ЛЕЧЕНИЕ Т-КЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ Российский патент 2025 года по МПК A61K39/395 A61K31/282 A61K31/7068 G01N33/53 A61P35/02 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № US 62/795194, поданной 22 января 2019, описание которой полностью включено в данную заявку посредством ссылки, включая любые фигуры.

Ссылка на перечень последовательностей

Настоящая заявка подана вместе с Перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла, названного «KIR-9 PCT_ST25», созданного 14 января 2020 г., размер которого составляет 54 Кб. Информация в электронном формате о Перечне последовательностей полностью включена в данную заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к применению нацеленных на KIR3DL2 агентов для диагностики и лечения T-клеточных лимфом.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

KIR3DL2/CD158k представляет собой рецептор на поверхности клетки, который экспрессируется на субпопуляциях здоровых NK и CD8+ T-лимфоцитов в кровотоке. KIR3DL2, тем не менее, также был обнаружен на поверхности злокачественных T-клеток, особенно злокачественных CD4+ T-клеток, и, следовательно, также стал мишенью для лечения T-клеточных лимфом (ТКЛ).

Экспрессирующие KIR3DL2 ТКЛ включают кожные T-клеточные лимфомы (КТКЛ), такие как фунгоидный микоз (ФМ) и синдром Сезари (СС) (см., например, публикации PCT WO2010/081890 (Innate Pharma) и WO02/50122 (INSERM)), а также периферические T-клеточные неходжкинские лимфомы (см., например, публикацию PCT WO2014/128221, Innate Pharma). Хотя ФМ и СС относительно редки, ПТКЛ составляют от 15% до 20% от агрессивных лимфом и от 7% до 10% от всех неходжкинских лимфом (НХЛ) в западных странах. Они обычно встречаются у пациентов от среднего до пожилого возраста, и проявления характеризуются диссеминированным поражением у 68% пациентов, с системными симптомами у почти половины из них (45%), вовлечением костного мозга (КМ) у четверти (25,8%) и внеузловым поражением у трети (37%). Несмотря на агрессивную терапию, более половины пациентов погибают от заболевания. Хотя при лечении некоторых особых нозологических форм наблюдают улучшение прогностических признаков, прогноз для множества агрессивных ПТКЛ остается относительно неизменным при применении курсов химиотерапии второго и третьего поколения, и 5-летняя общая выживаемость (ОВ) все еще остается, например, между 25% и 47% для ПТКЛ-БДУ.

Антитела, которые специфично связываются с KIR3DL2, хорошо известны в данной области. Innate Pharma, например, описала множество антител против KIR3DL2, направленных на диапазон различных эпитопов на KIR3DL2, например, антитела 15C11, 19H12, 22B2, 18B10, 12B11, 13H1, 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 и 20E9, описанные в публикациях PCT № WO2014/044681 и WO2014/044686. Клинические испытания, проведенные Innate Pharma, продемонстрировали положительные результаты для антитела против KIR3DL2 у пациентов-людей с фунгоидным микозом и синдромом Сезари. В частности, результаты для рефрактерных пациентов с СС выявили сильную клиническую активность при лечении многократными введениями одного агента IPH4102 (опосредующего АЗКЦ антитела против KIR3DL2), продемонстрированную частотой общего ответа (ЧОО) 42,9%, медианой продолжительности ответа (ПрО) 13,8 месяцев и медианой выживаемости без прогрессирования (ВБП) 11,7 месяцев. Данные обнадеживающие результаты, более того, с незначительным количеством побочных эффектов и способностью удалять злокачественные экспрессирующие KIR3DL2 клетки, не вызывая удаление здоровых экспрессирующих KIR3DL2 NK- и T-клеток, привели к существенному прогрессу в лечении ТКЛ. Тем не менее, у некоторых пациентов выявляли прогрессирующее заболевание, и/или они не достаточно отвечали на первичное лечение.

Следовательно, в данной области существует потребность в улучшенной пользе для пациентов с ТКЛ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение возникло, среди прочего, благодаря открытию, что каждый из гемцитабина и оксалиплатина может вызывать повышенную экспрессию KIR3DL2 в злокачественных T-клетках, и что когда данные агенты комбинируют с антителом, удаляющим KIR3DL2, они приводят к сильному повышению способности иммунных клеток (NK-клеток) удалять злокачественные T-клетки.

Интересно, что не только каждый из гемцитабина и оксалиплатина по-отдельности повышал экспрессию KIR3DL2 на клетках ТКЛ, но и комбинация гемцитабин + оксалиплатин вызывала еще большее повышение экспрессии KIR3DL2 на клетках ТКЛ. Также наблюдали, что тройная комбинация гемцитабин + оксалиплатин + антитело против KIR3DL2 приводила к сильной способности иммунных клеток (NK-клеток) удалять злокачественные T-клетки по сравнению с указанными агентами отдельно. Гемцитабин (или аналоги нуклеозидов) и/или оксалиплатин (или другие соединения платины), следовательно, можно применять для усиления активности антитела против KIR3DL2, или, в частности, для усиления способности антитела против KIR3DL2 индуцировать уничтожение клеток ТКЛ лимфоцитами (например, T-клетками, NK-клетками).

Комбинация гемцитабина и/или соединения на основе платины с антителом против KIR3DL2, следовательно, может обеспечить особенно эффективное лечение пациентов, страдающих ТКЛ (например, ТКЛ с экспрессией KIR3DL2, ПТКЛ, КТКЛ, СС или ФМ).

Гемцитабин (ГЕМЗАР®) одобрен как нуклеозидный метаболический ингибитор, и одобрен для множества карцином, включая:

- в комбинации с карбоплатином, для лечения распространенного рака яичников, который рецидивировал по меньшей мере через 6 месяцев после завершения терапии на основе платины,

- в комбинации с паклитакселом, в качестве терапии первой линии метастатического рака молочной железы после неэффективности предшествующей содержащей антрациклин адъювантной химиотерапии, если только антрациклины не были клинически противопоказаны,

- в комбинации с цисплатином, для лечения немелкоклеточного рака легкого, и

- в качестве монотерапии для лечения рака поджелудочной железы.

Оксалиплатин (ЭЛОКСАТИН®) представляет собой агент на основе платины, одобренный для:

- адъювантной терапии III стадии рака толстого кишечника у пациентов, которым провели полную резекцию первичной опухоли, и

- лечения распространенного колоректального рака.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложены улучшенные способы опосредования противоопухолевого иммунного ответа, направленного против экспрессирующей KIR3DL2 злокачественной T-клетки, путем применения антител, которые связывают KIR3DL2, в комбинации с агентом или лечением (например, химиотерапевтическим агентом), которое стимулирует или повышает экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки.

В одном аспекте настоящего изобретения предложены улучшенные способы усиления противоопухолевого иммунного ответа путем применения антитела, способного связывать KIR3DL2, в комбинации со средствами для стимуляции или повышения экспрессии KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки. В одном варианте реализации указанным средством для стимуляции или повышения экспрессии KIR3DL2 является фармацевтическая композиция, содержащая химиотерапевтический агент (например, аналог нуклеозида и/или агент на основе платины) и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте настоящего изобретения предложено антитело, которое связывает KIR3DL2, для применения в лечении ТКЛ, причем антитело, которое связывает KIR3DL2, вводят в комбинации с агентом, который стимулирует или повышает экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен агент, который стимулирует или повышает экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки, для применения в лечении ТКЛ, причем указанный агент, который стимулирует или повышает экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки, вводят в комбинации с антителом, которое связывает KIR3DL2.

В одном варианте реализации предложен способ лечения или предотвращения возникновения клетки ТКЛ у индивида, указанный способ включает введение индивиду: (a) агента, который стимулирует или повышает экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки, и (b) антитела, которое связывает KIR3DL2.

В одном варианте реализации предложен способ усиления противоопухолевого действия антитела, которое связывает KIR3DL2, указанный способ включает введение индивиду агента, который стимулирует или повышает экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки.

В одном варианте реализации агент или средство для стимуляции или повышения экспрессии KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки представляет собой агент на основе платины. В одном варианте реализации агент или средство для стимуляции или повышения экспрессии KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки представляет собой ингибитор метаболизма нуклеозидов, необязательно гемцитабин или его аналог или производное. В одном варианте реализации агент или средство для стимуляции или повышения экспрессии KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки представляет собой комбинацию агента на основе платины и метаболического ингибитора нуклеозидов (например, гемцитабина или его аналога или производного).

В одном варианте реализации антитело, которое связывает KIR3DL2, представляет собой антитело, которое опосредует или направляет опосредованный эффекторной клеткой лизис экспрессирующей KIR3DL2 клетки (например, злокачественной T-клетки). В одном варианте реализации антитело содержит домен Fc, способный опосредовать АЗКЦ и/или антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЗКФ). В одном варианте реализации антитело экспрессируется на поверхности иммунной эффекторной клетки (например, как часть химерного антигенного рецептора на иммунной эффекторной клетке). Необязательно, антитело представляет собой моноспецифическое или мультиспецифическое (например, биспецифическое) антитело, которое направляет АЗКЦ и/или АЗКФ на экспрессирующую KIR3DL2 клетку. В любом аспекте антитело, которое связывает полипептид KIR3DL2 и способно удалять экспрессирующие KIR3DL2 клетки, можно охарактеризовать как композицию, способную удалять экспрессирующие KIR3DL2 клетки, причем указанная композиция содержит антитело, которое связывает полипептид KIR3DL2. В одном варианте реализации антитело, которое связывает KIR3DL2, представляет собой лакутамаб.

В одном аспекте любого варианта реализации в данной заявке, может быть уточнено, что индивид представляет собой человека.

В одном варианте реализации каждый из антитела против KIR3DL2 и агента или средства для стимуляции или повышения экспрессии KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки вводят в терапевтически эффективном количестве.

В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 вводят индивиду, страдающему раком, в количестве и с частотой, достаточными для опосредования АЗКЦ в отношении экспрессирующих KIR3DL2 опухолевых клеток.

В одном варианте реализации агент или средство для стимуляции или повышения экспрессии KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки вводят индивиду, страдающему раком, в количестве и с частотой, достаточной, чтобы вызвать повышение экспрессии KIR3DL2 на поверхности злокачественных T-клеток.

В любом аспекте в данной заявке, индивид, которого лечат в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой индивида, который не дает клинического ответа, или у которого наблюдали частичный или неполный ответ на предшествующее лечение ТКЛ.

В других вариантах реализации предложены способы прогнозирования или оценки эффективности или пригодности противоракового агента для комбинированного применения с антителом, которое связывает полипептид KIR3DL2, для лечения ТКЛ, указанный способ включает определение или оценку (например, in vitro), способен ли противораковый агент вызывать или повышать экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки, причем определение того, что противораковый агент способен вызывать или повышать экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки, свидетельствует о том, что указанный агент можно применять для лечения рака в комбинации с антителом против KIR3DL2. Определение или оценка того, способен ли противораковый агент вызывать или повышать экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественной T-клетки, может включать, например, приведение злокачественных экспрессирующих KIR3DL2 T-клеток (например, опухолевых клеток) в контакт с агентом in vitro и оценку экспрессии KIR3DL2. В одном варианте реализации противораковый агент представляет собой химиотерапевтический агент, необязательно аналог нуклеозида или агент на основе платины.

Данные аспекты более полно описаны далее, и дополнительные аспекты, особенности и преимущества должны быть очевидны из описания настоящего изобретения, представленного в данной заявке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показана цитотоксичность антитела против KIR3DL2 по отношению к линии клеток ТКЛ HUT78 (синдром Сезари), Противоопухолевая активность антитела против KIR3DL2 возрастала под влиянием каждого из гемцитабина и оксалиплатина, и еще сильнее - комбинации из гемцитабина и оксалиплатина.

На фигуре 2 показано, что гемцитабин и оксалиплатин повышают экспрессию на поверхности клетки KIR3DL2 в опухолевых клетках. RAJI-KIR3DL2 (48 часов инкубации) (фигура 2, панель слева) или Hut 78 (трансфицированная линия клеток B-НХЛ; 24 часа инкубации (фигура 2, панель справа) инкубировали с возрастающими дозами гемцитабина и оксалиплатина. Медиану интенсивности флуоресценции KIR3DL2 на поверхности клеток опухолевой линии анализировали с помощью проточной цитометрии.

На фигуре 3 показана выживаемость мышей (n = 9 на группу), которым привили в/в Raji-KIR3DL2, и которых лечили дважды в неделю: МАТ изотипического контроля, IPH4102 (0,3 мкг на инъекцию), гемцитабином (50 мг/кг) или оксалиплатином (5 мг/кг), обоими IPH4102 + гемцитабином или обоими IPH4102 + оксалиплатином.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке употребление единственного числа означает один или более. В пункте(-ах) формулы изобретения, при использовании вместе с термином «включающий», употребление единственного числа может означать один или более чем один. В данной заявке «другой» может означать по меньшей мере второй или более.

При использовании термина «включающий», его необязательно можно заменить на «состоящий по существу из» или «состоящий из».

Во всех случаях, когда во всем тексте настоящей заявки упоминают «лечение ТКЛ» или тому подобные термины в отношении направленного против KIR3DL2 связывающего агента (например, антитела), это означает: (a) способ лечения ТКЛ, указанный способ включает этап введения (для по меньшей мере одного лечения) направленного против KIR3DL2 связывающего агента (например, в фармацевтически приемлемом материале носителя) теплокровному животному, в частности, человеку, нуждающемуся в таком лечении, в дозе, которая позволяет лечение ТКЛ (терапевтически эффективном количестве), например, в дозе (количестве), указанной в данной заявке выше и ниже; (b) применение направленного против KIR3DL2 связывающего агента для лечения ТКЛ, или направленный против KIR3DL2 связывающий агент для применения для указанного лечения (особенно человека); (c) применение направленного против KIR3DL2 связывающего агента для производства фармацевтического состава для лечения ТКЛ, способ применения направленного против KIR3DL2 связывающего агента для производства фармацевтического состава для лечения ТКЛ, включающий смешивание направленного против KIR3DL2 связывающего агента с фармацевтически приемлемым носителем, или фармацевтический состав, содержащий эффективную дозу направленного против KIR3DL2 связывающего агента, который подходит для лечения ТКЛ; или (d) любую комбинацию a), b) и c), в соответствии с объектом изобретения, допустимым для патентования в стране, где подана настоящая заявка.

Термин «антитело» в данной заявке относится к поликлональным и моноклональным антителам. В зависимости от типа константного домена в тяжелых цепях, антитела относят к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них дополнительно подразделяются на подклассы или изотипы, такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и тому подобные. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара содержит одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50 - 70 кДа). На N-конце каждой цепи находится вариабельная область из приблизительно 100 - 110 или более аминокислот, которая, главным образом, отвечает за распознавание антигена. Термины вариабельная область легкой цепи (V_L) и вариабельная область тяжелой цепи (V_H) относятся к данным легкой и тяжелой цепям, соответственно. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют «альфа», «дельта», «эпсилон», «гамма» и «мю», соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. IgG является типичным классом антител, используемым в данной заявке, так как они представляют собой наиболее распространенные антитела в физиологических условиях и так как их наиболее легко получить в лабораторных условиях. В одном варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело. Предложены гуманизированные, химерные, человеческие или другим образом подходящие для человека антитела. В объем термина «антитела» входят полноразмерные антитела, а также любой фрагмент или производное любого из описанных в данной заявке антител.

Термин «гипервариабельный участок», используемый в данной заявке, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельный участок, как правило, содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 24 - 34 (L1), 50 - 56 (L2) и 89 - 97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31 - 35 (H1), 50 - 65 (H2) и 95 - 102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat и др. 1991) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26 - 32 (L1), 50 - 52 (L2) и 91 - 96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26 - 32 (H1), 53 - 55 (H2) и 96 - 101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia и Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917), или аналогичной системы определения необходимых аминокислот, отвечающих за связывание антигена. Обычно нумерацию аминокислотных остатков в данной области осуществляют согласно способу, описанному в Kabat и др., выше. Формулировки, такие как «положение по Кабату», «нумерация остатков вариабельного домена по Кабату» и «согласно Кабату», в данной заявке относятся к данной системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При использовании системы нумерации по Кабату, фактическая линейная последовательность аминокислот пептида может содержать меньшее количество аминокислот или содержать дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52a согласно Кабату) после остатка 52 в CDR H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b, 82c и т.д. согласно Кабату) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Кабату можно определить для данного антитела путем выравнивания на участках гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной по Кабату последовательностью.

Под «каркасом» или остатками «FR» в данной заявке подразумевают область вариабельного домена антитела за исключением областей, называемых CDR. Каждый каркас вариабельного домена антитела можно дополнительно подразделить на непрерывные участки, разделенные участками CDR (FR1, FR2, FR3 и FR4). Термины «домен Fc», «часть Fc» и «Fc-область» относятся к C-концевому фрагменту тяжелой цепи антитела, например, с приблизительно аминокислоты (АК) 230 по приблизительно АК 450 тяжелой цепи γ (гамма) человека или эквивалентной ей последовательности в другом типе тяжелых цепей антител (например, α, δ, ε и μ для антител человека), или к встречающемуся в природе его аллотипу. Если не указано иное, по всему тексту настоящего описания используют общепринятую нумерацию аминокислот по Кабату для иммуноглобулинов (см. Kabat и др. (1991), Sequences of Protein of Immunological Interest, 5ое изд., Служба общественного здравоохранения Соединенных Штатов, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд).

Термин «специфично связывается» означает, что антитело может связываться в конкурентном анализе связывания с партнером по связыванию, например, KIR3DL2, что оценивают, применяя либо рекомбинантные формы белков, либо их эпитопы, либо нативные белки, присутствующие на поверхности выделенных клеток-мишеней. Анализы конкурентного связывания и другие способы определения специфического связывания дополнительно описаны ниже и хорошо известны в данной области.

Если указано, что антитело «конкурирует с» конкретным моноклональным антителом, то это означает, что антитело конкурирует с указанным моноклональным антителом в анализе связывания с применением либо рекомбинантной молекулы KIR3DL2, либо экспрессированных на поверхности молекул KIR3DL2. Например, если тестируемое антитело уменьшает связывание AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11 с полипептидом KIR3DL2 или экспрессирующей KIR3DL2 клеткой в анализе связывания, то говорят, что антитело «конкурирует», соответственно, с AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11.

