Новый промотор и его применение Российский патент 2023 года по МПК C12N15/113 C12N15/77 C12N1/21 C12P13/08 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новому промотору и способу получения целевого вещества с использованием указанного промотора. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому полинуклеотиду, обладающему промоторной активностью, к вектору и клетке-хозяину, каждое из которых содержит указанный полинуклеотид, и к способу получения целевого вещества с использованием указанного микроорганизма.

Описание предшествующего уровня техники

L-аминокислоты являются основными структурными единицами белков и находят применение как важные вещества для фармацевтического сырья, пищевых добавок, кормов для животных, питательных веществ, пестицидов, бактерицидных веществ и так далее. В числе L-аминокислот L-лизин является незаменимой аминокислотой, не проходящей биосинтез в живом организме, и известен как аминокислота, необходимая для стимуляции роста, метаболизма кальция, стимуляции секреции желудочного сока и резистентности к заболеваниям. L-лизин находит широкое применение в кормах, продуктах медицинского назначения, продуктах питания и так далее. L-триптофан также является одной из незаменимых аминокислот и находит применение в пищевых добавках, трансфузионных агентах, фармацевтическом сырье, веществах для оздоровительного питания и так далее.

Распространенные методы получения аминокислот включают главным образом ферментационные методы с использованием микроорганизмов, таких как Brevibacterium или Cory neb actehum (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center: 195-215, 1986), в дополнение к Escherichia coli, микроорганизмам рода Bacillus, Streptomyces, Penicillium, Klebsiella, Erwinia, Pantoea и так далее (патенты США №№ 3,220,929 и 6,682,912), и также включают промышленные методы синтеза, такие как монохлорацетатный метод, метод Штреккера и так далее.

Кроме того, было проведено множество исследований для эффективного получения аминокислот, например, были предприняты попытки разработать микроорганизм, обеспечивающий высокую эффективность получения аминокислот, или ферментационную технологию. Конкретно, были разработаны специфические в отношении целевого вещества способы повышения экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в биосинтез аминокислот, или удаления генов, не являющихся обязательными для биосинтеза аминокислот, у штамма рода Corynebacterium (патенты Кореи №№ 10-0924065 и 1208480). В дополнение к этим методам применяют метод удаления генов, не вовлеченных в получение аминокислот, и метод удаления генов, конкретные функции которых при получении аминокислот не известны. Тем не менее, все еще существует потребность в исследованиях метода, который позволил бы эффективно получать L-аминокислоты с высоким выходом.

С учетом этого предшествующего уровня техники авторы настоящего изобретения разработали новый полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, позволяющий получать целевое вещество с высокой продуктивностью в микроорганизме рода Corynebacterium, и обнаружили, что при введении этого полинуклеотида в микроорганизм продуктивность в отношении целевого вещества может быть повышена, завершив посредством этого настоящее изобретение.

Авторы настоящего изобретения приложили значительные усилия для получения нового полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, и в результате обнаружили, что при усовершенствовании промотора целевого гена посредством замены оснований усовершенствованный промотор способен регулировать экспрессию гена, функционально связанного с ним, завершив посредством этого настоящее изобретение.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на С.

Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить генную экспрессионную кассету, содержащую указанный полинуклеотид и целевой ген.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить клетку-хозяина, содержащую указанный полинуклеотид или указанную генную экспрессионную кассету.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ получения целевого вещества, включающий стадии культивирования указанной клетки-хозяина в среде и выделения целевого вещества из среды.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить применение полинуклеотид а в качестве промотора, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Настоящее изобретение будет описано подробно, как изложено ниже. В то же время, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в данном изобретении, может также быть применено к другим описаниям и воплощениям. То есть объем настоящего изобретения включает все комбинации различных элементов, раскрытых в данном изобретении. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже.

Кроме того, специалистам в данной области будет ясно, или они смогут убедиться, применяя не более чем рутинные эксперименты, что существует множество эквивалентов конкретных воплощений изобретения, описанных здесь. Кроме того, эти эквиваленты следует трактовать как включенные в настоящее изобретение.

Для решения указанных выше задач согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на С.

При использовании здесь термин «нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 1», может относиться к части промоторной последовательности гена NCgl0859.

В этой связи, термин «ген NCg10859» относится к гену, естественным образом присутствующему у микроорганизма рода Corynebacterium, или гену, кодирующему гипотетический белок, функция которого неизвестна.

Последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 1, может представлять собой последовательность, имеющую происхождение из Corynebacterium (Corynebacterium sp.), и, конкретно, последовательность, имеющую происхождение из Corynebacterium glutamicum. Тем не менее, последовательность, обладающая активностью, эквивалентной активности указанного полинуклеотида или превышающей активность указанного полинуклеотида, может быть включена в промотор по настоящему изобретению без ограничения.

При использовании здесь термин «полинуклеотид», относящийся к нуклеотидному полимеру, где нуклеотидные мономеры ковалентно связаны в длинную цепь, относится к цепи ДНК, имеющей предопределенную длину или длину, превышающую предопределенную длину.

При использовании здесь термин «промотор» относится к нетранслируемой нуклеотидной последовательности выше кодирующей области, содержащей сайт связывания для полимеразы и обладающей активностью инициации транскрипции целевого гена промотора с образованием мРНК (матричная РНК), то есть к домену ДНК, с которым связывается полимераза, инициируя транскрипцию гена. Промотор может быть расположен в 5'-домене домена инициации транскрипции с образованием мРНК.

При использовании здесь термин «полинуклеотид, обладающий промоторной активностью», относится к области ДНК, которая содержит сайт связывания для РНК-полимеразы или энхансер, и так далее, для экспрессии гена, расположенного ниже ее и функционально связанного с ней, то есть целевого гена, и расположена вблизи сайта транскрипции целевого гена. Применительно к задачам настоящего изобретения, полинуклеотид может быть использован как промотор для общего применения, и, по сравнению с существующим промотором или эндогенным промотором в клетках, полинуклеотид может регулировать (например, повышать или снижать) экспрессию целевого гена, функционально связанного с ним, и образование и/или активность белка, кодируемого целевым геном, и он может регулировать (например, повышать или снижать) образование и/или активность целевого продукта (биологически активного вещества, например одного или более чем одного, выбранного из группы, состоящей из аминокислот, нуклеиновых кислот, витаминов, белков, жирных кислот, органических кислот и так далее), вовлеченного в образование указанного белка, без ограничения этим.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может содержать любую полинуклеотидную последовательность без ограничения, при условии, что она обладает промоторной активностью.

В одном воплощении полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может содержать полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где один или более чем один нуклеотид в нуклеотидной последовательности, представленной SEQ IDNO: 1, заменен на другой нуклеотид.

Конкретно, полинуклеотид может состоять из полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, где один или более чем один нуклеотид в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен на другой нуклеотид. В настоящем описании полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, может быть использован взаимозаменяемо с «вариантом промотора», и все описанные выше термины могут быть использованы в настоящем описании.

Например, полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, может представлять собой полинуклеотид, где нуклеотид в определенном положении полинуклеотидной последовательности, обладающей существующей промоторной активностью, заменен и, таким образом, промоторная активность ослаблена или усилена.

В одном воплощении вариант промотора может представлять собой промотор, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид.

«Другой нуклеотид» не ограничен, при условии, что он представляет собой нуклеотид, отличный от нуклеотида до замены. Например, описание того, что «нуклеотид в положении 178 SEQ ID NO: 1 заменен на другой нуклеотид», означает, что нуклеотид заменен на аденин (А), цитозин (С) или гуанин (G), за исключением тимина (Т). Кроме того, в настоящем изобретении, если не указано иное, описание нуклеотида как «замененного» означает, что нуклеотид заменен на нуклеотид, отличный от нуклеотида до замены.

В то же время, специалисты в данной области могут определить нуклеотид в положении, соответствующем положению 178 SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, в любой полинуклеотидной последовательности посредством выравнивания последовательностей, известного в данной области. Если в настоящем изобретении не описано иное, то при описании «нуклеотида в определенном положении определенной SEQ ID NO» очевидно, что этот нуклеотид также включает «нуклеотид в соответствующем положении» в любой полинуклеотидной последовательности. Таким образом, полинуклеотидная последовательность, где любой один или более чем один нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из нуклеотидов в положениях, соответствующих положению 178 полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид в любой полинуклеотидной последовательности, обладающей промоторной активностью, также включена в объем настоящего изобретения.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой полинуклеотид, где нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 1, то есть промоторная последовательность гена NCg10859, изменена. Конкретно, изменение может представлять собой замену нуклеотида в положении 178 указанной последовательности на другой нуклеотид. Конкретно, нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, может быть заменен на С.

