Интегративный плазмидный вектор PVEAL3-Lassa-Trim, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GPC вируса Ласса в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-GPC-LASV и рекомбинантный белок GPC-LASV, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-GPC-LASV Российский патент 2024 года по МПК C12N15/00 C12N15/63 C12N15/79 C12N15/85 

Область техники

Изобретение относится к интегративному плазмидному вектору pVEAL3-Lassa-Trim, обеспечивающему экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GPC вируса Ласса в эукариотической системе клеток млекопитающих, штамму рекомбинантной клеточной линии СНО-K1-GPC-LASV и рекомбинантному белку GPC-LASV, продуцируемому указанной клеточной линией СНО-GPC-LASV и может быть использовано в области генной инженерии и биотехнологии.

Рекомбинантный поверхностный гликопротеин GPC LASV может служить для создания диагностикумов лихорадки Ласса, а также для решения лабораторных задач, таких как получение фаговых библиотек.

Уровень техники

Инфекция, вызванная LASV, распространяется за пределы традиционно эндемичных районов Западной Африки, представляя биоугрозу для всего мира [Warner B. M., Safronetz D., Stein D. R. Current research for a vaccine against Lassa hemorrhagic fever virus // Drug Des Devel Ther. - 2018. - № 12. - P. 2519-2527. Bell-Kareem, A. R. & Smither, A. R. Epidemiology of Lassa fever. Cur. Top. Microbiol. Immunol. https://doi.org/10.1007/82_20 (2021)].

Эффективная профилактическая вакцина против лихорадки Ласса до сих пор не разработана. До сих пор единственной терапией геморрагической лихорадки Ласса одобренной является рибавирин, но это лечение имеет побочные эффекты, и его эффективность сомнительна [Salam A.P. et al. Time to reconsider the role of ribavirin in Lassa fever // PLoS Negl. Trop. Dis. - 2021. - № 15. - P. e0009522].

Основным и важным компонентом любой кандидатной вакцины против LASV, является высокогликозилированный гликопротеиновый комплекс GPC, представленный на поверхности вириона [Watanabe Y. Structure of the Lassa virus glycan shield provides a model for immunological resistance. // Biochemistry. - 2018. - Vol. 115. - № 28. - P. 7320-7325]. Важным фактором для получения GPC LASV является выбор системы экспрессии. Наиболее перспективными являются клетки млекопитающих, поскольку позволяют получать целевой белок в наиболее близкой к нативной форме, т.е. прошедший необходимые пострансляционные модификации, что весьма важно для иммуногенности рекомбинантного белка.

Ближайшие аналоги

Известна разработка американских ученых (WO 2022232612, МПК A61K 39/12, 03.11.2022 г.), в которой описаны наноантитела, способные нейтрализовать псевдотипированный вирус, экспрессирующий GPC LASV и специфически связываться со стабилизированным тримером GPC LASV. В работе представлен подробный дизайн, а также приведена характеристика стабилизированного растворимого тримера GPC LASV. Стабильность тримера оценивали как реактивность фракционного связывания с моноклональным антителом 37.7Н. Однако в описании данной международной заявки нет сведений о технологии получения тримера GPC LASV и в какой системе он был синтезирован.

Известно изобретение по патенту RU 2752858, МПК C12N 15/74, опубл. 11.08.2021 г.). В данном патенте используется наиболее близкий интеграционный вектор pVEAL2 для создания стабильного продуцента вирусного белка RBD SARS-CoV-2 c использованием клеточной линии CHO-K1.

Наиболее близким аналогом (прототипом) по назначению является разработка американских ученых (US 20140377740, МПК C07K 14/005, опубл.25.12.2014 г.), в которой получают растворимые формы двух субъединиц GP1, GP2, предшественника гликопротеина GPC и нуклеокапсидный белок (NP) с использованием векторов pMAL для экспрессии в E. Coli.

Недостатком данного изобретения является использование системы экспрессии в клетках E.coli. Известно, что у прокариот отсутствуют некоторые системы посттрансляционной модификации белков, например, гликозилирование, необходимое для получения корректной формы GPC LASV. Так же существует риск некорректного фолдинга молекул. Кроме того, в данном изобретении были получены две субъединицы GP1 и GP2, а не единый белок GPC LASV.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является создание плазмидной конструкции и нового рекомбинантного штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка, продуцирующего поверхностный гликопротеин GPC LASV в более иммунологически корректной форме, способный взаимодействовать с антителами иммунизированного животного.

