Новый биомаркер для диагностики болезни Альцгеймера, обнаруженный в полученных из крови экзосомах, и способ диагностики болезни Альцгеймера с его использованием Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 C07K16/28 C07K16/18 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому биомаркеру для диагностики болезни Альцгеймера, обнаруженному в полученных из крови экзосомах, и к способу диагностики болезни Альцгеймера с его использованием. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому полученному из экзосом биомаркеру для диагностики болезни Альцгеймера, композиции для диагностики болезни Альцгеймера, содержащей указанный биомаркер, набору для диагностики болезни Альцгеймера, содержащему указанную композицию, и способу предоставления информации для диагностики болезни Альцгеймера с использованием указанного биомаркера, композиции или набора.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера, дегенеративное заболевание головного мозга, на которое приходится от 60% до 70% случаев деменции, является наиболее характерным заболеванием среди пожилых людей. Болезнь Альцгеймера встречается у 10% людей в возрасте от 65 до 74 лет, 19% людей в возрасте от 75 до 84 лет и 47% людей в возрасте 85 лет и старше, заболеваемость увеличивается с каждым годом, и данная болезнь превратилась в большую социальную проблему.

Существующие продукты представляют собой наборы для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) р-амилоидного пептида и общего количества тау-белка и фосфорилированного тау-белка, идентифицированных в исследованиях болезни Альцгеймера к настоящему времени, которые только предоставляют информацию об указанных белках и не так полезны в диагностике.

Доля рынка и осведомленность о продуктах-лидерах среди наборов для диагностики болезни Альцгеймера незначительна, один биомаркер дает низкую точность диагностики болезни Альцгеймера, и необходимо увеличить степень ее выявления путем формирования панели биомаркеров для диагностики болезни Альцгеймера.

Между тем экстракты, полученные из экзосом, демонсирируют более четкую связь между заболеваниями и биомаркерами, чем обычные экстракты плазмы, и могут быть хорошо очищены. Активно проводятся исследования по обнаружению биомаркеров из экстрактов, полученных из экзосом.

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения обнаружили новый биомаркер для диагностики болезни Альцгеймера из более надежных полученных из крови экзосом и разработали способ предоставления информации, необходимой для диагностики болезни Альцгеймера, с использованием этого биомаркера.

Техническое решение

Основной задачей настоящего изобретения является обеспечение нового биомаркера для диагностики болезни Альцгеймера, обнаруженного в полученных из крови экзосомах.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа предоставления информации, необходимой для диагностики болезни Альцгеймера, с использованием указанного биомаркера, композиции или набора.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение композиции для диагностики болезни Альцгеймера, содержащей агент для определения уровня экспрессии биомаркера.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение набора для диагностики болезни Альцгеймера, содержащего указанную композицию.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа предоставления информации для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера с использованием указанного биомаркера, указанной композиции или указанного набора.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение применения биомаркера для диагностики болезни Альцгеймера для получения композиции для диагностики болезни Альцгеймера.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение применения композиции для диагностики болезни Альцгеймера с целью диагностики болезни Альцгеймера.

Эффекты, обеспечивающие преимущества

Биомаркер для диагностики болезни Альцгеймера, предложенный в настоящем изобретении, может широко применяться для эффективной диагностики болезни Альцгеймера и, кроме того, для лечения болезни Альцгеймера, поскольку можно не только увеличить степень выявления болезни Альцгеймера, но также повысить точность, чувствительность и специфичность благодаря разделению диагноза в соответствии со стадиями прогрессирования (здоровые, MCI и AD) болезни Альцгеймера с использованием указанного биомаркера. Краткое описание чертежей

ФИГ. 1 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее способ предоставления информации для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера согласно настоящему изобретению;

ФИГ. 2А и 2 В представляют собой таблицы, иллюстрирующие результаты первого и второго протеомного анализа образца экзосомы, разделенные на увеличивающиеся и уменьшающиеся маркеры;

ФИГ. 3 иллюстрирует шесть биомаркеров (MYH9, TSP1, TERA, АРОМ, АРОСЗ и АРОА4), паттерны увеличения и уменьшения которых в значительной степени перекрываются в результате первого и второго протеомного анализа;

ФИГ. 4А представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими тенденцию к увеличению в порядке от легкого когнитивного расстройства (MCI) до болезни Альцгеймера (AD), с наименьшей разницей в экспрессии в здоровой контрольной группе;

ФИГ. 4В представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими тенденцию к специфическому увеличению при легком когнитивном расстройстве;

ФИГ. 4С представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими тенденцию к специфическому увеличению при болезни Альцгеймера;

ФИГ. 4D представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими самую высокую экспрессию в здоровой контрольной группе;

ФИГ. 5 представляет собой схематическое изображение, обобщающее процесс выбора переходов целевого пептида;

ФИГ. 6 представляет собой схематическое изображение, обобщающее процесс оптимизации перехода целевого пептида SIS;

ФИГ. 7 представляет собой график, иллюстрирующий результаты проведения анализа MRM с использованием конечного оптимизированного пептида SIS;

ФИГ. 8А представляет собой график, иллюстрирующий результаты подтверждения и проверки различия выраженности переходов в образцах, специфичных для AD, с помощью анализа AuDIT;

ФИГ. 8 В представляет собой график, иллюстрирующий результаты подтверждения и проверки различия выраженности перехода в образцах, специфичных для MCI, с помощью анализа AuDIT;

ФИГ. 9 представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа отдельных образцов в обучающей выборке;

ФИГ. 10 иллюстрирует ROC-кривые биомаркеров-кандидатов 1 и 5, полученные посредством анализа отдельных образцов;

ФИГ. 11 представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа уровней экспрессии трех биомаркеров (ITGB3, АРОА4 и CRP) в соответствии со стадиями прогрессирования болезни Альцгеймера;

ФИГ. 12 представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты проведения парного теста восьми клонированных антител методом сэндвич-ELISA;

ФИГ. 13 представляет собой график, иллюстрирующий результаты проведения парного теста восьми клонированных антител методом сэндвич-ELISA;

ФИГ. 14А представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее способ определения аффинности антиген-антитело;

ФИГ. 14В иллюстрирует результаты определения аффинности антитела 1 к антигену;

ФИГ. 14С иллюстрирует результаты определения аффинности антитела 3 к антигену;

ФИГ. 14D иллюстрирует результаты определения аффинности антитела 6 к антигену;

ФИГ. 15 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую способ разработки диагностического набора для болезни Альцгеймера и испытаний характеристик набора;

ФИГ. 16 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую комбинацию биомаркеров, включенную в набор для диагностики болезни Альцгеймера;

ФИГ. 17 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую способ нанесения биомаркера и последующего проведения анализа, когда в качестве примера конструируют набор, содержащий маркер тау-белка, связанный с болезнью Альцгеймера;

ФИГ. 18 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую порядок нанесения трех биомаркеров;

