СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДВИЖНЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ В РАЗБАВЛЕННОЙ И ЗАМОРОЖЕННО-ОТТАЯННОЙ СПЕРМЕ БАРАНОВ- И БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 A61B5/00 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарной медицины и предназначено для подсчета количество объектов в определенном объеме биологической жидкости, в частности для определения концентрации сперматозоидов, форменных элементов крови, содержание микрообъектов в 1 мл биологической жидкости методом подсчета с помощью счетной камеры предназначено, для определения подвижности сперматозоидов.

Известен способ определение концентрация микроскопических объектов с использованием счетной камеры Горяева, который предусматривает подготовка камеры для проведения исследования притиранием покровного стекла к предметное стекло имеющего прямоугольное углубление с нанесенной микроскопической сеткой. После притирания покровного стекла создается камера, которая заполняется исследуемой жидкости с помощью пипетки. Подсчитываются количество исследуемых микроскопических объектов например сперматозоидов проводится при увеличение 200×400 в пяти больших квадратах по диагонали и использованием формул определяется концентрация, однако данный способ требует определенные навыки по подготовки камеры для исследования, требует большие затраты времени для проведение исследование так как после каждой исследуемого образца надо камеру снова подготовить камеру: вымыть дезинфицировать и притирать покровного стекла к предметное стекло.

Известен способ определение концентрация микроскопических объектов с использованием счетной камеры Нойбауэра. С помощью нагнетательной пипетки оба резервуара наполняют хорошо перемешанной разбавленной спермой. Резервуар оставляют на 5 мин для оседания клеток. Подсчитывают только отдельные сперматозоиды на сетке. Изолированные головки, хвосты и другие клетки зародышевой линии должны быть отмечены, но их не подсчитывают. После подсчета сперматозоидов с одной стороны резервуара производят подсчет на второй решетке. Затем находят среднее значение. Если отдельные значения отличаются от среднего более чем на 5%, следует провести тест повторно. Если оба полученных при подсчете значения засчитываются, среднее значение делят на вычисленную площадь поверхности и умножают на коэффициент разбавления, таким образом находят концентрацию сперматозоидов в первоначальном образце спермы (млн/мл), однако использование счетной камеры сопровождается определенными проблемами такие как прицельные сетки не должны быть перегружены и в них не должно быть жидкости. Нагрузка должна быть точной. Важно, чтобы начинка была однородной, то есть пузырьков не было. Не выполнение этих условий приводит к искажению результатов или приходится собрать камеру с нова, что требует большое затраты времени, в камере за один анализ можно сделать только одну пробу.

Известен способ определение концентрация сперматозоидов с помощью счетной камеры Маклера, которая позволяет оценить подвижность и концентрации сперматозоидов одновременно, однако стоимость данного прибора очень высокая, и на данном приборе после каждого образца необходимо камеру вымыть высушить и только после этого проанализировать следующий образец, что отрицательно отражается на стоимости анализа и производительности труда.

Известен способ определение концентрация сперматозоидов с помощью фотометра принцип, которого основан на изменении фотометрических характеристик светового луча, пропускаемого через микрокювету с образцом спермы, на дисплей отображается концентрация сперматозоидов в 1 мл, однако для использования фотометра необходимо его калибровать для каждого вида, проводится калибровка производителем для каждого вида или же пользователем при проведении исследования, что отражается на точности исследования.

Известен способ определение концентрация сперматозоидов с помощью автоматических анализаторов таки как SQA-V, QwikCheck Gold, АФС-500-2 и др., которые позволяют проводить оценки нескольких параметров спермы, однако эти оборудование отличаются высокой стоимости, требует обслуживание высококвалифицированными инженерно-техническими сотрудниками, а также калибровка для использования с целью оценки качества семени разных видов.

Задачей настоящего изобретения является разработка счетной камеры для микроскопии с целью подсчета микроскопических объектов в биологических жидкостях для определения их количество единице объема Камера должна обеспечивать точность определения концентрацию микроскопических объектов в единице объеме несложностью расчетов для определения концентрацию микроскопических объектов, снижать себестоимость теста отличатся удобством и безопасности в эксплуатации, многоразового использования, экологическим безопасным.

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность определения концентрацию микроскопических объектов в единице объеме, оценка подвижности сперматозоидов и оценка морфологии сперматозоидов в нативном, разбавленном и замороженно-оттаянном семени.

Технический результат изобретения достигается за счет того, что, хорошо смешанного капли 10 мкл исследуемой жидкости наносится в центре одного из четырех секторов где имеется счетная сетка площади 1 мм^2, состоящей из 100 квадратов площадью 0,1×0,1 мм, и покрывают покровным стеклом. При высоте 0,01 мм (10 микрона) объем в жидкости в одной квадрате составляет 0,001 мм³ подсчет количество в 10 квадратах умножен на степень разбавление равно количеству микрообъектов в миллионах штук в 1 мл биологической жидкости. Степень разбавления, зависит от концентрации исходного биоматериала. Технический результат изобретения по определению активности сперматозоидов достигается за счет определения % подвижности сперматозоида с помощью видео съемки продолжительности 1 секунды и подсчета обще количества сперматозоидов по формуле: Σn=PR+NPR+IM; где PR - прогрессивно-подвижные, непрогрессивно-подвижные (NPR) и неподвижные (IM) и делением количество сперматозоидов с PR на общей количества сперматозоидов и выраженной в % по формуле: ; где PR_n - количество сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением; Σn- общее количество всех подсчитанных сперматозоидов. При использовании CASA технологии оценки качества спермы проводится с помощью программного обеспечения.

