Новый промотор и его применение Российский патент 2024 года по МПК C12N15/113 C12N15/63 C12N15/77 C12P13/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к новому промотору и способу получения целевого вещества с его применением и, более конкретно, к новому полинуклеотиду, обладающему активностью промотора, вектору и микроорганизму рода Corynebacterium, включающим его, способу получения целевого вещества с применением микроорганизма и к применению промотора.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Многочисленные исследования получения целевых веществ (например, аминокислот) в микроорганизмах были направлены на экологичные и безопасные способы получения, среди них непрерывно проводились исследования по получению целевых веществ в больших количествах в микроорганизмах рода Corynebacterium. Микроорганизм рода Corynebacterium (Corynebacterium sp.), в частности, Corynebacterium glutamicum, представляющий собой грамположительный микроорганизм, который часто применялся для получения L-аминокислот и других полезных веществ. Для получения L-аминокислот и других полезных веществ проводились различные исследования для создания микроорганизмов, обеспечивающих высокоэффективные технологические процессы получения и ферментации.

L-лизин, репрезентативное вещество, продуцируемое микроорганизмами рода Corynebacterium, применяется в промышленности по производству кормов для животных, а также фармацевтических и косметических средств для человека, и образуется путем ферментации с применением штаммов Corynebacterium. Известны микроорганизмы с генами, связанными с усиленным биосинтезом L-лизина, и способы получения L-лизина с его применением (KR 10-0924065 В1).

L-треонин, представляющий собой незаменимую аминокислоту, широко применяется в качестве пищевой и кормовой добавки и также применяется в медицинских целях в качестве исходного синтетического материала для инфузий и фармацевтических средств. Поскольку животные с вегетарианским рационом питания предрасположены к дефициту L-треонина вследствие меньшего содержания L-треонина в растительных белках, L-треонин особенно эффективно применяется в качестве добавки в корма для животных. L-треонин преимущественно производится путем ферментации с применением микроорганизмов Е. coli или Corynebacterium, созданных путем искусственной мутации или генетической рекомбинации. Как правило, известен способ с применением рекомбинантного штамма, в котором L-треонин производится посредством внедрения треонинового оперона, происходящего из Е. coli, в треонин-продуцирующий штамм Brevibacterium flavum (TURBA E, et at, Agric. Biol. Chem. 53:2269-2271, 1989).

O-ацетилгомосерин представляет собой вещество, используемое в качестве предшественника для получения метионина и является промежуточным соединением в пути биосинтеза метионина (WO 2008/013432). O-ацетил-L-гомосерин синтезируется гомосеринО-ацетилтрансферазой из L-гомосерина и ацетил-СоА в качестве субстратов.

Изолейцин, представляющий собой незаменимую аминокислоту, которая не синтезируется в организме, известен своим влиянием, способствующим росту, улучшению функций нервов, улучшению функции печени и увеличению мышечной силы, и обычно образуется путем ферментации с применением микроорганизмов.

По-прежнему существует потребность в разработке универсального промотора, поскольку необходима система, демонстрирующая высокую эффективность экспрессии в различных микроорганизмах, то есть в микроорганизмах рода Escherichia, микроорганизмах рода Corynebacterium или микроорганизмах рода Bacillus. Также ожидается, что универсальный промотор, разработанный без ограничения конкретным целевым веществом, может применяться в получении различных веществ.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

В данном изобретении было установлено, что новый синтетический промотор, будучи расположенным в прямом направлении, обладает высокой экспрессирующей активностью по отношению к нижележащим генам по сравнению с известным промотором, приводя к образованию различных целевых веществ.

Техническое решение

Аспектом данного изобретения является предложение полинуклеотида, обладающего активностью промотора.

Другим аспектом данного изобретения является предложение вектора или экспрессионой кассеты, включающих полинуклеотид и ген, кодирующий целевой белок и функционально связанный с полинуклеотидом.

Еще одним аспектом данного изобретения является предложение микроорганизма рода Corynebacterium, включающего полинуклеотид или полинуклеотид и ген, кодирующий целевой белок и функционально связанный с полинуклеотидом.

Еще одним аспектом данного изобретения является предложение способа продуцирования целевого вещества, включающего культивирование микроорганизма рода Corynebacterium в среде и выделение целевого вещества из среды.

Еще одним аспектом данного изобретения является предложение применения полинуклеотида, обладающего активностью промотора, в качестве промотора, в котором нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32 и 36 заменены другими нуклеотидами в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.

Полезные эффекты

Новый полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может быть внедрен в микроорганизм, продуцирующий целевое вещество, тем самым увеличивая продуцирование целевого вещества. Благодаря улучшенному выходу, можно ожидать удобство получения, снижение стоимости производства и другие эффекты, касающиеся промышленного аспекта.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее данное изобретение будет описано более подробно. Каждое из описаний и воплощений, изложенных в данной заявке, также может быть применено к другим описаниям и воплощениям. Таким образом, все комбинации различных элементов, изложенных в данной заявке, входят в объем данного изобретения. Более того, объем данного изобретения не ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже.

Кроме того, специалисты в данной области поймут или смогут найти, проведя рутинные эксперименты, множество эквивалентов частных воплощений данного изобретения, описанных в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем данного изобретения.

Аспектом данного изобретения является предложение полинуклеотида, обладающего активностью промотора.

В частности, полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может представлять собой полинуклеотид, обладающий активностью промотора и включающий по меньшей мере одну полинуклеотидную замену в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.

В данном описании термин «полинуклеотид» относится к полимеру из нуклеотидов, образованному в результате соединения нуклеотидных мономеров ковалентными связями в длинную цепь, и полинуклеотид представляет собой цепь ДНК, имеющую заданную длину или более.

В данном описании термин «полинуклеотид, обладающий активностью промотора» относится к области ДНК, находящейся вблизи сайта, где находится экспрессируемый ген, то есть целевой ген транскрибируется, включая сайт, с которым для экспрессии целевого гена связывается РНК-полимераза, энхансер или тому подобное.

Полинуклеотид, обладающий активностью промотора, может применяться в качестве универсального усиливающего промотора. Например, полинуклеотид может применяться в качестве промотора, способного усиливать экспрессию полипептида, обладающего глутаматдегидрогеназной (gdh) активностью. В качестве альтернативы, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, вовлеченный в увеличение продуцирования или выхода целевого вещества, в частности, лизина, треонина, О-ацетилгомосерина или изолейцина.

Полинуклеотид по данному изобретению может охватывать любой полинуклеотид, обладающий активностью промотора, без ограничения. В частности, полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может представлять собой полинуклеотид, обладающий активностью промотора и включающий по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь нуклеотидных замен в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.

Примером полинуклеотидной последовательности с SEQ ID NO: 1, может быть полинуклеотид, обладающий активностью промотора глутаматдегидрогеназы. Полинуклеотид, имеющий замену конкретного полинуклеотида в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, при условии наличия промоторной активности, может также представлять собой полинуклеотид, обладающий активностью промотора глутаматдегидрогеназы. Полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 может быть репрезентативной полинуклеотидной последовательностью для указания положений мутаций, и другие полинуклеотидные последовательности, соответствующие ей и обладающие активностью промотора, также входят в последовательность, в которую могут быть внедрены мутации. Например, любая полинуклеотидная последовательность, которая может служить в качестве промотора полипептида, обладающего активностью глутаматдегидрогеназы (gdh) или активностью, соответствующей ей, может быть включена в объем последовательности, в которую могут быть внедрены мутации по данному изобретению, без ограничения.

Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1, может быть подтверждена в NCBI GenBank, известной базе данных, и последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 1, как последовательность, способная служить промотором глутаматдегидрогеназы, может быть получена из Corynebacterium sp., в частности, Corynebacterium glutamicum. Однако, последовательности, обладающие активностью, эквивалентной или более высокой, чем у полинуклеотида, могут быть включены в промотор по данному изобретению, без ограничения.

Полинуклеотид, обладающий активностью промотора, предложенный в данном изобретении, может представлять собой полинуклеотид, у которого активность промотора усилена заменой нуклеотида в определенном положении в существующей полинуклеотидной последовательности, обладающей активностью промотора.

В воплощении полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может включать в себя полинуклеотид, обладающий активностью промотора, в котором по меньшей мере один нуклеотид заменен другим нуклеотидом в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1. В частности, полинуклеотид по данному изобретению может состоять из полинуклеотида, обладающего активностью промотора, в котором по меньшей мере один нуклеотид заменен другим нуклеотидом в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1. Полинуклеотид, обладающий активностью промотора, в данном документе может использоваться взаимозаменяемо с «модифицированным промотором».

В воплощении модифицированный промотор может представлять собой полинуклеотид, обладающий активностью промотора и включающий замену по меньшей мере одного нуклеотида, выбранного из группы, состоящей из нуклеотидов в положениях 27, 28, 31, 32 и 36, на другой нуклеотид в SEQ ID NO: 1. В частности, модифицированный промотор может представлять собой промотор, имеющий замены на другие нуклеотиды в по меньшей мере одном, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех или по меньшей мере пяти положениях из описанных выше положений или в положениях, соответствующих им. Кроме того, модифицированный промотор может дополнительно иметь дополнительную замену нуклеотида в положении 66 и/или 261.

