КОМПЛЕКС ПРОИЗВОДНОГО МОЧЕВИНЫ С РАДИОНУКЛИДНОЙ МЕТКОЙ Tс ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ПРОСТАТСПЕЦИФИЧЕСКИЙ МЕМБРАННЫЙ АНТИГЕН, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K51/04 A61K51/08 A61K103/10 C07K7/06 C07F13/00 

Изобретения относятся к органической химии, медицине, онкологии и фармакологии, в частности к радиофармацевтическому соединению на основе производного мочевины, тропного к простатспецифическому мембранному антигену (ПСМА), и содержащему ^99mTc, и способу его получения для радионуклидной диагностики рака предстательной железы.

Известно NO₂-DOTA-PSMA - производное мочевины для диагностики опухолей, экспрессирующих простатспецифический мембранный антиген (ПСМА) [RU 2730507 С1, МПК (2006.01) C07D 257/02, А61К 49/00, А61К 51/00, опубл. 24.08.2020. Соединение для диагностики опухолей, экспрессирующих ПСМА, и композиция на его основе], представляющее собой конъюгат на основе производного мочевины структуры Glu-Urea-Lys и модифицированного гидрофобного пептидного линкера, включающего фрагмент 6-аминогексановой кислоты, связанный с хелатором DOTA (1):

В качестве радионуклидной метки для соединения (1) используют трехзарядные катионы металлов: ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁹⁰Y, ¹⁰⁹Pb, ²⁰³Pb, ¹⁰⁵Rh, ¹⁷⁷Lu, ²¹³Bi, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb и ²²⁵ Ac.

Для исследования in vivo меченые комплексы с соединением (1) получали следующим образом: к 760 мкл раствора [⁹⁰Y]YCl₃ с активностью 200 кБк или [⁶⁸Ga]GaCl₃ с активностью 4 МБк в 0,1 М НС1, полученных из радионуклидных генераторов ⁹⁰Sr/⁹⁰Y и ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, соответственно, добавляли 20 мкл водного раствора NO₂-DOTA-PSMA (PSMA - ПСМА ингибитор) с концентрацией 0,5 мг/мл, 20 мкл 0,5 г/мл раствора NaOAc рН 5.

Выдерживали полученный раствор при 95°С в течение 15 минут.

Известно производное мочевины PSMA-I&T формулы (2) для визуализации и терапии, а также способ получения его комплекса с ¹⁷⁷ Lu с PSMA-I&T (ПСМА ингибитор для диагностики и терапии) [Wurzer A, Di Carlo D, Schmidt A, et al. Radiohybrid ligands: a novel tracer concept exemplified by ¹⁸F- or ⁶⁸Ga-labeled rhPSMA inhibitors. J Nucl Med. 2020; 61:735-742. Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar].

В данном способе 4 мг гентизиновой кислоты растворяют в 0,5 мл высокоочищенной воды. В растворе с содержанием гентизиновой кислоты 0,1 мг (~ 96 нмоль) растворяют PSMA-I&T. Затем 13 мг аскорбата натрия и 31 мг тригидрата ацетата натрия растворяют в 6 мл 0,04 М раствора уксусной кислоты. К раствору добавляют 4 ГБк [¹⁷⁷Lu]LuCl₃. Реакционную смесь нагревают при 80°С в течение 20 мин. После нагревания реакционную смесь остужают до комнатной температуры. Затем к остывшему раствору добавляют смесь, содержащую хлорид натрия, ДТПА и этанол (1,2 мл этанола (≥99%) добавляют к 10 мл ДТПА в хлориде натрия). Итоговый объем реакционной смеси составляет 11 мл. Радиохимический выход (РХВ) составляет свыше 95%. Недостатком является то, что технология мечения включает использование широкого ряда реагентов, защищающих радиолиганд от процесса радиолиза. Кроме того, технология мечения включает использование этанола в качестве солюбилизатора в силу высокой липофильности получаемого радиолиганда, а радиохимическая чистота (РХЧ) получаемого радиолиганда составляет 90%, что обусловлено использованием большого ряда вспомогательных веществ для обеспечения стабильности радиокомплекса.

Известен тераностический ПСМА-связывающий лиганд PSMA-617 на основе мочевины (Glu-Urea-Lys), хелатирующей части в виде 1,4,7,10-тетраазациклододекана-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), и линкерной части между ними из 2-нафтил-L-аланина и транексамовой кислоты (3) [Schollhammer, Romain, et al. "Comparison of ⁶⁸Ga-PSMA-617 PET/CT and ⁶⁸Ga-RM2 PET/CT in Patients with Localized Prostate Cancer Who Are Candidates for Radical Prostatectomy: A Prospective, Single-Arm, Single-Center, Phase II Study." Journal of Nuclear Medicine 64.3 (2023): 379-385]:

Лиганд PSMA-617, меченный ¹⁷⁷Lu, используют для терапевтических целей, а меченный ⁶⁸Ga проходит вторую фазу клинических исследований в качестве ПЭТ-диагностического препарата.