ФИГ. 19 представляет собой фотографию, иллюстрирующую процесс установления условий для формы пятна в соответствии с разницей в концентрации нанесенного антитела;

ФИГ. 20А представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты эксперимента по поиску условий нанесения АРОА4;

ФИГ. 20 В иллюстрирует результаты проведения испытания на образцах с низким, средним и высоким титрами в условиях, которые считаются наиболее подходящими среди композиций для нанесения АРОА4;

ФИГ. 21 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты выполнения скринингового испытания в отношении ITGB3;

ФИГ. 22 представляет собой фотографию и изображение, иллюстрирующее результаты проведения испытания по нанесению маркера CRP;

ФИГ. 23 представляет собой изображение, иллюстрирующее конкретные композиции для нанесения АРОА4, CRP и ITGB3;

ФИГ. 24 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты испытания для установления условий стабилизации нанесенных пятен антител после нанесения пятен трех маркеров;

ФИГ. 25 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты проведения испытания на блокирование нанесенных пятен антител после нанесения пятен трех маркеров;

ФИГ. 26 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты проведения испытания на высыхание нанесенных пятен антител после нанесения пятен трех маркеров;

ФИГ. 27 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты проведения испытания условий в отношении разбавителя образца;

ФИГ. 28 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты проведения испытания условий в отношении разбавителя конъюгата;

ФИГ. 29А представляет собой фотографию и таблицу, иллюстрирующие результаты проведения вестерн-блоттинга в отношении ITGB3;

ФИГ. 29В представляет собой фотографию и таблицу, иллюстрирующие результаты проведения Вестерн-блоттинга в отношении АРОА4;

ФИГ. 29С представляет собой фотографию и таблицу, иллюстрирующие результаты выполнения вестерн-блоттинга в отношении CRP;

ФИГ. 30 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты анализа реального образца с использованием окончательно сконструированного набора;

ФИГ. 31 представляет собой график, иллюстрирующий результаты корреляционного анализа для маркера ITGB3; и

ФИГ. 32 представляет собой график, иллюстрирующий результаты корреляционного анализа для маркера АРОА4.

Лучший способ осуществления изобретения

Для решения задач, описанных выше, в одном из воплощений настоящего изобретения предложен биомаркер для диагностики болезни Альцгеймера, содержащий белок, выбранный из группы, состоящей из АРОА4, ITGB3 и их комбинации.

С помощью технологии SG Сар, исходной технологии настоящего изобретения, был разработан диагностический набор с несколькими биомаркерами, который может одновременно обнаруживать существующий маркер и новый обнаруженный маркер, а не один биомаркер, и ожидается, что можно повысить точность, чувствительность и специфичность диагностики, которых не хватает в существующих наборах для отдельных биомаркеров. Содержание исходной технологии описано в патентах Кореи №№10-1274765, 10-0784437 и 10-1547643.

Чтобы разработать способ объективной оценки и диагностики наступления болезни Альцгеймера, авторы настоящего изобретения провели различные исследования для обнаружения белковых маркеров, уровни экспрессии которых изменяются в зависимости от наступления болезни Альцгеймера среди белков в сыворотке. В результате авторы настоящего изобретения подтвердили, что уровни экспрессии АРОА4 и ITGB3 изменяются в зависимости от наступления болезни Альцгеймера, и предложили АРОА4 и ITGB3 в качестве маркеров.

Термин «диагностика» согласно настоящему изобретению включает действие по определению предрасположенности субъекта к конкретному заболеванию или расстройству, действие по определению наличия у субъекта в настоящее время конкретного заболевания или расстройства, действие по определению прогноза субъекта, имеющего определенное заболевание или расстройство; или тераметрию (например, действие по наблюдению за состоянием субъекта для предоставления информации об эффективности лечения).

В настоящем изобретении диагностику болезни Альцгеймера можно интерпретировать как действие по объективному определению наступления болезни Альцгеймера у целевого пациента или стадии прогрессирования болезни Альцгеймера, когда болезнь развилась.

Термин «АРОА4 (аполипопротеин A-IV)» согласно настоящему изобретению относится к типу белка плазмы, экспрессируемого геном АРОА4, и может называться apoA-IV, apoAIV или ароА4. После того, как белок, состоящий из 396 аминокислот, экспрессируется из гена, АРОА4, гликопротеин, состоящий из 376 аминокислот, экспрессируется в процессе созревания. Известно, что у большинства млекопитающих АРОА4 экспрессируется в кишечнике и секретируется в кровеносную систему. Информация о конкретной аминокислотной последовательности АРОА4 или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок, приведена в базе данных, такой как NCBI. Например, последовательность приведена в GenBank под идентификаторами NP 031494, NM 007468, NM 000482 и т.п.

Термин «ITGB3 (интегрин (33)» согласно настоящему изобретению относится к пептиду, составляющему интегрин, представляющий собой один из белков клеточной поверхности, и известно, что интегрин участвует в клеточной адгезии и опосредованной клеточной поверхностью передаче сигнала. Информация о конкретной аминокислотной последовательности ITGB3 или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок, приведена в базе данных, такой как NCBI. Например, последовательность приведена в GenBank под идентификаторами NM_000212, NM_016780, NP_000203, NP_058060 и т.п.

Биомаркер для диагностики болезни Альцгеймера, предложенный в настоящем изобретении, может дополнительно включать CRP.

Термин «CRP (С-реактивный белок)» согласно настоящему изобретению представляет собой кольцеобразный пентамерный белок, обнаруженный в плазме крови человека, синтезируемый в печени и часто используемый в качестве тестового инструмента для определения того, находится ли организм человека в состоянии воспаления, поскольку концентрация CRP в крови увеличивается, когда организм человека находится в состоянии воспаления. Информация о конкретной аминокислотной последовательности CRP или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего указанный белок, приведена в базе данных, такой как NCBI. Например, последовательность приведена в GenBank под идентификаторами NM_007768, NP_031794 и т.п.

В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ предоставления информации, необходимой для диагностики болезни Альцгеймера, с использованием биомаркера, композиции или набора.

В частности, способ предоставления информации, необходимой для определения наступления болезни Альцгеймера согласно настоящему изобретению, включает (а) количественный анализ уровня экспрессии маркерного белка, выбранного из группы, состоящей из АРОА4, ITGB3 и их комбинации, в образце сыворотки субъекта, отличного от человека с подозрением на болезнь Альцгеймера; и (б) сопоставление полученного в ходе количественного анализа уровня маркерного белка с определением наступления болезни Альцгеймера.

Термин «субъект» согласно настоящему изобретению может включать, без ограничения, млекопитающих, включая мышей, домашний скот, людей и т.п., разводимую рыбу и т.п., которые имеют болезнь Альцгеймера или могут заболеть ею.

