5-[4'-(1"-МЕТИЛИНДОЛ-2"-ИЛ)ФЕНИЛ]-10,15,20-ТРИС(N-МЕТИЛПИРИДИН-3'-ИЛ)ПОРФИРИН ТРИИОДИД, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВО ОСАЖДЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ РАСТВОРОВ Российский патент 2025 года по МПК C07D487/22 C07H21/00 C12N15/10 

Изобретение относится к химической промышленности, а именно к получению соединения, которое может быть использовано в медицине, клинической лабораторной диагностике, биохимии, молекулярной биологии, вирусологии, пищевой промышленности, криминалистике в качестве комплексообразующего реагента ДНК, олигонуклеотидов, приводящего к агрегации нуклеиновых кислот и образованию осадка.

Нуклеиновые кислоты с химической точки зрения являются биополимерами, в водных растворах существуют в виде полианионов. Нуклеиновые кислоты – это жизненно важные полинуклеотиды, присутствующие во всех клетках любого живого организма. Выделяют два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК). Их биологические функции отличаются: РНК отвечает за синтез белков, а ДНК отвечает за хранение, экспрессию и передачу генетической информации [Tripathi M., Sarkar A., Mahilang M. Nucleic acids: Components, nomenclature, types, and protection method. Handbook of Biomolecules. – Elsevier. 2023. С. 57-76.]. Анализ нуклеиновых кислот очень востребован, например, в медицине, начиная от диагностики генетических заболеваний, оценке генетического сродства и заканчивая обнаружением возбудителя инфекции; в пищевой промышленности при контроле качества консервированной продукции из благородных сортов рыб, контроле содержания мяса птицы, свинины, говядины в мясных изделиях; в сельском хозяйстве при расчетах удельной копийности генов у трансгенных организмов, а также анализ ДНК нужен в криминалистических исследованиях. Какой бы ни была конечна цель, первым этапом работы с нуклеиновыми кислотами является этап их выделения. Основными требованиями, предъявляемыми к методу выделения, является эффективное отделение нуклеиновых кислот от белков, а также минимальная степень фрагментации полученных препаратов. Следует отметить, что от чистоты, степени сохранности нуклеиновой кислоты будет зависеть результат последующих этапов работы, например, ПЦР, секвенирования, генотипирования и достоверность полученных результатов. Поэтому важна оптимизация каждого из этапов выделения ДНК, сокращения их времени, что будет способствовать уменьшению вероятности контаминации.

Выделение нуклеиновых кислот из образцов подразумевает [Dairawan M., Shetty P. J. The evolution of DNA extraction methods. Am. J. Biomed. Sci. Res. 2020. Vol. 8. №.1. P. 39-45.]: 1) разрушение клеточной стенки и клеточного ядра (как правило, для лизиса клеток сочетают химическое воздействие с нагреванием); 2) отделение ДНК от примесей (белков, липидов, сахаров и других химических компонентов клеток). К настоящему времени описаны три основные стратегии отделения ДНК от примесей: 1) жидкофазная экстракция; 2) твердофазная экстракция; 3) осаждение ДНК.

Стратегия выделения ДНК осаждением основана на способности полярных растворителей (например, этанола) и солей (например, ацетата натрия) осаждать ДНК из водных буферов [Shapiro D. J. Quantitative ethanol precipitation of nanogram quantities of DNA and RNA. Analytical biochemistry. 1981. Vol. 110. №. 1. P. 229-231].

