ЗАМЕЩЕННЫЕ НАФТАЛИНДИИМИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07D471/04 A61K31/5377 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к нафталиндиимидам, NDIs и способам их синтеза. NDIs обладают ДНК-квадруплекс связывающей и стабилизирующей активностью и могут применяться при лечении рака поджелудочной железы, простаты и других видов рака человека.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В WO2009/068916 авторы изобретения описали три- и тетразамещенные нафталиндиимиды и способы их получения. Ни один из приведенных в качестве примеров продуктов, которые были тризамещены, не имел различных аминофункциональных лигандов в эквациональных и полярных положениях на ядре лиганде. Способ, который считается подходящим для получения тризамещенных соединений, был основан на следующей схеме:

в которой R¹ представляет собой необязательно замещенный алкил или арил и n равно 0 или 1. На практике получали смесь тетра- (n=1) и три-замещенных (n=0) соединений. Все заместители, т. е. R¹ группы являются одинаковыми.

В описании предоставлены способы получения тетразамещенных соединений, исходя из дихлорзамещенного аналога дибромсоединения, использованного выше. Процессы проходили за одну стадию, в каждом случае один и тот же реагент H₂NR¹ реагировал на обеих ангидридных группах и на обоих - хлорзамещенных углеродах с получением 4 идентичных R^1-заместителей в продукте, или в две стадии, когда в первой стадии первый реагент H₂NR² реагирует по обеим ангидридным группам и во второй стадии второй реагент H₂NR³ реагирует по обоим хлорзамещенным атомам углерода. Соединения с основными заместителями на имидном заместителе и/или на ароматических кольцах обладают сильными свойствами связывания ДНК-квадруплексов.

В WO2017/103587 авторы изобретения описали тризамещенные нафталиндиимиды и способы их получения. Способ, который считается подходящим для получения тризамещенных соединений, был основан на следующей схеме:

в которой Y представляет собой H или Br, группа R¹² является одинаковой и выбрана из группы, состоящей из C_1-6алкендиила с прямой и разветвленной цепью, R¹³ выбран из группы, состоящей из H и C_1-6алкила, R¹⁴ выбран из группы, состоящей из C_1-6алкандиила и C_7-12аралкандиила с прямой и разветвленной цепью, X² выбран из группы, состоящей из галогена, R¹¹, NR¹⁵₂, CONR¹⁶₂, COOR¹⁷, SH и COR¹⁸, R¹¹ выбран из группы, состоящей из H, необязательно замещенного C_1-6алкила, необязательно замещенного C_5-7циклоалкила, C_5-7гетероциклоалкила и арила, каждый R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H, C_1-6алкила, арила и C_7-12аралкила, N группы R¹⁵ вместе с N-атомом, к которому они присоединены, образуют насыщенное гетероциклическое кольцо из 5-7 атомов, каждый R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H и C_1-6алкильных групп, или группы R¹⁶ вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 5-7-членное гетероциклическое кольцо, R¹⁷ выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного C_1-6алкила, C_7-12аралкила и арила, R¹⁸ выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного C_1-6алкила, C_7-12аралкила и арила, и при этом атом Br или один или каждый атом Br замещен нуклеофильным аминным азотом аминного реагента с образованием замещенного соединения NDI.

Тетразамещенные продукты, включая продукты с группами R², отличными от групп R³, были исследованы в WO2009/068916, US2014-0275065A и в Hampel S. M. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2010) 20, 6459-6463, Micco. M., et al., J. Med. Chem. (2013) 56, 2959-2974, Collie, G. W., et al., J.A.C.S. (2012) 134, 2723-2731, Gunaratnam, M. et al., J. Med. Chem. (2009) 52, 3774-3783, Gunaratnam, M. et al., Bioorg. Med. Chem. (2011) 19, 7151-7157 and Mitchell, T. et al., Biochemistry (2013) 52, 1429-1436 в отношении их связывающих свойств с квадруплексами теломер и также с теми, которые обнаруживаются в промоторной области некоторых генов. Данные показывают эффективное подавление нескольких белков, промоторы генов которых нацелены на диимиды, и, следовательно, приводят к ингибированию роста некоторых клеточных линий из панели линий раковых клеток. В этих публикациях авторы изобретения предложили дополнительно исследовать влияние изменения природы групп заместителей и основности третичных аминогрупп в катионных заместителях на специфичность и силу связывания и исследовать потенциал соединений при лечении рака, путем тестирования моделей рака, включая рак поджелудочной железы.

В Scientific Reports (2015) 5:11385, Ohnmacht, S.A., et al. раскрыта активность 4,9-бис((3-(4-метилпиперазин-1-ил)-пропил)амино)-2,7-бис(3-морфолинопропил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона, также известного как MM41, in vivo на мышиной модели рака поджелудочной железы человека.

Nadai, M., et al., in Int. J. Oncol. (2015) 46, 369-380 раскрывают тризамещенное соединение нафталиндиимида, имеющее 2-диметиламиноэтильные группы, замещенные у каждого атома азота имидо, и имеющее в качестве третьего заместителя 2-(4-гидрокси-3-диметиламинометил)фенил)этиламиногруппу, замещенную в 4-м положении ядра NDI. Оно обладает активностью, стабилизирующей теломерный G-квадруплекс (GQ), вызывая дисфункцию теломер и пониженную регуляцию теломеразы. Глобальная экспрессия генов на панели клеточных линий показала модуляцию генов, участвующих в функции теломер и механизмах рака. Однако авторы приходят к выводу, что прямые доказательства биологической значимости G-4 в клеточном контексте все еще отсутствуют (Marchetti et al, J Med Chem, 2018, 61(6), pp. 2500-2517).

Синтез тризамещенного соединения, описанный Nadai et al., раскрыт в Doria et al, Org Biomol. Chem, (2012) 10, 2798-2806.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что определенная группа боковых цепей в соединении тетразамещенного нафталиндиимида приводит к улучшенному связыванию соединения диимида с GQ, что приводит к улучшенной противораковой активности.

Соответственно, в первом аспекте изобретения предоставлено новое соединение Формулы I:

L находится в мета или пара положении фенильного кольца и выбран из группы, состоящей из (CH₂)_1-6 и (CH₂)_1-5NH;

R¹ выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного C_5-7циклоалкила, необязательно замещенного азотсодержащего 5-7-членного гетероциклоалкила и NR₉R₁₀;

R² и R⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из C_1-6алкандиила с прямой или разветвленной цепью;

R³, R⁹ и R¹⁰ независимо выбраны из группы, состоящей из H или C_1-6алкила;

X выбран из группы, состоящей из галогена, OR⁵, NR⁶₂, CONR⁷₂, COOR⁸, H и COR⁸;

R⁵ выбран из группы, состоящей из H, C_1-6алкила, C_4-7циклоалкила, 4-7-членного гетероциклоалкила и арила;

R⁶ выбран из группы, состоящей из H, C_1-6алкила, арила и C_7-12аралкила, или группы R⁶ вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют N-содержащую насыщенную 4-7-членную гетероциклическую группу;

группы R⁷ каждая выбрана из H и C_1-6алкильных групп или группы R⁷ вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4-7-членную гетероциклическую группу;

R⁸ выбран из группы, состоящей из C_1-6алкила, C_7-12аралкила и арила; и

его соли, гидраты и сольваты.

