КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ТРИ СЛИТЫХ БЕЛКА OSPA, ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K14/20 A61K39/02 A61P31/00 A61P31/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей слитый белок OspA с SEQ ID NO: 1 (LipS1D1-S2D1), слитый белок OspA с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок OspA с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1), для применения в вакцине или для применения в способе индукции иммунного ответа у человека против болезни Лайма.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лайм-боррелиоз (также упоминаемый в настоящем описании как «ЛБ»), также называемый болезнью Лайма (также упоминаемой в настоящем описании как «БЛ»), представляет собой быстро распространяющееся клещевое природно-очаговое заболевание, вызываемое несколькими геновидами спирохеты Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.). Это наиболее распространенное трансмиссивное заболевание в Европе и Северной Америке [Mead P.S., Epidemiology of Lyme Disease, Infect Dis Clin N Am 29(2015) 187-210]. В Европе регистрируют от 65000 до 85000 случаев в год, однако из-за непоследовательной регистрации случаев и того факта, что ЛБ часто не диагностируют, это число безусловно занижено [Rizzoli A, et al. Lyme borreliosis in Europe. Euro Surveill 16(2011); Lindgren E, Jaenson TGT, Organization WHO Europe (2006) Lyme borreliosis in Europe: Influences of climate and climate change, epidemiology, ecology and adaptation measures, http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0006/96819/E89522.pdf, последняя оценка проводилась в марте 2016]. По оценкам центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) в Соединенных Штатах количество выявляемых ежегодно случаев составляет приблизительно 300000, что почти в 10 раз превышает зарегистрированные случаи [Hinckley AF, et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clin Infect Dis. 2014 Sep 1; 59(5):676-81. doi: 10.1093/cid/ciu397. Epub 2014 May 30; Nelson CA, et al. Incidence of Clinician-Diagnosed Lyme Disease, United States, 2005-2010. Emerg Infect Dis. 2015 Sep; 21(9):1625-31. doi: 10.3201/eid2109.150417]. Заболеваемость ЛБ имеет бимодальное распределение по возрасту. Двумя основными целевыми группами являются дети в возрасте 5-14 лет и взрослые в возрасте 50-64 лет [Rizzoli A, et al. 2011 г., см. выше; http://www.cdc.gov/lyme/stats/graphs.html, последняя оценка проводилась в марте 2016 г.].

В Европе большинство инфекций у человека вызываются четырьмя геновидами Borrelia, представляющими шесть серотипов OspA (ST): B. afzelii (ST2), B. garinii (ST3, ST5 и ST6), B. burgdorferi sensu stricto (s.s.) (ST1) и B. bavariensis (ST4). В США B. burgdorferi s.s. (ST1) встречается почти в 100% случаев. Недавно был описан новый геновид, названный Borrelia mayonii, обнаруженный в нескольких клинических образцах, выделенных в Верхнем Среднем Западе США [Pritt BS, et al. Identification of a novel pathogenic Borrelia species causing Lyme borreliosis with unusually high spirochaetaemia: a descriptive study, Lancet Infect Dis 2016; 16:556-64].

Наиболее частым клиническим проявлением БЛ является постепенно распространяющаяся эритематозная кожная сыпь, называемая мигрирующей эритемой (МЭ), явный признак ранней локализованной боррелиозной инфекции. МЭ появляется в течение нескольких дней или недель в месте укуса клеща и часто сопровождается симптомами усталости, лихорадки, головной боли, легкой ригидности затылочных мышц, артралгии или миалгии [Mead et al., 2015, см. выше]. Приблизительно в 70-80% случаев БЛ у пациентов развивается МЭ [Stanek G, et al. Lyme borreliosis, Lancet 2012; 379:461-73; Wormser GP, et al, The Clinical Assessment, Treatment, and Prevention of Lyme Disease, Human Granulocytic Anaplasmosis, and Babesiosis: Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America, Clinical Infectious Diseases 2006; 43:1089-134].

При отсутствии лечения или при неадекватном лечении антибиотиками инфекция может распространиться на другие части тела и вызвать серьезные поздние проявления, поражающие нервную систему (паралич лицевого нерва, менингит, миелит и энцефалит), суставы (рецидивирующий или персистирующий синовит крупных суставов) или сердце (например, нарушения проводимости и кардит).

Наиболее распространенные клинические проявления поздней стадии ЛБ, которые развиваются приблизительно у 30% пациентов, включают скелетно-мышечные проявления, такие как артрит Лайма. Артрит Лайма, который развивается через несколько месяцев после укуса клеща, включает повторяющиеся приступы или длительное опухание суставов (синовит), обычно одного или более суставов, чаще всего коленных. Проявления со стороны нервной системы включают нейроборрелиоз Лайма, который чаще всего проявляется в течение нескольких недель после заражения в виде краниальной невропатии с параличом лицевого нерва, возможно с двусторонним поражением (двусторонний паралич Белла). У взрослых заболевание обычно проявляется болезненным менингорадикулоневритом и параличом лицевого нерва. У детей, напротив, чаще всего развиваются головная боль из-за менингита и паралич лицевого нерва. У детей наблюдаются более быстро проходящие симптомы и более легкий исход болезни. Проявления со стороны сердца при БЛ встречаются редко, а кардит Лайма обычно проявляется в течение двух месяцев после заражения в виде миокардита с острой перемежающейся атриовентрикулярной блокадой. В Европе более тяжелые кожные проявления (например, хронический атрофический акродерматит (ACA), боррелиозная лимфоцитома) могут быть результатом диссеминированной инфекции в качестве поздних осложнений [Stanek et al. 2012, выше].

Белок внешней поверхности A (OspA) является одним из доминирующих белков, экспрессируемых Borrelia burgdorferi s.l. при ее наличии у голодного клеща. В процессе поглощения пищи поступающая в организм клеща кровь сигнализирует о снижении экспрессии OspA, позволяя спирохетам проникать в эпителий кишечника, мигрировать в слюнные железы и далее в кровь хозяина [Schwan TG and Piesman J. Temporal changes in outer surface proteins A and C of the Lyme disease-associated spirochete, Borrelia burgdorferi, during the chain of infection in ticks and mice. J Clin Microbiol 2000,38:382-8]. Вакцины на основе OspA, направленные против ЛБ, индуцируют образование антител, которые действуют в кишечнике клеща на спирохеты, экспрессирующие OspA, блокируя передачу спирохеты в слюнные железы и впоследствии позвоночному хозяину [de Silva AM и Telford SR 3rd, Brunet LR, Barthold SW, Fikrig E., J Exp Med. 1996, 183(1):271-5].

Две вакцины, содержащие OspA, выделенные из B. burgdorferi s.s. (ST1), ранее продемонстрировали свою эффективность в предотвращении ЛБ у людей: LYMErix (SmithKline Beecham) [Steere AC, et al., Lyme Disease Vaccine Study Group, Vaccination against Lyme disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A with adjuvant, N Engl J Med. 1998;339(4):209-15] и ImuLyme (Pasteur Mérieux Connaught) [Sigal LH, et al., A vaccine consisting of recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein A to prevent Lyme disease, N Engl J Med. 1998; 339(4):216-22]. LYMErix была лицензирована и коммерчески доступна с 1998 по 2002 год, пока не была добровольно снята с продаж. После лицензирования LYMErix была выдвинута гипотеза о возможной связи между вакциной против болезни Лайма и реакциями суставов по причине частичной гомологии используемого в вакцине OspA ST1 с hLFA-1 (антигеном-1, ассоциированным с функцией лейкоцитов человека), который, как утверждалось, индуцирует резистентный к антибиотикам Лайм-артрит в подгруппе естественно инфицированных пациентов [Gross DM, et al., Identification of LFA-1 as a candidate autoantigen in treatment-resistant Lyme arthritis, Science. 1998 Jul 31; 281(5377):703-6]. Однако доказать эту гипотезу не было возможности. Напротив, ретроспективное изучение жалоб на суставы, зарегистрированных в Системе отчетности о неблагоприятных событиях после вакцинации (VAERS), после распределения более 1400000 доз в течение первых 19 месяцев после лицензирования вакцины, не выявило необычного количества таких жалоб [Lathrop SL, et al., Adverse event reports following vaccination for Lyme disease: December 1998-July 2000, Vaccine 20 (2002) 1603-1608]. В фазе III исследования вакцины заболеваемость транзиторной артралгией была незначительно увеличена у вакцинированных, но заболеваемость артритом не была увеличена по сравнению с группой плацебо [Steere, et al., 1998, см. выше].

Совсем недавно компания Baxter провела исследование фазы I/II аналогичной поливалентной вакцины-кандидата на основе OspA, которая показала свою безопасность, хорошую переносимость и высокую иммуногенность [Wressnigg N, et al.; Safety and immunogenicity of a novel multivalent OspA vaccine against Lyme borreliosis in healthy adults: a double-blind, randomised, dose-escalation phase 1/2 trial, Lancet Infect Dis. 2013 Aug; 13(8):680-9; Wressnigg N, et al., A Novel multivalent OspA vaccine against Lyme borreliosis is safe and immunogenic in an adult population previously infected with Borrelia burgdorferi sensu lato, Clin Vaccine Immunol. 2014 Nov; 21(11):1490-9]. Однако в настоящее время дальнейшие работы по разработке этой вакцины не проводятся. В настоящее время на рынке нет вакцины против ЛБ, и ни одна другая вакцина-кандидат против ЛБ не находится на стадии клинической разработки.

Поливалентная вакцина против Лайм-боррелиоза по настоящему изобретению содержит иммунодоминантную С-концевую часть шести наиболее распространенных серотипов OspA, присутствующих в Европе (от ST1 до ST6) и США (ST1), и предназначена для индукции анти-OspA антител для нейтрализации Borrelia в кишечнике клеща, блокируя его передачу хозяину. В мышиных моделях, в которых для заражения использовали либо инфицированных клещей, либо выращенных in vitro спирохет, было показано, что мультимерная вакцина против Borrelia обладает высокой степенью защиты от четырех геновидов Borrelia (B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis и B. garinii), включая пять клинически значимых серотипов OspA (ST1, ST2, ST4-ST6).

В прошлом было показано, что вакцины на основе OspA являются эффективными у людей. Поливалентная вакцина против Borrelia компании Valneva способна предотвращать заражение наиболее распространенным штаммом B. burgdorferi s.l. и серотипами OspA, присутствующими в Европе и США.

Для вакцин на основе OspA требуются высокие и устойчивые титры антител, что связано с их механизмом действия (вне организма).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг. 1. Анализ бактерицидной активности сыворотки, используемый в качестве функционального анализа in vitro (см. Материалы и методы).

Фиг. 2. План исследования (первое исследование фазы 1 на людях), включая бустерную иммунизацию выбранных субъектов из группы, получавшей высокие дозы, через 13 месяцев (дополнительная бустерная иммунизация).

Фиг. 3А-3В. Данные фазы 1: Данные по иммуногенности в день 84, выборка пациентов, выполнивших требования протокола (PP) (т.е. субъекты, получившие все три иммунизации в правильной дозе и в правильный момент времени в соответствии с протоколом), для каждого серотипа: Фиг 3A) средний геометрический титр IgG (GMT); и Фиг. 3B) показатель сероконверсии, определяемый как процент субъектов, достигших ≥4-кратного увеличения титра IgG по сравнению с исходным уровнем.

Фиг. 4А-4D. Данные фазы 1: значения GMT IgG, PP популяция бустерной иммунизации (т.е. субъекты, включенные в фазу дополнительной бустерной иммунизации и получившие правильную бустерную дозу в правильный момент времени в соответствии с протоколом), для каждого серотипа, на фиг. 4A) Д84, фиг. 4B) M13, фиг. 4C) M14 и фиг. 4D) M19.

Фиг. 5А-5F. Данные фазы 1: серотип-специфические значения GMT IgG, PP популяция бустерной иммунизации, с течением времени. Фиг. 5A) ST1, фиг. 5B) ST2, фиг. 5C) ST3, фиг. 5D) ST4, фиг. 5E) ST5, фиг. 5F) ST6.

Фиг. 6А-6С. Данные фазы 1: сравнение титров ELISA с титрами SBA. Фиг. 6A) Серотип 1 (ST1) - образцы с титрами ELISA ниже 100 ЕД/мл редко давали положительный результат в SBA. Всего было собрано 116 достоверных точек данных SBA. Нижний предел количественного определения (LLOQ) ST1 в методе SBA устанавливали равным 20, и отрицательным образцам присваивали значение 10. Фиг. 6B) ST2 - образцы с титрами ELISA ниже 200 ЕД/мл редко давали положительный результат в SBA. Всего было собрано 48 достоверных точек данных SBA. LLOQ ST2 в SBA устанавливали равным 20, и отрицательным образцам присваивали значение 10. Фиг. 6C) ST3 - образцы с титрами ELISA ниже 100 Ед/мл редко давали положительный результат в SBA. Всего было собрано 122 действительные точки данных SBA. LLOQ ST3 в SBA устанавливали равным 160, и отрицательным образцам присваивали значение 80.

Фиг. 7. Первое испытание фазы 2: План исследования (первое испытание фазы 2) поливалентной вакцины против Borrelia по изобретению, в котором исследовали 3 дозы адъювантной вакцины А (90 мкг, 135 мкг и 180 мкг) в «вводной фазе» и 2 группы с выбранными дозами (135 мкг, 180 мкг) в «основной фазе исследования».

Фиг. 8. Второе испытание фазы 2. План клинических испытаний фазы 2 поливалентной вакцины против Borrelia по изобретению, в котором изучали альтернативный график иммунизации.

Фиг. 9А-9F. титр корреляции ELISA-SBA, день 208, объединенные группы лечения мультимерной вакциной против Borrelia, PP попляция без серопозитивных по SBA субъектов на исходном уровне. (Фиг. 9A) Коэффициент корреляции Спирмена: 0,7083, p-значение: <0,0001; (Фиг. 9B) Коэффициент корреляции Спирмена: 0,8217, p-значение: <0,0001; (Фиг. 9C) Коэффициент корреляции Спирмена: 0,9131, p-значение: <0,0001; (Фиг. 9D) Коэффициент корреляции Спирмена: 0,6487, p-значение: <0,0001; (Фиг. 9E) Коэффициент корреляции Спирмена: 0,6554, p-значение: <0,0001; (Фиг. 9F) Коэффициент корреляции Спирмена: 0,7818, p-значение: <0,0001.

Фиг. 10: Показатели сероконверсии для OspA-специфического IgG, на серотип, Д85, выборка PP. Скобки обозначают значимые различия между группами. Значимых различий между группами лечения 135 мкг и 180 мкг не наблюдалось.

Фиг. 11: Показатели сероконверсии для OspA-специфического IgG, на серотип, Д208, выборка PP. Скобки обозначают значимые различия между группами. Значимых различий между группами лечения 135 мкг и 180 мкг не наблюдалось.

Фиг. 12: Обратная кумулятивная функция распределения для ELISA - ST1. Процент субъектов по сравнению с OspA-специфическим IgG на единицу времени. Верхняя панель: группа лечения 135 мкг. Нижняя панель: группа лечения 180 мкг.

Фиг. 13: Обратная кумулятивная функция распределения для ELISA - ST2, процент субъектов по сравнению с OspA-специфическим IgG на единицу времени. Верхняя панель: группа лечения 135 мкг. Нижняя панель: группа лечения 180 мкг.

Фиг. 14: Обратная кумулятивная функция распределения для ELISA - ST3, процент субъектов по сравнению с OspA-специфическим IgG на единицу времени. Верхняя панель: группа лечения 135 мкг. Нижняя панель: группа лечения 180 мкг.

Фиг. 15: Обратная кумулятивная функция распределения для ELISA - ST4, процент субъектов по сравнению с OspA-специфическим IgG на единицу времени. Верхняя панель: группа лечения 135 мкг. Нижняя панель: группа лечения 180 мкг.

Фиг. 16: Обратная кумулятивная функция распределения для ELISA - ST5, процент субъектов по сравнению с OspA-специфическим IgG на единицу времени. Верхняя панель: группа лечения 135 мкг. Нижняя панель: группа лечения 180 мкг.

Фиг. 17: Обратная кумулятивная функция распределения для ELISA - процент субъектов ST6 по сравнению с OspA-специфическим IgG на единицу времени. Верхняя панель: группа лечения 135 мкг. Нижняя панель: группа лечения 180 мкг.

Фиг. 18A-18B: ELISA OspA-специфические IgG-антитела (GMT) для каждого серотипа с течением времени, выборка PP. Фиг. 18А) группа 135 мкг; Фиг. 18В) группа 180 мкг.

Фиг. 19: Зачисление субъектов на фазу 2 клинического испытания поливалентной вакцины против Borrelia для изучения трехдозового или двухдозового графика первичной иммунизации, который применяли в порядке убывания возраста, поэтапно для трех возрастных когорт.

Фиг. 20: План клинических испытаний фазы 2 поливалентной вакцины против Borrelia по изучению трехдозового или двухдозового графика первичной иммунизации вакциной и бустерной дозы в исследуемой популяции в возрасте от 5 до 65 лет.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1), для применения в качестве вакцины, где вакцина предназначена для введения i) взрослому человеку не менее трех раз при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу или, более предпочтительно, от 120 до 200 мкг на дозу или ii) человеческому ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу или от 120 до 200 мкг на дозу, или от 60 до 100 мкг на дозу. Альтернативно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1), для применения в качестве вакцины, где вакцина предназначена для введения i) взрослому человеку не менее двух раз при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу или более предпочтительно от 120 до 200 мкг на дозу или ii) человеческому ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу или от 120 до 200 мкг на дозу или от 60 до 100 мкг на дозу. Указанная композиция, содержащая слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1), также взаимозаменяемо упоминается в настоящем описании как «вакцина А» или мультимерная вакцина против Borrelia («MBV»).

Вышеупомянутые слитые белки (иногда также называемые гетеродимерами) происходят от белка A внешней поверхности Borrelia (OspA). OspA экспрессируется Borrelia только тогда, когда она находится в кишечнике клеща-переносчика. Таким образом, анти-OspA антитела, вырабатываемые при вакцинации, не борются с инфекцией в организме, а попадают в кишечник клеща, когда он питается кровью. Там антитела, вероятно, нейтрализуют спирохеты и блокируют миграцию бактерий из средней кишки в слюнные железы клеща, путь, по которому Borrelia проникает в позвоночного хозяина. Таким образом, OspA-специфические антитела предотвращают передачу Borrelia от клеща-переносчика человеку-хозяину.

