СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2025 года по МПК A61K31/4745 A61K47/55 A61K47/68 A61P35/00 

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании китайской патентной заявки (заявка CN 202010219311.2), поданной 25 марта 2020 г., и китайской патентной заявки (заявка CN 202110297397.5), поданной 19 марта 2021 г.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата антитело-лекарственное средство и, в частности, к стадиям синтеза и очистки способа получения конъюгата антитело-лекарственное средство.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Утверждения в данном разделе относятся только к общей информации, связанной с настоящим изобретением, и не обязательно составляют уровень техники.

Химиотерапия остается одним из важнейших противоопухолевых средств, которые включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию и таргетную терапию. Хотя существует большое разнообразие эффективных цитотоксических препаратов, разница между опухолевыми клетками и нормальными клетками невелика, что ограничивает широкое клиническое применение этих противоопухолевых соединений из-за их токсических побочных действий. Поскольку противоопухолевое моноклональное антитело обладает специфичностью к антигену поверхности опухолевых клеток, препараты на основе антител стали препаратами первой линии для противоопухолевого лечения, но когда антитело применяют отдельно в качестве противоопухолевого препарата, терапевтический эффект часто бывает неудовлетворительным.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) образуется путем связывания моноклонального антитела или фрагмента антитела с биологически активным цитотоксическим лекарственным средством посредством стабильного химического линкерного соединения и позволяет полностью использовать специфичность связывания антитела с поверхностными антигенами нормальных клеток и опухолевых клеток и высокую эффективность цитотоксического лекарственного средства, а также избежать недостатка первого компонента, заключающегося в слабом терапевтическом эффекте, недостатка второго компонента, заключающегося в наличии серьезных токсических побочных действий, и т.п.Это означает, что конъюгат антитело-лекарственное средство может более точно связываться с опухолевыми клетками и оказывает меньшее действие на нормальные клетки по сравнению с общепринятыми химиотерапевтическими лекарственными средствами в прошлом (Milliard А, (2013) Nature Reviews Drug Discovery, 12:329-332; DiJoseph JF, Armellino DC, (2004) Blood, 103:1807-1814).

Милотарг (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceutical Co., Ltd.), первый конъюгат антитело-лекарственное средство, был одобрен FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) США в 2000 г. для лечения острого миелоцитарного лейкоза (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; US4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US 5767285; US 5773001).

Adcetris® (брентуксимаб ведотин, Seagen Inc.) был одобрен в ходе ускоренной оценки, проведенной FDA США в августе 2011 г., для лечения лимфомы Ходжкина и рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы (Nat. Biotechnol (2003) 21(7):778-784; WO2004010957; WO2005001038; US7090843; US7659241; WO2008025020). Adcetris® (адцетрис) является новым препаратом ADC, который позволяет лекарственному средству непосредственно воздействовать на мишень CD30 на клетках лимфомы, а затем осуществлять эндоцитоз, чтобы вызвать апоптоз опухолевых клеток.

И милотарг, и адцетрис являются таргетными препаратами против гематологических опухолей, тканевая структура которых относительно проста по сравнению с солидными опухолями. Кадсила (адо-трастузумаб эмтанзин, T-DM1) была одобрена FDA США в феврале 2013 г. для лечения HER2-положительных пациентов с распространенным или метастатическим раком молочной железы и с лекарственной устойчивостью к трастузумабу (торговое название: Herceptin®) и паклитакселу (WO2005037992; US8088387). Кадсила является первым препаратом ADC, одобренным FDA США для лечения солидных опухолей.

Существует несколько классов малых молекул, обладающих цитотоксичностью и подходящих для конъюгатов антитело-лекарственное средство, одним из которых являются производные камптотецина, обладающие противоопухолевым действием за счет ингибирования топоизомеразы I. Сообщалось о применении производного камптотецина, иринотекана (химическое название: (1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]имидазо[1,2-b]хинолин-10,13(9Н,15Н)-дион), в конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC), как описано в WO2014057687; Clinical Cancer Research (2016)22 (20):5097-5108; Cancer Sci (2016) 107: 1039-1046. По-прежнему сохраняется потребность в дальнейшей разработке препаратов ADC с лучшими терапевтическими эффектами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложен способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную общей формулой (Pc-L_a-Y-D):

где:

W выбран из группы, состоящей из С_1-8 алкила, С_1-8 алкил-С_3-7 циклоалкила и линейного гетероалкила из 1-8 атомов, где линейный гетероалкил содержит 1-3 гетероатома, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждый из С_1-8 алкила, С_3-7 циклоалкила и линейного гетероалкила независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, C_1-6 алкила, C_1-6 хлоралкила, дейтерированного C_1-6 алкила, C_1-6 алкокси и С_3-7 циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где р¹ представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислотных остатков, где аминокислотные остатки выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот фенилаланина (F), глицина (G), валина (V), лизина (K), цитруллина, серина (S), глутаминовой кислоты (Q) и аспарагиновой кислоты (D), и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, C_1-6 алкила, C_1-6 хлоралкила, дейтерированного С_1-6 алкила, С_1-6 алкокси и С_3-7 циклоалкила;

R¹ представляет собой C_1-6 галогеналкил или С_3-7 циклоалкил;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, С_1-6 галогеналкила и С_3-7 циклоалкила;

или R¹ и R² вместе со связанными с ними атомами углерода образуют С_3-7 циклоалкил;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода, С_1-6 алкила, C_1-6 галогеналкила, дейтерированного C_1-6 алкила и гидрокси C_1-6 алкила;

R⁶ и R⁷ являются одинаковыми или разными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, С_1-6 алкила, C_1-6 галогеналкила, дейтерированного С_1-6 алкила и гидрокси С_1-6 алкила;

m равно 0 или 1;

n представляет собой десятичное или целое число от 3 до 8;

Рс представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

где способ получения включает следующие стадии:

стадия (а): подвергание указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента взаимодействию с восстанавливающим агентом при температуре реакции от приблизительно 1°С до приблизительно 36°С; и

стадия (b): подвергание продукта стадии (а) взаимодействию с соединением следующей формулы (La-Y-D):

где: W, L²,L³,R¹,R²,R⁵,R⁶,R⁷ и m являются такими, как определено выше.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8;

где способ получения включает следующие стадии:

стадия (а): подвергание указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента взаимодействию с восстанавливающим агентом при температуре реакции от приблизительно 1°С до приблизительно 36°С; и

стадия (b): подвергание продукта стадии (а) взаимодействию с соединением следующей формулы:

В альтернативном варианте осуществления температурные условия реакции на стадии (а) представляют собой от приблизительно 4°С до приблизительно 30°С, предпочтительно от приблизительно 20°С до приблизительно 30°С и более предпочтительно 25°С, неограничивающие примеры которых включают приблизительно 20°С, приблизительно 21°С, приблизительно 22°С, приблизительно 23°С, приблизительно 24°С, приблизительно 25°С, приблизительно 26°С, приблизительно 27°С, приблизительно 28°С, приблизительно 29°С и приблизительно 30°С. В некоторых вариантах осуществления температурные условия реакции представляют собой от 13°С до 28°С или от 13°С до 25°С.

В альтернативном варианте осуществления реакцию на стадии (а) проводят при рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5, предпочтительно реакцию проводят при рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, и более предпочтительно реакцию проводят при рН приблизительно 5,6. В неограничивающем примере реакцию проводят при рН приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9 или приблизительно 6,0.

В альтернативном варианте осуществления реакцию на стадии (а) проводят в буфере; в неограничивающем примере буфер выбран из группы, состоящей из буферов на основе соли гистидина, фосфатных буферов и ацетатных буферов.

В альтернативном варианте осуществления реакцию на стадии (а) проводят в буфере; в неограничивающем примере буфер представляет собой буфер на основе гистидина и соляной кислоты.

В альтернативном варианте осуществления буфер выбран из группы, состоящей из ЭДТА-содержащих буферов на основе соли гистидина и ЭДТА-содержащих буферов на основе гистидина и соляной кислоты. Для иллюстрации, буфер на основе соли гистидина имеет концентрацию от 1 мМ до 100 мМ, от 10 мМ до 50 мМ, 20 мМ, 30 мМ или 40 мМ; ЭДТА имеет концентрацию от 1 мМ до 10 мМ, от 2 мМ до 5 мМ, 2,5 мМ, 3 мМ или 4 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер содержит от 10 мМ до 50 мМ буфера на основе соли гистидина и от 1 мМ до 10 мМ ЭДТА. В некоторых вариантах осуществления буфер содержит 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты и 2,5 мМ ЭДТА. ЭДТА относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте.

В альтернативном варианте осуществления восстанавливающий агент на стадии (а) выбран из группы, состоящей из трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) или его соли, 1,4-димеркаптотреитола (DTT), (3-меркаптоэтанола ((3-МЕ) и других подходящих восстанавливающих агентов, предпочтительно ТСЕР или его соли, и более предпочтительно гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина.

В альтернативном варианте осуществления молярное отношение восстанавливающего агента к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту (Рс) на стадии (а) составляет от 2:1 до 10:1, от 2,6:1 до 7:1, от 2,9:1 до 3,7:1, от 3,2:1 до 3,4:1, или 3,3:1.

В альтернативном варианте осуществления стадию (b) проводят в органическом растворителе, где предпочтительные органические растворители включают диметилсульфоксид (ДМСО), N,N-диметилформамид (ДМФА), N,N-диметилацетамид (DMAc), ацетонитрил или их смесь. В неограничивающем примере стадия (b) включает: растворение соединения формулы (La-Y-D) в ДМСО и смешивание продукта стадии (а) с раствором соединения формулы (La-Y-D) в ДМСО.

В альтернативном варианте осуществления указанный выше способ получения дополнительно включает стадию (с), включающую очистку продукта стадии (b). Очистка может быть проведена с помощью катионной колоночной хроматографии или аффинной колоночной хроматографии, где наполнитель для катионной колоночной хроматографии выбран из группы, состоящей из Capto S Impact и Poros XS, и предпочтительно Capto S Impact. В некоторых вариантах осуществления Capto S Impact представляет собой Capto™ S Impact. В некоторых вариантах осуществления Poros XS представляет собой Poros™ XS.

В альтернативном варианте осуществления лекарственная нагрузка (n) может составлять от 3 до 8, от 4 до 8 или от 5 до 7, предпочтительно от 5,3 до 6,1 и более предпочтительно 5,7, цитотоксических лекарственных средств, которые связываются с каждым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом (Рс). n представляет собой десятичное или целое число. В некоторых вариантах осуществления n равно 5,3, 5,4, 5,5, 5,6 или 5,7.

В альтернативном варианте осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее; предпочтительно доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 6% или менее. В неограничивающем примере доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее или 1% или менее; доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее или 1% или менее. Или в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более, 66% или более, 67% или более, 68% или более, 69% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более или 95% или более. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 70% или более. В некоторых вариантах осуществления долю тяжелых цепей антитела и/или легких цепей антитела определяют с помощью обращенно-фазовой хроматографии.

В альтернативном варианте осуществления способ получения подходит для крупномасштабного производства. Количество антитела трастузумаба в способе получения составляет 100 мг или более, предпочтительно 1 г или более, более предпочтительно 10 г или более и наиболее предпочтительно 100 г или более.

В альтернативном варианте осуществления конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную общей формулой (Pc-Lb-Y-D):

где:

s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

Рс, R¹, R², R⁵, R⁶, R⁷, m и n являются такими, как определено выше; где способ получения включает следующие стадии:

стадия (а): подвергание указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента взаимодействию с восстанавливающим агентом при температуре реакции от приблизительно 1°С до приблизительно 36°С; и

стадия (b): подвергание продукта стадии (а) взаимодействию с соединением следующей формулы (L_b-Y-D):

где s¹, R¹, R², R⁵, R⁶, R⁷ и m являются такими, как определено выше. В альтернативном варианте осуществления описанный выше конъюгат антитело-лекарственное средство имеет следующую структуру:

где Pc и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

В альтернативном варианте осуществления Рс представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и указанное антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела и полностью человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

В альтернативном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из антитела к HER2 (ErbB2), антитела к EGFR, антитела к В7-Н3, антитела к c-Met, антитела к HER3 (ErbB3), антитела к HER4 (ErbB4), антитела к CD20, антитела к CD22, антитела к CD30, антитела к CD33, антитела к CD44, антитела к CD56, антитела к CD70, антитела к CD73, антитела к CD105, антитела к СЕА, антитела к А33, антитела к Cripto, антитела к EphA2, антитела к G250, антитела к MUC1, антитела к антигену LeY, антитела к VEGFR, антитела к GPNMB, антитела к интегрину, антитела к PSMA, антитела к тенасцину-С, антитела к SLC44A4, антитела к мезотелину и их антигенсвязывающего фрагмента;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из трастузумаба, пертузумаба, нимотузумаба, эноблитузумаба, эмибетузумаба, инотузумаба, пинатузумаба, брентуксимаба, гемтузумаба, биватузумаба, лорвотузумаба, cBR96, глематумамаба и их антигенсвязывающего фрагмента.

В альтернативном варианте осуществления конъюгат антитела имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8; где способ получения включает следующие стадии:

стадия (а): подвергание трастузумаба взаимодействию с ТСЕР при температуре реакции от приблизительно 4°С до приблизительно 30°С и рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5; и

стадия (b): подвергание продукта стадии (а) взаимодействию с соединением следующей формулы:

В альтернативном варианте осуществления конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8; где способ получения включает следующие стадии:

стадия (а): подвергание трастузумаба взаимодействию с ТСЕР при температуре реакции приблизительно 25°С и рН приблизительно 5,6, где реакцию проводят в ЭДТА-содержащем буфере на основе гистидина и соляной кислоты;

стадия (b): подвергание продукта стадии (а) взаимодействию с соединением следующей формулы:

и

стадия (с): подвергание продукта стадии (b) очистке через катионную хроматографическую колонку или аффинную хроматографическую колонку. В некоторых вариантах осуществления ЭДТА-содержащий буфер на основе гистидина и соляной кислоты содержит 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты и 2,5 мМ ЭДТА.

В настоящем изобретении также предложен конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную общей формулой (Рс-L_a-Y-D):

где:

W выбран из группы, состоящей из C_1-8 алкила, C_1-8 алкил-С_3-7 циклоалкила и линейного гетероалкила из 1-8 атомов, где линейный гетероалкил содержит 1-3 гетероатома, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждый из C_1-8 алкила, С_3-7 циклоалкила и линейного гетероалкила независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, C_1-6 алкила, C_1-6 хлоралкила, дейтерированного C_1-6 алкила, C_1-6 алкокси и С_3-7 циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где р¹ представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислотных остатков, где аминокислотные остатки выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот фенилаланина (F), глицина (G), валина (V), лизина (K), цитруллина, серина (S), глутаминовой кислоты (Q) и аспарагиновой кислоты (D), и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, C_1-6 алкила, C_1-6 хлоралкила, дейтерированного C_1-6 алкила, C_1-6 алкокси и С_3-7 циклоалкила;

R¹ представляет собой С_1-6 галогеналкил или С_3-7 циклоалкил;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-6 галогеналкила и С_3-7 циклоалкила;

или R¹ и R² вместе со связанными с ними атомами углерода образуют С_3-7 циклоалкил;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода, С_1-6 алкила, С_1-6 галогеналкила, дейтерированного С_1-6 алкила и гидрокси С_1-6 алкила;

R⁶ и R⁷ являются одинаковыми или разными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-6 алкила, C_1-6 галогеналкила, дейтерированного C_1-6 алкила и гидрокси C_1-6 алкила;

m равно 0 или 1;

n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8;

Рс представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее; предпочтительно доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 6% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 70% или более.

В настоящем изобретении также предложен конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, где конъюгат антитело-лекарственное средство получен способом получения конъюгата антитело-лекарственное средство, описанным выше; и распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее; предпочтительно доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 6% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 70% или более.

В настоящем изобретении также предложен конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8;

конъюгат антитело-лекарственное средство получен способом получения конъюгата антитело-лекарственное средство, описанным выше; и распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее; предпочтительно доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 6% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более. В некоторых вариантах осуществления распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 1% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 4% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 70% или более.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложен способ получения, более подходящий для крупномасштабного производства. В частности, продукт, полученный указанным способом получения, имеет преимущества более узкого распределения лекарственной нагрузки, более низкого содержания свободного токсина и более высокого выхода.

Термины

Для облегчения понимания настоящего изобретения некоторые технические и научные термины отдельно определены ниже. Если иное не определено явным образом в настоящем документе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно понимаемые специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Заявка PCT/CN2019/107873 полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) образуется путем связывания антитела или фрагмента антитела с биологически активным цитотоксином или низкомолекулярным лекарственным средством с активностью уничтожения клеток посредством стабильного химического линкерного соединения и позволяет полностью использовать специфичность антитела к опухолевым клеткам или специфичность связывания клеток с высокой экспрессией антигена и высокую эффективность цитотоксина, и избежать токсического побочного действия на нормальные клетки. Конъюгат антитело-лекарственное средство может более точно связываться с опухолевыми клетками и оказывает меньшее действие на нормальные клетки по сравнению с общепринятыми химиотерапевтическими лекарственными средствами в прошлом.

«Буфер» относится к буферу, который противостоит изменениям рН за счет действия его компонентов, составляющих его сопряженную кислотно-основную пару. Примеры буферов, которые регулируют рН в соответствующем диапазоне, включают ацетатный, сукцинатный, глюконатный, буфер на основе соли гистидина, оксалатный, лактатный, фосфатный, цитратный, тартратный, фумаратный, глицилглициновый и другие буферы на основе органических кислот.

«Буфер на основе соли гистидина» представляет собой буфер, содержащий ионы гистидина. Примеры буферов на основе соли гистидина включают буфер на основе гистидина и соляной кислоты, буфер на основе гистидина и уксусной кислоты, буфер на основе гистидина и фосфорной кислоты, буфер на основе гистидина и серной кислоты и т.п., и предпочтительно буфер на основе гистидина и соляной кислоты, где буфер на основе гистидина и уксусной кислоты получают из гистидина и уксусной кислоты, и буфер на основе гистидина и соляной кислоты получают из гистидина и соляной кислоты или гистидина и гидрохлорида гистидина.

«Фосфатный буфер» представляет собой буфер, содержащий фосфат-ионы. Примеры фосфатных буферов включают буфер на основе гидрофосфата натрия и дигидрофосфата натрия, буфер на основе гидрофосфата натрия и дигидрофосфата калия, буфер на основе гидрофосфата натрия и лимонной кислоты, и т.п. Предпочтительным фосфатным буфером является буфер на основе гидрофосфата натрия и дигидрофосфата натрия.

«Ацетатный буфер» представляет собой буфер, содержащий ацетат-ионы. Примеры ацетатных буферов включают буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, буфер на основе уксусной кислоты и соли гистидина, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата калия, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата кальция, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата магния, и т.п. Предпочтительным ацетатным буфером является буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия.

Термины «приблизительно» и «примерно» в контексте настоящего документа означают, что численное значение находится в пределах допустимого диапазона погрешности для конкретного значения, определенного специалистом в данной области техники, и численное значение частично зависит от того, как значение измерено или определено (т.е. пределов системы измерений). Например, «приблизительно» может означать в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения в соответствии с практикой, принятой в данной области техники. Или «приблизительно» или «по существу содержащий» может означать диапазон до 20%. Кроме того, в особенности для биологических систем или процессов, этот термин может означать величину до порядка или до 5-кратной величины от числового значения. Когда в настоящей заявке и формуле изобретения указано конкретное значение, если не указано иное, значение «приблизительно» или «по существу содержащий» следует предполагать находящимся в допустимом диапазоне погрешности для этого конкретного значения.

Трехбуквенные коды и однобуквенные коды для аминокислот, используемые в настоящем описании, соответствуют описанным в J. Biol. Chem, 243, р3558 (1968).