Полинуклеотид может иметь измененную (повышенную или сниженную) промоторную активность по сравнению с полинуклеотидом без изменения. Таким образом, возможна регуляция (повышение или снижение) экспрессии целевого гена, функционально связанного с полинуклеотидом, и активности белка, кодируемого целевым геном, и, кроме того, возможна регуляция экспрессии гена, отличного от целевого гена.

Например, замена нуклеотида в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, на другой нуклеотид позволяет получить промотор, обладающий активностью, более ослабленной или усиленной, чем промоторная последовательность без замены (неизмененная).

Кроме того, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, вовлеченный в увеличение образования или образованного количества целевого вещества, конкретно L-аминокислоты, и более конкретно L-лизина.

Эффект увеличения образованного количества L-аминокислоты, более конкретно L-лизина, посредством изменения промотора гена NCg10859 был впервые изучен авторами настоящего изобретения.

При использовании здесь «L-лизин», являющийся одной из основных α-аминокислот, представляет собой незаменимую аминокислоту, не синтезируемую in vivo. L-лизин может находить применение, но без ограничения, в различных продуктах, таких как корма, или кормовые добавки, или продукты питания, пищевые добавки, продукты медицинского назначения и так далее.

В одном воплощении полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может содержать полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Например, полинуклеотид может по существу состоять из или может состоять из полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, без ограничения этим.

Кроме того, без ограничения описанным выше воплощением, в полинуклеотидную последовательность могут быть включены различные изменения в диапазоне, не приводящем к существенному снижению промоторной активности. Например, нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть изменена посредством известного метода мутагенеза, например направленной эволюции, сайт-направленного мутагенеза и так далее.

В этой связи, термин «изменение» относится к генетически или негенетически стабильному фенотипическому изменению, и в настоящем изобретении он может быть использован взаимозаменяемо с «модификацией» или «мутацией».

Таким образом, в настоящем изобретении полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, может представлять собой полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или полинуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%, или более гомологичную или идентичную SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В числе указанных выше категорий, нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию или идентичность, может представлять собой последовательность, идентичную менее чем на 100%, за исключением последовательности, идентичной на 100%.

Несмотря на то, что он описан в настоящем изобретении как «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную определенной SEQ ID NO», или «полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную определенной SEQ ID NO», очевидно, что в настоящем изобретении может также быть использован полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности, при условии, что он обладает активностью, идентичной или соответствующей активности полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности соответствующей SEQ ID NO.

Например, очевидно, что полинуклеотид, где во внутренней области или в конце нуклеотидной последовательности соответствующей SEQ ID NO добавлена бессмысленная последовательность или где во внутренней области или в конце нуклеотидной последовательности соответствующей SEQ ID NO удалена часть последовательности, также включен в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает активностью, идентичной или соответствующей активности указанного полинуклеотида.

Гомология или идентичность относятся к степени совпадения двух заданных нуклеотидных последовательностей и могут быть выражены в процентах.

Во многих случаях термины «гомология» и «идентичность» могут быть использованы взаимозаменяемо.

Гомология или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотидов может быть определена с применением стандартных алгоритмов выравнивания и может быть использована с штрафом за разрыв, установленным в используемой программе по умолчанию. По существу гомологичные или идентичные последовательности могут гибридизоваться в условиях умеренной или высокой жесткости по всей длине или на протяжении по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90% всей длины последовательностей. Также рассматриваются полинуклеотиды, содержащие вырожденные кодоны вместо кодонов гибридизующихся полинуклеотидов.

Гомология, сходство или идентичность любых двух полинуклеотидных последовательностей могут быть определены с применением известного компьютерного алгоритма, такого как программа «FASTA», с использованием параметров по умолчанию, например как в Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. Альтернативно, как в программе Needleman пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версии 5.0.0 или последующих версий), гомология, сходство или идентичность могут быть определены с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с применением BLAST или ClustalW базы данных Национального центра биотехнологической информации.

Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидов могут быть определены путем сравнения информации о последовательностях с применением компьютерной программы GAP, например Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как раскрыто в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Кратко, программа GAP определяет значение, полученное делением числа сходно выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значения 1 для идентичных положений и 0 для неидентичных) и взвешенную матрицу сравнения по Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) (альтернативно, матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS-версия NCBI NUC4.4); (2) штраф 3,0 за каждый разрыв и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа каждого разрыва (альтернативно, штраф за начало разрыва 10, штраф за продолжение разрыва 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевой разрыв. Соответственно, термин «гомология» или «идентичность», используемый в настоящем изобретении, отражает родство последовательностей.

Кроме того, может быть включен, без ограничения, зонд, который может быть получен из известной генной последовательности, например полинуклеотидной последовательности, имеющей такую же активность и гибридиующейся с последовательностью, комплементарной всей описанной выше полинуклеотидной последовательности или ее части, в жестких условиях. «Жесткие условия» обозначают условия, позволяющие проводить специфичную гибридизацию полинуклеотидов. Эти условия конкретно раскрыты в литературе (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Например, жесткие условия могут включать условия, при которых гены, имеющие высокую гомологию или идентичность, гены, гомологичные или идентичные на 40% или более, конкретно на 70% или более, 80% или более, 85% или более или 90% или более, более конкретно на 95% или более, намного более конкретно на 97% или более и особенно конкретно на 99% или более, гибридизуются друг с другом, в то время как гены, имеющие более низкую гомологию или идентичность, чем указано выше, не гибридизуются друг с другом, или могут включать обычные условия промывки при Саузерн-гибридизации, то есть однократную промывку, конкретно двукратную или трехкратную, при концентрации соли и температуре, соответствующих 60°С, 1x SSC (физиологический раствор-цитрат натрия) и 0,1% SDS (додецилсульфатом натрия), конкретно 60°С, 0,1х SSC и 0,1% SDS, и более конкретно 68°С, 0,1х SSC и 0,1% SDS.

Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, однако в зависимости от жесткости гибридизации могут быть возможны несовпадения нуклеотидов. Термин «комплементарный» использован для описания связи между нуклеотидами, гибридизуемыми друг с другом. Например, применительно к ДНК, аденин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, настоящее изобретение может также включать выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный полноразмерной последовательности, а также последовательность нуклеиновой кислоты, по существу сходную с ним.

Конкретно, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность, может быть определен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении T_m 55°С в условиях, описанных выше. Кроме того, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, без ограничения этим, и специалисты в данной области могут надлежащим образом его контролировать в зависимости от поставленной задачи.

Жесткость, подходящая для гибридизации полинуклеотидов, зависит от длины и комплементарности полинуклеотидов, и эти показатели хорошо известны в данной области (см. Sambrook et al., указанную выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может быть выделен или получен с применением стандартных молекулярно-биологических методик. Например, полинуклеотид может быть получен с применением стандартной технологии синтеза с использованием автоматического синтезатора ДНК, но получение не ограничено этим.

Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может быть использован в качестве промотора.

Промотор может быть расположен в 5'-области сайта инициации транскрипции с образованием мРНК.

Промотор может иметь повышенную или сниженную промоторную активность по сравнению с существующими промоторами. Иными словами, промотор может повышать или снижать экспрессию и/или активность белка, кодируемого целевым геном, а также экспрессию целевого гена в клетках-хозяевах. Применительно к задачам настоящего изобретения, целевой ген, экспрессия которого усилена или ослаблена, может быть изменен в соответствии с продуктом, который необходимо получить, и промотор может быть использован как промотор для общего применения для усиления или ослабления целевого гена.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена генная экспрессионная кассета, содержащая полинуклеотид и целевой ген.

Полинуклеотид по настоящему изобретению является таким, как описано выше.

При использовании здесь термин «генная экспрессионная кассета» относится к стандартной кассете, содержащей промотор и целевой ген и способной экспрессировать целевой ген, расположенный ниже промотора и функционально связанный с ним. В область, расположенную внутри или вне генной экспрессионной кассеты, могут быть включены различные факторы, которые могут способствовать эффективной экспрессии целевого гена. Обычно генная экспрессионная кассета может помимо промотора, функционально связанного с целевым геном, содержать сигнал терминации транскрипции, домен связывания рибосом и сигнал терминации трансляции, но без ограничения ими.

Применительно к задачам настоящего изобретения, «целевой ген» относится к гену, экспрессию которого регулирует промоторная последовательность по настоящему изобретению. Белок, кодируемый целевым геном, может быть назван «целевым белком», а ген, кодирующий «целевой белок», может быть назван «целевым геном».

