Композиции с Neisseria meningitidis и способы их применения Российский патент 2025 года по МПК A61K39/95 C07K14/22 A61P31/04 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США 62/907,097, поданной 27 сентября 2019 и предварительной заявке на патент США 63/040,498, поданной 17 июня 2020. Все вышеуказанные заявки включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям Neisseria meningitides и к способам их применения.

Предшествующий уровень техники

Neisseria meningitides представляет собой грамотрицательную инкапсулированную бактерию, которая может вызывать сепсис, менингит и смерть. N. meningitides может быть подразделена по меньшей мере на 12 серогрупп (включающих серогруппы А, В, С, 29Е, Н, I, K, L, W-135 (в основном теперь называемую W), X, Y и Z) на основе химически и антигенно отличных полисахаридных капсул. Штаммы пяти серогрупп (А, В, С, Y и W135) несут ответственность за большинство заболеваний.

Менингококковый менингит - это тяжелое заболевание, которое может убить детей и молодых людей в течение нескольких часов, несмотря на доступность антибиотиков. Существует потребность в улучшенных иммуногенных композициях против менингококковых серогрупп А, В, С, Y и W135, и/или X.

В настоящее время еще нет в продаже вакцины или композиции с перекрестной защитой, эффективная против широкого спектра MnB и изолятов менингококковых серогрупп А, С, Y и W, и/или X. Соответственно, требуется вакцина или композиция с перекрестной защитой, эффективная против различных MnB и изолятов менингококковых серогрупп А, С, Y и W, и/или X.

Еще одна цель изобретения заключается в предложении улучшенных схем введения менингококковой вакцины. Согласно рекомендованной в настоящее время схеме проводят 4-5 вакцинаций против менингококковых серогрупп А, С, W, Y и В, которые проводят в разном возрасте. Существует неудовлетворенная потребность в эффективном вакцинировании, которое может упростить схемы иммунизации и улучшить охват прививками для достижения дальнейшего сокращения инвазивных менингококковых заболеваний (IMD).

Краткое изложение сущности изобретения

Для удовлетворения этих и других потребностей настоящее описание относится к менингококковым композициям и способам их применения.

Авторы изобретения обнаружили способ индуцирования иммунного ответа у человека, включающий введение этому человеку композиции, содержащей а) полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitides; (б) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы А; (в) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы С; (г) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы W; и (д) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы Y, где композиция индуцирует иммунный ответ против капсульного полисахарида по меньшей мере одной из серогрупп А, С, W-135 и Y и серогруппы В Neisseria meningitides, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител, который выше, чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированный соответствующей лицензированной вакциной против серогруппы.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили способ индуцирования иммунного ответа у человека, включающий введение этому человеку композиции, содержащей а) первый полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitides; (б) второй полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitides; (в) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; (г) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы С; (д) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы W; и (е) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы Y, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного из капсульных полисахаридов серогрупп А, С, W-135 и Y и серогруппы В Neisseria meningitides, при этом иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител, который выше чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированных соответствующей лицензированной вакциной против серогруппы.

В некоторых воплощениях, полипептид включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 62.

В предпочтительном воплощении композиция включает (а) первый полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) второй полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы А, конъюгированного с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера.

В некоторых воплощениях композиция вызывает иммунный ответ к любой из серогрупп Neisseria meningitides А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides.

В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitides серогруппы А, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides.

В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitides серогруппы С, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides.

В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitides серогруппы W, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides .

В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitides серогруппы Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides.

В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ к любой из серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides.

В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ к менингококку серогруппы В, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной фактор Н-связывающей вакциной к менингококку серогруппы В.

В некоторых воплощениях композиция вызывает иммунный ответ к каждой из серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ к капсульным полисахаридам каждой из серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду N. meningitides серогрупп А, С, W-135 и Y; и композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitides серогруппы В, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной фактор Н-связывающей вакциной к менингококку серогруппы В; где лицензированную вакцину к капсульному полисахариду N. meningitides серогрупп А, С, W-135 и Y и лицензированную фактор Н-связывающую вакцину к менингококку серогруппы В вводят последовательно и не в комбинированной дозе.

В некоторых воплощениях композиция включает адъювант. В некоторых воплощениях композиция включает алюминиевый адъювант. В некоторых воплощениях, композиция включает гидроксид алюминия. В некоторых воплощениях композиция включает фосфат алюминия. В некоторых воплощениях композиция включает алюминий.

В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% первого полипептида связано с алюминием в композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% второго полипептида связано с алюминием в композиции.

В некоторых воплощениях композиция приготовлена в виде стерильной жидкости. В некоторых воплощениях композиция включает фармацевтически приемлемый консервант. В некоторых воплощениях композиция включает полисорбат-80. В некоторых воплощениях композиция включает Tris-HCl; хлорид натрия; сахарозу; гистидин; полисорбат 80; и фосфат алюминия.

В некоторых воплощениях, композиция включает примерно 120 мкг/мл первого полипептида; примерно 120 мкг/мл второго полипептида; примерно 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 10 мМ гистидина; и примерно 150 мМ хлорида натрия.

В некоторых воплощениях композиция включает примерно 60 мкг первого полипептида; примерно 60 мкг второго полипептида; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenA, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenC, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenW, конъюгированного с примерно 3,75 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenY, конъюгированного с примерно 3,25 мкг ТТ; примерно 97 мкг Tris-HCl, рН 6,8±0,3; 4,69-4,71 мг хлорида натрия; примерно 28 мг сахарозы; примерно 0,78 мг L-Гистидина; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 0,25 мг алюминия; и дополнительно включающая 0,5 мл воды, на дозу.

В некоторых воплощениях иммунный ответ включает сывороточные бактерицидные антитела. В некоторых воплощениях композиция способна вызывать бустерный иммунный ответ по меньшей мере к одной серогруппе А, С, W-135 и Y N. meningitides. В некоторых воплощениях композиция способна вызывать бустерный ответ к N. meningitides серогруппы В.

В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека в возрасте вплоть до 25 лет. В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека в возрасте от по меньшей мере 2 месяцев до 25 лет. В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека от 10 до 25 лет. В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека от 10 до 26 лет. В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека в возрасте от 12 до менее 18 месяцев или от 18 до менее 24 месяцев. В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека в возрасте от 18 до менее 24 месяцев. В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека в возрасте от не менее 24 месяцев до менее 10 лет.

В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека, который является серонегативным к менингококковым серогруппам А, С, W-135 и Y N. meningitides. В некоторых воплощениях иммунный ответ вызывается у человека, который является серопозитивным к серогруппам А, С, W-135 и Y N. meningitides.

В некоторых воплощениях композицию вводят человеку в виде по меньшей мере двух доз, причем вторую дозу вводят через примерно 6 месяцев после первой дозы. В некоторых воплощениях возраст человека составляет по меньшей мере 10 лет и не более 17 лет. В некоторых воплощениях третью дозу композиции вводят человеку, когда его возраст составляет по меньшей мере 16 лет.

В некоторых воплощениях, композицию вводят человеку в виде не более двух доз, при этом вторую дозу вводят примерно через 6 месяцев после первой дозы.

В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ против А22. В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ против А56. В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ против В24. В некоторых воплощениях, композиция вызывает иммунный ответ против В44.

В некоторых воплощениях, композиция включает примерно 60 мкг первого полипептида; примерно 60 мкг второго полипептида; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenA, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenC, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenW, конъюгированного с примерно 3,75 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenY, конъюгированного с примерно 3,25 мкг ТТ; примерно 97 мкг Tris-HCl, рН 6,8±0,3; 4,69-4,71 мг хлорида натрия; примерно 28 мг сахарозы; примерно 0,78 мг L-гистидина; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 0,25 мг алюминия; и дополнительно включает 0,5 мл воды, на дозу.

Композиция, включающая (а) первый полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitides; (б) второй полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitides; (в) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы А; (г) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы С; (д) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы W; и (е) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitides серогруппы Y; при этом композиция вызывает иммунный ответ по меньшей мере против одной из менингококковых серогрупп А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной против серогруппы Neisseria meningitidis.

В некоторых воплощениях полипептид включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 62.

Композиция включает (а) первый полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitides; (б) второй полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitides; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы А, конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; при этом композиция вызывает иммунный ответ против по меньшей мере одной из серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем ответ, вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп А, С, W-135 и Y N. meningitides.

Способ индукции иммунного ответа против штамма Neisseria meningitides серогруппы В подсемейства А и против штамма Neisseria meningitides серогруппы В подсемейства В у человека, включающий введение этому человеку эффективного количества композиции.

Способ индукции иммунного ответа против Neisseria meningitides серогруппы А, Neisseria meningitides серогруппы С, Neisseria meningitides серогруппы W и/или штамма Neisseria meningitides серогруппы Y у человека, включающий введение этому человеку эффективного количества композиции.

Способ индукции иммунного ответа против Neisseria meningitides серогруппы А, Neisseria meningitides серогруппы В, Neisseria meningitides серогруппы С, Neisseria meningitides серогруппы W, штамма Neisseria meningitides серогруппы Y у человека, включающий введение человеку эффективного количества композиции

Способ индукции иммунного ответа против Neisseria meningitides серогруппы А, Neisseria meningitides серогруппы В, Neisseria meningitides серогруппы С, Neisseria meningitides серогруппы W, штамма Neisseria meningitides серогруппы Y, и/или штамма Neisseria meningitides серогруппы X у человека, включающий введение этому человеку эффективного количества композиции.

В некоторых воплощениях пациент ранее не получал поливалентной менингококковой вакцины на основе конъюгата капсульного сахарида-белка носителя до первого введения композиции.

В некоторых воплощениях пациент ранее получал поливалентную менингококковую вакцину на основе конъюгата капсульного сахарида-белка носителя до первого введения композиции

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1А-В - Иммунные ответы, измеренные в hSBA (Фиг. 1А) против тестовых штаммов MenB через 1 месяц после дозы 2 и (Фиг. 1В) против тестовых штаммов Men A, MenC, MenW и MenY через 1 месяц после доз 1 и 2. Планки погрешности представляют 95% Cis (доверительный интервал). Штаммы MenB отмечают варианты FHbp в скобках. *MenABCWY, n=418-4432; MenB-FHbp, n=814-850. Составной ответ = титр hSBA≥LLOQ для всех 4 тестовых штаммов MenB. MenABCWY, n=227-262; MenACWY-CRM, n=446-506. ^§MenABCWY, n=187-257; MenACWY-CRM, n=370-495. hSBA = бактерицидная активность сыворотки с человеческим комплементом; MenA = менингококковая серогруппа А; LLOQ = нижний предел количественного определения; m-месяц; MenABCWY = пентавалентная вакцина серогрупп А, В, С, W, Y; MenACWY-CRM=MENVEO®, менингококковая (группы А, С, Y и W-135) олигосахаридная CRM197 конъюгатная вакцина (четырехвалентная менингококковая CRM-вакцина); MenB = менингококковая серогруппа В; MenB-FHbp = TRUMENBA®, менингококковый группы В бивалентный рекомбинантный липопротеин 2086 (бивалентный rLP2086).

вакцина; MenC = менингококковая серогруппа С; MenW = менингококковая серогруппа W; MenY = менингококковая серогруппа Y; PD = после введения вакцины.

Фиг. 2А-В. (Фиг. 2А) Местные реакции и (Фиг. 2В) Системные явления, отмеченные в течение 7 суток после любой дозы. MenABCWY, n=542; MenB-FHbp+MenACWY-CRM, n=1050. *В месте инъекции MenABCWY/MenB-FHbp. MenABCWY = пентавалентная вакцина серогрупп А, В, С, W, Y; MenACWY-CRM=MENVEO®, менингококковая (группы А, С, Y и W-135) олигосахаридная CRM197 конъюгированная вакцина (четырехвалентная менингококковая CRM вакцина); MenB-FHbp=TRUMENBA®, менингококковый группы В бивалентный рекомбинантный липопротеин 2086 (бивалентный rLP2086).

Фиг 3. Предполагаемые предотвращенные случаи в течение 10 лет при различных стратегиях введения вакцины по сравнению с гипотетическим сценарием без вакцинирования.

ИДЕНТИФИКАТОРЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептидного антигена А05 варианта 2086 N. meningitides серогруппы В.

SEQ ID NO: 2 представляет аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептидного антигена В01 варианта 2086 N. meningitides, серогруппы В.

SEQ ID NO: 3 представляет аминокислотные остатки в положениях 1-4 из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 4 представляет аминокислотную последовательность N-конца полипептида (А05) рекомбинантного полипептида LP2086 (rLP2086) нейссериального подсемейства А.

SEQ ID NO: 5 представляет аминокислотную последовательность N-конца полипептида (А05) полипептида LP2086 М98250771 нейссериального подсемейства А.

SEQ ID NO: 6 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В153.

SEQ ID NO: 7 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А04.

SEQ ID NO: 8 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А05.

SEQ ID NO: 9 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А12.

SEQ ID NO: 10 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А22.

SEQ ID NO: 11 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В02.

SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В03.

SEQ ID NO: 13 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В09.

SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В22.

SEQ ID NO: 15 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В24.

SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В44.

SEQ ID NO: 17 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В16.

SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А07.

SEQ ID NO: 19 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А19.

SEQ ID NO: 20 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А06.

SEQ ID NO: 21 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А15.

SEQ ID NO: 22 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта А29.

SEQ ID NO: 23 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides, серогруппы В, 2086 варианта В15.

SEQ ID NO: 24 представляет аминокислотную последовательность N-конца полипептида (В01) рекомбинантного полипептида LP2086 (rLP2086) нейссериального подсемейства В.

SEQ ID NO: 25 представляет аминокислотную последовательность N-конца полипептида (В01) полипептида LP2086 CDC-1573 нейссериального подсемейства В.

SEQ ID NO: 26 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы А, экспрессирующего фактор Н-связывающий белок (fHBP) В16.

SEQ ID NO: 27 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы С, экспрессирующего fHBP А10.

SEQ ID NO: 27 также представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы W, экспрессирующего fHBP А10.

SEQ ID NO: 28 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы W, экспрессирующего fHBP А19.

SEQ ID NO: 29 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы Y, экспрессирующего fHBP В47.

SEQ ID NO: 30 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы X, экспрессирующего fHBP В49.

SEQ ID NO: 31 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides серогруппы В, 2086 варианта В16.

SEQ ID NO: 32 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides серогруппы В, 2086 варианта А07.

SEQ ID NO: 33 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides серогруппы В, 2086 варианта А19.

SEQ ID NO: 34 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides серогруппы В, 2086 варианта А06.

SEQ ID NO: 35 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides серогруппы В, 2086 варианта А15.

SEQ ID NO: 36 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides серогруппы В, 2086 варианта А29.

SEQ ID NO: 37 представляет аминокислотную последовательность N. meningitides серогруппы В, 2086 варианта В15.

SEQ ID NO: 38 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы А, экспрессирующего фактор Н-связывающий белок (fHBP) В16.

SEQ ID NO: 39 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы С, экспрессирующего fHBP А10.

SEQ ID NO: 39 также представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitides серогруппы W, экспрессирующего fHBP А10.

SEQ ID NO: 40 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitidis серогруппы W, экспрессирующего fHBP А19.

SEQ ID NO: 41 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitidis серогруппы Y, экспрессирующего fHBP В47.

SEQ ID NO: 42 представляет аминокислотную последовательность штамма N. meningitidis серогруппы X, экспрессирующего fHBP В49.

SEQ ID NO: 43 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В44.

SEQ ID NO: 44 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В09.

SEQ ID NO: 45 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В09.

SEQ ID NO: 46 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А05.

SEQ ID NO: 47 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В01.

SEQ ID NO: 48 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В01, которая включает N-концевой Cys в аминокислотном положении 1.

SEQ ID NO: 49 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В15, которая включает N-концевой Cys в аминокислотном положении 1.

SEQ ID NO: 50 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы Вб 2086 варианта В16, которая включает N-концевой Cys в аминокислотном положении 1.

SEQ ID NO: 51 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В22.

SEQ ID NO: 52 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А22.

SEQ ID NO: 53 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А12.

SEQ ID NO: 54 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А22.

SEQ ID NO: 55 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А62, которая включает N-концевой Cys в аминокислотном положении 1.

SEQ ID NO: 56 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А62.

SEQ ID NO: 57 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А29, которая включает N-концевой Cys в аминокислотном положении 1.

SEQ ID NO: 58 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В22.

SEQ ID NO: 59 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А05.

SEQ ID NO: 60 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А05.

SEQ ID NO: 61 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В24.

SEQ ID NO: 62 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В24.

SEQ ID NO: 63 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А02.

SEQ ID NO: 64 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А28.

SEQ ID NO: 65 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А42.

SEQ ID NO: 66 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А63.

SEQ ID NO: 67 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А76.

SEQ ID NO: 68 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В05.

SEQ ID NO: 69 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В07.

SEQ ID NO: 70 представляет аминокислотную последовательность N. Meningitides серогруппы В, 2086 варианта В08.

SEQ ID NO: 71 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В13.

SEQ ID NO: 72 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В52.

SEQ ID NO: 73 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта В107.

