АНТИТЕЛО, НАЦЕЛЕННОЕ НА CD47, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 A61P35/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к технической области биологических лекарственных средств. В частности, изобретение относится к антителу, нацеленному на CD47, и его применению, а более конкретно относится к анти-CD47 антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке, композиции, применению и набору.

Предшествующий уровень техники

Иммунотерапия онкологических заболеваний является крупным событием в области биологических наук последних лет. Терапия ингибиторами контрольной точки иммунитета, в частности, на основе Т-клеток, антител к CTLA4, антител к PD-1, антител к PD-L1 и т.п., а также клеточная терапия с помощью CAR-T, TCR-T и т.п. - все это основные иммунотерапевтические подходы в последние годы. Эти подходы так или иначе связаны с восстановлением функции всех Т-клеток без исключения, и, другими словами, с улучшением приобретенной способности иммунной системы. Тем не менее, путь использования иммунной контрольной точки в качестве целевой точки и активации функции Т-клеток, чтобы улучшить способность приобретенной иммунной системы побеждать онкологическое заболевание, по-прежнему полон изгибов и поворотов. Однако действие системы врожденного иммунитета при иммунотерапии опухолей не проявляется длительное время. Фактически во всей области инфильтрации опухоли макрофаги составляют около 50% опухолевых тканей. Что еще более важно, количество макрофагов обратно пропорционально прогнозу опухолей, что дополнительно указывает на то, что макрофаги оказывают очень важное влияние на опухоли. Фагоцитоз, осуществляемый макрофагами, требует одновременного действия двух сигналов: один - это активация сигнала «съешь меня» на поверхности клетки-мишени, а другой - инактивация сигнала «не ешь меня» на поверхности той же мишени. Отсутствие какого-либо одного сигнала недостаточно для запуска фагоцитоза. Все больше данных свидетельствует о том, что CD47 является типом сигнала «не ешь меня» и ингибирует фагоцитоз макрофагов путем взаимного соединения с сигнальным регуляторным белком α (SIRPα) на поверхности макрофагов. Опухолевые клетки могут также избежать фагоцитоза макрофагами за счет экспрессии CD47 (например, можно сослаться на EP 2242512 и родственные документы, цитируемые в нем).

CD47, также известный как интегрин-ассоциированный белок (IAP), представляет собой мембранный белок массой 50 кДа с амино-концевым иммуноглобулиновым доменом и карбокси-концевым множественным трансмембранным доменом. Он взаимодействует с множеством лигандов, включая, помимо прочего, SIRPα, SIRPγ, интегрин и тромбоспондин-1 (TSP-1). SIRPα в основном экспрессируется на миелоидных клетках, включая макрофаги, миелоидные дендритные клетки (ДК), гранулоциты, тучные клетки и их предшественники, а также гемопоэтические стволовые клетки. Взаимодействие CD47/SIRPα передает сигнал «не ешь меня» и предотвращает аутофагию. Анализ опухолей пациентов и соответствующих соседних нормальных (неопухолевых) тканей показывает, что белок CD47 сверхэкспрессируется на клетках злокачественной опухоли, и это эффективно помогает им избежать врожденного иммунного надзора и элиминации. Уже было показано, что блокирование взаимодействия CD47-SIRPα с помощью анти-CD47 антитела эффективно индуцирует фагоцитоз опухолевых клеток in vitro и ингибирует рост различных гематологических и солидных опухолей in vivo. Таким образом, CD47 является эффективной мишенью для терапии онкологических заболеваний, и для получения терапевтических агентов для человека требуется его соответствующий антагонист.

Сущность изобретения

Моноклональное анти-CD47 антитело обладает более высокой способностью направленного связывания с эритроцитами и легко вызывает агглютинацию эритроцитов, так что терапевтический эффект соответствующего антитела значительно снижается, и имеют место побочные эффекты лекарственных средств. Настоящее изобретение предназначено для обеспечения антитела, нацеленного на CD47, которое может блокировать связывание CD47 с SIRPα и способствовать фагоцитозу макрофагов. Еще больше важна способность этого антитела предотвращать агглютинацию эритроцитов в определенной степени, а также хорошая безопасность.

Задачей настоящего изобретения является создание анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, причем указанное антитело содержит следующие области, определяющие комплементарность (CDRs):

LCDR1, показанную в SEQ ID NO:1, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1, LCDR2, показанную в SEQ ID NO:2, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2 и LCDR3, показанную в SEQ ID NO:3, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:3; и

HCDR1, показанную в SEQ ID NO:10, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:10, HCDR2, показанную в SEQ ID NO:11, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% последовательности идентичность с SEQ ID NO:11 и HCDR3, показанную в SEQ ID NO:12, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:12.

Другая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции, относящихся к анти-CD47 антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.

Настоящее изобретение также относится к применению анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и относящихся к ним нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики CD47-положительной опухоли.

Настоящее изобретение также относится к применению анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и относящихся к ним нуклеиновой кислоты, вектора или клетки для приготовления набора для обнаружения CD47 или диагностики связанного с CD47 заболевания.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается набор для обнаружения CD47, который содержит анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается набор для диагностики заболевания, связанного с CD47, который содержит анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Краткое описание чертежей

Для более ясного описания конкретных воплощений настоящего изобретения ниже кратко представлены чертежи, необходимые для их раскрытия. Следует понимать, что на чертежах показаны только некоторые воплощения настоящего изобретения, но это не следует рассматривать как ограничение объема настоящего изобретения. Специалистами в данной области техники в соответствии с этими чертежами без осуществления творческой деятельности также могут быть получены другие чертежи.

Фиг. 1 представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H11, 7A11H12, 7A11H22, 7A11H32, 7A11H42, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с CD47 человека.

Фиг. 2 представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H52, 7A11H14, 7A11H15, 7A11H33, 7A11H34, 7A11H35, 7A11H55, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с CD47 человека.

Фиг. 3 представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H11, 7A11H12, 7A11H22, 7A11H32, 7A11H42, 7A11H52, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с обезьяньим CD47.

Фиг. 4 представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H14, 7A11H15, 7A11H33, 7A11H34, 7A11H35, 7A11H55, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с обезьяньим CD47.

Фиг. 5 представляет собой результат ингибирования связывания CD47/SIRPα (человеческого CD47) с помощью анти-CD47 антитела (7A11H11, 7A11H12, 7A11H22, 7A11H32, 7A11H42 и изотипический контроль hIgG4).

Фиг. 6 представляет собой результат ингибирования связывания CD47/SIRPα (человеческого CD47) с помощью анти-CD47 антитела (7A11H52, 7A11H14, 7A11H15, 7A11H33, 7A11H34, 7A11H35 и 7A11H55).

Фиг. 7 представляет собой результат тестирования способности анти-CD47 антитела стимулировать макрофагальный фагоцитоз опухолевой клетки.

Фиг. 8 представляет собой результат тестирования способности к агглютинации эритроцитов (RBC) антитела CD47.

Фиг. 9 представляет собой результат тестирования способности анти-CD47 антитела связываться с эритроцитом человека.

Фиг. 10 представляет собой результат анализа связывания анти-CD47 антитела с тромбоцитами человека.