Технический результат достигается созданием интегративного плазмидного вектора pVEAL3-Lassa-Trim, обеспечивающего экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GPC LASV в клетках млекопитающих, имеющего размер 5738 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 и содержащего в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы:

- 5'ITR_SB, имеющий координаты с 88 по 317 п.н.;

- Плечо интеграции 5'IFR, имеющий координаты с 318 по 368 п.н.;

- CMV enhancer, имеющий координаты с 369 по 733 п.н.;

- CmV promoter (координаты с 734 по 937 п.н.)

- Ген GPCL, имеющий координаты с 1021 по 2292 п.н. и кодирующий поверхностный гликопротеин вируса Ласса;

- Foldon, имеющий координаты с 2293 по 2373 п.н.;

- Последовательность 10his, имеющий координаты с 2374 по 2403 п.н. и являющийся полигистидиновым тэгом для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии;

- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющий координаты с 2425 по 2999 п.н.;

- BleoR - ген устойчивости к антибиотику блеомицину, имеющий координаты с 3004 по 3011 п.н.;

- PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты с 3012 по 3611 п.н.;

- T3 promoter, имеющий координаты с 3621 по 3628 п.н.;

- SV40 poly(A) signal, имеющий координаты с 3646 по 3767 п.н.;

- Плечо интеграции 3'IFR, имеющий координаты с 3788 по 3835 п.н.;

- 3'ITR_SB, имеющий координаты с 3836 по 4065 п.н.;

- tonB terminator, имеющий координаты с 4117 по 4148 п.н.;

- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты с 4252 по 5067 п.н.;

- Участок начала репликации Ori, имеющий координаты с 5130 по 5717 п.н.

Технический результат был достигнут созданием штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GPC-LASV, полученного путем трансфекции клеток экспрессионным вектором PVEAL3-Lassa-Trim по п. 1 и продуцирующего поверхностный гликопротеин GPC LASV.

Указанный технический результат достигается также тем, что созданный интегративный плазмидный вектор PVEAL3-Lassa-Trim позволяет получать в результате экспрессии гена GPC LASV, кодирующего поверхностный гликопротеин LASV, в клетках млекопитающих CHO.

Для разработки продуцента была выбрана клеточная линия СНО-К1, поскольку экспрессионная система позволяет получать наиболее корректную форму белка, обеспечивая все необходимые процессы посттрансляционной модификации. Для получения эффективной культуры-продуцента в заявленном изобретении проведен отбор наиболее продуктивных клонов. Это дополнительно увеличивает выход целевого продукта, поскольку поликлональная клеточная культура содержит клоны с разной способностью к продукции рекомбинантного белка. Описан способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-K1- GPC-LASV продуцента рекомбинантного поверхностного гликопротеина LASV, содержащего генетическую конструкцию (SEQIDNO:1), введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток проводили при помощи антибиотика Puromycin B.

Таким образом, заявляемая группа изобретений обеспечивает высокий выход рекомбинантного белка GPC LASV в иммунологически корректной форме, что является хорошей платформой для создания иммунобиологических препаратов и вакцин. Технические решения соответствуют критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Осуществление изобретения

Описание фигур

Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг. 1, 2 и таблица 1.

На фиг. 1 изображена физическая и генетическая карта универсального интегративного плазмидного вектора pVEAL3-Lassa-Trim.

На фиг. 2 представлены результаты иммуноферментного анализа взаимодействия рекомбинантного белка GPC-LASV с моноклональным антителом 37.7H против LASV.

Примечание:

37.7H - человеческое моноклональное антитело против LASV, ранее описанное в статье Robinson J.E., Hastie K.M., Cross R.W., et al. Most neutralizing human monoclonal antibodies target novel epitopes requiring both Lassa virus glycoprotein subunits // Nature communications. -2016. - V.7. - №11544, полученное в отделе биоинженерии.

iB20 - человеческое моноклональное антитело против SARS-CoV-2 (отрицательный контроль), описано в статье Kulemzin S.V., Sergeeva M.V., Baranov K.O., et al. VH3-53/66-Class RBD-Specific Human Monoclonal Antibody iB20 Displays Cross-Neutralizing Activity against Emerging SARS-CoV-2 Lineages // Journal of personalized medicine. - 2022. - V. 12. - № 6. - P. 895.

MR191 - человеческое моноклональное антитело против MARV, ранее описанное в статье King L.B., Fusco M.L., Flyak A.I., et al. The Marburgvirus-Neutralizing Human Monoclonal Antibody MR191 Targets a Conserved Site to Block Virus Receptor Binding // Cell host & microbe. - 2018. - V. 23. - №. 1. - P. 101-109, полученное в отделе биоинженерии (отрицательный контроль).