«Другой нуклеотид» или «другие нуклеотиды» не ограничены, при условии, что нуклеотид или нуклеотиды отличаются от нуклеотида или нуклеотидов до замены. Если взять для примера аденин (А) как нуклеотид в положении 27 в SEQ ID NO: 1, выражение «нуклеотид в положении 27 был заменен другим нуклеотидом в SEQ ID NO: 1» означает замену на цитозин (С), тимин (Т) или гуанин (G), за исключением аденина. Если не указано иное, выражение, что определенный нуклеотид был «замещен» в данном изобретении означает замену нуклеотидом, отличным от нуклеотида до замены.

При этом, специалист в области техники может взять нуклеотиды в положениях, соответствующих нуклеотидам в положениях 27, 28, 31, 32, 36, 66 и 261 в SEQ ID NO: 1 по данному изобретению, в любой полинуклеотидной последовательности посредством выравнивания последовательностей, известного в области техники, и даже если здесь это не описано отдельно, выражение «нуклеотид в конкретном положении в последовательности с конкретным номером» очевидно означает в том числе и «нуклеотид в положении, соответствующем» ему в любой полинуклеотидной последовательности. Таким образом, любая полинуклеотидная последовательность, обладающая активностью промотора, в которой любые один или более нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из нуклеотидов в положениях 27, 28, 31, 32, 36, 66 и 261, заменены другими нуклеотидами в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, также входит в объем данного изобретения.

В одном воплощении полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может представлять собой полинуклеотид, в котором любые один или более нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из нуклеотидов в положениях 27, 28, 31, 32, 36, 66 и 261, заменены другими нуклеотидами в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.

В частности, полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может представлять собой полинуклеотид, в котором в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32 и 36 заменены другими нуклеотидами; нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32, 36, 66 и 261 заменены другими нуклеотидами; и нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32, 36 и 66 заменены другими нуклеотидами, без ограничения.

Например, промотор, обладающий более высокой активностью по сравнению с промотором с незамещенной (немодифицированной) последовательностью, может быть получен, когда по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь нуклеотидов в положениях, соответствующих положениям 27, 28, 31, 32, 36, 66 и 261 в полинуклеотиде с SEQ ID NO: 1, заменены другими нуклеотидами. В частности, полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может представлять собой полинуклеотид, в котором нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32 и 36 заменены другими нуклеотидами в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1. Полинуклеотид по данному изобретению может также представлять собой полинуклеотид, обладающий активностью промотора, в котором нуклеотиды в положениях 66 и 261 дополнительно заменены другими нуклеотидами или нуклеотид в положении 66 заменен другим нуклеотидом.

В качестве частного примера, полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может представлять собой полинуклеотид, в котором в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 нуклеотид аденин (А) в положении 27 заменен тимином (Т); нуклеотид цитозин (С) в положении 28 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (С) в положении 31 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (С) в положении 32 заменен тимином (Т); и нуклеотид аденин (А) в положении 36 заменен цитозином (С); в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO:l нуклеотид аденин (А) в положении 27 заменен тимином (Т); нуклеотид цитозин (С) в положении 28 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (С) в положении 31 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (С) в положении 32 заменен тимином (Т); нуклеотид аденин (А) в положении 36 заменен цитозином (С); нуклеотид цитозин (С) в положении 66 заменен тимином (Т); и нуклеотид аденин (А) в положении 261 заменен гуанином (G); и в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 нуклеотид аденин (А) в положении 27 заменен тимином (Т); нуклеотид цитозин (С) в положении 28 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (С) в положении 31 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (С) в положении 32 заменен тимином (Т), нуклеотид аденин (А) в положении 36 заменен цитозином (С) и нуклеотид цитозин (С) в положении 66 заменен тимином (Т).

В качестве более частного примера, полинуклеотид по данному изобретению может представлять собой полинуклеотид, приведенный в полинуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO: 2-4. В частности, полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может содержать или (по существу) состоять из полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, 3 или 4.

Без ограничения описанными выше воплощениями, также могут включаться различные модификации полинуклеотидной последовательности в объеме, не снижающем существенным образом активность промотора.

Полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может представлять собой полинуклеотид, обладающий гомологией или идентичностью по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 2, 3 или 4. Нуклеотидные последовательности, обладающие гомологией или идентичностью, могут не включать в указанный диапазон последовательность, обладающую 100% идентичностью, или могут быть последовательностями, обладающими идентичностью менее 100%.

Несмотря на описание в данном документе «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в последовательности с конкретным номером» или «полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, приведенную в последовательности с конкретным номером» полинуклеотид, имеющий полинуклеотидную последовательность, часть которой удалена, модифицирована, заменена или добавлена, очевидно, может также применяться в данном изобретении, при условии, что полинуклеотид обладает такой же или соответствующей активностью по сравнению с полипептидом, состоящим из нуклеотидной последовательности с соответствующим номером последовательности.

Например, при наличии такой же или соответствующей активности с полинуклеотидом, полинуклеотид, в котором добавлена нонсенс-последовательность внутри или на конце нуклеотидной последовательности с соответствующим номером последовательности, или удалена часть последовательности внутри или на конце нуклеотидной последовательности с соответствующим номером последовательности, также входит в объем данного изобретения.

Гомология или идентичность относится к степени родства между двумя заданными нуклеотидными последовательностями и может выражаться в процентах.

Термины гомология и идентичность зачастую могут использоваться взаимозаменяемо.

Гомология или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотид о в может быть установлена при помощи стандартного алгоритма выравнивания, и вместе с ним можно применять значения штрафов за открытие гэпа, установленные по умолчанию в используемой программе. По существу, гомологичные или идентичные последовательности обычно могут гибридизоваться друг с другом по всей длине последовательностей или по меньшей мере на протяжение приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от всей длины последовательностей в условиях умеренной или высокой строгости. При гибридизации также можно учитывать полинуклеотиды, включающие вместо кодона вырожденный кодон.

Установить, обладают ли две любые полинуклеотидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, можно, например, при помощи известного компьютерного алгоритма, такого как программа «FASTA» с использованием параметров по умолчанию, например, как описано Pearson et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, это можно устанавливать при помощи алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), который реализован в программе Needleman пакета программ Европейского открытого программного модуля для молекулярной биологии (EMBOSS) (Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая пакет программ GCG (Devereux, I, et al, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. E, et al, J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно устанавливать при помощи программ BLAST или ClustalW из базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации.

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов можно устанавливать путем сравнения информации о последовательности, например, с применением компьютерной программы GAP, например, предложенной Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как изложено Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Вкратце, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность как значение, полученное путем деления количества одинаковых выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичных и 0 для неидентичных символов) и взвешенную матрицу сравнения, предложенную Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, как изложено Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979) (или подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)); (2) штраф 3,0 за каждый гэп и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом гэпе (или штраф за открытие гэпа 10 и штраф за продолжение гэпа 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы. Таким образом, термин «гомология», или «идентичность», используемый в данном документе, относится к родству между последовательностями.

Кроме того, может быть включена любая полинуклеотидная последовательность, которая может гибридизоваться в строгих условиях с зондом, который может быть получен из известного гена, например, последовательность, комплементарная всей или части вышеописанной полинуклеотидной последовательности, и обладающая такой же активностью, без ограничения. Термин «строгие условия» относится к условиям, при которых обеспечивается специфическая гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия, в частности, описаны в литературе (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Например, условия могут включать условия, при которых гены, обладающие высокой гомологией или идентичностью, такие как гены, обладающие гомологией или идентичностью по меньшей мере 40%, в частности, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90%, более конкретно, по меньшей мере 95%, еще более конкретно, по меньшей мере 97%, и еще более конкретно, по меньшей мере 99%, гибридизуются друг с другом, а гены, обладающие гомологией или идентичностью меньше указанных диапазонов, не гибридизуются друг с другом; или стандартные условия отмывки при гибридизации по Саузерну, то есть, в частности, отмывка проводится однократно, в частности, двукратно или трехкратно при концентрации соли и температуре, соответствующих 60°С, 1×SSC, 0,1% SDS, в частности, 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, и более конкретно, 68°С, 0,1×SSC и 0,1% SDS.

Для гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя возможны несовпадения между основаниями, в зависимости от строгости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания взаимодействия между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК аденин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, данное изобретение может охватывать не только по существу схожие последовательности нуклеиновых кислот, но также и выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные полной последовательности.

В частности, полинуклеотиды, обладающие гомологией или идентичностью, можно обнаружить с применением условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении T_m 55°С в описанных выше условиях. Кроме того, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, без ограничения, и может быть соответствующим образом скорректировано специалистом в области техники в зависимости от задачи.

Надлежащая строгость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотид о в и степени их комплементарности, и возможные значения хорошо известны в области техники (см. Sambrook et at, выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

Полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, может применяться в качестве промотора.

Промотор может располагаться в 5'-области от сайта инициации транскрипции мРНК.

Промотор по данному изобретению может обладать активностью промотора, усиленной по сравнению со стандартными промоторами. Таким образом, промотор может повышать экспрессию целевого гена, а также экспрессию и/или активность белка, кодируемого целевым геном. В контексте данного изобретения целевой ген для усиления экспрессии может быть изменен в зависимости от продукта, который необходимо получить, и промотор может применяться в качестве универсального промотора для усиления целевого гена.

Термин «целевой ген» в контексте данного изобретения относится к гену, экспрессия которого регулируется последовательностью промотора по данному изобретению. Белок, кодируемый целевым геном, может обозначаться как «целевой белок», а ген, кодирующий «целевой белок», может обозначаться как «целевой ген».

Полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может иметь различные модификации в его кодирующей области в том объеме, который не меняет полинуклеотидную последовательность, вследствие вырожденности кодонов или с учетом предпочтения кодонов в организме, в котором будет экспрессироваться полипептид. Полинуклеотидная последовательность является такой, как описано выше.