Вышеупомянутые белки представляют собой слитые белки липидированного мутантного фрагмента OspA, содержащего гибридный C-концевой фрагмент OspA, где гибридный фрагмент состоит из C-концевого домена OspA Borrelia, состоящего из фрагмента, полученного из OspA штамма Borrelia, отличного от B. garinii, штамма PBr, и второго фрагмента OspA, полученного от B. garinii, штамма PBr, и отличается от соответствующей последовательности дикого типа по меньшей мере введением по меньшей мере одной дисульфидной связи. Дисульфидные связи представляют собой дисульфидные связи Типа 1, в которых остатки цистеина вставлены в положения 183 +/-3 и 270 +/-3 (дополнительную информацию см. в WO 2015/104396 A1). S3hyb означает слияние аминокислот 125-176 B. valaisiana и аминокислот 177-274 B. garinii, штамм PBr. Lip означает липидирование и указывает на N-концевое добавление остатков глицерина и жирных кислот. Пептидный линкер «LN1» представляет собой слияние двух отдельных петлевых участков N-концевой половины OspA из B. burgdorferi s.s., штамм B31 (аминокислоты 65-74 и 42-53, с аминокислотной заменой в положении 53 D53S), который имеет следующую последовательность: gtsdknngsgskeknkdgkys (SEQ ID NO: 7).

В частности, Lip-S1D1-S2D1 представляет собой слитый белок OspA серотипа 1 и OspA серотипа 2 с дисульфидной связью типа 1 и содержит N-концевой CSS для добавления липидов, линкерную последовательность LN1 и N-концевое липидирование. Аминокислоты 164-174 OspA серотипа 1 заменены не-hLFA-1-подобной последовательностью NFTLEGKVAND (SEQ ID NO: 8). Последовательность показана в виде следующей SEQ ID NO: 1:

Lip-S1D1-S2D1-aa SEQ ID NO: 1

Lipcssfnekgevsekiitradgtrleytgiksdgsgkakevlknftlegkvandkttlvvkcgtvtlsknisksgevsvelndtdssaatkktaawnsgtstltitvnskktkdlvftkentitvqqydsngtklegsaveitkldeicnalkgtsdknngsgskeknkdgkysfnekgelsaktmtrengtkleytemksdgtgkakevlknftlegkvandkvtlevkcgtvtlskeiaksgevtvalndtnttqatkktgawdsktstltisvnskkttqlvftkqdtitvqkydsagtnlegtaveiktldelcnalk

Lip-S4D1-S3hybD1 представляет собой слитый белок OspA серотипа 4 и OspA серотипа 3, содержащий аминокислоты 125-176 B. valaisiana, штамм VS116, и аминокислоты 177-274 B. garinii, штамм PBr, серотип 3, с дисульфидной связью типа 1 и содержит N-концевой CSS для добавления липидов, линкерную последовательность LN1 и N-концевое липидирование. Последовательность показана в виде следующей SEQ ID NO: 2:

Lip-S4D1-S3hybD1-aa SEQ ID NO: 2

LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

Lip-S5D1-S6D1 представляет собой слитый белок OspA, оба серотипа 6, с дисульфидной связью типа 1, N-концевой CSS для добавления липидов, линкерной последовательностью LN1 и N-концевым липидированием. Последовательность показана в виде следующей SEQ ID NO: 2:

Lip-S5D1-S6D1-aa SEQ ID NO: 3

Lipcssfnekgeisektivrangtrleytdiksdktgkakevlkdftlegtlaadgkttlkvtcgtvtlsknisksgeitvalddtdssgnkksgtwdsgtstltisknrtktkqlvftkedtitvqnydsagtnlegkaveittlkelcnalkgtsdknngsgskeknkdgkysfngkgetsektivrangtrleytdiksdgsgkakevlkdftlegtlaadgkttlkvtcgtvvlsknilksgeitaalddsdttratkktgkwdsktstltisvnsqktknlvftkedtitvqrydsagtnlegkaveittlkelcnalk

Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вышеуказанные слитые белки являются следующими:

Lip-S1D1-S2D1-nt SEQ ID NO: 4

atgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggttgctcaagcttcaacgaaaagggcgaagtcagcgaaaaaatcattacccgcgcagacggcacccgcctggaatacaccggcatcaaatcggacggcagcggcaaagcgaaagaagttctgaaaaactttaccctggaaggcaaagtcgcaaatgataaaaccaccctggtggtgaaatgcggcaccgttacgctgagcaaaaacattagtaaatccggtgaagtctctgtggaactgaatgataccgacagctctgcggccaccaagaaaaccgcagcttggaactcaggcacctcgacgctgaccattacggttaatagcaagaaaaccaaagatctggtcttcacgaaagaaaacaccatcacggtgcagcaatatgacagcaatggtaccaaactggaaggctccgctgtggaaatcacgaaactggatgaaatctgtaatgctctgaaaggtactagtgacaaaaacaatggctctggtagcaaagagaaaaacaaagatggcaagtactcattcaacgaaaaaggcgaactgtcggcgaaaacgatgacgcgtgaaaacggcaccaaactggaatatacggaaatgaaaagcgatggcaccggtaaagcgaaagaagttctgaaaaactttaccctggaaggcaaagtcgccaatgacaaagtcaccctggaagtgaaatgcggcaccgttacgctgtcaaaagaaattgcaaaatcgggtgaagtgaccgttgctctgaacgatacgaataccacgcaagcgaccaagaaaaccggcgcctgggacagcaaaacctctacgctgaccattagtgttaatagcaagaaaaccacgcagctggtcttcaccaaacaagatacgatcaccgtgcagaaatacgacagtgcgggtaccaacctggaaggcacggctgttgaaatcaaaaccctggacgaactgtgtaacgccctgaaa

Lip-S4D1-S3hybD1-nt SEQ ID NO: 5

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGAAGTGAGCGAAAAAATTCTGACCCGTAGCAATGGCACCACCCTGGAATATAGCCAGATGACCGATGCAGAAAATGCAACCAAAGCAGTTGAAACCCTGAAAAACGGTATTAAACTGCCTGGTAATCTGGTTGGTGGTAAAACCAAACTGACCGTTACCTGTGGCACCGTTACCCTGAGCAAAAACATTAGCAAAAGCGGTGAAATTACCGTGGCACTGAATGATACCGAAACCACACCGGCAGACAAAAAAACCGGTGAATGGAAAAGCGATACCAGCACCCTGACCATTAGTAAAAATAGCCAGAAAACAAAACAGCTGGTGTTTACCAAAGAAAACACCATTACCGTGCAGAATTATAACCGTGCAGGTAATGCACTGGAAGGTAGTCCGGCAGAAATTAAAGATCTGGCAGAACTGTGTGCAGCCCTGAAATAA

Lip-S5D1-S6D1-nt SEQ ID NO: 6

atgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggttgctcaagcttcaacgaaaagggcgaaatctcagaaaaaaccatcgtccgcgctaacggcacccgcctggaatacaccgacatcaaatcagacaagaccggtaaagcgaaggaagttctgaaagattttacgctggaaggtaccctggcagcagacggtaaaaccacgctgaaggtgacctgcggtaccgttacgctgtccaaaaacattagtaagtccggcgaaatcacggtcgccctggatgacaccgatagctctggcaacaaaaagagcggtacctgggattcaggcacctcgacgctgaccatttctaaaaatcgtacgaaaaccaagcagctggtcttcacgaaagaagatacgatcaccgtgcaaaactatgacagcgcaggtaccaatctggaaggcaaagctgtggaaattaccacgctgaaagaactgtgtaatgctctgaaaggtactagtgacaaaaacaatggctctggtagcaaagagaaaaacaaagatggcaagtactcattcaacggcaaaggtgaaacgagcgaaaagaccatcgtgcgtgcgaacggtacccgcctggaatatacggacattaaatcggacggcagcggcaaagcaaaggaagtcctgaaagattttacgctggaaggtaccctggcagcagacggtaaaaccacgctgaaggtgacgtgcggcaccgtggttctgtcaaaaaacattctgaagtcgggtgaaatcaccgcagctctggatgacagcgataccacgcgtgctacgaaaaagaccggtaaatgggatagcaagacctctacgctgaccattagtgtcaactcccagaaaacgaagaatctggtgttcaccaaagaagatacgatcaccgttcaacgctatgacagtgcgggcaccaacctggaaggcaaagccgttgaaattaccacgctgaaagaactgtgtaatgctctgaaa

Дополнительная информация о слитых белках и их продуцировании содержится в WO 2015/104396 A1, где Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 и Lip-S5D1-S6D1 соответствуют SEQ ID NO: 29, 27 и 33, соответственно.

Как подробно описано выше, слитые белки представляют собой липидированные белки, в которых липидные фрагменты вместе с глицериновой группой также обозначены как «Lip». В соответствии с изобретением Lip содержит от одного до трех липидов, таких как C_14-20 алкил и/или C_14-20 алкенил, присоединенных к глицерину, и аминогруппу N-концевого цистеина полипептида по изобретению, или предпочтительно Lip представляет собой часть формулы (I), как указано ниже:

где один из R₁, R₂ или R₃ представляет собой C_14-C₂₀ алкил или алкенил, и каждый из остальных независимо представляет собой C₁₄-C₂₀ алкил или C₁₄-C₂₀ алкенил, и X представляет собой аминокислотную последовательность, присоединенную к остатку цистеина, показанному в Формуле (I). Более предпочтительно, Lip плюс N-концевой цистеин полипептида представляет собой N-пальмитоил-S-(2RS)-2,3-бис-(пальмитоилокси)пропилцистеин (обозначенный в настоящем описании как «Pam₃Cys») и связан через С карбонильной группы цистеина с указанной аминокислотной последовательностью по изобретению. В приведенной выше Формуле (I) R₁, R₂ и R₃ будут представлять собой пальмитоильные фрагменты, и X представляет собой аминокислотную последовательность, присоединенную к остатку цистеина.

Слитые белки включены в композицию. Композиция является фармацевтически приемлемой, что позволяет вводить ее человеку. Она необязательно может содержать любой фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество, такое как буферные вещества, стабилизаторы или дополнительные активные ингредиенты, особенно ингредиенты, известные в связи с фармацевтическими композициями и/или производством вакцин. Композиция может содержать фосфат натрия, хлорид натрия, L-метионин, сахарозу и полисорбат-20 (Tween-20) при рН 6,7±0,2. Предпочтительно фармацевтическая композиция также содержит гидроксид алюминия, предпочтительно в концентрации 0,15%. Композиция также может содержать от 5 мМ до 50 мМ фосфата натрия, от 100 до 200 мМ хлорида натрия, от 5 мМ до 25 мМ L-метионина, от 2,5% до 10% сахарозы, от 0,01% до 0,1% Tween-20 и от 0,1% и 0,2% (мас./об.) гидроксида алюминия. Более предпочтительно состав содержит 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 10 мМ L-метионина, 5% сахарозы, 0,05% Tween-20 и 0,15% (мас./об.) гидроксида алюминия при рН 6,7±0,2. В предпочтительном варианте осуществления вспомогательным веществом является L-метионин.

В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую слитые белки, вводят субъекту в объеме от приблизительно 0,25 миллилитра (мл) до приблизительно 1,0 мл или более, например, 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл или 1,0 мл. В одном из вариантов осуществления объем, вводимый субъекту, находится в диапазоне от 0,25 мл до 1,0 мл или от 0,25 мл до 0,5 мл, или от 0,5 мл до 1,0 мл. В одном из вариантов осуществления объем, вводимый субъекту, составляет приблизительно 0,25 мл, приблизительно 0,5 мл или приблизительно 1,0 мл. В одном из вариантов осуществления объем, вводимый субъекту, составляет 0,25 мл, 0,5 мл или 1,0 мл. В одном из вариантов осуществления объем, вводимый субъекту, составляет 0,25 мл. В одном из вариантов осуществления объем, вводимый субъекту, составляет 0,5 мл. В одном из вариантов осуществления объем, вводимый субъекту, составляет 1,0 мл. В предпочтительном варианте осуществления объем, вводимый субъекту в возрасте 5 лет или старше (например, от 5 до 17 лет, от 5 до 11 лет, от 12 до 17 лет, 18 лет или старше, от 18 до 65 лет или 50 лет или старше) составляет 0,5 мл или 1,0 мл. В предпочтительном варианте осуществления объем, вводимый субъекту в возрасте 5 лет или старше (например, от 5 до 17 лет, от 5 до 11 лет, от 12 до 17 лет, 18 лет или старше, от 18 до 65 лет или 50 лет и старше) составляет 1,0 мл. В еще одном предпочтительном варианте осуществления объем, вводимый субъекту в возрасте 5 лет или старше (например, от 5 до 17 лет, от 5 до 11 лет, от 12 до 17 лет, 18 лет или старше, от 18 до 65 лет, или 50 лет или старше) составляет 0,5 мл. В еще одном предпочтительном варианте осуществления объем, вводимый субъекту в возрасте от 0 до 4 лет (например, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет), составляет 0,25 мл.

Согласно изобретению композицию используют в качестве вакцины, в частности, против инфекции, вызываемой видами Borrelia, более предпочтительно патогенными видами Borrelia, раскрытыми в настоящем описании, более предпочтительно содержащими B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis и B. garinii, и/или другими патогенами, против которых в вакцину были включены антигены. Предпочтительно виды Borrelia выбраны из B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi или B. sinica, предпочтительно B. burgdorferi s.s., B. afzelii и B. garinii.

Было обнаружено, что конкретный график введения является предпочтительным, особенно для получения устойчивого защитного эффекта против всех серотипов OspA Borrelia. Это касается минимального количества введений, а также диапазона доз. В соответствии с этим вакцину следует вводить взрослому человеку не менее трех раз при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу или более предпочтительно от 120 до 200 мкг на дозу, или человеческому ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу, или от 120 до 200 мкг на дозу, или от 60 до 100 мкг на дозу. В некоторых вариантах осуществления вакцину следует вводить взрослому человеку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу или более предпочтительно от 120 до 200 мкг на дозу или человеческому ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 200 мкг на дозу или от 120 до 200 мкг на дозу, или от 60 до 100 мкг на дозу.

Первые данные демонстрируют, что вакцины по настоящему изобретению, такие как вакцина А, в дозах 135 мкг и 180 мкг общего содержания слитых белков на дозу оказались более эффективными, чем доза 90 мкг (см. пример 2). Соответственно, общее содержание белка 3 слитых белках находится в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу для взрослого человека (взрослая доза). Для детей можно применять половину указанных выше доз, т.е. 60-100 мкг (половинная доза), но доза для взрослых также может быть подходящей, т.е. от 120 до 200 мкг (взрослая доза). В контексте введения половинных доз человеческий ребенок обычно является ребенком младшего возраста от рождения до 4 лет (0-4 лет), от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет. Дети более старшего возраста (от 5 до 17 лет), в том числе подростки (от 12 до 17 лет), получают дозу взрослого.

Ввиду особого механизма действия этой вакцины, происходящего вне организма человека, крайне важное значение имеет постоянное наличие относительно высоких титров антител в течение всего клещевого сезона. Кроме того, нельзя ожидать появления естественного бустерного эффекта для имеющихся OspA-специфических антител при естественном заражении, поскольку OspA присутствует на поверхности Borrelia только до тех пор, пока Borrelia находятся в средней кишке клеща, а не после возможного проникновения антител в человека-хозяина. Следовательно, необходимы высокие титры антител, и композицию следует вводить по меньшей мере три раза или, альтернативно, два раза. В соответствии с этим композицию можно вводить два раза, три раза, четыре раза, пять раз или даже чаще.

Первая первичная иммунизация указана в настоящем описании как серия 0-2-6 месячных иммунизаций. Дальнейшие введения представляют собой бустерные дозы для повторного воздействия вакцины и обычно применяются каждые 12 месяцев после 3-й первичной иммунизации (т.е. первую бустерную иммунизацию осуществляют на 18-м месяце). Альтернативно, первая первичная иммунизация указана в настоящем описании как серия 0-6 месячных иммунизаций. Дальнейшие введения представляют собой бустерные дозы для повторного воздействия вакцины и обычно применяются каждые 12 месяцев после 2-й первичной иммунизации (т.е. первую бустерную иммунизацию осуществляют на 18-м месяце). Бустерные дозы повышают иммунитет до защитного уровня после снижения титров с течением временем (см. Пример 1). Было показано, что в случае композиции по настоящему изобретению бустерные иммунизации необходимы для поддержания высоких уровней антител OspA, необходимых для обеспечения защиты.

Хотя бустерные дозы обычно применяются каждые 12 месяцев, в пределах 12-месяцев бустерные дозы можно вводить в течение нескольких месяцев, например в период между 9-15 месяцами после последней дозы первичной иммунизации (например, через 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев или 15 месяцев) или после последующих бустерных доз (например, через 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев или 15 месяцев после первой или последующих бустерных доз).

Композицию по настоящему изобретению можно вводить человеку в виде инъекционной композиции, например, в виде стерильной водной дисперсии, предпочтительно изотонической. Композицию можно вводить системно или через слизистую. Эти введения могут включать внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную или подкожную инъекцию; или через слизистую ротового/пищеварительного, респираторного или мочеполового трактов. Хотя вакцину по настоящему изобретению можно вводить в виде комбинации 3 слитых белков, ее компоненты (т.е. отдельные слитые белки) также можно вводить по отдельности в одно и то же время или последовательно или в виде однокомпонентной вакцины (т.е. S1D1-S2D1).

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1), для применения в способе индукции иммунного ответа против Лайм-боррелиоза у человека, где способ включает введение человеку композиции по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, или в случае человеческого ребенка (в частности, ребенка младшего возраста от 0 до 4 лет, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет) только половину дозы, например, по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу. Альтернативно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1), для применения в способе индукции иммунного ответа против Лайм-боррелиоза у человека, где способ включает введение человеку композиции по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка или в случае человеческого ребенка (в частности, ребенка младшего возраста от 0 до 4 лет, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет) половину дозы, например, по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

Приведенные выше определения и комментарии в отношении первого аспекта изобретения применимы также и ко второму аспекту изобретения.

Во втором аспекте композиция используется в способе индукции иммунного ответа у человека против болезни Лайма, вызванной видами Borrelia, более предпочтительно патогенными видами Borrelia, раскрытыми в настоящем документе, более предпочтительно содержащими B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis и B.garinii, и/или другими патогенами, против которых в композицию были включены антигены. Предпочтительно композиция предназначена для применения в способе индукции иммунного ответа против B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi или B. sinica, предпочтительно B. burgdorferi s.s., B. afzelii и/или B. garinii.