Фиг. 11 представляет собой результат анализа эффекта анти-CD47 антитела на фагоцитоз эритроцита активированным макрофагом.

Фиг. 12 представляет собой результат противоопухолевого эффекта анти-CD47 антитела на модели подкожного ксенотрансплантата В-лимфоцитов человека.

Фиг. 13 представляет собой результат противоопухолевого эффекта анти-CD47 антитела на модели злокачественной меланомы человека.

Подробное описание воплощений

Настоящее изобретение дополнительно описано ниже в сочетании с конкретными воплощениями, но воплощения не ограничивают настоящее изобретение в какой-либо форме. Если не указано иное, реагенты, способы и устройства, используемые согласно настоящему описанию, являются обычными реагентами, способами и устройствами в данной области техники.

Если не указано иное, реагенты и материалы, используемые в представленных далее воплощениях, являются коммерчески доступными.

Настоящее изобретение относится к анти-CD47 антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, и указанное антитело содержит следующие CDR:

LCDR1, показанную в SEQ ID NO:1, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1, LCDR2, показанную в SEQ ID NO:2, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2 и LCDR3, показанную в SEQ ID NO:3, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:3; и

HCDR1, показанную в SEQ ID NO:10, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:10, HCDR2, показанную в SEQ ID NO:11, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% последовательности идентичность с SEQ ID NO:11 и HCDR3, показанную в SEQ ID NO:12, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO:12.

Важным преимуществом антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является его высокая аффинность к CD47.

Важным преимуществом антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является то, что оно обладает способностью блокировать связывание CD47 с SIRPα.

Важным преимуществом антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является его способность стимулировать макрофаг к фагоцитированию опухолевой клетки.

Важным преимуществом антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является то, что оно значительно уменьшает агломерацию эритроцитов крови.

Важным преимуществом антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является то, что оно демонстрирует очень слабый уровень связывания или отсутствие связывания с эритроцитом.

Из-за вышеуказанных свойств антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно можно использовать в качестве лекарственного средства на основе антитела.

В настоящем изобретении технический термин «антитело или его антигенсвязывающий фрагмент» означает белок, который связывается со специфическим антигеном, и обычно относится ко всем белкам и белковым фрагментам, содержащим CDRs. «Антитело» конкретно относится к полноразмерному антителу. Термин «полноразмерное антитело» включает поликлональное антитело и моноклональное антитело.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» означает вещество, содержащее часть или все CDRs антитела и лишенное по меньшей мере некоторых аминокислот, присутствующих в полноразмерной цепи, но все же способное специфически связываться с антигеном. Этот тип фрагмента обладает биологической активностью, поскольку связывается с антигеном-мишенью и может конкурировать с другими антигенсвязывающими молекулами (включая полное антитело) за связывание с данным эпитопом. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент выполняет функцию специфического распознавания и связывания с CD47. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент, который имеет функцию блокирования связывания CD47 с его лигандом и активации иммунной клетки, и в одном аспекте этот тип фрагмента выбран из Fab (состоящего из полной легкой цепи и Fd), Fv (состоит из VH и VL), ScFv (одноцепочечное антитело, VH и VL связаны линкерным пептидом) или однодоменного антитела (состоит только из VH). Фрагмент может быть получен с помощью технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот или может быть получен ферментативным лизисом или химическим расщеплением антигенсвязывающих молекул (включая полное антитело).

Термин «определяющая комплементарность область» или «CDR» относится к гипервариабельным областям тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина. Существует три CDRs тяжелой цепи и три CDRs легкой цепи. В данном описании, в зависимости от ситуации, термины «CDR» и «CDRs» используются для обозначения области, содержащей один или несколько или даже все основные аминокислотные остатки, которые вносят вклад в аффинность связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном или эпитопом, распознаваемыми ими. В другом конкретном воплощении область CDR или просто CDR относится к гипервариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, определенной Международной информационной системой иммуногенетики (IMGT).

В настоящем изобретении определяющая комплементарность область тяжелой цепи обозначена как HCDR, а определяющая комплементарность область легкой цепи обозначена как LCDR. Общие способы маркировки CDR, используемые в данной области, включают: схему нумерации по Kabat, схему нумерации по Chothia и Lesk и новую стандартизированную систему нумерации, введенную Lefranc et al. в 1997 г. для всех белковых последовательностей суперсемейства иммуноглобулинов. Kabat et al. были первыми, кто предложил стандартизированную схему нумерации вариабельной области иммуноглобулина. В их компиляции «Sequences of Proteins of Immunological Interest», аминокислотные последовательности вариабельных областей легких (λ κ) и тяжелых цепей антитела, а также вариабельные области рецепторов Т-клеток (α, β, γ и δ) выровнены и пронумерованы. В последние несколько десятилетий накопление последовательностей привело к созданию базы данных KABATMAN, и схема нумерации по Kabat обычно считается широко принятым стандартом для нумерации остатков антител. Настоящее изобретение использует аннотационный стандарт Kabat для маркировки областей CDR, но области CDR, маркированные другими способами, также относятся к объему настоящего изобретения.

Термины «специфическое распознавание», «селективное связывание», «селективно связывающийся» и «специфически связывающийся» или подобные им относятся к связыванию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с заранее определенным эпитопом на антигене. Как правило, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с аффинностью (KD) менее чем около 10^-6 М, например менее чем около 10^-7 М, 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или менее.

В настоящем изобретении объект, специфически распознаваемый предлагаемым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, может представлять собой CD47, полученный из различных родов, таких как человек, мышь и обезьяна (например, яванский макак).

В некоторых воплощениях антитело содержит по меньшей мере одну из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи и последовательностей вариабельной области легкой цепи; по меньшей мере часть по меньшей мере одной из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи и последовательностей вариабельной области легкой цепи происходит из по меньшей мере одного из числа мышиного антитела, гуманизированного антитела, происходящего из примата антитела или их мутанта.

В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена любой из SEQ ID NO:5~9 или последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с любой из SEQ ID NO:5~9.

В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена любой из SEQ ID NO:14~18 или последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с любой из SEQ ID NO:14~18.

В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:5, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:15; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:17; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:18; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:8, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:9, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:7, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:8, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:9, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:9, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:18.

В некоторых воплощениях антитело имеет константную область, причем константная область тяжелой цепи выбрана из области любого из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD, а и константная область легкой цепи представляет собой κ- или λ-цепь.

В некоторых воплощениях источником константной области является мышь, кролик, овца, обезьяна или человек.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой любое одно или несколько антител с привитыми CDRs, мультимерное антитело или биспецифическое антитело.

В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой любой один или несколько из F(ab')2, Fab, scFv, Fv и однодоменного антитела.

В некоторых воплощениях CD47 представляет собой CD47 человека, CD47 мыши или CD47 обезьяны.

Настоящее изобретение дополнительно относится к нуклеиновой кислоте, и нуклеиновая кислота кодирует анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Нуклеиновая кислота обычно представляет собой рибонуклеиновую кислоту (РНК) или дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), и молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, если промотор или энхансер влияет на транскрипцию кодирующей последовательности, то промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью. Нуклеиновую кислоту ДНК предпочтительно используют, когда она лигирована в вектор.

