Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биомедицины, и конкретно, к способу конструирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида.
Уровень техники
В настоящее время обычный способ для разработки биспецифических антител, в общем, включает скрининг специфических антител против двух мишеней по отдельности, затем спаривание каждого из одной группы специфических антител с каждым из другой группы антител, экспрессию и очистку, и затем их анализ и тестирование по физико-химической или биологической активности и т.д. Общепринятый способ имеет проблемы многократности скрининга, высокой стоимости, длительного времени цикла и серьезного ухудшения качества после длительного хранения, что делает сложным соответствие нуждам промышленной массовой продукции.
Таким образом, существует настоятельная необходимость в способах скрининга биспецифических антител, которые могут соответствовать нуждам промышленной массовой продукции, с контролируемым качеством и простыми манипуляциями.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу дисплея биспецифических антигенсвязывающих полипептидов (например, биспецифических антител) на поверхности клеток (например, клеток млекопитающих). Сначала конструируют бактериальную библиотеку, способную экспрессировать различные компоненты (например, антигенсвязывающие полипептиды или их фрагменты, против двух или более различных мишеней, компоненты экспрессирующего вектора), и желательные компоненты расщепляют посредством использования рестрикционных эндонуклеаз в специфических участках рестрикции для получения соответствующих фрагментов вектора, которые можно направленно лигировать для формирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида. Экспрессирующий вектор переносят в клетку, так что клетка может экспонировать биспецифический антигенсвязывающий полипептид, и экспрессию биспецифического антигенсвязывающего полипептида и аффинность связывания с каждым антигеном можно анализировать напрямую. Посредством использования способа по настоящему изобретению, биспецифические антигенсвязывающие белки можно успешно экспрессировать на поверхности клеток млекопитающих, и множество пептидных цепей можно экспрессировать одновременно. Вектор можно использовать для экспрессии и скрининга биспецифических антигенсвязывающих белков любых структурных форм, таким образом, способствуя скринингу и разработке лекарственных средств на основе биспецифических антител и улучшению показателя успешности лекарственного средства.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу конструирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида, включающему: a) получение первого полинуклеотида, содержащего S5-LC1-S6 в направлении от 5' до 3'; b) получение второго полинуклеотида, содержащего B4-VH1-B3 в направлении от 5' до 3'; c) получение третьего полинуклеотида, содержащего B2-LC2-B4 в направлении от 5' до 3'; d) получение четвертого полинуклеотида, содержащего B5-VH2-B6 в направлении от 5' до 3'; e) получение пятого полинуклеотида, содержащего S6-фрагмент I экспрессирующего вектора-B2 в направлении от 5' до 3'; f) получение шестого полинуклеотида, содержащего B3-фрагмент II экспрессирующего вектора-B5 в направлении от 5' до 3'; g) получение седьмого полинуклеотида, содержащего B6-фрагмент III экспрессирующего вектора-S5 в направлении от 5' до 3'; h) специфическое расщепление первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, третьего полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, пятого полинуклеотида, шестого полинуклеотида и седьмого полинуклеотида с использованием рестрикционной эндонуклеазы для получения расщепленного первого полинуклеотида, расщепленного второго полинуклеотида, расщепленного третьего полинуклеотида, расщепленного четвертого полинуклеотида, расщепленного пятого полинуклеотида, расщепленного шестого полинуклеотида и расщепленного седьмого полинуклеотида; где рестрикционная эндонуклеаза специфически узнает S5, S6, B4, B3, B2, B5 и B6, соответственно; i) смешивание расщепленного первого полинуклеотида, расщепленного второго полинуклеотида, расщепленного третьего полинуклеотида, расщепленного четвертого полинуклеотида, расщепленного пятого полинуклеотида, расщепленного шестого полинуклеотида и расщепленного седьмого полинуклеотида таким образом, чтобы их можно было направленно лигировать и циклизовать для формирования экспрессирующего вектора; где LC1 кодирует первую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH1 кодирует вариабельную область первой тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и первая легкая цепь может связываться с вариабельной областью первой тяжелой цепи для формирования первого Fab для узнавания первой мишени; LC2 кодирует вторую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH2 кодирует вариабельную область второй тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и вторая легкая цепь может связываться с вариабельной областью второй тяжелой цепи для формирования второго Fab для узнавания второй мишени; где каждый из B2, B3, B4, B5, B6, S5 и S6 независимо представляют собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, конец, образованный в результате специфического расщепления B2 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B3, B4, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, конец, образованный в результате специфического расщепления B3 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, конец, образованный в результате специфического расщепления B4 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B3, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, конец, образованный в результате специфического расщепления B5 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B3, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, конец, образованный в результате специфического расщепления B6 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B3, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, конец, образованный в результате специфического расщепления S5 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, B3 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, конец, образованный в результате специфического расщепления S6 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, S5 и B3 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления, рестрикционная эндонуклеаза выбрана из SfiI и BsmBI.
В некоторых вариантах осуществления, B2, B3, B4, B5 и B6 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством BsmBI.
В некоторых вариантах осуществления, S5 и S6 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством Sfil.
В некоторых вариантах осуществления, B2 включает последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления, B3 включает последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления, B4 включает последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах осуществления, B5 включает последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления, B6 включает последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах осуществления, S5 включает последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления, S6 включает последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение первого полинуклеотида в первую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1. В некоторых вариантах осуществления, способ включает вставку первого полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения LC1 и введение продукта лигирования для хранения LC1 в первую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение плазмиды компонента первой легкой цепи, содержащей первый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение расщепленного первого полинуклеотида из плазмиды компонента первой легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления, способ включает расщепление плазмиды компонента первой легкой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S5 и S6, таким образом, получение расщепленного первого полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение второго полинуклеотида во вторую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1. В некоторых вариантах осуществления, способ включает вставку второго полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения VH1 и введение продукта лигирования для хранения VH1 во вторую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение плазмиды компонента первой тяжелой цепи, содержащей второй полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение расщепленного второго полинуклеотида из плазмиды компонента первой тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает расщепление плазмиды компонента первой тяжелой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B4 и B3, таким образом, получение расщепленного второго полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение третьего полинуклеотида в третью бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2. В некоторых вариантах осуществления, способ включает вставку третьего полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения LC2 и введение продукта лигирования для хранения LC2 в третью бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение плазмиды компонента второй легкой цепи, содержащей третий полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение расщепленного третьего полинуклеотида из плазмиды компонента второй легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления, способ включает расщепление плазмиды компонента второй легкой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B2 и B4, таким образом, получение расщепленного третьего полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение четвертого полинуклеотида в четвертую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2. В некоторых вариантах осуществления, способ включает вставку четвертого полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения VH2 и введение продукта лигирования для хранения VH2 в четвертую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение плазмиды компонента второй тяжелой цепи, содержащего четвертый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение расщепленного четвертого полинуклеотида из плазмиды компонента второй тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления, способ включает расщепление плазмиды компонента второй тяжелой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B5 и B6, таким образом, получение расщепленного четвертого полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение пятого полинуклеотида в пятую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I. В некоторых вариантах осуществления, способ включает вставку пятого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента I для хранения и введение продукта лигирования для хранения в пятую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение плазмиды фрагмента I компонента дисплея, содержащей пятый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение расщепленного пятого полинуклеотида из плазмиды фрагмента I компонента дисплея. В некоторых вариантах осуществления, способ включает расщепление плазмиды фрагмента I компонента дисплея с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S6 и B2, таким образом, получение расщепленного пятого полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение шестого полинуклеотида в шестую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II. В некоторых вариантах осуществления, способ включает вставку шестого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента II для хранения и введение продукта лигирования для хранения в шестую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение плазмиды фрагмента II компонента дисплея, содержащей шестой полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение расщепленного шестого полинуклеотида из плазмиды фрагмента II компонента дисплея. В некоторых вариантах осуществления, способ включает расщепление плазмиды фрагмента II компонента дисплея с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B3 и B5, таким образом, получение расщепленного шестого полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение седьмого полинуклеотида в седьмую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III. В некоторых вариантах осуществления, способ включает вставку седьмого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента III для хранения и введение продукта лигирования хранения в седьмую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение плазмиды фрагмента III компонента дисплея, содержащей седьмой полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает получение расщепленного седьмого полинуклеотида из плазмиды фрагмента III компонента дисплея. В некоторых вариантах осуществления, способ включает расщепление плазмиды фрагмента III компонента дисплея с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B6 и S5, таким образом, получение расщепленного седьмого полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает криоконсервирование бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1, бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2, бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1, бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2, бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I, бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II и бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III.
В некоторых вариантах осуществления, вектор компонента происходит из вектора pUC.
В некоторых вариантах осуществления, вектор pUC представляет собой вектор pUC19 или происходит из вектора pUC19.
В некоторых вариантах осуществления, бактериальная библиотека компонента легкой цепи LC1 включает по меньшей мере 10 различных клонов.
В некоторых вариантах осуществления, бактериальная библиотека компонента легкой цепи LC2 включает по меньшей мере 10 различных клонов.
В некоторых вариантах осуществления, бактериальная библиотека компонента тяжелой цепи VH1 включает по меньшей мере 10 различных клонов.
В некоторых вариантах осуществления, бактериальная библиотека компонента тяжелой цепи VH2 включает по меньшей мере 10 различных клонов.
В некоторых вариантах осуществления, экспрессирующий вектор биспецифического антигенсвязывающего полипептида включает по меньшей мере 10 различных клонов.
В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид и/или четвертый полинуклеотид получают из материалов образцов.