Осуществление изобретения

Предлагаемый нами изобретение было использовано для определения концентрацию и активности сперматозоидов баранов- и быков-производителей.

Подготавливают счетную камеру, и настраивают микроскопа для оценки сперму, если используется CASA технология запускают программу и заполняют первичные данные. Готовят раствор цитрата натрия для разбавления свежеполученной нативной сперму. Температура спермы и разбавителя должно быть одинаковый 37°С. Сперму в зависимости от вида животного разбавляют (баранов 1:200, быков 1:100) раствором цитрата натрия. Для разбавления используют меланжер (для быка и барана эритроцитарных - хряка и жеребца лейкоцитарных. Для определения концентрацию и подвижности камеру и покровное стекло предварительно ставить на термостолик на 5 минут, если задача заключается только в определении концентрацию тогда можно без предварительного подогрева камеры провести анализ. Для анализа в центр одного из четырёх сектора (каждая камера состоит из 4 сектора А;B;C;D) где имеется счетная сетка наносят небольшую хорошо смешанного каплю сперму и покрывают покровным стеклом. Для определения концентрацию в 1 мл считают количество сперматозоидов в 10 квадратах по диагонали, полученные данные умножаем на степень разбавления получаем концентрацию сперматозоидов в млн/мл. Для определения подвижности сперматозоидов с помощью видео фиксации или CASA технологии проводится видеосъёмки продолжительности 1 сек при ×20 увеличении записывают три видео ролика из трех полей, при наличии автоматизированной системы оценки активность сперматозоидов проводится с помощью программного обеспечения, если отсутствует соответствующей программного обеспечение оценки проводят с помощью программ (свободное распространение) позволяющие проводить маркировку на экране. С помощью маркеров проводим маркировку неподвижных (IM), непрогрессивно подвижных (NPR) и прогрессивно подвижных сперматозоидов (PR) и проводят подсчет всех сперматозоидов, определяют обще количества сперматозоидов по формуле: Σn=PR+NPR+IM. Содержание подвижных сперматозоидов PR%, определяют по формуле: где PR_n - количество сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением; Σn- общее количество всех подсчитанных сперматозоидов.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарной медицины и предназначено для определения подвижных сперматозоидов в разбавленной и замороженно-оттаянной сперме баранов- и быков-производителей. Получают, разбавляют свежеполученную нативную или оттаянную замороженную сперму; подготавливают счетную камеру, состоящую из 4 секторов A, B, C, D со счетной сеткой. Заправляют камеру исследуемым образцом: на счетную сетку, состоящую из 100 квадратов площадью 0,1×0,1 мм, наносят каплю спермы и покрывают покровным стеклом, проводят подсчет количества сперматозоидов в десяти квадратах. Определяют концентрацию сперматозоидов в биологической жидкости млн/мл, осуществляют видеосъемку трех видеороликов из трех полей продолжительностью 1 сек. Проводят маркировку сперматозоидов в зависимости от характера движения неподвижных (IM), непрогрессивно подвижных (NPR) и прогрессивно подвижных сперматозоидов (PR). Определяют общее количество сперматозоидов и подвижных сперматозоидов по формуле. Изобретение обеспечивает возможность определения концентрации микроскопических объектов в единице объеме, оценку подвижности сперматозоидов и оценку морфологии сперматозоидов в нативном, разбавленном и замороженно-оттаянном семени.

Способ определения подвижных сперматозоидов в разбавленной и замороженно-оттаянной сперме баранов- и быков-производителей, включающий получение, разбавление свежеполученной нативной или оттаивание замороженной спермы, подготовку счетной камеры, состоящей из 4 секторов A, B, C, D со счетной сеткой, заправку камеры исследуемым образцом: на счетную сетку, состоящую из 100 квадратов площадью 0,1×0,1 мм, наносят каплю спермы и покрывают покровным стеклом, проводят подсчет количества сперматозоидов в десяти квадратах, определяют концентрацию сперматозоидов в биологической жидкости млн/мл, осуществляют видеосъемку трех видеороликов из трех полей продолжительностью 1 сек, проводят маркировку сперматозоидов в зависимости от характера движения неподвижных (IM), непрогрессивно подвижных (NPR) и прогрессивно подвижных сперматозоидов (PR), и определяют общее количество сперматозоидов по формуле: Σn =PR+NPR+IM, а определение подвижных сперматозоидов PR% по формуле: , где PRn - количество сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением; Σn - общее количество всех подсчитанных сперматозоидов.