Термин «аффинность» в данной заявке означает силу связывания антитела с эпитопом. Аффинность антитела задается константой диссоциации Kd, которую определяют как [АТ] x [АГ]/[АТ-АГ], где [АТ-АГ] представляет собой молярную концентрацию комплекса антитело-антиген, [АТ] представляет собой молярную концентрацию несвязанного антитела и [АГ] представляет собой молярную концентрацию несвязанного антигена. Константу сродства K_a определяют как 1/Kd. Способы определения аффинности МАТ можно найти в Harlow, и др., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1988), Coligan и др., ред., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. и Wiley Interscience, Нью-Йорк, (1992, 1993), и Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), указанные ссылочные материалы полностью включены в данную заявку посредством ссылки. Одним стандартным способом, хорошо известным в данной области, для определения аффинности МАТ является применение скрининга методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (такого как анализ с помощью аналитического устройства для ППР BIAcore™).

«Детерминанта» означает сайт взаимодействия или связывания на полипептиде.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте и представляет собой область или участок на антигене, с которым связывается антитело. Эпитоп белка может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, а также аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическим антигенсвязывающим антителом или пептидом, т.е. аминокислотные остатки внутри «области узнавания» антитела. Это наиболее простая форма или наименьшая структурная область на сложной молекуле антигена, которая может соединяться, например, с антителом или рецептором. Эпитопы могут быть линейными или конформационными/структурными. Термин «линейный эпитоп» означает эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, которые являются смежными на линейной последовательности аминокислот (в первичной структуре). Термин «конформационный или структурный эпитоп» означает эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, не все из которых являются смежными, и, следовательно, представляет собой разделенные части линейной последовательности аминокислот, которые сближаются друг с другом благодаря укладке молекулы (вторичной, третичной и/или четвертичной структурам). Конформационный эпитоп зависит от трехмерной структуры. Термин «конформационный», следовательно, часто используют взаимозаменяемо с термином «структурный».

Термин «деплеция», «удалять» или «обеднять» по отношению к экспрессирующим KIR3DL2 клеткам означает процесс, способ или соединение, которые могут убивать, уничтожать, лизировать или вызывать такое уничтожение, элиминирование или лизис (например, посредством индукции АЗКЦ или АЗКФ), чтобы отрицательно влиять на количество экспрессирующих KIR3DL2 клеток, присутствующих в образце или в субъекте.

Термины «иммуноконъюгат», «конъюгат антитела», «конъюгат антитела с лекарственным средством» и «ADC» используют взаимозаменяемо, и они относятся к антителу, которое конъюгировано с другой молекулой (например, любой не являющейся антителом молекулой, терапевтическим агентом, цитотоксической молекулой или меткой).

Термин «агент» в данной заявке используют для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов. Термин «терапевтический агент» относится к агенту, который обладает биологической активностью.

Термин «антителозависимая клеточная цитотоксичность» или «АЗКЦ» является термином, который хорошо понимают в данной области, и он относится к опосредованной клетками реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR), распознают связанное антитело на целевой клетке, а затем вызывают лизис целевой клетки. Неспецифические цитотоксические клетки, которые опосредуют АЗКЦ, включают естественные клетки-киллеры (NK), макрофаги, моноциты, нейтрофилы и эозинофилы.

Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу или главным образом свободен от компонентов, которые обычно сопутствуют ему при нахождении в нативном состоянии. Чистоту и гомогенность обычно определяют, применяя методики аналитической химии, такие как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок, который является преобладающим видом, присутствующим в составе, является по существу очищенным.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в данной заявке по отношению к полимеру из аминокислотных остатков. Указанные термины распространяются на полимеры аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков являются искусственными химическими миметиками соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также на встречающиеся в природе полимеры аминокислот и не встречающийся в природе полимер аминокислот.

Термин «рекомбинантный», когда его используют по отношению, например, к клетке, или нуклеиновой кислоте, белку или вектору, указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что указанная клетка происходит из клетки, модифицированной таким образом. Следовательно, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаруживают внутри нативной (нерекомбинантной) формы клетки, или экспрессируют нативные гены, которые иным образом аномально экспрессируются, экспрессируются на пониженном уровне или вовсе не экспрессируются.

В рамках контекста данной заявки, термин антитело, которое «связывает» полипептид или эпитоп, означает антитело, которое связывает указанную детерминанту со специфичностью и/или аффинностью.

Термин «идентичность» или «идентичный», когда его используют для обозначения взаимосвязи между последовательностями двух или более полипептидов, относится к степени родства последовательностей между полипептидами, которую определяют по количеству совпадений между цепочками из двух или более аминокислотных остатков. «Идентичность» является мерой процента идеальных совпадений в меньшей из двух или более последовательностей при выравнивании с гэпами (если они нужны), который определяют с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (т.е. «алгоритмов»). Идентичность родственных полипептидов можно легко рассчитать с помощью известных способов. Такие способы включают, но не ограничены способами, описанными в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., изд., Oxford University Press, Нью-Йорк, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ред., Academic Press, Нью-Йорк, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть 1, Griffin, A. M., и Griffin, H. G., ред., Humana Press, Нью-Джерси, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. и Devereux, J., ред., M. Stockton Press, Нью-Йорк, 1991; и Carillo и др., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

Способы определения идентичности разработаны, чтобы определить наибольшее совпадение между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Способы с применением компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают пакет программ GCG, включающий GAP (Devereux и др., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и в других источниках (BLAST Manual, Altschul и др. NCB/NLM/NIH Бетесда, Мэриленд. 20894; Altschul и др., выше). Для определения идентичности также можно применять хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.

Лечение T-клеточных злокачественных новообразований.

В данной заявке описаны способы, полезные для лечения и предотвращения ТКЛ у индивида путем введения агентов, которые вызывают или повышают экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественных T-клеток, для усиления активности антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2. Схемы лечения и способы, описанные в данной заявке, можно применять для различных T-клеточных лимфом, в частности, для CD4+ T-клеточных лимфом. В любом аспекте может быть уточнено, что ТКЛ представляет собой ТКЛ, для которой характерны злокачественные клетки, которые экспрессируют KIR3DL2 на своей поверхности.

В данной заявке показано, что гемцитабин (Гемзар®, Eli Lilly and Company) может вызывать или повышать экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественных T-клеток. Гемцитабин представляет собой аналог нуклеозида, одобренный в качестве химиотерапии для лечения солидных опухолей. Аналогично фторурацилу и другим аналогам пиримидинов, указанное лекарственное средство замещает один из структурных элементов нуклеиновых кислот, в данном случае цитидин, в процессе репликации ДНК. Соответственно, гемцитабин и его аналоги и производные можно применять для усиления активности антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2.

В данной заявке показано, что оксалиплатин может вызывать или повышать экспрессию KIR3DL2 на поверхности злокачественных T-клеток. Оксалиплатин и другие агенты на основе платины хорошо известны в данной области и включают, например, цисплатин, карбоплатин, недаплатин, фенантриплатин, пикоплатин, сатраплатин. Соответственно, агенты на основе платины можно применять для усиления активности антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2.

Агент на основе платины и/или агент гемцитабин может находиться в любой подходящей конфигурации или составе, включая, например, нахождение в виде свободного соединения или в составе конъюгата, состава с наночастицами, в инкапсулированной форме (например, в липосоме), в каждом случае необязательно дополнительно в комбинации с дополнительными фармацевтически активными агентами.

Соответственно, в одном аспекте предложены способы лечения индивида, страдающего ТКЛ, где указанный способ включает введение индивиду эффективного количества каждого из: (a) антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, и (b) агента на основе платины и/или гемцитабина. В одном варианте реализации указанный способ включает введение индивиду антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, агента на основе платины (например, оксалиплатина) и гемцитабина. В другом варианте реализации указанный способ включает введение индивиду антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, и агента на основе платины (например, оксалиплатина), без введения или применения в комбинации с гемцитабином. В другом варианте реализации указанный способ включает введение индивиду антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, и гемцитабина, без введения или применения в комбинации с оксалиплатином. В другом варианте реализации указанный способ включает введение индивиду антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, и гемцитабина, без введения или применения в комбинации с агентом на основе платины.

В одном варианте реализации агент на основе платины (например, оксалиплатин) и/или гемцитабин вводят в количестве, эффективном, чтобы вызвать повышение экспрессии полипептидов KIR3DL2 на поверхности злокачественных клеток.

В одном аспекте предложены способы повышения экспрессии полипептидов KIR3DL2 на поверхности злокачественных клеток, необязательно клеток ТКЛ (например, in vitro или in vivo у индивида, страдающего ТКЛ), где указанный способ включает приведение в контакт злокачественных клеток с эффективным количеством агента на основе платины и/или гемцитабина. В одном варианте реализации способ дополнительно включает этап удаления экспрессирующих KIR3DL2 злокачественных клеток (например, имеющих повышенную экспрессию KIR3DL2), причем указанный этап включает приведение в контакт злокачественных клеток с эффективным количеством антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2.

Комбинированная терапия для лечения рака, предложенная в данной заявке, может включать введение: (a) антитела, удаляющего KIR3DL2 (например, связывающего KIR3DL2 антитела или фрагмента антитела, эффекторной клетки, экспрессирующей на своей поверхности химерный активирующий рецептор (например, T-клеточный рецептор), содержащий связывающий KIR3DL2 фрагмент антитела), и (b) агента на основе платины, необязательно оксалиплатина, для лечения индивида, страдающего T-клеточным злокачественным новообразованием, необязательно CD4+ T-клеточным злокачественным новообразованием.

В другом варианте реализации комбинированная терапия для лечения рака, предложенная в данной заявке, включает введение: (a) антитела, удаляющего KIR3DL2 (например, связывающего KIR3DL2 антитела или фрагмента антитела, эффекторной клетки, экспрессирующей на своей поверхности химерный активирующий рецептор (например, T-клеточный рецептор), содержащий связывающий KIR3DL2 фрагмент антитела), и (b) аналога нуклеозида, необязательно гемцитабина, для лечения индивида, страдающего T-клеточным злокачественным новообразованием, необязательно CD4+ T-клеточным злокачественным новообразованием.

В другом варианте реализации комбинированная терапия для лечения рака, предложенная в данной заявке, включает введение: (a) антитела, удаляющего KIR3DL2 (например, связывающего KIR3DL2 антитела или фрагмента антитела, эффекторной клетки, экспрессирующей на своей поверхности химерный активирующий рецептор (например, T-клеточный рецептор), содержащий связывающий KIR3DL2 фрагмент антитела), и (b) агента на основе платины, необязательно оксалиплатина, и (c) аналога нуклеозида, необязательно гемцитабина, для лечения индивида, страдающего T-клеточным злокачественным новообразованием, необязательно CD4+ T-клеточным злокачественным новообразованием.

Предложены способы терапии для лечения индивидов, страдающих ТКЛ, предрасположенных к ТКЛ или перенесших ТКЛ. В одном варианте реализации ТКЛ представляет собой агрессивную или распространенную ТКЛ (например, стадии IV, или, в более общем случае, выше II стадии). В одном варианте реализации у пациента наблюдается рецидивирующее или рефрактерное заболевание. В одном варианте реализации у пациента наблюдается плохой прогноз прогрессирования заболевания (например, плохой прогноз выживаемости), наблюдается плохой прогноз для ответа на терапию, или наблюдается прогрессирующее или рецидивирующее заболевание после предшествующего лечения с помощью предшествующей терапии.

В одном варианте реализации ТКЛ представляет собой агрессивное T-клеточное новообразование. В одном варианте реализации ТКЛ представляет собой агрессивную некожную ТКЛ. В другом варианте реализации ТКЛ представляет собой агрессивную кожную ТКЛ, необязательно первичную кожную CD4+ мелко/среднеклеточную T-клеточную лимфому или первичную CD8+ мелко/среднеклеточную T-клеточную лимфому. В одном варианте реализации ТКЛ представляет собой кожную T-клеточную лимфому (КТКЛ). В одном варианте реализации ТКЛ представляет собой периферическую T-клеточную лимфому (ПТКЛ), необязательно некожную ПТКЛ. Необязательно может быть уточнено, что ПТКЛ и ПТКЛ-БДУ представляют собой заболевания, отличные от кожных T-клеточных лимфом.

Кожная T-клеточная лимфома (КТКЛ) (см. изображение ниже) представляет собой группу лимфопролиферативных расстройств, для которых характерна локализация опухолевых T-лимфоцитов в коже. В совокупности, КТКЛ классифицируют как тип неходжкинской лимфомы (НХЛ). Классификация КТКЛ согласно Всемирной организации здравоохранения и Европейской организации по исследованию и лечению рака (ВОЗ-EORTC) описана в Willemze и др. (2005) Blood 105:3768-3785. ВОЗ-EORTC подразделяет КТКЛ на КТКЛ с вялотекущим клиническим поведением и КТКЛ агрессивных подтипов. В третью категорию входят новообразования из гематологических клеток-предшественников, которые не являются T-клеточными лимфомами (CD4+/CD56+ гематодермальное новообразование, лимфома из бластных клеток-естественных киллеров (NK) или первичные кожные новообразования, происходящие из B-клеток). КТКЛ, у которых может наблюдаться вялотекущее клиническое поведение, включают фунгоидный микоз (ФМ) и его варианты, первичное кожное CD30+ лимфопролиферативное расстройство (например, первичную кожную анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфоматоидный папулез), подкожную панникулит-подобную Т-клеточную лимфому (предварительный диагноз) и первичную кожную CD4+ мелко/среднеклеточную плеоморфную T-клеточную лимфому (предварительный диагноз). КТКЛ с агрессивным клиническим поведением включают синдром Сезари (СС), T-клеточный лейкоз/лимфому взрослых, внеузловую NK/T-клеточную лимфому, назальный тип, первичную кожную периферическую T-клеточную лимфому, неуточненную, первичную кожную агрессивную эпидермотропную CD8+ T-клеточную лимфому (предварительный диагноз) и кожную гамма/дельта-положительную T-клеточную лимфому (предварительный диагноз). Способы, описанные в данной заявке, можно применять для лечения каждого из данных состояний.

Наиболее распространенными КТКЛ являются ФМ и СС. Их особенности описаны, например, в обзоре Willemze и др. (2005) Blood 105:3768-3785, содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки. В большинстве случаев ФМ, диагностику проводят благодаря их клиническим особенностям, анамнезу заболевания и результатам гистоморфологического и цитоморфологического исследования. Дополнительным диагностическим критерием, позволяющим отличить КТКЛ от воспалительных дерматозов, является обнаружение доминантного клона T-клеток в образцах биопсии кожи с помощью молекулярного анализа (например, саузерн-блоттинга, полимеразной цепной реакции (ПЦР)). Генетическое тестирование также можно рассмотреть. Классический фунгоидный микоз подразделяется на три стадии: (1) пятно (атрофическое или неатрофическое): неспецифический дерматит, пятна на нижней части туловища и ягодицах; с минимальным/отсутствующим зудом; (2) бляшка: сильно зудящие бляшки, лимфаденопатия, и (3) опухоль: склонная к изъязвлению. Синдром Сезари определяют по эритродермии и лейкозу. Признаки и симптомы включают отечную кожу, лимфаденопатию, ладонный и/или подошвенный гиперкератоз, алопецию, дистрофию ногтей, эктропию и гепатоспленомегалию. Критерии для диагностирования синдрома Сезари обычно включают абсолютное количество клеток Сезари, иммунофенотипические аномалии, утрату T-клеточных антигенов и/или присутствие T-клеточного клона в периферической крови, показанное молекулярными или цитогенетическими методами.

Стадии КТКЛ включают I, II, III и IV, в соответствии с классификацией TNM, и в соответствующих случаях, с вовлечением периферической крови. Присутствие в периферической крови клеток фунгоидного микоза или синдрома Сезари (ФМ/СС) коррелирует с более распространенной кожной стадией, вовлечением лимфатических узлов и внутренних органов и сокращенной выживаемостью. Для ФМ и СС создана официальная система стадирования, предложенная Международным обществом по кожным лимфомам (ISCL) и Европейской организацией по исследованию и лечению рака (EORTC). См. Olsen и др., (2007) Blood. 110(6):1713-1722; и Agar и др. (2010) J. Clin. Oncol. 28(31):4730-4739, содержания которых включены в данную заявку посредством ссылки.

В одном варианте реализации ТКЛ представляет собой периферическую T-клеточную лимфому (ПТКЛ), необязательно некожную ПТКЛ. Необязательно может быть уточнено, что ПТКЛ и ПТКЛ-БДУ представляют собой заболевания, отличные от кожных T-клеточных лимфом - синдрома Сезари и фунгоидного микоза, которые считают различными патологиями. В одном варианте реализации ПТКЛ является узловой (например, большей частью или преимущественно узловой) ПТКЛ. Преимущественно узловые ПТКЛ включают, среди прочих, ПТКЛ-БДУ (периферические T-клеточные лимфомы, без дополнительных уточнений), анапластические крупноклеточные лимфомы (АККЛ) и ангиоиммунобластные T-клеточные лимфомы (АИТЛ). Например, ПТКЛ может представлять собой агрессивную некожную преимущественно узловую ПТКЛ (у указанного заболевания дополнительно может быть внеузловое проявление).

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой внеузловую (например, большей частью внеузловую) ПТКЛ. Например, ПТКЛ может представлять собой агрессивную некожную внеузловую ПТКЛ.

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой T-клеточный лейкоз или лимфому взрослых (ТЛВ), например, HTLV+ ТЛВ.

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой внеузловую NK-/T-клеточную лимфому назального типа. В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой ассоциированную с энтеропатией T-клеточную лимфому.

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой печеночно-селезеночную T-клеточную лимфому, необязательно печеночно-селезеночную αβ T-клеточную лимфому, необязательно печеночно-селезеночную γδ T-клеточную лимфому.

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой анапластическую крупноклеточную лимфому (АККЛ), необязательно ALK+ АККЛ, необязательно ALK- АККЛ. У ALK+ АККЛ, как правило, благоприятный прогноз при применении обычной терапии (93% 5-летняя выживаемость), но у ALK- АККЛ плохой прогноз (37%). Для АККЛ, как правило, характерная равномерная экспрессия CD30 на поверхности. В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой ангиоиммунобластную T-клеточную лимфому (АИТЛ), необязательно кожную АИТЛ, необязательно первичную кожную CD4+ мелко/среднеклеточную T-клеточную лимфому или первичную CD8+ мелко/среднеклеточную T-клеточную лимфому, необязательно некожную АИТЛ.