В настоящем изобретении любой способ, известный специалистам в данной области, может быть использован на стадии количественного анализа уровня экспрессии белка. В качестве конкретных примеров могут быть использованы методы полимеразной цепной реакции (PCR), лигазной цепной реакции (LCR), амплификации транскрипции, автономной репликации последовательностей и амплификации последовательностей на основе нуклеиновых кислот (NASBA) и т.п., но указанный способ не ограничивается ими. В настоящее время аминокислотная последовательность маркерного белка для диагностики болезни Альцгеймера согласно настоящему изобретению или нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок, известна из базы данных, такой как NCBI, и специалисты в данной области техники могут использовать соответствующие средства, необходимые для определения уровня экспрессии белка.

Полученные в ходе количественного анализа уровни соответствующих белков варьируются в зависимости от состояния пациента, поэтому нелегко использовать только полученный в ходе количественного анализа уровень одного из белков для определения наступления болезни Альцгеймера, и полученные в ходе количественного анализа уровни соответствующих белков могут быть объединены и проанализированы для определения наступления болезни Альцгеймера.

В качестве примера способа объединения и анализа соответствующих результатов количественного анализа белков можно привести способ, в котором начало болезни Альцгеймера устанавливают с использованием уровня количественного анализа каждого белка, определенного в образце сыворотки по отдельности или в комбинации.

В качестве другого примера способа объединения и анализа соответствующих результатов количественного анализа белков может быть принят обычный статистический метод анализа. В настоящее время статистический метод анализа, который может быть применен, конкретно не ограничивается указанными, но, например, можно использовать по отдельности или в комбинации линейный или нелинейный метод регрессионного анализа; линейный или нелинейный метод классификационного анализа; дисперсионный анализ (ANOVA); метод нейросетевого анализа; метод генетического анализа; метод машинного анализа с помощью опорных векторов; метод иерархического анализа или кластерного анализа; иерархический алгоритм, использующий деревья решений, или метод анализа с помощью главных компонент ядра; метод анализа с помощью одеяла Маркова; метод анализа с рекурсивным исключением признаков или рекурсивным исключением признаков на основе энтропии; метод анализа с помощью плавающего поиска вперед или плавающего поиска назад; и т.п.

Объединение результатов количественного анализа может быть осуществлено с использованием компьютерного алгоритма, способного автоматически осуществлять статистический метод.

Способ предоставления информации, необходимой для определения наступления болезни Альцгеймера согласно настоящему изобретению, может дополнительно включать стадию количественного анализа уровня экспрессии белка CRP на стадии (а).

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция для диагностики болезни Альцгеймера, содержащая агент для определения уровня экспрессии биомаркера.

Термин «агент для определения уровня экспрессии» согласно настоящему изобретению относится к агенту, способному специфически связываться и распознавать белок или мРНК, кодирующую белок, или амплифицировать микроРНК. Его конкретные примеры включают, но не ограничиваются ими, антитело, которое специфически связывается с белком, праймер или зонд, который специфически связывается с микроРНК, и специалисты в данной области смогут выбрать подходящий агент для цели изобретения.

Указанный агент может быть прямо или косвенно меченным для определения уровня экспрессии белка или мРНК. В частности, в качестве метки можно использовать лиганды, шарики (beads), радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцирующие вещества, хемилюминесцентные материалы, магнитные частицы, гаптены, красители и т.п., но метка не ограничивается ими. В качестве конкретных примеров лиганды включают биотин, авидин, стрептавидин и т.п., ферменты включают люциферазу, пероксидазу, бета-галактозидазу и т.п., и флуоресцентные вещества включают флуоресцеин, кумарин, родамин, фикоэритрин, хлорид сульфородамовой кислоты (техасский красный) и т.п., но метка не ограничивается ими. В качестве таких обнаруживаемых меток могут быть применены большинство известных меток, и специалисты в данной области смогут выбрать подходящие метки в соответствии с целью изобретения.

Термин «антитело» согласно настоящему изобретению относится к белковой молекуле, способной специфически связываться с антигенным участком белковой или пептидной молекулы, и такое антитело может быть получено путем клонирования каждого гена в вектор экспрессии согласно общепринятому способу с получением белка, кодируемого маркерным геном, и превращение полученного белка в антитело общепринятым способом. Форма антитела конкретно не ограничена, и любое поликлональное антитело, моноклональное антитело или его часть, обладающие антигенсвязывающими свойствами, также включены в антитело согласно настоящему изобретению и могут включать не только все иммуноглобулиновые антитела, но также и специальные антитела, такие как гуманизированные антитела. Антитело включает функциональные фрагменты молекулы антитела, а также полные формы, имеющие две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи. Функциональный фрагмент молекулы антитела относится к фрагменту, имеющему по меньшей мере антигенсвязывающую функцию, и может включать Fab, F(ab'), F(ab')2 и Fv.

Термин «праймер» согласно настоящему изобретению представляет собой нуклеотидную последовательность, имеющую короткую свободную 3'-концевую гидроксильную группу, и относится к короткой последовательности, способной образовывать пары оснований с комплементарной матрицей и служить отправной точкой для копирования цепи матрицы. В настоящем изобретении праймер, используемый для амплификации микроРНК, может представлять собой одноцепочечный олигонуклеотид, который может действовать в качестве отправной точки для направленного матрицей синтеза ДНК в соответствующих условиях (например, четыре различных нуклеозидтрифосфата и полимеризующие агенты, такие как ДНК, РНК-полимераза или обратная транскриптаза) в соответствующем буфере при соответствующей температуре, и правильная длина праймера может варьироваться в зависимости от цели его применения. Последовательность праймера не обязательно должна быть полностью комплементарной полинуклеотиду микроРНК гена или комплементарному ему полинуклеотиду, и можно использовать любой праймер, если его последовательность является достаточно комплементарной для гибридизации.

Термин «зонд» согласно настоящему изобретению относится к меченому фрагменту нуклеиновой кислоты или пептиду, способному специфически связываться с микроРНК. В качестве конкретного примера, зонд может быть сконструирован в виде олигонуклеотидных зондов, одноцепочечных ДНК-зондов, двухцепочечных ДНК-зондов, РНК-зондов, олигонуклеотидных пептидных зондов или полипептидных зондов.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен набор для диагностики болезни Альцгеймера, содержащий устройство для количественного определения уровня экспрессии биомаркера.

Устройство для количественного определения, включенное в диагностический набор согласно настоящему изобретению, может определять уровень экспрессии маркерного белка. В качестве конкретного примера набор может представлять собой набор для RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) или набор для ELISA (иммуноферментный анализ), но не ограничивается ими, при условии, что можно определить уровень экспрессии микроРНК или белка.

В этом случае набор для RT-PCR может представлять собой набор, включающий основные элементы, необходимые для проведения RT-PCR. Например, набор для RT-PCR может включать пробирки или другие подходящие емкости, реакционные буферы (с различными рН и концентрациями магния), дезоксинуклеотиды (dNTP), дидезоксинуклеотиды (ddNTP), ферменты, такие как Taq-полимераза и обратная транскриптаза, ДНКаза, ингибиторы РНКазы, DEPC-вода (вода, обработанная диэтилпирокарбонатом), стерильная вода и т.п.в дополнение к каждому праймеру, специфичному для гена. Также может быть включена пара праймеров, специфичных для гена, применяемого в качестве контроля количественного определения.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предоставления информации для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера с использованием биомаркера, композиции или набора.