Изобретение дополнительно предоставляет новые соединения для применения в способе лечения животного для лечения рака или для подавления роста солидной опухоли или для уменьшения размера солидной опухоли, например, опухолей поджелудочной железы и простаты.

Изобретение также предоставляет композиции, содержащие новое соединение и разбавитель или носитель. Композиции представляют собой предпочтительно фармацевтические композиции, и в таком случае носитель является фармацевтически приемлемым.

Во втором аспекте изобретения предоставлен способ синтеза соединения замещенного нафталиндиимида в соответствии с первым аспектом изобретения, включающий стадии:

i) взаимодействие соединения Формулы IV в реакции нуклеофильного замещения с соединением Формулы V:

в которой, по меньшей мере, один Br в соединении Формулы III замещен азотом нуклеофильного амина в соединении Формулы IV;

ii) взаимодействие соединения Формулы V, полученного из продукта, полученного в результате реакции нуклеофильного замещения Формулы III и Формулы IV, с соединением Формулы VI:

в которой арил-арильная связь образуется между фенилом Формулы VI и фенилом с присоединенным Br в соединении Формулы V, в которой LG и Br представляют собой уходящие группы, с образованием соединения Формулы I; и желательно

iii) выделение соединения Формулы I из продукта, полученного в результате реакции Формулы V и Формулы VI;

в которой L, X и R¹-R⁴ представляют собой, как определено для Формулы I первого аспекта изобретения.

ФИГУРЫ

Чертеж показывает регрессию опухоли в опухоли рака поджелудочной железы у мышей, получавших соединение изобретения и сравнительные соединения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Используемые в настоящем описании «алкильные», «циклоалкильные», «гетероциклоалкильные», «гетероциклические», «арильные» и «аралкильные» группы могут быть одновалентными или двухвалентными, если не указано иначе.

Используемый в настоящем описании, если не указано иначе, «арил» означает моноциклический, бициклический или трициклический одновалентный или двухвалентный (в случае необходимости) ароматический радикал, такой как фенил, бифенил, нафтил, антраценил, который может быть необязательно замещен до трех заместителей.

Используемый в настоящем описании, если не указано иначе, «необязательно замещенный» обозначает один из заместителей, выбранных из группы, состоящей из C₁-C₆алкила, гидрокси, C₁-C₃гидроксиалкила, C₁-C₃алкокси, C₁-C₃галогеналкокси, амино, C₁-C₃моноалкиламино, C₁-C₃бисалкиламино, C₁-C₃ациламино, C₁-C₃аминоалкила, моно(C₁-C₃алкил)аминоC₁-C₃алкила, бис(C₁-C₃алкил)аминоC₁-C₃алкила, C₁-C₃ациламино, C₁-C₃алкилсульфониламино, галогена, нитро, циано, трифторметила, карбокси, C₁-C₃алкоксикарбонила, аминокарбонила, моно-C₁-C₃алкиламинокарбонила, бис-C₁-C₃алкиламинокарбонила, -SO₃H, C₁-C₃алкилсульфонила, аминосульфонила, моно-C₁-C₃алкиламиносульфонила и бис-C₁-C₃алкиламиносульфонила.

Используемые в настоящем описании, если не указано иначе, «гетероциклоалкильные» и «гетероциклические» группы представляют собой карбоциклические радикалы, содержащие до 4 гетероатомов, выбранных из кислорода, азота и серы. Они могут быть бициклическими или моноциклическими. Они предпочтительно являются насыщенными. Если гетероцикл представляет собой двухвалентный линкер, гетероцикл может быть присоединен к соседним группам через атом углерода или через один из гетероатомов, например, N. Примерами гетероциклов являются пирролидин, пиперазин и морфолин.

Предпочтительные группы изобретения

В первом аспекте изобретения L представляет собой предпочтительно (CH₂)_1-6, предпочтительно (CH₂)_1-4, более предпочтительно (CH₂)_1-3, еще более предпочтительно (CH₂)_1-2, еще более предпочтительно (CH₂). Предпочтительно L находится в пара-положении фенила. Когда R¹ представляет собой необязательно замещенный азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил или NR₉R₁₀, предпочтительно, что R¹ присоединяется к L через атом азота R¹.

Предполагается, что L или R¹ содержит основной атом азота. По существу R¹ может быть любой группой, которая содержит основной атом азота. R¹ представляет собой предпочтительно азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил, предпочтительно азотсодержащий 5-6-членный гетероциклоалкил, более предпочтительно азотсодержащий 5-членный гетероциклоалкил. Предпочтительно азот азотсодержащего 5-7-членного гетероциклоалкила является единственным гетероатомом в гетероциклоалкиле. В другом аспекте азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил содержит второй гетероатом, такой как атом кислорода.

Соответственно, азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил выбран из группы, состоящей из пирролидинила, имидазолидинила, пиразолидинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, азепанила, диазепанила, предпочтительно пирролидинила. Подходящим образом L представляет собой (CH₂) и R¹ представляет собой пирролидинил.

Соответственно, R¹ представляет собой NR₉R₁₀. R⁹ и R¹⁰ независимо выбраны из группы, состоящей из H или C_1-6алкила, предпочтительно C_1-6алкила, более предпочтительно C_2-4алкила, еще более предпочтительно C_2-3алкила. Соответственно, NR₉R₁₀ представляет собой диэтиламино, дипропиламино или этилпропиламино.

В другом варианте осуществления L содержит основной атом азота. Соответственно, L представляет собой (CH₂)_1-5NH, предпочтительно (CH₂)_1-3NH, более предпочтительно (CH₂)_1-2NH, еще более предпочтительно (CH₂)NH и R¹ представляет собой C₅-₇циклоалкил, предпочтительно C₅циклоалкил. Предпочтительно L находится в пара-положении фенила.

Обе группы R² в Формуле I идентичны друг другу. R² представляет собой предпочтительно C_2-4алкандиил с прямой цепью, наиболее предпочтительно C₃алкандиил с прямой цепью. R⁴ может быть или не быть таким же, как R² и представляет собой предпочтительно C_2-4алкандиил с прямой или разветвленной цепью, наиболее предпочтительно C₂алкандиил.