В одном воплощении целевой белок может представлять собой полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью (gdh). Таким образом, целевой ген промотора может представлять собой ген, кодирующий полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью (gdh).

В настоящем документе термин «глутаматдегидрогеназа (gdh)» может также обозначаться «глутаматдегидрогеназа» или подобным образом. Глутаматдегидрогеназа задействована в метаболизме глутамата в 2-оксоглутарат и может вызывать эффект улучшения продуктивности полезных веществ, таких как лизин, треонин, O-гомосерин и изолейцин через контроль их активности.

Примерами гена, кодирующего глутаматдегидрогеназу, могут быть ген gdh (NCgl1999) Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и тому подобные, без ограничения. Специалист в области техники можно легко получить информацию о генах, кодирующих глутаматдегидрогеназу из известной базы данных (GenBank или аналогичной).

Аминокислотные последовательности, составляющие глутаматдегидрогеназу, могут быть получены из GenBank NCBI, известной базы данных. Например, аминокислотная последовательность может быть получена из Corynebacterium glutamicum.

Кроме того, «полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью» в данном изобретении включает не только глутаматдегидрогеназу дикого типа, немодифицированную или нативную, но также и вариант, обладающий такой же или усиленной активностью по сравнению с ней.

В данном описании термин «модифицированный полипептид», который имеет то же значение, что и «вариант» относится к белку, в котором по меньшей мере одна аминокислота в приведенной последовательности подвергнута консервативной замене и/или модификации относительно указанной последовательности, но его функции или свойства сохранены.

Вариант отличается от указанной последовательности заменами, делециями или добавлениями нескольких аминокислот. Такой вариант, как правило, может быть обнаружен путем модификации одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности белка и оценки свойств модифицированного белка. Таким образом, способность варианта может быть повышена по сравнению с нативным белком. Кроме того, некоторые варианты могут включать варианты, в которых была удалена по меньшей мере одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен.

Термин «вариант» может также использоваться взаимозаменяемо с «модификацией», «модифицированным белком», «модифицированным полипептидом», «мутантом», «мутеином», «дивергентом», «вариантом» и так далее, и может использоваться любой термин, без ограничения, при условии, что он используется в смысле «мутированный». В контексте данного изобретения вариант может относиться к тем, в которых активность мутированного белка повышена по сравнению с таковой нативного белка дикого типа или немодифицированного белка, однако вариант ими не ограничивается.

В данном описании термин «консервативная замена» относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую схожую структуру и/или химические свойства. Например, вариант может иметь одну или более чем одну консервативную замену, при этом сохраняя одну или более чем одну биологическую активность. Такие аминокислотные замены, как правило, могут возникать на основании сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков.

Кроме того, вариант может включать делеции или вставки аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, которая обеспечивает транспорт белка одновременно с трансляцией или после ее завершения. Кроме того, полипептид может также быть конъюгирован с другой последовательностью или линкером для обнаружения, очистки или синтеза полипептида.

Ген, кодирующий полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью по данному изобретению, может быть назван «геном gdh».

Ген может происходить из рода Corynebacterium, в частности, Corynebacterium glutamicum.

В данном изобретении «ген gdh», который представляет собой полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью, может иметь различные модификации в его кодирующей области в том объеме, который не меняет аминокислотную последовательность, вследствие вырожденности кодонов или с учетом предпочтения кодонов в организме, в котором будет экспрессироваться полипептид.

Полипептид по данному изобретению, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью, также включает последовательность варианта и, в частности, варианта белка, который модифицирован для усиления глутаматдегидрогеназной активности.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложена композиция для экспрессии гена, содержащая полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора.

Композиция для экспрессии гена относится к композиции, способной экспрессировать ген, который может экспрессироваться полинуклеотидом, обладающим активностью промотора по данному изобретению.

Например, композиция для экспрессии гена может включать полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, и может дополнительно включать, без ограничения, структуру, способную управлять полинуклеотидом как промотор.

В композиции для экспрессии гена по данному изобретению полинуклеотид может находиться в форме, которая включена в вектор, чтобы обеспечивать экспрессию гена, функционально связанного с клеткой-хозяином, в который внедрен полинуклеотид.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложена экспрессирующая кассета, включающая полинуклеотид, обладающий активностью промотора, или полинуклеотид и ген, кодирующий целевой белок.

В данном описании термин «экспрессионная кассета» относится к единой кассете, включающей полинуклеотид, обладающий активностью промотора, и ген, кодирующий целевой белок, и поэтому способной экспрессировать целевой ген, функционально связанный с промотором, расположенный в направлении по ходу транскрипции. В частности, в экспрессионной кассете полинуклеотид, обладающий активностью промотора, может быть функционально связан с геном, кодирующим целевой белок. Кроме того, в данном описании термин «функционально связан» относится к функциональной связи между последовательностью гена и последовательностью полинуклеотида, обладающего активностью промотора, который инициирует и опосредует транскрипцию гена, кодирующего целевой белок.

Внутри или вне такой кассеты для экспрессии гена могут быть дополнительно включены различные факторы, которые могут способствовать эффективной экспрессии целевого гена. Обычно экспрессионная кассета может включать в себя помимо промотора, функционально связанного с целевым геном, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции.

В одном воплощении целевой белок может представлять собой полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложен вектор, включающий полинуклеотид, обладающий активностью промотора, или полинуклеотид и ген, кодирующий целевой белок.

В одном воплощении целевой белок может представлять собой полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью.

В данном описании термин «вектор» относится к ДНК-конструкции, включающей в себя полинуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок, функционально связанную с соответствующей регуляторной последовательностью, обеспечивающей экспрессию целевого белка в подходящем хозяине.

В контексте данного изобретения регуляторная последовательность может включать полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора.

Регуляторная последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для регуляции такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы на мРНК, и последовательности для регуляции терминации транскрипции и трансляции. После трансформации подходящей клетки-хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может интегрироваться в сам геном.

Вектор, используемый в данном изобретении, не ограничивается какими-либо конкретными, при условии, что экспрессия может осуществляться в клетке-хозяине, и клетку-хозяина можно трансформировать любым вектором, известным в области техники. Примеры обычно используемых векторов могут включать нативные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги.

Например, в качестве фаговых векторов или космидных векторов могут применяться pWE15, М13, λLB3, λBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A и Charon21A, а в качестве плазмидных векторов могут применяться векторы на основе pBR, на основе pUC, на основе pBluescriptII, на основе pGEM, на основе pTZ, на основе pCL и на основе рЕТ.

Кроме того, эндогенный промотор в хромосоме может быть заменен полинуклеотидом по данному изобретению, обладающим активностью промотора, при помощи вектора для встраивания в хромосому клетки-хозяина. Например, можно использовать векторы pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208 или pXMJ19, без ограничения. В качестве альтернативы, можно использовать вектор как известную технологию (патент Кореи 10-09240675).

Встраивание полинуклеотида в хромосому может достигаться при помощи любого способа, известного в области техники, например, посредством гомологичной рекомбинации, без ограничения. Вектор может дополнительно включать в себя селективный маркер для исследования встраивания или отсутствия встраивания в хромосому. Селективный маркер используют для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть для исследования встраивания или отсутствия встраивания целевой молекулы нуклеиновой кислоты, и могут применяться маркеры, придающие фенотипы, позволяющие осуществлять отбор, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим лекарственным средствам и экспрессия поверхностных белков. В условиях воздействия селективных агентов могут выживать или экспрессировать другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективные маркеры, поэтому трансформированные клетки можно отбирать. Например, полинуклеотид дикого типа может быть заменен модифицированным полинуклеотидом при помощи вектора для встраивания в хромосому клетки.

В данном описании термин «трансформация» может означать, что вектор, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий целевой белок, внедрен в клетку-хозяина, так чтобы обеспечить экспрессию целевого белка в клетке-хозяине.

Трансформированный полинуклеотид может включать любой полипептид, который может экспрессироваться в клетке-хозяине, независимо от того, встроен ли полипептид в хромосому клетки-хозяина и находится в ней или находится за пределами хромосомы. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может содержать ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Полинуклеотид может быть внедрен в любой форме, при условии, что полинуклеотид может быть внедрен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть внедрен в клетку- хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии.

Обычно экспрессионная кассета может включать в себя промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим целевой белок, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Кроме того, полинуклеотид, имеющий целевой белок, может быть внедрен в клетку-хозяина как таковой и быть функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, без ограничения.

Кроме того, термин «функционально связан» относится к функциональной связи между последовательностью гена и последовательностью промотора, инициирующего и опосредующего транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок по данному изобретению.

В контексте данного изобретения промотор может представлять собой полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора.

Способ трансформации вектором по данному изобретению включает любой способ внедрения нуклеиновой кислоты в клетку и может осуществляться путем выбора известной в области техники подходящей стандартной методики, в зависимости от клетки-хозяина. Примеры способа могут включать электропорацию, преципитацию фосфатом кальция (CaPO₄), преципитацию хлоридом кальция (CaCl₂), инфицирование ретровирусом, микроинъекцию, способ с полиэтиленгликолем (PEG) и способ с DEAE-декстраном, способ с катионными липосомами, способ с ацетатом лития-DMSO и тому подобные, без ограничения.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложен микроорганизм, включающий: полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора; экспрессионную кассету, включающую полинуклеотид и ген, кодирующий целевой белок; или вектор, включающий полинуклеотид и ген, кодирующий целевой белок.

