Способ лабораторной диагностики хронической сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса у пациентов с сахарным диабетом на основе исследования белкового профиля фракции экзосом сыворотки крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/49 G01N30/72 

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, и может быть использовано для ранней диагностики хронической сердечной недостаточности.

Сердечная недостаточность (СН) является патологией, развивающейся как осложнение распространённых заболеваний сердечно-сосудистой системы, в том числе, таких, как артериальная гипертензия и ишемическая болезнь сердца, особенно у пациентов старшей возрастной группы [Polyakov D. S. [и др.]. Chronic heart failure in the Russian Federation: what has changed over 20 years of follow-up? Results of the EPOCH-CHF study // Kardiologiya. 2021. № 4 (61). C. 4–14]. Своевременная диагностика СН на ранней стадии позволяет назначить своевременное лечение, тем самым улучшить качество жизни пациентов и предотвратить быстрое наступление последующих стадий СН и ранней инвалидизации. Инструментальная диагностика (эхокардиография, рентгенография, пробы с нагрузками, магнитно-резонансная томография) является наиболее информативным методом при выявлении СН вследствие различия в этиологии заболевания у разных пациентов [Larina V. N., Skiba I. K., Skiba A. S. Summary of updates to the 2021 European Society of Cardiology Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure // Russian Journal of Cardiology. 2022. № 2 (27). C. 97–105; Хроническая сердечная недостаточность. Клинические рекомендации 2020. Российский кардиологический журнал. 2020;25(11):4083. https://doi.org/10.15829/1560-4071-2020-4083].

В то же время, несмотря на различия в причинах возникновения СН, морфологические и функциональные изменения, выявляемые при помощи инструментальных методов, сходны. Из биохимических методов общепризнанным, но только в сочетании с инструментальной диагностикой, является изменение концентрации натрийуретических пептидов в крови [Попова К.А., Авдеев С.Н. Значение натрийуретических пептидов в диагностике сердечной недостаточности и других заболеваний Role of natriuretic peptide B in diagnosis of heart failure and dyspnea // Пульмонология. 2006. (4)]. Использование такого исследования в качестве дополнительного обусловлено низкой специфичностью данного метода – концентрация натрийуретических пептидов может меняться не только вследствие развития СН и не отличаться от нормальной у пациентов в стабильном состоянии.

Известно, что существуют генетические факторы предрасположенности к развитию СН [Березикова Е.Н. [и др.]. Клинико-генетические детерминанты генов ФНО-ос, ИЛ-1/3 и ИЛ-1Ра в инициации и развитии хронической сердечной недостаточности у больных ишемической болезнью сердца // Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины. 2009]. Обнаруженные полиморфизмы ряда генов, ассоциированных с предрасположенностью, хотя и обладают прогностической ценностью с точки зрения развития СН в течение жизни, не позволяют определить время начала развития заболевания и начать своевременное лечение. Периодическое же обследование пациентов группы риска сопряжено с определёнными сложностями экономического характера. Вместе с тем, наличие генов предрасположенности позволяет предположить существование метаболических путей, в которых участвуют белковые продукты, кодируемые генами предрасположенности, задействованные в развитии СН. Несмотря на разницу в этиологии СН, по-видимому, эти пути касаются функционирования компенсаторных механизмов. Поэтому выявление компонентов метаболических путей, определяющих развитие СН у пациентов с предрасположенностью, является актуальной задачей, направленной на создание новых методов неинвазивной диагностики СН на ранних стадиях.

В основу изобретения положена задача создания более достоверного способа лабораторной диагностики хронической сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса у пациентов с сахарным диабетом на основе исследования белкового профиля фракции экзосом сыворотки крови. Для постановки диагноза СН предлагается исследовать белковый профиль фракции экзосом сыворотки крови с помощью электрофореза белков в полиакриламидном геле с денситометрией и последующей идентификацией белков.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе лабораторной диагностики хронической сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса у пациентов с сахарным диабетом на основе исследования белкового профиля фракции экзосом сыворотки крови, включающий масс-спектрометрическую идентификацию белков серотрансферрина, альбумина, альфа-1-антитрипсина и фибриногена, и оценку их концентраций в сыворотке крови, отличающийся тем, что при референтных значениях: серотрансферрина 315,9–3673,6 мкг/л; альбумина 1828,1–6567,0 мкг/л; альфа-1-антитрипсина и бета-цепи фибриногена 248,8–1611,1 мкг/л устанавливают диагноз ХСН.