В частности, способ предоставления информации для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера согласно настоящему изобретению включает (а) количественный анализ уровня экспрессии маркерного белка, выбранного из группы, состоящей из АРОА4, ITGB3 и их комбинации в образце сыворотки субъекта, отличного от человека с подозрением на болезнь Альцгеймера; и (б) сопоставление полученного в ходе количественного анализа уровня маркерного белка с определением наступления болезни Альцгеймера.

В способе «субъект», «количественный анализ уровня экспрессии белка», «комбинация результатов количественного анализа» и т.п.являются такими, как описано выше.

Способ предоставления информации для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера согласно настоящему изобретению может дополнительно включать стадию количественного анализа уровня экспрессии белка CRP на стадии (а).

В способе предоставления информации для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера, предусмотренном настоящим изобретением, стадиями прогрессирования болезни Альцгеймера являются здоровый контроль (НС) -легкое когнитивное расстройство (MCI) - болезнь Альцгеймера (AD), которая может быть диагностирована поэтапно по мере нарастания тяжести. Например, АРОА4 в качестве специфического маркера MCI можно использовать для диагностики НС, AD и MCI по отдельности, a ITGB3 можно использовать для диагностики НС и AD по отдельности (ФИГ. 1).

ФИГ. 1 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее способ предоставления информации для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера, предложенный в настоящем изобретении.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложено применение биомаркера для диагностики болезни Альцгеймера для получения композиции или набора для диагностики болезни Альцгеймера.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложено применение композиции или набора для диагностики болезни Альцгеймера с целью диагностики болезни Альцгеймера.

Вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах. Однако эти примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

Пример 1: Скрининг биомаркеров

Для поиска кандидатов в биомаркеры, обеспечивающие прогнозирование болезни Альцгеймера извлекали экзосомы из крови контрольной группы здоровых людей, группы пациентов с легким когнитивным расстройством и группы пациентов с болезнью Альцгеймера, и одни и те же образцы были подвергали первому и второму протеомному анализу. Затем, в результате первого и второго анализов, для каждого из первого и второго анализов было выбрано 50 биомаркеров со значительным увеличением и уменьшением белка среди здоровой контрольной группы, группы пациентов с легким когнитивным расстройством и группы пациентов с болезнью Альцгеймера. В конце были отобраны биомаркеры с заметно перекрывающимися типами увеличения и уменьшения в первом и втором анализах (ФИГ. 2А, 2В и 3).

ФИГ. 2А и 2В представляют собой таблицы, иллюстрирующие результаты первого и второго протеомного анализа образцов экзосом, разделенные на увеличивающиеся или уменьшающиеся маркеры, а на ФИГ. 3 показаны шесть биомаркеров (MYH9, TSP1, TERA, АРОМ, АРОСЗ и АРОА4), типы увеличения или уменьшения которых в значительной степени перекрываются в результате первого и второго протеомного анализа.

Пример 2: Проверка релевантности биомаркеров, отобранных в примере 1, для болезни Альцгеймера

Для обнаружения биомаркеров, полученных в примере 1, для ранней диагностики болезни Альцгеймера экзосомы экстрагировали из образцов плазмы больных болезнью Альцгеймера (AD), легким когнитивным расстройством (MCI) и здоровых людей, полученных из Швейцарии (Université de Genève, Neurix), и были проведены исследования для обнаружения и проверки биомаркеров для прогнозирования болезни Альцгеймера и легкого когнитивного расстройства.

Пример 2-1: Сортировка экспрессии выбранных белков-кандидатов по образцу перед проверкой биомаркера

В общей сложности четыре паттерна экспрессии были установлены путем сравнения различий в экспрессии выбранных белков-кандидатов между группами пациентов с болезнью Альцгеймера и легким когнитивным расстройством (ФИГ. 4A-4D).

ФИГ. 4А представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими тенденцию к увеличению в порядке от легкого когнитивного расстройства к болезни Альцгеймера, с наименьшей разницей в экспрессии в здоровой контрольной группе; ФИГ. 4В представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими тенденцию к специфическому увеличению при легком когнитивном расстройстве; ФИГ. 4С представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими тенденцию к специфическому увеличению при болезни Альцгеймера; и ФИГ. 4D представляет собой набор паттернов с кандидатами, демонстрирующими самую высокую экспрессию в здоровой контрольной группе.

Пример 2-2: Выбор репрезентативных целевых пептидов и переходов для MRM валидации кандидата в биомаркеры

Для MRM валидации (валидации методом мониторинга множественных реакций) в отношении выбранных кандидатов в биомаркеры, позволяющие прогнозировать болезнь Альцгеймера и легкое когнитивное расстройство, были выбраны целевые пептиды, которые могли бы специфически представлять каждый белок. Для эффективности обнаружения были исключены пептиды, содержащие от 6 до 20 аминокислот и содержащие последовательности, не фрагментированные посттрансляционной модификацией белка или трипсином. В MRM-анализе переход, представляющий собой комбинацию иона-предшественника (Q1) и иона-продукта (Q3), которые выражают количественные значения, также был установлен в диапазоне от 50 m/z до 1350 m/z в соответствии с показаниями прибора Agilent, используемого в лаборатории, и выбирали по меньшей мере три перехода на один пептид (ФИГ. 5).

ФИГ. 5 представляет собой схематическое изображение, обобщающее процесс выбора переходов целевых пептидов.

Пример 2-3: Процесс оптимизации перехода пептида SIS

По меньшей мере три пептида-мишени для каждого белка-мишени выбирали, обращаясь к онлайн-библиотеке (SRMAtlas, National Cancer Institute of Cancer Clinical Proteomics, PeptideAtlas). Предпочтительно синтезировали и конструировали пептид SIS (стабильный изотопный стандарт), который имел ту же последовательность, что и целевой пептид, но был помечен изотопами (¹³С и ¹⁵N) по углероду и азоту лизина и аргинина. После этого пептид SIS анализировали и выполняли оптимизацию перехода (ФИГ. 6).

ФИГ. 6 представляет собой схематическое изображение, обобщающее процесс оптимизации перехода целевого пептида SIS.

Переход, оптимизированный с помощью пептида SIS, добавляли к образцам, объединенным для соответствующих контрольных групп, легкого когнитивного расстройства и болезни Альцгеймера, и одновременно проводили анализ MRM. Благодаря одновременному анализу пептидов SIS и объединенных образцов можно определить точное время элюирования и стандартизировать абсолютный количественный анализ. Обнаруженный переход был повторно валидирован как надежный переход во время количественного определения путем применения аналитической воспроизводимости (коэффициент вариации, CV<20%) и статистического эталонного значения (значение р<0,05) с помощью программы AuDIT (автоматическое обнаружение неточных и неопределенных переходов) (ФИГ. 7).