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может иметь различные модификации в кодирующей области в диапазоне, не приводящем к изменению полипептидной последовательности, в силу вырожденности кодонов или с учетом кодонов, предпочтительных для организма, который будет экспрессировать полинуклеотид. Описание полинуклеотидной последовательности является таким, как описано выше.

В частности, выражение «состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2» означает, что при использовании рестриктазы не исключены добавление, делеция и/или изменение нуклеотидов, которые могут произойти в процессе лигирования с целевым геном, когда соответствующий полинуклеотид используют в качестве промотора, лигируя его с целевым геном.

Кроме того, полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, может включать любую нуклеотидную последовательность без ограничения, при условии, что она представляет собой нуклеотидную последовательность, гибридизуемую с последовательностью, комплементарной всей или части нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, в жестких условиях, обладая промоторной активностью по настоящему изобретению.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид или генную экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид и целевой ген.

Полинуклеотид, целевой ген и генная экспрессионная кассета по настоящему изобретению являются такими, как описано выше.

При использовании здесь термин «вектор» относится к искусственной молекуле ДНК, имеющей генетический материал, способный экспрессировать целевой ген у подходящего хозяина, и конкретно относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность гена, кодирующего целевой белок, функционально связанную с ней.

При использовании здесь термин «функционально связанный» означает, что полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению функционально связан с последовательностью гена для инициации и опосредования транскрипции целевого гена. Функциональная связь может быть достигнута с применением рекомбинантной генетической методики, известной в данной области, а сайт-специфичное расщепление и лигирование ДНК может быть осуществлено с использованием рестриктазы и лигазы, известных в данной области, без ограничения этим.

Конкретных ограничений относительно вектора, используемого в настоящем изобретении, нет, при условии, что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине, и для трансформации клетки-хозяина может быть использован любой вектор, известный в данной области. Примеры часто используемого вектора могут включать естественные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги.

Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, ГХП, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, и так далее; и в качестве плазмидного вектора могут быть использованы векторы на основе pDZ, pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET; однако векторы не ограничены перечисленными. Конкретно, могут быть использованы векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и так далее, однако векторы не ограничены перечисленными. Кроме того, введение полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено любым методом, известным в данной области, например посредством гомологичной рекомбинации.

Поскольку вектор по настоящему изобретению может быть введен в хромосому путем индуцирования гомологичной рекомбинации, возможно дополнительное включение селекционного маркера для подтверждения успешного введения гена в хромосому. Селекционный маркер предназначен для скрининга клеток, трансформированных вектором, то есть для определения того, введен ли полинуклеотид. Могут быть использованы маркеры, обеспечивающие селектируемые фенотипы, такие как резистентность к лекарственным средствам, ауксотрофия, резистентность к токсичным агентам или экспрессия поверхностных белков. В среде, обработанной селективным агентом, выжить или продемонстрировать отличный фенотип могут только клетки, экспрессирующие селекционный маркер, и таким образом можно отбирать трансформированные клетки.

При использовании здесь термин «трансформация» относится к введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, для обеспечения возможности экспрессии белка, кодируемого полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Кроме того, при условии, что полинуклеотид, используемый для трансформации, может быть экспрессирован в клетке-хозяине, не имеет значения, расположен ли полинуклеотид, используемый для трансформации, в хромосоме клетки-хозяина или вне хромосомы, и изобретение включает оба эти случая. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой генную конструкцию, содержащую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии, или в форме вектора, содержащего указанную экспрессионную кассету.

Метод трансформации включает любой метод введения гена, кодирующего целевой белок, в клетку и может быть осуществлен путем выбора подходящей стандартной методики, известной в данной области, в соответствии с клеткой-хозяином. Например, метод трансформации может включать электропорацию, преципитацию с фосфатом кальция (CaPO₄), преципитацию с хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекцию, методику с полиэтиленгликолем (PEG), методику с ВЕАЕ(диэтиламиноэтил)-декстраном, методику с катионными липосомами, методику с ацетатом лития и DMSO (диметилсульфоксид) и так далее, однако метод не ограничен этим.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая указанный полинуклеотид или указанную генную экспрессионную кассету.

Конкретно, клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, без ограничения им.

Полинуклеотид и генная экспрессионная кассета являются такими, как описано выше.