Лайм-боррелиоз, или болезнь Лайма, является наиболее распространенным клещевым заболеванием в Европе и Северной Америке. Заболевание вызывается инфекцией переносимой членистоногими грамотрицательной спирохеты Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi s.l.) и может поражать множество органов или тканей, приводя к кожным, сердечным, скелетно-мышечным и неврологическим расстройствам. В большинстве стран Лайм-боррелиоз не является болезнью, подлежащей обязательной регистрации; поэтому точные данные о годовой частоте случаев заболевания отсутствуют. В Соединенных Штатах возбудителем является B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.), и Лайм-боррелиоз локализуется в северо-восточных, среднеатлантических и верхних северо-центральных штатах. В 2010 году в Центрах по контролю и профилактике заболеваний (CDC) в США было зарегистрировано 30000 случаев Лайм-боррелиоза. Согласно обновленному отчету CDC за 2013 г., в котором учтены диагностические данные из других источников, фактическое число новых случаев в год в США приближается к 300000 (http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.html). В Европе основными возбудителями Лайм-боррелиоза являются B. afzelii и B. garinii, а также B. burgdorferi s.s. и B. bavariensis, которые вносят меньший вклад, исходя из географического положения. Распространенность клещевого боррелиоза в разных европейских странах различается в значительной степени с общей тенденцией к увеличению распространенности с запада на восток. В большей части Европы число зарегистрированных случаев клещевого боррелиоза увеличилось с начала 1990-х годов (например, в Чешской Республике, Эстонии, Литве; см. Лайм-боррелиоз в Европе, отчет ВОЗ за 2006 г.), и также расширилось географическое распределение случаев.

Как подробно описано выше, для поддержания высоких уровней антител к OspA необходимы высокие титры антител после первичной иммунизации и после бустерных доз. В частности, широкий график первичной иммунизации (например, месяцы 0-2-6) оказался подходящим в контексте настоящего изобретения (см. пример 3). В качестве альтернативы можно использовать график первичной иммунизации двумя дозами (например, месяцы 0-6).

Таким образом, указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению предпочтительно характеризуются тем, что второе введение проводят в период от по меньшей мере 4-6 недель до не более 3 месяцев после первого введения и/или третье введение проводят в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения. В соответствии с этим первое введение проводят в нулевой момент времени (день 1), второе введение - в период от по меньшей мере 6 недель до не более 3 месяцев после этого, и третье введение - в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения. Дальнейшую бустерную иммунизацию можно выполнять каждый год, например через 12 месяцев, 24 месяца, 36 месяцев и т.д. после 3-го введения вакцины (т.е. после иммунизации в 6 месяце). В качестве альтернативы, второе введение проводят в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения. В соответствии с этим первое введение происходит в нулевой момент времени (день 1), второе введение - в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения. Дальнейшую бустерную иммунизацию можно выполнять каждый год, например через 12 месяцев, 24 месяца, 36 месяцев и т.д. после второго введения вакцины (т.е. после иммунизации в 6 месяце). Соответственно, композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно характеризуются тем, что дальнейшие введения осуществляют каждый год после третьего введения (или, альтернативно, после второго введения при 0-6-месячном графике двухдозовой первичной иммунизации), в частности, через 1 год, 2 года и 3 года и т.д. Указанные бустерные дозы как правило можно вводить до начала сезона клещей, т.е. приблизительно с февраля по июнь в северном полушарии и приблизительно с сентября по декабрь в южном полушарии.

Более предпочтительно, вышеуказанные композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 40 дней до не более 80 дней, в частности, в период от по меньшей мере 50 дней до не более 70 дней, более конкретно, в период от по меньшей мере 50 дней до не более 60 дней, особенно через 56 дней после первого введения.

Также более предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что третье введение проводят в период от по меньшей мере 120 дней до не более 240 дней, в период от по меньшей мере 175 дней до не более 185 дней, особенно через 180 дней после первого введения. Альтернативно, вышеуказанные композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что второе введение проводят в период от по меньшей мере 120 до не более 240 дней, в период от по меньшей мере 175 до не более 185 дней, особенно через 180 дней после первого введения.

В некоторых случаях может потребоваться или желательно одно или более дополнительных введений. В соответствии с этим четвертое введение композиции (или, альтернативно, третье введение в случае 0-6-месячного графика первичной иммунизации двумя дозами) может осуществляться в период от по меньшей мере 15 месяцев до не более 21 месяца, особенно в период от по меньшей мере 17 месяцев до не более 19 месяцев, особенно через 18 месяцев, после первого введения.

Предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что для взрослого человека (в возрасте 18 лет или старше, включая от 18 до 65 лет) общее содержание белка указанных 3 слитых белков находится в диапазоне от 135 мкг до 180 мкг на дозу, особенно 135 мкг или 180 мкг на дозу. Дозы с общим содержанием белка указанных 3 слитых белков, равные 135 мкг и 180 мкг, оказались особенно подходящими для обеспечения устойчивого защитного действия против всех серотипов OspA Borrelia (см. примеры 2 и 3). Соответственно, можно сделать вывод о наличии эффекта во всем диапазоне от 135 мкг до 180 мкг общего содержания белка указанных 3 гетеродимеров на дозу. Как указано выше, для детей младшего возраста (от рождения до 4 лет) можно использовать половинную дозу (при этом полная доза также может быть подходящей). Соответственно, для человеческого ребенка (в частности, ребенка младшего возраста от рождения до 4 лет, например, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет) общее содержание белка указанных 3 слитых белков находится в диапазоне от 67,5 мкг до 90 мкг на дозу, особенно 67,5 мкг или 90 мкг на дозу. Для детей старшего возраста (в возрасте от 5 до 17 лет), включая подростков (в возрасте от 12 до 17 лет), можно использовать полную дозу с общим содержанием белка указанных 3 гетеродимеров на дозу от 135 мкг до 180 мкг.

Предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что 3 слитых белка составляют по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно 80% всех белков в композиции. Специалисту в данной области техники очевидно, что композиция для применения по настоящему изобретению может также включать дополнительные белки, отличные от слитых белков c SEQ ID NO: 1, 2 и 3. Однако соотношение слитых белков не должно быть ниже вышеуказанных пределов, в зависимости от веса. Другие белки могут иметь функцию, например, стабилизации композиции или могут быть примесями.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит 3 слитых белка, предпочтительно Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 1), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 2) и Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 3) в весовом соотношении 1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1: 3:3, 2:1:1, 2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1, 2:3:1, 2:3:2, 2:3: 3, 3:1:1, 3:1:2, 3:1:3, 3:2:1, 3:2:2, 3:2:3, 3:3:1 или 3:3:2. Предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что композиция содержит слитые белки в весовом соотношении 1:1:1 (Lip-S1D1-S2D1:Lip-S4D1-S3hybD1:Lip-S5D1-S6D1).

Предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что композиция содержит адъювант, более предпочтительно адъювант на основе алюминия.

Выбор подходящего адъюванта для смешивания с бактериальными белками, полученными с помощью способов по изобретению, находится в компетенции специалиста в данной области. Подходящие адъюванты включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соли других металлов, такие как соли кальция, магния, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионно- или анионно-дериватизированные сахариды или полифосфазены. В предпочтительном варианте осуществления композиция дополнена адъювантом на основе алюминия, таким как гидроксид алюминия. В еще одном предпочтительном варианте осуществления количество меди, связанной с адъювантом на основе алюминия, в вакцинной композиции составляет менее 1,25 частей на миллиард.

Наиболее предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 135 мкг на дозу для человека, в частности взрослого или ребенка, или может составлять только 67,5 мкг на дозу для человеческого ребенка (в частности, ребенка младшего возраста от рождения до 4 лет, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет), где второе введение осуществляют через 56 дней (2 месяца) после первого введения, при этом третье введение осуществляют через 180 дней (6 месяцев) после первого введения, и необязательное четвертое введение (1-я бустерной дозы) осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

Также наиболее предпочтительно вышеуказанные композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 180 мкг на дозу для человека, в частности, взрослого или ребенка, или может составлять 90 мкг на дозу для человеческого ребенка (в частности, ребенка младшего возраста от рождения до 4 лет, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет), где второе введение осуществляют через 56 дней (2 месяца) после первого введения, при этом третье введение осуществляют через 180 дней (6 месяцев) после первого введения, и необязательное четвертое введение (первой бустерной дозы) осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

Альтернативно, указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 135 мкг на дозу для человека, в частности взрослого или ребенка, или может составлять только 67,5 мкг на дозу для человеческого ребенка (в частности, ребенка младшего возраста от рождения до 4 лет, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет), при этом второе введение осуществляют через 180 дней (6 месяцев) после первого введения, и при этом необязательное третье введение (1-ой бустерной дозы) осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

Кроме того, в качестве альтернативы вышеуказанные композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 180 мкг на дозу для человека, в частности, взрослого или ребенка, или может составлять 90 мкг на дозу для человеческого ребенка (в частности, ребенка младшего возраста от рождения до 4 лет, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет), при этом второе введение осуществляют через 180 дней (6 месяцев) после первого введения, и при этом необязательное третье введение (первой бустерной дозы) осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

Предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что индуцируемый иммунный ответ содержит ответ с выработкой антител с бактерицидной активностью к OspA серотипа 1, OspA серотипа 2, OspA серотипа 3, OspA серотипа, OspA серотипа 5 и/или OspA серотипа 6.

Предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что вызываемый иммунный ответ включает антитела с бактерицидной активностью к OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6, экспрессируемому спирохетами.

Предпочтительно указанные выше композиции для применения по настоящему изобретению характеризуются тем, что иммунный ответ к OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 180 дней, по меньшей мере приблизительно 365 дней или по меньшей мере приблизительно 540 дней. Устойчивый иммунный ответ можно протестировать, как описано в Примере 2.

В одном из вариантов осуществления композиция или вакцина по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный антиген (обобщенно именуемая в настоящем описании «комбинированная вакцина»). В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный антиген происходит от вида Borrelia, вызывающего Лайм-боррелиоз. В различных аспектах по меньшей мере один дополнительный антиген происходит от другого патогена, предпочтительно переносимого клещами патогена. В другом аспекте патоген вызывает пятнистую лихорадку Скалистых гор, гранулоцитарный эрлихиоз человека (HGE), лихорадку Сеннетсу, моноцитарный эрлихиоз человека (HME), анаплазмоз, лихорадку бутоннеза (Boutonneuse), риккетсиоз Rickettsia parkeri, южную клещевую сыпь (STARI), пятнистую лихорадку Helvetica, 364D риккетсиоз, африканскую пятнистую лихорадку, возвратный тиф, туляремию, колорадскую клещевую лихорадку, клещевой энцефалит (КЭ), конго-крымскую геморрагическую лихорадку, Ку-лихорадку, омскую геморрагическую лихорадку, кьясанурскую лесную болезнь, Повассан энцефалит, болезнь, вызванную вирусом Хартленда, или бабезиоз. В другом аспекте заболевание представляет собой японский энцефалит. В другом варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный антиген получают из переносимого вектором, предпочтительно переносимого клещами, патогена, выбранного из группы, содержащей Borrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Neoehrlichia mikurensis, Coxiella burnetii и Borrelia lonestari, вирус клещевого энцефалита (вирус TBEV aka FSME), вирус колорадской клещевой лихорадки (CTFV), вирус Конго-крымской геморрагической лихорадки (CCHFV), вирус Омской геморрагической лихорадки (OHFV), вирус японского энцефалита (JEV) и Babesia spp.

В одном из вариантов осуществления представлено применение композиции для применения по настоящему изобретению пожилым субъектом с иммуногенным профилем, аналогичным профилю у более молодого субъекта, где указанный взрослый человек является пожилым субъектом старше 50 лет. Неожиданно было показано, что изобретение обеспечивает у пожилых людей (возрастная группа 50-65 лет) иммунные ответы, аналогичные таковым у более молодых людей (возрастная группа 18-49 лет), без статистически значимых различий. См. экспериментальную часть.

В одном из вариантов осуществления композиция для применения по настоящему изобретению содержит менее 1,25 частей на миллиард меди или достаточное количество L-метионина. Алюминий является адъювантом, часто используемым при вакцинации. Адъюванты на основе алюминия обычно содержат примеси, в частности тяжелые металлы, такие как медь, никель и железо. Их присутствие, в частности меди, снижает биодоступность белка OspA в вакцине. Не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагается, что белок OspA связывается с алюминием, и тяжелый металл, в частности медь, предотвращает высвобождение, тем самым снижая биодоступность белка OspA в вакцине. Таким образом, композиция и, в частности, адъювант на основе алюминия содержат менее 1,25 частей на миллиард меди. Единица ppb (частей на миллиард) часто используется в области масс-спектрометрии для количественного определения примесей. В случае водных растворов 1 ppb означает, что в 1 г раствора присутствует 1 нг вещества (примеси), что означает, что 1 ppb равен 1 мкг/л (при условии, что 1 литр раствора имеет массу 1 кг). Обычно медь находится в форме иона, в частности в виде Cu⁺ или Cu²⁺. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит менее 1,00 ppb, менее 0,75 ppb или менее 0,50 ppb меди в расчете на массу водной композиции. Известно, что L-метионин способен связываться с медью. Требуемое количество L-метионина, очевидно, будет зависеть от количества меди в композиции. Специалист в данной области сможет выбрать подходящее количество L-метионина. L-метионин можно использовать для комплексообразования избытка меди в композиции для применения в настоящем изобретении. Типичная подходящая концентрация L-метионина в композиции составляет по меньшей мере 10 ммоль/л. В зависимости от количества меди в композиции концентрация может быть даже выше, например, по меньшей мере 20 ммоль/л, по меньшей мере 30 ммоль/л, по меньшей мере 40 ммоль/л или по меньшей мере 50 ммоль/л или ниже, например, не более 10 ммоль/л, не более 5 ммоль/л или не более 1 ммоль/л. Альтернативно, концентрацию L-метионина определяют исходя из концентрации меди в композиции. В частности, концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере эквивалентна концентрации меди в композиции. Альтернативно, концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере в два, три, четыре, пять или даже десять раз превышает концентрацию меди в композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция для применения дополнительно содержит реакционноспособное соединение, которое выбирают из группы, состоящей из окислительно-восстановительного активного соединения, соединения, образующего радикалы, стабилизирующего соединения и любой их комбинации. Не ограничиваясь какой-либо теорией, деградация антигена белковых вакцин в водных композициях, содержащих ионы тяжелых металлов, присутствующих в соли алюминия, такой как гидроксид алюминия, может быть объяснена наличием пути деградации, предполагающей участие свободных радикалов, таких как, например, свободные радикалы сульфита. Окисление, катализируемое тяжелыми металлами, является путем деградации, приводящим к ковалентной модификации белков. Модифицированные физико-химические свойства окисленного/модифицированного белка или антигена могут привести к потере биологической активности. Для предотвращения этой модификации подходящими являются окислительно-восстановительные активные соединения. Предпочтительно реакционноспособное соединение выбирают из группы, состоящей из формальдегида, этанола, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, тритона Х-100, дезоксихолата, диэтилпирокарбоната, сульфита, Na₂S₂O₅, бета-проприолактона, полисорбата, такого как Tween 20®, Tween 80®, O₂, фенола, сополимеров типа плюроник и любой их комбинации.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения являются следующими:

1. Способ вакцинации человека, включающий введение композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1)

- взрослому человеку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

- человеческому ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу или от 60 до 100 мкг на дозу.

2. Способ индукции иммунного ответа у человека против болезни Лайма, включающий введение композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1)

- взрослому человеку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

- человеческому ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу или от 60 до 100 мкг на дозу.

3. Способ по варианту осуществления 1 или варианту осуществления 2, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 6 недель до не более 3 месяцев после первого введения и/или третье введение осуществляют в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения.

4. Способ по любому из вариантов осуществления 1-3, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 50 дней до не более 70 дней, в частности, в период от по меньшей мере 55 дней до не более 60 дней, в частности через 56 дней после первого введения; и/или

где третье введение осуществляют в период от по меньшей мере 170 дней до не более 190 дней, в период от по меньшей мере 175 дней до не более 185 дней, в частности через 180 дней после первого введения.

5. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, где четвертое введение композиции осуществляют в период от по меньшей мере 15 месяцев до не более 21 месяца, в частности в период от по меньшей мере 17 месяцев до не более 19 месяцев, в частности через 18 месяцев после первого введения.

6. Способ по любому из вариантов осуществления 1-5, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков находится в диапазоне от 135 мкг до 180 мкг на дозу, в частности 135 мкг или 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, или где общее содержание белка указанных 3 слитых белков находится в диапазоне от 67,5 мкг до 90 мкг на дозу, в частности, 67,5 мкг или 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста.

7. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, где 3 слитых белка составляют по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% всех белков в композиции.

8. Способ по любому из вариантов осуществления 1-7, где композиция содержит слитые белки в весовом соотношении 1:1:1 (Lip-S1D1-S2D1:Lip-S4D1-S3hybD1:Lip-S5D1-S6D1).

9. Способ по любому из вариантов осуществления 1-8, где композиция содержит адъювант.

10. Способ по любому из вариантов осуществления 1-9, где композиция содержит адъювант на основе алюминия.

11. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

14. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

15. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

16. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

17. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

18. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

19. Способ по любому из вариантов осуществления 1-18, где дополнительные введения проводят каждый год после последней первичной иммунизации или в начале каждого сезона клещей, в частности, через 1 год, через 2 года и через 3 года и так далее.

20. Способ по любому из вариантов осуществления 1-19, где индуцируемый иммунный ответ содержит ответ с выработкой антител с бактерицидной активностью к OspA серотипа 1, OspA серотипа 2, OspA серотипа 3, OspA серотипа 4, OspA серотипа 5 и/или OspA серотипа 6.

21. Способ по любому из вариантов осуществления 1-20, где индуцируемый иммунный ответ содержит антитела с бактерицидной активностью к OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6, экспрессируемому спирохетами.

22. Способ по любому из вариантов осуществления 1-21, где иммунный ответ к OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 180 дней, по меньшей мере приблизительно 365 дней или по меньшей мере приблизительно 540 дней.

23. Способ по любому из вариантов осуществления 1-22, где композиция содержит менее 1,25 частей на миллиард меди или достаточное количество L-метионина.

24. Способ по любому из вариантов осуществления 1-23, где медь находится в форме иона, в частности, в виде Cu⁺ или Cu²⁺.

25. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, где L-метионин присутствует в концентрации по меньшей мере 10 ммоль/л.

26. Способ по любому из вариантов осуществления 23-25, где концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере эквивалентна концентрации меди в композиции.

27. Способ по любому из вариантов осуществления 1-26, где композиция дополнительно содержит реакционноспособное соединение, которое выбирают из группы, состоящей из окислительно-восстановительного активного соединения, соединения, образующего радикалы, стабилизирующего соединения и любой их комбинации, в частности, особенно где реакционноспособное соединение выбирают из группы, состоящей из формальдегида, этанола, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, тритона Х-100, дезоксихолата, диэтилпирокарбоната, сульфита, Na₂S₂O₅, бета-проприолактона, полисорбата, такого как Tween 20®, Tween 80®, O₂, фенола, сополимеров типа плюроник и любой их комбинации.

28. Способ по любому из вариантов осуществления 1-27, где указанный взрослый человек является субъектом в возрасте 18 лет или старше, например, в возрасте 18-65 лет.

29. Способ по любому из вариантов осуществления 1-27, где указанный взрослый человек является пожилым человеком в возрасте 50 лет или старше.

30. Способ по любому из вариантов осуществления 1-27, где указанный человеческий ребенок является субъектом в возрасте от 5 до 17 лет, например от 12 до 17 лет или от 5 до 11 лет.

31. Способ по любому из вариантов осуществления 1-27, где указанный человеческий ребенок является субъектом в возрасте от 0 до 4 лет, например, от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет.

32. Способ по любому из вариантов осуществления 1-31, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме от 0,25 миллилитра (мл) до 1,0 мл, например, 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл или 1,0 мл.

33. Способ по любому из вариантов осуществления 1-32, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме 0,25 мл, 0,5 мл или 1,0 мл.

34. Способ вакцинации человека, включающий введение композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1)

- взрослому человеку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

- человеческому ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу или от 60 до 100 мкг на дозу.

35. Способ индукции иммунного ответа у человека против болезни Лайма, включающий введение композиции, содержащей слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1), слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1)

- взрослому человеку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

- человеческому ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных 3 слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу или от 60 до 100 мкг на дозу.

36. Способ по варианту осуществления 34 или варианту осуществления 35, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения.

37. Способ по любому из вариантов осуществления 34-36, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 170 дней до не более 190 дней, в период от по меньшей мере 175 дней до не более 185 дней, в частности через 180 дней после первого введения.

38. Способ по любому из вариантов осуществления 34-37, где третье введение композиции осуществляют в период от по меньшей мере 15 месяцев до не более 21 месяца, в частности в период от по меньшей мере 17 месяцев до не более 19 месяцев, в частности через 18 месяцев после первого введения.

39. Способ по любому из вариантов осуществления 34-38, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков находится в диапазоне от 135 мкг до 180 мкг на дозу, в частности 135 мкг или 180 мкг на дозу, или где общее содержание белка указанных 3 слитых белков находится в диапазоне от 67,5 мкг до 90 мкг на дозу, в частности 67,5 мкг или 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста.

40. Способ по любому из вариантов осуществления 34-39, где 3 слитых белка составляют по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% всех белков в композиции.

41. Способ по любому из вариантов осуществления 34-40, где композиция содержит слитые белки в весовом соотношении 1:1:1 (Lip-S1D1-S2D1:Lip-S4D1-S3hybD1:Lip-S5D1-S6D1).

42. Способ по любому из вариантов осуществления 34-41, где композиция содержит адъювант.

43. Способ по любому из вариантов осуществления 34-42, где композиция содержит адъювант на основе алюминия.

44. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

45. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

46. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

47. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

48. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

49. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

50. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение составляет 6 месяцев после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

51. Способ по любому из вариантов осуществления 34-43, где общее содержание белка указанных 3 слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

52. Способ по любому из вариантов осуществления 34-51, где дополнительные введения осуществляют каждый год после последней первичной иммунизации или в начале каждого сезона клещей, в частности, через 1 год, через 2 года и через 3 года и т.д.

53. Способ по любому из вариантов осуществления 34-52, где индуцируемый иммунный ответ содержит ответ с выработкой антител с бактерицидной активностью к OspA серотипа 1, OspA серотипа 2, OspA серотипа 3, OspA серотипа 4, OspA серотипа 5 и/или OspA серотипа 6.

54. Способ по любому из вариантов осуществления 34-53, где индуцируемый иммунный ответ содержит антитела с бактерицидной активностью к OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6, экспрессируемому спирохетами.

55. Способ по любому из вариантов осуществления 34-54, где иммунный ответ к OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 180 дней, по меньшей мере приблизительно 365 дней или по меньшей мере приблизительно 540 дней.

56. Способ по любому из вариантов осуществления 34-55, где композиция содержит менее 1,25 частей на миллиард меди или достаточное количество L-метионина.

57. Способ по любому из вариантов осуществления 34-56, в котором медь находится в форме иона, в частности, в виде Cu⁺ или Cu²⁺.

58. Способ по любому из вариантов осуществления 34-57, где L-метионин присутствует в концентрации по меньшей мере 10 ммоль/л.

59. Способ по любому из вариантов осуществления 56-58, где концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере эквивалентна концентрации меди в композиции.

60. Способ по любому из вариантов осуществления 34-59, где композиция дополнительно содержит реакционноспособное соединение, которое выбирают из группы, состоящей из окислительно-восстановительного активного соединения, соединения, образующего радикалы, стабилизирующего соединения и любой их комбинации, особенно где реакционноспособное соединение выбирают из группы, состоящей из формальдегида, этанола, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, тритона Х-100, дезоксихолата, диэтилпирокарбоната, сульфита, Na₂S₂O₅, бета-проприолактона, полисорбата, такого как Tween 20®, Tween 80®, O₂, фенола, сополимеров типа плюроник и любой их комбинации.

61. Способ по любому из вариантов осуществления 34-60, где указанный взрослый человек является субъектом в возрасте 18 лет или старше, например, в возрасте 18-65 лет.

62. Способ по любому из вариантов осуществления 34-60, где указанный взрослый человек является пожилым человеком в возрасте 50 лет или старше.

63. Способ по любому из вариантов осуществления 34-60, где указанный человеческий ребенок является субъектом в возрасте от 5 до 17 лет, например от 12 до 17 лет или от 5 до 11 лет.

64. Способ по любому из вариантов осуществления 34-60, где указанный человеческий ребенок является субъектом в возрасте от 0 до 4 лет, например от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет.

65. Способ по любому из вариантов осуществления 34-64, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме от 0,25 миллилитра (мл) до 1,0 мл, например 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл или 1,0 мл.

66. Способ по любому из вариантов осуществления 34-65, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме 0,25 мл, 0,5 мл или 1,0 мл.

Термины «содержащий», «содержать» и «содержит» в настоящем описании подразумевают возможную замену терминами «состоящий из», «состоять из» и «состоит из», соответственно, в каждом случае. Термин "содержит" означает "включает". Таким образом, если из контекста не следует иное, слово "содержит" и варианты, такие как "содержать" и "содержащий", следует понимать как подразумевающие включение указанного соединения или композиции (например, нуклеиновой кислоты, полипептида, антитела) или этапа, или группы соединений или этапов, не исключая при этом любые другие соединения, композиции, этапы или их группы. Сокращение «e.g.» происходит с Латинского exempli gratia и используется в настоящем описании для указания неограничивающего примера. Таким образом, сокращение «e.g.» является синонимом термина «например».

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, в котором их обычно понимает специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Определения общих терминов в молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Термины в единственном числе включают ссылки на множественное число, если из контекста не следует иное. Аналогично, слово «или» включает «и», если из контекста в явном виде не следует иное. Термин «множество» относится к двум или более. Кроме того, следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, указанные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания. Кроме того, численные ограничения, указанные в отношении концентраций или уровней вещества, такого как антиген, могут быть приблизительными.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже чертежами, таблицами и примерами, из которых могут быть взяты дополнительные признаки, варианты осуществления и преимущества. Как таковые, обсуждаемые конкретные модификации не следует рассматривать как ограничение объема изобретения. Специалист в данной области осведомлен, что могут быть выполнены различные эквиваленты, изменения и модификации, не выходящие за пределы объема изобретения, и, таким образом, следует понимать, что такие эквивалентные варианты осуществления предназначены для включения в объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Метод заражения через контакт с клещом. Метод заражения через контакт с клещом осуществляют путем нанесения по меньшей мере одной нимфы клеща (например, I. ricinus), инфицированной Borrelia (например, B. afzelii, штамм IS1), на мышь, иммунизированную поливалентной вакциной против Borrelia по изобретению или предварительно обработанной человеческой сывороткой; и b) нанесения по меньшей мере одной инфицированной нимфы клеща на вторую мышь, обработанную соответствующим плацебо, (отрицательным) контролем, таким как только буфер или адъювант; и c) сравнения уровней инфицирования у двух мышей, как правило, через четыре-шесть недель после заражения. Предпочтительно для каждой обработки используют группы мышей (например, 5-10 мышей/группу). Оценку инфекционного статуса можно осуществлять с помощью VLsE ELISA, в случае использования сыворотки, и/или количественной ПЦР, в случае использования собранных тканей, как описано в WO 2014006226, или с помощью других подходящих методов.

Метод заражения иглой. Метод заражения иглой осуществляют, используя требуемый штамм Borrelia (например, B. burgdorferi, штамм N40), путем подкожного введения Borrelia в дозе, в 20-50 раз превышающей инфицирующую дозу (ID)₅₀, мышам, иммунизированным поливалентной вакциной против Borrelia по изобретению или предварительно обработанным человеческой сывороткой или соответствующим плацебо, (отрицательным) контролем, таким как только буфер или адъювант, и сравнения уровней инфицирования у зараженных мышей. ID₅₀, измеренную в количестве бактерий, определяют как дозу, при которой инфицированы 50% необработанных зараженных мышей. Инфицирующая доза может меняться в широких пределах и зависит от штамма; следовательно, вирулентность штамма должна быть сначала оценена в экспериментах по контрольному заражению для определения ID₅₀. Через четыре недели после заражения иглой собирают кровь и ткани для методов считывания, чтобы определить статус инфекции. Методы считывания могут представлять собой, например, VLsE ELISA, в случае использования сыворотки, и/или количественной ПЦР, в случае использования собранных тканей, как описано в WO 2014006226, или другие методы.

Анализ связывания антител со спирохетами. Спирохеты 1×10⁵-1×10⁶ смешивают с равным объемом 4% параформальдегида и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре в 96-луночном планшете (Nunclon 96U, Nunc). Планшет центрифугируют в течение 5 минут при 2000g, и супернатант отбрасывают. Клетки промывают 150 мкл сбалансированного солевого раствора Хэнкса с 2% BSA (HBSS-B), центрифугируют, как указано выше, и супернатант отбрасывают. Сыворотки инактивируют нагреванием, инкубируя при 56°С в течение 35 минут. Инактивированную нагреванием сыворотку разводят в HBSS-B и стерильно фильтруют путем центрифугирования при 17000g в течение 3 минут, используя фильтры для центрифужных пробирок Costar spin-X (0,22 мкм, Corning, USA). Спирохеты суспендируют в 100 мкл сыворотки и инкубируют в течение 45 минут при комнатной температуре. Планшеты центрифугируют в течение 5 минут при 2000g, и супернатант отбрасывают. Клетки один раз промывают 150 мкл HBSS-B и ресуспендируют в 100 мкл HBSS-B с PE-конъюгированным вторичным антителом, разбавленным 1:150. К клеткам добавляют один микролитр соответствующего вторичного антитела (например, РЕ-конъюгированного антимышиного или античеловеческого IgG, доступного от Beckman Coulter, США) и инкубируют при комнатной температуре в течение 45 минут в темноте. Спирохеты промывают один раз 150 мкл HBSS-B и ресуспендируют в 200 мкл HBSS, содержащего 10 мкг ДНК-красителя LDS 751, и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Окрашенные спирохеты осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 2000g и затем ресуспендируют в 200 мкл HBSS. Меченые спирохеты измеряют с помощью проточного цитометра CytoFlex (Beckman Coulter), гейтированного в отношении положительных событий LDS 751.

Анализ бактерицидной активности сыворотки (SBA) позволяет измерить способность антител, индуцированных вакциной, убивать бактерии в сочетании с экзогенно добавленным комплементом (фиг. 1). Антитела, индуцированные вакциной, распознают экспонированные на поверхности антигены спирохет и рекрутируют комплемент, который активируется в основном по классическому пути, что приводит к образованию мембраноатакующего комплекса, бактериолизу и, в итоге, к гибели бактерий-мишеней. Осуществляют серийное двухкратное разведение образцов сыворотки средой BSK-II, которые затем смешивают с Borrelia, полученными из ночной культуры, и комплементом морской свинки или детеныша кролика (исходная и конечная концентрации 1-25%, в зависимости от серотипа), в среде BSK-II в белом 96-луночном планшете. Затем планшет инкубируют при +32°C, 5% CO₂ в течение 3-6 дней (в зависимости от серотипа Borrelia). Количество живых (метаболически активных) Borrelia определяют в конце анализа путем измерения АТФ-зависимого излучения света с помощью реакции на основе люциферазы (BacTiter-Glo, Promega). Пулы человеческой сыворотки служат в качестве положительного контроля качества (QC), а коммерчески доступная наивная человеческая сыворотка служит в качестве отрицательного контроля (NC). Для расчета титра образца каждое разведение образца сравнивают с соответствующим разведением отрицательной человеческой сыворотки (NC), для которой относительные световые единицы принимают равными 100%. Титр SBA тестируемого образца является обратной величиной самого высокого разведения сыворотки, обеспечивающего жизнеспособность ≤50%. Для серотипов 1, 2, 4, 5, 6 значения ниже предела количественного определения для SBA (титр 20) заменяют значениями для титра 10. Для серотипа 3 значения ниже предела количественного определения для SBA (титр 160) заменяют значениями для титра 80.

Иммуноферментный анализ (ELISA) для оценки в человеческой сыворотке уровня IgG, специфического для серотипа OspA. Средние геометрические титры IgG антител, специфических для серотипа OspA, определяли с помощью ELISA. Планшеты покрывали полноразмерным липидированным OspA из ST1, ST2, ST3, ST4, ST5 или ST6. Из пула образцов человеческой сыворотки готовили серийные разведения образцов сыворотки, эталонного вещества (RS) и образцов QC. Также использовали пустой контроль. Связанные антитела детектировали с помощью конъюгата вторичных антител, специфических к человеческому IgG. Концентрации OspA-специфических IgG рассчитывали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro 5.2 GxP. Отдельно для каждого образца, протестированного относительно эталонного вещества, строили кривые с помощью анализа параллельной линии. Относительную активность, указанную на этих кривых, использовали для расчета концентрации IgG (Ед/мл) в образце относительно кривой концентрации эталонного вещества. ELISA анализ, примененный в испытаниях фазы 1, использовали в испытаниях фазы 2 с модификациями (см. Таблицу A-1). Предел количественного определения ELISA, использованного в испытаниях фазы 1 (пример 1), составлял 20 единиц ELISA (МЕд)/мл (также обозначаемых как Ед/мл); значения <20 МЕд/мл заменяли значением 10 МЕд/мл. В немного измененном ELISA, использованном в первом испытании фазы 2 (пример 2), предел количественного определения составлял 40 МЕд/мл; значения <40 МЕд/мл заменяли значением 20 МЕд/мл.

Таблица А-1. Различия в определении IgG (ELISA) в клинических испытаниях фазы 1 и фазы 2 Фаза 1 Фаза 2 Покрывающий антиген His-меченный липидированный полноразмерный OspA (0,5 мкг/мл) липидированный полноразмерный OspA
(0,5 мкг/мл) QC моноклональное Ab Пулы поликлональных человеческих сывороточных антител Эталонное вещество (RS) Пул сыворотки фазы 1 Новое RS, приготовленное из образцов фазы 1 бустерной иммунизации Нижний предел количественного определения (LLOQ) 20 Ед/мл 40 Ед/мл Сероконверсия (SC) Показатель сероконверсии определяют как долю субъектов, достигших ≥4-кратного повышения титра IgG антител относительно дня 0. Сероконверсию определяют как переход от серонегативного к серопозитивному (≥40 Ед/мл) или ≥4-кратное повышение титра IgG антител относительно дня 0.

Пример 1. Клинические испытания фазы 1 поливалентной вакцины против Borrelia

План клинического испытания фазы 1 и результаты иммуногенности

Проводили первое слепое, частично рандомизированное, многоцентровое клиническое испытание фазы I с повышением дозы на людях для изучения безопасности и иммуногенности различных доз мультимерной вакцины против Borrelia («MBV») по изобретению с гидроксидом алюминия и без него. Испытание проводили на здоровых взрослых в возрасте от 18 до 39 лет, которые изначально были серонегативными в отношении Borrelia burgdorferi sensu lato (т.е. субъекты, которые ранее не были инфицированы Borrelia). План испытания показан на фиг. 2. Вкратце, характеристики безопасности и иммуногенность трех внутримышечных вакцин, выполненных с интервалом в 28 дней, оценивали, используя шесть разных видов обработки (3 уровня доз, каждый с адъювантом и без него), примененных к 179 здоровым субъектам (т.е. приблизительно по 30 субъектов в группе обработки). Все составы содержали каждый из полипептидов фрагмента OspA (SEQ ID No: 1, 2 и 3) в весовом соотношении 1:1:1 (например, низкая доза (12 мкг) содержала 4 мкг каждого из липидированных полипептидов, определенных SEQ ID No: 1, 2 и 3).

Группы дозирования в испытании фазы 1 (вакцинированные внутримышечно d0, d28, d56):

-12 мкг с алюминием (n=29)

-12 мкг без алюминием (n=29)

-48 мкг с алюминием (n=31)

-48 мкг без алюминия (n=29)

-90 мкг с алюминием (n=31)

-90 мкг без алюминия (n=30)

Иммуногенность оценивали во всех группах в дни 0, 28, 57, 84, 180, 236 и 365 с пиковыми титрами антител, ожидаемыми в день 84 (т.е. через 4 недели после третьей вакцинации, анализ первичной конечной точки). Средние геометрические титры антител к каждому серотипу OspA в день 84 показаны на фиг. 3А. На фиг. 3B представлены показатели сероконверсии (т.е. доля субъектов, у которых произошла сероконверсия) для каждой группы, где сероконверсия определена как ≥4-кратное увеличение титра IgG по сравнению с исходным уровнем.

