Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к вариантам альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) и интерлейкина-2 (IL2). В одном варианте осуществления описанные здесь варианты IL2 имеют аминокислотные замены в области IL2, которая контактирует с альфа (α) субъединицей гетеротримерного рецепторного комплекса IL2Rαβγ, что снижает его способность связывать и активировать гетеротримерный рецепторный комплекс. Наоборот, соответствующие варианты IL2Rα, описанные в настоящей заявке, имеют аминокислотные замены, компенсирующие такую сниженную способность вариантов IL2 связываться и активировать IL2Rαβγ, предпочтительно по аминокислотным остаткам, контактирующим с аминокислотными остатками IL2, которые заменены в вариантах IL2, описанных в настоящей заявке. Варианты IL2 демонстрируют нарушение связывания и/или активации IL2R дикого типа, то есть IL2R, содержащего альфа-субъединицу (дикого типа) IL2R. Однако изменение альфа-субъединицы IL2R по меньшей мере частично восстанавливает связывание и/или активацию IL2R, содержащего вариант альфа-субъединицы IL2R. Таким образом, в настоящей заявке описаны пары, наборы или системы соответствующих вариантов альфа-субъединиц IL2R и IL2, которые демонстрируют уровень связывания и/или активации, который превышает уровень связывания и/или активации, показанный вариантами IL2 и IL2Rαβγ дикого типа.
В частности, в настоящей заявке описаны рецепторные полипептиды, содержащие мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении, содержащем кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа и/или замещены по меньшей мере в положении, содержащем основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа. Если аминокислотный остаток представляет собой кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток. Если аминокислотный остаток является основным аминокислотным остатком в альфа-субъединице IL2R дикого типа, замену осуществляют на кислый аминокислотный остаток. Также описаны полинуклеотиды, кодирующие рецепторные полипептиды, описанные в настоящей заявке, клетки-хозяева, в частности иммунные эффекторные клетки, такие как Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторного полипептида, описанного в настоящей заявке, а также фармацевтические композиции и медицинские препараты, содержащие полинуклеотиды и клетки-хозяева.
Также описаны соответствующие лигандные полипептиды, содержащие мутеин IL2 или функционального варианта IL2, в которых, когда альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант замещают по меньшей мере в положении, содержащем кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, IL2 или его функциональный вариант замещают по меньшей мере в указанном основном аминокислотном остатке в IL2 дикого типа, и/или когда альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант замещают по меньшей мере в положении, содержащем основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, IL2 или его функциональный вариант замещают по меньшей мере в указанном кислом аминокислотном остатке в IL2 дикого типа. Если аминокислотный остаток является основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, замену осуществляют на кислый аминокислотный остаток. Если аминокислотный остаток представляет собой кислый аминокислотный остаток в IL2 дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток.
Иммунные эффекторные клетки, такие как Т-клетки, несущие IL2R дикого типа, будут демонстрировать пониженную чувствительность при контакте с вариантами IL2, описанными в настоящей заявке. Однако ответная реакция соответствующих иммунных эффекторных клеток, таких как Т-клетки, несущие вариант IL2R (IL2R, содержащий вариантный полипептид IL2Rα), будет восстановлена по меньшей мере частично. Пары, наборы или системы соответствующих вариантов альфа-субъединиц IL2R и IL2 могут быть использованы для специфической активации иммунных эффекторных клеток, таких как Т-клетки, несущие вариант IL2R, описанный в настоящей заявке. Такие иммунные эффекторные клетки, такие как Т-клетки, несущие описанный в настоящей заявке вариант IL2R, могут быть получены ex vivo или in vitro и впоследствии введены субъекту, нуждающемуся в лечении, или могут быть созданы in vivo у субъекта, нуждающегося в лечении. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам и агентам для усиления эффекта иммунных эффекторных клеток, таких как Т-клетки. В частности, настоящее изобретение относится к способам, включающим предоставление субъекту иммунных эффекторных клеток, генетически модифицированных для экспрессии варианта IL2R, описанного в настоящей заявке, и предоставление субъекту соответствующего варианта IL2, например, путем введения субъекту соответствующего варианта IL2, полинуклеотида, кодирующего соответствующий вариант IL2, или клетки-хозяина, генетически модифицированной для экспрессии соответствующего варианта IL2. Описанные здесь способы и агенты, в частности, полезны для лечения заболеваний, характеризующихся патологическими клетками, экспрессирующими антиген, на который направлены иммунные эффекторные клетки. В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки несут рецептор антигена, такой как Т-клеточный рецептор (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), обладающий специфичностью связывания с антигеном или продуктом его процессирования. В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки генетически модифицированы для экспрессии рецептора антигена. Такая генетическая модификация может быть осуществлена ex vivo или in vitro, и впоследствии иммунные эффекторные клетки могут быть введены субъекту, нуждающемуся в лечении, или могут быть получены in vivo у субъекта, нуждающегося в лечении.
Предшествующий уровень техники
Иммунная система играет важную роль в развитии рака, аутоиммунитета, аллергии, а также заболеваний, связанных с патогенами. Т-клетки и NK-клетки являются важными медиаторами противоопухолевых иммунных ответов. CD8+ Т-клетки и NK-клетки могут непосредственно лизировать опухолевые клетки. С другой стороны, CD4+ Т-клетки могут опосредовать приток различных иммунных субпопуляций, включая CD8+ Т-клетки и NK-клетки, в опухоль. CD4+ T-клетки способны стимулировать дендритные клетки (DC) для праймирования противоопухолевых ответов CD8+ T-клеток, и могут действовать напрямую на опухолевые клетки за счет IFNγ-опосредованной позитивной регуляции MHC и ингибирования роста. CD8+, а также CD4+ онкоспецифические Т-клеточные ответы могут быть индуцированы вакцинацией или адоптивным переносом Т-клеток.
Иммунотерапия, основанная на переносе адоптивных клеток (ACT), в широком смысле может быть определена как форма пассивной иммунизации ранее сенсибилизированными Т-клетками, которые переносят неиммунным реципиентам или аутологичному хозяину после экспансии ex vivo от низких количеств предшественников до клинически значимого количества клеток. Типы клеток, которые использовались для экспериментов с ACT, представляют собой лимфокин-активированные киллеры (LAK) (Mule, JJ et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, SA et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) (Rosenberg, SA et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), донорские лимфоциты после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) а также опухолеспецифические Т-клеточные линии или клоны (Dudley, ME et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. US А 99, 16168-16173). Альтернативным подходом является адаптивный перенос аутологичных Т-клеток, перепрограммированных для экспрессии опухоль-реактивного иммунорецептора определенной специфичности во время кратковременного культивирования ex vivo с последующей реинфузией пациенту (Kershaw MH et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8): 525-41). Эта стратегия делает ACT применимым к множеству распространенных злокачественных новообразований, даже если у пациента отсутствуют опухоль-реактивные Т-клетки. Например, адоптивный перенос Т-клеток с модифицированным химерным антигенным рецептором (CAR Т-клеток), исследуется в большом количестве клинических испытаний по всему миру. Химерные антигенные рецепторы (CAR) представляют собой тип рецепторов, нацеленных на антиген, состоящих из внутриклеточных сигнальных доменов Т-клеток, слитых с внеклеточными антигенсвязывающими фрагментами, чаще всего одноцепочечными вариабельными фрагментами (scFv) из моноклональных антител. CAR непосредственно распознают антигены клеточной поверхности, независимо от МНС-опосредованной презентации, что позволяет использовать единственную рецепторную конструкцию, специфичную для любого данного антигена, у всех пациентов. CAR сливают домены распознавания антигена с цепью активации CD3ζ комплекса Т-клеточного рецептора (TCR) и содержат вторичные костимулирующие сигналы в тандеме с CD3ζ, включая внутриклеточные домены из CD28 или различных молекул семейства рецепторов TNF, таких как 4-1BB (CD137) и OX40 (CD134). CAR значительно повысили противоопухолевую эффективность, продемонстрировав замечательную клиническую эффективность, особенно у пациентов, страдающих гемобластозами (Hartmann, J. et al. EMBO Mol. Med. 9, 1183-1197 (2017)). Недавно два лекарственных средства на основе CAR Т-клеток были одобрены FDA и EMA для лечения В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Kymriah®) и диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (Yescarta®) (Zheng, P. et al. Drug Discov. Today 6, 1175-1182 (2018)). Однако в отношении солидных опухолей адоптивный перенос Т-клеток пока показал ограниченную эффективность и требует улучшения (Newick, K. et al. Annu. Rev. Med. 68, 139-152 (2017)).
Принято считать, что устойчивая экспансия in vivo и сохранение онкореактивных иммунорецептор-модифицированных Т-клеток являются критическими прогностическими факторами стойких клинических ремиссий у пациентов с гемобластозами (Guedan, S. et al. JCI Insight. 3 (1) (2018)); Maude, SL. Et al. N Engl J. Med. 371, 1507-1517 (2014)). Можно предположить, что это же самое верно и для пациентов с солидными опухолями. Следовательно, необходимо поддерживать присутствие или даже увеличивать количество терапевтически активных клонов клеток у пациента.
Одним из потенциальных способов дальнейшего улучшения клинической эффективности Т-клеток, модифицированных иммунорецепторами, является поддержка и модуляция указанных клеток с помощью цитокинов, которые влияют на выживаемость и функцию клеток. Следовательно, применение цитокинов, имеющих решающее значение для выживания, может свести к минимуму необходимость в сопутствующей жесткой лимфодеплецирующей терапии, такой как химио- или лучевая терапия, которая успешно используется для увеличения устойчивости адоптивно перенесенных Т-клеток (Maus, M. et al. Clin. Cancer Res. 22 (8), 1875-1884 (2016)), путем установки свободных сигналов выживания, таких как IL15 и IL7, в противном случае потребляемых резидентными иммунными клетками (Gattinoni, L. et al. J. Exp. Med. 202, 907-12 (2005)). Более того, терапевтический потенциал перенесенных клеток может быть увеличен путем одновременного введения соответствующих цитокинов. Например, интерлейкин-2 (IL2) является мощным иммуностимулятором, активирующим различные клетки иммунной системы. Известно, что IL2 поддерживает дифференцировку, пролиферацию, выживание и эффекторные функции Т-клеток и NK-клеток (Blattman, JN et al. Nat. Med. 9, 540-7 (2003)) и десятилетиями используется для лечения злокачественной меланомы на поздней стадии (Maas, RA, Dullens, HF & Den Otter, W. Cancer Immunol. Immunother. 36, 141-8 (1993)).
Однако существует несколько проблем, связанных с введением цитокинов для поддержки АСТ:
(1) Рекомбинантные цитокины имеют очень короткий период полужизни в плазме, что вызывает необходимость часто вводить большие количества цитокинов. В случае IL2 это приводит к серьезным побочным эффектам, таким как синдром повышенной проницаемости сосудов (VLS) (Rosenberg, S. A. et al. N. Engl. J. Med. 316, 889-97 (1987)).
(2) Иммунные клетки обычно конкурируют за сигналы выживания. Следовательно, введенные цитокины потребляются и влияют как на резидентные иммунные клетки, так и на перенесенные клетки. Поскольку перенесенные клетки составляют меньшинство, пострадают в основном резидентные иммунные клетки. Это не только ограничивает эффективность цитокинов для АСТ, но также требует сопутствующей лимфоаблативной терапии (Gattinoni, L. et al. J. Exp. Med. 202, 907-12 (2005)).
(3) Введение цитокинов может вызвать нежелательные эффекты в отношении резидентных иммунных клеток. Например, IL2 известен своей способностью стимулировать регуляторные Т-клетки (Treg) более эффективно, чем эффекторные Т-клетки (Todd, JA et al. PLoS Med. 13, e1002139 (2016)), поскольку высокоаффинный рецептор IL2 (IL2Rαβγ), состоящий из CD25 (IL2Rα), CD122 (IL2Rβ) и CD132 (IL2Rγ), экспрессируется на Treg, а также на активированных CD4+ и CD8+ Т-клетках, в то время как рецептор промежуточной аффинности (IL2Rβγ), в котором отсутствует CD25, преобладает у наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, а также NK-клеток. Treg коррелируют со снижением выживаемости онкологических больных, поскольку они могут подавлять функцию противоопухолевых эффекторных Т-клеток и NK-клеток (Nishikawa, H. & Sakaguchi. Curr. Opin. Immunol. 27, 1-7 (2014)). Было показано, что попытки изменить IL2 таким образом, чтобы он терял предпочтение в отношении экспрессирующих CD25 клеток, тем самым относительно увеличивая стимулирующий потенциал наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, а также NK-клеток, улучшали его противоопухолевый потенциал (Arenas-Ramirez, N. et al., Sci. Transl. Med. 8, 1-13 (2016)).
Ясно, что существует потребность в новых стратегиях повышения эффективности иммунотерапии, в частности, клеточной иммунотерапии рака, такой как лечение на основе аутологичных TIL или TCR- или CAR-трансгенных Т-клеток и/или вакцин, в частности противораковых вакцин. Чтобы устранить ограничения, возникающие при сочетании ACT или перепрограммирования in vivo иммунных клеток с цитокиновой терапией, в настоящей заявке мы предлагаем наборы из вариантов IL2R, в частности вариантов α-субъединицы IL2R, и вариантов IL2. Описанные здесь варианты IL2 предпочтительно активируют клетки, которые экспрессируют соответствующую вариантную α-субъединицу IL2R, по сравнению с клетками, которые экспрессируют α-субъединицу IL2R дикого типа. Адоптивно перенесенные эффекторные иммунные клетки или генетически модифицированные иммунные эффекторные клетки in vivo, несущие вариантный IL2R, избирательно нацелены на соответствующий вариант IL2, в то время как нецелевые эффекты в отношении немодифицированных иммунных клеток хозяина ограничены. Следовательно, новые пары вариантов IL2 и IL2R обладают способностью сильно модулировать выживаемость и эффекторную функцию перенесенных клеток, что приводит к повышению терапевтической эффективности.
Изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении представлены новые пары вариантов IL2 и IL2R. В частности, описаны варианты IL2, которые содержат мутации, влияющие на связывание CD25 («mutCD25»). Соответствующие варианты IL2Rα компенсируют нарушенное связывание CD25 вариантов IL2. Было высказано предположение, что нарушение взаимодействий IL2 с IL2Rα посредством соответствующей модификации специфических связывающих остатков на поверхности связывания IL2 предотвращает эффективное связывание (и, следовательно, активацию) с клетками, экспрессирующими IL2Rαβγ. Однако на клетках, экспрессирующих IL2Rαβγ, содержащих соответствующую вариантную α-субъединицу IL2R, будет происходить связывание с клетками (и, таким образом, их активация). Ожидается, что вариант IL2, способный избирательно активировать IL2Rαβγ, содержащий соответствующий вариант α-субъединицы IL2R, на иммунных эффекторных клетках, например, Т-клетках, таких как Т-клетки памяти, наивные Т-клетки и эффекторные Т-клетки, а также NK-клетки, в предпочтении к клеткам, экспрессирующим IL2Rαβγ дикого типа, будет иметь улучшенный терапевтический индекс по сравнению с IL2 дикого типа и уменьшенный профиль токсичности. Вариант IL2 с улучшенным терапевтическим индексом будет иметь значительно расширенный диапазон применения при лечении расстройств, требующих стимуляции иммунной системы, например, при лечении рака (в качестве прямой и/или дополнительной терапии). В частности, применение РНК вариантного IL2 является многообещающим подходом для повышения терапевтической эффективности множественных иммунотерапевтических средств на основе Т- и NK-клеток (для лечения рака).
Иммунные эффекторные клетки, несущие описанный здесь вариантный IL2R, могут быть получены in vitro и впоследствии введены субъекту, нуждающемуся в лечении, или могут быть созданы in vivo у субъекта, нуждающегося в лечении. Введение субъекту соответствующего варианта IL2, полинуклеотида, кодирующего соответствующий вариант IL2, или клетки-хозяина, генетически модифицированной для экспрессии соответствующего варианта IL2, позволяет осуществлять специфическую стимуляцию иммунных эффекторных клеток со сконструированным рецептором. Описанные здесь способы и агенты, в частности, полезны для лечения заболеваний, характеризующихся патологическими клетками, экспрессирующими антиген, на который направлены иммунные эффекторные клетки. В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки несут рецептор антигена, такой как Т-клеточный рецептор (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), обладающий специфичностью связывания с антигеном или продуктом его процессирования. В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки присутствуют у субъекта, которого лечат, и генетически модифицированы in vivo у субъекта для экспрессии рецепторного полипептида, описанного в настоящей заявке. В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки либо от субъекта, подлежащего лечению, либо от другого субъекта вводят субъекту, которого лечат. Введенные иммунные эффекторные клетки могут быть генетически модифицированы ex vivo перед введением или генетически модифицированы in vivo у субъекта после введения для экспрессии рецепторного полипептида, описанного в настоящей заявке. В одном варианте осуществления рецептор антигена является эндогенным для иммунных эффекторных клеток. В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки генетически модифицированы ex vivo или in vivo для экспрессии рецептора антигена. Таким образом, такая генетическая модификация с помощью рецептора антигена может быть осуществлена in vitro (при необходимости вместе с генетической модификацией полипептидов рецептора IL2, описанных в настоящей заявке), и впоследствии иммунные эффекторные клетки вводят субъекту, нуждающемуся в лечении, или они могут быть получены in vivo (при необходимости вместе с генетической модификацией полипептидами рецептора IL2, описанными здесь) у субъекта, нуждающегося в лечении. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение в целом охватывает лечение заболеваний путем направленной доставки в клетки, экспрессирующие антиген, такие как патологические клетки, в частности раковые клетки, экспрессирующие опухолевый антиген. Клетки-мишени могут экспрессировать антиген на поверхности клетки или могут презентировать продукт процессирования антигена. В одном из вариантов осуществления антиген представляет собой антиген, ассоциированный с опухолью, и заболевание представляет собой рак. Такое лечение обеспечивает избирательное уничтожение клеток, которые экспрессируют антиген, тем самым сводя к минимуму неблагоприятные воздействия на нормальные клетки, не экспрессирующие антиген. В одном варианте осуществления вакцинный антиген или кодирующий его полинуклеотид вводят для обеспечения (при необходимости после экспрессии полинуклеотида соответствующими клетками-мишенями) антигена для стимуляции, праймирования и/или размножения иммунных эффекторных клеток, где иммунные эффекторные клетки (при необходимости генетически модифицированные для экспрессии рецептора антигена) нацелены на антиген или продукт его процессирования, и иммунный ответ представляет собой иммунный ответ на популяцию клеток-мишеней или ткань-мишень, экспрессирующую антиген. В одном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий вакцинный антиген, представляет собой РНК. Иммунные эффекторные клетки, такие как Т-клетки, стимулированные, праймированные и/или размноженные у пациента, способны распознавать клетки, экспрессирующие антиген, что приводит к уничтожению патологических клеток. Описанные здесь способы и агенты особенно эффективны, если РНК, кодирующая варианты IL2, нацелена на печень для системной доступности. Клетки печени можно эффективно трансфицировать, и они способны продуцировать большое количество белка. Кодирующая антиген РНК предпочтительно нацелена на вторичные лимфоидные органы.
Соответственно, один аспект относится к системам из альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2Rα) и вариантов интерлейкина-2 (IL2) для специфической активации иммунных эффекторных клеток при лечении заболеваний, при которых такие иммунные эффекторные клетки могут быть эффективными, таких как рак, включая солидные опухоли, но не ограничиваясь ими. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к стратегии адоптивного переноса клеток, таких как Т-клетки, трансдуцированные для экспрессии CAR. CAR представляют собой молекулы, которые сочетают в себе специфичность в отношении необходимого антигена (например, опухолевого антигена), которая предпочтительно основана на антителах, с внутриклеточным доменом, активирующим Т-клеточный рецептор, для образования химерного белка, который проявляет специфическую клеточную иммунную активность (например, специфическую противоопухолевую клеточную иммунную активность). Предпочтительно клетка может быть генетически модифицирована для стабильной экспрессии CAR (и полипептида рецептора IL2, описанного в настоящей заявке) на своей поверхности, что придает новую антигенную специфичность, не зависящую от MHC. Т-клетки, экспрессирующие CAR, называются здесь CAR-Т-клетками или CAR-модифицированными Т-клетками.
Один аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в одном положении;
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин IL2 или функционального варианта IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в одном положении;
при этом замены таковы, что
(a) мутеин, указанный в пункте (ii), связывается и активирует IL2R, содержащий мутеин, указанный в пункте (i), в качестве альфа-субъединицы, и
(b) связывание и/или активация IL2R, содержащего мутеин из пункта (i) в качестве альфа-субъединицы, мутеином в соответствии с пунктом (ii) превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант в качестве альфа субъединицы, мутеином согласно пункту (ii).
В одном варианте осуществления связывание и/или активация IL2R, содержащего мутеин по пункту (i) в качестве альфа-субъединицы, мутеином по пункту (ii) превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего мутеин по пункту (i) в качестве альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом. В одном варианте осуществления связывание и/или активация IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант в качестве альфа-субъединицы, посредством IL2 или его функционального варианта превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант, мутеином согласно пункту (ii). В одном варианте осуществления связывание и/или активация IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант в качестве альфа-субъединицы, посредством IL2 или его функционального варианта превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего мутеин в соответствии с пунктом (i) в качестве альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом.
В одном варианте осуществления система согласно изобретению включает:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы IL2R или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении, содержащем кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа и/или замещены по меньшей мере в положении, содержащем основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, где, если аминокислотный остаток представляет собой кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток, а если аминокислотный остаток является основным аминокислотным остатком в альфа-субъединице IL2R дикого типа, замену осуществляют кислым аминокислотным остатком;
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин IL2 или функционального варианта IL2, в котором, когда альфа-субъединицу IL2R или его функциональный вариант замещают по меньшей мере в положении, содержащем кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, IL2 или его функциональный вариант замещают по меньшей мере по указанному основному аминокислотному остатку в IL2 дикого типа, и/или когда альфа-субъединицу IL2R или его функционального варианта замещают по меньшей мере в положении, содержащем основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, IL2 или его функциональный вариант замещают по меньшей мере по указанному кислому аминокислотному остатку в IL2 дикого типа, при этом, если аминокислотный остаток является основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, замену осуществляют на кислый аминокислотный остаток, а если аминокислотный остаток является кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток.
В одном варианте осуществления система согласно изобретению включает:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении, содержащем кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа и/или замещены по меньшей мере в положении, содержащем основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, которое контактирует с кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, причем, если аминокислотный остаток является кислым аминокислотным остатком в альфа-субъединице IL2R дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток, а если аминокислотный остаток представляет собой основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, замену осуществляют на кислый аминокислотный остаток;
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин IL2 или функционального варианта IL2, в котором, когда альфа-субъединицу IL2R или его функционального варианта замещают по меньшей мере в положении, содержащем кислый аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, который контактирует с основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, IL2 или его функциональный вариант замещают по меньшей мере по указанному основному аминокислотному остатку в IL2 дикого типа и/или когда замещают альфа-субъединицу IL2R или его функционального варианта по меньшей мере в положении, содержащем основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа, которое контактирует с кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, IL2 или его функциональный вариант замещают по меньшей мере по указанному кислому аминокислотному остатку в IL2 дикого типа, при этом, если аминокислотный остаток является основным аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, замену осуществляют на кислый аминокислотный остаток, а если аминокислотный остаток является кислым аминокислотным остатком в IL2 дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток.
В одном варианте осуществления системы по настоящему изобретению альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R. В одном варианте системы по настоящему изобретению IL2 представляет собой человеческий IL2.
В различных вариантах осуществления человеческая альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант и человеческий IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в следующих положениях (относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа):
(i) IL2R или его функциональный вариант: положение 1 (глутаминовая кислота), и
IL2 или его функциональный вариант: положение 35 (лизин);
(ii) IL2R или его функциональный вариант: положение 29 (глутаминовая кислота), и
IL2 или его функциональный вариант: положение 43 (лизин);
(iii) IL2R или его функциональный вариант: положение 38 (лизин), и
IL2 или его функциональный вариант: положение 61 (глутаминовая кислота);
(iv) IL2R или его функциональный вариант: положение 1 (глутаминовая кислота),
IL2 или его функциональный вариант: положение 35 (лизин);
IL2R или его функциональный вариант: положение 29 (глутаминовая кислота), и
IL2 или его функциональный вариант: положение 43 (лизин);
(v) IL2R или его функциональный вариант: положение 1 (глутаминовая кислота),
IL2 или его функциональный вариант: положение 35 (лизин);
IL2R или его функциональный вариант: положение 38 (лизин), и
IL2 или его функциональный вариант: положение 61 (глутаминовая кислота);
(vi) IL2R или его функциональный вариант: положение 29 (глутаминовая кислота),
IL2 или его функциональный вариант: положение 43 (лизин);
IL2R или его функциональный вариант: положение 38 (лизин), и
IL2 или его функциональный вариант: положение 61 (глутаминовая кислота); или
(vii) IL2R или его функциональный вариант: положение 1 (глутаминовая кислота),
IL2 или его функциональный вариант: положение 35 (лизин);
IL2R или его функциональный вариант: положение 29 (глутаминовая кислота),
IL2 или его функциональный вариант: положение 43 (лизин);
IL2R или его функциональный вариант: положение 38 (лизин), и
IL2 или его функциональный вариант: положение 61 (глутаминовая кислота).
IL2R или его функциональный вариант: в одном варианте осуществления положение 1 замещено лизином. В одном варианте осуществления положение 29 замещено лизином. В одном варианте осуществления положение 38 замещено глутаминовой кислотой.
IL2 или его функциональный вариант: в одном варианте осуществления положение 35 замещено глутаминовой кислотой. В одном варианте осуществления положение 43 замещено глутаминовой кислотой. В одном варианте осуществления положение 61 замещено лизином.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 1 (глутаминовая кислота) относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R а дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерован в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления положение 1 замещено лизином. В одном варианте осуществления положение 35 замещено глутаминовой кислотой.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления положение 29 замещено лизином. В одном варианте осуществления положение 43 замещено глутаминовой кислотой.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 38 (лизин) относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 61 (глутаминовая кислота) относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления положение 38 замещено глутаминовой кислотой. В одном варианте осуществления положение 61 замещено лизином.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный варианта замещены по меньшей мере в положении 1 (глутаминовая кислота) на лизин, в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин, и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) на глутаминовую кислоту, в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный варианта замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) на глутаминовую кислоту, в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) на глутаминовую кислоту, в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерован в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, и альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления системы изобретения:
(i) альфа-субъединица IL2R представляет собой человеческую альфа-субъединицу IL2R, а альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 1 (глутаминовая кислота) на лизин, в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) IL2 представляет собой человеческий IL2, и IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 человека (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R человека, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 1 (глутаминовая кислота) на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) на кислый аминокислотный остаток, относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления положение 1 замещено на лизин. В одном варианте осуществления положение 35 замещено на глутаминовую кислоту.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на кислый аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления положение 29 замещено на лизин. В одном варианте осуществления положение 43 замещено на глутаминовую кислоту.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 38 (лизин) на кислый аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 61 (глутаминовая кислота) на основной аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления положение 38 замещено на глутаминовую кислоту. В одном варианте осуществления положение 61 замещено на лизин.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 1 (глутаминовая кислота) на лизин, в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) на глутаминовую кислоту, в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту, и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) на глутаминовую кислоту, в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 35 (лизин) на глутаминовую кислоту, в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту, и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
Следующий аспект изобретения относится к системе, включающей:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 1 (глутаминовая кислота) на лизин, в положении 29 (глутаминовая кислота) на лизин, и в положении 38 (лизин) на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где IL2 или его функциональный вариант замещены по меньшей мере в положении 43 (лизин) на глутаминовую кислоту и в положении 61 (глутаминовая кислота) на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и пронумерован в соответствии с человеческим IL2 дикого типа.
В различных вариантах осуществления каждая альфа-субъединица IL2R или ее функциональный вариант и/или IL2 или его функциональный вариант замещены в одном или более, например в двух или более, или трех или более, например, в 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 положениях, в частности положениях, содержащих кислый или основной аминокислотный остаток в альфа-субъединице IL2R дикого типа и/или IL2 дикого типа, где соответствующими положениями в альфа-субъединице IL2R дикого типа и/или IL2 дикого типа являются положения, образующие пары кислых/ основных аминокислот, контактирующие друг с другом. В одном варианте осуществления кислый аминокислотный остаток в IL2 дикого типа контактирует с основным аминокислотным остатком в альфа-субъединице IL2R. В одном варианте осуществления основной аминокислотный остаток в IL2 дикого типа контактирует с кислым аминокислотным остатком в альфа-субъединице IL2R.
В одном варианте осуществления системы любого аспекта изобретения альфа-субъединица IL2R имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2.
В одном варианте осуществления системы любого аспекта изобретения IL2 имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления мутеин по пункту (ii) связывается и активирует IL2R, содержащий мутеин по пункту (i) в качестве альфа-субъединицы. В одном варианте осуществления связывание и/или активация IL2R, содержащего мутеин по пункту (i) в качестве альфа-субъединицы, мутеином в соответствии с пунктом (ii) превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или его функционального варианта в качестве альфа-субъединицы, мутеином по пункту (ii). В одном варианте осуществления связывание и/или активация IL2R, содержащего мутеин по пункту (i) в качестве альфа-субъединицы, мутеином по пункту (ii) превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего мутеин по пункту (i) в качестве альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом. В одном варианте осуществления связывание и/или активация IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант в качестве альфа-субъединицы, посредством IL2 или его функционального варианта превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант, в качестве альфа-субъединицы, мутеином согласно пункту (ii). В одном варианте осуществления связывание и/или активация IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или ее функциональный вариант в качестве альфа-субъединицы, посредством IL2 или его функционального варианта превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего мутеин в соответствии с пунктом (i) в качестве альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом.
В одном варианте осуществления системы любого аспекта изобретения замена в IL2 или его функциональном варианте снижает аффинность к IL2R, содержащему альфа-субъединицу IL2R дикого типа в качестве альфа-субъединицы (IL2Rαβγ).
В одном варианте осуществления системы из любого аспекта изобретения замена в IL2 или его функциональном варианте снижает аффинность к IL2R, содержащему альфа-субъединицу IL2R дикого типа в качестве альфа-субъединицы (IL2Rαβγ), в большей степени, чем для рецепторного комплекса βγ-IL2 (IL2Rβγ).