Предлагаемый нами подход, позволяющий технически осуществить данную проблему, заключается в получении из сыворотки крови фракции экзосом – микровезикул, циркулирующих в крови и несущих пептиды, некоторые белки и малые РНК [Xue R. [и др.]. Role of Exosomal miRNAs in Heart Failure // Frontiers in Cardiovascular Medicine. 2020. № December (7). C. 1–9]. В ряде работ рассматривается анализ экзосом при диагностике СН различной этиологии и предлагается разработка диагностических систем на их основе [Tromp J. [и др.]. Biomarker profiles in heart failure patients with preserved and reduced ejection fraction // Journal of the American Heart Association. 2017. № 4 (6)]. Однако авторы данных работ сосредоточились на исследовании типов и содержании малых регуляторных РНК, участвующих в патологических, в том числе, воспалительных процессах, сопровождающих развитие СН [Xue R. [и др.]. Role of Exosomal miRNAs in Heart Failure // Frontiers in Cardiovascular Medicine. 2020. № December (7). C. 1–9]. Пептидному же составу микровезикул в данных исследованиях внимания не уделялось, хотя в работе [Moreira-Costa L. [и др.]. Exosome-derived mediators as potential biomarkers for cardiovascular diseases: A network approach // Proteomes. 2021. № 1 (9). C. 1–29] упоминаются изменения протеома экзосом при СН.

Изобретение поясняется фиг.1, на которой показаны результаты ЭФ в ПААГ сывороток пациентов. М – маркер молекулярных масс. На фиг.2 представлены зоны, отмеченные для денситометрии и использованные для масс-спектрометрической идентификации.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделение экзосом осуществляли методом ультрацентрифугирования. Исследования осуществлялись на 48 образцах сыворотки крови, полученных от больных сердечной недостаточностью разного типа с или без с сахарным диабетом и пациентов из группы контроля. Диагноз Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) устанавливали на основании Национальных рекомендаций по диагностике и лечению ХСН [Мареев В.Ю., Фомин И.В., Агеев Ф.Т., и др. Клинические рекомендации ОССН - РКО - РНМОТ. Сердечная недостаточность: хроническая (хсн) и острая декомпенсированная (одсн). Диагностика, профилактика и лечение. Кардиология. 2018; 58(6S): 8-158] и соответствующим критериям NYHA; Сахарный диабет (СД) - на основании клинических рекомендаций по СД у взрослых от 2019 г. [https://www.endocrincentr.ru/sites/default/files/specialists/science/clinic-recomendations/saharnyy_diabet_2_tipa_u_vzroslyh.pdf].

Сыворотки от пациентов каждой группы объединяли, в результате получили пулы 1-6 (Табл. 1).

В Табл. представлены типы изучаемых групп и приведены номера, соответствующие условной нумерации сывороток, полученных от пациентов.

Таблица 1. Исследуемые группы пациентов.

No Группа М / Ж 1 Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) со сниженной фракцией выброса (ФВ) и Сахарный диабет (СД) 7 / 0 2 ХСН со сниженной ФВ без СД 9 / 0 3 ХСН с нормальной ФВ и СД 3 / 5 4 ХСН с нормальной ФВ без СД 6 / 5 5 Контроль (без ХСН и без СД) 5 / 2 6 СД без ХСН 4 / 2

Из 12 мл сыворотки каждой группы с использованием низкоскоростного центрифугирования для осаждения клеток, их обломков и полимера, а затем высокоскоростного ультрацентрифугирования при 110,000 g, были выделены фракции экзосом, морфология и размеры которых (100-200 нм), были подтверждены с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Далее было проведено электрофоретическое разделение (ЭФ) в полиакриламидном геле (ПААГ) всех групп сывороток крови, разбавленных в 50 раз (фиг.1). Электрофорез белка в 8% ПААГ осуществляли в пластинах с размерами 10×10 см при градиенте напряжения 20 В/см в геле следующего состава: 8% акриламид (акриламид/метиленбисакриламид=29:1), 37мМ Tris-HCl, pH 9.4, 0.01% SDS, 0.01% персульфат аммония, 0.001% тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) с использованием электродного буфера, содержащего 0.125 М Tris-НСl, рН 6.8 и 0.1% SDS.