Известен способ выделения ДНК [Патент № 2400537 Российская Федерация, МПК C12N 15/10(2006.01), B82B 1/00(2006.01). Cпособ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот [Текст] / Куцев М. Г. (RU), Плотников В. А. (RU), Макаров С. В. (RU); заявитель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" (RU), Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "Алтайбиотех" (ООО "АБТ") (RU); заявл. 05.11.2008; опубл. 27.09.2010 Бюл. № 27], основанный на том, что образец подвергают лизису в буфере на основе анионного детергента (SDS), лизат подвергают очистке и дезоксирибонуклеиновую кислоту осаждают этанолом или изопропанолом. Очистку лизата проводят суспензией детонационного наноалмаза, избирательно сорбирующим примеси ненуклеиновой природы. Детонационный наноалмаз предварительно отжигают в температурном интервале 400-700°С в вакууме 10^-2-10^-3 Торр.

К недостаткам данного способа можно отнести сложность получения наноалмазов, необходимость их длительного отжига для предотвращения контаминации, а также высокую степень фрагментации ДНК и неудовлетворительное качество ее очистки.

Известно изобретение [Авторское свидетельство 165740 Российская Федерация, МПК C07D 473/00(1995.01), C08B 37/00(1995.01). Способ выделения нуклеиновых кислот и полисахаридов [Текст] / Баев А.А. (RU), Горшкова В.И. (RU), Крутилина А.И. (RU), Мирзабеков А.Д (RU); заявл. 18.01.1964; опубл. 26.10.1964] в котором предложен способ выделения нуклеиновых кислот из водных разбавленных растворов при помощи цетавлона (цетилтриметиламмоний бромид), который образует с нуклеиновой кислотой соль. Далее в полученный раствор добавляют диэтиловый эфир и встряхиванием переводят полученную соль в интерфазу.

Недостатком данного изобретения является использование высокотоксичного цетавлона, сложность в выделении интерфазы, большие потери извлекаемой ДНК.

Хотя эта стратегия подходит для очистки ДНК с высокой молекулярной массой и даже используется в коммерческих наборах, выход и чистота ДНК могут быть субоптимальными.

Существенным недостатком всех вышеперечисленных изобретений является: недостаточная чистота и степень извлечения нуклеиновых кислот, длительное время проведения анализа и его многоэтапность, зависимость результатов от качества используемых реактивов. Некоторые из изобретений требуют использования опасных химикатов или дорогостоящего оборудования. Очевидной проблемой является отсутствие простого способа выделения ДНК с сохранением ее целостности.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является патент [Патент № 2584346. Российская Федерация, МПК G01N 33/48(2006.01). Способ выделения нуклеиновых кислот [Текст] / Хрипко Ю. И. (RU), Батенева Н. В. (RU), Смирнов П. Н. (RU); заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет (RU); заявл. 17.06.2014; опубл. 20.05.2016 Бюл. № 14], согласно которому способ выделения нуклеиновых кислот включает применение изопропанола на этапе преципитации и осаждения ДНК, при этом в качестве соосадителя нуклеиновых кислот используется линейный полиакриламид. Линейный полиакриламид хорошо осаждается спиртом, что позволяет использовать его в качестве соосадителя для очистки и концентрирования ДНК.

Основными недостатками предложенного решения являются: использование дорогостоящего оборудования - высокоскоростной центрифуги со скоростью вращения 14000 об/мин для отделения осадка, а также необходимости наличия сведений о концентрации ДНК в растворе для внесения необходимого количества соосадителя. Существенным недостатком является высокая вероятность контаминации образца как при внесении полимера, имеющего высокое сродство к полианиону, так и переносом раствора в емкости для центрифугирования, которое осуществляется согласно методике 4 раза.

Задачей изобретения является получение нового водорастворимого порфирина с высоким выходом, который образует комплексы с нуклеиновыми кислотами и олигонуклеотидами, приводя к образованию осадка, то есть проявляющего свойство осадителя нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов из раствора.

Поставленная задача достигается новым химическим соединением формулы:

Поставленная задача решена также применением данного нового химического соединения для осаждения нуклеиновых кислот из раствора.

