СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ТРОМБОЭМБОЛИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ С ФИБРИЛЛЯЦИЕЙ ПРЕДСЕРДИЙ НЕКЛАПАННОГО ГЕНЕЗА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике и терапии, и предназначено для определения риска возникновения тромбоэмболических осложнений у больных с различными видами фибрилляции предсердий неклапанного генеза.

Фибрилляция предсердий (ФП) является одним из наиболее распространенных нарушений сердечного ритма [1]. В последние годы достигнут значительный прогресс в выявлении ФП и ее лечении. Известно, что фибрилляция предсердий может приводить к протромботическому или гиперкоагуляционному состоянию с аномальным гемостазом, фибринолизом и эндотелиальной дисфункцией [2]. Однако, по-прежнему, риск развития тромбоэмболических осложнений (ТЭО), в том числе ишемического инсульта у пациентов с ФП в 5 раз превышает таковой у пациентов с синусовым ритмом, поэтому одним из основных направлений лечения пациентов с данным нарушением ритма является профилактика ТЭО [3]. Пероральные антикоагулянты позволяют уменьшить риск инсульта при ФП, однако частота инсультов и периферических тромбоэмболий на фоне использования антикоагулянтов остается достаточно высокой. Это может указывать на роль сохраняющегося тромбообразования в левых отделах сердца на фоне приема антикоагулянтов у части больных [4]. ФП приводит к расширению полости левого предсердия, нарушению его сократительной функции, а отсутствие полноценной систолы предсердий и пассивное опорожнение ушка левого предсердия за счет сокращения прилежащей стенки левого желудочка – к замедлению кровотока в ушке левого предсердия [5]. Образованию тромбов в ушке левого предсердия способствуют его анатомические особенности: узкая конусовидная форма, а также неровность внутренней поверхности, обусловленная наличием гребенчатых мышц и мышечных трабекул [6,7]. Антитромботическая профилактика при фибрилляции предсердий является важной задачей для изучения, поскольку проблема ТЭО остается не решенной. В последние годы активно изучаются взаимосвязи между тромбозом и воспалением, так как известно, что не только воспаление сопровождается повышением активности системы свертывания крови, но и тромбообразование в свою очередь приводит к активации воспаления [8].

Одним из биомаркеров, проявляющим важные противовоспалительные, антикоагулянтные и антифибринолитические свойства и участвующим в поддержании сосудистого гомеостаза является тромбомодулин (ТМ). Тромбомодулин представляет собой интегральный мембранный белок, рецептор тромбина, находящийся на клетках эндотелия кровеносных сосудов и участвующий в системе антикоагуляции, который способствует опосредованной тромбином активации протеина С. При связывании с тромбомодулином, активность тромбина изменяется в следующем направлении: основной характеристикой тромбин-тромбомодулинового комплекса является его способность активировать белок С, который затем осуществляет негативную регуляцию каскада свертывания за счет протеолитической инактивации необходимых кофакторов фактора Va и фактора VIIIa, оказывая, таким образом, антикоагулянтное действие [9]. Комплекс тромбин-тромбомодулин также способен активировать ингибитор фибринолиза (TAFI), который затем противодействует фибринолизу.

Протеин C – основной физиологический антикоагулянт, он относится к витамин K-зависимым протеолитическим ферментам (сериновая протеаза), который активируется под действием тромбина. При этом он превращается в активированный протеин С, который способен связываться с протеином S и расщеплять факторы коагуляции Va и VIIIа. Активированный протеин С является основным ферментом каскадного пути протеина С, который обеспечивает физиологическую антитромботическую активность крови и обладает также выраженными противовоспалительной и антиапоптозной активностями. Тромбомодулин образует прочный стехиометрический – 1:1 – комплекс с тромбином, существенно модифицируя свойства тромбина [10]. В результате взаимодействия тромбина и фибриногена последний растворяется с образованием фибрина – белка, способного свертывать кровь и образовывать сгустки. Тромбин в каскаде коагуляции активирует тромбоциты и превращает кофакторы свертывания V и VIII в их активные формы - Va и VIIIa. Без комплекса с тромбомодулином тромбин активирует протеин C, но только очень медленно и неэффективно. Комплекс тромбина с тромбомодулином промотирует активацию протеина C, причем константа скорости активации протеина C в 20000 раз выше для комплекса тромбина C с тромбомодулином, чем для одного тромбина [11].