«Антитело», описанное в настоящем документе, относится к иммуноглобулину и имеет структуру тетрапептидной цепи, образованную за счет связывания двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей интактного антитела межцепочечными дисульфидными связями. Константные области тяжелой цепи иммуноглобулина различаются по своему аминокислотному составу и расположению и, следовательно, по своей антигенности. Таким образом, иммуноглобулины могут быть разделены на пять классов, которые также называют названы изотипами иммуноглобулинов, а именно, IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, и их соответствующие тяжелые цепи представляют собой μ-цепь, δ-цепь, γ-цепь, α-цепь и ε-цепь, соответственно. Один и тот же класс Ig может быть разделен на разные подклассы в соответствии с различием в аминокислотном составе шарнирных областей и количеством и положением дисульфидных связей тяжелых цепей; например, IgG может быть подразделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи классифицируют как κ- или λ-цепи в соответствии с различиями в константных областях. Каждый из пяти классов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь. Антитело, описанное в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой специфичные антитела к антигенам клеточной поверхности на клетках-мишенях, неограничивающими примерами которых являются одно или более из следующих: антитело к HER2 (ErbB2), антитело к EGFR, антитело к В7-Н3, антитело к c-Met, антитело к HER3 (ErbB3), антитело к HER4 (ErbB4), антитело к CD20, антитело к CD22, антитело к CD30, антитело к CD33, антитело к CD44, антитело к CD56, антитело к CD70, антитело к CD73, антитело к CD105, антитело к СЕА, антитело к А33, антитело к Cripto, антитело к EphA2, антитело к G250, антитело к MUC1, антитело к антигену LeY, антитело к VEGFR, антитело к GPNMB, антитело к интегрину, антитело к PSMA, антитело к тенасцину-С, антитело к SLC44A4 и антитело к мезотелину; антитело предпочтительно представляет собой трастузумаб (торговое название: Herceptin), пертузумаб (также известный как 2С4, торговое название: Perjeta), нимотузумаб (торговое название: Taixinsheng®), эноблитузумаб, эмибетузумаб, инотузумаб, пинатузумаб, брентуксимаб, гемтузумаб, биватузумаб, лорвотузумаб, cBR96 или глематумамаб.

В тяжелой и легкой цепях антитела последовательности из приблизительно 110 аминокислот вблизи N-конца значительно различаются и поэтому называются вариабельными областями (Fv-областями); остальные аминокислотные последовательности вблизи С-конца относительно стабильны и поэтому называются константными областями. Вариабельная область включает 3 гипервариабельных области (HVR) и 4 каркасных области (FR) с относительно консервативными последовательностями. 3 гипервариабельные области определяют специфичность антитела и поэтому также известны как определяющие комплементарность области (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) или вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. 3 CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; и 3 CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Аминокислотные остатки CDR областей LCVR и HCVR антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, соответствуют известной схеме нумерации согласно Kabat (LCDR 13, HCDR 13) в отношении количества и положений.

В настоящем изобретении легкая цепь антитела согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область легкой цепи, содержащую человеческие или мышиные κ- и λ-цепи или их варианты.

В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, содержащую человеческие или мышиные IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 или их варианты.

Антитело согласно настоящему изобретению включает мышиное антитело, химерное антитело и гуманизированное антитело, и предпочтительно гуманизированное антитело.

Термин «мышиное антитело» в контексте настоящего документа относится к антителу, полученному из мышей в соответствии со знаниями и навыками в данной области техники. В процессе получения подопытному вводят определенный антиген, а затем выделяют гибридомы, экспрессирующие антитела с желаемой последовательностью или функциональными свойствами.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, полученному путем слияния вариабельной области мышиного антитела и константной области человеческого антитела, что может снизить иммунный ответ, вызываемый мышиным антителом. Для получения химерного антитела сначала создают гибридому, секретирующую мышиное специфичное моноклональное антитело, затем клонируют ген вариабельной области из клеток мышиной гибридомы, а затем клонируют ген константной области человеческого антитела, если необходимо, связывают ген мышиной вариабельной области с геном человеческой константной области с образованием химерного гена, вставляют химерный ген в вектор экспрессии и, наконец, экспрессируют молекулы химерного антитела в эукариотической системе или прокариотической системе.

Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитыми CDR, относится к антителу, полученному путем прививки мышиных последовательностей CDR на каркасную область вариабельной области человеческого антитела, т.е. последовательность каркасной области другого типа, человеческую. Такое антитело может преодолевать гетерогенную реакцию, вызываемую химерным антителом, из-за наличия большого количества мышиных белковых компонентов. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельной области человеческой тяжелой и легкой цепи можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase», а также в Kabat, Е. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, последовательности FR в вариабельной области человеческого антитела можно подвергать минимальным реверсивным мутациям или обратным мутациям для поддержания активности. Гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению также включает гуманизированные антитела, дополнительно подвергнутые созреванию аффинности CDR с помощью фагового дисплея.

Термин «голое антитело» относится к антителу, которое не конъюгировано с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксическим фрагментом) или радиоактивной меткой.

«Антигенсвязывающий фрагмент антитела», описанный в настоящем документе, может относиться к Fab-фрагментам, Fab'-фрагментам и F(ab')₂-фрагментам, обладающим антигенсвязывающей активностью, и Fv-фрагментам и scFv-фрагментам, связывающимся с антигеном. Fv-фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, но не константную область, и имеет наименьший фрагмент антитела со всеми антигенсвязывающими сайтами. Как правило, Fv-антитело также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL и способно образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Две вариабельные области антитела также могут быть связаны в одну полипептидную цепь с использованием различных линкеров, известную как одноцепочечное антитело или одноцепочечный fv (sFv).

Термин «антигенсвязывающий сайт», раскрытый в настоящем документе, относится к непрерывному или прерывистому трехмерному пространственному сайту на антигене, который распознается антителом или антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению.

«ADCC», т.е. антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность, описанная в настоящем документе, относится к прямому уничтожению покрытых антителом клеток-мишеней клетками, экспрессирующими Fc-рецептор, посредством распознавания Fc-сегмента антитела. Эффекторная функция ADCC антитела может быть снижена или устранена путем модификации Fc-сегмента IgG. Модификация относится к мутации в константной области тяжелой цепи антитела, такой как мутация, выбранная из группы, состоящей из N297A, L234A и L235A IgG1; химеры IgG2/4 и F234A/L235A IgG4.

«Мутации» в описанных в настоящем документе мутантных последовательностях включают, не ограничиваясь перечисленным, «обратную мутацию», «консервативную модификацию» или «консервативное замещение или замену». «Консервативная модификация» или «консервативное замещение или замена», описанные в настоящем документе, относятся к замене аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими схожие характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность или конформацию и жесткость основной цепи), чтобы можно было часто вносить изменения без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области техники известно, что в общем случае замена одной аминокислоты в несущественных областях полипептида по существу не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p224, (4th edition)). Кроме того, маловероятно, что замена аминокислотами с аналогичной структурой или функцией повлияет на биологическую активность.

Термин «мутантная последовательность», описанный в настоящем документе, относится к нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности, имеющей другую степень процентной идентичности нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности согласно настоящему изобретению, когда в нуклеотидную последовательность и/или аминокислотную последовательность согласно настоящему изобретению соответствующим образом внесены мутационные модификации, такие как замены, вставки или делеции. Описанная в настоящем документе идентичность последовательностей может составлять по меньшей мере 85%, 90% или 95%, и предпочтительно по меньшей мере 95%. Неограничивающие примеры идентичности последовательностей включают 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно выполнить с помощью настроек по умолчанию для алгоритма BLASTN/BLASTP, доступного на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации.

Термин «линкерное звено» или «линкерный фрагмент» относится к фрагменту химической структуры или связи, который связан с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом на одном конце и с лекарственным средством на другом конце, а также может быть связан с антитело или лекарственным средством после связывания с другим линкером.

Линкер включает удлиняющие звенья, спейсерные звенья и аминокислотные звенья и может быть синтезирован способами, известными в данной области техники, такими как описанные в US2005-0238649 А1. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», способствующий высвобождению лекарственных средств в клетках. Например, могут быть использованы кислотолабильные линкеры (например, гидразоны), чувствительные к протеазе (например, чувствительные к пептидазе) линкеры, фотолабильные линкеры, диметиловые линкеры или дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131(1992); патент США №5,208,020).

Сконструированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению могут быть получены и очищены обычными методами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, могут быть клонированы и рекомбинированы в вектор экспрессии GS. Векторы экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина могут быть стабильно трансфицированы в клетки СНО. В качестве более рекомендуемого предшествующего уровня техники системы экспрессии млекопитающих могут приводить к гликозилированию антител, особенно в высококонсервативном N-концевом сайте Fc-области. Положительные клоны размножают в бессывороточной среде биореактора для получения антител. Культура с секретированным антителом может быть очищена с помощью обычных методик, например, очистку проводят на колонке с А- или G-сефарозой FF, содержащей отрегулированный буфер. Неспецифически связанные фракции вымываются. Затем связанное антитело элюируют методом градиента рН, и фрагменты антитела детектируют с помощью SDS-PAGE и собирают. Антитело может быть отфильтровано и концентрировано обычными методами. Растворимые смеси и полимеры также могут быть удалены обычными методами, например, с помощью молекулярных сит и ионного обмена. Полученный продукт необходимо немедленно заморозить, например, при -70°С, или лиофилизировать.

Термин «алкил» относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, которая представляет собой линейную или разветвленную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкил, содержащий от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно алкил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, и наиболее предпочтительно алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. Неограничивающие примеры алкила включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил, н-гептил, 2-метилгексил, 3-метилгексил, 4-метилгексил, 5-метилгексил, 2,3-диметилпентил, 2,4-диметилпентил, 2,2- диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 2-этилпентил, 3-этилпентил, н-октил, 2,3- диметилгексил, 2,4-диметилгексил, 2,5-диметилгексил, 2,2-диметилгексил, 3,3-диметилгексил, 4,4-диметилгексил, 2-этилгексил, 3-этилгексил, 4-этилгексил, 2- метил-2-этилпентил, 2-метил-3-этилпентил, н-нонил, 2-метил-2-этилгексил, 2-метил-3-этилгексил, 2,2-диэтилпентил, н-децил, 3,3-диэтилгексил, 2,2-диэтилгексил и их различные разветвленные изомеры, и т.д. Более предпочтителен низший алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, и неограничивающие примеры низшего алкила включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил и т.п. Алкил может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения, где заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин «гетероалкил» относится к алкилу, содержащему один или более гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где алкил является таким, как определено выше.

Термин «алкилен» относится к насыщенной линейной или разветвленной алифатической углеводородной группе, имеющей 2 остатка, полученные из исходного алкана путем удаления двух атомов водорода от одного и того же атома углерода или двух разных атомов углерода. Он представляет собой линейную или разветвленную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 12 атомов углерода, и более предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. Неограничивающие примеры алкилена включают, не ограничиваясь перечисленным, метилен(-СН₂-), 1,1-этилиден(-СН(СН₃)-), 1,2-этилиден(-СН₂СН₂)-, 1,1-пропилиден(-СН(СН₂СН₃)-), 1,2-пропилиден(-СН₂СН(СН₃)-), 1,3-пропилиден(-СН₂СН₂СН₂-), 1,4-бутилиден(-СН₂СН₂СН₂СН₂-), 1,5-бутилиден(-СН₂СН₂СН₂СН₂СН₂-) и т.д. Алкилен может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения одним или более заместителями, предпочтительно независимо необязательно выбранными из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин «алкокси» относится к -О-(алкилу) и -O-(незамещенному циклоалкилу), где алкил или циклоалкил является таким, как определено выше. Неограничивающие примеры алкокси включают метокси, этокси, пропокси, бутокси, циклопропилокси, циклобутокси, циклопентилокси и циклогексилокси. Алкокси может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он является замещенным, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетеро циклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин «циклоалкил» относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому или полициклическому углеводородному заместителю. Циклоалкильное кольцо содержит от 3 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода и наиболее предпочтительно от 3 до 7 атомов углерода. Неограничивающие примеры моноциклического циклоалкила включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогексадиенил, циклогептил, циклогептатриенил, циклооктил и тому подобное. Полициклический циклоалкил включает спироциклоалкил, конденсированный циклоалкил и мостиковый циклоалкил.

Термин «гетероциклил» относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому или полициклическому углеводородному заместителю, содержащему от 3 до 20 атомов в кольце, где один или более атомов кольца представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и S(O)_m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), исключая циклическую часть -О-О-, -O-S- или -S-S-, а остальные атомы кольца представляют собой атомы углерода. Гетероциклоалкил предпочтительно содержит от 3 до 12 атомов в кольце, из которых от 1 до 4 представляют собой гетероатомы; более предпочтительно циклоалкильное кольцо содержит от 3 до 10 атомов в кольце. Неограничивающие примеры моноциклического гетероциклила включают пирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, гомопиперазинил и т.д. Неограничивающие примеры полициклического гетероциклила включают спирогетероциклил, конденсированный гетероциклил и мостиковый гетеро циклил.

Термин «спирогетероциклил» относится к 5-20-членной полициклической гетероциклильной группе, в которой моноциклические кольца имеют один общий атом (называемый спироатомом), где один или более атомов кольца представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и S(O)_m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), а остальные атомы кольца представляют собой атомы углерода. Эти кольца могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из них не имеет полностью сопряженной π-электронной системы. Предпочтительно мостиковый гетероциклил является 6-14-членным, и более предпочтительно 7-10-членным. В зависимости от количества спироатомов, общих для колец, спирогетероциклил может представлять собой моноспирогетероциклил, биспирогетероциклил или полиспирогетероциклил, предпочтительно моноспирогетероциклил и биспирогетероциклил, более предпочтительно 4- членный/4-членный, 4-членный/5-членный, 4-членный/6-членный, 5-членный/5-членный или 5-членный/6-членный моноспирогетероциклил. Неограничивающие примеры спирогетероциклила включают:

Термин «конденсированный гетероциклил» относится к 5-20-членной полициклической гетероциклильной группе, в которой каждое кольцо имеет общую пару соседних атомов с другими кольцами в системе, причем одно или более колец могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из них не имеет полностью сопряженной π-электронной системы, где один или более атомов кольца представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и S(O)_m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), а остальные атомы кольца представляют собой атомы углерода. Предпочтительно мостиковый гетероциклил является 6-14-членным, и более предпочтительно 7-10-членным. В зависимости от количества образованных колец конденсированный гетероциклил может представлять собой бициклический, трициклический, тетрациклический или полициклический конденсированный гетероциклил, предпочтительно бициклический или трициклический конденсированный гетероциклил, и более предпочтительно 5-членный/5-членный или 5-членный/6-членный бициклический конденсированный гетероциклил. Неограничивающие примеры конденсированного гетероциклила включают:

Термин «мостиковый гетероциклил» относится к 5-14-членной полициклической гетероциклильной группе, в которой любые два кольца имеют два общих атома, которые напрямую не связаны друг с другом, где эти кольца могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из них не имеет полностью сопряженной π-электронной системы, где один или более атомов кольца представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и S(O)_m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), а остальные атомы кольца представляют собой атомы углерода. Предпочтительно мостиковый гетероциклил является 6-14-членным, и более предпочтительно 7-10-членным. В зависимости от количества образованных колец мостиковый гетероциклил может представлять собой бициклический, трициклический, тетрациклический или полициклический мостиковый гетероциклил, предпочтительно бициклический, трициклический или тетрациклический мостиковый гетероциклил и более предпочтительно бициклический или трициклический мостиковый гетероциклил. Неограничивающие примеры мостикового гетероциклила включают:

Гетероциклильное кольцо может быть конденсировано с арильным, гетероарильным или циклоалкильным кольцом, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой гетероциклил. Неограничивающие примеры гетероциклильного кольца включают, не ограничиваясь перечисленным:

и т.д.

Гетероциклил может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он является замещенным, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин «арил» относится к 6-14-членной, предпочтительно 6-10-членной углеродной моноциклической или конденсированной полициклической (т.е. где кольца имеют общую пару соседних атомов углерода) группе, имеющей сопряженную π-электронную систему, такой как фенил и нафтил, предпочтительно фенил. Арильное кольцо может быть конденсировано с гетероарильным, гетероциклильным или циклоалкильным кольцом, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой арильное кольцо. Неограничивающие примеры арильного кольца включают, не ограничиваясь перечисленным:

Арил может быть замещенным или незамещенным, и когда он является замещенным, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин «гетероарил» относится к гетероароматической системе, содержащей от 1 до 4 гетероатомов и от 5 до 14 атомов в кольце, где гетероатомы выбраны из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Гетероарил предпочтительно является 5-10-членным, более предпочтительно 5- или 6-членным, например, фуранил, тиенил, пиридинил, пирролил, N-алкилпирролил, пиримидинил, пиразинил, имидазолил и тетразолил. Гетероарильное кольцо может быть конденсировано с арильным, гетероциклильным или циклоалкильным кольцом, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой гетероарильное кольцо. Неограничивающие примеры гетеро арильного кольца включают:

Гетероарил может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он является замещенным, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин «аминозащитная группа» относится к группе, которая легко может быть удалена и предназначена для защиты аминогруппы от изменения при проведении реакции в другом месте молекулы. Неограничивающие примеры аминозащитной группы включают 9-флуоренилметоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, ацетил, бензил, аллил, п-метоксибензил и т.д. Эти группы могут быть необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, алкокси и нитро. Аминозащитная группа предпочтительно представляет собой 9-флуоренилметоксикарбонил.

Термин «циклоалкилалкил» относится к алкилу, замещенному одной или более циклоалкильными группами, предпочтительно одной циклоалкильной группой, где алкил является таким, как определено выше, и циклоалкил является таким, как определено выше.

Термин «галогеналкил» относится к алкилу, замещенному одним или более атомами галогена, где алкил является таким, как определено выше.

Термин «дейтерированный алкил» относится к алкилу, замещенному одним или более атомами дейтерия, где алкил является таким, как определено выше.

Термин «гидрокси» относится к группе -ОН.

Термин «галоген» относится к фтору, хлору, брому или иоду.

Термин «амино» относится к -NH₂.

Термин «нитро» относится к -NO₂.

Термин «циано» относится к -CN.

Термин «необязательный» или «необязательно» означает, что событие или обстоятельство, описанное далее, может, но не обязательно должно, произойти, и что описание включает случаи, когда это событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, «необязательно содержащий 1-3 вариабельные области тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельные области тяжелой цепи антитела с определенными последовательностями могут присутствовать, но не обязательно присутствуют.

Термин «замещенный» означает, что один или более, предпочтительно до 5, более предпочтительно от 1 до 3 атомов водорода в группе независимо замещены соответствующим количеством заместителей. Очевидно, что заместитель расположен только в его возможных химических положениях, и специалисты в данной области техники смогут определить (экспериментально или теоретически) возможные или невозможные замены, не прилагая чрезмерных усилий. Например, замена может быть нестабильной, когда амино- или гидроксигруппа, имеющая свободный водород, связана с атомом углерода, имеющим ненасыщенную (например, олефиновую) связь.

Термин «лекарственная нагрузка» (DAR) относится к среднему количеству цитотоксического лекарственного средства, загруженного на каждое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в ADC, и может также быть представлено как отношение лекарственного средства к антителу, которое представляет собой целое или десятичное число. В вариантах осуществления настоящего изобретения лекарственная нагрузка представлена как п, и иллюстративные значения могут представлять собой среднее значение из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. Среднее количество лекарственных средств на молекулу ADC после реакций связывания может быть охарактеризовано обычными методами, такими как спектроскопия в УФ/видимой области, масс-спектрометрия, анализы ELISA и ВЭЖХ.

Термин «распределение лекарственной нагрузки» относится к распределению антител, связанных с различным количеством лекарственных средств, в популяции конъюгатов антитело-лекарственное средство, например, к распределению антител, связанных с 0, 2, 4, 6 и 8 лекарственными средствами, в популяции. Причем DAR, составляющие 1, 3, 5 и 7 лекарственных средств, также могут быть включены в смесь из-за потенциального образования продуктов разложения. В настоящем изобретении распределение лекарственной нагрузки антител может быть охарактеризовано с помощью тяжелых цепей антитела, связывающихся с разным количеством лекарственных средств, например: Н₀ представляет собой тяжелую цепь, не связывающуюся с лекарственными средствами, H₁ представляет собой тяжелую цепь, связывающуюся с одним лекарственным средством, Н₂ представляет собой тяжелую цепь, связывающуюся с двумя лекарственными средствами, Н₃ представляет собой тяжелую цепь, связывающуюся с тремя лекарственными средствами, и Н₄ представляет собой тяжелую цепь, связывающуюся с четырьмя лекарственными средствами. Для иллюстрации, доля Н₃, равная 4%, означает, что в популяции тяжелых цепей конъюгатов антитело-лекарственное средство доля тяжелых цепей, связывающихся с тремя лекарственными средствами, составляет 4%. Соответственно, распределение лекарственной нагрузки антител в настоящем изобретении также может быть охарактеризовано с помощью легких цепей антитела, связывающихся с разным количеством лекарственных средств, где L₀ представляет собой легкую цепь антитела, не связывающуюся с лекарственными средствами, и L₁ представляет собой легкую цепь антитела, связывающуюся с одним лекарственным средством.

