Способ выявления вируса Guanarito методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23 Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров вируса Guanarito (GTOV).

GTOV - одноцепочечный РНК-вирус рода Mammarenavirus, принадлежащий к кладе В аренавирусов Нового Света наряду с вирусами Amapari, Machupo, Junin, Tacaribe и Sabia. В сентябре 1989 г. в муниципалитете Гуанарито штата Португеза Венесуэлы произошла вспышка тяжелой вирусной геморрагической лихорадки (ВГЛ), вызванная вирусом Guanarito, которая считается первой вспышкой GTOV-инфекции, зафиксированной в научной литературе.

Инфицирование человека в естественных условиях происходит вследствие контакта с инфицированными грызунами - хлопковыми хомяками {Sigmodon alstoni) и короткохвостыми камышовыми хомячками {Zygodontomys brevicauda). Последние служат естественным резервуаром возбудителя в природе, заболевание у них протекает в хронической и персистирующей формах. Из-за стойкой вирусемии элиминация вируса (с носовым секретом, семенной жидкостью, мочой, фекалиями) происходит непрерывно, что приводит к заражению воды, пищи, различных предметов окружающей среды. Мыши-вирусоносители инфицируют как особей своего вида, так и S. alstoni, однако горизонтальная передача вируса преобладает. Антитела к вирусу Guanarito обнаружены и у других видов мелких грызунов в регионе равнины Льянос центральной части Венесуэлы: черных {Rattus rattus), щетинистых (Proechimys guairae) и бурых рисовых хомячков. Однако популяции последних, скорее всего, служат тупиковыми хозяевами, и, следовательно, не имеют значения в распространении вируса. Вероятный путь заражения людей - вдыхание зерновой пыли, контаминированной экскрементами грызунов.

У людей длительность инкубационного периода составляет 6-12 суток. Клиническая картина характеризуется резким подъемом температуры тела -до 40°С и выше - на фоне общего недомогания. Первыми симптомами острой геморрагической лихорадки у заболевших служат головная боль, миалгия, артралгия, сыпь, признаки воспаления верхних дыхательных путей (кашель, сухость в горле), упадок психической деятельности. Клиническая картина ВГЛ неспецифична и вариабельна, что затрудняет постановку диагноза. Патогномоничные признаки в начальный период заболевания отсутствуют, что характерно и для других вирусных геморрагических лихорадок.

Помимо лихорадки могут наблюдаться тахипноэ, небольшая брадикардия, гипотензия (вплоть до циркуляторного шока), кровоизлияние под конъюнктиву, фарингит, лимфаденопатия. Возможен энцефалит, сопровождающийся делирием, эпилептическими припадками, признаками поражения мозжечка и комой. Геморрагические симптомы, если они возникают, развиваются позднее и включают петехиальные высыпания, пурпуру, кровоизлияние в слизистые оболочки и конъюнктиву, гематурию, рвоту с кровью и мелену. Как правило, страдают печень и почки пропорционально развитию поражения сердечно-сосудистой системы. Имеют место диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС-синдром) и тромбоцитопения.

В ходе прогрессирования заболевания появляются дополнительные симптомы: желудочно-кишечный дистресс, головокружение, головная боль, фотофобия, ретроорбитальная боль, тахикардия, петехии и кровоизлияние в конъюнктиву, глухота. Сочетание неврологических проявлений и геморрагического синдрома, как правило, приводит к гибели больных.

Вирус Guanarito, как и другие патогенные для человека аренавирусы, размножается в лимфоидной ткани, что приводит к длительной виремии. В ходе выполнения лабораторных исследований у больных выявляютсялейкопения, анемия, тромбоцитопения и повышенный уровень печеночных ферментов.