На фиг. 3 приведена нуклеотидная последовательность интегративного плазмидного вектора pVEAL3-Lassa-Trim, а на фиг. 4 - аминокислотная последовательность поверхностного гликопротеина GPC LASV.

В таблице 1 представлены последовательности синтезированных олигонуклеотидов, использованных для получения плазмиды pVEAL3-Lassa-Trim.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K. et al. Science. 1988, 239(4839):487-491; Sanger F. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74:5463-5467].

Пример 1. Конструирование интегративного плазмидного вектора PVEAL3-Lassa-Trim, обеспечивающего экспрессию поверхностного гликопротеина GPC LASV.

Для получения тримеризованного варианта GPC LASV взята нуклеотидная последовательность, кодирующая гликопротеин GPC LASV, из базы данных GenBank (AIT17266.1). Далее была проведена кодон - оптимизация под клеточную линию яичников китайского хомячка СНО-K1 в онлайн сервисе https://www.thermofisher.com для увеличения выхода целевого белка. Синтез праймеров (табл. 1) и нуклеотидной последовательности, кодирующей тример GPC LASV, был осуществлен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).

В состав вектора PVEAL3 была клонирована синтезированная последовательность, кодирующая тримеризованный вариант GPC LASV (фиг.1). Последовательности синтезированных праймеров, использованных для сборки интегративного плазмидного вектора PVEAL3-Lassa-Trim, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Последовательности синтезированных олигонуклеотидов, использованных для получения интегративного плазмидного вектора PVEAL3-Lassa-Trim Название Последовательность F-GPC 5’- aaaaaagctagCCATGGGCCAGATCGTGACATTCTTCCA -3’ R-GPC 5’-aaaaaaCACCATCATCACCATCACCACCACTAAGTCGAC -3’

С помощью ПЦР была амплифицирована нуклеотидная последовательность Lassa-Trim, кодирующая тримеризованный гликопротеин GPC LASV. ПЦР проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл, содержащая 2 мкг ДНК (плазмида pGH-Lassa-Trim), 10 пкМ каждого праймера (F-GPC и R-GPC) (таблица 1), 10 мкл 5х Q5 реакционного буфера, 10 мкл 5xQ5 High GC Enhancer, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 0.5 ед. Q5 High-Fidelity ДНК-полимеразы, реакцию осуществляли при следующих параметрах: 10с - 98°С (1 цикл), 10 с - 58°С, 70 с - 72°С (30 циклов). Готовый ПЦР-продукт был выделен и очищен из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Предварительно наработанную и очищенную плазмиду PVEAL3 и ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазами рестрикции AsuNHI и SalI. Реакцию гидролиза проводили в условиях, рекомендованных производителем. С целью очистки линеаризованного вектора, плазмидную ДНК наносили на 1%-й агарозный гель и выделяли из геля с использованием набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия). Реакцию лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакция проводилась при +4°С в течение ночи. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамм Neb Stable.

Первичную проверку на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с колонии. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл).

Положительные колонии, культивировали в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNAminikit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Первичную структуру экспрессионного вектора подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате был получен интегративный плазмидный вектор PVEAL3-Lassa-Trim, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 (фиг. 3) и обеспечивающий экспрессию белка тримеризованного поверхностного гликопротеина GPC LASV.

Секвенирование плазмидной ДНК положительных клонов в районе встройки позволило отобрать клоны с отсутствием дефектов встраиваемых генов (вставки, делеции, замены), после чего из отобранных клонов была наработана и выделена целевая плазмидная ДНК.

Пример 2. Получение штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GPC-LASV путем трансфекции клеток CHO-K1 интегративным плазмидным вектором PVEAL3-Lassa-Trim и наработка культуральной жидкости, содержащей тримеризованный поверхностный гликопротеин GPC LASV.

Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GPC-LASV, получен на основе клеточной линии яичников китайского хомячка СНО-K1 с использованием разработанной конструкции PVEAL3-Lassa-Trim. Суспензию клеток CHO-K1, растили в инкубаторе при 5% содержания CO₂, 80%-ной влажности температуре (37±1)°С во влажной атмосфере 5%СО2 и скорости вращения платформы 185 об/мин. При достижении плотности суспензии 5х10⁶ клеток/мл проводили трансфекцию клеток с помощью полиэтиленамина (PEI 25K™) в соответствии с инструкцией производителя. Трансфецировали клетки смесью плазмид PVEAL3-Lassa-Trim и pCMV(CAT)T7-SB100, взятых в соотношении 1:10. Через 48 часов после трансфекции добавляли селективный антибиотик пуромицин в концентрации 2 мкг/мл. Селекцию проводили в течение 12 суток с постепенным увеличением концентрации антибиотика с 2 до 10 мкг/мл. Полученный пул клеток был криоконсервирован, после чего было проведено клонирование с целью отбора индивидуальных клонов с высокой продукцией. Клонирование выполнялось методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах. Через 14 суток визуально отбирали лунки, содержащие единственный клон, для которых проводили отбор культуральной жидкости с целью оценки продуктивности клонов при помощи ИФА, из которых и получен заявляемый рекомбинантный штамм CHO-K1- GPC-LASV.

Характеристика рекомбинантного штамма CHO-K1- GPC-LASV.

Морфология: веретеновидные и эпителиоподобные клетки с круглыми ядрами, содержащими от 1 до 2 ядрышек.

Способ культивирования: суспензионный.

Среда для культивирования: 97% питательная среда HyCell CHO, 2% Glutamax, 1% Pluronic-F68.

Температура культивирования: 37°С.

Посевная концентрация: 1x10⁶ клеток в 1 мл.

Частота пассирования: 3-4 суток.

Условия криоконсервации: питательная среда DMEM/F-12 (1:1) - 50 %, сыворотка крови плодов коровы - 40 %, ДМСО - 10 %.

Режим замораживания: при температуре 4°С - 1 ч, минус 80°С - 12 ч, минус 196°С.

Условия хранения: в криопробирках в количестве 5 шт. хранится в жидком азоте при температуре минус 196°С.

Номер пассажа в жидком азоте: 3.

Жизнеспособность после криоконсервации: 85-90 %.

Штамм культуры-продуцента CHO-K1-GPC-LASV культивировали на роллерных установках и собирали культуральную жидкость, содержащую тримеризованный белок поверхностного гликопротеина GPC LASV, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, приведенную на фиг. 4.

Пример 3. Иммуноферментный анализ взаимодействия моноклонального тримеризованного GPC LASV с моноклональным антителом 37.7H против LASV

Для идентификации тримеризованного белка поверхностного гликопротеина GPC LASV использовали иммуноферментный анализ. В качестве антитела брали нейтрализующее моноклональное антитело 37.7H против LASV. Культуральную жидкость, содержащую тримеризованный GPC LASV разводили в соотношение 1:100 в растворе натрия углекислого кислого (pH 8,0) и вносили в лунки планшета для ИФА по 150 мкл. Антиген инкубировали при 4°С в течение 16 часов, а затем удалили из лунок путем встряхивания. Блокировка проходила при добавлении в лунки к сорбированным антигенам по 200 мкл блокирующего буфера (фосфатно-солевой буфер (ФСБ) + 1% BSA) и инкубации при 37°С в течении 2 часов. После удаления растворов четырехкратно промыли лунки промывочным буфером ФСБ-0,5% Tween20 (ФСБ-Т). Для проверки специфичности тримера использовали рекомбинантные человеческие моноклональное антитела 37.7H, iB20 (отрицательный контроль) и MR191 (отрицательный контроль). Описание антител приведено выше. Антитела разводили в блокирующем буфере до концентрации 4 мкг/мл и вносили в лунки по 150 мкл. Планшеты с растворами инкубировали 2 часа при 37°С. Затем отмывали лунки четырехкратно промывочным буфером и в лунки вносили по 150 конъюгата Goat anti-human IgG-HRP (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:30.000. Инкубировали 2 часа при 37°С и промыли лунки четырехкратно с ФСБ-Т. Для визуализации результатов в лунки вносили по 100 мкл 0,02% раствора хромогена ТМБ в цитрат-фотфатном буфере с перекисью водорода (БРС). После 15 мин инкубации при 37°С в лунки нанесли по 50 мкл 0,9М раствора серной кислоты в качестве стоп-реагента. Результаты регистрировали в планшетном ридере при длине волны 450 нм. Результаты иммуноферментного анализа подтверждают взаимодействие рекомбинантного белка GPC-LASV с моноклональным антителом 37.7H против LASV, которые представлены на фиг.2.