Поставленная задача решена за счет того, что получено новое порфириновое соединение, содержащее три N-метилпиридильных фрагмента и остаток индола, структура которого подтверждена физико-химическими методами анализа. Выбор порфирина обусловлен следующими причинами: три катионных группы обеспечивают растворимость соединения в водных и физиологических средах, а также способность соединения участвовать в образовании электролитного комплекса с противоположно заряженным фосфатным остовом одной из молекул ДНК, гетерильный заместитель (остаток индола) способен к интеркаляционному взаимодействию с другой молекулой ДНК. Таким образом, инициируется агрегация, при достаточном количестве порфирина происходит седиментация комплекса. Скорость седиментации может быть увеличена при охлаждении.

Для получения этого соединения используют следующие вещества:

- 3-пиридилкарбоксальдегид – коммерческий продукт TCI EUROPE N.V.;

- пиррол – ТУ 6-09-07-242-84;

- 4-бромбензальдегид – коммерческий продукт TCI EUROPE N.V.;

- N-метилиндол – коммерческий продукт Merck;

- ацетат натрия 3-водный – ГОСТ 199-78;

- диметилацетамид – ТУ 2636-113-44493179-08

- пропионовая кислота – ГОСТ 32746-2014;

- пропионовый ангидрид – ТУ 6-09-08-1176-77;

- оксид алюминия – ТУ 6-09-426-75;

- силикагель ГОСТ 3956-76;

- метанол – ГОСТ 2222-95;

- хлорид палладия – ГОСТ 13462-2010;

- хлористый метилен – ТУ 2631-44493179-98 с изм. №1, 2, 3;

- гексан – ТУ 6-09-06-4521-77;

- этилацетат – ГОСТ 8981-78;

- диметилформамид – ГОСТ 20289-74 с изм. №1, 2;

- бензол – ГОСТ 5955-75 с изм. №1, 2;

- метилиодид – ТУ: 6-09-3988-83;

- аммиак водный - «ХЧ», ГОСТ 3760-79.

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 показан результат изменения электронных спектров поглощения (ЭСП) в области полосы Соре (а) и спектров флуоресценции (б) раствора порфирина индивидуального и при добавлении репрезентативного олигонуклеотида поли[d(GC)2]. Спектры флуоресценции получены при облучении анализируемых растворов светом длиной волны 425 нм. Исходный спектр флуоресценции порфирина является типичным с максимумами флуоресценции 655 и 702 нм, оба указанных максимума типичны для порфиринов и относятся к переходу S1–S0. В порфириновый раствор, объемом 2 мл, дозировался раствор поли[d(GC)2] (объем дозы 5мкл, суммарный объем 40 мкл). При внесении поли[d(GC)2] в раствор порфирина (концентрация 1⋅10^-5 моль/л) происходит небольшой батохромный сдвиг полосы Соре и уменьшение ее оптической плотности, что свидетельствует о комплексообразовании порфирина с олигонуклотидом. На спектрах флуоресценции увеличение количества поли[d(GC)2] в порфириновом растворе приводит к небольшому тушению флуоресценции. Увеличение количества поли[d(GC)2] приводит к следующим спектральным изменениям: на ЭСП фиксируется отклонение базовой линии, на спектрах флуоресценции - увеличение интенсивности светорассеяния, что говорит о процессах агрегации комплекса.

На фиг. 2 показана фотография раствора порфирина и его комплекса с поли[d(GC)2], после выдержки при 6÷8 °С. Раствор порфирина является оптически прозрачным, комплекс порфирина с поли[d(GC)2] окрашен, четко виден образующийся осадок.

На фиг. 3 показан результат изменения электронных спектров поглощения в области полосы Соре (а) и спектров флуоресценции (б) раствора порфирина индивидуального и при добавлении раствора ДНК спермы лосося (ssDNA). В порфириновый раствор, объемом 2 мл, дозировался раствор ssDNA (объем дозы 5 мкл, суммарный объем 45 мкл). При внесении ssDNA в раствор порфирина (концентрация 1⋅10^-5 моль/л) происходит уменьшение оптической плотности полосы Соре на 60% и отклонения базовой линии, что свидетельствует о комплексообразовании порфирина с ssDNA. На спектрах флуоресценции увеличение количества ssDNA в порфириновом растворе приводит к небольшому тушению флуоресценции и росту интенсивности светорассеяния, что говорит о процессах агрегации комплекса. Раствор седиментационно неустойчив, образование осадка фиксируется без охлаждения.