В одном варианте осуществления системы из любого аспекта изобретения мутеин по пункту (ii) имеет пониженную способность к стимуляции регуляторных Т-клеток по сравнению с IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления описанный выше замещенный IL2 или его функциональный вариант (мутеин IL2) имеет аминокислотную последовательность, идентичную IL2 дикого типа по другим незамещенным остаткам. В одном варианте осуществления описанный выше мутеин IL2 имеет аминокислотные модификации, такие как аминокислотные замены в одном или нескольких сайтах в других остатках IL2 дикого типа. В одном варианте осуществления такие замены аминокислот приводят к относительно повышенной аффинности к IL2Rβγ по сравнению с IL2 дикого типа (также называемые здесь мутациями «mutβγ»). Такие мутанты являются сильными агонистами передачи сигнала IL2. В одном варианте осуществления такие аминокислотные замены находятся в аминокислотных остатках, которые связываются с IL2Rβ и/или IL2Rγ.
В одном варианте осуществления одна или несколько аминокислотных замен, которые увеличивают аффинность к IL2Rβγ, включают замены в одном или нескольких положениях IL2, выбранных из группы, состоящей из K9, L12, Q13, E15, H16, D20, Q74, L80, R81, D84, L85, I86, N88, I92, L94 и E95.
В одном варианте осуществления одна или несколько аминокислотных замен, которые увеличивают аффинность к IL2Rβγ, включают замену по меньшей мере в одном из положений 24, 65, 74, 80, 81, 85, 86, 89, 92 и 93 относительно человеческого IL2 дикого типа и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа. Замещенный (замещенные) аминокислотный (аминокислотные) остаток (остатки) может представлять собой консервативную замену, но не обязательно. Например, мутация может быть: I24V, P65H, Q74R, Q74H, Q74N, Q74S, L80F, L80V, R81I, R81T, R81D, L85V, I86V, I89V, I92F, V93I.
В одном варианте осуществления мутеин IL2 содержит следующий набор аминокислотных замен: 80F/81D/85V/86V/92F. Мутеин IL2 может дополнительно содержать аминокислотную замену 42A. Мутеин IL2 может дополнительно содержать одну или несколько из следующих аминокислотных замен: 24V, 65H, 74R, 74H, 74N, 74S, 89V, 93I.
В некоторых вариантах осуществления мутеин IL2 содержит набор аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из:
(i) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F;
(ii) 74H, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iii) 74S, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iv) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(v) 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(vi) 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I;
(vii) 18R, 22E, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T;
(viii) 18R, 22E, 74S, 80F, 81T, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T.
В одном варианте осуществления системы по любому аспекту изобретения мутеин по пункту (ii) дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, которые увеличивают аффинность к IL2Rβγ. В одном варианте осуществления одна или несколько аминокислотных замен, которые увеличивают аффинность к IL2Rβγ, включают следующий набор замен: 80F, 81D, 85V, 86V, 92F.
Описанный в настоящей заявке мутеин IL2 может быть присоединен к группе, модифицирующей фармакокинетику, и, таким образом, может быть «IL2 с пролонгированной фармакокинетикой (ФК)». В одном аспекте лигандный полипептид, описанный в настоящей заявке, представляет собой IL2 с пролонгированной фармакокинетикой (ФК), дополнительно содержащий аминокислотную последовательность, которая является гетерологичной для IL2 или его функционального варианта, слитую с мутеином IL2. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность, которая является гетерологичной для IL2 или его функционального варианта, выбрана из группы, состоящей из сывороточного альбумина, фрагмента иммуноглобулина, трансферрина и Fn3, или их вариантов. В одном варианте осуществления сывороточный альбумин включает сывороточный альбумин мыши или сывороточный альбумин человека. В одном варианте осуществления фрагмент иммуноглобулина включает Fc-домен иммуноглобулина.
В одном варианте осуществления системы из любого аспекта изобретения лигандный полипептид представляет собой полипептид с пролонгированной фармакокинетикой (ФК). В одном варианте осуществления полипептид с пролонгированной ФК включает слитый белок. В одном варианте осуществления слитый белок содержит компонент из мутеина по пункту (ii) и компонент, который является гетерологичным для IL2 или его функционального варианта. В одном варианте осуществления слитый белок содержит компонент из мутеина по пункту (ii) и компонент, выбранный из группы, состоящей из сывороточного альбумина, фрагмента иммуноглобулина, трансферрина, Fn3 и их вариантов. В одном варианте осуществления сывороточный альбумин включает сывороточный альбумин мыши или сывороточный альбумин человека. В одном варианте осуществления фрагмент иммуноглобулина включает Fc-домен иммуноглобулина.
Вышеописанные рецепторные полипептиды также называются в настоящей заявке «вариантный полипептид IL2Rα», «вариантный полипептид IL2R» или просто «вариант IL2R». Вышеописанные лигандные полипептиды также называются здесь «вариантный полипептид IL2» или просто «вариант IL2».
В различных вариантах осуществления система, описанная в настоящей заявке, содержит комбинации рецепторных полипептидов и лигандных полипептидов, включающих рецепторные полипептиды IL2R и лигандные полипептиды IL2, соответственно, выбранные из следующего:
Следующий аспект изобретения относится к рецепторному полипептиду любой из описанных здесь систем.
Следующий аспект изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему рецепторный полипептид, описанный в настоящей заявке. В одном варианте осуществления полинуклеотид представляет собой РНК.
Следующий аспект изобретения относится к клетке-хозяину, включающей полинуклеотид, описанный в настоящей заявке. Следующий аспект изобретения относится к клетке-хозяину, генетически модифицированной для экспрессии рецепторного полипептида любой из описанных здесь систем. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой иммунную эффекторную клетку. В одном варианте осуществления эффекторная иммунная клетка представляет собой Т-клетку.
Следующий аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей описанный здесь полинуклеотид или описанную здесь клетку-хозяин. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или наполнителей.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения субъекта, включающему введение субъекту полинуклеотида, описанного в настоящей заявке, клетки-хозяина, описанной в настоящей заявке, или фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке. В одном варианте осуществления способ представляет собой способ лечения или профилактики рака у субъекта.
Следующий аспект изобретения относится к медицинскому препарату, включающему:
(i) полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид системы, описанной в настоящей заявке, или иммунную эффекторную клетку, генетически модифицированную для экспрессии рецепторного полипептида системы, описанной в настоящей заявке, и
(ii) соответствующий лигандный полипептид из системы по пункту (i), полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид, или клетку-хозяин, генетически модифицированную для экспрессии лигандного полипептида.
В одном варианте осуществления медицинский препарат представляет собой набор. В одном варианте осуществления медицинский препарат содержит каждый из компонентов (i) и (ii) в отдельных контейнерах. В одном варианте осуществления компоненты присутствуют в фармацевтической композиции. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или наполнителей. В одном варианте осуществления медицинский препарат дополнительно содержит инструкции по применению медицинского препарата для лечения или профилактики рака.
Следующий аспект изобретения относится к описанному в настоящей заявке медицинскому препарату для фармацевтического применения. В одном варианте осуществления фармацевтическое применение включает терапевтическое или профилактическое лечение заболевания или расстройства.
Следующий аспект изобретения относится к описанному в настоящей заявке медицинскому препарату для использования в способе лечения или профилактики рака у субъекта.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения субъекта, включающему:
(i) предоставление субъекту иммунных эффекторных клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида системы, описанной в настоящей заявке, и
(ii) введение субъекту соответствующего лигандного полипептида системы согласно пункту (i), полинуклеотида, кодирующего лигандный полипептид, или клетки-хозяина, генетически модифицированной для экспрессии лигандного полипептида.
В одном варианте осуществления субъект болен раком.
В одном варианте осуществления способ представляет собой способ индукции иммунного ответа у указанного субъекта. В одном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой иммунный ответ, опосредованный Т-клетками.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения субъекта, имеющего заболевание, расстройство или состояние, связанное с экспрессией или повышенной экспрессией антигена, включающему:
(i) предоставление субъекту иммунных эффекторных клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида системы, описанной в настоящей заявке, при этом эффекторные иммунные клетки нацелены на антиген или клетки, экспрессирующие антиген, и
(ii) введение субъекту соответствующего лигандного полипептида системы по пункту (i), полинуклеотида, кодирующего лигандный полипептид, или клетки-хозяина, генетически модифицированной для экспрессии лигандного полипептида.
В одном варианте осуществления заболевание, расстройство или состояние представляет собой рак, и антиген представляет собой антиген, ассоциированный с опухолью.
В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторного полипептида, предоставляют субъекту путем введения иммунных эффекторных клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида, или путем генерации иммунных эффекторных клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида у субъекта.
В одном варианте осуществления описанный в настоящей заявке способ представляет собой способ лечения или профилактики рака у субъекта. В одном варианте осуществления рак выбран из группы, состоящей из меланомы, лейкоза, лимфомы, рака легкого, рака молочной железы, рака простаты, рака яичника, рака толстой кишки, мезотелиомы, почечно-клеточного рака и рака головного мозга.
В одном варианте осуществления медицинского препарата или способа, описанного в настоящей заявке, полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид и/или полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид, представляет собой РНК.
В одном варианте осуществления медицинского препарата РНК присутствует в форме, выбранной из жидкой формы, твердой формы или их комбинации. В одном варианте осуществления твердая форма представляет собой замороженную форму или дегидратированную форму. В одном варианте осуществления дегидратированная форма представляет собой лиофилизированную форму или форму, высушенную распылением.
В одном варианте осуществления медицинского препарата или способа, описанных в настоящей заявке, иммунные эффекторные клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторного полипептида, содержат полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид.
В одном варианте осуществления медицинского препарата или способа, описанного в настоящей заявке, клетка-хозяин, генетически модифицированная для экспрессии лигандного полипептида, включает полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид.
В одном варианте осуществления медицинского препарата или способа, описанного в настоящей заявке, полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид и/или полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид, представляет собой РНК.
В одном варианте осуществления медицинского препарата или способа, описанных в настоящей заявке, эффекторные иммунные клетки представляют собой Т-клетки.
В одном варианте осуществления описанные в настоящей заявке способы дополнительно включают введение субъекту ингибитора иммунной контрольной точки. В одном варианте осуществления ингибитор иммунной контрольной точки нацелен на взаимодействие между (i) PD-1 и PD-L1 или (ii) CTLA-4 и CD80 или CD86. В одном варианте осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела нацелены на PD-1, PD-L1 или CTLA-4.
Аналогичным образом, в одном варианте осуществления описанный в настоящей заявке медицинский препарат дополнительно содержит ингибитор иммунной контрольной точки. В одном варианте осуществления ингибитор иммунной контрольной точки нацелен на взаимодействие между (i) PD-1 и PD-L1 или (ii) CTLA-4 и CD80 или CD86. В одном варианте осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела нацелены на PD-1, PD-L1 или CTLA-4.
В дополнительном аспекте изобретение относится к агентам и композициям, описанным в настоящей заявке, например, вариантам IL2R, вариантам IL2 или системам вариантов IL2R/IL2, описанным в настоящей заявке, к полинуклеотидам, кодирующим варианты IL2R, варианты IL2 или системы вариантов IL2R/IL2, описанные в настоящей заявке, к клеткам, экспрессирующим варианты IL2R, описанные в настоящей заявке, для терапевтического использования, в частности, для использования в способах, описанных в настоящей заявке.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Экспрессия in vitro и связывание IL2Rβγ вариантов hAlb-hIL2, кодируемых РНК. 1,2×106 клеток HEK293T/17 высевали в 6-луночные планшеты и после достижения конфлюэнтности примерно 80% проводили липофекцию с 3 мкг мРНК (400 нг мРНК в комплексе на мкл липофектамина MessengerMAX) в общем объеме 3,25 мл DMEM + 10% ФБР. После 20 часов инкубации при 37°C, 7,5% CO2 собирали надосадочную жидкость, и ее серийные разведения инкубировали с человеческой клеточной линией TF-1_IL2Rβγ, экспрессирующей рецептор IL2 промежуточной аффинности (IL2Rβγ). Пролиферационные ответы измеряли через три дня путем определения жизнеспособных клеток по количеству АТФ с использованием анализа CellTiter-Glo® 2.0. Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD) для n = 2 технических повторов. RLU = относительные единицы люминесценции.
Фигура 2: экспрессия in vitro мутантов hIL2RA (CD25), кодируемых РНК, в первичных CD8+ Т-клетках человека. Первичные CD8+ Т-клетки человека выделяли из РВМС с помощью технологии MACS с использованием анти-CD8 MicroBeads, и 10×106 CD8+ Т-клеток подвергали электропорации с 15 мкг мРНК, кодирующей мутанты hIL2RA (CD25), в 250 мкл X-Vivo15 в 4-мм кювете для электропорации при одном импульсе 500 В, 3 мс. После 20-24 часов инкубации при 37°C, 5% CO2, экспрессию мутантов hIL2RA (CD25) на клеточной поверхности проверяли проточной цитометрией с использованием мышиного антитела PerCP-Cy™ 5.5 против человеческого CD25. Показанные данные представляют собой значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) для одного измерения.
Фигура 3: Функциональная активность вариантов hAlb-hIL2 на естественно экспрессирующих CD25 CD4+CD25+ регуляторных Т-клетках по сравнению с CD8+ Т-клетками, электропорированными с hIL2RA (CD25), при измерении посредством IL2-опосредованного фосфорилирования STAT5. Кривые доза-ответ фосфорилирования STAT5 (pSTAT5) на CD4+CD25+ регуляторных T-клетках (A) и CD8+ T-клетках, трансфицированных hIL2RA (CD25) (B). РВМС и CD8+ Т-клетки, трансфицированные hIL2RA (CD25), инкубировали с серийными разведениями надосадочной жидкости, содержащей вариант hAlb-hIL2, и затем анализировали фосфорилирование STAT5 с помощью проточной цитометрии. Показанные данные соответствуют четырехпараметрической логарифмической аппроксимации для расчета значений EC50.
Фигуры 4, 5 и 6. Функциональная активность вариантов hAlb-hIL2 на CD8+ Т-клетках, электропорированных с различными мутантами hIL2RA (CD25), измеренная с помощью IL2-опосредованного фосфорилирования STAT5. Кривые доза-ответ фосфорилирования STAT5 (pSTAT5) на CD8+ Т-клетках, трансфицированных мутантами hIL2RA (CD25), показаны для hAlb-hIL2 (Фигура 4), hAlb-hIL2_A3 (Фигура 5, A), hAlb-hIL2_A4 (Фигура 5, B), hAlb-hIL2_A5 (Фигура 6, A) и hAlb-hIL2_A8 (Фигура 6, B). CD8+ Т-клетки инкубировали с серийными разведениями надосадочной жидкости, содержащей вариант hAlb-hIL2, и затем анализировали фосфорилирование STAT5 с помощью проточной цитометрии. Показанные данные взяты из одного репрезентативного эксперимента из четырех, и снабжены четырехпараметрической логарифмической аппроксимацией для расчета значений EC50.
Фигуры 7, 8, 9: Влияние вариантов hAlb-hIL2 in vitro на противоопухолевую эффективность CAR-перепрограммированных CD8+ Т-клеток, подвергнутых электропорации с различными мутантами hIL2RA (CD25).
Положительные по клаудину-6 (CLDN6), eGFP-трансгенные опухолевые сфероиды PA-1 культивировали совместно с CD8+ Т-клетками, электропорированными с IVT-мРНК, кодирующей мутанты hIL2RA (hIL2RA_mut1, hIL2RA_mut4 или hIL2RA дикого типа) и CLDN6-специфическими конструкциями CAR. Конструкцию CAR, специфичную для клаудина-18.2 (CLDN18.2), использовали в качестве отрицательного контроля (контрольный CAR). Совместное культивирование инициировали с субоптимальным соотношением эффектор/мишень 10:1, и проводили обработку 25% надосадочными жидкостями, содержащими соответствующие реципрокные варианты hAlb-hIL2 hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4 или hAlb в качестве контроля с n = 3 повторами на условие. Цитотоксичность, опосредованную CAR-Т-клетками, оценивали с течением времени с использованием сигнала флуоресценции опухолевых сфероидов в качестве суррогатного маркера жизнеспособности клеток в системе визуализации живых клеток Incucyte S3. Регистрировали общую площадь зеленого объекта каждого сфероида опухоли в трех экземплярах и нормализовали к соответствующей площади сфероида в начале совместного культивирования. Данные для каждой конструкции CAR (CLDN18.2 CAR 28ζ, CLDN6 CAR 28ζ и CLDN6 CAR BBζ) нанесены отдельно на Фигуре 7, Фигуре 8 и Фигуре 9, соответственно.
Подробное описание изобретения
Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными методологиями, протоколами и реагентами, описанными в настоящей заявке, поскольку они могут варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники.
Предпочтительно, чтобы используемые здесь термины были определены, как описано в «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», H.G.W. Leuenberger, B. Nagel и H. 
, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland (1995).
Практика настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, обычные методы химии, биохимии, клеточной биологии, иммунологии и методики рекомбинантной ДНК, которые объяснены в литературе в данной области техники (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены с конкретными вариантами осуществления, однако следует понимать, что они могут быть объединены любым способом и в любом количестве для создания дополнительных вариантов осуществления. Различные описанные примеры и варианты осуществления не должны толковаться как ограничение настоящего изобретения только явно описанными вариантами осуществления. Следует понимать, что это описание раскрывает и охватывает варианты осуществления, которые объединяют явно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов следует считать раскрытыми в этом описании, если контекст не указывает иное.
Термин «примерно» означает «приблизительно» или «около», и в контексте числового значения или диапазона, изложенного в настоящей заявке, в одном варианте осуществления означает ±20%, ±10%, ±5% или ±3% от указанного или заявленного числового значения или диапазона.
Термины единственного числа и аналогичные ссылки, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, если в настоящей заявке не указано иное, или явно противоречит контексту. Перечисление диапазонов значений здесь просто предназначено для использования в качестве сокращенного метода индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон. Если здесь не указано иное, каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно указано здесь. Все способы, описанные в настоящей заявке, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящей заявке или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в настоящей заявке, предназначено просто для лучшей иллюстрации раскрытия и не накладывает ограничения на объем формулы изобретения. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент, существенный для практики изобретения.
Если специально не указано иное, термин «содержащий» используется в контексте настоящего документа для обозначения того, что дополнительные элементы могут при необходимости присутствовать в дополнение к элементам списка, введенным словом «содержащий». Однако в качестве конкретного варианта осуществления настоящего изобретения предполагается, что термин «содержащий» охватывает возможность отсутствия дополнительных элементов, т.е. для целей этого варианта осуществления «содержащий» следует понимать, как имеющий значение «состоящий из».
В тексте данного описания цитируется несколько документов. Каждый из цитируемых здесь документов (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), указанный выше или ниже, включен в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте. Ничто в настоящей заявке не должно толковаться как признание того, что настоящее раскрытие не имело права датировать такое раскрытие задним числом.
Далее будут предоставлены определения, которые применяются ко всем аспектам настоящего изобретения. Следующие термины имеют следующие значения, если не указано иное. Любые неопределенные термины имеют свое признанное значение.
Определения
Такие термины, как «снижать», «уменьшать», «ингибировать» или «ухудшать» в контексте настоящего описания относятся к общему снижению или способности вызывать общее снижение, предпочтительно на 5% или более, 10% или более, 20% или более, более предпочтительно на 50% или более, и наиболее предпочтительно на 75% или более, на уровне, например, на уровне связывания.
Такие термины, как «увеличить», «усилить» или «превышать», предпочтительно относятся к увеличению или усилению по меньшей мере примерно на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 500% или еще более.
Согласно описанию, термин «пептид» включает олигопептиды и относится к веществам, которые содержат примерно две или более, примерно 3 или более, примерно 4 или более, примерно 6 или более, примерно 8 или более, примерно 10 или более, примерно 13 или более, примерно 16 или более, примерно 20 или более, и примерно до 50, примерно 100 или примерно 150 последовательных аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Термин «белок» или «полипептид» относится к большим пептидам, в частности пептидам, имеющим по меньшей мере около 150 аминокислот, но термины «пептид», «белок» и «полипептид» используются здесь обычно как синонимы.
«Терапевтический белок» оказывает положительное или благоприятное действие на состояние или патологическое состояние субъекта, когда его предоставляют субъекту в терапевтически эффективном количестве. В одном варианте осуществления терапевтический белок обладает лечебными или паллиативными свойствами, и может быть применен для снижения, уменьшения, облегчения, регрессии, отсрочки наступления или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Терапевтический белок может обладать профилактическими свойствами и может быть использован для отсрочки начала заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Термин «терапевтический белок» включает полные белки или пептиды, а также может относиться к их терапевтически активным фрагментам. Он также может включать терапевтически активные варианты белка. Примеры терапевтически активных белков включают цитокины и антигены для вакцинации, но не ограничиваются ими.
«Фрагмент» со ссылкой на аминокислотную последовательность (пептид или белок) относится к части аминокислотной последовательности, то есть последовательности, которая представляет аминокислотную последовательность, укороченную на N-конце и/или C-конце. Фрагмент, укороченный на С-конце (N-концевой фрагмент), можно получить, например, путем трансляции усеченной открытой рамки считывания, в которой отсутствует 3'-конец открытой рамки считывания. Фрагмент, укороченный на N-конце (C-концевой фрагмент), можно получить, например, путем трансляции усеченной открытой рамки считывания, в которой отсутствует 5'-конец открытой рамки считывания, при условии, что усеченная открытая рамка считывания содержит стартовый кодон, который служит для инициации трансляции. Фрагмент аминокислотной последовательности включает, например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности. Фрагмент аминокислотной последовательности предпочтительно содержит по меньшей мере 6, в частности, по меньшей мере 8, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 100 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности.
Под «вариантом», «вариантным белком» или «вариантным полипептидом» в настоящей заявке подразумевается белок, который отличается от белка дикого типа на основании по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Исходный полипептид может быть природным полипептидом или полипептидом дикого типа (WT) или может быть модифицированной версией полипептида дикого типа. Предпочтительно вариантный полипептид имеет по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с исходным полипептидом, например, от 1 до примерно 20 модификаций аминокислот и предпочтительно от 1 до примерно 10 или от 1 до примерно 5 аминокислотных модификаций по сравнению с исходным полипептидом.
Под «исходным полипептидом», «исходным белком», «предшественником полипептида» или «предшественником» в контексте настоящего описания подразумевается немодифицированный полипептид, который впоследствии модифицируют для создания варианта. Исходный полипептид может быть полипептидом дикого типа, или вариантом или сконструированной версией полипептида дикого типа.
Под «диким типом», «WT» или «нативным» здесь подразумевается аминокислотная последовательность, которая встречается в природе, включая аллельные варианты. Белок или полипептид дикого типа имеет аминокислотную последовательность, которая не была намеренно модифицирована.
Для целей настоящего изобретения «варианты» аминокислотной последовательности (пептид, белок или полипептид) включает варианты с вставкой аминокислот, варианты с добавлением аминокислот, варианты с делецией аминокислот и/или варианты с заменой аминокислот. Термин «вариант» включает все варианты сплайсинга, посттрансляционно модифицированные варианты, конформации, изоформы и видовые гомологи, в частности те, которые экспрессируются клетками в естественных условиях. Термин «вариант» включает, в частности, фрагменты аминокислотной последовательности.
Варианты с вставкой аминокислот включают вставки одной, двух или более аминокислот в конкретную аминокислотную последовательность. В случае вариантов аминокислотной последовательности, имеющих вставку, один или несколько аминокислотных остатков вставляют в конкретный сайт в аминокислотной последовательности, хотя также возможна случайная вставка с соответствующим скринингом полученного продукта. Варианты добавления аминокислот включают слияния на амино- и/или карбокси-конце одной или нескольких аминокислот, таких как 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот. Варианты с делецией аминокислот характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности, например, с удалением 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот. Делеции могут находиться в любом положении белка. Варианты с делецией аминокислот, которые включают делецию на N-конце и/или C-конце белка, также называются вариантами с усечением на N-конце и/или C-конце. Варианты с аминокислотной заменой характеризуются тем, что по меньшей мере один остаток в последовательности удаляется и на его место вставляется другой остаток. Предпочтение отдается модификациям в положениях аминокислотной последовательности, которые не являются консервативными между гомологичными белками или пептидами, и/или замене аминокислот другими, имеющими аналогичные свойства. Предпочтительно, аминокислотные замены в пептидных и белковых вариантах представляют собой консервативные аминокислотные замены, то есть замены одинаково заряженных или незаряженных аминокислот. Консервативная аминокислотная замена включает замену одной из семейства аминокислот, которые являются схожими в своих боковых цепях. Природные аминокислоты обычно делятся на четыре семейства: кислые (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин), неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин) аминокислоты. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда вместе классифицируются как ароматические аминокислоты. В одном варианте осуществления консервативные аминокислотные замены включают замены в следующих группах:
глицин, аланин;
валин, изолейцин, лейцин;
аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота;
аспарагин, глутамин;
серин, треонин;
лизин, аргинин; и
фенилаланин, тирозин.
Термин «кислый аминокислотный остаток» предпочтительно относится к глутаминовой кислоте (глутамат, Glu) или аспарагиновой кислоте (аспартат, Asp), в частности к глутаминовой кислоте. Термин «основной аминокислотный остаток» предпочтительно относится к лизину (Lys) или аргинину (Arg), в частности к лизину.
Предпочтительно степень сходства, предпочтительно идентичности между данной аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью, которая является вариантом указанной данной аминокислотной последовательности, будет составлять по меньшей мере примерно 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%. Степень сходства или идентичности дается предпочтительно для аминокислотной области, которая составляет по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90% или примерно 100% от всей длины эталонной аминокислотной последовательности. Например, если эталонная аминокислотная последовательность состоит из 200 аминокислот, степень сходства или идентичности дается предпочтительно для по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 40, по меньшей мере примерно 60, по меньшей мере примерно 80, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 120, по меньшей мере примерно 140, по меньшей мере примерно 160, по меньшей мере примерно 180 или примерно 200 аминокислот, предпочтительно непрерывных аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления степень сходства или идентичности дана для всей длины эталонной аминокислотной последовательности. Выравнивание для определения сходства последовательностей, предпочтительно идентичности последовательностей, может быть выполнено с помощью известных в данной области инструментов, предпочтительно с использованием наилучшего выравнивания последовательностей, например, с помощью Align, с использованием стандартных настроек, предпочтительно EMBOSS:needle, Матрица: Blosum62, Открытие гэпа 10.0, Продолжение гэпа 0,5.
«Сходство последовательностей» указывает процент аминокислот, которые либо идентичны, либо представляют собой консервативные аминокислотные замены. «Идентичность последовательностей» между двумя аминокислотными последовательностями указывает процент аминокислот, которые идентичны между последовательностями.
Термин «процентная идентичность» предназначен для обозначения процентной доли идентичных аминокислотных остатков в двух сравниваемых последовательностях, полученных после наилучшего выравнивания, т.е. процент является чисто статистическим, а различия между двумя последовательностями распределены случайным образом по всей их длине. Сравнение последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями обычно проводят путем сравнения этих последовательностей после их оптимального выравнивания, причем упомянутое сравнение проводят по сегментам или «окну сравнения», чтобы идентифицировать и сравнивать локальные области сходства последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть произведено, помимо ручного, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, с помощью алгоритма локальной гомологии Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, с помощью метода поиска сходства Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, или с помощью компьютерных программ, использующих эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин).
Процент идентичности рассчитывают путем определения количества идентичных положений между двумя сравниваемыми последовательностями, деления этого числа на количество сравниваемых положений и умножения полученного результата на 100, чтобы получить процентную идентичность между этими двумя последовательностями.
Гомологичные аминокислотные последовательности проявляют в соответствии с изобретением по меньшей мере 40%, в частности по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичности аминокислотных остатков.
Описанные в настоящей заявке варианты аминокислотной последовательности могут быть легко получены специалистом в данной области техники, например, путем манипуляции с рекомбинантной ДНК. Манипуляции с последовательностями ДНК для получения пептидов или белков, содержащих замены, добавления, вставки или делеции, подробно описаны в Sambrook et al. (1989), например. Кроме того, описанные здесь пептидные и аминокислотные варианты могут быть легко получены с помощью известных методов синтеза пептидов, таких как, например, твердофазный синтез и аналогичные методы.
В одном варианте осуществления фрагмент или вариант аминокислотной последовательности (пептид или белок) предпочтительно представляет собой «функциональный фрагмент» или «функциональный вариант». Термин «функциональный фрагмент» или «функциональный вариант» аминокислотной последовательности относится к любому фрагменту или варианту, проявляющему одно или несколько функциональных свойств, идентичных или аналогичных свойствам аминокислотной последовательности, из которой он получен, т.е. он функционально эквивалентен. Что касается цитокинов, таких как IL2, одна конкретная функция представляет собой одну или несколько иммуномодулирующих активностей, проявляемых аминокислотной последовательностью, из которой происходит фрагмент или вариант, и/или связывание с рецептором (рецепторами) аминокислотной последовательности, из которой получен фрагмент или вариант. Что касается рецепторов цитокинов, таких как IL2R, одна конкретная функция представляет собой одну или несколько иммуномодулирующих активностей, проявляемых аминокислотной последовательностью, из которой происходит фрагмент или вариант, и/или связывание с лигандом (лигандами) аминокислотной последовательности, из которой получен фрагмент или вариант. Термин «функциональный фрагмент» или «функциональный вариант», используемый в настоящей заявке, в частности, относится к варианту молекулы или последовательности, которая содержит аминокислотную последовательность, которая изменена на одну или несколько аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью исходной молекулы или последовательности, и которая все еще способна выполнять одну или несколько функций исходной молекулы или последовательности, например, связываться с молекулой-мишенью или способствовать связыванию с молекулой-мишенью. В одном варианте осуществления модификации аминокислотной последовательности исходной молекулы или последовательности существенно не влияют или не изменяют характеристики связывания молекулы или последовательности. В различных вариантах осуществления связывание функционального фрагмента или функционального варианта может быть снижено, но все же значительно присутствовать, например, связывание функционального варианта может составлять по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% исходной молекулы или последовательности. Однако в других вариантах осуществления связывание функционального фрагмента или функционального варианта может быть усилено по сравнению с исходной молекулой или последовательностью.
Аминокислотная последовательность (пептид, белок или полипептид), «полученная из» обозначенной аминокислотной последовательности (пептида, белка или полипептида), относится к происхождению первой аминокислотной последовательности. Предпочтительно аминокислотная последовательность, происходящая от конкретной аминокислотной последовательности, имеет аминокислотную последовательность, которая идентична, по существу идентична или гомологична этой конкретной последовательности или ее фрагменту. Аминокислотные последовательности, полученные из конкретной аминокислотной последовательности, могут быть вариантами этой конкретной последовательности или ее фрагмента. Например, специалисту в данной области техники будет понятно, что антигены и цитокины (например, IL2), подходящие для использования в настоящей заявке, могут быть изменены таким образом, что они варьируют в последовательности из природных или нативных последовательностей, из которых они были получены, при сохранении необходимой активности нативных последовательностей.