«Дача», «введение» и «лечение» применительно к животным, людям, подопытным субъектам, клеткам, тканям, органам или биологическим жидкостям относятся к контакту экзогенного лекарственного средства, терапевтического агента, диагностического агента или композиции с указанными животными, людьми, субъектами, клетками, тканями, органами или биологическими жидкостями. «Дача», «введение» и «лечение» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным методам. Обработка клеток включает приведение реагента в контакт с клетками, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клетками. «Дача», «введение» и «лечение» также относятся к обработке, например, клетки реагентом, диагностической, связывающей композицией или другой клеткой in vitro и ex vivo. «Лечение», применительно к человеку, субъектам ветеринарного лечения или субъектам исследования, относится к терапевтическому лечению, превентивным или профилактическим мерам, а также исследовательским и диагностическим применениям.

«Лечение» или «осуществление лечения» относится к введению терапевтического агента, такого как композиция, содержащая любое из конъюгированных соединений согласно настоящему изобретению, внутрь или экстракорпорально пациенту, у которого есть один или более симптомов заболевания, при котором терапевтический агент, как известно, оказывает терапевтический эффект. Обычно терапевтический агент вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания у получающего лечение пациента или популяции, чтобы вызвать регресс таких симптомов или подавить развитие таких симптомов в любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического агента, эффективное для облегчения симптомов заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как патологическое состояние, возраст и масса тела пациента, а также способность лекарственного средства оказывать желаемый терапевтический эффект у пациента. Был ли облегчен симптом заболевания, можно оценить с помощью любых методов клинического тестирования, обычно используемых врачами или другими специалистами в области здравоохранения для оценки степени тяжести или прогрессирования симптома. Хотя варианты осуществления настоящего изобретения (например, способы лечения или продукты) могут быть неэффективны для облегчения симптомов каждого представляющего интерес заболевания, они должны ослаблять симптомы представляющего интерес заболевания у статистически значимого количества пациентов, что определяют с помощью любых статистических методов тестирования, известных в данной области техники, таких как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Краскела-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона.

«Эффективное количество» включает количество, достаточное для облегчения или предотвращения симптома или состояния медицинского заболевания. Эффективное количество также относится к количеству, достаточному для обеспечения или облегчения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, способ, путь и дозировка введения, а также тяжесть побочных действий. Эффективным количеством может быть максимальная доза или схема введения, позволяющая избежать значительных побочных действий или токсических действий.

«Обмен» относится к замене системы растворителей, которая солюбилизирует белок антитела. Например, систему растворителей с высоким содержанием солей или гипертонических растворителей, содержащую белок антитела, заменяют с помощью физических операций буферной системой стабильного состава, так что белок антитела присутствует в стабильном составе. Такие физические операции включают, не ограничиваясь перечисленным, ультрафильтрацию, диализ или восстановление после центрифугирования.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1А показаны результаты теста на стабильность в плазме для ADC-19 согласно настоящему изобретению.

На ФИГ. 1В показаны результаты теста на стабильность в плазме для ADC-18 согласно настоящему изобретению.

На ФИГ. 1С показаны результаты теста на стабильность в плазме для ADC-20 согласно настоящему изобретению.

На ФИГ. 2 показана оценка эффективности ADC-21 и ADC-24 на мышах с опухолями ЛМТ-1.

На ФИГ. 3 показана оценка терапевтического действия ADC у голых мышей с ксенотрансплантатом клеток рака молочной железы человека SK-BR-3.

На ФИГ. 4 показаны результаты теста на стабильность в плазме для ADC-25 согласно настоящему изобретению.

На ФИГ. 5 показано терапевтическое действие ADC у голых мышей с ксенотрансплантатом астроцитомы головного мозга человека U87MG.

На ФИГ. 6 показано терапевтическое действие ADC у голых мышей с ксенотрансплантатом клеток Detroit 562 фарингеального рака человека, метастазирующего в плевральный выпот.

На ФИГ. 7 показано терапевтическое действие ADC у голых мышей с ксенотрансплантатом глиобластомы человека U87MG.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение дополнительно описано ниже со ссылкой на примеры, но эти примеры не ограничивают объем настоящего изобретения.

Экспериментальные процедуры, для которых в примерах настоящего изобретения не указано конкретных условий, обычно проводят в соответствии с обычными условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем исходных веществ или коммерческих продуктов. Реагенты без указания конкретного происхождения являются коммерчески доступными обычными реагентами.

I. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство и его свойства и биологические испытания Структуры соединений были определены с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и/или масс-спектрометрии (МС). Спектры ЯМР измеряли с использованием прибора для ядерного магнитного резонанса Bruker AVANCE-400 с использованием дейтерированного диметилсульфоксида (ДМСО-d6), дейтерированного хлороформа (CDCl₃) и дейтерированного метанола (CD₃OD) в качестве растворителей для определения, и тетраметилсилана (TMS) в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги приведены в единицах 10^-6 (ppm).

Спектры МС измеряли с использованием масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ESI) (производитель: Thermo, модель: Finnigan LCQ advantage MAX).

УВЭЖХ-анализ проводили с использованием системы жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией Waters Acquity UPLC SQD.

ВЭЖХ-анализ проводили с использованием жидкостного хроматографа высокого давления Agilent 1200DAD (хроматографическая колонка Sunfire С18 150 × 4,6 мм) и жидкостного хроматографа высокого давления Waters 2695-2996 (хроматографическая колонка Gimini С18 150 × 4,6 мм).

УФ-ВЭЖХ-анализ проводили с использованием УФ-спектрофотометра Thermo nanodrop2000.

Степени ингибирования пролиферации и значения IC₅₀ измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов PHERA starFS (BMG, Германия).

Силикагелевые пластины Yantai Huanghai HSGF254 или Qingdao GF254 с размерами от 0,15 мм до 0,2 мм были выбраны для анализа методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и от 0,4 мм до 0,5 мм для разделения и очистки методом ТСХ.

В качестве носителя для колоночной хроматографии, как правило, использовали силикагель Yantai Huanghai на 200-300 меш.

Известные исходные вещества, описанные в настоящем документе, могут быть синтезированы известными в данной области техники способами или могут быть приобретены у ABCR GmbH & Co.KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc, Chembee Chemicals и т.д.

В Примерах реакции проводили в атмосфере аргона или атмосфере азота, если не указано иное.

Атмосфера аргона или атмосфера азота означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим приблизительно 1 л аргона или азота.

Атмосфера водорода означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим приблизительно 1 л водорода.

В реакциях гидрирования под давлением использовали гидрогенизатор Parr 3916EKX, гидрогенизатор Qinglan QL-500 или гидрогенизатор HC2-SS.

Реакции гидрирования обычно включают 3 цикла вакуумирования и продувки водородом.

В реакциях под воздействием микроволнового излучения использовали микроволновый реактор СЕМ Discover-S 908860.

В Примерах раствор в реакции относится к водному раствору, если не указано иное.

В Примерах температура реакции представляет собой комнатную температуру, если не указано иное.

Комнатная температура является оптимальной температурой реакции, которая колеблется от 20°С до 30°С.

Приготовление буфера PBS с рН 6,5 в примерах: 8,5 г KH₂PO₄, 8,56 г K₂HPO_4⋅3Н₂О, 5,85 г NaCl и 1,5 г ЭДТА добавляли в колбу и доводили объем до 2 л. Все добавки растворяли ультразвуком, и раствор хорошо перемешивали путем встряхивания с получением желаемого буфера.

Система элюентов для колоночной хроматографии и система проявляющих растворителей для тонкослойной хроматографии, использованные для очистки соединения, включают следующие: А: система из дихлорметана и изопропанола, В: система из дихлорметана и метанола и С: система из петролейного эфира и этилацетата. Объемное соотношение растворителей регулировали в соответствии с полярностью соединения или путем добавления небольшого количества триэтиламина и кислотного или основного реагента.

Некоторые из соединений согласно настоящему изобретению охарактеризованы с помощью Q-TOF ЖХ-МС (тандемная квадруполь-времяпролетная жидкостная хромато-масс-спектрометрия). В анализе Q-TOF ЖХ-МС использовали квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр Agilent 6530 с определением точной массы и ультравысокоэффективный жидкостный хроматограф Agilent 1290-Infinity (хроматографическая колонка Agilent Poroshell 300SB-C8 5 мкм, 2,1 × 75 мм).

Пример 1-1

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопропан-1-карбоксамид 1

К мезилату экзатекана 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль, полученному способом, раскрытым в патентной заявке «ЕР0737686 А1») добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина. Реакционный раствор перемешивали до тех пор, пока он не стал прозрачным. К реакционному раствору последовательно добавляли 1-гидроксициклопропилкарбоновую кислоту 1а (1,4 мг, 3,7 мкмоль, полученную известным способом «Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984») и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (3,8 мг, 13,7 мкмоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 2 ч, останавливали реакцию 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 1 (1,6 мг, выход 82,1%).

МС m/z (ESI): 520,2 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,90-7,84 (m, 1H), 7,80-7,68(m, 1H), 5,80-5,70 (m, 1H), 5,62-5,54(m, 2Н), 5,44-5,32 (m, 2Н), 5,28-5,10 (m, 2Н), 3,40-3,15 (m, 3Н), 2,44 (s, 3Н), 2,23(t, 1H), 2,06-1,75 (m, 2Н), 1,68-1,56 (m, 1H), 1,22-1,18 (m, 2Н), 1,04-0,98 (m, 2Н), 0,89 (t, 3Н).

Пример 1-2

(S)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-А

(R)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-В

К 1b (4 мг, 7,53 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида. Смесь трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционный раствор перемешивали до тех пор, пока он не стал прозрачным. К реакционному раствору последовательно добавляли 2-циклопропил-2-гидроксиуксусную кислоту 2а (2,3 мг, 19,8 мкмоль, полученную способом, раскрытым в патентной заявке «WO2013106717»), 1-гидроксибензотриазол (3 мг, 22,4 мкмоль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (4,3 мг, 22,4 мкмоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 1 ч. Баню с ледяной водой убирали, реакционный раствор нагревали до 30°С, перемешивали в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 2 очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), и соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (2-А: 1,5 мг, 2-В: 1,5 мг).

MC m/z (ESI): 534,0.[М+1].

Соединение в единственной конфигурации 2-В (более короткое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,06 мин; чистота: 88% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,37 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,58-5,56 (m, 1Н), 5,48 (d, 1H), 5,41 (s, 2Н), 5,32-5,29 (m, 2Н), 3,60 (t, 1H), 3,19-3,13 (m, 1Н), 2,38 (s, 3H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,98 (q, 2Н), 1,87-1,83 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,34-1,28 (m, 1H), 0,86 (t, 3Н), 0,50-0,39 (m, 4Н).

Соединение в единственной конфигурации 2-А (более долгое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,10 мин; чистота: 86% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,35 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,58-5,53 (m, 1H), 5,42 (s, 2Н), 5,37 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 3,62 (t, 1H), 3,20-3,15 (m, 2Н), 2,40 (s, 3Н), 2,25-2,16 (m, 1H), 1,98 (q, 2Н), 1,87-1,82 (m, 1Н), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,21-1,14 (m, 1Н), 0,87 (t, 3Н), 0,47-0,35 (m, 4Н).

Пример 1-3

(S)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионамид 3-А

(R)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионамид 3-В

К 1b (5,0 мг, 9,41 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционный раствор перемешивали до тех пор, пока он не стал прозрачным. К реакционному раствору последовательно добавляли 3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионовую кислоту 3а (4,1 мг, 28,4 мкмоль, поставщик Alfa), 1-гидроксибензотриазол (3,8 мг, 28,1 мкмоль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (5,4 мг, 28,2 мкмоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 10 мин. Баню с ледяной водой убирали, реакционный раствор нагревали до 30°С, перемешивали в течение 8 ч и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 3 очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), и соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (1,5 мг, 1,5 мг).

MC m/z (ESI): 561,9.[М+1].

Соединение в единственной конфигурации (более короткое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,11 мин; чистота: 88% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,94 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,20 (d, 1Н), 6,53 (s, 1H), 5,61-5,55 (m, 1H), 5,45-5,23 (m, 3Н), 5,15-5,06 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3Н), 2,26-2,20 (m, 1H), 2,16-2,08 (m, 1H), 2,02-1,94 (m, 1H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3Н).

Соединение в единственной конфигурации (более долгое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,19 мин; чистота: 90% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,97 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,53 (s, 1Н), 5,63-5,55 (m, 1H), 5,45-5,20 (m, 3Н), 5,16-5,07 (m, 1Н), 4,66-4,57 (m, 1Н), 3,18-3,12 (m, 1Н), 2,40 (s, 3H), 2,22-2,14 (m, 1H), 2,04-1,95 (m, 2Н), 1,89-1,82 (m, 1Н), 1,50-1,40 (m, 1Н), 0,87 (t, 3Н).

Пример 1-4

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопентан-1-карбоксамид 4

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина. Реакционный раствор перемешивали до тех пор, пока он не стал прозрачным. К реакционному раствору последовательно добавляли 1-гидроксициклопентанкарбоновую кислоту 4а (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную способом, раскрытым в патентной заявке «WO2013106717») и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (4,7 мг, 16,9 мкмоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 1 ч, останавливали реакцию 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 4 (2,5 мг, выход 80,9%).

MC m/z (ESI): 548,0.[М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,73-7,62 (m, 2Н), 5,75-5,62 (m, 1H), 5,46-5,32 (m, 2Н), 5,26-5,10 (m, 1H), 3,30-3,10 (m, 1H), 2,43 (s, 3Н), 2,28-2,20 (m, 2Н), 2,08-1,84 (m, 8Н), 1,69-1,58 (m, 2Н), 1,04-1,00 (m, 2Н), 0,89 (t, 3Н).

Пример 1-5

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклопропан-1-карбоксамид 5

К 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина. Реакционный раствор перемешивали до тех пор, пока он не стал прозрачным. К реакционному раствору последовательно добавляли 1-гидроксициклопентанкарбоновую кислоту 5а (0,87 мг, 7,5 мкмоль, полученную способом, раскрытым в патентной заявке «WO201396771») и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (2 мг, 7,24 мкмоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 2 ч, останавливали реакцию 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 5 (1,0 мг, выход 50%).

MC m/z (ESI): 533?9.[М+1].

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 8,07 (s, 1H), 7,23-7,18 (m, 2Н), 6,71-6,64 (m, 1H), 6,55-6,51 (m, 1H), 5,36-5,27 (m, 2Н), 4,67-4,61 (m, 2Н), 3,53-3,48 (m, 1H), 3,30-3,22 (m, 2Н), 3,18-3,13 (m, 1Н), 2,71-2,61 (m, 2Н), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,04-1,91 (m, 4Н), 1,53-1,40 (m, 3Н), 0,91-0,75 (m, 4Н).

Пример 1-6

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоксамид 6

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина.

Реакционный раствор перемешивали до тех пор, пока он не стал прозрачным. К реакционному раствору последовательно добавляли 1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоновую кислоту 6а (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную способом, раскрытым в документе «Journal of the American Chemical Society, 2014, vol. 136, №22, c. 8138-8142») и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (4,7 мг, 16,9 мкмоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 1 ч, останавливали реакцию 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 6 (2,1 мг, выход 67,9%).

MC m/z (ESI): 548,0.[М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 7,85-7,62 (m, 1H), 6,88 (br, 1H), 5,87-5,48 (m, 2Н), 5,47-5,33 (m, 1H), 5,31-5,06 (m, 1Н), 4,25-3,91 (m, 2Н), 3,25 (br, 1H), 2,60-2,32 (m, 3Н), 2,23 (t, 1H), 2,15-1,95 (m, 3H), 1,70-1,56 (m, 2Н), 1,41-1,17 (m, 9Н), 1,03 (s, 1H), 0,95-0,80 (m, 2Н).

Пример 1-7

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклобутан-1-карбоксамид 7

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционный раствор перемешивали до тех пор, пока он не стал прозрачным. К реакционному раствору последовательно добавляли 1-гидроксициклобутанкарбоновую кислоту 7а (2,0 мг, 17,22 мкмоль, поставщик PharmaBlock), 1-гидроксибензотриазол (2,3 мг, 17,0 мкмоль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (3,2 мг, 16,7 мкмоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 10 мин. Баню с ледяной водой убирали, реакционный перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 7 (2,5 мг, выход 83,1%).

MC m/z (ESI): 534,0.[М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,28 (d, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 6,51 (s, 1Н), 6,12 (s, 1Н), 5,59-5,51 (m, 1Н), 5,41 (s, 2Н), 5,20-5,01 (m, 2Н), 3,27-3,17 (m, 1Н), 3,15-3,05 (m, 1Н), 2,71-2,63 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,12-2,05 (m, 1H), 2,03-1,94 (m, 2Н), 1,92-1,78 (m, 4Н), 1,50-1,42 (m, 1H), 0,90-0,83 (m, 4Н).

Пример 1-8

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаэйкозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Стадия 1

Бензил-1-((2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоксилат 8 с

В реакционную колбу добавляли бензил-1-гидроксициклопропан-1-карбоксилат 8а (104 мг, 0,54 ммоль; полученный способом, раскрытым в патентной заявке «US2005/20645») и 2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метил ацетат 8b (100 мг, 0,27 ммоль; полученный способом, раскрытым в патентной заявке «CN105829346A»), с последующим добавлением 5 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли трет-бутилат калия (61 мг, 0,54 ммоль). Ледяную баню убирали, реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 мин, добавляли 20 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 3 мл 1,4-диоксана и добавляли 0,6 мл воды, бикарбонат натрия (27 мг, 0,32 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиат (70 мг, 0,27 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 20 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 8 с (100 мг, выход 73,6%).

MC m/z (ESI): 501,0.[М+1].

Стадия 2

1-((2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоновая кислота 8d

8 с (50 мг, 0,10 ммоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (об.:об.=2:1) и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (25 мг, загрузка 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционный раствор фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 8d (41 мг, выход 100%).

МС m/z (ESI): 411,0.[М+1].

Стадия 3

(9Н-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклопропокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 8е

В реакционную колбу добавляли 1b (7 мг, 0,013 ммоль) с последующим добавлением 1 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина, раствора 8d (7 мг, 0,017 ммоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамид и хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (7 мг, 0,026 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 35 мин, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (5 мл х 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 8е (8,5 мг, выход 78,0%).

MC m/z (ESI): 828,0.[М+1].

Стадия 4

1-((2-Аминоацетиламино)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8f

8е (4 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,2 мл дихлорметана и добавляли 0,1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 8f (2,9 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

МС m/z (ESI): 606,0.[М+1].

Стадия 5

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаэйкозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Неочищенный 8f (2,9 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,5 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением раствора (S)-2-2-(-2-(6-(2,5-диоксо-1Н-пиррол-1-ил)гексанамидо)ацетиламино)-3-фенилпропионовой кислоты 8g (2,7 мг, 5,80 ммоль, полученной способом, раскрытым в патентной заявке «ЕР2907824)) в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (2,7 мг, 9,67 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 30 мин, после чего ледяную баню. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 15 мин, и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 8 (2 мг, выход 39,0%).

MCm/z (ESI): 1060,0.[М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 9,01 (d, 1H), 8,77 (t, 1H), 8,21 (t, 1H), 8,08-7,92 (m, 2Н), 7,73 (d, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,24-7,07 (m, 4Н), 6,98 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,61 (q, 1H), 5,40 (s, 2Н), 5,32 (t, 1Н), 5,12 (q, 2H), 4,62 (t, 1H), 4,52 (t, 1H), 4,40-4,32 (m, 1H), 3,73-3,47 (m, 8H), 3,16-3,04 (m, 2H), 2,89 (dd, 1H), 2,69-2,55 (m, 2H), 2,37-2,23 (m, 4H), 2,12-1,93 (m, 4H), 1,90-1,74 (m, 2H), 1,52-1,38 (m, 4H), 1,33-1,11 (m, 5H), 0,91-0,81 (m, 4H).

Пример 1-9

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-А

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-В

Стадия 1

Бензил-2-циклопропил-2-гидроксиацетат 9а 2а (1,3 г, 11,2 ммоль; полученный способом, раскрытым в патентной заявке «WO2013/106717») растворяли в 50 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (6,18 г, 44,8 ммоль), бензилбромид (1,33 мл, 11,2 ммоль) и иодид тетрабутиламмония (413 мг, 1,1 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом (10 мл). Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 9а (2 мг, выход 86,9%).