ФИГ. 7 представляет собой график, иллюстрирующий результаты проведения анализа MRM с использованием конечных оптимизированных пептидов SIS.

В результате анализа AuDIT 1572 перехода, соответствующие 215 пептидам, были выбраны в качестве окончательных кандидатов для валидации отдельных образцов.

Пример 2-4: Выбор конечного биомаркера для применения при разработке наборов и валидация конечного биомаркера в образце пациента

Чтобы повысить надежность проверки отдельных выборок, анализ проводили путем разделения всех выборок на две независимые когорты, обучающую выборку и тестовую выборку. Основываясь на результатах анализа отдельных выборок обучающей выборки, полиномиальный регрессионный анализ и С-статистику использовали для анализа групп с болезнью Альцгеймера, легким когнитивным расстройством и здоровых контрольных групп, а результаты использовали в качестве основы для выбора биомаркеров, и окончательные биомаркеры были выбраны с учетом нескольких других факторов, указанных ниже.

В настоящее время в результате анализа некоторых отдельных образцов было подтверждено, что некоторые кандидаты демонстрируют значительные различия экспрессии между соответствующими группами больных и здоровой контрольной группой (ФИГ. 8А и 8В).

ФИГ. 8А представляет собой график, иллюстрирующий результаты подтверждения и валидации различия выраженности перехода в образцах, специфичных для AD, с помощью анализа AuDIT, а ФИГ. 8В представляет собой график, иллюстрирующий результаты подтверждения и валидации различий экспрессии переходов в образцах, специфичных для MCI, с помощью анализа AuDIT.

Кандидатов в биомаркеры валидировали путем проверки значения AUC (площадь под кривой) по кривой рабочей характеристики приемника (ROC), выбирали кандидатов в биомаркеры со значением AUC 0,7 или более, которое было стандартом оценки. После этого кандидат, валидированный с помощью обучающей выборки, был повторно валидирован как биомаркер, специфичный для болезни Альцгеймера, посредством анализа отдельных образцов в тестовой выборке (ФИГ. 9).

ФИГ. 9 представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа отдельных образцов в обучающей выборке.

На основании результатов анализа отдельных образцов было принято решение о том, что в качестве биомаркера в диагностическом наборе будет использован специфичный для MCI биомаркер-кандидат 5 (АРОА). Результаты MS/MS отличались даже для биомаркеров АРОА, принадлежащих к одной и той же группе, и было подтверждено, что, в частности, АРОА4 был специфичен для MCI (ФИГ. 10).

На ФИГ. 10 показаны ROC-кривые биомаркеров-кандидатов 1 и 5, полученные посредством анализа отдельных образцов.

В случае специфичного для AD биомаркера-кандидата 1 (ITGB3), значение ROC составляло 0,71, и было решено, что биомаркер-кандидат 1 будет использован вместе с АРОА4 в диагностическом наборе. Данный специфичный для AD маркер был выбран как применимый для диагностики болезни Альцгеймера, поскольку уровень его экспрессии постепенно увеличивался по мере ухудшения заболевания от контрольной группы здоровых людей к группе MCI и группе AD.

Наконец, биомаркер CRP также наносили в ту же лунку. CRP с небольшим отрывом не смог пройти значение ROC, которое было внутренним критерием для выбора биомаркеров, но была предпринята попытка найти достоверную корреляцию между болезнью Альцгеймера и указанным биомаркером, когда позднее было накоплено больше данных, учитывая, что этот биомаркер, согласно литературе, обладал свойством вовлеченности в воспалительную реакцию и был маркером, связанным с болезнью Альцгеймера.

Пример 2-5: Результаты протеомного анализа экзосом

Экзосомы (16НС, 9MCI и 17AD), выделенные из крови пациентов на стадиях здорового контроля, легкого когнитивного расстройства (MCI) и болезни Альцгеймера (AD), соответственно, при поиске биомаркеров болезни Альцгеймера объединяли для одной и той же стадии заболевания с получением трех объединенных образцов для каждой стадии заболевания, и проводили протеомный анализ для трех биомаркеров (ITGB3, АРОА4 и CRP), идентифицированных выше (ФИГ. 11).

ФИГ. 11 представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа уровней экспрессии трех биомаркеров (ITGB3, АРОА4 и CRP) в соответствии со стадиями прогрессирования болезни Альцгеймера.

Как показано на ФИГ. 11, поскольку уровни экспрессии трех биомаркеров показали различные паттерны для каждой стадии прогрессирования болезни Альцгеймера, было проанализировано, что стадия прогрессирования болезни Альцгеймера может быть диагностирована по паттернам уровней экспрессии указанных трех биомаркеров.

Пример 3: Разработка восьми антител к валидированным биомаркерам и выбор пар антител с помощью метода сэндвич-ELISA

Чтобы использовать для диагностики АРОА4, выбранный MCI-специфический биомаркер, сначала было сконструировано антитело. Антитела к ITGB3 и CRP, двум биомаркерам, отличным от АРОА4, не были сконструированы, а были разработаны с использованием коммерчески доступных антител.

Пример 3-1: Разработка восьми антител к валидированным биомаркерам

Антиген АРОА4 инъецировали мышам для индукции иммунного ответа, из них конструировали гибридому для конструирования всего пяти клонированных антител, а три клонированных антитела конструировали таким же образом с использованием Goat. Для удобства восемь клонированных антител были произвольно названы от антитела 1 до антитела 8, а затем их подвергали реакции с антигеном АРОА4 для проведения парного теста методом ELIS А.

Восемь антител, сконструированных выше, тестировали попарно с помощью метода сэндвич-ELISA, и восемь сконструированных антител тестировали с использованием захватывающего и детектирующего антитела, соответственно (ФИГ. 12 и 13).

ФИГ. 12 представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты проведения парного теста восьми клонированных антител с помощью сэндвич-ELISA, а ФИГ. 13 представляет собой график, иллюстрирующий результаты выполнения парного теста.

Как показано на ФИГ. 12 и 13, были выбраны две пары, которые считались подходящими в качестве пары для применения в диагностическом наборе ((захватывающее антитело 1, детектирующее антитело 6), (захватывающее антитело 3, детектирующее антитело 6)).

Пример 3-2: Определение аффинности с использованием сэндвич-ELISA и выбор пар антител

Определяли аффинность антитела 1, антитела 3 и антитела 6, выбранных в результате парного теста, к антигену (ФИГ. 14А). При этом, антигеном, используемым для определения аффинности, был антиген, используемый при конструировании антител. Аффинность антиген-антитело определяли для каждого из трех антител (антитело 1- антитело 6, антитело 3-антитело 6). В качестве основного метода определения использовали прямой метод ELISA. Аффинность определяли в эксперименте, вызывающем конкурентное связывание между антигенами и антителами (анализ конкурентного связывания). Количество детектирующего антитела, используемого во время эксперимента по конкурентному связыванию антиген-антитело, определяли путем построения графика Клотца.