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой лимфому кишечника, например, АККЛ кишечника.

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой T-клеточный пролимфоцитарный лейкоз.

В одном варианте реализации ПТКЛ представляет собой ПТКЛ-БДУ (периферическую T-клеточную лимфому, без дополнительных уточнений). ПТКЛ-БДУ, также называемые ПТКЛ-Н или неуточненными ПТКЛ, представляют собой агрессивные лимфомы, преимущественно узлового типа, но часто встречается вовлечение внеузловых очагов. Большинство узловых случаев являются CD4⁺ и CD8⁻, и CD30 может экспрессироваться в крупноклеточных вариантах. У большинства пациентов с ПТКЛ-БДУ присутствует узловое вовлечение; тем не менее, множество внеузловых очагов также могут быть вовлечены (например, печень, костный мозг, желудочно-кишечный тракт, кожа). В исследованиях, как правило, сообщают о 5-летней общей выживаемости, составляющей приблизительно 30% - 35%, при применении стандартной химиотерапии. В прошлом было описано множество определенных нозологических форм, соответствующих узнаваемым подтипам T-клеточного новообразования, таких как лимфома Ленерта, Т-клеточная лимфома тимуса, плеоморфная T-клеточная лимфома и T-иммунобластная лимфома, но доказательства того, что они соответствуют отдельным клинико-патологическим нозологическим формам, все еще отсутствуют. По этой причине предложенная недавно Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) классификация гематопоэтических и лимфоидных новообразований собрала указанные лимфомы в одну общую категорию ПТКЛ-БДУ/Н. Следовательно, может быть уточнено, что ПТКЛ-БДУ исключает некоторые особые клинико-патологические нозологические формы, такие как T-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, ТЛВ/T-клеточный лейкоз взрослых, внеузловой NK-/T-клеточный лейкоз назального типа, ЭТЛВ/энтеропатический тип T-клеточной лимфомы, печеночно-селезеночная T-клеточная лимфома, подкожная панникулит-подобная Т-клеточная лимфома, АККЛ/анапластическая крупноклеточная лимфома и/или АИТЛ/ангиоиммунобластная T-клеточная лимфома.

Критерии диагностики ПТКЛ можно найти в стандартных медицинских руководствах, например, в соответствии с системой классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (см., например, Всемирная организация здравоохранения. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 4^е изд. Лион, Франция: IARC Press, 2008). См. также, например, Foss и др. (2011) Blood 117:6756-6767, содержания которых включены в данную заявку посредством ссылки.

В одном варианте реализации ТКЛ характеризуется опухолями или опухолевыми клетками, которые не экспрессируют значительное и/или детектируемое количество полипептидов CD30 на своей поверхности (CD30-отрицательная). В других вариантах реализации ТКЛ характеризуется опухолями или опухолевыми клетками, которые экспрессируют CD30 на своей поверхности (CD30-положительная); в одном варианте реализации опухоль или опухолевые клетки экспрессируют на своей поверхности низкие уровни CD30; в другом варианте реализации опухоли или опухолевые клетки экспрессируют на своей поверхности высокие уровни CD30. Необязательно, экспрессию CD30 определяют с помощью иммуногистохимии.

В одном типичном аспекте предложен способ снижения прогрессирования ТКЛ у хозяина-млекопитающего (например, пациента-человека), имеющего детектируемый уровень раковых клеток, включающий введение антитела против KIR3DL2, композиции с антителом против KIR3DL2 или сходной композиции (например, нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против KIR3DL2, композиции клеток, экспрессирующих фрагмент антитела против KIR3DL2), в количестве, достаточном для детектируемого снижения прогрессирования гематологического злокачественного новообразования у хозяина.

В одном типичном аспекте предложен способ лечения ТКЛ у индивида с плохим прогнозом заболевания и/или у которого произошел рецидив, который невосприимчив или нечувствителен к терапии первым терапевтическим агентом.

Диагноз ПТКЛ (например, ПТКЛ-БДУ) обычно ставят на основании исследования периферической крови или биоптата ткани на наличие гистологических признаков, с дополнительным развернутым анализом методом иммуногистохимии, проточной цитометрии, цитогенетики и молекулярной генетики. Исследование может включать, например, общий клинический анализ крови с подсчетом форменных элементов, тестирование функции почек и печени, определение лактатдегидрогеназы (ЛДГ), бета-2-микроглобулина, альбумина, кальция в сыворотке, мочевой кислоты, биопсию костного мозга, рентгенографию грудной клетки и компьютерную томографию (КТ) грудной клетки, живота и таза. Прогрессирование необязательно определяют путем оценки селективной клональной экспансии инициирующих клеток. Способы обнаружения рака и прогрессирования рака можно осуществить с помощью любой подходящей методики, несколько примеров которых известны в данной области. Примеры подходящих методик включают ПЦР и ПЦР-РВ (например, связанных с раковой клеткой генов или «маркеров»), биопсию, методики визуализации, кариотипирование и другой хромосомный анализ, иммуноанализ/иммуноцитохимические методики детектирования, гистологический и/или гистопатологический анализ, исследования кинетики в клетках и анализ клеточного цикла, проточную цитометрию и методики физикального обследования (например, для выявления физических симптомов).

Доставку антитела против KIR3DL2 субъекту (либо путем непосредственного введения в виде выделенного или очищенного антитела (например, антитела в растворе), либо в виде фрагмента антитела, экспрессированного CAR-клеткой, либо путем экспрессии с нуклеиновой кислоты в ней, такой как вектор для переноса генов на основе поксвируса, содержащий последовательность(-и) нуклеиновой(-ых) кислот(ы), кодирующую(-ие) антитело против KIR3DL2) и осуществление других способов в данной заявке можно применять для уменьшения, лечения, предотвращения или снижения выраженности любого подходящего аспекта прогрессирования рака (в частности, прогрессирования ТКЛ). Способы, описанные в данной заявке, могут быть особенно полезны для уменьшения и/или снижения выраженности роста опухоли (например, процента (опухолевых клеток по сравнению со здоровыми T-клетками), количества опухолевых клеток в кровотоке), и любого параметра или симптома, связанного с ним (например, биомаркеров). Способы, которые уменьшают, предотвращают или другим образом снижают выраженность таких аспектов прогрессирования рака, независимо и в совокупности, являются предпочтительными.

В дополнительном аспекте предложен способ активации ремиссии ТКЛ у хозяина-млекопитающего, такого как пациент-человек, включающий введение композиции, содержащей антитело против KIR3DL2, хозяину, чтобы вызвать ремиссию ТКЛ у хозяина.

В еще одном дополнительном аспекте предложен способ снижения риска развития ТКЛ, увеличения времени до возникновения ракового состояния и/или снижения тяжести ТКЛ, диагностированной на ранних стадиях, включающий введение хозяину профилактически эффективного количества антитела против KIR3DL2 или композиции с ним, чтобы добиться желательного(-ых) физиологического(-ых) действия(-й).

В дополнительном аспекте предложен способ повышения вероятности выживаемости в течение соответствующего периода человека-пациента, у которого диагностирована ТКЛ. В другом аспекте предложен способ улучшения качества жизни пациента с ТКЛ, включающий введение пациенту композиции в количестве, эффективном для улучшения качества его жизни. В дополнительном аспекте, способы, описанные в данной заявке, можно применять для значительного уменьшения количества клеток ТКЛ у позвоночного хозяина, так что, например, общее количество клеток ТКЛ снижается. В родственном контексте, предложен способ уничтожения (например, либо прямо, либо опосредованно вызывающий гибель) клеток ТКЛ у позвоночного, такого как страдающий раком пациент-человек.

В данной заявке дополнительное или комбинированное введение включает одновременное введение соединений в одной или различных лекарственных формах, или раздельное введение соединений (например, последовательное введение). Таким образом, связывающее KIR3DL2 антитело можно применять в комбинации с агентом на основе платины и/или гемцитабином. Например, антитело против KIR3DL2 и агент на основе платины и/или гемцитабин можно одновременно вводить в одном составе. В качестве альтернативы, антитело против KIR3DL2 и агент на основе платины и/или гемцитабин можно включить в состав для раздельного введения и вводить одновременно или последовательно.

Подходящая доза для введения гемцитабина представляет собой дозу, составляющую 800 - 1200 мг/м², которую вводят внутривенно. Введение гемцитабина можно повторять один раз в 2 недели. В качестве альтернативы, гемцитабин можно вводить в дни 1 и 8 3-недельного цикла (который можно повторить).

Подходящая доза для введения оксалиплатина представляет собой дозу, составляющую 75 - 150 мг/м² (например, 75 мг/м², 100 мг/м²,130 мг/м², 75 - 130 мг/м²), которую вводят внутривенно. Введение оксалиплатина можно повторять один раз в 2 недели, например, в дозе 75 - 100 мг/м² (например, 75 мг/м², 100 мг/м²). В качестве альтернативы оксалиплатин можно вводить один раз в три недели (например, в дни 1 и 8 3-недельного цикла, причем цикл можно повторять). Если оксалиплатин необходимо вводить один раз в три недели, то диапазон доз необязательно может быть выше, чем при введении один раз в две недели, например, доза 100 - 150 мг/м² (например, 100 мг/м², 130 мг/м²) для схемы приема один раз в три недели.

Как правило, лечение включает по меньшей мере один цикл введения (например, период восемь недель или менее), причем в каждом из по меньшей мере одного цикла вводят две, три или четыре дозы антитела против KIR3DL2 и вводят по меньшей мере две, три или четыре дозы агента на основе платины (например, оксалиплатина) и/или гемцитабина.

Гемцитабин и оксалиплатин можно вводить в тот же день (например, день 1), или гемцитабин, например, можно вводить в первый день (день 1), а затем оксалиплатин - на следующий день (день 2).

Подходящие протоколы терапии для лечения человека, страдающего ТКЛ (например, ПТКЛ, КТКЛ, ФМ или СС), включают, например, введение пациенту эффективного количества каждого из антитела против KIR3DL2 и гемцитабина, причем лечение включает по меньшей мере один цикл введения, в котором вводят по меньшей мере одну дозу, необязательно по меньшей мере две дозы антитела против KIR3DL2 (например, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в четыре недели), и вводят по меньшей мере одну дозу, необязательно по меньшей мере две дозы гемцитабина, причем необязательно гемцитабин вводят в дозе приблизительно 800 - 1200 мг/м² , необязательно приблизительно 800 - 1000 мг/м². Необязательно гемцитабин вводят один раз в 2 недели или в дни 1 и 8 повторяющегося 3-недельного цикла. Необязательно протокол лечения отличается тем, что в нем отсутствует комбинированное лечение с агентом на основе платины или оксалиплатином.

Типичные протоколы для лечения человека, страдающего ФМ или СС, могут включать, например, введение пациенту эффективного количества каждого из антитела против KIR3DL2 и гемцитабина, причем лечение включает по меньшей мере один цикл введения, в котором вводят по меньшей мере одну дозу, необязательно по меньшей мере две дозы антитела против KIR3DL2 (например, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в четыре недели), и вводят по меньшей мере одну дозу, необязательно по меньшей мере две дозы гемцитабина, причем гемцитабин вводят в дозе приблизительно 800 - 1200 мг/м² в недели 1, 2 и 3 (например, приблизительно в дни 1, 8 и 15) повторяющегося 4-недельного цикла. 4-недельный цикл можно повторять, например, в течение периода 3, 4, 5, 6 или более месяцев. Протокол может отличаться отсутствием комбинированного лечения с агентом на основе платины или оксалиплатином.

Дополнительные подходящие протоколы лечения человека, страдающего ТКЛ (например, ПТКЛ), включают, например, введение пациенту эффективного количества каждого из антитела против KIR3DL2 и оксалиплатина, причем лечение включает по меньшей мере один цикл введения, в котором вводят по меньшей мере одну дозу, необязательно по меньшей мере две дозы антитела против KIR3DL2 (например, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в четыре недели), и вводят по меньшей мере одну дозу, необязательно по меньшей мере две дозы оксалиплатина, необязательно при этом оксалиплатин вводят в дозе приблизительно 75 - 130 мг/м². Необязательно, оксалиплатин вводят один раз в 2 недели или один раз в 3 недели.

Другие подходящие протоколы лечения человека, страдающего ПТКЛ, включают, например, введение пациенту эффективного количества каждого из антитела против KIR3DL2, гемцитабина и оксалиплатина, причем лечение включает по меньшей мере один цикл введения, включающий введение:

- по меньшей мере одной дозы, необязательно по меньшей мере двух доз, антитела против KIR3DL2 (например, каждую неделю, каждые две недели, каждые четыре недели),

- по меньшей мере одной дозы, необязательно по меньшей мере двух доз, гемцитабина, необязательно при этом гемцитабин вводят в дозе приблизительно 800 - 1000 мг/м², необязательно при этом гемцитабин вводят один раз в 2 недели или в дни 1 и 8 повторяющегося 3-недельного цикла, и

- по меньшей мере одной дозы, необязательно по меньшей мере двух доз, оксалиплатина, необязательно при этом оксалиплатин вводят в дозе приблизительно 75 - 130 мг/м², необязательно при этом оксалиплатин вводят один раз в 2 недели или один раз в 3 недели (например, или в день 1 повторяющегося 3-недельного цикла). В одном варианте реализации каждый из оксалиплатина и гемцитабина вводят один раз в две недели, необязательно дополнительно в один и тот же день. В другом варианте реализации каждый из оксалиплатина и гемцитабина вводят каждые 3 недели, при этом оксалиплатин вводят в день 1 3-недельного периода и гемцитабин вводят в дни 1 и 8 3-недельного периода.

Должно быть очевидно, что цикл введения может представлять собой подходящий период времени, соответствующий частотам введения, описанным в данной заявке. Например, цикл введения может представлять собой период 4 недели, 8 недель, более 8 недель, менее 8 недель, и т.д.

В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 вводят в тот же день, что и гемцитабин и/или оксалиплатин. В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 вводят по меньшей мере через один день (например, через один, два, три дня) после введения гемцитабина. В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 вводят по меньшей мере через один день (например, через один, два, три дня) после введения оксалиплатина. В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 вводят по меньшей мере через один день (например, один, два, три, четыре, пять, шесть или семь дней) после введения обоих гемцитабина и оксалиплатина (например, по меньшей мере через один день после последнего введенного соединения).

Антитело против KIR3DL2 (например, гуманизированное антитело 2B12, известное как IPH4102 или лакутамаб) можно успешно вводить путем внутривенной инфузии в дозе 1 - 20 мг/кг массы тела, необязательно 1 - 10 мг/кг массы тела, или в фиксированной дозе 750 мг. Антитело против KIR3DL2 можно успешно вводить 1 - 4 раза в месяц, например, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в четыре недели. В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 вводят в соответствии со схемой приема, включающей первую фазу, во время которой антитело против KIRDL2 вводят еженедельно (например, четыре еженедельных введения), а затем вторую фазу, во время которой антитело против KIRDL2 вводят менее раза в неделю, например, 1 - 2 раза в месяц, один раз в две недели, один раз в месяц. В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 вводят в соответствии со схемой приема, включающей первую фазу, во время которой антитело против KIRDL2 вводят еженедельно (например, четыре еженедельных введения), а затем вторую фазу, во время которой антитело против KIRDL2 вводят один раз в две недели (например, по меньшей мере 2 последовательных введения, которые осуществляют один раз в две недели, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более введений, которые осуществляют один раз в две недели), а затем третью фазу, во время которой антитело против KIRDL2 вводят один раз в месяц (например, по меньшей мере 2 последовательных введения, которые осуществляют один раз в месяц, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более введений, которые осуществляют один раз в месяц).

При комбинировании с гемцитабином и оксалиплатином, можно уточнить, например, что способ лечения включает по меньшей мере один цикл введения (например, период восемь недель или менее, необязательно восемь недель, необязательно четыре недели), причем в каждом из по меньшей мере одного цикла вводят две, три или четыре дозы антитела против KIR3DL2 (например, гуманизированного антитела 2B12 в дозе 1 - 20 или 1 - 10 мг/кг массы тела, в фиксированной дозе 750 мг) и вводят по меньшей мере две, три или четыре дозы гемцитабина и оксалиплатина. Можно уточнить, что гемцитабин и оксалиплатин вводят в один и тот же день или в последовательные дни (например, оксалиплатин в дозе 75 - 130 мг/м² вводят в день после дня введения гемцитабина в дозе 800 - 1000 мг/м²). Можно уточнить, что связывающее KIR3DL2 антитело вводят в тот же день, что и гемцитабин и/или оксалиплатин, в последовательные дни до или после дня введения гемцитабина и/или оксалиплатина, или за несколько дней до или после дня введения гемцитабина и/или оксалиплатина.

В способах лечения, связывающее KIR3DL2 антитело и агент на основе платины и/или гемцитабин можно вводить раздельно, совместно или последовательно, или в составе смеси. В некоторых вариантах реализации связывающее KIR3DL2 антитело вводят до введения агента(-ов) на основе платины и/или гемцитабина. Например, связывающее KIR3DL2 антитело можно вводить приблизительно за 0 - 30 дней, необязательно за 1 - 7 дней, до введения гемцитабина, или за 0 - 30 дней, необязательно за 1 - 7 дней, до введения агента на основе платины. В некоторых вариантах реализации связывающее KIR3DL2 антитело вводят за от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня, или за приблизительно 1 - 5 дней до введения гемцитабина (или агента на основе платины). В некоторых вариантах реализации связывающее KIR3DL2 антитело вводят одновременно с введением агента на основе платины и/или гемцитабина. В некоторых вариантах реализации связывающее KIR3DL2 антитело вводят после введения агента(-ов) на основе платины и/или гемцитабина. Например, связывающее KIR3DL2 антитело можно вводить приблизительно через 0 - 30 дней, необязательно 1 - 7 дней, после введения агента(-ов) на основе платины и/или гемцитабина. В некоторых вариантах реализации связывающее KIR3DL2 антитело вводят через от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня, или через приблизительно 1 - 5 дней после введения агента(-ов) на основе платины и/или гемцитабина.

В одном варианте реализации антитело против KIR3DL2 и агент на основе платины и/или гемцитабин вводят в следующих дозах:

(a) 750 мг антитела против KIR3DL2 и (i) 75 - 130 мг/м² агента на основе платины (например, оксалиплатина) или (ii) 800 - 1200 мг/м² гемцитабина;

(b) 1 - 10 мг/кг или 750 мг антитела против KIR3DL2 и 75 - 130 мг/м² оксалиплатина;

(c) 1 - 10 мг/кг или 750 мг антитела против KIR3DL2 и 800 - 1200 мг/м² гемцитабина;

(d) 1 - 10 мг/кг или 750 мг антитела против KIR3DL2, 75 - 100 мг/м² оксалиплатина и 800 - 1000 мг/м² гемцитабина;

(e) 1 - 10 мг/кг или 750 мг антитела против KIR3DL2, 100 - 130 мг/м² оксалиплатина и 800 - 1000 мг/м² гемцитабина.

