Способ выявления РНК вируса Henipavirus hendraense методом рекомбиназной полимеразной амплификации Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров вируса Henipavirus hendraense (HENV).

РНК-содержащий вирус Henipavirus hendraense принадлежит семейству Paramyxoviridae, роду Henipavirus, является зоонозом, вызывающим у человека гриппоподобное заболевание, которое способно приводить к развитию пневмонии, энцефалита и смерти. Кроме того энцефалит при заражении вирусом Н. hendraense может развиться после бессимптомного периода после начала заболевания. Инкубационный период оценивается в 5-21 день, смертность среди людей более 50%.

Вирус Н hendraense распространен в Австралии и встречается наиболее часто в штатах Квинсленд и Новый Южный Уэльс. Его естественным резервуаром являются летучие лисицы видов Pteropus conspicillatus, P. alecto, P. scapulatus и P. poliocephalus. Данный вирус способен передаваться лошадям, вызывая различные симптомы, чаще всего респираторные и неврологические. Летальность от заражения среди лошадей составляет более 70%, инкубационный период от 3 до 16 дней. Основным путем заражения Н hendraense среди лошадей считается прямой контакт с выделениями инфицированных летучих лисиц. Известны случаи передачи вируса от лошади к лошади и от лошади к человеку. Случаев передачи Н. hendraense от человека к человеку не было задокументировано. На данный момент времени существует вакцина Equivac® HeV, зарегистрированная в 2015 году, для иммунизации лошадей против Н. hendraense [https://www.dpi.nsw.gov.au/animals-and-livestock/horses/health-and-disease/hendra-virus/vaccine-info-vets]. Для людей вакцины и эффективного лечения не существует.

Несмотря на существование вакцины, угроза заражения вирусом Н. hendraense лошадей и людей не исчезает из-за широкого распространения и роста популяции летучих лисиц на территории Австралии. Широкая вариация клинических проявлений заражения вирусом (у лошадей: тахипноэ, атаксия, наклон головы, кружение, судороги, недержание мочи, нарушение мышления, лежачее положение, колики, депрессия, лихорадка, тахикардия, отсутствие аппетита, беспокойство; у людей: лихорадка, головная боль, сонливость, гриппоподобные симптомы, респираторные симптомы, спутанность сознания, гиподинамия, судороги, энцефалит) не позволяет идентифицировать болезнь симптоматически. Идентификация вируса возможна только при помощи лабораторных методов.

Для обнаружения вируса Н. hendraense методами вирусной изоляции и культивирования и реакцией нейтрализации необходим наивысший уровень биобезопасности лаборатории BSL-4, утвержденный только в ограниченном количестве лабораторий в мире [https://wvvav.health.qld.gov.au/cdcg/index/hendra], что является значительным ограничением для их применения. Кроме того недостатком данных тестов является большое количество времени необходимое на проведение одного анализа. Например, реакция нейтрализации занимает 3 дня [DOI: 10.1016/j.onehlt.2020.100207].

Идентификация вируса возможна методом иммуноферментного анализа (ИФА) на IgM и IgG [DOI: 10.3390/microorganisms 10061095]. Недостатком данного метода является сам принцип работы метода, основанного на выявлении иммунной реакции организма на возбудитель заболевания, а не самого возбудителя [Основы иммуноанализа: учебное пособие / Н.Е. Максимова, Н.Н. Мочульская, В.В. Емельянов; под общ. ред. Н.Н. Мочульской; Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, Уральский федеральный университет. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2021 - 148 с.: ил - Библиогр.: с. 147. - 30 экз.- ISBN 978-5-7996-3295-3].

Кроме ИФА для обнаружения генетического материала вируса применяют анализы на основе ПНР с обратной транскрипцией [DOI: 10.1016/j.onehlt.2020.100207]. Известным недостатком данного метода анализа является потребность в специальном оборудовании и длительном времени анализа [https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.15_NIPAH_HENDRA.pdf].