Таким образом, группа заявленных изобретений обеспечивает получение иммунологически корректной формы рекомбинантного белка тримеризованного поверхностного гликопротеина GPC LASV, который может быть использован как платформа для создания диагностикумов лихорадки Ласса, а также для решения лабораторных задач, таких как получение фаговых библиотек.

--->

Перечень последовательностей по стандарту ST-26 ВОИС

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2023-07-25"

softwareVersion="2.2.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Заявка

Ласса тример конечный вариант.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RU-PVEAL3-Lassa-Trim</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-30</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>RU-PVEAL3-Lassa-Trim</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RU-PVEAL3-Lassa-Trim</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-30</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>State Research Center of Virology and

Biotechnology VECTOR</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">PVEAL3-Lassa-Trim</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>5738</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5738</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>gene</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>

<1021..2292</INSDFeature_location>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaagaaaggcccacccgtgaaggtgagccagtgagttgattgcagtccagt

tacgctggagtctgaggctcgtcctgaatggatccctatacagttgaagtcggaagtttacatacactta

agttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttggca

agtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagattat

ttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttcgactcctct

gcagaatgcggcgatgtttcggtaaggggtccgctactagttattaatagtaatcaattacggggtcatt

agttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgccc

aacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccatt

gacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaag

tacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgg

gactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagt

acatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgg

gagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaa

atgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactg

cttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagccatgggccagatc

gtgacattcttccaagaggtgccccacgtgatcgaggaagtgatgaacatcgtcctgatcgccctgtcca

tcctggctgtgctgaagggcctgtacaacctggctacctgtggacttgtgggcctcgtgaccttcctgct

gctgtgcggcagatcctgtaccacctctctgtacaagggcgtgtacgagctgcagaccctggaactgaac

atggaaaccctgaacatgaccatgcctctgtcctgcaccaagaacaactcccaccactacatcatggtcg

gaaacgagacaggcctcgagctgaccctgaccaacaccagcctgatcaaccacaagttctgcaacctgag

cgacgcccacaagaagaacctgtacgatcacgccctgatgtccatcatctccaccttccacctgagcatc

cccaacttcaaccagtacgaggccatgtcctgcgacttcaacggcggcaagatctccgtgcagtacaatc

tgtcccactcctacgccgtggatgccgccaatcattgtggcaccgtggctaatggcgtgctgcagacatt

catgagaatggcctggggcggctcctatatcgccctggattctggatgtggcggctgggactgcatcatg

accagctaccagtacctgatcatccagaacaccacctgggaagatcactgccagttctcccggccttctc

ctatcggctatctgggcctgctgtctcagcggaccagagacatctacatctcccggcggagaagaggcac

cttcacctggacactgtccgactccgaaggcaaggatacccctggcggctactgtctgacccggtggatg

ctgattgaggccgagctgaagtgcttcggcaataccgctgtggccaagtgcaacgagaagcacgacgagg

aattctgcgacatgctgcggctgttcgatttcaacaagcaggccatccagcggctgaaggcccctgctca

gatgagcatccagctgattaacaaggccgtgaacgctctgatcaacgaccagctcatcatgaagaaccac

ctccgggacatcatgtgcatcccttactgcaactactccaagtactggtatctgaaccacaccaccaccg

gcagaaccagcctgcctagatgttggctggtgtccaacggctcctacctgaacgagacacacttctccga

cgacatcgagcagcaggccgacaacatgatcaccgagatgctgcagaaagagtacatggaacggcagggc

ggctacatccctgaggcccctagagatggccaggcctatgtgagaaaggatggcgagtgggtgctgctgt

ctacctttctgcatcaccaccatcatcaccatcaccaccactaagtcgaccgagcggttcccgcccctct

ccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgt

tattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgag

cattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagtt

cctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg

gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtg

ccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaacaaggggctg

aaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtg

tttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacga

tgataatatggccacaaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccc

agggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggacc

gccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggt

gtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtg

ttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaag

gcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgacca

ccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgccc

gccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccg

acgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgattcgcatatgg

gttaatgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtga

aaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaac

aagttcctcgacctctagctagagctactcgggaccccttaccgaaacatcgccgcattctgcagaggag

tcgagtgtatgtaaacttctgacccactgggaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattct

ctctactattattctgatatttcacattcttaaaataaagtggtgatcctaactgacctaagacagggaa

tttttactaggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgta

aacttccgacttcaactgtatagggatccgctcaatactgaccatttaaatcatacctgacctccatagc

agaaagtcaaaagcctccgaccggaggcttttgacttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccat

aatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaa

tgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttata

tgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagccc

gatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtca

ggctaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgc

atggttactcaccactgcgatcccagggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggt

gaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtcctt

ttaacggcgatcgcgtatttcgtctggctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttggtgcgag

tgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgcca

ttctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaat

taataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaa

ctgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgat

atgaataaattgcagtttcacttgatgctcgatgagtttttctaatgagggcccaaatgtaatcacctgg

ctcaccttcgggtgggcctttctgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatca

caaaaatcgatgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccct

ggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctccctt

cgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaa

gctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgag

tccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggt

atgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttgg

tatctgcgctctgctgaagccagttacctcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaacca

ccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaaga

tcctttgattttctac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>491</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..491</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MGQIVTFFQEVPHVIEEVMNIVLIALSILAVLKGLYNLATCGLVGLVTFLLL

CGRSCTTSLYKGVYELQTLELNMETLNMTMPLSCTKNNSHHYIMVGNETGLELTLTNTSLINHKFCNLSD

AHKKNLYDHALMSIISTFHLSIPNFNQYEAMSCDFNGGKISVQYNLSHSYAVDAANHCGTVANGVLQTFM

RMAWGGSYIALDSGRGGWDCIMTSYQYLIIQNTTWEDHCQFSRPSPIGYLGLLSQRTRDIYISRRLLGTF

TWTLSDSEGKDTPGGYCLTRWMLIEAELKCFGNTAVAKCNEKHDEEFCDMLRLFDFNKQAIQRLKAEAQM

SIQLINKAVNALINDQLIMKNHLRDIMGIPYCNYSKYWYLNHTTTGRTSLPRCWLVSNGSYLNETHFSDD

IEQQADNMITEMLQKEYMERQGKTPLGLVDLFVFSTSFYLISIFLHLVKIPTHRHIVGKSCPKPHRLNHM

GICSCGLYKQPGVPVKWKR</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан интегративный плазмидный вектор pVEAL3-Lassa-Trim, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GPC LASV в клетках млекопитающих, имеющий размер 5738 п.н. Также описаны рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GPC-LASV, продуцирующий рекомбинантный поверхностный гликопротеин GPC LASV и содержащий интегративный плазмидный вектор pVEAL3-Lassa-Trim и рекомбинантный белок GPC LASV, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GPC-LASV. Техническим результатом заявленного изобретения является создание плазмидной конструкции и нового рекомбинантного штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка, продуцирующего поверхностный гликопротеин GPC LASV в более иммунологически корректной форме, способный взаимодействовать с антителами иммунизированного животного. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Интегративный плазмидный вектор pVEAL3-Lassa-Trim, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GPC LASV в клетках млекопитающих, имеющий размер 5738 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и содержащего в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы:

- 5'ITR_SB, имеющий координаты с 88 по 317 п.н.;

- плечо интеграции 5'IFR, имеющий координаты с 318 по 368 п.н.;

- MV enhancer, имеющий координаты с 369 по 733 п.н.;

- CmV promoter (координаты с 734 по 937 п.н.);

- ген GPCL, имеющий координаты с 1021 по 2292 п.н. и кодирующий поверхностный гликопротеин вируса Ласса;

- Foldon, имеющий координаты с 2293 по 2373 п.н.;

- последовательность 10his, имеющий координаты с 2374 по 2403 п.н. и являющийся полигистидиновым тэгом для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии;

- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющий координаты с 2425 по 2999 п.н.;

- BleoR - ген устойчивости к антибиотику блеомицину, имеющий координаты с 3004 по 3011 п.н.;

- PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты с 3012 по 3611 п.н.;

- T3 promoter, имеющий координаты с 3621 по 3628 п.н.;

- SV40 poly(A) signal, имеющий координаты с 3646 по 3767 п.н.;

- плечо интеграции 3'IFR, имеющий координаты с 3788 по 3835 п.н.;

- 3'ITR_SB, имеющий координаты с 3836 по 4065 п.н.;

- tonB terminator, имеющий координаты с 4117 по 4148 п.н.;

- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты с 4252 по 5067 п.н.;

- участок начала репликации Ori, имеющий координаты с 5130 по 5717 п.н.

2. Рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GPC-LASV, продуцирующий рекомбинантный поверхностный гликопротеин GPC LASV и содержащий интегративный плазмидный вектор pVEAL3-Lassa-Trim по п. 1.

3. Рекомбинантный белок GPC LASV, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GPC-LASV по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и предназначенный для создания иммунобиологических препаратов.