Для всех найденных в гелях зон была проведена денситометрия (определено относительное содержание белка в каждой зоне) согласно схеме (фиг.2), после чего был проведён статистический анализ полученных результатов. Статистическая обработка полученных данных проводилась при помощи непараметрического теста One-way ANOVA с поправкой на множественное сравнение. Соответствие каждой из 17 зон какому-либо белку было проведено путём масс-спектрометрической идентификации после ферментативного гидролиза белков в геле трипсином, в табл. 2. представлены результаты для белков, которые удалось идентифицировать.

Таблица 2 – Результаты масс-спектрометрической идентификации. Во всех случаях пороговое значение «Score» составляло 56 (в случае, если «Score» больше порогового, идентификация считается достоверной, p < 0.05). Значение «Score» равно -10*log(P), где P - вероятность того, что наблюдаемое в измерении совпадение молекулярных масс триптических фрагментов с триптическими фрагментами белка из базы данных является случайным событием.

Номер зоны Белок «Score» ID белка Масса, Да 2 Альфа-2-мароглобулин  123 A2MG_HUMAN 163188 3 Церулоплазмин 58 CERU_HUMAN 122128 4
5 Компонент комплемента С3
Уромодулин (белок Тамма-Хорсфалла) 122
–* CO3_HUMAN
UROM_HUMAN 187030
86700 6 Серотрансферрин 80 TRFE_HUMAN 77014 7 Альбумин 133 ALBU_HUMAN 69321 8 Альфа-1-антитрипсин 62 A1AT_HUMAN 46707 Фибриноген (цепь бета) 72 FIBB_HUMAN 55892 9 Фибриноген (цепь гамма) 79 FIBG_HUMAN 51479 Иммуноглобулин гамма -1 59 IGHG1_HUMAN 36083 10 Гаптоглобин 80 HPT_HUMAN 45177 11 Аполипопротеин А 120 APOA1_HUMAN 30759 14 Бета-глобин 84 HBB_HUMAN 15988 Альфа-глобин 59 HBA_HUMAN 15248

*Белок был в последующем идентифицирован методом ИФА, к которому значение «SCORE» не применимо.

Метод электрофоретического разделения компонентов сыворотки в полиакриламидном геле с последующей денситометрией позволил выявить статистически значимые различия в концентрации белков между исследованными группами. У больных хронической сердечной недостаточностью с сохраненной фракцией выброса и сахарным диабетом наблюдалась достоверно ниже концентрация серотрансферрина, альбумина, альфа-1-антитрипсина и фибриногена (цепь бета) по сравнению с контрольной группой. Концентрации соответствующих белков варьировались между исследуемыми сыворотками пациентов, однако оставались в пределах определенных диапазонов: концентрация серотрансферрина (зона 6) 315,9–3673,6 мкг/л.; альбумина (зона 7) 1828,1–6567,0 мкг/л.; альфа-1-антитрипсина и бета-цепи фибриногена (зона 8) 248,8–1611,1 мкг/л. Также в данной группе, по сравнению с группами хронической сердечной недостаточности без сахарного диабета и с сахарным диабетом и низкой фракцией выброса наблюдались изменения концентрации белка в зоне 5. В ходе дополнительных исследований, проведенных методом иммуноферментного анализа (ИФА) удалось идентифицировать данный белок как белок Тамма-Хорсфалла (Уромодулин) и определить диапазон значений его концентрации в исследуемых сыворотках: 48–277 мкг/л. Невозможность идентификации белка методом MALDI масс-спектрометрии по-видимому, связана с его низкой концентрацией (и, следовательно, низкой интенсивностью бэнда), а также с его высокой степенью гликозилирования (что можно заметить по ширине бэнда).

Таким образом, проведение электрофоретического разделения белков экзосомной фракции сывороток пациентов в полиакриламидном геле с денситометрией и масс-спектрометрической идентификацией после ферментативного гидролиза белков в геле трипсином позволяет диагностировать сердечную недостаточность с нормальной фракцией выброса в том числе у пациентов с сахарным диабетом, на основании снижения концентрации серотрансферрина, альбумина, альфа-1-антитрипсина и фибриногена (цепь бета) до обозначенных референтных значений.

Апробация способа осуществлялась на базе кафедры и клиники Пропедевтики внутренних болезней (ПВБ) Военно-медицинской Академии (ВМедА) им. С.М. Кирова.