При использовании здесь термин «микроорганизм» включает все из микроорганизма дикого типа и микроорганизма, генетически модифицированного естественным или искусственным образом, и представляет собой понятие, включающее микроорганизм, имеющий определенный механизм, ослабленный или усиленный вследствие введения чужеродного гена или усиления или ослабления активности эндогенного гена. В настоящем изобретении микроорганизм может включать любой микроорганизм без ограничения, при условии, что в него введен полинуклеотид по настоящему изобретению или он содержит полинуклеотид по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении микроорганизм может содержать полинуклеотид, конкретно полинуклеотид и/или вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и более конкретно вектор, содержащий ген, кодирующий целевой белок, но без ограничения этим. Кроме того, полинуклеотид и вектор могут, без ограничения, быть введены в микроорганизм посредством трансформации.

Микроорганизм представляет собой клетку или микроорганизм, трансформированные вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению и ген, кодирующий целевой белок, для экспрессии целевого гена, и, применительно к задачам настоящего изобретения, клетка-хозяин или микроорганизм могут представлять собой любой микроорганизм, при условии, что он способен продуцировать целевой продукт, содержащий целевой белок.

При использовании здесь термин «микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт», включает все из микроорганизма дикого типа и микроорганизма, генетически модифицированного естественным или искусственным образом, и относится к микроорганизму, имеющему определенный механизм, ослабленный или усиленный вследствие введения чужеродного гена или усиления или инактивации активности эндогенного гена. Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для получения целевого белка или продукта.

Применительно к задачам настоящего изобретения, микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную продуктивность в отношении целевого белка или целевого продукта за счет того, что он содержит полинуклеотид по настоящему изобретению. Конкретно, в настоящем изобретении микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт, или микроорганизм, имеющий продуктивность в отношении целевого белка или целевого продукта, может представлять собой микроорганизм, где усилены или ослаблены некоторые из генов пути биосинтеза целевого белка или целевого продукта, или усилены или ослаблены некоторые из генов пути деградации целевого белка или целевого продукта.

Применительно к задачам настоящего изобретения, микроорганизм, содержащий полинуклеотид, может иметь повышенную продукцию L-аминокислоты, конкретно L-лизина.

В настоящем изобретении микроорганизм может включать любой микроорганизм без ограничения, при условии, что он представляет собой микроорганизм, в который введен полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению, и, таким образом, в котором указанный полинуклеотид может действовать как промотор.

Конкретно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, более конкретно Corynebacterium glutamicum или Corynebacterium flavum, и наиболее конкретно Corynebacterium glutamicum, без ограничения этим.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения целевого вещества, включающий стадии культивирования указанной клетки-хозяина в среде и выделения целевого вещества из среды.

Клетка-хозяин является такой, как описано выше.

В настоящем изобретении целевое вещество может представлять собой аминокислоту. Конкретно, если не указано иное, аминокислота может представлять собой аминокислоту L-типа и может быть выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, треонина, серина, цистеина, глутамина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина и их комбинаций, без ограничения ими.

Более конкретно, аминокислота может представлять собой L-лизин, без ограничения этим.

При использовании здесь термин «культивирование» относится к выращиванию микроорганизма в подходящих и искусственно контролируемых условиях окружающей среды. В настоящем изобретении способ получения целевого вещества с использованием микроорганизма, содержащего указанный полинуклеотид, может быть осуществлен с применением метода, широко известного в данной области. Конкретно, культивирование можно проводить методом периодической, подпитываемой или повторяющейся подпитываемой культуры, без ограничения этим. Среда, используемая для культивирования, должна подходящим образом соответствовать требованиям для определенных штаммов. Культуральные среды для микроорганизмов рода Corynebacterium раскрыты, например, в Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.

В качестве источника углерода, используемого в средах, могут быть включены: сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и так далее; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут быть использованы, без ограничения, по отдельности или в смеси.

В качестве используемого источника азота могут быть включены пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука, мочевина или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота могут также быть использованы, без ограничения, по отдельности или в смеси.

В качестве используемого источника фосфора могут быть включены дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие натрийсодержащие соли. Кроме того, культуральная среда может содержать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа, необходимую для роста. В завершение, помимо веществ, указанных выше, могут быть использованы вещества, необходимые для роста, такие как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральной среде могут быть использованы подходящие предшественники. В процессе культивирования указанные выше вещества-источники можно адекватным образом добавлять в культуру периодическим или непрерывным образом.