В некоторых вариантах осуществления, материалы образцов включают антитела, нацеленные на специфические антигены, или их антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты нацелены на PD-1 и/или PD-L1.
В некоторых вариантах осуществления, направленное лигирование включает использование лигазы.
В некоторых вариантах осуществления, лигаза включает ДНК-лигазу T4.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору биспецифического антигенсвязывающего полипептида, полученному посредством этого способа.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к библиотеке дисплея биспецифических антигенсвязывающих полипептидов, полученной посредством использования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида.
В конкретном варианте осуществления, библиотека представляет собой библиотеку дисплея клеток млекопитающих.
В конкретном варианте осуществления, библиотека является способной экспонировать по меньшей мере 10 различных биспецифических антител или их фрагментов антител.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу скрининга антител или фрагментов антител, включающему использование библиотеки по настоящему изобретению.
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения может легко осознать специалист в данной области из следующего подробного описания. В следующем подробном описании, только иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения показаны и описаны. Как будет понятно специалисту в данной области, содержание настоящего изобретения позволяет специалисту в данной области вносить изменения в описанные конкретные варианты осуществления без отклонения от содержания и объема изобретения, включенного в настоящую заявку. Соответственно, чертежи и раскрытие в описании настоящего изобретения являются просто иллюстративными, а не ограничивающими.
Краткое описание чертежей
Конкретные признаки изобретения, включенного в настоящую заявку, являются такими, как показано в прилагаемой формуле изобретения. Характеристики и преимущества изобретения, включенного в настоящую заявку, можно лучше понять со ссылкой на иллюстративные варианты осуществления, подробно описанные ниже, и сопровождающие чертежи. Краткое описание чертежей является таким, как ниже:
На ФИГ. 1 показана структура экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида по настоящему изобретению;
На ФИГ. 2 показана структура экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида в качестве конкретного примера в настоящей заявке;
На ФИГ. 3 показана экспрессия биспецифического антигенсвязывающего полипептида по настоящему изобретению на поверхности клетки;
На ФИГ. 4A-4J показано, что биспецифический антигенсвязывающий полипептид по настоящему изобретению связывается с антигеном зависимым от дозы образом.
Подробное описание вариантов осуществления
Осуществление настоящего изобретения будет проиллюстрировано ниже посредством конкретных примеров, и другие преимущества и эффекты настоящего изобретению может легко узнать специалист в данной области из содержания, раскрытого в описании.
Определение терминов
В настоящей заявке термин «продукт лигирования для хранения», в общем, относится к продукту, образованному посредством лигирования расщепленного полинуклеотида с нуклеотидом вектора компонента. В настоящей заявке, полинуклеотид можно лигировать с вектором компонента, содержащим участок узнавания для такой же рестрикционной эндонуклеазы, посредством лигазы (например, ДНК-лигазы), для получения продукта лигирования для хранения.
В настоящей заявке, термин «вектор компонента», в общем, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может содержать целевую нуклеиновую кислоту (такую как первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид, пятый полинуклеотид, шестой полинуклеотид и седьмой полинуклеотид по настоящему изобретению) и может быть использована для введения целевой нуклеиновой кислоты в клетку. Термин «вектор» может включать (но без ограничения,) плазмиду, вирус, космиду и искусственную хромосому. Как правило, сконструированный вектор может включать точку начала репликации, участок рестрикции и селективный маркер. Вектор, как правило, представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно, последовательность ДНК. В некоторых случаях, вектор компонента по настоящему изобретению может происходить из плазмидного вектора, например, плазмидного вектора pUC. В качестве другого примера, вектор pUC может представлять собой вектор pUC19 или происходить из вектора pUC19.
В настоящей заявке, термин «введение», в общем, относится к способу вставки экзогенного полинуклеотида в клетку, который может включать «трансфекцию», «трансформацию» или «трансдукцию». «Введение» может включать введение в эукариотическую клетку или прокариотическую клетку, то есть, нуклеотид может входить в клетку и превращаться в автономный репликон. Клетка может представлять собой клетку-хозяина. Введенная клетка включает первичные клетки субъекта и их потомство. Клетка может представлять собой прокариотическую клетку, например, она может представлять собой бактериальную клетку.
В настоящей заявке, термин «антитело», в общем, относится к молекуле полипептида, способной к специфическому узнаванию и/или нейтрализации специфического антигена. Основная 4-цепочечная единица антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи, как правило, состоит из трех доменов CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи (VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен CL. Области VH и VL можно далее подразделять на множество гипервариабельных областей, называемых определяющими комплементарность областями (CDR), которые перемежаются более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, которые аранжированы от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи включают связывающие домены, взаимодействующие с антигеном.
В настоящей заявке, термин «биспецифический связывающий полипептид», в общем, относится к полипептиду, способному к специфическому связыванию по меньшей мере двух различных антигенов (например, первой мишени и второй мишени), который по меньшей мере включает первый Fab для узнавания первой мишени и второй Fab для узнавания второй мишени.
В настоящей заявке, термин «Fab», в общем, относится к антигенсвязывающему фрагменту, состоящему из интактной цепи L (которая может включать VL и CL) вместе с доменом вариабельной области (VH) одной тяжелой цепи и первым константным доменом (CH1) одной тяжелой цепи. Каждый Fab может иметь один антигенсвязывающий участок. Биспецифический антигенсвязывающий полипептид может включать первый Fab и второй Fab. «Первый Fab», в общем, относится к Fab, который может узнавать первую мишень биспецифического антигенсвязывающего полипептида, как правило, сформированному посредством связывания первой легкой цепи с вариабельной областью первой тяжелой цепи. «Второй Fab», в общем, относится к Fab, который может узнавать вторую мишень биспецифического антигенсвязывающего полипептида, как правило, сформированному посредством связывания второй легкой цепи с вариабельной областью второй тяжелой цепи.
В настоящей заявке, термин «LC», в общем, относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь или фрагмент легкой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида. В настоящей заявке, легкая цепь или фрагмент легкой цепи может иметь способность к связыванию с тяжелой цепью из такого же или сходного антитела. В настоящей заявке, легкая цепь или фрагмент легкой цепи может включать вариабельную область легкой цепи (VL) и константную область легкой цепи (CL). Константную область легкой цепи можно подразделять на каппа-тип и лямбда-тип. Легкая цепь также включает легкую цепь, имеющую вариабельную область лямбда (V-λ), связанную с константной областью каппа (C-κ), или вариабельную область каппа (V-κ), связанную с константной областью лямбда (C-λ). Легкая цепь по настоящему изобретению может включать интактную легкую цепь и ее антигенсвязывающие фрагменты. При этом, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, узнающую первую мишень посредством первого Fab в биспецифическом антигенсвязывающем полипептиде (то есть, первую легкую цепь), может быть обозначен как LC1, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, узнающую вторую мишень посредством второго Fab (то есть, вторую легкую цепь), может быть обозначен как LC2.
В настоящей заявке, термин «VH», в общем, относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты кодирующую вариабельную область тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида. В настоящей заявке, вариабельная область тяжелой цепи может иметь способность к связыванию с легкой цепью или ее антигенсвязывающим фрагментом из такого же или сходного антитела. Вариабельная область тяжелой цепи может представлять собой область, включающую CDR1, каркас (FR) 2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4 тяжелой цепи (H). Вариабельная область тяжелой цепи по настоящему изобретению может включать интактную вариабельную область тяжелой цепи и ее антигенсвязывающие фрагменты. При этом, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, узнающую первую мишень посредством первого Fab в биспецифическом антигенсвязывающем полипептиде (то есть, вариабельную область первой тяжелой цепи), может быть обозначен как VH1, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, узнающую вторую мишень посредством второго Fab в биспецифическом антигенсвязывающем полипептиде (то есть, вариабельную область второй тяжелой цепи), может быть обозначен как VH2.
В настоящей заявке, термин «направленное лигирование», в общем, относится к последовательному лигированию различных полинуклеотидов в одном направлении или в одной последовательности. В настоящей заявке, направленное лигирование полинуклеотидов можно обеспечивать посредством расщепления с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей один участок расщепления, для формирования липких концов, которые не узнают концы или не поддаются лигированию с концами, сформированными посредством рестрикционных эндонуклеаз, которые специфически узнают другие участки расщепления. Направленное лигирование может включать использование лигазы, например, ДНК-лигазы.
В настоящей заявке, термин «полинуклеотид», в общем, относится к по меньшей мере двум нуклеотидам, связанным вместе. Полинуклеотиды могут представлять собой полимеры любой длины, включая, например, 10, 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10000, 100000 и т.д. Полинуклеотиды могут содержать фосфодиэфирные связи. «Полинуклеотид» может представлять собой любой из рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида, или модифицированных форм этих двух нуклеотидов. Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут являться линейными.
В настоящей заявке, термин «циклизация», в общем, относится к способу связывания множества полинуклеотидов конец к концу для формирования кольца. Например, расщепленный первый полинуклеотид, расщепленный второй полинуклеотид, расщепленный третий полинуклеотид, расщепленный четвертый полинуклеотид, расщепленный пятый полинуклеотид, расщепленный шестой полинуклеотид и расщепленный седьмой полинуклеотид, в настоящей заявке, можно подвергать циклизации для формирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида.
В настоящей заявке, термин «клон», в общем, относится к количеству колоний. Например, клон может представлять собой количество колоний в бактериальной библиотеке (например, в бактериальной библиотеке компонента легкой цепи LC1, бактериальной библиотеке компонента легкой цепи LC2, бактериальной библиотеке компонента тяжелой цепи VH1 и/или бактериальной библиотеке компонента тяжелой цепи VH2) или для экспрессирующего вектора. В некоторых случаях, клон может представлять собой количество различных колоний в бактериальной библиотеке. В некоторых случаях, клон может представлять собой количество популяций потомства, образованных отдельным клоном.