По последним данным, с сентября 1989 г. по декабрь 2006 г. в штате Португеза было зарегистрировано в общей сложности 618 случаев ВГЛ с летальностью 23,1%. Из-за плохой системы надзора и отсутствия эпидемиологических исследований в Венесуэле нет обновленных данных о количестве случаев с 2006 по 2021 год. Лечение при ВГЛ, как и при других аренавирусных геморрагических лихорадках, в основном направлено на устранение последствий интоксикации и тромбогеморрагического синдрома. Современная терапия при ВГЛ в основном поддерживающая, она преобладает в стратегии лечения ВГЛ. При лечении заболевших ВГЛ помимо общеукрепляющих средств используют такие противовирусные препараты широкого спектра действия, как рибавирин и фавипиравир. Последний препарат избирательно действует на РНК-зависимую РНК-полимеразу аренавирусов, поэтому особенно эффективен в отношении минус-РНК, для которой данный фермент является структурным белком вириона. Средства специфической профилактики ВГЛ отсутствуют.

Диагностируют вирус по наличию в биологических образцах (кровь и ее производные, мазок из носоглотки, мазок из ротоглотки, мокрота) вирусной РНК GTOV. Между тем, GTOV является возбудителем BSL-4, и лабораторные исследования, помимо выделения вирусной культуры, включают выявление антител с помощью иммуноферментного анализа и непрямого иммунофлуоресцентного анализа с использованием рекомбинантных вирусных наночастиц, эти методы более широко используются для серологического надзора, поскольку выявление инфекции таким способом требует достаточного времени для выработки антител и эти тесты можно проводить в лабораториях BSL-2, которые более доступны (doi: 10.3390/v4102097; DOI: 10.1002/jmv.21265).

Для обнаружения вируса на ранних стадиях заболевания разработана мультиплексная qRT-ПЦР в реальном времени (doi: 10.1371/journal.pone.0095635), однако мультиплексная ПЦР имеет существенные недостатки: в случае большого количества праймеров вероятность взаимодействия между ними увеличивается (образование димеров, шпилек и т.д.), что снижает эффективность мультиплексной ПЦР. Существует также qRT-PCR TaqMan для быстрого обнаружения филовирусов и ареновирусов (doi: 10.4269/ajtmh.2010.09-0636), в том числе GTOV, но использование универсальных праймеров для амплификации целевых фрагментов генома вирусов разных семейств содержит значительное количество точек дегенерации, что приводит к большой гетерогенности этих праймеров. А также использование метода ПЦР требует дорогостоящего оборудования, специальных лабораторных условий и квалифицированного персонала.

Целью создания настоящего изобретения является расширение арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий.

Технической задачей изобретения является разработка достоверного метода идентификации генетического материала вируса Guanarito в биологических образцах и других вирус содержащих пробах (культуральная вирус-содержащая жидкость, и т.д.

Поставленная задача решалась путем:

1) конструирования диагностического биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23, соответствующего консервативному участку фрагмента L сегмента вируса Guanarito, и флуоресцентно-меченного зонда;

2) оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения детекции.

Авторами предложен способ, согласно которому РНК вируса Guanarito анализируют с использованием метода основанного на применении дезоксирибозима 10-23 для целевых фрагментов РНК генома вируса Guanarito с использованием смеси олигонуклеотидов и соответствующегофлуоресцентно-меченного зонда, комплементарных участку L сегмента вируса Guanarito.

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора Axxin T16-ISO Isothermal Fluorescence Reader (Axxin, Australia). Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции контрольного образца, не содержащего РНК, причем отношение F1/F0, где F0 означает сигнал флуоресценции от контрольных образцов, a F1 означает сигнал флуоресценции от образцов, должно быть равно или превышать значение 1,5.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы флуоресцентный субстрат (Fsub), синтетическая короткая целевая РНК вируса Guanarito, пара олигонуклеотидов (Dz1 и Dz2 каждый состоит из участков связывания целевой РНК, флуоресцентного субстрата и половины последовательности каталитического участка дезоксирибозима 10-23).