Стадия 2

Бензил-10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 9b

В реакционную колбу добавляли 9а (120,9 мг, 0,586 ммоль) и 8b (180 мг, 0,489 ммоль) с последующим добавлением 4 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли трет-бутилат калия (109 мг, 0,98 ммоль). Ледяную баню убирали, реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 40 мин, добавляли 10 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (20 мл × 2) и хлороформом (10 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 4 мл диоксана и добавляли 2 мл воды, бикарбонат натрия (49,2 мг, 0,586 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиат (126 мг, 0,49 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, добавляли 20 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 9b (48 мг, выход 19%).

МС m/z (ESI): 515,0.[М+1].

Стадия 3

10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-овая кислота 9с

9b (20 мг, 0,038 ммоль) растворяли в 4,5 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (об.:об.=2:1) и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (12 мг, загрузка 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционный раствор фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 9с (13 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 424,9 [М+1].

Стадия 4

(9Н-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 9d

В реакционную колбу добавляли 1b (10 мг, 18,8 мкмоль) с последующим добавлением 1 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина, неочищенного продукта 9 с (13 мг, 30,6 мкмоль) и хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (16,9 мг, 61,2 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 40 мин, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 9d (19 мг, выход 73,6%).

MC m/z (ESI): 842,1.[М+1].

Стадия 5

2-((2-аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)ацетамид 9е

9d (19 мг, 22,6 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и оставляли. Затем супернатант удаляли, а твердое вещество сохраняли. Твердый остаток концентрировали при пониженном давлении и сушили с помощью масляного насоса с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 9е (17 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 638,0.[М+18].

Стадия 6

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-А

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-В

Неочищенный 9е (13,9 мг, 22,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли раствор 8g (21,2 мг, 44,8 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (18,5 мг, 67,3 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 10 мин, после чего ледяную баню. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч с получением соединения 9. Реакционный раствор очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (9-А: 2,4 мг, 9-В: 1,7 мг).

MCm/z (ESI): 1074,4.[М+1].

Соединение в единственной конфигурации 9-А (более короткое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,14 мин; чистота: 85% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,60 (t, 1H), 8,51-8,49 (d, 1H), 8,32-8,24 (m, 1Н), 8,13-8,02 (m, 2Н), 8,02-7,96 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,15 (m, 4Н), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 2Н), 5,35-5,15 (m, 3Н), 4,74-4,62 (m, 1Н), 4,54-4,40 (m, 2Н), 3,76-3,64 (m, 4Н), 3,62-3,48 (m, 2Н), 3,20-3,07 (m, 2Н), 3,04-2,94 (m, 1H), 2,80-2,62 (m, 1H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,15 (m, 2Н), 2,15-2,04 (m, 2Н), 1,93-1,78 (m, 2Н), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 5Н), 0,87 (t, 3H), 0,64-0,38 (m, 4Н). Соединение в единственной конфигурации 9-В (более долгое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,16 мин; чистота: 89% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,68-8,60 (m, 1H), 8,58-8,50 (m, 1H), 8,32-8,24 (m, 1Н), 8,13-8,02 (m, 2Н), 8,02-7,94 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,13 (m, 3H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,60-5,50 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 2H), 4,78-4,68 (m, 1H), 4,60-4,40 (m, 2H), 3,76-3,58 (m, 4H), 3,58-3,48 (m, 1H), 3,20-3,10 (m, 2H), 3,08-2,97 (m, 2H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,13 (m, 2H), 2,13-2,04 (m, 2H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,91-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 4H), 0,91-0,79 (m, 3H), 0,53-0,34 (m, 4H).

Пример 1-10

N-((2S,10S)-10-бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-А

N-((2R,10S)-10-бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-В

Стадия 1

Бензил-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионат 10а

3а (1,80 г, 12,5 ммоль) растворяли в 100 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (5,17 г, 37,5 ммоль), бензилбромид (4,48 мл, 37,5 ммоль) и иодид тетрабутиламмония (231 мг, 0,63 ммоль). Реакционный раствор нагревали до 60°С и перемешивали в течение 5 часов, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 10а (980 мг, выход 33,5%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,43-7,36 (m, 5Н), 5,34 (s, 2Н), 4,53 (s, 1H), 3,44 (s, 1H).

Стадия 2

Бензил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-10-(трифторметил)-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 10b

В реакционную колбу добавляли 8b (63 мг, 0,17 ммоль) и 10а (80 мг, 0,34 ммоль) с последующим добавлением 3 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли трет-бутилат калия (38 мг, 0,34 ммоль). Ледяную баню убирали, реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 20 мин, добавляли 10 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (20 мл × 2) и хлороформом (10 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали, полученный остаток растворяли в 2 мл диоксана и добавляли 0,4 мл воды с последующим добавлением бикарбоната натрия (19 мг, 0,23 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиата (49 мг, 0,19 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 20 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 10b (51 мг, выход 55,3%).

MC m/z (ESI): 559,9 [М+18].

Стадия 3

1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-10-(трифторметил)-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-овая кислота 10 с

10b (15 мг, 0,28 ммоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (об.:об.=2:1) и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (15 мг, загрузка 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционный раствор фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 10с (13 мг).

MC m/z (ESI): 452,9 [М+1].

Стадия 4

(9Н-флуорен-9-ил)метил(2-((((3-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,1,1-трифтор-3-оксопроп-2-ил)окси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 10d

В реакционную колбу добавляли 1b (10 мг, 18,8 мкмоль) с последующим добавлением 1 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина, раствора 10 с (13 мг, 28,7 мкмоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамид и хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (11 мг, 39,7 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 30 мин, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 10d (16 мг, выход 97,8%).

MC m/z (ESI): 870,0 [М+1].

Стадия 5

2-((2-Аминоацетиламино)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-ди оксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифторпропионамид 10е

10d (16 мг, 18,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана и добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и оставляли. Затем супернатант удаляли, а твердое вещество сохраняли; эти процедуры повторяли трижды. Твердый остаток концентрировали при пониженном давлении и сушили с помощью масляного насоса с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 10е (12 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 647,9 [М+1].

Стадия 6

N-((2S,10S)-10-бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-А

N-((2R,10S)-10-бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-В

Неочищенный 10е (12 мг, 18,5 мкмоль) растворяли в 1,0 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли раствор 8g (14 мг, 29,6 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (15 мг, 54,2 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 30 мин, после чего ледяную баню. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч с получением соединения 10. Реакционный раствор очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (2,7 мг, 2,6 мг).

MC m/z (ESI): 1102,0 [М+1].

Соединение в единственной конфигурации (более короткое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,18 мин; чистота: 91% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,97 (d, 1H), 8,85-8,76 (m, 1H), 8,37-8,27 (m, 1H), 8,12-8,02 (m, 1H), 8,02-7,95 (m, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,10 (m, 4Н), 6,99 (s, 1H), 6,66 (br, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,37-5,25 (m, 3H), 5,23-5,13 (m, 1H), 4,81-4,68 (m, 2Н), 4,51-4,41 (m, 1Н), 3,78-3,45 (m, 6Н), 3,21-3,13 (m, 1H), 3,02-2,93 (m, 1Н), 2,77-2,63 (m, 2Н), 2,45-2,29 (m, 3H), 2,24-2,05 (m, 3H), 2,04-1,93 (m, 5Н), 1,90-1,75 (m, 2Н), 1,52-1,38 (m, 4Н), 0,90-0,78 (m, 5Н).

Соединение в единственной конфигурации (более долгое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,23 мин; чистота: 90% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 9,05 (d, 1H), 8,97-8,88 (m, 1H), 8,35-8,27 (m, 1H), 8,11-8,03 (m, 1H), 8,02-7,95 (m, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,29-7,13 (m, 4Н), 6,99 (s, 1H), 6,66 (br, 1H), 6,54 (s, 1H), 5,64-5,55 (m, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,36-5,20 (m, 3H), 4,92-4,85 (m, 1H), 4,82-4,72 (m, 2H), 4,52-4,42 (m, 1H), 3,77-3,48 (m, 6H), 3,21-3,14 (m, 1H), 3,03-2,95 (m, 1H), 2,79-2,65 (m, 2H), 2,47-2,28 (m, 3H), 2,25-2,05 (m, 3H), 2,05-1,94 (m, 5H), 1,91-1,76 (m, 2H), 1,52-1,37 (m, 4H), 0,92-0,77 (m, 5H).

Пример 1-11

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаэйкозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 11

Стадия 1

Бензил-1-((2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклобутан-1-карбоксилат 11b

В реакционную колбу добавляли бензил-1-гидроксициклобутанкарбоксилат 11а (167 мг, 0,81 ммоль, полученный способом, раскрытым в документе «Journal of Medicinal Chemistry, 2013, vol. 56, №13, с. 5541-5552») и 8b (150 мг, 0,41 ммоль) с последующим добавлением 5 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли трет-бутилат калия (92 мг, 0,82 ммоль). Ледяную баню убирали, реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 мин, добавляли 20 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали, полученный остаток растворяли в 3 мл диоксана и добавляли 0,6 мл воды с последующим добавлением бикарбоната натрия (41 мг, 0,48 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиата (105 мг, 0,41 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 20 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 11b (37 мг, выход 17,6%).

MC m/z (ESI): 514,6 [М+1].

Стадия 2

1-((2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклобутан-1-карбоновая кислота 11 с

11b (37 мг, 71,9 мкмоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (об.:об.=2:1) и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (15 мг, загрузка 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционный раствор фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 11 с (35 мг, выход 82%), который непосредственно использовали на следующей стадии.

Стадия 3

(9Н-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклобутокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 11d В реакционную колбу добавляли 1b (10 мг, 0,018 ммоль) с последующим добавлением 1 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина, раствора 11 с (13 мг, 0,031 ммоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамид и хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (25 мг, 0,091 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 40 мин, добавляли 8 мл воды и экстрагировали этилацетатом (5 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (8 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей А с получением указанного в заголовке продукта 11d (19 мг, выход 73,9%).

MC m/z (ESI): 842,3 [М+1].

Стадия 4

1-((2-Аминоацетиламино)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 11е

11d (19 мг, 22,6 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 4 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 11е (15 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

Стадия 5

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаэйкозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 11

Неочищенный 11е (2 мг, 3,22 мкмоль) растворяли в 0,5 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли раствор 8g (1,5 мг, 3,17 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (2,7 мг, 9,67 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и концентрировали досуха с помощью масляного насоса для удаления ДМФА, а остаток растворяли в ДХМ и дважды очищали непосредственно тонкослойной хроматографией (полярность проявляющего растворителя: ДХМ/МеОН = 10/1) с получением указанного в заголовке продукта 11 (1 мг, выход 28,8%).

MC m/z (ESI): 1073,6 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 8,70-8,60 (m, 1Н), 8,28-8,19 (m, 1H), 8,13-7,91 (m, 3H), 7,79-7,71 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,25-7,09 (m, 4Н), 6,98 (s, 1H), 6,71-6,62 (m, 1H), 6,55-6,47 (m, 1H), 5,64-5,54 (m, 2Н), 5,40 (s, 1H), 5,35-5,27 (t, 2Н), 5,17-5,10 (m, 2Н), 4,60-4,51 (m, 1H), 4,51-4,35 (m, 2Н), 3,93-3,78 (m, 3H), 3,71-3,59 (m, 3H), 3,01-2,88 (m, 3H), 2,70-2,64 (m, 2Н), 2,44-2,30 (m, 3H), 2,28-2,14 (m, 3H), 2,11-1,92 (m, 6Н), 1,90-1,76 (m, 3H), 1,51-1,39 (m, 4Н), 0,92-0,75 (m, 6Н).

Пример 1-12

(S)-3-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропионамид 12-А

(R)-3-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропионамид 12-В

Стадия 1

3-циклопропил-2-гидроксипропионовая кислота 12b 12а (0,5 г, 3,87 ммоль, поставщик Adamas) растворяли в 35 мл смешанного растворителя воды и уксусной кислоты (об:об=4:1) и охлаждали реакционный раствор до 0-5°С на бане с ледяной водой, по каплям добавляли 2 М водный раствор нитрита натрия (0,53 г, 7,74 ммоль), нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 ч. К реакционному раствору добавляли твердый хлорид натрия для насыщения водной фазы. Реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (8 мл × 8), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 12b (0,45 г, выход 89,3%).

Стадия 2

(S)-3-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13, 15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропионамид 12-А

(R)-3-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропионамид 12-В

К 1b (45 мг, 0,085 ммоль) добавляли 1,5 мл этанола и 1,5 мл N,N-диметилформамида, реакционный раствор трижды продували аргоном, добавляли по каплям 0,1 мл N-метилморфолина и перемешивали до тех пор, пока раствор не стал прозрачным К реакционному раствору последовательно добавляли соединение 12b (90 мг, 0,691 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (34 мг, 0,251 ммоль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (49 мг, 0,256 ммоль). После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 12 очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: Sharpsil-T С18 5 мкм 21,2 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), с получением указанного в заголовке продукта (7 мг, 15 мг).

MC m/z (ESI): 547,9 [М+1].

Соединение в единственной конфигурации (более короткое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,345 мин; чистота: 72% (хроматографическая колонка: ZORBAX Ecliphase Plus С18 1,8 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,42 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,60-5,50 (m, 2Н), 5,42 (s, 1H), 5,19 (q, 2Н), 4,02-4,00 (m, 1H), 3,21-3,11 (m, 2Н), 2,39 (s, 3H), 2,21-2,07 (m, 2Н), 2,05-1,95 (m, 1H), 1,92-1,68 (m, 4Н), 1,53-1,41 (m, 1Н),0,87 (t, 3H), 0,48-0,34 (m, 2Н), 0,14-0,01 (m, 2Н).

Соединение в единственной конфигурации (более долгое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,399 мин; чистота: 88% (хроматографическая колонка: ZORBAX Ecliphase Plus С18 1,8 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,36 (d, 1H), 7,77 (d, 1Н), 7,31 (s, 1H), 6,51 (s, 1Н), 5,58-5,51 (m, 1H), 5,48 (d, 1H), 5,42 (s, 1Н),5,20 (q, 2Н), 4,09-4,02 (m, 1H), 3,22-3,11 (m, 2Н), 2,39 (s, 3H), 2,27-2,06 (m, 2Н), 2,05-1,95 (m, 1H), 1,93-1,81 (m, 2Н), 1,65-1,43 (m, 2Н), 1,32-1,21 (m, 1H), 0,87 (t, 3H), 0,48-0,33 (m, 2Н), 0,14-0,01 (m, 2Н).

Пример 1-13 (референсный пример) N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид

Указанное в заголовке соединение 13 получали способом, раскрытым в «Примере 76 на с. 147 описания патента ЕР2907824А1».

Пример 1-14

N-((2R,10S)-10-бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-А

N-((2S,10S)-10-бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-В

Стадия 1

Бензил-3-циклопропил-2-гидроксипропионат 14а

12b (200 г, 1,54 ммоль) растворяли в 20 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (1,06 г, 7,68 ммоль), бензилбромид (0,16 мл, 1,34 ммоль) и иодид тетрабутиламмония (28 мг, 0,07 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом (10 мл). Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 14а (140 мг, выход 41,3%).

Стадия 2

Бензил-10-(циклопропилметил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 14b

В реакционную колбу добавляли 14а (94 мг, 0,427 ммоль) и 8b (130 мг, 0,353 ммоль) с последующим добавлением 10 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли трет-бутилат калия (79 мг, 0,704 ммоль) и убирали ледяную баню. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 мин, добавляли 20 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 4). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали, и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 14b (50 мг, выход 26,8%).

MC m/z (ESI): 529,2 [М+1].

Стадия 3

10-(циклопропилметил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-овая кислота 14с

14b (27 мг, 0,051 ммоль) растворяли в 3 мл этилацетата и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (7 мг, загрузка 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционный раствор фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 14с (23 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 439,1 [М+1].

Стадия 4

(9Н-флуорен-9-ил)метил(2-((((3-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1, 2-b]хинолин-1-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)окси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 14d

В реакционную колбу добавляли 1b (22 мг, 42,38 мкмоль) с последующим добавлением 3 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина (4,3 мг, 42,49 мкмоль), неочищенного продукта 14 с (23 мг, 51,1 мкмоль) и хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (17,6 мг, 63,6 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 40 мин, добавляли 15 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (15 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 14d (29 мг, выход 79,9%).

MC m/z (ESI): 856,1 [М+1].

Стадия 5

2-((2-аминоацетамидо)метокси)-3-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)пропанамид 14е

14d (29 мг, 33,9 мкмоль) растворяли в 0,8 мл дихлорметана и добавляли 0,4 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и оставляли. Затем супернатант удаляли; и эти процедуры повторяли трижды. Остаток концентрировали при пониженном давлении и сушили с помощью масляного насоса с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 14е (22 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 634,1 [М+1].

Стадия 6

N-((2R,10S)-10-бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-А

N-((2S,10S)-10-бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-В

Неочищенный 14е (22 мг, 33,9 мкмоль) растворяли в 2,5 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и последовательно добавляли 8g (24 мг, 50,8 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (14 мг, 50,6 мкмоль), и убирали ледяную баню. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч с получением соединения 14. Реакционный раствор очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин) с получением указанного в заголовке продукта (2 мг, 2 мг).

MC m/z (ESI): 1088,4 [М+1].

Соединение в единственной конфигурации (более короткое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,18 мин; чистота: 88% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

Соединение в единственной конфигурации (более долгое время удерживания) УВЭЖХ-анализ: время удерживания: 1,23 мин; чистота: 96% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

Пример 1-15

1-((S)-9-бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 15

Стадия 1

Бензил-1-(10-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклопропан-1-карбоксилат 15b

В реакционную колбу добавляли соединение 8b (500 мг, 1,35 ммоль), 6 мл тетрагидрофурана и бензил-1-гидроксиметилциклопропан-1-карбамат 15а (233 мг, 1,13 ммоль; полученный способом, раскрытым в «Примере 22-2 на с. 262 описания патентной заявки ЕР2862856 А1»). Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли гидрид натрия (54 мг, 1,35 ммоль), и убирали ледяную баню. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 40 мин, затем охлаждали до 0°С, добавляли 20 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 15b (15 мг, выход 2,5%).

MC m/z (ESI): 515,2 [М+1].

Стадия 2

1-(10-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклопропан-1-карбоновая кислота 15с

15b (15 мг, 0,029 ммоль) растворяли в 2 мл этилацетата и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (3 мг, загрузка 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом, перемешивали при комнатной температуре в течение 4,5 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 15 с (11 мг, выход 89%).

MC m/z (ESI): 425,2 [М+1].

Стадия 3

(9Н-флуорен-9-ил)метил(2-((((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклопропил)метокси)метил)амино)2-оксоэтил)карбамат 15d

В реакционную колбу добавляли 1b (10 мг, 0,021 ммоль) с последующим добавлением 1 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли одну каплю триэтиламина и добавляли 15 с (11 мг, 0,026 ммоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (10,7 мг, 0,039 ммоль). По окончании добавления реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 60 ч, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (5 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 15d (19 мг, выход 87,0%).

MC m/z (ESI): 842,2 [М+1].

Стадия 4

1-(((2-аминоацетиламино)метокси)метил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 15е

15d (19 мг, 22,56 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч и концентрировали при пониженном давлении при 0°С. Добавляли 1 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 15е (13,9 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 620,1 [М+1].

Стадия 5

1-((S)-9-бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 15 Неочищенный 15е (13,9 мг, 22,4 мкмоль) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли 8g (15,8 мг, 33,4 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (9,3 мг, 33,6 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 60 мин, и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 15 (2,5 мг, выход 10,3%).

MC m/z (ESI): 1074,2 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,51-8,37 (m, 1H), 8,22 (t, 1H), 8,14-8,02 (m, 2Н), 8,011-7,94 (m, 1H), 7,82-7,73 (m, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,26-7,10 (m, 3H), 6,98 (s, 1H), 6,53-6,47 (m, 1Н), 5,62-5,50 (m, 1Н), 5,45-5,36 (m, 1Н), 5,35-5,23 (m, 2Н), 5,13-5,02 (m, 2Н), 4,61-4,50 (m, 2Н), 4,42-4,28 (m, 2Н), 3,76-3,61 (m, 3H), 3,60-3,45 (m, 3H), 3,27-3,23 (m, 1H), 3,20-2,81 (m,7Н), 2,75-2,61 (m, 3H), 241-2,28 (m, 3H), 2,23-2,13 (m, 2Н), 2,11-2,01 (m, 1H), 2,03-1,94 (m, 1Н), 1,90 (s, 1H), 1,87-1,74 (m, 2Н), 1,53-1,36 (m, 3H), 1,29-1,08 (m, 4Н), 0,90-0,68 (m, 4Н).