Определенное количество детектирующего антитела и серийно разбавленный антиген подвергали взаимодействию, затем полученную смесь распределяли в лунки, покрытые антигеном, и измеряли флуоресценцию при 450 нм.

Измеренное значение OD (оптическая плотность) наносили на график с использованием программного обеспечения Sigma plot для определения значения константы диссоциации K_d, которое представляло собой аффинность антиген-антитело.

ФИГ. 14А представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее процесс определения аффинности антиген-антитело.

Пример 3-2-1: Определение аффинности антитела 1 к антигену

Испытание на аффинность антитела 1 к антигену проводили путем самопроверки (ФИГ. 14В).

ФИГ. 14В иллюстрирует результаты определения аффинности антитела 1 к антигену.

Как показано на ФИГ. 14В, значение константы диссоциации K_d, полученное с использованием программного обеспечения Sigma plot, составляло 11,38 нМ, что, как было подтверждено, примерно в 10 раз меньше, чем аффинность 1 нМ или более, выбранная в качестве критерия оценки, и было обнаружено, что антитело 1 не подходит для использования в разработке набора.

Пример 3-2-2: Определение аффинности антитела 3 к антигену Испытание на аффинность антитела 3 к антигену проводили путем самопроверки (ФИГ. 14С).

ФИГ. 14С иллюстрирует результаты определения аффинности антитела 3 к антигену.

Как показано на ФИГ. 14С, значение константы диссоциации Kd, полученное с использованием программного обеспечения Sigma plot, составляло 0,2035 нМ, что, как было подтверждено, примерно в 5 раз превышает аффинность 1 нМ или более, выбранную в качестве критерия оценки, и было обнаружено, что антитело 3 подходит для использования в разработке набора.

Пример 3-2-3: Определение аффинности антитела 6 к антигену Испытание на аффинность антитела 6 к антигену проводили путем самопроверки (ФИГ. 14D).

ФИГ. 14D иллюстрирует результаты определения аффинности антитела 6 к антигену.

Как показано на ФИГ. 14D, значение константы диссоциации K_d, полученное с пррименением программного обеспечения Sigma plot, составляло 0,2755 нМ, что, как было подтверждено, примерно в 4 раза превышает аффинность 1 нМ или более, выбранную в качестве критерия оценки, и было обнаружено, что антитело 6 подходит для использования в разработке набора.

На основании результатов определения аффинности был разработан диагностический набор с использованием антитела 3 и антитела 6 в качестве захватывающего и детектирующего антитела, соответственно.

Пример 4: Разработка набора для диагностики болезни Альцгеймера

Пример 4-1: Схема диагностического набора

Каждую стадию от создания набора до проверки работоспособности можно разделить на три основных стадии: процесс нанесения антител, процесс стабилизации нанесенных антител и процесс реакции для анализа, соответственно. Поскольку такие условия, как рН и концентрация антител на каждой стадии, влияют на эффективность набора, можно сказать, что ключом к разработке набора является поиск этих условий и выбор оптимальных условий (ФИГ. 15).

ФИГ. 15 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую способ разработки диагностического набора для болезни Альцгеймера и испытания в отношении характеристик набора.

Было определено, что диагностический набор, использующий два или более биомаркеров, был более выгодным с точки зрения надежности и точности результатов, чем создание диагностического набора для болезни Альцгеймера только с одним новым биомаркером благодаря использованию преимущества технологии компании авторов настоящего изобретения, благодаря чему стала возможной множественная диагностика.

Целью разработки окончательного диагностического набора была поставлена множественная диагностика с использованием в общей сложности трех различных биомаркеров, и конфигурация указанных трех биомаркеров представляла собой специфичный для MCI АРОА4, специфичный для AD ITGB3 и CRP, что, как ожидается, будет важным при дальнейших клинических испытаниях (ФИГ. 16).

ФИГ. 16 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую комбинацию биомаркеров, включенную в набор для диагностики болезни Альцгеймера.

Пример 4-2: Нанесение биомаркеров

Работа по нанесению была проведена с использованием антитела 3, которое показало превосходную аффинность в результате анализа аффинности, проведенного в примере 3-2 с помощью золь-гель метода, который был основной технологией PCL Inc.

Для процесса нанесения захватывающее антитело наносили на дно лунки планшета, затем антиген и детектирующее антитело подвергали реакции с помощью метода сэндвич-ELISA, и значение сигнала измеряли путем сканирования при 532 нм (ФИГ. 17).

ФИГ. 17 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую процесс нанесения биомаркера и последующего проведения анализа, когда в качестве примера получают набор, содержащий маркер тау-белка, связанный с болезнью Альцгеймера.

Перед использованием фактического образца антиген, используемый в анализе, анализировали с приобретенным антигеном, используемым во время конструирования антител, это делали для более точной проверки реальных образцов пациентов с большим количеством реальных образцов, когда процесс нанесения золь-гель был установлен позже.

Сначала проводили поиск по наносимой композиции на основе маркера АРОА4, который представлял собой биомаркер, специфичный для MCI, и когда композиция маркера АРОА4 была установлена, затем наносили маркер АРОА4 с помощью ITGB3, и, наконец, все три маркера, включая CRP, наносили вместе, чтобы завершить конструирование набора (ФИГ. 18).

ФИГ. 18 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую порядок нанесения трех биомаркеров.

В частности, в случае АРОА4 при конструировании набора применяли антитело, на котором основывалась конструкция, а в качестве наносимых и реактивных антител к ITGB3 и CRP, которые являлись маркерами, отличными от АРОА4, использовались не вновь сконструированные антитела, а коммерческие антитела. Антитела к этим двум маркерам также подвергали скринингу для выбора подходящих антител, и использовали выбранные антитела.

Захватывающее антитело смешивали с золь-гелем и наносили в соответствии с протоколом, заранее установленным заявителями в отношении состава золь-геля, и в результате наблюдалось явление, при котором пятно уменьшалось. Эмпирически был сделан вывод, что это явление в основном было вызвано слишком низкой концентрацией захватывающего антитела, и было проведено концентрирование от 0,5 мг/мл (концентрация существующего захватывающего антитела) до 1 мг/мл, и пятно было получено снова при том же составе золь-гель для улучшения ситуации с уменьшением пятна (ФИГ. 19).

ФИГ. 19 представляет собой фотографию, иллюстрирующую процесс установления условия для формы пятна на основе разницы в концентрации антитела, которое должно быть определено.

По данным ФИГ. 19, концентрация захватывающего антитела была установлена равной 1 мг/мл, чтобы отразить результаты последующих экспериментов с использованием различных композиций антител и пятен золь-гель.

В ходе эксперимента по нанесению захватывающего антитела и золь-геля при различных композициях маркера АРОА4 было обнаружено, что композиция (CBS-3) имеет несколько более высокое значение сигнала (ФИГ. 20А и 20В).

ФИГ. 20А представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты эксперимента по поиску условий нанесения АРОА4, а ФИГ. 20 В иллюстрирует результаты проведения испытания на образцах с низким, средним и высоким титрами в условиях, которые считаются наиболее подходящими среди композиций для нанесения АРОА4.