Более конкретно, термин «микроорганизм» охватывает все микроорганизмы дикого типа или микроорганизмы с естественной или искусственной генетической модификацией и относится к микроорганизму, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие вставки экзогенного гена или усиления или ослабления активности эндогенного гена. В частности, микроорганизм может включать: полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, и целевой белок.

Целевой белок может представлять собой полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью (gdh). Полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, целевой белок, полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью (gdh), вектор и экспрессионная кассета являются такими, как описано выше.

Микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, и в частности, Corynebacterium glutamicum.

Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий глутаматдегидрогеназу, микроорганизм, экспрессирующий полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью, или микроорганизм, в который внедрен полипептид, обладающий глутаматдегидрогеназной активностью, без ограничения.

В данном изобретении микроорганизм может включать полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, и, в частности, может включать полинуклеотид и/или ген, функционально связанный с полинуклеотидом и кодирующий целевой белок. В качестве альтернативы, микроорганизм может включать вектор или экспрессионную кассету, включающие полинуклеотид или последовательность, регулирующие экспрессию гена, и ген, кодирующий целевой белок, без ограничения. Кроме того, полинуклеотид, ген, кодирующий целевой белок, вектор и экспрессионная кассета могут быть внедрены в микроорганизм посредством трансформации, без ограничения. Более того, не имеет значения, расположены ли полинуклеотид и ген, кодирующий целевой белок, на хромосоме или за пределами хромосомы, при условии, что ген может экспрессироваться в микроорганизме.

В данном документе термин «экспрессируемый/экспрессирующийся» применительно к белку означает состояние, в котором глутаматдегидрогеназу или ее вариант вводят в микроорганизм или модифицируют для экспрессии в микроорганизме. Когда целевой белок представляет собой белок, присутствующий в микроорганизме, термин относится к состоянию, при котором активность белка усилена по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации белка.

В частности, термин «внедрение белка» может означать, что микроорганизм демонстрирует активность конкретного белка, которой он изначально не обладал, или микроорганизм демонстрирует активность, которая усилена по сравнению с эндогенной активностью соответствующего белка или его активностью до модификации. Например, термин может означать, что в хромосому микроорганизма внедряют полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, или в микроорганизм внедряют вектор или экспрессионную кассету, включающие полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, и таким образом обеспечивают проявление активности белка.

Термин «усиление активности» может означать, что активность конкретного белка микроорганизма, которой обладает микроорганизм, усиливается по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации. Термин «эндогенная активность» может относиться к активности конкретного белка, которой изначально обладал родительский штамм до трансформации, когда микроорганизм трансформирован вследствие генетической мутации, вызванной естественными или искусственными факторами.

В контексте данного изобретения усиление активности может достигаться с применением полинуклеотидной последовательности, обладающей активностью промотора по данному изобретению, в качестве последовательности, регулирующей экспрессию целевого белка. Поскольку целевой белок может быть в нативной форме или в форме варианта, как описано выше, последовательность, регулирующая экспрессию, может представлять собой последовательность, регулирующую экспрессию гена, кодирующего вариант белка, или последовательность, регулирующую экспрессию гена на хромосоме, кодирующего нативный белок.

Помимо этого, также можно применять другие способы усиления активности в комбинации. Например, в дополнение к применению полинуклеотидной последовательности, обладающей активностью промотора по данному изобретению, в качестве последовательности, регулирующей экспрессию целевого белка, по меньшей мере один способ, выбранный из группы, состоящей из: способа увеличения количества внутриклеточных копий гена, кодирующего целевой белок, способа замены гена на хромосоме, кодирующего нативный белок, геном, кодирующим вариант белка, и способа внедрения дополнительной мутации в ген, кодирующий белок, которая приводит к усилению активности варианта белка, и способа внедрения варианта белка в микроорганизм, без ограничения.

Активность целевого белка может быть усилена с применением полинуклеотида, обладающего активностью промотора по данному изобретению, для регулирования экспрессии целевого белка в микроорганизмах.

Например, активность или концентрация соответствующего белка может быть повышена по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 400% или по меньшей мере на 500% и вплоть до 1000% или 2000%, относительно активности или концентрации белка в штамме дикого типа или в немодифицированном микроорганизме, без ограничения.

В данном описании термин «немодифицированный микроорганизм» не исключает штамма, включающего мутацию, которая может возникнуть в микроорганизме естественным образом, и относится к самому штамму дикого типа, микроорганизму, не включающему полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, или к микроорганизму, не трансформированному вектором, включающим полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора.

В данном описании термин «микроорганизм, продуцирующий целевое вещество» включает все микроорганизмы с генетическими модификациями естественного или искусственного происхождения и может относиться к микроорганизму, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие вставки экзогенного гена или усиления активности или инактивации эндогенного гена, где микроорганизм имеет генетическую мутацию или усиленную активность для продуцирования целевого вещества. В контексте данного изобретения микроорганизм, продуцирующий целевое вещество, может относиться к микроорганизму, способному продуцировать целевое вещество в избытке по сравнению с микроорганизмом дикого типа или немодифицированным микроорганизмом, благодаря включению полинуклеотида, обладающего активностью промотора по данному изобретению.

Термин «микроорганизм, продуцирующий целевое вещество» может использоваться взаимозаменяемо с такими терминами как «продуцирующий целевое вещество микроорганизм», «микроорганизм, обладающий способностью продуцировать целевое вещество», «продуцирующий целевое веществ штамм», «штамм, обладающий способностью продуцировать целевое вещество» и тому подобными.

Целевое вещество может представлять собой аминокислоту, в частности, лизин, треонин, O-ацетилгомосерин или изолейцин. В качестве более конкретного примера, лизин может представлять собой L-лизин, треонин может представлять собой L-треонин, а изолейцин может представлять собой L-изолейцин, без ограничения.

В контексте данного изобретения микроорганизм, продуцирующий целевое вещество, может обладать улучшенной способностью продуцировать целевое вещество, в частности, лизин, треонин, O-ацетилгомосерин или изолейцин.

При этом, продуцирующий целевое вещество микроорганизм может представлять собой микроорганизм дикого типа или рекомбинантный микроорганизм. Рекомбинантный микроорганизм является таким, как описано выше. Микроорганизм может дополнительно включать мутацию, такую как усиливающую пути биосинтеза для увеличения способности продуцировать целевое вещество, снимающую ингибирование по принципу обратной связи или инактивирующую гены, ослабляющие пути расщепления или пути биосинтеза, и такие мутации могут возникать искусственным образом, например, вследствие УФ облучения, но не исключают естественные мутации.

В частности, продуцирующий целевое вещество микроорганизм может быть модифицирован, чтобы продуцировать целевое вещество. Например, микроорганизм, не обладающий способностью продуцировать целевое вещество, может быть модифицирован, чтобы обладать способностью продуцировать целевое вещество или способность микроорганизма продуцировать целевое вещество может быть усилена. В качестве примера, белки или их варианты, вовлеченные в пути биосинтеза, могут быть внедрены в микроорганизмы дикого типа для продуцирования целевых веществ (KR 10-2011994, KR 10-1947959 и KR 10-1996769).

В качестве частного примера, продуцирующий целевое вещество микроорганизм по данному изобретению может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, содержащий аспартокиназу (lysC), гомосериндегидродегеназу (hom), пируваткарбоксилазу (рус), L-треониндегидратазу (ilvA) или их комбинацию. Аспартокиназа, гомосериндегидродегеназа, пируваткарбоксилаза или L-треониндегидратаза могут быть белком дикого типа или могут быть вариантом белка, который мутирован с приобретением преимущества производить целевое вещество вследствие ослабления или усиления активности.

Микроорганизм поданному изобретению может обладать способностью продуцировать целевое вещество, усиленной по меньшей мере на 1%, 5%, 10%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 22%, 25%, 29%, 33%, 38%, 44%, 45% или 48% по сравнению с микроорганизмом, не включающим полинуклеотид, обладающий активностью промотора.

Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложен способ продуцирования целевого вещества, включающий культивирование микроорганизма в среде. Микроорганизм и целевое вещество являются такими, как описано выше.

В данном изобретении способ получения целевого вещества с применением микроорганизмов, включающих полинуклеотид, может осуществляться с применением способа, широко известного в области техники. В частности, культивирование может осуществляться непрерывно при помощи периодического процесса или периодического процесса с подпиткой или повторяющегося периодического процесса с подпиткой, без ограничения. Среда, используемая в культивировании, должна соответствующим образом удовлетворять потребностям определенных штаммов. Культуральная среда для штаммов рода Corynebacterium изложена (например, Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).

В качестве среды и других условий культивирования, применяемых для культивирования штаммов по данному изобретению, можно использовать любую среду, используемую при стандартном культивировании микроорганизмов рода Corynebacterium, без конкретного ограничения. В частности, штаммы по данному изобретению можно культивировать в стандартных средах, содержащих надлежащие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, в аэробных или анаэробных условиях при поддержании температуры, рН и тому подобного.

В данном изобретении в качестве источников углерода можно использовать: углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота, аминокислоты, такие как глутамат, метионин и лизин, и тому подобное, без ограничения. Кроме того, можно использовать органические источники питательных веществ, такие как гидролизаты крахмала, меласса, сырая меласса, рисовые отруби, маниок, выжимки сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт, и углеводы, такие как глюкоза и стерилизованная обработанная меласса (то есть меласса, в которой сахара конвертированы в восстанавливающие) и можно использовать другие источники углерода в соответствующем количестве, без ограничения. Эти источники углерода можно использовать по-отдельности или в виде комбинации двух или более из них.