Пример 1-16

1-((S)-9-бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-Н-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо -2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 16

Стадия 1

1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоновая кислота 16b Этил-1-(гидроксиметил)циклобутанкарбоксилат 16а (250 мг, 1,58 ммоль, поставщик Alfa) растворяли в метаноле (2 мл) и воде (1 мл) и добавляли гидроксид натрия (126 мг, 3,15 ммоль). Реакционный раствор нагревали до 40°С, перемешивали в течение 3 ч, охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении для удаления органического растворителя. Реакционный раствор подвергали обратной экстракции диэтиловым эфиром (10 мл) для сбора водной фазы. Водную фазу доводили до рН 3-4 с помощью 6 н. водного раствора соляной кислоты и концентрировали при пониженном давлении с получением твердого вещества. Добавляли 3 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении досуха; процедуры повторяли трижды.

Остаток сушили с помощью масляного насоса с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 16b (206 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI, NEG): 129,2 [М-1].

Стадия 2

Бензил-1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоксилат 16с

Неочищенный 16b (206 мг, 1,58 ммоль) растворяли в ацетонитриле (15 мл), добавляли безводный карбонат калия (1,09 г, 7,90 ммоль), иодид тетрабутиламмония (29 мг, 78,51 мкмоль) и бензилбромид (216 мг, 1,26 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 16 с (112 мг, выход 32,1%).

MC m/z (ESI): 221,1 [М+1].

Стадия 3

Бензил-1-(10-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклобутан-1-карбоксилат 16d

В реакционную колбу добавляли 16 с (77 мг, 0,35 ммоль) и 8b (100 мг, 0,27 ммоль) с последующим добавлением 3 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой и добавляли трет-бутилат калия (61 мг, 0,54 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 10 мин, добавляли 20 мл ледяной воды со льдом и экстрагировали этилацетатом (5 мл) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 3 мл 1,4-диоксана и добавляли 0,5 мл воды, бикарбонат натрия (27 мг, 0,32 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиат (71 мг, 0,27 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 20 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 16d (24 мг, выход 16,7%).

MC m/z (ESI): 551,3 [М+23].

Стадия 4

1-(10-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклобутан-1-карбоновая кислота 16е

16d (12 мг, 22,7 мкмоль) растворяли в 1?5 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (об.:об.=2:1) и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (5 мг, загрузка 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционный раствор фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 16е (10 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

Стадия 5

(9Н-флуорен-9-ил)метил(2-((((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклобутил)метокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 16f

В реакционную колбу добавляли lb (7,5 мг, 0,014 ммоль) с последующим добавлением 1 мл N,N-диметилформамида. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой с последующим добавлением капли триэтиламина, добавляли раствор неочищенного 16е (10 мг) в 0,5 мл N,N-диметилформамид, а затем добавляли хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (6 мг, 0,026 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 30 мин, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 16f (10,6 мг, выход 87,8%).

MC m/z (ESI): 856,2 [М+1].

Стадия 6

1-(((2-аминоацетиламино)метокси)метил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 16g 16f (10,6 мг, 12,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана и добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Остаток концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 16g (8 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MCm/z (ESI): 634,1 [М+1].

Стадия 7

1-((S)-9-бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 16

Неочищенный 16g (8 мг) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. К реакционному раствору добавляли 8g (8,8 мг, 18,6 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (5,2 мг, 18,8 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин) с получением указанного в заголовке продукта 16 (1,0 мг, выход 7,2%).

MC m/z (ESI): 1088,0 [М+1].

Пример 1-17

(1r,4r)-N-((S)-7-бензил-1-(1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклопропокси)-3,6,9,12,15-пентаоксо-17,20,23,26,29,32,35,38,41-нонаксо-2,5,8,11,14-пентаазатетратридец-43-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 17

Стадия 1

Трет-бутил-1-фенил-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-декаоксатриундек-31-оат 17b

1-фенил-2,5,8,11,14,17,20,23,26-нонаоксадиоктадецил-28-ол 17а (0,34 г, 0,67 ммоль, поставщик Bide) растворяли в 10 мл дихлорметана и последовательно добавляли оксид серебра (0,24 г, 1,01 ммоль), трет-бутилбромацетат (0,16 г, 0,81 ммоль) и иодид калия (0,07 г, 0,40 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 17b (0,42 мг, выход 100%).

MC m/z (ESI): 636,3 [М+18].

Стадия 2

Трет-бутил 29-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27-нонаксогенэйкозано-1-оат 17с

17b (417 мг, 0,67 ммоль) растворяли в 15 мл тетрагидрофурана и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (110 мг, загрузка 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом, перемешивали при 60°С в течение 3 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 17с (357 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 546,2 [М+18].

Стадия 3

Трет-бутил-29-азидо-3,6,9,12,15,18,21,24,27-нонаксомонтанил-1-оат 17d

17с (357 мг, 0,675 ммоль) растворяли в 10 мл толуола и добавляли дифенилфосфорилазид (279 мг, 1,014 ммоль) и 1,8-диазабициклоундец-7-ен (206 мг, 1,353 ммоль). Реакционный раствор трижды продували аргоном, перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем нагревали до 105°С в течение 19 ч. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, концентрировали, добавляли 20 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 4). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 17d (412 мг).

MC m/z (ESI): 571,3 [М+18].

Стадия 4

Трет-бутил-29-амино-3,6,9,12,15,18,21,24,27-нонаксомонтанил-1-оат 17е

17d (230 мг, 0,415 ммоль) растворяли в 8 мл тетрагидрофурана и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (58 мг, загрузка 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом, перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 17е (220 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 528,2 [М+1].

Стадия 5

Трет-бутил-1-((1r,4r)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексил)-1-оксо-5,8,11,14,17,20,23,26,29-нонаокса-2-азатриундек-31-оат 17f

(1r,4r)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоновую кислоту (98,5 мг, 0,415 ммоль) растворяли в 10 мл дихлорметана и добавляли 2-(7-бензотриазолоксид)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (190 мг, 0,500 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (162 мг, 1,253 ммоль). Реакционный раствор трижды продували аргоном, добавляли неочищенный 17е (220 мг, 0,417 ммоль), перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 15 мл воды и экстрагировали дихлорметаном (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (15 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 17f (122 мг, выход 39,2%).

MC m/z (ESI): 747,2 [М+1].

Стадия 6

1-((1r,4r)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексил)-1-оксо-5,8,11,14,17,20,23,26,29-нонаокса-2-азатриундец-31-овая кислота 17g

7f (122 мг, 0,163 ммоль) растворяли в 0,8 мл дихлорметана и добавляли 0,4 мл трифторуксусной кислоты. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, разбавляли 15 мл дихлорметана и концентрировали при пониженном давлении; добавляли 10 мл н-гексана с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Затем к реакционному раствору добавляли 10 мл толуола, концентрировали при пониженном давлении, затем суспендировали с 10 мл смешанного растворителя н-гексан:диэтиловый эфир =5:1 три раза, чтобы довести рН до близкого к 7, концентрировали и сушили с помощью масляного насоса с получением указанного в заголовке продукта 17g (98 мг, выход 86,8%).

MC m/z (ESI): 691,2 [М+1].

Стадия 7

2,4-диметоксибензил-1-((2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропил-1-карбоксилат 17h

8d (164 мг, 0,40 ммоль) растворяли в дихлорметане (5 мл) и последовательно добавляли 2,4-диметоксибензиловый спирт (81 мг, 0,48 ммоль), гидрохлорид 1-этил-(3-диметиламинопропил)карбонилдиимина (115 мг, 0,60 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (5 мг, 0,041 ммоль). После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 20 мл воды и слои разделяли после встряхивания. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 17 h (124 мг, выход 55,4%).

MC m/z (ESI): 583,1 [М+23].

Стадия 8

2,4-диметоксибензил-(S)-1-((11-бензил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазепин-17-ил)окси)циклопропил-1-карбоксилат 17j

17 h (39 мг, 69,6 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана и добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли три раза с последующим концентрированием при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт растворяли в 2 мл N,N-диметилформамида и добавляли (((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)глицил-L-фенилаланин 17i (35 мг, 69,8 мкмоль, полученный способом, раскрытым в «Примерах 7-12 на с. 13 описания в патентной заявке CN108853514A») и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (23 мг, 83,1 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 17j (48 мг, выход 83,9%).

MC m/z (ESI): 822,0 [М+1].

Стадия 9

(S)-1-((11-бензил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазепанил-17-ил)окси)циклопропан-1-карбоновая кислота 17k

17j (48 мг, 58,4 мкмоль) растворяли в 1,4 мл 3% (об./об.) раствора дихлоруксусной кислоты в дихлорметане. Реакционный раствор охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли триэтилсилан (21 мг, 180,6 мкмоль) и перемешивали на бане с ледяной водой в течение 3 ч. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении на бане с ледяной водой для удаления половины органического растворителя, добавляли 5 мл диэтилового эфира, затем нагревали естественным образом до комнатной температуры, суспендировали для осаждения белого твердого вещества и фильтровали. Фильтровальный осадок собирали и сушили с помощью масляного насоса с получением указанного в заголовке продукта 17k (33 мг, выход 84,1%).

Стадия 10

(9Н-флуорен-9-ил)метил((S)-7-бензил-1-(1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклопропокси)-3,6,9,12-тетраоксо-2,5,8,11-тетраазатриден-13-ил)карбамат 17l

В реакционную колбу добавляли 1b (20 мг, 42,4 мкмоль) с последующим добавлением 1 мл 10% (об./об.) раствора метанола в растворе дихлорметана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли одну каплю триэтиламина и перемешивали до растворения 1b. 17k (33 мг, 49,1 мкмоль) растворяли в 1 мл 10% (об./об.) раствора метанола в дихлорметане, затем реакционную смесь по каплям добавляли к вышеуказанному реакционному раствору с последующим добавлением хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (17,6 мг, 63,6 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч, добавляли 10 мл дихлорметана и 5 мл воды, перемешивали в течение 5 мин и выдерживали для разделения слоев. Органическую фазу собирали, а водную фазу экстрагировали дихлорметаном (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 171 (37 мг, выход 80,2%).

MC m/z (ESI): 1090,1 [М+1].

Стадия 11

(1r,4r)-N-((S)-7-бензил-1-(1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклопропокси)-3,6,9,12,15-пентаоксо-17,20,23,26,29,32,35,38,41-нонаксо-2,5,8,11,14-пентаазатетратридец-43-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 17 17l (15,5 мг, 14,23 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана и добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, а затем сушили с помощью масляного насоса. Полученный неочищенный продукт растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. К реакционному раствору добавляли 17g (11 мг, 15,92 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (6,0 мг, 21,68 мкмоль), трижды продували азотом, перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 17 (6 мг, выход 27,4%).

MC m/z (ESI): 1556,4 [М+18].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,98 (d, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,20 (br, 1H), 8,12-7,95 (m, 3H), 7,93-7,76 (m, 2Н), 7,75-7,66 (m, 2Н), 7,24 (s, 1Н), 7,20-7,05 (m, 6Н), 6,97 (s, 1H), 6,64 (br, 1Н), 6,55 (d, 1Н), 6,47 (s, 1H), 5,61-5,52 (m, 2Н), 5,37 (s, 1H), 5,33-5,23 (m, 2Н), 5,18 (s, 1H), 5,13 (s, 1H), 5,05 (s, 1H), 5,00 (s, 1H), 4,65-4,55 (m, 2Н), 4,53-4,45 (m, 1H), 4,38-4,28 (m, 2Н), 3,84 (s, 2Н), 3,67 (d, 3H), 3,60-3,40 (m, 3H), 3,18 (d, 1H), 3,15-3,08 (m, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,00-1,92 (m, 3H), 1,85 (s, 2Н), 1,82-1,73 (m, 2Н), 1,68-1,52 (m, 4Н), 1,29-1,15 (m, 3H), 0,86-0,76 (m, 5Н).

Пример 1-18

(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентааза-тетрагексадец-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 18

Стадия 1

Бензил-(R)-2-циклопропил-2-гидроксиацетат 18а

Бензил-(S)-2-циклопропил-2-гидроксиацетат 18b

2а (7,4 г, 63,7 ммоль) растворяли в 200 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (35 г, 253,6 ммоль), бензилбромид (9,3 мл, 54,4 ммоль) и иодид тетрабутиламмония (500 мг, 1,36 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом (10 мл). Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С. Полученный остаток (4,1 г) дополнительно очищали хиральным разделением с получением указанных в заголовке продуктов 18а (1,1 г) и 18b (1,2 г).

Стадия 2

Бензил-(R)-10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 18с

8b (3,1 г, 8,41 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (55 мл), добавляли 18а (2,0 г, 9,70 ммоль). Реакционный раствор охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли трет-бутилат калия (1,89 г, 16,84 ммоль), перемешивали на бане с ледяной водой в течение 10 мин, добавляли этилацетат (30 мл) и воду (20 мл) и выдерживали для разделения слоев. Водный слой экстрагировали хлороформом (30 мл × 5), органические слои объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в 1,4-диоксане (32 мл) и воде (8 мл), добавляли карбонат натрия (1,78 г, 16,79 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиат (2,18 г, 8,42 ммоль), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, добавляли воду (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (50 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 18 с (1,3 г, выход 30,0%).

MC m/z (ESI): 515,2 [М+1].

Стадия 3

(R)-10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-овая кислота 18d

18с (1,29 г, 2,51 ммоль) растворяли в этилацетате (15 мл) и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (260 мг, загрузка 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом, перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом (20 мл) и метанолом (20 мл). Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 18d (980 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 425,1 [М+1].

Стадия 4

2,4-диметоксибензил(R)-10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-эфир 18е

Неочищенный 18d (980 мг, 2,31 ммоль) растворяли в дихлорметане (15 мл) и добавляли 2,4-диметоксибензиловый спирт (777 мг, 4,62 ммоль), гидрохлорид 1-этил-(3-диметиламинопропил)карбонилдиимина (664 мг, 3,46 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (28 мг, 0,23 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и концентрировали при пониженном давлении для удаления органического растворителя. К реакционному раствору добавляли 20 мл воды и экстрагировали этилацетатом (50 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 18е (810 мг, выход 61,1%).

MC m/z (ESI): 575,0 [М+1].

Стадия 5

2,4-диметоксибензил(R)-2-((2-аминоацетиламино)метокси)-2-циклопропилацетат 18f

18е (33 мг, 57,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана и добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 18f (21 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

Стадия 6

2,4-диметоксибензил(11S,19R)-11-бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-диокса-4,7,10,13,16-пентаазаэйкоза-20-оат 18g

Неочищенный 18f (21 мг, 57,4 мкмоль) растворяли в 3 мл N,N-диметилформамида. К реакционному раствору добавляли 17i (29 мг, 57,8 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (19 мг, 68,7 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 18g (37 мг, выход 77,1%).

MC m/z (ESI): 853,0 [М+18].

Стадия 7

(11S,19R)-11-бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-дио кса-4,7,10,13,16-пентаазэйкоза-20-овая кислота 18h

18g (37 мг, 44,3 мкмоль) растворяли в 1,4 мл 3% (об./об.) раствора дихлоруксусной кислоты в дихлорметане. Реакционный раствор охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли триэтилсилан (15,4 мг, 132,4 мкмоль) и перемешивали на бане с ледяной водой в течение 3 ч. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении на бане с ледяной водой для удаления половины органического растворителя, добавляли 5 мл диэтилового эфира, затем нагревали естественным образом до комнатной температуры, суспендировали для осаждения белого твердого вещества и фильтровали. Фильтровальный осадок собирали и сушили с помощью масляного насоса с получением указанного в заголовке продукта 18h (24 мг, выход 79,1%).

MC m/z (ESI): 708,2 [М+23].

Стадия 8

(9Н-флуорен-9-ил)метил((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)карбамат 18i

В реакционную колбу добавляли 1b (30 мг, 63,6 мкмоль) с последующим добавлением 1 мл 10% (об./об.) раствора метанола в растворе дихлорметана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли одну каплю триэтиламина и перемешивали до растворения 1b. 18h (65 мг, 94,8 мкмоль) растворяли в 1 мл 10% (об./об.) раствора метанола в дихлорметане, затем реакционную смесь по каплям добавляли к вышеуказанному реакционному раствору с последующим добавлением хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (27 мг, 97,6 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч, добавляли 10 мл дихлорметана и 5 мл воды, перемешивали в течение 5 мин и выдерживали для разделения слоев. Органическую фазу собирали, а водную фазу экстрагировали дихлорметаном (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 18i (25 мг, выход 35,6%).

MC m/z (ESI): 1104,4 [М+1].

Стадия 9

(S)-2-(2-(2-аминоацетиламино)ацетиламино)-N-(2-((((R)-1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4'':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтокси)-3-фенилпропанамид 18j

18i (12 мг, 10,9 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана и добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 18j (10 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MC m/z (ESI): 881,0 [М+1].

Стадия 10

(1r,4r)-R-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентааза-тетрагексадец-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 18

Неочищенный 18j (10 мг) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. К реакционному раствору добавляли 17g (8,5 мг, 12,3 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (4,6 мг, 16,6 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, фильтровали и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 18 (9,5 мг, выход 56,2%).

MC m/z (ESI): 1570,2 [М+18].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,77 (d, 1H), 8,59-8,55 (m, 1H), 8,42 (d, 1H), 8,37-8,28 (m, 1Н), 8,25-8,06 (m, 2Н), 7,96-7,86 (m, 1H), 7,86-7,70 (m, 2Н), 7,32-7,28 (m, 1Н), 7,25-7,14 (m, 3H), 6,67 (m, 1H), 5,96 (s, 1H), 5,80-5,72 (m, 1Н), 5,62-5,52 (m, 2Н), 5,43-5,30 (m, 3H), 5,28-5,17 (m, 2Н), 5,12-5,08 (m, 1H), 4,72-4,35 (m, 8Н), 3,95-3,70 (m, 13Н), 3,35-3,22 (m, 14Н), 2,42-2,32 (m, 3H), 2,05-1,98 (m, 4Н), 1,88-1,82 (m, 12Н), 1,47-1,39 (m, 3H), 1,32-1,18 (m, ПН), 0,90-0,80 (m, 4Н), 0,52-0,37 (m, 3H), 0,32-0,18 (m, 2Н).

Пример 1-19

(1r,4r)-R-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентааза-тетрагексадец-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 19

Бензил-(S)-10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 19а

В реакционную колбу добавляли 18b (252 мг, 1,22 ммоль) с последующим добавлением 4 мл дихлорметана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой добавляли трет-бутилат лития (98 мг, 1,22 ммоль), перемешивали на бане с ледяной водой в течение 15 мин до тех пор, пока раствор не стал прозрачным, затем добавляли 8b (300 мг, 814,3 мкмоль) и перемешивали на бане с ледяной водой в течение 2,5 ч. Добавляли воду (10 мл) для разделения жидкости. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (8 мл × 2), органические фазы объединяли и промывали водой (10 мл × 1), промывали насыщенным солевым раствором (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с системой проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 19а (282 мг, выход 67,2%).

Стадия 2

(S)-10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-овая кислота 19b

19а (280 мг, 0,554 ммоль) растворяли в 8 мл этилацетата и добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (84 мг, загрузка 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом, перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, фильтровали через целит и промывали фильтровальный осадок этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 19b (230 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

Стадия 3

2,4-диметоксибензил(S)-10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 19с

Неочищенный 19b (230 мг, 541,8 мкмоль) растворяли в 7 мл дихлорметана и последовательно добавляли 2,4-диметоксибензиловый спирт (136,7 мг, 812,7 мкмоль), гидрохлорид 1-этил-(3-диметиламинопропил)карбодиимидата (155 мг, 808,5 мкмоль). и 4-диметиламинопиридин (6,6 мг, 53,5 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, разбавляли 10 мл дихлорметана, промывали водой (10 мл × 1) и насыщенным солевым раствором (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 19 с (159 мг, выход 51,0%).

Стадия 4

2,4-диметоксибензил(S)-2-((2-аминоацетиламино)метокси)-2-циклопропилацетат 19d

19с (60 мг, 104,4 мкмоль) растворяли в 1 мл дихлорметана и добавляли 0,5 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 19d (21 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

Стадия 5

2,4-диметоксибензил(11S,19S)-11-бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-диокса-4,7,10,13,16-пентаазейкоза-20-оат 19е

Неочищенный 19d (36 мг, 102,2 мкмоль) растворяли в 4 мл N,N-диметилформамида. К реакционному раствору добавляли 17i (52 мг, 103,6 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (34,6 мг, 125,0 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 10 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 19е (70 мг, выход 80,2%).