Экспрессия ТМ жестко регулируется для обеспечения быстрой и локализованной гемостатической и воспалительной реакции на повреждение. Тромбомодулин широко экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток и в присутствии цитокинов, активированных нейтрофилов и макрофагов эндотелиальный тромбомодулин расщепляется ферментативно, высвобождая растворимые фрагменты, которые циркулируют в крови. Растворимая форма тромбомодулина считается маркером повреждения эндотелия и сохраняет свои антикоагулянтные свойства. Растворимый тромбомодулин также оказывает ингибирующее действие на активацию тромбоцитов тромбином. Повышение уровня физиологических антикоагулянтов никогда не приводит к кровотечениям, в то время как снижение их содержания существенно повышает риск тромбозов [12, 13].

Понимание патофизиологической роли провоспалительной и протромботической активации у пациентов с фибрилляцией предсердий, способствует изучению биомаркеров в качестве метода индивидуальной оценки риска возникновения тромбоэмболических осложнений. Биомаркеры являются надежным, безопасным и объективным средством лабораторной диагностики, контроля коррекции лечения, прогнозирования и стратификации риска развития ТЭО. Исследования последних лет демонстрируют повышенный интерес к разработке новых лабораторных методов оценки риска возникновения ТЭО. Однако, среди достаточно большого количества биомаркеров, пока ни один не удовлетворяет условиям чувствительного специфичного маркера в оценке вероятности развития ТЭО у пациентов с фибрилляцией предсердий неклапанного генеза, получающих антикоагулянтную терапию. Поиск наиболее чувствительного, доступного и специфичного биологического маркера для оценки риска возникновения ТЭО является актуальным. Применяющиеся в рутинной клинической практике методы исследования не позволяют точно определить наличие тромбов.

Известен способ для выявления тромбов в полостях сердца, им является чреспищеводная ЭхоКГ (чувствительность – 92-100%, специфичность – 98-100%) [14]. Однако и он имеет недостатки: сложная структура ушек предсердий, горизонтальное расположение сердца в грудной клетке, выраженное ожирение значительно затрудняют полноценность визуализации. Среднетяжелое и тяжелое состояние больного в большинстве случаев делает проведение чреспищеводного Эхо-КГ проблематичным или абсолютно невыполнимым. Это относится, в том числе, к больным с сердечной недостаточностью, тахипное, выраженной одышкой, а также к пациентам с массивной и субмассивной ТЭЛА. Также чреспищеводная ЭхоКГ проводится лишь в крупных специализированных медицинских центрах.

Для прогнозирования тромбоэмболии из левых отделов сердца в настоящее время используется модифицированная бирмингемская шкала (2009 г.) – шкала CHA2DS2-VASc. Она вошла в официальные рекомендации Европейского общества кардиологов по ведению больных мерцательной аритмией в качестве основной шкалы для оценки риска развития тромбоэмболических осложнений однако следует отметить, что она не лишена недостатков и обладает лишь умеренной предсказательной ценностью худшей предсказательной ценностью для пациентов некоторых рас, при сниженной функции почек и т.д. Также некоторым ограничением шкалы CHA2DS2-VASc можно считать тот факт, что она имеет схожую предсказательную ценность для определения риска инсульта у пациентов как с ФП, так и без нее, что может указывать на недостаточную специфичность [6].

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития тромбоэмболических осложнений у больных с фибрилляцией предсердий неклапанного генеза с применением наиболее чувствительного, специфичного и простого в определении маркера.

Поставленная задача решается путем регистрации возраста пациента на момент включения в исследование и определения содержания растворимого тромбомодулина (sТМ) в сыворотке крови пациентов с фибрилляцией предсердий неклапанного генеза с последующим расчетом вероятности P. Для вычисления вероятности P возникновения тромбоэмболических осложнений у пациентов с фибрилляцией предсердий была построена модель логистической регрессии P=1/(1+e^-L), где L вычислялась по формуле:

L=-5,32 + 0,10 х Возраст - 0,66 х sТМ.

Была определена пороговая вероятность P₀ = 0,58. Если модельная вероятность P, вычисленная для пациента по его возрасту и значениям sТМ превышала пороговую вероятность P_0, то у него высокий риск развития тромбоэмболических осложнений. Проведен ROC-анализ этой модели и построена ROC-кривая. По шкале качества модель характеризуется как «очень хорошая» (AUC=0,81).