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на ФИГ.1 представлена конструкция биосенсора, представляющего собой бинарную пробу, состоящую из двух независимых друг от друга нуклеотидов Dz1 (синия цепь) и Dz2 (зеленая цепь) при наличии целевой РНК (желтая цепь) в растворе происходит связывание РНК за счет комплиментарности, что приводит к сборке каталитического ядра. Затем это ядро расщепляет субстрат (Fsub) (лиловая цепь), который помечен флуорофором (желтая зввезда) и гасителем (темно-фиолетовый пятиугольник), что приводит к высвобождению флуорофора в раствор. А на ФИГ.2 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе образцов РНК вируса Guanarito. Темно-зеленая линия отображает уровень флуоресценции отрицательного контроля (К-), светло-зеленая -положительного (К+).

Биосенсор представляет собой бинарную пробу, состоящую из двух независимых друг от друга нуклеотидов Dz1 (синия цепь) и Dz2 (зеленая цепь) при наличии целевой РНК (желтая цепь) в растворе происходитсвязывание РНК за счет комплиментарности, что приводит к сборке каталитического ядра. Затем это ядро расщепляет субстрат (Fsub) (лиловая цепь), который помечен флуорофором (желтая зввезда) и гасителем (темно-фиолетовый пятиугольник), что приводит к высвобождению флуорофора в раствор.

Все последовательности вируса Guanarito доступные в GenBank (NCBI), были выровнены для идентификации консервативных сайтов с помощью BioEdit (https://www.bioedit.com/). В качестве мишени с помощью PLOTCON (http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/plotcon) был выбран фрагмент L сегмента длиной 157 нуклеотидов. Вторичная структура РНК может мешать формированию комплекса РНК-биосенсор, для предотвращения этого была предсказана вторичная структура в The Nucleic Acid Package (https://www.nupack.org/) и выбран более короткий участок-мишень с учетом вторичной структуры, которые также были проанализированы в NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/) на предмет уникальности. Последовательности олигонуклеотидов и флуоресцентно-меченого зонда представлены в Таблице 1.

Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных последовательностей биосенсора и флуоресцентно-меченого зонда проводился с использованием программного обеспечения Axxin T16-ISO Isothermal Fluorescence Reader (Axxin, Australia).

Для контроля качества детекции были введены положительные контрольные образцы К+, которые являются короткой синтетической РНК вируса Guanarito.

Оценку аналитической чувствительности способа производили на разведениях РНК-содержащего положительного контроля К+: определяли минимальное разведение, детектируемое как положительное в 100% случаев, с помощью биосенсора, состоящего из двух независимых олигонуклеотидов G_Dz1 и G_Dz2, и флуоресцентно-меченного зонда (Fsub). Определенная таким образом аналитическая чувствительность способа составила 5 нМ на реакцию или 6*10¹⁰ копий/мл.

Аналитическую специфичность оценивали при помощи тестирования образцов синтетической РНК из следующих вирусов: Hendra, Machupo, Nipah, Junin, Sabia и SARS-CoV (тяжелый острый респираторный синдром). Неспецифические реакции отсутствуют.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан и апробирован способ выявления РНК вируса Guanarito.

Техническим результатом является получение достоверной диагностики РНК вируса Guanarito с помощью биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23 и флуоресцентно-меченного зонда с учетом результатов в режиме реального времени, согласно изобретению.

Диагностика проводится следующим образом: для упрощения и стандартизации подготовки реактивов в тест-систему входят 5 смесей. Реактив RB3 представляет из себя 2х буферный раствор для расщепления, содержащий 200 mM HEPES+600 mM КС1, 7.5 рН. Реактив СА представляет из себя 1 М CaCl₂ раствор. Реактив Dz_G содержит смесь флуоресцентно-меченого зонда (Fsub), G_Dz1 и G_Dz2 каждый в концентрации 5 мкМ. К+ представляет собой синтетическую РНК содержащую специфическую последовательность нуклеотидов РНК в концентрации 10 мкМ, детектируемую биосенсором. К- представляет собой ультрачисую стерильную воду. Реактивы Dz_G, К+ и К- хранятся притемпературе -20°С, реактивы RB3 и СА хранятся при +4°С в течении 3 месяцев.