Также предложены наборы, например, наборы, которые содержат:

(i) фармацевтическую композицию, содержащую антитело против KIR3DL2, и фармацевтическую композицию, содержащую гемцитабин;

(ii) фармацевтическую композицию, содержащую антитело против KIR3DL2, и фармацевтическую композицию, содержащую агент на основе платины (например, оксалиплатин);

(iii) фармацевтическую композицию, содержащую антитело против KIR3DL2, фармацевтическую композицию, содержащую агент на основе платины (например, оксалиплатин), и фармацевтическую композицию, содержащую гемцитабин;

(iv) первую фармацевтическую композицию, содержащую антитело против KIR3DL2, и инструкции по введению указанного антитела против KIR3DL2 вместе с агентом на основе платины (например, оксалиплатином) и/или гемцитабином;

(v) фармацевтическую композицию, содержащую агент на основе платины (например, оксалиплатин) и/или гемцитабин, и инструкции по введению указанной композиции вместе с антителом против KIR3DL2;

(vi) фармацевтическую композицию, содержащую агент на основе платины (например, оксалиплатин), и инструкции по введению указанной композиции вместе с антителом против KIR3DL2 (и необязательно дополнительно с гемцитабином);

(vii) фармацевтическую композицию, содержащую гемцитабин, и инструкции по введению указанной композиции вместе с антителом против KIR3DL2 (и необязательно дополнительно с агентом на основе платины (например, оксалиплатином)).

Необязательно можно уточнить, что фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. Необязательно можно уточнить, что антитело против KIR3DL2, агент на основе платины и/или гемцитабин присутствуют в терапевтически эффективном количестве, пригодном для применения в любом из способов, описанных в данной заявке, необязательно в количестве, которое повышает уровни KIR3DL2 на поверхности злокачественных клеток ТКЛ. Наборы необязательно также могут содержать инструкции, например, включающие схемы введения, чтобы позволить пользователю (например, врачу, медицинской сестре или пациенту) вводить композицию, содержащуюся в нем, пациенту, страдающему раком (например, в частности, КТКЛ или ПТКЛ, описанными в данной заявке). В любом варианте реализации набор также может содержать шприц.

Необязательно, наборы содержат множество упаковок однодозовых фармацевтических композиций, каждая из которых содержит эффективное количество антитела против KIR3DL2, и/или агента на основе платины (например, оксалиплатина), и/или гемцитабина, для однократного введения в соответствии со способами, предложенными выше. Приспособления или устройства, необходимые для введения фармацевтической(-их) композиции(-й), также можно включить в состав наборов. Например, в наборе может быть предоставлен один или более предварительно наполненных шприцов или ампул, содержащих некоторое количество антитела против KIR3DL2, агента на основе платины или гемцитабина.

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен набор для лечения ТКЛ у пациента-человека, указанный набор содержит:

(a) дозу антитела против KIR3DL2, содержащего домены H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 вариабельной области тяжелой цепи с последовательностью, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 32 или 48 - 51, и домены L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 вариабельной области легкой цепи с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 33 или 43 - 47; и/или

(b) дозу агента на основе платины (например, оксалиплатина) и/или дозу гемцитабина; и

(c) необязательно инструкции по применению указанного антитела против KIR3DL2 и/или указанного агента на основе платины (например, оксалиплатина) и/или гемцитабина в любом из способов, описанных в данной заявке.

В одном варианте реализации лечение включает введение антитела против KIR3DL2, агента на основе платины (например, оксалиплатина) и гемцитабина без введения какого(-их)-либо дополнительного(-ых) противоракового(-ых) агента(-ов).

Должно быть очевидно, что способ лечения в соответствии с настоящим изобретением может включать или может не включать этап определения экспрессии KIR3DL2 в опухолевых клетках перед лечением. В любом варианте реализации экспрессию KIR3DL2 можно определить с помощью иммуногистохимии.

В одном варианте реализации способы включают: (a) определение того, страдает ли индивид ТКЛ, необязательно ПТКЛ; и (b) если индивид страдает ТКЛ, необязательно ПТКЛ, определение того, есть ли у индивида клетки ТКЛ, которые экспрессируют полипептид KIR3DL2. Определение того, что у индивида есть клетки ТКЛ, которые экспрессируют полипептид KIR3DL2, свидетельствует о том, что индивида можно лечить с помощью способа лечения в соответствии с настоящим изобретением. Необязательно способ включает этап введения индивиду лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением.

В одном варианте реализации полипептид KIR3DL2 экспрессируется в значительном количестве опухолевых клеток (например, клеток ТКЛ), взятых из данного пациента. Например, KIR3DL2 может присутствовать по меньшей мере в 30%, 40%, 50°%, 60%, 70%, 80% или большем проценте клеток ТКЛ, взятых из пациента.

Способ необязательно может дополнительно включать этап оценки уровня развития ТКЛ (стадирования заболевания), позволяющий провести оценку доли (например, процента) злокачественных клеток ТКЛ, присутствующих внутри некоторого компартмента организма пациента. В соответствии с данным способом, клетки из биологического образца, собранного из указанного компартмента организма, приводят в контакт с антителом против KIR3DL2, и измеряют опухолевые клетки (например, долю клеток), экспрессирующие полипептид KIR3DL2 на своей поверхности. Клетки могут представлять собой, например, CD4+ клетки или CD4-CD8+ клетки. Обнаружение того, что опухолевые клетки экспрессируют, или преимущественно экспрессируют, KIR3DL2, свидетельствует о том, что ТКЛ представляет собой агрессивную или распространенную ТКЛ (например, стадии IV, или, в более общем случае, выше II стадии). Такую ТКЛ можно успешно лечить, применяя способы лечения в соответствии с настоящим изобретением.

В любом варианте реализации способ может включать этап диагностики ТКЛ, включающий приведение клеток из биологического образца из индивида в контакт с антителом против KIR3DL2 и измерение доли (например, процента) T-клеток, экспрессирующих полипептид KIR3DL2 на своей поверхности, и сравнение такой доли со средней долей (например, процентом) T-клеток, экспрессирующих полипептид KIR3DL2 на своей поверхности, наблюдаемой у людей без ТКЛ (например, у здоровых людей), причем диагноз ТКЛ ставят, когда указанная измеренная доля значительно выше, чем указанная средняя доля.

В другом варианте реализации способы включают этап определения уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида KIR3DL2 в биологическом образце из индивида, которому осуществили введение агента на основе платины или гемцитина, например, на опухолевых клетках, обнаруженных в биологическом образце.

В другом варианте реализации способы включают этап определения того, повышает ли противораковый агент (например, агент на основе платины или гемцитин) уровень экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида KIR3DL2 в биологическом образце из индивида, например, на опухолевых клетках, обнаруженных в биологическом образце.

Определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида KIR3DL2 в биологическом образце может включать сравнение уровня с эталонным уровнем (например, значением, слабым окрашиванием поверхности клетки, и т.д.), соответствующим здоровому(-ым) индивиду(-ам) или индивиду(-ам) перед лечением противораковым агентом (например, агентом на основе платины или гемцитином). Определение того, что биологический образец экспрессирует нуклеиновую кислоту или полипептид KIR3DL2 на уровне, который повышен по сравнению с эталонным уровнем, свидетельствует о том, что индивид страдает ТКЛ, и ему может быть полезно лечение антителом против KIR3DL2, или необязательно что индивид страдает ТКЛ, и ему может быть полезно лечение антителом против KIR3DL2 в комбинации с противораковым агентом (например, агентом на основе платины и/или гемцитином, соответственно). Необязательно обнаружение полипептида KIR3DL2 в биологическом образце включает обнаружение полипептида KIR3DL2, экспрессированного на поверхности злокачественного лимфоцита.

Получение антител

KIR3DL2 (CD158k) представляет собой связанный дисульфидной связью гомодимер из молекул с тремя доменами Ig массой приблизительно 140 кДа, описанный в Pende и др. (1996) J. Exp. Med. 184: 505-518, содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки. Было описано несколько аллельных вариантов полипептидов KIR3DL2, каждый из которых входит в объем термина KIR3DL2. Последовательность аминокислот зрелого KIR3DL2 человека (аллель *002) представлена ниже в SEQ ID NO: 1 и соответствует номеру доступа в Genbank AAB52520, в котором лидерная последовательность из 21 аминокислотного остатка была опущена.

lmggqdkpf lsarpstvvp rgghvalqch yrrgfnnfml ykedrshvpi fhgrifqesf imgpvtpaha gtyrcrgsrp hsltgwsaps nplvimvtgn hrkpsllahp gpllksgetv ilqcwsdvmf ehfflhrdgi sedpsrlvgq ihdgvskanf sigplmpvla gtyrcygsvp hspyqlsaps dpldivitgl yekpslsaqp gptvqagenv tlscsswssy diyhlsrege aherrlravp kvnrtfqadf plgpathggt yrcfgsfral pcvwsnssdp llvsvtgnps sswpspteps sksgicrhlh vligtsvvif lfilllffll yrwcsnkkna avmdqepagd rtvnrqdsde qdpqevtyaq ldhcvfiqrk isrpsqrpkt pltdtsvyte lpnaeprskv vscprapqsg legvf (SEQ ID NO: 1).

кДНК KIR3DL2 (аллель *002) представлена под номером доступа в Genbank U30272. Последовательность аминокислот аллеля *003 KIR3DL2 человека представлена ниже и соответствует номеру доступа в Genbank AAB36593:

msltvvsmac vgffllqgaw plmggqdkpf lsarpstvvp rgghvalqch yrrgfnnfml ykedrshvpi fhgrifqesf imgpvtpaha gtyrcrgsrp hsltgwsaps npvvimvtgn hrkpsllahp gpllksgetv ilqcwsdvmf ehfflhregi sedpsrlvgq ihdgvskanf sigplmpvla gtyrcygsvp hspyqlsaps dpldivitgl yekpslsaqp gptvqagenv tlscsswssy diyhlsrege aherrlravp kvnrtfqadf plgpathggt yrcfgsfral pcvwsnssdp llvsvtgnps sswpspteps sksgicrhlh vligtsvvif lfilllffll yrwcsnkkna avmdqepagd rtvnrqdsde qdpqevtyaq ldhcvfiqrk isrpsqrpkt pltdtsvyte lpnaeprskv vscprapqsg legvf (SEQ ID NO : 2).

Также в объем настоящего изобретения входят любые последовательности нуклеиновых кислот или белков, обладающие одинаковыми одним или более биологическими свойствами или функциями с полноразмерным KIR3DL2 дикого типа, соответственно, и идентичные по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более по последовательности нуклеотидов или аминокислот.

Близко родственный KIR3DL1 (CD158e1) представляет собой мономерную молекулу массой приблизительно 70 кДа, описанную в Colonna и Samaridis (1995), Science 268 (5209), 405-408. кДНК, кодирующая полипептид KIR3DL1 (CD158e2) (аллель *00101), представлена под номером доступа в Genbank L41269; кодируемая последовательность аминокислот представлена под номером доступа в Genbank AAA69870. В одном варианте реализации полипептид KIR3DL1, на который ссылаются в данной заявке, представляет собой аллель *00101.

Примеры антител, которые связывают KIR3DL2 человека, включают антитела 19H12, 12B11, 10F6, 2B12, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 или 20E9. Данные и дополнительные антитела представлены в PCT/EP2013/069302 и PCT/EP2013/069293, обе из которых поданы 17 сентября 2013 г., описания указанных антител включены в данную заявку посредством ссылки. Данные антитела селективно связываются с KIR3DL2 и не связываются с KIR3DL1 (или KIR3DS1). Тогда как антитело 10F6, 2B12, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 или 20E9 можно применять, например, в качестве терапевтического агента, который вводят индивиду для удаления экспрессирующей KIR3DL2 мишени, например, путем индукции АЗКЦ, направленной на патогенную экспрессирующую KIR3DL2 клетку, антитела 12B11 и 19H12 будет полезны для применения для детектирования (например, в анализе in vitro) экспрессии KIR3DL2 на поверхности клеток, так как 12B11 и 19H12 позволяют особенно эффективно детектировать KIR3DL2-положительные клетки в анализе детектирования, 12B11 полезно для иммуногистохимического анализа с применением замороженных срезов ткани, тогда как 19H12 полезно для детектирования методом проточной цитометрии.

Каждое из 2B12, 10G5, 19H12 и 12B11 также подходит для применения в качестве терапевтического агента, который вводят индивиду для элиминирования экспрессирующих KIR3DL2 клеток-мишеней. 19H12 и 12B11, а также другие антитела, описанные в PCT/EP2013/069293, способны интернализоваться в клетки посредством KIR3DL2, и их можно успешно применять в качестве удаляющего (деплетирующего) антитела в конфигурации конъюгата антитела с лекарственным средством, например, когда антитело конъюгировано с токсичной молекулой. 2B12 и другие антитела, описанные в PCT/EP2013/069302, не вызывают какой-либо интернализации KIR3DL2 в опухолевые клетки, тем самым, они дают преимущество для применения в случаях, когда ищут опосредованную эффекторными клетками активность, например, для удаления антител, которые вызывают АЗКЦ.

Последовательности аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антител 10F6, 9E10, 10G5, 13H1, 1E2, 1C3 или 20E9 приведены в таблице A.

Таблица A

Антитело SEQ ID NO Последовательность аминокислот 10F6 VH 27 QIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASGYTFTIAGMQWVQKMPGKGLKWIGWINTHSGVPKYAEDFKGRFAFSLETSANIAYLQISNLKNEDTATYFCARGGDEGVMDYWGQGTSVTVS 10F6 VL 28 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYHQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDYTLTISALQAEDLALYYCQQHYNTPWTFGGGTKLEIK 9E10 VH 29 QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTDYNQKFKDKTTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGSTLTVSS 9E10 VL 30 EIVLTQSIPSLTVSAGERVTISCKSNQNLLWSGNQRYCLVWHQWKPGQTPTPLITWTSDRYSGVPDRFIGSGSVTDFTLTISSVQAEDVAVYFCQQHLHIPYTFGGGTKLEIK 13H1 VH 31 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASHYSFIGYTMNWVKQRHGKNLEWIGLINPYNGDTTYNQKFKGKASLTVDKSSSTAYMEILSLTSEDSAVYYCARENWGYPYAMDYWGQGTSVTVS 13H1 VL 62 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSRSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK 1E2 VH 63 QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMNWVKQSHAKSLEWIGVISTYYGDANYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCALIYYDYDGSYWGQGTTLTVS 1E2 VL 64 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPYTFGGGTKLEIK 1C3 VH 65 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARRYDGYYHFDYWGQGTTLTVS 1C3 VL 66 DIVMTQSPSSLAVTAGEKVTMSCKSSQSLLWSVNQKNYLSWYQQKQRQPPKLLIYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHAEDLAVYYCQHNHGSFLPLTFGSGTKLEIK 20E9 VH 67 QVQLQQSGAEVARPGASVKLSCKSSGFTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSITAYMQLSSLASEDSAVYYCARRGDYGNYGMDYWGQGTSVTVSS 20E9 VL 68 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNHFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK 10G5 VH 69 QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEW
IGYINPSSGYTENNRKFKDKTTLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQT 10G5 VL 70 DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK

В конкретном варианте реализации предложено антитело, которое связывает по существу такой же эпитоп или детерминанту, как и любое из моноклональных антител AZ158, 19B12, 10G5, 12B11, 10G5 или 2B12; необязательно антитело содержит антигенсвязывающую область из антитела AZ158, 10G5, 19B12, 12B11 или 2B12. В любом из вариантов реализации, описанных в данной заявке, антитело AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 или 2B12 можно охарактеризовать по его последовательности аминокислот и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ее. В одном варианте реализации моноклональное антитело содержит часть Fab или F(ab')₂ из AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 или 2B12. Также предложено моноклональное антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи из AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 или 2B12. Согласно одному варианту реализации моноклональное антитело содержит три CDR вариабельной области тяжелой цепи из AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 или 2B12. Также предложено моноклональное антитело, которое дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи из AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 или 2B12 или один, два или три CDR вариабельной области легкой цепи из AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 или 2B12. Необязательно любой один или более из указанных CDR легкой или тяжелой цепи может содержать одну, две, три, четыре или пять или более модификаций аминокислот (например, замен, вставок или делеций). Необязательно предложено антитело, в котором любая из вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи, содержащих часть или всю антигенсвязывающую область антитела AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 или 2B12, слита с константной областью иммуноглобулина типа IgG человека, необязательно с человеческой константной областью, необязательно изотипа IgG1 или IgG3 человека.

Связывающее KIR3DL2 антитело (или фрагмент антитела) для применения в лечении ТКЛ может, например, находиться в форме выделенной и/или очищенной белковой композиции, или оно может присутствовать на поверхности или быть связанным с поверхностью клетки (например, эффекторной CAR-клетки, такой как T-клетка, NK-клетка или NKT-клетка), или еще дополнительно в форме нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело, например, из вектора переноса генов на основе поксвируса или другого вируса, содержащего последовательность(-и) нуклеиновой(-ых) кислот(ы), кодирующую(-ие) антитело против KIR3DL2. Можно сконструировать клетку, экспрессирующую химерный антигенный рецептор (CAR). Сконструированы примеры CAR, которые содержат внеклеточное одноцепочечное антитело (scFv), слитое с внутриклеточным сигнальным доменом цепи дзета комплекса T-клеточного антигенного рецептора, и обладают способностью, когда они экспрессируются в эффекторных клетках, таких как T-клетки, NKT-клетки или NK-клетки, перенаправлять распознавание антигена (т.е. распознавание KIR3DL2) на основании специфичности моноклонального антитела. В одном аспекте предложены генно-инженерные иммунные клетки, которые экспрессируют и несут на поверхности мембраны клетки KIR3DL2-специфичный химерный иммунный рецептор, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, трансмембранный домен (ТМ) и KIR3DL2-специфичный внеклеточный домен (например, домен, полученный из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела, которое специфично связывается с KIR3DL2, например, одного из антител, описанных в данной заявке). Также предложены KIR3DL2-специфичные химерные иммунные рецепторы, конструкции ДНК, кодирующие указанные рецепторы, и плазмидные векторы экспрессии, содержащие указанные конструкции в подходящей для экспрессии ориентации.