SEQ ID NO: 74 представляет аминокислотную последовательность N. meningitidis серогруппы В, 2086 варианта А56.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения обнаружили, что композиция, включающая по меньшей мере один фактор Н-связывающий белок (fHBP) и конъюгаты капсульных сахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W и Y, являются стабильными и иммуногенными. Авторы изобретения, кроме того, обнаружили, что композиция индуцирует иммунный ответ у людей против по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 из N. meningitidis серогрупп А, С, W, Y и В. Неожиданно оказалось, что индуцированный иммунный ответ выше, чем иммунный ответ, вызванный лицензированными вакцинами против N. meningitidis.

В одном аспекте композиция включает по меньшей мере один полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка N. meningitidis, и по меньшей мере один менингококковый капсульный сахарид, конъюгированный с белком-носителем.

БЕЛОК, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ ФАКТОР Н-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА (FHBP).

В одном воплощении композиция включает любой fHBP, такой как, например, любой из следующих полипептидов: В24, В16, В44, А22, В03, В09, А12, А19, А05, А07, А06, А15, А29, В01, А62, В15 и любую их комбинацию. Предпочтительно, композиция включает комбинацию полипептидов А05 и В01. В другом предпочтительном воплощении композиция включает комбинацию полипептидов В24 и А05. В другом воплощении композиция включает комбинацию полипептидов А05, А12, В09 и В44. В одном воплощении композиция включает липидированный fHBP. В одном воплощении композиция не включает нелипидированный fHBP.

В другом воплощении, композиция включает нелипидированный fHBP, такой как любой из нелипидированного fHBP, описанного в международной патентной публикации WO 2012/032489, патентной публикации US 20120093852, международной патентной публикации WO 2013/132452 и патентной публикации US 20160030543, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. В одном воплощении композиция включает по меньшей мере один нелипидированный fHBP и по меньшей мере один липидированный fHBP.

В некоторых воплощениях, композиция включает полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 62.

В предпочтительном воплощении композиция включает (а) первый полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) второй полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А, конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера.

ПЕРВЫЙ ПОЛИПЕПТИД; БЕЛОК MNB RLP2086 ПОДСЕМЕЙСТВА А (А05)

В одном воплощении композиция включает первый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Полипептид представляет собой модифицированный фактор Н-связывающий белок (fHBP) из штамма N. meningitidis М98250771. Описание fHBP раскрыто в WO 2012032489 и патентной публикации США US 2012/0093852, каждая из которых включена посредством ссылки во всей полноте. Полипептид на N-конце липидирован тремя преобладающими жирными кислотами С16:0, С16:1 и С18:1, ковалентно связанными в трех положениях полипептида. Первый полипептид включает в общей сложности 258 аминокислот.

Типичная первичная структура белка MnB rLP2086 А05 представлен на Фиг. 4 патента US 10 183 070. Первичная структура белка показана на Фиг. 4 патента US 10 183 070 с использованием однобуквенного обозначения для всех аминокислот, за исключением N-концевого цистеина и глицерильных группировок (показанных с использованием полной химической формулы). Эта структура включает первичную структуру последовательности белка, в которой N-концевой остаток цистеина липидирован. Аминогруппа N-концевого остатка цистеина на N-конце белка присоединена к жирной кислоте (R1), образуя амидную связь, и группа цистеинилсульфгидрил присоединена к глицериновой группировке, содержащей две связанных сложноэфирной связью жирные кислоты (R2). Структура R1 логически выведена как гексадекановая кислота (С16:0), а структуры R2 варьируют в зависимости от изоформ MNB rLP2086.

Первый полипептид включает две модификации, введенные в N-концевую область полипептида, по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа штамма N. meningitidis М98250771. Глицин во втором положении добавлен как результат введения сайта клонирования. Вторая модификация включает делецию четырех аминокислот. Соответственно, в одном воплощении первый полипептид включает последовательность C-G-S-S (SEQ ID NO: 3) на N-конце. Смотри SEQ ID NO: 1, первые четыре аминокислотных остатка.

N-концевые различия между первой полипептидной последовательностью и нейссериальной последовательностью дикого типа показаны ниже. Соответственно, в одном воплощении первый полипептид включает по меньшей мере первые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или более аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, первый полипептид включает по меньшей мере первые 4, более предпочтительно по меньшей мере первые 6, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере первые 8 аминокислотных остатков SEQ ID NO: 1.

Сравнение спрогнозированных N-концевых последовательностей рекомбинантного полипептида и полипептида LP2086 нейссериального подсемейства А

rLP2086M98250771 CGSS-----GGGGVAAD (SEQ ID NO: 4)

Несериальный LP2086 М98250771 C-SSGS-GSGGGGVAAD (SEQ ID NO: 5)

>А05 (SEQ ID NO: 1)

CGSSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ

В одном воплощении первый полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В одном воплощении первый полипептид имеет в общей сложности 258 аминокислот. В одном воплощении первый полипептид не включает аминокислотную последовательность, имеющую менее чем 100%-ную идентичность последовательности SEQ ID NO: 1. В другом воплощении первый полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. В другом воплощении первый полипептид включает аминокислотную последовательность KDN. Смотрите, например, аминокислотные остатки 73-75 в SEQ ID NO: 1. В другом воплощении первый полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, на N-конце полипептида. В другом воплощении первый полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, на N-конце полипептида.

В предпочтительном воплощении первый полипептид легко экспрессируется в рекомбинантной клетке хозяине с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. В другом предпочтительном воплощении первый полипептид включает бактерицидный эпитоп на N- и/или С-домене SEQ ID NO: 1. В одном воплощении первый полипептид включает по меньшей мере первые 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, первый полипептид включает по меньшей мере первые 2, более предпочтительно по меньшей мере первые 4, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере первые 8 аминокислотных остатков SEQ ID NO: 1.

В другом воплощении первый полипептид включает по меньшей мере последние 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении, композиция включает примерно 30 мкг/мл первого полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В одном предпочтительном воплощении композиция включает примерно 60 мкг первого полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В одном предпочтительном воплощении композиция включает примерно 60 мкг первого полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, где композиция предпочтительно имеет общий объем 0,5 мл. В другом воплощении композиция включает примерно 120 мкг/мл первого полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.

ВТОРОЙ ПОЛИПЕПТИД; БЕЛОК MNB RLP2086 ПОДСЕМЕЙСТВА В (В01)

В одном воплощении, композиция включает второй полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Полипептид представляет собой фактор Н-связывающий белок (fHBP) из штамма N. meningitidis CDC1573. Описание fHBP раскрыто в WO 2012032489 и патентной публикации US 2012/0093852, каждая из которых включена посредством ссылки во всей полноте.

Полипептид липидирован на N-конце тремя преобладающими жирными кислотами C16:0, С16:1 и С18:1, ковалентно связанными в трех положениях полипептида. Второй полипептид включает в общей сложности 261 аминокислоту.

Типичная первичная структура белка MnB rLP2086 В01 показана на Фиг. 5 патента US 10 183 070. Первичная структура белка проиллюстрирована на Фиг. 5 патента US 10 183 070 с использованием однобуквенного обозначения для всех аминокислот за исключением N-концевого цистеина и глицерильных группировок (показанных с использованием полной химической формулы). Эта структура включает первичную структуру последовательности белка, в которой N-концевой остаток цистеина является липидированным. Аминогруппа N-концевого остатка цистеина на N-конце белка присоединена к жирной кислоте (R1), образуя амидную связь, и группа цистеинилсульфгидрил присоединена к глицериновой группировке, содержащей две связанные сложноэфирной связью жирные кислоты (R2). Структура R1 логически выведена как гексадекановая кислота (С16:0), а структуры R2 варьируют в зависимости от изоформ rLP2086.

Второй полипептид включает одну модификацию, введенную в N-концевую область белка rLP2086 подсемейства В, по сравнению с соответствующей последовательностью штамма N. meningitidis CDC-1573 дикого типа. Глицин во втором положении является следствием введения сайта клонирования.

N-концевые отличия от исходных нейссериальных последовательностей показаны ниже.

Сравнение спрогнозированных N-концевых последовательностей рекомбинантного белка и белка LP2086 нейссериального подсемейства В rLP2086 CDC-1573 CGSSGGGGSGGGGVTAD (SEQ ID NO: 24)

Нейссериальный LP2086 CDC-1573 C-SSGGGGSGGGGVTAD (SEQ ID NO: 25) В одном воплощении второй полипептид включает последовательность C-G-S-S (SEQ ID NO: 3) на N-конце. Смотрите первые четыре аминокислотных остатка SEQ ID NO: 2.

>В01 (SEQ ID NO: 2)

CGSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ

В одном воплощении второй полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В одном воплощении второй полипептид имеет в общей сложности 261 аминокислоту. В одном воплощении второй полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В другом воплощении второй полипептид дополнительно не включает полипептид, имеющий менее чем 100%-ную идентичность последовательности SEQ ID NO: 2. В предпочтительном воплощении первый полипептид и второй полипептид включает последовательность C-G-S-S (SEQ ID NO: 3) на N-конце соответствующего полипептида.

В предпочтительном воплощении второй полипептид легко экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. В другом предпочтительном воплощении второй полипептид включает бактерицидный эпитоп на N- и/или С-домене SEQ ID NO: 2. В одном воплощении второй полипептид включает по меньшей мере первые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Предпочтительно второй полипептид включает по меньшей мере первые 2, более предпочтительно по меньшей мере первые 4, и наиболее предпочтительно по меньшей мере первые 8 аминокислотных остатков SEQ ID NO: 2.

В другом воплощении второй полипептид включает по меньшей мере последние 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении, композиция включает примерно 30 мкг/мл первого полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В одном предпочтительном воплощении композиция включает примерно 60 мкг первого полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В одном предпочтительном воплощении, композиция включает примерно 60 мкг второго полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, где композиция предпочтительно имеет общий объем 0,5 мл. В другом воплощении композиция включает 120 мкг/мл второго полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

КАПСУЛЬНЫЕ САХАРИДЫ МЕНИНГОКОККОВЫХ СЕРОГРУПП А, С, W И Y (MENACWY)

Термин "сахарид" во всем описании изобретения может указывать на полисахарид или олигосахарид и включает их оба. Полисахариды выделяют из бактерий, или выделяют из бактерий и доводили до нужного размера посредством известных методов и возможно посредством микрофлюидизации. Полисахариды могут быть доведены до нужного размера для того, чтобы уменьшить вязкость в полисахаридных образцах и/или улучшить фильтруемость конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют низкое число повторяющихся единиц (как правило, 5-30 повторяющихся единиц) и обычно являются гидролизованными полисахаридами.

Каждый капсульный сахарид N. meningitidis может быть конъюгирован с белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ, и белка D. Хотя один или более капсульных сахаридов N. meningitidis может быть конъюгирован с разными другими белками-носителями из других, в одном воплощении они все конъюгированы с одним и тем же белком-носителем. Например, они все могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ, и белка D. В данном контексте CRM197 и DT могут считаться одним и тем же белком-носителем, так как они отличаются только одной аминокислотой. В предпочтительном воплощении все представленные капсульные сахариды N. meningitidis конъюгированы с ТТ.

Если белок-носитель является одинаковым для 2 или более сахаридов в композиции, сахарид может быть конъюгирован с той же молекулой белка-носителя (молекулами носителя, имеющими более 2 разных сахаридов, конъюгированных с ним) [смотрите, например, WO 04/083251; например, один белок-носитель может быть конъюгирован с MenA и MenC; MenA и MenW; MenA и MenY; MenC и MenW; MenC и MenY; MenW и MenY; MenA, MenC и MenW; MenA, MenC и MenY; MenA, MenW и MenY; MenC, MenW и MenY; MenA, MenC, MenW и MenY. Альтернативно, каждый из сахаридов может отдельно быть конъюгирован с разными молекулами белка-носителя (каждая молекула белка-носителя имеет только один тип сахарида, конъюгированный с ней).

В одном воплощении по меньшей мере 2 разных сахаридных конъюгата конъюгированы отдельно с одним и тем же типом белка-носителя, где один или более сахаридов конъюгированы с белком-носителем посредством первого типа химической группы на белке-носителе и один или более сахаридов конъюгированы с белком-носителем посредством второго (другого) типа химической группы на белке-носителе.

В одном воплощении 2 конъюгата включают один и тот же сахарид, связанный с одним и тем же носителем, но посредством разных химических методов конъюгирования. В альтернативном воплощении 2 разных сахарида конъюгированы с разными группами на белке-носителе.

Под фразой "отдельно конъюгированы с одним и тем же типом белка-носителя" подразумевается, что сахариды конъюгированы с одним и тем же носителем индивидуально (например, MenA конъюгирован со столбнячным анатоксином посредством аминогруппы на столбнячном анатоксине, а MenC конъюгирован со столбнячным анатоксином через группу карбоновой кислоты на другой молекуле столбнячного анатоксина).

Капсульный(е) сахарид(ы) может(гут) быть конъюгирован(ы) с одним и тем же белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ, и белка D. Более полный список белков-носителей, которые можно использовать в конъюгатах по изобретению, представлены ниже. В данном контексте CRM197 и DT могут рассматриваться, как один и тот же белок-носитель, так как они отличаются только одной аминокислотой. В одном воплощении все присутствующие капсульные сахариды конъюгированы с ТТ.

Сахариды могут включать любой из: капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы А (MenA), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы С (MenC), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы W (MenW), или любую их комбинацию.

Первые и вторые химические группы, присутствующие на белке-носителе отличаются друг от друга и в идеале представляют собой природные химические группы, которые могут быть легко использованы для целей конъюгирования. Они могут быть выбраны независимо из группы, состоящей из: карбоксильных групп, аминогрупп, сульфидрильных групп, гидроксильных групп, имидазолильных групп, гуанидильных групп и индолильных групп. В одном воплощении первая химическая группа является карбоксильной, а вторая аминогруппой или наоборот. Об этих группах более подробно пояснено ниже.

В конкретном воплощении иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2 разных капсульных сахарида N. meningitidis, где один или более выбран(ы) из первой группы, состоящей из MenA и MenC, который(е) конъюгирован(ы) с белком-носителем посредством первого типа химической группы на белке-носителе (например карбоксильной), и один или более разных сахаридов выбран(ы) из второй группы, состоящей из MenC, MenY и MenW, который(е) конъюгирован(ы) с белком-носителем посредством второго типа химической группы на белке-носителе (например амино).

В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит MenA, конъюгированный посредством первого типа химической группы (например карбоксильной), и MenC, конъюгированный посредством второго типа химической группы (например амино).

В другом воплощении иммуногенная композиция содержит MenC, конъюгированный посредством первого типа химической группы (например карбоксильной), и MenY, конъюгированный посредством второго типа химической группы (например амино).

В другом воплощении иммуногенная композиция содержит MenA, конъюгированный посредством первого типа химической группы (например карбоксильной), и MenC, MenY и MenW, конъюгированные посредством второго типа химической группы (например амино).

В другом воплощении иммуногенная композиция содержит MenA и MenC, конъюгированные посредством первого типа химической группы (например карбоксильной), и MenY и MenW, конъюгированные посредством второго типа химической группы (например амино).

Сахариды по изобретению, включенные в фармацевтические (иммуногенные) композиции по изобретению, конъюгированы с белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин (ТТ), фрагмент С столбнячного анатоксина, нетоксичные мутанты столбнячного токсина [обратите внимание, что все такие варианты ТТ считаются одинковым типом белка-носителя для целей данного раскрытия], дифтерийный анатоксин (DT), CRM197, другие нетоксичные мутаты дифтерийного токсина [такие как CRM176, CRM197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 и CRM107 и другие мутации, описанные Nicholls and Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеция или мутация Glu-148 на Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 на Gly и другие мутации, описанные в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другие мутации, описанные в US 5917017 или US 6455673; или фрагмент, описанный в US 5843711] (обратите внимание, что все такие варианты DT считаются одинаковым типом белка-носителя для целей данного раскрытия), пневмококовый пневмолизин (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), OMPC (менингококковый наружный мембранный белок - обычно извлеченный из N. meningitidis серогруппы В - ЕР0372501), синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), белки коклюша (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные человеческие CD4+ Т-клеточные эпитопы из различных антигенов патогенного происхождения (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), белки захвата железа (WO 01/72337), токсин А или В из С. difficile (WO 00/61761) или белок D (ЕР 594610 и WO 00/56360).

В одном воплощении в иммуногенной композиции по изобретению используется один и тот же тип белка-носителя (независимо) по меньшей мере в двух, трех, четырех или каждом из сахаридов, содержащихся в ней.

В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит сахарид N. meningitidis, конъюгированный с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ и белка D.

Иммуногенная композиция по изобретению возможно содержит по меньшей мере один менингококковый конъюгат сахарида (например MenA; MenC; MenW; MenY; MenA и MenC; MenA и MenW; MenA и MenY; MenC и MenW; Men С и MenY; MenW и MenY; MenA, MenC и MenW; MenA, MenC и MenY; MenA, MenW и MenY; MenC, MenW и MenY or MenA, MenC, MenW и MenY), имеющий соотношение Men-сахарида к белку-носителю от 1:5 до 5:1, от 1:2 до 5:1, от 1:0,5 до 1:2,5 или от 1:1,25 до 1:2,5 (масс./масс.). В одном предпочтительном воплощении композиция включает MenA, MenC, MenW и MenY, где каждый конъюгирован со столбнячным анатоксином в соотношениях (анатоксин к полисахариду) примерно 3, примерно 3, примерно 1,5 и примерно 1,3, соответственно.

Соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) в конъюгате можно определить с использованием стерилизованного конъюгата. Количество белка определяют с помощью метода Лоури (например Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275 или Peterson et al Analytical Biochemistry 100, 201-220 (1979)), а количество сахарида определяют с использованием ICP-OES (оптико-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой) для MenA, DMAP(4-диметиламинопиридин) анализа для MenC и анализа с резорцином для MenW и MenY (Monsigny et al (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530).

В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат(ы) сахарида N. meningitidis, где сахарид(ы) N. meningitidis конъюгирован(ы) с белком-носителем посредством линкера, например бифункционального линкера. Линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим, например, реакционноспособную аминную группу и реакционноспособную группу карбоновой кислоты, 2 реакционноспособные аминные группы или две реакционноспособные группы карбоновой кислоты. Линкер имеет, например, от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10 атомов углерода. Возможным линкером является ADH (дигидразид адипиновой кислоты). Другие линкеры включают В-пропионамидо (WO 00/10599), нитрофенил-этиламин (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), галоалкилгалиды (US 4057685), гликозидные связи (US 4673574, US 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (US 4459286).

Конъюгаты сахарида, присутствующие в иммуногенных композициях по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью любого известного метода связывания. Метод конъюгирования может быть основан на активировании сахарида с помощью 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората (CDAP) с образованием цианатного эфира. Активированный сахарид, таким образом, может быть соединен непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который может быть соединен с носителем посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с малеимид-активированным белком-носителем (например, с использованием GMBS) или голо-ацетилированного белка-носителя (например, с использованием йодоацетимида или N-сукцинимидил-бромацетатбромоацетата). Возможно, цианатный эфир (возможно полученный посредством CDAP-химии) соединен с гександиамином или ADH и амино-дериватизированный сахарид конъюгирован с белком-носителем с использованием карбодиимидного (например EDAC или EDC) химического метода посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке WO 93/15760, Uniformed Services University, и WO 95/08348 и WO 96/29094.

В других подходящих методах используют карбииниды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в WO 98/42721. Конъюгирование может включать карбонильный линкер, который может быть образован посредством реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18) с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать уменьшение аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможную защиту/снятие защиты первичной гидроксильной группы, реакцию первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI-карбаматного промежуточного продукта и соединение CDI карбаматного промежуточного продукта с аминогруппой на белке.

Конъюгаты также могут быть получены посредством методов прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) и US 4673574 (Anderson). Другие методы описаны в ЕР-0-161-188, ЕР-208375 и ЕР-0-477508.

Еще один метод включает соединение активированного бромцианом (или CDAP) сахарида, дериватизированного гидразидом адипиновой кислоты (ADH), с белком-носителем посредством карбодиимидной конденсация (Chu С. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), например, с использованием EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид).

В одном воплощении гидроксильная группа (возможно активированная гидроксильная группа, например гидроксильная группа, активированная цианатным эфиром), на сахариде связана с амино или карбоксильной группой на белке непосредственно или опосредованно (через линкер). В случае наличия линкера, гидроксильная группа на сахариде возможно связана с аминогруппой на линкере, например путем использования CDAP-конъюгирования. Еще одна аминная группа в линкере, например ADH) может быть конъюгирована с карбоксильной группой на белке, например, путем использования карбодиимидной химии, например, посредством использования EDAC. В одном воплощении, капсульный(е) сахарид(ы) N. meningitidis (или сахарид вообще) конъюгируют сначала с линкером, до того, как линкер конъюгируют с белком-носителем. Альтернативно, линкер может быть конъюгирован с носителем до конъюгирования с сахаридом.

В общем случае следующие типы химических групп на белковом носителе могут быть использованы для соединения/конъюгирования:

А) Карбоксил (например, посредством аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты). В одном воплощении эта группа сязана с аминногруппами на сахаридах непосредственно или с аминогруппой на линкере посредством карбодиимидной химии, например с помощью EDAC.

Б) Аминогруппа (например посредством лизина). В одном воплощении эта группа связана с карбоксильными группами на сахаридах непосредственно или с карбоксильной группой на линкере с помощью карбодиимидной химии, например EDAC. В другом воплощении эта группа связана с гидроксильными группами, активированными с помощью CDAP или CNBr, на сахаридах непосредственно или с такими группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами, имеющими сукцинимидную эфирную группу.

В) Сульфидрил (например, посредством цистеина). В одном воплощении эта группа связана с бромо- или хлорацетилированным сахаридом или линкером с помощью малеимидной химии. В одном воплощении эта группа активирована/модифицирована с помощью бис-диазобензидина.

Г) Гидроксильная группа (например, посредством тирозина). В одном воплощении эта группа активирована/модифицирована с помощью бис-диазобензидина.

Д) Имидазолильная группа (например, посредством гистидина). В одном воплощении эта группа активирована/модифицирована с помощью бис-диазобензидина.

Е) Гуанидильная группа (например, посредством аргинина).

Ж) Индолильная группа (например, посредством триптофана).

На сахариде, в общем случае, следующие группы могут быть использованы для связывания: ОН, СООН или NH2. Альдегидные группы могут быть получены после разных обработок, известных в данной области техники, таких как: периодат, кислотный гидролиз, перекись водорода и т.д.

Подходы с прямым соединением:

Сахарид-ОН + CNBr или CDAP -----> цианатный эфир + NH2-Prot ----> конъюгат

Сахарид-альдегид + NH2-Prot ----> основание Шиффа + NaCNBH3 ----> конъюгат

Сахарид-СООН + NH2-Prot + EDAC ----> конъюгат

Сахарид-NH2 + COOH-Prot + EDAC ----> конъюгат

Подходы с непрямым соединением посредством спейсера (линкера):

Сахарид-ОН + CNBr или CDAP ---> цианатный эфир + NH2----NH2 ----> сахарид----NH2 + COOH-Prot + EDAC -----> конъюгат

Сахарид-ОН + CNBr или CDAP ----> цианатный эфир + NH2-----SH -----> сахарид----SH + SH-Prot (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогруппами белка, например, посредством SPDP) -----> сахарид-S-S-Prot

Сахарид-ОН + CNBr или CDAP ---> цианатный эфир + NH2----SH -------> сахарид----SH + малеимид-Prot (модификация аминных групп) ----> конъюгат

Сахарид-СООН + EDAC + NH2-----NH2 ---> сахарид------NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> конъюгат

Сахарид-СООН + EDAC + NH2----SH -----> сахарид----SH + SH-Prot (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка, например посредством SPDP) -----> сахарид-S-S-Prot

Сахарид-СООН + EDAC + NH2----SH -----> сахарид----SH + малеимид-Prot (модификация аминогрупп) ----> конъюгат

Сахарид-Альдегид + NH2-----NH2 ----> сахарид---NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> конъюгат

Примечание: вместо приведенного выше EDAC может быть использован любой подходящий карбодиимид.

Таким образом, типами химических групп белка-носителя, которые могут быть в общем случае использованы для связывания с сахаридом, являются аминогруппы (например на остатках лизина), группы СООН (например на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и группы SH (если они доступны) (например на остатках цистеина).

В одном воплощении, по меньшей мере один из капсульных сахаридов N. meningitidis (или сахарид вообще) непосредственно конъюгирован с белком-носителем; возможно MenW и/или MenY и/или MenC сахарид(ы) непосредственно конъюгирован(ы) с белком-носителем. Например, MenW; MenY; MenC; MenW и MenY; MenW и MenC; MenY и MenC; или MenW, MenY и MenC непосредственно соединены с белком-носителем. Возможно, по меньшей мере один из капсульных сахаридов N. meningitidis непосредственно конъюгирован посредством CDAP. Например, MenW; MenY; MenC; MenW и MenY; MenW и MenC; MenY и MenC; или MenW, MenY и MenC непосредственно соединены с белком-носителем посредством CDAP (см. WO 95/08348 и WO 96/29094). В одном воплощении все капсульные сахариды N. meningitidis конъюгированы со столбнячным анатоксином.

В одном воплощении соотношение сахарида MenW и/или Y к белку-носителю находится между 1:0,5 и 1:2 (масс./масс.) и/или соотношение сахарида MenC к белку-носителю находится между 1:0,5 и 1:4 или 1:0,5 и 1:1,5 (масс./масс.), особенно когда эти сахариды непосредственно связаны с белком, возможно с использованием CDAP.

В одном воплощении по меньшей мере один из капсульных сахаридов N. meningitidis (или сахарид в целом) конъюгирован с белком-носителем посредством линкера, например бифункционального линкера. Линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим, например, реакционноспособную аминную группу и реакционноспособную карбоксильную группу, 2 реакционноспособные аминные группы или 2 реакционноспособные карбоксильные группы. Линкер имеет, например, от 4 до 20, от 4 до 12, 5 и 10 атомов углерода. Возможным линкером является ADH.

В одном воплощении MenA; MenC; или MenA и MenC конъюгированы с белком-носителем (например столбнячным анатоксином) посредством линкера.

В одном воплощении по меньшей мере один сахарид N. meningitidis конъюгирован с белком-носителем посредством линкера с использованием CDAP и EDAC. Например, MenA; MenC; или MenA и MenC конъюгированы с белком посредством линкера (например, имеющих две группы гидразино на своих концах, таких как ADH) с использованием CDAP и EDAC, как описано выше. Например, CDAP используют для конъюгирования сахарида с линкером, и EDAC используют для конъюгирования линкера с белком. Возможно, конъюгирование посредством линкера приводит к соотношению сахарида к белку-носителю, составляющему от 1:0.5 до 1:6; от 1:1 до 1:5, или от 1:2 до 1:4, для MenA; MenC; или MenA и MenC.

В одном воплощении присутствующий капсульный сахарид MenA является по меньшей мере частично О-ацетилированным, например, по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% повторяющихся единиц являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном положении. О-ацетилирование присутствует, например, по меньшей мере в положении O-3 у по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% повторяющихся единиц.

В одном воплощении присутствующий капсульный сахарид MenC является по меньшей мере частично О-ацетилированным, например, по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% (α2 →9)-соединенных NeuNAc повторяющихся единиц являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование, например, присутствует в положениях O-7 и/или O-8 у по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% повторяющихся единиц.

В одном воплощении присутствующий капсульный сахарид MenW является по меньшей мере частично О-ацетилированным, например, по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% повторяющихся единиц являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование, например, присутствует в положениях O-7 и/или O-9 у по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% повторяющихся единиц.

В одном воплощении присутствующий капсульный сахарид MenY является по меньшей мере частично О-ацетилированным, например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% повторяющихся единиц являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование присутствует в положении 7 и/или 9 у по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% повторяющихся единиц.

Процент О-ацетилирования относится к проценту повторяющихся единиц, содержащих О-ацетилирование. Он может быть измерен в сахариде до конъюгирования и/или после конъюгирования.

В одном воплощении по изобретению иммуногенной композиции присутствующий сахарид или каждый присутствующий капсульный сахарид N. meningitidis конъюгирован с ТТ. В еще одном воплощении каждый капсульный сахарид N. meningitidis отдельно конъюгирован с отдельным белком-носителем. В еще одном воплощении для каждого конъюгата капсульного сахарида N. meningitidis соотношение сахарид:носитель составляет 1:5-5:1 или 1:1-1:4 (масс./масс.). В еще одном воплощении по меньшей мере один, два или три конъюгат(а) капсульного сахарида N. meningitidis непосредственно конъюгирован(ы) с белком-носителем. В еще одном воплощении MenW и/или MenY, MenW и/или MenC, MenY и/или MenC, или MenW и MenC и MenY непосредственно конъюгированы с белком-носителем. В еще одном воплощении по меньшей мере один, два или три конъюгат(а) сахарида N. meningitidis непосредственно конъюгированы посредством CDAP химии. В еще одном воплощении для MenW и/или Y соотношение сахарида к белку-носителю составляет 1:0.5 и 1:2 (масс./масс.). В еще одном воплощении MenC соотношение сахарида с белком-носителем составляет от 1:0,5 до 1:2 (масс./масс.). В еще одном воплощении по меньшей мере один, два или три капсульный(х) сахарид(а) N. meningitidis конъюгирован(ы) с белком-носителем посредством линкера (который может быть бифункциональным, например имеющим две реакционноспособные аминогруппы (например ADH) или две реакционноспособные карбоксильные группы, или реакционноспособную аминогруппу на одном конце и реакционноспособную карбоксильную группу на другом). Линкер может иметь от 4 до 12 атомов углерода. В еще одном воплощении такой или каждый N. meningitidis капсульный сахарид, конъюгированный посредством линкера, конъюгирован с линкером посредством CDAP химии. В еще одном воплощении белок-носитель конъюгирован с линкером с использованием карбодиимидных химических методов, например с использованием EDAC. В еще одном воплощении такой или каждый капсульный сахарид N. meningitidis конъюгирован с линкером до того, как белок-носитель конъюгирован с линкером. В еще одном воплощении MenA конъюгирован с белком-носителем посредством линкера (соотношение MenA сахарида с белком-носителем может составлять от 1:2 до 1:5 (масс./масс.)). В еще одном воплощении MenC конъюгирован с белком-носителем посредством линкера (соотношение MenC сахарида с белком-носителем может составлять от 1:2 до 1:5 (масс./масс.)).

Путем использовании нативных или небольших полисахаридных конъюгатов, может быть реализовано одно или более из следующих преимуществ: 1) конъюгат, обладающий высокой иммуногенностью, который фильтруется через фильтр 0,2 микрона; 2) иммунная память может быть усилена (как в примере три); 3) изменение соотношения полисахарида к белку в конъюгате, например соотношение полисахарида к белку (масс./масс.) в конъюгате, может быть увеличено (это может привести к снижению супрессивного эффекта носителя); 4) иммуногенные конъюгаты, склонные к гидролизу (например MenA конъюгаты), могут быть стабилизированы путем использования более крупных полисахаридов для конъюгирования. Использование более крупных полисахаридов может привести к большему сшиванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из конъюгата. Конъюгатные вакцины, описанные в уровне техники, имеют тенденцию к деполимеризации полисахаридов перед конъюгированием, чтобы улучшить конъюгирование. Менингококковые (или сахаридные) конъюгатные вакцины, сохраняющие большой размер сахарида, могут обеспечивать хороший иммунный ответ против менингококкового заболевания.

Иммуногенная композиция по изобретению может, таким образом, содержать один или более сахаридных конъюгатов, где средний размер каждого сахарида до конъюгации составляет примерно 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, 110 кДа, 120 кДа или 130 кДа. В одном воплощении конъюгат после конъюгирования должен быть легко фильтруемым через фильтр 0,2 микрона, так чтобы после фильтрации получался выход более чем 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с образцом до фильтрации.

В частности, иммуногенная композиция по изобретению содержит капсульные сахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где средний размер (средневесовая молекулярная масса; Mw) по меньшей мере одного, двух, трех или четырех, или каждого сахарида N. meningitidis составляет примерно 50 кДа, 60 кДа, 75 кДа, 100 кДа, 110 кДа, 120 кДа или 130 кДа.

В предпочтительном воплощении средняя Mw конъюгата MenA_AH-ТТ составляет по меньшей мере 250 кДа, 260 кДа, 270 кДа, 280 кДа или 290 кДа, более предпочтительно примерно 300 кДа, и наиболее предпочтительно 350 кДа или 330 кДа. В предпочтительном воплощении средняя Mw конъюгата MenC_AH-ТТ составляет по меньшей мере 150 кДа, 160 кДа, 170 кДа, 180 кДа или 190 кДа, более предпочтительно примерно 200 кДа и наиболее предпочтительно 250 кДа или 230 кДа. В предпочтительном воплощении средняя Mw конъюгата MenW-TT составляет по меньшей мере 240, 250 кДа, 260 кДа или 270 кДа, более предпочтительно примерно 280 кДа, и наиболее предпочтительно 330 кДа или 310 кДа. В предпочтительном воплощении средняя Mw конъюгата MenY-TT составляет по меньшей мере 220 кДа, 230 кДа, 240 кДа или 250 кДа, более предпочтительно примерно 270 кДа и наиболее предпочтительно 320 кДа или 300 кДа.

Иммуногенная композиция может содержать капсульные сахариды N. meningitidis из по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре, или каждый сахарид N. meningitidis является либо нативным сахаридом или его размер изменен в соответствии с фактором х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10 по сравнению со средней молекулярной массой нативного полисахарида.

Для цели описания "нативный полисахарид" относится к сахариду, который не был повергнут процессу, целью которого было уменьшение размера сахарида. Полисахарид может быть слегка уменьшен в размере во время обычных процедур очистки. Такой сахарид все еще считается нативным. Только если полисахарид был подвергнут методам изменения размера, он не будет считаться нативным.

Для целей описания "размер изменен в соответствии с фактором х2" означает, что сахарид подвергнут процессу, предназначенному для уменьшения размера этого сахарида, но при сохранении размера, соответствующего более чем половине размера нативного полисахарида. Х3, х4 и т.д. следует интерпретировать таким же образом, т.е. сахарид подвергают процессу, направленному на уменьшение его размера, но при сохранение размера, соответствующего более чем трети, четверти и т.д. размера нативного полисахарида.