Кроме того, поскольку антитело представляет собой мембранный белок, нуклеиновая кислота обычно включает последовательность сигнального пептида.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вектору, который является носителем указанной выше нуклеиновой кислоты.

Термин «вектор» относится к средству доставки нуклеиновой кислоты, в которое может быть вставлен полинуклеотид. Поскольку вектор может экспрессировать белок, кодируемый вставленным полинуклеотидом, такой вектор называют экспрессирующим вектором. Вектор может быть введен в клетку-хозяин путем трансформации, трансдукции или трансфекции, так что переносимый им элемент генетического материала может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Вектор хорошо известен специалистам в данной области и включает, без ограничения указанным: плазмиду; фагемиду; космиду; искусственную хромосому, такую как искусственная хромосома дрожжей (YAC), искусственная хромосома бактерий (BAC) или искусственная хромосома, полученная из P1 (PAC); фаг, такой как фаг λ или фаг М13, и вирус животных. Вирус животных, который можно использовать в качестве вектора, включает, без ограничения указанным, ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус (например, вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, папилломавирус и паповавирус (например, SV40). В некоторых воплощениях вектор, описанный в настоящем изобретении, содержит регуляторный элемент, обычно используемый в генной инженерии, такой как энхансер, промотор, внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) и другие элементы контроля экспрессии (например, сигнал терминации транскрипции или сигнал полиаденилирования и полимерная U-последовательность).

Настоящее изобретение дополнительно относится к клетке, и эта клетка содержит указанную выше нуклеиновую кислоту или указанный выше вектор. Нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, используется для связывания с вектором, который затем экспрессируется в клетке, в которой может быть получено соответствующее антитело. Вектор может быть введен в эукариотическую клетку, особенно в клетку млекопитающего, для конструирования и получения клеток, способных экспрессировать анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении.

Используемые в данном описании выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие названия включают потомство. Таким образом, слова «трансформант» и «трансформированная клетка» включают первичную тестируемую клетку и культуру, полученную из нее, независимо от количества переносов. Следует также понимать, что из-за преднамеренных или непреднамеренных мутаций все потомки могут быть не совсем одинаковыми с точки зрения содержания ДНК. В объем изобретения включено мутантное потомство, обладающее той же функцией или биологической активностью, что и исходная трансформированная клетка, что определено скринингом. В случае, если имеется в виду другое название, это ясно из контекста.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, и фармацевтическая композиция содержит анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор или клетку.

В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. «Фармацевтически приемлемый носитель» может включать любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и фунгицидные агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и т.п., которые являются физиологически совместимыми для продления срока хранения или эффективности антитела.

Применение анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или композиции при получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики CD47-положительной опухоли также входит в объем настоящего изобретения.

Лекарственное средство может обладать пониженной способностью агглютинировать эритроциты крови и иметь пониженную активность связывания с эритроцитами.

Применение анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора или клетки для изготовления набора для обнаружения CD47 или диагностики заболевания, связанного с CD47, также входит в объем настоящего изобретения.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается набор для обнаружения CD47, который содержит анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается набор для диагностики заболевания, связанного с CD47, и набор содержит анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Настоящее изобретение обеспечивает следующие полезные эффекты.

В настоящем изобретении предложено анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело не агглютинирует эритроциты in vitro, и, что более замечательно, оно демонстрирует очень слабый уровень связывания или отсутствие связывания с эритроцитами; антитело может эффективно блокировать связывание CD47 с SIRPα, а также активировать и опосредовать фагоцитарную активность макрофагов в отношении опухолевых клеток; кроме того, антитело демонстрирует значительную специфичность нацеливания на CD47-положительные опухолевые клетки, обладает высокой аффинностью и сильной специфичностью, не вызывая агглютинации эритроцитов и демонстрируя крайне слабое связывание с эритроцитами и тромбоцитами человека, обладает хорошей безопасностью и, следовательно, анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть использованы в качестве многообещающего сайта-мишени в системе иммунотерапии опухолей, играть важную роль в лечении опухолей человека и иметь широкую перспективу применения при получении лекарственного средства для лечения CD47-положительных опухолей.

Воплощения настоящего изобретения подробно описаны ниже.

Пример 1. Скрининг мышиных моноклональных анти-CD47 антител

1. Конструирование рекомбинантной экспрессирующей плазмиды hCD47-ECD-HIS

Последовательность ДНК, кодирующая внеклеточную область CD47 человека (hCD47-ECD), за которой следует последовательность 6 × HIS-метки, синтезировали на основе матрицы (CEJ 94640.1) из GenBank, а затем клонировали в экспрессирующий вектор pCDNA3.4 (Thermo Company), чтобы получить рекомбинантную эукариотическую экспрессирующую плазмиду внеклеточного полноразмерного белка CD47, которую назвали рекомбинантной ДНК-плазмидой hCD47-ECD-HIS.

2. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка hCD47-ECD-HIS

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка hCD47-ECD-HIS включает следующие стадии.

(1) За день до транзиторной трансфекции клетки Expi293 (ThermoFisher Scientific; A14635) пассировали, инокулировали в среду Dynamis (gibco; A2617502) с плотностью 2*10⁶ во встряхиваемой колбе объемом 1 л (conning; 431147), помещали в шейкер для клеточных культур (Adolf Kuhner; ISF4-XC) и культивировали при 37°C, 8% CO₂ и 120 об/мин.

В день трансфекции клетки Expi293 подсчитывали с помощью счетчика клеток (Countstar; IC1000), клетки разводили и доводили до 2,9×10⁶ свежим культуральным раствором Dynamis; после чего клетки были готовы для трансфекции; PEI:ДНК=3:1; однородно перемешивали в течение 5 мин, осторожно перемешивали 20 раз и выдерживали в течение 15-30 мин; к клеткам Expi293 добавляли смесь ДНК-PEI, однородно перемешивали и помещали в шейкер для клеточных культур (Adolf Kuhner; ISF4-XC) и культивировали при 37°C, 8% CO₂ и 120 об/мин; и через 4 часа после трансфекции добавляли антитело для сэндвич-анализа (gibco; 15140122) и антикоагулянт (gibco; 0010057).

(2) Сбор надосадочной жидкости: трансфектомы непрерывно культивировали в течение 7 дней, а затем собирали образец. Сначала образец центрифугировали при низкой скорости 1000 об/мин×10 мин при 4°С, а затем центрифугировали при высокой скорости 12000 об/мин×30 мин при 4°С; надосадочную жидкость клеточной культуры собирали и фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм.

(3) Очистка с помощью колонки для аффинной хроматографии HisTrap: надосадочную жидкость загружали в колонку для аффинной хроматографии HisTrap со скоростью 1 мл/мин. После завершения загрузки хроматографическую колонку промывали 5 объемами колонки уравновешивающего раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl и 150 мМ NaCl, рН 8,0; далее хроматографическую колонку промывали 5 объемами колонки элюента, содержащего 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl и 0-500 мМ имидазола, рН 8,0, и собирали элюируемый пик. Очищенный белок CD47-ECD идентифицировали электрофорезом в полиакриламидном геле (SDS-PAGE).