В одном варианте реализации связывающее KIR3DL2 антитело включает антитело или фрагмент антитела, которое направляет АЗКЦ и необязательно дополнительно АЗКФ на экспрессирующую KIR3DL2 клетку.

В одном варианте реализации антитело, применяемое в любом варианте реализации, описанном в данной заявке, связывает полипептид KIR3DL2, причем необязательно антитело по существу не связывает полипептид KIR3DL1, отличается аффинностью связывания (K_D) с полипептидом KIR3DL2 человека менее (лучше) 100 нг/мл, необязательно от 1 до 100 нг/мл.

Антитело необязательно характеризуется EC₅₀ в анализе высвобождения ⁵¹Cr для лизиса опухоли HuT78 посредством МКПК из здоровых волонтеров, меньшей чем 100 нг/мл, необязательно от 1 до 100 нг/мл, необязательно от 1 до 50 нг/мл, необязательно от 25 до 75 нг/мл, необязательно приблизительно равной 50 нг/мл. Антитело необязательно отличается EC₅₀ в анализе высвобождения ⁵¹Cr для лизиса опухоли HuT78 посредством МКПК из здоровых волонтеров, сравнимой с таковой у антитела против KIR3DL2, описанного в данной заявке (например, имеет EC₅₀ ниже или в пределах 1-log или 0,5-log от EC₅₀ у антитела 2B12, описанного в данной заявке, содержащего VH с последовательностью SEQ ID NO 49: и VL с последовательностями SEQ ID NO: 44 или 45, содержащего домен Fc из дикого типа или модифицированного изотипа IgG1 человека, и которое опосредует АЗКЦ).

Антитело AZ158

AZ158 связывает полипептиды KIR3DL2 человека, а также KIR3DL1 человека (см. публикацию по PCT №WO2010/081890). VH AZ158 представлена ниже, где CDR 1, 2 и 3 подчеркнуты, соответственно:

QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT SFGVHWVRQP PGKGLEWLGV IWAGGSTNYN SALMSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQNDDT AMYYCARGNS NHYVSSFYYF DYWGQGTTLT VSS

(SEQ ID NO: 3).

VL AZ158 представлена ниже, где CDR 1, 2 и 3 подчеркнуты, соответственно:

DIQMTQSPSS LSASLGGKVT ITCKASQDIN KYIAWYQHKP GKGPRLLIHY TSTLQPGIPS RFSGSGSGRD YSFSISNLEP EDITTYYCLQ YDNLWTFGGG TKLEIK

(SEQ ID NO: 4).

Антитела против KIR3DL2 могут включать антитела, содержащие последовательности вариабельной области или CDR из таких антител AZ158 (например, вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи, слитую с человеческой константной областью; вариабельную область тяжелой цепи, слитую с константной областью тяжелой цепи IgG1 человека); в качестве альтернативы, антитела против KIR3DL2 могут представлять собой антитело, отличное от антител, содержащих последовательности вариабельной области или CDR из антитела AZ158.

Антитело 19H12

Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи антитела 19H12 представлена ниже:

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARNGNFGYYFDYWGQGTTLTVSS

(SEQ ID NO: 5).

Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи антитела 19H12 представлена ниже:

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASFSCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPSLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 6).

В одном аспекте предложен очищенный полипептид, который кодирует антитело, причем антитело содержит: участок HCDR1, содержащий последовательность аминокислот GYTFTNFGMN, представленную в SEQ ID NO: 9, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее (например, NFGMN (SEQ ID NO: 7), GYTFTN (SEQ ID NO: 8)), причем одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок HCDR2, содержащий последовательность аминокислот WINTYTGEPTYADDF, представленную в SEQ ID NO: 10, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее (например, WINTYTGE (SEQ ID NO: 11)), причем одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок HCDR3, содержащий последовательность аминокислот NGNFGYYFDY, представленную в SEQ ID NO: 12, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR1, содержащий последовательность аминокислот RSSQNIVHSNGNTYLE, представленную в SEQ ID NO: 13, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR2, содержащий последовательность аминокислот KVSNRFS, представленную в SEQ ID NO: 14, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; и/или участок LCDR3, содержащий последовательность аминокислот FQGSHVPFT, представленную в SEQ ID NO: 15, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно удалить или заменить на отличную аминокислоту, или где последовательность может содержать вставку одной или более аминокислот.

В другом аспекте предложено антитело, которое связывает KIR3DL2 человека, содержащее:

(a) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:5, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(b) вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 6, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(c) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 5, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 6, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(d) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), представленные в SEQ ID NO: 7 - 9, 10 - 11 и 12, соответственно, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(e) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), представленные в SEQ ID NO: 13, 14 или 15, соответственно, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(f) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), представленные в SEQ ID NO: 7, 8 или 9, 10 или 11 и 12, соответственно, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), представленные в SEQ ID NO: 13, 14 или 15, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(g) вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична вариабельной области, имеющей последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(h) вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична вариабельной области, имеющей последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту.

Антитело 12B11

Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи антитела 12B11 представлена ниже:

QLVQSGPELKNPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAHGPWLAYWGQGTLVTVS

(SEQ ID NO: 16).

Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи антитела 12B11 представлена ниже:

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINVYLSWFQQKPGKSPKTLIYRAIRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCLQYDELPYTFGGGTKLEIE

(SEQ ID NO: 17).

В одном аспекте предложен очищенный полипептид, который кодирует антитело, причем антитело содержит: участок HCDR1, содержащий последовательность аминокислот GYTFTNYGMN, представленную в SEQ ID NO: 20, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее (например, NYGMN (SEQ ID NO: 18), GYTFTN (SEQ ID NO: 19)), в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок HCDR2, содержащий последовательность аминокислот WINTYTGEPTYADDFKG, представленную в SEQ ID NO: 21, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее (например, WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 22)), в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок HCDR3, содержащий последовательность аминокислот GPWLAY, представленную в SEQ ID NO: 23, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR1, содержащий последовательность аминокислот KASQDINVYLS, представленную в SEQ ID NO: 24, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR2, содержащий последовательность аминокислот RAIRLVD, представленную в SEQ ID NO: 25, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR3, содержащий последовательность аминокислот LQYDELPYT, представленную в SEQ ID NO: 26, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно удалить или заменить на отличную аминокислоту.

В другом аспекте предложено антитело, которое связывает KIR3DL2 человека, содержащее:

(a) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 16, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(b) вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 17, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(c) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 16, в которой один или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 17, в которой одну, две, три или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(d) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), представленные в SEQ ID NO: 18, 19 или 20, 21 или 22 и 23, соответственно, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(e) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), представленные в SEQ ID NO: 24, 25 и 26, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(f) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), представленные в SEQ ID NO: 18, 19 или 20, 21 или 22 и 23, соответственно, в которых один или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), представленные в SEQ ID NO: 24, 25 и 26, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(g) вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична вариабельной области, имеющей последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(h) вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична вариабельной области, имеющей последовательность аминокислот SEQ ID NO: 17, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту.

Антитело 2B12

Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи антитела 2B12 представлена ниже (CDR согласно определению по Кабату подчеркнуты):

Q I Q L V Q S G P E L K K P G E T V R I S C K A S G Y T F T T A G M Q W V Q K T P G K G L K W I G W I N S H S G V P K Y A E D F K G R F A F S L E T S A S T A Y L Q I S T L K N E D T A T Y F C A R G G D E G V M D Y W G Q G T S V T V S

(SEQ ID NO: 32).

Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи антитела 2B12 представлена ниже (CDR по Кабату подчеркнуты):

D I V M T Q S H K F M S T S L G D R V S F T C K A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P G Q S P K L L I Y W T S T R H T G V P D R F T G S G S G T D Y T L T I S S V Q A E D L A L Y Y C Q Q H Y S T P W T F G G G T K L E I K

(SEQ ID NO: 33).

В одном аспекте предложен очищенный полипептид, который кодирует антитело, причем антитело содержит: участок HCDR1, содержащий последовательность аминокислот GYTFTTAGMQ, представленную в SEQ ID NO: 36, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее (например, GYTFTT (SEQ ID NO: 34), или TAGMQ (SEQ ID NO: 35)), в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок HCDR2, содержащий последовательность аминокислот WINSHSGVPKYAEDFKG, представленную в SEQ ID NO: 37, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее (например, WINSHSGVP (SEQ ID NO: 38)), в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок HCDR3, содержащий последовательность аминокислот GGDEGVMDY, представленную в SEQ ID NO: 39 (необязательно дополнительно содержащую остаток триптофана), или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR1, содержащий последовательность аминокислот KASQDVSTAVA, представленную в SEQ ID NO: 40, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR2, содержащий последовательность аминокислот WTSTRHT, представленную в SEQ ID NO: 41, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно заменить на отличную аминокислоту; участок LCDR3, содержащий последовательность аминокислот QQHYSTPWT, представленную в SEQ ID NO: 42, или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из нее, в которой одну или более из данных аминокислот можно удалить или заменить на отличную аминокислоту.

В другом аспекте предложено антитело, которое связывает KIR3DL2 человека, содержащее:

(a) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), представленные в SEQ ID NO: 34, 35 или 36 (HCDR1), 37 или 38 (HCDR2) и 39 (HCDR3), соответственно, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(b) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), представленные в SEQ ID NO: 40, 41 и 42, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(c) последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), представленные в SEQ ID NO: 34, 35 или 36 (HCDR1), 37 или 38 (HCDR2) и 39 (HCDR3), соответственно, в которых один или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и последовательности аминокислот CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), представленные в SEQ ID NO: 40, 41 и 42, в которых один, два, три или более аминокислотных остатков из любого CDR можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(d) вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична вариабельной области, имеющей последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 32 или 48 - 51, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту; и/или

(e) вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична вариабельной области, имеющей последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 33 или 43 - 47, в которой один, два, три или более аминокислотных остатков можно заменить на отличную аминокислоту.

В другом аспекте любого из вариантов реализации, описанных в данной заявке, любой из CDR 1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепи можно описать последовательностью из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот из него, и/или как имеющий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности конкретного CDR или набора CDR, приведенной в соответствующем SEQ ID NO.

В другом аспекте предложено антитело, которое конкурирует за связывание с KIR3DL2 с моноклональным антителом согласно (a) - (h), для любого из описанных выше антител.

Гуманизированные антитела

В другом аспекте, антитело против KIR3DL2, применяемое в способах лечения в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой гуманизированное антитело, например, гуманизированное антитело 2B12 или 10G5, содержащее VH и VL, выбранные из вариабельных областей 2B12 и 10G5, представленных ниже в таблице B.

Например, гуманизированное антитело 2B12 может содержать:

(a)CDR-H1, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 34, 35 или 36;

(b)CDR-H2, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 37 или 38;

(c)CDR-H3, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 39;

(d)CDR-L1, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40;

(e)CDR-L2, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41;

(f)CDR-L3, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42; и

(g)человеческие каркасные последовательности.

В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркас тяжелой цепи из человеческой подгруппы VH1 и/или VH7 вместе с JH6, необязательно указанные антитела содержат IGHV7-4-1*02 и/или IGHV1-c*01, вместе с IGHJ6*01. В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркас легкой цепи из человеческой подгруппы VK1 и/или VK4, необязательно IGKV4-1*01 и/или IGKV1-39*01, вместе с JH4, необязательно IGKJ4*01.

Необязательно человеческий каркас содержит одну или более мутаций, например, обратных мутаций.

В другом аспекте гуманизированные антитела содержат домен VH, идентичный по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или более процентов идентичный) последовательности домена VH гуманизированного 2B12 с последовательностями SEQ ID NO: 48 - 51. В другом конкретном аспекте гуманизированное антитело содержит: (a) домен VH, который содержит отличные от человеческих остатки CDR, включенные в человеческий домен VH, причем домен VH по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен гуманизированной VH 2B12 с последовательностями SEQ ID NO: 48 - 51, и (b) домен VL, который содержит отличные от человеческих остатки CDR, включенные в человеческий домен VL, причем домен VL по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен гуманизированной VL 2B12 с последовательностями SEQ ID NO: 43 - 47.

В другом аспекте гуманизированные антитела содержат домен VH, идентичный по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или более процентов идентичный) последовательности домена VH гуманизированного 10G5, представленной в SEQ ID NO: 57 - 61. В другом конкретном аспекте гуманизированное антитело содержит: (a) домен VH, который содержит отличные от человеческих остатки CDR, включенные в человеческий домен VH, причем домен VH по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен VH гуманизированного 10G5 с последовательностями SEQ ID NO: 57 - 61, и (b) домен VL, который содержит отличные от человеческих остатки CDR, включенные в человеческий домен VL, причем домен VL по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен VL гуманизированного 10G5 с последовательностями SEQ ID NO: 52 - 56.

Антитело 10G5 или 2B12 может дополнительно содержать нативный или сконструированный константный домен IgG человека. Необязательно константный домен представляет собой домен IgG1, необязательно дополнительно содержащий модификацию для повышения связывания с Fc-рецептором.

Таблица B

Домен антитела Последовательность аминокислот (SEQ ID NO) 2B12-L0 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 43) 2B12-L1 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 44) 2B12-L2 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 45) 2B12-L3 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 46) 2B12-L4 DIVMTQSHKFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 47) 2B12-H1 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKSPGQGLEWMGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 48) 2B12-H2 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 49) 2B12-H3 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKSPGQGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 50) 2B12-H4 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKTPGKGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFAFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO: 51) 10G5-L0 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLLYAATNLADGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 52) 10G5-L2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 53) 10G5-L3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 54) 10G5-L4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYTLTINSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 55) 10G5-L5 DIQMTQSPSSLSASVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYTLTINSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 56) 10G5-H0 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGYTEN NRKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 57) 10G5-H3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 58) 10G5-H4 QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSS
(SEQ ID NO: 59) 10G5-H5 QVQLVQSGAELARPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 60) 10G5-H6 QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSS
(SEQ ID NO: 61)

В одном варианте реализации гуманизированное моноклональное антитело 2B12 содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 49, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 44.

В одном варианте реализации гуманизированное моноклональное антитело 2B12 содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 49, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 45.

В одном варианте реализации гуманизированное моноклональное антитело 10G5 содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 58, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 53.

В одном варианте реализации гуманизированное моноклональное антитело 10G5 содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 59, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 53.

В одном варианте реализации гуманизированное антитело 2B12 представляет собой или содержит последовательность аминокислот тяжелой и легкой цепи антитела IPH4102 (Innate Pharma, Франция), также известного как лакутамаб (см. WHO Drug Information, том 32, № 4, 2018 г.). Лакутамаб представляет собой гуманизированное антитело 2B12 (содержащее CDR1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепи по Кабату из 2B12) и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 44.

Хотя должно быть очевидно, что можно применять любое подходящее антитело, в одном аспекте антитела, которые применяют, связываются с той же областью или участком, что и известное антитело против KIR3DL2, включая любое из антител против KIR3DL2, описанных в данной заявке. Антитела против KIR3DL2 могут связываться с эпитопом, который по меньшей мере частично перекрывается, или содержит по меньшей мере один остаток во фрагменте, соответствующем остаткам 1 - 192, остаткам 1 - 98 или остаткам 99 - 192 полипептида KIR3DL2 с последовательностью SEQ ID NO: 1 (или его подпоследовательности). В одном варианте реализации все главные остатки эпитопа находятся во фрагменте, соответствующем остаткам 1 - 192, остаткам 1 - 98 или остаткам 99 - 192 полипептида KIR3DL2 с последовательностью SEQ ID NO: 1. В одном варианте реализации антитела связывают эпитоп, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более остатков во фрагменте, соответствующем остаткам 1 - 192, 1 - 98 или 99 - 192 полипептида KIR3DL2 с последовательностью SEQ ID NO: 1. Предпочтительно остатки, которые связывает антитело, присутствуют на поверхности полипептида KIR3DL2.

Необязательно, антитела связывают эпитоп, содержащий остаток P179 и/или остаток S181 из последовательности SEQ ID NO: 1. Необязательно антитела связывают эпитоп, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 или более остатков, выбранных из группы, состоящей из: N99, H100, E130, H131, F132, V178, P179, H180, S181, P182, Y183 и/или остатка Q184 из последовательности SEQ ID NO: 1.

В PCT/EP2013/069302 и PCT/EP2013/069293 описано тестирование ряда мутантных человеческих полипептидов KIR3DL2. Связывание антител против KIR3DL2 с клетками, трансфицированными мутантами KIR3DL2, измеряли и сравнивали со способностью антитела против KIR3DL2 связывать полипептид KIR3DL2 дикого типа (SEQ ID NO: 1). Снижение связывания между антителом против KIR3DL2 и мутантным полипептидом KIR3DL2, используемым в данной заявке, означает, что присутствует снижение аффинности связывания (например, измеренной с помощью известных способов, таких как тестирование с помощью FACS клеток, экспрессирующих конкретного мутанта, или тестирование с помощью Biacore связывания с мутантными полипептидами) и/или снижение общей способности к связыванию у антитела против KIR3DL2 (например, о чем свидетельствует снижение Bmax на графике зависимости концентрации антитела против KIR3DL2 от концентрации полипептида). Значительное снижение связывания свидетельствует о том, что мутированный остаток непосредственно участвует в связывании с антителом против KIR3DL2 или находится в непосредственной близости от связывающегося белка, когда антитело против KIR3DL2 связано с KIR3DL2. Эпитоп антитела, следовательно, будет содержать такой остаток и может содержать дополнительные остатки, пространственно расположенные рядом с таким остатком.

В некоторых вариантах реализации значительное снижение связывания означает, что аффинность и/или способность к связыванию между антителом против KIR3DL2 и мутантным полипептидом KIR3DL2 снижена более чем на 40 %, более чем на 50 %, более чем на 55 %, более чем на 60 %, более чем на 65 %, более чем на 70 %, более чем на 75 %, более чем на 80 %, более чем на 85 %, более чем на 90% или более чем на 95% по сравнению со связыванием между антителом и полипептидом KIR3DL2 дикого типа (например, полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации связывание снижается ниже пределов обнаружения. В некоторых вариантах реализации значительное снижение связывания подтверждают, когда связывание антитела против KIR3DL2 с мутантным полипептидом KIR3DL2 составляет менее 50% (например, менее чем 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% или 10%) от связывания, наблюдаемого между антителом против KIR3DL2 и полипептидом KIR3DL2 дикого типа (например, внеклеточным доменом, представленным в SEQ ID NO: 1). Такие измерения связывания можно осуществить, применяя различные анализы связывания, известные в данной области. Конкретный пример одного такого анализа описан в разделе «Примеры».

