Способ выявления вируса Mammarenavirus machupoense методом DETECTR с изотермической амплификацией Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров вируса Mammarenavirus machupoense (MACV).

РНК-содержащий вирус Mammarenavirus machupoense принадлежит семейству Arenaviridae, роду Mammarenavirus, является зоонозом, вызывающим у человека Боливийскую геморрагическую лихорадку (БГЛ). Естественными носителями данного вируса являются грызуны Calomys callosus из семейства Cricetidae, распространенные в таких странах Южной Америки, как Боливия, Аргентина, Бразилия и Парагвай. Однако к настоящему времени вирус MACV в С.callosus был обнаружен только в Боливии в провинциях Маморе, Итенес и Якума из департамента Бени и в провинции Серкадо департамента Кочабамба.

Исследования на С.callosus в условиях лабораторного инфицирования показали, что при заражении новорожденных грызунов, иммунный ответ и видимые признаки заболевания не развиваются. При заражении взрослых особей возможно развитие иммунного ответа с выработкой нейтрализующих антител с последующим уменьшением количества выделяющегося вируса либо отсутствие нейтрализующих антител с развитием анемии и уменьшением фертильности. Патологического влияния на популяцию С.callosus данный вирус не оказывает. При асимптоматическом протекании заболевания у С.callosus примерно в 35-50% случаях инфицирования грызунов развивается виремия и вирус обнаруживается в слюне, моче и фекалиях.

Лабораторные исследования показали, что данный вирус способен поражать нечеловекообразных обезьян: Saquinus geoffroyi, Масаса mulatto, Масаса fascicularis, Cercopithecus aethiops, вызывая неврологические и геморрагические симптомы. В случае заражения MACV взрослых особей таких животных, как лошади, свиньи, кошки, кролики, морские свинки, хомяки, крысы, мыши дикого типа, наблюдается выработка нейтрализующих антител без развития заболевания.

Передача вируса Mammarenavirus machupoense от С.callosus к человеку происходит через вдыхание аэрозолей от экскрементов или секретов инфицированных животных, потребление зараженных вирусом пищевых продуктов или непосредственном контакте слизистой оболочки с зараженным материалом. Существуют также подтвержденные случаи внутрибольничного заражения от человека к человеку членов семьи больных БГЛ. Основной группой риска заражения MACV являются фермеры, работающие на полях в обозначенных провинциях Боливии. Кроме того сообщается, что С.callosus могут появляться в домах и сосуществовать рядом с домашней мышью Mus musculus.

Первые вспышки заболеваний БГЛ в Боливии в 1959-1964 годах связывают с увеличением популяции грызунов в данном районе и с их миграцией. Число заболевших в тот период составило около тысячи, из которых в 25% случаев была задокументирована смерть пациентов вследствие развития геморрагических и неврологических симптомов. В период с 1965 по 2005 зафиксировано 55 случаев заражения людей MACV, из которых 18 оказались летальными. Резкий спад заболеваемости БГЛ связывают с усилением мер контроля численности грызунов в фермерских регионах. С 2005 года наблюдается рост заболеваемости БГЛ в департаменте Бени (в 2005-2021 годах 331 случай).Это говорит либо об улучшении качества диагностики заболевания, либо об увеличении числа заражений, что может быть вызвано ростом населения и расширением посевных площадей. Кроме того расширение областей транспортировки зерна, а также наращивание экспорта может повысить риск того, что MACV покинет свой эпидемиологический регион и станет международной угрозой.

Инкубационный период БГЛ составляет 3-16 дней. Симптомами продромального периода, который длится 1-5 дней, являются недомогания, лихорадка, тошнота, головная боль, обезвоживание, кашель, анорексия, миалгия. Лабораторные данные клинических образцов на данном этапе включают лейкопению, тромбоцитопению и протеинурию. После этого примерно у трети пациентов в течение недели после продромального периода развиваются тяжелые неврологические и геморрагические симптомы: гипотермия, гипотония, гиперемия головы и туловища, петехии, кровоточивость слизистых оболочек, носовое кровотечение, кровь в рвоте и стуле, мелена, метроррагия, делирий, энцефалопатия, судороги, тремор, кома. Смертность от БГЛ во время вспышек была оценена в 25-33%. Период выздоровления может занимать до 8 недель и включать в себя состояние общей слабости, выпадение волос, учащенный пульс, головокружение. Причина возникновения неврологических симптомов до сих пор не ясна.