X предпочтительно содержит аминогруппу, т. е. X представляет собой предпочтительно NR⁶₂ или CONR⁷₂, еще более предпочтительно NR⁶₂. Группы R⁶ и R⁷ вместе с атомом N, к которому они присоединены, предпочтительно образуют N-содержащую насыщенную 4-7-членную гетероциклическую группу, более предпочтительно N-содержащую насыщенную 5-членную гетероциклическую группу. Из таких соединений предпочтительными являются те, в которых две группы R⁶ связаны с образованием гетероцикла, поскольку они, по-видимому, обладают пригодной цитотоксической активностью в исследованиях линии раковых клеток. X представляет собой наиболее предпочтительно насыщенную пирролидинильную группу.

Предпочтительно, Формула I имеет следующую структуру Формулы II:

в которой L и R¹ представляют собой, как определено для Формулы I, с любой из предпочтительных групп, как указано выше.

Соответственно, соединение выбрано из группы, состоящей из:

2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)-9-(4-(пирролидин-1-илметил)фенил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-(морфолинометил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)-9-(3-(пирролидин-1-илметил)фенил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-(4-(пиперидин-1-илметил)фенил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-((диэтиламино)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-((циклопентиламино)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-(азепан-1-илметил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона и

их солей, гидратов и сольватов.

Во втором аспекте изобретения L, X и R¹-R⁴ для от Формулы IV до Формулы VIII представляют собой предпочтительно, как определено в качестве предпочтительных признаков выше для L, X и R¹-R⁴ Формулы I первого аспекта изобретения.

Способ изобретения включает первую стадию взаимодействия бромированного нафталиндиимида Формулы III с аминным реагентом Формулы IV в реакции ароматического нуклеофильного замещения, при которой атом брома замещается аминогруппой N(R³)(R⁴X). Исходный диимид представляет собой дибромсоединение, и реакция ароматического нуклеофильного замещения может приводить к замене обоих атомов брома аминогруппой или только одним из них (т. е. соединением Формулы V), хотя предпочтительно, что только один из бромов замещается, и должно быть получено, по меньшей мере, одно соединение Формулы V. Предпочтительно разделять смесь как одно-, так и двухзамещенного нафталиндиимида, например, с использованием колоночной хроматографии.

Во второй стадии соединение Формулы V, полученное в первой стадии, взаимодействует с реагентом Формулы VI в реакции замещения, при которой атом брома замещается фенилом в Формуле VI через атом углерода, к которому LG (уходящая группа) прикреплена изначально. В одном аспекте LG может представлять собой группу бороновой кислоты, однако специалист в данной области техники поймет, что существует множество способов проведения реакции замещения и образования арил-арильной связи между Формулами V и VI. В результате образуется, по меньшей мере, одно соединение Формулы I.

Предпочтительно, в другой стадии соединение Формулы I выделяют с использованием колоночной хроматографии.

Предпочтительно, конкретную используемую форму колоночной хроматографии выбирают из гель-хроматографии и колоночной флэш-хроматографии.

Соединения настоящего изобретения могут быть предоставлены в форме фармацевтически приемлемых композиций. Соединения настоящего изобретения, особенно когда они представлены в форме кислотно-аддитивных солей, например, когда некоторые или все основные аминогруппы преобразованы в солевую форму, являются водорастворимыми и имеют приблизительно нейтральный pH. Как таковые, эти соли подходят для введения в форме водного раствора, который подходит для внутривенного введения. Водные фармацевтические растворы предпочтительно содержат от 1 до 500 мг/л соединения.

Соединения настоящего изобретения могут быть предоставлены в форме, подходящей для включения в фармацевтические композиции, например, в высушенной регидратируемой форме, например, с носителем или разбавителем. Такие высушенные формы могут быть получены кристаллизацией и/или испарением. Альтернативно, соединения могут быть предоставлены в виде концентратов, например, в воде или органическом фармацевтически приемлемом растворителе для разбавления перед введением.

Используемая в настоящем описании фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием. Фармацевтически приемлемые кислоты включают как неорганические кислоты, такие как хлористоводородная, серная, фосфорная, дифосфорная, бромистоводородная или азотная кислота, так и органические кислоты, такие как лимонная, фумаровая, малеиновая, яблочная, аскорбиновая, янтарная, винная, бензойная, уксусная, метансульфоновая, этансульфоновая, салициловая, стеариновая, бензолсульфоновая или п-толуолсульфоновая кислота. Фармацевтически приемлемые основания включают гидроксиды щелочных металлов (например, натрия или калия) и щелочноземельных металлов (например, кальция или магния) и органические основания, такие как алкиламины, ариламины или гетероциклические амины.

Во избежание сомнений настоящее изобретение также охватывает пролекарства, которые взаимодействуют in vivo с образованием соединения настоящего изобретения.

Комбинации в соответствии с настоящим изобретением также можно использовать в сочетании с другими агентами для ингибирования нежелательной и неконтролируемой пролиферации клеток, например, антителами. Соединение можно конъюгировать с антителом или вводить в виде двух отдельных компонентов.

Соединения изобретения и композиции, содержащие их, можно вводить любым путем. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая соединение изобретения, может быть составлена в формате, подходящем для перорального, ректального, парентерального, интраназального или трансдермального введения или введения путем ингаляции или в виде суппозитория. Типичными способами введения являются парентеральное, интраназальное или трансдермальное введение или введение путем ингаляции. Для химиотерапии опухолей композиции наиболее удобно вводить внутривенно.

При использовании в качестве лечения существующих опухолей соединения настоящего изобретения можно вводить с использованием схем, разработанных для химиотерапевтических средств.

Соединения изобретения и композиции являются пригодными для лечения объектов, страдающих раком. Один определенный класс рака известен как солидные опухоли, в которых можно идентифицировать солидную массу ракового материала. Другой класс включает гематологический рак, известный как рак, который поражает кровеносную систему.

Определенные типы рака, которые можно лечить с использованием соединений и композиций настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, рак простаты, поджелудочной железы, мелкоклеточный рак легких или рак желудочно-кишечного тракта. В предпочтительном варианте осуществления рак представляет собой рак простаты или поджелудочной железы.

Соединения изобретения и композиции являются пригодными для лечения, направленного на ингибирование роста солидной опухоли или на уменьшение размера солидной опухоли, например, когда опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы или простаты.

Подходящим объектом лечения является животное, предпочтительно человек.

По существу предоставлен способ лечения, включающий введение объекту соединения или фармацевтической композиции изобретения для лечения рака, в частности тех, которые уже описаны выше.

Также предоставлено применение соединения или фармацевтической композиции изобретения при изготовлении лекарственного препарата для лечения рака, в частности тех, которые уже описаны выше.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано сопровождающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Ряд тетразамещенных нафталиндиимидов синтезировали и оценивали в качестве лигандов G-квадруплекса и в качестве потенциальных противораковых агентов.

Химия

Все химические вещества, реагенты и растворители приобретали из коммерческих источников и использовали в том виде, в котором они были получены, если не указано иначе. Растворители были коммерческой чистоты для ВЭЖХ, если не указан сухой растворитель, и в этом случае использовали сухие растворители Aldrich «Sure Seal». Колоночную хроматографию проводили на предварительно набитых картриджах с диоксидом кремния (230-400 меш, 40-63 мкм), используя указанный элюент.