На фиг. 4 показана фотография раствора порфирина и его комплекса с ssDNA. Раствор порфирина является оптически прозрачным, комплекс порфирина с ssDNA окрашен, четко виден образующийся осадок.

На фиг. 5 показан результат изменения электронных спектров поглощения в области полосы Соре (а) и спектров флуоресценции (б) раствора индивидуального порфирина и при добавлении раствора фибрилл ДНК тимуса теленка (ctDNA). В порфириновый раствор (концентрация 1⋅10^-5 моль/л), объемом 2 мл, дозировался раствор ctDNA (объем дозы 5 мкл, суммарный объем 20 мкл). При внесении первых доз ctDNA, раствор становится седиментационно неустойчив, образование осадка фиксируется без охлаждения.

На фиг. 6 показана фотография раствора порфирина и его комплекса с ctDNA. Раствор порфирина является оптически прозрачным, комплекс порфирина с ctDNA окрашен, четко виден образующийся осадок.

На фиг. 7 представлено фото раствора фибрилл ДНК тимуса теленка после добавления заявляемого порфирина.

Заявленное соединение получают следующим образом.

Вначале получают 4-(1'-метилиндол-2'-ил)бензальдегид следующим образом:

В круглодонную колбу помещают 3 г 4-бромбензальдегида (16,2 ммоль), 1 мл 1-метилиндола (0,81 ммоль), 1,32 г ацетата натрия (16,2 ммоль), 28 мг(20 мол.%) хлорида палладия и 20 мл диметилацетамида. Реакционную смесь нагревают при 130 °С в течение 20 часов. Далее реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выливают в 200 мл холодной воды. Выпавший маслянистый остаток экстрагируют 100 мл хлористого метилена, растворитель упаривают. Очистку 4-(1'-метилиндол-2'-ил)бензальдегида проводят с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 2% раствор этилацетат в гексане). Выход 1,48 г (78%). R_f 0,44 (силуфол, EtOAc:гексан - 1:9); ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ(ppm) 3,80 (с, 3H), 6,69 (с, 1H), 7,18 (т, 1H, J = 6,8 Гц), 7,30 (т, 1H, J = 6,2 Гц), 7,39 (д, 1H, J = 8,4 Гц), 7,66-7,71 (м, 3H), 7,98 (д, 2H, J = 8,4 Hz), 10,08 (s, 1H); Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 235,28 [М]+. C₁₆H₁₃NO. М 235,31.

Затем получают 5-[4'-(1ʺ-метилиндол-2ʺ-ил)фенил]-10,15,20-трис(3'-пиридил)порфирин:

В трёхгорловую круглодонную колбу, снабжённую обратным холодильником, трубкой для подвода воздуха и капельной воронкой, помещают 200 мл пропионовой кислоты и 15 мл (0,12 моль) пропионового ангидрида, 0,3 г (1,127 ммоль) 4-(1'-метилиндол-2'-ил)бензальдегида, 318 мкл (3,825 ммоль) 3-пиридилкарбоксальдегида, 601 мкл пиррола (5,1 ммоль) и нагревают до кипения при пропускании воздуха. Смесь кипятят 1,5 часа при пропускании воздуха. Пропионовую кислоту отгоняют под вакуумом на водяной бане. Остаток в колбе разбавляют 100 мл метанола и 15 мл концентрированного раствора аммиака (25%). Осадок порфирина отфильтровывают, промывают метанолом и высушивают при комнатной температуре до постоянного веса. Для очистки порфирин растворяют в 100 мл дихлорметана и хроматографируют на оксиде алюминия III степени активности по Брокману, элюируя дихлорметаном и собирают третью фракцию 5-[4'-(1ʺ-метилиндол-2ʺ-ил)фенил]-10,15,20-трис(3'-пиридил)-порфирина. Выход: 0,342 г (9%). ЭСП (дихлорметан, λ_max, нм (lgε): 421 (5,98), 516 (4,12), 553 (3,83), 591 (3,99), 642 (3,56). Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃), δ, м. д. (J, Гц): 9,49 с (3H, H²′, Py); 9,10 д (3H, H⁶′, Py, J 5,5); 8,97 д (2H, H^8,12, J 4,5); 8,90 с (4H, H^3,7,13,17); 8,59 д (2H, H^2,18, J 4,5); 8,45 д (3H, H⁴′, Py, J 5,5); 8,18 д (2H, H^{2′′,6′′}, Ph, J 6,0); 7,80–7,81 м (5H, H⁵′, Py, H^3′′,5′′, Ph); 7,71 д (1Н индол); 7,55 д (1Н индол); 7,41 т (1Н индол); 7,27 т (1Н индол); 6,71 с (1Н индол); 3,84 с (3H-CH₃ индол); –2,76 с (2H, NH). Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 746,86 [М]+. C₅₀H₃₄N₁₈. М 748,12.

Получение заявляемого соединения – 5-[4'-(1ʺ-метилиндол-2ʺ-ил)фенил]-10,15,20-трис(N-метилпиридин-3'-ил)порфирин трииодида

В круглодонную колбу помещают 0,1 г (0,133 ммоль) 5-[4'-(1ʺ-метилиндол-2ʺ-ил)фенил]-10,15,20-трис(3'-пиридил)-порфирина, 0,1 мл (0,092 ммоль) метилиодида и 30 мл ДМФА и кипят в течение 1 ч. Раствор охлаждают и разбавляют бензолом, 1:1. Осадок отфильтровывают, промывают последовательно бензолом, ацетоном и высушивают при комнатной температуре до постоянного веса. Выход 0,153 г (98%). ЭСП (вода), λ_max, нм (lgε): 418 (6,01), 516 (4,13), 551 (4,43), 582 (4,59), 644 (4,62). Спектр ЯМР ¹H (ДМСO-d6), δ, м. д. (J, Гц): 9,51 с (3H, H²′, Py), 9,10 д (3H, H⁶′, Py, J 5,4), 9,02 д (2H, H^8,12, J 4,4), 8,90 с (4H, H^3,7,13,17), 8,57 д (2H, H^2,18, J 4,4), 8,44 д (3H, H4′, Py, J 5,5), 8,27 д (2H, H^2′′,6′′, Ph, J 5,9), 7,82–7,80 м (5H, H⁵′, Py, H^{3′′,5′′}, Ph); 7,72 д (1Н индол); 7,67 д (1Н индол); 7,32 т (1Н индол); 7,18 т (1Н индол); 6,98 с (1Н индол); 4,69 с (9H, CH₃N пиридилы), 4,11 с (3H-CH₃ индол); –3,02 с (2H, NH). Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 1172,68 [М]+. C₅₃H₄₃I₃N₈. М 1172,69.

Пример применения заявляемого соединения

Готовят концентрированный раствор 5-[4'-(1ʺ-метилиндол-2ʺ-ил)фенил]-10,15,20-трис(N-метилпиридин-3'-ил)порфирин трииодида в Трис-буфере, для этого навеску соединения массой 0,00113 г растворяют в 4,8 мл раствора Трис буфера рН = 7,4. Полученный раствор с концентраций 2⋅10^-4 моль/л хранят в герметичной таре в свето-защищенном месте.