Пример 4-3: Испытание по нанесению ITGB3

В случае маркера ITGB3 был проведен скрининговое испытание на 10-12 композициях для нанесения пятен в соответствии с протоколом, установленным компанией создателей настоящего изобретения, и благодаря этому была выбрана композиция, считающаяся значимой. В результате стало возможным получить значительное значение сигнала от композиции CBS, к которой ничего не добавлялось, и это было выбрано в качестве условия нанесения (ФИГ. 21).

ФИГ. 21 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты выполнения скринингового испытания в отношении ITGB3.

Пример 4-4: Испытание по нанесению CRP

В случае маркера CRP нанесение выполняли с использованием композиции для нанесения, установленной компанией создателей настоящего изобретения в качестве протокола, как и в случае скрининга маркера ITGB3. В результате скринингового испытания только для композиции значимые значения сигнала были получены для двух композиций, композиции R-1 и композиции R-1-1, в которой соотношение золь-гель было довольно низким. Однако в случае с R-1-1 в состав сырья для композиции было включено очень липкое вещество под названием Sol3, поэтому было сочтено, что при массовом производстве набора в будущем возникнут трудности в процессе получения или контроле качества, и в конечном итоге была выбрана композиция R-1 (ФИГ. 22).

ФИГ. 22 представляет собой фотографию и изображение, иллюстрирующие результаты проведения испытания с нанесением маркера CRP.

Таким образом, были установлены композиции для нанесения для АРОА4, CRP и ITGB3 (ФИГ. 23).

ФИГ. 23 представляет собой изображение, иллюстрирующее конкретные композиции для нанесения для АРОА4, CRP и ITGB3.

После этого проводили испытание на старение нанесенных антител, испытание на блокирование и испытание на высыхание, которые представляли собой процессы стабилизации нанесенных антител.

Пример 4-4-1: Испытание на старение нанесенных антител

После того, как все РОА4, ITGB3 и CRP были нанесены, проводили испытания условий для стадии старения, которая представляла собой стадию, помогающую пятнам оставаться стабильно нанесенными (ФИГ. 24). Грубо говоря, испытание на старение проводили в двух условиях: в производственном помещении с высокой влажностью приблизительно 60% и в эксикаторе с низкой влажностью приблизительно 9% и в двух временных условиях: 2 часа и в течение ночи.

ФИГ. 24 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты условий проведения испытания для стабилизации нанесенных антител после нанесения трех маркеров.

Как показано на ФИГ. 24, было подтверждено, что значение сигнала было высоким, когда старение проводилось в эксикаторе, и форма пятна была более стабильной в условиях 2 часов, чем в условиях ночи; в результате стабильность пятна была улучшена в условиях эксикатора при комнатной температуре в качестве места старения и 2 часов в качестве времени старения, и это условие было определено как условие старения. Пример 4-4-2: Испытание на блокирование нанесенных антител После того, как было определено условие старения, было проведено испытание с блокирующим буфером, процесс, направленный на устранение неспецифических реакций. Испытание с блокирующим буфером проводили с использованием в общей сложности трех буферов, включая буфер (1% BSA, 0,1% козьей сыворотки, 1 г Tween 20, 2 г азида натрия), используемый в существующем протоколе создателей настоящего изобретения, и стабилизаторов StabilBlock SG01 и ST01 (ФИГ. 25).

ФИГ. 25 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты проведения испытания на блокирование нанесенных антител после нанесения трех маркеров.

Как показано на ФИГ. 25, было подтверждено, что наиболее благоприятный сигнал был получен с точки зрения величины сигнала и стабильности пятна, когда блокирование выполняли с помощью ST01.

Пример 4-4-3: Испытание на условия сушки

После процесса блокирования с целью осушения лунки было проведено испытание при двух условиях влажности и двух временных условиях. Испытание проводили, устанавливая два режима: производственное помещение с влажностью 60% и эксикатор с влажностью 9%, и два временных режима: 2 часа и ночь (ФИГ. 26).

ФИГ. 26 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты проведения испытания на высыхание пятен антител после нанесения трех маркеров.

Как показано на ФИГ. 26, разница в значениях сигнала между условиями высыхания была невелика, но условия «эксикатор и ночь» были определены как окончательные условия сушки с учетом того факта, что лунки не были полностью высушены в условиях, отличных от условий «эксикатор и ночь».

Пример 4-5: Окончательное испытание для стандартизации диагностического набора

Критерии для процесса анализа диагностического набора были заданы на основе протокола, установленного компанией создателей настоящего изобретения, и на его основе были выбраны оптимальные условия анализа путем изменения таких условий, как разбавитель образца и разбавитель конъюгата.

Пример 4-5-1: Испытание условий в отношении разбавителя образца

Во время анализа было проведено испытание условий в отношении разбавителя, который должен быть дозирован вместе с образцом (ФИГ. 27).

ФИГ. 27 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты испытания условий в отношении разбавителей образцов.

Как показано на ФИГ. 27, реакцию проводили, устанавливая соотношение образца и разбавителя образца 1:4 и общий дозированный объем 100 мкл, и в результате самые лучшие результаты были получены с использованием разбавителя образца, содержащего козью сыворотку.

Пример 4-5-2: Испытание условий в отношении разбавителя конъюгата

Испытание условий было проведено для разбавителя конъюгата, который должен быть дозирован во второй реакции после реакции с образцом (ФИГ. 28).

ФИГ. 28 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты испытания условий в отношении разбавителей конъюгатов.

Как показано на ФИГ. 28, в результате было подтверждено, что значения сигнала для всех маркеров увеличиваются при проведении реакции с использованием буфера, к которому добавляли BSA.

Пример 4-5-3: Информация об окончательном испытании для стандартизации диагностического набора

Информация об окончательном испытании для стандартизации диагностического набора, окончательно подтвержденная результатами приведенных примеров, выглядит следующим образом:

i. Информация о старении

1. Эксикатор при комнатной температуре, 2 часа

ii. Информация о блокировании 1. Комнатная температура, 1 час

iii. Информация о сушке

1. Эксикатор при комнатной температуре, в течение ночи.

iv. Информация о запуске

1. Применяемое оборудование: шейкер

2. Протокол анализа

v. Информация по анализу

1. Съемочное оборудование: оборудование Sensovation

Пример 4-6: Окончательная конструкция набора и фактическое испытание образца

Три маркера наносили в одну лунку в зависимости от условий нанесения и проводили проверку эффективности набора с использованием реальных образцов НС, MCI и AD. Среди образцов, взятых у 380 пациентов, были объединены от трех до четырех образцов для каждой стадии заболевания. Наконец, всего было установлено 69 образцов, по 23 для каждой из групп НС, MCI и AD.