Используемый в настоящей заявке термин «инструкционный материал» или «инструкции» включает публикацию, запись, диаграмму или любое другое средство для выражения, который можно использовать для сообщения о полезности композиций и способов по изобретению. Инструкционный материал из набора по настоящему изобретению может, например, быть прикреплен к контейнеру, который содержит композиции по настоящему изобретению, или может быть отправлен вместе с контейнером, который содержит композиции. В качестве альтернативы, инструкционный материал может быть доставлен отдельно от контейнера с целью, чтобы инструкционный материал и композиции использовались получателем совместно.
Термин «изолированный» означает измененный или извлеченный из естественного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, естественно присутствующие у живого животного, не «изолированы», но та же самая нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сосуществующих материалов в ее естественном состоянии, являются «изолированными». Изолированная нуклеиновая кислота или белок могут существовать в практически очищенной форме или могут существовать в ненативной среде, такой как, например, клетка-хозяин.
Термин «рекомбинантный» в контексте настоящего изобретения означает «полученный с помощью генной инженерии». Предпочтительно «рекомбинантный объект», такой как рекомбинантная клетка в контексте настоящего изобретения, не является природным.
Используемый в настоящей заявке термин «природный» относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые присутствуют в организме (включая вирусы) и могут быть выделены из природного источника, и которые не были намеренно модифицированы человеком в лаборатории, являются природными.
Используемый в настоящей заявке термин «лентивирус» относится к роду семейства Retroviridae. Лентивирусы уникальны среди ретровирусов тем, что способны инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительный объем генетической информации в ДНК клетки-хозяина, поэтому они являются одним из наиболее эффективных методов вектора доставки генов. ВИЧ, SIV и FIV являются примерами лентивирусов. Векторы, полученные из лентивирусов, предлагают средства для достижения значительных уровней переноса генов in vivo.
Под термином «специфически связывается» в контексте настоящего описания подразумевается молекула, такая как антитело или CAR, которая распознает конкретный антиген, но по существу не распознает или не связывает другие молекулы в образце или у субъекта. Например, антитело, которое специфически связывается с антигеном одного вида, может также связываться с этим антигеном одного или нескольких других видов. Но такая межвидовая реактивность сама по себе не меняет классификации антитела как специфического. В другом примере антитело, которое специфически связывается с антигеном, может также связываться с различными аллельными формами антигена. Однако такая перекрестная реактивность сама по себе не меняет классификации антитела как специфического. В некоторых случаях термины «специфическое связывание» или «специфически связывающийся» могут использоваться в отношении взаимодействия антитела, белка или пептида со вторым химическим веществом, что означает, что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) химического вещества; например, антитело распознает и связывается с конкретной структурой белка, а не с белками в целом. Если антитело специфично к эпитопу «А», присутствие молекулы, содержащей эпитоп «А» (или свободного немеченого «А»), в реакции, содержащей меченный «А» и антитело, снижает количество меченого А, связанного с антителом.
Термин «генетическая модификация» включает трансфекцию клеток нуклеиновой кислотой. Термин «трансфекция» относится к введению нуклеиновых кислот, в частности РНК, в клетку. Для целей настоящего изобретения термин «трансфекция» также включает введение нуклеиновой кислоты в клетку или поглощение нуклеиновой кислоты такой клеткой, при этом клетка может присутствовать у субъекта, например, пациента. Таким образом, согласно настоящему изобретению клетка для трансфекции описанной здесь нуклеиновой кислоты может присутствовать in vitro или in vivo, например, клетка может формировать часть органа, ткани и/или организма пациента. Согласно изобретению трансфекция может быть временной или стабильной. Для некоторых применений трансфекции достаточно, если трансфицированный генетический материал экспрессируется только временно. РНК можно трансфицировать в клетки для временной экспрессии кодируемого ею белка. Поскольку нуклеиновая кислота, введенная в процессе трансфекции, обычно не интегрируется в ядерный геном, чужеродная нуклеиновая кислота будет разбавляться посредством митоза или деградировать. Клетки, позволяющие выполнять эписомальную амплификацию нуклеиновых кислот, значительно снижают скорость разведения. Если необходимо, чтобы трансфицированная нуклеиновая кислота действительно оставалась в геноме клетки и ее дочерних клеток, должна происходить стабильная трансфекция. Такая стабильная трансфекция может быть достигнута с использованием систем на основе вирусов или систем на основе транспозонов для трансфекции. Обычно клетки, которые генетически модифицированы для экспрессии рецепторного полипептида и/или антигенного рецептора, стабильно трансфицируют нуклеиновой кислотой, кодирующей рецепторный полипептид и/или нуклеиновой кислотой, кодирующей рецептор антигена, при этом, как правило, нуклеиновую кислоту, кодирующую лигандный полипептид и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, временно трансфицируют в клетки.
Иммунные эффекторные клетки
Клетки, используемые в связи с настоящим изобретением, в которых нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), кодирующие полипептиды рецептора IL2, в частности IL2Rα, (при необходимости вместе с нуклеиновыми кислотами, кодирующими IL2Rβ и/или IL2Rγ), и при необходимости нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), кодирующие рецепторы антигена, могут быть введены, включают любую клетку, которая либо естественным образом, либо после трансфекции одним или несколькими полипептидами IL2R реагирует на IL2. Такая реактивность включает активацию, дифференцировку, пролиферацию, выживание и/или проявление одной или нескольких иммунных эффекторных функций. Клетки включают, в частности, иммунные эффекторные клетки, такие как клетки с литическим потенциалом, в частности, лимфоидные клетки, и предпочтительно представляют собой Т-клетки, в частности, цитотоксические лимфоциты, предпочтительно выбранные из цитотоксических Т-клеток, естественных киллеров (NK) и лимфокин-активированных киллерных клеток (LAK). После активации каждый из этих цитотоксических лимфоцитов запускает разрушение клеток-мишеней. Например, цитотоксические Т-клетки запускают разрушение клеток-мишеней одним или обоими из следующих способов. Во-первых, при активации Т-клетки выделяют цитотоксины, такие как перфорин, гранзимы и гранулизин. Перфорин и гранулизин создают поры в клетке-мишени, а гранзимы проникают в клетку и запускают каспазный каскад в цитоплазме, который вызывает апоптоз (запрограммированную смерть) клетки. Во-вторых, апоптоз может быть индуцирован посредством взаимодействия лиганда Fas-Fas между Т-клетками и клетками-мишенями. Клетки, используемые в связи с настоящим изобретением, предпочтительно являются аутологичными клетками, хотя можно использовать гетерологичные клетки или аллогенные клетки.
Термин «эффекторные функции» в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, которые приводят, например, к уничтожению патологических клеток, таких как опухолевые клетки, или к ингибированию роста опухоли и/или подавлению развития опухоли, включая подавление распространения опухоли и метастазирования. Предпочтительно эффекторные функции в контексте настоящего изобретения являются эффекторными функциями, опосредованными Т-клетками. Такие функции включают в случае хелперных Т-клеток (CD4+ Т-клеток) высвобождение цитокинов и/или активацию CD8+ лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток, а в случае CTL - элиминацию клеток, т.е. клеток, характеризующихся экспрессией антигена, например, посредством апоптоза или опосредованного перфорином лизиса клеток, продукцию цитокинов, таких как IFN-β и TNF-α, и специфическое цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих клеток-мишеней.
Термин «эффекторная иммунная клетка» или «иммунореактивная клетка» в контексте настоящего изобретения относится к клетке, которая выполняет эффекторные функции во время иммунной реакции. «Иммунная эффекторная клетка» в одном варианте осуществления способна связывать антиген, такой как антиген, представленный в контексте MHC на клетке или экспрессируемый на поверхности клетки и опосредующий иммунный ответ. Например, иммунные эффекторные клетки включают Т-клетки (цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, Т-клетки, инфильтрирующие опухоль), В-клетки, естественные киллерные клетки, нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Предпочтительно в контексте настоящего изобретения «иммунные эффекторные клетки» представляют собой Т-клетки, предпочтительно CD4+ и/или CD8+ Т-клетки. Согласно изобретению, термин «иммунная эффекторная клетка» также включает клетку, которая может созревать в иммунную клетку (такую как Т-клетка, в частности Т-хелперная клетка или цитолитическая Т-клетка) при подходящей стимуляции. Иммунные эффекторные клетки включают CD34+ гемопоэтические стволовые клетки, незрелые и зрелые Т-клетки, а также незрелые и зрелые В-клетки. Дифференцировка предшественников Т-клеток в цитолитические Т-клетки при воздействии антигена аналогична клональной селекции иммунной системы.
Предпочтительно «иммунная эффекторная клетка» распознает антиген с некоторой степенью специфичности, в частности, если он присутствует в контексте MHC или на поверхности патологических клеток, таких как раковые клетки. Предпочтительно указанное распознавание позволяет клетке, которая распознает антиген, быть отвечающей или реактивной. Если клетка является хелперной Т-клеткой (CD4+ Т-клеткой), такой ответ или реактивность может включать высвобождение цитокинов и/или активацию CD8+ лимфоцитов (CTL) и/или В-клеток. Если клетка представляет собой CTL, такая ответная реакция или реактивность может включать элиминацию клеток, то есть клеток, характеризующихся экспрессией антигена, например, посредством апоптоза или перфорин-опосредованного клеточного лизиса. Согласно изобретению, ответ CTL может включать устойчивый приток кальция, деление клеток, продукцию цитокинов, таких как IFN-и TNF-α, повышающую регуляцию маркеров активации, таких как CD44 и CD69, и специфическое цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих клеток-мишеней. Ответ CTL также может быть определен с использованием искусственного репортера, который точно указывает ответ CTL. Такие CTL, которые распознают антиген и являются отвечающими или реактивными, также называются здесь «антиген-реактивными CTL».
В одном варианте осуществления эффекторные иммунные клетки представляют собой экспрессирующие CAR иммунные эффекторные клетки. В одном варианте осуществления эффекторные иммунные клетки представляют собой иммунные эффекторные клетки, экспрессирующие TCR.
Иммунные эффекторные клетки, используемые в соответствии с изобретением, могут экспрессировать эндогенный рецептор антигена, такой как Т-клеточный рецептор или В-клеточный рецептор, или могут не проявлять экспрессии эндогенного рецептора антигена.
«Лимфоидная клетка» представляет собой клетку, которая, по возможности после подходящей модификации, например, после переноса рецептора антигена, такого как TCR или CAR, способна вызывать иммунный ответ, такой как клеточный иммунный ответ, или клетку-предшественник такой клетки, и включает лимфоциты, предпочтительно Т-лимфоциты, лимфобласты и плазматические клетки. Лимфоидная клетка может быть иммунной эффекторной клеткой, как описано в настоящей заявке. Предпочтительной лимфоидной клеткой является Т-клетка, которая может быть модифицирована для экспрессии рецептора антигена на поверхности клетки. В одном варианте осуществления лимфоидная клетка лишена эндогенной экспрессии Т-клеточного рецептора.
Термины «Т-клетка» и «Т-лимфоцит» используются здесь взаимозаменяемо и включают Т-хелперные клетки (CD4+ Т-клетки) и цитотоксические Т-клетки (CTL, CD8+ Т-клетки), которые включают цитолитические Т-клетки. Термин «антиген-специфическая Т-клетка» или аналогичные термины относятся к Т-клетке, которая распознает антиген, на который нацелена Т-клетка, и предпочтительно выполняет эффекторные функции Т-клеток. Т-клетки считаются специфичными к антигену, если они убивают клетки-мишени, экспрессирующие антиген. Специфичность Т-клеток может быть оценена с использованием любого из множества стандартных методов, например, с помощью анализа высвобождения хрома или анализа пролиферации. В качестве альтернативы можно измерить синтез лимфокинов (таких как IFN-γ).
Т-клетки принадлежат к группе белых кровяных клеток, известных как лимфоциты, и играют центральную роль в клеточном иммунитете. Их можно отличить от других типов лимфоцитов, таких как В-клетки и естественные киллерные клетки, по наличию на их клеточной поверхности специального рецептора, называемого Т-клеточным рецептором (TCR). Тимус - главный орган, ответственный за созревание Т-клеток. Было обнаружено несколько различных субпопуляций Т-клеток, каждая из которых выполняет свою функцию.
Т-хелперные клетки помогают другим лейкоцитам в иммунологических процессах, включая созревание В-клеток в плазматические клетки и активацию цитотоксических Т-клеток и макрофагов, среди других функций. Эти клетки также известны как CD4+ Т-клетки, потому что они экспрессируют гликопротеин CD4 на своей поверхности. Хелперные Т-клетки активируются при презентации пептидных антигенов молекулами MHC класса II, которые экспрессируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). После активации они быстро делятся и выделяют небольшие белки, называемые цитокинами, которые регулируют активный иммунный ответ или помогают ему.
Цитотоксические Т-клетки разрушают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки, а также участвуют в отторжении трансплантата. Эти клетки также известны как CD8+ Т-клетки, поскольку они экспрессируют гликопротеин CD8 на своей поверхности. Эти клетки распознают свои мишени путем связывания с антигеном, ассоциированным с MHC класса I, который присутствует на поверхности почти каждой клетки организма.
«Регуляторные Т-клетки» или «Treg» представляют собой субпопуляцию Т-клеток, которые модулируют иммунную систему, поддерживают толерантность к аутоантигенам и предотвращают аутоиммунные заболевания. Treg являются иммуносупрессивными и обычно подавляют или обеспечивают понижающую регуляцию индукции и пролиферации эффекторных Т-клеток. Tregs экспрессируют биомаркеры CD4, FoxP3 и CD25.
Используемый в настоящей заявке термин «наивные Т-клетки» относится к зрелым Т-клеткам, которые, в отличие от активированных Т-клеток или Т-клеток памяти, не встречались со своим когнатным антигеном на периферии. Наивные Т-клетки обычно характеризуются поверхностной экспрессией L-селектина (CD62L), отсутствием маркеров активации CD25, CD44 или CD69 и отсутствием изоформы памяти CD45RO.
Используемый в настоящей заявке термин «Т-клетки памяти» относится к подгруппе или субпопуляции Т-клеток, которые ранее встречались и отреагировали на свой когнатный антиген. При втором контакте с антигеном Т-клетки памяти могут воспроизводиться, чтобы вызвать более быстрый и сильный иммунный ответ, чем в первый раз, когда иммунная система ответила на антиген. Т-клетки памяти могут быть CD4+ или CD8+, и обычно экспрессируют CD45RO.
Все Т-клетки имеют Т-клеточный рецептор (TCR), существующий в виде комплекса нескольких белков. В большинстве Т-клеток активный Т-клеточный рецептор состоит из двух отдельных пептидных цепей, которые производятся из независимых генов альфа- и бета -Т-клеточного рецептора (TCRα и TCRβ) и называются α- и β-цепями TCR. Гораздо менее распространенная (2% от общего числа Т-клеток) группа Т-клеток, γδ Т-клетки (гамма-дельта-Т-клетки) обладают отличающимся Т-клеточным рецептором (TCR) на своей поверхности, который состоит из одной γ-цепи и одной δ-цепи.
Все Т-клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Гемопоэтические клетки-предшественники, происходящие из гемопоэтических стволовых клеток, заселяют тимус и размножаются путем деления клеток с образованием большой популяции незрелых тимоцитов. Самые ранние тимоциты не экспрессируют ни CD4, ни CD8, и поэтому классифицируются как дважды негативные (CD4-CD8-) клетки. По мере своего развития они становятся дважды позитивными тимоцитами (CD4+CD8+) и, наконец, созревают до одинарно-позитивных (CD4+CD8- или CD4-CD8+) тимоцитов, которые затем высвобождаются из тимуса в периферические ткани.
Т-клетки обычно можно получить in vitro или ex vivo с использованием стандартных процедур. Например, Т-клетки могут быть выделены из костного мозга, периферической крови, или фракции костного мозга или периферической крови млекопитающего, такого как пациент, с использованием коммерчески доступной системы разделения клеток. Альтернативно, Т-клетки могут быть получены от родственных или неродственных людей, животных, не относящихся к человеку, клеточных линий или культур. Образец, содержащий Т-клетки, может быть, например, мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС).
Используемый в настоящей заявке термин «NK-клетка» или «естественная киллерная клетка» относится к подгруппе лимфоцитов периферической крови, определяемой экспрессией CD56 или CD16 и отсутствием Т-клеточного рецептора. Как предусмотрено в настоящей заявке, NK-клетка также может быть дифференцирована от стволовой клетки или клетки-предшественника.
Нуклеиновые кислоты
Термин «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» в контексте настоящего описания предназначен для включения ДНК и РНК, таких как геномная ДНК, кДНК, мРНК, рекомбинантно полученные и химически синтезированные молекулы. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной. РНК включает РНК, транскрибированную in vitro (РНК IVT) или синтетическую РНК. Согласно изобретению, полинуклеотид предпочтительно является изолированным.
Нуклеиновые кислоты могут содержаться в векторе. Используемый в настоящей заявке термин «вектор» включает любые векторы, известные специалисту в данной области техники, включая плазмидные векторы, космидные векторы, фаговые векторы, такие как лямбда-фаг, вирусные векторы, такие как ретровирусные, аденовирусные или бакуловирусные векторы, или векторы искусственных хромосом, такие как бактериальные искусственные хромосомы (BAC), дрожжевые искусственные хромосомы (YAC) или искусственные хромосомы P1 (PAC). Указанные векторы включают векторы экспрессии, а также векторы клонирования. Векторы экспрессии включают плазмиды, а также вирусные векторы и обычно содержат необходимую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине (например, бактериях, дрожжах, растении, насекомых или млекопитающих) или в системах экспрессии in vitro. Клонирующие векторы обычно используют для конструирования и амплификации определенного необходимого фрагмента ДНК, и они могут не иметь функциональных последовательностей, требующихся для экспрессии необходимых фрагментов ДНК.
В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая вариант IL2, нуклеиновая кислота, кодирующая вариантный полипептид IL2R, нуклеиновая кислота, кодирующая рецептор антигена, или нуклеиновая кислота, кодирующая вакцинный антиген, экспрессируют в клетках субъекта, подвергающегося лечению, для получения варианта IL2, вариантного полипептида IL2R, рецептора антигена или вакцинного антигена. В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения нуклеиновую кислоту временно экспрессируют в клетках субъекта. Таким образом, в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота не интегрирована в геном клетки. В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения нуклеиновая кислота представляет собой РНК, предпочтительно РНК, транскрибируемую in vitro.
Описанные в настоящей заявке нуклеиновые кислоты могут быть рекомбинантными и/или изолированными молекулами.
В настоящем описании термин «РНК» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает рибонуклеотидные остатки. В предпочтительных вариантах осуществления РНК содержит все или большинство рибонуклеотидных остатков. Используемый в настоящей заявке термин «рибонуклеотид» относится к нуклеотиду с гидроксильной группой в 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. РНК включает без ограничения двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, изолированную РНК, такую как частично очищенная РНК, по существу чистую РНК, синтетическую РНК, рекомбинантную РНК, а также модифицированную РНК, которая отличается от природной РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут относиться к добавлению ненуклеотидного материала к нуклеотидам внутренней РНК или к концу (концам) РНК. Здесь также предполагается, что нуклеотиды в РНК могут быть нестандартными нуклеотидами, такими как химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Для настоящего описания эти измененные РНК считаются аналогами природной РНК.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения РНК представляет собой матричную РНК (мРНК), которая относится к транскрипту РНК, кодирующему пептид или белок. Как установлено в данной области техники, мРНК обычно содержит 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), область, кодирующую пептид, и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR). В некоторых вариантах осуществления РНК получают транскрипцией или химическим синтезом in vitro. В одном варианте осуществления мРНК получают транскрипцией in vitro с использованием матрицы ДНК, где ДНК относится к нуклеиновой кислоте, содержащей дезоксирибонуклеотиды.
В одном варианте осуществления РНК представляет собой РНК, транскрибируемую in vitro (IVT-РНК), и может быть получена путем транскрипции in vitro соответствующей матрицы ДНК. Промотор для контроля транскрипции может быть любым промотором любой РНК-полимеразы. Матрица ДНК для транскрипции in vitro может быть получена путем клонирования нуклеиновой кислоты, в частности кДНК, и введения ее в соответствующий вектор для транскрипции in vitro. кДНК может быть получена обратной транскрипцией РНК.
В одном варианте осуществления РНК может содержать модифицированные рибонуклеотиды. Примеры модифицированных рибонуклеотидов включают 5-метилцитидин, псевдоуридин и/или 1-метил-псевдоуридин, но не ограничиваются ими.
В некоторых вариантах осуществления РНК по настоящему изобретению содержит 5'-кэп. В одном варианте осуществления РНК из настоящего изобретения не содержит незащищенных 5'-трифосфатов. В одном варианте осуществления РНК может быть модифицирована аналогом 5'-кэпа. Термин «5'-кэп» относится к структуре, обнаруженной на 5'-конце молекулы мРНК, и обычно состоит из гуанозинового нуклеотида, соединенного с мРНК через 5'-5'-трифосфатную связь. В одном варианте осуществления этот гуанозин метилирован в 7 положении. Обеспечение РНК 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа может быть достигнуто с помощью транскрипции in vitro, при которой 5'-кэп котранскрипционно экспрессируется в цепи РНК, или может быть присоединен к РНК посттранскрипционно с использованием кэпирующих ферментов.
В некоторых вариантах осуществления РНК по настоящему изобретению содержит 5'-UTR и/или 3'-UTR. Термин «нетранслируемая область» или «UTR» относится к области в молекуле ДНК, которая транскрибируется, но не транслируется в аминокислотную последовательность, или к соответствующей области в молекуле РНК, такой как молекула мРНК. Нетранслируемая область (UTR) может присутствовать в 5' (выше расположенной) открытой рамке считывания (5'-UTR) и/или 3' (ниже расположенной) открытой рамке считывания (3'-UTR). 5'-UTR, если присутствует, располагается на 5'-конце перед стартовым кодоном области, кодирующей белок. 5'-UTR находится ниже 5'-кэпа (если присутствует), например, непосредственно примыкает к 5'-кэпу. 3'-UTR, если присутствует, расположен на 3'-конце, ниже терминирующего кодона области, кодирующей белок, но термин «3'-UTR» предпочтительно не включает поли(A) хвост. Таким образом, 3'-UTR находится выше последовательности поли(A) (если присутствует), например, непосредственно рядом с последовательностью поли(A).
В некоторых вариантах осуществления РНК по настоящему изобретению содержит 3'-поли(A) последовательность. Используемый в настоящей заявке термин «последовательность поли(А)» или «хвост поли-А» относится к непрерывной или прерывистой последовательности из аденилатных остатков, которая обычно расположена на 3'-конце молекулы РНК. Последовательности поли(A) известны специалистам в данной области техники и могут следовать за 3'-UTR в описанных здесь РНК. Последовательность поли(А) может иметь любую длину. В некоторых вариантах осуществления последовательность поли(A) включает или состоит из по меньшей мере из 20, по меньшей мере из 30, по меньшей мере из 40, по меньшей мере из 80 или по меньшей мере из 100, и до 500, до 400, до 300, до 200, или до 150 нуклеотидов, и в частности, примерно из 110 нуклеотидов.
В некоторых вариантах осуществления последовательность поли(A) состоит только из нуклеотидов A. В некоторых вариантах осуществления последовательность поли(A) по существу состоит из нуклеотидов A, но прерывается случайной последовательностью из четырех нуклеотидов (A, C, G и U), как раскрыто в WO 2016/005324 A1, включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Такая случайная последовательность может иметь длину от 5 до 50, от 10 до 30 или от 10 до 20 нуклеотидов. Кассета поли(А), присутствующая в кодирующей цепи ДНК, которая по существу состоит из нуклеотидов dA, но прерывается случайной последовательностью, имеющей равное распределение четырех нуклеотидов (dA, dC, dG, dT) и имеющей длину, например, 5-50 нуклеотидов, показывает на уровне ДНК постоянное размножение плазмидной ДНК в E. coli и все еще связана на уровне РНК с полезными свойствами в отношении поддержания стабильности РНК и эффективности трансляции.
В некоторых вариантах осуществления никакие нуклеотиды, кроме нуклеотидов А, не фланкируют последовательность поли(А) на ее 3'-конце, то есть последовательность поли(А) не замаскирована и не сопровождается на своем 3'-конце нуклеотидом, отличным от А.
В контексте настоящего изобретения термин «транскрипция» относится к процессу, в котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Впоследствии РНК может быть транслирована в пептид или белок.
«Кодирование» относится к неотъемлемому свойству специфических последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательность аминокислот и вытекающие из них биологические свойства. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, продуцируют белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в перечнях последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, может обозначаться как кодирующая белок или другой продукт этого гена или кДНК.
Используемый в настоящей заявке термин «эндогенный» относится к любому материалу из организма, клетки, ткани или системы, или производимому внутри них.
Используемый в настоящей заявке термин «экзогенный» относится к любому материалу, введенному или произведенному вне организма, клетки, ткани или системы.
Используемый в настоящей заявке термин «экспрессия» определяется как транскрипция и/или трансляция конкретной нуклеотидной последовательности.
В контексте настоящего описания термины «связанный», «слитый» или «гибридизованный» используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к объединению двух или более элементов, компонентов или доменов.
Цитокины
Цитокины представляют собой категорию небольших белков (~ 5-20 кДа), которые важны для передачи сигналов в клетке. Их высвобождение влияет на поведение клеток вокруг них. Цитокины участвуют в передаче аутокринных сигналов, паракринных сигналов и эндокринных сигналов в качестве иммуномодулирующих агентов. Цитокины включают хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины и факторы некроза опухоли, но обычно не гормоны или факторы роста (несмотря на некоторое совпадение терминологии). Цитокины продуцируются широким кругом клеток, включая иммунные клетки, такие как макрофаги, В-лимфоциты, Т-лимфоциты и тучные клетки, а также эндотелиальные клетки, фибробласты и различные стромальные клетки. Определенный цитокин может продуцироваться более чем одним типом клеток. Цитокины действуют через рецепторы и особенно важны для иммунной системы; цитокины модулируют баланс между гуморальными и клеточными иммунными ответами, и они регулируют созревание, рост и реакцию определенных популяций клеток. Некоторые цитокины комплексным образом усиливают или подавляют действие других цитокинов.
IL2 и IL2R
Интерлейкин-2 (IL2) представляет собой цитокин, который индуцирует пролиферацию антиген-активируемых Т-клеток и стимулирует естественные киллерные клетки (NK). Биологическая активность IL2 опосредуется многосубъединичным рецепторным комплексом IL2 (IL2R) из трех полипептидных субъединиц, которые проходят через клеточную мембрану: p55 (IL2Rα, альфа-субъединицы, также известной как CD25 у человека), p75 (IL2Rβ, бета-субъединицы, также известной как CD122 у человека) и p64 (IL2Rγ, гамма-субъединицы, также известной как CD132 у человека). Ответ Т-клеток на IL2 зависит от множества факторов, включая: (1) концентрацию IL2; (2) количество молекул IL2R на поверхности клетки; и (3) количество IL2R, занятых IL2 (т.е. аффинность связывающего взаимодействия между IL2 и IL2R (Smith, «Cell Growth Signal Transduction is Quantal» In Receptor Activation by Antigens, Cytokines, Hormones, and Growth Factors 766:263-271, 1995)). Комплекс IL2:IL2R интернализуется при связывании лиганда, и различные компоненты подвергаются дифференциальной сортировке. При внутривенном (в/в) болюсном введении IL2 имеет быстрый системный клиренс (начальная фаза клиренса с периодом полувыведения 12,9 минут, за которой следует более медленная фаза клиренса с периодом полувыведения 85 минут) (Konrad et al., Cancer Res.50: 2009-2017, 1990).
В эукариотических клетках человеческий IL2 синтезируется как полипептид-предшественник из 153 аминокислот, из которых 20 аминокислот удаляются с образованием зрелого секретируемого IL2. Рекомбинантный человеческий IL2 был продуцирован в E. coli, в клетках насекомых и в COS клетках млекопитающих.
Результаты системного применения IL2 у онкологических больных далеки от идеала. В то время как от 15 до 20 процентов пациентов объективно реагируют на высокие дозы IL2, подавляющее большинство не реагируют, и многие страдают серьезными, опасными для жизни побочными эффектами, включая тошноту, спутанность сознания, гипотензию и септический шок. Сильная токсичность, связанная с лечением высокими дозами IL2, в значительной степени объясняется активностью естественных киллеров (NK). Были предприняты попытки снизить концентрацию в сыворотке за счет уменьшения дозы и корректировки режима дозирования, но хотя такие методы лечения были менее токсичными, они также были менее эффективными.
Согласно изобретению, в некоторых вариантах осуществления вариантные полипептиды IL2, описанные в настоящей заявке, содержат группу, модифицирующую фармакокинетику. В одном варианте осуществления часть варианта IL2 или мутеин, описанный в настоящем документе, присоединяется к группе, модифицирующей фармакокинетику. Полученная в результате молекула, далее именуемая «IL2 с пролонгированной фармакокинетикой (ФК)», имеет более длительный период полужизни в кровотоке по сравнению со свободным IL2. Увеличенный период полувыведения из кровотока IL2 с пролонгированной фармакокинетикой позволяет поддерживать концентрации IL2 в сыворотке in vivo в терапевтических пределах, потенциально приводя к усиленной активации многих типов иммунных клеток, включая Т-клетки. Благодаря своему благоприятному фармакокинетическому профилю, IL2 с пролонгированной ФК можно вводить реже и в течение более длительных периодов времени по сравнению с немодифицированным IL2.
Используемый в настоящей заявке термин «период полужизни» относится к времени, необходимому для того, чтобы концентрация соединения, такого как пептид или белок, в сыворотке или плазме крови снизилась на 50% in vivo, например, из-за деградации и/или клиренса или секвестрации посредством природных механизмов. Цитокин с пролонгированной ФК, такой как интерлейкин с пролонгированной ФК (IL), подходящий для использования в настоящей заявке, стабилизируется in vivo, и его период полувыведения увеличивается, например, путем слияния с сывороточным альбумином (например, HSA или MSA), который сопротивляется деградации и/или клиренсу или секвестрации. Период полувыведения можно определить любым известным способом, например, с помощью фармакокинетического анализа. Подходящие методики будут понятны специалисту в данной области техники и могут, например, обычно включать стадии подходящего введения подходящей дозы аминокислотной последовательности или соединения субъекту; сбор образцов крови или других образцов у указанного субъекта через регулярные промежутки времени; определение уровня или концентрации аминокислотной последовательности или соединения в указанном образце крови; и вычисление из (графика) полученных таким образом данных времени, когда уровень или концентрация аминокислотной последовательности или соединения снижается на 50% по сравнению с исходным уровнем при введении дозы. Дополнительные подробности представлены, например, в стандартных справочниках, таких как Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, and Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996). Также сделана ссылка на Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982).
Согласно изобретению, IL2 (при необходимости как часть IL2 с пролонгированной ФК) может быть природным IL2, или его фрагментом или вариантом. IL2 может быть человеческим IL2 и может происходить от любого позвоночного животного, особенно от любого млекопитающего.