Известен способ получения комплекса ⁶⁸Ga с ПСМА-связывающим лигандом PSMA-617 для диагностики рака предстательной железы [Schollhammer, Romain, et al. "Comparison of ⁶⁸Ga-PSMA-617 PET/CT and ⁶⁸Ga-RM2 PET/CT in Patients with Localized Prostate Cancer Who Are Candidates for Radical Prostatectomy: A Prospective, Single-Arm, Single-Center, Phase II Study." Journal of Nuclear Medicine 64.3 (2023): 379-385], отвечающего формуле (4):

Согласно способу, PSMA-617 растворяют в дистиллированной воде в концентрации 1 мкг/мкл. Около 20-30 мКи ⁶⁸GaCl₃ добавляют к 2,5 мкг (2,4 нмоль) PSMA-617 и доводят до рН 3,5-4 с помощью HEPES. Реакционную смесь инкубируют в течение 10 мин при 95°С. После охлаждения до комнатной температуры смесь пропускают через колонку C₁₈ Sep-Pak. Радиохимическую чистоту меченого комплекса проверяют методами ВЭЖХ и тонкослойной хроматографии. РХЧ составляет свыше 96%. Захват ⁶⁸Ga-PSMA-617 в ПСМА-экспрессирующих опухолях в экспериментах по распределению у мышей составляет 8,5±4,1%, соотношение опухоль: кровь составляет 7,8.

Недостатки комплекса ⁶⁸Ga-PSMA-617 связаны с низкой доступностью ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-генераторов на территории Российской Федерации, коротким периодом полураспада ⁶⁸Ga, ограниченной доступностью и высокой стоимостью услуг ПЭТ-центров.

Наиболее близким к заявляемому способу можно считать способ получения технеций- и рений-бис(гетероарильных) комплексов с производными мочевины и методы их применения для ингибирования PSMA [RU 2532912 С2, МПК (2006.01) С07С 275/24, C07D 213/56, C07D 403/12, C07D 401/12, C07F 13/00, А61К 49/00, А61К 51/04, опубл. 20.11.2014. Технеций- и рений-бис(гетероарильные) комплексы и методы их применения для ингибирования PSMA]. Комплексы относятся к радиофармацевтическим соединениям структурной формулы (5):

где R обозначает Н или (С1-С8)алкильную группу;

W обозначает связь, -CH(NH₂)-, -C(O)-NH-CH(COOH)-, -O-(CH₂)_n -O-(CH₂)_n - или -(CH₂)nO(CH₂)_nO(CH₂)_n;

Z обозначает -NHC(O)-, -NH-C(O)-CH(NH₂)- или -C(O)-NH-CH(COOH)-;

e - целое число от 1 до 4;

f - целое число от 0 до 10;

g - целое число от 0 до 10;

n - целое число от 0 до 2;

значения радикала NR^aR^b приведены в формуле изобретения.

Радиомечение с помощью ^99mTc проводят в две стадии, используя коммерческие наборы IsoLink™ kits (Covidien) для образования интермедиата [^99mTc(СО)₃(H₂O)₃]⁺, который вводят в реакцию с подходящим соединением формулы (5) (10^-6 М - 10^-4 М) в равнообъемной смеси (1:1) ацетонитрила и фосфатного буфера. Герметизированный сосуд нагревают 30 мин при 100°С.

Недостатками способа являются использование коммерчески малодоступного набора реагентов, двухэтапная методика, использование органического растворителя, при этом радиохимический выход свыше 95% достигается только при концентрации соединений более 10^-4 М. Кроме того на лабораторных животных показано, что специфичный опухолевый захват составляет до 12%, соотношения опухоль: кровь до 10.

Техническим результатом заявляемых изобретений является расширение арсенала комплексов производных мочевины с радионуклидной меткой ^99MТс для диагностики опухолей, экспрессирующих простатспецифический мембранный антиген, при одновременном повышении специфичного опухолевого захвата и соотношения опухоль: кровь.