Во время культивирования микроорганизма рН культуры можно подходящим образом корректировать с использованием основного соединения, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак, или кислого соединения, такого как фосфорная кислота или серная кислота. Кроме того, пенообразование можно предотвращать с использованием пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. Для поддержания аэробного состояния в культуру можно вводить кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух).

Температура культуры (среды) может обычно составлять от 20 до 45° С, конкретно от 25 до 40°С. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества целевого вещества, но, конкретно, его можно осуществлять от 10 до 160 часов.

Применительно к выделению целевого вещества из культуры (среды), целевое вещество можно отделять и выделять обычным методом, известным в данной области. В методе разделения можно применять центрифугирование, фильтрование, хроматографию, кристаллизацию и так далее. Например, без ограничения, супернатант, полученный путем центрифугирования культуральной среды при низкой скорости и удаления биомассы, можно отделять посредством ионообменной хроматографии.

Стадия выделения может дополнительно включать процесс очистки.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение полинуклеотида в качестве промотора, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид.

Полинуклеотид является таким, как описано выше.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Тем не менее, последующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для пояснения настоящего изобретения и, таким образом, не подразумевают ограничения объема настоящего изобретения. С другой стороны, технические подробности, не описанные в данном описании, могут быть в достаточной степени поняты и легко реализованы специалистами в данной области или областях, сходных с областью, к которой относится настоящее изобретение.

Пример 1. Получение рекомбинантного вектора, содержащего новую промоторную последовательность

Сначала на основе базы данных GenBank Национальных институтов здравоохранения США (U.S. National Institutes of Health GenBank (NIH GenBank)) была получена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1), содержащая промоторную область NCg10859 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 дикого типа. Для изучения эффекта варианта промотора (PNCg10859(t178c), SEQ ID NO: 2), где нуклеотид, соответствующий положению 178 полинуклеотида SEQ ID NO: 1, был заменен с Т на С, на продукцию L-лизина, получали вектор для получения экспрессирующего его штамма с использованием плазмиды pDCM2 (публикация патента Кореи №10-2020-0136813) для введения и замены гена в хромосоме Corynebacterium.

Подробно, для проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) использовали гДНК (геномную ДНК) Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 дикого типа в качестве матрицы, пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4 и пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 5 и 6. Для проведения ПЦР с перекрывающимися фрагментами использовали смесь двух фрагментов, полученных, как описано выше, в качестве матриц и пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6, получая посредством этого фрагмент. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 минут; 30 циклов из 94°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд; и 72°С в течение 5 минут. Плазмиду pDCM2 обрабатывали Smal и полученный продукт ПЦР клонировали в нее методом слияния. При клонировании методом слияния использовали набор для клонирования In-Fusion® HD (Clontech). Полученный вектор был обозначен как pDCM2-PNCg10859(t178c). Информация о последовательностях праймеров, использованных для получения вектора, представлена в Таблице 1 ниже.

Пример 2. Оценка продуктивности микроорганизма, содержащего новую промоторную последовательность, в отношении L-лизина 2-1. Получение штамма, экспрессирующего вариант PNCg10859

Вектор с замененным геном, полученный в Примере 1, вводили в Corynebacterium glutamicum CJ3P (US 9556463 В2) с получением штамма с введенным вариантом, продуцирующего L-лизин, «CJ3P_PNCg10859(tl78c)».

Подробно, осуществляли трансформацию посредством электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 52:541-545) и затем осуществляли отбор штамма, в хромосому которого посредством гомологичной рекомбинации последовательностей был введен вектор, на агаровой питательной среде, содержавшей 25 мг/л канамицина. Первично отобранный штамм подвергали вторичному кроссинговеру для отбора штамма, в который был введен целевой вариант. Вариант (замену) у конечного трансформированного штамма анализировали посредством ПЦР с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 7 и 8 с последующим секвенированием. Информация о последовательностях праймеров, использованных для получения штамма, экспрессирующего вариант PNCg10859, представлена в Таблице 2 ниже.

2-2. Сравнение продуктивности штамма, экспрессирующего вариант PNCg10859, в отношении L-лизина

Продуктивность в отношении L-лизина анализировали по титрам штамма, полученного в Примере 2-1, и контрольного исходного штамма, при ферментации в колбах.