Спектры ¹H ЯМР получали на спектрометре Bruker Avance III при 400 МГц с использованием остаточного недейтерированного растворителя в качестве стандартного образца.

Аналитическую ЖХМС проводили с использованием или кислотных, или основных способов следующим образом:

Кислотная, ВЭЖХ: колонка Waters X-Select CSH C18, 2,5 мкм, 4,6×30 мм, элюирование с градиентом 0,1% муравьиной кислоты в MeCN в 0,1% муравьиной кислоте в воде. Градиент от 5 до 95% 0,1% муравьиной кислоты в MeCN происходит от 0,00 до 3,00 минут при 2,5 мл/мин с промыванием от 3,01 до 3,5 минут при 4,5 мл/мин. Повторное уравновешивание колонки до 5% MeCN занимает от 3,60 до 4,00 минут при 2,5 мл/мин. УФ-спектры элюированных пиков измеряли с использованием Agilent 1260 Infinity или Agilent 1200 VWD при 254 нм. Масс-спектры измеряли с использованием Agilent 6120 или Agilent 1956 MSD, работающего с положительным/отрицательным переключением, или Agilent 6100 MSD, работающего или в положительном, или в отрицательном режиме.

Основная, ВЭЖХ: колонка Waters X-Select BEH C18, 2,5 мкм, 4,6×30 мм, элюирование с градиентом MeCN в водном 10 мМ бикарбонате аммония. Градиент от 5 до 95% MeCN происходит от 0,00 до 3,00 минут при 2,5 мл/мин с промыванием от 3,01 до 3,5 минут при 4,5 мл/мин. Повторное уравновешивание колонки до 5% MeCN занимает от 3,60 до 4,00 минут при 2,5 мл/мин. УФ-спектры элюированных пиков измеряли с использованием Agilent 1260 Infinity или Agilent 1200 VWD при 254 нм. Масс-спектры измеряли с использованием Agilent 6120 или Agilent 1956 MSD, работающего с положительным/отрицательным переключением, или Agilent 6100 MSD, работающего или в положительном, или в отрицательном режиме.

В качестве альтернативы аналитическую СВЭЖХ/МС проводили с использованием или кислотных, или основных способов следующим образом:

Кислотная, СВЭЖХ: колонка Waters Acquity CSH C18, 1,7 мкм, 2,1×30 мм, элюирование с градиентом 0,1% муравьиной кислоты в MeCN в 0,1% муравьиной кислоте в воде. Градиент структурирован с начальной точкой 5% MeCN, удерживаемой от 0,0 до 0,11 минут. Градиент от 5 до 95% происходит от 0,11 до 2,15 минут с промыванием от 2,15 до 2,56 минут. Повторное уравновешивание колонки до 5% MeCN занимает от 2,56 до 2,83 минут. УФ-спектры элюированных пиков измеряли с использованием Acquity PDA и масс-спектры записывали с использованием детектора Acquity QDa с ESI положительным/отрицательным переключением.

Основная, СВЭЖХ: колонка Waters Acquity BEH C18, 1,7 мкм, 2,1×30 мм, элюирование с градиентом MeCN в 10 мМ водном бикарбонате аммония. Градиент структурирован с начальной точкой 5% MeCN, удерживаемой от 0,0 до 0,11 минут. Градиент от 5 до 95% происходит от 0,11 до 2,15 минут с промыванием от 2,15 до 2,56 минут. Повторное уравновешивание колонки до 5% MeCN занимает от 2,56 до 2,83 минут. УФ-спектры элюированных пиков измеряли с использованием Acquity PDA и масс-спектры записывали с использованием детектора Acquity QDa с ESI положительным/отрицательным переключением.

Препаративную ВЭЖХ проводили с использованием колонки Waters Xselect CSH C18, 5 мкм, 19×50 мм, используя или градиент 0,1% муравьиной кислоты в MeCN в 0,1% водной муравьиной кислоте, или градиент MeCN в 10 мМ водном бикарбонате аммония; или колонки Waters Xbridge BEH C18, 5 мкм, 19×50 мм с использованием градиента MeCN в 10 мМ водном бикарбонате аммония. Фракции собирали после обнаружения УФ на одной длине волны, измеренной детектором с переменной длиной волны на препаративной ВЭЖХ Gilson 215 или препаративной ВЭЖХ Varian PrepStar; по массе и УФ на одной длине волны, измеренной с помощью одноквадрупольного масс-спектрометра ZQ с электрораспылением положительно и отрицательно заряженных ионов и двухволнового детектора на Waters FractionLynx ЖХМС.

Пример 1: 2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)-9-(4-(пирролидин-1-илметил)фенил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон (100 мг, 0,141 ммоль), (3,5-диметоксифенил)бороновую кислоту (77 мг, 0,422 ммоль) или 1-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)пирролидин (121 мг, 0,422 ммоль) и Pd(Ph₃P)₄ (8,12 мг, 7,03 мкмоль) растворяли в ТГФ/2M K₂CO₃ (3:1, 2 мл) и дегазировали, обратное заполнение азотом три раза. Смесь нагревали (температура блока 70°C) при перемешивании в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали, разбавляли ДХМ (15 мл), промывали водой (15 мл), пропускали через гидрофобную фритту и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, основной, 20-50 MeCN в воде с получением указанного в заголовке соединения (7,1 мг, 8,34 мкмоль, выход 6%) в виде темно-красного твердого вещества.

1H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ 10,24 (т, J=5,3 Гц, 1H), 8,48 (с, 1H), 8,32 (с, 1H), 7,52 (д, J=7,9 Гц, 2H), 7,38-7,29 (м, 2H), 4,34-4,25 (м, 2H), 4,21-4,07 (м, 2H), 3,87 (с, 2H), 3,75 (кв, J=6,2 Гц, 2H), 3,62 (дт, J=16,8, 4,7 Гц, 8H), 2,95 (т, J=6,5 Гц, 2H), 2,78 (с, 4H), 2,71-2,64 (м, 4H), 2,53 (т, J=7,0 Гц, 2H), 2,50-2,35 (м, 10H), 2,02-1,78 (м, 12H). 1H ЯМР в CDCl3 1863-70-преп2 соответствовал структуре продукта при чистоте 93%. ЖХМС, основная, 1863-70B-преп, m/z 792,4 [M+H]+ при 4 мин, чистота 96% @ 254 нм. Содержит 4% CMO3 при ЖХ @ 254 нм.