На данный момент не существует вакцины против MACV. Исследования с вакциной Candid#1 против схожего вируса Mammarenavirus juninense, вызывающего Аргентинскую геморрагическую лихорадку, были проведены только на модельных нечеловекообразных приматах и результаты не могут быть достоверно перенесены на людей. Лечение на данный момент симптоматическое. Применение противовирусного препарата рибавирина, которое показало значительные успехи в лечении на модели мышей с нокаутированным геном STAT-1, оказалось недостаточно исследованным и клинически неподтвержденным в случае людей. Также в регионах Боливии данный препарат доступен в очень ограниченных количествах в виду его стоимости и необходимости обеспечения условий транспортировки и хранения.

Диагностика БГЛ обычно осуществляется клинически и требует подтверждения лабораторными тестами. Симптоматически БГЛ сложно отличить от схожих заболеваний, таких как малярия, лихорадка денге, желтая лихорадка, лептоспироз и геморрагические лихорадки, вызванные другими вирусами.

Идентификация вируса MACV возможна на поздних стадиях продромального периода методом иммуноферментного анализа (ИФА) на IgM и IgG (https://doi.org/10.3390/v4102097). Недостатком данного метода является сам принцип работы метода, основанного на выявлении иммунной реакции организма на возбудитель заболевания, а не самого возбудителя (Основы иммуноанализа: учебное пособие / Н.Е. Максимова, Н.Н. Мочульская, В.В. Емельянов; под общ. ред. Н.Н. Мочульской; Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, Уральский федеральный университет. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2021. - 148 с.: ил. - Библиогр.: с. 147. - 30 экз. - ISBN 978-5-7996-3295-3).

Кроме ИФА для обнаружения генетического материала вируса применяют анализы на основе ПНР с обратной транскрипцией. Известным недостатком данного метода анализа является потребность в специальном оборудовании, доступного только в крупных больницах и лабораториях Боливии (https://doi.org/10.1016/j.coviro.2014.02.007, https://doi.org/10.3201/eid1509.090017). В отчете ООН за 2020 год о мерах против COVID-19 сообщается о наличии только 3х соответствующих ПЦР-лабораторий на территории Боливии (https://www.undp.org/sites/g/files/zskgke326/files/migration/latinamerica/e6065d23ef0241a95e7a6ab394d68fb8446c7c53eecb25280f6d005e5b8aeac2.pdf). Данный недостаток значительно усложняет диагностику и делает невозможным более масштабные эпидемиологические исследования.

Целью создания настоящего изобретения является расширение арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий.

Технической задачей изобретения является разработка изотермического способа идентификации генетического материала вируса Mammarenavirus machupoense в биологических образцах и других вирус содержащих пробах.

Поставленная задача решалась следующим путем:

1) конструирование диагностических праймеров, гидовой РНК и флуоресцентно-меченного зонда на консервативный участок гена L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса;

2) конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК и MS2-фага, несущих специфический участок ДНК- и РНК-матрицы;

3) составление и оптимизация компонентов реакционной смеси и условий проведения анализа для совмещенной системы изотермической амплификации с обратной транскрипцией RT-RPA и системы детекции на основе платформы DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) с использованием Lba Cas12a (далее Cas12a).