Стадия 6

(11S,19S)-11-бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-диокса-4,7,10,13,16-пентаазэйкоза-20-овая кислота 19f

19е (70 мг, 83,7 мкмоль) растворяли в 2,5 мл 3% (об./об.) раствора дихлоруксусной кислоты в дихлорметане. Реакционный раствор охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли триэтилсилан (29 мг, 249,4 мкмоль) и перемешивали на бане с ледяной водой в течение 3 ч. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении на бане с ледяной водой для удаления половины органического растворителя, добавляли 5 мл диэтилового эфира, затем нагревали естественным образом до комнатной температуры, суспендировали для осаждения белого твердого вещества и фильтровали. Фильтровальный осадок собирали и сушили с помощью масляного насоса с получением указанного в заголовке продукта 19f (57 мг, выход 99,2%).

Стадия 7

(9Н-флуорен-9-ил)метил((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадец-16-ил)карбамат 19g

В реакционную колбу добавляли 1b (30 мг, 63,6 мкмоль) с последующим добавлением 1 мл 10% (об./об.) раствора метанола в растворе дихлорметана. Реакционный раствор трижды продували аргоном, охлаждали до 0-5°С на бане с ледяной водой, добавляли одну каплю триэтиламина и перемешивали до растворения 1b. 19f (57 мг, 83,1 мкмоль) растворяли в 1 мл 10% (об./об.) раствора метанола в дихлорметане, затем реакционную смесь по каплям добавляли к вышеуказанному реакционному раствору с последующим добавлением хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (26 мг, 93,9 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч, добавляли 10 мл дихлорметана и 5 мл воды, перемешивали в течение 5 мин и выдерживали для разделения слоев. Органическую фазу собирали, а водную фазу экстрагировали дихлорметаном (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 19g (56 мг, выход 79,8%).

MC m/z (ESI): 1103,1 [М+1].

Стадия 8

(S)-2-(2-(2-аминоацетиламино)ацетиламино)-N-(2-((((S)-1-циклопропил-2-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизин[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)-3-фенилпропанамид 19h

19g (4?6 мг, 4,16 мкмоль) растворяли в 1,5 мл дихлорметана и добавляли 0,75 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,6 ч, концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; эти процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; эти процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 19h (4,0 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

Стадия 9

(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,3 5,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентааза-тетрагексадец-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 19

Неочищенный 19h (4,0 мг) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. К реакционному раствору добавляли 17g (2,9 мг, 4,2 мкмоль) и хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния (1,5 мг, 5,4 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 40 мин, фильтровали и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 19 (2,1 мг, выход 32,4%).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,71-8,62 (m, 1H), 8,59-8,51 (m, 1H), 8,34-8,26 (m, 1H), 8,14-8,02 (m, 2Н), 7,95-7,86 (m, 1Н), 7,83-7,69 (m, 2Н), 7,35-7,31 (m, 1H), 7,29-7,11 (m, 3H), 7,01 (s, 1H), 6,72-6,50 (m, 3H), 5,59-5,50 (m, 2Н), 5,42 (s, 2Н), 5,38-5,18 (m, 3H), 4,79-4,69 (m, 2Н), 4,61-4,42 (m, 3H), 3,91 (s, 2Н), 3,79-3,65 (m, 4Н), 3,63-3,44 (m, 13Н), 3,41-3,30 (m, 2Н), 3,26-3,09 (m, 5Н), 3,08-2,84 (m, 4Н), 2,81-2,64 (m, 3H), 2,42-2,28 (m, 3H), 2,24-2,12 (m, 2Н), 2,05-1,93 (m, 4Н), 1,89-1,77 (m, 2Н), 1,72-1,56 (m, 3H), 1,53-1,38 (m, 3H), 1,34-1,10 (m, ПН), 0,94-0,78 (m, 5Н), 0,52-0,35 (m, 3Н).

Пример 1-20 (референсный пример)

Указанное в заголовке соединение 20 синтезировали способом, раскрытым в «Примере 58 нас. 163 описания патента CN104755494A».

Следующие антитела могут быть получены с использованием обычного способа получения антител и могут быть получены, например, путем конструирования вектора, трансфекции эукариотических клеток, таких как клетки HEK293 (Life Technologies, кат. №11625019), экспрессии и очистки.

Ниже приведена последовательность трастузумаба:

Легкая цепь

Тяжелая цепь

Ниже приведена последовательность пертузумаба:

Легкая цепь

Тяжелая цепь

Ниже приведена последовательность антитела к В7Н3 1F9DS:

Легкая цепь

Тяжелая цепь

Пример 1-21 ADC-1

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,082 мл, 0,82 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 2,5 мл, 9,96 мг/мл, 0,168 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл, 2,0 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 10 - соединение с более коротким временем удерживания (2,1 мг, 2,02 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 2,0 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (5,0 мг/мл, 1,1 мл) иллюстративного продукта ADC-1 общей формулы FADC-1, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=5,09.

Пример 1-22 ADC-2

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,082 мл, 0,82 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 2,5 мл, 9,96 мг/мл, 0,168 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл, 2,0 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 10 - соединение с более долгим временем удерживания (2,1 мг, 2,02 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 2,0 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (4,95 мг/мл, 1,1 мл) иллюстративного продукта ADC-2 общей формулы FADC-1, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=7,39.

Пример 1-23 ADC-3

Водный раствор трис(2-карбоксютил)фосфина (10 мМ, 0,082 мл, 0,82 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 2,5 мл, 9,96 мг/мл, 0,168 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл, 2,0 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 8 (2,1 мг, 2,02 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 2,0 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (5,24 мг/мл, 1,1 мл) иллюстративного продукта ADC-3 общей формулы FADC-3, и хранили буфер при 4°С. Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=7,36.

Пример 1-24 ADC-4

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 3,74 мл, 13,38 мг/мл, 0,338 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 6,7 мг/мл, 1,3 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (1,0 мг, 0,93 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 1,3 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,72 мг/мл, 2,36 мл) иллюстративного продукта ADC-4 общей формулы FADC-4A, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=7,39.

Пример 1-25 ADC-5

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,067 мл, 0,67 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 3,0 мл, 6,70 мг/мл, 0,136 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С, 0,614 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (0,5 мг, 0,42 мкмоль) растворяли в 0,031 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 0,614 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (3,08 мг/мл, 0,82 мл) иллюстративного продукта ADC-5 общей формулы FADC-4A, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=3,16.

Пример 1-26 ADC-6

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 3,74 мл, 13,38 мг/мл, 0,338 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 6,7 мг/мл, 0,75 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 9 - соединение 9-В с более долгим временем удерживания (0,68 мг, 0,63 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 0,75 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,78 мг/мл, 1,78 мл) иллюстративного продукта ADC-б общей формулы FADC-4A, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=3,94.

Пример 1-27 ADC-7

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 5,0 мл, 10 мг/мл, 0,338 мкмоль) антитела пертузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл, 1,0 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 8 (0,65 мг, 0,6 мкмоль) растворяли в 0,1 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанному 1,0 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,42 мг/мл, 2,15 мл) иллюстративного продукта ADC-7 общей формулы FADC-7, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=6,91.

Пример 1-28 ADC-8

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 5,0 мл, 10 мг/мл, 0,338 мкмоль) антитела пертузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл, 1,6 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 10 - соединение с более коротким временем удерживания (1,04 мг, 1,0 мкмоль) растворяли в 0,1 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 1,6 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (2,14 мг/мл, 2,31 мл) иллюстративного продукта ADC-8 общей формулы FADC-8, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=6,58.

Пример 1-29 ADC-9

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН=6,5; 5,0 мл, 10 мг/мл, 0,338 мкмоль) антитела пертузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию; реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл, 0,8 мл полученного раствора отбирали и подвергали взаимодействию.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (0,55 мг, 0,5 мкмоль) растворяли в 0,1 мл ДМСО, и реакционную смесь добавляли к вышеуказанным 0,8 мл раствора, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (2,27 мг/мл, 1,11 мл) иллюстративного продукта ADC-9 общей формулы FADC-9A, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=3,16.

Пример 1-30 ADC-10

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 19,76 мкл, 197,6 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,574 мл, 38,78 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 14 - соединение с более коротким временем удерживания (0,64 мг, 588 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (5,48 мг/мл, 1,03 мл) иллюстративного продукта ADC-10 общей формулы FADC-10, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,25.

Пример 1-31 ADC-11

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 22,24 мкл, 222,4 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,646 мл, 43,64 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 14 - соединение с более долгим временем удерживания (0,72 мг, 662 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (2,13 мг/мл, 1,87 мл) иллюстративного продукта ADC-11 общей формулы FADC-10, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,03.

Пример 1-32 ADC-12

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 25,0 мкл, 250,0 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,726 мл, 49,05 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 15 (0,81 мг, 754 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (3,34 мг/мл, 1,45 мл) иллюстративного продукта ADC-12 общей формулы FADC-12, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,93.

Пример 1-33 ADC-13

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 9,88 мкл, 98,8 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; Ю,0 мг/мл, 0,287 мл, 19,39 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 16 (0,32 мг, 294 нмоль) растворяли в 20 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (2,37 мг/мл, 0,88 мл) иллюстративного продукта ADC-13 общей формулы FADC-13, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,53.

Пример 1-34 ADC-14

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 20,38 мкл, 203,8 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,592 мл, 40,0 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 17 (0,92 мг, 598 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (0,30 мг/мл, 12,0 мл) иллюстративного продукта ADC-14 общей формулы FADC-14, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,61.

Пример 1-35 ADC-15

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 20,38 мкл, 203,8 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,592 мл, 40,0 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 18 (0,93 мг, 599 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (0,32 мг/мл, 11,8 мл) иллюстративного продукта ADC-15 общей формулы FADC-15, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,89.

Пример 1-36 ADC-16

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 18,25 мкл, 182,5 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,53 мл, 35,8 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 19 (0,83 мг, 534 нмоль) растворяли в 35 мкл /ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (0,32 мг/мл, 12,0 мл) иллюстративного продукта ADC-16 общей формулы FADC-16, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,43.

Пример 1-37 ADC-17

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 43,2 мкл, 432 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 2,0 мл, 135,12 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (2,22 мг, 2067 нмоль) растворяли в 175 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,32 мг/мл, 12,0 мл) иллюстративного продукта ADC-17 общей формулы FADC-4A, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=5,42.

Пример 1-38 ADC-18 (референсный пример)

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 51,7 мкл, 517 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,5 мл, 101,3 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (2,0 мг, 1934 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (0,79 мг/мл, 13,0 мл) иллюстративного продукта ADC-18 общей формулы FADC-18, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,23.

Пример 1-39 ADC-19

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 46,9 мкл, 469 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,36 мл, 91,9 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (2,0 мг, 1862 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (0,73 мг/мл, 13,0 мл) иллюстративного продукта ADC-19 общей формулы FADC-4A, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,26.

Пример 1-40 ADC-20

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 51,7 мкл, 517 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,5 мл, 101,3 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 10 соединение с более долгим временем удерживания (2,0 мг, 1815 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (0,73 мг/мл, 13,0 мл) иллюстративного продукта ADC-20 общей формулы FADC-1, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,43.

Пример 1-41 ADC-21 (референсный пример)

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 63,9 мкл, 639 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,86 мл, 125,4 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (2,07 мг, 2001 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (2,91 мг/мл, 4,44 мл) иллюстративного продукта ADC-21 общей формулы FADC-18, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,23.

Пример 1-42 ADC-22

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 64,9 мкл, 649 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,88 мл, 127,2 нмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (2,1 мг, 1955 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (3,56 мг/мл, 3,98 мл) иллюстративного продукта ADC-22 общей формулы FADC-4A, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,79.

Пример 1-43 ADC-23 (референсный пример)

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 11,89 мл, 118,9 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 345 мл, 23,31 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3,5 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (362 мг, 350 нмоль) растворяли в 7,12 мкл MeCN и 3,56 мл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем последовательного обессоливания через ультрафильтрационные мембраны с помощью 2% (об./об.) MeCN и 1% (об./об.) ДМСО-содержащего водного буферного раствора PBS (0,05 М водный буферный раствор PBS при рН=6,5) и водного буферного раствора янтарной кислоты (0,01 М водный буферный раствор янтарной кислоты при рН=5,3), затем добавляли сахарозу до 60 мг/мл и твин-20 до 0,2 мг/мл, и реакционный раствор лиофилизировали с получением образца лиофилизированного порошка иллюстративного продукта ADC-23 общей формулы FADC-18, и хранили образец при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,05.

Пример 1-44 ADC-24

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 11,44 мл, 114,4 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 332 мл, 22,43 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3,5 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 соединение 9-А с более коротким временем удерживания (241 мг, 224 мкмоль) растворяли в 13,76 мкл MeCN и 6,88 мл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем последовательного обессоливания через ультрафильтрационные мембраны с помощью 4% (об./об.) MeCN и 2% (об./об.) ДМСО-содержащего водного буферного раствора PBS (0,05 М водный буферный раствор PBS при рН=6,5) и водного буферного раствора янтарной кислоты (0,01 М водный буферный раствор янтарной кислоты при рН=5,3), затем добавляли сахарозу до 60 мг/мл и твин-20 до 0,2 мг/мл, и реакционный раствор лиофилизировали с получением образца лиофилизированного порошка иллюстративного продукта ADC-24 общей формулы FADC-4A, и хранили образец при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,07.

Пример 1-45 ADC-25

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 73,7 мкл, 740 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 2,14 мл, 144,60 нмоль) антитела к В7Н3 1F9DS при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (3,0 мг, 2793 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,28 мг/мл, 13,0 мл) иллюстративного продукта ADC-25 общей формулы FADC-25, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,87.

Пример 1-46 ADC-26 (референсный пример)

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 30,1 мкл, 300 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,89 мл, 60,14 нмоль) антитела к В7Н3 1F9DS при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (1,0 мг, 967 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,61 мг/мл, 4,0 мл) иллюстративного продукта ADC-26 общей формулы FADC-26, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,15.

Пример 1-47 ADC-27

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 30,1 мкл, 300 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,89 мл, 60,14 нмоль) антитела к В7Н3 1F9DS при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (1,02 мг, 950 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,94 мг/мл, 3,5 мл) иллюстративного продукта ADC-27 общей формулы FADC-25, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,11.

Пример 1-48 ADC-28 (референсный пример)

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 81,3 мкл, 810 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 2,36 мл, 159,47 нмоль) антитела к В7Н3 1F9DS при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (3,0 мг, 2901 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,29 мг/мл, 13,0 мл) иллюстративного продукта ADC-28 общей формулы FADC-26, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,46.

Пример 1-49 ADC-29

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 28,6 мкл, 290 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,80 мл, 50,06 нмоль) антитела к В7Н3 1F9DS при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (1,29 мг, 1201 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (2,63 мг/мл, 2,4 мл) иллюстративного продукта ADC-29 общей формулы FADC-25, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=7,24.

Пример 1-50 ADC-30 (референсный пример)

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 29,1 мкл, 290 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,86 мл, 58,4 нмоль) антитела к В7Н3 1F9DS при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (1,0 мг, 967 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,61 мг/мл, 4,0 мл) иллюстративного продукта ADC-30 общей формулы FADC-26, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,15.

Пример 1-51 ADC-31

Водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 30,1 мкл, 300 нмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,89 мл, 60,14 нмоль) антитела к В7Н3 1F9DS при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 8 (1,0 мг, 943 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем обессоливания на колонке с гелем Sephadex G25 (фаза элюента: 0,05 М буферный раствор PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением PBS-буферного раствора (1,47 мг/мл, 4,5 мл) иллюстративного продукта ADC-31 общей формулы FADC-31, и хранили буфер при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью детекции в УФ и видимой области: n=6,33.

Анализ лекарственной нагрузки в исходном растворе ADC Цель и принцип эксперимента

Исходный раствор ADC представляет собой лекарственное средство с перекрестно связанным антителом, и механизм лечения заболеваний с его помощью заключается в транспортировке молекул токсина в клетки в зависимости от способности антитела нацеливать действие с целью уничтожения клеток. Лекарственная нагрузка играет решающую роль в эффективности лекарственного средства. Лекарственную нагрузку в исходном растворе ADC определяли с использованием УФ-метода. Методика эксперимента

Кюветы, содержащие натрий-сукцинатный буфер, помещали в референсную ячейку и ячейку для образца и вычитали оптическую плотность холостого раствора. Затем кювету, содержащую испытуемый раствор, помещали в кювету для образца и определяли оптическую плотность при 280 нм и 370 нм.

Расчет результатов: величину нагрузки исходного раствора ADC определяли с помощью УФ-спектрофотометрии (прибор: УФ-спектрофотометр Thermo nanodrop2000), основанный на том принципе, что общая оптическая плотность исходного раствора ADC при определенной длине волны представляет собой сумму значений оптической плотности цитотоксического лекарственного средства и моноклонального антитела при этой длине волны, а именно:

ε_ЛС-280: средний молярный коэффициент экстинкции лекарственного средства при 280 нм равен 5100;

С_ЛС: концентрация лекарственного средства;

ε_mab-280: средний молярный коэффициент экстинкции исходного раствора моноклонального антитела трастузумаба или пертузумаба при 280 нм равен 214600;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела трастузумаба или пертузумаба;

b: длина оптического пути равна 1 см.

Аналогичным образом, уравнение для полной оптической плотности образца при 370 нм может быть представлено как:

ε_ЛС-370: средний молярный коэффициент экстинкции лекарственного средства при 370 нм равен 19000;

С_ЛС: концентрация лекарственного средства;

ε_mab-370: коэффициент ослабления исходного раствора моноклонального антитела трастузумаба или пертузумаба при 370 нм равен 0;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела трастузумаба;

b: длина оптического пути равна 1 см.

Лекарственную нагрузку можно рассчитать, используя оба уравнения (1) и (2), а также коэффициенты ослабления моноклонального антитела и лекарственного средства при обеих длинах волн и их концентрации.

Лекарственная нагрузка =С_ЛС/C_mab.

Биологическая оценка Тестовый пример 1-1: Тест на ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro соединениями, раскрытыми в настоящем документе

I. Цель

Этот эксперимент был предназначен для обнаружения ингибирующей активности фармацевтических соединений согласно настоящему изобретению в отношении пролиферации in vitro клеток U87MG (банк клеток, Китайская академия наук, кат. №TCHu138) и опухолевых клеток SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человек, АТСС, кат. №НТВ-30). Клетки обрабатывали in vitro соединением в различных концентрациях. После 6 дней культивирования измеряли пролиферацию клеток с помощью реагентов CTG (CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, кат. №G7573) и оценивали активность соединения in vitro в соответствии со значением IC₅₀.

II. Метод

Метод тестирования ингибирования пролиферации клеток U87MG in vitro был описан ниже в качестве примера метода анализа ингибирующей активности соединений согласно настоящему изобретению в отношении пролиферации опухолевых клеток in vitro. Этот метод также был применим, не ограничиваясь перечисленным, для теста на ингибирующую активность в отношении пролиферации in vitro других опухолевых клеток.

1. Культура клеток: клетки U87MG и SK-BR-3 культивировали в среде ЕМЕМ (GE, кат. №SH30024.01), содержащей 10% FBS, и в среде McCoy's 5А (Gibco, кат. №16600-108), содержащей 10% FBS, соответственно.

2. Подготовка клеток: клетки U87MG и SK-BR-3 в логарифмической фазе роста однократно промывали PBS (фосфатный буфер, Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd.), а затем расщепляли 2-3 мл трипсина (0,25% трипсин-ЭДТА (1×), Gibico, Life Technologies) в течение 2-3 мин. После полного расщепления клеток добавляли 10-15 мл культуральной среды для элюирования расщепленных клеток. Смеси центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, супернатанты отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в 10-20 мл культуральной среды с получением суспензий одиночных клеток.

3. Посев клеток: каждую из суспензий одиночных клеток U87MG и SK-BR-3 тщательно перемешивали и доводили с помощью культуральной среды до плотности клеток 2,75 × 10³ клеток/мл и 8,25 × 10³ клеток/мл, соответственно. Клеточные суспензии со скорректированной плотностью тщательно перемешивали и добавляли в 96-луночные планшеты для культивирования клеток в количестве 180 мкл/лунку. В каждую периферийную лунку 96-луночного планшета добавляли только 200 мкл среды. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 24 ч (37°С, 5% СО₂).