Пример 2: 4-(4-(морфолинометил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

Перемешиваемую смесь 4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона (202 мг, 0,284 ммоль) и (4-(морфолинометил)фенил)бороновой кислоты (188 мг, 0,852 ммоль) в диоксане (4 мл) обрабатывали карбонатом калия (568 мкл, 2 М водного раствора, 1,135 ммоль) и дегазировали. Добавляли S-Phos Pd G3 (6,64 мг, 8,52 мкмоль) и смесь снова дегазировали, затем всю смесь нагревали до 80°C (температура блока, предварительно нагретая). Через 18 ч смеси давали остыть, затем разбавляли водой (10 мл) и насыщ. водн. NaHCO₃ (10 мл) и экстрагировали ДХМ (2×20 мл). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и испаряли. Колоночная хроматография (12 г Buchi FlashPure, предварительно адсорбированная, 10-70% [9:1 (1:1 ТГФ:ДХМ): 7 M NH₃ в MeOH] в (1:1 ТГФ:ДХМ)) предоставляла две фракции умеренно чистого продукта. Центр полосы продукта испаряли и растворяли в MeCN (2 мл). Через ~48 ч смесь отфильтровывали и твердое вещество удаляли. В то же время материал с края полосы продукта испаряли и повторно превращали в суспензию из изогексана. Этот материал объединяли с жидкостями MeCN из вышеуказанной партии, и полученный продукт очищали c помощью колоночной хроматографии (12 г RediSep Gold, 30-70% (9:1 ДХМ:0,7 M NH₃ в MeOH) в ДХМ, загрузка в ДХМ). Центральный разрез этой полосы испаряли с получением продукта в виде ярко-красного стекловидного твердого вещества (50 мг, 22%).

ЖХМС: найдено m/z 808,3 (для C₄₅H₅₈N₇O₇ (MH⁺) требуется 808,4) при 6,68 мин. ¹H ЯМР (500 МГц, хлороформ-d) δ 10,24 (т, J=5,3 Гц, 1H), 8,50 (с, 1H), 8,33 (с, 1H), 7,45 (д, J=8,0 Гц, 2H), 7,32 (д, J=8,0 Гц, 2H), 4,30 (т, J=7,4 Гц, 2H), 4,15 (т, J=7,4 Гц, 2H), 3,83-3,71 (м, 6H), 3,65-3,59 (м, 10H), 2,95 (т, J=6,4 Гц, 2H), 2,70-2,67 (м, 4H), 2,58-2,50 (м, 6H), 2,47-2,40 (м, 10H), 1,96 (вид п, J=7,1 Гц, 2H), 1,90-1,84 (м, 6H).

Пример 3: 2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)-9-(3-(пирролидин-1-илметил)фенил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

Перемешиваемую смесь 4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона (149 мг, 0,209 ммоль) и 1-(3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)пирролидина (180 мг, 0,628 ммоль) в диоксане (4 мл) обрабатывали карбонатом калия (419 мкл 2 М водного раствора, 0,837 ммоль) и дегазировали. Загружали S-Phos Pd G3 (4,90 мг, 6,28 мкмоль), смесь снова дегазировали и все нагревали до 80°C. Через 16 ч смесь оставляли охлаждаться, затем разбавляли водой (10 мл) и насыщ. водн. NaHCO₃ (10 мл) и экстрагировали ДХМ (2×20 мл). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и испаряли. Колоночная хроматография (12 г RediSep Gold, 30-60% (9:1 ДХМ:0,7 M NH₃ в MeOH) в ДХМ, загрузка в ДХМ) предоставляла продукт средней чистоты. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (12 г Reveleris C-18, 75-100% (70 мМ NH₃ в MeOH) в воде), загрузка в ДМСО) с получением продукта с лучшей, но все же неудовлетворительной чистотой. Остаток повторно очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (12 г Reveleris C-18, 75-100% (70 мМ NH₃ в МеОН) в воде, загрузка в ДМСО) с получением продукта в виде ярко-красного стекловидного твердого вещества (16 мг , 10%).

ЖХМС: найдено m/z 792,4: (C₄₅H₅₈N₇O₆ (MH⁺) требуется 792,4) @ 6,42 мин. ¹H ЯМР (500 МГц, метиленхлорид-d₂) δ 10,26 (т, J=5,5 Гц, 1H), 8,47 (с, 1H), 8,35 (с, 1H), 7,47-7,37 (м, 2H), 7,35 (уш.с, 1H), 7,26 (дт, J=7,2, 1,7 Гц, 1H), 4,30 (т, J=7,4, 2H), 4,13 (т, J=7,4 Гц, 2H), 3,82-3,65 (м, 4H), 3,52-3,58 (м, 8H), 2,95 (т, J=6,2 Гц, 2H), 2,69-2,66 (м, 4H), 2,61-2,30 (м, 16H), 1,93 (п, J=6,9 Гц, 2H), 1,89-1,75 (м, 10H).

Пример 4: 2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-(4-(пиперидин-1-илметил)фенил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

Перемешиваемую смесь 4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона (155 мг, 0,218 ммоль) и 1-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)пиперидина (197 мг, 0,653 ммоль) в диоксане (4 мл) обрабатывали карбонатом калия (436 мкл 2 М водного раствора, 0,871 ммоль) и дегазировали. Загружали S-Phos Pd G3 (5,10 мг, 6,53 мкмоль), смесь снова дегазировали и все нагревали до 80°C. Через 16 ч смеси давали охлаждаться, затем разбавляли водой (10 мл) и насыщ. водн. NaHCO₃ (10 мл) и экстрагировали ДХМ (2×20 мл). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и испаряли. Колоночная хроматография (12 г RediSep Gold, 30-60% (9:1 ДХМ:0,7 M NH₃ в MeOH) в ДХМ, загрузка в ДХМ) предоставляла продукт средней чистоты. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (12 г Reveleris C-18, 75-100% (70 мМ NH₃ в MeOH) в воде, загрузка в ДМСО) с получением продукта в виде ярко-красного стекловидного твердого вещества (61 мг, 35%).

ЖХМС: найдено m/z 806,3: (C₄₆H₆₀N₇O₆ (MH⁺) требуется 805,5) @ 7,38 мин. ¹H ЯМР (500 МГц, метиленхлорид-d₂) δ 10,25 (т, J=5,1 Гц, 1H), 8,47 (с, 1H), 8,34 (с, 1H), 7,43 (д, J=8,1 Гц, 2H), 7,33 (д, J=8,1 Гц, 2H), 4,29 (т, J=7,4 Гц, 2H), 4,14 (т, J=7,3 Гц, 2H), 3,75 (кв, J=5,9 Гц, 2H), 3,64-3,50 (м, 10H), 2,95 (т, J=6,2 Гц, 2H), 2,69-2,66 (м, 4H), 2,56-2,29 (м, 16H), 1,93 (п, J=7,0 Гц, 2H), 1,89-1,82 (м, 6H), 1,68-1,62 (м, 4H), 1,53-1,49 (м, 2H).