Фаза дополнительной бустерной иммунизации. На основании результатов анализа в день 84 отбирали группы, получавшие дозы 48 мкг и 90 мкг с адъювантом или без него, для проведения бустерной иммунизации приблизительно через 13 месяцев с последующим 6-месячным наблюдением для оценки безопасности и персистенции антител. Вводимые бустерные дозы и составы были такими же как дозы и составы для первичной иммунизации. Часть дополнительной бустерной иммунизации этого исследования выполняли только в одном из трех исследовательских центров, что дало значительно меньшее количество субъектов N=64 на фазе бустерной иммунизации.

Группы дозирования части дополнительной бустерной иммунизации испытания фазы 1 (внутримышечная ревакцинация, 13-й мес.):

-48 мкг с алюминием (n=15)

-48 мкг без алюминия (n=16)

-90 мкг с алюминием (n=16)

-90 мкг без алюминия (n=17)

Иммуногенность оценивали через 13 месяцев (до бустерной иммунизации), 14 и 19 месяцев в группах дополнительной бустерной иммунизации. Цели дополнительной бустерной иммунизации заключались в оценке безопасности и иммуногенности бустерной дозы вакцины А, введенной приблизительно через год после последней иммунизации по основному графику, не более чем через шесть месяцев после введения бустерной дозы.

Еще одной целью применения дополнительной бустерной дозы заключалось в получении сывороток с высоким титром для разработки функционального анализа и потенциальных исследований для проверки концепции (PoC). Кроме того, бустерная доза позволила собрать данные по безопасности и иммуногенности бустерной дозы на ранних стадиях клинической разработки.

Значения GMT IgG у субъектов, включенных в первичный анализ фазы дополнительной бустерной иммунизации (PP популяция бустерной иммунизации), в день 84 и через 13, 14 и 19 месяцев, показаны на фиг. 4A-D, соответственно, и в таблице 1 ниже. Представлены среднегеометрический кратный рост (GMFR) титра IgG по сравнению с моментом времени до бустерной иммунизации (13-й месяц) и по сравнению с пиковым титром после серии первичных иммунизаций (день 84), а также показатели сероконверсии в день 84, месяцы 13 и 14 в Таблице 2 и Таблице 3, соответственно. Для сравнения групп в отношении иммунных ответов на каждый из шести серотипов на протяжении всего исследования значения на фиг. 5A-F представлены GMT субъектов, включенных в фазу дополнительной бустерной иммунизации (PP популяция бустерной иммунизации, т.е. субъектов, включенных в фазу дополнительной бустерной иммунизации и получивших правильную бустерную дозу в правильное время в соответствии с протоколом) в течение всего периода испытания.

Таблица 1. GMT титра серотип-специфического IgG в день 84, M13, M14 и M19, PP популяция бустерной иммунизации. GMT [Ед/мл] 48 мкг+алюминий 48 мкг - алюминий 90 мкг+алюминий 90 мкг - алюмний Момент времени D84 M13 M14 M19 D84 M13 M14 M19 D84 M13 M14 M19 D84 M13 M14 M19 ST1 60 10 305 64 24 10 66 15 49 10 286 37 18 10 39 10 ST2 185 12 640 144 84 10 221 34 212 13 840 152 60 10 167 25 ST3 292 13 832 208 109 12 194 35 283 15 763 161 72 12 156 22 ST4 116 12 436 87 38 12 105 20 95 12 416 59 38 13 84 18 ST5 125 13 455 96 67 11 164 28 136 13 558 78 59 14 129 19 ST6 154 18 523 119 106 15 223 34 180 15 713 98 72 15 189 32

Таблица 2. Среднегеометрический кратный рост (GMFR) титра серотип-специфических IgG в месяцы 14 и 19 по сравнению с месяцем 13 (до бустерной иммунизации) и днем 84 (пиковый титр антител после серии первичных иммунизаций), PP популяция бустерной иммунизации. GMFR 48 мкг+алюминий 48 мкг - алюминий 90 мкг+алюминий 90 мкг - алюминий месяц M14 M14 M19 M19 M14 M14 M19 M19 M14 M14 M19 M19 M14 M14 M19 M19 По сравнению с моментом времени M13 D84 M13 D84 M13 D84 M13 D84 M13 D84 M13 D84 M13 D84 M13 D84 ST1 31 5 6 1,1 7 2 2 0,6 29 6 4 0,7 4 2 1 0,5 ST2 54 4 12 0,8 22 2 3 0,4 67 4 12 0,7 17 3 3 0,4 ST3 66 3 17 0,7 15 2 3 0,3 52 3 11 0,6 13 2 2 0,3 ST4 35 4 7 0,7 10 3 2 0,5 36 4 5 0,6 6 2 1 0,5 ST5 35 4 7 0,8 15 2 3 0,4 44 4 6 0,6 9 2 1 0,3 ST6 30 3 7 0,8 17 2 3 0,3 49 4 7 0,5 13 3 2 0,5

Таблица 3. Показатели сероконверсии (SCR) для каждого серотипа в день 84, M13, M14 и M19, PP популяция бустерной иммунизации. SCR [%] 48 мкг+алюминий 48 мкг - алюминий 90 мкг+алюминий 90 мкг - алюминий Момент времени D84 M13 M14 M19 D84 M13 M14 M19 D84 M13 M14 M19 D84 M13 M14 M19 ST1 67 0 93 67 31 0 57 20 63 0 94 50 29 0 47 0 ST2 87 0 100 87 69 0 86 47 94 0 100 88 59 0 82 38 ST3 100 13 100 100 88 13 86 53 94 13 94 88 65 6 82 38 ST4 80 7 93 73 56 0 79 33 75 0 88 63 29 6 82 19 ST5 80 13 93 73 75 0 86 33 75 6 100 69 59 12 82 25 ST6 80 13 93 80 81 13 86 47 88 13 100 75 71 12 82 31

Корреляция титров ELISA и SBA в образцах сыворотки фазы 1. Анализ бактерицидной активности серотип-специфической сыворотки (SBA - см. Материалы и методы), коррелят in vitro защиты для клинических образцов, дал значения, которые тесно коррелировали со значениями ELISA для серотипов 1, 2 и 3 в сыворотках отдельных субъектов, как показано на фиг. 6А, В и С, соответственно.

Таким образом, использование всех доз и составов, исследованных на фазе 1, индуцировало образование серотип-специфических IgG-антител, при этом более высокую иммуногенность наблюдали для групп с более высокими дозами и для составов с адъювантом. Бустерная доза, введенная приблизительно через год после завершения серии первичных иммунизаций, генерировала значимый бустерный ответ (т.е. титры IgG были значительно выше через 4 недели после бустерной иммунизации по сравнению с 4 неделями после завершения первичной иммунизации) для всех шести серотипов OspA, который сохранялся при более высоких уровнях в течение 19 месяцев (таблица 3). Поскольку устойчивые уровни циркулирующих антител имеют большое значение для эффективности вакцин на основе OspA, на фазе 2 использовали дальнейшее увеличение дозы и альтернативные схемы, чтобы вызвать более ранний, более сильный и устойчивый иммунный ответ.

Пример 2. Клинические испытания фазы 2 поливалентной вакцины против Borrelia для оценки более высоких доз вакцины.

План клинических исследований фазы 2 и краткий обзор предварительных описательных данных по иммуногенности, полученных в вводной фазе

В настоящее время проводится слепое рандомизированное плацебо-контролируемое многоцентровое испытание фазы 2 с целью изучения безопасности и иммуногенности ряда более высоких доз мультимерной вакцины против Borrelia с адъювантом гидроксидом алюминия у здоровых взрослых в возрасте от 18 до 65 лет. В испытание были зачислены субъекты, изначально серонегативные в отношении Borrelia burgdorferi sensu lato (т.е. субъекты, которые ранее не были инфицированы Borrelia), а также субъекты, изначально серопозитивные в отношении Borrelia burgdorferi sensu lato (т.е. субъекты, ранее инфицированные Borrelia). Испытание состоит из вводной фазы безопасности (возраст 18-40 лет, N=120 субъектов) для изучения безопасности трех уровней доз: 90 мкг, 135 мкг и 180 мкг мультимерной вакцины против Borrelia («MBV») по изобретению с алюминием и без него, проводимую сначала в меньшей популяции, до проведения основной фазы исследования, (возраст 18-65, N=450 субъектов) (см. фиг. 7) с участием двух групп с более высокими дозами 135 мкг и 180 мкг. Субъект получал три внутримышечные вакцинации с интервалом в один месяц (т.е. месяцы 0-1-2). В основной фазе исследования испытуемых делили на две возрастные группы (18-49 лет и 50-65 лет) в соотношении приблизительно 2:1. Основными задачами испытания фазы 2 являются оценка иммуногенности и безопасности мультимерной вакцины против Borrelia у здоровых взрослых в возрасте 18-65 лет при более высоких уровнях доз по сравнению с первым испытанием на людях и определение оптимальной дозы вакцины. Все составы содержали каждый из полипептидов фрагмента OspA (SEQ ID No: 1, 2 и 3) в весовом соотношении 1:1:1 (например, низкая доза (90 мкг) содержала по 30 мкг каждого из липидированных полипептидов, определенных SEQ ID No: 1, 2 и 3, высокая доза (180 мкг) содержала по 60 мкг каждого из липидированных полипептидов, определенных SEQ ID No: 1, 2 и 3).

Вводная фаза. Предусматривалось зачисление в общей сложности 120 здоровых субъектов в возрасте от 18 до 40 лет в четыре группы обработки (вакцинированные внутримышечно Д1, Д29, Д57): 90 мкг мультимерной вакцины против Borrelia («MBV») по изобретению с алюминием, 135 мкг MBV с алюминием, 180 мкг MBV с алюминием, плацебо (PBS), приблизительно 30 субъектов на группу обработки. После того, как Совет по мониторингу безопасности данных (DSMB) изучил данные по безопасности вплоть до дня 85, эти две группы, получавщие более высокие дозы (т.е. 135 мкг и 180 мкг), были отобраны для дальнейшего изучения в основной фазе исследования. Сыворотки собирают в дни 1, 29, 57, 85 (первичный анализ иммуногенности), дни 180, 236 и 365 и оценивают иммуногенность с помощью ELISA и SBA (выбранные моменты времени в репрезентативной подгруппе субъектов).

Предварительный описательный анализ данных по иммуногенности на вводной фазе показал, что поливалентная вакцина против Borrelia является иммуногенной при всех уровнях доз, протестированных на вводной фазе. Предварительные титры по GMT (ELISA) в группе, получавшей 90 мкг с алюминием, были сравнимы с титрами, полученными в испытаниях фазы 1 при том же уровне дозы. Дозозависимую реакцию с самыми низкими титрами IgG наблюдали в группе с дозой 90 мкг, и с самыми высокими титрами наблюдали в группе с дозой 180 мкг для всех серотипов. Увеличение дозы по сравнению с фазой 1, как и ожидалось, привело к усилению пикового иммунного ответа после первичной иммунизации. Однако уровни антител снижались относительно существенно вплоть до 180-го дня во всех группах дозирования. Учитывая наблюдаемое в вводной фазе 2 снижение титров антител после серии первичной иммунизации, при будущей разработке мультимерной вакцины против Borrelia следует рассмотреть более широкий график вакцинации: 0-2-6 месяцев. Основываясь на опыте с другими вакцинами, ожидается, что это приведет к еще более высоким пиковым титрам и, что важно, к улучшенной персистенции, и также может улучшить качество антител.

Основная фаза. Предусматривалось зачисление в общей сложности 450 здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 65 лет в три группы обработки (вакцинированные внутримышечно Д1, Д29, Д57): 135 мкг с алюминием (n=приблизительно 180), 180 мкг с алюминием (n=приблизительно 180), плацебо (PBS) (n=приблизительно 90). Был проведен первый анализ данных, который включал объединенные данные по иммуногенности (GMT IgG, специфических к серотипу OspA, по данным ELISA), начиная с дня 85 основной фазы исследования и вводной фазы. Функциональность антител в день 85 оценивали с помощью анализа бактерицидной активности сыворотки (SBA). Данные подтвердили результаты предварительного анализа данных вводной фазы с точки зрения более высоких титров антител после завершения серии первичной иммунизации, т.е. в день 85 были достигнуты более высокие уровни антител в группах введения дозы 135 мкг (GMT меняется в пределах от 101,1 [ST1] до 282,2 [ST3]) и дозы 180 мкг (GMT в диапазоне от 115,8 [ST1] до 308,6 [ST3]) по сравнению с группой введения дозы 90 мкг, исследованной во вводной фазе (GMT в диапазоне от 74,3 [ST1] до 267,4 [ST3]). Данные показывают, что пожилые люди (возрастная группа 50-65 лет), которые являются одной из групп высокого риска заражения болезнью Лайма, также продемонстрировали обнадеживающий иммунный ответ без статистически значимых различий между двумя возрастными группами. Краткий обзор данных по иммуногенности приведена в таблице 4.

Кроме того, вакцина против Borrelia, как указано выше (полипептиды фрагмента OspA (SEQ ID No: 1, 2 и 3) в весовом соотношении 1:1:1 (например, низкая доза (90 мкг) содержала по 30 мкг каждого из липидированных полипептидов, определенных SEQ ID No: 1, 2 и 3, высокая доза (180 мкг) содержала 60 мкг каждого из липидированных полипептидов, определенных SEQ ID No: 1, 2 и 3), была иммуногенной во всех протестированных группах доз. Более высокие дозы, использованные в этом испытании, вызывали более высокий ответ антител ко всем серотипам по сравнению с фазой 1. Показатели сероконверсии (SCR) в случае самой высокой дозы находились в пределах от 81,5% (ST1) до 95,8% (ST2). В возрастной группе, сравниваемой с возрастной группой, исследованной на фазе 1 (18-49 лет), SCR находилась в пределах от 85,6% до 97% (предыдущее исследование: от 71,4% до 96,4%). Особенно обнадеживающим оказался иммунологический ответ у пожилых людей, одной из основных целевых групп для Лайм-вакцины. Результаты не показали, что предшествующее воздействие Лайм-вакцины (серопозитивность) влияет на иммуногенность или безопасность.

Указанная вакцина против Borrelia в целом оказалась безопасной во всех исследованных дозах и для всех возрастных групп. Серьезных нежелательных явлений (SAE) при применении вакцины против Borrelia в этом исследовании не наблюдалось ни в одной группе обработки. При последующих вакцинациях реактогенность снижалась.

В целом профиль переносимости, включая показатели лихорадки, оказался сравнимым с другими липидсодержащими рекомбинантными вакцинами или составами, содержащими липиды.

Таблица 4:
GMT в день 85, первое исследование фазы 2 (0-1-2 месячный график), PP популяция Вводная фаза Субъекты из вводной фазы и основной фазы исследования 90 мкг 135 мкг 180 мкг 18-40 лет
N=26
[МЕд/мл] 18-49 лет
N=129
[МЕд/мл] 50-65 лет
N=59
[МЕд/мл] 18-65 лет
N=188
[МЕд/мл] 18-49 лет
N= 132
[МЕд/мл] 50-65 лет
N=57
[МЕд/мл] 18-65
лет
N= 189
[МЕд/мл] ST1 74,3 103,8 95,4 101,1 129,6 89,2 115,8 ST2 180,9 292,7 245,2 276,9 322,1 265,0 303,7 ST3 267,4 293,4 259,1 282,2 334,2 256,5 308,6 ST4 117,0 175,1 158,5 169,7 206,8 158,1 190,7 ST5 118,3 178,8 165,8 174,6 218,3 162,1 199,6 ST6 115,6 184,4 178,5 182,6 225,6 174,3 208,7

Показатели сероконверсии (SCR) в день 85 представлены в таблице 12. В группе с дозой 90 мкг показатель SCR находился в пределах от 65,4% (ST1) до 96,2 (ST3), в группе с дозой 135 мкг показатель SCR находился в пределах от 80,9% (ST1) до 98,4 (ST2), и в группе с дозой 180 мкг показатель SCR находился в пределах от 81,5% ( ST1) до 95,8% (ST3).

Таблица 12: Показатель SCR (ELISA) в день 85, первое исследование фазы 2 (0-1-2 месячный график), PP популяция 90 мкг
N =29
(%) 135 мкг
N =188
(%) 180 мкг
N=189
(%) ST1 65,4 80,9 81,5 ST2 88,5 98,4 95,2 ST3 96,2 97,3 95,8 ST4 80,8 94,1 93,7 ST5 80,8 91,0 90,5 ST6 80,8 93,1 91,5

Функциональность антител была продемонстрирована для всех серотипов с помощью анализа бактерицидной активности сыворотки (SBA - см. Материалы и методы). Значения GMT в день 85 приведены в таблице 13.

Таблица 13: GMT для функциональных антител, измеренное с помощью SBA в день 85 (0-1-2 месячный график). 135 мкг
N=84
SBA титр 180 мкг
N=86
SBA титр ST1 17,5 21,4 ST2 14,9 17,6 ST3 737,6 700,1 ST4 21,9 25,8 ST5 23,2 24,4 ST6 100,2 152,4

Титр ELISA в значительной степени коррелировал с соответствующим титром SBA для каждого серотипа OspA и сывороток отдельных субъектов, как показано на фиг. 9A-9F. Коэффициенты корреляции Спирмена варьировали в пределах от 0,5737, значение p <0,0001, для серотипа 4 до 0,9030, значение p <0,0001, для серотипа 3.