3. Скрининг мышиных моноклональных анти-CD47 антител

Рекомбинантный белок hCD47-ECD-HIS (далее именуемый антигеном hCD47), очищенный на стадии 2, использовали для иммунизации мышей BALB/C (приобретенных в Центре экспериментальных животных Гуандуна). Конкретный способ заключается в следующем.

(1) Иммунизация животных: очищенный антиген hCD47 эмульгировали с полным адъювантом Фрейнда, мышей BALB/C в возрасте 6-8 недель иммунизировали методом подкожной или внутрибрюшинной инъекции, иммунизирующая доза составляла 25 мкг/мышь и в каждой группе было по 5 мышей; вторую иммунизацию проводили через 1 неделю, антиген эмульгировали с неполным адъювантом Фрейнда, доза иммунизации составляла 25 мкг/мышь. После 4-кратной иммунизации собирали хвостовую кровь и разбавляли в градиенте с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для определения титра сыворотки; и иммунизацию усиливали за три дня до слияния и для слияния клеток отбирали мышь с самым высоким титром антител.

(2) Слияние клеток: Sp2/0, полученные из BALB/C (ATCC® CRL-1581), использовали в качестве клеток миеломы, во время слияния они находились в логарифмической фазе роста; у иммунизированной мыши брали селезенку для приготовления одноклеточной суспензии лимфоцитов; лимфоциты селезенки мыши и клетки миеломы смешивали в соотношении 1:5~1:10, добавляли по каплям 1 мл 50% PEG1500 (рН 8,0) при 37°С, добавляли неполную среду DMEM и другой стоп-раствор. Среду HAT суспендировали и однородно перемешивали, надосадочную жидкость удаляли центрифугированием, помещали в 96-луночный планшет, который выдерживали в термостате с постоянной температурой 37°C и 5% CO₂. После одной недели культивирования проводили первую замену раствора на среду HАT, а еще через три дня культивирования проводили вторую замену раствора на среду HАT.

(3) Скрининг и клонирование: через 2 недели после слияния брали клеточную надосадочную жидкость для теста ELISA, чтобы определить факт связывания клеточной надосадочной жидкости с очищенным рекомбинантным белком CD47-ECD-His, и после этого клетки, результаты ELISA которых были положительными, подвергали скринингу, для повторного тестирования проводили второй тест ELISA; клетки в положительных лунках подвергали предельному разведению, значение ELISA определяли через 7 дней после каждого предельного разведения, и моноклональные лунки с более высоким положительным значением OD280 отбирали для предельного разведения, до тех пор, пока результаты ELISA всего 96-луночного планшета не становились положительными. Были отобраны моноклональные штаммы с высокими положительными значениями.

(4) Приготовление и очистка моноклонального антитела из надосадочной жидкости клеток: положительные клоны культивировали в культуральной колбе Т25 со средой DMEM, содержащей 15% сыворотки, и при размножении культуры их центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляли и клетки переносили во встряхиваемую колбу на 500 мл, добавляли бессывороточную среду (Hybridoma-SFM Complete DPM; Gibco; 12300-067) так, чтобы плотность клеток составляла около 3×10⁵ клеток/мл. После непрерывного культивирования в течение 1-2 недель, когда скорость гибели клеток достигает 60-70%, клеточную суспензию собирали и центрифугировали при высокой скорости 8000 об/мин в течение 20 минут, отбирали надосадочную жидкость, затем очищали надосадочную жидкость с помощью аффинной хроматографии и очищали антитело с помощью аффинной хроматографии с протеином А. Загрузка образца; проточная промывка: проточную промывку 2,5 М раствором фосфатного буфера (PBS) с pH 7,4 осуществляли до тех пор, пока исходный уровень UV280 не стал равным 0; элюирование: элюирование 0,1 М раствором лимонной кислоты с рН 3,5, в каждую пробирку для элюата набирали объем 2 мл, в каждую пробирку добавляли 100 мкл 1 М раствора Трис; собранный раствор концентрировали; определяли концентрацию очищенного моноклонального антитела и подтверждали чистоту антитела с помощью геля SDS-PAGE; антитело расфасовывали (100 мкл/пробирку) и хранили при -80°C.

Пример 2. Гуманизированный дизайн и комбинирование с мышиным моноклональным антителом

Аминокислотные последовательности CDRs легкой цепи мышиного антитела показаны в SEQ ID NO:1~3:

7A11D3D3-LCDR1 7A11D3D3-LCDR2 7A11D3D3-LCDR3 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRES KQSYNLRT

Аминокислотные последовательности CDRs тяжелой цепи мышиного антитела показаны в SEQ ID NO:10~12:

7A11D3D3-HCDR1 7A11D3D3-HCDR2 7A11D3D3-HCDR3 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SNWMN MIHPSDSETRLNQKFKD GTTVVDAFAY

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного антитела (>7A11D3D3-VL) показана в SEQ ID NO:4.

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела (>7A11D3D3-VH) показана в SEQ ID NO:13.

Гуманизированный дизайн выполнили на мышином антителе, 5 гуманизированных последовательностей, 7A11-L01~05 соответственно, сконструировали для легкой цепи мышиного моноклонального антитела 7A11D3D3, аминокислотные последовательности вариабельных областей гуманизированной легкой цепи (7A11-L01~05) показаны в SEQ ID NO:5-9; и 5 гуманизированных последовательностей, 7A11-H01~05 соответственно, сконструировали для тяжелой цепи, аминокислотные последовательности гуманизированных вариабельных областей тяжелой цепи (7A11-H01~05) показаны в SEQ ID NO:14~18.

Вышеупомянутые аминокислотные последовательности были объединены, и полученные антитела, и последовательности, соответствующие их вариабельным областям тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL), представлены в табл. 1.

Таблица 1. Антитело и его соответствующие последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи Название антитела VH VL 7A11H11 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:5 7A11H12 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:6 7A11H22 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:6 7A11H32 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:6 7A11H42 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:6 7A11H52 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:6 7A11H14 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:8 7A11H15 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:9 7A11H33 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:7 7A11H34 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:8 7A11H35 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 7A11H55 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:9

Пример 3. Получение анти-CD47 антитела

Гуманизированный вариабельный домен объединяли с сигналом секреции и константными доменами κ и FcIgG4S228P человека, клонировали в систему экспрессии млекопитающих и трансфицировали в клетки 293 для получения гуманизированного mAb. Гуманизированный вариант экспрессировали в виде молекулы IgG полной длины, секретировали в культуральную среду и очищали с помощью протеина А.

Гуманизированное антитело и антитело положительного контроля Hu5F9-G4 (последовательность Hu5F9-G4 уже раскрыта в заявке США US2015/0183874A1) транзиторно экспрессировали в клетках Expi293 и очищали.