Пример 1. Раствор порфиринового соединения может быть использован в медицине, клинической лабораторной диагностике, биохимии, молекулярной биологии, вирусологии, пищевой промышленности, криминалистике для выделения олигонуклеотидов, например, поли[d(AT)2] или поли[d(GC)2].

Для этого 2 мл водного раствора порфирина с концентрацией 1⋅10^-5 моль/л титруют анализируемым раствором, содержащим олигонуклеотид поли[d(AT)2] или поли[d(GC)2]. По электронным спектрам поглощения, либо по спектрам флуоресценции, либо по спектрам отражения фиксируют образования комплекса. Для ЭСП это гипохромность полосы Соре не менее 40%, по спектрам флуоресценции – уменьшение интенсив флуоресценции на 5-10% и смещение полос на 10-15 нм, по спектрам отражение – увеличение интенсивности светорассеяния. Полученный раствор выдерживают при температуре 6-8 °С для формирования осадка. При хранение раствора при температуре 4 °С визуально видно выпадение коричневого осадка – комплекса 5-[4'-(1ʺ-метилиндол-2ʺ-ил)фенил]-10,15,20-трис(3'-N-метилпиридил)порфирин трииодида с полиолигонуклеотидом (фиг. 1). Для ускорения процесса раствор центрифугируют в течение 5 мин с использованием лабораторной центрифуги 1000 об/мин.

Пример 2. Раствор порфиринового соединения может быть использован в медицине, клинической лабораторной диагностике, биохимии, молекулярной биологии, вирусологии, пищевой промышленности, криминалистике для выделения нуклеиновых кислот различной молекулярной массы, в том числе высокомолекулярной ДНК. Причем с увеличением молекулярной массы нуклеотида процесс седиментации протекает быстрее и не требует выдержки раствора при низкой температуре.

Для этого в раствор порфиринового соединения дробно небольшими порциями добавляют анализируемый раствор ДНК. Для контроля состояния процесса целесообразно осуществлять данную процедуру в спектрофотометрической кювете, регистрируя электронные спектры поглощения или спектры флуоресценции, или спектры светоотражения. Образование комплекса в случае высокомолекулярной ДНК можно наблюдать визуально – образование взвеси, непрозрачность раствора (фиг. 7) или по спектрофотометрическим кривым. Для ЭСП это гипохромность полосы Соре не менее 40%, для спектров флуоресценции – уменьшение интенсивности флуоресценции на 5-10% и смещение полос на 10-15 нм, для спектров отражение – увеличение интенсивности светорассеяния.

Для высокомолекулярной ДНК образование осадка фиксируют без охлаждения.

Таким образом, заявляемое соединение позволяет осаждать из раствора олигонуклеотиды и нуклеиновые кислоты различной молекулярной массы, в том числе высокомолекулярные ДНК, за счет образования с ними соответствующих комплексов.

Изобретение относится к химической промышленности, а именно к получению соединения, которое может быть использовано в медицине, клинической лабораторной диагностике, биохимии, молекулярной биологии, вирусологии, пищевой промышленности, криминалистике в качестве комплексообразующего реагента ДНК, олигонуклеотидов, приводящего к агрегации нуклеиновых кислот и образованию осадка. Предложен 5-[4'-(1''-метилиндол-2''-ил)фенил]-10,15,20-трис(N-метилпиридин-3'-ил)порфирин трииодид формулы, указанной ниже, а также его применение для осаждения нуклеиновых кислот из раствора. Техническим результатом изобретения является получение нового водорастворимого порфирина с высоким выходом, проявляющего свойство осадителя нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов из раствора. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 2 пр.

1. 5-[4'-(1''-Метилиндол-2''-ил)фенил]-10,15,20-трис(N-метилпиридин-3'-ил)порфирин трииодид формулы:

2. Применение 5-[4'-(1''-метилиндол-2''-ил)фенил]-10,15,20-трис(N-метилпиридин-3'-ил)порфирин трииодида для осаждения нуклеиновых кислот из растворов.