Примеры источников азота могут включать: источники неорганического азота, такие как аммоний, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, и источники органического азота, такие как аминокислоты, пептон, NZ-амин, мясные экстракты, дрожжевые экстракты, мальтозные экстракты, жидкий кукурузный экстракт, гидролизаты казеина, рыба или продукты ее переработки, обезжиренный соевый жмых или продукты его переработки. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в виде комбинации двух или более из них, без ограничения.

Примеры источников фосфора могут включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие натрий-содержащие соли. Примеры неорганических соединений могут включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобные.

Кроме того, среда может содержать аминокислоты, витамины и/или соответствующие предшественники. В частности, в среду для культивирования штамма можно добавлять L-аминокислоту или тому подобное. В частности, можно добавлять глицин, глутамат и/или цистеин и при необходимости можно дополнительно добавлять L-аминокислоту, такую как лизин, без ограничения.

Такие среды или предшественники можно добавлять в культуру при периодическом или непрерывном культивировании, без ограничения.

В данном изобретении в процессе культивирования штаммов можно корректировать рН культур путем добавления надлежащим образом к культурам таких соединений как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммоний, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, для предупреждения образования пены в процессе культивирования можно добавлять пеногаситель, такой как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. Для поддержания аэробного состояния культуры в культуру можно вводить кислород или кислород-содержащий газ, либо для поддержания анаэробных или микроаэробных состояний газ можно не вводить или можно вводить азот, водород или углекислый газ.

Температуру культур можно поддерживать от 25°С до 40°С, и в частности, от 28°С до 37°С, без ограничения. Культивирование может продолжаться до достижения желаемого количества продуцируемого полезного вещества и, в частности, может составлять от 1 до 160 часов или от 10 до 100 часов, без ограничения.

Способ получения целевого вещества может дополнительно включать дополнительный процесс после стадии культивирования. Дополнительный процесс может быть выбран надлежащим образом в зависимости от применения целевого вещества.

В частности, способ получения целевого вещества может включать после стадии культивирования выделение целевого вещества из по меньшей мере одного, выбранного из: микроорганизма, среды, высушенного продукта микроорганизма, экстракта микроорганизма, культуры микроорганизма, надосадочной жидкости культуры и лизата микроорганизма.

Способ может дополнительно включать лизирование микроорганизма (штамма) до или одновременно со стадией выделения. Лизис штамма может осуществляться способом, обычно используемым в области техники, к которой относится данное изобретение, например, при помощи лизирующего буфера, воздействия ультразвуком, нагревания, френч-пресса и тому подобного. Кроме того, стадия лизиса может включать ферментативную реакцию с ферментом, разрушающим клеточную стенку, ферментом, расщепляющим нуклеиновую кислоту, ферментом, переносящим нуклеиновую кислоту, протеолитическим ферментом или тому подобным, без ограничения.

В данном изобретении термин «высушенный продукт микроорганизма» может использоваться взаимозаменяемо с термином «высушенный продукт штамма» или тому подобным. Высушенный продукт микроорганизма может быть получен путем высушивания клеток, накапливающих в себе целевое вещество, и, в частности, они могут входить в кормовую композицию, пищевую композицию и тому подобное, без ограничения.

В данном изобретении экстракт микроорганизма может использоваться взаимозаменяемо с термином «экстракт штамма» или тому подобным. Экстракт штамма может относиться к веществам, остающимся после отделения клеточных стенок от клеток штамма. В частности, экстракт штамма может относиться к другим компонентам, остающимся после отделения клеточных стенок от компонентов, полученных при лизисе клеток. Экстракт штамма содержит целевое вещество и может содержать по меньшей мере один компонент из белков, углеводов, нуклеиновых кислот и волокон, помимо целевого вещества, без ограничения.

На стадии выделения целевое вещество можно выделять при помощи подходящего способа, известного в области техники.

Стадия выделения может включать процесс очистки. Процесс очистки может быть таким, что из штамма выделяется только целевое вещество, после чего следует очистка от примесей. В результате процесса очистки можно получать целевое вещество, очищенное от примесей.

При необходимости способ получения целевого вещества может дополнительно включать смешивание эксципиента и материала, выбранного из штамма, полученного после стадии культивирования, или его сухого продукта, экстракта, культуры или лизата, и выделенного из них целевого вещества.

Эксципиент может быть выбран надлежащим образом и применяться согласно целевому назначению или форме и может, например, быть выбран из крахмала, глюкозы, целлюлозы, лактозы, гликогена, D-маннита, сорбита, лактита, мальтодекстрина, карбоната кальция, искусственного силиката алюминия, моногидрофосфата кальция, сульфата кальция, хлорида натрия, гидрокарбоната натрия, очищенного ланолина, декстрина, альгината натрия, метилцеллюлозы, коллоидного диоксида кремния, гидроксипропилкрахмала, гидроксипропилметилцеллюлозы, пропиленгликоля, казеина, лактата кальция, примойела и гуммиарабика. В частности, эксципиент может представлять собой по меньшей мере один компонент, выбранный из крахмала, глюкозы, целлюлозы, лактозы, декстрина, гликогена, D-маннита и мальтодекстрина, без ограничения.

Примеры эксципиента могут включать консервант, увлажняющее вещество, диспергирующее вещество, суспендирующее вещество, буфер, стабилизатор или изотоническое вещество или тому подобное, без ограничения.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложено применение полинуклеотида в качестве промотора, полинуклеотид обладает активностью промотора, где нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32 и 36 заменены другими нуклеотидами в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.

Полинуклеотид является таким, как описано выше.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее данное изобретение будет описано более подробно с отсылкой к приведенным в качестве примера воплощениям. Однако, эти приведенные в качестве примера воплощения даны исключительно для иллюстрации данного изобретения, и объем данного изобретения не ограничен этими примерами.

Пример 1. Определение активности нового промотора для индукции экспрессии целевого гена

Пример 1-1. Библиотека мутаций промотора gdh при применении случайного мутагенза

Вначале из NIH GenBank получали нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1), содержащую промоторную область гена gdh (регистрационный номер NCBI NCgl1999) Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС13032. Получали ПЦР-продукты мутированного промотора gdh (Pmgdh) с различными последовательностями с использованием промотора гена gdh, состоящего из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве матрицы, а также праймеров с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 и набора для осуществления случайного мутагенеза при помощи ПЦР Diversify PCR Random Mutagenesis (TaKaRa). Что касается открытой рамки считывания (ORF) гена GFP, выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы вектора pGFPuv (Clontech, USA) и праймеров с SEQ ID NO: 7 и 8. Проводили ПЦР с денатурацией при 94°С в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 55°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 1 мин, и затем реакции полимеризации при 72°С в течение 7 мин с получением фрагментов гена, содержащих ORF GFP.

ПЦР-продукты мутированного промотора gdh (Pmgdh) и GFP, представляющие собой продукты амплификации, смешивали с pCES208, представлявшим собой челночный вектор Е. coli-Corynebacterium, полученный путем расщепления рестрикционными ферментами BamHI/SalI (J. Microbiol. Biotechnol. 18:639-647, 2008), с конструированием рекомбинантной векторной библиотеки, в которой Pmgdh был связан с GFP, при помощи набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech). Соответствующие векторы получали названия от pCES_Pm1gdh_gfp до pCES_Pm100gdh_gfp.

В качестве контроля для исследования активности библиотеки Pmgdh использовали рекомбинантный вектор, в котором промотор (SEQ ID NO: 1) гена gdh дикого типа был связан с GFP. Фрагменты промотора гена gdh дикого типа получали с использованием в качестве матрицы Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС13032 и праймеров с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6. Что касается открытой рамки считывания (ORF) гена GFP, выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы вектора pGFPuv (Clontech, USA) и праймеров с SEQ ID NO: 7 и 8. Проводили ПЦР с денатурацией при 94°С в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 55°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 1 мин, и затем реакции полимеризации при 72°С в течение 7 мин с получением фрагментов гена, содержащих ORF GFR

ПЦР-продукты промотора дикого типа gdh (Pgdh) и GFP, представляющие собой продукты амплификации, смешивали с pCES208, представлявшим собой челночный вектор Е. coli-Corynebacterium, полученный путем расщепления рестрикционными ферментами BamHI/SalI (J. Microbiol. Biotechnol. 18:639-647, 2008), с конструированием рекомбинантного вектора, в котором Pgdh был связан с GFP, при помощи набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech), и указанный рекомбинантный вектор обозначали pCES_Pgdh_gfp.

Пример 1-2. Получение трансформированных штаммов

Вектором pCES208 и рекомбинантной векторной библиотекой pCES_Pmgdh_gfp (от pCES_Pm1gdh_gfp до pCES_Pm100gdh_gfp) и pCES_Pgdh_gfp, сконструированными в Примере 1-1, трансформировали Corynebacterium glutamicum АТСС13032 посредством электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545). Затем отбирали трансформированные штаммы на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина, и обозначали ATCC13032/pCES, ATCC13032/pCES_Pmgdh_gfp (от ATCC13032/pCES_Pm1gdh_gfp до ATCC13032/pCES_Pm100gdh_gfp) и ATCC13032/pCES_Pgdh_gfp, соответственно.