В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит капсульные сахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре, или каждый сахарид N. meningitidis представляет собой нативный полисахарид.

В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит капсульные сахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где у по меньшей мере одного, двух, трех или четырех, или каждого сахарида N. meningitidis изменен размер в соответствии с фактором x1,5, х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10.

Иммуногенные композиции по изобретению возможно содержат конъюгаты: капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы С (MenC), капсульного сахарида серогруппы А (MenA), капсульного сахарида серогруппы W135 (MenW), капсульного сахарида серогруппы Y (MenY), капсульных сахаридов серогрупп С и Y (MenCY), капсульных сахаридов серогрупп С и А (MenAC), капсульных сахаридов серогрупп С и W (MenCW), капсульных сахаридов серогрупп А и Y (MenAY), капсульных сахаридов серогрупп А и W (MenAW), капсульных сахаридов серогрупп W и Y (Men WY), капсульных сахаридов серогрупп А, С и W (MenACW), капсульных сахаридов серогрупп А, С и Y (MenACY); капсульных сахаридов серогрупп A, W135 и Y (MenAWY), капсульных сахаридов серогрупп С, W135 и Y (MenCWY); или капсульных сахаридов серогрупп А, С, W135 и Y (MenACWY). Это определение "одна, две, три или четыре" или "по меньшей мере одна из" серогрупп А, С, W и Y, или каждый сахарид N. meningitidis, где они упоминаются в данном описании изобретения.

В одном воплощении средний размер по меньшей мере одного, двух, трех, четырех или каждого сахарида N. meningitidis составляет от 50 кДа до 1500 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 300 кДа, от 101 кДа до 1500 кДа, от 101 кДа до 500 кДа, от 101 кДа до 300 кДа, при определении посредством MALLS (многоугловое рассеяние лазерного света).

В одном воплощении присутствующий сахарид MenA имеет молекулярную массу 50-500 кДа, 50-100 кДа, 100-500 кДа, 55-90 кДа, 60-70 кДа или 70-80 кДа, или 60-80 кДа.

В одном воплощении присутствующий сахарид MenC имеет молекулярную массу 100-200 кДа, 50-100 кДа, 100-150 кДа, 101-130 кДа, 150-210 кДа или 180-210 кДа.

В одном воплощении присутствующий сахарид MenY имеет молекулярную массу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа или 110-140 кДа, 50-100 кДа, 100-140 кДа, 140-170 кДа или 150-160 кДа.

В одном воплощении присутствующий сахарид MenW имеет молекулярную массу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа, 110-140 кДа, 50-100 кДа или 120-140 кДа.

Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида в настоящем описании относится к средневесовой молекулярной массе (Mw) сахарида, измеренной до конъюгирования и измеряется посредством MALLS.

Метод MALLS хорошо известен в данной области техники и обычно выполняется, как описано в примере 2. Для MALLS-анализа менингококковых сахаридов, могут быть использованы в комбинации две колонки (TSKG6000 и 5000PWxl) и сахариды элюируют в воде. Сахариды определяют с помощью детектора рассеяния света (например Wyatt Dawn DSP, оснащенного аргоновым лазером мощностью 10 мВт при 488 нм) и инферометрическим рефрактометром (например Wyatt Otilab DSP, оснащенным P100 cell и красным фильтром при 498 нм).

В одном воплощении сахариды N. meningitidis представляют собой нативные полисахариды или натиные полисахариды, которые уменьшились в размере во время обычного процесса экстракции.

В одном воплощении сахариды N. meningitidis доводят до нужного размера посредством механического расщепления, например посредством микрофлюидизации или обработки ультразвуком. Преимуществом микрофлюидизация и обработка ультразвуком является уменьшение размера больших нативных полисахаридов в достаточной мере для того, чтобы получить фильтруемый конъюгат (например через фильтр 0,2 микрона). Изменение размера определяется фактором, не более чем х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3, х2 или x1,5.

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит конъюгаты N. meningitidis, которые получены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, размер которых изменен в соответствии с фактором не более чем х20. Например, сахариды из MenC и/или MenA являются нативными. Например, размер сахаридов из MenY и/или MenW изменен в соответствии с фактором не более чем х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3 или х2. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из MenY, и/или MenW, и/или MenC, и/или MenA, размер которого изменен в соответствии с фактором не более чем х10 и/или который микрофлюидизирован. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenA, и/или MenC, и/или MenW, и/или MenY. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenC. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативных MenC и MenA, размер которых изменен в соответствии с фактором не более чем х10 и/или которые являются микрофлюидизированными. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативных MenC и MenY, размер которых изменен в соответствии с фактором не более чем х10 и/или которые являются микрофлюидизированными.

В одном воплощении полидисперсность сахарида составляет 1-1.5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 или 1-1,05, и после конъюгирования с белком-носителем полидисперсность конъюгата составляет 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 или 1,5-2,0. Все измерения полидисперсности выполняются посредством MALLS.

Размер сахаридов, возможно, изменен вплоть до 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 раз от размера полисахарида, выделенного из бактерий.

В одном воплощении каждый сахарид N. meningitidis является либо нативным полисахаридом или имеет размер, измененный в соответствии с фактором не более чем х10. В еще одном воплощении каждый капсульный сахарид N. meningitidis представляет собой нативный полисахарид. В еще одном воплощении по меньшей мере один, два, три или четыре капсульных сахарида N. meningitidis доведены до нужного размера с помощью микрофлюидизации. В еще одном воплощении каждый капсульный сахарид N. meningitidis доведен до нужного размера в соответствии с фактором не более чем х10. В еще одном воплощении конъюгаты N. meningitidis получены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые доведены до нужного размера в соответствии с фактором не более чем х10. В еще одном воплощении капсульный сахарид серогруппы Y доведен до нужного размера в соответствии с фактором не более чем х10. В еще одном воплощении капсульные сахариды серогрупп А и С представляют собой нативные полисахариды и сахариды серогрупп W135 и Y доведены до нужного размера в соответствии с фактором не более чем х10. В еще одном воплощении средний размер каждого капсульного сахарида N. meningitidis составляет от 50 кДа до 300 кДа или от 50 кДа до 200 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenA, имеющий средний размер примерно 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа или средний размер 50-100 кДа или 55-90 кДа или 60-80 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenC, имеющий средний размер примерно 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа или 100-200 кДа, 100-150 кДа, 80-120 кДа, 90-110 кДа, 150-200 кДа, 120-240 кДа, 140-220 кДа, 160-200 кДа или 190-200 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenY, имеющий средний размер примерно 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа или 60-190 кДа или 70-180 кДа или 80-170 кДа или 90-160 кДа или 100-150 кДа, 110-145 кДа или 120-140 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenW, имеющий средний размер примерно 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа или 60-190 кДа или 70-180 кДа или 80-170 кДа или 90-160 кДа или 100-150 кДа, 140-180 кДа, 150-170 кДа или 110-140 кДа.

В одном воплощении изобретения доза сахарида каждого из по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из конъюгатов сахарида N. meningitidis возможно является одинаковой или примерно одинаковой.

В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению доведена до или забурена при рН 7,0-8,0, при рН 7,2-7,6 или примерно или точно при рН 7,4.

Иммуногенная композиция или вакцины по изобретению возможно лиофилизированный в присутствии стабилизирующего агента, например полила, такого как сахароза или трегалоза.

Для вышеописанных комбинаций сахарида N. meningitidis, может быть выгодно не использовать алюминиевый адъювант или вообще какой-либо адъювант.

Активный агент может присутствовать в различных концентрациях в фармацевтической композиции или вакцине по изобретению. Как правило, минимальная концентрация вещества представляет собой количество, необходимое для достижения его предполагаемого применения, а максимальная концентрация представляет собой максимальное количество, которое останется в растворе или однородно суспендированным в исходной смеси. Например, минимальное количество терапевтического агента возможно представляет собой количество, которое обеспечивает одну терапевтически эффективную дозу. Для биологически активных веществ минимальная концентрация представляет собой количество, необходимое для биологической активности после восстановления, а максимальная концентрация представляет собой точку, в которой невозможно поддерживать однородную суспензию.

В другом воплощении композиция включает конъюгат капсульного полисахарида серогруппы X N. meningitidis и молекулы носителя. Структура капсульного полисахарида группы X состоит из N-ацетилглюкозамин-4-фосфатных остатков, удерживаемых вместе посредством al-4-фосфодиэфирных связей без О-ацетильных групп. Молекулой носителя может быть дифтерийный или столбнячный анатоксин, CRM197 или белок D. В предпочтительном воплощении, как показано в Примерах, композиция не включает конъюгат капсульного полисахарида серогруппы X N. meningitidis

Дополнительные описания типичных композиций приведены ниже.

КОМПОЗИЦИЯ И ВАКЦИНА

В некоторых воплощениях композиция включает лиофилизированную композицию MenACWY-TT, которую восстанавливают жидкой MnB бивалентной rLP2086 композицией. Лиофилизированная композиция MenACWY-TT и жидкая MnB биваленетная rLP2086 композиция предпочтительно совместимы и стабильны после восстановления в течение по меньшей мере 24 часов при комнатной температуре.

В предпочтительных воплощениях композиция индуцирует образование бактерицидного антитела против N. meningitidis серогруппы В и N. Meningitides серогрупп, отличных от В. Например, в некоторых воплощениях MnB бивалентная rLP2086 композиция индуцирует образование бактерицидного антитела против по меньшей мере N. meningitidis серогрупп А, С, W, Y и X.

Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что композиция вызывает средний геометрический титр против N. meningitidis серогрупп А, С, W и Y, который совпадает со средним геометрическим титром, наблюдаемым для лицензированной вакцины против N. meningitidis серогрупп А, С, W и Y.

В некоторых воплощениях композиция вызывает средний геометрический титр против N. meningitidis серогрупп А, С, W и Y, который выше, чем средний геометрический титр, наблюдаемый для лицензированной вакцины против N. meningitidis серогрупп А, С, W и Y.

Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что композиция вызывает средний геометрический титр против N. meningitidis серогруппы В, который совпадает со средним геометрическим титром, наблюдаемым для лицензированной вакцины против N. meningitidis серогруппы В.

В некоторых воплощениях композиция вызывает средний геометрический титр против N. meningitidis серогруппы В, который выше, чем средний геометрический титр, наблюдаемый для лицензированной вакцины против N. meningitidis серогруппы В.

В некоторых воплощениях композиция, включающая fHBP, вызывает эффективный иммунный ответ у людей в возрасте по меньшей мере 12 месяцев. Композиция также вызывает иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы X. В некоторых воплощениях композиция включает по меньшей мере один фактор Н-связывающий полипептид (fHBP) и по меньшей мере один конъюгат капсульного сахарида N. meningitidis. В предпочтительном воплощении композиция является стабильной и вызывает иммунный ответ против штаммов, которые экспрессируют варианты fHBP, которые гомологичны варианту fHBP в многокомпонентной композиции, и иммунный ответ против штаммов, которые экспрессируют варианты fHBP, которые гетерологичны по отношению к варианту fHBP в многокомпонентной композиции.

В некоторых воплощениях жидкая MnB бивалентная rLP2086 композиция может легко восстанавливать лиофилизированную композицию MenACWY-TT и комбинированная композиция является совместимой и стабильной.

В одном аспекте изобретение относится к композиции против Neisseria meningitides. Композиция включает (а) первый липидированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) второй липидированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А (MenA), конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH), с помощью 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, где линкер конъюгирован с белком-носителем столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (конъюгат MenA_AH-ТТ); (г) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С (MenC), конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, где линкер конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (конъюгат MenC_AH-ТТ); (д) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы W135 (MenW), непосредственно конъюгированный с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, в отсутствие линкера (конъюгат MenW-TT); (е) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы Y (MenY), непосредственно конъюгированный с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, в отсутствие линкера (конъюгат MenY-TT).

В другом аспекте изобретение относится к композиции, которая включает комбинацию MnB бивалентной rLP2086 композиции и композиции MenACWY-TT. MnB бивалентная rLP2086 композиция относится к композиции, которая включает один полипептидный компонент N. meningitidis, который вызывает эффективный широкозащитный иммунный ответ против многочисленных штаммов N. meningitidis серогруппы В. В частности, в одном воплощении MnB бивалентная rLP2086 композиция включает белок MnB rLP2086 подсемейства A (SEQ ID NO: 1) и белок MnB rLP2086 подсемейства В (SEQ ID NO: 2). В одном воплощении композиция не включает слитый белок. В одном воплощении композиция не включает химерный белок. В одном воплощении композиция не включает гибридный белок. В одном воплощении композиция, кроме этого, не включает фрагмент пептида. В другом воплощении композиция, кроме этого, не включает нейссериальный полипептид, который не является fHBP. Например, в одном воплощении, композиция не включает белок PorA. В другом воплощении, композиция не включает белок NadA. В другом воплощении, композиция, кроме этого, не включает нейссериальный гепарин-связывающий антиген (NHBA). В другом воплощении, композиция, кроме этого, не включает нейссериальную везикулу внешней мембраны (OMV). В предпочтительном воплощении композиция, кроме этого, не включает антигены, отличные от первого полипептида и второго полипептида. В предпочтительном воплощении MnB бивалентная rLP2086 композиция дополнительно включает полисорбат-80. В одном воплощении MnB бивалентная rLP2086 композиция дополнительно включает гистидиновый буфер. В одном воплощении MnB бивалентная rLP2086 композиция дополнительно включает хлорид натрия. В одном воплощении MnB бивалентная rLP2086 композиция дополнительно включает фосфат алюминия. В одном воплощении MnB бивалентная rLP2086 композиция дополнительно включает полисорбат-80, гистидиновый буфер, хлорид натрия и фосфат алюминия. Предпочтительно, MnB бивалентная rLP2086 композиция представляет собой жидкую композицию, где полипептиды приготовлены в виде 120 мкг/мл/подсемейство в 10 мМ гистидиновом буфере, рН 6,0, 150 мМ хлорид натрия (NaCl) с 0,5 мг/мл фосфата алюминия (AlPO₄), и дополнительно включает 0,018 мг полисорбата-80 в 0,5 мл дозе.

Композиция MenACWY-TT относится к композиции, которая включает очищенные капсульные полисахариды Neisseria meningitides серогруппы А, С, W-135 и Y, из которых каждый независимо конъюгирован с ТТ в соотношениях (ТТ к полисахариду) ~3, ~3, ~1,5 и ~1,3 соответственно. В частности, композиция включает (в) капсульный сахарид N. meningitides серогруппы А (MenA), конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, где линкер конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (конъюгат MenA_AH-ТТ); (г) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С (MenC), конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, где линкер конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (конъюгат MenC_AH-ТТ); (д) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы W135 (MenW), непосредственно конъюгированный с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, в отсутствие линкера (конъюгат MenW-TT); (е) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы Y (MenY), непосредственно конъюгированный с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатной химии, в отсутствие линкера (конъюгат MenY-TT). Предпочтительно, композиция MenACWY-TT представлена в виде лиофилизированного порошка.

Конъюгаты MenA_AH-ТТ, MenC_AH-ТТ, MenW-T и MenY-TT получают посредством следующих стадий: получение промежуточного полисахаридного лекарственного средства, получение промежуточного ТТ лекарственного вещества, микрофлюидизация полисахарида, дериватизация полисахарида (только для процессов MenAAH-ТТ и MenCAH-ТТ), дополнительная очистка ТТ и конъюгирование отдельных полисахаридов с ТТ.

Что касается конъюгата MenAAH-ТТ, то полисахарид MenA сначала подвергают микрофлюидизации для уменьшения размера молекулы и вязкости, затем активируют путем цианирования с помощью 1-циано-4-диметиламино-пиридина-тетрафторбората (CDAP). Активированный MenA дериватизируют дигидразидом адипиновой кислоты (ADH) с образованием MenA_AH. MenA_AH и столбнячный анатоксин (ТТ) соединяют посредством карбодиимид-опосредованной конденсации (технологии соединения посредством 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC)) с образованием конъюгата MenA_AH-столбнячный анатоксин (MenA_AH-ТТ).

Что касается конъюгата MenC_AH-ТТ, то полисахарид MenC сначала подвергают микрофлюидизации для уменьшения размера молекулы и вязкости, затем активируют посредством цианирования с помощью CDAP. Активированный MenC дериватизируют дигидразидом адипиновой кислоты (ADH) с образованием MenC_AH. MenC_AH и ТТ соединяют посредством карбодиимид-опосредованной конденсации EDAC технологии соединения) с образованием конъюгата MenC_AH- столбнячный анатоксин (MenC_AH-ТТ).

Что касается конъюгата MenW-TT, полисахарид MenW сначала подвергают микрофлюидизации для уменьшения размера молекулы и вязкости, а затем активируют путем цианирования с помощью CDAP. Активированный MenW непосредственно соединяют с ТТ с образованием конъюгата MenW- Столбнячный анатоксин (MenW-TT).

Что касается конъюгата MenY-TT, то полисахарид MenY сначала подвергают микрофлюидизации для уменьшения размера молекулы и вязкости, а затем активируют путем цианирования с помощью CDAP. Активированный MenY напрямую соединяют с ТТ с образованием конъюгата MenY-столбнячный анатоксин (MenY-TT).