4. Приготовление соединения: соединение растворяли в ДМСО (диметилсульфоксид, Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.) для приготовления исходного раствора с начальной концентрацией 10 мМ.

Низкомолекулярные соединения готовили в исходной концентрации 500 нМ следующим образом.

Различные исследуемые образцы в концентрации 100 мкМ (30 мкл) добавляли в первую колонку 96-луночного планшета с U-образным дном, и по 20 мкл ДМСО добавляли в каждую лунку со второй по одиннадцатую колонок. Образцы в первой колонке (10 мкл) добавляли к 20 мкл ДМСО во второй колонке, и смеси хорошо перемешивали. Смеси (10 мкл) добавляли в третью колонку и так далее до десятой колонки. Лекарственные средства в планшете (5 мкл на лунку) переносили в среду ЕМЕМ (95 мкл), и смеси хорошо перемешивали для последующего использования.

ADC готовили в исходной концентрации 10 нМ или 500 нМ следующим образом.

Различные исследуемые образцы в концентрации 100 нМ или 5 мкМ (100 мкл) добавляли в первую колонку 96-луночного планшета, и по 100 мкл PBS добавляли в каждую лунку со второй по одиннадцатую колонок. Образцы в первой колонке (50 мкл) добавляли к 100 мкл PBS во второй колонке, и смеси хорошо перемешивали. Смеси (50 мкл) добавляли в третью колонку и так далее, путем 3-кратных разбавлений, до десятой колонки.

5. Добавление образца: исследуемые образцы, приготовленные в различных концентрациях (20 мкл), добавляли в культуральный планшет, при этом для каждого образца использовали две параллельные лунки. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 6 дней (37°С, 5% CO₂).

6. Проявление окраски: 96-луночный планшет для культивирования клеток извлекали и в каждую лунку добавляли по 90 мкл раствора CTG с последующей инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре.

7. Считывание планшета: 96-луночный планшет для культивирования клеток извлекали и тестировали в устройстве для считывания микропланшетов (BMG labtech, PHERAstar FS) для определения хемилюминесценции.

III. Анализ данных

Данные обрабатывали и анализировали с использованием Microsoft Excel и Graphpad Prism 5. Результаты эксперимента приведены ниже в таблице 1.

Вывод: низкомолекулярные фрагменты согласно настоящему изобретению обладают значительной ингибирующей активностью в отношении пролиферации клеток SK-BR-3 и клеток U87, а хиральные центры оказывают определенное влияние на ингибирующую активность соединений.

Тестовый пример 1-2: Тест на ингибирование in vitro пролиферации опухолевых клеток конъюгатами антитело-лекарственное средство согласно настоящему изобретению, нацеленными на HER2

Целью этого эксперимента было обнаружение ингибирующей активности конъюгатов антитело-лекарственное средство, нацеленных на мишени HER2, согласно настоящему изобретению в отношении пролиферации in vitro SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человека, АТСС, кат. №НТВ-30) и MDA-MB-468 (клетки рака молочной железы человека, АТСС, кат. №НТВ-132). Клетки обрабатывали in vitro соединением в различных концентрациях. После 6 дней культивирования измеряли пролиферацию клеток с помощью реагентов СТG и оценивали активность соединения in vitro в соответствии со значением IC₅₀.

В соответствии с методикой анализа из тестового примера 1 тестируемые клетки представляли собой SK-BR-3 и MDA-MB-468, а среда для культивирования клеток представляла собой среду McCoy's 5А, содержащую 10% FBS (Gibco, кат. №16600-108), среду ЕМЕМ, содержащую 10% FBS (GE, кат. №SH30024.01), и среду L-15, содержащую 10% FBS (ThermoFisher, кат. №11415-114), соответственно. Плотность клеток трех штаммов клеток доводили до 8,33 × 10³ клеток/мл, 8,33 × 10³ клеток/мл и 1,39 × 10⁴ клеток/мл с помощью культуральной среды, соответственно, и клеточные суспензии после корректировки плотности хорошо перемешивали и добавляли в 96-луночные планшеты для культивирования клеток в количестве 180 мкл/лунку. Результаты испытаний соответствующих соединений приведены ниже в таблице 2.

Вывод: конъюгаты антитело-лекарственное средство, нацеленные на мишени HER2, согласно настоящему изобретению обладают значительной ингибирующей активностью в отношении HER2-положительных клеток SK-BR-3; при этом ингибирующая пролиферацию активность соединений в отношении HER2-отрицательных клеток MDA-MB-468 является слабой; соединения обладают хорошей селективностью.

Тестовый пример 1-3: Тест на стабильность Her2-ADC в плазме

Образцы ADC-19, ADC-18 и ADC-20, плазму человека, плазму обезьяны (Shanghai Medicilon Inc.) и 1% раствор BSA (Sigma) в PBS (Sangon Biotech (Шанхай)) фильтровали через 0,22 мкм фильтр для стерилизации. К стерильной плазме или раствору 1% BSA в PBS добавляли ADC-19, ADC-18 и ADC-20 соответственно в конечной концентрации 200 мкг/мл и реакционный раствор инкубировали в инкубаторе при 37°С; день инкубации отмечали как день 0, а образцы извлекали на 7, 14 и 21 день соответственно для обнаружения свободного токсина.

25 мкл образцов извлекали на 96-луночный планшет; добавляли 50 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта (100 нг/мл раствора камптотецина в ацетонитриле) и 150 мкл ацетонитрила; смесь встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали в течение 10 мин (4000 об/мин), 5 мкл полученных образцов использовали для анализа ЖХ/МС/МС (Applied Biosystems, США).

Результаты показали следующее: ADC-19 был достаточно стабилен как в плазме человека, так и в плазме обезьяны, а также в растворе 1% BSA в PBS, со скоростью высвобождения свободного токсина не более 2,1% на самом высоком уровне и, как правило, оставался стабильным на 14 день, см. ФИГ. 1А.

ADC-18 был плохо стабилен в плазме человека и обезьяны с максимальной скоростью высвобождения свободного токсина 14,5% и 8,10% соответственно. Он был относительно стабилен в растворе 1% BSA в PBS, см. ФИГ. 1В.

ADC-20 был плохо стабилен в плазме человека, плазме обезьяны и растворе 1% BSA в PBS, с максимальной скоростью высвобождения свободного токсина 21,7%, 29,7% и 21,7% соответственно. Он находился в разложившемся состоянии в растворе 1% BSA в PBS, см. ФИГ. 1С.

Тестовый пример 1-4: Оценка эффективности лекарственных средств на мышах с опухолями ЛМТ-1

1. Цель

Голых мышей nu/nu использовали в качестве подопытных животных, и оценивали терапевтическое действие антител Her2-ADC T-DM1, ADC-21 и ADC-24 у голых мышей с ксенотрансплантатом лекарственно-резистентных к трастузумабу (герцептин) клеток рака молочной железы человека ЛМТ-1 после внутрибрюшинной инъекции.

2. Исследуемые лекарственных средства и материалы 2-1. Исследуемые лекарственные средства

T-DM1 (полученный согласно US20050169933)

ADC-21: 3 мг/кг ADC-21: 10 мг/кг ADC-24: 3 мг/кг

ADC-24: 10 мг/кг

Холостой контроль (холостой): PBS

2-2. Способ приготовления: все разбавляли PBS.

2-3. Подопытные животные

Голые мыши nu/nu, приобретенные у Beijing Vital River.

3. Методика анализа

Мышам подкожно инокулировали в правый бок клетки ЛМТ-1 (Nanjing Kebai) (5×10⁶/мышь с 50% искусственной базальной мембраной), и опухоли росли в течение 8 дней до 203,09±11,94 мм, после чего животных случайным образом разделяли на группы (d1), по 8 на группу, всего 6 групп.

Лекарственное средство вводили с помощью внутрибрюшинной инъекции в общей сложности 2 раза. Два раза в неделю измеряли объемы опухолей и массу тела и регистрировали результаты.

Использовали программное обеспечение для статистического анализа Excel 2003. Средние значения рассчитывали как avg; значения SD рассчитывали как STDEV; значения SEM рассчитывали как STDEV/SQRT; и Р-значение межгрупповой разницы рассчитывали как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывали как: V=1/2 × L_{длинный} × L_{короткий}²

Относительный объем (RTV)=V_t/V₀

Степень ингибирования опухоли (%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%)

Где V₀ и V_T - объем опухоли в начале и конце эксперимента, соответственно. C_{RTV и TRTV - относительные объемы опухолей в холостой группе (носитель, PBS) и в экспериментальных группах, соответственно, в конце эксперимента. 4. Результаты эксперимента}

Результаты эксперимента приведены на ФИГ. 2. Эксперимент был закончен после двух внутрибрюшинных инъекций, после чего велось наблюдение в течение 34 дней. T-DM1 (10 мг/кг) не оказывал ингибирующего действия на опухоли; 3 мг/кг ADC-21 имели степень ингибирования опухоли 46,22% (Р<0,01); 10 мг/кг ADC-21 имели степень ингибирования опухоли 56,77% (Р<0,001); 3 мг/кг ADC-24 имели степень ингибирования опухоли 62,77% (Р<0,001); 10 мг/кг ADC-24 имели степень ингибирования опухоли 76,32% (Р<0,001). При одинаковой дозировке эффект ингибирования опухоли ADC-24 был значительно лучше, чем у ADC-21.

Тестовый пример 1-5: Оценка эффективности лекарственного средства на мышах с опухолями SK-BR-3

1. Цель

Голых мышей nu/nu использовали в качестве подопытных животных, и оценивали терапевтическое действие антител Her2-ADC ADC-21 и ADC-22 у голых мышей с ксенотрансплантатом клеток рака молочной железы человека SK-BR-3 после внутрибрюшинной инъекции.

2. Исследуемые лекарственных средства и материалы 2-1.

Исследуемые лекарственные средства

ADC-21: 1 мг/кг

ADC-21: 6 мг/кг

ADC-22: 1 мг/кг

ADC-22: 6 мг/кг

Холостой контроль (холостой): PBS.

2-2. Способ приготовления: все разбавляли PBS.

2-3. Подопытные животные

Голые мыши nu/nu, приобретенные у Beijing Vital River.

3. Методика анализа

Мышам подкожно инокулировали в правый бок клетки SK-BR-3 (АТСС) (5×10⁶/мышь с 50% искусственной базальной мембраной), и опухоли росли в течение 20 дней до 153,34±11,73 мм³, после чего животных случайным образом разделяли на группы (д 0), по 8 на группу, всего 5 групп.

Лекарственное средство вводили с помощью внутрибрюшинной инъекции в общей сложности 1 раз. Два раза в неделю измеряли объемы опухолей и массу тела и регистрировали результаты.

Использовали программное обеспечение для статистического анализа Excel 2003. Средние значения рассчитывали как avg; значения SD рассчитывали как STDEV; значения SEM рассчитывали как STDEV/SQRT; и Р-значение межгрупповой разницы рассчитывали как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывали как: V=1/2 × L_{длинный} × L_{короткий}²

Относительный объем (RTV)=V_T/V₀

Степень ингибирования опухоли (%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%)

Где V₀ и V_T - объем опухоли в начале и конце эксперимента, соответственно. C_RTV и T_RTV относительные объемы опухолей в контрольной холостой группе и в экспериментальных группах, соответственно, в конце эксперимента.

4. Результаты эксперимента

Результаты эксперимента приведены на ФИГ. 3. Эксперимент был закончен после одной внутрибрюшинной инъекции, после чего велось наблюдение в течение 28 дней. 1 мг/кг ADC-21 имел степень ингибирования опухоли 15,01%; 6 мг/кг ADC-21 имели степень ингибирования опухоли 77,4% и имели значительную разницу по сравнению с холостым контролем (Р<0,001). 1 мг/кг ADC-22 имел степень ингибирования опухоли 19,82%; 6 мг/кг ADC-22 имели степень ингибирования опухоли 98,38% (Р<0,001). При одинаковой дозировке 6 мг/кг эффект ингибирования опухоли ADC-22 был значительно лучше, чем у ADC-21.

Тестовый пример 1-6:

Стабильность в плазме

Образец ADC-25 равномерно смешивали с плазмой человека, плазмой обезьяны и раствором 1% BSA в PBS до конечной концентрации 100 мкг/мл, смесь фильтровали для стерилизации, а затем инкубировали на водяной бане при 37°С; день инкубации отмечали как день 0, а образцы извлекали на 7, 14 и 21 день соответственно для выявления свободного токсина.

Образцы извлекали в разные моменты времени, затем помещали при комнатной температуре, встряхивали и хорошо перемешивали; 25 мкл образцов извлекали на 96-луночный планшет; добавляли 50 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта (100 нг/мл раствора камптотецина в ацетонитриле) и 150 мкл ацетонитрила; смесь встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали в течение 10 мин (4000 об/мин), 5 мкл супернатанта извлекали для анализа ЖХ/МС/МС.

Результаты показали следующее: ADC-25 был достаточно стабилен как в плазме человека, так и в плазме обезьяны, а также в растворе 1% BSA в PBS, со скоростью высвобождения свободного токсина не более 2% на самом высоком уровне и, как правило, оставался стабильным на 14 день, см. ФИГ. 4.

Тестовый пример 1-7: Оценка терапевтического действия ADC на ксенотрансплантат астроцитомы головного мозга человека U87MG у голых мышей

1. Цель

В этом эксперименте голых мышей BALB/cA использовали в качестве подопытных животных и оценивали терапевтическое действие соединений ADC, раскрытых в настоящем документе, на ксенотрансплантат астроцитомы головного мозга человека U87MG у голых мышей.

2. Исследуемые лекарственных средства и материалы 2-1. Исследуемые лекарственные средства ADC-27 (3 мг/кг)

ADC-26 (3 мг/кг)

Холостой контроль (холостой): PBS-буфер при рН 7,4.

2-2. Способ приготовления: PBS-буфер при рН 7,4.

2-3. Подопытные животные

Голые мыши BALB/cA: приобретены у Shanghai Jiesijie Experimental Animal Company.

3. Методика анализа

В эксперименте самкам голых мышей BALB/cA в возрасте 6-7 недель подкожно инокулировали клетки астроцитомы головного мозга человека U87MG (астроцитома головного мозга человека, банк клеток, Китайская академия наук, кат. №TCHu138). На десятый день после инокуляции клеток животных случайным образом разделяли на группы (Д 0), по 8 животных на группу, осуществляли внутрибрюшинную инъекцию один раз в неделю, в общей сложности 3 раза, и измеряли объем опухоли и массу тела 2-3 раза в неделю, и регистрировали данные. Объем опухоли (V) рассчитывали следующим образом:

V=1/2 × а × b²

где а и b представляют собой длину и ширину, соответственно.

Относительный объем (RTV)=V_T/V₀

Степень ингибирования опухоли (%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%)

Где V₀ и V_T - объем опухоли в начале и конце эксперимента, соответственно. C_RTV и T_RTV - относительные объемы опухолей в контрольной холостой группе (холостой) и в экспериментальных группах, соответственно, в конце эксперимента. 4. Результаты эксперимента

Внутрибрюшинную инъекцию (в/б) осуществляли один раз в неделю, в общей сложности 3 раза; после наблюдения в течение 22 дней 3 мг/кг ADC-27 имели степень ингибирования опухоли 63,3% (Р<0,0001), а 3 мг/кг ADC-26 имели степень ингибирования 49,1%. ADC-27 показал более сильное противоопухолевое действие, чем ADC-26.

Масса тела всех животных в каждой группе была нормальной в процессе введения, и ADC не оказывали явного токсического или побочного действия. Результаты обнаружения приведены в таблице 3 и на ФИГ. 5. Обнаруженные антитела могли эффективно ингибировать рост ксенотрансплантатной опухоли U87MG у голых мышей с опухолями и продемонстрировали дозозависимый эффект.

Тестовый пример 1-8: Оценка терапевтического действия ADC на ксенотрансплантат клеток Detroit 562 фарингеального рака человека, метастазирующего в плевральный выпот, у голых мышей

1. Цель

В этом эксперименте голых мышей BALB/cA использовали в качестве подопытных животных и оценивали терапевтическое действие соединений ADC, раскрытых в настоящем документе, на ксенотрансплантат клеток Detroit 562 фарингеального рака человека, метастазирующего в плевральный выпот, у голых мышей.

2. Исследуемые лекарственных средства и материалы 2-1.

Исследуемые лекарственные средства ADC-29 (3 мг/кг)

ADC-28 (3 мг/кг)

ADC отрицательного контроля (3 мг/кг): конъюгат антитело-лекарственное средство, образованный путем связывания антител, не нацеленных на В7Н3, с соединением 20.

2-2. Способ приготовления: все разбавляли PBS.

2-3. Подопытные животные

Голые мыши BALB/cA: приобретены у Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.

3. Методика анализа

В эксперименте самкам голых мышей BALB/cA в возрасте 6-7 недель подкожно инокулировали клетки Detroit 562 фарингеального рака человека, метастазирующего в плевральный выпот (АТСС, кат. №АТСС® CCL-138™). На десятый день после инокуляции клеток животных случайным образом разделяли на группы (Д 0), по 8 животных на группу, осуществляли внутрибрюшинную инъекцию один раз в неделю, в общей сложности 3 раза, и измеряли объем опухоли и массу тела 2-3 раза в неделю, и регистрировали данные. Объем опухоли (V) рассчитывали следующим образом:

V=1/2 × а × b²

где а и b представляют собой длину и ширину, соответственно.

Относительный объем (RTV)=V_T/V₀

Степень ингибирования опухоли (%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%)

Где V₀ и V_T - объем опухоли в начале и конце эксперимента, соответственно. C_RTV и T_RTV относительные объемы опухолей в контрольной группе (отрицательный контроль) и в экспериментальных группах, соответственно, в конце эксперимента.

4. Результаты эксперимента

Внутрибрюшинную инъекцию осуществляли один раз в неделю, в общей сложности 3 раза; после наблюдения в течение 28 дней 3 мг/кг ADC-29 (3 мг/кг) имели степень ингибирования опухоли 72,27% (Р<0,001), а 3 мг/кг ADC-28 (3 мг/кг) имели степень ингибирования 56,2% (Р<0,001). ADC-29 показал более сильное противоопухолевое действие, чем ADC-28.

Масса тела всех животных в каждой группе была нормальной в процессе введения, и ADC не оказывали явного токсического или побочного действия. Результаты обнаружения приведены в таблице 4 и на ФИГ. 6. Обнаруженные антитела могли эффективно ингибировать рост ксенотрансплантатной опухоли Detroit 562 у голых мышей с опухолями и продемонстрировали дозозависимый эффект.

Тестовый пример 1-9: Оценка эффективности лекарственного средства на мышах с опухолями U87-MG

1. Цель

Голых мышей Balb/c использовали в качестве подопытных животных, и оценивали терапевтическое действие конъюгата антитело к В7Н3-лекарственное средство после внутрибрюшинной инъекции на модели ксенотрансплантата клеток глиобластомы человека U87MG у мышей.

2. Исследуемые лекарственных средства и материалы 2-1.

Исследуемые лекарственные средства ADC-30 1 мг/кг

ADC-30 3 мг/кг ADC-31 1 мг/кг ADC-31 3 мг/кг

Холостой контроль (холостой): PBS

2-2. Способ приготовления: все разбавляли PBS.

2-3. Подопытные животные

Голые мыши BALB/cA: приобретены у Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.

3. Методика анализа

Мышам инокулировали подкожно в правый бок клетки U87MG (астроцитома головного мозга человека, банк клеток, Китайская академия наук, кат. №TCHu138) (2,5×10⁶/мышь), и опухоли росли в течение 14 дней до 167,49 мм³, после чего животных случайным образом разделяли на группы (д 1), по 8 на группу, всего 5 групп.

Внутрибрюшинную инъекцию осуществляли один раз в неделю, в общей сложности 3 раза. Два раза в неделю измеряли объемы опухолей и массу тела и регистрировали результаты.

Использовали программное обеспечение для статистического анализа Excel 2003. Средние значения рассчитывали как avg; значения SD рассчитывали как STDEV; значения SEM рассчитывали как STDEV/SQRT; и Р-значение межгрупповой разницы рассчитывали как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывали как: V=1/2 × L_{длинный} × L_{короткий}²

Относительный объем (RTV)=V_T/V₀

Степень ингибирования опухоли (%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%)

Где V₀ и V_T - объем опухоли в начале и конце эксперимента, соответственно. C_RTV и T_RTV относительные объемы опухолей в контрольной холостой группе (носитель) и в экспериментальных группах, соответственно, в конце эксперимента.