В настоящей заявке, термин «расщепленный» полинуклеотид, в общем, относится к полинуклеотиду с липкими концами, полученному после обработки с использованием рестрикционной эндонуклеазы.
В настоящей заявке, термин «рестрикционная эндонуклеаза», в общем, относится к ферменту, который расщепляет двухцепочечную ДНК. Рестрикционная эндонуклеаза может образовывать липкие концы с выступающей одноцепочечной ДНК, которые могут связываться с ДНК-лигазой. В настоящей заявке, рестрикционная эндонуклеаза может оказывать эффекты узнавания и рестрикционного расщепления. Например, участок расщепления для рестрикционной эндонуклеазы находится на определенном расстоянии от ее участка узнавания. Например, рестрикционная эндонуклеаза может быть выбрана из SfiI и BsmBI.
В настоящей заявке, термин «рестрикционная эндонуклеаза, специфически узнающая…», в общем, относится к рестрикционной эндонуклеазе, которая может узнавать только полинуклеотид, содержащий последовательность оснований конкретного участка узнавания, и не может узнавать полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, отличную от последовательности оснований участка узнавания.
В настоящей заявке, термин «специфическое расщепление», в общем, означает, что только полинуклеотид, содержащий последовательность оснований конкретного участка узнавания, может подвергаться расщеплению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, отличную от последовательности оснований участка узнавания, не может подвергаться расщеплению.
В настоящей заявке, термин «соответствующая рестрикционная эндонуклеаза», в общем, относится к рестрикционным эндонуклеазам, способным к узнаванию и расщеплению одинаковой последовательности нуклеиновой кислоты. Концы, полученные после узнавания и расщепления посредством соответствующих рестрикционных эндонуклеаз, как правило, являются способными к узнаванию друг друга или лигированию друг с другом.
В настоящей заявке, термин «дисплей», в общем, относится к возможности экспрессии биспецифического антигенсвязывающего полипептида в клетке, содержащей экспрессирующий вектор биспецифического антигенсвязывающего полипептида.
В настоящей заявке, термин «плазмида компонента», в общем, относится к плазмиде, полученной из бактерий в бактериальной библиотеке и содержащей полинуклеотиды (такие как первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид, пятый полинуклеотид, шестой полинуклеотид и/или седьмой полинуклеотид). Плазмида компонента может также включать участок узнавания для рестрикционной эндонуклеазы.
В настоящей заявке, термин «содержать», в общем, относится к включению явно указанных признаков, но не к исключению других элементов.
В настоящей заявке, термин «приблизительно», в общем, относится к изменчивости в рамках диапазона 0,5%-10% выше или ниже указанного значения, например, к изменчивости в рамках диапазона 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% или 10% выше или ниже указанного значения.
Подробное описание
В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу конструирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида.
Получение полинуклеотидов
Способ может включать получение полинуклеотидов, например, первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, третьего полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, пятого полинуклеотида, шестого полинуклеотида и/или седьмого полинуклеотида.
1) Участок рестрикции
Полинуклеотид может включать участок узнавания для рестрикционной эндонуклеазы. В настоящей заявке, последовательность участка узнавания для рестрикционной эндонуклеазы сконструирована как не включенная в полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий полипептид или его фрагмент. Рестрикционные эндонуклеазы по настоящему изобретению могут специфически узнавать S5, S6, B4, B3, B2, B5 и B6, соответственно. При этом, каждый из B2, B3, B4, B5, B6, S5 и S6 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционных эндонуклеаз.
Участки узнавания для рестрикционных эндонуклеаз в настоящей заявке могут подвергаться специфическому узнаванию посредством 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более рестрикционных эндонуклеаз, соответственно. В некоторых случаях, рестрикционные эндонуклеазы могут быть выбраны из SfiI и BsmBI. В других случаях, могут быть выбраны также другие целесообразные рестрикционные эндонуклеазы.
В некоторых случаях, участки узнавания для рестрикционных эндонуклеаз могут представлять собой участки, специфически узнаваемые и расщепляемые посредством SfiI. Например, они могут быть обозначены как S5 и S6, соответственно. Например, S5 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 6. В качестве другого примера, S6 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 7.
Участки узнавания для рестрикционных эндонуклеаз могут представлять собой участки, специфически узнаваемые и расщепляемые посредством BsmBI. Например, они могут быть обозначены как B2, B3, B4, B5 и B6, соответственно. Например, B2 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 1. В качестве другого примера, B3 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 2. В качестве другого примера, B4 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 3. В качестве другого примера, B5 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 4. В качестве другого примера, B6 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 5.
Следует отметить, что участки узнавания для рестрикционных эндонуклеаз в настоящей заявке включают, но без ограничения, участки узнавания, перечисленные в настоящем описании, и могут также включать участки узнавания для других рестрикционных эндонуклеаз, не перечисленные, так же как другие участки узнавания для рестрикционных эндонуклеаз, при условии, что они не вызывают нежелательного узнавания или расщепления целевой последовательности (например, полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий полипептид или его фрагменты).
2) Биспецифический антигенсвязывающий полипептид
Полинуклеотиды по настоящему изобретению (например, первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид, пятый полинуклеотид, шестой полинуклеотид и седьмой полинуклеотид) могут также включать полинуклеотид LC1, VH1, LC2, VH2, кодирующий биспецифический антигенсвязывающий полипептид или его фрагменты.
В настоящей заявке, LC1 может кодировать первую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH1 может кодировать вариабельную область первой тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и первая легкая цепь может связываться с вариабельной областью первой тяжелой цепи для формирования первого Fab для узнавания первой мишени. В настоящей заявке, LC2 может кодировать вторую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH2 может кодировать вариабельную область второй тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и вторая легкая цепь может связываться с вариабельной областью второй тяжелой цепи для формирования второго Fab для узнавания второй мишени. В некоторых случаях, первая мишень и вторая мишень могут представлять собой антигены.
В настоящей заявке, первый Fab может связываться с вторым Fab для формирования биспецифического антигенсвязывающего полипептида.
Полинуклеотиды по настоящему изобретению (например, первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид, пятый полинуклеотид, шестой полинуклеотид и седьмой полинуклеотид) могут включать фрагменты экспрессирующего вектора, такие как фрагмент I экспрессирующего вектора, фрагмент II экспрессирующего вектора и фрагмент III экспрессирующего вектора. Желательную длину или тип фрагмента I экспрессирующего вектора, фрагмента II экспрессирующего вектора и фрагмента III экспрессирующего вектора можно выбирать, соответственно, в соответствии с длиной или характером биспецифического антигенсвязывающего полипептида или его фрагментов, подлежащих экспрессии, и длиной или характером участков рестрикции.
В некоторых случаях, фрагмент I экспрессирующего вектора, фрагмент II экспрессирующего вектора и фрагмент III экспрессирующего вектора могут происходить из фрагмента вектора из любого вектора, способного экспрессировать ген-мишень. Например, фрагмент I экспрессирующего вектора, фрагмент II экспрессирующего вектора и фрагмент III экспрессирующего вектора могут происходить из фрагментов вектора дисплея pDGB4 (применительно к pDGB4, см. Ivan Zhou, et al., «Four-way ligation for construction of a mammalian cell-based full-length antibody display library», Acta Biochim Biophys Sin 2011, 43: 232-238).
Фрагменты экспрессирующего вектора по настоящему изобретению (например, фрагмент I экспрессирующего вектора, фрагмент II экспрессирующего вектора и фрагмент III экспрессирующего вектора) может включать нуклеотидные последовательности со специфическими функциями, включая, но без ограничения, промоторы, энхансеры, сигнальные пептиды, маркеры для скрининга (например, они могут включать участки узнавания ферментов, гены устойчивости, репортерные гены и гены для скрининга), которые может корректировать в фрагментах экспрессирующего вектора специалист в данной области, в соответствии с желательной функцией (вставляя/заменяя и/или делетируя вышеуказанные нуклеотидные последовательности со специфическими функциями). В некоторых случаях, фрагменты экспрессирующего вектора можно корректировать в различных случаях для получения различных нуклеотидных последовательностей.
В настоящей заявке, первый полинуклеотид может включать S5-LC1-S6 в направлении от 5’ до 3’, где каждый из S5 и S6 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы, LC1 может кодировать первую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида. В некоторых случаях, S5 и S6 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством Sfil, соответственно. Например, S5 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 6, и S6 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 7.
Второй полинуклеотид может включать B4-VH1-B3 в направлении от 5’ до 3’, где каждый из B4 и B3 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы, VH1 может кодировать вариабельную область первой тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида. В некоторых случаях, B4 и B3 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством BsmBI, соответственно. Например, B4 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 3, и B3 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 2.
Третий полинуклеотид может включать B2-LC2-B4 в направлении от 5’ до 3’, где каждый из B2 и B4 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы, LC2 может кодировать вторую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида. В некоторых случаях, B2 и B4 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством BsmBI, соответственно. Например, B2 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 1, и B4 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 3.
Четвертый полинуклеотид может включать B5-VH2-B6 в направлении от 5’ до 3’, где каждый из B5 и B6 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы, VH2 может кодировать вариабельную область второй тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида. В некоторых случаях, B5 и B6 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством BsmBI, соответственно. Например, B5 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 4, и B6 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 5.
Пятый полинуклеотид может включать S6-фрагмент I экспрессирующего вектора-B2 в направлении от 5’ до 3’, где каждый из S6 и B2 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы. В некоторых случаях, S6 может быть специфически узнан и расщеплен посредством Sfil, B3 может быть специфически узнан и расщеплен посредством BsmBI. Например, S6 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 7, и B2 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 1.