В другом аспекте полипептидные антигены происходят из не более чем двух штаммов N. meningitidis серогруппы В, индуцируют эффективный широко защитный иммунный ответ против многочисленных штаммов N. meningitidis серогруппы В. Соответственно, в одном воплощении композиция дополнительно не включает полипептид, который не происходит из штамма N. meningitidis серогруппы В fHBP подсемейства А М98250771 и/или штамма N. meningitidis серогруппы В fHBP подсемейства В CDC1573

В одном воплощении, композиция, кроме этого, не включает полипептид, имеющий менее чем 100%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1. В другом воплощении, композиция, кроме этого, не включает полипептид, имеющий менее чем 100%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2. Например, композиция, кроме этого, не включает полипептид, имеющий менее чем 100%-ную идентичность последовательности с полноразмерной последовательностью SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении композиция дополнительно включает полисорбат-80, алюминий, гистидин и хлорид натрия. В одном воплощении композиция включает примерно 60 мкг первого липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, примерно 60 мкг второго липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 2,8 молярного соотношения полисорбата-80 к каждому полипептиду, 0,5 мг алюминия/мл в виде фосфата алюминия, 10 мМ гистидина и 150 мМ хлорида натрия, где композиция предпочтительно имеет общий объем примерно 0,5 мл.

В другом аспекте композиция включает примерно 120 мкг/мл первого липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, примерно 120 мкг/мл второго липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 2,8 молярного соотношения полисорбата-80 к каждому полипептиду, 0,5 мг алюминия/мл в виде фосфата алюминия, 10 мМ гистидина и 150 мМ хлорида натрия.

В дополнительном аспекте композиция включает а) 60 мкг первого липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; б) 60 мкг второго липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; в) 18 мкг полисорбата-80; г) 250 мкг алюминия; д) 780 мкг гистидина, и; е) 4380 мкг хлорида натрия.

В типичном воплощении композиция включает примерно 60 мкг первого липидированного полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, примерно 60 мкг второго липидированного полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 2,8 молярного соотношения полисорбата-80 к первому липидированному полипептиду и ко второму липидированному полипептиду, 0,5 мг/мл фосфата алюминия, 10 мМ гистидина, и 150 мМ хлорида натрия, где композиция имеет общий объем примерно 0,5 мл. В типичном воплощении композиция представляет собой стерильную изотоническую забуференную жидкую суспензию. В типичном воплощении композиция имеет рН 6,0. В типичном воплощении первый полипептид и второй полипептид адсорбированы на алюминии.

В одном воплощении композиция включает конъюгат MenA_AH-ТТ, имеющий среднее соотношение ТТ/полисахарид 3; конъюгат MenC_AH-ТТ, имеющий среднее соотношение ТТ/полисахарид 3; конъюгат MenW-TT, имеющий среднее соотношение ТТ/полисахарид 1,5; и конъюгат MenY-TT, имеющий среднее соотношение ТТ/полисахарид 1,3. В предпочтительном воплощении композиция включает конъюгат MenA_AH-ТТ, имеющий 5 мкг полисахарида MenA и ~ 15 мкг ТТ; конъюгат MenC_AH-ТТ имеющий 5 мкг полисахарида MenC и ~ 15 мкг ТТ; конъюгат MenW-TT, имеющий 5 мкг полисахарида MenW и ~ 7,5 мкг ТТ; и конъюгат MenY-TT, имеющий 5 мкг полисахарида MenY и ~ 6,5 мкг ТТ. Композиция может дополнительно включать Tris-HCl, сахарозу и хлорид натрия.

В другом воплощении композиция включает конъюгат MenA_AH-ТТ; конъюгат MenC_AH-ТТ; конъюгат MenW-TT; и конъюгат MenY-TT, которые включают полисахарид MenA; полисахарид MenC; полисахарид MenW; и полисахарид MenY и белок-носитель ТТ. Композиция может дополнительно включать сахарозу и Трометанол. Например, в одном воплощении композиция включает 10 мг/мл полисахарида MenA; 10 мг/мл полисахарида MenC; 10 мг/мл полисахарида MenW; и 10 мг/мл полисахарида MenY; 88 мг/мл белка-носителя ТТ; 164 мМ сахарозы; и 1,6 мМ Трометанола.

В одном воплощении композиция имеет общий объем примерно 0,5 мл. В одном воплощении первая доза композиции имеет общий объем примерно 0,5 мл. "Первая доза" относится к дозе композиции, которую вводят в сутки 0. "Вторая доза" или "третья доза" относится к дозе композиции, которую вводят после первой дозы, которая может быть равной или неравной первой дозе.

В одном аспекте изобретение относится к жидкой иммуногенной композиции, полученной из лиофилизированной композиции MenACWY-TT после восстановления жидкой MnB бивалентной rLP2086 композицией. Восстановление относится к восстановлению сухой лиофилизированной композиции в жидкую форму путем добавления жидкого разбавителя. В одном предпочтительном воплощении жидкую MnB бивалентную rLP2086 композицию не вводят одновременно, не назначают совместно и не вводят вместе с лиофилизированной композицией MenACWY-TT, где лиофилизированная композиция MenACWY-TT была восстановлена жидкой композицией, которая не является жидкой MnB бивалентной rLP2086 композицией. Например, в одном предпочтительном воплощении лиофилизированную композицию MenACWY-TT не восстанавливают водным разбавителем, состоящим из хлорида натрия и воды, и затем не вводят параллельно, не вводят вместе и не вводят одновременно с жидкой MnB бивалентной rLP2086 композицией.

Скорее, в предпочтительном воплощении, лиофилизированную MenACWY-TT композицию вводят с MnB бивалентной rLP2086 композицией в одном, то есть однократном введении человеку. Получаемое однократное введение (например композиции MenABCWY) может быть результатом смешивания MnB бивалентной rLP2086 композиции из первого контейнера с лиофилизированной композицией MenACWY-TT из второго контейнера. Альтернативно, однократное введение композиции MenABCWY может быть получено из одного (единственного) контейнера, включающего MnB бивалентную rLP2086 композицию и лиофилизированную композицию MenACWY-TT. Устройства для доставки вакцинных или иммуногенных композиций известны в данной области техники. В одном воплощении композицию MenABCWY вводят одновременно с любым из ибупрофена, парацетамола и амоксициллина.

Композиция является иммуногенной после введения первой дозы человеку. В одном воплощении общий объем первой дозы составляет примерно 0,5 мл.

Композиция индуцирует бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина, который выше по меньшей мере более чем в 1 раз, предпочтительно выше по меньшей мере в 2 раза, у человека после получения первой дозы, чем бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в сывороточном бактерицидном анализе с использованием человеческого комплемента (hSBA).

Бактерицидный титр или бактерицидный иммунный ответ направлен против N. meningitidis серогруппы В. В предпочтительном воплощении бактерицидный титр или бактерицидный иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В fHBP подсемейства А и против штамма N. meningitidis серогруппы В fHBP подсемейства В. Наиболее предпочтительно, когда бактерицидный титр или бактерицидный иммунный ответ направлен по меньшей мере против штамма В01, N. meningitidis серогруппы В, fHBP подсемейства В.

В одном воплощении композиция индуцирует бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина, который выше по меньшей мере более чем в 1 раз, например по меньшей мере в 1,01 раза, 1,1 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз или 16 раз у человека после получения дозы композиции, чем бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина у человека до получения указанной дозы, при измерении в идентичных условиях в сывороточном бактерицидном анализе с использованием человеческого комплемента.

В одном воплощении композиция представляет собой иммуногенную композицию. В одном воплощении композиция представляет собой иммуногенную композицию для человека. В другом воплощении композиция представляет собой вакцину. "Вакцина" относится к композиции, которая включает антиген, который содержит по меньшей мере один эпитоп, который индуцирует иммунный ответ, который является специфическим для этого антигена. Вакцина может быть введена непосредственно субъекту путем подкожного, перорального, ороназального или интраназального пути введения. Предпочтительно, вакцину вводят внутримышечно. В одном воплощении композиция представляет собой человеческую вакцину. В одном воплощении, композиция представляет собой иммуногенную композицию против N. meningitidis.

В одном воплощении композиция представляет собой жидкую композицию. В предпочтительном воплощении композиция представляет собой жидкую суспензионную композицию. В другом предпочтительном воплощении композиция не является лиофилизированной.

СТАБИЛЬНОСТЬ

Термины "стабильный" и "стабильность" относятся к способности антигена оставаться иммуногенным в течение некоторого периода времени. Стабильность можно измерять по активности в течение времени. Термины "стабильный" и "стабильность", кроме того, относятся к физической, химической и конформационной стабильности иммуногенной композиции. Нестабильность белковой композиции может быть вызвана химической деградацией или агрегацией молекул белка с образованием полимеров более высокого порядка, диссоциацией гетеродимеров на мономеры, дегликозилированием, модификацией гликозилирования или любой другой структурной модификацией, которая снижает по меньшей мере одну биологическую активность белковой композиции, включенной в настоящее изобретение. Стабильность может быть оценена методами, хорошо известными в данной области, включая измерение светорассеяния образца, видимое ослабление света (поглощение или оптическая плотность), измерение размера (например, с помощью эксклюзионной хроматографии), определение in vitro или in vivo биологической активности и/или свойств с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) Другие методы оценки стабильности известны в данной области и также могут быть использованы согласно настоящему описанию.

В некоторых воплощениях антиген в стабильной композиции по изобретению может поддерживать по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% активность, по сравнению с эталоном, в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 24 месяцев, 30 месяцев, 36 месяцев, 42 месяцев, 48 месяцев, 54 месяцев или 60 месяцев. В некоторых воплощениях антиген в стабильной композиции по изобретению может поддерживать по меньшей мере 50% активность по сравнению с эталоном в течение по меньшей мере 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет or 5 лет. Термины "стабильный" и "стабильность" также относятся к способности антигена сохранять эпитопы или иммунореактивность в течение некоторого периода времени. Например, антиген в стабильной композиции по изобретению может поддерживать по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% своих эпитопов или иммунореактивности по сравнению с эталоном в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 24 месяцев, 30 месяцев, 36 месяцев, 42 месяцев, 48 месяцев, 54 месяцев или 60 месяцев. В некоторых воплощениях стабильность измеряют в зависимости от условий окружающей среды. Неограничивающие примеры условий окружающей среды включают свет, температуру, циклы замораживания/оттаивания, перемешивание и рН. Специалист в данной области сможет определить наличие антигенных эпитопов или иммунореактивности с использованием методов, раскрытых в настоящем описании изобретения, или других методов, известных в данной области. В некоторых воплощениях стабильность антигена измеряют с момента его создания. В некоторых воплощениях, стабильность антигена измеряют с момента изменения условий его хранения. Неограничивающие примеры изменения условий хранения включают изменение условий хранения с замороженных на охлажденные, изменение с замороженных на комнатную температуру, изменение с охлажденных на комнатную температуру, изменение с охлажденных на замороженные, изменение с комнатной температуры на замороженные, изменение с комнатной температуры на охлажденные, изменение со света на темноту, или введение перемешивания.

В одном воплощении термины "стабильный" и "стабильность" включают способность антигена связываться с алюминием. Например, стабильная композиция по изобретению включает по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% белка, который связан с алюминием (например фосфатом алюминия) в композиции, по сравнению с эталоном, в течение по меньшей мере 1 часа, 6 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часов, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 24 месяцев, 30 месяцев, 36 месяцев, 42 месяцев, 48 месяцев, 54 месяцев или 60 месяцев. Смотрите, например, Пример 13. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% от общего количества полипептида rLP2086 подсемейства А (например, полипептида, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1), связано с алюминием в композиции. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% от общего количества полипептида rLP2086 подсемейства В (например полипептида, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2), связано с алюминием в композиции.

Определение связывания алюминия. Композицию, содержащую алюминий и по меньшей мере один белковый антиген, центрифугировали таким образом, чтобы осаждался алюминий. Центрифугирование абсорбированных алюминием белков известно в данной области техники. Смотрите, например, Egan et al., Vaccine, Vol. 27(24): 3175-3180 (2009). Связанный с алюминием белок также осаждался, в то время как не связанный с алюминием белок оставался в супернатанте. Общий белок в супернатанте и осадке определяли методом Лоури. Процент связанного белка рассчитывали путем деления общего белка в супернатанте на общее количество белка, добавленного в композицию, и умножения на 100%. Аналогично, процент несвязанного белка рассчитывали путем деления общего белка в супернатанте на общее количество белка, добавленного в композицию, и умножения на 100%. Для композиций, содержащих антигены и подсемейства А и подсемейства В, концентрации отдельных белков подсемейств А и В в супернатанте определяли посредством ионообменной хроматографии. Разделение и элюирование белков подсемейств А и В проводили с использованием сильной анионообменной колонки и элюента с высокой концентрацией соли. Белки подсемейств А и В были обнаружены и количественно определены с помощью флуоресцентного детектора, настроенного на возбуждение = 280 run и эмиссию = 310 run. Белки подсемейства А и подсемейства элюируются с разным временем удерживания и их количественно определяли с использованием стандартной кривой, созданной против эталонного белка rLP2086. Процент несвязанного белка рассчитывали путем деления общего количества белка в супернатанте на общее количество белка, добавленного в композицию, и умножения на 100%. Процент связанного белка рассчитывали путем вычитания процента несвязанного белка из 100%.

ПОЛИСОРБАТ-80

Полисорбат 80 (PS-80) представляет собой неионное поверхностно-активное вещество. Ускоренные исследования стабильности с использованием моноклонального антитела in vitro на основе анализа активности продемонстрировали нестабильность белка подсемейства В при высоких молярных соотношениях PS-80 к MnB rLP2086 белку в конечной композиции. Дополнительные эксперименты с варьирующимися соотношениями PS-80 показали, что, для сохранения активности, оптимальное молярное соотношение PS-80 и белка MnB rLP2086 составляет примерно 2,8±1,4.

Концентрация PS-80 в композиции зависит от молярного соотношения PS-80 к полипептиду. В одном воплощении композиция включает молярное соотношение PS-80 к первому полипептиду и ко второму полипептиду, равное 2,8±1,4. В одном воплощении, композиция включает молярное соотношение PS-80 к первому полипептиду и ко второму полипептиду, равное 2,8±1,1. В одном воплощении композиция включает молярное соотношение PS-80 к полипептиду, равное по меньшей мере 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2 или 3,3. В одном воплощении композиция включает молярное соотношение PS-80 к полипептиду, составляющее не более 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0 или 2,9. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения для определения диапазона. Предпочтительно, композиция включает молярное соотношение PS-80 к полипептиду, равное 2,8.

Молярное соотношение PS-80 к полипептиду определяют путем подсчета измеренной концентрации PS-80 и измеренной общей концентрации полипептида, при этом оба значения выражены в молях. Например, молярное соотношение PS-80 к белку определяют путем подсчета измеренной концентрации PS-80 (например, посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC)) к измеренной общей концентрации белка (например, посредством ионообменной жидкостной хроматографии при высоком давлении (ионно-обменная ВЭЖХ)) в конечном лекарственном веществе, где обе величины выражены в молях.

RP-HPLC используют для количественной оценки концентрации Полисорбата 80 в вакцинных композициях. Концентрацию детергента определяют посредством омыления жирнокислотной группировки; Полисорбат 80 преобразуется в свободную олеиновую кислоту посредством щелочного гидролиза при 40°С. Образец отделяют с помощью RP-HPLC, используя колонку С18, и проводят количественное определение с использованием УФ-детектора при длине волны 200 нм.

Первый и второй полипептиды разделяют с помощью анионообменной ВЭЖХ. Белки rLP2086(fHBP) подсемейства А и В элюируются с разным временем удерживания и их количественно определяют с помощью стандартной кривой, построенной против соответствующего эталонного белка rLP2086.

Термин "молярное соотношение" и описание иммуногенной композиции, включающей fHBP и PS-80, дополнительно раскрыты в WO 2012025873 и патентной публикации патента US 2013/0171194, каждая из которых включена посредством ссылки во всей полноте.

Используемый здесь термин "молярное соотношение" относится к соотношению числа молей двух разных элементов композиции. В некоторых воплощениях молярное соотношение представляет собой соотношение молей детергента к молям полипептида. В некоторых воплощениях молярное соотношение представляет собой соотношение молей PS-80 к молям белка. В одном воплощении, на основании концентраций белка и Полисорбата 80, молярное соотношение может быть рассчитано с использованием следующей формулы:

В одном воплощении композиция включает молярное соотношение PS-80 к белку rLP2086 MnB, составляющее от 1,4 до 4,2 для сохранения активности. В одном воплощении композиция включает молярное соотношение, составляющее по меньшей мере 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7 или 2,8. В одном воплощении композиция включает молярное соотношение, составляющее не более 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9 или 2,8. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона.

В одном воплощении композиция включает примерно 0,0015, 0,0017, 0,0019, 0,0021, 0,0023, 0,0025, 0,0027, 0,0029, 0,0031, 0,0033, 0,0035, 0,0037, 0,0039, 0,0041, 0,0043, 0,0045, 0,0047, 0,0049, 0,0051 мг/мл PS-80. Предпочтительно композиция включает примерно 0,0035 мг/мл PS-80.

