Способ выявления вируса Nipah методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23 Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 C12Q1/6888 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров вируса Nipah (NiV).

Вирус Nipah - это зоонозный вирус, животным-хозяином NiV является плодовая летучая мышь (род Pteropus), также известная как летучая лисица, которая также является хозяином вируса Hendra рода Henipavirus. Передача вируса Nipah происходит при употреблении зараженных вирусом пищевых продуктов и при контакте с инфицированными животными или биологическими жидкостями инфицированного человека. Факторы риска включают непосредственную близость, а именно прикосновение, кормление или посещение инфицированного вирусом человека, что способствует контакту с капельной инфекцией, вызываемой вирусом Nipah. С данным вирусом не связаны какие-либо значительные патологические изменения в популяции летучих мышей.

Вирус Nipah демонстрирует очень широкий видовой тропизм. Помимо нескольких видов летучих мышей, NiV естественным образом заражает свиней, лошадей, собак, кошек и людей. Также было показано, что NiV экспериментально заражает морских свинок, хомяков, хорьков, беличьих обезьян и африканских зеленых мартышек. Этот широкий спектр видового тропизма частично обусловлен тем фактом, что NiV использует молекулы ephrinB2/B3 в качестве своих входных рецепторов, которые высоко консервативны среди всех млекопитающих. Вирус Nipah отличается высокой контагиозностью среди свиней. Свиньи заразны во время инкубационного периода, который длится от 4 до 14 дней. У инфицированных свиней симптомы могут не появляться, но у некоторых из них развиваются острое лихорадочное заболевание, затрудненное дыхание и неврологические симптомы, такие как дрожь, подергивание и мышечные спазмы. В целом, смертность среди свиней, за исключением молодых особей, является низкой. Эти симптомы не отличаются значительным образом от симптомов других респираторных и неврологических болезней свиней, что затрудняет диагностику и эпидемиологический контроль.

Однако у людей инфекция может протекать в разных формах - от бессимптомной инфекции до острой респираторной инфекции (легкой или тяжелой) и до смертельного энцефалита. Изучение клинических данных и результатов вскрытия 32 случаев инфекции NiV во время первоначальной вспышки в Малайзии и Сингапуре в 1998-1999 гг.показало, что среднее время от начала лихорадки до госпитализации составляло 3,3 дня, а среднее время от начала лихорадки до смерти - всего лишь 9,5 дней. Клинические симптомы этой вспышки были в основном локализованы в центральной нервной системе (ЦНС) и включали сонливость, головную боль и некоторую степень энцефалопатии. Наиболее частыми патологическими признаками были гистопатологические изменения сосудов многих органов с признаками васкулита мелких сосудов. Почти во всех случаях в паренхиме головного мозга наблюдались некротические бляшки, а также единичные синцитиальные или многоядерные гигантские эндотелиальные клетки.

Считается, что инкубационный период (период после инфицирования до развития симптомов) длится 4-14 дней. Вместе с тем, сообщалось об инкубационном периоде, составляющем 45 дней. Большинство людей, выживших после острого энцефалита, полностью восстанавливаются, но среди них также регистрировались долговременные неврологические последствия. Примерно 20% пациентов страдают от остаточных неврологических последствий, таких как припадочные расстройства и изменения личности. У небольшого числа выздоровевших людей впоследствии бывают рецидивы или позднее развивается энцефалит.

Коэффициент летальности оценивается в пределах от 40% до 70% в задокументированных вспышках с 1998 по 2018 годы; в условиях разных вспышек болезни этот показатель может варьироваться в зависимости от местных возможностей для проведения эпиднадзора и клинического ведения пациентов. Вакцины и препараты против инфекции отсутствуют. Лечение симптоматическое.