4. Результаты эксперимента

Результаты эксперимента приведены на ФИГ. 7. Внутрибрюшинную инъекцию осуществляли один раз в неделю, в общей сложности 3 раза; после наблюдения в течение 18 дней исследованные ADC имели следующие степени ингибирования опухоли: 1 мг/кг ADC-30 имел степень ингибирования опухоли 0,31%; 3 мг/кг ADC-30 имели степень ингибирования опухоли 45,23% (Р<0,0001); 1 мг/кг ADC-31 имел степень ингибирования опухоли 39,22% (Р<0,01); 3 мг/кг ADC-31 имели степень ингибирования опухоли 80,24% (Р<0,0001). При одинаковой дозировке эффект ингибирования опухоли ADC-31 был значительно лучше, чем у ADC-30.

II. Оптимизация процесса получения Иллюстративные продукты следующих примеров имеют структуру, показанную ниже:

Пример 2-1

Исходный раствор антитела (0,0004251 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 61,71 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,7311 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,002550 ммоль) в 20 мМ буфере на основе гистидина и соляной кислоты (рН 5,6), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 0°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (3,196 мг, 0,002975 ммоль) растворяли в 0,2062 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,2052 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-1 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,45.

Пример 2-2

Исходный раствор антитела (0,0004251 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 61,71 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,5118 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,001785 ммоль) в 20 мМ буфере на основе гистидина и соляной кислоты (рН 5,6), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 13°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (3,196 мг, 0,002975 ммоль) растворяли в 0,2062 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,2052 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-2 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,49.

Пример 2-3

Исходный раствор антитела (0,0004251 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 61,71 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,4021 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,001403 ммоль) в 20 мМ буфере на основе гистидина и соляной кислоты (рН 5,6), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 25°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 соединение 9-А с более коротким временем удерживания (3,196 мг, 0,002975 ммоль) растворяли в 0,2062 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,2052 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-3 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,39.

Пример 2-4

Исходный раствор антитела (0,0004251 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 61,71 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,3899 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,001360 ммоль) в 20 мМ буфере на основе гистидина и соляной кислоты (рН 5,6), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 28°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (3,196 мг, 0,002975 ммоль) растворяли в 0,2062 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,2052 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-4 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,44.

Пример 2-5

Исходный раствор антитела (0,0004251 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 61,71 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,3778 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,001318 ммоль) в 20 мМ буфере на основе гистидина и соляной кислоты (рН 5,6), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 37°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (3,196 мг, 0,002975 ммоль) растворяли в 0,2062 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,2052 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-5 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,46.

Пример 2-6

Исходный раствор антитела (0,0003790 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 50 мМ буфера PBS до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 55,02 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,4563 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,001592 ммоль) в 50 мМ буфере PBS (рН 6,5), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 13°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 соединение 9-А с более коротким временем удерживания (2,850 мг, 0,002653 ммоль) растворяли в 0,1839 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,1829 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-6 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,39.

Пример 2-7

Исходный раствор антитела (0,0003790 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 50 мМ буфера PBS до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 55,02 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,3477 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,001213 ммоль) в 50 мМ буфере PBS (рН 6,5), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 25°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (2,850 мг, 0,002653 ммоль) растворяли в 0,1839 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,1829 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-7 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,50.

Пример 2-8

Исходный раствор антитела (0,0003790 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 50 мМ буфера PBS до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 55,02 мг трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,3259 мг гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 0,001137 ммоль) в 50 мМ буфере PBS (рН 6,5), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 37°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 соединение 9-А с более коротким временем удерживания (2,850 мг, 0,002653 ммоль) растворяли в 0,1839 мл ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,1829 мл ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию избытком цистеина. Был получен иллюстративный продукт ADC-2-8 общей формулы FADC-4A.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,47.

Пример 2-9

Исходный раствор антитела (0,88 ммоль, антитело трастузумаб, разбавленное 20 мМ буфера на основе гистидина и соляной кислоты до конечной концентрации антитела 15 мг/мл), содержащий 127,4 г трастузумаба, подвергали взаимодействию с 0,83 г гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (Sigma, 2,90 ммоль) в 20 мМ буфере на основе гистидина и соляной кислоты (рН 5,6), содержащем 2,5 мМ ЭДТА, при перемешивании на водяной бане с постоянной температурой при 25°С в течение 3 ч с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9 соединение 9-А с более коротким временем удерживания (6,6 г, 6,14 ммоль) растворяли в 0,43 л ДМСО с получением раствора соединения 9-А в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,43 л ДМСО и к полученному раствору добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-А в ДМСО, который перемешивали на водяной бане при 25°С в течение 1 ч и останавливали реакцию.

Вышеуказанный реакционный раствор очищали на катионной хроматографической колонке Capto S Impact (GE) и промывали не менее чем 9 колоночными объемами 0,05 М ацетатного буфера, содержащего 10% (об./об.) ДМСО (рН=5,5), и 6 колоночными объемами 0,05 М ацетатного буфера (рН=5,5) с последующим элюированием 0,05 М ацетатным буфером (рН=5,5, содержащим 0,39 М хлорида натрия) для удаления свободных токсинов и остаточного растворителя из реакционного раствора. Элюат после катионной хроматографии подвергали 7-кратной ультрафильтрации равным объемом (пакет ультрафильтрационных мембран на 30 кДа) и замене буфера на 0,01 М буфер янтарной кислоты (рН 5,0) при 25°С с получением иллюстративного продукта ADC-A1 общей формулы FADC-4A. Образцы 4 партий были получены способом, описанным выше.

Лекарственная нагрузка образцов 4 партий, определенная методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, составила 5,7. Выходы четырех партий составили 100,8%, 98,9%, 97,4% и 99,0%, соответственно.

Пример 2-10

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 3,55 мл, 35,5 мкмоль) добавляли к водному PBS-буферному раствору (0,05 М водный буферный раствор PBS с рН 6,5; 10,0 мг/мл, 164 мл, 11,08 мкмоль) антитела трастузумаба при 37°С, и реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней для проведения реакции при 37°С в течение 3,5 ч при встряхивании и останавливали реакцию. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9 - соединение 9-А с более коротким временем удерживания (185 мг, 172 мкмоль) растворяли в 3,88 мкл ацетонитрила и 1,94 мл ДМСО, и к вышеуказанному реакционному раствору добавляли реакционную смесь, помещали в шейкер с водяной баней и проводили реакцию при 25°С в течение 3 ч при встряхивании, и останавливали реакцию. Реакционный раствор очищали путем последовательного обессоливания через ультрафильтрационные мембраны с помощью водного буферного раствора PBS, содержащего 2% (об./об.) ацетонитрила и 1% (об./об.) ДМСО (0,05 М водный буферный раствор PBS при рН 6,5), и водного буферного раствора янтарной кислоты (0,01 М водный буферный раствор янтарной кислоты при рН 5,3) для удаления малых молекул, и был получен образец иллюстративного продукта ADC-B14 общей формулы FADC-4A, который хранили при 4°С.

Средние значения рассчитывали методом обращенно-фазовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией: n=5,3.

Тестовый пример 2-1: Тест распределения лекарственной нагрузки

1. Способ определения RP-DAR

1.1. Анализ RP-DAR проводили при следующих условиях измерения:

Система УВЭЖХ: система УВЭЖХ с ультравысокоэффективным жидкостным хроматографом Waters H-Class

Детектор: детектор TUV (длина волны измерения: 280 нм)

Хроматографическая колонка: Waters ACQUITY UPLC Protein ВЕН C4 (2,1 мм × 150 мм, 1,7 мкм)

Температура колонки: 80°С

Скорость потока: 0,3 мл/мин

Температура камеры для образца: 20°С

Время регистрации: 25 мин

Подвижная фаза А: 0,1% водный раствор дифторуксусной кислоты (DFA)

Подвижная фаза В: 0,1% раствор DFA в ацетонитриле

Программа градиента: 27,0% В-44,0% В (0,00 мин-12,00 мин), 44,0% В-100% В (12,00 мин-13,00 мин), 100% В-100% В (13,00 мин-20,00 мин), 100% В-27,0% В (20,00 мин-20,04 мин) и 27,0% В-27,0% В (20,04 мин-25 мин)

Объем вводимой пробы: 1,0 мкл

1.2. Анализ данных

В случае легкой цепи, связанной с лекарственным средством (легкая цепь, связанная с одним лекарственным средством: L₁) и тяжелых цепей, связанных с лекарственным средством (тяжелая цепь, связанная с одним лекарственным средством: H₁, тяжелые цепи, связанные с двумя лекарственными средствами: Н₂, тяжелые цепи, связанные с тремя лекарственными средствами: Н₃, и тяжелые цепи, связанные с четырьмя лекарственными средствами: Н₄), гидрофобность увеличивалась пропорционально количеству связанных лекарственных средств, а время удерживания увеличивалось по сравнению с легкой цепью (L₀) и тяжелой цепью (Н₀) антитела, не связывающимися с лекарственными средствами. Поэтому элюирование проводили в следующем порядке: L₀, L₁, Н₀, H₁, Н₂, Н₃ и Н₄.

Поскольку линкеры лекарственного средства поглощали УФ-излучение, результирующую площадь пика корректировали в соответствии с количеством связанных лекарственных средств с использованием молярных коэффициентов поглощения легких цепей, тяжелых цепей и линкеров лекарственного средства в соответствии со следующим выражением. Формула расчета представляла собой следующую:

Легкая цепь (ε LC-280)/(ε LC-280 + количество связанных лекарственных средств × ε ЛС-280)

Тяжелая цепь (ε HC-280)/(ε НС-280 + количество связанных лекарственных средств × ε ЛС-280)

Примечание: ε LC-280: молярный коэффициент экстинкции легкой цепи при 280 нм;

ε НС-28: молярный коэффициент экстинкции тяжелой цепи при 280 нм;

ε ЛС-280: молярный коэффициент экстинкции токсина при 280 нм.

Общая скорректированная площадь пика НС = скорректированная площадь пика Н₀+ скорректированная площадь пика H₁+ скорректированная площадь пика Н₂+ скорректированная площадь пика Н₃+ скорректированная площадь пика H₄

Лекарственная нагрузка n=2 × Σ(количество связанных лекарственных средств × процент скорректированной площади пика)/100

2. Результаты измерения

Результаты показали, что для образцов, полученных с использованием одной и той же буферной системы и различных температур реакции восстановления, однородная степень распределения лекарственной нагрузки в образцах была значительно улучшена наряду со снижением температуры реакции восстановления; для образцов, полученных с использованием одной и той же температуры реакции восстановления и различных буферных систем, распределение лекарственной нагрузки в образцах, где использовалась буферная система гистидин-соляная кислота, было более однородным.

Тестовый пример 2-2: Тест на свободный токсин 1.

Способ определения свободного токсина

1.1. ВЭЖХ-анализ проводили при следующих условиях измерения:

Система ВЭЖХ: система УВЭЖХ с ультравысокоэффективным жидкостным хроматографом Waters H-Class

Детектор: детектор TUV (длина волны измерения: 370 нм)

Хроматографическая колонка: Waters ACQUITY UPLC Petide ВЕН C18 (130, 2,1 мм × 150 мм, 1,7 мкм)

Температура колонки: 40°С

Скорость потока: 0,3 мл/мин

Температура камеры для образца: 10°С

Подвижная фаза А: 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты (TFA)

Подвижная фаза В: 0,1% раствор TFA в ацетонитриле

Программа градиента: 25,0% В-25,0% В (0,00 мин-1,00 мин), 25,0% В-55,0% В (1,00 мин-17,00 мин), 55,0% В-25,0% В (17,00 мин-17,10 мин), 25,0% В-25,0% В (17,10 мин-20,00 мин)

Объем вводимой пробы: 5,0 мкл

1.2. Анализ данных

Предел LOD для токсина рассчитывали следующим образом:

Предел токсина (ppm)=0,1 × 4 × 1000/С

Примечание:

a) 0,1- концентрация раствора LOD токсина (мкг/мл), 4 - коэффициент разбавления во время предварительной обработки образца, 1000 - коэффициент пересчета единиц измерения, и С - концентрация белка (мг/мл) в образце, подлежащем измерению.

b) Если площадь пика свободного токсина в образце была меньше, чем площадь пика раствора LOD, то считалось, что он меньше предела или не поддается обнаружению.

2. Результаты измерения

Обнаружение свободного токсина проводили на ADC-A1 (партии 1-4) и ADC-B14, и результаты (см. таблицу 7) показали, что катионная колоночная хроматография не только пригодна для крупномасштабного производства, но также значительно уменьшала содержание свободного токсина.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛС КО., ЛТД.

ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.

<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

<130> 721020CPCT

<150> CN202010219311.2

<151> 2020-03-25

<150> CN202110297397.5

<151> 2021-03-19

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Легкая цепь трастузумаба

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Тяжелая цепь трастузумаба

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 3

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Легкая цепь пертузумаба

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Тяжелая цепь пертузумаба

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 5

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Легкая цепь антитела к B7H3 1F9DS

<400> 5

Asp Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

His Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile His Val Asp Arg

85 90 95

Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 6

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Тяжелая цепь антитела к B7H3 1F9DS

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Arg Leu Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты способы получения конъюгатов антитело-лекарственное средство, включающие стадии их синтеза и очистки. Также раскрыты полученные указанными способами противоопухолевые конъюгаты антитело-лекарственное средство и их фармацевтически приемлемые соли. Изобретение обеспечивает улучшенные терапевтические эффекты полученных конъюгатов. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 табл., 72 пр.

1. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную общей формулой (Pc-L_a-Y-D):

;

где W представляет собой C_1-8 алкил или C_1-8 алкил-C_3-7 циклоалкил;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислотных остатков, где аминокислотные остатки выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты;

R¹ представляет собой C_3-7 циклоалкил;

R² представляет собой водород;

или R¹ и R² вместе со связанными с ними атомами углерода образуют C_3-7 циклоалкил;

R⁵ представляет собой водород;

R⁶ и R⁷ представляют собой водород;

m равно 0 или 1;

n представляет собой десятичное или целое число от 3 до 8;

Pc представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

где способ получения включает следующие стадии:

стадия (a): подвергание указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента взаимодействию с восстанавливающим агентом при температуре реакции от 1°С до 36°С; и

стадия (b): подвергание продукта стадии (a) взаимодействию с соединением следующей формулы (La-Y-D):

где W, L², L³, R¹, R², R⁵, R⁶, R⁷ и m являются такими, как определено выше.

2. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по п. 1, где температурные условия реакции на стадии (a) представляют собой от 4°С до 30°С, от 20°С до 30°С и более предпочтительно 25°С.

3. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по п. 1 или 2, где реакцию на стадии (a) проводят при рН от 4,5 до 6,5, предпочтительно реакцию проводят при рН от 5,0 до 6,0, более предпочтительно реакцию проводят при рН 5,6.

4. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-3, где реакцию на стадии (a) проводят в буфере; предпочтительно буфер выбран из группы, состоящей из буферов на основе соли гистидина, фосфатных буферов и ацетатных буферов; более предпочтительно буфер представляет собой ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)-содержащий буфер на основе соли гистидина.

5. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-4, где восстанавливающий агент на стадии (a) выбран из группы, состоящей из трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) или его соли, 1,4-димеркаптотреитола и β-меркаптоэтанола, и предпочтительно гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина.

6. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-5, где способ получения дополнительно включает стадию (c), включающую очистку продукта стадии (b) с помощью катионной колоночной хроматографии или аффинной колоночной хроматографии; предпочтительно стадия (c) включает подвергание продукта стадии (b) катионной колоночной хроматографии с использованием наполнителя, выбранного из группы, состоящей из Capto S Impact и Poros XS и предпочтительно Capto S Impact.

7. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из антитела к HER2 (ErbB2), антитела к EGFR, антитела к B7-H3, антитела к c-Met, антитела к HER3 (ErbB3), антитела к HER4 (ErbB4), антитела к CD20, антитела к CD22, антитела к CD30, антитела к CD33, антитела к CD44, антитела к CD56, антитела к CD70, антитела к CD73, антитела к CD105, антитела к CEA, антитела к A33, антитела к Cripto, антитела к EphA2, антитела к G250, антитела к MUCl, антитела к антигену LeY, антитела к VEGFR, антитела к GPNMB, антитела к интегрину, антитела к PSMA, антитела к тенасцину-C, антитела к SLC44A4, антитела к мезотелину и их антигенсвязывающего фрагмента;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из трастузумаба, пертузумаба, нимотузумаба, эноблитузумаба, эмибетузумаба, инотузумаба, пинатузумаба, брентуксимаба, гемтузумаба, биватузумаба, лорвотузумаба, cBR96, глематумамаба и их антигенсвязывающего фрагмента.

8. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-7, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8.

9. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-8, где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8, предпочтительно десятичное или целое число от 5 до 7 и более предпочтительно десятичное или целое число от 5,3 до 6,1.

10. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9, где распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее;

предпочтительно распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более.

11. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8;

где способ получения включает следующие стадии:

стадия (a): подвергание трастузумаба взаимодействию с TCEP при температуре реакции от 4°С до 30°С и pH от 5,0 до 6,0; и

стадия (b): подвергание продукта стадии (a) взаимодействию с соединением следующей формулы:

12. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное число или целое число от 4 до 8;

где способ получения включает следующие стадии:

стадия (a): подвергание трастузумаба взаимодействию с TCEP при температуре реакции 25°С и pH 5,6, где реакцию проводят в ЭДТА-содержащем буфере на основе гистидина и соляной кислоты;

стадия (b): подвергание продукта стадии (a) взаимодействию с соединением следующей формулы:

стадия (c): подвергание продукта стадии (b) очистке через катионную хроматографическую колонку.

13. Противоопухолевый конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную общей формулой (Pc-L_a-Y-D):

;

где W представляет собой C_1-8 алкил или C_1-8 алкил-C_3-7 циклоалкил;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислотных остатков, где аминокислотные остатки выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты;

R¹ представляет собой C_3-7 циклоалкил;

R² представляет собой водород;

или R¹ и R² вместе со связанными с ними атомами углерода образуют C_3-7 циклоалкил;

R⁵ представляет собой водород;

R⁶ и R⁷ представляют собой водород;

m равно 0 или 1;

n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8;

Pc представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из антитела к HER2 (ErbB2), антитела к EGFR, антитела к B7-H3, антитела к c-Met, антитела к HER3 (ErbB3), антитела к HER4 (ErbB4), антитела к CD20, антитела к CD22, антитела к CD30, антитела к CD33, антитела к CD44, антитела к CD56, антитела к CD70, антитела к CD73, антитела к CD105, антитела к CEA, антитела к A33, антитела к Cripto, антитела к EphA2, антитела к G250, антитела к MUCl, антитела к Lewis Y, антитела к VEGFR, антитела к GPNMB, антитела к интегрину, антитела к PSMA, антитела к тенасцину-C, антитела к SLC44A4, антитела к мезотелину и их антигенсвязывающего фрагмента;

и распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее.

14. Противоопухолевый конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 13, где распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более.

15. Противоопухолевый конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, где конъюгат антитело-лекарственное средство получен способом получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9, и распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с 4 лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее,

где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в конъюгате антитело-лекарственное средство выбраны из группы, состоящей из антитела к HER2 (ErbB2), антитела к EGFR, антитела к B7-H3, антитела к c-Met, антитела к HER3 (ErbB3), антитела к HER4 (ErbB4), антитела к CD20, антитела к CD22, антитела к CD30, антитела к CD33, антитела к CD44, антитела к CD56, антитела к CD70, антитела к CD73, антитела к CD105, антитела к CEA, антитела к A33, антитела к Cripto, антитела к EphA2, антитела к G250, антитела к MUCl, антитела к Lewis Y, антитела к VEGFR, антитела к GPNMB, антитела к интегрину, антитела к PSMA, антитела к тенасцину-C, антитела к SLC44A4, антитела к мезотелину и их антигенсвязывающего фрагмента.

16. Противоопухолевый конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 15, где распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более.

17. Противоопухолевый конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную следующей формулой:

где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8;

конъюгат антитело-лекарственное средство получен способом получения конъюгата антитело-лекарственное средство по п. 11 или 12, и распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее.

18. Противоопухолевый конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 17, где распределение лекарственной нагрузки в конъюгате антитело-лекарственное средство является следующим: в популяции тяжелых цепей антитела доля тяжелых цепей антитела, связывающихся с четырьмя лекарственными средствами, составляет 4% или менее, и доля тяжелых цепей антитела, не связывающихся с лекарственными средствами, составляет 5% или менее; и в популяции легких цепей антитела доля легких цепей антитела, связывающихся с одним лекарственным средством, составляет 65% или более.