В данном контексте «человеческий IL2» или «человеческий IL2 дикого типа» означает IL2, нативный или рекомбинантный, имеющий обычно встречающуюся 133 аминокислотную последовательность нативного человеческого IL2 (за вычетом сигнального пептида, состоящего из дополнительных 20 N-концевых аминокислот), аминокислотная последовательность которого описана Fujita, et. al, PNAS USA, 80, 7437-7441 (1983), с дополнительным N-концевым метионином или без него, который обязательно включают, когда белок экспрессируется как внутриклеточная фракция в E. coli. В одном варианте осуществления человеческий IL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления функциональный вариант человеческого IL2 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 1. В одном варианте функциональный вариант IL2 связывается с рецептором IL2 или субъединицей рецептора IL2, такой как альфа-субъединица и/или бета/гамма-субъединица.
В определенных вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, часть варианта IL2 или мутеин слит с гетерологичным полипептидом (т.е. полипептидом, который не является IL2 и предпочтительно не является вариантом IL2). Гетерологичный полипептид может увеличивать время полужизни IL2 в кровотоке. Как более подробно обсуждается ниже, полипептид, который увеличивает время полужизни в кровотоке, может представлять собой сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека или мыши.
Используемый в настоящей заявке термин «мутеин IL2» означает вариант IL2 (включая его функциональные варианты), в частности полипептид, в котором сделаны специфические замены белка IL2. В одном варианте осуществления замены в человеческом белке IL2 были сделаны по меньшей мере в положении, которое контактирует с альфа-субъединицей рецепторного комплекса αβγ IL2 (IL2Rαβγ). В одном варианте осуществления такое положение содержит кислый или основной аминокислотный остаток в человеческом IL2 дикого типа, где, если аминокислотный остаток является кислым аминокислотным остатком в человеческом IL2 дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток, а если аминокислотный остаток представляет собой основной аминокислотный остаток в человеческом IL2 дикого типа, замену производят на кислый аминокислотный остаток. Особо предпочтительные варианты осуществления включают следующее: остаток лизина (Lys) в положении 35, остаток лизина (Lys) в положении 43 и остаток глутаминовой кислоты (Glu) в положении 61 относительно IL2 человека дикого типа, и пронумерованы в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, или любую их комбинацию.
Мутеины IL2 могут иметь аминокислотную последовательность, идентичную IL2 дикого типа по другим незамещенным остаткам (т.е. мутеины IL2 содержат мутации «mutCD25»). Однако мутеины IL2 также могут быть охарактеризованы аминокислотными вставками, делециями, заменами и модификациями в одном или нескольких сайтах в или в других остатках нативной полипептидной цепи IL2. В соответствии с настоящим изобретением любые такие вставки, делеции, замены и модификации могут приводить к мутеину IL2, который сохраняет аффинность к IL2Rβγ, но при этом имеет пониженную аффинность к IL2Rαβγ.
Например, мутеины IL2 могут также характеризоваться аминокислотными заменами в одном или нескольких сайтах в или в других остатках нативной полипептидной цепи IL2, такие аминокислотные замены приводят, например, к относительно повышенной аффинности к IL2Rβγ по сравнению с IL2 дикого типа (т.е. мутеины IL2 в дополнение к мутациям mutCD25 также содержат мутации «mutβγ»). Такие мутанты являются сильными агонистами передачи сигнала IL2. Эти мутации могут быть в аминокислотных остатках, которые контактируют с IL2Rβ и/или IL2Rγ.
В различных вариантах осуществления мутеины IL2, описанные в настоящей заявке, могут отличаться от IL2 дикого типа заменой одного или нескольких остатков в положениях 24, 65, 74, 80, 81, 85, 86, 89, 92 и 93 IL2 дикого типа. Замещенный (замещенные) аминокислотный (аминокислотные) остаток (остатки) может представлять собой консервативную замену, но не обязательно.
Например, мутация может представлять собой I24V, P65H, Q74R, Q74H, Q74N, Q74S, L80F, L80V, R81I, R81T, R81D, L85V, I86V, I89V, I92F, V93I.
В одном варианте осуществления представлен мутеин IL2, содержащий следующий набор аминокислотных замен: 80F/81D/85V/86V/92F. Мутеин может дополнительно содержать аминокислотную замену 42А. Мутеин может дополнительно содержать одну или несколько из следующих аминокислотных замен: 24V, 65H, 74R, 74H, 74N, 74S, 89V, 93I.
В некоторых вариантах осуществления представлен мутеин IL2, содержащий набор аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из:
(i) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F;
(ii) 74H, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iii) 74S, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iv) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(v) 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(vi) 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I;
(vii) 18R, 22E, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T;
(viii) 18R, 22E, 74S, 80F, 81T, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T.
Под «пронумерованными в соответствии с IL2 дикого типа» мы подразумеваем идентификацию выбранной аминокислоты со ссылкой на положение, в котором эта аминокислота обычно находится в зрелой последовательности IL2 дикого типа. Когда в мутеине IL2 делают вставки или делеции, специалист в данной области техники поймет, что аминокислота, обычно встречающаяся в определенном положении, может быть сдвинута в положение в мутеине. Однако расположение смещенной аминокислоты можно легко определить путем проверки и корреляции фланкирующих аминокислот с аминокислотами, фланкирующими аминокислоту в IL2 дикого типа.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2 и кодирующие их полинуклеотиды могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области техники. Такие способы включают введение соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту, кодирующую IL2, или синтез полинуклеотида или белка IL2 in vitro. Например, последовательность ДНК, кодирующая описанный здесь вариантный полипептид IL2, может быть сконструирована, и эти последовательности могут быть экспрессированы в трансформированном подходящим образом хозяине или в любой другой подходящей системе экспрессии. Этот способ будет производить полипептиды варианта IL2, описанные в настоящей заявке, и/или кодирующую их РНК. Однако вариантные полипептиды IL2, описанные в настоящей заявке, и кодирующие их полинуклеотиды также могут быть получены, хотя и менее предпочтительно, химическим синтезом.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2 могут связываться с IL2Rαβγ с аффинностью, которая ниже, чем аффинность, с которой вариантный полипептид IL2 связывает IL2Rα'βγ (α'представляет собой вариантную альфа-субъединицу IL2R, описанную в настоящей заявке). Аффинность вариантных полипептидов IL2, описанных в настоящей заявке, к IL2Rαβγ может быть по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз ниже, чем аффинность, с которой вариантный полипептид IL2 связывает IL2Rα'βγ.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2 могут связываться с IL2Rαβγ с аффинностью, которая ниже, чем аффинность, с которой IL2 дикого типа связывает IL2Rαβγ. Аффинность вариантных полипептидов IL2, описанных в настоящей заявке, к IL2Rαβγ может быть по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз ниже, чем аффинность, с которой IL2 дикого типа связывает IL2Rαβγ.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2 могут связываться с IL2Rβγ с аффинностью, превышающей аффинность, с которой IL2 дикого типа связывает IL2Rβγ. Аффинность вариантных полипептидов IL2, описанных в настоящей заявке, к IL2Rβγ может быть по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз больше, чем аффинность, с которой IL2 дикого типа связывает IL2Rβγ.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2 могут иметь более низкую способность стимулировать регуляторные Т-клетки, чем IL2 дикого типа, в частности, по сравнению со способностью стимулировать эффекторные Т-клетки и/или NK-клетки.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2 могут иметь мутацию (например, делецию, добавление или замену) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислотных остатков относительно IL2 дикого типа.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2 могут включать аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 87%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% с IL2 дикого типа.
В одном варианте осуществления вариантные полипептиды IL2, описанные в настоящей заявке, обладают одним или несколькими, предпочтительно всеми из следующих свойств:
1) Агонистическое действие на IL2Rβγ. Это свойство можно оценить непосредственно в анализах пролиферации in vitro с клеточными линиями, зависимыми от IL2.
2) Потеря способности, по сравнению с IL2 дикого типа, к стимуляции in vitro и/или in vivo популяций регуляторных Т-клеток. Это свойство можно оценить, например, путем изучения способности мутеинов по сравнению с IL2 дикого типа к индукции экспансии регуляторных Т-клеток.
3) Повышенный терапевтический эффект по отношению к нативному IL2 на животных моделях. Это свойство можно оценить, например, путем сравнения противоопухолевого или антиметастатического эффекта вариантных полипептидов IL2, описанных в настоящей заявке, и IL2 дикого типа в качестве монотерапии на моделях трансплантируемых опухолей (например, меланомы B16). Его также можно оценить по потенцирующему эффекту клеточного и/или гуморального ответа на интересующую вакцину.
Многие иммунные клетки временно осуществляют повышающую регуляцию IL2Rαβγ при активации, чтобы повысить чувствительность к IL2 при возникновении иммунологического ответа, включая праймирование CD8 Т-клеток. Поскольку некоторое связывание IL2Rαβγ посредством IL2 может быть необходимым, настоящее изобретение предусматривает использование смеси вариантных полипептидов IL2, описанных в настоящей заявке, в комбинации с IL2 (включая его функциональные варианты), который не демонстрирует пониженную аффинность к IL2Rαβγ, таким как IL2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления молярное отношение вариантных полипептидов IL2, описанных в настоящей заявке, к IL2, который не демонстрирует пониженной аффинности к IL2Rαβγ, составляет от 50:1 до 1:1, от 20:1 до 2:1, от 10:1 до 5:1 или от 5:1 до 3:1.
Согласно изобретению, альфа-субъединица рецептора IL2 (IL2R) или IL2Rα может быть природной IL2Rα, или ее фрагментом или вариантом. IL2Rα может быть человеческой IL2Rα и может происходить от любого позвоночного животного, особенно от любого млекопитающего.
В данном контексте «человеческая IL2Rα» или «человеческая IL2Rα дикого типа» означает IL2Rα, нативную или рекомбинантную, имеющую обычно встречающуюся последовательность из 251 аминокислоты нативной человеческой IL2Rα (за вычетом сигнального пептида, состоящего из дополнительной 21 N-концевой аминокислоты). Человеческая IL2Rα, нативная или рекомбинантная, включающая сигнальный пептид, состоящий из 21 дополнительной N-концевой аминокислоты, имеет 272 аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4. В одном варианте человеческая IL2Rα содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В одном варианте функциональный вариант человеческой IL2Rα содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В одном варианте функциональный вариант IL2Rα, при необходимости как часть IL2Rαβγ, связывается с IL2.
Используемый в настоящей заявке термин «мутеин IL2Rα» означает вариант IL2Rα (включая ее функциональные варианты), в частности полипептид, в котором сделаны специфические замены белка IL2Rα. В одном варианте осуществления замены в человеческом белке IL2Rα произведены по меньшей мере в положении, которое контактирует с IL2. В одном варианте осуществления такое положение имеет кислый или основной аминокислотный остаток в человеческом IL2Rα дикого типа, при этом, если аминокислотный остаток является кислым аминокислотным остатком в человеческом IL2Rα дикого типа, замену осуществляют на основной аминокислотный остаток, а если аминокислотный остаток представляет собой основной аминокислотный остаток в человеческом IL2Rα дикого типа, замену производят на кислый аминокислотный остаток. Особо предпочтительные варианты осуществления включают следующее: остаток глутаминовой кислоты (Glu) в положении 1, остаток глутаминовой кислоты (Glu) в положении 29 и остаток лизина (Lys) в положении 38 относительно человеческого IL2Rα дикого типа, и с нумерацией в соответствии с человеческим IL2Rα дикого типа, или любую их комбинацию.
Мутеины IL2Rα могут иметь аминокислотную последовательность, идентичную IL2Rα дикого типа по другим незамещенным остаткам. Однако мутеины IL2Rα также могут быть охарактеризованы аминокислотными вставками, делециями, заменами и модификациями в одном или нескольких сайтах в других остатках нативной полипептидной цепи IL2Rα.
Под «пронумерованной в соответствии с IL2Rα дикого типа» мы подразумеваем идентификацию выбранной аминокислоты со ссылкой на положение, в котором эта аминокислота обычно находится в зрелой последовательности IL2Rα дикого типа. Когда в мутеине IL2Rα выполняют вставки или делеции, специалист в данной области техники поймет, что аминокислота, обычно встречающаяся в определенном положении, может быть сдвинута в положении в мутеине. Однако расположение смещенной аминокислоты можно легко определить путем проверки и корреляции фланкирующих аминокислот с аминокислотами, фланкирующими аминокислоту в IL2Rα дикого типа.
Описанные в настоящей заявке вариантные полипептиды IL2Rα и кодирующие их полинуклеотиды могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области техники. Такие способы включают внесение соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту, кодирующую IL2Rα, или синтез полинуклеотида или белка IL2Rα in vitro. Например, последовательность ДНК, кодирующая вариантный полипептид IL2Rα, описанный в настоящей заявке, может быть сконструирована, и эти последовательности могут быть экспрессированы в трансформированном соответствующим образом хозяине или в любой другой подходящей системе экспрессии. Этот способ будет производить вариантные полипептиды IL2Rα, описанные в настоящей заявке, и/или кодирующую их РНК. Однако описанные здесь вариантные полипептиды IL2Rα и кодирующие их полинуклеотиды также могут быть получены, хотя и менее предпочтительно, химическим синтезом.
Группа с пролонгированной ФК
Описанные здесь вариантные полипептиды IL2 могут быть получены в виде слитых или химерных полипептидов, которые включают часть варианта IL2 и гетерологичный полипептид (т.е. полипептид, который не является IL2 или его вариантом). Варианты IL2 могут быть слиты с группой с пролонгированной ФК, что увеличивает период полужизни в кровотоке. Неограничивающие примеры групп с пролонгированной ФК описаны ниже. Следует понимать, что другие ФК-группы, которые увеличивают время полужизни цитокинов в циркуляции, или их варианты также применимы к настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления группа с пролонгированной ФК представляет собой домен сывороточного альбумина (например, сывороточный альбумин мыши, сывороточный альбумин человека).
Используемый в настоящей заявке термин «ФК» является аббревиатурой от «фармакокинетики» и охватывает свойства соединения, включая, например, абсорбцию, распределение, метаболизм и выведение субъектом. Используемый здесь термин «группа с пролонгированной ФК» относится к белку, пептиду или фрагменту, который увеличивает период полужизни в кровотоке биологически активной молекулы при слиянии с ней или введении вместе с биологически активной молекулой. Примеры группы с пролонгированной ФК включают сывороточный альбумин (например, HSA), Fc иммуноглобулина или Fc-фрагменты и их варианты, трансферрин и его варианты, а также вещества, связывающие человеческий сывороточный альбумин (HSA) (как описано в публикациях США №№2005/0287153 и 2007/0003549). Другие примерные группы пролонгированной ФК раскрыты в Kontermann, Expert Opin Biol Ther, 2016 Jul; 16 (7): 903-15, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте. Используемый в настоящей заявке термин «цитокин с пролонгированной ФК» относится к цитокиновому компоненту в комбинации с группой с пролонгированной ФК. В одном варианте осуществления цитокин с пролонгированной ФК представляет собой слитый белок, в котором цитокиновый компонент связан или слит с группой с пролонгированной ФК. В контексте настоящего описания термин «IL с пролонгированной ФК» относится к компоненту из интерлейкина (IL) (включая компонент из варианта IL) в комбинации с группой с пролонгированной ФК. В одном варианте осуществления IL с пролонгированной ФК представляет собой слитый белок, в котором компонент IL связан или слит с группой с пролонгированной ФК. Примером слитого белка является гибрид HSA/IL2, в котором компонент IL2 слит с HSA.
В некоторых вариантах осуществления период полужизни в сыворотке IL с пролонгированной ФК увеличивается по сравнению с одним IL (т.е. IL, не слитым с группой с пролонгированной ФК). В некоторых вариантах осуществления изобретения период полувыведения IL с пролонгированной ФК из сыворотки по меньшей мере на 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800 или 1000% больше по сравнению с периодом полужизни в сыворотке одного IL. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в сыворотке IL с пролонгированной ФК по меньшей мере в 1,5 раза, в 2 раза, в 2,5 раза, в 3 раза, в 3,5 раза, в 4 раза, в 4,5 раза, в 5 раз, в 6 раз. в 7 -раз, в 8 раз, в 10 раз, в 12 раз, в 13 раз, в 15 раз, в 17 раз, в 20 раз, в 22 раза, в 25 раз, в 27 раз, в 30 раз, в 35 раз, в 40 раз или в 50 раз больше, чем период полужизни в сыворотке одного только IL. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в сыворотке IL с пролонгированной ФК составляет по меньшей мере 10 часов, 15 часов, 20 часов, 25 часов, 30 часов, 35 часов, 40 часов, 50 часов, 60 часов, 70 часов, 80 часов, 90 часов, 100 часов, 110 часов, 120 часов, 130 часов, 135 часов, 140 часов, 150 часов, 160 часов или 200 часов.
В некоторых вариантах осуществления группа с пролонгированной ФК включает сывороточный альбумин или его фрагменты, или варианты сывороточного альбумина или их фрагменты (все из которых для целей настоящего изобретения охватываются термином «альбумин»). Описанные здесь полипептиды могут быть слиты с альбумином (или его фрагментом или вариантом) с образованием слитых белков с альбумином. Такие слитые белки с альбумином описаны в публикации США №20070048282.
В данном контексте «слитый белок с альбумином» относится к белку, образованному путем слияния по меньшей мере одной молекулы альбумина (или его фрагмента или варианта) по меньшей мере с одной молекулой белка, такого как терапевтический белок, в частности IL2 (или его вариант). Слитый белок с альбумином может быть получен путем трансляции нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий терапевтический белок, соединен в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим альбумин. Терапевтический белок и альбумин, являющиеся частью слитого белка альбумина, каждый может называться «частью», «областью» или «компонентом» слитого белка альбумина (например, «частью терапевтического белка» или «альбуминовой частью белка»). В наиболее предпочтительном варианте осуществления слитый белок с альбумином содержит по меньшей мере одну молекулу терапевтического белка (включая зрелую форму терапевтического белка, но не ограничиваясь этим) и по меньшей мере одну молекулу альбумина (включая зрелую форму альбумина, но не ограничиваясь этим). В одном варианте осуществления слитый белок с альбумином подвергается процессингу клеткой-хозяином, такой как клетка органа-мишени для вводимой РНК, например, клетка печени, и секретируется в кровоток. Процессинг формирующегося слитого белка с альбумином, который происходит в секреторных путях клетки-хозяина, используемой для экспрессии РНК, может включать расщепление сигнального пептида; образование дисульфидных связей; надлежащий фолдинг; добавление и процессинг углеводов (такой как, например, N- и O-связанное гликозилирование); специфические протеолитические расщепления; и/или сборку в мультимерные белки, но не ограничивается этим. Слитый белок с альбумином предпочтительно кодируется РНК в непроцессированной форме, которая, в частности, имеет сигнальный пептид на своем N-конце, и после секреции клеткой предпочтительно присутствует в процессированной форме, в которой, в частности, сигнальный пептид был отделен. В наиболее предпочтительном варианте осуществления «процессированная форма слитого белка с альбумином» относится к продукту слитого белка с альбумином, который подвергся отделению N-концевого сигнального пептида, в настоящей заявке также называемому «зрелым слитым белком альбумина».
В предпочтительных вариантах осуществления слитые белки с альбумином, содержащие терапевтический белок, имеют более высокую стабильность в плазме по сравнению со стабильностью в плазме того же терапевтического белка, когда он не слит с альбумином. Стабильность в плазме обычно относится к периоду времени между тем, когда терапевтический белок вводят in vivo и он переносится в кровоток, и когда терапевтический белок разрушается и выводится из кровотока в такой орган, как почка или печень, который в конечном итоге выводит терапевтический белок из организма. Стабильность в плазме рассчитывают как период полужизни терапевтического белка в кровотоке. Период полужизни терапевтического белка в кровотоке можно легко определить с помощью общепринятых анализов, известных в данной области техники.
Используемый в настоящей заявке термин «альбумин» в совокупности относится к белку или аминокислотной последовательности альбумина, или фрагменту или варианту альбумина, обладающим одной или несколькими функциональными активностями (например, биологическими активностями) альбумина. В частности, «альбумин» относится к человеческому альбумину, или его фрагментам или вариантам, особенно зрелой форме человеческого альбумина, или альбумину от других позвоночных, или их фрагментам, или вариантам этих молекул. Альбумин может происходить от любого позвоночного животного, особенно от любого млекопитающего, например, человека, мыши, коровы, овцы или свиньи. Альбумины, не относящиеся к млекопитающим, включают альбумин курицы и лосося, но не ограничиваются ими. Альбуминовая часть слитого белка альбумина может происходить от иного животного, чем часть терапевтического белка.
В некоторых вариантах осуществления альбумин представляет собой сывороточный альбумин человека (HSA) или его фрагменты или варианты, такие как раскрытые в US 5876969, WO 2011/124718, WO 2013/075066 и WO 2011/0514789.
Термины «человеческий сывороточный альбумин» (HSA) и «человеческий альбумин» (HA) используются в настоящей заявке взаимозаменяемо. Термины «альбумин» и «сывороточный альбумин» являются более широкими и охватывают человеческий сывороточный альбумин (и его фрагменты и варианты), а также альбумин других видов (и его фрагменты и варианты).
В данном контексте альбуминовый фрагмент, достаточный для пролонгации терапевтической активности или стабильности в плазме терапевтического белка, относится к фрагменту альбумина, имеющему достаточную длину или структуру для стабилизации или продления терапевтической активности или стабильности в плазме белка, так что стабильность в плазме терапевтической части белка для слитого белка альбумина пролонгирована или увеличена по сравнению со стабильностью в плазме в не-слитом состоянии.
Альбуминовая часть слитых белков альбумина может включать полную длину последовательности альбумина или может включать один или несколько ее фрагментов, которые способны стабилизировать или продлевать терапевтическую активность или стабильность в плазме. Такие фрагменты могут состоять из 10 или более аминокислот по длине, или могут включать примерно 15, 20, 25, 30, 50 или более смежных аминокислот из последовательности альбумина, или могут включать часть или все конкретные домены альбумина. Например, можно использовать один или несколько фрагментов HSA, охватывающих первые два иммуноглобулиноподобных домена. В предпочтительном варианте осуществления фрагмент HSA представляет собой зрелую форму HSA.
Вообще говоря, фрагмент или вариант альбумина будет иметь длину по меньшей мере 100 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 150 аминокислот.
Согласно изобретению, альбумин может быть природным альбумином, или его фрагментом или вариантом. Альбумин может быть человеческим альбумином и может происходить от любого позвоночного животного, особенно от любого млекопитающего. В одном варианте осуществления альбумин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO: 3.
Предпочтительно, слитый белок с альбумином содержит альбумин в качестве N-концевой части и терапевтический белок в качестве C-концевой части. В качестве альтернативы также можно использовать слитый белок с альбумином, содержащий альбумин в качестве С-концевой части и терапевтический белок в качестве N-концевой части.
В одном варианте осуществления терапевтический белок (белки) присоединяется (присоединяются) к альбумину посредством пептидного линкера (линкеров). Линкерный пептид между слитыми частями может обеспечивать большее физическое разделение между фрагментами и, таким образом, максимизировать доступность терапевтической белковой части, например, для связывания с ее когнатным рецептором. Линкерный пептид может состоять из аминокислот, так что он может быть гибким или более жестким. Линкерная последовательность может расщепляться протеазой или химическим путем.
Используемый в настоящей заявке термин «Fc-область» относится к части нативного иммуноглобулина, образованной соответствующими Fc-доменами (или Fc-фрагментами) двух его тяжелых цепей. Используемый в настоящей заявке термин «домен Fc» относится к части или фрагменту тяжелой цепи одиночного иммуноглобулина (Ig), где домен Fc не содержит домен Fv. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен начинается в шарнирной области непосредственно перед сайтом расщепления папаином и заканчивается на С-конце антитела. Соответственно, полный домен Fc включает по меньшей мере шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3. В некоторых вариантах осуществления домен Fc содержит по меньшей мере одно из шарнирного домена (например, верхнего, среднего и/или нижнего шарнирного участка), домена CH2, домена CH3, домена CH4 или их варианта, части или фрагмента. В некоторых вариантах осуществления домен Fc содержит полный домен Fc (т.е. шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3). В некоторых вариантах осуществления домен Fc содержит шарнирный домен (или его часть), слитый с доменом CH3 (или его частью). В некоторых вариантах осуществления домен Fc включает домен CH2 (или его часть), слитый с доменом CH3 (или его частью). В некоторых вариантах осуществления домен Fc состоит из домена CH3 или его части. В некоторых вариантах осуществления домен Fc состоит из шарнирного домена (или его части) и домена CH3 (или его части). В некоторых вариантах осуществления домен Fc состоит из домена CH2 (или его части) и домена CH3. В некоторых вариантах осуществления домен Fc состоит из шарнирного домена (или его части) и домена CH2 (или его части). В некоторых вариантах осуществления в домене Fc отсутствует по меньшей мере часть домена CH2 (например, весь домен CH2 или его часть). Fc-домен в настоящей заявке обычно относится к полипептиду, содержащему весь или часть Fc-домена тяжелой цепи иммуноглобулина. Это включает полипептиды, содержащие целые домены CH1, шарнир, CH2 и/или CH3, а также фрагменты таких пептидов, содержащие только, например, шарнирный домен, домен CH2 и CH3, но не ограничивается ими. Fc домен может происходить из иммуноглобулина любого вида и/или любого подтипа, включая человеческие антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM, но не ограничиваясь ими. Fc домен включает нативные молекулы Fc и варианты Fc. Как изложено в настоящей заявке, специалисту в данной области техники будет понятно, что любой Fc домен может быть модифицирован так, что он отличается по аминокислотной последовательности от нативного Fc домена природной молекулы иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления Fc домен имеет сниженную эффекторную функцию (например, связывание FcγR).
Fc-домены полипептида, описанного в настоящей заявке, могут происходить из различных молекул иммуноглобулинов. Например, Fc домен полипептида может включать домен CH2 и/или CH3, полученный из молекулы IgG1, и шарнирную область, полученную из молекулы IgG3. В другом примере Fc домен может включать химерный шарнирный участок, частично полученный из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В другом примере Fc домен может включать химерный шарнир, частично полученный из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.
В некоторых вариантах осуществления группа с пролонгированной ФК включает Fc домен или его фрагменты, или варианты Fc домена или их фрагменты (все из которых для целей настоящего изобретения охватываются термином «Fc домен»). Fc домен не содержит вариабельной области, которая связывается с антигеном. Fc домены, подходящие для использования в настоящем изобретении, могут быть получены из ряда различных источников. В некоторых вариантах осуществления Fc домен происходит из иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления Fc домен происходит из константной области человеческого IgG1. Однако понятно, что Fc домен может происходить из иммуноглобулина другого вида млекопитающих, включая, например, грызунов (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или виды приматов, не относящиеся к человеку (например, шимпанзе, макаку).
Более того, Fc домен (или его фрагмент или вариант) может происходить из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа иммуноглобулина, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Различные последовательности генов Fc домена (например, последовательности генов константных областей мыши и человека) доступны в виде общедоступных депозитов. Домены константной области, содержащие последовательность Fc домена, могут быть выбраны без конкретной эффекторной функции и/или с конкретной модификацией для снижения иммуногенности. Опубликованы многие последовательности антител и генов, кодирующих антитела, и подходящие последовательности Fc домена (например, последовательности шарнира, CH2 и/или CH3, или их фрагменты или варианты) могут быть получены из этих последовательностей с использованием признанных в данной области техники способов.
В некоторых вариантах осуществления группа с пролонгированной ФК представляет собой белок, связывающий сывороточный альбумин, такой как белки, описанные в US 2005/0287153, US 2007/0003549, US 2007/0178082, US 2007/0269422, US 2010/0113339, WO2009/083804 и WO 2009/133208, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В некоторых вариантах осуществления группа с пролонгированной ФК представляет собой трансферрин, как описано в патентах США 7,176,278 и 8,158,579, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В некоторых вариантах осуществления группа с пролонгированной ФК представляет собой белок, связывающий сывороточный иммуноглобулин, такой как описаны в US 2007/0178082, US 2014/0220017 и US 2017/0145062, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В некоторых вариантах осуществления группа с пролонгированной ФК представляет собой белок каркасного домена на основе фибронектина (Fn), который связывается с сывороточным альбумином, такой как описано в US 2012/0094909, который включен в настоящее описание посредством ссылки во всей полноте. Способы получения белков каркасных доменов на основе фибронектина также раскрыты в US 2012/0094909. Неограничивающим примером группы с пролонгированной ФК на основе Fn3 является Fn3(HSA), то есть белок Fn3, который связывается с сывороточным альбумином человека.
В определенных аспектах IL с пролонгированной ФК, подходящий для использования в соответствии с описанием, может использовать один или несколько пептидных линкеров. Используемый в настоящей заявке термин «пептидный линкер» относится к пептидной или полипептидной последовательности, которая соединяет два или более домена (например, компонент с пролонгированной ФК и компонент из IL, такой как IL2) в линейной аминокислотной последовательности полипептидной цепи. Например, пептидные линкеры можно использовать для соединения компонента IL2 с доменом HSA.
Линкеры, подходящие для слияния группы с пролонгированной ФК, например, с IL2, хорошо известны в данной области техники. Примеры линкеров включают глицин-сериновые полипептидные линкеры, глицин-пролиновые полипептидные линкеры и пролин-аланиновые полипептидные линкеры. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой глицин-сериновый полипептидный линкер, то есть пептид, который состоит из остатков глицина и серина.
В дополнение к гетерологичным полипептидам, описанным выше, или вместо них, описанный в настоящей заявке вариантный полипептид IL2 может содержать последовательности, кодирующие «маркер» или «репортер». Примеры маркерных или репортерных генов включают β-лактамазу, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), аденозиндезаминазу (ADA), аминогликозидфосфотрансферазу, дигидрофолатредуктазу (DHFR), гигромицин-B-фосфотрансферазу (HPH), тимидинкиназу (ТК), β-галактозидазу и ксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (XGPRT).
Рецепторы антигена
Описанные в настоящей заявке клетки, такие как иммунные эффекторные клетки, которые могут быть модифицированы (например, ex vivo/in vitro или in vivo у субъекта, подлежащего лечению) для экспрессии описанного в настоящей заявке вариантного полипептида IL2R, могут экспрессировать рецептор антигена, такой как Т-клеточный рецептор (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), связывающий антиген, или продукт его процессинга, в частности, когда он присутствует на клетке-мишени или представлен ею. Клетки могут естественным образом экспрессировать рецептор антигена или быть модифицированными (например, ex vivo/in vitro или in vivo у субъекта, подлежащего лечению) для экспрессии рецептора антигена. В одном варианте осуществления модификацию для экспрессии вариантного полипептида IL2R, описанного в настоящей заявке, и модификацию для экспрессии рецептора антигена осуществляют ex vivo/in vitro либо одновременно, либо в разные моменты времени. Впоследствии модифицированные клетки могут быть введены пациенту. В одном варианте осуществления модификация для экспрессии вариантного полипептида IL2R, описанного в настоящей заявке, происходит ex vivo/in vitro, и после введения клеток пациенту модификация для экспрессии рецептора антигена происходит in vivo. В одном варианте осуществления модификация для экспрессии рецептора антигена происходит ex vivo/in vitro, и после введения клеток пациенту модификация для экспрессии варианта полипептида IL2R, описанного в настоящей заявке, имеет место in vivo. В одном варианте осуществления модификация для экспрессии варианта полипептида IL2R, описанного в настоящей заявке, и модификация для экспрессии рецептора антигена происходит in vivo либо одновременно, либо в разные моменты времени. Клетки могут быть эндогенными клетками пациента или могут быть введены пациенту.