Шестой полинуклеотид может включать B3-фрагмент II экспрессирующего вектора-B5 в направлении от 5’ до 3’, где каждый из B3 и B5 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы. В некоторых случаях, B3 и B5 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством BsmBI, соответственно. Например, B3 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 2, и B5 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 4.
Седьмой полинуклеотид может включать B6-фрагмент III экспрессирующего вектора-S5 в направлении от 5’ до 3’, где каждый из B6 и S5 могут независимо представлять собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы. В некоторых случаях, B6 может быть специфически узнан и расщеплен посредством BsmBI, и S5 может быть специфически узнан и расщеплен посредством Sfil. Например, B6 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 5, и S5 может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 6.
Первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид и/или четвертый полинуклеотид по настоящему изобретению можно получать из материалов образцов. В некоторых случаях, материалы образцов могут включать антитела, нацеленные на специфические антигены, или их антигенсвязывающие фрагменты. Антигены могут представлять собой любые иммуногенные фрагменты или детерминанты, включая, но без ограничения, PD-1, PD-L1, LAG-3, CD47, CD3. Например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты нацелены на PD-1 и/или PD-L1.
Способ по настоящему изобретению может включать введение полинуклеотидов (например, первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, третьего полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, пятого полинуклеотида, шестого полинуклеотида и седьмого полинуклеотида) в бактерии.
Для скрининга положительных бактерий, в которые введены полинуклеотиды, полинуклеотиды могут также включать последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие сигнальные пептиды, например, сигнальные пептиды, экспрессирующие природные гены устойчивости. В одном примере, 3’-конец последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид, может связываться с участком рестрикции на 5’-конце полинуклеотида. В некоторых случаях, для введения подходящего участка рестрикции в 3’-концевую часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид, ее последовательность оснований может быть изменена посредством непреднамеренной мутации, однако, аминокислотная последовательность сигнального пептида остается неизменной. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, может включать последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12; альтернативно, сигнальный пептид может включать аминокислотную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, и SEQ ID NO: 13.
Полинуклеотиды можно получать посредством общепринятых в данной области способов, которые могут включать, но без ограничения: стандартную ПЦР, протяженную ПЦР, ПЦР с горячим стартом, qПЦР, RT-ПЦР и изотермическую амплификацию. В некоторых случаях, праймеры можно конструировать, в соответствии с последовательностями целевых фрагментов (например, LC1, VH1, LC2, VH2, фрагмента I экспрессирующего вектора, фрагмента II экспрессирующего вектора и фрагмента III экспрессирующего вектора), соответственно, которые затем используют в качестве матриц для амплификации, для получения полинуклеотидов. Например, праймер для амплификации LC1 может включать нуклеотидную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21. Например, праймер для амплификации LC2 может включать нуклеотидную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23. Например, праймер для амплификации VH1 может включать нуклеотидную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25. Например, праймер для амплификации VH2 может включать нуклеотидную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27. Например, праймер для амплификации фрагмента I экспрессирующего вектора может включать нуклеотидную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15. Например, праймер для амплификации фрагмента II экспрессирующего вектора может включать нуклеотидную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. Например, праймер для амплификации фрагмента III экспрессирующего вектора может включать нуклеотидную последовательность, как указано в любой, выбранной из SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.
Получение бактериальной библиотеки
После получения полинуклеотидов, их можно по отдельности вводить в бактерию для получения бактериальной библиотеки. Таким образом, способ по настоящему изобретению может дополнительно включать следующие стадии: введения первого полинуклеотида в первую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1; введения второго полинуклеотида во вторую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1; введения третьего полинуклеотида в третью бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2; введения четвертого полинуклеотида в четвертую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2; введения пятого полинуклеотида в пятую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I; введения шестого полинуклеотида в шестую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II; и введения седьмого полинуклеотида в седьмую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III.
В некоторых случаях, полинуклеотиды можно вставлять в векторы компонентов для получения продуктов лигирования для хранения. В некоторых случаях, полинуклеотиды можно вставлять в векторы компонентов посредством использования клонирования продуктов ПЦР. Векторы компонентов могут включать плазмидные векторы (например, pBR322, векторы pUC), фаговые векторы (например, вектор M13, вектор λ), происходящие из фагов плазмиды (например, фагмиду, космиду) и бактериальную искусственную хромосому (BAC). В некоторых вариантах осуществления, вектор компонента может происходить из вектора pUC. Например, вектор компонента может представлять собой вектор pUC19 или происходить из вектора pUC19.
Затем продукты лигирования для хранения можно вводить в бактерию для получения бактериальной библиотеки.
В настоящей заявке, способ может включать вставку первого полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения LC1 и введение продукта лигирования для хранения LC1 в первую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1. В некоторых случаях, бактериальная библиотека компонента легкой цепи LC1 может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
Способ может включать вставку третьего полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения LC2 и введение продукта лигирования для хранения LC2 в третью бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2. В некоторых случаях, бактериальная библиотека компонента легкой цепи LC2 может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
Способ может включать вставку второго полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения VH1 и введение продукта лигирования для хранения VH1 во вторую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1. В некоторых случаях, бактериальная библиотека компонента тяжелой цепи VH1 может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
Способ может включать вставку четвертого полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения VH2 и введение продукта лигирования для хранения VH2 в четвертую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2. В некоторых случаях, бактериальная библиотека компонента тяжелой цепи VH2 может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
Способ может включать вставку пятого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента I для хранения и введение продукта лигирования для хранения в пятую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I. В некоторых случаях, бактериальная библиотека экспрессирующего вектора компонента I может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
Способ может включать вставку шестого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента II для хранения и введение продукта лигирования для хранения в шестую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II. В некоторых случаях, бактериальная библиотека экспрессирующего вектора компонента II может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
Способ может включать вставку седьмого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента III для хранения и введение продукта лигирования для хранения в седьмую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III. В некоторых случаях, бактериальная библиотека экспрессирующего вектора компонента III может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать криоконсервирование бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1, бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2, бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1, бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2, бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I, бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II, и бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III.
В настоящей заявке, способ может включать получение плазмиды компонента, содержащей полинуклеотид, из бактериальной библиотеки, после получения бактериальной библиотеки.
В некоторых случаях, способ может включать получение плазмиды компонента первой легкой цепи, содержащей первый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1, где плазмида компонента первой легкой цепи может также включать S5 и S6. В некоторых случаях, способ может включать получение плазмиды компонента второй легкой цепи, содержащей третий полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2, где плазмида второго компонента легкой цепи может также включать B2 и B4. В некоторых случаях, способ может включать получение плазмиды компонента первой тяжелой цепи, содержащей второй полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1, где плазмида компонента первой тяжелой цепи может также включать B4 и B3. В некоторых случаях, способ может включать получение плазмиды компонента второй тяжелой цепи, содержащей четвертый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2, где плазмида второго компонента тяжелой цепи может также включать B5 и B6. В некоторых случаях, способ может включать получение плазмиды фрагмента I компонента дисплея, содержащей пятый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I, где плазмида фрагмента I компонента дисплея может также включать S6 и B2. В некоторых случаях, способ может включать получение плазмиды фрагмента II компонента дисплея, содержащей шестой полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II, где плазмида фрагмента II компонента дисплея может также включать B3 и B5. В некоторых случаях, способ может включать получение плазмиды фрагмента III компонента дисплея, содержащей седьмой полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III, где плазмида фрагмента III компонента дисплея может также включать B6 и S5.
Получение расщепленных полинуклеотидов
Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать h) специфическое расщепление первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, третьего полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, пятого полинуклеотида, шестого полинуклеотида и седьмого полинуклеотида с использованием рестрикционной эндонуклеазы для получения расщепленного первого полинуклеотида, расщепленного второго полинуклеотида, расщепленного третьего полинуклеотида, расщепленного четвертого полинуклеотида, расщепленного пятого полинуклеотида, расщепленного шестого полинуклеотида и расщепленного седьмого полинуклеотида.
В некоторых случаях, после получения плазмиды компонента, содержащей полинуклеотид, способ может дополнительно включать получение расщепленного полинуклеотида из плазмиды компонента. В некоторых случаях, плазмиду можно расщеплять с использованием рестрикционной эндонуклеазы для получения расщепленного полинуклеотида. Способ может включать стадии: получения расщепленного первого полинуклеотида из плазмиды компонента первой легкой цепи; получение расщепленного второго полинуклеотида из плазмиды компонента второй легкой цепи; получение расщепленного третьего полинуклеотида из плазмиды компонента первой тяжелой цепи; получение расщепленного четвертого полинуклеотида из плазмиды компонента второй тяжелой цепи; получение расщепленного пятого полинуклеотида из плазмиды фрагмента I компонента дисплея; получение расщепленного шестого полинуклеотида из плазмиды фрагмента II компонента дисплея; и получение расщепленного седьмого полинуклеотида из плазмиды фрагмента III компонента дисплея.
В некоторых случаях, плазмиду компонента первой легкой цепи можно расщеплять с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S5 и S6, таким образом, получая расщепленный первый полинуклеотид.
В некоторых случаях, плазмиду компонента первой тяжелой цепи можно расщеплять с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B4 и B3, таким образом, получая расщепленный второй полинуклеотид.
В некоторых случаях, плазмиду второго компонента легкой цепи можно расщеплять с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B2 и B4, таким образом, получая расщепленный третий полинуклеотид.
В некоторых случаях, плазмиду фрагмента I компонента дисплея можно расщеплять с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S6 и B2, таким образом, получая расщепленный пятый полинуклеотид.