На момент появления симптомов диагноз инфекции вируса Nipah часто не предполагается, поскольку она не имеет специфических первых признаков и симптомов. Это может затруднять точную диагностику и препятствовать выявлению вспышки болезни и принятию эффективных и своевременных мер инфекционного контроля и реагирования. Ввиду того, что вирус Nipah является высококонтагиозным, он инфицирует большое число животных и приводит к тяжелым заболеваниям и смерти людей, его диагностика является актуальной проблемой.

Диагностируют вирус по наличию в биологических образцах (кровь и ее производные, мазок из носоглотки, мазок из ротоглотки, мокрота) вирусной РНК методом ПЦР (https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/Nipah-virus). Метод диагностики предусматривает экстракцию РНК из биологических образцов, с последующим проведением двухстадийной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов РНК вируса Nipah. Данный метод является довольно дорогостоящим и требует стационарного оборудования и высококвалифицированных кадров для его проведения.

Целью создания настоящего изобретения является расширение арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий.

Технической задачей изобретения является разработка высокочувствительного способа идентификации генетического материала вируса Nipah в биологических образцах и других вирус содержащих пробах (культуральная вирус содержащая жидкость, и т.д).

Поставленная задача решалась путем: 1) конструирования диагностического биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23 и флуоресцентно-меченного зонда, соответствующих консервативным участкам гена G; 2) оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения детекции.

Авторами предложен способ, согласно которому РНК вируса Nipah анализируют с использованием метода основанного на применении дезоксирибозима 10-23 для целевых фрагментов РНК генома вируса Nipah с использованием смеси олигонуклеотидов и соответствующего флуоресцентно-меченного зонда, комплементарных участку гена белка G вируса Nipah.

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора Axxin T16-ISO Isothermal Fluorescence Reader (Axxin, Australia). Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции контрольного образца, не содержащего РНК, причем отношение F1/F0, где F0 означает сигнал флуоресценции от контрольных образцов, a F1 означает сигнал флуоресценции от образцов, должно быть равно или превышать значение 1,5.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы флуоресцентный субстрат (Fsub), синтетическая короткая целевая РНК вируса Nipah, пара олигонуклеотидов (Dz1 и Dz2 каждый состоит из участков связывания целевой РНК, флуоресцентного субстрата и половины последовательности каталитического участка дезоксирибозима 10-23), и дополнительные олигонуклеотиды, которые используются в качестве платформы для прикрепления одного из плеч. Конструкция биосенсора поясняется чертежом ФИГ. 1. Так цепь Т1 действует как платформа или «ядро», нити Т2 и ТЗ комплементарны ядру Т1, но в то же время цепь Т2 соединена с цепью Dz_1 через линкер из гексаэтиленгликоля. Цепь Dz_2 представляет собой свободный олигонуклеотид, который не взаимодействует с Т3, чтобы исключить возможность сборки каталитического ядра дезоксирибозима 10-23 в отсутствие РНК-мишени.

Все последовательности вируса Nipah доступные в GenBank (NCBI), были выровнены для идентификации консервативных сайтов с помощью BioEdit (https://www.bioedit.com/). В качестве мишени для амплификации с помощью PLOTCON (http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/plotcon) был выбран фрагмент гена G длиной 169 нуклеотидов. Вторичная структура РНК может мешать формированию комплекса РНК-биосенсор, для предотвращения этого была предсказана вторичная структура в The Nucleic Acid Package (https://www.nupack.org/) и выбран более короткий участок-мишень с учетом вторичной структуры, которые также были проанализированы в NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) на предмет уникальности. Последовательности олигонуклеотидов и флуоресцентно-меченого зонда представлены в Таблице 1 и Таблице 2.

Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных последовательностей биосенсора и флуоресцентно-меченого зонда проводился с использованием программного обеспечения Axxin T16-ISO Isothermal Fluorescence Reader (Axxin, Australia).

Для контроля качества детекции были введены положительные контрольные образцы K+, которые являются короткой синтетической РНК вируса Nipah.