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на ФИГ. 1 представлены кривые флуоресценции, полученные в программе прибора CFX96 Touch (Bio-Rad, США) для случаев образцов с разведением РНК К+ (А) и РНК ПКО (Б) при применении метода DETECTR, совмещенного в одной пробирке с изотермической рекомбиназной полимеразной амплификацией и обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров, гидовой РНК и флуоресцентного зонда. Отрицательные контрольные образцы, не содержащие РНК вируса MACV, изображены красным цветом. В них нет существенного роста флуоресцентного сигнала. Образцы, содержащие К+ и ПКО, в состав которых входит вставка последовательности фрагмента генома вируса М. machupoense, изображены оранжевым цветом, их десяти- и стократные разбавления - зеленым и голубым цветом соответственно. В случаях более концентрированных образцов наблюдается значительный рост сигнала. Конечная точка значения флуоресценции на 40 минуте анализа превышает значение отрицательного контроля. При аппроксимации кривых флуоресценции линейными функциями, значение их коэффициента наклона больше, чем для случая отрицательного наклона. Поэтому результаты анализа образцов, содержащих РНК К+ и ПКО, имеющих в составе вставку MACV, интерпретируются как положительные. Форма кривой флуоресценции зависит от концентрации РНК Mammarenavirus machupoense в образце, ее характерный вид - возрастающая зависимость значений флуоресцентного сигнала от времени, имеющая или не имеющая линейность по времени и достигающая или не достигающая насыщения по мере прохождения анализа.

Таким образом, техническим результатом является получение достоверной диагностики наличия РНК вируса Mammarenavirus machupoense с помощью метода DETECTR на основе Lba Cas12a, совмещенного с изотермической амплификацией и обратной транскрипцией в одной пробирке.

Данный метод основан на определении наличия РНК вируса Mammarenavirus machupoense, выделенной из биологических образцов, по флуоресцентному сигналу при помощи реакции рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров, совмещенной в одной пробирке с системой детекции на основе нуклеазы Cas12a, направляемой специфической гидовой РНК, частично комплементарной участку гена L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы данного вируса. Результатом применения данного метода является изменение зависимости флуоресцентного сигнала от времени. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, способного считывать флуоресцентный сигнал от красителя FAM в изотермических условиях при +40°С в режиме «реального времени». Примером такого прибора является амплификатор CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК Mammarenavirus machupoense. Причем результат считается положительным, если уровень флуоресцентного сигнала и угол наклона кривой флуоресценции в пробе выше, чем в отрицательных контрольных образцах.

Преимуществом представленного способа обнаружения РНК вируса Mammarenavirus machupoense методом DETECTR с изотермической амплификацией над ПЦР с обратной транскрипцией является отсутствие необходимости в специальном оборудовании - термоциклерах или амплификаторах "реального времени", поскольку все реакции, в том числе амплификация, протекают при одной температуре +40°С.

Принцип работы метода DETECTR заключается в следующем. В основе диагностической платформы DETECTR лежит способность фермента Cas12a к коллатеральной нуклеазной активности. Она проявляется в том случае, когда комплекс Cas12a с гидовой РНК специфически распознает и взаимодействует с мишенью - дцДНК, и после активации нуклеазной активности становится способным расщеплять любые одноцепочечные ДНК. Таким образом, если в качестве одноцепочечных ДНК использовать ДНК-зонды, меченные с одного конца флуорофором (FAM) и с другой стороны гасителем (BHQ1), то при их расщеплении происходит высвобождение флуорофора от гасителя и появление флуоресцентного сигнала. Так получается система, способная реагировать на наличие в растворе дцДНК последовательности-мишени возрастанием флуоресцентного сигнала от расщепленных зондов. Поскольку Mammarenavirus machupoense является РНК-содержащим вирусом, для получения кДНК была использована реакция обратной транскрипции. Для амплификации кДНК и получения дцДНК последовательности-мишени в детектируемом количестве использована изотермическая рекомбиназная полимеразная амплификация.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы пара специфических олигонуклеотидных праймеров, специфическая гидовая РНК и неспецифический зонд для флуоресцентной детекции продуктов амплификации при помощи Cas12a. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) на основе анализа всех последовательностей был выбран наиболее уникальный и консервативный участок генома вируса Mammarenavirus machupoense - фрагмент гена, кодирующего L-сегмент РНК-зависимой РНК-полимеразы, длиной 136 пар нуклеотидов. Подбор олигонуклеотидных праймеров проводился согласно рекомендациям TwistAmp® DNA Amplification Kits, Assay Design Manual и анализировался с использованием программного обеспечения Multiple Primer Analyzer (Thermo Fisher Scientific) и SnapGene. Для подбора специфической гидовой РНК для Lba Cas12a на выбранную мишень использовался инструмент CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/sequence/).

