ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИОДЕСТРУКТОРОВ УГЛЕВОДОРОДОВ РОДА RHODOCOCCUS SPP. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 C12Q1/6888 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и микробиологии.

Загрязнение воды и почвы нефтепродуктами представляет собой значительную проблему, так как при добыче, транспортировке и хранении нефти и ее производных оно происходит практически неизбежно. При попадании в окружающую среду эти соединения в силу своей токсичности и таких специфических физических свойств, как высокая склонность к образованию пленок, наносят значительный урон. Механические методы удаления таких загрязнений на сегодняшний день считаются наиболее действенными, однако они имеют серьезные недостатки. В последние годы активно разрабатываются методы биологической деструкции таких поллютантов; методы эти, потенциально, окажутся более эффективными, и, что важнее, более безопасными, чем удаление нефти или ее продуктов из среды механическим путем. Особенно перспективным представляется использование для биологической ремедиации экосистем микроорганизмов-технофилов. Исследования последних лет выявили несколько родов микроорганизмов, обладающих свойствами к деструкции углеводородов (УВ) ферментативным путем. Среди них бактерии рода Rhodococcus spp.показали наибольшую активность и уже снискали применение в составе целого ряда биопрепаратов и рецептур.

Однако не все штаммы рода Rhodococcus spp.обладают означенными свойствами. Способность деградировать УВ у бактерий рода Rhodococcus spp.определяется наличием фермента AlkB, кодируемого геном AlkB. Наличие этого гена в геноме может быть установлена путем биоинформатического анализа данных полногеномного секвенирования. Попытка отнести отдельно взятую бактериальную культуру к какому-либо конкретному виду этого рода и через это предположить наличие искомого гена так же не даст результата, так как анализ последовательности 16s не информативен в случае Rhodococcus spp. в силу их высокой консервативности внутри рода. Таким образом, определение наличия гена AlkB молекулярно-генетическими методами на сегодняшний день имеет только одно решение, которое связано с полногеномным секвенированием, что требует больших затрат времени и средств.

Принципиально иной метод определения ферментативной активности в отношении УВ у бактерий - культивирование их на селективной бедной питательной среде с добавлением нефти или нефтепродуктов, например, дизельного топлива. В такой среде УВ являются единственным возможным питательным веществом для бактерии, и сам факт развития культуры на такой среде указывает на ее способность к деструкции нефти или ее производных. Этот подход требует значительно меньших материальных затрат, однако, вместе с тем, занимает длительное время - культивирование может потребовать несколько суток.

Таким образом, все существующие методы определения ферментативной активности в отношении УВ у бактерий рода Rhodococcus spp. имеют свои значительные недостатки. Обойти их можно, используя метод классической полимеразной цепной реакции (ПНР), несоизмеримо менее затратный по сравнению с полногеномным секвенированием и намного более быстрый, чем культивирование на селективных питательных средах - такой анализ займет не более 4 часов вместе с пробоподготовкой и регистрацией результата методом гель-электрофореза, стоимость одной пробы сопоставима с стоимостью пробоподготовки в ходе секвенирования.

На сегодняшний день тест-систем для идентификации биодеструкторов УВ рода Rhodococcus spp. методом ПЦР не описано. Однако, существуют аналогичные тест-системы для идентификации других биологически-активных белков у бактерий [3]. Например, известен способ идентификации штаммов и изолятов бактерии Acinetobacter и определения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам (RU 2 646 107 C1) [1] и описанный в патенте (RU 2 346 045 С1) способ идентификации Coccidioides posadasii [2]. Они так же основаны на использовании реакции классической ПЦР с заданными парами праймеров, а значит имеют те же преимущества, что и предлагаемое изобретение - относительно низкую стоимость и быстроту выполнения анализа. Однако, для решения обозначенной нами проблемы -идентификации биодеструкторов УВ рода Rhodococcus spp., они в силу своей специфичности не применимы.

Сущность изобретения заключается в создании вырожденных олигонуклеотидных праймеров для выявления бактерий - биодеструкторов углеводородов рода Rhodococcus spp., используемых в биотехнологии.

Целью изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для идентификации биодеструкторов УВ рода Rhodococcus spp.методом ПЦР.

Цель достигается конструированием специфичных праймеров для идентификации одного из высококонсервативных участков гена AlkB, определяющего способность биологической деструкции УВ у бактерий рода Rhodococcus spp.. Предлагаемые праймеры имеют следующую структуру:

RhAlkB-F: 5' -CCGCCAGMGVTACCTGTGG-3'

RhAlkB-R: 5'-CCGTARTGCTCGAGGTAG-3'

Опираясь на данные множественных выравниваний вариантов гена AlkB, полученных из открытой базы данных GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), был отобран высококонсервативный фрагмент целевого гена длинной 776 пар нуклеотидов (п.н.), к которому были сконструированы фланкирующие комплементарные олигонуклеотидные праймеры.