Оценку аналитической чувствительности способа производили на разведениях РНК-содержащего положительного контроля K+, олигонуклеотиды T1, nip_Dz1_T2 и Т3 собирались в буфере для сборки (50 мМ HEPES, 50 мМ, MgCl2, 20 мМ KCl, 120 мМ NaCl, 0.03% Triton Х-100, 1% DMSO, рН 7.4) при помощи нагревания при 95°С в течении 5 минут, а затем с помощью собранного биосенсора, плеча nip_Dz2 и флуоресцентно-меченного зонда (Fsub) определяли минимальное разведение, детектируемое как положительное в 100% случаев. Определенная таким образом аналитическая чувствительность способа составила 10 нМ или 6* 10¹⁵ копий/мл.

Аналитическую специфичность оценивали при помощи тестирования образцов синтетической РНК из следующих вирусов: Hendra, Machupo, Guanarito, Junin, Sabia и SARS-CoV (тяжелый острый респираторный синдром). Неспецифические реакции отсутствуют.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан и апробирован способ выявления РНК вируса Nipah.

Технический результат достигается путем определения синтетической РНК вируса Nipah биосенсором на основе дезоксирибозима 10-23 с учетом результатов в режиме реального времени, согласно изобретению.

Диагностика проводится следующим образом: для упрощения и стандартизации подготовки реактивов в тест-систему входят 6 смесей. Реактив АВ представляет из себя буферный раствор для расщепления, содержащий 50 мМ HEPES, 50 мМ, MgCl2, 20 мМ KCl, 120 мМ NaCl, 0.03% Triton Х-100, 1% DMSO, рН 7.4. Реактив MG представляет из себя 1 М MgCl2-6H20 раствор. Реактив DzA содержит предварительно собранную конструкцию Т1-Т3 в концентрации 5 мкМ. Сборка проводилась при температуре 95°С в течении 5 минут в специальном буфере для сборки, содержащем 50 мМ HEPES, 50 мМ MgCl2, 20 мМ KCl, 120 мМ NaCl, 0.03% Triton Х-100, 1% DMSO, рН 7.4. После полного остывания собранные цепи можно хранить при -20°С, они также не теряют каталитической активности при трех циклах заморозки-оттаивания. Реактив DzB содержит смесь флуоресцентно-меченого зонда (Fsub) и nip_Dz2 каждый в концентрации 5 мкМ. К+ представляет собой синтетическую РНК содержащую специфическую последовательность нуклеотидов РНК в концентрации 10 мкМ, детектируемую биосенсором. К- представляет собой дистиллированную стерильную воду. Все реактивы хранятся при температуре -20°С, кроме буфера для расщепления, он хранится при +4°С в течении месяца.

Для постановки реакции в реальном времени отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл, соответствующее числу исследуемых проб, а также две пробирки для положительных и отрицательных контролей. Далее в каждую пробирку вносится по 44.5 мкл буфера АВ, 2.5 мкл MG, по 1 мкл DzA и DzB, после вносится по 1 мкл образца. Готовят 2 контрольные реакции. Для этого в пробирку для положительного контроля вносят 1 мкл К+, в пробирку для отрицательного контроля вносят 1 мкл К-. Конечный объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Пробирки переносят в программируемый изотермический флюориметр Axxin T16-ISO Isothermal Fluorescence Reader (Axxin, Australia) с функцией детекции флуоресценции в режиме «реального времени» с наличием 3 каналов детекции флуоресценции (FAM/Green, HEX/Yellow и ROX/Red).

Детекцию флуоресцентного сигнала производят при 37°С по каналу FAM (Green). Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах по детектируемым каналам. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции образцом линии разметки прибора равной 2000 а.и. Результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца пересекает пороговую линию(2000 а.и.) и/или превышает значение отрицательного контроля в полтора раза.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на ФИГ. 2 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе образцов РНК вируса Nipah. Красная линия отображает фоновое свечение субстрата, содержащего FAM (Fsub), до расщепление при концентрации 100 нМ, оранжевая линия - демонстрирует свечение высвобожденной половины субстрата в концентрации 100 нМ (half_Fsub). Зеленая линия отображает уровень свечение отрицательного контроля (K-), салатовая линия - положительного (K+).