В другом воплощении композиция включает по меньшей мере 10 мкг, 11 мкг, 12 мкг, 13 мкг, 14 мкг, 15 мкг, 16 мкг, 17 мкг, 18 мкг, 19 мкг, 20 мкг, 21 мкг, 22 мкг, 23 мкг, 24 мкг или 25 мкг PS-80. В другом воплощении композиция включает не более 30 мкг, 29 мкг, 28 мкг, 27 мкг, 26 мкг, 25 мкг, 24 мкг, 23 мкг, 22 мкг, 21 мкг, 20 мкг, 19 мкг или 18 мкг PS-80. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона. В предпочтительном воплощении композиция включает по меньшей мере 10 мкг и не более 20 мкг PS-80. В наиболее предпочтительном воплощении композиция включает примерно 18 мкг PS-80.

В другом воплощении, композиция включает концентрацию PS-80 в диапазоне 0,0005% - 1%. Например, концентрация PS-80 в композиции может быть по меньшей мере 0,0005%, 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% или 1,1% PS-80. В одном воплощении концентрация PS-80 в композиции может быть не более 2,0%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8% или 0,7% PS-80. В предпочтительном воплощении композиция включает примерно 0,07% PS-80. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона.

В некоторых воплощениях композиция, которая включает комбинацию первой композиции и второй композиции, может иметь другое молярное соотношение полисорбата-80 относительно полипептидов MnB rLP2086, по сравнению с молярным соотношением полисорбата-80 относительно полипептидов MnB rLP2086 в первой композиции. В некоторых воплощениях не требуется дополнительное поверхностно-активное вещество для комбинированной композиции для поддержания растворимости и стабильности полипептидов MnB rLP2086 в комбинированной композиции. Соответственно, в одном воплощении набор не включает более 0,02 мг полисорбата-80.

АЛЮМИНИЙ

Композиция включает алюминий в виде фосфата алюминия. AlPO₄ добавляют в качестве стабилизатора для обеспечения повышенной технологичности и стабильности. Способ получения фосфата алюминия описан в патентной публикации US 2009/0016946, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. В одном воплощении композиция дополнительно не включает мультивалентный катион, отличные от алюминия. В одном воплощении композиция дополнительно не включает Al(ОН)₃ или Al(SO₄)₃.

В одном воплощении, композиция включает по меньшей мере 50 мкг, 60 мкг, 70 мкг, 80 мкг, 90 мкг 100 мкг, 110 мкг, 120 мкг, 130 мкг, 140 мкг, 150 мкг, 160 мкг, 170 мкг, 180 мкг, 190 мкг, 200 мкг, 210 мкг, 220 мкг, 230 мкг, 240 мкг или 250 мкг алюминия. В одном воплощении, композиция включает не более 500 мкг, 490 мкг, 480 мкг, 470 мкг, 460 мкг, 450 мкг, 440 мкг, 430 мкг, 420 мкг, 410 мкг, 400 мкг, 390 мкг, 380 мкг, 370 мкг, 360 мкг, 350 мкг, 340 мкг, 330 мкг, 320 мкг, 310 мкг, 300 мкг, 290 мкг, 280 мкг, 270 мкг, 260 мкг или 250 мкг алюминия. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона. В наиболее предпочтительном воплощении композиция включает 250 мкг алюминия.

В одном воплощении, композиция включает по меньшей мере 0,005 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,03 мг/мл, 0,04 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,06 мг/мл, 0,07 мг/мл, 0,08 мг/мл, 0,09 мг/мл, 0,10 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл или 0,5 мг/мл фосфата алюминия. В одном воплощении композиция включает не более 2,0 мг/мл, 1,9 мг/мл, 1,8 мг/мл, 1,7 мг/мл, 1,6 мг/мл, 1,5 мг/мл, 1,4 мг/мл, 1,3 мг/мл, 1,2 мг/мл, 1,1 мг/мл, 1,0 мг/мл, 0,9 мг/мл, 0,8 мг/мл или 0,7 мг/мл PS-80. В предпочтительном воплощении, композиция включает примерно 0,07 мг/мл PS-80. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона. В предпочтительном воплощении композиция включает 0,5 мг/мл фосфата алюминия. В наиболее предпочтительном воплощении композиция включает 0,5 мг алюминия/мл в виде фосфата алюминия (AlPO₄). Эта концентрация поддерживает связывание (по меньшей мере 90% связывания или более) белков подсемейства А и В с алюминием.

В некоторых воплощениях комбинация первой композиции и второй композиции меняет процент MnB rLP2086 полипептидов, связанных с алюминием, по сравнению с процентом MnB rLP2086 полипептидов, связанных с алюминием в первой композиции. В некоторых воплощениях комбинация первой и второй композиций поддерживает связывание по меньшей мере 90% общего количества MnB rLP2086 полипептидов с алюминием. Соответственно, в одном воплощении процентное соотношение общего количества полипептидов MnB rLP2086 к количеству алюминия в комбинированной композиции составляет по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Предпочтительно, процентное соотношение общего количества полипептидов MnB rLP2086 к количеству алюминий в комбинированной композиции составляет по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100%.

В другом воплощении концентрация полипептидов, связанных с алюминием в иммуногенной композиции, не уменьшается через 24 часа, по сравнению с концентрацией полипептидов, связанных с алюминием в жидкой композиции перед восстановлением лиофилизированной композиции. В другом воплощении концентрация конъюгата MenA_AH-ТТ в иммуногенной композиции не снижается через 24 часа, по сравнению с концентрацией конъюгата MenA_AH-ТТ в лиофилизированной композиции. В одном воплощении концентрация уменьшается не более чем на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% через 24 часа, по сравнению с соответствующей концентрацией в жидкой композиции перед восстановлением.

В другом воплощении, концентрация конъюгата MenC_AH-ТТ в иммуногенной композиции не снижается через 24 часа, по сравнению с концентрацией конъюгата MenC_AH-ТТ в лиофилизированной композиции. В другом воплощении концентрация конъюгата MenW-TT в иммуногенной композиции не снижается через 24 часа, по сравнению с концентрацией конъюгата MenW-TT в лиофилизированной композиции. В другом воплощении концентрация конъюгата MenY-TT в иммуногенной композиции не снижается через 24 часа, по сравнению с концентрацией конъюгата MenY-TT в лиофилизированной композиции. В одном воплощении концентрация снижается не более чем на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% через 24 часов, по сравнению с соответствующей концентрацией в лиофилизированной композиции перед восстановлением.

ЭКСЦИПИЕНТЫ

В одном воплощении композиция включает гистидин. В одном воплощении композиция включает по меньшей мере 650 мкг, 660 мкг, 670 мкг, 680 мкг, 690 мкг, 700 мкг, 710 мкг, 720 мкг, 730 мкг, 740 мкг, 750 мкг, 760 мкг, 770 мкг, 780 мкг, 790 мкг, 800 мкг, 810 мкг, 820 мкг, 830 мкг, 840 мкг или 850 мкг гистидина. В одном воплощении, композиция включает не более 1560 мкг, 1500 мкг, 1400 мкг, 1300 мкг, 1200 мкг, 1100 мкг, 1000 мкг, 950 мкг, 900 мкг, 890 мкг, 880 мкг, 870 мкг, 860 мкг, 850 мкг, 840 мкг, 830 мкг, 820 мкг, 810 мкг, 800 мкг, 790 мкг или 780 мкг гистидина. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона. Предпочтительно, композиция включает 780 мкг гистидина.

В одном воплощении композиция включает трис-, фосфатный или сукцинатный буфер. В предпочтительном воплощении, композиция не включает трис-буфер. В предпочтительном воплощении композиция не включает фосфатный буфер. В одном предпочтительном воплощении композиция не включает сукцинатный буфер. В предпочтительном воплощении композиция включает гистидиновый буфер.

В одном воплощении, композиция включает хлорид натрия. Концентрация хлорида натрия в композиции MenABCWY может варьировать от 160,5 до 161,1 мМ.

В одном воплощении рН композиции составляет от 5,5 до 7,5. В предпочтительном воплощении рН композиции составляет от 5,8 до 7,0, наиболее предпочтительно от 5,8 до рН 6,0. В одном воплощении рН композиции составляет не более 6,1. В одном воплощении рН композиции составляет 5,8.

НАБОРЫ

Еще один аспект изобретения представляет собой набор для введения дозы композиции для индукции бактерицидных антител против Neisseria meningitidis у млекопитающего.

В одном аспекте набор включает первую композицию, включающую вышеописанный первый полипептид и вышеописанный второй полипептид. В предпочтительном воплощении первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В другом предпочтительном воплощении второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Набор дополнительно включает вторую композицию, включающую конъюгат MenA_AH-ТТ, конъюгат MenC_AH-ТТ, конъюгат MenW-TT и конъюгат MenY-TT. В одном воплощении набор включает по меньшей мере два контейнера, где первый контейнер включает первую композицию, а второй контейнер включает вторую композицию.

В одном воплощении набор включает жидкую первую композицию и лиофилизированную вторую композицию. Предпочтительно, набор включает жидкую MnB бивалентную rLP2086 композицию и лиофилизированную MenACWY-TT композицию.

В некоторых воплощениях, композиция включает комбинацию первой композиции и второй композиции с измененным молярным соотношением полисорбата-80 относительно полипептидов MnB rLP2086 в первой композиции. В некоторых воплощениях не требуется дополнительного поверхностно-активного вещества для комбинированной композиции для поддержания растворимости и стабильности полипептидов MnB rLP2086 в комбинированной композиции. Соответственно, в одном воплощении набор не содержит более 0,02 мг полисорбата-80.

В одном воплощении изобретения набор дополнительно не включает ни одну из следующих коммерческих иммуногенных композиций: MENACTRA(R), MENVEO(R), ADACEL(R), HAVRIX(R), GARDASIL(R), REPEVAX или любую их комбинацию.

Например, набор предпочтительно также не включает композицию конъюгата менингококковых полисахаридов А, С, Y и W-135 (MCV4), где белок-носитель представляет собой дифтерийный анатоксин. В одном воплощении набор дополнительно не включает композицию конъюгатов менингококковых полисахаридов А, С, Y и W-135 (MCV4), где белок-носитель представляет собой CRM197. В одном воплощении набор дополнительно не содержит вакцину NIMENRIX, где NIMENRLX содержит разбавитель, состоящий из хлорида натрия и воды.

БАКТЕРИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ

Заболеваемость, обусловленная MnB, составляет примерно 1 на 100 000, что означает, что для статистически значимой оценки эффективности потребуется очень большое количество испытуемых (от 400 000 до более 6 миллионов). Таким образом, для оценки иммуногенности в клинических испытаниях используют сывороточный бактерицидный анализ с использованием человеческого комплемента (hSBA), который является упрощенным показателем защиты и эффективности вакцины.

Компания Pfizer собрала обширную коллекцию штаммов MnB (N = по меньшей мере 1263), содержащую изоляты, вызывающие IMD (иммуно-обусловленное заболевание), за период с 2000 г по 2006 г. Изоляты MnB систематически собирали из Центров США по борьбе с болезнями и их профилактике (CDC) и из здравоохранительных и справочных лабораторий Европейских стран.

В одном воплощении, иммунный ответ, индуцированный введением композиции человеку, определяют с использованием сывороточного бактерицидного с использованием человеческого комплемента (hSBA) против четырех штаммов N. meningitidis серогруппы В (MnB). Штаммы MnB, используемые в hSBA, были выбраны из пула штаммов. Пул штаммов представлял собой коллекцию систематически собранных клинически значимых штаммов N. meningitidis.

Высокий уровень hSBA-ответа на все тестируемые штаммы, особенно на штаммы, экспрессирующие варианты липопротеина 2086 с последовательностями, гетерологичным как первому полипептиду, так и второму полипептиду, позволяет предположить, что композиция является широко защитной вакциной, достаточной для обеспечения высокой серологической защиты против штаммов N. meningitidis, экспрессирующие rLP2086 (FHBP) по меньшей мере серогруппы В, включая дополнительные серогруппы, такие как серо группа X.

Штаммы подсемейства А

В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, который экспрессирует белок LP2086 (fHBP) подсемейства А. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP) подсемейства А, который экспрессирует вариант липопротеина 2086, который является гетерологичным штамму N. meningitidis, экспрессирующему А05. Например, в одном воплощении, штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP) подсемейства А, который экспрессирует вариант липопротеина 2086, который является гетерологичным штамму М98250771.

В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий fHBP А10. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 (fHBP) А22. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 (fHBP) А56. В еще одном воплощении штаммы hSBA представляют собой штаммы LP2086 (fHBP) А22 и LP2086 (fHBP) А56. В другом воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А04. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А05. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А12. В одном воплощении, штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А22. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А12. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А04. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А19. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 А07. В другом воплощении штамм hSBA включает любой из А22-, А12-, А19-, А05- и А07-экспрессирующего штамма. В одном воплощении штамм hSBA включает любой из А06-, А15- и А29- экспрессирующего штамма.

В одном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В fHPB подсемейства А, который является гетерологичным штамму N. meningitidis, экспрессирующему А05. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В А22. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В А56. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В А06. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В А15. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В А29. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В А62. В одном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А, который является гетерологичным штамму N. meningitidis М98250771.

В одном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с первым полипептидом. В другом воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с фактор Н-связывающим белком, экспрессируемым штаммом N. meningitidis М98250771. В предпочтительном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis, серогруппы В подсемейства А, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 84% идентичность с фактор Н-связывающим белком, экспрессируемым штаммом N. meningitidis М98250771.

В другом воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая имеет не более чем 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с первым полипептидом. В другом воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая имеет не более чем 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с фактор Н-связывающим белком, экспрессируемым штаммом N. meningitidis М98250771. В предпочтительном воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая имеет не более чем 85%, более предпочтительно не более чем 99%, идентичность с фактор Н-связывающим белком, экспрессируемым N. meningitidis М98250771. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона.

В одном воплощении иммунный ответ, вызванный композицией, является бактерицидным не только против штамма N. meningitidis серогруппы В fHPB подсемейства А, но также против штамма N. meningitidis, экспрессирующего полипептид fHBP подсемейства А, где серо группа не является серогруппой В. Например, в одном предпочтительном воплощении иммунный ответ, вызываемый композицией, является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А и против штамма N. meningitidis серогруппы С, который экспрессирует полипептид fHBP подсемейства А, гетерологичный по отношению к fHBP А05. Например, в одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы С, экспрессирующего fHBP А10. В другом воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы W, экспрессирующего fHBP А19. В одном воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis подсемейства А, который экспрессирует полипептид fHBP, где штамм является гетерологичным по отношению к штамму N. meningitidis М98250771.

Штаммы подсемейства В

В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP)под семейства В. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP)подсемейства В, который экспрессирует вариант липопротеина 2086, который является гетерологичным по отношению к штамму N. meningitidis, экспрессирующему В01. Например, в одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP) подсемейства В, который экспрессирует вариант липопротеина 2086, который является гетерологичным по отношению к штамму CDC1127. В предпочтительном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP) подсемейства В, который экспрессирует вариант липопротеина 2086, который является гетерологичным по отношению к штамму CDC1573.

В одном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В fHPB подсемейства В, который является гетерологичным по отношению к штамму N. meningitidis, экспрессирующему В01. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В24. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В44. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В16. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В03. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В09. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В15. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В153. В одном воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который является гетерологичным по отношению к штамму N. meningitidis CDC1573.

В одном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность которая обладает по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью со вторым полипептидом. В другом воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность которая обладает по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью с фактор Н-связывающим белком, экспрессируемый штаммом N. meningitidis CDC1573. В предпочтительном воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 87% идентичностью с фактор Н-связывающим белок, экспрессируемым штаммом N. meningitidis CDC1573. В другом предпочтительном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность, которая обладает 100% идентичностью с фактор Н-связывающим белок, экспрессируемым штаммом N. meningitidis CDC1573.

В другом воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitides серогруппы В подсемейства В, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность которая имеет не более чем 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность со вторым полипептидом. В другом воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность которая имеет не более чем 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с фактор Н-связывающим белок, экспрессируемым штаммом N. meningitidis CDC1573. В предпочтительном воплощении, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который экспрессирует фактор Н-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность которая обладает не более чем 88% идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью с фактор Н-связывающим белок, экспрессируемым штаммом N. meningitidis CDC1573. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона.

В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP) В24. В другом воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 (fHBP) В44. В другом воплощении штаммы hSBA включают штаммы LP2086 (fHBP) В24 и LP2086 (fHBP) В44. В одном воплощении штаммы hSBA включают штаммы LP2086 (fHBP) А22, LP2086 (fHBP) А56, LP2086 (fHBP) В24 и LP2086 (fHBP) В44. В одном воплощении, штамм hSBA включает В15. В одном воплощении штамм hSBA включает В153. В другом воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 В16. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 В03. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм LP2086 В09. В другом воплощении штаммы hSBA включают В24, В16, В44, В03 и В09 или любую их комбинацию. В другом воплощении штаммы hSBA включают В24, В16, В44, А22, В03, В09, А12, А19, А05 и А07, или любую их комбинацию. В другом воплощении штаммы hSBA включают A06, A07, A12, A15, A19, A29, В03, В09, В15 и В16 или любую их комбинацию.

В одном воплощении способ индуцирует иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы В fHPB подсемейства А и против штамма N. meningitidis серогруппы В fHPB подсемейства В. Предпочтительно, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В fHPB подсемейства А и против штамма N. meningitidis серогруппы В fHPB подсемейства В.