В некоторых случаях, плазмиду фрагмента II компонента дисплея можно расщеплять с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B3 и B5, таким образом, получая расщепленный шестой полинуклеотид.
В некоторых случаях, плазмиду фрагмента III компонента дисплея можно расщеплять с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B6 и S5, таким образом, получая расщепленный седьмой полинуклеотид.
После расщепления с использованием рестрикционной эндонуклеазы, липкие концы можно получать на 3’-конце и/или 5’-конце плазмиды компонента.
В некоторых случаях, конец, образованный в результате специфического расщепления B2 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B3, B4, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. Альтернативно, конец, образованный в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B2, может узнавать только конец или связываться только с концом, образованным в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B2.
В некоторых случаях, конец, образованный в результате специфического расщепления B3 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. Альтернативно, конец, образованный в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B3, может узнавать только конец или связываться только с концом, образованным в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B3.
В некоторых случаях, конец, образованный в результате специфического расщепления B4 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B3, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. Альтернативно, конец, образованный в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B4, может узнавать только конец или связываться только с концом, образованным в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B4.
В некоторых случаях, конец, образованный в результате специфического расщепления B5 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B3, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. Альтернативно, конец, образованный в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B5, может узнавать только конец или связываться только с концом, образованным в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B5.
В некоторых случаях, конец, образованный в результате специфического расщепления B6 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B3, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. Альтернативно, конец, образованный в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B6, может узнавать только конец или связываться только с концом, образованным в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать B6.
В некоторых случаях, конец, образованный в результате специфического расщепления S5 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, B3 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. Альтернативно, конец, образованный в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать S5, может узнавать только конец или связываться только с концом, образованным в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать S5.
В некоторых случаях, конец, образованный в результате специфического расщепления S6 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, B3 и S5 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. Альтернативно, конец, образованный в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать S6, может узнавать только конец или связываться только с концом, образованным в результате специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, которая может специфически узнавать S6.
Получение экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида посредством лигирования
В настоящей заявке, способ может дополнительно включать: i) смешивание расщепленного первого полинуклеотида, расщепленного второго полинуклеотида, расщепленного третьего полинуклеотида, расщепленного четвертого полинуклеотида, расщепленного пятого полинуклеотида, расщепленного шестого полинуклеотида и расщепленного седьмого полинуклеотида таким образом, чтобы их можно было направленно лигировать и циклизовать для формирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида. Например, расщепленные полинуклеотиды можно смешивать в равных пропорциях и вводить в клетку (например, клетку млекопитающего). Затем колонии сортируют для секвенирования, для определения экспрессирующего вектора, содержащего желательную последовательность биспецифического антигенсвязывающего полипептида.
Например, структура экспрессирующего вектора может являться такой, как показано на ФИГ. 1, которая сформирована посредством направленного лигирования и циклизации семи расщепленных полинуклеотидов. Конец на 3’-конце первого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S6, может узнавать конец или связываться с концом на 5’-конце пятого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S6. Конец на 3’-конце пятого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B2, может узнавать конец или связываться с концом на 5’-конце третьего полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B2. Конец на 3’-конце третьего полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B4, может узнавать конец или связываться с концом на 5’-конце второго полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B4. Конец на 3’-конце второго полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B3, может узнавать конец или связываться с концом на 5’-конце шестого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B3. Конец на 3’-конце шестого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B5, может узнавать конец или связываться с концом на 5’-конце четвертого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B5. Конец на 3’-конце четвертого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B6, может узнавать конец или связываться с концом на 5’-конце седьмого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B6. Конец на 3’-конце седьмого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S5 может узнавать конец или связываться с концом на 5’-конце первого полинуклеотида после специфического расщепления посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S5.
В некоторых случаях, направленное лигирование может включать использование лигазы. Например, лигаза может включать ДНК-лигазу T4.
Экспрессирующий вектор биспецифического антигенсвязывающего полипептида может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору биспецифического антигенсвязывающего полипептида, полученному в соответствии с описанным способом. Экспрессирующий вектор биспецифического антигенсвязывающего полипептида может включать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных клонов.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к библиотеке дисплея биспецифических антигенсвязывающих полипептидов, полученной посредством использования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида. В некоторых вариантах осуществления, библиотека дисплея может представлять собой библиотеку дисплея клеток млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления, библиотека может экспонировать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных биспецифических антител или их фрагментов антител.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу скрининга антител или фрагментов антител, который может включать использование библиотеки по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, библиотека дисплея может представлять собой библиотеку дисплея клеток млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления, библиотека может экспонировать по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более) различных биспецифических антител или их фрагментов антител. В некоторых случаях, антитела или фрагменты антител могут представлять собой биспецифические антигенсвязывающие полипептиды. Например, способ может включать: отбор клеток млекопитающих из библиотеки, получение линии клеток, стабильно экспрессирующей биспецифический антигенсвязывающий полипептид, и затем скрининг. Например, экспрессию биспецифического антигенсвязывающего полипептида на поверхности клетки и его специфическую аффинность для по меньшей мере двух антигенов можно анализировать с использованием FACS.
Без намерения быть ограниченными какой-либо теорией, следующие примеры представлены только для иллюстрации слитого белка, способа его получения и применения по настоящему изобретению, и не использованы для ограничения изобретательского объема настоящего изобретения.
Пример
Пример 1 Конструирование экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида
1.1 Получение материалов образцов
Для конструирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида, как показано на ФИГ. 2, нацеленное на PD-1 антитело пембролизумаб и нацеленное на PD-L1 антитело атезолизумаб, так же как вектор pDGB4, выбраны в качестве примеров. Нуклеотидная последовательность легкой цепи пембролизумаба представляла собой: SEQ ID NO: 28, нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи пембролизумаба представляла собой: SEQ ID NO: 29, нуклеотидная последовательность легкой цепи атезолизумаба представляла собой: SEQ ID NO: 30, нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи атезолизумаба представляла собой: SEQ ID NO: 31, и нуклеотидная последовательность вектора pDGB4 представляла собой: SEQ ID NO: 32.
1.2 Конструирование участков рестрикции
В соответствии с рестрикционными эндонуклеазами BsmBI и SfiI, конструировали последовательности 5 участков узнавания BsmBI (B2, B3, B4, B5 и B6) и последовательности 2 участков узнавания SfiI (S5 и S6), с последовательностями, показанными в таблице 1 ниже:
1.3 Выбор сигнальных пептидов
Выбраны три сигнальных пептида, экспрессирующих нативные гены антител, где sp1 был локализован на 5’-конце LC2, sp2 был локализован на 5’-конце VH2, и sp3 был локализован на 5’-конце LC1. Для введения подходящих участков рестрикции в 3’-концевую часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид, последовательности оснований трех кодированных сигнальных пептидов были изменены посредством непреднамеренной мутации, однако, аминокислотные последовательности сигнальных пептидов оставались неизменными. Последовательности показаны в таблице 2 ниже:
1.4 Получение полинуклеотидов
Праймеры для последовательности легкой цепи (LC1) и вариабельной области тяжелой цепи (VH1), кодирующей PD-1, легкой цепи (LC2) и вариабельной области тяжелой цепи (VH2) PD-L1, и последовательности нуклеиновой кислоты вектора pDGB4 из трех фрагментов (три фрагмента представляли собой, соответственно, фрагмент I экспрессирующего вектора, фрагмент II экспрессирующего вектора и фрагмент III экспрессирующего вектора) конструировали, соответственно, с 5-концами праймеров, содержащими участки рестрикции. Кроме того, экспрессией всех рамок для LC1, LC2-VH1 и LC2 управлял промотор CMV. Синтезировали праймеры, с последовательностями, показанными в таблице 3.
Семь полинуклеотидов амплифицировали посредством ПЦР (LA Taq, Takara Co., проведенной в соответствии с инструкцией к продукту от компании), и использованные последовательности матриц и праймеров показаны в таблице 3. Продукты ПЦР получали, соответственно, после очистки и выделения посредством электрофореза в геле (действуя в соответствии с инструкцией в «Molecular Cloning: A Laboratory Manual»). Посредством способа клонирования TA (набора для клонирования TA, закупленного из Takara Co.), продукты ПЦР вставляли в плазмидный вектор pUC19 для получения продукта лигирования для хранения. Компетентные бактерии DH5a (Takara Co.) трансформировали с использованием вектора для хранения продукта, и культивировали в течение ночи при 37°C на чашке. Колонии посылали на секвенирование, и затем получали бактерии, представляющие полинуклеотиды, содержащие желательные последовательности, представляющие собой первый полинуклеотид, содержащий LC1, второй полинуклеотид, содержащий VH1, третий полинуклеотид, содержащий LC2, четвертый полинуклеотид, содержащий VH2, пятый полинуклеотид, содержащий фрагмент I экспрессирующего вектора, шестой полинуклеотид, содержащий фрагмент II экспрессирующего вектора, и седьмой полинуклеотид, содержащий фрагмент III экспрессирующего вектора. Бактерии можно криоконсервировать в форме бактериальной библиотеки для позднейшего использования.
1.5 Расщепление
Плазмиды из бактерий в бактериальной библиотеке из примера 1.4, соответственно, выделяли посредством использования набора для выделения плазмид (закупленного из Axygen). Затем плазмидные векторы расщепляли с использованием рестрикционных эндонуклеаз BsmBI и SfiI, первый полинуклеотид расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S5 и S6, второй полинуклеотид расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B4 и B3, третий полинуклеотид расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B2 и B4, четвертый полинуклеотид расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B5 и B6, пятый полинуклеотид расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S6 и B2, шестой полинуклеотид расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B3 и B5, седьмой полинуклеотид расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B6 и S5. Выделение и очистку проводили посредством электрофореза для получения семи расщепленных полинуклеотидов.