Ниже приводятся результаты апробации:

Клинический пример 1

Больной Д., 60 лет. Диагноз: Гипертоническая болезнь 2 стадии, АГ 1 степени, риск 3; Сахарный диабет 2 типа. Недостаточность кровообращения II функционального класса NYHA, фракция выброса левого желудочка 58%, длительность сахарного диабета 7 лет. Сопутствующие заболевания: хронический гастрит антрального отдела желудка (фаза ремиссии). В крови, взятой утром натощак, содержание N-терминального фрагмента мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) соответствовало референтным значениям с учетом возраста пациента (101 пг/мл); определенная методом Тейхольца фракция выброса левого желудочка также соответствовала референсу – 58%. Тем не менее, выявленная по данным Эхо-КГ диастолическая дисфункция (Е/е’ > 14) и положительный дистолический стресс-тест позволили установить диагноз ХСН-сФВ.

По результатам электрофоретического разделения компонентов сыворотки в полиакриламидном геле с последующей денситометрией и масс-спектрической идентификацией белков было выявлено значимое снижение плазменных концентраций серотрансферрина – до 871,4 мкг/л.; альбумина – до 2001,7 мкг/л.; альфа-1-антитрипсина и бета -цепи фибриногена – до 611,9 мкг/л, что позволило диагностировать ХСН согласно разработанной формуле.

Клинический пример 2

Больной Н., 55 лет. Диагноз: Гипертоническая болезнь II стадии, АГ 1 степени, дислипидемия, гиперурикемия, нарушенная гликемия натощак, ожирение 2 ст., ГЛЖ, атеросклероз аорты, сонных артерий, риск 3. ЦВБ. Дисциркуляторная энцефалопатия II ст. В крови, взятой утром натощак, наблюдали диагностически значимое повышение содержания NT-proBNP – 161,4 пг/мл; значение фракции выброса левого желудочка по Тейхольцу – 60%, диастолическая дисфункция левого желудочка (Е/е’ > 14).

Для определения плазменных концентраций серотрансферрина, альбумина, альфа-1-антитрипсина и бета-цепи фибриногена был использован метод электрофоретического разделения компонентов сыворотки пациента в полиакриламидном геле с последующей денситометрией и масс-спектрической идентификацией белков. Полученные концентрации: серотрансферрин – 4255,1 мкг/л; альбумин – 7299,7 мкг/л; альфа-1-антитрипсин и бета -цепь фибриногена – 3725,3 мкг/л. Выходящие за предел предложенного нами референтного диапазона сывороточные концентрации обозначенных белков позволяют исключить наличие у пациента ХСН, что коррелирует с низким содержанием специфического маркера данного состояния и отсутствия признаков дисфункции левого желудочка по данным Эхо-КГ.

Таким образом, применение данного способа лабораторной диагностики хронической сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса у пациентов с сахарным диабетом и внедрение его в клиническую кардиологическую практику позволяет верифицировать развивающуюся ХСН на ранних стадиях по составу периферической крови, отражая клеточно-молекулярные механизмы ее развития. Результат применения способа будет выражаться в более достоверной ранней диагностике ХСН у данного фенотипа пациентов, что позволит проводит своевременную фармакотерапию заболевания.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики хронической сердечной недостаточности (ХСН) с сохраненной фракцией выброса у пациентов с сахарным диабетом на основе исследования белкового профиля фракции экзосом сыворотки крови. Проводят масс-спектрометрическую идентификацию белков серотрансферрина, альбумина, альфа-1-антитрипсина и фибриногена, и оценку их концентраций в сыворотке крови. При референтных значениях: серотрансферрина 315,9–3673,6 мкг/л; альбумина 1828,1–6567,0 мкг/л; альфа-1-антитрипсина и бета-цепи фибриногена 248,8–1611,1 мкг/л устанавливают диагноз ХСН. Способ обеспечивает возможность достоверной диагностики хронической сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса у пациентов с сахарным диабетом за счет исследования белкового профиля фракции экзосом сыворотки крови с помощью электрофореза белков в полиакриламидном геле и последующей идентификацией белков. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ лабораторной диагностики хронической сердечной недостаточности (ХСН) с сохраненной фракцией выброса у пациентов с сахарным диабетом на основе исследования белкового профиля фракции экзосом сыворотки крови, включающий масс-спектрометрическую идентификацию белков серотрансферрина, альбумина, альфа-1-антитрипсина и фибриногена, и оценку их концентраций в сыворотке крови, характеризующийся тем, что при референтных значениях: серотрансферрина 315,9–3673,6 мкг/л; альбумина 1828,1–6567,0 мкг/л; альфа-1-антитрипсина и бета-цепи фибриногена 248,8–1611,1 мкг/л устанавливают диагноз ХСН.