Химерные антигенные рецепторы
Терапия с адоптивным переносом клеток с использованием CAR-инженерных Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы, является многообещающим противораковым терапевтическим средством, поскольку CAR-модифицированные Т-клетки могут быть созданы для нацеливания практически на любой опухолевый антиген. Например, Т-клетки пациента могут быть сконструированы с помощью генной инженерии (генетически модифицированы) для экспрессии CAR, специфически направленных против антигенов на опухолевых клетках пациента, а затем введены обратно пациенту.
Согласно изобретению термин «CAR» (или «химерный антигенный рецептор») является синонимом терминов «химерный Т-клеточный рецептор» и «искусственный Т-клеточный рецептор» и относится к искусственному рецептору, содержащему одну молекулу или комплекс молекулы, которые распознают, т.е. связываются с целевой структурой (например, антигеном) на клетке-мишени, такой как раковая клетка (например, путем связывания антигенсвязывающего домена с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени), и могут придавать специфичность для иммунной эффекторной клетки, такой как Т-клетка, экспрессирующая указанный CAR на поверхности клетки. Предпочтительно, распознавание целевой структуры посредством CAR приводит к активации иммунной эффекторной клетки, экспрессирующей указанный CAR. CAR может содержать одну или несколько указанных белковых единиц, содержащих один или несколько доменов, как описано в настоящей заявке. Термин «CAR» не включает Т-клеточные рецепторы.
CAR содержит специфический для мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающим компонентом или антигенсвязывающим доменом, который обычно является частью внеклеточного домена CAR. Антигенсвязывающий домен распознает лиганд, который действует как маркер клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с определенным патологическим состоянием. В частности, CAR по изобретению нацеливает на антиген, такой как опухолевый антиген, на патологической клетке, такой как опухолевая клетка.
В одном варианте осуществления связывающий домен в CAR специфически связывается с антигеном. В одном варианте осуществления антиген, с которым связывается связывающий домен в CAR, экспрессируется в раковой клетке (опухолевый антиген). В одном варианте осуществления антиген экспрессируется на поверхности раковой клетки. В одном варианте осуществления связывающий домен связывается с внеклеточным доменом или с эпитопом во внеклеточном домене антигена. В одном варианте связывающий домен связывается с нативными эпитопами антигена, присутствующими на поверхности живых клеток.
В одном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен включает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) со специфичностью к антигену и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (VL) со специфичностью к антигену. В одном варианте осуществления иммуноглобулин представляет собой антитело. В одном варианте осуществления указанная вариабельная область тяжелой цепи (VH) и соответствующая вариабельная область легкой цепи (VL) связаны через пептидный линкер. Предпочтительно, часть антигенсвязывающего фрагмента в CAR представляет собой scFv.
CAR сконструирован, чтобы содержать трансмембранный домен, который слит с внеклеточным доменом CAR. В одном варианте осуществления трансмембранный домен не является естественно ассоциированным с одним из доменов в CAR. В одном варианте осуществления трансмембранный домен естественным образом ассоциирован с одним из доменов в CAR. В одном варианте осуществления трансмембранный домен модифицирован аминокислотной заменой, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или разных поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса. Трансмембранный домен может быть получен из природного или синтетического источника. Если источник является природным, домен может происходить из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области, которые можно использовать в данном изобретении, могут быть получены из (т.е. содержать по меньшей мере трансмембранную область (области)) альфа, бета или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Альтернативно, трансмембранный домен может быть синтетическим, и в этом случае он будет содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. Предпочтительно триплет фенилаланина, триптофана и валина будет находиться на каждом конце синтетического трансмембранного домена.
В некоторых случаях CAR по изобретению включает шарнирный домен, который образует связь между трансмембранным доменом и внеклеточным доменом.
Цитоплазматический домен или иначе внутриклеточный сигнальный домен CAR отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую был помещен CAR. Термин «эффекторная функция» относится к специализированной функции клетки. Эффекторной функцией Т-клетки, например, может быть цитолитическая активность или хелперная активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин «внутриклеточный сигнальный домен» относится к части белка, которая трансдуцирует сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Хотя обычно может использоваться весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях нет необходимости использовать всю цепь. В той степени, в которой используется усеченная часть внутриклеточного сигнального домена, такая усеченная часть может использоваться вместо интактной цепи, пока она преобразует сигнал эффекторной функции. Термин внутриклеточный сигнальный домен, таким образом, означает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для трансдукции сигнала эффекторной функции.
Известно, что сигналов, генерируемых только через TCR, недостаточно для полной активации Т-клетки, и что также требуется вторичный или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клеток опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые действуют антиген-независимым образом, обеспечивая вторичный или костимуляторный сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности).
В одном варианте осуществления CAR содержит первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, полученную из CD3-дзета. Кроме того, цитоплазматический домен CAR может содержать сигнальный домен CD3-дзета, объединенный с костимуляторной сигнальной областью.
Идентичность костимуляторного домена ограничена только тем, что он обладает способностью увеличивать клеточную пролиферацию и выживаемость при связывании целевого фрагмента CAR. Подходящие костимуляторные домены включают CD28, CD137 (4-1BB), член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR), CD134 (OX40), член суперсемейства рецепторов TNFR, и CD278 (ICOS), костимуляторную молекулу суперсемейства CD28, экспрессируемую на активированных Т-клетках. Специалисту в данной области техники понятно, что варианты последовательностей этих отмеченных костимуляторных доменов можно использовать без отрицательного влияния в изобретении, где варианты обладают такой же или подобной активностью, что и домен, на котором они моделируются. Такие варианты будут иметь по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью домена, из которого они происходят. В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкции CAR содержат два костимуляторных домена. Хотя конкретные комбинации включают все возможные варианты четырех указанных доменов, конкретные примеры включают CD28+CD137 (4-1BB) и CD28+CD134 (OX40).
Цитоплазматические сигнальные последовательности в цитоплазматической сигнальной части CAR могут быть связаны друг с другом в случайном или заданном порядке. При необходимости короткий олиго- или полипептидный линкер, предпочтительно длиной от 2 до 10 аминокислот, может формировать связь. Дублет глицин-серин обеспечивает особенно подходящий линкер.
В одном варианте осуществления CAR содержит сигнальный пептид, который направляет растущий белок в эндоплазматическом ретикулуме. В одном варианте осуществления сигнальный пептид предшествует антигенсвязывающему домену. В одном варианте осуществления сигнальный пептид происходит из иммуноглобулина, такого как IgG.
Термин «антитело» включает иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно VL) и константной области легкой цепи. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), с включениями более консервативных областей, называемых каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Антитело связывается, предпочтительно специфически связывается с антигеном. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, происходящими из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут быть иммунореактивными частями или фрагментами интактных иммуноглобулинов. Антитела обычно представляют собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов. Антитела по настоящему изобретению могут существовать в различных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab')2, а также одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, in: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
Антитела, экспрессируемые B-клетками, иногда обозначают как BCR (B-клеточный рецептор) или антигенный рецептор. В этот класс белков входят пять членов: IgA, IgG, IgM, IgD и IgE. IgA - это первичные антитела, которые присутствуют в секретах организма, таких как слюна, слезы, грудное молоко, желудочно-кишечные соки и слизистые выделения из дыхательных и мочеполовых путей. IgG является наиболее распространенным циркулирующим антителом. IgM является основным иммуноглобулином, вырабатываемым при первичном иммунном ответе у большинства субъектов. Это наиболее эффективный иммуноглобулин в агглютинации, фиксации комплемента и других ответах антител, и он важен для защиты от бактерий и вирусов. IgD - это иммуноглобулин, который не имеет известной функции антител, но может служить рецептором антигена. IgE - это иммуноглобулин, который опосредует гиперчувствительность немедленного типа, вызывая высвобождение медиаторов из тучных клеток и базофилов при воздействии аллергена.
Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела и обычно включает антигенные определяющие вариабельные области интактного антитела.
Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела, антитела scFv и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.
Термин «тяжелая цепь антитела» в контексте настоящего описания относится к большему из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их естественных конформациях.
«Легкая цепь антитела» в контексте настоящего описания относится к меньшему из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их естественных конформациях, легкие цепи κ и λ относятся к двум основным изотипам легкой цепи антитела.
Согласно описанию, CAR, который, когда присутствует на Т-клетке, распознает антиген, например, на поверхности антигенпрезентирующих клеток или патологических клеток, таких как раковые клетки, таким образом, что Т-клетка стимулируется и/или размножается, или проявляет эффекторные функции, как описано выше.
Генетическая модификация иммунных эффекторных клеток
Для введения полипептидов рецептора IL2, таких как варианты IL2Rα, описанные в настоящей заявке, и, при необходимости, рецепторов антигена, таких как конструкции CAR, в клетки, такие как Т-клетки, можно использовать различные способы получения клеток, генетически модифицированных для экспрессии полипептидов рецептора IL2, таких как варианты IL2Rα, описанные в настоящей заявке, и при необходимости рецепторы антигена. Такие способы включают трансфекцию ДНК на невирусной основе, трансфекцию РНК на невирусной основе, например, трансфекцию мРНК, системы на основе транспозонов и системы на основе вирусов. Трансфекция ДНК на невирусной основе имеет низкий риск инсерционного мутагенеза. Системы на основе транспозонов могут интегрировать трансгены более эффективно, чем плазмиды, не содержащие интегрирующий элемент. Системы на основе вирусов включают использование γ-ретровирусов и лентивирусных векторов. γ-Ретровирусы относительно легко продуцировать, они эффективно и постоянно трансдуцируют Т-клетки и предварительно доказали свою безопасность с точки зрения интеграции в первичные Т-клетки человека. Лентивирусные векторы также эффективно и постоянно трансдуцируют Т-клетки, но их производство является более дорогим. Они также потенциально более безопасны, чем системы на основе ретровирусов.
В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения Т-клетки или предшественники Т-клеток трансфицируют либо ex vivo, либо in vivo нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид рецептора IL2, и при необходимости нуклеиновой кислотой, кодирующей рецептор антигена. В одном варианте осуществления может быть использована комбинация трансфекции ex vivo и in vivo. В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения Т-клетки или предшественники Т-клеток получены от субъекта, подлежащего лечению. В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения Т-клетки или предшественники Т-клеток получены от субъекта, который отличается от субъекта, подлежащего лечению.
CAR Т-клетки могут быть продуцированы in vivo и, следовательно, почти мгновенно, с использованием наночастиц, нацеленных на Т-клетки. Например, наночастицы на основе поли(β-аминоэфира) могут быть связаны с анти-CD3e F(ab) фрагментами для связывания с CD3 на Т-клетках. После связывания с Т-клетками эти наночастицы подвергаются эндоцитозу. Их содержимое, например, плазмидная ДНК, кодирующая противоопухолевый антиген CAR, может быть направлено в ядро Т-клетки из-за включения пептидов, содержащих последовательности, ассоциированные с микротрубочками (MTAS), и сигналы ядерной локализации (NLS). Включение транспозонов, фланкирующих кассету экспрессии гена CAR, и отдельной плазмиды, кодирующей гиперактивную транспозазу, может обеспечить эффективную интеграцию вектора CAR в хромосомы. Такая система, которая позволяет продуцировать in vivo CAR T-клетки после инфузии наночастиц, описана в Smith et al. (2017) Нац. Nanotechnol. 12: 813-820.
Другой возможностью является использование способа CRISPR/Cas9 для преднамеренного размещения кодирующей последовательности CAR в конкретном локусе. Например, существующие рецепторы Т-клеток (TCR) могут быть нокаутированы, в то время как блокируется CAR и помещается под динамический регуляторный контроль эндогенного промотора, который в противном случае мог бы сдерживать экспрессию TCR; см., например, Eyquem et al. (2017) Nature 543: 113-117.
В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения клетки, генетически модифицированные для экспрессии одного или нескольких полипептидов рецептора IL2, таких как варианты IL2Rα, описанные в настоящей заявке, и при необходимости рецептор антигена, стабильно или временно трансфицируют нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептиды рецептора IL2, такими как варианты IL2Rα, описанные в настоящей заявке, и при необходимости нуклеиновой кислотой, кодирующей рецептор антигена. В одном варианте осуществления клетки стабильно трансфицируют определенной нуклеиновой кислотой и временно трансфицируют другой нуклеиновой кислотой. Таким образом, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептиды рецептора IL2, такие как варианты IL2Rα, описанные в настоящей заявке, и при необходимости нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор антигена, интегрируют или не интегрируют в геном клеток.
В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецептора антигена, инактивированы для экспрессии эндогенного Т-клеточного рецептора и/или эндогенного HLA.
В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения клетки, описанные в настоящей заявке, могут быть аутологичными, аллогенными или сингенными по отношению к субъекту, подлежащему лечению. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает взятие клеток у пациента и последующую повторную доставку клеток пациенту. В одном варианте осуществления настоящее изобретение не предусматривает взятие клеток у пациента. В последнем случае все этапы генетической модификации клеток выполняют in vivo.
Термин «аутологичный» используется для описания всего, что происходит от одного и того же субъекта. Например, «аутологичный трансплантат» относится к трансплантату ткани или органов, полученным от одного и того же субъекта. Такие процедуры полезны, потому что они преодолевают иммунологический барьер, который в противном случае приводит к отторжению.
Термин «аллогенный» используется для описания всего, что происходит от разных индивидуумов одного и того же вида. Говорят, что два или более индивидуума аллогенны по отношению друг к другу, если гены в одном или нескольких локусах не идентичны.
Термин «сингенный» используется для описания всего, что происходит от индивидуумов или тканей, имеющих идентичные генотипы, то есть от идентичных близнецов или животных одного и того же инбредного штамма, или их тканей.
Термин «гетерологичный» используется для описания чего-либо, состоящего из нескольких различных элементов. Например, перенос костного мозга одного человека другому представляет собой гетерологичный трансплантат. Гетерологичный ген - это ген, полученный из источника, отличного от субъекта.
Антиген
В одном варианте осуществления способы, описанные в настоящей заявке, дополнительно включают стадию контактирования с эффекторными иммунными клетками, в частности с эффекторными иммунными клетками, экспрессирующими рецептор антигена, например, с эффекторными иммунными клетками, которые подвергаются генетическим манипуляциям для экспрессии рецептора антигена, либо ex vivo, либо у субъекта, которого лечат, с помощью молекулы когнатного антигена, где молекула антигена или продукт ее процессирования, например, ее фрагмент, связывается с рецептором антигена, таким как TCR или CAR, переносимыми эффекторными иммунными клетками. В одном варианте осуществления молекула когнатного антигена выбрана из группы, состоящей из антигена, экспрессируемого клеткой-мишенью, на которую нацелены иммунные эффекторные клетки, или его фрагмента, или вариантного антигена или фрагмента. В одном варианте осуществления эффекторные иммунные клетки контактируют с молекулой когнатного антигена в условиях, при которых происходит размножение и/или активация иммунных эффекторных клеток. В одном варианте осуществления стадия контактирования иммунных эффекторных клеток с молекулой родственного антигена происходит in vivo или ex vivo.
В одном варианте осуществления описанные здесь способы включают стадию введения субъекту молекулы когнатного антигена или кодирующей ее нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу когнатного антигена, экспрессируется в клетках субъекта, обеспечивая молекулу когнатного антигена. В одном варианте осуществления экспрессия молекулы когнатного антигена происходит на поверхности клетки. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу когнатного антигена, временно экспрессируется в клетках субъекта. В одном варианте нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу когнатного антигена, представляет собой РНК. В одном варианте осуществления молекулу родственного антигена или кодирующую ее нуклеиновую кислоту вводят системно. В одном варианте осуществления после системного введения нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, происходит экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, в селезенке. В одном варианте осуществления после системного введения нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, происходит экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, в антигенпрезентирующих клетках, предпочтительно профессиональных антигенпрезентирующих клетках. В одном варианте осуществления антигенпрезентирующие клетки выбраны из группы, состоящей из дендритных клеток, макрофагов и В-клеток. В одном варианте осуществления после системного введения нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, не происходит или практически отсутствует экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, в легких и/или печени. В одном варианте осуществления после системного применения нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу когнатного антигена, в селезенке по меньшей мере в 5 раз превышает количество экспрессии в легких.
Пептидный и белковый антиген, который вводят субъекту согласно изобретению (либо путем введения пептидного и белкового антигена, либо нуклеиновой кислоты, в частности РНК, кодирующей пептид и белковый антиген), то есть вакцинный антиген, предпочтительно приводит к стимуляции, праймированию и/или экспансии иммунных эффекторных клеток у субъекта, которому вводят пептидный или белковый антиген, или нуклеиновую кислоту. Указанные стимулированные, праймированные и/или размноженные иммунные эффекторные клетки предпочтительно направлены против антигена-мишени, в частности антигена-мишени, экспрессируемого патологическими клетками, тканями и/или органами, то есть ассоциированного с заболеванием антигена. Таким образом, вакцинный антиген может включать ассоциированный с заболеванием антиген, или его фрагмент или вариант. В одном варианте осуществления такой фрагмент или вариант иммунологически эквивалентен антигену, связанному с заболеванием. В контексте настоящего изобретения термин «фрагмент антигена» или «вариант антигена» означает агент, который приводит к стимуляции, праймированию и/или размножению иммунных эффекторных клеток, где стимулированные, праймированные и/или размноженные иммунные эффекторные клетки нацелены на антиген, т.е. ассоциированный с заболеванием антиген, в частности, когда он презентирован патологическими клетками, тканями и/или органами. Таким образом, вакцинный антиген может соответствовать или может содержать ассоциированный с заболеванием антиген, может соответствовать или может содержать фрагмент ассоциированного с заболеванием антигена, или может соответствовать или может содержать антиген, который гомологичен ассоциированному с заболеванием антигену, или его фрагмент. Если вакцинный антиген содержит фрагмент ассоциированного с заболеванием антигена или аминокислотную последовательность, которая гомологична фрагменту ассоциированного с заболеванием антигена, указанный фрагмент или аминокислотная последовательность может содержать эпитоп ассоциированного с заболеванием антигена, на который антигенный рецептор иммунных эффекторных клеток нацелен, или последовательность, которая гомологична эпитопу антигена, ассоциированного с заболеванием. Таким образом, согласно описанию, вакцинный антиген может содержать иммуногенный фрагмент ассоциированного с заболеванием антигена или аминокислотную последовательность, гомологичную иммуногенному фрагменту ассоциированного с заболеванием антигена. «Иммуногенный фрагмент антигена» согласно настоящему описанию предпочтительно относится к фрагменту антигена, который способен стимулировать, праймировать и/или вызывать экспансию иммунных эффекторных клеток, несущих рецептор антигена, связывающийся с антигеном или клетками, экспрессирующими антиген. Предпочтительно вакцинный антиген (аналогичный антигену, связанному с заболеванием) обеспечивает соответствующий эпитоп для связывания антигенсвязывающим доменом, присутствующим в иммунных эффекторных клетках. В одном варианте осуществления вакцинный антиген (аналогичный антигену, связанному с заболеванием) экспрессируется на поверхности клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, с тем, чтобы обеспечить соответствующий эпитоп для связывания иммунными эффекторными клетками. Вакцинный антиген может быть рекомбинантным антигеном.
В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая вакцинный антиген, экспрессируется в клетках субъекта, обеспечивая антиген или продукт его процессинга для связывания рецептором антигена, экспрессируемым иммунными эффекторными клетками, где указанное связывание приводит к стимуляции, праймированию и/или экспансии иммунных эффекторных клеток.
Термин «иммунологически эквивалентный» означает, что иммунологически эквивалентная молекула, такая как иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность, проявляет такие же или практически такие же иммунологические свойства и/или оказывает такие же или практически такие же иммунологические эффекты, например, в отношении типа иммунологического эффекта. В контексте настоящего описания термин «иммунологически эквивалентный» предпочтительно используется в отношении иммунологических эффектов или свойств антигенов, или вариантов антигенов, используемых для иммунизации. Например, аминокислотная последовательность является иммунологически эквивалентной эталонной аминокислотной последовательности, если указанная аминокислотная последовательность при воздействии на иммунную систему субъекта, например, при связывании Т-клеток с эталонной аминокислотной последовательностью или клетками, экспрессирующими эталонную аминокислотную последовательность, вызывает иммунную реакцию, имеющую специфичность взаимодействия с эталонной аминокислотной последовательностью. Таким образом, молекула, которая иммунологически эквивалентна антигену, проявляет такие же или практически такие же свойства и/или оказывает такие же или практически такие же эффекты в отношении стимуляции, праймирования и/или экспансии Т-клеток, что и антиген, на который нацелены Т-клетки.
«Активация» или «стимуляция» в контексте настоящего описания относится к состоянию иммунной эффекторной клетки, такой как Т-клетка, которая была достаточно стимулирована для индукции детектируемой клеточной пролиферации. Активация также может быть связана с инициированием сигнальных путей, индуцированной продукции цитокинов и обнаруживаемым эффекторным функциям. Термин «активированные эффекторные иммунные клетки» относится, среди прочего, к иммунным эффекторным клеткам, которые подвергаются клеточному делению.
Термин «праймирование» относится к процессу, при котором эффекторная иммунная клетка, такая как Т-клетка, впервые контактирует со своим специфическим антигеном и вызывает дифференцировку в эффекторные клетки, такие как эффекторные Т-клетки.
Термин «клональная экспансия» или «экспансия» относится к процессу, при котором размножается конкретный объект. В контексте настоящего изобретения этот термин предпочтительно используется в контексте иммунологического ответа, при котором лимфоциты стимулируются антигеном, пролиферируют, и специфический лимфоцит, распознающий указанный антиген, амплифицируется. Предпочтительно клональная экспансия приводит к дифференцировке лимфоцитов.
Термин «антиген» относится к агенту, содержащему эпитоп, против которого может быть выработан иммунный ответ. Термин «антиген» включает, в частности, белки и пептиды. В одном варианте осуществления антиген представлен или присутствует на поверхности клеток иммунной системы, таких как антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки или макрофаги. Антиген или продукт его процессинга, такой как Т-клеточный эпитоп, в одном варианте осуществления связывается рецептором антигена. Соответственно, антиген или продукт его процессирования могут специфически реагировать с иммунными эффекторными клетками, такими как Т-лимфоциты (Т-клетки). В одном варианте осуществления антиген представляет собой ассоциированный с заболеванием антиген, такой как опухолевый антиген, вирусный антиген или бактериальный антиген, и эпитоп происходит от такого антигена.
Термин «ассоциированный с заболеванием антиген» используется в самом широком смысле для обозначения любого антигена, ассоциированного с заболеванием. Антиген, ассоциированный с заболеванием, представляет собой молекулу, которая содержит эпитопы, которые будут стимулировать иммунную систему хозяина для выработки клеточного антиген-специфического иммунного ответа и/или гуморального ответа антител против заболевания. Следовательно, ассоциированный с заболеванием антиген или его эпитоп можно использовать в терапевтических целях. Антигены, ассоциированные с заболеванием, могут быть связаны с инфекцией микробами, обычно микробными антигенами, или связаны с раком, обычно с опухолями.
Термин «опухолевый антиген» относится к компоненту раковых клеток, который может происходить из цитоплазмы, поверхности клетки и ядра клетки. В частности, это относится к тем антигенам, которые продуцируются внутриклеточно или как поверхностные антигены на опухолевых клетках. Опухолевый антиген обычно предпочтительно экспрессируется раковыми клетками (например, он экспрессируется на более высоких уровнях в раковых клетках, чем в нераковых клетках), а в некоторых случаях он экспрессируется исключительно раковыми клетками. Примеры опухолевых антигенов включают p53, ART-4, BAGE, бета-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, белки клеточной поверхности из семейства клаудинов, таких как клаудин-6, клаудин-18.2 и клаудин-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 или MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Мелан-A, MC1R, миозин/м, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 минорный BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, протеиназу 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, сурвивин, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT и WT-1, но не ограничиваются ими.
Термин «вирусный антиген» относится к любому вирусному компоненту, обладающему антигенными свойствами, т.е. способному вызывать иммунный ответ у индивидуума. Вирусный антиген может быть вирусным рибонуклеопротеином или белком оболочки.
Термин «бактериальный антиген» относится к любому бактериальному компоненту, обладающему антигенными свойствами, то есть способному вызывать иммунный ответ у индивидуума. Бактериальный антиген может происходить из клеточной стенки или цитоплазматической мембраны бактерии.
Термин «экспрессированный на поверхности клетки» или «связанный с поверхностью клетки» означает, что молекула, такая как рецептор или антиген, связана с плазматической мембраной клетки и расположена на ней, причем по меньшей мере часть молекулы обращена к внеклеточному пространству указанной клетки и доступна извне указанной клетки, например, для антител, расположенных вне клетки. В этом контексте часть предпочтительно составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 12, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот. Ассоциация может быть прямой или косвенной. Например, ассоциация может быть обеспечена одним или несколькими трансмембранными доменами, одним или несколькими липидными якорями или взаимодействием с любым другим белком, липидом, сахаридом или другой структурой, которая может быть обнаружена на внешнем слое плазматической мембраны клетки. Например, молекула, связанная с поверхностью клетки, может быть трансмембранным белком, имеющим внеклеточную часть, или может быть белком, связанным с поверхностью клетки путем взаимодействия с другим белком, который является трансмембранным белком.
«Клеточная поверхность» или «поверхность клетки» используется в соответствии с их обычным значением в данной области техники и, таким образом, включает внешнюю часть клетки, которая доступна для связывания белками и другими молекулами.
Термин «внеклеточная часть» или «экзодомен» в контексте настоящего изобретения относится к части молекулы, такой как белок, которая обращена во внеклеточное пространство клетки и предпочтительно доступна извне указанной клетки, например, путем связывания молекул, таких как антитела, расположенных вне клетки. Предпочтительно термин относится к одной или нескольким внеклеточным петлям или доменам, или их фрагменту.
Термин «эпитоп» относится к части или фрагменту молекулы, такой как антиген, который распознается иммунной системой. Например, эпитоп может распознаваться Т-клетками, В-клетками или антителами. Эпитоп антигена может включать непрерывную или прерывистую часть антигена и может составлять примерно от 5 до 100, например, приблизительно от 5 до 50, более предпочтительно примерно от 8 до 30, наиболее предпочтительно примерно от 10 до 25 аминокислот по длине, например, эпитоп может предпочтительно состоять из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот по длине. В одном варианте осуществления эпитоп имеет длину примерно от 10 до 25 аминокислот. Термин «эпитоп» включает эпитопы Т-клеток.
Термин «Т-клеточный эпитоп» относится к части или фрагменту белка, который распознается Т-клеткой, когда он презентирован в контексте молекул MHC. Термин «главный комплекс гистосовместимости» и аббревиатура «MHC» включают молекулы MHC класса I и MHC класса II, и относится к комплексу генов, который присутствует у всех позвоночных. Белки или молекулы MHC важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками или патологическими клетками в иммунных реакциях, где белки или молекулы MHC связывают пептидные эпитопы и презентируют их для распознавания Т-клеточными рецепторами на Т-клетках. Белки, кодируемые MHC, экспрессируются на поверхности клеток и обеспечивают дисплей как аутоантигенов (пептидных фрагментов из самой клетки), так и не-аутоантигенов (например, фрагментов вторгающихся микроорганизмов) для Т-клетки. В случае комплексов МНС I класса/пептид связывающие пептиды обычно имеют длину примерно от 8 до 10 аминокислот, хотя более длинные или более короткие пептиды могут быть эффективными. В случае комплексов МНС II класса/пептид связывающие пептиды обычно имеют длину примерно от 10 до 25 аминокислот, в частности, примерно от 13 до 18 аминокислот, в то время как более длинные и более короткие пептиды могут быть эффективными.
В одном варианте осуществления антиген-мишень представляет собой опухолевый антиген, а вакцинный антиген или его фрагмент (например, эпитоп) происходит от опухолевого антигена. Опухолевый антиген может быть «стандартным» антигеном, который, как известно, экспрессируется при различных формах рака. Опухолевый антиген также может быть «неоантигеном», который специфичен для индивидуальной опухоли и ранее не распознавался иммунной системой. Неоантиген или неоэпитоп могут быть результатом одной или нескольких онкоспецифических мутаций в геноме раковых клеток, приводящих к аминокислотным изменениям. Если опухолевый антиген представляет собой неоантиген, вакцинный антиген предпочтительно включает эпитоп или фрагмент указанного неоантигена, содержащий одну или несколько аминокислотных замен.
Раковые мутации варьируют у каждого индивидуума. Таким образом, раковые мутации, кодирующие новые эпитопы (неоэпитопы), представляют собой привлекательные мишени для разработки вакцинных композиций и иммунотерапевтических средств. Эффективность иммунотерапии опухолей зависит от выбора онкоспецифических антигенов и эпитопов, способных вызывать мощный иммунный ответ у хозяина. РНК может быть использована для доставки пациенту специфичных для пациента опухолевых эпитопов. Дендритные клетки (DC), находящиеся в селезенке, являются антигенпрезентирующими клетками, представляющими особый интерес для экспрессии РНК иммуногенных эпитопов или антигенов, таких как эпитопы опухоли. Было показано, что использование множественных эпитопов способствует терапевтической эффективности противоопухолевых вакцинных композиций. Быстрое секвенирование мутанома опухоли может обеспечить множественные эпитопы для индивидуализированных вакцин, которые могут кодироваться описанной здесь РНК, например, в виде одного полипептида, в котором эпитопы при необходимости разделены линкерами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения РНК кодирует по меньшей мере один эпитоп, по меньшей мере два эпитопа, по меньшей мере три эпитопа, по меньшей мере четыре эпитопа, по меньшей мере пять эпитопов, по меньшей мере шесть эпитопов, по меньшей мере семь эпитопов, по меньшей мере восемь эпитопов, по меньшей мере девять эпитопов или по меньшей мере десять эпитопов. Типичные варианты осуществления включают РНК, которая кодирует по меньшей мере пять эпитопов (называемую «пентатопом»), и РНК, которая кодирует по меньшей мере десять эпитопов (называемую «декатопом»).
Согласно различным аспектам изобретения целью предпочтительно является обеспечение иммунного ответа против раковых клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, и лечение онкологического заболевания, вовлекающего клетки, экспрессирующие опухолевый антиген. Предпочтительно изобретение включает введение сконструированных с помощью рецептора антигена иммунных эффекторных клеток, таких как Т-клетки, нацеленные против раковых клеток, экспрессирующих опухолевый антиген.