В некоторых вариантах реализации для антител против KIR3DL2 выявляют значительно более низкое связывание с мутантным полипептидом KIR3DL2, в котором остаток в полипептиде KIR3DL2 дикого типа (например, SEQ ID NO: 1) заменен. Сокращенная форма записи, используемая в настоящем описании, представлена в следующем формате: остаток дикого типа: положение в полипептиде: мутантный остаток, причем нумерация остатков соответствует таковой в SEQ ID NO: 1.

Необязательно, антитела меньше связываются с полипептидом KIR3DL2, содержащим замену в остатках N99, H100, E130, H131, F132, V178, P179, H180, S181, P182, Y183 и/или остатке Q184 из последовательности SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах реализации антитело против KIR3DL2 связывает полипептид KIR3DL2 дикого типа, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, но связывается в меньшей степени с мутантным полипептидом KIR3DL2, содержащим любую одну или более (например, 1, 2, 3 или 4) из следующих мутаций: P179T и/или S181T (согласно SEQ ID NO: 1). В одном варианте реализации связывание с мутантным KIR3DL2 значительно снижалось по сравнению со связыванием с KIR3DL2 дикого типа.

В некоторых вариантах реализации антитела против KIR3DL2 проявляют значительно меньшее связывание с мутантным полипептидом KIR3DL2, в котором некоторый остаток во фрагменте, соответствующем остаткам 1 - 98, остаткам 99 - 292 или остаткам 99 - 192 (или их подпоследовательности) в полипептиде KIR3DL2 дикого типа (например, SEQ ID NO: 1), заменен на отличную аминокислоту.

В одном аспекте антитело может конкурировать с моноклональным антителом AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 или 12B11 и распознает, связывает или иммуноспецифично к по существу или фактически тому же, или к тому же, эпитопу или «эпитопному сайту» на молекуле KIR3DL2, что и моноклональное антитело AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 или 12B11. В других вариантах реализации моноклональное антитело состоит из антитела или представляет собой производное или фрагмент антитела AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 или 12B11.

Должно быть очевидно, что, хотя антитела могут связываться с тем же эпитопом, что и антитело AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 или 12B11, подходящие антитела могут распознавать и быть получены против любой части полипептида KIR3DL2, при условии, что антитело связывает KIR3DL2 и обладает желательными функциональными свойствами. Например, любой фрагмент KIR3DL2, например, KIR3DL2 человека, или любую комбинацию фрагментов KIR3DL2 можно применять в качестве иммуногенов для получения антител, и указанные антитела могут распознавать эпитопы в любом положении внутри полипептида KIR3DL2, при условии, что они могут это делать на экспрессирующих KIR3DL2 NK-клетках, описанных в данной заявке. В некотором варианте реализации распознаваемые эпитопы присутствуют на поверхности клетки, т.е. они доступны для антител, присутствующих снаружи клетки. Необязательно, эпитоп представляет собой эпитоп, который специфично распознается антителом AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 или 12B11. Кроме того, антитела, распознающие различные эпитопы внутри KIR3DL2, можно применять в комбинации, например, чтобы связываться с полипептидами KIR3DL2 с максимальной эффективностью и широтой среди различных индивидов.

Указанные антитела можно получить с помощью различных методик, известных в данной области. Обычно их получают путем иммунизации отличного от человека животного, необязательно мыши, иммуногеном, содержащим полипептид KIR3DL2, необязательно полипептид KIR3DL2 человека. Полипептид KIR3DL2 может содержать полноразмерную последовательность полипептида KIR3DL2 человека, или ее фрагмент или производное, обычно иммуногенный фрагмент, т.е. часть полипептида, содержащую эпитоп, выставленный на поверхности клетки, экспрессирующей полипептид KIR3DL2, необязательно эпитоп, распознаваемый антителом AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 или 12B11. Такие фрагменты обычно содержат по меньшей мере приблизительно 7 последовательных аминокислот последовательности зрелого полипептида, или по меньшей мере приблизительно 10 последовательных аминокислот из нее. Фрагменты обычно по существу получают из внеклеточного домена рецептора. В одном варианте реализации иммуноген включает полипептид KIR3DL2 дикого типа человека в липидной мембране, обычно на поверхности клетки. В одном варианте реализации иммуноген включает интактные клетки, особенно интактные клетки человека, необязательно обработанные или лизированные. В другом варианте реализации полипептид представляет собой рекомбинантный полипептид KIR3DL2.

Этап иммунизации антигеном отличного от человека млекопитающего можно осуществить любым способом, хорошо известным в данной области для стимулирования продукции антител в мыши (см., например, E. Harlow и D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк (1988), содержание которого полностью включено в данную заявку посредством ссылки). Иммуноген суспендируют или растворяют в буфере, необязательно с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда. Способы определения количества иммуногена, типа буферов и количеств адъюванта хорошо известны специалистам в данной области и ни коим образом не являются ограничивающими. Данные параметры могут отличаться для различных иммуногенов, но их легко выявить.

Аналогично, место и частота иммунизации, достаточные для стимуляции продукции антител, также хорошо известны в данной области. В обычном протоколе иммунизации отличным от человека животным вводят путем интраперитонеальной инъекции антиген в день 1 и снова приблизительно неделю спустя. Затем следуют вторичные инъекции антигена приблизительно в день 20, необязательно с адъювантом, таким как неполный адъювант Фрейнда. Вторичные инъекции проводят внутривенно, и их можно повторять в течение нескольких последовательных дней. Затем следует бустер-инъекция в день 40, либо внутривенно, либо интраперитонеально, обычно без адъюванта. Данный протокол приводит к получению антигенспецифических, продуцирующих антитела B-клеток приблизительно через 40 дней. Другие протоколы также можно применять, при условии, что они приводят к получению B-клеток, экспрессирующих антитело, направленное против антигена, используемого для иммунизации.

Для получения поликлональных антител получают сыворотку из иммунизированного отличного от человека животного, и антитела, присутствующие в ней, выделяют с помощью хорошо известных методик. Сыворотку можно очистить аффинным способом, используя любой из иммуногенов, описанных выше, связанных с твердой подложкой, с получением антител, которые реагируют с полипептидами KIR3DL2.

В альтернативном варианте реализации лимфоциты из неиммунизированного отличного от человека млекопитающего выделяют, растят in vitro, а затем приводят в контакт с иммуногеном в культуре клеток. Лимфоциты затем собирают, и осуществляют этап слияния, описанный ниже.

Для типичных моноклональных антител следующий этап состоит в выделении спленоцитов из иммунизированного отличного от человека млекопитающего и последующем слиянии данных спленоцитов с иммортализованной клеткой с получением продуцирующей антитело гибридомы. Выделение спленоцитов из отличного от человека млекопитающего хорошо известно в данной области и обычно включает удаление селезенки из анестезированного отличного от человека млекопитающего, разрезание ее на маленькие кусочки и выдавливание спленоцитов из капсулы селезенки через нейлоновую сетку клеточного сита в подходящий буфер, с получением суспензии отдельных клеток. Полученные клетки промывают, центрифугируют и ресуспендируют в буфере, который лизирует все красные кровяные клетки. Раствор снова центрифугируют, и оставшиеся в осадке лимфоциты, наконец, ресуспендируют в свежем буфере.

После выделения и получения суспензии отдельных клеток, лимфоциты можно слить с иммортализованной линией клеток. Последняя обычно представляет собой линию клеток миеломы мыши, хотя в данной области известно множество других иммортализованных линий клеток, пригодных для создания гибридом. Линии клеток миеломы мыши включают, но не ограничены таковыми, происходящими из опухолей мыши MOPC-21 и MPC-11, доступными в Salk Institute Cell Distribution Center, Сан-Диего, США, клетки X63 Ag8653 и SP-2, доступные в Американской коллекции типовых культур (ATCC), Роквилл, Мэриленд, США. Слияние осуществляют, применяя полиэтиленгликоль или тому подобные вещества. Полученные в результате этого гибридомы затем выращивают в селективных средах, которые содержат одно или более веществ, которые ингибируют рост или выживаемость неслитых исходных клеток миеломы. Например, если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансфераза (ГГФТ, HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом обычно будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), указанные вещества предотвращают рост клеток с дефицитом HGPRT.

Гибридомы обычно растят на питающем слое из макрофагов. Макрофаги могут быть из отличного от человека млекопитающего, однопометного для такового, использованного для выделения спленоцитов, и их обычно примируют неполным адъювантом Фрейнда или тому подобным адъювантом за несколько дней до посева гибридом. Способы слияния описаны в Goding «Monoclonal Antibodies: Principles and Practice», стр. 59 - 103 (Academic Press, 1986), содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки.

Клеткам позволяют расти в селекционных средах в течение времени, достаточного для образования колоний и продукции антител. Этот период обычно составляет от приблизительно 7 до приблизительно 14 дней.

Затем в колониях гибридом анализируют продукцию антител, которые специфично связывают продукты гена полипептида KIR3DL2, необязательно эпитоп, который специфично распознается антителом AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11. Анализ обычно представляет собой колориметрический анализ типа ELISA, хотя можно использовать любой анализ, который можно приспособить для лунок, в которых выращивают гибридомы. Другие виды анализа включают радиоиммуноанализ или сортировку клеток с возбуждением флуоресценции. Лунки, положительные по продукции желательного антитела, исследуют, чтобы определить, присутствует ли одна или более различных колоний. Если присутствует более одной колонии, то клетки можно повторно клонировать и вырастить, чтобы гарантировать, что только одна клетка дала начало колонии, продуцирующей желательное антитело. Обычно, у антител также исследуют способность связываться с полипептидами KIR3DL2, например, экспрессирующими KIR3DL2 клетками.

Гибридомы, для которых подтвердили продукцию моноклонального антитела, можно нарастить в больших количествах в подходящей среде, такой как DMEM или RPMI-1640. В качестве альтернативы, клетки гибридомы можно растить in vivo в виде асцитных опухолей у животного. После достаточного наращивания для получения желательного моноклонального антитела, ростовые среды, содержащие моноклональное антитело (или асцитную жидкость), отделяют от клеток, и моноклональное антитело, присутствующее в них, очищают. Очистку обычно осуществляют с помощью электрофореза в геле, диализа, хроматографии с применением сефарозы с белком A или белком G, или с помощью Ig против мыши, связанного с твердой подложкой, такой как гранулы агарозы или сефарозы (все указанные способы описаны, например, в Antibody Purification Handbook, Biosciences, публикация № 18-1037-46, издание AC, содержание которого настоящим включено в данную заявку посредством ссылки). Связанное антитело обычно элюируют с колонок с белком A/белком G, применяя буферы с низким pH (глициновые или ацетатные буферы с pH 3,0 или меньше), с незамедлительной нейтрализацией содержащих антитела фракций. Данные фракции объединяют, диализируют и концентрируют при необходимости.

Положительные лунки с одной явной колонией обычно повторно клонируют и повторно анализируют, чтобы гарантировать, что только одно моноклональное антитело детектируется и продуцируется.

Антитела также можно получить путем селекции из комбинаторных библиотек иммуноглобулинов, как описано, например, в (Ward и др. Nature, 341 (1989) стр. 544, содержание которого полностью включено в данную заявку посредством ссылки).

Идентификацию одного или более антител, которые связываются с интересующим антигеном, т.е. KIR3DL2, особенно или по существу с той же областью, детерминантой или эпитопом, с которыми связывается моноклональное антитело AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11, можно легко осуществить, применяя любой из различных способов иммунологического скринингового анализа, в которых можно оценить конкурирование антител. Множество таких способов анализа регулярно практикуются и хорошо известны в данной области (см., например, патент США номер 5660827, выданный 26 августа 1997 г., который конкретно включен в данную заявку посредством ссылки).

Например, когда тестируемые антитела, которые нужно исследовать, получены из различных животных источников, или даже принадлежат к различным изотипам Ig, можно применять простой конкурентный анализ, в котором контрольное (AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11, например) и тестируемые антитела смешивают (или предварительно адсорбируют) и наносят на образец, содержащий полипептиды KIR3DL2. Протоколы на основе вестерн-блоттинга и применения анализа BIACORE подходят для применения в таких конкурентных исследованиях.

В некоторых вариантах реализации предварительно смешивают контрольные антитела (например, AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11, например) с различными количествами тестируемых антител (например, приблизительно 1:10 или приблизительно 1:100) в течение некоторого периода времени перед нанесением на образец антигена KIR3DL2. В других вариантах реализации контрольное и различные количества тестируемых антител можно просто смешать во время приведения в контакт с образцом антигена KIR3DL2. При условии, что можно отличить связанные антитела от свободных (например, применяя методики разделения или промывки для удаления несвязанных антител) и 2B12 от тестируемых антител (например, путем применения видоспецифических или специфических к изотипу вторичных антител или путем специфического мечения AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11 детектируемой меткой), тогда можно определить, снижают ли тестируемые антитела связывание AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11 с антигенами. Связывание (меченых) контрольных антител в отсутствие полностью неродственного антитела может служить в качестве наибольшего контрольного значения. Наименьшее контрольное значение можно получить путем инкубации меченых (AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11) антител с немечеными антителами точно такого же типа (AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11), при которой будет происходить конкуренция и снижать связывание меченых антител. При анализе тестируемых антител, значительное снижение реакционной способности меченого антитела в присутствии тестируемого антитела указывает на то, что тестируемое антитело «дает перекрестную реакцию» или конкурирует с меченым (AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11) антителом. Можно выбрать любое тестируемое антитело, которое уменьшает связывание AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11 с антигенами KIR3DL2 по меньшей мере приблизительно на 50%, например, по меньшей мере приблизительно на 60%, или более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% или 90% (например, приблизительно на 65 - 100%), при любом соотношении AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11:тестируемое антитело в диапазоне от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100. В одном варианте реализации такое тестируемое антитело будет снижать связывание AZ158, 19H12, 2B12 или 12B11 с антигеном KIR3DL2 по меньшей мере приблизительно на 90% (например, приблизительно на 95%).

Конкуренцию также можно оценить, например, с помощью анализа методом проточной цитометрии. В таком анализе клетки, несущие данный полипептид KIR3DL2, можно инкубировать сначала с 2B12, например, а затем с тестируемым антителом, меченым флуорохромом или биотином. Говорят, что антитело конкурирует с 2B12, если связывание, полученное после предварительной инкубации с насыщающим количеством 2B12, составляет приблизительно 80%, предпочтительно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%, 20% или 10%) от связывания (измеренного по средней флуоресценции), полученного для антитела без предварительной инкубации с 2B12. В качестве альтернативы, говорят, что антитело конкурирует с 2B12, если связывание, полученное с меченым антителом 2B12 (измеренное по флуорохрому или биотину) на клетках, предварительно инкубированных с насыщающим количеством тестируемого антитела, составляет приблизительно 80%, предпочтительно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%, 20% или 10%) от связывания, полученного без предварительной инкубации с тестируемым антителом.

Определение того, связывается ли антитело внутри области эпитопа, можно осуществить способами, известными специалисту в данной области. В качестве одного примера таких способов картирования/исследования, область эпитопа для антитела против KIR3DL2 можно определить путем «получения отпечатка» эпитопа, используя химическую модификацию выставленных аминов/карбоксилов в соответствующем белке KIR3DL2. Одним конкретным примером такой методики получения отпечатка является применение HXMS (водород-дейтериевый обмен, детектируемый с помощью масс-спектрометрии), при котором происходит водород-дейтериевый обмен протонов амидов белков рецептора и лиганда, связывание и обратный обмен, причем амидные группы остова, участвующие в связывании белка, защищены от обратного обмена и, следовательно, будут оставаться дейтерированными. Соответствующие области можно обнаружить на данном этапе с помощью пепсинового протеолиза, разделения с помощью быстрой микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и/или масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. См., например, Ehring H, Analytic Biochemistry, том 267 (2), стр. 252-259 (1999) Engen, J. R. и Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Другим примером подходящей методики идентификации эпитопа является картирование эпитопа методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР), где обычно сравнивают положение сигналов на двумерных спектрах ЯМР свободного антигена и антигена в комплексе с антигенсвязывающим пептидом, таким как антитело. Антиген обычно селективно метят изотопом 15N, чтобы на ЯМР-спектре наблюдались только сигналы, соответствующие антигену, и не наблюдались сигналы от антигенсвязывающего пептида. Сигналы антигена, происходящие из аминокислот, участвующих во взаимодействии с антигенсвязывающим пептидом, как правило, сдвинут положение в спектре комплекса по сравнению со спектром свободного антигена, и аминокислоты, участвующие в связывании, можно определить таким способом. См., например, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang и др., Journal of Molecular Biology, том 281 (1) стр. 61-67 (1998); и Saito и Patterson, Methods. Июнь,1996 г; 9 (3): 516-24.

Картирование/исследование эпитопа также можно осуществить, применяя способы масс-спектрометрии. См., например, Downard, J Mass Spectrom. Апрель 2000 г.; 35 (4): 493-503 и Kiselar и Downard, Anal Chem. Май 1999 г., 1; 71 (9): 1792-1801. методики расщепления протеазой также могут быть полезны в контексте картирования и исследования эпитопа. Участки/последовательности, относящиеся к антигенной детерминанте, можно определить путем расщепления протеазой, например, применяя трипсин в соотношении приблизительно 1:50 к KIR3DL2 при расщеплении в течение ночи при pH 7 - 8 с последующим анализом с помощью масс-спектрометрии (МС) для идентификации пептидов. Пептиды, защищенные от расщепления трипсином благодаря связующей KIR3DL2 молекуле, затем можно идентифицировать путем сравнения образцов, подвергнутых расщеплению трипсином, и образцов, инкубированных с антителом, а затем подвергнутых расщеплению, например, трипсином (что позволяет выявить отпечаток (область узнавания) связывающей молекулы). Другие ферменты, такие как химотрипсин, пепсин и т.д., можно также или в качестве альтернативы применять в аналогичных способах исследования эпитопов. Более того, ферментативное расщепление может позволить быстрый анализ того, находится ли последовательность потенциальной антигенной детерминанты внутри области полипептида KIR3DL2, которая не экспонирована на поверхности и, соответственно, наиболее вероятно не важна с точки зрения иммуногенности/антигенности.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой другую методику, полезную для идентификации эпитопа связывания. Например, при «сканировании аланином» каждый остаток внутри фрагмента белка заменяют на остаток аланина и измеряют последствия для аффинности связывания. Если мутация приводит к значительному снижению аффинности связывания, то данный остаток наиболее вероятно участвует в связывании. Моноклональные антитела, специфичные к структурным эпитопам (т.е. антитела, которые не связывают несвернутый белок), можно применять, чтобы удостовериться в том, что замена на аланин не влияет на общую укладку белка. См., например, Clackson и Wells, Science 1995; 267:383-386; и Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6.