Последовательности олигонуклеотидных праймеров, гидовой РНК и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1.

Для контроля качества прохождения диагностики в состав методики были введены положительные контрольные образцы К+ и ПКО. Матрицу для создания рекомбинантных положительных контрольных образцов получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ГЩР в один шаг. Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор рЕТ под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм Turbo, New England BioLabs, США). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и гидовой РНК. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500x1 (Applied Biosystems, США).

Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца К+, который представляет собой транскрибированную РНК, содержащую вставку выбранного участка L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Mammarenavirus machupoense. Также плазмиды использовались для получения рекомбинантного содержащего РНК положительного контрольного образца (ПКО) с защитной белковой оболочкой MS2-фага.

Реализация метода DETECTR с изотермической амплификацией происходила следующим образом. Для одной реакции на 25 мкл составляется 14 мкл смеси для RT-RPA и 10 мкл смеси DETECTR. Смесь RT-RPA составляют с использованием реагентов из набора TwistAmp® Liquid Basic (TwistDx™, UK):no 0,72 мкл каждого праймера RPA MacV3_1F и RPA MacV3_4R (ДНК-Синтез, Россия) в концентрации 10 мкМ, 7,5 мкл 2х Reaction Buffer (TwistDx™, UK), 0,675 мкл dNTPs в концентрации 10 мМ каждого (New England Biolabs, США), 1,5 мкл 10х Basic E-mix (TwistDx™, UK), 0,3 мкл обратной транскриптазы M-MuLV в концентрации 200,000 U/ml (New England Biolabs, США), 0,75 мкл 20x Core Reaction Mix (TwistDx™, UK), 0,75 мкл 280mM MgOAc (TwistDx™, UK), 1,085 мкл ультрачистой воды Milli-Q. Для получения смеси DETECTR смешивают по 2,5 мкл 1 мкМ EnGen Lba Cas12a (Cpf1) (New England Biolabs, США), 1 мкМ gRNA MacV3_1 (ГенТерра, Россия), 10х NEBuffer™ r2.1 (New England Biolabs, США), 10 мкМ флуоресцентно-меченный зонд FB-short-Cas12 (ГенТерра, Россия).

Анализ происходит следующим образом: в оптически прозрачную пробирку объемом 200 мкл вносят 14 мкл смеси RT-RPA и каплю опускают на дно пробирки. Затем 10 мкл смеси DETECTR наносят на внутреннюю поверхность крышки. В смесь RT-RPA добавляется 1 мкл РНК, пипетируется и пробирка аккуратно закрывается. Закрытые пробы ставятся в термостат на +40°С на 30 минут. После прохождения изотермической амплификации с обратной транскрипцией пробирки откручиваются на центрифуге микроспин (BioSan FV-2400) для сбрасывания с крышки смеси DETECTR. Общая реакционная смесь перемешивается на вортексе с осаждением капель. После этого пробы переносятся в прибор для регистрации флуоресцентного сигнала. На амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США) или приборе с аналогичными возможностями выставляется программа анализа DETECTR (Таблица 2) со считыванием сигнала от флуоресцентного красителя FAM через каждые 60 секунд в течение 40 минут при постоянной температуре +40°С.

Тестирование метода DETECTR с изотермической амплификацией в одной пробирке проведено на РНК К+ и ПКО. Для получения РНК К+ использовался набор для транскрипции Т7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System (Promega, США). Продукты транскрипции очищены при помощи AMPure ХР Bead-Based Reagent (Beckman Coulter, США). Концентрация РНК К+ определена при помощи Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, США) и она разбавлена в РНК-буфере (из комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (АмплиСенс®, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия)) до рабочей концентрации 1*10⁴ копий/мкл, что соответствует 1*10⁷ копий/мл или ≈16,6 фМ.