Пример 5: 4-(4-((диэтиламино)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

Перемешиваемую смесь 4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона (155 мг, 0,218 ммоль) и N-этил-N-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)этанамина (189 мг, 0,653 ммоль) в диоксане (4 мл) обрабатывали карбонатом калия (436 мкл 2 М водн. раствора, 0,871 ммоль) и дегазировали. Загружали S-Phos Pd G3 (5,10 мг, 6,53 мкмоль), смесь снова дегазировали и все нагревали до 80°C. Через 16 ч смесь оставляли охлаждаться, затем разбавляли водой (10 мл) и насыщ. водн. NaHCO₃ (10 мл) и экстрагировали ДХМ (2 × 20 мл). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и испаряли. Колоночная хроматография (12 г BuchiFlashPure, 30-60% (9:1 ДХМ: 1,4 M NH₃ в MeOH) в ДХМ, загрузка в ДХМ) предоставляла продукт средней чистоты. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (12 г Reveleris C-18, 75-100% (70 мМ NH₃ в МеОН) в воде, загрузка в ДМСО) с получением продукта в виде ярко-красного стекловидного твердого вещества (81 мг, 47%).

ЖХМС: найдено m/z 794,2: (C₄₅H₆₀N₇O₆ (MH⁺) требуется 794,5) @ 6,93 мин. ¹H ЯМР (500 МГц, метиленхлорид-d₂) δ 10,24 (т, J=5,2 Гц, 1H), 8,46 (с, 1H), 8,32 (с, 1H), 7,46 (д, J=8,0 Гц, 2H), 7,33 (д, J=8,0 Гц, 2H), 4,28 (т, J=7,4 Гц, 2H), 4,13 (т, J=7,4 Гц, 2H), 3,79-3,71 (м, 2H), 3,69 (с, 2H), 3,58-3,53 (м, 8H), 2,94 (т, J=6,2 Гц, 2H), 2,69-2,66 (м, 4H), 2,61 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 2,50 (т, J=6,8 Гц, 2H), 2,47-2,30 (м, 10H), 1,93 (п, J=6,9 Гц, 2H), 1,88-1,82 (м, 6H), 1,12 (т, J=7,1 Гц, 6H).

Пример 6: 4-(4-((циклопентиламино)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

Перемешиваемую смесь 4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона (153 мг, 0,215 ммоль) и N-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)циклопентанамина (194 мг, 0,645 ммоль) в диоксане (4 мл) обрабатывали карбонатом калия (430 мкл 2 М водн. раствора, 0,860 ммоль) и дегазировали. Загружали S-Phos Pd G3 (5,03 мг, 6,45 мкмоль), смесь снова дегазировали и все нагревали до 80°C. Через 16 ч смесь оставляли охлаждаться, затем разбавляли водой (10 мл) и насыщ. водн. NaHCO₃ (10 мл) и экстрагировали ДХМ (2 × 20 мл). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и испаряли. Колоночная хроматография (12 г BuchiFlashPure, 30-60% (9:1 ДХМ:1,4 M NH₃ в MeOH) в ДХМ, загрузка в ДХМ) предоставляла продукт средней чистоты. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (12 г Reveleris C-18, 75-100% (70 мМ NH₃ в MeOH) в воде, загрузка в ДМСО) с получением продукта в виде ярко-красного стекловидного твердого вещества (29 мг, 17%).

ЖХМС: найдено m/z 806,4: (C₄₆H₆₀N₇O₆ (MH⁺) требуется 805,5) @ 6,57 мин. ¹H ЯМР (500 МГц, метиленхлорид-d₂) δ 10,25 (т, J=5,1 Гц, 1H), 8,46 (с, 1H), 8,34 (с, 1H), 7,45 (д, J=7,9 Гц, 2H), 7,33 (д, J=7,9 Гц, 2H), 4,29 (т, J=7,3 Гц, 2H), 4,13 (т, J=7,4, Гц, 2H), 3,88 (с, 2H), 3,75 (кв, J=5,9 Гц, 2H), 3,58-3,53 (м, 8H), 3,23 (п, J=6,4 Гц, 1H), 2,95 (т, J=6,2 Гц, 2H), 2,69-2,66 (м, 4H), 2,50 (т, J=6,8 Гц, 2H), 2,47-2,30 (м, 10H), 1,96-1,89 (м, 4H), 1,88-1,80 (м, 6H), 1,79-1,72 (м, 2H), 1,65-1,58 (м, 2H), 1,51-1,42 (м, 2H), CH₂NHCH не наблюдается.

Пример 7: 4-(4-(азепан-1-илметил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

Перемешиваемую смесь 4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона (223 мг, 0,313 ммоль) и 1-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)азепана (296 мг, 0,940 ммоль) в диоксане (4 мл) обрабатывали карбонатом калия (627 мкл 2 М водн. раствора, 1,253 ммоль) и дегазировали. Загружали S-Phos Pd G3 (7,33 мг, 9,40 мкмоль), смесь снова дегазировали и все нагревали до 80°C. Через 16 ч смесь оставляли охлаждаться, затем разбавляли водой (10 мл) и насыщ. водн. NaHCO₃ (10 мл) и экстрагировали ДХМ (2 × 20 мл). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и испаряли. Колоночная хроматография (12 г Buchi FlashPure, 30-60% (9:1 ДХМ:1,4 M NH₃ в MeOH) в ДХМ, загрузка в ДХМ) предоставляла продукт средней чистоты. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (12 г Reveleris C-18, 75-100% (70 мМ NH₃ в MeOH) в воде, загрузка в ДМСО) с получением продукта в виде ярко-красного стекловидного твердого вещества (130 мг, 51%).

ЖХМС: найдено m/z 820,3: (C₄₇H₆₂N₇O₆ (MH⁺) требуется 820,5) @ 7,69 мин. ¹H ЯМР (500 МГц, метиленхлорид-d₂) δ 10,25 (т, J=5,1 Гц, 1H), 8,47 (с, 1H), 8,34 (с, 1H), 7,47 (д, J=7,8 Гц, 2H), 7,33 (д, J=7,8 Гц, 2H), 4,29 (т, J=7,4 Гц, 2H), 4,14 (т, J=7,3 Гц, 2H), 3,82-3,70 (м, 4H), 3,57-3,53 (м, 8H), 2,95 (т, J=6,2 Гц, 2H), 2,78-2,61 (м, 8H), 2,50 (т, J=6,8 Гц, 2H), 2,47-2,30 (м, 10H), 1,93 (п, J=7,0 Гц, 2H), 1,88-1,82 (м, 6H), 1,73-1,68 (м, 8H).