Пример 4-6-1: Результаты анализа экзосом методом вестерн-блоттинга

Для валидации биомаркеров АРОА4, CRP и ITGB3 большое количество образцов экзосом (по 23 на каждую стадию, всего 69) было проанализировано с помощью вестерн-блоттинга. При этом, порядок образцов был установлен произвольно без проведения эксперимента путем сбора пациентов для каждой стадии заболевания с учетом различий между гелями вестерн-блоттинга (ФИГ. 29А, 29 В и 29С).

ФИГ. 29А представляет собой фотографию и таблицу, иллюстрирующие результаты проведения вестерн-блоттинга в отношении ITGB3, ФИГ. 29 В представляет собой фотографию и таблицу, иллюстрирующие результаты выполнения вестерн-блоттинга в отношении АРОА4, а ФИГ. 29С представляет собой фотографию и таблицу, иллюстрирующие результаты выполнения вестерн-блоттинга в отношении CRP.

Как показано на ФИГ. 29А, 29В и 29С, результаты вестерн-блоттинга соответствовали результатам протеомного анализа в случае ITGB3 и АРОА4, однако методом вестерн-блоттинга (WB) было сложно проанализировать CRP, поэтому результаты были приложены, но исключены из корреляционного анализа в окончательном заключении.

Пример 4-6-2: Результаты фактического анализа проб после окончательного конструирования набора

Результаты были получены путем взаимодействия 69 образцов плазмы, полученных от тех же пациентов, что и в эксперименте по вестерн-блоттингу, с использованием сконструированного набора (ФИГ. 30).

ФИГ. 30 представляет собой фотографию, иллюстрирующую результаты анализа реальных образцов с использованием окончательно сконструированного набора.

Пример 4-6-3: Корреляция между фактическими результатами анализа образцов и результатами анализа методом вестерн-блоттинга

Корреляцию между данными, полученными в примере 4-6-2, и интенсивностью вестерн-блоттинга устанавливали и анализировали (ФИГ. 31 и 32).

Для начала, ФИГ. 31 представляет собой график, иллюстрирующий результаты корреляционного анализа для маркера ITGB3.

Как показано на ФИГ. 31, в случае маркера ITGB3, во всех результатах протеомного анализа, результатах вестерн-блоттинга и результатах анализа сконструированным набором было подтверждено, что уровень экспрессии белка также имеет тенденцию к увеличению по мере прогрессирования заболевания от НС до MCI и AD, и коэффициент корреляции (R2) также был 80% и более.

Далее на ФИГ. 32 представлен график, иллюстрирующий результаты корреляционного анализа для маркера АРОА4.

Как показано на фиг.32, было подтверждено, что маркер АРОА4 имеет очень высокий уровень экспрессии на стадии MCI, но снова имеет тенденцию к снижению на стадии AD.

Важно своевременно диагностировать заболевание на стадии MCI, так как целью диагностического набора является ранняя диагностика болезни Альцгеймера, и можно четко знать, что у пациента есть болезнь Альцгеймера без использования диагностического набора, когда пациент достигает стадии AD.

Подтверждено, что маркер АРОА4 показал коэффициент корреляции (R2) приблизительно 88% между результатами анализа сконструированным диагностическим набором и вестерн-блоттингом в образцах на стадии MCI.

Наконец, в случае маркера CRP трудно определить количественное значение в вестерн-блоттинге, однако по результатам протеомного анализа и литературным данным видно, что уровень экспрессии CRP снижается на стадии MCI, и было проанализировано, что желательно использовать маркер CRP в качестве вспомогательного индикатора.

На основании приведенного выше описания специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть реализовано в другой конкретной форме без изменения его технической сущности или основных характеристик. Поэтому следует понимать, что приведенное выше воплощение не является ограничивающим, а является иллюстративным во всех аспектах. Объем раскрытия определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим ему описанием, и, следовательно, все изменения и модификации, попадающие в рамки формулы изобретения или эквиваленты таких рамок, должны быть охвачены формулой изобретения.

Группа изобретений относится к области медицины и диагностики. 1 объект представляет собой применение APOA4 и ITGB3 в качестве маркерных белков для диагностики болезни Альцгеймера. 2 объект – способ диагностики наступления болезни Альцгеймера, включающий количественный анализ уровня экспрессии маркерных белков APOA4 и ITGB3. 3 объект – применение набора для диагностики наступления болезни Альцгеймера, где указанный набор содержит устройство для количественного определения уровней экспрессии APOA4 и ITGB3 и буфер. Технический результат заключается в обеспечении диагностики болезни Альцгеймера с использованием биомаркеров APOA4 и ITGB3. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 32 ил., 4 пр.

1. Применение APOA4 и ITGB3 в качестве маркерных белков для диагностики болезни Альцгеймера, где APOA4 представляет собой маркерный белок, специфический для легкого когнитивного расстройства (MCI).

2. Способ диагностики наступления болезни Альцгеймера, включающий:

(а) количественный анализ уровня экспрессии маркерных белков APOA4 и ITGB3 в образце сыворотки субъекта, отличного от человека с подозрением на болезнь Альцгеймера; и

(б) сопоставление полученного в ходе количественного анализа уровня маркерных белков с определением наступления болезни Альцгеймера,

где стадия сопоставления включает подтверждение стадии прогрессирования болезни Альцгеймера,

где указанная стадия прогрессирования представляет собой одну из здорового контроля (HC), легкого когнитивного расстройства (MCI) и болезни Альцгеймера (AD).

3. Способ по п. 2, где стадию сопоставления осуществляют путем объединения результатов количественного анализа каждого маркерного белка,

где указанное объединение результатов количественного анализа осуществляют с использованием метода анализа, выбранного из группы, состоящей из линейного или нелинейного метода регрессионного анализа; линейного или нелинейного метода классификационного анализа; дисперсионного анализа (ANOVA); метода нейросетевого анализа; метода генетического анализа; метода машинного анализа с помощью опорных векторов; метода иерархического анализа или кластерного анализа; иерархического алгоритма, использующего деревья решений, или метода анализа с помощью главных компонент ядра; метода анализа с помощью одеяла Маркова; метода анализа с рекурсивным исключением признаков или рекурсивным исключением признаков на основе энтропии; метода анализа с помощью плавающего поиска вперед или плавающего поиска назад; и их комбинации.

4. Способ по п. 3, где объединение результатов количественного анализа осуществляют с использованием компьютерного алгоритма.

5. Применение по п. 1, где маркерные белки дополнительно включают С-реактивный белок (CRP).

6. Способ по п. 2, где маркерные белки дополнительно включают CRP.

7. Применение набора для диагностики наступления болезни Альцгеймера, где указанный набор содержит устройство для количественного определения уровней экспрессии APOA4 и ITGB3 и буфер,

где указанный набор предназначен для подтверждения стадии прогрессирования болезни Альцгеймера, где указанная стадия прогрессирования представляет собой одну из здорового контроля (HC), легкого когнитивного расстройство (MCI) и болезни Альцгеймера (AD).

8. Применение по п. 7, где указанный набор дополнительно содержит устройство для количественного определения уровней экспрессии CRP.