Пептидный и белковый антиген может состоять из 2-100 аминокислот, включая, например, 5 аминокислот, 10 аминокислот, 15 аминокислот, 20 аминокислот, 25 аминокислот, 30 аминокислот, 35 аминокислот, 40 аминокислот, 45 аминокислот или 50 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления пептид может содержать более 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид может содержать более 100 аминокислот.
Согласно изобретению, вакцинный антиген должен распознаваться иммунной эффекторной клеткой. Предпочтительно антиген, если он распознается эффекторной иммунной клеткой, способен индуцировать в присутствии соответствующих костимулирующих сигналов стимуляцию, праймирование и/или размножение иммунной эффекторной клетки, несущей рецептор антигена, распознающий антиген. В контексте вариантов осуществления настоящего изобретения антиген предпочтительно присутствует на поверхности клетки, предпочтительно антигенпрезентирующей клетки. Распознавание антигена на поверхности патологической клетки может привести к иммунной реакции против антигена (или клетки, экспрессирующей антиген).
В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения антиген экспрессируется в патологической клетке, такой как раковая клетка. В одном варианте осуществления антиген экспрессируется на поверхности патологической клетки, такой как раковая клетка. В одном варианте осуществления рецептор антигена представляет собой CAR, который связывается с внеклеточным доменом или с эпитопом во внеклеточном домене антигена. В одном варианте осуществления CAR связывается с нативными эпитопами антигена, присутствующего на поверхности живых клеток. В одном варианте осуществления связывание CAR, экспрессируемого Т-клетками и/или присутствующего на Т-клетках, с антигеном, присутствующим на таких клетках, как антигенпрезентирующие клетки, приводит к стимуляции, праймированию и/или экспансии указанных Т-клеток. В одном варианте осуществления связывание CAR, экспрессируемого Т-клетками и/или присутствующего на Т-клетках, с антигеном, присутствующим на патологических клетках, таких как раковые клетки, приводит к цитолизу и/или апоптозу патологических клеток, при этом указанные Т-клетки предпочтительно выделяют цитотоксические факторы, например, перфорины и гранзимы.
Ингибиторы иммунной контрольной точки
В некоторых вариантах осуществления ингибиторы иммунной контрольной точки используют в комбинации с другими терапевтическими агентами, описанными в настоящей заявке.
Используемый в настоящей заявке термин «иммунная контрольная точка» относится к костимулирующим и ингибирующим сигналам, которые регулируют амплитуду и качество распознавания антигена Т-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления иммунная контрольная точка представляет собой ингибирующий сигнал. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий сигнал представляет собой взаимодействие между PD-1 и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий сигнал представляет собой взаимодействие между CTLA-4 и CD80 или CD86 для замещения связывания CD28. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий сигнал представляет собой взаимодействие между молекулами LAG3 и MHC II класса. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий сигнал представляет собой взаимодействие между TIM3 и галектином 9.
Используемый в настоящей заявке термин «ингибитор иммунной контрольной точки» относится к молекуле, которая полностью или частично снижает, ингибирует, препятствует или модулирует один или несколько белков контрольной точки. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки предотвращает ингибирующие сигналы, связанные с иммунной контрольной точкой. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его фрагмент, которые нарушают ингибирующую передачу сигналов, связанную с иммунной контрольной точкой. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой небольшую молекулу, которая нарушает передачу ингибирующих сигналов. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело, его фрагмент или имитатор антитела, которые предотвращают взаимодействие между белками-блокаторами контрольных точек, например, антитело или его фрагмент, которые предотвращают взаимодействие между PD-1 и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его фрагмент, которые предотвращают взаимодействие между CTLA-4 и CD80 или CD86. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его фрагмент, которые предотвращают взаимодействие между LAG3 и его лигандами или TIM-3 и его лигандами. Ингибитор контрольной точки также может быть в виде растворимой формы самих молекул (или их вариантов), например, растворимого PD-L1 или гибридного PD-L1.
Рецептор «запрограммированной гибели-1 (PD-1)» относится к иммуно-ингибирующему рецептору, принадлежащему к семейству CD28. PD-1 экспрессируется преимущественно на ранее активированных Т-клетках in vivo и связывается с двумя лигандами, PD-L1 и PD-L2. Используемый в настоящей заявке термин «PD-1» включает человеческий PD-1 (hPD-1), варианты, изоформы и видовые гомологи hPD-1, а также аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с hPD-1.
«Лиганд запрограммированной гибели-1 (PD-L1)» является одним из двух гликопротеиновых лигандов клеточной поверхности для PD-1 (другим является PD-L2), который подавляет активацию Т-клеток и секрецию цитокинов при связывании с PD-1. Используемый в настоящей заявке термин «PD-L1» включает человеческий PD-L1 (hPD-L1), варианты, изоформы и видовые гомологи hPD-L1, а также аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с hPD-L1.
«Ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами антиген-4 (CTLA-4)» представляет собой молекулу на поверхности Т-клеток и является членом суперсемейства иммуноглобулинов. Этот белок обеспечивает понижающую регуляцию иммунной системы, связываясь с CD80 и CD86. Используемый здесь термин «CTLA-4» включает человеческий CTLA-4 (hCTLA-4), варианты, изоформы и видовые гомологи hCTLA-4, а также аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с hCTLA-4.
«Ген-3 активации лимфоцитов (LAG3)» представляет собой ингибирующий рецептор, связанный с ингибированием активности лимфоцитов путем связывания с молекулами MHC II класса. Этот рецептор усиливает функцию Treg-клеток и подавляет функцию CD8+ эффекторных T-клеток. Используемый здесь термин «LAG3» включает человеческий LAG3 (hLAG3), варианты, изоформы и видовые гомологи hLAG3, а также аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп.
«Т-клеточный мембранный белок-3 (TIM3)» представляет собой ингибирующий рецептор, участвующий в ингибировании активности лимфоцитов путем ингибирования ответов клеток TH1. Его лиганд - галектин 9, который подвергается повышающей регуляции при различных типах рака. Используемый здесь термин «TIM3» включает человеческий TIM3 (hTIM3), варианты, изоформы и видовые гомологи hTIM3, а также аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп.
«Семейство B7» относится к ингибиторным лигандам с неустановленными рецепторами. Семейство B7 включает B7-H3 и B7-H4, оба из которых подвергаются повышающей регуляции на опухолевых клетках и клетках, инфильтрирующих опухоль.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки, подходящий для использования в способах, раскрытых в настоящей заявки, представляет собой антагонист ингибиторных сигналов, например, антитело, которое нацелено, например, на PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, B7- H3, B7-H4 или TIM3. Обзор этих лигандов и рецепторов см. в Pardoll, D., Nature. 12: 252-264, 2012.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, которая нарушает или ингибирует передачу сигналов от ингибирующего иммунорегулятора. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой небольшую молекулу, которая нарушает или ингибирует передачу сигналов от ингибирующего иммунорегулятора.
В некоторых вариантах осуществления ингибирующий иммунорегулятор является компонентом сигнального пути PD-1/PD-L1. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают введение субъекту антитела или его антигенсвязывающей части, которые нарушают взаимодействие между рецептором PD-1 и его лигандом, PD-L1. Антитела, которые связываются с PD-1 и нарушают взаимодействие между PD-1 и его лигандом, PD-L1, известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть специфически связывается с PD-1. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть специфически связывается с PD-L1 и ингибирует его взаимодействие с PD-1, тем самым повышая иммунную активность.
В некоторых вариантах осуществления ингибирующий иммунорегулятор является компонентом сигнального пути CTLA4. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают введение субъекту антитела или его антигенсвязывающей части, которые нацелены на CTLA4 и нарушают его взаимодействие с CD80 и CD86.
В некоторых вариантах осуществления ингибирующий иммунорегулятор является компонентом сигнального пути LAG3 (гена активации лимфоцитов 3). Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают введение субъекту антитела или его антигенсвязывающей части, которые нацелены на LAG3 и нарушают его взаимодействие с молекулами MHC II класса.
В некоторых вариантах осуществления ингибирующий иммунорегулятор является компонентом сигнального пути семейства B7. В некоторых вариантах осуществления членами семейства B7 являются B7-H3 и B7-H4. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают введение субъекту антитела или его антигенсвязывающей части, нацеленных на B7-H3 или H4. Семейство B7 не имеет каких-либо определенных рецепторов, но эти лиганды активируются на опухолевых клетках или инфильтрирующих опухоль клетках. Доклинические модели на мышах показали, что блокада этих лигандов может усиливать противоопухолевый иммунитет.
В некоторых вариантах осуществления ингибирующий иммунорегулятор является компонентом сигнального пути TIM3 (белка 3 Т-клеточной мембраны). Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают введение субъекту антитела или его антигенсвязывающей части, которые нацелены на TIM3 и нарушают его взаимодействие с галектином 9.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что другие мишени иммунных контрольных точек также могут быть нацелены антагонистами или антителами, при условии, что таргетинг приводит к стимуляции иммунного ответа, такого как противоопухолевый иммунный ответ, что отражается, например, в увеличении пролиферации Т-клеток, усилении активации Т-клеток и/или увеличении продукции цитокинов (например, IFN-γ, IL2).
Таргетинг РНК
Особо предпочтительно согласно изобретению, описанные в настоящей заявке пептиды, белки или полипептиды, в частности вариантные полипептиды IL2 и/или вакцинные антигены, вводят в форме РНК, кодирующей пептиды, белки или полипептиды, описанные в настоящей заявке. В одном варианте осуществления различные пептиды, белки или полипептиды, описанные в настоящей заявке, кодируются разными молекулами РНК.
В одном варианте осуществления РНК готовят в носителе для доставки. В одном варианте осуществления средство доставки содержит частицы. В одном варианте осуществления средство доставки содержит по меньшей мере один липид. В одном варианте осуществления по меньшей мере один липид включает по меньшей мере один катионный липид. В одном варианте осуществления липид образует комплекс с РНК и/или инкапсулирует ее. В одном варианте осуществления липид содержится в везикуле, инкапсулирующей РНК. В одном варианте осуществления РНК приготовлена в липосомах.
Согласно изобретению, после введения описанной здесь РНК по меньшей мере часть РНК доставляется в клетку-мишень. В одном варианте осуществления по меньшей мере часть РНК доставляется в цитозоль клетки-мишени. В одном варианте осуществления РНК транслируется клеткой-мишенью с образованием кодируемого пептида или белка.
Некоторые аспекты изобретения включают направленную доставку РНК, раскрытой в настоящей заявке (например, РНК, кодирующей вариантные полипептиды IL2, и/или РНК, кодирующей вакцинный антиген).
В одном варианте осуществления изобретение включает направленную доставку в лимфатическую систему, в частности во вторичные лимфоидные органы, более конкретно в селезенку. Направленная доставка в лимфатическую систему, в частности во вторичные лимфоидные органы, более конкретно в селезенку, является особо предпочтительной, если вводимая РНК представляет собой РНК, кодирующую вакцинный антиген.
В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой клетку селезенки. В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой антигенпрезентирующую клетку, такую как профессиональная антигенпрезентирующая клетка в селезенке. В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой дендритную клетку селезенки.
«Лимфатическая система» - это часть системы циркуляции и важная часть иммунной системы, состоящая из сети лимфатических сосудов, по которым проходит лимфа. Лимфатическая система состоит из лимфатических органов, проводящей сети лимфатических сосудов и циркулирующей лимфы. Первичные или центральные лимфоидные органы генерируют лимфоциты из незрелых клеток-предшественников. Тимус и костный мозг составляют основные лимфоидные органы. Вторичные или периферические лимфоидные органы, включая лимфатические узлы и селезенку, поддерживают зрелые наивные лимфоциты и инициируют адаптивный иммунный ответ.
РНК может быть доставлена в селезенку с помощью так называемых липоплексных составов, в которых РНК связана с липосомами, содержащими катионный липид, и при необходимости, дополнительный или вспомогательный липид с образованием инъекционных составов наночастиц. Липосомы могут быть получены путем инъекции раствора липидов в этаноле в воду или подходящую водную фазу. Липоплексные частицы РНК для направленной доставки в селезенку могут быть получены путем смешивания липосом с РНК. Липоплексные частицы РНК для направленной доставки в селезенку описаны в WO 2013/143683, включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Было обнаружено, что липоплексные частицы РНК, имеющие суммарный отрицательный заряд, могут быть использованы для преимущественной направленной доставки в ткань селезенки или клетки селезенки, такие как антигенпрезентирующие клетки, в частности дендритные клетки. Соответственно, после введения липоплексных частиц РНК происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в селезенке. Таким образом, липоплексные частицы РНК по настоящему описанию можно использовать для экспрессии РНК в селезенке. В одном варианте осуществления после введения липоплексных частиц РНК не происходит или практически не происходит накопления РНК и/или экспрессии РНК в легких и/или печени. В одном варианте осуществления после введения липоплексных частиц РНК происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в антигенпрезентирующих клетках, таких как профессиональные антигенпрезентирующие клетки в селезенке. Таким образом, липоплексные частицы РНК по настоящему описанию можно использовать для экспрессии РНК в таких антигенпрезентирующих клетках. В одном варианте осуществления антигенпрезентирующие клетки представляют собой дендритные клетки и/или макрофаги.
В контексте настоящего описания термин «липоплексная частица РНК» относится к частице, которая содержит липид, в частности катионный липид, и РНК. Электростатические взаимодействия между положительно заряженными липосомами и отрицательно заряженной РНК приводят к комплексообразованию и спонтанному образованию липоплексных частиц РНК. Положительно заряженные липосомы обычно можно синтезировать с использованием катионного липида, такого как DOTMA, и дополнительных липидов, таких как DOPE. В одном варианте осуществления липоплексная частица РНК представляет собой наночастицу.
Используемый в настоящей заявке термин «катионный липид» относится к липиду, имеющему суммарный положительный заряд. Катионные липиды связывают отрицательно заряженную РНК электростатическим взаимодействием с липидной матрицей. Обычно катионные липиды содержат липофильную группу, такую как стерол, ацильную или диацильную цепь, и концевая группа липида обычно несет положительный заряд. Примеры катионных липидов включают 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA), диметилдиоктадециламмоний (DDAB); 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP); 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропан (DODAP); 1,2-диацилокси-3-диметиламмоний-пропаны; 1,2-диалкилокси-3-диметиламмоний-пропаны; диоктадецилдиметиламмоний хлорид (DODAC), 2,3-ди (тетрадекокси)пропил-(2-гидроксиэтил)диметилазаний (DMRIE), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DMEPC), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропан (DMTAP), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметил-гидроксиэтиламмоний бромид (DORIE) и 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамид)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминий трифторацетат (DOSPA), но не ограничиваются ими. Предпочтительными являются DOTMA, DOTAP, DODAC и DOSPA. В конкретных вариантах осуществления катионный липид представляет собой DOTMA и/или DOTAP.
Дополнительный липид может быть включен для регуляции общего отношения положительного и отрицательного зарядов и физической стабильности липоплексных частиц РНК. В некоторых вариантах осуществления дополнительный липид представляет собой нейтральный липид. Используемый здесь термин «нейтральный липид» относится к липиду, имеющему нулевой суммарный заряд. Примеры нейтральных липидов включают 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингоэмиелин, цефалин, холестерин и цереброзид, но не ограничиваются ими. В конкретных вариантах осуществления дополнительный липид представляет собой DOPE, холестерин и/или DOPC.
В некоторых вариантах осуществления частицы липоплекса РНК включают как катионный липид, так и дополнительный липид. В примерном варианте осуществления катионный липид представляет собой DOTMA, а дополнительный липид представляет собой DOPE.
В некоторых вариантах осуществления молярное отношение по меньшей мере одного катионного липида к по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет примерно от 10:0 до 1:9, примерно от 4:1 до 1:2 или примерно от 3:1 до 1:1. В конкретных вариантах осуществления молярное соотношение может составлять примерно 3:1, примерно 2,75:1, примерно 2,5:1, примерно 2,25:1, примерно 2:1, примерно 1,75:1, примерно 1,5:1, примерно 1,25:1 или примерно 1:1. В примерном варианте осуществления молярное отношение по меньшей мере одного катионного липида к по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет примерно 2:1.
Описанные в настоящей заявке липоплексные частицы РНК имеют средний диаметр, который в одном варианте осуществления находится в диапазоне примерно от 200 нм до 1000 нм, примерно от 200 нм до 800 нм, примерно от 250 до 700 нм, примерно от 400 до 600 нм, примерно от 300 нм до 500 нм или примерно от 350 нм до 400 нм. В конкретных вариантах осуществления липоплексные частицы РНК имеют средний диаметр примерно 200 нм, примерно 225 нм, примерно 250 нм, примерно 275 нм, примерно 300 нм, примерно 325 нм, примерно 350 нм, примерно 375 нм, примерно 400 нм, примерно 425 нм, примерно 450 нм, примерно 475 нм, примерно 500 нм, примерно 525 нм, примерно 550 нм, примерно 575 нм, примерно 600 нм, примерно 625 нм, примерно 650 нм, примерно 700 нм, примерно 725 нм, примерно 750 нм, примерно 775 нм, примерно 800 нм, примерно 825 нм, примерно 850 нм, примерно 875 нм, примерно 900 нм, примерно 925 нм, примерно 950 нм, примерно 975 нм или примерно 1000 нм. В одном варианте осуществления липоплексные частицы РНК имеют средний диаметр в диапазоне примерно от 250 нм до 700 нм. В другом варианте осуществления липоплексные частицы РНК имеют средний диаметр в диапазоне примерно от 300 нм до 500 нм. В примерном варианте осуществления липоплексные частицы РНК имеют средний диаметр примерно 400 нм.
Электрический заряд липоплексных частиц РНК по настоящему изобретению представляет собой сумму электрических зарядов, присутствующих по меньшей мере в одном катионном липиде, и электрических зарядов, присутствующих в РНК. Отношение зарядов - это отношение положительных зарядов, присутствующих по меньшей мере в одном катионном липиде, к отрицательным зарядам, присутствующим в РНК. Отношение положительных зарядов, присутствующих по меньшей мере в одном катионном липиде, к отрицательным зарядам, присутствующим в РНК, рассчитывают по следующему уравнению: отношение зарядов = [(концентрация катионного липида (моль)) * (общее количество положительных зарядов в катионном липиде)] / [(концентрация РНК (моль)) * (общее количество отрицательных зарядов в РНК)].
Описанные в настоящей заявке липоплексные частицы РНК для направленной доставки в селезенку при физиологическом pH, предпочтительно имеют суммарный отрицательный заряд, такой как отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам примерно от 1,9:2 до 1:2. В конкретных вариантах осуществления отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в липоплексных частицах РНК при физиологическом pH составляет примерно 1,9:2,0, примерно 1,8:2,0, примерно 1,7:2,0, примерно 1,6:2,0, примерно 1,5:2,0, примерно 1,4:2,0, примерно 1,3:2,0, примерно 1,2:2,0, примерно 1,1:2,0 или примерно 1:2,0.
Системы доставки РНК имеют характерное предпочтение по отношению к печени. Это касается частиц на основе липидов, катионных и нейтральных наночастиц, в частности липидных наночастиц, таких как липосомы, наномицеллы и липофильные лиганды в биоконъюгатах. Накопление в печени вызвано прерывистой природой сосудистой сети печени или метаболизмом липидов (липосом и конъюгатов липидов или холестерина).
В одном из вариантов направленной доставки вариантного полипептида IL2, описанного в настоящей заявке, орган-мишень представляет собой печень, а ткань-мишень представляет собой ткань печени. Доставка в такую ткань-мишень является предпочтительной, в частности, если необходимо присутствие вариантного полипептида IL2 в этом органе или ткани и/или если необходимо экспрессировать большие количества вариантного полипептида IL2 и/или если системное присутствие вариантного полипептида IL2, особенно в значительных количествах, желательно или необходимо.
В одном варианте осуществления РНК, кодирующую вариантный полипептид IL2, вводят в составе для направленной доставки в печень. Такие составы описаны здесь выше.
Для доставки РНК в печень in vivo можно использовать систему доставки лекарств, чтобы транспортировать РНК в печень, предотвращая ее деградацию. Например, полиплексные наномицеллы, состоящие из поверхности, покрытой полиэтиленгликолем (PEG), и ядра, содержащего мРНК, являются полезной системой, поскольку наномицеллы обеспечивают превосходную стабильность РНК in vivo в физиологических условиях. Кроме того, свойство невидимости, обеспечиваемое поверхностью полиплексной наномицеллы, состоящей из плотных палисадов ПЭГ, обеспечивает эффективное уклонение от иммунной защиты хозяина.
Фармацевтические композиции
Пептиды, белки, полипептиды, РНК, частицы РНК, иммунные эффекторные клетки и другие агенты, например, ингибиторы иммунной контрольной точки, описанные в настоящей заявке, могут быть введены в фармацевтических композициях или лекарственных средствах для терапевтического или профилактического лечения, и могут быть введены в форме любых подходящих фармацевтических композиций, которые могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, и могут при необходимости содержать один или несколько адъювантов, стабилизаторов и т.д. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция предназначена для терапевтического или профилактического лечения, например, для использования при лечении или профилактике заболевания, связанного с антигеном, такого как онкологические заболевания, такие как описаны в настоящей заявке.
Термин «фармацевтическая композиция» относится к составу, содержащему терапевтически эффективный агент, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами. Указанная фармацевтическая композиция полезна для лечения, предотвращения или уменьшения тяжести заболевания или расстройства путем введения указанной фармацевтической композиции субъекту. Фармацевтическая композиция также известна в данной области техники как фармацевтический состав. В контексте настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает пептиды, белки, полипептиды, РНК, частицы РНК, иммунные эффекторные клетки и/или другие агенты, как описано в настоящей заявке.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько адъювантов, или могут быть введены с одним или несколькими адъювантами. Термин «адъювант» относится к соединению, которое продлевает, усиливает или ускоряет иммунный ответ. Адъюванты включают гетерогенную группу соединений, таких как масляные эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие как квасцы), бактериальные продукты (такие как токсин Bordetella pertussis) или иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов включают ЛПС, GP96, олигодезоксинуклеотиды CpG, факторы роста и цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины, хемокины, но не ограничиваются ими. Цитокинами могут быть IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-a. Другими известными адъювантами являются гидроксид алюминия, адъювант Фрейнда или масло, такое как Montanide® ISA51. Другие подходящие адъюванты для использования в настоящем раскрытии включают липопептиды, такие как Pam3Cys.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению обычно применяют в «фармацевтически эффективном количестве» и в «фармацевтически приемлемом препарате».
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к отсутствию токсичности материала, который не взаимодействует с активным компонентом фармацевтической композиции.
Термин «фармацевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое обеспечивает необходимую реакцию или необходимый эффект по отдельности или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного заболевания необходимая реакция предпочтительно связана с ингибированием течения заболевания. Это включает замедление прогрессирования болезни и, в частности, прерывание или регресс развития болезни. Необходимой реакцией при лечении заболевания также может быть отсрочка возникновения или предотвращение возникновения указанного заболевания или указанного состояния. Эффективное количество описанных в настоящей заявке композиций будет зависеть от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, рост и массу тела, продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии (при ее наличии), конкретный способ введения и аналогичные факторы. Соответственно, вводимые дозы описанных здесь композиций могут зависеть от различных таких параметров. В случае, если реакция у пациента недостаточна для начальной дозы, могут быть использованы более высокие дозы (или по существу более высокие дозы, достигаемые другим, более локализованным путем введения).
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать соли, буферы, консерванты и, возможно, другие терапевтические агенты. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или вспомогательных веществ.
Подходящие консерванты для использования в фармацевтических композициях по настоящему изобретению включают бензалкония хлорид, хлорбутанол, парабен и мертиолят, но не ограничиваются ими.
Используемый в настоящей заявке термин «вспомогательное вещество» относится к веществу, которое может присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, но не является активным ингредиентом. Примеры вспомогательных веществ включают носители, связующие агенты, разбавители, любриканты, загустители, поверхностно-активные агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы, ароматизаторы или красители, но не ограничиваются ими.
Термин «разбавитель» относится к разбавляющему и/или разжижающему веществу. Далее, термин «разбавитель» включает любую одно или несколько из жидкости, жидкой или твердой суспензии и/или смешивающей среды. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.
Термин «носитель» относится к компоненту, который может быть природным, синтетическим, органическим, неорганическим, в котором активный компонент объединен для облегчения, усиления или обеспечения возможности введения фармацевтической композиции. Используемый здесь носитель может быть одним или несколькими совместимыми твердыми или жидкими наполнителями, разбавителями или инкапсулирующими веществами, которые подходят для введения субъекту. Подходящий носитель включает стерильную воду, раствор Рингера, Рингер-лактатный раствор, стерильный раствор хлорида натрия, изотонический солевой раствор, полиалкиленгликоли, гидрированные нафталины и, в частности, биосовместимые лактидные полимеры, сополимеры лактида/гликолида или сополимеры полиоксиэтилена/полиоксипропилена, но не ограничивается ими. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает изотонический солевой раствор.
Фармацевтически приемлемые носители, наполнители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтике и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R Gennaro, редакция 1985).
Фармацевтические носители, вспомогательные вещества или разбавители могут быть выбраны с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики.
В одном варианте осуществления описанные здесь фармацевтические композиции можно вводить внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрикожно или внутримышечно. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция приготовлена для местного или системного введения. Системное введение может включать энтеральное введение, которое включает абсорбцию через желудочно-кишечный тракт, или парентеральное введение. Используемый здесь термин «парентеральное введение» относится к введению любым способом, отличным от желудочно-кишечного тракта, таким как внутривенная инъекция. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции составлены для системного введения. В другом предпочтительном варианте осуществления системное введение осуществляют путем внутривенного введения. В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения РНК, кодирующую вариантный полипептид IL2, описанный в настоящей заявке, и при необходимости РНК, кодирующую антиген, вводят системно.
Используемый в настоящей заявке термин «совместное введение» означает процесс, посредством которого разные соединения или композиции (например, иммунные эффекторные клетки, РНК, кодирующую вариантный полипептид IL2, и при необходимости РНК, кодирующую вакцинный антиген) вводят одному и тому же пациенту. Различные соединения или композиции можно вводить одновременно, по существу в одно и то же время или последовательно.
Лечение
Агенты, композиции и способы, описанные в настоящей заявке, можно использовать для лечения субъекта с заболеванием, например, заболеванием, характеризующимся наличием патологических клеток, экспрессирующих антиген. Особо предпочтительными заболеваниями являются онкологические заболевания. Например, если антиген происходит от вируса, агенты, композиции и способы могут быть полезны при лечении вирусного заболевания, вызванного указанным вирусом. Если антиген представляет собой опухолевый антиген, агенты, композиции и способы могут быть полезны при лечении онкологического заболевания, при котором раковые клетки экспрессируют указанный опухолевый антиген.
Агенты, композиции и способы, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы в терапевтическом или профилактическом лечении различных заболеваний, при этом обеспечение эффекторных иммунных клеток и/или активность иммунных эффекторных клеток, как описано в настоящей заявке, является благоприятным для пациента, страдающего таким заболеванием, как рак и инфекционные заболевания. В одном варианте осуществления описанные здесь агенты, композиции и способы полезны для профилактического и/или терапевтического лечения заболевания, связанного с антигеном.
Термин «заболевание» относится к ненормальному состоянию, которое поражает организм индивидуума. Заболевание часто трактуется как медицинское состояние, связанное с определенными симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, исходящими из внешнего источника, такими как инфекционное заболевание, или оно может быть вызвано внутренними дисфункциями, такими как аутоиммунные заболевания. У людей «болезнь» часто используется в более широком смысле для обозначения любого состояния, которое вызывает боль, дисфункцию, дистресс, социальные проблемы или смерть человека, страдающего этим заболеванием, или аналогичные проблемы для тех, кто находится в контакте с этим человеком. В этом более широком смысле он иногда включает травмы, инвалидность, расстройства, синдромы, инфекции, изолированные симптомы, девиантное поведение и атипичные вариации структуры и функции, в то время как в других контекстах и для других целей их можно рассматривать как отдельные категории. Болезни обычно поражают людей не только физически, но и эмоционально, поскольку поражение многими заболеваниями и жизнь с ними могут изменить взгляд на жизнь и личность.
В настоящем контексте термин «лечение» или «терапевтическое вмешательство» относится к ведению и уходу за субъектом с целью борьбы с таким состоянием, как заболевание или расстройство. Термин предназначен для включения полного спектра лечения данного состояния, от которого страдает субъект, такого как введение терапевтически эффективного соединения для облегчения симптомов или осложнений, для замедления прогрессирования заболевания, расстройства или состояния, для облегчения или ослабления симптомов и осложнений и/или излечения или устранения заболевания, расстройства или состояния, а также предотвращения состояния, при этом профилактику следует понимать как ведение и уход за человеком с целью борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, и она включает введение активных соединений для предотвращения появления симптомов или осложнений.
Термин «терапевтическое лечение» относится к любому лечению, которое улучшает состояние здоровья и/или продлевает (увеличивает) продолжительность жизни человека. Указанное лечение может устранить заболевание у индивидуума, остановить или замедлить развитие заболевания у индивидуума, подавить или замедлить развитие заболевания у индивидуума, уменьшить частоту или тяжесть симптомов у индивидуума и/или уменьшить рецидив у индивидуума, который в настоящее время или ранее болел.
Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» относятся к любому лечению, которое предназначено для предотвращения возникновения заболевания у индивидуума. Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» используются здесь взаимозаменяемо.
Термины «индивидуум» и «субъект» используются здесь взаимозаменяемо. Они относятся к человеку или другому млекопитающему (например, такому как мышь, крыса, кролик, собака, кошка, крупный рогатый скот, свинья, овца, лошадь или примат), которые могут быть поражены или подвержены риску развития заболевания или расстройства (например, рака), но могут иметь или не иметь заболевания или расстройства. Во многих вариантах осуществления индивидуумом является человек. Если не указано иное, термины «индивидуум» и «субъект» не обозначают конкретный возраст и, таким образом, охватывают взрослых, пожилых людей, детей и новорожденных. В вариантах осуществления настоящего изобретения «индивидуум» или «субъект» является «пациентом».
Термин «пациент» означает индивидуума или субъекта, подлежащего лечению, в частности, больного индивидуума или субъекта.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения цель состоит в обеспечении иммунного ответа против патологических клеток, экспрессирующих антиген, таких как раковые клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, и в лечении такого заболевания, как раковое заболевание, вовлекающее клетки, экспрессирующие антиген, такой как опухолевый антиген.
Используемый в настоящей заявке термин «иммунный ответ» относится к интегрированному ответу организма на антиген или клетку, экспрессирующую антиген, и относится к клеточному иммунному ответу и/или гуморальному иммунному ответу.