1.6 Получение экспрессирующих векторов
Семь расщепленных полинуклеотидов, полученных в примере 1,5, смешивали в равных молекулярных пропорциях, к которым добавляли лигазу таким образом, чтобы они подвергались направленному лигированию и циклизации для формирования экспрессирующего вектора. Экспрессирующий вектор переносили в компетентные бактерии DH5a (Takara, используемые в соответствии с инструкциями производителя), и культивировали в среде 2YT без антибиотиков при 37°C, с встряхиванием в то же время при 250 об./мин в течение 60 минут, затем распределяли на чашках для анализа устойчивости к ампициллину (Thermo, кат. #240845) и выращивали в течение ночи при 37°C. Колонии сортировали для секвенирования, и получали экспрессирующие векторы, содержащие корректные последовательности. Экспрессирующие векторы переносили в клетки FCHO для получения линий клеток, стабильно экспрессирующих биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, таким образом, получая клеточную библиотеку дисплея.
Пример 2 Экспрессия биспецифических антигенсвязывающих полипептидов на поверхности клетки
Клетки из клеточной библиотеки из примера 1.6 подвергали адгерентному культивированию. После достижения определенной концентрации, диспергированные клетки расщепляли с использованием 0,5 мМ ЭДТА-PBS, и собирали посредством центрифугирования. Собранные клетки суспендировали с использованием буфера для окрашивания (2% FBS-PBS), и распределяли в 96-луночный планшет при 5e4 клеток/50 мкл на лунку. В лунки добавляли 1-3 вида флуоресцентно меченных антител или антигенов, перечисленных ниже, в соответствии с требованиями эксперимента, хорошо перемешивали и инкубировали на льду в течение 30 минут. После этого, буфер для окрашивания добавляли при 200 мкл/лунку, и затем проводили проточную цитометрию. Лунки без добавленных флуоресцентно меченных антигенов/антител организовывали в качестве отрицательного контроля.
PEK: меченное PE антитело мыши против легкой цепи каппа человека, которое детектировало, присутствовала ли легкая цепь каппа на поверхности клетки; FITC-G: меченное FITC антитело мыши против тяжелой цепи IgG человека, которое детектировало, присутствовала ли тяжелая цепь IgG на поверхности клетки; FITC-Ag1: меченный FITC антиген PD1, который детектировал, может ли антитело, экспонированное на поверхности клетки, связываться с антигеном PD1; FITC-Ag2: меченный FITC антиген PDL1, который детектировал, может ли антитело, экспонированное на поверхности клетки, связываться с антигеном PDL1.
Результаты показали, что присутствовали биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, экспрессированные на поверхности клетки (ФИГ. 3). На ФИГ. 3:
1. Отрицательный контроль без окрашивания, нет ни сигнала PE, ни сигнала FITC;
2. Одиночное окрашивание PEK, более чем 50% клеток имели сигнал PE, показывающий экспрессию легкой цепи каппа;
3. Одиночное окрашивание FITC-G, более чем 50% клеток имели сигнал FITC, показывающий экспрессию тяжелой цепи IgG;
4. Двойное окрашивание PEK+FITC-G, более чем 50% клеток имели двойные сигналы PE и PFITC, показывающие, что экспрессировались как легкая цепь каппа, так и тяжелая цепь IgG;
5. Двойное окрашивание PEK+FITC-Ag1, более чем 50% клеток имели двойные сигналы PE и PFITC, показывающие, что антитела, экспрессированные на поверхности клетки, могли связываться с антигеном PD1;
6. Двойное окрашивание PEK+FITC-Ag2, более чем 26% клеток имели двойные сигналы PE и PFITC, показывающие, что антитела, экспрессированные на поверхности клетки, могли связываться с антигеном PDL1;
7. Тройное окрашивание PEK+FITC-Ag1+FITC-Ag2, более чем 54% клеток имели двойные сигналы PE и PFITC. Хотя доля двойных положительных клеток увеличивалась только на 4%, популяция двойных положительных клеток была сдвинута вправо, показывая, что флуоресцентный сигнал FITC был усилен, что должно являться результатом наложения флуоресцентных сигналов, вызванным связыванием антител, экспонированных на поверхности клетки, с обоими антигенами PD1 и PDL1.
Пример 3 Связывание биспецифического антигенсвязывающего полипептида с антигеном зависимым от дозы образом
В соответствии со способом из примера 2, клетки, экспрессирующие биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, совместно инкубировали с различными концентрациями меченных FITC антигенов PD1 (FAg1, 0,3 мкл, 1 мкл, 3,3 мкл) и различными концентрациями меченных FITC антигенов PDL1 (FAg2, 0,3 мкл, 1 мкл, 3,3 мкл), и анализировали посредством проточной цитометрии.
Результаты показали, что, по мере увеличения концентрации антигена, популяция клеток сдвигалась вправо, и флуоресцентный сигнал увеличивался с увеличением FAg, показывая, что для биспецифических антител показана зависимость от дозы обоих антигенов (ФИГ. 4). На ФИГ. 4: A. Отрицательный контроль без окрашивания; B. Одиночное окрашивание PEK; C. Одиночное окрашивание FAg1; D. Одиночное окрашивание FAg2; E. PEK+0,3 мкл FAg1; F. PEK+1 мкл FAg1; G. PEK+3,3 мкл FAg1; H. PEK+0,3 мкл FAg2; I. PEK+1 мкл FAg2; J. PEK+3,3 мкл Ag2.
--->
Список последовательностей
<110> DDBio.Co,Ltd.,(Shang Hai)
<120> СПОСОБ ДИСПЛЕЯ БИСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА НА ПОВЕРХНОСТИ
КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО И ВЕКТОР
<130> 0112-PA-007RU
<160> 32
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> B2
<400> 1
cgtctcagtg gt 12
<210> 2
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> B3
<400> 2
cgtctcatca gc 12
<210> 3
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> B4
<400> 3
cgtctcaagt cc 12
<210> 4
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> B5
<400> 4
cgtctcagct ga 12
<210> 5
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> B6
<400> 5
cgtctcctct gc 12
<210> 6
<211> 13
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> S5
<400> 6
ggccacaggg gcc 13
<210> 7
<211> 13
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> S6
<400> 7
ggcctgcacg gcc 13
<210> 8
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты sp1
<400> 8
atgccctggg ctctgctcct cctgaccctc ctcactcact ctgccgtctc agtggtc 57
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность sp1
<400> 9
Met Pro Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Val Val
<210> 10
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты sp2
<400> 10
atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggcgt ctcagct 57
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность sp2
<400> 11
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Ser Ala
<210> 12
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты sp3
<400> 12
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcgg ccacaggggc ccactcc 57
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность sp3
<400> 13
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 14
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P1-I
<400> 14
aaggcctgca cggccctcga gtctagaggg cccgttt 37
<210> 15
<211> 86
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P2-I
<400> 15
gggagaccca agctggctag tagtccacca tgccctgggc tctgctcctc ctgaccctcc 60
tcactcactc tgccgtctca gtggtc 86
<210> 16
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P3-II
<400> 16
caccgtgacc gtctcatcag ctagcaccaa gggcccatcg gtc 43
<210> 17
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P4-II
<400> 17
tcagctgaga cgccttggag aacagccagg aggagggcga ggatggcggt tgaccccatg 60
gtggttcata gccagcttgg gtctcccta 89
<210> 18
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P5-III
<400> 18
accctggtga ccgtctcctc tgcctccacc aagggcccat cg 42
<210> 19
<211> 83
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P6-III
<400> 19
tgggcccctg tggccgctgc caccaagaag aggatcctcc aggtccagtc catggtggtt 60
catagccagc ttgggtctcc cta 83
<210> 20
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P7-LC1
<400> 20
tggcagcggc cacaggggcc cactccgaaa ttgtgctgac ccagagccc 49
<210> 21
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P8-LC1
<400> 21
tagactcgag ggccgtgcag gccttatcag cattcgccgc ggttaaagct tttg 54
<210> 22
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P9-LC2
<400> 22
actcactctg ccgtctcagt ggtcgacatc cagatgaccc agtccccttc 50
<210> 23
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> agctgcacctgggacttgagacggcactcgcccctgttgaagc
<400> 23
agctgcacct gggacttgag acggcactcg cccctgttga agc 43
<210> 24
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P11-VH1
<400> 24
gggcgagtgc cgtctcaagt cccaggtgca gctggtgcag agcg 44
<210> 25
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P12-VH1
<400> 25
ccttggtgct agctgatgag acggtcacgg tggtgccctg gc 42
<210> 26
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P13-VH2
<400> 26
ttctccaagg cgtctcagct gaggtgcagc tggtggaaag cggc 44
<210> 27
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P14-VH2
<400> 27
ttggtggagg cagaggagac ggtcaccagg gtgccctggc cc 42
<210> 28
<211> 657
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PD1-LC
<400> 28
gaaattgtgc tgacccagag ccctgccaca ctcagcctga gccctggaga gagggccacc 60
ctgtcctgca gagccagcaa gggcgtgagc accagcggct acagctacct gcactggtac 120
cagcagaagc ccggccaggc tcccagactg ctgatctacc tggcttctta tttagaaagc 180
ggcgtgcctg ctagattcag cggctccggc tccggcaccg actttaccct gaccatcagc 240
tccctggagc ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc acagcaggga cctgcccctg 300
acctttggcg gaggcaccaa ggtggagatc aagaggaccg tggccgctcc cagcgtgttc 360
atcttccccc ccagcgacga gcagctgaag agcggaaccg ccagcgtggt gtgcctgctg 420
aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tcgacaacgc cctgcagagc 480
ggcaatagcc aggagtccgt gaccgagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctgagc 540
agcaccctca ccctgtccaa ggccgactac gagaagcata aggtgtacgc ctgtgaggtg 600
acccaccagg gcctgtccag ccctgtgacc aaaagcttta accgcggcga atgctga 657
<210> 29
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PD1-VH
<400> 29
caggtgcagc tggtgcagag cggcgtggag gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgtaagg cctccggcta cacattcacc aactactaca tgtactgggt gaggcaagcc 120
cctggccagg gactggaatg gatgggcgga atcaacccct ccaatggagg caccaacttt 180
aacgagaagt tcaagaacag ggtgacactg acaaccgaca gcagcacaac aaccgcttac 240
atggagctga agagcctgca gttcgatgac accgccgtgt actactgcgc caggagggac 300
tacaggttcg acatgggctt tgattactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtctcatca 360
<210> 30
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PDL1-LC
<400> 30
gacatccaga tgacccagtc cccttccagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca gagccagcca ggatgtgtct actgctgttg cttggtacca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatttactcc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
agatttagcg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctatta ctgccagcag tacctgtacc accccgccac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gaggaccgtg gccgctcctt ccgtgttcat ctttcccccc 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420
cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480
gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaaggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 31
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PDL1-VH
<400> 31
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggctc cctcagactg 60
tcctgcgctg cctccggctt cacattcagc gactcctgga ttcattgggt cagacaggcc 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtggcttgg atcagccctt acggcggaag cacctactac 180
gccgatagcg tgaagggaag gttcaccatt tccgccgaca ccagcaagaa caccgcttac 240
ctccagatga acagcctgag ggctgaggac acagccgtgt actattgcgc caggagacac 300
tggcccggcg gctttgatta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtctc ctct 354
<210> 32
<211> 9109
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pDGB4
<400> 32
tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 60
gggagaccca agctggctag gccacatagg cctgaaccac catggtgttg cagacccagg 120
tcttcatttc tctgttgctc tggatctctg tgattacagg tgccgacggg gacatcgtga 180
tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc atcaactgca 240
agtccagcca gagtgtttta tacagcccca acaatgagaa cttcttagct tggtaccaac 300
agaagccagg acagtctcct aagttgctca tttactgggc gtctacccgg gaatccgggg 360
tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc atcagcaacc 420
tgcaggctga agatgtggca gtttactact gtcaacaata ttatagtgct cctatcactt 480
tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct 540
tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata 600
acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta 660
actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca 720
ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaact ctacgcctgc gaagtcaccc 780
atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtct tgataaggcc 840