Изобретение направлено на расширение арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий.

Технический результат - разработка быстрого и достоверного способа идентификации генетического материала вируса Henipavirus hendraense в биологических образцах и других вируссодержащих пробах.

Поставленная задача решалась следующим путем:

1) конструирования диагностических праймеров и специфического флуоресцентно-меченого зонда на консервативный участок гена L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса;

2) конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК и получение транскрибированной РНК, несущих специфический участок ДНК- и РНК-матрицы;

3) оптимизации компонентов реакционной смеси и условий проведения анализа рекомбиназной полимеразной амплификации с обратной транскрипцией в реальном времени.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на ФИГ. 1 представлены кривые флуоресценции, полученные в программе прибора CFX96 Touch (Bio-Rad, США) для случаев образцов с разведением РНК К+. Отрицательный контрольный образец, не содержащий РНК вируса HENV, изображен красным цветом. В нем нет существенного роста флуоресцентного сигнала. Образцы, содержащие К+ в различных разведениях, изображены следующими цветами: 100 копий/мкл - светло-зеленый, 500 копий/мкл - темно-зеленый, 1000 копий/мкл - голубой, 10⁴ копий/мкл - фиолетовый. В случаях более концентрированных образцов наблюдается значительный рост сигнала. Конечная точка значения флуоресценции на 20 минуте анализа превышает значение отрицательного контроля. Поэтому результаты анализа образцов, содержащих РНК К+ в указанных концентрациях, интерпретируются как положительные.

Данный метод основан на определении наличия РНК вируса Henipavirus hendraense, выделенной из биологических образцов, по флуоресцентному сигналу при помощи реакции рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с обратной транскрипцией в режиме «реального времени» с использованием специфических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда. Результатом применения данного метода является изменение зависимости флуоресцентного сигнала от времени. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, способного считывать флуоресцентный сигнал от красителя FAM в изотермических условиях при +40°С в режиме «реального времени». Примером такого прибора является амплификатор CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК Henipavirus hendraense. Причем результат считается положительным, если значение флуоресцентного сигнала возрастает со временем и конечное значение к 20 минуте анализа превышает значение в образце отрицательного контроля. При большой концентрации РНК Henipavirus hendraense в образце флуоресцентный сигнал может иметь характерный вид резкого возрастания с достижением насыщения.

Преимуществом представленного метода обнаружения РНК вируса Henipavirus hendraense методом рекомбиназной полимеразной амплификацией с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-RPA ехо) над ПЦР с обратной транскрипцией является отсутствие необходимости в специальном оборудовании - термоциклерах или амплификаторах “реального времени”, поскольку все реакции протекают при одной температуре +40°С. Кроме того, время анализа RT-RPA ехо составляет 20 минут, в то время как ПЦР реального времени с обратной транскрипцией обычно занимает больше часа.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы пара специфических олигонуклеотидных праймеров и специфический флуоресцентно-меченый зонд с модификацией. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) на основе анализа всех последовательностей был выбран наиболее уникальный и консервативный участок генома вируса Henipavirus hendraense - фрагмент гена, кодирующего L-сегмент РНК-зависимой РНК-полимеразы, длиной 128 пар нуклеотидов. Подбор олигонуклеотидных праймеров и зонда проводился согласно рекомендациям TwistAmp® DNA Amplification Kits, Assay Design Manual и анализировался с использованием программного обеспечения Multiple Primer Analyzer (Thermo Fisher Scientific) и SnapGene. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1.