В основе предложенного способа оценки вероятности развития тромбоэмболических осложнений у пациентов с фибрилляцией предсердий лежит снижение содержания в крови растворимого ТМ, приводящее к увеличению протромбогенного и провоспалительного потенциала у пациентов с фибрилляцией предсердий при наличии дефицита естественного ингибитора коагуляции тромбомодулина.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволит выбрать оптимальную лечебную тактику у пациентов с высокой вероятностью возникновения ТЭО и предотвратить в ряде случаев новые эпизоды ТЭО, то есть положительно повлиять (повысить) на их выживаемость. Проводить более дорогостоящие исследования прицельно группе больных, где вероятность возникновения ТЭО наиболее высока, т.е. экономить материальные средства и граждан, и медицинских учреждений.

Новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства явным образом не вытекающие из уровня техники и не очевидные для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован в практическом здравоохранении для повышения точности диагностики возникновения тромбоэмболических осложнений при ФП.

Исходя из вышеизложенного следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенной к нему фигуры.

На фигуре изображена ROC-кривая, AUC=0,81 чувствительность – 0,87, специфичность – 0,62, p<0,05.

Предлагаемый способ основан на результатах клинического исследования. В исследование были включены 56 пациентов старше 18 лет (средний возраст 56,6±17,9), с диагнозом фибрилляция предсердий неклапанного генеза, верифицированном на основании клинических рекомендаций (рекомендации ESC 2020 по диагностике и лечению фибрилляции предсердий), подтверждённым по ЭКГ, суточном мониторировании ЭКГ, получающих антикоагулянтную терапию. Из них у 21 пациента (35%) произошло развитие тромботических осложнений на фоне адекватной антикоагулянтной терапии. При наличии показаний и при отсутствии противопоказаний - проводилось эндокардиальное ЭФИ и РЧА с использованием нефлюороскопической навигационной системы CARTO 3 EP (BiosenseWebster, США). Критерии невключения субъектов: противопоказания к приему антикоагулянтов, хроническая сердечная недостаточность с выраженным снижением фракции выброса левого желудочка менее 40% и значительной дилатацией полостей сердца, клапанная патология сердца, беременные или женщины детородного возраста, планирующие беременность на время проведения исследования, недееспособные пациенты по психо-неврологическим состояниям. Все пациенты дали свое письменное информированное согласие на включение в исследование. Протокол исследования был одобрен комитетом по биомедицинской этике НИИ кардиологии.

Способ осуществляют следующим образом: проводят оценку содержания растворимого тромбомодулина в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа материала, забранного в течение первых суток с момента поступления. Используют наборы Human soluble Thrombomodulin ELISA kit, Hycult Biotech, (Netherlands), измерение проводя на иммуноферментном анализаторе Tecan Austria Infinite F50. Используемый материал: сыворотка крови.

Сбор и хранение образцов: Забор крови проводят натощак из локтевой вены методом венопункции в специальную стерильную вакуумную систему с активатором свертывания. Полученные образцы крови инкубируют при комнатной температуре 30-45 минут, после чего в течение 10 минут центрифугируют при скорости 3000 об/мин при комнатной температуре. Полученную сыворотку аликвотируют в одноразовые пластиковые пробирки и подвергают заморозке и хранению в температурных условиях при -20°C или ниже.

Протокол анализа:

1. До начала иммуноанализа выполняют подготовку реагентов: приготовление разведений стандарта, контролей качества, подготовку промывочного буфера, буфера для разведений, стандартного раствора сыворотки.

2. Вносят по 100 мкл в дублях каждого стандарта, контроля и образца в соответствующие лунки, согласно протоколу анализа.

3. Планшет герметизируют адгезивной пленкой и инкубируют 1 час при комнатной температуре (20-25°C) на микропланшетном шейкере со скоростью 750 rpm.

4. Удаляют жидкость из лунок и трижды промывают планшет, внося по 200 мкл готового буфера для промывок.

5. Вносят по 100 мкл трейсера во все лунки, планшет герметизируют адгезивной пленкой и инкубируют 1 час при комнатной температуре (20-25°C) на микропланшетном шейкере со скоростью 750 rpm.

6. Удаляют жидкость из лунок и трижды промывают планшет, внося по 200 мкл готового буфера для промывок.

7. Вносят по 100 мкл во все лунки коньюгат стрептавидин-пероксидаза, разведенного непосредственно перед шагом7, планшет герметизируют адгезивной пленкой и инкубируют 1 час при комнатной температуре (20-25°C) на микропланшетном шейкере со скоростью 750 rpm.

8. Удаляют жидкость из лунок и трижды промывают планшет, внося по 200 мкл готового буфера для промывок.

9. Вносят по 100 мкл во все лунки раствор субстрата ТМВ

10. Планшет герметизируют адгезивной пленкой и инкубируют 30 минут при комнатной температуре (20-25°C).