tgcacggccc tcgagtctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct 900
tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 960
gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 1020
tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 1080
aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc 1140
tggggctcta gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg 1200
gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct 1260
ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg 1320
ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag 1380
ggtgatggtt cacgtaccta gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata 1440
ggaacttcct tggccaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa gtttctgatc 1500
gaaaagttcg acagcgtgtc cgacctgatg cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct 1560
ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg taaatagctg cgccgatggt 1620
ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa 1680
gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctgacctatt gcatctcccg ccgtgcacag 1740
ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc gaactgcccg ctgttctgca gccggtcgcg 1800
gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt cggcccattc 1860
ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc gattgctgat 1920
ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc cgtcgcgcag 1980
gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca cctcgtgcac 2040
gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc gcataacagc ggtcattgac 2100
tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt cttctggagg 2160
ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca tccggagctt 2220
gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca actctatcag 2280
agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc 2340
gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag cgcggccgtc 2400
tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc cagcactcgt 2460
ccgagggcaa aggaatagca cgtactacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 2520
aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat 2580
ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 2640
taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 2700
ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag 2760
agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 2820
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 2880
taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 2940
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 3000
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 3060
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 3120
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 3180
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 3240
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 3300
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 3360
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 3420
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 3480
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 3540
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 3600
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 3660
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 3720
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 3780
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 3840
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 3900
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 3960
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 4020
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 4080
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 4140
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 4200
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 4260
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 4320
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 4380
atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 4440
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 4500
aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 4560
gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 4620
gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 4680
gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 4740
ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 4800
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 4860
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 4920
gtgccacctg acgtcgacgg atcgggagat ctcccgatcc cctatggtgc actctcagta 4980
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatctgct ccctgcttgt gtgttggagg 5040
tcgctgagta gtgcgcgagc aaaatttaag ctacaacaag gcaaggcttg accgacaatt 5100
gcatgaagaa tctgcttagg gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat 5160
atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 5220
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 5280
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 5340
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 5400
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 5460
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 5520
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 5580
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 5640
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 5700
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 5760
taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 5820
gggagaccca agctggctag ccacctgatt ggcgtctcta gtccaccatg gactttgggc 5880
tgagctggct ttttcttgtg gctattttaa aaggtgtcca gtgtgaggtg cagctgttgg 5940
agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg 6000
gattcacctt tagcagctat gccatgagct gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg 6060
agtgggtctc aggtattact gggagtggtg gtagtacata ctacgcagac tccgtgaagg 6120
gccggttcac catctccaga gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc 6180
tgagagccga ggacacggcc gtatattact gtgcgaaaga tccagggact acggtgatta 6240
tgagttggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gctagcacca 6300
agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg 6360
ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag 6420
gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca ggactctact 6480
ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc tacacctgca 6540
acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc aaatgttgtg 6600
tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc ctcttccccc 6660
caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg 6720
acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc 6780
ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt gtggtcagcg 6840
tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca 6900
acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg cagccccgag 6960
aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc 7020
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 7080
ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct 7140
tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 7200
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc 7260
cgggtaaaaa tgctgtgggc caggacacgc aggaggtcat cgtggtgcca cactccttgc 7320
cctttaaggt ggtggtgatc tcagccatcc tggccctggt ggtgctcacc atcatctccc 7380
ttatcatcct catcatgctt tggcagaaga agccacgttg ataaccatga ctctggacca 7440
tgggaaatgt cagagtggag aaccacaccg agtgccactg cagcacttgt tattatcaca 7500
aatcctaata gtttgcagtg ggccttgctg atgatggctg acttgctcaa aaggaaaatt 7560
aatttgtcca gtgtctatgg ctttgtgaga taaaaccctc cttttccttg ccataccatt 7620
tttaacctgc tttgagaata tactgcagct ttattgcttt tctccttatc ctacaatata 7680
atcagtagtc ttgatctttt catttggaat gaaatatggc atttagcatg accataaaaa 7740
gctgattcca ctggaaataa agtcttttaa atcatcactc tatcactgaa ttctaatttt 7800
ttctgaaaag tttcaagcca gttacttttg ataggattaa cggaagggag tgagccagtg 7860
ggtgaggtgg gttcccatgt agtcaatggc ctaatactgg agaatcttat tctaaccaag 7920
ccttccagag caagctgtga gcccctcaga cagtgggcta ctcatgagac agtccattgg 7980
ggtaaaggaa gaaaatataa cttctatttc tattcatttg cacattgtct ttagatgccc 8040
atttgggtga gttttataga agtacagcta cattaaaaaa tagaactgat aatagataag 8100
gctttaaaaa aacttcattc atcaccagtt tgtcaagatt ccatttcaaa gtgaaaaacc 8160
aatttctaac gggttggtaa acacagcaga tggcagggtg aaaaattaaa gtgagtgcat 8220
gtacctttaa agaaacactg aaatgcacac acattactta acctgctcat tcatttattt 8280
acatatagtc ttgggtgtac aaaatttaga aataaataca tagatctccc gatcccctat 8340
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg 8400
cttgtgtgtt ggagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg 8460
aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg 8520
cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat 8580
agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 8640
cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 8700
gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 8760
catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 8820
gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 8880
gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 8940
tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 9000
ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 9060
caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctc 9109
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАГОВОЙ БИБЛИОТЕКИ | 2020 |
|
RU2815522C2 |
| УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ В ВИРУСАХ ОСПОВАКЦИНЫ/ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ | 2017 |
|
RU2747557C2 |
| СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СЕКРЕЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ | 2010 |
|
RU2585488C2 |
| АНТИТЕЛА, УЗНАЮЩИЕ УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЙ ЭПИТОП НА CD43 И СЕА, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ НА РАКОВЫХ КЛЕТКАХ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2008 |
|
RU2528738C2 |
| МНОГОЦЕПОЧЕЧНЫЙ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2013 |
|
RU2663725C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ | 2013 |
|
RU2628088C2 |
| МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К IL-5Rα | 2017 |
|
RU2698048C2 |
| Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания B-клеток | 2016 |
|
RU2706582C2 |
| АНТИТЕЛА, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ TREM2 | 2019 |
|
RU2807996C2 |
| АНТИТЕЛА К ЭФРИНУ В2 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2007 |
|
RU2451031C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ конструирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида. Получают первый полинуклеотид, содержащий S5-LC1-S6 в направлении от 5' до 3'. Получают второй полинуклеотид, содержащий B4-VH1-B3 в направлении от 5' до 3'. Получают третий полинуклеотид, содержащий B2-LC2-B4 в направлении от 5' до 3'. Получают четвертый полинуклеотид, содержащий B5-VH2-B6 в направлении от 5' до 3'. Получают пятый полинуклеотид, содержащий S6-фрагмент I экспрессирующего вектора-B2 в направлении от 5' до 3'. Получают шестой полинуклеотид, содержащий B3-фрагмент II экспрессирующего вектора-B5 в направлении от 5' до 3'. Получают седьмой полинуклеотид, содержащий B6-фрагмент III экспрессирующего вектора-S5 в направлении от 5' до 3'. Осуществляют специфическое расщепление первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, третьего полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, пятого полинуклеотида, шестого полинуклеотида и седьмого полинуклеотида с использованием рестрикционной эндонуклеазы. При этом рестрикционная эндонуклеаза специфически узнает S5, S6, B4, B3, B2, B5 и B6, соответственно. Смешивают расщепленный первый, второй, третий, четвертый, пятый, шестой и седьмой, расщепленный полинуклеотид таким образом, чтобы их можно было направленно лигировать и циклизовать для формирования экспрессирующего вектора. При этом LC1 кодирует первую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH1 кодирует вариабельную область первой тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и первая легкая цепь может связываться с вариабельной областью первой тяжелой цепи для формирования первого Fab для узнавания первой мишени; LC2 кодирует вторую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH2 кодирует вариабельную область второй тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и вторая легкая цепь может связываться с вариабельной областью второй тяжелой цепи для формирования второго Fab для узнавания второй мишени, а каждый из B2, B3, B4, B5, B6, S5 и S6 независимо представляют собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы. 15 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 3 пр.