Пример 8: 4-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон

Перемешиваемую смесь 4-бром-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона (213 мг, 0,299 ммоль) и 1-метил-4-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)пиперазина (284 мг, 0,898 ммоль) в диоксане (4 мл) обрабатывали карбонатом калия (599 мкл 2 М водн. раствора, 1,197 ммоль) и дегазировали. Загружали S-Phos Pd G3 (7,01 мг, 8,98 мкмоль), смесь снова дегазировали и все нагревали до 80°C. Через 16 ч смесь оставляли охлаждаться, затем разбавляли водой (10 мл) и насыщ. водн. NaHCO₃ (10 мл) и экстрагировали ДХМ (2 × 20 мл). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и испаряли. Колоночная хроматография (12 г BuchiFlashPure, 30-60% (9:1 ДХМ: 3,5 M NH₃ в MeOH) в ДХМ, загрузка в ДХМ) предоставляла продукт средней чистоты. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (12 г Reveleris C-18, 75-100% (70 мМ NH₃ в MeOH) в воде, загрузка в ДМСО) с получением продукта в виде ярко-красного стекловидного твердого вещества (111 мг, 45%).

ЖХМС: найдено m/z 821,2: (C₄₆H₆₁N₈O₆ (MH⁺) требуется 821,5) @ 6,06 мин. ¹H ЯМР (500 МГц, метиленхлорид-d₂) δ 10,25 (т, J=5,1 Гц, 1H), 8,46 (с, 1H), 8,34 (с, 1H), 7,43 (д, J=8,1 Гц, 2H), 7,33 (д, J=8,1 Гц, 2H), 4,29 (т, J=7,4 Гц, 2H), 4,13 (т, J=7,3 Гц, 2H), 3,75 (кв, J=5,9 Гц, 2H), 3,62 (с, 2H), 3,57-3,53 (м, 8H), 2,95 (т, J=6,2 Гц, 2H), 2,77-2,20 (м, 27H), 1,94 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,89-1,80 (м, 6H).

Биофизические данные и данные клеточной биологии

Анализ пролиферации клеток

CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Invitrogen) представляет собой колориметрический метод определения количества жизнеспособных клеток в анализах пролиферации или цитотоксичности. Реагент CellTiter 96® AQueous One Solution содержит новое соединение тетразолия [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий, внутренняя соль; MTS] и реагент электронного связывания (этосульфат феназина; PES). PES обладает повышенной химической стабильностью, что позволяет комбинировать его с MTS с образованием стабильного раствора. Соединение тетразолия MTS (реагент Оуэна) биологически восстанавливается клетками до окрашенного формазанового продукта, который растворим в среде для культивирования тканей. Анализы проводят путем добавления небольшого количества реагента CellTiter 96® AQueous One Solution непосредственно в лунки для культивирования, инкубации в течение 1-4 часов и затем регистрации оптической плотности при 490 нм с помощью планшетного ридера для 96-луночных планшетов. Количество формазанового продукта, измеренное по оптической плотности при 490 нм, прямо пропорционально количеству живых клеток в культуре. Набор использовали в соответствии с инструкциями изготовителя. После 96-часовой инкубации с каждым соединением примером в клетках MIA-PACA2 пролиферацию клеток каждого образца измеряли с использованием анализа пролиферации клеток MTS Cell Titre 96 Aqueous One Solution (Promega Ltd). Процент ингибирования рассчитывали относительно среднего значения для контрольных образцов, обработанных ДМСО.

Соединение примера Отн. IC₅₀ АБС. IC₅₀ 1 0,035 0,056 2 0,188 0,292 3 0,282 0,284 4 0,132 0,175 5 0,239 0,180 6 0,099 0,102 7 0,117 0,182 8 0,174 0,277 Таблица 1 - Данные ингибирования роста клеток для панели линий клеток рака поджелудочной железы для Примеров 1-8; значения IC₅₀ (нМ) из 96-часовых анализов MTS. Данные показывают, что Примеры с 1 по 8 демонстрируют различную способность ингибировать рост раковых клеток. В конкретном примере соединение 1 является наиболее активным в группе.

Исследования эффективности ксенотрансплантатов in vivo

Мышей в возрасте 5-7 недель и массой приблизительно 25-32 г подвергали имплантации для исследования и приобретали у Charles River. Процедура имплантации опухолевых клеток поджелудочной железы включала подкожную имплантацию клеток MIA-PACA2 (1×10⁷ в матригеле) с использованием иглы 22 размера в задний бок мышей. Оцениваемые параметры включают размер опухоли и массу тела животного. Объем опухоли измеряли три раза в неделю и массу тела, по меньшей мере, 3 раза в неделю. Распределение по группам лечения производили случайным образом, когда опухоли достигали приблизительно 50 мм³ для животных в исследовании эффективности. Животным (самкам бестимусных голых мышей с опухолями MIA-PACA2) вводили в/в дозы в течение 28 дней, два раза в неделю, в дозах 10 и 15 мг/кг для C1 и в дозах 0,5 и 1,0 мг/кг для Примера 1, исходя из его клеточной активности в 10 раз больше. Каждая группа состояла из 8 животных. Все протоколы, использованные в этом исследовании, были одобрены соответствующим Советом по благополучию животных и этике, и все процедуры проводили в соответствии с положениями Закона Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года. Результаты показаны в таблицах ниже и на чертеже.

Пример 1 C1 Мол. масса 791,99 632,33 clogP 5,65 3,72 Возбуждение и эмиссия флуоресценции макс, в нм 510, 612 (эм)
510 (возб) 510, 590 (эм)
510 (возб) Состав свободного основания, для исследований на клетках и in vivo, до МПД Подкисленный фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Подкисленный фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Соль и растворимость в воде Не сделана HCl/соль муравьиной кислоты:
> 5 мг/мл Стабильность в солевом растворе при 0°C > 1 месяца > 1 месяца t_1/2 мышиная микросомальная стабильность, мин 268 >480 Связывание с белками плазмы % in vitro 66,1 35 In vitro распределение кровь/плазма 6,1 10,9 FRET ΔT_m, °C с GQ 23,1 17,6 Таблица 2 - Основные свойства и данные связывания GQ in vitro из Примера 1 по сравнению с соединением C1 предшествующего уровня техники (со ссылкой на WO2017/103587A1)

Пример 1 C1 MIA-PACA2 1,3 13,0 PANC-1 1,4 15,6 CAPAN-1 5,9 26,5 Bx-PC3 2,6 15,5 MIA-PACA2^gemR 3,8 14,9 Таблица 3 - Данные ингибирования роста клеток для панели линии клеток рака поджелудочной железы для Примера 1 по сравнению с соединением C1 предшествующего уровня техники (со ссылкой на WO2017/103587A1); значения IC₅₀ (нМ) из 96-часовых анализов SRB, как подробно описано в предшествующих публикациях и раскрытиях изобретателей. Данные показывают, что соединение Примера 1 является значительно более сильнодействующим с точки зрения его способности ингибировать рост раковых клеток и что его фармакологические свойства, по меньшей мере, сопоставимы.