В одном воплощении, иммунный ответ, вызванный композицией, является бактерицидным не только против штамма N. meningitides серогруппы В fHPB подсемейства В, но и против штамма N. meningitidis, экспрессирующего полипептид fHBP подсемейства В, где серо группа не является серогруппой В. Например, в одном предпочтительном воплощении иммунный ответ, вызванный композицией, является бактерицидным ответом против штамма В N. meningitidis серогруппы В подсемейства В и против штамма N. meningitidis серогруппы Y, который экспрессирует полипептид fHBP подсемейства В, гетерологичный к fHBP В01. Например, в одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы А, экспрессирующего fHBP В16. В другом воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы Y, экспрессирующего fHBP В47. В другом воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы X, экспрессирующего fHBP В49. В одном воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis, который экспрессирует полипептид fHBP подсемейства В, где штамм является гетерологичным штамму CDC1573 N. meningitidis серогруппы В.

В одном аспекте изобретение относится к применениям композиции, включающей первый липидированный полипептидный вариант N. meningitidis серогруппы В фактор Н-связывающего белка (fHBP) и второй липидированный полипептидный вариант N. meningitidis серогруппы В fHBP. В одном воплощении композиция индуцирует бактерицидный иммунный ответ против по меньшей мере одного штамма N. meningitidis серогруппы В, экспрессирующего полипептид, выбранный из группы, состоящей из В А02, А28, А42, А63, А76, В05, В07, В08, В13, В52 и В107. Например, в одном аспекте, изобретение относится к применениям композиции, включающей первый липидированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и второй липидированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий fHBP В05. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 (fHBP) В07. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 (fHBP) В08. В другом воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 В13. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 В52. В одном воплощении штамм hSBA представляет собой штамм N. meningitidis, экспрессирующий LP2086 В107. В другом воплощении, штамм hSBA включает любой штамм, выбранный из группы, состоящей из В05, В07, В08, В13, В52 и В107. В другом воплощении штамм hSBA включает любой штамм, выбранный из группы, состоящей из В05, В07, В08, В13, В52, В107, В01, В24, В44, В16, В03, В09, В15 и В153.

В одном воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В, который является гетерологичным по отношению к штамму N. meningitidis, экспрессирующему В01. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В05. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В07. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В08. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В13. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В52. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В107. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В24. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В44. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В16. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В03. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В09. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В15. В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В В153. В одном воплощении иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis, серогруппы В подсемейства В, который является гетерологичным по отношению к штамму N. meningitidis CDC1573.

В одном воплощении иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В, выбранного из группы, состоящей из А02, А28, А42, А63 и А76. В одном воплощении, иммунный ответ направлен против штамма N. meningitidis серогруппы В, выбранного из группы, состоящей из В05, В07, В08, В13, В52, В107, В01, В24, В44, В16, В03, В09, В15 и В153, и любой их комбинации.

В одном воплощении штаммы hSBA включают В05, В07, В08, В13, В52 и В107, и любую их комбинацию. В другом воплощении, штаммы hSBA включают В05, В07, 808, В13, В52 и В107, В24, В16, В44, В03 и В09, и любую их комбинацию. В одном воплощении штаммы hSBA включают А02, А28, А42, А63, А76, В05, В07, В08, В13, В52 и В107 и любую их комбинацию. В другом воплощении штаммы hSBA дополнительно включают А06, А07, А12, А15, А19, А29, В03, В09, В15 и В16, или любую их комбинацию. В другом воплощении штаммы hSBA включают А02, А28, А42, А63, А76, В05, В07, В08, В13, В52 и В107, А06, А07, А12, А15, А19, А29, В03, 809, В15 и В16 и любую их комбинацию.

В одном воплощении способ индуцирует иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А и против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В. Предпочтительно, иммунный ответ является бактерицидным против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства А и против штамма N. meningitidis серогруппы В подсемейства В. В одном воплощении способ индуцирует иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы В, выбранного из группы, состоящей из А02, А28, А42, А63, А76, В05, В07, В08, В13, В52 и В107, и любой их комбинации. В одном воплощении, способ индуцирует иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы В, выбранного из группы, состоящей из А02, А28, А42, А63, А76, В05, В07, В08, В13, В52 and В107, А06, А07, А12, А15, А19, А29, В03, В09, В15 и В16, и любой их комбинации.

ТИТРЫ

В одном воплощении композиция вызывает увеличение бактерицидного титра у человека по сравнению с бактерицидным титром у человека до введения дозы композиции, при измерении в идентичных условиях в hSBA. В одном воплощении увеличение бактерицидного титра сравнивают с бактерицидным титром у человека до введения первой дозы композиции, по сравнению с бактерицидным титром у человека до введения первой дозы композиции, при измерении в идентичных условиях в hSBA. В одном воплощении увеличение титра наблюдается после второй дозы композиции, по сравнению с бактерицидным титром у человека до введения второй дозы композиции, при измерении в идентичных условиях в hSBA. В другом воплощении увеличение бактерицидного титра наблюдается после введения третьей дозы композиции по сравнению с бактерицидным титром у человека до введения третьей дозы композиции, при измерении в идентичных условиях в hSBA.

В одном воплощении композиция вызывает бактерицидный титр у человека после введения дозы, где бактерицидный титр выше по меньшей мере более чем в 1 раз, чем бактерицидный титр у человека до введения дозы, при измерении в идентичных условиях в hSBA. Например, бактерицидный титр может быть по меньшей мере в 1,01 раза, в 1,1 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз, в 11 раз, в 12 раз, в 13 раз, в 14 раз, в 15 раз или в 16 раз выше у человека после получения дозы композиции, по сравнению с бактерицидным титром у человека до введения дозы, при измерении в идентичных условиях в hSBA.

В одном воплощении "субъект, отвечающий на лечение" относится к человеку, у которого композиция индуцирует бактерицидный титр после введения дозы, где бактерицидный титр выше по меньшей мере более чем в 1 раз, чем бактерицидный титр у человека до введения дозы. В предпочтительном воплощении субъект, отвечающий на лечение, достигает по меньшей мере ≥4-кратного повышения титра hSBA по сравнению с бактерицидным титром у человека до введения дозы. Такой субъект, отвечающий на лечение, может упоминаться как имеющий защитный титр. В некоторых воплощениях защитный титр представляет собой титр выше 1:4.

В одном воплощении титр hSBA представляет собой величину, обратную наибольшему разведению образца сыворотки, которое обеспечивает измеряемый эффект. Например, в одном воплощении титр hSBA представляет собой величину, обратную наибольшему 2-кратному разведению тестируемой сыворотки, которое приводит к по меньшей мере 50% снижению MnB бактерий (50% выживаемость бактерий) по сравнению со значением Т30 КОЕ (т.е. количеством бактерий, выживших после инкубации в аналитических лунках, содержащих все компоненты аналитической смеси, кроме тестовой сыворотки; 100% выживаемость бактерий).

В одном воплощении композиция индуцирует бактерицидный титр у человека после получения первой дозы, который по меньшей мере в 2 раза превышает бактерицидный титр у человека до получения первой дозы (например выше, чем бактерицидный титр у человека в отсутствие первой дозы), при измерении в идентичных условиях в hSBA. В одном воплощении композиция индуцирует бактерицидный титр у человека, который по меньшей мере в 4 раза выше, чем бактерицидный титр у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в бактерицидном анализе сыворотки крови человека с использованием человеческого комплемента (hSBA). В одном воплощении композиция индуцирует бактерицидный титр у человека, который по меньшей мере в 8 раз выше, чем бактерицидный титр у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в бактерицидном анализе сыворотки крови человека с использованием человеческого комплемента (hSBA).

В предпочтительном воплощении комплемент сыворотки крови человека получают от человека, имеющего низкую внутреннюю бактерицидную активность в отношении данного тестируемого штамма hSBA. Низкая внутренняя бактерицидная активность означает, например, бактерицидный титр, который по меньшей мере меньше чем разведение 1:4 против данного тестируемого штамма hSBA. В одном воплощении человеческий комплемент получен от человека, имеющего титр hSBA, который по меньшей мере меньше чем 1:4, например 1:2 разведение, против данного тестируемого штамма hSBA, где композицию не вводили человеку.

Человек может иметь титр hSBA менее 1:4 до введения композиции, такой как бивалентная rLP2086 композиция, или человек может иметь титр hSBA ≥1:4 до введения композиции. Соответственно, в предпочтительных воплощениях и примерах, введение по меньшей мере одной дозы композиции человеку приводит к титру hSBA, который по меньшей мере в 4 раза выше титра у человека до введения. В некоторых воплощениях введение по меньшей мере одной дозы композиции человеку приводит к титру hSBA, который по меньшей мере выше 1:4, например титру hSBA ≥1:8, титру hSBA ≥1:16 и титру hSBA ≥1:32. Соответствующие Примеры, описанные в здесь, включают оценку доли людей, имеющих титр hSBA ≥1:8 и/или ≥1:16, при введении человеку бивалентной rLP2086 композиции. В некоторых воплощениях 4-кратное увеличение титра у человека после введения композиции по сравнению с титром до введения композиции показывает, что защита связана с композицией. В некоторых воплощениях такие предпочтительные оценки титров hSBA выше 1:4 показывают, что защита, т.е. индуцированный у человека бактерицидный иммунный ответ, ассоциирована с композицией.

В одном воплощении человек имеет титр hSBA, который равен или выше нижнего предела количественного определения (LLOQ) после введения первой дозы композиции. В другом воплощении человек имеет титр hSBA, который равен или выше hSBA LLOQ после введения второй дозы композиции. В другом воплощении человек имеет титр hSBA, который равен или выше hSBA LLOQ после введения третьей дозы композиции.

СПОСОБЫ И ВВЕДЕНИЕ

В одном аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против N. meningitidis у человека. В другом аспекте изобретение относится к способу вакцинации человека.

В некоторых воплощениях способ включает введение человеку композиции, где композиция индуцирует иммунный ответ против каждого из капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител, и где титр выше, чем титр, индуцированный лицензированной вакциной против менингококковых капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y. В некоторых воплощениях лицензированная вакцина против менингококковых капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y представляет собой MENVEO.

В некоторых воплощениях способ включает введение человеку композиции, где композиция индуцирует иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы В, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител, который выше, чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированный лицензированной вакциной против N. meningitidis серогруппы В. В некоторых воплощениях лицензированная вакцина против N. meningitidis серогруппы В представляет собой TRUMENBA.

В некоторых воплощениях способ включает введение человеку композиции, где композиция индуцирует иммунный ответ к каждому из капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, а также N. meningitidis серогруппы В, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител к каждому капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, который выше, чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированный лицензированной вакциной против капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, и, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител к менингококку серогруппы В, который выше, чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированный лицензированной вакциной против N. meningitidis серогруппы В. В некоторых воплощениях, лицензированная вакцина против менингококковых капсульных полисахаридов N. meningitidis серогруппы А, С, W-135 и Y представляет собой MENVEO. В некоторых воплощениях лицензированная вакцина против N. meningitidis серогруппы В представляет собой TRUMENBA.

Описание относится к способу индукции иммунного ответа у человека любого возраста. В некоторых воплощениях возраст человека составляет по меньшей мере 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель. Например, в предпочтительном воплощении возраст человека составляет по меньшей мере 6 недель. Как известно в данной области техники, конъюгатная вакцина менингококковой группы А, С, W-135 и Y, такая как NIMENRIX®, подходит для младенцев, начиная с шестинедельного возраста, и может быть назначена любому человеку в возрасте от шести недель и старше. В некоторых воплощениях возрасте человека составляет по меньшей мере 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев или 12 месяцев. Например, в предпочтительном воплощении возраст человека составляет по меньшей мере 12 месяцев. В одном воплощении возрасте человека составляет от 12 до 18 месяцев. В другом аспекте описание относится к способу индукции иммунного ответа у пациента в возрасте по меньшей мере 18 месяцев. В одном воплощении возраст человека составляет от 18 до 24 месяцев. В еще одном аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа у пациента в возрасте по меньшей мере 24 месяца. В одном воплощении возраст человека составляет от 24 месяцев до 10 лет. В другом аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа у пациента в возрасте 10 лет и более.

В некоторых воплощениях возрасте человека составляет от 10 лет до 25 лет. В некоторых воплощениях возраст человека составляет от 10 до 26 лет. В некоторых воплощениях возраст человека составляет от 12 до <18 месяцев. В некоторых воплощениях возраст человека составляет от 18 до <24 месяцев. В некоторых воплощениях возраст человека составляет от 18 до <24 месяцев. В некоторых воплощениях возраст человека составляет от ≥24 месяцев до <10 лет.

В некоторых воплощениях возраст человеку составляет по меньшей мере 16 лет. В таких воплощениях способ включает введение одной дозы человеку, предпочтительно не более одной дозы человеку в возрасте по меньшей мере 16 лет. В некоторых воплощениях возраст человека составляет не более 17 лет.

В некоторых воплощениях, возрасте человека составляет от 10 до 12 лет. В таких воплощениях способ включает введение человеку по меньшей мере одной дозы. В предпочтительном воплощении вторую дозу вводят человеку примерно через 6 месяцев после первой дозы. В предпочтительном воплощении способ включает введение первой дозы и второй дозы композиции человеку в возрасте от 10 до 12 лет, а третью дозу композиции вводят человеку по меньшей мере через четыре года после первой дозы.

В некоторых воплощениях способ включает введение по меньшей мере двух доз человеку. В предпочтительном воплощении две дозы разделяют по меньшей мере примерно 6 месяцев. В предпочтительном воплощении способ включает введение первой дозы и второй дозы композиции человеку в возрасте от 10 до 12 лет, а третью дозу композиции вводят человеку по меньшей мере через четыре года после первой дозы.

В некоторых воплощениях способ включает введение первой дозы композиции человеку в возрасте примерно 11 лет и введение по меньшей мере двух доз композиции человеку по меньшей мере через четыре года после первой дозы. В некоторых воплощениях способ включает введение второй и последующих доз композиции примерно через пять лет после первой дозы.

В некоторых воплощениях человек является серонегативным к N. meningitidis серогруппы А. В некоторых воплощениях человек является серонегативным к N. meningitidis серогруппы С. В некоторых воплощениях человек является серонегативным к N. meningitidis серогруппы W. В некоторых воплощениях человек является серонегативным к N. meningitidis серогруппы Y. В некоторых воплощениях человек является серонегативным к капсульным полисахаридам N. meningitidis серогруппы А, С, W-135 и Y.

В некоторых воплощениях человек является серопозитивным к N. meningitidis серогруппы А. В некоторых воплощениях человек является серопозитивным к N. meningitidis серогруппы С. В некоторых воплощениях человек является серопозитивным к N. meningitidis серогруппы W. В некоторых воплощениях человек является серопозитивным к N. meningitidis серогруппы Y. В некоторых воплощениях человек является серопозитивным к капсульным полисахаридам N. Meningitides серогруппы А, С, W-135 и Y.

В одном воплощении способ включает введение человеку по меньшей мере одной дозы вышеописанной композиции. В предпочтительном воплощении способ включает введение человеку не более одной дозы вышеописанной композиции. В другом воплощении способ включает введение человеку по меньшей мере первой дозы и второй дозы вышеописанной композиции.

В одном воплощении вторую дозу вводят по меньшей мере через 20, 30, 50, 60, 100, 120, 160, 170 или 180 суток после первой дозы и не более чем через 250, 210, 200 или 190 суток после первой дозы. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона.

В другом воплощении вторую дозу вводят примерно через 30 суток после первой дозы. В другом воплощении вторую дозу вводят примерно через 60 суток после первой дозы, как, например, при 0, 2-месячном графике иммунизации. В другом воплощении вторую дозу вводят примерно через 180 суток после первой дозы, как, например, при 0, 6-месячном графике иммунизации. В еще одном воплощении вторую дозу вводят примерно через 120 суток после первой дозы, как, например, при 2, 6-месячном графике иммунизации.

В одном воплощении, способ включает введение человеку двух доз композиции и не более двух доз. В одном воплощении две дозы вводят в пределах периода примерно 6 месяцев после первой дозы. В одном воплощении способ не включает дополнительное введение бустер-инъекции человеку. "Бустер", при использовании в настоящем описании изобретения, относится к дополнительному введению композиции человеку. Введение человеку не более двух доз композиции может быть более целесообразным. Такая целесообразность включает, например, облегчение соблюдения человеком полного графика введения и содействие экономической эффективности графика.

В одном воплощении первую дозу и вторую дозу вводят человеку с интервалом примерно 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 суток, и не более чем 400, 390, 380, 370, 365, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210 или 200 суток после первой дозы. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона. Предпочтительно, первую и вторую дозу вводят по меньшей мере с интервалом в 4 недели, например ≥8 недель, ≥2 месяцев, ≥3 месяцев, ≥6 месяцев, и т.д.

В одном воплощении первую и вторую дозу вводят человеку за период примерно 30 суток. В другом воплощении первую и вторую дозу вводят человеку за период примерно 60 суток. В другом воплощении первую и вторую дозу вводят человеку за период примерно 180 суток.

Для удобства первую дозу можно вводить практически одновременно (например, во время той же консультации или визита к медицинскому работнику или в пределах 24 часов после первой дозы менингококковой вакцины) с другой вакциной, например вводить по существу в то же самое время, что и вакцину против вируса гепатита В, вакцину против дифтерии, вакцину против столбняка, вакцину против коклюша (либо клеточной, либо предпочтительно бесклеточной), вакцину против Haemophilus influenzae тип b, вакцину против Streptococcus pneumoniae и/или вакцину против полиомиелита (предпочтительно инактивированную полиовирусную вакцину). Каждая из этих возможно совместно вводимых вакцин может быть моновалентной вакциной или может быть частью комбинированной вакцины (например частью вакцины DTP (дифтерия, столбняк, коклюш)).