Кроме того система протестирована на РНК, экстрагированной из ПКО с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот «Рибо-Преп» (АмплиСенс®, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия). Для полученного продукта производили определение концентрации методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) (BioRad, США).

Оценку предела обнаружения производили на разведениях К+ и ПКО и определяли как минимальную концентрацию РНК, содержащую вставку вируса MACV и детектируемую данным методом как положительный результат в 100% случаев. Лимит детекции составил 10 копий/мкл РНК К+, содержащей вставку вируса Mammarenavirus machupoense, и 4,4*10⁴ копий/мкл РНК ПКО, выделенной из фаговых частиц, содержащих аналогичную вставку вируса.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Последовательности_Способ выявления вируса Mammarenavirus

machupoense методом DETECTR с изотермической амплификацией.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-12-14">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>000000</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-14</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>000000</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Department of Epidemiology, Pasteur Institute,

Federal Service on Consumers&apos; Rights Protection and Human

Well-Being Surveillance</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Капитонова Марина

Анатольевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Kapitonova Marina

Anatol&apos;evna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления вируса

Mammarenavirus machupoense методом DETECTR с изотермической

амплификацией</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagattctaacaccctcgaagttagagacaac</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>33</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaattgactgactttgccttaatggttaagaat</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>44</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taatttctactaagtgtagatcagagctatgtttgtggaggata</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>5</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein (6-FAM)

[1-(3-Fluoranthenyl)-1H-pyrrole-2 5-dione] at

5`-end</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>6-Карбоксифлуоресцеин (6-FAM)

[1-(3-Флуорантенил)-1H-пиррол-2,5-дион] на 5`-

конце</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&gt;5</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Non-fluorescent Black Hole Quencher 1

(2-[N-(2-hydroxyethyl)-4-[[2-methoxy-5-methyl-4-[(4-methyl-2-

nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]anilino]ethanol) at

3`-end</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Не флуоресцентный тушитель Black

Hole Quencher 1

(2-[N-(2-гидроксиэтил)-4-[[2-метокси-5-метил-4-[(4-метил-2-

нитрофенил)диазенил]фенил]диазенил]анилино]этанол) на

3`-конце</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ выявления вируса Mammarenavirus machupoense при помощи метода DETECTR, включающий экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома вируса. Далее проводят изотермическую рекомбиназную полимеразную амплификацию с обратной транскрипцией, совмещенную в одной пробирке с флуоресцентной детекцией, посредством предварительного пространственного разделения реакционных смесей для амплификации нуклеиновых кислот и флуоресцентной детекции DETECTR по пробирке с последующим их перемешиванием. Технический результат заключается в разработке изотермического способа идентификации генетического материала вируса Mammarenavirus machupoense в биологических образцах и других вируссодержащих пробах. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ выявления вируса Mammarenavirus machupoense при помощи метода DETECTR, включающий экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома вируса, отличающийся тем, что дополнительно проводят изотермическую рекомбиназную полимеразную амплификацию с обратной транскрипцией, совмещенную в одной пробирке с флуоресцентной детекцией, посредством предварительного пространственного разделения реакционных смесей для амплификации нуклеиновых кислот и флуоресцентной детекции DETECTR по пробирке с последующим их перемешиванием, с использованием нуклеазы LbaCas12a, специфических праймеров

RPA MacV3_1F 5'-GAGATTCTAACACCCTCGAAGTTAGAGACAAC-3',

RPA MacV3_4R 5'-GAATTGACTGACTTTGCCTTAATGGTTAAGAAT-3',

гидовой РНК

gRNA MacV3_1 5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAGAGCUAUGUU-UGUGGAGGAUA-3'

и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда

FB-short-Cas12 5'-FAM-TTATT-BHQ1-3',

где результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК Mammarenavirus machupoense, причем результат считается положительным, если уровень флуоресцентного сигнала и угол наклона кривой флуоресценции в пробе выше, чем в отрицательных контрольных образцах.