Технический результат достигается комплексом производного мочевины ((((1S)-5-((2S)-2-((2S)-2-(8-((2S)-2-ацетамидо-6-(2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(2-меркаптоацетамидо)бутанамидо)бутанамидо)бутанамидо)ацетамидо) гексанамидо)октанамидо)-3-(4-гидроксифенил)пропанамидо)-3-(нафтален-2-ил)пропанамидо)-1 -карбоксипентил)карбамоил)-L-глутаминовая кислота) с

радионуклидной меткой ^99mTc со следующей структурной формулой (6):

(6)

Также технический результат достигается способом получения заявляемого комплекса производного мочевины ((((1S)-5-((2S)-2-((2S)-2-(8-((2S)-2-ацетамидо-6-(2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(2-меркаптоацетамидо)бутанамидо)бутан-амидо)бутанамидо)ацетамидо)гексанамидо)октанамидо)-3-(4-гидроксифенил)пропан-

амидо)-3-(нафтален-2-ил)пропанамидо)-1-карбоксипентил)карбамоил)-L-глутаминовая кислота) с радионуклидной меткой ^99mTc, заключающемся в следующем: 5-2000 мкг указанного производного мочевины, растворенного в фосфатно-солевом буфере, добавляют к лиофилизату, содержащему 4-6 мг натриевой соли глюконовой кислоты, 50-150 мкг хлорида двухвалентного олова и 50-200 мкг натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затем к смеси добавляют ^99mTc-пертехнетат 250-750 МБк и инкубируют при температуре 70-90°С в течение 30-90 мин.

Радиохимический выход составляет 95,0-99,8%, в связи с чем очистка полученного комплекса не требуется. Захват комплекса производного мочевины с радионуклидной меткой ^99mTc в опухоли составляет (30±4) %, соотношение опухоль: кровь (38±14).

На фиг. 1 показано биораспределение комплекса производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^99mTc в ксенографтах ПСМА-экспрессирующих опухолей через 1, 3, 6 часов после инъекции, где %ВД/г - процент введенной дозы вещества на массу органа. Данные представлены как среднее значение %ВД/г± стандартное отклонение для четырех мышей.

На фиг. 2 представлено соотношение опухоль/орган комплекса производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^99mTc в ксенографтах ПСМА-экспрессирующих опухолей через 1, 3, 6 часов после инъекции. Данные представлены как среднее значение соотношения опухоль/орган ± стандартное отклонение для четырех мышей.

Синтез исходного производного мочевины, обозначенного как BQ0413, проводили как описано в источнике [Lundmark, Fanny, et al. "Design, synthesis, and evaluation of linker-optimised PSMA-targeting radioligands." Pharmaceutics 14.5 (2022): 1098] в несколько этапов. Сначала получали известным из уровня техники способом [Ryan P. Murelli, Andrew X. Zhang, Julien Michel, William L. Jorgensen, David A. Spiege. Chemical Control Over Immune Recognition: A Class of Antibody-Recruiting Molecules (ARMs) that Target Prostate Cancer. J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131, 17090-17092] тритретбутиловое производное ПСМА-связывающего лиганда формулы (7):

Из промежуточного соединения (7) производное мочевины синтезировали с использованием твердофазного пептидного синтеза. Все реакции связи между аминокислотами выполнены в диметилформамиде (ДМФА) с использованием связующего агента (Oxyma Pure; N, N'-диизопропилкарбодиимида и основания N,N-диизопропилэтиламина. После каждой реакции соединения смолу промывали ДМФА, Fmoc-защитные группы удаляли с использованием 20% пиперидина в ДМФА.

Посредством реакции сочетания присоединяли фрагмент Fmoc-Nal-OH к свободной амино-группе в (7), а последующие аминокислоты связывали с (Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-8Aoc и Fmoc-Lys(Alloc)-OH). После снятия Fmoc защиты с лизина, проводили ацетилирование свободного амина в пиридине. После промывки с помощью ДМФА и дихлорметана защиту Alloc на боковой цепи лизина снимали с помощью PhSiH₃ и Pd(PPh₃)₄ в дихлорметане. Глицин, три остатка глутамата и 2-меркаптоуксусную кислоту присоединяли с использованием стандартной процедуры связывания, описанной выше. Конечный продукт выделяли с использованием 5% водного раствора трифторуксусной кислоты в присутствии карбокатионного поглотителя триизопропилсилана. Конечный продукт осаждали в холодном диэтиловом эфире и очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Таким образом, было получено соединение - производное мочевины, содержащее три остатка глутаминовой кислоты и один остаток цистеина и обозначенное как BQ0413, ((((1S)-5-((2S)-2-((2S)-2-(8-((2S)-2-ацетамидо-6-(2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(2-меркаптоацетамидо)бутанамидо)бутанамидо)бутанамидо)ацетамидо)гексанамидо) октанамидо)-3-(4-гидроксифенил)пропанамидо)-3-(нафтален-2-ил)пропанамидо)-

1-карбоксипентил)карбамоил)-L-глутаминовая кислота) со следующей структурной формулой (8):

Пример 1. Получение комплекса производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^99mTc.

10 мкг производного мочевины BQ0413, растворенного в фосфатно-солевом буфере (рН=7,4), добавили к лиофилизату, содержащему 5 мг натриевой соли глюконовой кислоты, 75 мкг хлорида двухвалентного олова и 100 мкг натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затем к смеси добавили раствор ^99mTc-пертехнетата с активностью 400 МБк, после чего проводили инкубацию при 90°С в течение 60 мин.

