.

18. ADC по п. 16, где GFR представляет собой ErbB.

19. ADC по п. 16, где GFR представляет собой ErbB2 (HER2).

20. ADC по п. 16, где GFR представляет собой рецептор из семейства HER.

21. Фармацевтическая композиция для стимулирования иммунного ответа, содержащая фармацевтически приемлемое количество ADC по любому из пп. 1-20.

22. Способ стимулирования иммунного ответа у пациента-человека, нуждающегося в этом, включающий введение этому пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п. 21.

23. Способ лечения рака у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение этому пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество ADC по любому из пп. 1-20, где рак выбирают из рака легких, рака груди, рака кишечника и рака почки.

24. Соединение, представляющее собой соединение формулы IIk:

Формула IIk

где

W и Y представляют собой CH;

X и Z представляют собой N;

R¹ представляет собой этил, замещенный амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой;

R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол;

или его фармацевтически приемлемую соль.

25. Соединение по п. 24, где R¹ представляет собой этил, замещенный амино-группой.

26. Соединение по любому из пп. 24-25, где по меньшей мере в одном случае R^P представляет собой гидроксил.

27. Соединение по любому из пп. 24-25, где по меньшей мере в одном случае R^P представляет собой тиол.

28. Соединение по п. 24, где соединение представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль.

29. Композиция для конъюгирования циклического динуклеотида (ЦДН) с линкером, содержащая:

фармацевтически приемлемое количество ЦДН; и

линкер или сшивающий агент, или и линкер, и сшивающий агент;

где ЦДН представляет собой соединение по любому из пп. 24-28, и сшивающий агент обеспечивает сшивание ЦДН с линкером.

30. Композиция по п.29, где ЦДН имеет следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемую соль.

31. Соединение формулы L-ЦДН, где

L представляет собой линкер, который содержит сайт, способный связываться с комплементарным сайтом в антителе или в антиген-связывающемся фрагменте;

ЦДН представляет собой циклический динуклеотид, имеющий структуру формулы IIk:

Формула IIk

где

W и Y представляют собой CH;

X и Z представляют собой N;

R¹ представляет собой C_1-6 алкил, замещенный тиольной группой, амино-группой или C_1-6 алкиламино-группой;

R^P в каждом случае независимо представляет собой гидроксил или тиол;

или его фармацевтически приемлемую соль; и

ЦДН связан с L по тиольной группе, амино-группе или C_1-6 алкиламино-группе в R¹.

32. Соединение по п. 31, где ЦДН связан с L через тиоэфирную, амидную, сложноэфирную, карбаматную, карбонатную, мочевинную, дисульфидную группу или простую эфирную группу.

33. Соединение по п. 32, где соединение имеет структуру, отвечающую формуле IXb:

Формула IXb

где R^L представляет собой остальную часть линкера L.

34. Соединение по п. 32, где соединение имеет структуру, отвечающую формуле IXf:

Формула IXf

где R^L представляет собой остальную часть линкера L.

35. Соединение по любому из пп. 31-34, где R¹ представляет собой этил, замещенный амино-группой.

36. Соединение по любому из пп. 31-35, где по меньшей мере в одном случае R^P представляет собой гидроксил.

37. Соединение по любому из пп. 31-35, где по меньшей мере в одном случае R^P представляет собой тиол.

38. Соединение по п. 31, где ЦДН имеет следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемую соль.

39. Соединение по п. 31, где ЦДН имеет следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемую соль.