Для транзиторной экспрессии антитела в клетках Expi293 использовали вектор pCDNA3.4, и тяжелую цепь и легкую цепь антитела сначала клонировали в отдельные векторы pCDNA3.4, использовали реагент для химической трансфекции PEI (приобретенный у Polysciences), векторы pCDNA3.4 с тяжелой и легкой цепью молекулы антитела трансфицировали в клетки Expi293 методом химической трансфекции, причем клетки трансфицировали и культивировали по схеме, предложенной производителем.

За день до транзиторной трансфекции клетки Expi293 (ThermoFisher Scientific; A14635) пассировали, инокулировали средой Dynamis (gibco; A2617502) при плотности 2E6 в шейкерной колбе объемом 1 л (conning; 431147), помещали в шейкер для клеточных культур и культивировали в нем (Adolf Kuhner; ISF4-XC) при 37°C, 8% CO₂ и 120 об/мин.

В день трансфекции клетки Expi293 подсчитывали с помощью счетчика клеток (Countstar; IC1000), клетки разводили и доводили до плотности 2,9E6 свежим культуральным раствором Dynamis; после чего клетки были готовы для трансфекции; PEI:ДНК=3:1 равномерно смешивали в течение 5 минут, осторожно перемешивали 20 раз и выдерживали в течение 15~30 минут; смесь ДНК-PEI добавляли к клеткам Expi293, однородно перемешивали, помещали в шейкер для клеточных культур (Adolf Kuhner; ISF4-XC) и культивировали при 37°C, 8% CO₂ и 120 об/мин и через 4 часа после трансфекции добавляли антитело для сэндвич-анализа (gibco; 15140122) и антикоагулянт (gibco; 0010057).

Очистка собранной надосадочной жидкости: трансфектомы непрерывно культивировали в течение 7 дней, а затем собирали образец. Сначала центрифугировали при низкой скорости 1000 об/мин, 10 мин и 4°С (Xiangyi H2050R), а затем центрифугировали при высокой скорости 12000 об/мин, 30 мин и 4°С; надосадочную жидкость клеточной культуры собирали и фильтровали при 0,22 мкм. Культуральные надосадочные жидкости использовали в колонке с протеином А-сефарозой (GE Healthcare). Колонку промывали PBS и элюировали элюирующим буфером (0,1 М цитратно-натриевый буфер, pH 3,0) для удаления белка. Собранный компонент нейтрализовали 1 М Трис pH 9,0. Наконец, очищенный образец подвергали диализу с PBS.

Пример 4. Определение аффинности анти-CD47 антитела

1. Экспериментальный метод

Константу равновесной диссоциации (KD) антитела по настоящему изобретению, связывающегося с CD47 человека (hCD47), определяли с помощью биопленочной интерферометрии (ForteBio). Определение аффинности ForteBio проводили в соответствии со способом, известным в данном уровне техники (Estep, P et al., High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs; 2013.5 (2): p.270-8), который заключается в следующем: датчик использовался для уравновешивания в автономном режиме в течение 30 минут в анализирующем буфере и обнаруживался в режиме онлайн в течение 60 секунд для установления исходного уровня. Очищенное антитело, полученное в Примере 3, загружали в рабочем режиме в датчик AHC (ForteBio) для определения аффинности ForteBio, а затем датчик с загруженным антителом подвергали воздействию 100 нМ антигена CD47 в течение 5 минут, после чего датчик переносили в анализирующий буфер для диссоциации на 5 минут и использовали для измерения скорости диссоциации. Кинетический анализ проводили с моделью связывания 1:1.

2. Экспериментальный результат

Результаты определения аффинности анти-CD47 антитела представлены в табл. 2, и результаты показали, что анти-CD47 антитело обладает высокой аффинностью.

Таблица 2. Результаты определения аффинности анти-CD47 антитела Название антитела KD (M) Kon (1/Mс) Kd (1/с) 7A11H11 5,90E-10 5,90E-10 5,90E-10 7A11H12 4,59E-10 4,59E-10 4,59E-10 7A11H14 5,62E-10 5,62E-10 5,62E-10 7A11H15 2,12E-10 1,48E+06 3,13E-04 7A11H35 8,81E-10 8,81E-10 8,81E-10 7A11H22 7,40E-10 7,40E-10 7,40E-10 7A11H33 3,60E-10 3,60E-10 3,60E-10 7A11H42 3,09E-10 3,09E-10 3,09E-10

Пример 5. Связывание анти-CD47 антитела с CD47 человека

1. Экспериментальный метод

Связывание анти-CD47 антитела по настоящему изобретению с CD47 человека измеряли способом, основанным на проточной цитометрии. Конкретные стадии были следующими.

Использовали клеточную линию CCRF-CEM (Cell Bank of China Academy of Sciences, Shanghai), экспрессирующую человеческий CD47, которая относится к Т-лимфоцитам острого лимфобластного лейкоза человека. Клетки CCRF-CEM (0,1×10⁶ клеток) смешивали с экспериментальными антителами (анти-CD47 антитело по настоящему изобретению и антитело Hu5F9-G4) в различных концентрациях (самая высокая концентрация составляет 30 мкг/мл, это было трехкратное разведение, и всего было 10 концентраций) в PBS, содержащем 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA), и инкубировали на льду в течение 30 минут. Затем клетки промывали не менее двух раз, готовили флуоресцентно меченное второе козье PE-антитело против IgG Fc человека (разведение 1:500×) с FCM-буфером (1XPBS+3%BSA), добавляли в соответствующий 96-луночный планшет по 100 мкл/лунку и инкубировали в холодильнике при 4°С в течение 30 мин. Затем 96-луночный планшет вынимали и центрифугировали при 250 g в течение 5 минут, после чего надосадочную жидкость осторожно удаляли, добавляли FCM-буфер в количестве 200 мкл/лунку и снова центрифугировали при 250 g в течение 5 минут, и осторожно удаляли надосадочную жидкость. Клетки промывали не менее двух раз и ресуспендировали, используя 100 мкл/лунку 1×PBS, и анализировали с помощью проточной цитометрии, и в GraphPad строили кривую зависимости концентрации от средней интенсивности флуоресценции (MFI). Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты EC₅₀ связывания анти-CD47 антитела с CD47 человека представлены в табл. 3, средняя интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H11, 7A11H12, 7A11H22, 7A11H32, 7A11H42, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с CD47 человека, показана на фиг. 1 и средняя интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H52, 7A11H14, 7A11H15, 7A11H33, 7A11H34, 7A11H35, 7A11H55, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с CD47 человека, показана на фиг. 2. Результаты показали, что анти-CD47 антитело по настоящему изобретению и антитело положительного контроля обладают сравнимой специфической связывающей способностью с CD47 человека на клеточном уровне.