График на чертеже показывает данные ксенотрансплантата в модели MIA-PACA2 после 28 дней в/в введения с последующим 28-дневным измерением (выполненным AXIS BioServices). Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение n=8 до 23 дня и n=4 до конца исследования. Данные показывают, что соединение Примера 1 ингибировало рост опухоли поджелудочной железы и уменьшало размер опухоли значительно больше, чем это было у сравнительного соединения C1 или известного противоракового препарата, Гемцитабина, даже при режиме дозирования один раз в неделю. Кроме того, Пример 1 и схемы дозирования хорошо переносились, не проявляя никаких признаков побочных эффектов. Исходные объемы опухоли составляли 0,4 мм³. Пример 1 был активен в обоих исследуемых режимах дозирования, 1 раз в неделю и 2 раза в неделю, оба при дозе 1 мг/кг. У обоих наблюдалось 5/8 полной регрессии объема опухоли в конце периода дозирования. В когортах с полной регрессией опухоли полностью исчезли и не наблюдалось возобновления роста через 28 дней после введения дозы. Меньшая часть опухолей в группах C1 и Примера 1 не демонстрирует полной регрессии, но демонстрирует снижение роста опухоли, что приводит к постоянно меньшим объемам, чем в контрольных группах наполнителя.

Анализ XTT

CyQUANT XTT Cell Viability Assay (Invitrogen) представляет собой полный, оптимизированный анализ, который обеспечивает последовательное колориметрическое обнаружение жизнеспособных клеток млекопитающих. Набор для анализа состоит из двух реагентов: реагента XTT (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилида) и реагента электронного взаимодействия. Реагент XTT используется для оценки жизнеспособности клеток как функции окислительно-восстановительного потенциала клетки и реагент электронного связывания улучшает динамический диапазон анализа. Набор использовали в соответствии с инструкциями изготовителя.

Пример 1 C1 Абиратерон Энзалутамид PC-3 3 94 4820 5350 DU145 32 113 н/д н/д LNCaP 247 394 3860 4820 VCaP 68 135 н/д н/д 22RV1 90 90 н/д н/д Таблица 4 - Данные ингибирования роста клеток для панели линии клеток рака простаты для Примера 1 по сравнению с соединением C1 предшествующего уровня техники (со ссылкой на WO2017/103587A1) и клинически одобренными гормональными терапевтическими средствами против рака простаты Абиратероном и Энзалутамидом; значения IC₅₀ (нМ) из 72-часовых анализов XTT. Данные показывают, что соединение примера 1 высокоактивно для панели линий клеток рака простаты, особенно в метастатической и андроген-независимой линии PC-3, по сравнению с C1 и даже в большей степени по сравнению с двумя клинически используемыми лекарственными средствами.

Таким образом, соединения изобретения проявляют противоопухолевую активность в ряде линий раковых клеток.

Изобретение относится к соединению Формулы I, которое может найти применение для лечения рака предстательной железы или поджелудочной железы. В Формуле I L находится в мета- или пара-положении фенильного кольца; L означает (CH₂)_1-2 и R¹ выбран из группы, состоящей из азотсодержащего 5-7-членного гетероциклоалкила, который может содержать второй гетероатом, и NR₉R₁₀; или L означает (CH₂)_1-5NH и R¹ означает C_5-7циклоалкил; причем азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил необязательно замещен C₁-C₆алкилом; R² означает C_2-4алкандиил с прямой цепью; R³ означает H; R⁴ означает C_2-4алкандиил с прямой цепью; R⁹ и R¹⁰ независимо означают C_1-6алкил; и X означает NR⁶₂, где группы R⁶ вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют пирролидин-1-ил. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение, и способу его получения. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 8 пр.

1. Соединение Формулы I

Формула I

L находится в мета- или пара-положении фенильного кольца;

L означает (CH₂)_1-2 и R¹ выбран из группы, состоящей из азотсодержащего 5-7-членного гетероциклоалкила, который может содержать второй гетероатом, и NR₉R₁₀; или

L означает (CH₂)_1-5NH и R¹ означает C_5-7циклоалкил; причем азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил необязательно замещен C₁-C₆алкилом;

R² означает C_2-4алкандиил с прямой цепью;

R³означает H;

R⁴ означает C_2-4алкандиил с прямой цепью;

R⁹ и R¹⁰ независимо означают C_1-6алкил; и

X означает NR⁶₂, где группы R⁶ вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют пирролидин-1-ил.

2. Соединение по п. 1, в котором L представляет собой (CH₂)_1-2 и R¹ означает азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил.

3. Соединение по любому из пп. 1 или 2, где азотсодержащий 5-7-членный гетероциклоалкил выбран из группы, состоящей из пирролидинила, имидазолидинила, пиразолидинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, азепанила, диазепанила, предпочтительно пирролидинила.

4. Соединение по п. 1, в котором L представляет собой (CH₂)_1-5NH и R¹ представляет собой C_5-7циклоалкил.

5. Соединение по любому из предшествующих пунктов, в котором L находится в пара-положении.

6. Соединение по п. 1, в котором соединение выбрано из группы, состоящей из:

2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)-9-(4-(пирролидин-1-илметил)фенил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-(морфолинометил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)-9-(3-(пирролидин-1-илметил)фенил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-(4-(пиперидин-1-илметил)фенил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-((диэтиламино)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-((циклопентиламино)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона;

4-(4-(азепан-1-илметил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона; и

4-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)фенил)-2,7-бис(3-морфолинопропил)-9-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраона.

7. Соединение по п. 1, которое представляет собой 2,7-бис(3-морфолинопропил)-4-((2-(пирролидин-1-ил)этил)амино)-9-(4-(пирролидин-1-илметил)фенил)бензо[lmn][3,8]фенантролин-1,3,6,8(2H,7H)-тетраон.

8. Соединение по любому из пп. 1-5, в котором Формула I имеет следующую структуру Формулы II:

Формула II

в которой L и R¹ определены в любом из пп. 1-5.

9. Композиция для лечения рака, или для ингибирования роста солидной опухоли, или для сокращения размера солидной опухоли, где рак представляет собой рак предстательной железы или поджелудочной железы, а опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы или предстательной железы, содержащая терапевтиески эффективное количество соединения по любому из предшествующих пунктов в комбинации с разбавителем, причем композиция представляет собой фармацевтическую композицию и разбавитель представляет собой фармацевтически приемлемый разбавитель.

10. Способ получения замещенного соединения нафталиндиимида по любому из пп. 1-8, включающий стадии:

i) взаимодействие соединения Формулы III в реакции нуклеофильного замещения с соединением Формулы IV

Формула III,

HN(R³)(R⁴X)

Формула IV,

в которой один Br в соединении Формулы III замещен азотом нуклеофильного амина в соединении Формулы IV;

ii) взаимодействие соединения Формулы V, полученного из продукта, полученного в результате реакции нуклеофильного замещения Формулы III и Формулы IV, с соединением Формулы VI

Формула V,

Формула VI,

в которой арил-арильная связь образуется между фенилом Формулы VI и фенилом с присоединенным Br в соединении Формулы V, в которой LG и Br представляют собой уходящие группы, с образованием соединения Формулы I.