11. Реакцию останавливают добавлением во все лунки 100 мкл стоп-раствора.

12. Проводят измерение абсорбции в спектрофотометре при 450 нм, следуя инструкциям производителя оборудования, не позднее, чем через 30 минут после внесения стоп-раствора.

13. Вычисляют результаты с помощью калибровочной кривой с использованием соответствующего программного обеспечения.

На основании полученных результатов была построена модель логистической регрессии предикторов возраст и растворимый тромбомодулин с чувствительностью – 87%, специфичность модели – 62%, (p<0,05).

Таким образом, предлагаемый в изобретении способ с использованием данных возраста и уровня sTM продемонстрировал удовлетворительный уровень чувствительности и специфичности для оценки вероятности развития тромбоэмболических осложнений у пациентов с фибрилляцией предсердий.

Способ оценки вероятности развития тромбоэмболических осложнений по анализу содержания в крови маркера – sTM иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1

Пациент Г., мужчина, 53 года, поступил в плановом порядке в отделение хирургического лечения сложных нарушений ритма сердца и электрокардиостимуляции НИИ кардиологии, Томский НИМЦ. Основное заболевание: ИБС, ГБ 2степени, пароксизмальная фибрилляция предсердий. Осложнение: ХСН 1, ФК 2, (NYHA). Из анамнеза: 15.01.2017 была проведена CARTO PЧА, изоляция ЛВ. Антикоагулянтная терапия-ксарелто. Тромбоэмболические осложнения не развились.

Значение показателя растворимого тромбомодулина – 3,56 нг/мл.

Проведено исследование согласно предлагаемому способу:

P=1/(1+e^-L),

L=-5,32 + 0,10 × 53 - 0,66 × 3,56= -2,37

P₀=1/(1+e^2,37) =0,15, полученное значение ниже порогового значения, у пациента низкий риск развития ТЭО.

Пример 2

Пациентка К., женщина, 75 лет, поступила в плановом порядке в отделение хирургического лечения сложных нарушений ритма сердца и электрокардиостимуляции НИИ кардиологии, Томский НИМЦ. Основное заболевание: ГКМП, ИБС, ГБ 2 степени, впервые выявленная фибрилляция предсердий. Осложнение: ХСН 1, ФК 2, (NYHA). Антикоагулянтная терапия-ксарелто. Впоследствии развился тромбоз ушка левого предсердия.

Значение показателя растворимого тромбомодулина – 1,8 нг/мл.

Проведено исследование согласно предлагаемому способу:

P=1/(1+e^-L),

L=-5,32 + 0,10 × 75 - 0,66 × 1,8=0,98

P₀=1/(1+e^-0,98) =0,68, полученное значение выше порогового значения, что соответствует возникновению тромбоэмболических осложнений у данной больной.

Предлагаемый в качестве изобретения способ апробирован у 56 пациентов с фибрилляцией предсердий неклапанного генеза и позволяет прогнозировать развитие тромбоэмболических осложнений. Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью выявить группу высокого риска развития тромбоэмболических осложнений у пациентов с фибрилляцией предсердий неклапанного генеза для диспансерного наблюдения и оценить персональный риск возникновения ТЭО.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике и терапии, и предназначено для определения риска возникновения тромбоэмболических осложнений у больных с различными видами фибрилляции предсердий неклапанного генеза. Регистрируют возраст пациента, определяют количественное содержание растворимого тромбомодулина в сыворотке крови (sТМ). Вычисляют вероятность возникновения тромбоэмболических осложнений Р по формуле и при значении Р больше 0,58 прогнозируют высокий риск развития тромбоэмболических осложнений. 1 ил., 2 пр.

Способ прогнозирования риска развития тромбоэмболических осложнений у больных с фибрилляцией предсердий неклапанного генеза, характеризующийся тем, что пациенту регистрируют возраст на момент включения в исследование и в сыворотке крови измеряют уровень растворимого тромбомодулина, а вероятность возникновения тромбоэмболических осложнений рассчитывают по формуле:

P=1/(1+e^-L),

где P - вероятность возникновения тромбоэмболических осложнений,

e - основание натурального логарифма,

L - величина логистической регрессии, которую определяют по формуле

L=-5,32+0,10×Возраст-0,66×sТМ,

где Возраст - возраст, годы,

sТМ - растворимый тромбомодулин, нг/мл,

5,32 - коэффициент постоянный,

0,10 - коэффициент переменной Возраст,

0,66 - коэффициент переменной sТМ,

и при значении P больше 0,58 прогнозируют высокий риск развития тромбоэмболических осложнений.