Таблица 3: Результаты определения способности анти-CD47 антитела связываться с CD47 человека Название антитела EC50 (нM) 7A11H11 0,8218 7A11H12 0,7157 7A11H22 0,8202 7A11H32 0,7172 7A11H42 0,7269 7A11H52 0,9148 7A11H14 0,9334 7A11H15 0,7234 7A11H33 0,7598 7A11H34 1,195 7A11H35 0,8623 7A11H55 1,209 Hu5F9-G4 0,7289

Пример 6. Связывание анти-CD47 антитела с CD47 обезьяны

1. Экспериментальный метод

Путем трансфекции вектора pCDNA3.4, несущего полноразмерный CD47 обезьяны, получали стабильную клеточную линию СНО (клетки CHO-cynoCD47), сверхэкспрессирующую CD47 обезьяны, и клетки CHO-cynoCD47 (0,1×10⁶ клеток) смешивали с экспериментальными антителами (анти-CD47 антитело по настоящему изобретению и антитело Hu5F9-G4) в различных концентрациях (самая высокая концентрация составляет 10 мкг/мл, это было трехкратное разведение, всего было 10 концентраций) в PBS, содержащем 3% BSA, и инкубировали на льду в течение 30 минут. Затем клетки промывали не менее двух раз, получали флуоресцентно меченное второе козье PE-антитело против IgG Fc человека (разведение 1:500×) с FCM-буфером (1XPBS+3%BSA), добавляли в соответствующий 96-луночный планшет по 100 мкл/лунку и инкубировали в холодильнике при 4°С в течение 30 мин. Извлекали 96-луночный планшет и центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, после чего осторожно удаляли надосадочную жидкость, добавляли буфер FCM в количестве 200 мкл/лунку и снова центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, после чего тщательно удаляли надосадочную жидкость. Клетки промывали не менее двух раз и ресуспендировали с 1×PBS в количестве 100 мкл/лунку и анализировали с помощью проточной цитометрии, и кривую, зависящую от концентрации, строили с помощью GraphPad в соответствии с медианой интенсивности флуоресценции (MFI). Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты EC₅₀ связывания антитела CD47 с CD47 обезьяны представлены в табл. 4, средняя интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H11, 7A11H12, 7A11H22, 7A11H32, 7A11H42, 7A11H52, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с CD47 обезьяны, показана на фиг. 3, и средняя интенсивность флуоресценции анти-CD47 антитела (7A11H14, 7A11H15, 7A11H33, 7A11H34, 7A11H35, 7A11H55, положительное контрольное антитело Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4), связывающегося с CD47 обезьяны, показана на фиг. 4. Результаты показали, что антитело по настоящему изобретению и антитело положительного контроля обладают сравнимой специфической связывающей способностью с CD47 обезьяны на клеточном уровне.

Таблица 4. Результаты EC₅₀ связывания анти-CD47 антитела с CD47 обезьяны Название антитела EC50 (нM) 7A11H11 8,932 7A11H12 7,353 7A11H22 8,546 7A11H32 17,12 7A11H42 5 7A11H52 4,506 7A11H14 4,957 7A11H15 7,271 7A11H33 4,847 7A11H34 8,609 7A11H35 4,379 7A11H55 4,616 Hu5F9-G4 5,123

Пример 7. Анти-CD47 антитело блокирует взаимодействие SIRPα, лиганда CD47 человека, с CD47

1. Экспериментальный метод

Способность анти-CD47 антитела по настоящему изобретению блокировать связывание CD47 человека с SIRPα определяли с помощью проточной цитометрии. Конкретные стадии были следующими:

Разведение антител: буфер FCM (1XPBS+3%BSA) использовали для разведения анти-CD47 антитела по настоящему изобретению и контрольного антитела Hu5F9-G4 до 90 мкг/мл, затем антитело разбавляли до 10 концентраций в 3-кратном градиенте, и контрольный подтип hIgG4 разводили до 30 мкг/мл, 1,1 мкг/мл и 0,04 мкг/мл, а лиганд hSIRP α-mFC (AcroBiosystems) разводили до 10 мкг/мл.

Клетки CCRF-CEM (Клеточный банк Китайской академии наук, Шанхай) добавляли в 96-луночный планшет V-типа в количестве 0,1×10⁶ клеток/лунку и связывание hSIRPα-mFC контролировали в условиях увеличения количества анти-CD47 антитела. Связанный SIRPα определяли с помощью второго козьего PE-антитела против мышиного IgG Fc (Biolegend). Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты ингибирования анти-CD47 антителом связывания CD47/SIRPα применительно к CD47 человека (7A11H11, 7A11H12, 7A11H22, 7A11H32, 7A11H42, Hu5F9-G4 и изотипический контроль hIgG4) показаны на фиг. 5 и результаты ингибирования анти-CD47 антителом связывания CD47/SIRPα применительно к CD47 человека (7A11H52, 7A11H14, 7A11H15, 7A11H33, 7A11H34, 7A11H35 и 7A11H55) показаны на фиг. 6. Результаты показали, что анти-CD47 антитело по настоящему изобретению может значительно ингибировать связывание CD47 с SIRPα на клеточном уровне, и по сравнению с антителом положительного контроля анти-CD47 антитело по настоящему изобретению демонстрирует сравнимую блокирующую способность.

Пример 8. Детекция способности анти-CD47 антитела стимулировать макрофаги к фагоцитозу опухолевых клеток

1. Экспериментальный метод

Способность анти-CD47 антитела по настоящему изобретению стимулировать макрофагальный фагоцитоз опухолевых клеток измеряли способом, основанным на проточной цитометрии. Конкретные стадии были следующими:

Брали свежую кровь донора и разделяли для получения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), при этом CD14-положительные мононуклеарные клетки отделяли от РВМС с помощью магнитных гранул hCD14 (Miltenyi/130-050-201). Готовили полную среду, содержащую rhGM-CSF (R&D; 7954-GM-010), конечная концентрация rhGM-CSF составляла 50 нг/мл, а концентрация CD14-положительных мононуклеарных клеток составляла 5E5/мл, среду добавляли в чашку для культивирования клеток по 20 мл/чашку; чашку переносили в термостат для культивирования клеток при 5% СО2 и 37°С и заменяли среду (содержащую 50 нг/мл GM-CSF) наполовину каждые 3 дня; продолжали культивирование в течение 4 дней. На 8-й день надосадочную жидкость макрофагов аспирировали в центрифужную пробирку объемом 15 мл и одновременно добавляли предварительно охлажденный DPBS, а клетки непосредственно собирали клеточным скребком.

Линия опухолевых клеток Jurkat (Банк клеток Китайской академии наук, Шанхай) с высокой экспрессией человеческого CD47 выбрали в качестве типа клеток-мишеней и эти опухолевые клетки-мишени флуоресцентно метили в соответствии с инструкциями к набору CellTraceTM CFSE. Меченые опухолевые клетки культивировали совместно с указанными выше дифференцированными макрофагами в соотношении 1:1, одновременно добавляя антитела в конечных концентрациях 10 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл, и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем клетки промывали не менее двух раз и осторожно продували, добавляли антитело к CD14, меченное аллофикоцианином (APC) (приобретенное у Biolegend; B259538), и инкубировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, на льду (защищенном от света) в течение 30 минут. Клетки промывали не менее двух раз и анализировали с помощью проточной цитометрии. Популяция фагоцитирующих клеток представляла собой популяцию клеток, которые являются CD14-положительными живыми клетками, а также положительны в отношении флуоресцентного красителя CFSE (диацетат карбоксифлуоресцеина и сукцинимидиловый эфир). Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты измерения способности анти-CD47 антитела стимулировать макрофагальный фагоцитоз опухолевых клеток представлены на фиг. 7. Результаты показали, что анти-CD47 антитело по настоящему изобретению обладает способностью стимулировать фагоцитоз макрофагами опухолевых клеток, причем способность стимулировать фагоцитоз макрофагами опухолевых клеток сравнима со способностью положительного контрольного антитела Hu5F9-G4.