Таким образом, заявляемый метод позволяет достоверно выявлять РНК вируса Nipah.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Способ выявления вируса Нипах методом основанном на

применении дезоксирибозима 10-23.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-05-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Saint-Petersburg Pasteur

Institute</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Кириченко Анастасия

Дмитриевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Kirichenko Anastasiia

Dmitrievna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления вируса Nipah

методом основанном на применении дезоксирибозима

10-23</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">Method for detecting Nipah virus

by deoxyribozyme 10-23</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgccgggggccctggcccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>10</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgggccaggg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atcagccagtcgactgcaagtataaatgagaatgt</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RNA The region complementary to the

target RNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>РНК Участок комплементарный целевой

РНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>18..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA The region complementary to the

fluorescent substrate</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Участок комплиментарный

флуоресцентному субстрату</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>11..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA Half of the catalytic

core</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Половина каталитического кора

дезоксирибозима 10-23</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atttatacttacaacgagaggaaacctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>12..13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>РНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>14..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein (6-FAM)

[1-(3-Fluoranthenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione] at

5`-end.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>6-Карбоксифлуоресцеин (6-FAM)

[1-(3-Флуорантенил)-1H-пиррол-2,5-дион] на

5`-конце.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Non-fluorescent Black Hole Quencher 1

(2-[N-(2-hydroxyethyl)-4-[[2-methoxy-5-methyl-4-[(4-methyl-2-nitrophen

yl)diazenyl]phenyl]diazenyl]anilino]ethanol) at

3`-end.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Не флуоресцентный тушитель Black

Hole Quencher 1

(2-[N-(2-гидроксиэтил)-4-[[2-метокси-5-метил-4-[(4-метил-2-нитрофенил)

диазенил]фенил]диазенил]анилино]этанол) на

3`-конце.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggtttcctcgtccctgggca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>38</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA The region complementary to the

fluorescent substrate</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Участок комплиментарный

Т1</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>29..38</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RNA The region complementary to the

target RNA</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>РНК Участок комплиментарный целевой

РНК</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>10..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q25">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>DNA Half of the catalytic

core</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>ДНК Участок соответствующий

половине дезоксирибозима 10-23</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..38</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Hexaoxyethylene glycol linker (HEG)

[3,6,9,12,15-Pentaoxaheptadecane-1,17-diol]</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Гексаоксиэтиленгликолевый линкер

(HEG)

[3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диол]</NonEnglishQualifier_value

>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cccccggcactgcccagggaggctagctgcagtcgact</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выявления вируса Nipah методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23. Способ включает экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома Nipah вируса с использованием олигонуклеотидных последовательностей биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23 и флуоресцентно-меченого зонда, комплементарных специфическому фрагменту гена гликопротеина. Технический результат заключается в обеспечении достоверной диагностики РНК вируса Nipah с помощью биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23 и флуоресцентно-меченого зонда. 2 ил., 1 табл.

Способ выявления вируса Nipah методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23, включающий экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома Nipah вируса с использованием олигонуклеотидных последовательностей биосенсора на основе дезоксирибозима 10-23 и флуоресцентно-меченого зонда, комплементарных специфическому фрагменту гена гликопротеина (G), в качестве каталитического ядра используют последовательности

T1 GTGCCGGGGGCCCTGGCCCG

Т3 CGGGCCAGGG

nip_Dz1_T2 CCCCCGGCAC/HEG/TGCCCAGGGAGGCTAGCTgcagucgacu

nip_Dz2 auuuauacuuACAACGAGAGGAAACCTT,

а в качестве флуоресцентно-меченого зонда -

Fsub AAG GTT(FAM) ТСС TCg uCC CTG GGC A(BHQ1).