Пример 1-3. Отбор мутированных промоторов gdh

Для исследования активности мутированных промоторов gdh культивировали следующим способом Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pCES, ATCC13032/pCES_Pgdh_gfp и ATCC13032/pCES_Pmgdh_gfp (от ATCC13032/pCES_Pm1gdh_gfp до ATCC13032/pCES_Pm100gdh_gfp), представлявшие собой трансформированные штаммы, полученные в Примере 1-2, и измеряли активность GFP.

В частности, каждым из трансформированных штаммов Corynebacterium glutamicum инокулировали 25 мл среды (20 г глюкозы, 5 г сульфата аммония, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 150 мкг биотина, 1,5 мг тиамина гидрохлорида, 3 мг кальция пантотената, 3 мг никотинамида (из расчета на 1 л бидистиллированной воды), рН 7,2), находившейся во флаконе, и культивировали при встряхивании при 30°С в течение 20 часов. Выделяли клетки из культур путем центрифугирования (5000 об/мин, 15 минут), дважды промывали 50 мМ буфером Tris-HCl (рН 8,0) и затем суспендировали в том же буфере. После добавления 1,25 г стеклянных шариков на 1,5 мл суспензии клетки разрушали при помощи шариковой мельницы в течение 6 минут. Затем отделяли надосадочную жидкость путем центрифугирования (15000 об/мин, 20 минут) и определяли концентрацию белков методом Брэдфорда. Равные количества клеточных экстрактов облучали светом с длиной волны 488 нм для возбуждения флуоресценции согласно способу, предложенному Laure Gory et al. (FEMS Microbiology Letters, 194, 127-133, 2001), и измеряли испускаемый свет при 511 нм с применением спектрофотометра LS-50 В (Perkin-Elmer) и таким образом измеряли уровень экспрессии гена GFP. Путем сравнения с уровнем экспрессии гена GFP в контрольном штамме ATCC13032/pCES_Pgdh_gfp отбирали три штамма с наибольшими уровнями экспрессии GFP (Таблица 1).

Как показано в Таблице 1 выше, промоторы Pm3gdh, Pm16gdh, и Pm78gdh демонстрировали промоторную активность в Corynebacterium glutamicum, а также демонстрировали более высокую чувствительность к флуоресценции по сравнению с промотором gdh дикого типа. Для исследования мутации, внедренной в промоторы gdh трех типов штаммов, отобранных выше, мутированные промоторы gdh секвенировали. Выполняли ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 для установления последовательностей, затем выполняли секвенирование. Проводили сравнение с последовательностью SEQ ID NO: 1, представляющей собой последовательность промотора gdh дикого типа и таким образом секвенировали модифицированные промоторы gdh. Последовательности промоторов gdh выбранных штаммов показаны в Таблице 2 ниже (Таблица 2).

ТАБЛИЦА 2.

Пример 2: Конструирование векторов для внедрения мутированных промоторов Pm3gdh, Pm16gdh и Pm78gdh

Для конструирования векторов для внедрения мутированных промоторов Pm3gdh, Pm16gdh и Pm78gdh получали продукты ПЦР, соответствующие мутированным промоторам, с использованием векторов pCES_Pm3gdh_gfp, pCES_Pm16gdh_gfp и pCES_Pm78gdh_gfp в качестве матриц, соответственно, а также праймеров с SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14. Получали фрагменты генов, содержащие область в направлении против хода транскрипции от промотора gdh и часть ORF gdh с использованием хромосомы штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы, а также набора праймеров с SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16. Выполняли ПЦР с денатурацией при 94°С в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 55°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 1 мин, и затем реакции полимеризации при 72°С в течение 5 мин, получая таким образом соответствующие продукты ПЦР. Три продукта амплификации смешивали с вектором pDCM2, который готовили заранее путем расщепления рестрикционным ферментом Smal (публикация патента Кореи 10-2020-0136813), с конструированием рекомбинантных векторов с применением набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech), и обозначали эти векторы pDCM2_Pm3gdh_gdh, pDCM2_Pm16gdh_gdh и pDCM2_Pm78gdh_gdh, соответственно.

Пример 3. Оценка способности продуцировать целевое вещество

3-1. Оценка способности продуцировать лизин

3-1-1. Получение продуцирующих L-лизин штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

Для получения штаммов, трансформированных мутированными промоторами gdh, продуцирующий L-лизин штамм Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) трансформировали векторами pDCM2_Pm3gdh_gdh, pDCM2_Pm16gdh_gdh и pDCM2_Pm78gdh_gdh, сконструированными в Примере 2, для внедрения мутированных последовательностей промотора gdh в хромосому. Штамм CJ3P представляет собой штамм Corynebacterium glutamicum, обладающий способностью продуцировать L-лизин благодаря внедрению трех типов мутаций (рус(Pro458Ser), hom(Val59Ala) и lysC(Thr311Ile)) в штамм дикого типа на основе известных технологий.

В частности, векторы, сконструированные в Примере 2, внедряли в штамм CJ3P путем электропорации и затем получали трансформированные штаммы на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Штаммы, в хромосому которых встраивались мутированные промоторы gdh в виде фрагментов ДНК в результате вторичного кроссинговера, отбирали при помощи ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и секвенировали, и отобранные штаммы обозначали Corynebacterium glutamicum CJ3P::Pm3gdh_gdh, CJ3P::Pml6gdh_gdh и CJ3P::Pm78gdh_gdh.

3-1-2. Оценка способности продуцировать L-лизин у штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

Для оценки способности продуцировать L-лизин у штамма Corynebacterium glutamicum CJ3P, использованного в качестве родительского штамма, и штаммов Corynebacterium glutamicum CJ3P::Pm3gdh_gdh, CJ3P::Pm16gdh_gdh и CJ3P::Pm78gdh_gdh, полученных в Примере 3-1-1, культивировали штаммы следующим способом и затем анализировали.

Вначале, каждым штаммом инокулировали 25 мл среды для посева, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл затравочной культуры инокулировали 24 мл среды для продуцирования, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 32°С в течение 48 часов. Состав среды для посева и среды для культивирования показан ниже.

Среда для посева (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мг тиамина гидрохлорида, 2000 мкг кальция пантотената и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

Среда для продуцирования (рН 7,0)

45 г глюкозы, 10 г соевого белка, 10 г мелассы, 15 г (NH₄)₂SO₄, 0,55 г KH₂PO₄, 0,6 г MgSO₄⋅7H₂O, 9 мг FeSO₄⋅7H₂O, 9 мг MnSO₄⋅5H₂O, 0,9 мг биотина, 4,5 мг тиамина гидрохлорида, 30 г СаСО₃, 4,5 мг кальция пантотената, 30 мг никотинамида, 0,45 мг ZnSO₄ и 0,45 мг CuSO₄ (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

По окончании культивирования измеряли количество произведенного L-лизина при помощи ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Концентрация L-лизина и степень увеличения концентрации в культуре каждого из штаммов Corynebacterium glutamicum CJ3P, CJ3P::Pm3gdh_gdh, CJ3P::Pm16gdh_gdh и CJ3P::Pm78gdh_gdh показана в Таблице 3 ниже.

Как показано в Таблице 3, три штамма с внедренными мутированными промоторами gdh демонстрировали увеличение концентрации L-лизина по сравнению с родительским штаммом CJ3P. CJ3P::gdhPm3_gdh обозначали СМ03-1660, депонировали в Корейском центре консервации микроорганизмов, учреждении, осуществляющем депонирование в соответствии с Будапештским соглашением, 5 апреля 2021 и присваивали регистрационный номер KCCM12970P.

Пример 3-2. Оценка способности продуцировать треонин

3-2-1. Получение штаммов, продуцирующих треонин

Для получения штаммов, трансформированных мутированными промоторами gdh с использованием векторов pDCM2_Pm3gdh_gdh, pDCM2_Pm16gdh_gdh и pDCM2_Pm78gdh_gdh, сконструированных в Примере 2, вначале получали продуцирующие L-треонин штаммы с внедренным мутантом lysC(L377K) (патент Кореи 10-2011994) и мутантом hom(R398Q) (патент Кореи 10-1947959) на основе штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032.

В частности, для получения продуцирующих L-треонин штаммов вначале конструировали вектор для внедрения lysC(L377K). Для конструирования вектора выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомы штамма Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС13032, а также праймеров с SEQ ID NO: 17 и 18 и SEQ ID NO: 19 и 20. Выполняли ПЦР с денатурацией при 95°С в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 сек, отжига при 55°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 30 сек, и затем реакции полимеризации при 72°С в течение 7 мин, получая таким образом соответствующие продукты ПЦР. Продукты амплификации смешивали с вектором pDCM2, который готовили заранее путем расщепления рестрикционным ферментом Smal с конструированием рекомбинантного вектора с применением набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech), и затем вектор обозначали pDCM2_lysC(L377K).

Сконструированный вектор pDCM2_lysC(L377K) внедряли в штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13032 путем электропорации и затем получали трансформированный штамм на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Штаммы, у которых в ген lysC был внедрен мутированный нуклеотид в результате встраивания в хромосому фрагментов ДНК в результате вторичного кроссинговера, отбирали при помощи ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 и секвенировали, и отобранные штаммы обозначали ATCC13032::lysC(L377K).

Для конструирования вектора для внедрения hom(R398Q) выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомы штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032, а также праймеров с SEQ ID NO: 21 и 22 и SEQ ID NO: 23 и 24. Выполняли ПЦР с условиями ПЦР, представляющими собой денатурацию при 95°С в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 сек, отжига при 55°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 30 сек, и затем реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 мин. Продукты амплификации смешивали с вектором pDCM2, который готовили заранее путем расщепления рестрикционным ферментом Smal с конструированием рекомбинантного вектора с применением набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech), и затем вектор обозначали pDCM2_hom(R398Q).