Пример 3. клинические испытания фазы 2 поливалентной вакцины против Borrelia по изучению более высоких доз вакцины и более широкого графика иммунизации

В это слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование фазы 2, в котором изучали группы с теми же дозами, что и в примере 2, при альтернативном, более широком графике иммунизации, были включены в общей сложности 246 здоровых субъектов в возрасте от 18 до 65 лет. Субъекты получили три внутримышечные иммунизации в дозе 135 мкг или 180 мкг мультимерной вакцины против Borrelia, приготовленной с алюминием (приблизительно по 100 субъектов для каждой дозы) или плацебо (приблизительно 50 субъектов) в месяцы 0, 2 и 6 (дни 1-57-180) (т.е. полипептиды фрагмента OspA (SEQ ID No: 1, 2 и 3) в весовом соотношении 1:1:1 (например, низкая доза (135 мкг) содержала по 45 мкг каждого из липидированных полипептидов, определенных SEQ ID No: 1, 2 и 3, высокая доза (180 мкг) содержала по 60 мкг каждого из липидированных полипептидов, определенных SEQ ID No: 1, 2 и 3). Субъекты были включены в две возрастные группы (18-49 лет и 50-65 лет) в соотношении приблизительно 2:1. Кроме того, в исследование были включены субъекты, изначально серонегативные в отношении Borrelia burgdorferi sensu lato (т.е. субъекты, которые ранее не были инфицированы Borrelia), а также субъекты, изначально серопозитивные в отношении Borrelia burgdorferi sensu lato (т.е. субъекты, ранее инфицированные Borrelia). Основными задачами исследования фазы 2 являются оценка иммуногенности и безопасности мультимерной вакцины против Borrelia для здоровых взрослых в возрасте 18-65 лет при более высоких уровнях доз по сравнению с первым испытанием на людях и при применении более широкого графика иммунизации, использованного в приведенных выше примерах. Вместе с результатами, полученными в примере 2, данные могут быть использованы для определения оптимальной дозы и схемы введения вакцины на поздней стадии клинической разработки. Схема испытания показана на фиг. 8.

Сыворотки собирают в дни 1, 29, 57, 85, 180, 208 (первичный анализ иммуногенности), 365 и 545, и оценка иммуногенности будет проводиться с помощью ELISA и SBA (в выбранные моменты времени).

В день 85 (т.е. после второй вакцинации) уровни антител (GMT) в группе с дозой 135 мкг находились в пределах от 64,1 [ST1] до 166,4 [ST3], а в группе с дозой 180 мкг находились в пределах от 75,2 [ST1] до 217,7 [ST3]. В таблице 10 представлен краткий обзор средних геометрических титров (GMT), полученных во втором исследовании фазы 2, и в таблице 11 на фиг. 10 представлен краткий обзор показателей сероконверсии, полученных во втором исследовании фазы 2 в день 85. См. также фиг. 12-17.

В целом инициация иммунного ответа, по-видимому, происходит несколько быстрее при более высокой дозе 180 мкг, т.е. GMT в день 85 выше в группе, получившей дозу 180 мкг, по сравнению с группой, получившей 135 мкг. См. фиг. 18A и 18B для сравнения GMT между группами, получавшими 135 мкг и 180 мкг, и таблицу 10 для значений GMT в день 85.

Таблица 10: GMT в день 85, второе исследование фазы 2 (0-2-6 месячный график), PP популяция 135 мкг+алюминий
N=84
[МЕд/мл]
[95% CI] 180 μg+алюминий
N=86
[МЕд/мл]
[95% CI] Плацебо
N=43
[МЕд/мл]
[95% CI] p-значение
(Общее) ST1 64,1
[50,2, 81,7] 75,2
[59,6, 94,9] 21,7
[19,7, 23,8] <.0001 ST2 160,8
[125,4, 206,3] 183,5
[144,9, 232,4] 20,0
[20,0, 20,0] <.0001 ST3 166,4
[128,3, 215,9] 217,7
[171,7, 275,9] 20,7
[19,3, 22,2] <.0001 ST4 78,7
[62,5, 99,0] 100,8
[81,2, 125,0] 21,6
[20,0, 23,3] <.0001 ST5 86,8
[68,5, 110,0] 100,2
[81,0, 124,1] 20,0
[20,0, 20,0] <.0001 ST6 79,5
[62,4, 101,3] 84,3
[67,4, 105,4] 20,7
[19,3, 22,1] <.0001

Таблица 11: SCR в день 85, второе исследование фазы 2 (0-2-6 месячный график), PP популяция 135 мкг+алюминий
N=84
n/Nm (%)
[95% CI] 180 мкг+алюминий
N=86
n/Nm (%)
[95% CI] Плацебо
N=43
n/Nm (%)
[95% CI] p-значение
(общее) ST1 48/82 (58,5)
[47,7, 68,6] 58/84 (69,0)
[58,5, 77,9] 1/43 (2,3)
[0,4, 12,1] <.0001 ST2 69/82 (84,1)
[74,7, 90,5] 75/84 (89,3)
[80,9, 94,3] 0/43 (0,0)
[0,0, 8,2] <.0001 ST3 69/82 (84,1)
[74,7, 90,5] 77/84 (91,7)
[83,8, 95,9] 1/43 (2,3)
[0,4, 12,1] <.0001 ST4 61/82 (74,4)
[64,0, 82,6] 70/84 (83,3)
[73,9, 89,8] 3/43 (7,0)
[2,4, 18,6] <.0001 ST5 60/82 (73,2)
[62,7, 81,6] 68/84 (81,0)
[71,3, 87,9] 0/43 (0,0)
[0,0, 8,2] <.0001 ST6 50/82 (61,0)
[50,2, 70,8] 60/84 (71,4)
[61,0, 80,0] 0/43 (0,0)
[0,0, 8,2] <.0001 ST1 до ST6, объединенные 39/82 (47,6)
[37,1, 58,2] 54/84 (64,3)
[53,6, 73,7] 0/43 (0,0)
[0,0, 8,2] <.0001 ST1 и ST2, объединенные 48/82 (58,5)
[47,7, 68,6] 58/84 (69,0)
[58,5, 77,9] 0/43 (0,0)
[0,0, 8,2] <.0001

Анализ начальных данных, включая данные по иммуногенности и безопасности в день 208 (т.е. через 1 месяц после третьей вакцинации), показывает дальнейшее увеличение титров антител при использовании более широкого графика иммунизации (0-2-6 месячный график). Пиковые уровни антител (GMT) в день 208 в группе с дозой 135 мкг находились в пределах от 276,4 [ST1] до 539,0 [ST2], а в группе с дозой 180 мкг находилось в пределах от 274,7 [ST1] до 596,8 [ST3] (см. Таблицу 5), что соответствует 1,7-2,7-кратному увеличению титров по сравнению с соответствующими титрами, полученными в тех же группах обработки при использовании 0-1-2 месячного графика вакцинации (см. таблицу 6). В соответствии с данными ELISA, GMT для титров SBA также показали 1,4-3,1-кратное увеличение при использовании 0-2-6 месячного графика по сравнению с 0-1-2 месячным графиком (таблица 14). В таблице 5 представлен краткий обзор средних геометрических титров (GMT), полученных во втором исследовании фазы 2, и в таблице 6 сравнение значений GMT при использовании разных схем вакцинации.

Таблица 5: GMT (ELISA) в день 208, второе исследование фазы 2 (0-2-6 месячный график), PP популяция 135 мкг 180 мкг 18-49 лет
N=55
[МЕд/мл] 50-65 лет
N=29
[МЕд/мл] 18-65 лет
N=84
[МЕд/мл] 18-49 лет
N= 57
[МЕд/мл] 50-65 лет
N=29
[МЕд/мл] 18-65 лет
N= 86
[МЕд/мл] ST1 284,1 263,5 276,4 291,2 246,6 274,7 ST2 551,9 517,2 539,0 581,3 577,0 579,8 ST3 573,5 434,5 518,4 633,4 534,3 596,8 ST4 365,2 275,6 329,7 393,3 324,8 367,8 ST5 358,8 287,0 330,8 371,0 337,2 358,8 ST6 362,4 300,3 338,4 337,5 361,4 345,7

Как показано в таблице 5, особенно обнадеживает иммунный ответ у пожилых людей, одной из основных целевых групп для Лайм-вакцины. Кроме того, результаты не указывают на то, что предшествующее воздействие Лайм-вакцины (сероположительный результат) влияет на иммуногенность или безопасность (данные не показаны).

Таблица 6: Сравнение GMT (ELISA) при использовании разных схем иммунизации Исследование 1
0-1-2 месячный график
Пиковые титры в день 85 Исследование 2
0-2-6 месячный график
Пиковые титры в день 208 Отношение GMT Исследование 2 (День 208)/ Исследование 1 (День 85) 135 мкг 180 мкг 135 мкг 180 мкг 135 мкг 180 мкг 18-65 лет
N=188
[МЕд/мл] 18-65 лет
N= 189
[МЕд/мл] 18-65 лет
N=84
[МЕд/мл] 18-65 лет
N= 86
[МЕд/мл] ST1 101,1 115,8 276,4 274,7 2,7 2,4 ST2 276,9 303,7 539,0 579,8 1,9 1,9 ST3 282,2 308,6 518,4 596,8 1,8 1,9 ST4 169,7 190,7 329,7 367,8 1,9 1,9 ST5 174,6 199,6 330,8 358,8 1,9 1,8 ST6 182,6 208,7 338,4 345,7 1,9 1,7

Как и в первом исследовании фазы 2, пожилые люди (возрастная группа 50-65 лет), которые относятся к одной из групп высокого риска заражения болезнью Лайма, также продемонстрировали обнадеживающий иммунный ответ без статистически значимых различий показателей GMT между двумя возрастными группами (таблица 5).

Показатели сероконверсии (SCR) в день 208 представлены в таблице 7 и на фиг. 11. В группе с дозой 135 мкг показатели SCR находились в пределах от 89,6% (ST6) до 98,7 (ST3), а в группе с дозой 180 мкг показатели SCR находились в пределах от 93,8% (ST1) до 98,8% (СТ2, СТ4).

Таблица 7: Показатели SCR (ELISA) в день 208, второе исследование фазы 2 (0-2-6 месячный график), PP популяция 135 мкг
N=84
(%) 180 мкг
N=86
(%) ST1 92,2 93,8 ST2 96,1 98,8 ST3 98,7 97,5 ST4 97,4 98,8 ST5 94,8 96,3 ST6 89,6 96,3

Функциональность антител была продемонстрирована для всех серотипов с помощью анализа бактерицидной активности сыворотки (SBA - см. Материалы и методы). Краткий обзор GMT в день 208 приведен в таблице 8.

Таблица 8: Показатели GMT для функциональных антител, измеренные по SBA в день 208. 135 мкг
N=84
SBA титр 180 мкг
N=86
SBA титр ST1 47,0 52,3 ST2 45,8 38,0 ST3 1200,8 1408,0 ST4 44,6 51,4 ST5 31,4 36,8 ST6 196,8 251,1

Титр ELISA значительно коррелировал с соответствующим титром SBA для каждого серотипа OspA и сывороток отдельных субъектов, как показано на фиг. 9A-9F. Коэффициенты корреляции Спирмена находились в пределах от 0,6487, значение p <0,0001, для серотипа 4 до 0,9131, значение p <0,0001, для серотипа 3.

Таблица 14: Сравнение показателей GMT (SBA) при использовании разных графиков иммунизации Исследование 1
0-1-2 месячный график
Титры в день 85 Исследование 2
0-2-6 месячный график
Титры в день 208 отношение GMT исследование 2 (день 208)/ исследование 1 (день 85) 135 мкг 180 мкг 135 мкг 180 мкг 135 мкг 180 мкг 18-65 лет
N=188
[МЕд/мл] 18-65 лет
N= 189
[МЕд/мл] 18-65 лет
N=84
[МЕд/мл] 18-65 лет
N= 86
[МЕд/мл] ST1 17,5 21,4 47,0 52,3 2,7 2,4 ST2 14,9 17,6 45,8 38,0 3,1 2,2 ST3 737,6 700,1 1200,8 1408,0 1,6 2,0 ST4 21,9 25,8 44,6 51,4 2,0 2,0 ST5 23,2 24,4 31,4 36,8 1,4 1,5 ST6 100,2 152,4 196,8 251,1 2,0 1,6

Мультимерная вакцина против Borrelia («MBV») в целом была безопасной при всех исследованных дозах и для всех возрастных групп. Серьезных нежелательных явлений (SAE) в этом или любом другом исследовании не наблюдалось. Реактогенность снижалась после первой вакцинации. В целом профиль переносимости, включая показатели лихорадки, был сравним с другими липидсодержащими рекомбинантными вакцинами или составами, содержащими липиды. В таблице 9 представлено сравнение данных по безопасности между исследованиями фазы 2 с применением указанной вакциной, а также сравнение с другими липидированными рекомбинантными вакцинами или липидсодержащими составами.

Таблица 9: Сравнение запрашиваемых локальных и системных нежелательных явлений с другими липидсодержащими рекомбинантными вакцинами или составами, содержащими липиды. MBV
(график
M0-1-2)
18-65 лет
135 мкг
N= 214
% субъектов MBV
(график
M0-2-6)
18-65 лет
135 мкг
N= 97
% субъектов MBV
(график
M0-1-2)
18-65 лет
180 мкг
N= 205
% субъектов MBV
(график
M0-2-6)
18-65 лет
180 мкг
N= 98
% субъектов Trumenba¹
(график
M0-2-6)
18-25 лет
N= 1823-2425
% субъектов Bexsero²
(график
M0-2)
10-25 лет
N= 110-114
% субъектов Lymerix³
(график
M0-1-12)
15-70 лет
N= 402
% субъектов Боль
после 1^ой вакц.
после 2^ой вакц.
после 3^ей вакц. 76,0
66,3
60,5 78,4
72,8
67,4 81,8
74,2
63,8 73,2
68,1
71,1 84,2
79,3
80,4 90
83
Не примен. 82
76
83 Краснота
после 1^ой вакц.
после 2^ой вакц.
после 3^ей вакц. 5,3^A
6,4
3,6 6,3^A
2,2
4,7 3,0^A
8,7
6,2 8,3^A
7,7
6,7 13,8^A
11,8
17,1 50
45
n/a 22
17
25 Опухание
после 1^ой вакц.
после 2^ой вакц.
после 3^ей вакц. 6,8^A
7,3
4,0 5,2^A
1,1
3,5 7,4^A
9,6
5,2 8,3^A
8,6
4,5 15,5^A
14,0
16,6 Не зарег.
Не зарег.
Не примен. 14
11
19 Лихорадка (varying def.)
после 1^ой вакц.
после 2^ой вакц.
после 3^ей вакц. 1,0
1,0
0,5 3,2
3,4
0,0 0,0
1,5
1,0 2,2
0,0
1,2 2,4
1,2
2,0 1
5
n/a 1,5
1,0
1,0 Головн. боль
после 1^ой вакц.
после 2^ой вакц.
после 3^ей вакц. 20,2
16,6
14,4 30,9
23,9
17,4 27,1
17,8
17,0 28,9
24,5
19,1 43,9
33,1
32,5 33
34
n/a 21
14
20 Миалгия
после 1^ой вакц.
после 2^ой вакц.
после 3^ей вакц. 38,5
26,0
18,0 41,2
29,3
26,7 36,0
24,9
17,5 37,1
29,0
32,6 25,9
15,6
16,9 49
48
n/a n/a
n/a
n/a Артралгия
после 1^ой вакц.
после 2^ой вакц.
после 3^ей вакц. 10,1
9,8
8,5 11,5
13,0
8,1 7,9
7,1
8.2 8,3
10,6
11,2 19,6
15,1
12,6 13
16
n/a 12
11
13

¹ Trumenba Обзор информации о назначении 9/2017, 2 Bexsero Обзор информации о назначении 10/2017, 3 PI Lymerix (частота запрошенных AE).

«Любой» означает кумулятивную частоту субъектов, которые сообщили о реакции как «легкой», «умеренной» или «тяжелой» в течение 7 дней после вакцинации. Мягкий (2,5-5,0 см); умеренный (>5,0-10,0 см); тяжелый (>10,0 см).

Таким образом, клинические исследования показали, что мультимерная вакцина против Borrelia в целом является безопасной во всех исследованных дозах и для всех возрастных групп. Иммуногенность была увеличена на фазе 2 при использовании более высоких доз вакцины (135 мкг, 180 мкг) и альтернативного графика иммунизации (месяцы 0-2-6).

Пример 4: Клинические испытания фазы 2 поливалентной вакцины против Borrelia для изучения трехдозового или двухдозового графика первичной иммунизации вакцины и бустерной дозы в исследуемой популяции в возрасте от 5 до 65 лет

Это исследование представляет собой рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование фазы 2 с участием здоровых добровольцев в возрасте от 5 до 65 лет. Исследование состоит из двух частей (часть A: основная фаза исследования, часть B: фаза бустерной иммунизации). Исследование начинается с набора сигнальных когорт в порядке убывания возраста. Зачисление субъектов в часть A начинается с когорты взрослых, что позволяет получить и оценить соответствующие данные по безопасности до начала исследования когорты детей.

Зачисление субъектов в часть A (основная фаза исследования):

Зачисление осуществляется в порядке убывания возраста, поэтапно для трех возрастных когорт (см. фиг. 19).

Набор когорты 1 (18-65 лет):

Набор начинается с 30 сигнальных взрослых субъектов в возрасте от 18 до 65 лет (когорта 1). Субъектов рандомизируют в соотношении 1:1:1 в одну из трех групп исследования для вакцинации мультимерной вакциной против Borrelia ("MBV") с адъювантом гидроксидом алюминия (группы 1 и 2) или плацебо (группа 3). После завершения первой вакцинации этих 30 сигнальных субъектов и визита в день 7 для контроля безопасности после вакцинации (посещение 1A), включая оценку 7-дневных данных в электронном дневнике, независимый внутренний комитет (IRC) изучает демаскированные данные по безопасности. Основываясь на этих данных, IRC дает рекомендацию о том, можно ли начинать зачисление в когорту подросткового возраста (12-17 лет, когорта 2). Во время оценки IRC набор оставшихся 270 взрослых субъектов в когорту 1 продолжается без ограничений.

Набор когорты 2 (12-17 лет):

После разрешения IRC для исследования набирают 30 сигнальных подростков в возрасте 12-17 лет (когорта 2). Субъектов рандомизируют в соотношении 1:1:1 в одну из трех групп исследования для вакцинации мультимерной вакциной против Borrelia с адъювантом гидроксидом алюминия (группы 1 и 2) или плацебо (группа 3). И в этом случае, после контрольного визита этих субъектов в день 7 для оценки безопасности первой вакцинации (посещение 1A), включая оценку 7-ми дневных данных в электронном дневнике, IRC изучает данные по безопасности. IRC дает рекомендацию, можно ли начинать зачисление в когорту самой младшей возрастной группы (5-11 лет). В этой возрастной когорте набор остальных 120 подростков начинают только после получения разрешения IRC.