Обозначение модификаций:

• [FAM-dT] = флуоресцеин-dT фосфорамидит = 5'-Диметокситритилокси-5-[N-((3',6'-дипивалоилфлуоресцеинил)-аминогексил)-3-акрилимидо]-2'-дезоксиуридин-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит / Fluorescein-dT Phosphoramidite = 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-aciylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite;

• [dSpacer] = dSpacer СЕ фосфорамидит = 5'-O-диметокситритил-1',2'-дидезоксирибоза-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит / dSpacer СЕ Phosphoramidite = 5'-O-Dimethoxytrityl-1',2'-Dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite;

• [BHQ1-dT] = BHQ1-dT фосфорамидит = 5'-диметокситритилокси-5-[(N-4ʺ-карбоксиэтил-4ʺ-(N-этил)-4'-(2-нитро-4-толуилдиазо)-2'-метокси-5'-метил-азобензол)-аминогексил-3-акрилимидо]-2'-дезоксиуридин-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит / BHQ1-dT Phosphoramidite = 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[(N-4ʺ-carboxyethyl-4ʺ-(N-ethyl)-4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene)-aminohexyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)] -phosphoramidite.

Для контроля качества прохождения диагностики в состав методики был введен положительный контрольный образец K+. Матрицу для создания рекомбинантного положительного контрольного образца получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в один шаг. Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор рЕТ под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм Turbo, New England BioLabs, США). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и гидовой РНК. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500x1 (Applied Biosystems, США). Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца К+, который представляет собой транскрибированную РНК, содержащую вставку выбранного участка L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Н. hendraense.

Для реализации изобретения использовался набор для рекомбиназной изотермической амплификации TwistAmp® ехо kit (TwistDx™, UK). В пробирки с сухим веществом TwistAmp® ехо reaction (TwistDx™, UK) вносятся смесь из 2,1 мкл 10 мкМ RPA_Hen_F (ДНК-Синтез, Россия), 2,1 мкл 10 мкМ RPA_Hen_R (ДНК-Синтез, Россия), 0,6 мкл 10 мкМ флуоресцентно-меченого зонда Ехо_Hen (ДНК-Синтез, Россия), 29,5 мкл Primer Free Rehydration buffer (TwistDx™, UK), 11,7 мкл ультрачистой воды Milli-Q, 0,5 мкл обратной транскриптазы M-MuLV в концентрации 200,000 U/ml (New England Biolabs, США). Смесь аккуратно пипетируют до полного растворения лиофилизированного осадка. В холодном штативе в пробирки вносят по 2,5 мкл 280 мМ Magnesium Acetate (MgOAc) (TwistDx™, UK) и 1 мкл РНК образца. Раствор в пробирках перемешивают, капли осаждают на центрифуге микроспин (BioSan FV-2400). Пробы переносят в прибор для регистрации флуоресцентного сигнала. На амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США) или приборе с аналогичными возможностями выставляют программу анализа RT-RPA ехо (Таблица 2) со считыванием сигнала от флуоресцентного красителя FAM через каждые 60 секунд в течение 20 минут при постоянной температуре +40°С.

Тестирование способа выявления РНК вируса HENV методом рекомбиназной полимеразной амплификации с обратной транскрипцией в реальном времени проведено на К+. Для получения РНК К+ использовался набор для транскрипции Т7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System (Promega, США). Продукты транскрипции очищены при помощи AMPure ХР Bead-Based Reagent (Beckman Coulter, США). Концентрация РНК К+ определена при помощи Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, США) и она разбавлена в РНК-буфере (из комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (АмплиСенс®, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия)) до рабочей концентрации 1*10⁴ копий/мкл, что соответствует 1*10⁷ копий/мл или ≈16,6 фМ.

Оценку предела обнаружения производили на разведениях К+ и определяли как минимальную концентрацию РНК, содержащую вставку вируса HENV и детектируемую данным методом как положительный результат в 100% случаев. Лимит детекции составил 100 копий/мкл РНК К+, содержащей вставку вируса Н. hendraense. Таким образом, достоверная диагностика данного вируса осуществляется за 20 минут.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Способ выявления РНК вируса Henipavirus hendraense методом

рекомбиназной полимеразной амплификации.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-03-14">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText> </ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-03-14</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference> </ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Department of Epidemiology, Pasteur Institute,