В качестве положительного контроля в эксперименте использовалась ДНК Rhodococcus qingshengii VER34, наличие гена AlkB в которой ранее было подтверждено молекулярно-генетическими и классическими микробиологическими методами. Выделение ДНК проводилось методом термического разрушения клеток в деионизированной воде при 95°С в течение 10 минут. Апробация полученных праймеров проводилась на наборе штаммов рода Rhodococcus spp.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика подбора олигонуклеотидных праймеров для идентификации биодеструкторов УВ рода Rhodococcus spp. методом ПЦР.

На основе литературного обзора исследований УВ-деструкции у бактерий рода Rhodococcus spp.был выбран целевой ген AlkB, кодирующий фермент AlkB. Различные варианты гена были скачаны из открытой базы данных GenBank NCBI. После был произведен биоинформатический анализ данных с помощью ПО UGENE, что позволило выявить наиболее консервативные участки гена. Так же для повышения надежности амплификации различных вариантов гена, было решено сконструировать вырожденные праймеры. Для анализа возможных неспецифических взаимодействий между генетическими структурами использовалось ПО GeneRunner.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов гена AlkB с помощью сконструированных вырожденных олигонуклеотидных праймеров.

Для повышения надежности анализа использовался метод Hot Start, заключающийся в разделении реактивов для ПЦР слоем парафина для предотвращения неспецифического отжига праймеров. Реактивы вступают в реакцию, когда смесь разогрета до 95°С, и парафиновая прослойка начинает плавиться. К этому моменту матричная ДНК и олигонуклеотидные праймеры полностью проходят стадию плавления, и риск возникновения неспецифических генетических структур снижается.

Состав реакционной смеси для ПЦР на 1 пробу (25 мкл):

100 мМТрис-HCl;

100 мМКСl;

0,4 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;

4 мМ MgCl₂;

0,06 ед. акт./мкл Tag-полимеразы;

0, 2% Tween 20;

стабилизаторы HS-Taq ДНК-полимеразы; рН 8,5 (при 25°С); Далее в реакционную смесь вносятся 5 мкл ДНК-матрицы, по 1 мкл праймеров (10 мкМ), 18 мкл деионизированной воды и наслаивается 30 мкл минерального масла.

Условия проведения реакции для амплификации: этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течении 30 циклов -денатурация ДНК при 95°С - 10 с; отжиг праймеров при 56°С - 15 с; элонгация цепи при 72°С - 50 с; с финальной полимеризацией в течении 10 мин.

Регистрация результатов реакции проводится методом гель-электрофореза в 1%-м агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Полученный ПЦР-продукт сравнивают с полосами маркера молекулярного веса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент №RU 2646107 С1, Российская Федерация, МПК C12Q 1/68 (2006.01) 01.03.2018. Синтетические олигонулкеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерий Acinetabacter и определения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам и способ их применения: №2016147745: заявлен 2016.12.06: опубликован: 2018.03.01 / Баранов А.А., Савинова Т.А., Лапа С.А., Михайлович В.М., Гейдеров Р.Н.; заявитель ФГАУ «НЦЗД» Минздрава России - 3 с.

2. Патент № RU 2346045 C1, Российская Федерация, МПК C12N 15/30, C12Q 1/68. ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii №2007121817/13: заявлен 2007.06.09: опубликован: 2009.02.10 / Ткаченко Г.А., Савченко С.С, Гришина М.А., Антонов В.А.; заявитель ФГУЗ Волгоградский Научно-Исследовательский Противочумной Институт Роспотребнадзора - 1 с: ил.

3. Брюханов А.Л., Нетрусов А.И., Рыбак К.В. Молекулярная биология: учеб. для вузов. - М.: Издательство Московского Университета, 2012. - С. 253-260

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Деструкция.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-03-29">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023135110/20(076822)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-22</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

казённое военное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Военная академия радиационной, химической и биологической

защиты имени Маршала Советского Союза С.К. Тимошенко&quot;

Министерства обороны Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>VA RHBZ</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Олигонуклеотидные праймеры для

идентификации биодеструкторов углеводородов рода Rhodococcus spp.

методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccgccagmgvtacctgtgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccgtartgctcgaggtag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для идентификации микроорганизмов-биодеструкторов углеводородов рода Rhodococcus spp. методом полимеразной цепной реакции с последующей идентификацией методом гель-электрофореза, содержащий одну пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого RhAlkB-F и обратного RhAlkB-R праймеров в полимеразной цепной реакции. Технический результат заключается в расширении арсенала средств идентификации микроорганизмов-биодеструкторов углеводородов рода Rhodococcus spp. 2 пр.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для идентификации микроорганизмов-биодеструкторов углеводородов рода Rhodococcus spp. методом полимеразной цепной реакции с последующей идентификацией методом гель-электрофореза, содержащий одну пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого RhAlkB-F и обратного RhAlkB-R праймеров в полимеразной цепной реакции, имеющих следующую нуклеотидную последовательность:

RhAlkB-F: 5'-CCGCCAGMGVTACCTGTGG-3';

RhAlkB-R: 5'-CCGTARTGCTCGAGGTAG-3'.