Сконструированный вектор pDCM2_hom(R398Q) внедряли в штамм Corynebacterium glutamicum АТСС13032::lysC(L377K), полученный выше, путем электропорации и затем получали трансформированный штамм на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Штаммы, у которых в ген horn был внедрен мутированный нуклеотид в результате встраивания в хромосому фрагментов ДНК в результате вторичного кроссинговера, отбирали при помощи ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 и секвенировали, и отобранный штамм обозначали Corynebacterium glutamicum АТСС 13032::lysC(L377K)_hom(R398Q).

3-2-2. Получение продуцирующих L-треонин штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

В частности, векторы, сконструированные в Примере 2, внедряли в штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q) путем электропорации и затем получали трансформированные штаммы на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Штаммы, в хромосому которых встраивались мутированные промоторы gdh в виде фрагментов ДНК в результате вторичного кроссинговера, отбирали при помощи ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и секвенировали, и отобранные штаммы обозначали Corynebacterium glutamicum ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm3gdh_gdh, ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm16gdh_gdh и ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm78gdh_gdh.

3-2-3. Оценка способности продуцировать L-треонин у штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

Для оценки способности продуцировать L-треонин у штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032::lysC(L377K)_hom(R398Q), использованного в качестве родительского штамма, и штаммов Corynebacterium glutamicum ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm3gdh_gdh, ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm16gdh_gdh и ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm78gdh_gdh, полученных в Примере 3-2-2, культивировали штаммы следующим способом и затем анализировали.

Вначале, каждым штаммом инокулировали 25 мл среды для посева, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл затравочной культуры инокулировали 24 мл среды для продуцирования, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 32°С в течение 48 часов. Состав среды для посева и среды для культивирования показан ниже.

Среда для посева (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина гидрохлорида, 2000 мкг кальция пантотената и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

Среда для продуцирования (рН 7,0)

45 г глюкозы, 10 г соевого белка, 10 г мелассы, 15 г (NH₄)₂SO₄, 0,55 г KH₂PO₄, 0,6 г MgSO₄⋅7H₂O, 9 мг FeSO₄⋅7H₂O, 9 мг MnSO₄⋅5H₂O, 0,9 мг биотина, 4,5 мг тиамина гидрохлорида, 30 г СаСО₃, 4,5 мг кальция пантотената, 30 мг никотинамида, 0,45 мг ZnSO₄ и 0,45 мг CuSO₄ (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

По окончании культивирования измеряли количество произведенного L-треонина при помощи ВЭЖХ. Концентрация L-треонина и степень увеличения концентрации в культуре каждого из штаммов Corynebacterium glutamicum ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q),

ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm3gdh_gdh,

ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm16gdh_gdh и

ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q)::Pm78gdh_gdh показаны в Таблице 4 ниже.

Как показано в Таблице 4, три штамма с внедренными мутированными промоторами gdh демонстрировали увеличение концентрации L-треонина по сравнению с родительским штаммом ATCC13032::lysC(L377K)_hom(R398Q).

Пример 3-3. Оценка способности продуцировать О-ацетилгомосерин

3-3-1. Получение продуцирующих О-ацетилгомосерин штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

Векторы, сконструированные в Примере 2, внедряли в штамм Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС 13032 путем электропорации и затем получали трансформированные штаммы на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Штаммы, в хромосому которых встраивались мутированные промоторы gdh в виде фрагментов ДНК в результате вторичного кроссинговера, отбирали при помощи ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и секвенировали, и отобранные штаммы обозначали Corynebacterium glutamicum АТСС 13032::Pm3gdh_gdh, ATCC13032::Pm16gdh_gdh и АТСС 13032::Pm78gdh_gdh.

3-3-2. Оценка способности продуцировать О-ацетилгомосерин у штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

Для оценки способности продуцировать O-ацетилгомосерин у штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032, использованного в качестве родительского штамма, и штаммов АТСС 13032::Pm3gdh_gdh, АТСС 13032::Pm16gdh_gdh и ATCC13032::Pm78gdh_gdh, полученных в Примере 3-3-1, культивировали штаммы следующим способом и затем анализировали.

Каждым штаммом инокулировали 25 мл следующей среды, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, при помощи петли для инокуляции и затем культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 33°С в течение 20 часов.

Среда для продуцирования (рН 7,0)

30 г глюкозы, 2 г KH₂PO₄, 3 г мочевины, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г пептона, 5 г (10 мл) кукурузного экстракта (CSL, Sigma), 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O и 20 г СаСО₃ (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

По окончании культивирования измеряли способность продуцировать О-ацетилгомосерин при помощи ВЭЖХ. Концентрация (9-ацетилгомосерина и степень увеличения концентрации в культуре каждого из штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС13032, ATCC13032::Pm3gdh_gdh, ATCC13032::Pm16gdh_gdh и ATCC13032::Pm78gdh_gdh показана в Таблице 5 ниже.

Как показано в Таблице 5, три штамма с внедренными мутированными промоторами gdh демонстрировали увеличение концентрации (9-ацетилгомосерина по сравнению с родительским штаммом дикого типа АТСС 13032.

Пример 3-4. Оценка способности продуцировать L-изолейцин

3-4-1. Получение продуцирующих L-изолейцин штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

Для получения штаммов, трансформированных мутированными промоторами gdh, с использованием векторов pDCM2 Pm3gdh_gdh, pDCM2_Pm16gdh_gdh и pDCM2_Pm78gdh_gdh, сконструированных в Примере 2, векторами вначале трансформировали штамм Corynebacterium glutamicum CJP1 (патент Кореи 10-1996769) для внедрения последовательностей мутированных промоторов gdh в хромосому. Затем дополнительно внедряли вектор, включающий ген ilvA (V323A), в котором валин заменен на аланин в 323-й аминокислоте в известном гене ilvA, кодирующем L-треониндегидратазу (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p. 4345-4351) с получением продуцирующего L-изолейцин штамма (патент Кореи 10-1996769).

В частности, векторы, сконструированные в Примере 2, внедряли в штамм CJP1 путем электропорации и затем получали трансформированные штаммы на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Штаммы, в хромосому которых встраивались мутированные промоторы gdh в виде фрагментов ДНК в результате вторичного кроссинговера, отбирали при помощи ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и секвенировали, и отобранные штаммы обозначали Corynebacterium glutamicum CJP1::Pm3gdh_gdh, CJP1::Pm16gdh_gdh и CJP1::Pm78gdh_gdh.

Вектор pECCG117-ilvA(V323A) (патент Кореи 10-1996769) внедряли в полученные штаммы путем электропорации и затем получали трансформированные штаммы на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные штаммы обозначали CJP1::Pm3gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A), CJP1::Pm16gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A) и CJP1::Pm78gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A), соответственно.

3-4-2. Оценка способности продуцировать L-изолейцин у штаммов с внедренными мутированными промоторами gdh

Для оценки способности продуцировать L-изолейцин у штамма Corynebacterium glutamicum CJP1/pECCG117-ilvA(V323A), использованного в качестве родительского штамма, и штаммов CJP1::Pm3gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A), CJP1::Pm16gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A) и CJP 1::Pm78gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A), полученных в Примере 3-4-1, культивировали штаммы следующим способом и затем анализировали.

Вначале, каждым штаммом инокулировали 25 мл среды для посева, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл затравочной культуры инокулировали 24 мл среды для продуцирования, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 32°С в течение 48 часов. Состав среды для посева и среды для культивирования показан ниже.

Среда для посева (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина гидрохлорида, 2000 мкг кальция пантотената и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

Среда для продуцирования (рН 7,0)

45 г глюкозы, 10 г соевого белка, 10 г мелассы, 15 г (NH₄)₂SO₄, 0,55 г KH₂PO₄, 0,6 г MgSO₄⋅7H₂O, 9 мг FeSO₄⋅7H₂O, 9 мг MnSO₄⋅5H₂O, 0,9 мг биотина, 4,5 мг тиамина гидрохлорида, 30 г СаСО₃, 4,5 мг кальция пантотената, 30 мг никотинамида, 0,45 мг ZnSO₄ и 0,45 мг CuSO₄ (из расчета на 1 л дистиллированной воды)

По окончании культивирования измеряли количество произведенного L-изолейцина при помощи ВЭЖХ. Концентрация L-изолейцина и степень увеличения концентрации в культуре каждого из штаммов Corynebacterium glutamicum CJP1/pECCG117-ilvA(V323 А), CJP1::Pm3gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323 A), CJP 1::Pm16gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A) и CJP 1::Pm78gdh_gdh/pECCG117-ilvA(V323A) показаны в Таблице 6 ниже.

Как показано в Таблице 6, три штамма с внедренными мутированными промоторами gdh демонстрировали увеличение концентрации L-изолейцина по сравнению с родительским штаммом дикого типа CJP1/pECCG117-ilvA(V323A).

Приведенные выше результаты указывали, что у рекомбинантных микроорганизмов, включающих полинуклеотид по данному изобретению, обладающий активностью промотора, повышалась продуктивность L-лизина, L-треонина, О-ацетилгомосерина и L-изолейцина, применяющихся в промышленности.