Пример 9. Анализ гемагглютинации анти-CD47 антителами эритроцитов человека

1. Экспериментальный метод

Анализ гемагглютинации эритроцитов проводили, чтобы охарактеризовать способность анти-CD47 антитела к агглютинации эритроцитов. Анти-CD47 антитела подвергали скринингу на предмет агглютинации эритроцитов путем наблюдения за способностью антител не осаждать эритроциты человека. Конкретный способ заключался в следующем.

Эритроциты разводили до 2% в PBS и анти-CD47 антитело (последовательные концентрации 200 мкг/мл, 100 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 1,5625 мкг/мл, 0,78125 мкг/мл, 0,390625 мкг/мл, 0,195313 мкг/мл и 0,097656 мкг/мл) добавляли по каплям и инкубировали в круглодонном 96-луночном планшете при 37°C в течение 2 часов. Наличие неосажденных эритроцитов свидетельствовало о гемагглютинации эритроцитов и неосажденные эритроциты были похожи на дымку по сравнению с неагглютинированными эритроцитами, образующими четкие красные точки. Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты измерения способности анти-CD47 антитела к агглютинации эритроцитов представлены на фиг. 8. Результаты показали, что хотя концентрация анти-CD47 антитела достигает 200 мкг/мл, агглютинации клеток не происходит, и было обнаружено, что анти-CD47 антитело по настоящему изобретению оказывает эффект значительного снижения гемагглютинации эритроцитов. При лечении онкологических заболеваний побочные эффекты анти-CD47 антитела могут быть значительно снижены, при этом имеет место хорошая безопасность.

Пример 10. Анализ связывания анти-CD47 антитела с эритроцитами человека

1. Экспериментальный метод

Моноклональное анти-CD47 антитело обладает свойством связываться с эритроцитами человека. Для ингибирующих анти-CD47 антител существует потенциальный риск снижения эффективности лекарственного средства из-за интерференции с эритроцитами и мишенями, не являющимися опухолью. Если антитело с низкой активностью связывания с эритроцитами подвергнуть скринингу, риск нецелевого действия может быть снижен, а безопасность антитела может быть повышена. Конкретные стадии заключались в следующем.

(1) Разведение антител: буфер FACS использовали для разведения анти-CD47 антитела до исходной концентрации 20 мкг/мл в объеме 180 мкл, антитело разбавляли в 3-кратном градиенте (60+120) и получали 11 концентраций.

(2) Подсчет клеток и посев: эритроциты центрифугировали при 250 g в течение 5 минут, затем отбрасывали надосадочную жидкость, плотность клеток доводили до 2E+06 с помощью буфера FACS и равномерно распределяли в 96-луночном планшете с V-образными лунками по 100 мкл/лунку.

(3) Вышеуказанное разбавленное антитело добавляли к клеткам в количестве 100 мкл/лунку и инкубировали при 2°C~8°C в течение 0,5 часа.

(4) 96-луночный планшет вынимали и центрифугировали при 250 g в течение 5 минут, после того как надосадочную жидкость осторожно удаляли, добавляли FACS-буфер в количестве 200 мкл/лунку и снова центрифугировали при 250 g в течение 5 минут, после чего надосадочную жидкость осторожно удаляли.

(5) Флуоресцентно меченное второе козье PE-антитело против IgG Fc человека (biolegend) (разведение 1:500) готовили с буфером FACS и добавляли в соответствующий 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунку, клетки ресуспендировали, и инкубировали при 2°C~8°C в течение 30 мин.

(6) 96-луночный планшет вынимали и центрифугировали при 250 g в течение 5 минут, после осторожного удаления надосадочной жидкости добавляли FACS-буфер в количестве 200 мкл/лунку и снова центрифугировали при 250 g в течение 5 минут, осторожно удаляли надосадочную жидкость.

(7) Осадок ресуспендировали с 1×PBS в количестве 100 мкл/лунку и анализировали с помощью FACS. Данные анализировали с помощью проточного цитометра (Beckman, Cytoflex) и наносили на график с помощью GraphPad Prism. Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты измерения способности анти-CD47 антитела связываться с эритроцитами человека представлены на фиг. 9. Результаты показали, что по сравнению с антителом положительного контроля активность связывания анти-CD47 антитела по настоящему изобретению с эритроцитами человека значительно снижена, а его безопасность в качестве лекарственного средства повышена.

Пример 11. Анализ связывания анти-CD47 антител с тромбоцитами

1. Экспериментальный метод

Помимо того, что моноклональное антитело к CD47 способно связывается с эритроцитами человека, моноклональное анти-CD47 антитело обладает активными характеристиками связывания с тромбоцитами, и существует множество побочных эффектов, вызванных уменьшением количества тромбоцитов. Антитело с низким уровнем связывания тромбоцитов может снизить риск нецелевого воздействия и повысить его безопасность. Конкретный способ заключался в следующем.

Разведение антител: антитело разбавляли до 20 мкг/мл буфером FACS, объем составлял 240 мкл.

Подсчет клеток и посев: клетки цельной крови разбавляли в 20 раз и равномерно распределяли на 96-луночный планшет с V-образными лунками по 100 мкл/лунку.

Вышеуказанное разбавленное антитело добавляли к клеткам по 100 мкл/лунку и инкубировали при 2°C-8°C в течение 0,5 часа.

96-луночный планшет вынимали и центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, после чего осторожно удаляли надосадочную жидкость, добавляли FACS-буфер в количестве 200 мкл/лунку и снова центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, после чего надосадочную жидкость осторожно удаляли.

Флуоресцентно меченное второе PE-антитело (разведение 1:500) (козье PE-антитело против IgG Fc человека; biolegend; 409304) готовили с буфером FACS и добавляли в соответствующий 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунку и одновременно в каждую лунку добавляли1 мкл антитела АРС против CD61 человека (biolegend; 336411), клетки ресуспендировали и инкубировали при 2°С-8°С в течение 30 мин.

96-луночный планшет вынимали и центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, после осторожного удаления надосадочной жидкости добавляли FACS-буфер в количестве 200 мкл/лунку и снова центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, осторожно удаляли надосадочную жидкость.

Осадок ресуспендировали с 1xPBS в количестве 200 мкл/лунку и проводили детекцию FACS. Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты анализа связывания анти-CD47 антитела и тромбоцитов представлены на фиг. 10. Результаты показали, что анти-CD47 антитело по настоящему изобретению имеет значительно более низкую активность связывания с тромбоцитами, чем антитело положительного контроля, и демонстрирует лучшую безопасность.

Пример 12. Анализ влияния анти-CD47 антитела на фагоцитоз эритроцитов активированными макрофагами

1. Экспериментальный метод

Способ обнаружения такой же, как в Примере 8, опухолевые клетки замещали эритроцитами в качестве клеток-мишеней и определяли, оказывает ли анти-CD47 антитело по настоящему изобретению активирующее действие на фагоцитоз эритроцитов макрофагами. Антитело Hu5F9-G4 использовали в качестве положительного контроля.