Набор в когорту 3 (5-11 лет):

После получения разрешения IRC для исследования набирают 30 сигнальных субъектов в возрасте 5-11 лет (когорта 3). Субъектов рандомизируют в соотношении 1:1:1 в одну из трех групп исследования для вакцинации мультимерной вакциной против Borrelia с адъювантом гидроксидом алюминия (группы 1 и 2) или плацебо (группа 3). И в этом случае, после контрольного визита этих субъектов в день 7 для оценки безопасности первой вакцинации (посещение 1A), включая оценку 7-ми дневных данных в электронном дневнике, IRC изучает данные по безопасности. Набор остальных 120 субъектов в эту возрастную когорту начинается только после получения разрешения IRC. Внешний независимый совет по мониторингу безопасности данных (DSMB) анализирует демаскированные накопленные данные по безопасности через регулярные промежутки времени и может рекомендовать корректировку, приостановку или прекращение исследования в любое время.

Набор субъектов в часть B (фаза бустерной иммунизации):

Бустерная иммунизация мультимерной вакциной против Borrelia (группа 1 или 2)

Все подходящие субъекты (макс. 200; см. таблицу 15) в исследуемой группе (группа 1 или группа 2), получившие все иммунизации в соответствии с графиком первичной иммунизации, выбранным для дальнейшей разработки, переходят в часть B и получают дополнительную MBV вакцинацию в месяце 18.

Плацебо группа бустерной иммунизации (группа 1 или 2)

В части B участвует приблизительно половина субъектов (т.е. макс. 100, при сохранении возрастной стратификации 2:1:1; см. Таблицу 15) в группе исследования (группа 1 или группа 2), которые получили все иммунизации согласно альтернативному графику первичной иммунизации (т.е. график, который не был выбран для дальнейшей разработки) и которые подходят для участия в фазе бустерной иммунизации. Для этой цели в фазу бустерной иммунизации зачисляют первые 50 подходящих взрослых субъектов (возрастная группа 18-65 лет), первые 25 подходящих подростков (возрастная группа 12-17) и первые 25 подходящих субъектов (возрастная группа 5-11 лет) во время их 8-го визита/визита в месяц 18. Эти субъекты получают инъекцию плацебо на 18-м месяце. Остальные субъекты этой группы исследования заканчивают участие в исследовании.

Плацебо группа бустерной иммунизации (группа 3)

В части В участвует приблизительно половина субъектов (т.е. макс. 100, при сохранении возрастной стратификации 2:1:1; см. Таблицу 15) в группе исследования плацебо (группа 3), которые получили все иммунизации согласно графику и которые подходят для участия в фазе бустерной иммунизации. Для этой цели в фазу бустерной иммунизации зачисляют первые 50 подходящих взрослых субъектов (возрастная группа 18-65 лет), первые 25 подходящих подростков (возрастная группа 12-17 лет) и первые 25 подходящих субъектов (возрастная группа 5-11 лет) лет) во время их 8-го визита/визита в месяц 18. Эти субъекты получают дополнительную инъекцию плацебо на 18-м месяце. Остальные субъекты этой группы исследования заканчивают участие в исследовании. Спонсор исследования и статистики исследования имеют открытый доступ к данным во время анализа первичной конечной точки, т.е. до включения субъектов в часть B. После набора нужного количества подходящих субъектов для участия в части B исследовательский центр уведомляется об этом через электронную систему.

ПЛАН ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводят двумя частями (часть A: основная фаза исследования, часть B: фаза бустерной иммунизации). План исследования показан на фиг. 20.

В части А (основная фаза исследования) приблизительно 600 субъектов в возрасте от 5 до 65 лет рандомизируют 1:1:1 в три исследовательские группы: группа 1 (приблизительно 200 субъектов) получает три вакцинации мультимерной вакциной против Borrelia с адъювантом гидроксидом алюминия в месяцы 0-2-6. Группа 2 (приблизительно 200 субъектов) получает две вакцинации мультимерной вакциной против Borrelia с адъювантом гидроксидом алюминия в месяцы 0-6 и инъекцию плацебо в месяц 2, для сохранения слепого режима исследования. Группа 3 (приблизительно 200 субъектов) получает три инъекции плацебо в месяцы 0-2-6. В каждой исследуемой группе испытуемых зачисляют в соотношении 2:1:1 в три возрастные группы (18-65 лет, 12-17 лет и 5-11 лет).

В части A все субъекты получают три внутримышечные инъекции либо MBV, либо плацебо в месяцы 0-2-6 (т.е. в дни 1-57-180). В день 8/визит 1А (т.е. через 7 дней после первой вакцинации) осуществляют визит для оценки безопасности (телефонный звонок для субъектов в возрасте 18-65 лет, личный визит для субъектов в возрасте 5-17 лет). Личные визиты планируют для всех возрастных групп через месяц после каждой вакцинации. Во время скринингового визита собирают образцы крови для оценки иммуногенности, в день 85, день 180, день 194 (у подгруппы взрослых субъектов), в день 208, день 365/12-й месяц и 18-й месяц.

На основании данных по безопасности и иммуногенности, полученных в день 208/визит 6 части А (т.е. через 1 месяц после третьей иммунизации) принимают решение в отношении бустерной иммунизации в части В.

В части B (фаза бустерной иммунизации) подходящие субъекты из группы, получившей выбранный график первичной иммунизации в части A (либо группа 1, либо группа 2), получают бустерную дозу мультимерной вакцины против Borrelia с адъювантом гидроксидом алюминия в месяц 18.

Для сравнения данных по безопасности приблизительно 100 субъектов, зачисленных в группу, вакцинированную в части А в соответствии с альтернативным графиком вакцинации (т.е. либо группы 1, либо группы 2, прошедшие вакцинацию согласно графику первичной иммунизации, который не был не выбран для дальнейшей разработки вакцины) и приблизительно 100 субъектов группы 3 получают плацебо. Это направлено на сохранение возрастной стратификации 2:1:1 (18-65 лет, 12-17 лет и 5-11 лет) во всех исследуемых группах. Все субъекты, включенные в часть B, находятся под наблюдением в течение следующих 3 лет (т.е. до 54 месяца) с предусмотренным исследованием визитом в месяцы 19, 23, 26, 30, 36, 42, 48 и 54.

В таблице 15 представлен краткий обзор групп исследования и методов обработки. Вводимый объем инъекции во время лечения составляет 0,5 мл.

Таблица 15 - Группы исследования и вакцинации Группа исследования субъекты Возраст в годах лечение График вакцинации часть A: основная фаза исследования группа 1 Общее кол-во: 200
100
50
50 18-65
12-17
5-11 MBV 180 мкг месяцы 0-2-6 группа 2 Общее кол-во: 200
100
50
50 18-65
12-17
5-11 MBV 180 мкг
плацебо месяцы 0-6
месяц 2* группа 3 Общее кол-во: 200
100
50
50 18-65
12-17
5-11 плацебо месяцы 0-2-6 часть B: фаза бустерной иммунизации группа 1 или 2:
выбранный график Общее кол-во: 200
100
50
50 18-65
12-17
5-11 MBV 180 мкг месяц 18 группа 1 или 2:
альтернативный график Общее кол-во: 100
50
25
25 18-65
12-17
5-11 плацебо месяц 18 группа 3 Общее кол-во:
100
50
25
25 18-65
12-17
5-11 плацебо месяц 18

*Для сохранения слепого режима исследования, субъекты, отнесенные к группе 2, будут получать плацебо во 2 месяце.

--->

СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Valneva Austria GmbH

Pfizer Inc.

<120> Композиции, содержащие три слитых белка OspA, для применения

в медицине

<130> I0422.70135WO00

<150> EP 20169147.4

<151> 2020-04-09

<150> EP 20169148.2

<151> 2020-04-09

<150> EP 20169642.4

<151> 2020-04-15

<150> EP 20187283.5

<151> 2020-07-22

<150> EP 20202816.3

<151> 2020-10-20

<150> US 63/152582

<151> 2021-02-23

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 320

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЛИПИД

<222> (1)..(1)

<220>

<223> Синтетический

<400> 1

Cys Ser Ser Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr

1 5 10 15

Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly

20 25 30

Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys

35 40 45

Val Ala Asn Asp Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Cys Gly Thr Val Thr

50 55 60

Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn

65 70 75 80

Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser

85 90 95

Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp

100 105 110

Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser

115 120 125

Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp

130 135 140

Glu Ile Cys Asn Ala Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser

145 150 155 160

Gly Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Phe Asn Glu Lys

165 170 175

Gly Glu Leu Ser Ala Lys Thr Met Thr Arg Glu Asn Gly Thr Lys Leu

180 185 190

Glu Tyr Thr Glu Met Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys Ala Lys Glu Val

195 200 205

Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Val Thr

210 215 220

Leu Glu Val Lys Cys Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Glu Ile Ala Lys

225 230 235 240

Ser Gly Glu Val Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Asn Thr Thr Gln Ala

245 250 255

Thr Lys Lys Thr Gly Ala Trp Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr Ile

260 265 270

Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln Asp

275 280 285

Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly

290 295 300

Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Cys Asn Ala Leu Lys

305 310 315 320

<210> 2

<211> 322

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЛИПИД

<222> (1)..(1)

<220>

<223> Синтетический

<400> 2

Cys Ser Ser Phe Asn Ala Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Thr Ile Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Ser Asp Gly

20 25 30

Thr Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Ala Leu Glu Gly Thr

35 40 45

Leu Ala Ala Asp Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Cys Gly Thr Val Val

50 55 60

Leu Ser Lys His Ile Pro Asn Ser Gly Glu Ile Thr Val Glu Leu Asn

65 70 75 80

Asp Ser Asn Ser Thr Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser

85 90 95

Asn Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn

100 105 110

Ile Val Phe Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser

115 120 125

Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp

130 135 140

Glu Leu Cys Asn Ala Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser

145 150 155 160

Gly Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Phe Asn Glu Lys

165 170 175

Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Leu Thr Arg Ser Asn Gly Thr Thr Leu

180 185 190

Glu Tyr Ser Gln Met Thr Asp Ala Glu Asn Ala Thr Lys Ala Val Glu

195 200 205

Thr Leu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Pro Gly Asn Leu Val Gly Gly Lys

210 215 220

Thr Lys Leu Thr Val Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile

225 230 235 240

Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Glu Thr Thr

245 250 255

Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp Thr Ser Thr Leu

260 265 270

Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys

275 280 285

Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu

290 295 300

Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Cys Ala Ala

305 310 315 320

Leu Lys

<210> 3

<211> 322

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЛИПИД

<222> (1)..(1)

<220>

<223> Синтетический

<400> 3

Cys Ser Ser Phe Asn Ala Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Thr Ile Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Ser Asp Gly

20 25 30

Thr Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Ala Leu Glu Gly Thr

35 40 45

Leu Ala Ala Asp Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Cys Gly Thr Val Val

50 55 60

Leu Ser Lys His Ile Pro Asn Ser Gly Glu Ile Thr Val Glu Leu Asn

65 70 75 80

Asp Ser Asn Ser Thr Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser

85 90 95

Asn Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn

100 105 110

Ile Val Phe Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser

115 120 125

Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp

130 135 140

Glu Leu Cys Asn Ala Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser

145 150 155 160

Gly Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Phe Asn Glu Lys

165 170 175

Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Leu Thr Arg Ser Asn Gly Thr Thr Leu

180 185 190

Glu Tyr Ser Gln Met Thr Asp Ala Glu Asn Ala Thr Lys Ala Val Glu

195 200 205

Thr Leu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Pro Gly Asn Leu Val Gly Gly Lys

210 215 220

Thr Lys Leu Thr Val Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile

225 230 235 240

Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Glu Thr Thr

245 250 255

Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp Thr Ser Thr Leu

260 265 270

Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys

275 280 285

Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu

290 295 300

Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Cys Ala Ala

305 310 315 320

Leu Lys

<210> 4

<211> 1020

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60

tgctcaagct tcaacgaaaa gggcgaagtc agcgaaaaaa tcattacccg cgcagacggc 120

acccgcctgg aatacaccgg catcaaatcg gacggcagcg gcaaagcgaa agaagttctg 180

aaaaacttta ccctggaagg caaagtcgca aatgataaaa ccaccctggt ggtgaaatgc 240

ggcaccgtta cgctgagcaa aaacattagt aaatccggtg aagtctctgt ggaactgaat 300

gataccgaca gctctgcggc caccaagaaa accgcagctt ggaactcagg cacctcgacg 360

ctgaccatta cggttaatag caagaaaacc aaagatctgg tcttcacgaa agaaaacacc 420

atcacggtgc agcaatatga cagcaatggt accaaactgg aaggctccgc tgtggaaatc 480

acgaaactgg atgaaatctg taatgctctg aaaggtacta gtgacaaaaa caatggctct 540

ggtagcaaag agaaaaacaa agatggcaag tactcattca acgaaaaagg cgaactgtcg 600

gcgaaaacga tgacgcgtga aaacggcacc aaactggaat atacggaaat gaaaagcgat 660

ggcaccggta aagcgaaaga agttctgaaa aactttaccc tggaaggcaa agtcgccaat 720

gacaaagtca ccctggaagt gaaatgcggc accgttacgc tgtcaaaaga aattgcaaaa 780

tcgggtgaag tgaccgttgc tctgaacgat acgaatacca cgcaagcgac caagaaaacc 840

ggcgcctggg acagcaaaac ctctacgctg accattagtg ttaatagcaa gaaaaccacg 900

cagctggtct tcaccaaaca agatacgatc accgtgcaga aatacgacag tgcgggtacc 960

aacctggaag gcacggctgt tgaaatcaaa accctggacg aactgtgtaa cgccctgaaa 1020

<210> 5

<211> 1029

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 5

atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60

tgctcaagct tcaatgctaa gggcgaactg agcgaaaaaa cgatcctgcg tgcgaatggc 120

acccgtctgg aatacaccga aatcaaatcc gatggtacgg gcaaagcaaa ggaagtcctg 180

aaagattttg ctctggaagg taccctggcg gccgacaaaa ccacgctgaa ggtgacgtgc 240

ggcaccgtgg ttctgagcaa acatattccg aactctggtg aaatcaccgt tgaactgaac 300

gatagcaatt ctacgcaggc aaccaaaaag acgggcaaat gggacagtaa tacctccacg 360

ctgaccattt cagtcaactc gaaaaagacc aaaaatattg tgttcacgaa ggaagatacg 420

atcaccgttc aaaaatatga ctccgcgggc accaacctgg aaggcaatgc cgtcgaaatc 480

aaaaccctgg atgaactgtg taacgccctg aagggtacta gtgacaaaaa caatggctct 540

ggtagcaaag agaaaaacaa agatggcaag tactcattca acgaaaaagg cgaagtgagc 600

gaaaaaattc tgacccgtag caatggcacc accctggaat atagccagat gaccgatgca 660

gaaaatgcaa ccaaagcagt tgaaaccctg aaaaacggta ttaaactgcc tggtaatctg 720

gttggtggta aaaccaaact gaccgttacc tgtggcaccg ttaccctgag caaaaacatt 780

agcaaaagcg gtgaaattac cgtggcactg aatgataccg aaaccacacc ggcagacaaa 840

aaaaccggtg aatggaaaag cgataccagc accctgacca ttagtaaaaa tagccagaaa 900

acaaaacagc tggtgtttac caaagaaaac accattaccg tgcagaatta taaccgtgca 960

ggtaatgcac tggaaggtag tccggcagaa attaaagatc tggcagaact gtgtgcagcc 1020

ctgaaataa 1029

<210> 6

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 6

atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60

tgctcaagct tcaacgaaaa gggcgaaatc tcagaaaaaa ccatcgtccg cgctaacggc 120

acccgcctgg aatacaccga catcaaatca gacaagaccg gtaaagcgaa ggaagttctg 180

aaagatttta cgctggaagg taccctggca gcagacggta aaaccacgct gaaggtgacc 240

tgcggtaccg ttacgctgtc caaaaacatt agtaagtccg gcgaaatcac ggtcgccctg 300

gatgacaccg atagctctgg caacaaaaag agcggtacct gggattcagg cacctcgacg 360

ctgaccattt ctaaaaatcg tacgaaaacc aagcagctgg tcttcacgaa agaagatacg 420

atcaccgtgc aaaactatga cagcgcaggt accaatctgg aaggcaaagc tgtggaaatt 480

accacgctga aagaactgtg taatgctctg aaaggtacta gtgacaaaaa caatggctct 540

ggtagcaaag agaaaaacaa agatggcaag tactcattca acggcaaagg tgaaacgagc 600

gaaaagacca tcgtgcgtgc gaacggtacc cgcctggaat atacggacat taaatcggac 660

ggcagcggca aagcaaagga agtcctgaaa gattttacgc tggaaggtac cctggcagca 720

gacggtaaaa ccacgctgaa ggtgacgtgc ggcaccgtgg ttctgtcaaa aaacattctg 780

aagtcgggtg aaatcaccgc agctctggat gacagcgata ccacgcgtgc tacgaaaaag 840

accggtaaat gggatagcaa gacctctacg ctgaccatta gtgtcaactc ccagaaaacg 900

aagaatctgg tgttcaccaa agaagatacg atcaccgttc aacgctatga cagtgcgggc 960

accaacctgg aaggcaaagc cgttgaaatt accacgctga aagaactgtg taatgctctg 1020

aaa 1023

<210> 7

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 7

Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Ser Lys Glu Lys Asn Lys

1 5 10 15

Asp Gly Lys Tyr Ser

20

<210> 8

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp

1 5 10

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применимо в медицине. Изобретение раскрывает композицию, содержащую комбинацию трех слитых белков: белок OspA с SEQ ID NO: 1 (LipS1D1-S2D1), белок OspA с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и белок OspA с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1). Композиция согласно настоящему изобретению может быть применима в качестве вакцины или как иммуномодулирующее средство для индукции у человека иммунного ответа против возбудителей болезни Лайма, в частности против бактерий рода Borrelia. 8 н. и 124 з.п. ф-лы, 4 пр., 20 ил., 15 табл.

1. Способ иммунизации субъекта, представляющего собой человека, против болезни Лайма, включающий введение композиции, содержащей

(а) слитый белок c SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок c SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(с) слитый белок c SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1):

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

2. Способ индукции у субъекта, представляющего собой человека, иммунного ответа против Borrelia путем введения композиции, содержащей

(а) слитый белок c SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок c SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(с) слитый белок c SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1):

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

3. Способ по п. 1 или 2, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 6 недель до не более 3 месяцев после первого введения и/или третье введение осуществляют в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения.