«Клеточно-опосредованный иммунитет», «клеточный иммунитет», «клеточный иммунный ответ» или аналогичные термины предназначены для включения клеточного ответа, направленного на клетки, характеризующиеся экспрессией антигена, в частности, характеризующиеся презентацией антигена класса I или класса II MHC. Клеточный ответ относится к клеткам, называемым Т-лимфоцитами или Т-лимфоцитами, которые действуют как «хелперы» или «киллеры». Хелперные Т-клетки (также называемые CD4+ Т-лимфоцитами) играют центральную роль, регулируя иммунный ответ, а клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-клетками, цитолитическими Т-клетками, CD8+ Т-клетками или CTL) убивают больные клетки, такие как раковые клетки, предотвращая продукцию более патологических клеток.
Настоящее изобретение предполагает иммунный ответ, который может быть защитным, превентивным, профилактическим и/или терапевтическим. Используемый здесь термин «индуцирует [или вызывает] иммунный ответ» может указывать на отсутствие иммунного ответа против конкретного антигена до индукции или может указывать на то, что до индукции существовал базовый уровень иммунного ответа против конкретного антигена, который был усиливается после индукции. Следовательно, «индуцирует [или вызывает] иммунный ответ» включает «усиливает [или повышает] иммунный ответ».
Термин «иммунотерапия» относится к лечению заболевания или состояния путем индукции или усиления иммунного ответа. Термин «иммунотерапия» включает иммунизацию антигеном или вакцинацию антигеном.
Термины «иммунизация» или «вакцинация» описывают процесс введения антигена индивидууму с целью индукции иммунного ответа, например, в терапевтических или профилактических целях.
Термин «макрофаг» относится к подгруппе фагоцитарных клеток, продуцируемых путем дифференцировки моноцитов. Макрофаги, которые активируются воспалением, иммунные цитокины или микробные продукты неспецифически поглощают и убивают чужеродные патогены внутри макрофага за счет гидролитической и окислительной атаки, что приводит к деградации патогена. Пептиды из деградированных белков подвергаются дисплею на поверхности клеток макрофагов, где они могут распознаваться Т-клетками, и они могут напрямую взаимодействовать с антителами на поверхности В-клеток, что приводит к активации Т- и В-клеток и дальнейшей стимуляции иммунного ответа. Макрофаги относятся к классу антигенпрезентирующих клеток. В одном варианте осуществления макрофаги представляют собой макрофаги селезенки.
Термин «дендритная клетка» (DC) относится к другому подтипу фагоцитарных клеток, принадлежащих к классу антигенпрезентирующих клеток. В одном варианте осуществления дендритные клетки происходят из гемопоэтических клеток-предшественников костного мозга. Эти клетки-предшественники первоначально трансформируются в незрелые дендритные клетки. Эти незрелые клетки характеризуются высокой фагоцитарной активностью и низким потенциалом активации Т-клеток. Незрелые дендритные клетки постоянно проверяют окружающую среду на наличие патогенов, таких как вирусы и бактерии. Как только они вступают в контакт с подходящим антигеном, они активируются в зрелые дендритные клетки и начинают мигрировать в селезенку или лимфатический узел. Незрелые дендритные клетки фагоцитируют патогены и расщепляют их белки на мелкие части, и после созревания презентируют эти фрагменты на своей клеточной поверхности с помощью молекул MHC. Одновременно они обеспечивают повышающую регуляцию рецепторов на поверхности клетки, которые действуют как ко-рецепторы при активации Т-клеток, такие как CD80, CD86 и CD40, значительно повышая их способность активировать Т-клетки. Они также обеспечивают повышающую регуляцию CCR7, хемотаксического рецептора, который индуцирует дендритные клетки к перемещению через кровоток в селезенку или через лимфатическую систему в лимфатический узел. Здесь они действуют как антигенпрезентирующие клетки и активируют Т-хелперы и Т-киллеры, а также В-клетки, презентируя им антигены наряду с не-антиген-специфическими костимулирующими сигналами. Таким образом, дендритные клетки могут активно индуцировать иммунный ответ, связанный с Т-клетками или В-клетками. В одном варианте осуществления дендритные клетки представляют собой дендритные клетки селезенки.
Термин «антигенпрезентирующая клетка» (APC) означает клетку из множества клеток, способных отображать, приобретать и/или презентировать по меньшей мере один антиген или антигенный фрагмент на своей клеточной поверхности. Антигенпрезентирующие клетки можно отличить от профессиональных антигенпрезентирующих клеток и непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток.
Термин «профессиональные антигенпрезентирующие клетки» относится к антигенпрезентирующим клеткам, которые конститутивно экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС класса II), необходимые для взаимодействия с наивными Т-клетками. Если Т-клетка взаимодействует с комплексом молекул MHC класса II на мембране антигенпрезентирующей клетки, антигенпрезентирующая клетка продуцирует костимуляторную молекулу, индуцирующую активацию Т-клетки. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки включают дендритные клетки и макрофаги.
Термин «непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки» относится к антигенпрезентирующим клеткам, которые экспрессируют молекулы MHC класса II не конститутивно, но при стимуляции определенными цитокинами, такими как интерферон-гамма. Примеры непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток включают фибробласты, эпителиальные клетки тимуса, эпителиальные клетки щитовидной железы, глиальные клетки, бета-клетки поджелудочной железы или эндотелиальные клетки сосудов.
«Процессинг антигена» относится к расщеплению антигена на продукты его процессирования, которые являются фрагментами указанного антигена (например, к расщеплению белка на пептиды), и к ассоциации одного или нескольких из этих фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами MHC для презентации клетками, такие как антигенпрезентирующие клетки, специфическим Т-клеткам.
Термин «заболевание, связанное с антигеном» относится к любому заболеванию, которое связано с антигеном, например, заболеванию, характеризующемуся наличием антигена. Заболевание, связанное с антигеном, может быть инфекционным заболеванием, онкологическим заболеванием или просто раком. Как упоминалось выше, антиген может быть ассоциированным с заболеванием антигеном, таким как ассоциированный с опухолью антиген, вирусный антиген или бактериальный антиген. В одном варианте осуществления заболевание, вовлекающее антиген, представляет собой заболевание, вовлекающее клетки, экспрессирующие антиген, предпочтительно на поверхности клетки.
Термин «инфекционные заболевания» относится к любому заболеванию, которое может передаваться от индивидуума к индивидууму или от организма к организму, и вызывается микробным агентом (например, ОРВИ). Инфекционные заболевания известны в данной области техники и включают, например, вирусное заболевание, бактериальное заболевание или паразитарное заболевание, которое вызывается вирусом, бактерией и паразитом, соответственно. В этом отношении инфекционным заболеванием может быть, например, гепатит, заболевания, передающиеся половым путем (например, хламидиоз или гонорея), туберкулез, ВИЧ/синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), дифтерия, гепатит B, гепатит C, холера, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), птичий грипп и грипп.
Термины «онкологическое заболевание» или «рак» обозначают или описывают физиологическое состояние индивидуума, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз, но не ограничиваются ими. Более конкретно, примеры таких видов рака включают рак костей, гемобластоз, рак легкого, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, анальный рак, рак желудка, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак половых и репродуктивных органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак мочевого пузыря, рак почки, почечно-клеточный рак, рак почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), нейроэктодермальный рак, опухоли спинного мозга, глиому, менингиому и аденому гипофиза. Термин «рак» в соответствии с описанием также включает метастазы рака.
Комбинированные стратегии лечения рака могут быть необходимыми из-за результирующего синергетического эффекта, который может быть значительно сильнее, чем эффект монотерапевтического подхода. В одном из вариантов осуществления фармацевтическую композицию вводят с иммунотерапевтическим агентом. Используемый в настоящей заявке термин «иммунотерапевтический агент» относится к любому агенту, который может участвовать в активации специфического иммунного ответа и/или иммунной эффекторной функции (функций). Настоящее изобретение предполагает использование антитела в качестве иммунотерапевтического агента. Не желая углубляться в теорию, антитела способны достигать терапевтического эффекта против раковых клеток с помощью различных механизмов, включая индукцию апоптоза, блокировку компонентов путей передачи сигнала или ингибирование пролиферации опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут вызывать гибель клеток посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или связываясь с белками комплемента, что приводит к прямой клеточной токсичности, известной как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC). Неограничивающие примеры противораковых антител и потенциальных мишеней антител (в скобках), которые можно использовать в комбинации с настоящим изобретением, включают: абаговомаб (CA-125), абциксимаб (CD41), адекатумумаб (EpCAM), афутузумаб (CD20), алацизумаб пегол (VEGFR2), альтумомаб пентенат (CEA), аматуксимаб (MORAb-009), анатумомаб мафенатокс (TAG-72), аполизумаб (HLA-DR), аркитумомаб (CEA), атезолизумаб (PD-L), бавитуксимаб (фосфатидилсерин), бектумомаб (CD22), белимумаб (BAFF), бевацизумаб (VEGF-A), биватузумаб мертансин (CD44 v6), блинатумомаб (CD19), брентуксимаб ведотин (CD30 TNFRSF8), кантузумаб мертансин (муцин CanAg), кантузумаб равтансин (MUC1), капромаб пендетид (клетки карциномы предстательной железы), карлумаб (CNT0888), катумаксомаб (EpCAM, CD3), цетуксимаб (EGFR), цитатузумаб богатокс (EpCAM), циксутумумаб (рецептор IGF-1), клаудиксимаб (клаудин), кливатузумаб тетраксетан (MUC1), конатумумаб (TRAIL-R2), дацетузумаб (CD40), далотузумаб (рецептор инсулиноподобного фактора роста I), деносумаб (RANKL), детумомаб (клетка B-лимфомы), дрозитумаб (DR5), экромексимаб (ганглиозид GD3), эдреколомаб (EpCAM), элотузумаб (SLAMF7), энаватузумаб (PDL192), энситуксимаб (NPC-1C), эпратузумаб (CD22), эртумаксомаб (HER2/neu, CD3), этарацизумаб (интегрин ανβ3), фарлетузумаб (фолатный рецептор 1), FBTA05 (CD20), фиклатузумаб (SCH 900105), фигитумумаб (рецептор IGF-1), фланвотумаб (гликопротеин 75), фрезолимумаб (TGF-β), галиксимаб (CD80), ганитумаб (IGF-I), гемтузумаб озогамицин (CD33), гевокизумаб (ILIβ), гирентуксимаб (карбоангидраза 9 (CA-IX)), глембатумумаб ведотин (GPNMB), ибритумомаб тиуксетан (CD20), икрукумаб (VEGFR-1), иговомаб (CA-125), индатуксимаб равтансин (SDC1), интетумумаб (CD51), инотузумаб озогамицин (CD22), ипилимумаб (CD152), иратумумаб (CD30), лабетузумаб (CEA), лексатумумаб (TRAIL-R2), либивирумаб (поверхностный антиген гепатита B), линтузумаб (CD33), лорвотузумаб мертансин (CD56), лукатумумаб (CD40), люмиликсимаб (CD23), мапатумумаб (TRAIL-R1), матузумаб (EGFR), меполизумаб (IL5), милатузумаб (CD74), митумомаб (ганглиозид GD3), могамулизумаб (CCR4), моксетумомаб пасудотокс (CD22), наколомаб тафенатокс (антиген C242), наптумомаб эстафенатокс (5T4), наматумаб (RON), нецитумумаб (EGFR), нимотузумаб (EGFR), ниволумаб (IgG4), офатумумаб (CD20), оларатумаб (PDGF-R a), онартузумаб (киназа рецептора человеческого рассеивающего фактора), опортузумаб монатокс (EpCAM), ореговомаб (CA-125), окселумаб (OX-40), панитумумаб (EGFR), патритумаб (HER3), пемтумомаб (MUC1), пертузумаб (HER2/neu), пинтумомаб (антиген аденокарциномы), притумумаб (виментин), ракотумомаб (N-гликолилнейраминовая кислота), радретумаб (экстра-домен фибронектина-B), рафивирумаб (гликопротеин вируса бешенства), рамуцирумаб (VEGFR2), рилотумумаб (HGF), ритуксимаб (CD20), робатумумаб (рецептор IGF-1), самализумаб (CD200), сибротузумаб (FAP), силтуксимаб (IL6), табалумаб (BAFF), такатузумаб тетраксетан (альфа-фетопротеин), таплитумомаб паптокс (CD19), тенатумомаб (тенасцин C), тепротумумаб (CD221), тицилимумаб (CTLA-4), тигатузумаб (TRAIL-R2), TNX-650 (IL13), тозитумомаб (CD20), трастузумаб (HER2/neu), TRBS07 (GD2), тремелимумаб (CTLA-4), тукотузумаб целмолейкин (EpCAM), ублитуксимаб (MS4A1), урелумаб (4-1 BB), волоциксимаб (интегрин α5β1), вотумумаб (опухолевый антиген CTAA 16.88), залутумумаб (EGFR) и занолимумаб (CD4).
Цитирование документов и исследований, упомянутых в настоящей заявке, не означает признание того, что любое из вышеизложенного относится к соответствующему уровню техники. Все утверждения относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются признанием правильности содержания этих документов.
Следующее описание представлено, чтобы дать возможность специалисту в данной области техники создавать и использовать различные варианты осуществления. Описание конкретных устройств, методов и приложений приводится только в качестве примеров. Различные модификации описанных здесь примеров будут очевидны для специалистов в данной области техники, и общие принципы, определенные в настоящей заявке, могут быть применены к другим примерам и приложениям, не выходя за рамки сущности и объема различных вариантов осуществления. Таким образом, различные варианты осуществления не предназначены для ограничения описанными и показанными примерами, но должны соответствовать объему, соответствующему формуле изобретения.
Примеры
Пример 1: Дизайн конструкции
Чтобы сконструировать реципрокные пары человеческого IL2 (hIL2) и субъединицы альфа рецептора интерлейкина 2 (hIL2RA, CD25), в области связывания hIL2:hIL2RA были реализованы различные аминокислотные замены. Более подробно, руководствуясь кристаллической структурой высокоаффинного рецепторного комплекса hIL2, опубликованной Stauber et al. (Stauber, D. et al. PNAS February 21, 2006 103 (8) 2788-2793), были идентифицированы три пары основных и кислых аминокислотных остатков, которые являются частью ионных взаимодействий, управляющих связыванием hIL2: hIL2RA. Соответствующие остатки заменяли реципрокным способом, в результате чего основные аминокислоты превращались в кислые аминокислоты, и наоборот. Как для hIL2, так и для соответствующего hIL2RA было изменено до трех аминокислотных положений, что привело к появлению четырех вариантов hIL2 с прогнозируемым измененным связыванием hIL2RA и четырех мутантов hIL2RA с прогнозируемым измененным связыванием hIL2.
Четыре различных варианта hIL2 содержали следующие аминокислотные замены:
- hIL2_A3: K35E, K43E и E61K
- hIL2_A4: K43E и E61K
- hIL2_A5: E61K
- hIL2_A8: K43E
Четыре разных мутанта hIL2RA содержали следующие замены:
- hIL2RA_mut1: E29K и K38E
- hIL2RA_mut2: K38E
- hIL2RA_mut3: E29K
- hIL2RA_mut4: E1K, E29K и K38E
На основе этого первоначального дизайна были прогнозированы четыре благоприятных комбинации сочетающихся мутантных hIL2 и hIL2RA (см. Таблицу 1).
(K38E)
(E29K)
(E1K,E29K,K38E)
(K35E,K43E,E61K)
(K43E,E61K)
(E61K)
(K43E)
Пример 2: Продукция мРНК
Кодирующие цитокины мРНК для транскрипции in vitro были основаны на плазмидном каркасе pST1-T7-AGA-dEarI-hAg-MCS-FI-A30LA70 и производных ДНК-конструкциях. Эти плазмидные конструкции содержат 5' UTR (нетранслируемую область, производную 5'-UTR субъединицы альфа 1 гемоглобина (hAg) Homo sapiens), 3'-элемент FI (где F представляет собой 3'-UTR-фрагмент аминоконцевого энхансера расщепленной мРНК длиной 136 нуклеотидов, а I представляет собой 142-нуклеотидный фрагмент митохондриально кодируемой 12S-РНК, оба идентифицированы у Homo sapiens; WO 2017/060314), и поли(A) хвост из 100 нуклеотидов с линкером после 70 нуклеотидов.
Последовательности, кодирующие цитокины и сывороточный альбумин (hAlb), происходят от Homo sapiens, и никаких изменений в результирующих аминокислотных последовательностях не было внесено, за исключением предполагаемых мутаций в вариантах hIL2, описанных выше (hIL2: NP_000577.2; белковый ресурс NCBI). Для цитокиновых конструкций вариант hIL2 был добавлен к C-концу hAlb, и кодируемые белки были снабжены N-концевым сигнальным пептидом (SP), который является нативным SP соответствующего белка. В случае слитых белков сохранялся только SP N-концевой части, для других частей кодировалась только зрелая часть (белок без SP). Стоп-кодон был введен только для большей части С-концевого компонента. Различные белковые части в слитых конструкциях цитокинов и hAlb были разделены 30-нуклеотидной линкерной последовательностью, кодирующей остатки глицина и серина.
Последовательность, кодирующая IL2RA, происходит от Homo sapiens, и никаких изменений в результирующих аминокислотных последовательностях не было внесено, за исключением предполагаемых мутаций для изменения связывания hIL2 в реципрокных мутантах hIL2RA, описанных выше (hIL2RA: NP_000408.1; белковый ресурс NCBI). Кодированные белки были снабжены N-концевым сигнальным пептидом (SP), который является нативным SP hIL2RA.
мРНК получали транскрипцией in vitro, как описано Kreiter et al. (Kreiter, S. et al. Cancer Immunol. Immunother. 56, 1577-87 (2007)), с заменой нормального нуклеозида уридина на 1-метил-псевдоуридин. Полученные мРНК были снабжены структурой Cap1, а двухцепочечные (дцРНК) молекулы были истощены. Очищенную мРНК элюировали H2O и хранили при -80°C до дальнейшего использования. Транскрипция in vitro всех описанных конструкций мРНК была проведена в BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH. Список всех конструкций, использованных в последующих экспериментах, приведен в Таблице 2.
Пример 3: Экспрессия in vitro РНК-кодируемых вариантов hAlb-hIL2.
Экспрессия in vitro генерированных мРНК, кодирующих варианты hAlb-hIL2, была проанализирована путем липофекции мРНК в клетки HEK293T/17 и последующего анализа CD25-независимой активации репортерных клеток, экспрессирующих IL2Rβγ, надосадочной жидкостью, содержащей вариант hAlb-hIL2 (Фигура 1А, 1В). За день до липофекции 1,2×106 клеток HEK293T/17 засевали в 3 мл среды DMEM (Life Technologies GmbH, кат. №31966-021) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Biochrom GmbH, кат. №S0115). в 6-луночных планшетах. Для липофекции готовили 3 мкг IVT-мРНК в стерильных условиях без РНКаз с использованием 400 нг мРНК на мкл Lipofectamine MessengerMax (Thermo Fisher Scientific, кат. № LMRNA015) и наносили в 10 см2 культуральной чашке на клетки HEK293T/17 примерно при 80% слияния. После 20 часов экспрессии надосадочную жидкость собирали в стерильных условиях и хранили при -20°C до дальнейшего использования. CD25-независимую биоактивность вариантов hAlb-hIL2 оценивали путем измерения специфических реакций пролиферации клеток TF-1_IL2Rβγ, экспрессирующих рецептор IL2 с промежуточной аффинностью (IL2Rβγ). Эта клеточная линия была получена из клеток TF-1 (ATCC CRL-2003), линии эритролейкемических клеток человека, естественным образом экспрессирующих общую γ-цепь IL2R, путем трансдукции ретровирусным вектором, кодирующим последовательность цепи человеческого IL2Rβ (Идентификатор гена: 3560) по аналогии с Farner et al. (Farner, N. L. et al. Blood 86, 4568-4578 (1995)). Вкратце, клетки TF-1_IL2Rβγ промывали два раза D-PBS и повторно суспендировали в RPMI 1640 (+ GlutaMAX, Life Technologies GmbH, кат. №61870-010) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; Biochrom GmbH, кат. №S0115) и 1 мМ пирувата натрия (Life Technologies GmbH, кат. №11360-039). Всего 5000 клеток на лунку высевали в белые 96-луночные планшеты с плоским дном (Fisher Scientific GmbH, кат. №10072151) и инкубировали с четырехкратными серийными разведениями надосадочной жидкости, содержащей вариант hAlb-hIL2. Через три дня культивирования пролиферацию измеряли путем количественного определения жизнеспособных клеток по количеству АТФ с использованием теста CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, кат. №G9242). Люминесценцию регистрировали на ридере Tecan Infinite® F200 PRO (Tecan Deutschland GmbH), а кривые доза-реакция строили в GraphPad Prism версии 6.04 (GraphPad Software, Inc.).
HAlb-hIL2 дикого типа, а также все варианты hAlb-hIL2 со сниженной аффинностью связывания с CD25 (т.е. hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4, hAlb-hIL2_A5 и hAlb-hIL2_A8) обеспечивали равную индукцию CD25-независимой β-пролиферации IL2Rβγ-экспрессирующих клеток TF-1_IL2Rβγ с почти совпадающими кривыми доза-ответ (Фигуры 1A, 1B). Это также отражено в рассчитанных значениях ЕС50 в диапазоне от 4,62% надосадочной жидкости для hAlb-hIL2_A5 до 6,82% надосадочной жидкости для hAlb-hIL2_A4 (Таблица 3). В сумме это указывает на то, что мРНК, кодирующая hAlb-hIL2, а также варианты hAlb-IL2, транслируется в сопоставимые количества функционального цитокина.
Пример 4: Экспрессия in vitro мутантов hIL2RA (CD25), кодируемых РНК, в первичных CD8+ Т-клетках человека.
Чтобы проверить экспрессию мутантов hIL2RA в первичных CD8+ T-клетках человека, CD8+ T-клетки были выделены из РВМС методом магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) с использованием анти-CD8 MicroBeads (Miltenyi, кат. №130-045-201) в соответствии с инструкциями производителя. Примерно 10×106 CD8+ Т-клеток подвергали электропорации с 15 мкг транскрибированной in vitro (IVT)-мРНК, кодирующей мутанты hIL2RA (CD25), в 250 мкл X-Vivo15 (Biozym Scientific GmbH, кат. №881026) в 4-мм кювете для электропорации (VWR International GmbH, кат. №732-0023) с использованием устройства системы электропорации BTX ECM® 830 (BTX; 500 В, импульс 1×3 мс). Сразу после электропорации клетки переносили в свежую среду Дульбекко в модификации Искова (IMDM; Life Technologies GmbH, кат. №12440-053) с добавлением 5% сыворотки АВ, полученной из плазмы человека (One Lambda, кат. № A25761), и инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение примерно 24 часов. На следующий день собирали CD8+ Т-клетки и проверяли экспрессию мутантов hIL2RA (CD25) на клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. CD8+ Т-клетки окрашивали мышиным антителом PerCP-Cy™ 5.5 против CD25 человека (Becton Dickinson GmbH, кат. №560503). Анализ индивидуальной экспрессии на клеточной поверхности вариантов hIL2RA (CD25) проводили, оценивая среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в качестве параметра считывания.
По сравнению с ложно-электропорированными CD8+ Т-клетками, значение MFI CD8+ T-клеток, электропорированных с hIL2RA или мутантом hIL2RA, было увеличено в ≥ 9 раз (MFI 1837 против ≥ 17998; Фигура 2), что доказывает успешную поверхностную экспрессию всех протестированных конструкции hIL2RA. Важно отметить, что уровни экспрессии всех конструкций hIL2RA были в одном порядке величины, в диапазоне MFI от 17998 до 27352.
Пример 5: Сравнение функциональной активности вариантов hAlb-hIL2 на естественно экспрессирующих CD25 CD4+CD25+ регуляторных Т-клетках по сравнению с первичными CD8+ Т-клетками, электропорированными с hIL2RA (CD25), при измерении с помощью IL2-опосредованного фосфорилирования STAT5.
Чтобы квалифицировать изолированные первичные CD8+ Т-клетки человека, трансфицированные различными мутантами hIL2RA, как адекватную модельную систему для тестирования биологической активности различных реципрокно сконструированных вариантов hAlb-hIL2, биоактивность двух типичных вариантов hAlb-hIL2 с дефицитом связывания CD25 (hAlb- hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4) в сравнении с hAlb-hIL2 анализировали на CD4+CD25+ регуляторных Т-клетках, естественно экспрессирующих CD25, по сравнению с аутологичными CD8+ Т-клетками, электропорированными с hIL2RA (CD25), посредством анализа фосфорилирования STAT5.
На первом этапе CD8+ Т-клетки выделяли из РВМС, полученных от здоровых доноров (Transfusionszentrale, Университетская больница, Майнц, Германия) с помощью технологии MACS с использованием анти-CD8 MicroBeads в соответствии с инструкциями производителя. Примерно 10×106 CD8+ Т-клеток подвергали электропорации с 15 мкг IVT-мРНК, кодирующей hIL2RA (CD25), в 250 мкл X-Vivo15, как описано в Примере 4 (500 В, импульс 1×3 мс). Сразу после электропорации клетки переносили в свежую среду IMDM с добавлением 5% сыворотки AB человека и оставляли на ночь при 37°C, 5% CO2. На следующий день аутологичные РВМС размораживали, ресуспендировали в IMDM с добавлением 5% сыворотки AB человека и выдерживали в течение 2 часов при 37°C и 5% CO2. После инкубации (i) 125000 hIL2RA (CD25)-электропорированных CD8+ Т-клеток, и (ii) 125000 РВМС высевали на лунку 96-луночного планшета с V-образным дном (Greiner Bio-One GmbH, кат. №651101) с добавлением IMDM с 5% сывороткой AB человека. Параллельно с этим были получены восемь шестикратных серийных разведений надосадочной жидкости, содержащей вариант hAlb-hIL2, в IMDM с добавлением 5% сыворотки AB человека. Посеянные клетки смешивали 1:1 с надосадочной жидкостью вариантов hAlb-hIL2 и стимулировали в течение 10 мин при 37°C и 5% CO2. Затем добавляли фиксируемый краситель для определения жизнеспособности 1:1000 eFluor™ 780 (eBioscience, кат. №65-0865-14) и стимулировали клетки еще в течение 5 минут при 37°C и 5% CO2. Клетки фиксировали добавлением забуференного формальдегида (Carl Roth GmbH + Co. KG, кат. №P087.4) до конечной концентрации 2% и инкубировали в течение 10 минут на льду. Фиксированные РВМС/CD8+ Т-клетки промывали ледяным D-PBS и повышали проницаемость 100% ледяным метанолом (Carl Roth, кат. №7342.2) в течение 30 минут на льду. Пермеабилизированные РВМС/CD8+ Т-клетки дважды промывали D-PBS с добавлением 2% ЭТС и 2 мМ ЭДТА, и затем окрашивали. hIL2RA (CD25)-электропорированные CD8 Т-клетки окрашивали 1:10 Alexa Fluor® 488 Anti-Stat5 (pY694) (Becton Dickinson GmbH, кат. №612598) и 1:25 PerCP-Cy™ 5.5 мышиным антителом против CD25 человека в D-PBS с добавлением 2% ЭТС и 2 мМ ЭДТА в течение 30 мин при 2-8°C в защищенном от света месте; РВМС окрашивали 1:10 Alexa Fluor® 488 Anti-Stat5 (pY694), 1:25 PerCP-Cy™ 5.5 мышиным антителом против человеческого CD25, 1:50 BV421 мышиным антителом против человеческого CD4 (Becton Dickinson GmbH, кат. №565997) и 1:25 BV510 мышиным антителом против человеческого CD8 (Becton Dickinson GmbH, кат. №563256). Окрашенные МНКРК/CD8+ Т-клетки дважды промывали и, наконец, ресуспендировали в D-PBS с добавлением 2% ЭТС и 2 мМ ЭДТА. Проточный цитометрический анализ выполняли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson GmbH), а полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo версии 10. Были построены кривые доза-реакция и рассчитаны значения EC50 в GraphPad Prism версии 6.04 (GraphPad Software, Inc).
На обоих видах CD4+CD25+ регуляторных Т-клеток и hIL2RA (CD25)- электропорированных CD8+ Т-клеток hAlb-hIL2 продемонстрировал превосходную эффективность по сравнению с обоими типично протестированными вариантами hAlb-hIL2 с пониженной аффинностью связывания CD25 (hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4) (Фигура 3 и Таблицы 4, 5). В частности, биологическая активность hAlb-hIL2_A3 была сильно снижена примерно в 1718-1937 раз по сравнению с hAlb-hIL2, тогда как hAlb-hIL2_A4 проявлял промежуточный фенотип (активность снижена в 255-269 раз по сравнению с hAlb-hIL2). Что наиболее важно, даже несмотря на то, что индивидуальные значения EC50 для ествественных CD25+ регуляторных Т-клеток (Фигура 3A) примерно в 3 раза выше по сравнению с популяцией искусственных hIL2RA (CD25)-электропорированных CD8+ T-клеток (Фигура 3B), кратность разницы между мутантными вариантами hAlb-hIL2_A3/A4 и hAlb-hIL2 постоянна во всех естественных и искусственных субпопуляциях. Это открытие квалифицирует hIL2RA (CD25) и, следовательно, электропорированные мутантным hIL2RA CD8+ Т-клетки как адекватную суррогатную популяцию для тестирования биологической активности различных реципрокно сконструированных вариантов hAlb-hIL2.
Пример 6: Сравнение функциональной активности вариантов hAlb-hIL2 на первичных CD8+ Т-клетках, электропорированных с различными мутантами hIL2RA (CD25), при измерении с помощью IL2-опосредованного фосфорилирования STAT5.
hAlb-hIL2 дикого типа проявлял наивысшую биологическую активность в отношении CD8+ Т-клеток, трансфицированных hIL2RA, представленных значением ЕС50 0,0067 % надосадочной жидкости. По мере увеличения числа мутаций, реализованных в мутантах hIL2RA и, следовательно, увеличения числа репульсивных взаимодействий, биологическая активность hAlb-hIL2 постепенно снижалась приблизительно в 10-1000 раз, причем наиболее сильное снижение отмечается в CD8+ Т-клетках, трансфицированных hIL2RA_mut4 (3 мутации; ЕС50 7,76 % надосадочной жидкости) (Фигура 4, Таблица 6). По сравнению с hAlb-hIL2 дикого типа варианты hAlb-hIL2_A3 с тремя аминокислотными заменами или hAlb-hIL2_A4 с двумя аминокислотными заменами показали сильно сниженную биологическую активность на CD8+ Т-клетках, электропорированных с hIL2RA дикого типа (EC50 49,4 и 5,017 % надосадочной жидкости, соответственно), но оба варианта hAlb-hIL2 восстановили активность на культурах CD8+ Т-клеток, экспрессирующих все различные реципрокно сконструированные мутанты hIL2RA. Важно отметить, что биологическая активность в отношении CD8+ Т-клеток, экспрессирующих прогнозированный совпадающий мутант hIL2RA, а именно hIL2RA_mut4 для hAlb-hIL2_A3 (EC50 0,663 % надосадочной жидкости) и hIL2RA_mut1 для hAlb-hIL2_A4 (EC50 0,116 % надосадочной жидкости) (Фигура 5А, 5В и Таблица 6) превзошла все другие мутанты hIL2RA, тем самым отражая высокое увеличение селективности примерно в 74 раза для hAlb-hIL2_3 и в 43 раза для hAlb-hIL2_A4 на мутанте hIL2RA по сравнению с CD8+ Т-клетками, электропорированными с hIL2RA дикого типа (Таблица 7). Вариант hAlb-hIL2_A5 с промежуточной биологической активностью в отношении hIL2RA-экспрессирующих культур CD8+ Т-клеток, показал примерно 5-кратное повышение селективности в отношении CD8+ Т-клеток, трансфицированных прогнозированным hIL2RA_mut2 (EC50 0,237 % надосадочной жидкости против 1,106 % надосадочной жидкости в hIL2RA_mut2-положительной культуре), при этом он менее эффективен для всех других мутантов hIL2RA по сравнению с hIL2RA дикого типа (Фигура 6A, Таблицы 6 и 7). Аналогичным образом, вариант hAlb-hIL2_A8 показал примерно 11-кратное увеличение селективности только для CD8+ T-клеток, экспрессирующих реципрокно сконструированный hIL2RA_mut3 (Таблица 7), представленное значением EC50 0,0059 % надосадочной жидкости по сравнению с 0,0677 % надосадочной жидкости на CD8+ T-клетках, подвергнутых электропорации с hIL2RA дикого типа (Фигура 6B, Таблица 6).