Электронную микроскопию также можно применять для «получения отпечатка» эпитопа. Например, Wang и др., Nature 1992; 355:275-278 скоординировано применили криоэлектронную микроскопию, трехмерное реконструирование изображения и рентгеноструктурный анализ для определения физической области узнавания Fab-фрагмента на поверхности капсида нативного вируса мозаики коровьего гороха.

Другие виды анализа «без метки» для определения эпитопа включают поверхностный плазмонный резонанс (ППР, BIACORE) и рефлектометрическую интерференционную спектроскопию (RifS). См., например, Fägerstam и др., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice и др., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert и др., Angew. Chem. Int. изд. 1998; 37:3308-3311; Kröger и др., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.

Также следует отметить, что антитело, связывающее тот же или по существу тот же эпитоп, что и другое антитело, можно обнаружить с помощью одного или более из типичных конкурентных способов анализа, описанных в данной заявке.

После идентификации антител, которые способны связывать KIR3DL2 и/или обладают другими желательными свойствами (например, способностью опосредовать АЗКЦ и/или антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЗКФ)), также, как правило, будут оценивать, применяя стандартные способы, включая описанные в данной заявке, их способность связываться с другими полипептидами, включая неродственные полипептиды. Предпочтительно, антитела связываются со значительной аффинностью только с KIR3DL2, например, с KIR3DL2 человека, и не связываются на значительном уровне с неродственными полипептидами. Тем не менее должно быть очевидно, что если аффинность к KIR3DL2 значительно больше (например, в 5, в 10, в 50, в 100, в 500, в 1000, в 10000 или более раз), чем таковая к другим, неродственным полипептидам, то антитела подходят для применения в способах согласно настоящему изобретению.

Связывание антител с экспрессирующими KIR3DL2 клетками также можно оценить в отличных от человека приматах, например, яванских макаках, или других млекопитающих, таких как мыши. Предложено антитело, а также его фрагменты и производные, причем указанное антитело, фрагмент или производное специфично связывает KIR3DL2 и, более того, связывает KIR3DL2 из отличных от человека приматов, например, яванских макаков.

После иммунизации и получения антител в позвоночном или в клетке, можно осуществить определенные этапы селекции, чтобы выделить заявленные антитела. В этом отношении, в конкретном варианте реализации настоящего изобретения также предложены способы получения таких антител, включающие: (a) иммунизацию отличного от человека млекопитающего иммуногеном, содержащим полипептид KIR3DL2; и (b) получение антител из указанного иммунизированного животного; и (c) селекцию антител из этапа (b), которые способны связывать KIR3DL2.

В одном аспекте любого из вариантов реализации антитела, полученные в соответствии с настоящими способами, представляют собой моноклональные антитела. В другом аспекте отличное от человека животное, используемое для получения антител, представляет собой млекопитающее, такое как грызун, крупный рогатый скот, свинья, домашние птицы, лошадь, кролик, коза или овца.

В соответствии с альтернативным вариантом реализации ДНК, кодирующую антитело, которое связывает эпитоп, присутствующий на полипептидах KIR3DL2, выделяют из гибридомы и помещают в подходящий вектор экспрессии для трансфекции подходящего хозяина. Хозяина затем используют для рекомбинантного получения антитела, или его вариантов, таких как гуманизированный вариант этого моноклонального антитела, активные фрагменты указанного антитела, химерные антитела, содержащие распознающую антиген часть антитела, или варианты, содержащие детектируемую молекулу.

ДНК, кодирующую моноклональное антитело, можно легко выделить и секвенировать, применяя обычные процедуры (например, применяя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). После выделения ДНК можно поместить в векторы экспрессии, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы добиться синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. В других местах в настоящем тексте описано, что такие последовательности ДНК можно модифицировать для любой из множества целей, например, для гуманизирования антител, получения фрагментов или производных, или для модификации последовательности антитела, например, в сайте связывания антигена, чтобы оптимизировать специфичность связывания антитела.

Рекомбинантная экспрессия в бактериях ДНК, кодирующей антитело, хорошо известна в данной области (см., например, Skerra и др., Curr. Opinion in Immunol., 5, стр. 256 (1993); и Pluckthun, Immunol. 130, стр. 151 (1992).

После получения связывающего антиген соединения, можно оценить его способность вызывать АЗКЦ, АЗКФ и/или комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ), направленную на экспрессирующие KIR3DL2 клетки-мишени, и/или удалять экспрессирующие KIR3DL2 клетки-мишени. Оценку способности связывающего антиген соединения вызывать АЗКЦ, АЗКФ и/или КЗЦ или в целом приводить к элиминированию или ингибированию активности экспрессирующих KIR3DL2 клеток-мишеней можно осуществить на любой подходящей стадии способа. Данная оценка может быть полезна на одном или более из различных этапов, которые используют для идентификации, продукции и/или разработки антитела (или другого соединения), предназначенного для терапевтического применения. Например, активность можно оценить в контексте способа скрининга, чтобы определить кандидатные связывающие антиген соединения, или в способах, в которых проводят селекцию связывающего антиген соединения и делают его подходящим для человека (например, делают химерным или гуманизированным в случае антитела), в которых получили клетку, экспрессирующую связывающее антиген соединение (например, клетку-хозяина, экспрессирующую рекомбинантное связывающее антиген соединение), и оценивают ее способность продуцировать функциональные антитела (или другие соединения), и/или в которых получили некоторое количество связывающего антиген соединения, и нужно оценить его активность (например, чтобы проверить серии или партии продукта). В общем, будет известно, что связывающее антиген соединение специфично связывается с полипептидом KIR3DL2. Этап может включать тестирование множества (например, очень большого количества с применением высокопроизводительных способов скрининга или меньшего количества) связывающих антиген соединений.

Тестирование АЗКФ, КЗЦ и АЗКЦ можно осуществить с помощью различных способов анализа, включая известные в данной области и описанные в примерах экспериментов в данной заявке. Тестирование АЗКЦ обычно включает оценку опосредованной клетками цитотоксичности, при которой экспрессирующая KIR3DL2 целевая клетка (например, клетка ТКЛ или другая экспрессирующая KIR3DL2 клетка) со связанным антителом против KIR3DL2 распознается эффекторной клеткой, несущей Fc-рецепторы, без вовлечения комплемента. Клетку, которая не экспрессирует антиген KIR3DL2, необязательно можно использовать в качестве контроля. Активацию цитотоксичности, опосредованной NK-клетками, оценивают путем измерения повышения продукции цитокинов (например, продукции IFN-γ) или маркеров цитотоксичности (например, мобилизации CD107). В одном варианте реализации антитело будет вызывать повышение продукции цитокинов, экспрессию маркеров цитотоксичности или лизис клеток-мишеней, составляющие по меньшей мере 20%, 50%, 80%, 100%, 200% или 500% в присутствии клеток-мишеней относительно таковых для контрольного антитела (например, антитела, не связывающегося с KIR3DL2, антитела против KIR3DL2, содержащего мышиные константные области). В другом примере лизис клеток-мишеней детектируют, например, в анализе высвобождения хрома, например, антитело будет вызывать лизис по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40% или 50% клеток-мишеней.

Фрагменты и производные антител (которые входят в объем термина «антитело» или «антитела», используемого в настоящей заявке, если не указано иное или явно не противоречит контексту) можно получить с помощью методик, которые известны в данной области. «Фрагменты» включают часть интактного антитела, как правило, сайт связывания антигена или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2 и Fv; диатела; любой фрагмент антитела, который представляет собой полипептид, имеющий первичную структуру, состоящую из одной непрерывной последовательности из смежных аминокислотных остатков (называют в данной заявке «одноцепочечным фрагментом антитела» или «одноцепочечным полипептидом»), включая, без ограничения: (1) одноцепочечные молекулы Fv, (2) одноцепочечные полипептиды, содержащие только один вариабельный домен легкой цепи, или его фрагмент, который содержит три CDR вариабельного домена легкой цепи, без связанной молекулы тяжелой цепи, и (3) одноцепочечные полипептиды, содержащие только одну вариабельную область тяжелой цепи, или ее фрагмент, содержащий три CDR вариабельной области тяжелой цепи, без связанной молекулы легкой цепи; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В объем данного термина входят, среди прочего, нанотело, доменное антитело, однодоменное антитело или «dAb».

В некоторых вариантах реализации ДНК гибридомы, продуцирующей антитело, можно модифицировать перед вставкой в вектор экспрессии, например, путем замены на кодирующие последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепей из человека гомологичных отличных от человеческих последовательностей (например, Morrison и др., PNAS стр. 6851 (1984)), или путем ковалентного соединения с кодирующей иммуноглобулин последовательностью всей или части кодирующей последовательности отличного от иммуноглобулина полипептида. Таким образом, получают «химерные» или «гибридные» антитела со специфичностью связывания, которая была у исходного антитела. Обычно, такие отличные от иммуноглобулина полипептиды заменяют на константные домены антитела.

Таким образом, согласно другому варианту реализации, антитело является гуманизированным. «Гуманизированные» формы антител представляют собой специфические химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F (ab')2 или другие связывающие антиген подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина мыши. По большей части, гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены на остатки из CDR исходного антитела (донорного антитела), при этом сохраняется желательная специфичность, аффинность и функциональная активность исходного антитела.

В некоторых случаях, остатки каркаса Fv иммуноглобулина человека можно заменить на соответствующие отличные от человеческих остатки. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не содержатся ни в реципиентном антителе, ни во внедренных последовательностях CDR или каркаса. Данные модификации вводят, чтобы дополнительно улучшить и оптимизировать эффективность антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют таковым из исходного антитела, и все или по существу все области FR представляют собой таковые из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно таковую из иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности см. в Jones и др., Nature, 321, стр. 522 (1986); Reichmann и др., Nature, 332, стр. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, стр. 593 (1992); Verhoeyen et Science, 239, стр. 1534; и патент США № 4816567, содержания которых полностью включены в данную заявку посредством ссылки). Способы гуманизирования антител хорошо известны в данной области.

Выбор человеческих вариабельных доменов, как легкой, так и тяжелой цепи, для применения для получения гуманизированных антител очень важен для снижения антигенности. Согласно так называемому способу «наилучшей подгонки», последовательность вариабельного домена антитела подвергают скринингу против всей библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Человеческую последовательность, которая наиболее близка к таковой из мыши, затем используют в качестве человеческого каркаса (FR) для гуманизированного антитела (Sims и др., J. Immonol. 151, стр. 2296 (1993); Chothia и Lesk, J. Mol. 196, 1987, стр. 901). В другом способе используют определенный каркас из консенсусной последовательности всех антител человека определенной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и др., PNAS 89, стр. 4285 (1992); Presta и др., J. Immonol., 151, стр. 2623 (1993)).

Дополнительно важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к рецепторам KIR3DL2 и других предпочтительных биологических свойств. Для достижения данной цели, согласно одному способу, гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа исходных последовательностей и различных теоретических гуманизированных продуктов с применением трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают вероятные трехмерные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов. Визуальное изучение данных отображенных структур позволяет анализ вероятной роли остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться с его антигеном. Таким образом можно выбрать остатки FR и комбинировать таковые из консенсусной и импортированной последовательностей таким образом, чтобы добиться желательного свойства антитела, такого как повышенная аффинность к целевому антигену(-ам). Обычно остатки CDR непосредственно и наиболее существенно влияют на связывание антигена.

Другим способом получения человеческих или гуманизированных моноклональных антител является использование генетически модифицированной мыши для иммунизации. Известно несколько мышей-хозяев, у которых гены иммуноглобулинов были заменены на функциональные гены иммуноглобулинов человека. Таким образом, антитела, продуцированные данной мышью или гибридомами, полученными из B-клеток такой мыши, уже являются человеческими или гуманизированными. Примеры животных описаны в патенте Соединенных Штатов № 6162963 и в Jakobovitz и др., Nature 362 (1993) 255, которые включены в данную заявку посредством ссылки. Антитела человека также можно получить в соответствии с различными другими методиками, например, путем селекции из репертуаров антител с применением способов фагового дисплея. Такие методики известны квалифицированному специалисту, и их можно осуществить, начиная с моноклональных антител, как описано в настоящей заявке.

Связывающее KIR3DL2 соединение, например, антитело против KIR3DL2, может быть дополнительно связано со второй молекулой, причем антитело способно доставлять вторую молекулу в экспрессирующую KIR3DL2 клетку. Необязательно вторая молекула представляет собой терапевтический агент, токсичный агент и/или детектируемый агент.

Тогда как ожидают, что антитела в недериватизированной или немодифицированной форме, особенно типа IgG1 или IgG3, будут ингибировать пролиферацию чрезмерно пролиферирующих клеток или будут цитотоксичны в отношении чрезмерно пролиферирующих клеток, таких как клетки из пациента с ПТКЛ, например, направляя АЗКЦ, АЗКФ и/или КЗЦ на экспрессирующие KIR3DL2 клетки ПТКЛ, также можно получить дериватизированные иммуноконъюгаты антитела, являющиеся цитотоксичными. В одном варианте реализации после выделения специфических к KIR3DL2 антител и необязательной модификации в других случаях (например, гуманизирования), их будут дериватизировать, чтобы сделать их токсичными для клеток. Следовательно, введение антитела пациентам с ПТКЛ будет приводить к относительно специфическому связыванию антитела с чрезмерно пролиферирующими клетками, тем самым непосредственно уничтожая или ингибируя клетки, лежащие в основе расстройства.

Учитывая способность антител против KIR3DL2 вызывать АЗКЦ и КЗЦ, указанные антитела также можно получить с модификациями, которые повышают их способность связываться с Fc-рецепторами, которая может влиять на эффекторные функции, такие как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, а также на иммуномодулирующие сигналы, такие как регуляция пролиферации лимфоцитов и секреции антител. Обычные модификации включают модифицированные константные области IgG1 человека, содержащие по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (например, замену, делеции, вставки) и/или измененные типы гликозилирования, например, гипофукозилирование.

Антитела против KIR3DL2 могут содержать домен Fc (или его часть) изотипа IgG1 или IgG3 человека, необязательно модифицированный.

В некоторых вариантах реализации домен CH2 и/или CH3 (или домен Fc, содержащий их) может содержать одну или более модификаций аминокислот (например, замен аминокислот), которые повышают связывание с CD16 человека и необязательно другим рецептором, таким как FcRn. Необязательно указанные модификации не будут существенно снижать или нарушать способность происходящего из Fc полипептида связываться с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), например, FcRn человека. Обычные модификации включают модифицированные происходящие из IgG1 человека константные области, содержащие по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (например, замену, делеции, вставки), и/или измененный тип гликозилирования, например, гипофукозилирование. Такие модификации могут влиять на взаимодействие с Fc-рецепторами: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) и FcγRIII (CD 16) представляют собой активирующие (т.е. стимулирующие иммунную систему) рецепторы, тогда как FcγRIIB (CD32B) представляет собой ингибирующий (т.е. затормаживающий иммунную систему) рецептор. Модификация может, например, повышать связывание домена Fc с FcγRIIIa на эффекторных (например, NK) клетках и/или снижать связывание с FcγRIIB. Примеры модификаций представлены в публикации по PCT № WO2014/044686, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки. Конкретные мутации (в доменах Fc IgG1), которые влияют (повышают) на связывание FcγRIIIa или FcRn, также описаны ниже.

Изотип Вид Модификация Эффекторная функция Эффект от модификации IgG1 Человек T250Q/M428L Повышенное связывание с FcRn Увеличенное время полужизни IgG1 Человек 1M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F Повышенное связывание с FcRn Увеличенное время полужизни IgG1 Человек E333A Повышенное связывание с FcγRIIIa Повышенные АЗКЦ и КЗЦ  IgG1 Человек S239D/I332E или
S239D/A330L/I332E Повышенное связывание с FcγRIIIa Повышенная АЗКЦ  IgG1 Человек P257I/Q311 Повышенное связывание с FcRn Неизменившееся время полужизни  IgG1 Человек S239D/I332E/G236A Увеличенное соотношение FcγRIIa/FcγRIIb Повышенный фагоцитоз макрофагами

Вариант Fc-области может содержать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (например, содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификаций аминокислот) в домене CH2 и/или CH3 Fc-области, причем указанная модификация повышает связывание с полипептидом CD16 человека. В других вариантах реализации Fc-область содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификаций аминокислот) в домене CH2 Fc-области с аминокислот 237 - 341, или внутри области CH2 нижнего шарнира, которая содержит остатки 231 - 341. В некоторых вариантах реализации Fc-область содержит по меньшей мере две модификации аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификаций аминокислот), причем по меньшей мере одна из таких модификаций находится внутри области CH3 и по меньшей мере одна из таких модификаций находится внутри области CH2. В объем изобретения также входят модификации аминокислот в шарнирной области. В одном варианте реализации в объем изобретения входят модификации аминокислот в домене CH1, необязательно в верхней шарнирной области, которая содержит остатки 216 - 230 (нумерация в соответствии с EU-индексом по Кабату). Можно осуществить любую подходящую функциональную комбинацию модификаций Fc, например, любую комбинацию различных модификаций Fc, которые описаны в любом из патентов Соединенных Штатов № US 7632497; 7521542; 7425619; 7416727; 7371826; 7355008; 7335742; 7332581; 7183387; 7122637; 6821505 и 6737056; и/или в публикациях PCT № WO2011/109400; WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 и WO 04/063351; и/или в Lazar и др. (2006) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103(11): 405-410; Presta, L.G. и др. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490; Shields, R.L. и др. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740 и Shields, R.L. и др. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604).

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Исследования комбинирования in vitro с химиотерапевтическими агентами.