Для постановки реакции в реальном времени отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл, соответствующее числу исследуемых проб, а также две пробирки для положительных и отрицательных контролен. Далее в каждую пробирку вносится по 25 мкл реактива RB3, 3,75 мкл СА, 3 мкл Dz_G, 10 мкл образца и 8,25 мкл ультрачистой воды. Готовят 2 контрольные реакции. Для этого в пробирку для положительного контроля вносят 10 мкл К+, в пробирку для отрицательного контроля вносят 10 мкл К-. Конечный объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Пробирки переносят в программируемый изотермический флюориметр Axxin T16-ISO Isothermal Fluorescence Reader (Axxin, Australia) с функцией детекции флуоресценции в режиме «реального времени» с наличием 3 каналов детекции флуоресценции (FAM/Green, HEX/Yellow и ROX/Red).

Детекцию флуоресцентного сигнала производят при 37°С по каналу FAM (Green). Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах по детектируемым каналам. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции образцом линии разметки прибора равной 1000 а.u. Результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца пересекает пороговую линию(1000 а.u.) и/или превышает значение отрицательного контроля в два раза.

Таким образом, заявляемый метод позволяет достоверно выявлять РНК вируса Guanarito.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Способ выявления вируса Guanarito методом основанном на

применении дезоксирибозима 10-23.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-07">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference></ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Saint-Petersburg Pasteur

Institute</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Кириченко Анастасия

Дмитриевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Kirichenko Anastasiia

Dmitrievna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления вируса Guanarito

методом основанном на применении дезоксирибозима

10-23</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">Method for detecting Guanarito

virus by deoxyribozyme 10-23</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q27">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaatgcctccttctgataagacagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>12..13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>РНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>14..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein (6-FAM)

[1-(3-Fluoranthenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione] at

5`-end.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>6-Карбоксифлуоресцеин (6-FAM)

[1-(3-Флуорантенил)-1H-пиррол-2,5-дион] на

5`-конце.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Non-fluorescent Black Hole Quencher 1

(2-[N-(2-hydroxyethyl)-4-[[2-methoxy-5-methyl-4-[(4-methyl-2-nitrophen

yl)diazenyl]phenyl]diazenyl]anilino]ethanol) at

3`-end.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Не флуоресцентный тушитель Black

Hole Quencher 1

(2-[N-(2-гидроксиэтил)-4-[[2-метокси-5-метил-4-[(4-метил-2-нитрофенил)

диазенил]фенил]диазенил]анилино]этанол) на

3`-конце.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggtttcctcgtccctgggca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q37">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA The region complementary to the

fluorescent substrate</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Область, комплиментарная

флуоресцентному субстрату</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>10..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q41">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA Half of the catalytic

core</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Участок соответствующий

половине дезоксирибозима 10-23</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>19..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RNA The region complementary to the

target RNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>РНК Участок комплиментарный целевой

РНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgcccagggaggctagctaaggaggca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q45">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RNA The region complementary to the

target RNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>РНК Участок комплиментарный целевой

РНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>10..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA Half of the catalytic

core</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Участок соответствующий

половине дезоксирибозима 10-23</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>17..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q47">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA The region complementary to the

fluorescent substrate</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Область, комплиментарная

флуоресцентному субстрату</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcttatcagacaacgagaggaaacctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ выявления вируса Guanarito методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23. Проводят экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома Guanarito вируса с использованием олигонуклеотидных последовательностей биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23 и флуоресцентно-меченого зонда, комплементарных специфическому фрагменту L сегмента вируса Guanarito. Способ позволяет осуществить достоверную диагностику РНК вируса Guanarito. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ выявления вируса Guanarito методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23, включающий экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома Guanarito вируса с использованием олигонуклеотидных последовательностей биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23 и флуоресцентно-меченого зонда, комплементарных специфическому фрагменту L сегмента вируса Guanarito

G_Dz1 TGCCCAGGGAGGCTAGCTaaggaggca

G_Dz2 ucuuaucagACAACGAGAGGAAACCTT,

а в качестве флуоресцентно-меченого зонда -

Fsub AAG GTT(FAM) ТСС TCg uCC CTG GGC A(BHQ1).