Сначала каждый штамм вносили в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержавшую 25 мл посевной среды, и культивировали с покачиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. 1 мл раствора посевной культуры вносили в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержавшую 24 мл среды для продуцирования, и культивировали с покачиванием при 30°С в течение 72 часов при 200 об/мин. В связи с этим, состав посевной среды и среды для продуцирования был следующим.

Посевная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 0,1мг биотина, 1мг тиамина-HCl, 2 мг пантотената кальция и 2 мг никотинамида (на 1 л дистиллированной воды).

Среда для продуцирования (рН 7,0)

100 г глюкозы, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г соевого белка, 5 г сухого кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г КН₂РО₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида и 30 г СаСО₃ (на 1 л дистиллированной воды).

По завершении культивирования продуктивность в отношении L-лизина измеряли с применением ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), и концентрация лизина в культуральной среде и степень повышения концентрации для каждого штамма показаны в Таблице 3 ниже.

Как показано в Таблице 3, было подтверждено, что штамм Corynebacterium glutamicum CJ3P PNCg10859(t178c), в который был введен вариант, продемонстрировал повышение концентрации L-лизина на 22,5% по сравнению со штаммом Corynebacterium glutamicum CJ3P, в который не был введен вариант.

Иными словами, было подтверждено, что рассматриваемый вариант существенно повышал продуктивность микроорганизма в отношении L-лизина.

На основании приведенного выше описания специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в различных конкретных формах без изменения его технической идеи или существенных признаков.

В этой связи, следует понимать, что во всех аспектах описанные выше воплощения приведены для наглядности и не являются ограничивающими. Объем изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не предшествующим описанием, и поэтому подразумевают, что формула изобретения включает все изменения и модификации, не выходящие за рамки границ и пределов формулы изобретения или эквивалентов таких границ и пределов.

Эффект изобретения Новый промотор по настоящему изобретению вводят в микроорганизм, продуцирующий аминокислоту, для повышения продуктивности микроорганизма в отношении этой аминокислоты. В частности, при получении аминокислоты с использованием нового промотора L-лизин, который до настоящего времени получали существующими методами синтеза, можно получать методом ферментации, и, таким образом, промотор может быть полезным образом использован для получения аминокислот.

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Novel promoter and use thereof

<130> OPA21218

<150> KR 10-2021-0059092

<151> 2021-05-07

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 400

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> промотор

<400> 1

acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60

caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120

aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagctct 180

gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240

taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300

aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360

gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400

<210> 2

<211> 400

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> вариант промотора

<400> 2

acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60

caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120

aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagccct 180

gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240

taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300

aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360

gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 1F

<400> 3

tgaattcgag ctcggtaccc ccaccgcctt cacaccg 37

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 2R

<400> 4

gatcgaaaag aatcagggct tgtgacgatt atc 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 3F

<400> 5

gataatcgtc acaagccctg attcttttcg atc 33

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 4R

<400> 6

gtcgactcta gaggatcccc gcagtacata gatcgggg 38

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 5F

<400> 7

ccggcttgag cagttcg 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 6R

<400> 8

gcgacgaagg atcctgg 17

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен новый полинуклеотид, обладающий промоторной активностью. Также предложены генная экспрессионная кассета и клетка-хозяин, каждая из которых содержит указанный полинуклеотид, и способ получения целевого вещества с использованием указанной клетки. Изобретение обеспечивает повышенную продуктивность микроорганизма, содержащего полинуклеотид по изобретению, в отношении целевого продукта. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на C.

2. Полинуклеотид по п. 1, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2.

3. Генная экспрессионная кассета, содержащая полинуклеотид по п. 1 и целевой ген.

4. Клетка-хозяин для продуцирования целевого вещества, содержащая полинуклеотид по п. 1 или генную экспрессионную кассету по п. 3.

5. Клетка-хозяин по п. 4, представляющая собой микроорганизм рода Corynebacterium.

6. Клетка-хозяин по п. 5, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

7. Способ получения целевого вещества, включающий стадии культивирования клетки-хозяина по п. 4 в среде и выделения целевого вещества из среды.

8. Способ по п. 7, где целевое вещество представляет собой аминокислоту.

9. Способ по п. 7, где целевое вещество представляет собой L-лизин.