На основании вышеизложенного специалисты в области техники, к которой относится данное изобретение, поймут, что возможны и другие воплощения данного изобретения, не изменяющие технической концепции или существенных признаков данного изобретения. Таким образом, описанные выше воплощения следует рассматривать только в качестве примеров, не ограничивающих объем данного изобретения. Следует понимать, что объем изобретения ограничен прилагаемой формулой, и все изменения или модификации, вытекающие из определений и объема формулы изобретения, а также их эквиваленты, входят в объем данного изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ПРОМОТОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> OPA22002

<150> KR10-2021-0061306

<151> 2021-05-12

<160> 28

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 330

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

attctttgtg gtcatatctg tgcgacactg ccataattga acgtgagcat ttaccagcct 60

aaatgcccgc agtgagttaa gtctcaaagc aagaagttgc tctttagggc atccgtagtt 120

taaaactatt aaccgttagg tatgacaagc cggttgatgt gaacgcagtt tttaaaagtt 180

tcaggatcag atttttcaca ggcattttgc tccagcaaac gcctaggatg tacatggtgc 240

cctcaatggg aaccaccaac atcactaaat ggcccaggta cacactttaa aatcgtgcgc 300

gcatgcagcc gagatgggaa cgaggaaatc 330

<210> 2

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pm3gdh

<400> 2

attctttgtg gtcatatctg tgcgactgtg gtatacttga acgtgagcat ttaccagcct 60

aaatgcccgc agtgagttaa gtctcaaagc aagaagttgc tctttagggc atccgtagtt 120

taaaactatt aaccgttagg tatgacaagc cggttgatgt gaacgcagtt tttaaaagtt 180

tcaggatcag atttttcaca ggcattttgc tccagcaaac gcctaggatg tacatggtgc 240

cctcaatggg aaccaccaac atcactaaat ggcccaggta cacactttaa aatcgtgcgc 300

gcatgcagcc gagatgggaa cgaggaaatc 330

<210> 3

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pm16gdh

<400> 3

attctttgtg gtcatatctg tgcgactgtg gtatacttga acgtgagcat ttaccagcct 60

aaatgtccgc agtgagttaa gtctcaaagc aagaagttgc tctttagggc atccgtagtt 120

taaaactatt aaccgttagg tatgacaagc cggttgatgt gaacgcagtt tttaaaagtt 180

tcaggatcag atttttcaca ggcattttgc tccagcaaac gcctaggatg tacatggtgc 240

cctcaatggg aaccaccaac gtcactaaat ggcccaggta cacactttaa aatcgtgcgc 300

gcatgcagcc gagatgggaa cgaggaaatc 330

<210> 4

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pm78gdh

<400> 4

attctttgtg gtcatatctg tgcgactgtg gtatacttga acgtgagcat ttaccagcct 60

aaatgtccgc agtgagttaa gtctcaaagc aagaagttgc tctttagggc atccgtagtt 120

taaaactatt aaccgttagg tatgacaagc cggttgatgt gaacgcagtt tttaaaagtt 180

tcaggatcag atttttcaca ggcattttgc tccagcaaac gcctaggatg tacatggtgc 240

cctcaatggg aaccaccaac atcactaaat ggcccaggta cacactttaa aatcgtgcgc 300

gcatgcagcc gagatgggaa cgaggaaatc 330

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер Pgdhm

<400> 5

ctctagaact agtggatcca ttctttgtgg tcatatctg 39

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер Pgdhm

<400> 6

agttcttctc ctttactcat gatttcctcg ttcccatctc 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер GFP

<400> 7

gagatgggaa cgaggaaatc atgagtaaag gagaagaact 40

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер GFP

<400> 8

cccccctcga ggtcgactta tttgtagagc tcatcca 37

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер Pgdhm

<400> 9

attctttgtg gtcatatctg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер Pgdhm

<400> 10

gatttcctcg ttcccatctc 20

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер pDZ-Pm3, 4, 6_gdh

<400> 11

gtgaattcga gctcggtacc ccgtcggtgg gggagttg 38

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер pDZ-Pm3, 4, 6_gdh

<400> 12

gatatgacca caaagaatta aaattgtttg aaaatt 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер pDZ-Pm3, 4, 6_gdh

<400> 13

aattttcaaa caattttaat tctttgtggt catatc 36

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер pDZ-Pm3, 4, 6_gdh

<400> 14

cctgctcatc aactgtcatg atttcctcgt tcccatct 38

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер pDZ-Pm3, 4, 6_gdh

<400> 15

agatgggaac gaggaaatca tgacagttga tgagcagg 38

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер pDZ-Pm3, 4, 6_gdh

<400> 16

ggtcgactct agaggatccc ccaactccga tgtcacctg 39

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер lysC(L377K)

<400> 17

gtgaattcga gctcggtacc ctccaagatt ttggtgctgc g 41

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер lysC(L377K)

<400> 18

atctcagagg tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 40

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер lysC(L377K)

<400> 19

atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca cctctgagat 40

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер lysC(L377K)

<400> 20

ggtcgactct agaggatccc cgttcacctc agagacgatt a 41

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер hom(R398Q)

<400> 21

gtgaattcga gctcggtacc ctttccacac ccgtgttacc g 41

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер hom(R398Q)

<400> 22

atcatcgcgc tcttcctgtt ggattgtacg cagggagatt 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер hom(R398Q)

<400> 23

aatctccctg cgtacaatcc aacaggaaga gcgcgatgat 40

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер hom(R398Q)

<400> 24

ggtcgactct agaggatccc caaccattag ctgcagcaac a 41

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер lysC(L377K)

<400> 25

tcctaatgca cagaagctgg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер lysC(L377K)

<400> 26

gtggtgcagt tagggttcgc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер hom(R398Q)

<400> 27

atccaactgc agacgtcgaa 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер hom(R398Q)

<400> 28

atctgggtgg ccttcaaagg 20

<---

Изобретение относится к новому промотору и способу получения целевого вещества с его применением и, более конкретно, к новому полинуклеотиду, обладающему активностью промотора, вектору и микроорганизму рода Corynebacterium, включающим его, и к способу получения целевого вещества с применением микроорганизма. Изобретение позволяет продуцировать целевые вещества с высокой продуктивностью в микроорганизмах рода Corynebacterium. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.

1. Полинуклеотид, обладающий активностью промотора, в котором нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32 и 36; в положениях 27, 28, 31, 32, 36, 66 и 261 или в положениях 27, 28, 31, 32, 36 и 66 заменены другими нуклеотидами в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1,

где указанные другие нуклеотиды отличаются от нуклеотидов до замены и выбраны из группы, состоящей из аденина (A), цитозина (C), тимина (T) и гуанина (G).

2. Полинуклеотид по п. 1, в котором в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 нуклеотид аденин (A) в положении 27 заменен тимином (T); нуклеотид цитозин (C) в положении 28 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (C) в положении 31 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (C) в положении 32 заменен тимином (T); и нуклеотид аденин (A) в положении 36 заменен цитозином (C).

3. Полинуклеотид по п. 2, где полинуклеотид приведен в SEQ ID NO: 2.

4. Полинуклеотид по п. 1, в котором в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 нуклеотид аденин (A) в положении 27 заменен тимином (T); нуклеотид цитозин (C) в положении 28 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (C) в положении 31 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (C) в положении 32 заменен тимином (T); нуклеотид аденин (A) в положении 36 заменен цитозином (C); нуклеотид цитозин (C) в положении 66 заменен тимином (T); и нуклеотид аденин (A) в положении 261 заменен гуанином (G).

5. Полинуклеотид по п. 4, где полинуклеотид приведен в SEQ ID NO: 3.

6. Полинуклеотид по п. 1, в котором в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 нуклеотид аденин (A) в положении 27 заменен тимином (T); нуклеотид цитозин (C) в положении 28 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (C) в положении 31 заменен гуанином (G); нуклеотид цитозин (C) в положении 32 заменен тимином (T); нуклеотид аденин (A) в положении 36 заменен цитозином (C); и нуклеотид цитозин (C) в положении 66 заменен тимином (T).

7. Полинуклеотид по п. 6, где полинуклеотид приведен в SEQ ID NO: 4.

8. Полинуклеотид, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-7, функционально связанный с геном, кодирующим целевой белок.

9. Экспрессионная кассета, содержащая:

полинуклеотид по любому из пп. 1-7 и

ген, кодирующий целевой белок и функционально связанный с указанным полинуклеотидом.

10. Экспрессионная кассета по п. 9, где целевой белок представляет собой глутаматдегидрогеназу (gdh).

11. Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования аминокислоты, содержащий:

полинуклеотид по любому из пп. 1-7; или

полинуклеотид по любому из пп. 1-7 и ген, кодирующий целевой белок и функционально связанный с указанным полинуклеотидом.

12. Микроорганизм по п. 11, где целевой белок представляет собой глутаматдегидрогеназу (gdh).

13. Микроорганизм по п. 11, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

14. Способ получения аминокислоты, включающий:

культивирование микроорганизма рода Corynebacterium в среде, где указанный микроорганизм содержит полинуклеотид по любому из пп. 1-7 и ген, кодирующий целевой белок, вовлеченный в биосинтез аминокислоты, и функционально связанный с указанным полинуклеотидом; и

выделение аминокислоты из среды.

15. Способ по п. 14, где аминокислота представляет собой лизин, треонин, O-ацетилгомосерин или изолейцин.

16. Применение полинуклеотида, обладающего активностью промотора, в котором нуклеотиды в положениях 27, 28, 31, 32 и 36 заменены другими нуклеотидами в полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве промотора,

где указанные другие нуклеотиды отличаются от нуклеотидов до замены и выбраны из группы, состоящей из аденина (A), цитозина (C), тимина (T) и гуанина (G).