Federal Service on Consumers&apos; Rights Protection and Human

Well-Being Surveillance</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Капитонова Марина

Анатольевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Kapitonova Marina

Anatol&apos;evna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления РНК вируса

Henipavirus hendraense методом рекомбиназной полимеразной

амплификации</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agtgagaccagaagatgggcaaagtatgttcaac</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaattttctgactgagagactttgtgagag</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>31</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Fluorescein-dT Phosphoramidite

(5&apos;-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3&apos;,6&apos;-dipivaloylfluoresce

inyl)-aminohexyl)-3-acrylimido]-2&apos;-deoxyUridine-3&apos;-[(2-cyano

ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>флуоресцеин-dT фосфорамидит

(5&apos;-Диметокситритилокси-5-[N-((3&apos;,6&apos;-дипивалоилфлуоресц

еинил)-аминогексил)-3-акрилимидо]-2&apos;-дезоксиуридин-3&apos;-[(2-ци

аноэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>31^32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>dSpacer CE Phosphoramidite

(5&apos;-O-Dimethoxytrityl-1&apos;,2&apos;-Dideoxyribose-3&apos;-[(2-c

yanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>dSpacer CE фосфорамидит

(5&apos;-O-диметокситритил-1&apos;,2&apos;-дидезоксирибоза-3&apos;-[(2

-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит)</NonEnglishQualifier_valu

e>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>BHQ1-dT Phosphoramidite

(5&apos;-Dimethoxytrityloxy-5-[(N-4&apos;&apos;-carboxyethyl-4&apos;&a

pos;-(N-ethyl)-4&apos;-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2&apos;-methoxy-5&apos;

-methyl-azobenzene)-aminohexyl-3-acrylimido]-2&apos;-deoxyUridine-3&ap

os;-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)</INSDQualifier

_value>

<NonEnglishQualifier_value>BHQ1-dT фосфорамидит

(5&apos;-диметокситритилокси-5-[(N-4&apos;&apos;-карбоксиэтил-4&apos;&

apos;-(N-этил)-4&apos;-(2-нитро-4-толуилдиазо)-2&apos;-метокси-5&apos;

-метил-азобензол)-аминогексил-3-акрилимидо]-2&apos;-дезоксиуридин-3&ap

os;-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит)</NonEnglishQualifi

er_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgagagactttgtgagaggagattcctcattctgtcagccattgct</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выявления вируса Henipavirus hendraense методом изотермической рекомбиназной полимеразной амплификацией с обратной транскрипцией. Способ включает экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома вируса и отличается тем, что анализ проводят в реальном времени с использованием обратной транскриптазы M-MuLV, праймеров и зонда. Технический результат заключается в разработке быстрого и достоверного способа идентификации генетического материала вируса Henipavirus hendraense в биологических образцах и других вируссодержащих пробах. 1 ил., 2 табл.

Способ выявления вируса Henipavirus hendraense методом изотермической рекомбиназной полимеразной амплификацией с обратной транскрипцией, включающий экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома вируса, отличающийся тем, что анализ проводят в реальном времени с использованием обратной транскриптазы M-MuLV, специфических праймеров

RPA_Hen_F 5'-AGTGAGACCAGAAGATGGGCAAAGTATGTTCAAC-3',

RPA_Hen_R 5'-ATGAATTTTCTGACTGAGAGACTTTGTGAGAG-3'

и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда

Exo_Hen 5'-CTGAGAGACTTTGTGAGAGGAGATTCCTCA[FAM-dT][dSpacer][BHQ1-dT]CTGTCAGCCATTGCT-3', где [dSpacer] представляет собой соединение dSpacer СЕ фосфорамидит = 5'-O-диметокситритил-1',2'-дидеоксирибоза-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит,

где результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК Henipavirus hendraense, причем результат считается положительным, если значение флуоресцентного сигнала возрастает со временем и конечное значение к 20 минуте анализа превышает значение в образце отрицательного контроля.