4. Способ по пп. 1-3, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 50 дней до не более 70 дней, в частности в период от по меньшей мере 55 дней до не более 60 дней, особенно через 56 дней после первого введения; и/или

где третье введение осуществляют в период от по меньшей мере 170 дней до не более 190 дней, в период от по меньшей мере 175 дней до не более 185 дней, особенно через 180 дней после первого введения.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где четвертое введение композиции осуществляют в период от по меньшей мере 15 месяцев до не более 21 месяца, в частности в период от по меньшей мере 17 месяцев до не более 19 месяцев, особенно через 18 месяцев после первого введения.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 135 до 180 мкг на дозу, в частности 135 мкг или 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, или где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 67,5 до 90 мкг на дозу, в частности 67,5 мкг или 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где три слитых белка составляют по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% всех белков в композиции.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где композиция содержит слитые белки в весовом соотношении 1:1:1 (Lip-S1D1-S2D1:Lip-S4D1-S3hybD1:Lip-S5D1-S6D1).

9. Способ по любому из пп. 1-8, где композиция содержит адъювант.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где композиция содержит адъювант на основе алюминия, предпочтительно адъювант на основе алюминия с низким содержанием меди, предпочтительно менее 1,25 частей на миллиард меди.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения и необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

12. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

13. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения и необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

14. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, где третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

15. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

16. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

17. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

18. Способ по любому из пп. 1-10, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, где третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и где необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где последующие введения осуществляют каждый год после третьего введения, в частности через 1 год, через 2 года и через 3 года.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где индуцируемый иммунный ответ содержит ответ с выработкой антител с бактерицидной активностью к OspA серотипа 1, OspA серотипа 2, OspA серотипа 3, OspA серотипа 4, OspA серотипа 5 и/или OspA серотипа 6.

21. Способ по любому из пп. 1-20, где индуцируемый иммунный ответ содержит антитела против Borrelia серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

22. Способ по любому из пп. 1-21, где иммунный ответ против Borrelia серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 180 дней, по меньшей мере приблизительно 365 дней или по меньшей мере приблизительно 540 дней.

23. Способ по любому из пп. 1-22, где композиция содержит менее 1,25 частей на миллиард меди или достаточное количество L-метионина.

24. Способ по любому из пп. 1-23, где медь находится в форме иона, в частности в виде Cu⁺ или Cu²⁺.

25. Способ по любому из пп. 1-24, где L-метионин присутствует в концентрации по меньшей мере 10 ммоль/л.

26. Способ по любому из пп. 23-25, где концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере эквивалентна концентрации меди в композиции.

27. Способ по любому из пп. 1-26, где композиция дополнительно содержит реакционноспособное соединение, где реакционноспособное соединение выбрано из группы, состоящей из окислительно-восстановительного активного соединения, соединения, образующего радикалы, стабилизирующего соединения и любой их комбинации, особенно где реакционноспособное соединение выбирают из группы, состоящей из формальдегида, этанола, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, тритона Х-100, дезоксихолата, диэтилпирокарбоната, сульфита, Na₂S₂O₅, бета-проприолактона, полисорбата, такого как Tween 20®, Tween 80®, O₂, фенола, сополимеров типа плюроник и любой их комбинации.

28. Способ по любому из пп. 1-27, где указанный взрослый человек является субъектом в возрасте 18 лет или старше, например в возрасте от 18 до 65 лет.

29. Способ по любому из пп. 1-27, где указанный взрослый человек является пожилым человеком в возрасте 50 лет или старше.

30. Способ по любому из пп. 1-27, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 5 до 17 лет, например от 12 до 17 лет или от 5 до 11 лет.

31. Способ по любому из пп. 1-27, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 0 до 4 лет, например от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет.

32. Способ по любому из пп. 1-31, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме от 0,25 до 1,0 мл, например 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл или 1,0 мл.

33. Способ по любому из пп. 1-32, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме 0,25 мл, 0,5 мл или 1,0 мл.

34. Способ иммунизации субъекта, представляющего собой человека, против болезни Лайма, включающий введение композиции, содержащей

(а) слитый белок c SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок c SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(с) слитый белок c SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1):

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

35. Способ индукции у субъекта, представляющего собой человека, иммунного ответа против Borrelia путем введения композиции, содержащей

(а) слитый белок c SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок c SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(с) слитый белок c SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1):

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

36. Способ по п. 34 или 35, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения.

37. Способ по любому из пп. 34-36, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 170 дней до не более 190 дней, в период от по меньшей мере 175 дней до не более 185 дней, особенно через 180 дней после первого введения.

38. Способ по любому из пп. 34-37, где третье введение композиции осуществляют в период от по меньшей мере 15 месяцев до не более 21 месяца, в частности в период от по меньшей мере 17 месяцев до не более 19 месяцев, особенно через 18 месяцев после первого введения.

39. Способ по любому из пп. 34-38, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 135 до 180 мкг на дозу, в частности 135 мкг или 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, или где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 67,5 до 90 мкг на дозу, в частности 67,5 мкг или 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста.

40. Способ по любому из пп. 34-39, где три слитых белка составляют по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% всех белков в композиции.

41. Способ по любому из пп. 34-40, где композиция содержит слитые белки в весовом соотношении 1:1:1 (Lip-S1D1-S2D1:Lip-S4D1-S3hybD1:Lip-S5D1-S6D1).

42. Способ по любому из пп. 34-41, где композиция содержит адъювант.

43. Способ по любому из пп. 34-42, где композиция содержит адъювант на основе алюминия.

44. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

45. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

46. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

47. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

48. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

49. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

50. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, где второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

51. Способ по любому из пп. 34-43, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для ребенка младшего возраста, где второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения и где необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и затем необязательно каждые 12 месяцев.

52. Способ по любому из пп. 34-51, где дальнейшие введения осуществляют каждый год после последней первичной иммунизации или в начале каждого сезона клещей, в частности через 1 год, через 2 года и через 3 года и т.д.

53. Способ по любому из пп. 34-52, где индуцируемый иммунный ответ содержит ответ с выработкой антител с бактерицидной активностью к OspA серотипа 1, OspA серотипа 2, OspA серотипа 3, OspA серотипа 4, OspA серотипа 5 и/или OspA серотипа 6.

54. Способ по любому из пп. 34-53, где индуцируемый иммунный ответ содержит антитела с бактерицидной активностью против спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 1, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 2, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 3, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 4, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 5, и спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 6.

55. Способ по любому из пп. 34-54, где иммунный ответ против OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 180 дней, по меньшей мере приблизительно 365 дней или по меньшей мере приблизительно 540 дней.

56. Способ по любому из пп. 34-55, где композиция содержит менее 1,25 частей на миллиард меди или достаточное количество L-метионина.

57. Способ по любому из пп. 34-56, где медь находится в форме иона, в частности в виде Cu⁺ или Cu²⁺.

58. Способ по любому из пп. 34-57, где L-метионин присутствует в концентрации по меньшей мере 10 ммоль/л.

59. Способ по любому из пп. 56-58, где концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере эквивалентна концентрации меди в композиции.

60. Способ по любому из пп. 34-59, где композиция дополнительно содержит реакционноспособное соединение, где реакционноспособное соединение выбрано из группы, состоящей из окислительно-восстановительного активного соединения, соединения, образующего радикалы, стабилизирующего соединения и любой их комбинации, особенно где реакционноспособное соединение выбирают из группы, состоящей из формальдегида, этанола, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, тритона Х-100, дезоксихолата, диэтилпирокарбоната, сульфита, Na₂S₂O₅, бета-проприолактона, полисорбата, такого как Tween 20®, Tween 80®, O₂, фенола, сополимеров типа плюроник и любой их комбинации.

61. Способ по любому из пп. 34-60, где указанный взрослый человек является субъектом в возрасте 18 лет или старше, например от 18 до 65 лет.

62. Способ по любому из пп. 34-60, где указанный взрослый человек является пожилым человеком в возрасте 50 лет или старше.

63. Способ по любому из пп. 34-60, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 5 до 17 лет, например от 12 до 17 лет или от 5 до 11 лет.

64. Способ по любому из пп. 34-60, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 0 до 4 лет, например от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет.

65. Способ по любому из пп. 34-64, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме от 0,25 до 1,0 мл, например 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл или 1,0 мл.

66. Способ по любому из пп. 34-65, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме 0,25 мл, 0,5 мл или 1,0 мл.

67. Применение композиции, содержащей

(a) слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(c) слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1),

в получении лекарственного средства для иммунизации субъекта, представляющего собой человека, против болезни Лайма путем введения композиции:

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

68. Применение композиции, содержащей

(a) слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(c) слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1),

в получении лекарственного средства для индукции у субъекта, представляющего собой человека, иммунного ответа против Borrelia путем введения композиции:

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере три раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

69. Применение по любому из пп. 67, 68, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 6 недель до не более 3 месяцев после первого введения и/или третье введение осуществляют в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения.

70. Применение по любому из пп. 67-69, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 50 дней до не более 70 дней, в частности в период от по меньшей мере 55 дней до не более 60 дней, в частности 56 дней, после первого введения; и/или

причем третье введение осуществляют в период от по меньшей мере 170 дней до не более 190 дней, в период от по меньшей мере 175 дней до не более 185 дней, в частности 180 дней, после первого введения.

71. Применение по любому из пп. 67-70, где четвертое введение композиции осуществляют в период от по меньшей мере 15 месяцев до не более 21 месяца, в частности в период от по меньшей мере 17 месяцев до не более 19 месяцев, в частности 18 месяцев, после первого введения.

72. Применение по любому из пп. 67-71, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 135 до 180 мкг на дозу, в частности 135 мкг или 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка или где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 67,5 до 90 мкг на дозу, в частности 67,5 мкг или 90 мкг на дозу для маленького ребенка.

73. Применение по любому из пп. 67-72, где три слитых белка составляют по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% всех белков в композиции.

74. Применение по любому из пп. 67-73, где композиция содержит слитые белки в весовом соотношении 1:1:1 (Lip-S1D1-S2D1 : Lip-S4D1-S3hybD1 : Lip-S5D1-S6D1).

75. Применение по любому из пп. 67-74, где композиция содержит адъювант.

76. Применение по любому из пп. 67-75, где композиция содержит алюминиевый адъювант, предпочтительно алюминиевый адъювант с низким содержанием меди, предпочтительно менее 1,25 ppb меди.

77. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, причем третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

78. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, причем третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

79. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, причем третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

80. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 56 дней после первого введения, причем третье введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

81. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, причем третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

82. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, причем третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

83. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, причем третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

84. Применение по любому из пп. 67-76, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 2 месяца после первого введения, причем третье введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и причем необязательное четвертое введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения.

85. Применение по любому из пп. 67-84, где последующие введения осуществляют каждый год после третьего введения, в частности через 1 год, через 2 года и через 3 года.

86. Применение по любому из пп. 67-85, где индуцированный иммунный ответ включает антительный ответ анти-OspA серотипа 1, анти-OspA серотипа 2, анти-OspA серотипа 3, анти-OspA серотипа 4, анти-OspA серотипа 5 и/или анти-OspA серотипа 6 с бактерицидной активностью.

87. Применение по любому из пп. 67-86, где индуцированный иммунный ответ включает антитела к Borrelia серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

88. Применение по любому из пп. 67-87, где иммунный ответ против Borrelia серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 180 дней, по меньшей мере приблизительно 365 дней или по меньшей мере приблизительно 540 дней.

89. Применение по любому из пп. 67-88, где композиция содержит менее 1,25 ppb меди или достаточное количество L-метионина.

90. Применение по п. 89, где медь находится в форме иона, в частности в форме Cu⁺ или Cu²⁺.

91. Применение по любому из пп. 89, 90, где L-метионин присутствует в концентрации по меньшей мере 10 ммоль/л.

92. Применение по любому из пп. 89-91, где концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере эквивалентна концентрации меди в композиции.

93. Применение по любому из пп. 67-92, где композиция дополнительно содержит реакционноспособное соединение, где реакционноспособное соединение выбрано из группы, состоящей из окислительно-восстановительного активного соединения, соединения, образующего радикалы, стабилизирующего соединения и любой их комбинации, особенно где реакционноспособное соединение выбирают из группы, состоящей из формальдегида, этанола, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, тритона Х-100, дезоксихолата, диэтилпирокарбоната, сульфита, Na₂S₂O₅, бета-проприолактона, полисорбата, такого как Tween 20®, Tween 80®, O₂, фенола, сополимеров типа плюроник и любой их комбинации.

94. Применение по любому из пп. 67-93, где указанный взрослый человек представляет собой субъекта в возрасте 18 лет или старше, например в возрасте 18-65 лет.

95. Применение по любому из пп. 67-93, где указанный взрослый человек является пожилым субъектом в возрасте 50 лет или старше.

96. Применение по любому из пп. 67-93, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 5 до 17 лет, например от 12 до 17 лет или от 5 до 11 лет.

97. Применение по любому из пп. 67-93, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 0 до 4 лет, например от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет.

98. Применение по любому из пп. 67-97, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме от 0,25 до 1,0 мл, например 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл или 1,0 мл.

99. Применение по любому из пп. 67-98, причем указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме 0,25 мл, 0,5 мл или 1,0 мл.

100. Применение композиции, содержащей

(a) слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(c) слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1),

в получении лекарственного средства для индукции у пациента, представляющего собой человека, иммунного ответа против Borrelia путем введения композиции:

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

101. Применение композиции, содержащей

(a) слитый белок с SEQ ID NO: 1 (Lip-S1D1-S2D1),

(b) слитый белок с SEQ ID NO: 2 (Lip-S4D1-S3hybD1) и

(c) слитый белок с SEQ ID NO: 3 (Lip-S5D1-S6D1),

в получении лекарственного средства для индукции у пациента, представляющего собой человека, иммунного ответа против Borrelia путем введения композиции:

взрослому человеку или ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 120 до 200 мкг на дозу; или

ребенку по меньшей мере два раза при общем содержании белка указанных трёх слитых белков в диапазоне от 60 до 100 мкг на дозу.

102. Применение по любому из пп. 100, 101, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 5 месяцев до не более 7 месяцев после первого введения.

103. Применение по любому из пп. 100-102, где второе введение осуществляют в период от по меньшей мере 170 дней до не более 190 дней, в период от по меньшей мере 175 дней до не более 185 дней, в частности 180 дней после первого введения.

104. Применение по любому из пп. 100-103, где третье введение композиции осуществляют в период от по меньшей мере 15 месяцев до не более 21 месяца, в частности в период от по меньшей мере 17 месяцев до не более 19 месяцев, в частности 18 месяцев, после первого введения.

105. Применение по любому из пп. 100-104, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 135 до 180 мкг на дозу, в частности 135 мкг или 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, или где общее содержание белка указанных трёх слитых белков находится в диапазоне от 67,5 до 90 мкг на дозу, в частности 67,5 мкг или 90 мкг на дозу для маленького ребенка.

106. Применение по любому из пп. 100-105, где три слитых белка составляют по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% всех белков в композиции.

107. Применение по любому из пп. 100-106, где композиция содержит слитые белки в весовом соотношении 1:1:1 (Lip-S1D1-S2D1:Lip-S4D1-S3hybD1:Lip-S5D1-S6D1).

108. Применение по любому из пп. 100-107, где композиция содержит адъювант.

109. Применение по любому из пп. 100-108, где композиция содержит алюминиевый адъювант.

110. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

111. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

112. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

113. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 180 дней после первого введения, и причем необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

114. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 135 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и причем необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

115. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 67,5 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, а необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

116. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 180 мкг на дозу для взрослого человека или ребенка, причем второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, и причем необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

117. Применение по любому из пп. 100-109, где общее содержание белка указанных трёх слитых белков составляет 90 мкг на дозу для маленького ребенка, причем второе введение осуществляют через 6 месяцев после первого введения, а необязательное третье введение осуществляют через 18 месяцев после первого введения и необязательно затем каждые 12 месяцев.

118. Применение по любому из пп. 100-117, где дальнейшие введения осуществляют каждый год после последней первичной иммунизации или в начале каждого сезона клещей, в частности через 1 год, через 2 года и через 3 года и т.д.

119. Применение по любому из пп. 100-118, где индуцированный иммунный ответ включает антительный ответ анти-OspA серотипа 1, анти-OspA серотипа 2, анти-OspA серотипа 3, анти-OspA серотипа 4, анти-OspA серотипа 5 и/или анти-OspA серотипа 6 с бактерицидной активностью.

120. Применение по любому из пп. 100-119, где индуцированный иммунный ответ включает антитела с бактерицидной активностью против спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 1, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 2, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 3, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 4, спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 5, и спирохет, экспрессирующих OspA серотипа 6.

121. Применение по любому из пп. 100-120, где иммунный ответ против серотипов OspA 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 180 дней, по меньшей мере приблизительно 365 дней или по меньшей мере приблизительно 540 дней.

122. Применение по любому из пп. 100-121, где композиция содержит менее 1,25 ppb меди или достаточное количество L-метионина.

123. Применение по п. 122, где медь находится в форме иона, в частности в форме Cu⁺ или Cu²⁺.

124. Применение по любому из пп. 122, 123, где L-метионин присутствует в концентрации по меньшей мере 10 ммоль/л.

125. Применение по любому из пп. 122-124, где концентрация L-метионина в моль/л по меньшей мере эквивалентна концентрации меди в композиции.

126. Применение по любому из пп. 100-125, где композиция дополнительно содержит реакционноспособное соединение, где реакционноспособное соединение выбрано из группы, состоящей из окислительно-восстановительного активного соединения, соединения, образующего радикалы, стабилизирующего соединения и любой их комбинации, особенно где реакционноспособное соединение выбирают из группы, состоящей из формальдегида, этанола, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, тритона Х-100, дезоксихолата, диэтилпирокарбоната, сульфита, Na₂S₂O₅, бета-проприолактона, полисорбата, такого как Tween 20®, Tween 80®, O₂, фенола, сополимеров типа плюроник и любой их комбинации.

127. Применение по любому из пп. 100-126, где указанный взрослый человек представляет собой субъекта в возрасте 18 лет или старше, например от 18 до 65 лет.

128. Применение по любому из пп. 100-126, где указанный взрослый человек является пожилым субъектом в возрасте 50 лет или старше.

129. Применение по любому из пп. 100-126, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 5 до 17 лет, например от 12 до 17 лет или от 5 до 11 лет.

130. Применение по любому из пп. 100-126, где указанный ребенок является субъектом в возрасте от 0 до 4 лет, например от 1 до 4 лет или от 2 до 4 лет.

131. Применение по любому из пп. 100-130, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме от 0,25 до 1,0 мл, например 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл или 1,0 мл.

132. Применение по любому из пп. 100-131, где указанную композицию вводят взрослому человеку или ребенку в объеме 0,25 мл, 0,5 мл или 1,0 мл.