Радиохимический выход составил 99,8%, радиохимическая чистота составила свыше 99%.

Для полученного комплекса производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^99mTc проводили определение профиля биораспределения в ПСМА-экспрессирующих PC-3.pip ксенографтах через 1, 3 и 6 часов после инъекции. Мышам BALB/C nu/nu внутривенно вводили 40 пмоль (60 кБк) комплекса производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^99mTc в объеме 100 мкл в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина в фосфатном солевом буфере. Через 1, 3 и 6 ч соответственно проводили эвтаназию мышей инъекцией раствора кеталара-ромпуна (10 мг/мл кеталар и 1 мг/мл ромпун; 20 мкл раствора/г массы тела) и проводили диссекцию с последующим взвешиванием органов и опухолевой ткани. После этого измеряли активность, поглощенную органами и опухолевой тканью, с помощью гамма-счетчика и рассчитывали процент введенной дозы на грамм (% ВД/г) (фиг. 1). Захват комплекса производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^{99 m}Тс в опухоли составил (30±4) %, соотношение опухоль: кровь (38±14) спустя 1 ч после инъекции (фиг. 2).

Другие примеры получения комплекса производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^{99 m}Тс для диагностики опухолей, экспрессирующих простатспецифический мембранный антиген, представлены в таблице 1.

Из приведенных в таблице 1 экспериментальных данных следует, что во всех приведенных примерах достигается заявленный технический результат.

Таким образом, комплекс производного мочевины BQ0413 с радионуклидной меткой ^99mTc, полученный заявленным способом, позволяет расширить арсенал перспективных комплексов производных мочевины с радионуклидной меткой ^99МТс для диагностики рака предстательной железы, обеспечивая специфичный захват в опухолях с гиперэкспрессией ПСМА (захват в опухоли составляет (30±4) %, соотношение опухоль:кровь (38±14)), а способ получения предложенного комплекса ^99mTc с производным мочевины BQ0413 обеспечивает радиохимический выход до 99,8%.

Изобретение относится к органической химии, медицине, онкологии и фармакологии, а именно к комплексу производного мочевины с радионуклидной меткой ^99mTc для диагностики опухолей, экспрессирующих простатспецифический мембранный антиген, - ^99mTc-(((1S)-5-((2S)-2-((2S)-2-(8-((2S)-2-ацетамидо-6-(2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(2-меркаптоацетамидо)бутанамидо)бутанамидо)бутанамидо) ацетамидо)гексанамидо)октанамидо)-3-(4-гидроксифенил)пропанамидо)-3-(нафтален-2-ил)пропан-амидо)-1-карбоксипентил)карбамоил)-L-глутаминовая кислота, представленный структурной формулой, приведенной ниже. Также предложен способ получения указанного комплекса производного мочевины с радионуклидной меткой ^99mTc. Технический результат: расширение арсенала комплексов производных мочевины с радионуклидной меткой ^99mTс для диагностики опухолей, экспрессирующих простатспецифический мембранный антиген, при одновременном повышении специфичного опухолевого захвата до (30±4)% и соотношения опухоль:кровь до (38±14). 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 12 пр.

1. Комплекс производного мочевины с радионуклидной меткой ^99mTc для диагностики опухолей, экспрессирующих простатспецифический мембранный антиген, с общей формулой: ^99mTc-(((1S)-5-((2S)-2-((2S)-2-(8-((2S)-2-ацетамидо-6-(2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(2-меркаптоацетамидо)бутанамидо)бутанамидо)бутанамидо) ацетамидо)гексанамидо)октанамидо)-3-(4-гидроксифенил)пропанамидо)-3-(нафтален-2-ил)пропан-амидо)-1 -карбоксипентил)карбамоил)-L-глутаминовая кислота,

представленный следующей структурной формулой:

2. Способ получения комплекса производного мочевины ((((1S)-5-((2S)-2-((2S)-2-(8-((2S)-2-ацетамидо-6-(2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(4-карбокси-2-(2-меркаптоацетамидо)бутанамидо)бутанамидо)бутанамидо)ацетамидо)гексанамидо)октанам идо)-3-(4-гидроксифенил)пропанамидо)-3-(нафтален-2-ил)пропан-амидо)-1-карбоксипентил)карбамоил)-L-глутаминовая кислота) с радионуклидной меткой ^99mTc по п. 1, отличающийся тем, что 5-2000 мкг указанного производного мочевины, растворенного в фосфатно-солевом буфере, добавляют к лиофилизату, содержащему 4-6 мг натриевой соли глюконовой кислоты, 50-150 мкг хлорида двухвалентного олова и 50-200 мкг натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, затем к смеси добавляют ^99mTc-пертехнетат 250-750 МБк и инкубируют при 70-100°С в течение 30-90 мин.