2. Экспериментальный результат

Результаты анализа влияния анти-CD47 антитела на фагоцитоз эритроцитов активированными макрофагами представлены на фиг. 11. Результаты показали, что анти-CD47 антитело по настоящему изобретению очень слабо опосредует фагоцитоз эритроцитов макрофагами, а опосредующий эффект значительно ниже, чем у антитела положительного контроля, и демонстрирует лучшую безопасность.

Пример 13. Исследование противоопухолевой активности in vivo

1. Экспериментальный метод

70 Самок мышей NOD SCID (приобретенных у Zhejiang Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) отбирали для создания модели подкожного ксенотрансплантата В-лимфоцитов человека (Raji) и модели злокачественной меланомы человека (A375) и оценивали противоопухолевую активность анти-CD47 антитела по настоящему изобретению. В этих исследованиях аналог антитела Hu5F9-G4 и аналог антитела TJC-4 использовали в качестве антител положительного контроля, и в то же время hIgG4 использовали в качестве антитела изотипического контроля.

2. Экспериментальный результат

Противоопухолевое действие анти-CD47 антитела на модели подкожного ксенотрансплантата В-лимфоцитов человека показано на фиг. 12; результаты свидетельствуют о том, что анти-CD47 антитело по настоящему изобретению значительно эффективнее, чем положительное контрольное антитело, воздействует на подкожный ксенотрансплантат В-лимфоцитов человека.

Результаты противоопухолевого действия анти-CD47 антитела в модели злокачественной меланомы человека, представленные на фиг. 13, показали, что по сравнению с антителом положительного контроля анти-CD47 антитело по настоящему раскрытию более выигрышно при воздействии на злокачественную меланому человека.

Вышеуказанные воплощения являются предпочтительными воплощениями настоящего изобретения, но варианты настоящего изобретения не ограничиваются вышеуказанными воплощениями и любые другие изменения, модификации, замены, комбинации, упрощения могут быть сделаны без отклонения от сущности и принципов настоящего изобретения и являются эквивалентными раскрытым воплощениям и все они включены в объем настоящего изобретения.

--->

ИЗМЕНЕННЫЙ СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ГУАНДУН ФАПОН БИОФАРМА ИНК.

<120> АНТИТЕЛО, НАЦЕЛЕННОЕ НА CD47, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PN212981FPSW

<150> CN202011544262.6

<151> 2020-12-23

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 1

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 2

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 3

Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr

1 5

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 4

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 9

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile

50 55 60

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 10

Ser Asn Trp Met Asn

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 11

Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 12

Gly Thr Thr Val Val Asp Ala Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Val Val Asp Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Pro Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Val Val Asp Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Val Val Asp Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Val Val Asp Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Val Val Asp Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Val Val Asp Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к анти-CD47 антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, а также к фармацевтической композиции и набору, его содержащим. Также раскрыты нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанное антитело или его фрагмент, а также вектор и клетка, ее содержащие. Изобретение эффективно для лечения CD47-положительной опухоли. 11 н. и 14 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл., 13 пр.

1. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит следующие определяющие комплементарность области (CDR), приведенные в любом из подпунктов А), В) или С):

A) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные определяющим комплементарность областям последовательности SEQ ID NO:14, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные определяющим комплементарность областям последовательности SEQ ID NO:8, где HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 определены в соответствии с нумерацией Kabat;

B) LCDR1, представленную в SEQ ID NO:1, LCDR2, представленную в SEQ ID NO:2, и LCDR3, представленную в SEQ ID NO:3, и HCDR1, представленную в SEQ ID NO:10, HCDR2, представленную в SEQ ID NO:11, и HCDR3, представленную в SEQ ID NO:12, где HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 определены в соответствии с нумерацией Kabat; или

C) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные определяющим комплементарность областям последовательности SEQ ID NO:18, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные определяющим комплементарность областям последовательности SEQ ID NO:6, где HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 определены в соответствии с нумерацией Kabat.

2. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где указанное антитело содержит по меньшей мере одну из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи и последовательностей вариабельной области легкой цепи, причем по меньшей мере часть по меньшей мере одной из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи и последовательностей вариабельной области легкой цепи происходят по меньшей мере из одного антитела, представляющего собой антитело, полученное от мыши, гуманизированное антитело, антитело, полученное от примата, или их мутант.

3. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представляет собой последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:5-9.

4. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:14-18.

5. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 2-4, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:5, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:15; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:17; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:6, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:18; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:8, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:9, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:14; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:7, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:8, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:9, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:16; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:9, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO:18.

6. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, где указанное антитело имеет константную область, причем константная область тяжелой цепи выбрана из константной области любого из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD; а константная область легкой цепи представляет собой κ- или λ-цепь.

7. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 6, где вид источника константной области выбран из мыши, кролика, овцы, обезьяны или человека.

8. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, где константная область легкой цепи представляет собой κ-цепь человека, а константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG4 человека, имеющую мутацию S228P.

9. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, где константная область легкой цепи представляет собой κ-цепь человека, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; и константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG4 человека, имеющую мутацию S228P, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

10. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7, отличающиеся тем, что указанное антитело представляет собой любое одно или более из антитела с привитыми CDR или мультимерного антитела.

11. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой любой один или более из F(ab')2, Fab, scFv и Fv.

12. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11, где CD47 представляет собой CD47 человека, CD47 мыши или CD47 обезьяны.

13. Нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12.

14. Экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п. 13.

15. Трансформированная клетка для экспрессии анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-12, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 13 или экспрессирующий вектор по п. 14.

16. Фармацевтическая композиция для лечения CD47-положительной опухоли, причем указанная фармацевтическая композиция содержит анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12, нуклеиновую кислоту по п. 13, экспрессирующий вектор по п. 14 или трансформированную клетку по п. 15 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Применение анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13, экспрессирующего вектора по п. 14, трансформированной клетки по п. 15 или композиции по п. 16 для приготовления лекарственного средства для лечения CD47-положительной опухоли.

18. Применение по п. 17, где лекарственное средство способно снижать гемагглютинацию эритроцитов.

19. Применение по п. 17, где лекарственное средство имеет пониженную способность связывать эритроциты.

20. Применение анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13, экспрессирующего вектора по п. 14 или трансформированной клетки по п. 15 для изготовления набора для детекции CD47.

21. Набор для детекции CD47, содержащий анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12.

22. Набор для диагностики заболевания, связанного с CD47, содержащий анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12.

23. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12, нуклеиновая кислота по п. 13, экспрессирующий вектор по п. 14, трансформированная клетка по п. 15 или композиция по п. 16 для применения в качестве лекарственного средства для лечения CD47-положительной опухоли.

24. Анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12, нуклеиновая кислота по п. 13, экспрессирующий вектор по п. 14, трансформированная клетка по п. 15 или композиция по п. 16 для применения в способе лечения CD47-положительной опухоли.

25. Способ лечения CD47-положительной опухоли, включающий:

введение анти-CD47 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-12 или композиции по п. 16 субъекту, нуждающемуся в этом.