1. Способ конструирования экспрессирующего вектора биспецифического антигенсвязывающего полипептида, включающий:
a) получение первого полинуклеотида, содержащего S5-LC1-S6 в направлении от 5' до 3';
b) получение второго полинуклеотида, содержащего B4-VH1-B3 в направлении от 5' до 3';
c) получение третьего полинуклеотида, содержащего B2-LC2-B4 в направлении от 5' до 3';
d) получение четвертого полинуклеотида, содержащего B5-VH2-B6 в направлении от 5' до 3';
e) получение пятого полинуклеотида, содержащего S6-фрагмент I экспрессирующего вектора-B2 в направлении от 5' до 3';
f) получение шестого полинуклеотида, содержащего B3-фрагмент II экспрессирующего вектора-B5 в направлении от 5' до 3';
g) получение седьмого полинуклеотида, содержащего B6-фрагмент III экспрессирующего вектора-S5 в направлении от 5' до 3';
h) специфическое расщепление первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, третьего полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, пятого полинуклеотида, шестого полинуклеотида и седьмого полинуклеотида с использованием рестрикционной эндонуклеазы для получения расщепленного первого полинуклеотида, расщепленного второго полинуклеотида, расщепленного третьего полинуклеотида, расщепленного четвертого полинуклеотида, расщепленного пятого полинуклеотида, расщепленного шестого полинуклеотида и расщепленного седьмого полинуклеотида; где рестрикционная эндонуклеаза специфически узнает S5, S6, B4, B3, B2, B5 и B6, соответственно;
i) смешивание расщепленного первого полинуклеотида, расщепленного второго полинуклеотида, расщепленного третьего полинуклеотида, расщепленного четвертого полинуклеотида, расщепленного пятого полинуклеотида, расщепленного шестого полинуклеотида и расщепленного седьмого полинуклеотида таким образом, чтобы их можно было направленно лигировать и циклизовать для формирования экспрессирующего вектора;
где LC1 кодирует первую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH1 кодирует вариабельную область первой тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и первая легкая цепь может связываться с вариабельной областью первой тяжелой цепи для формирования первого Fab для узнавания первой мишени;
LC2 кодирует вторую легкую цепь биспецифического антигенсвязывающего полипептида, VH2 кодирует вариабельную область второй тяжелой цепи биспецифического антигенсвязывающего полипептида, и вторая легкая цепь может связываться с вариабельной областью второй тяжелой цепи для формирования второго Fab для узнавания второй мишени;
где каждый из B2, B3, B4, B5, B6, S5 и S6 независимо представляют собой участки узнавания для рестрикционной эндонуклеазы.
2. Способ по п.1, где конец, образованный в результате специфического расщепления B2 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B3, B4, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы;
конец, образованный в результате специфического расщепления B3 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы;
конец, образованный в результате специфического расщепления B4 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B3, B5, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы;
конец, образованный в результате специфического расщепления B5 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B3, B6, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы;
конец, образованный в результате специфического расщепления B6 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B3, S5 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы;
конец, образованный в результате специфического расщепления S5 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, B3 и S6 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы; и/или
конец, образованный в результате специфического расщепления S6 посредством рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей его, не узнает конец или не связывается с концом, образованным в результате специфического расщепления любого из B2, B4, B5, B6, S5 и B3 посредством соответствующей рестрикционной эндонуклеазы.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, где рестрикционная эндонуклеаза выбрана из SfiI и BsmBI.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где B2, B3, B4, B5 и B6 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством BsmBI; и S5 и S6 могут быть специфически узнаны и расщеплены посредством Sfil.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где B2 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 1; B3 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 2; B4 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 3; B5 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 4; B6 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 5; S5 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 6; и/или S6 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 7.
6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий:
вставку первого полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения LC1 и введение продукта лигирования для хранения LC1 в первую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1; получение плазмиды компонента первой легкой цепи, содержащей первый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC1, и получение расщепленного первого полинуклеотида из плазмиды компонента первой легкой цепи;
вставку второго полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения VH1 и введение продукта лигирования для хранения VH1 во вторую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1; получение плазмиды компонента первой тяжелой цепи, содержащей второй полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH1 и получение расщепленного второго полинуклеотида из плазмиды компонента первой тяжелой цепи;
вставку третьего полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения LC2 и введение продукта лигирования для хранения LC2 в третью бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2; получение плазмиды компонента второй легкой цепи, содержащей третий полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента легкой цепи LC2 и получение расщепленного третьего полинуклеотида из плазмиды компонента второй легкой цепи;
вставку четвертого полинуклеотида в вектор компонента для формирования продукта лигирования для хранения VH2 и введение продукта лигирования для хранения VH2 в четвертую бактерию для получения бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2; получение плазмиды компонента второй тяжелой цепи, содержащей четвертый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки компонента тяжелой цепи VH2, и получение расщепленного четвертого полинуклеотида из плазмиды компонента второй тяжелой цепи;
вставку пятого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента I для хранения и введение продукта лигирования для хранения в пятую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I; получение плазмиды фрагмента I компонента дисплея, содержащей пятый полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента I, и получение расщепленного пятого полинуклеотида из плазмиды фрагмента I компонента дисплея;
вставку шестого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента II для хранения и введение продукта лигирования для хранения в шестую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II; получение плазмиды фрагмента II компонента дисплея, содержащей шестой полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента II, и получение расщепленного шестого полинуклеотида из плазмиды фрагмента II компонента дисплея; и/или
вставку седьмого полинуклеотида в вектор компонента для формирования экспрессирующего вектора продукта лигирования фрагмента III для хранения и введение продукта лигирования для хранения в седьмую бактерию для получения бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III; получение плазмиды фрагмента III компонента дисплея, содержащей седьмой полинуклеотид, из бактериальной библиотеки экспрессирующего вектора компонента III, и получение расщепленного седьмого полинуклеотида из плазмиды фрагмента III компонента дисплея.
7. Способ по п. 6, включающий расщепление плазмиды компонента первой легкой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S5 и S6, таким образом, получение расщепленного первого полинуклеотида; расщепление плазмиды компонента первой тяжелой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B4 и B3, таким образом, получение расщепленного второго полинуклеотида; расщепление плазмиды компонента второй легкой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B2 и B4, таким образом, получение расщепленного третьего полинуклеотида; расщепление плазмиды компонента второй тяжелой цепи с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B5 и B6, таким образом, получение расщепленного четвертого полинуклеотида; расщепление плазмиды фрагмента I компонента дисплея с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей S6 и B2, таким образом, получение расщепленного пятого полинуклеотида; расщепление плазмиды фрагмента II компонента дисплея с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B3 и B5, таким образом, получение расщепленного шестого полинуклеотида; и/или расщепление плазмиды фрагмента III компонента дисплея с использованием рестрикционной эндонуклеазы, специфически узнающей B6 и S5, таким образом, получение расщепленного седьмого полинуклеотида.
8. Способ по любому из пп. 6, 7, где вектор компонента происходит из вектора pUC.
9. Способ по п. 8, где вектор pUC представляет собой вектор pUC19 или происходит из вектора pUC19.
10. Способ по любому из пп. 6-9, где бактериальная библиотека компонента легкой цепи LC1 содержит по меньшей мере 10 различных клонов; бактериальная библиотека компонента тяжелой цепи VH1 содержит по меньшей мере 10 различных клонов; бактериальная библиотека компонента легкой цепи LC2 содержит по меньшей мере 10 различных клонов; и/или бактериальная библиотека компонента тяжелой цепи VH2 содержит по меньшей мере 10 различных клонов.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где экспрессирующий вектор биспецифического антигенсвязывающего полипептида содержит по меньшей мере 10 различных клонов.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид и/или четвертый полинуклеотид получают из материалов образцов.
13. Способ по п. 12, где материалы образцов содержат антитела, нацеленные на специфические антигены, или их антигенсвязывающие фрагменты.
14. Способ по п. 13, где антитела или их антигенсвязывающие фрагменты нацелены на PD-1 и/или PD-L1.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где направленное лигирование включает использование лигазы.
16. Способ по п. 15, где лигаза содержит ДНК-лигазу T4.
| WO 2010059981 A2, 27.05.2010 | |||
| Rajendra Y | |||
| et al | |||
| Transient and stable CHO expression, purification and characterization of novel hetero‐dimeric bispecific IgG antibodies // Biotechnology Progress, 2017, 33(2), p.469-477 | |||
| Zhou I | |||
| et al | |||
| Four-way ligation for construction of a mammalian cell-based full-length antibody display library // Acta |