Таким образом, все прогнозы, сделанные для пар реципрокно сконструированных вариантов hAlb-hIL2 и мутантов hIL2RA (Таблица 1), подтвердились. Наибольшее увеличение селективности варианта hAlb-hIL2 для реципрокно сконструированного мутанта hIL2RA было достигнуто при спаривании hAlb-hIL2_A4 с hIL2RA_mut1 и hAlb-hIL2_A3 с hIL2RA_mut4, где две или даже три аминокислотные позиции были взаимно замещены, приводя к эффективности, повышенной примерно в 43 раз и 75 раз в отношении мутантного hIL2RA по сравнению с hIL2RA дикого типа. Обе комбинации одновременно показали высокую биологическую активность со значениями ЕС50 от 0,1 до 0,6 % надосадочной жидкости. Следует отметить, что биологическая активность hAlb-hIL2_A8 на hIL2RA_mut3-экспрессирующих CD8+ Т-клетках даже превышала уровни hAlb-hIL2 дикого типа на CD8+ Т-клетках, трансфицированных hIL2RA дикого типа (EC50 0,0059 против 0,0067 % надосадочной жидкости, Таблица 6), но селективность в отношении мутантного рецептора hIL2RA была увеличена только в 10 раз.
Пример 7: Влияние вариантов hAlb-hIL2 на in vitro противоопухолевую эффективность CAR-перенаправленных CD8+ Т-клеток, подвергнутых электропорации с различными мутантами hIL2RA (CD25).
Для исследования влияния реципрокных систем на цитотоксичность, опосредованную CAR-Т-клетками, был проведен in vitro анализ киллинга, сравнивающий CAR-T-клетки, подвергнутые электропорации с мутантным hIL2RA или hIL2RA дикого типа. CAR Т-клетки совместно культивировали со сфероидами человеческих раковых клеток яичников РА-1 в качестве мишеней. Клеточную линию PA-1 стабильно трансфицировали eGFP посредством лентивирусной трансдукции, чтобы обеспечить визуализацию живых организмов на основе флуоресценции. Совместные культуры были созданы в присутствии соответствующего реципрокного варианта hAlb-hIL2. Примененное соотношение E:T, равное 10:1, дает субоптимальную цитотоксичность, что позволяет оценить опосредованный вариантом hAlb-hIL2:мутантом hIL2RA усиленный киллинг.
На первом этапе CD8+ Т-клетки выделяли из РВМС, полученных от здоровых доноров (Transfusionszentrale, Университетская больница, Майнц, Германия) с помощью технологии MACS с использованием анти-CD8 MicroBeads в соответствии с инструкциями производителя. 2×106 CD8+ Т-клеток на лунку активировали в течение 2 дней в 24-луночных планшетах (VWR international, кат. №701605), покрытых 1 мкг анти-CD3-антитела (Abcam plc, кат. №ab86883) на лунку в присутствии 50 Ед/мл IL2 (Proleukin®S, Novartis Pharma, кат. №02238131). Затем Т-клетки переносили в новые 24-луночные планшеты со свежей средой, содержащей 50 Ед/мл IL2, для инкубации в течение дополнительных 3 дней перед электропорацией. Около 107 CD8+ Т-клеток электропорировали в 4-мм кювете с 20 мкг IVT-мРНК, кодирующей CLDN6-специфическую конструкцию CAR, содержащую химерный цитоплазматический домен CD28-CD3-дзета (ζ) (28ζ) (Kofler et al. Mol Ther 2011) или 15 мкг IVT-мРНК, кодирующей CLDN6-специфическую конструкцию CAR, содержащую химерный цитоплазматический домен 41BB-ζ (BBζ) (Reinhard et al. Science 2020), как описано в Примере 4. CD8+ T-клетки, подвергнутые электропорации с 20 мкг IVT-мРНК, кодирующей Клаудин 18.2 (CLDN18.2) -специфическую конструкцию CAR, использовали в качестве отрицательного контроля (контрольный CAR). Все конструкции CAR подвергали электропорации в комбинации с 10 мкг IVT-мРНК, кодирующей hIL2RA, hIL2RA_mut1 или hIL2RA_mut4. Сразу после электропорации клетки переносили в среду RPMI 1640 с добавлением 5% сыворотки AB человека и выдерживали при 37°C, 5% CO2 в течение ночи. В тот же день CLDN6-положительные опухолевые клетки PA-1 (ATCC® CRL-1572™) собирали из непрерывной культуры с использованием аккутазы (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, кат. № A6964-100ML) и доводили до 4×105 клеток/мл в MEM Glutamax (Gibco, кат. №41090036) с добавлением 10% термоинактивированной ЭТС, 1 мМ пирувата натрия (Life Technologies GmbH, кат. №11360-039), 1% NEAA (Gibco, кат. №11140050) и 2% бикарбоната натрия (Gibco, кат. №25080094). 25 мкл суспензии клеток PA-1 переносили на лунку в 96-луночные планшеты со сверхнизким прикреплением (Corning, кат. №7007) и инкубировали в течение 24 часов при 37°C и 5% CO2 для инициирования образования сфероидов опухоли. На следующий день поверхностная экспрессия hIL2RA дикого типа и мутантов, а также конструкций CAR на электропорированных CD8+ Т-клетках была подтверждена с помощью проточной цитометрии с использованием анти-CD25 (см. Пример 4) и специально разработанных анти-CAR идиотипических антител. Проточный цитометрический анализ выполняли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II, а полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10. 105 CAR- и hIL2RA-модифицированных CD8+ Т-клеток на лунку добавляли к культурам сфероидов опухоли PA-1 в 125 мкл FluoroBrite DMEM среды (Thermo Fisher Scientific, кат. №15266695) с добавлением 5% человеческой сыворотки AB в трех технических повторностях. 50 мкл надосадочной жидкости, содержащей соответствующий вариант hAlb-hIL2, добавляли к совместным культурам CAR T-клетки: опухолевого сфероида, и 96-луночные планшеты переносили в систему визуализации живых клеток Incucyte S3 (Essen Bioscience). hAlb-содержащую надосадочную жидкость использовали в качестве отрицательного контроля. Сигнал флуоресценции eGFP-положительных сфероидов опухоли PA-1 измеряли в течение 5 дней в качестве суррогатного маркера жизнеспособности клеток. Регистрировали общую площадь зеленого объекта каждого сфероида опухоли в трех экземплярах и нормализовали к соответствующей площади сфероида в начале совместного культивирования. Цитотоксический эффект в отношении опухолевых сфероидов PA-1, опосредованный CAR T-клетками, экспрессирующими соответствующие конструкции hIL2RA, анализировали при добавлении соответствующего реципрокного варианта hAlb-hIL2 и сравнивали с CAR T-клетками, электропорированными с hIL2RA дикого типа. Данные для каждой конструкции CAR (CLDN18.2 CAR 28ζ, CLDN6 CAR 28ζ и CLDN6 CAR BBζ) показаны отдельно на Фигуре 7, Фигуре 8 и Фигура 9, соответственно.
Независимо от применяемого варианта hAlb-hIL2 или контрольной надосадочной жидкости, совместные культуры, содержащие контрольный CAR (CLDN18.2 28ζ), не проявляли признаков CAR-опосредованной цитотоксичности (жизнеспособность от 92 до 120% в конце наблюдения; Фигура 7A-7C). Аналогичным образом, совместные культуры обработанных контрольной надосадочной жидкостью hAlb CLDN6-специфических CAR Т-клеток (как CLDN6 28ζ, так и CLDN6 BBζ): сфероидов опухоли PA-1 не изменили свою жизнеспособность (жизнеспособность от 90% до 101% в конце наблюдения; Фигуры 8-9A). Это соответствует субоптимальному количеству CAR Т-клеток, нанесенных на опухолевые сфероиды. Напротив, добавление как hAlb-hIL2_A3, так и hAlb-hIL2_A4 к соответствующим совместным культурам, содержащим CLDN6 28ζ CAR Т-клетки, электропорированным реципрокным hIL2RA, привело к селективно улучшенному уничтожению сфероидов PA-1, поскольку добавление к совместным культурам, содержащим подвергнутые электропорации hIL2RA дикого типа CLDN6 28ζ CAR T-клетки, не имело никакого эффекта (Фигуры 8B-C). Более подробно, обработка hAlb-hIL2_A3 привела к жизнеспособности опухолевого сфероида PA-1 на уровне 81% в конце наблюдения для со-электропорированных с hIL2RA_mut4 совместных культур CLDN6 28ζ CAR Т-клеток, по сравнению с жизнеспособностью 110% для со-электропорированных с hIL2RA дикого типа клеток (Фигура 8B). Это согласуется с обработкой hAlb-hIL2_A4, приводящей к жизнеспособности сфероида опухоли PA-1 56% в конце наблюдения для со-электропорированных hIL2RA_mut1 совместных культур CLDN6 28ζ CAR Т-клеток, по сравнению с 107% жизнеспособности для со-электропорированных с hIL2RA дикого типа клеток (Фигура 8C). Чтобы более четко установить эффект обработки hAlb-hIL2_A3, использовали совместные культуры, содержащие Т-клетки, модифицированные более мощной конструкцией CLDN6 BBζ CAR. Таким образом, обработка hAlb-hIL2_A3 привела к селективному улучшению уничтожения сфероидов опухоли PA-1 (51% жизнеспособности в конце наблюдения) для со-электропорированных hIL2RA_mut4 совместных культур, содержащих CLDN6 BBζ CAR Т-клетки, по сравнению с отсутствием снижения жизнеспособности сфероидов для со-электропорации с hIL2RA дикого типа (жизнеспособность 106% в конце наблюдения; Фигура 9B).
В заключение, данные анализа цитотоксичности сфероидов опухоли показывают, что цитотоксичность, опосредованная CAR T-клетками, может быть избирательно увеличена, когда CAR T-клетки модифицируют мутантом IL2RA и обрабатывают соответствующим реципрокным вариантом hAlb-hIL2.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH et al.
<120> Interleukin-2 receptor (IL2R) and interleukin-2 (IL2) variants
for specific activation of immune effector cells
<130> 674-243 PCT2
<150> PCT/EP2019/056719
<151> 2019-03-18
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly
210 215 220
Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
245 250
<210> 3
<211> 609
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu
<210> 4
<211> 272
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 5
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A3
<400> 5
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Glu Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A4
<400> 6
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 7
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A5
<400> 7
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 8
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A8
<400> 8
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 9
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2
<400> 9
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 10
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A3
<400> 10
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Glu Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 11
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A4
<400> 11
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 12
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A5
<400> 12
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 13
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A8
<400> 13
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 14
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut1
<400> 14
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Lys Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 15
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut2
<400> 15
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 16
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut3
<400> 16
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Lys Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 17
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut4
<400> 17
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Lys Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Lys Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| АКТИВИРУЕМЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2826454C2 |
| ВАРИАНТ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ИЛИ ЕГО ПРОИЗВОДНОЕ | 2019 |
|
RU2799437C2 |
| ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ РЕГУЛЯТОРНЫХ T-КЛЕТОК | 2017 |
|
RU2769871C2 |
| ВАРИАНТЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2018 |
|
RU2797536C2 |
| АКТИВИРУЕМЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА 12 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2826183C2 |
| АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С CD3 | 2019 |
|
RU2810924C2 |
| БЕЛКОВЫЙ КОМПЛЕКС ИНТЕРЛЕЙКИНА 15 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2711979C2 |
| ВАРИАНТЫ FC-ОБЛАСТИ С ИЗМЕНЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С НЕОНАТАЛЬНЫМ FC-РЕЦЕПТОРОМ (FCRN) ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ | 2019 |
|
RU2830231C2 |
| ХИМЕРНЫЙ ЦИТОКИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР | 2016 |
|
RU2826122C1 |
| ПЕПТИДНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-31 | 2019 |
|
RU2786441C2 |
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: системы для активации иммунных эффекторных клеток, включающие: рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R, и их применение для лечения рака, рецепторный полипептид IL2, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функциональный вариант, содержащий альфа-субъединицы IL2R, для применения при активации иммунных эффекторных клеток в комбинации с лигандным полипептидом; полинуклеотиды, кодирующие рецепторный полипептид IL2 и антигенный рецептор; система на основе транспозонов для трансфекции, содержащая полинуклеотид; клетка-хозяин для экспрессии рецепторного полипептида из системы; фармацевтическая композиция для применения в лечении или профилактики рака у субъекта. Также раскрыты: медицинский препарат для применения в лечении или профилактики рака, применение полинуклеотида, предпочтительно ДНК или РНК, кодирующего рецепторный или лигандный полипептид вместе с цитотоксической Т-клеткой для лечения или профилактики рака у субъекта, применения цитотоксических Т-клеток для лечения субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или состоянием, связанным с экспрессией или повышенной экспрессией антигена. Изобретение применяется для активации иммунных эффекторных клеток. 14 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 табл., 7 пр.
1. Система для активации иммунных эффекторных клеток, включающая:
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R,
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин IL2 или функционального варианта IL2,
где человеческая альфа-субъединица IL2R дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 и/или где человеческий IL2 дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1,
где мутеин альфа-субъединицы IL2R или ее функционального варианта и мутеин IL2 или его функционального варианта замещены в следующих положениях относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа:
(I) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте замещена глутаминовая кислота в положении 1, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте замещен лизин в положении 35,
предпочтительно где положение 1 замещено лизином, и/или где положение 35 замещено глутаминовой кислотой; и/или
(II) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте замещен лизин в положении 43,
предпочтительно, где положение 29 замещено лизином, и/или где положение 43 замещено глутаминовой кислотой; и/или
(III) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61,
предпочтительно, где положение 38 замещено глутаминовой кислотой и/или где положение 61 замещено лизином; или
(IV) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 1, предпочтительно на лизин, глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовою кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35, предпочтительно на глутаминовую кислоту, лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(V) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(VI) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(VII) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту; или
(VIII) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(IX) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин.
2. Система для активации иммунных эффекторных клеток, включающая:
(I) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 1 на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно где положение 1 замещено лизином, и/или где положение 35 замещено глутаминовой кислотой; или
(II) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно где положение 29 замещено лизином, и/или где положение 43 замещено глутаминовой кислотой, или
(III) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте лизин замещен в положении 38 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61 на основной аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно, где положение 38 замещено глутаминовой кислотой, и/или где положение 61 замещено лизином, или
(IV) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положениии 1 на лизин, глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин, и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на глутаминовую кислоту, лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(V) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(VI) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(VII) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа;
(VIII) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на глутаминовую кислоту, и лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(IX) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа,
где человеческая альфа-субъединица IL2R дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 и/или где человеческий IL2 дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1.
3. Система по п.1 или 2, где мутеин по подпункту (ii) связывается с IL2R, содержащим мутеин по подпункту (i), в качестве альфа-субъединицы, и активирует его.
4. Система по п. 3, где
(a) связывание и/или активация IL2R, содержащего мутеин по подпункту (i) в качестве альфа-субъединицы, мутеином по подпункту (ii) превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или её функциональный вариант в виде альфа-субъединицы, мутеином по подпункту (ii); и/или
(b) связывание и/или активация IL2R, содержащего мутеин по подпункту (i) в качестве альфа-субъединицы, мутеином по подпункту (ii) превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего мутеин по подпункту (i) в виде альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом; и/или
(с) связывание и/или активация IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или её функциональный вариант в качестве альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или её функциональный вариант в качестве альфа-субъединицы, мутеином согласно подпункту (ii); и/или
(d) связывание и/или активация IL2R, содержащего альфа-субъединицу IL2R или её функциональный вариант в качестве альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом превышает связывание и/или активацию IL2R, содержащего мутеин по подпункту (i) в качестве альфа-субъединицы, IL2 или его функциональным вариантом.
5. Система по любому из пп.1-4, где
(a) замена в IL2 или его функциональном варианте снижает аффинность к IL2R, содержащему альфа-субъединицу IL2R дикого типа в качестве альфа-субъединицы (IL2Rαβγ); и/или
(b) замена в IL2 или его функциональном варианте снижает аффинность к IL2R, содержащему альфа-субъединицу IL2R дикого типа в качестве альфа-субъединицы (IL2Rαβγ), в большей степени, чем к βγ IL2 рецепторному комплексу (IL2Rβγ); и/или
(с) где мутеин по подпункту (ii) имеет сниженную способность к стимуляции регуляторных Т-клеток по сравнению с IL2 дикого типа; и/или
(d) где мутеин по подпункту (ii) дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, повышающих аффинность к IL2Rβγ, предпочтительно где одна или несколько аминокислотных замен, повышающих аффинность к IL2Rβγ, включают следующий набор замен: 80F, 81D, 85V, 86V, 92F.
6. Система по любому из пп.1-5, где лигандный полипептид представляет собой полипептид с пролонгированной фармакокинетикой (ФК), предпочтительно где полипептид с пролонгированной ФК включает слитый белок, более предпочтительно где слитый белок содержит компонент из мутеина по подпункту (ii) и компонент, который является гетерологичным для IL2 или его функционального варианта, и/или
где слитый белок содержит компонент из мутеина по подпункту (ii) и компонент, выбранный из группы, состоящей из сывороточного альбумина, фрагмента иммуноглобулина, трансферрина, Fn3 и их вариантов, предпочтительно где сывороточный альбумин включает сывороточный альбумин мыши или сывороточный альбумин человека, или где фрагмент иммуноглобулина содержит Fc-домен иммуноглобулина.
7. Рецепторный полипептид IL2, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R), или функциональный вариант, содержащий альфа-субъединицы IL2R, для применения при активации иммунных эффекторных клеток в комбинации с лигандным полипептидом как определено в п.1,
где человеческая альфа-субъединица IL2R дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2,
где мутеин человеческой альфа-субъединицы IL2R или ее функционального варианта замещен в следующих положениях относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа:
(I) глутаминовая кислота замещена в положении 1 и/или
(II) глутаминовая кислота замещена в положении 29; и/или
(III) лизин замещен в положении 38; или
(IV) глутаминовая кислота замещена в положении 1, предпочтительно на лизин, глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту; или
(V) глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту; или
(VI) лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту; или
(VII) глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин; или
(VIII) глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту; или
(IX) глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин.
8. Полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид IL2 по п.7.
9. Полинуклеотид по п.8, который представляет собой ДНК.
10. Полинуклеотид, кодирующий
(i) рецепторный полипептид IL2 по п.7 и
(ii) антигенный рецептор, предпочтительно CAR.
11. Cистема на основе транспозонов для трансфекции, содержащая полинуклеотид по п.8.
12. Клетка-хозяин для экспрессии рецепторного полипептида из системы по любому из пп.1-6, где клетка-хозяин содержит полинуклеотид как определено в любом из пп.8, 9 или 10 или систему на основе транаспозонов по п.11.
13. Клетка-хозяин по п.12, которая является иммунной эффекторной клеткой.
14. Клетка-хозяин по п.13, где иммунная эффекторная клетка представляет собой Т-клетку, предпочтительно цитотоксическую T-клетку, более предпочтительно CAR T-клетку.
15. Клетка-хозяин по п.13, где клетка-хозяин представляет собой T-клетку, генетически модифицированную для экспрессии CAR и рецепторного полипептида.
16. Фармацевтическая композиция для применения в лечении или профилактики рака у субъекта, содержащая эффективное количество полинуклеотида как определено в пп.8, 9 или 10, или систему на основе транспозонов по п.11, или клетку-хозяина по пп.13, 14 или 15.
17. Применение полинуклеотида как определено в пп.8, 9 или 10, системы на основе транспозонов по п.11, клетки-хозяина как определено в пп.12-15, или фармацевтической композиции по п.16 для лечения субъекта, предпочтительно вместе с цитотоксической Т-клеткой для лечения или профилактики рака у субъекта.
18. Медицинский препарат для применения в лечении или профилактике рака у субъекта, включающий:
(i) полинуклеотид, предпочтительно ДНК, кодирующий рецепторный полипептид из системы по любому из пп.1-6, или цитотоксическую Т-клетку, генетически модифицированную для экспрессии рецепторного полипептида из системы по любому из пп.1-6, предпочтительно где T-клетка генетически модифицирована для стабильной экспрессии CAR и рецепторного полипептида; и
(ii) соответствующий лигандный полипептид из системы по любому из пп.1-6, полинуклеотид, предпочтительно РНК, кодирующий лигандный полипептид, или цитотоксическую Т-клетку, генетически модифицированную для экспрессии лигандного полипептида, где
медицинский препарат предпочтительно представляет собой набор,
необязательно данный медицинский препарат содержит каждый компонент из подпунктов (i) и (ii) в отдельных контейнерах, и/или медицинский препарат дополнительно включает инструкции по применению медицинского препарата для лечения или профилактики рака вместе с цитотоксической Т-клеткой.
19. Применение полинуклеотида, предпочтительно ДНК, кодирующего рецепторный полипептид вместе с цитотоксической Т-клеткой для лечения или профилактики рака у субъекта, где лечение или профилактика предусматривает введение полинуклеотида в комбинации с полинуклеотидом, предпочтительно РНК, кодирующим лигандный полипептид, где
(1)
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R,
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин IL2 или функционального варианта IL2,
где человеческая альфа-субъединица IL2R дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 и/или где человеческий IL2 дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1,
где мутеин альфа-субъединицы IL2R или ее функционального варианта и мутеин IL2 или его функционального варианта замещены в следующих положениях относительно альфа-субъединицы IL2R, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и относительно IL2 человека дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа:
(I) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте замещена глутаминовая кислота в положении 1, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте замещен лизин в положении 35,
предпочтительно где положение 1 замещено лизином, и/или где положение 35 замещено глутаминовой кислотой; и/или
(II) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте замещен лизин в положении 43,
предпочтительно, где положение 29 замещено лизином, и/или где положение 43 замещено глутаминовой кислотой; и/или
(III) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61,
предпочтительно, где положение 38 замещено глутаминовой кислотой и/или где положение 61 замещено лизином; или
(IV) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 1, предпочтительно на лизин, глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовою кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35, предпочтительно на глутаминовую кислоту, лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(V) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(VI) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(VII) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту; или
(VIII) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(IX) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин, или
(2) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 1 на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно где положение 1 замещено лизином, и/или где положение 35 замещено глутаминовой кислотой; или
(II) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно где положение 29 замещено лизином, и/или где положение 43 замещено глутаминовой кислотой, или
(III) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте лизин замещен в положении 38 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61 на основной аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно, где положение 38 замещено глутаминовой кислотой, и/или где положение 61 замещено лизином, или
(IV) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положениии 1 на лизин, глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин, и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на глутаминовую кислоту, лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(V) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(VI) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(VII) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа;
(VIII) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединица IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на глутаминовую кислоту, и лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(IX) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа,
где человеческая альфа-субъединица IL2R дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 и/или где человеческий IL2 дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1.
20. Применение полинуклеотида, предпочтительно РНК, кодирующего лигандный полипептид вместе с цитотоксической Т-клеткой для лечения или профилактики рака у субъекта, где лечение или профилактика предусматривает введение полинуклеотида в комбинации с полинуклеотидом, предпочтительно ДНК, кодирующим рецепторный полипептид, где
(1)
(i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта альфа-субъединицы IL2R,
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин IL2 или функционального варианта IL2,
где человеческая альфа-субъединица IL2R дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 и/или где человеческий IL2 дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1,
где мутеин альфа-субъединицы IL2R или ее функционального варианта и мутеин IL2 или его функционального варианта замещены в следующих положениях относительно альфа-субъединица IL2R, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и относительно IL2 человека дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа:
(I) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте замещена глутаминовая кислота в положении 1, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте замещен лизин в положении 35,
предпочтительно где положение 1 замещено лизином, и/или где положение 35 замещено глутаминовой кислотой; и/или
(II) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте замещен лизин в положении 43,
предпочтительно, где положение 29 замещено лизином, и/или где положение 43 замещено глутаминовой кислотой; и/или
(III) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61,
предпочтительно, где положение 38 замещено глутаминовой кислотой и/или где положение 61 замещено лизином; или
(IV) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 1, предпочтительно на лизин, глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовою кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35, предпочтительно на глутаминовую кислоту, лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(V) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(VI) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(VII) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту; или
(VIII) (i) в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и лизин замещен в положении 38, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин; или
(IX) (i) в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29, предпочтительно на лизин, и
(ii) в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43, предпочтительно на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61, предпочтительно на лизин, или
(2)
(I) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 1 на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно где положение 1 замещено лизином, и/или где положение 35 замещено глутаминовой кислотой; или
(II) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на основной аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно где положение 29 замещено лизином, и/или где положение 43 замещено глутаминовой кислотой, или
(III) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте лизин замещен в положении 38 на кислый аминокислотный остаток относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61 на основной аминокислотный остаток относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа, предпочтительно, где положение 38 замещено глутаминовой кислотой, и/или где положение 61 замещено лизином, или
(IV) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или её функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положениии 1 на лизин, глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин, и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на глутаминовую кислоту, лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(V) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(VI) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(VII) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа;
(VIII) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединица IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин и лизин замещен в положении 38 на глутаминовую кислоту относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 35 на глутаминовую кислоту, и лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту, и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа; или
(IX) (i) рецепторный полипептид, содержащий мутеин человеческой альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2R) или функционального варианта человеческой альфа-субъединицы IL2R, где в альфа-субъединице IL2R или ее функциональном варианте глутаминовая кислота замещена в положении 29 на лизин относительно человеческой альфа-субъединицы IL2R дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческой альфа-субъединицей IL2R дикого типа, и
(ii) лигандный полипептид, содержащий мутеин человеческого IL2 или функционального варианта человеческого IL2, где в IL2 или его функциональном варианте лизин замещен в положении 43 на глутаминовую кислоту и глутаминовая кислота замещена в положении 61 на лизин относительно человеческого IL2 дикого типа, и при нумерации в соответствии с человеческим IL2 дикого типа,
где человеческая альфа-субъединица IL2R дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 и/или где человеческий IL2 дикого типа имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1.
21. Применение по любому из пп.18-20, где полинуклеотид кодирующий рецепторный полипептид содержится в системе на основе транспозонов для трансфекции, и предпочтительно дополнительно содержит нуклеиновую кислот, кодирующую антигенный рецептор, предпочтительно где антигенный рецептор представляет собой CAR.
22. Применение по п. 21, где лечение или профилактика включает трансфекцию Т-клетки или предшественников Т-клеток in vivo основанной на траспозонах системой.
23. Применение цитотоксических Т-клеток для лечения субъекта, включающее:
(i) предоставление субъекту цитотоксических Т-клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида из системы по любому из пп.1-6, и
(ii) введение субъекту соответствующего лигандного полипептида из системы по пункту (i), полинуклеотида, кодирующего лигандный полипептид, или клетки-хозяина, генетически модифицированной для экспрессии лигандного полипептида.
24. Применение по п.23, которое представляет собой индукцию иммунного ответа у указанного субъекта.
25. Применение по п.24, где иммунный ответ представляет собой иммунный ответ, опосредованный Т-клетками.
26. Применение цитотоксических Т-клеток для лечения субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или состоянием, связанным с экспрессией или повышенной экспрессией антигена, включающее:
(i) предоставление субъекту цитотоксических Т-клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида из системы по любому из пп.1-6, где цитотоксические Т-клетки нацелены на антиген или клетки, экспрессирующие антиген, и
(ii) введение субъекту соответствующего лигандного полипептида из системы по пункту (i), полинуклеотида, кодирующего лигандный полипептид, или клетки-хозяина, генетически модифицированной для экспрессии лигандного полипептида, предпочтительно где заболевание, расстройство или состояние представляет собой рак, а антиген представляет собой антиген, ассоциированный с опухолью.
27. Применение по любому из пп.23-26, где цитотоксические Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторного полипептида, предоставляют субъекту путем введения цитотоксических Т-клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида, или путем генерации цитотоксических Т-клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторного полипептида у субъекта.
28. Применение по любому из пп.23-27, где применение предназначено для лечения или профилактики рака у субъекта.
29. Медицинский препарат по п.18, где полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид и/или полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид, представляет собой РНК; и/или
где цитотоксические Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторного полипептида, содержат полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид; и/или
где клетка-хозяин, генетически модифицированная для экспрессии лигандного полипептида, содержит полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид.
30. Медицинский препарат по п.18 или 29 где цитотоксические Т-клетки представляют собой CAR Т-клетки.
31. Применение по любому из пп.19-28,
где полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид представляет собой ДНК и полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид, представляет собой РНК; и/или
где цитотоксические Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторного полипептида, содержат полинуклеотид, кодирующий рецепторный полипептид; и/или
где клетка-хозяин, генетически модифицированная для экспрессии лигандного полипептида, содержит полинуклеотид, кодирующий лигандный полипептид.
32. Применение по любому из пп.18-28 или 31, где цитотоксические Т-клетки представляют собой CAR Т-клетки.
| JONATHAN T | |||
| SOCKOLOSKY et al | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Способ получения гидроцеллюлозы | 1920 |
|
SU359A1 |
| Устройство для подымания антенн при помощи привязных воздушных шаров | 1925 |
|
SU6379A1 |
| ФИГУРНЫЕ КЛЮЧЕВИНЫ ДЛЯ ЗАМКОВ | 1924 |
|
SU1037A1 |
| WO 2005086751 A2, 22.09.2005 | |||
| WO 2016022671 A1, 11.02.2016 | |||
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ IL2 | 2006 |
|
RU2425054C2 |