Известно, что химиотерапевтические агенты могут отрицательно влиять на иммунную систему хозяина и впоследствии ингибировать эффективность терапевтических антител, которые опосредуют АЗКЦ. Следовательно, мы хотели оценить, влияют ли химиотерапевтические агенты на опосредованную NK-клетками активность АЗКЦ гуманизированного антитела 2B12 лакутамаба, имеющего изотип IgG1 человека и содержащего последовательности аминокислот VH и VL, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 49 и 44, соответственно. Химиотерапевтические агенты добавляли, отдельно или в комбинации, при проведении анализа клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) in vitro с аллогенными NK-клетками и экспрессирующей KIR3DL2 линией клеток синдрома Сезари (Hut 78), в присутствии возрастающих концентраций антитела против KIR3DL2.

Результаты представлены на фигуре 1. В данных условиях эксперимента, ни гемцитабин, ни оксалиплатин не препятствовали вызванной антителом против KIR3DL2 АЗКЦ против линии клеток КТКЛ HUT78. В действительности, противоопухолевая активность против KIR3DL2 неожиданно усиливалась каждым из гемцитабина и оксалиплатина, и еще больше - комбинацией гемцитабина и оксалиплатина.

Пример 2. Каждый из гемцитабина и оксалиплатина повышает экспрессию KIR3DL2.

Для того чтобы исследовать возможные причины усиления вызванной антителом против KIR3DL2 АЗКЦ против линии клеток КТКЛ HUT78, оценивали, может ли экспрессия KIR3DL2 модулироваться теми же химиотерапевтическими агентами in vitro.

Вкратце, клетки Hut78 (линия клеток синдрома Сезари) или клетки RAJI-KIR3DL2 (линия клеток B-НХЛ RAJI, трансфицированных KIR3DL2 человека) инкубировали с возрастающими дозами гемцитабина и оксалиплатина. Медиану интенсивности флуоресценции KIR3DL2 на поверхности линий опухолевых клеток анализировали с помощью проточной цитометрии.

Результаты представлены на фигуре 2. Клетки RAJI-KIR3DL2 показаны на панели A (левая сторона) и клетки Hut78 показаны на панели B (правая сторона). Обнаружили, что как оксалиплатин, так и гемцитабин усиливали экспрессию KIR3DL2 на поверхности обеих линий клеток дозозависимым образом, вплоть до плато в 2 - 3 раза выше по сравнению с исходным уровнем (фигура 2). Данные фигуры являются примерами двух независимых экспериментов. Стоит отметить, что другие химиотерапевтические агенты, такие как циклофосфамид, не повышали экспрессию KIR3DL2 при таких же условиях эксперимента.

В совокупности, данные результаты поддерживают исследование комбинации антитела против KIR3DL2 с гемцитабином и оксалиплатином, в частности, у пациентов с рецидивировавшей ПТКЛ, у которых может присутствовать особая потребность в улучшенных способах лечения.

Пример 3. Эффективность in vivo.

Использовали ксенотрансплантатную модель на мышах CB17-SCID, благодаря которой у штамма мыши с нарушенным иммунитетом сохранились полностью функциональные NK-клетки и макрофаги. Кроме того, Fc-рецепторы мыши эффективно связывают Fc человека, позволяя привлечение эффекторных клеток мыши гуманизированным МАТ и осуществление ими АЗКЦ или АЗКФ in vivo. Линию клеток B-НХЛ RAJI трансфицировали, чтобы добиться стабильной экспрессии KIR3DL2 (RAJI-KIR3DL2), и трансфектантами инокулировали (5×10⁶ клеток) мышей SCID в/в путем, тем самым получая модель диссеминированной опухоли. Изначально, определили дозы гемцитабина и оксалиплатина отдельно в данной ксенотрансплантатной модели. Тем не менее, хотя гемцитабин и оксалиплатин можно применять совместно у людей, оказалось невозможным найти дозы гемцитабина и оксалиплатина, которые можно комбинировать, чтобы обеспечить активность и в то же время переносимость данными мышами. Следовательно, антитело против KIR3DL2 (лакутамаб) комбинировали либо с гемцитабином, либо с оксалиплатином отдельно.

В данной модели диссеминированной опухоли (n = 9 мышей на группу), группы мышей, следовательно, лечили дважды в неделю следующими агентами:

- МАТ изотипического контроля,

- антителом против KIR3DL2 (лакутамабом),

- гемцитабином (50 мг/кг)

- оксалиплатином (5 мг/кг),

- антителом против KIR3DL2 (лакутамабом) + гемцитабин (50 мг/кг), или

- антителом против KIR3DL2 (лакутамабом) + оксалиплатин (5 мг/кг).

Как антитело против KIR3DL2, так и изотипический контроль вводили в дозе 0,3 мкг на инъекцию.

Результаты представлены на фигуре 3. Комбинация антитела против KIR3DL2 и оксалиплатина была по меньшей мере также активна, как и антитело против KIR3DL2 отдельно (оксалиплатин оказывал очень ограниченное, если вообще оказывал, противоопухолевое действие сам по себе в указанной модели). Интересно, что для антитела против KIR3DL2 и гемцитабина выявили синергичную противоопухолевую активность in vivo. У мышей, которых лечили антителом против KIR3DL2 и гемцитабином, была значительно улучшенная выживаемость по сравнению с мышами, которых лечили каждым агентом отдельно. Эффекты, выявленные выше, воспроизводили в 2 независимых экспериментах, каждый раз с 9 мышами на группу.

Полученные результаты, вместе с результатами комбинирования in vitro и потенциальной индукцией KIR3DL2 гемцитабином и оксалиплатином, поддерживают идею терапевтического комбинирования антител против KIR3DL2 с гемцитабином и оксалиплатином у пациентов с ТКЛ. Хотя комбинация с гуманизированным 2B12 была особенно эффективна в качестве противоракового лекарственного средства, способность гемцитабина и/или оксалиплатина повышать экспрессию KIR3DL2 также может быть полезна для цели усиления противоопухолевой активности антител, которые отдельно менее эффективны, чем 2B12. Указанные комбинации могут быть особенно эффективны у пациентов с рецидивировавшей ПТКЛ.

Все ссылочные материалы, включая публикации, заявки на патент и патенты, цитированные в данной заявке, настоящим полностью включены в данную заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была отдельно и конкретно указана как включенная посредством ссылки и была полностью описана в данной заявке (до максимальной степени, допустимой законом), независимо от любого представленного отдельно включения конкретных документов, упомянутого в других местах в данной заявке.

Если не указано иное, все точные значения, предложенные в данной заявке, являются примерами соответствующих приблизительных значений (например, можно считать, что все точные типичные значения, предложенные в отношении конкретного фактора или измерения, также предусматривают соответствующую приблизительную меру, модифицированную термином «приблизительно», когда это уместно).

Предполагается, что описание в данной заявке любого аспекта или варианта реализации настоящего изобретения с применением таких терминов, как «включающий», «обладающий», «включая» или «содержащий» по отношению к элементу или элементам, включает сходный аспект или вариант реализации настоящего изобретения, который «состоит из», «состоит по существу из» или «по существу включает» указанный конкретный элемент или элементы, если не указано иное или нет явных противоречий с контекстом (например, следует понимать, что описание композиции, описанной в данной заявке как содержащей конкретный элемент, также включает описание композиции, состоящей из данного элемента, если не указано иное или нет явных противоречий с контекстом).

Использование любого и всех примеров или терминологии примеров (например, «такой как»), предложенных в данной заявке, предназначено лишь для лучшего освещения настоящего изобретения и не устанавливает ограничения на объем настоящего изобретения, если не заявлено иное. Никакая терминология в настоящем описании не должна толковаться как указывающая на то, что какой-либо незаявленный элемент необходим для осуществления настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Иннэйт Фарма

<120> ЛЕЧЕНИЕ T-КЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ

<130> KIR-9

<150> US 62/795194

<151> 2019-01-22

<160> 70

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 434

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<400> 1

Leu Met Gly Gly Gln Asp Lys Pro Phe Leu Ser Ala Arg Pro Ser Thr

1 5 10 15

Val Val Pro Arg Gly Gly His Val Ala Leu Gln Cys His Tyr Arg Arg

20 25 30

Gly Phe Asn Asn Phe Met Leu Tyr Lys Glu Asp Arg Ser His Val Pro

35 40 45

Ile Phe His Gly Arg Ile Phe Gln Glu Ser Phe Ile Met Gly Pro Val

50 55 60

Thr Pro Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Arg Gly Ser Arg Pro His

65 70 75 80

Ser Leu Thr Gly Trp Ser Ala Pro Ser Asn Pro Leu Val Ile Met Val

85 90 95

Thr Gly Asn His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala His Pro Gly Pro Leu

100 105 110

Leu Lys Ser Gly Glu Thr Val Ile Leu Gln Cys Trp Ser Asp Val Met

115 120 125

Phe Glu His Phe Phe Leu His Arg Asp Gly Ile Ser Glu Asp Pro Ser

130 135 140

Arg Leu Val Gly Gln Ile His Asp Gly Val Ser Lys Ala Asn Phe Ser

145 150 155 160

Ile Gly Pro Leu Met Pro Val Leu Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly

165 170 175

Ser Val Pro His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu

180 185 190

Asp Ile Val Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln

195 200 205

Pro Gly Pro Thr Val Gln Ala Gly Glu Asn Val Thr Leu Ser Cys Ser

210 215 220

Ser Trp Ser Ser Tyr Asp Ile Tyr His Leu Ser Arg Glu Gly Glu Ala

225 230 235 240

His Glu Arg Arg Leu Arg Ala Val Pro Lys Val Asn Arg Thr Phe Gln

245 250 255

Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly Gly Thr Tyr Arg Cys

260 265 270

Phe Gly Ser Phe Arg Ala Leu Pro Cys Val Trp Ser Asn Ser Ser Asp

275 280 285

Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser Ser Ser Trp Pro Ser

290 295 300

Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Ser Gly Ile Cys Arg His Leu His Val

305 310 315 320

Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Phe

325 330 335

Phe Leu Leu Tyr Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met

340 345 350

Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asp Arg Thr Val Asn Arg Gln Asp Ser Asp

355 360 365

Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val

370 375 380

Phe Ile Gln Arg Lys Ile Ser Arg Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu Thr Asp Thr Ser Val Tyr Thr Glu Leu Pro Asn Ala Glu Pro Arg

405 410 415

Ser Lys Val Val Ser Cys Pro Arg Ala Pro Gln Ser Gly Leu Glu Gly

420 425 430

Val Phe

<210> 2

<211> 455

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<400> 2

Met Ser Leu Thr Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Phe Phe Leu Leu

1 5 10 15

Gln Gly Ala Trp Pro Leu Met Gly Gly Gln Asp Lys Pro Phe Leu Ser

20 25 30

Ala Arg Pro Ser Thr Val Val Pro Arg Gly Gly His Val Ala Leu Gln

35 40 45

Cys His Tyr Arg Arg Gly Phe Asn Asn Phe Met Leu Tyr Lys Glu Asp

50 55 60

Arg Ser His Val Pro Ile Phe His Gly Arg Ile Phe Gln Glu Ser Phe

65 70 75 80

Ile Met Gly Pro Val Thr Pro Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Arg

85 90 95

Gly Ser Arg Pro His Ser Leu Thr Gly Trp Ser Ala Pro Ser Asn Pro

100 105 110

Val Val Ile Met Val Thr Gly Asn His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala

115 120 125

His Pro Gly Pro Leu Leu Lys Ser Gly Glu Thr Val Ile Leu Gln Cys

130 135 140

Trp Ser Asp Val Met Phe Glu His Phe Phe Leu His Arg Glu Gly Ile

145 150 155 160

Ser Glu Asp Pro Ser Arg Leu Val Gly Gln Ile His Asp Gly Val Ser

165 170 175

Lys Ala Asn Phe Ser Ile Gly Pro Leu Met Pro Val Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Pro His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Ala

195 200 205

Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro

210 215 220

Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Gln Ala Gly Glu Asn Val

225 230 235 240

Thr Leu Ser Cys Ser Ser Trp Ser Ser Tyr Asp Ile Tyr His Leu Ser

245 250 255

Arg Glu Gly Glu Ala His Glu Arg Arg Leu Arg Ala Val Pro Lys Val

260 265 270

Asn Arg Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly

275 280 285

Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg Ala Leu Pro Cys Val Trp

290 295 300

Ser Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser

305 310 315 320

Ser Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Ser Gly Ile Cys

325 330 335

Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Phe Leu Phe

340 345 350

Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu Tyr Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys

355 360 365

Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asp Arg Thr Val Asn

370 375 380

Arg Gln Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln

385 390 395 400

Leu Asp His Cys Val Phe Ile Gln Arg Lys Ile Ser Arg Pro Ser Gln

405 410 415

Arg Pro Lys Thr Pro Leu Thr Asp Thr Ser Val Tyr Thr Glu Leu Pro

420 425 430

Asn Ala Glu Pro Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro Arg Ala Pro Gln

435 440 445

Ser Gly Leu Glu Gly Val Phe

450 455

<210> 3

<211> 123

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 3

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Phe

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Asn Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asn Ser Asn His Tyr Val Ser Ser Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 106

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Thr Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 119

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 5

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Gly Asn Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 112

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 6

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 5

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 7

Asn Phe Gly Met Asn

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 8

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Gly Met Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 10

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

1 5 10 15

<210> 11

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 11

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu

1 5

<210> 12

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 12

Asn Gly Asn Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 13

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 14

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 14

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 15

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 16

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 16

Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Asn Pro Gly Glu Thr Val

1 5 10 15

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met

20 25 30

Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp

35 40 45

Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala His

85 90 95

Gly Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

<210> 17

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 17

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Val Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ile Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Glu

100 105

<210> 18

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 18

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn

1 5

<210> 20

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 20

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn

1 5 10

<210> 21

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 21

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 22

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr

1 5 10

<210> 23

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 23

Gly Pro Trp Leu Ala Tyr

1 5

<210> 24

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 24

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Val Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 25

Arg Ala Ile Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 26

Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 27

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 27

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Ala

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser

115

<210> 28

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 113

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 30

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Ile Pro Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Trp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Tyr Cys Leu Val Trp His Gln Trp Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Thr Pro Thr Pro Leu Ile Thr Trp Thr Ser Asp Arg Tyr Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Leu His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 31

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 31

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser His Tyr Ser Phe Ile Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asn Trp Gly Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

115

<210> 32

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 32

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Thr Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser

115

<210> 33

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 33

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 34

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 35

Thr Ala Gly Met Gln

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 36

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Gly Met Gln

1 5 10

<210> 37

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 37

Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 38

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 38

Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 39

Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr

1 5

<210> 40

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 40

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 41

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 41

Trp Thr Ser Thr Arg His Thr

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 42

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 43

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 45

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 47

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 49

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 50

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 51

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 53

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 57

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 59

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 59

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 60

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 61

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 62

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 62

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 63

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 63

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser

115

<210> 64

<211> 113

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 64

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 65

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 65

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser

115

<210> 66

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 66

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser

20 25 30

Val Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Arg Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser Trp Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Asn Val His Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His

85 90 95

Asn His Gly Ser Phe Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Glu Ile Lys

115

<210> 67

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 67

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asp Tyr Gly Asn Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 68

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn His Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 69

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 69

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr

130 135

<210> 70

<211> 107

<212> ПРТ

<213> mus musculus

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<---

Изобретения относятся к онкологии и могут быть использованы в лечении T-клеточных лимфом, экспрессирующих KIR3DL2. Предложено применение антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, в комбинации с гемцитабином и оксалиплатином для лечения T-клеточной лимфомы (ТКЛ), экспрессирующей KIR3DL2. Антитело содержит домен VH с последовательностью SEQ ID NO: 49 и домен VL с последовательностью SEQ ID NO: 44. Также предложен набор, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую антитело против KIR3DL2, фармацевтическую композицию, содержащую оксалиплатин, и фармацевтическую композицию, содержащую гемцитабин. Изобретения обеспечивают эффективное лечение периферической ТКЛ, T-клеточного лейкоза взрослых, ТКЛ, ассоциированной с энтеропатией, или анапластической крупноклеточной лимфомы. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Применение антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, в лечении T-клеточной лимфомы (ТКЛ), экспрессирующей KIR3DL2, причем антитело применяют в комбинации с гемцитабином и оксалиплатином, причем указанное антитело содержит (а) домен VH с последовательностью SEQ ID NO: 49, и (b) домен VL с последовательностью SEQ ID NO: 44.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что гемцитабин вводят в дозе 800 - 1000 мг/м² один раз в две недели и оксалиплатин вводят в дозе 75 - 100 мг/м² один раз в две недели.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что гемцитабин вводят в дозе 800 - 1000 мг/м² один раз в две недели и оксалиплатин вводят в дозе 75 - 130 мг/м² один раз в три недели.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело вводят от одного раза в неделю до одного раза в четыре недели.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что антитело вводят один раз в неделю, необязательно при этом антитело вводят один раз в неделю в первой фазе, за которой следует вторая фаза, в которой антитело вводят один раз в две недели или один раз в месяц.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ТКЛ представляет собой периферическую T-клеточную лимфому (ПТКЛ), предпочтительно T-клеточный лейкоз взрослых (ТЛВ), Т-клеточную лимфому, ассоциированную с энтеропатией (ЭТЛВ), ПТКЛ-БДУ или анапластическую крупноклеточную лимфому (АККЛ).

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что антитело вводят в дозе 1 - 20 мг/кг, необязательно в дозе 750 мг.

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что антитело вводят в рамках схемы приема, включающей по меньшей мере один цикл введения, причем в каждом из по меньшей мере одного цикла вводят две, три или четыре дозы антитела против KIR3DL2 и вводят по меньшей мере две, три или четыре дозы гемцитабина.

9. Применение по любому из пп. 1 - 8, отличающееся тем, что лечение ТКЛ у индивида включает:

a) определение статуса полипептида KIR3DL2 в злокачественных клетках от индивида, страдающего ТКЛ, и

b) после определения того, что у индивида присутствует полипептид KIR3DL2, экспрессированный на поверхности злокачественных клеток, введение индивиду антитела, которое связывает полипептид KIR3DL2, в комбинации с оксалиплатином и гемцитабином.

10. Применение согласно любому из пп. 1 - 9, отличающееся тем, что указанное антитело против KIR3DL2 и оксалиплатин и гемцитабин вводят одновременно, раздельно или последовательно.

11. Набор для лечения T-клеточной лимфомы (ТКЛ), экспрессирующей KIR3DL2, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую антитело против KIR3DL2, содержащее домен VH с последовательностью SEQ ID NO: 49 и домен VL с последовательностью SEQ ID NO: 44, фармацевтическую композицию, содержащую оксалиплатин, и фармацевтическую композицию, содержащую гемцитабин.