Для удобства вторую дозу можно вводить практически в то же время (например, во время той же консультации или визита к медицинскому работнику или в пределах 24 часов после введения второй дозы менингококковой вакцины), что и другую вакцину например, практически в то же время, что и вакцину против вируса гепатита В, вакцину против дифтерии, вакцину против столбняка, вакцину против коклюша (либо клеточную, либо предпочтительно бесклеточную), вакцину против Haemophilus influenzae тип b, вакцину против Streptococcus pneumoniae и/или вакцину против полиомиелита (предпочтительно инактивированную полиовирусную вакцину), вакцину против гриппа, вакцину против ветряной оспы, вакцину против кори, вакцину против свинки и/или вакцину против краснухи. Каждая из этих совместно вводимых вакцин может быть моновалентной вакциной или может быть частью комбинированной вакцины (например частью вакцины MMR).

Для удобства третью дозу можно вводить практически в то же время (например, во время той же консультации или визита к медицинскому работнику или в пределах 24 часов после введения третьей дозы менингококковой вакцины), что и другую вакцину, например практически в то же время, что и вакцину против вируса гепатита В, вакцину против дифтерии, вакцину против столбняка, вакцину против коклюша (либо клеточную, либо предпочтительно бесклеточную), вакцину против Haemophilus influenzae тип b, вакцину против Streptococcus pneumoniae и/или вакцину против полиомиелита (предпочтительно инактивированную полиовирусную вакцину), вакцину против гриппа, вакцину против ветряной оспы, вакцину против кори, вакцину против свинки и/или вакцину против краснухи. Каждая из этих совместно вводимых вакцин может быть моновалентной вакциной или может быть частью комбинированной вакцины (например частью вакцины MMR).

В одном воплощении трехголовый график введения композиции индуцирует бактерицидный титр против нескольких штаммов, экспрессирующие LP2086 (fHBP), гетерологичные по отношению к первому и/или второму полипептиду, у большего процента людей, чем двух дозовый график.

В одном воплощении способ включает введение человеку трех доз композиции. В другом воплощении, способ включает введение не более трех доз композиции. В одном воплощении три дозы вводят в пределах периода примерно 6 месяцев после первой дозы. В одном воплощении способ включает введение бестарной дозы человеку после третьей дозы. В другом воплощении способ не включает введение бестарной дозы человеку после третьей дозы. В другом воплощении способ, кроме того, не включает введения четвертой или бестарной дозы композиции человеку. В другом воплощении человеку вводят не более трех доз в течение периода примерно 6 месяцев.

В примерном воплощении вторую дозу вводят примерно через 30 суток после первой дозы, а третью дозу вводят примерно через 150 суток после второй дозы, как, например, при 0, 1, 6-месячном графике иммунизации. В другом типичном воплощении вторую дозу вводят примерно через 60 суток после первой дозы, а третью дозу вводят примерно через 120 суток после второй дозы, как, например, при 0, 2, 6-месячном графике иммунизации.

В одном воплощении первую дозу, вторую дозу и третью дозу вводят человеку в течение периода примерно 150, 160, 170 или 180 суток, и не более 240, 210, 200 или 190 суток. Любое минимальное значение может быть объединено с любым максимальным значением, описанным в настоящем описании изобретения, для определения диапазона. Предпочтительно, первую дозу, вторую дозу и третью дозу вводят человеку в течение периода, составляющего примерно 180 суток или 6 месяцев. Например, вторую дозу можно вводить человеку примерно через 60 суток после первой дозы, а третью дозу можно вводить человеку примерно через 120 суток после второй дозы. Соответственно, примерный график введения включает введение дозы человеку в примерно 0, 2 и 6 месяцев.

Как описано выше, человеку может быть введено несколько доз иммуногенной композиции, и количество дней между каждой дозой может варьировать. Преимущество такого способа включает, например, гибкость соблюдения человеком графика введения.

В одном воплощении способ включает введение человеку не более трех доз идентичной иммуногенной композиции. Например, в предпочтительном воплощении способ не включает введение человеку первой дозы первой композиции, введение человеку второй дозы второй композиции и введение человеку третьей дозы третьей композиции, где первая, вторая и третья композиции не идентичны. В другом воплощении способ включает введение человеку не более четырех доз идентичных иммуногенных композиций.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры иллюстрируют воплощения изобретения. Если в данном описании изобретения не указано иное, в следующих Примерах упоминается MnB бивалентная rLP2086 композиция, с величиной дозы 120 мкг бивалентной rLP2086 композиции, которая является предпочтительным типичным воплощением композиции, включающей: 60 мкг первого липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, на 0,5 мл дозу, 60 мкг второго липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, на 0,5 мл дозу, молярное соотношение полисорбата-80 к первому полипептиду, составляющее 2,8, молярное соотношение полисорбата-80 ко второму полипептиду, составляющее 2,8, 0,5 мг Al³⁺/мл композиции, 10 мМ гистидина и 150 мМ хлорида натрия.

Более конкретно, исследуемая бивалентная рекомбинантная rLP2086 вакцина с величиной дозы 120 мкг включает (а) 60 мкг первого липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) 60 мкг второго липидированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) 18 мкг полисорбата-80; (г) 250 мкг алюминия; (д) 780 мкг гистидина, и (е) 4380 мкг хлорида натрия. Каждая доза имеет объем 0,5 мл.

Если в настоящем описании изобретения не указано иное, в следующих Примерах упоминается композиция MenACWY-TT, которая является предпочтительным типичным воплощением тетравалентной менингококковой полисахаридной конъюгированной композиции, которая включает капсульные полисахариды А, С, W-135 и Y Neisseria meningitidis, каждый из которых соединен с столбнячным анатоксином в качестве белка-носителя. Полисахариды Neisseria meningitidis серогрупп А и С конъюгированы с адипин-дигидразидным (АН) спейсером и опосредованно конъюгированы со столбнячным анатоксином, в то время как полисахариды W-135 и Y конъюгированы непосредственно со столбнячным анатоксином. Композиция не содержит консервантов или адъювантов.

Более конкретно, лиофилизированная композиция MenACWY-TT, описанная в примерах ниже, включает 5 мкг полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, конъюгированного с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина; 5 мкг полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, конъюгированного с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина; 5 мкг полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы W-135, конъюгированного с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина; 5 мкг полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y, конъюгированного с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина; 28 мг сахарозы; 97 мкг трометанола на дозу (0,5 мл).

ПРИМЕР 1: КОМПОЗИЦИЯ MenABCWY

Конечную композицию MenABCWY получают путем восстановления флакона лиофилизированного лекарственного продукта MenACWY-TT (описанного в Примере 2 ниже) с помощью 0,67 мл MnB бивалентного rLP2086 лекарственного продукта (описанного в Примере 3 ниже), чтобы отобрать 0,5 мл дозы вакцины MenABCWY для внутримышечной инъекции. Все компоненты, используемые для получения вакцины MenABCWY, а также их функции представлены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1

Композиция вакцины MenABCWY

Ингредиенты Количество/доза MnB rLP2086 подсемейства A (SEQ ID NO: 1) 60 мкг MnB rLP2086 подсемейства B (SEQ ID NO: 2) 60 мкг конъюгат MenAAH-TT
(среднее соотношение TT/полисахарид: ~3) 5 мкг MenA
~15 мкг TT

конъюгат MenCAH-TT
(среднее соотношение TT/полисахарид: ~3) 5 мкг MenC
~15 мкг TT конъюгат MenW-TT
(среднее соотношение TT/полисахарид: ~1,5) 5 мкг MenW
~7,5 мкг TT конъюгат MenY-TT
(среднее соотношение TT/полисахарид: ~1,3) 5 мкг MenY
~6,5 мкг TT Tris-HCl 97 мкг Хлорид натрия^a 4,69- 4,71 мг Сахароза 28 мг L-Гистидин 0,78 мг Полисорбат 80 (PS80) 0,02 мг Фосфат алюминия 0,25 мг алюминия Вода для инъекции сколько требуется до 0,5 мл

^a Концентрация хлорида натрия в вакцине MenABCWY может варьировать от 160,5 до 161,1 мМ, на основе состава партий клинического и коммерческого лекарственного

средства NIMENRIX (DP).

MenABCWY представляет собой комбинированный продукт, содержащий одну дозу лиофилизированного MenACWY-TT в 2 мл стеклянном флаконе типа 1, неградуированный 1 мл типа I стеклянный стандартный предварительно заполненный шприц (PFS), содержащий MnB бивалентную rLP2086 суспензию для разбавления и 13 мм адаптер для флакона.

Лиофилизированный лекарственный продукт MenACWY-TT восстанавливают посредством прикрепления прилагаемого адаптера для флакона к флакону с лиофилизированным продуктом и присоединения к адаптеру для флакона PFS с MnB бивалентной rLP2086 композицией. Этот процесс предназначен облегчить асептическую доставку MnB суспензии из PFS во флакон и последующий перенос восстановленной вакцины из флакона в PFS для введения. После восстановления содержимое флакона извлекают в тот же шприц через адаптер для флакона. Адаптер для флакона отсоединяют от шприца, и иглу прикрепляют к PFS для внутримышечной (РМ) инъекции. PFS с MnB бивалентной rLP2086 композицией разработан так, чтобы иметь более высокий объем заполнения, чем TRUMENBA (~0,67 мл в отличие от теперешнего 0,57 мл), что гарантирует доставку целевого объема дозы (0,5 мл) конечной вакцины (MenABCWY).

Конечная вакцинная композиция включает белки rLP2086 подсемейства А и В, приготовленные в количестве 120 мг/мл/под семейство, очищенные капсульные полисахариды Neisseria meningitidis серогрупп А, С, W и Y в концентрации 10 мг/мл/тип, конъюгированные со столбнячным анатоксином в соотношении ~ 1:3, ~ 1:3, ~ 1:1.5, ~ 1:1.3 соответственно, в 10 мМ гистидина, 1,2 мМ Трис-буфер, 160,5 - 161,1 мМ хлорида натрия, 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия (AIPO4), 1,35 мг/мл полисорбата-80 и 56 мг/мл сахарозы

ПРИМЕР 2: ОПИСАНИЕ И КОМПОЗИЦИЯ MnB БИВАЛЕНТНОГО rLP2086 ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРОДУКТА

MnB бивалентный rLP2086 лекарственный продукт представляет собой стерильную жидкую композицию, состоящую из белков rLP2086 подсемейства А и В, приготовленных в количестве 120 мкг/мл/подсемейства в 10 мМ гистидиновом буфере, 150 мМ хлорида натрия (NaCl) при рН 6,0 с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия (AlPO₄). Полисорбат 80 (PS-80) добавляют к лекарственному веществу для получения целевого молярного соотношения PS-80 к белку. Следовательно, PS-80 не добавляют во время изготовления лекарственного продукта, но он присутствует в конечном лекарственном продукте в таком же соотношении. Лекарственным продуктом заполняют 1 мл шприцы. Одна доза вакцины составляет 0,5 мл без консервантов.

Влияние концентрации Полисорбата 80

Полисорбат 80 (PS-80) представляет собой неионное поверхностно-активное вещество. Он используется для стабилизации и солюбизации белков MnB rLP2086 подсемейства А и В в композиции посредством предотвращения агрегации и адсорбции, которые могут быть вызваны температурой, контактом с фильтром, трубками, контейнером/заглушкой, и процессом смешивания. Изучение стабильности с использованием in vitro анализа активности на основе моноклональных антител показало нестабильность белка подсемейства В при высоких молярных соотношениях PS-80 к белку MnB rLP2086 в конечной композиции. Эксперименты с различными молярными соотношениями PS-80 к белку показали, что оптимальное молярное соотношение PS-80 к белку MnB rLP2086 составляет примерно 1,4 - 4,2 для сохранения активности.

ПРИМЕР 3: ОПИСАНИЕ И СОСТАВ КОМПОЗИЦИИ MenACWY-TT

Лекарственный продукт MenACWY-TT состоит из очищенных полисахаридов Neisseria meningitidis серогрупп А, С, W и Y, каждый из которых конъюгирован со столбнячным анатоксином (ТТ) в соотношениях к полисахариду ~3, ~3, ~1,5 и ~1,3 соответственно.

Лекарственный продукт MenACWY-TT представлен в виде лиофилизированного порошка, помещенного в 3 мл стеклянный флакон с пробкой из бромбутиловой резины, подходящей для лиофилизации, и развальцованного алюминиевого колпачка. Все компоненты, используемые в изготовлении лекарственного продукта MenACWY-TT и их функции представлены в Таблица 3.

ПРИМЕР 4: ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОЗИЦИИ MenABCWY

Конечную композицию MenABCWY готовят в клинике путем восстановления флакона с лиофилизированным лекарственным продуктом MenACWY-TT с помощью 0,67 мл MnB бивалентной rLP2086. Полученная композиция MenABCWY (вакцинный жидкий лекарственный продукт) содержит белки rLP2086 подсемейства А и В в количестве 120 мкг/мл/подсемейство, очищенные полисахариды Neisseria meningitis типов А, С, W и Y в концентрации 10 мкг/мл/тип, конъюгированные со столбнячным анатоксином в соотношении ~3, ~3, ~1,5 и ~3 соответственно, в 10 мМ гистидине и 1,6 мМ трис-буфер, содержащий 160,5-161,1 мМ хлорида натрия, 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия (AlPO₄), 0,035 мг/мл полисорбата 80 и 56 мг/мл сахарозы при рН 6,05 для внутримышечной инъекции.

Вакцину MenABCWY готовят путем смешивания двух лекарственных продуктов, MenACWY-TT и MnB бивалентный rLP2086. Компоненты буфера и эксципиенты были выбраны на основе индивидуальной разработки каждого компонента и было показало, что они обеспечивают необходимый профиль стабильности для пролонгированного срока хранения.

Были проведены исследования по подтверждению дозы, чтобы показать, что лекарственный продукт MenACWY-TT и MnB бивалентный rLP2086 лекарственный продукт совместимы при смешивании вместе для введения вакцины MenABCWY и что все лекарственные продукты и вводимые растворы совместимы с компонентами, необходимыми для введения, и что растворы для введения стабильны в вводимых компонентах в течение периода времени, достаточного для выполнения операций по приготовлению дозы и введению. Стабильность вакцины MenABCWY, полученной посредством восстановления лекарственного продукта MenACWY-TT с помощью 0,67 мл MnB бивалентного rLP2086 лекарственного продукта в течение времени нахождения при температуре окружающей среды и освещенности была подтверждена в восстановленном флаконе и дозировочном шприце.

Образцы, представляющие дозированные растворы вакцины MenABCWY, были протестированы с использованием методов определения стабильности, таких как RP-HPLC для связывания антигена и чистоты, анализ активности Bioplex, ELISA и ICP-MS (масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой), с предопределенными критериями приемлемости. Результаты этого исследования показали приемлемую стабильность вакцины MenABCWY в течение 24 часов при комнатной температуре и освещенности.

ПРИМЕР 5: ОЦЕНКА ВАКЦИНЫ MenABCWY

Было проведено исследование, чтобы оценить, имеется ли приемлемая физическая совместимость и кратковременная стабильность при восстановлении лиофилизированной композиции MenACWY-TT с помощью MnB бивалентной rLP2086 композиции. Лиофилизированная композиция MenACWY-TT и жидкая MnB бивалентная rLP2086 композиция были объединены и хранились в течение 24 часов в условиях неконтролируемой комнатной температуры для приближения к реальным условиям. Было показано, что лиофилизированная композиция MenACWY-TT может быть восстановлена с помощью жидкой MnB бивалентной rLP2086 композиции при щадящем ручном перемешивании, а комбинированное значение рН и осмоляльность находились в пределах типичного диапазона для инъекции. Все ключевые признаки конъюгатов и белков были аналогичны контрольным в течение вплоть до 24 часов в условиях неконтролируемой комнатной температуры.

Физическую совместимость оценивали путем оценки рН, внешнего вида, легкости восстановления и осмоляльности комбинированного лекарственного продукта. Стабильность антигенов оценивали посредством определения концентрации, чистоты и относительной антигенности in vitro (IVRA) белков rLP2086 подсемейства А и подсемейства В, а также концентраций конъюгированных менингококковых полисахаридов А, С, Y и W-135 посредством ELISA.

Примеры 5-15 показали, что комбинация лиофилизированной композиции MenACWY-TT и жидкой MnB бивалентной rLP2086 композиции, то есть композиция MenABCWY, была признана совместимой и стабильной в течение по меньшей мере 24 часов при комнатной температуре.

ELISA для определения концентраций полисахарида Mening А, С, Y и W-135 в композиции MenABCWY- Разработка ELISA для Mening А, С, Y и W-135 и скрининг pAb для обнаружения

Шесть антител были отобраны для скрининга для использования в анализах ELISA. Каждую из четырех групп по десять кроликов иммунизировали одним из конъюгатов Men А, С, Y или W-135 полисахарида с ТТ, затем после выработки антител кроликов обескровливали. Каждый кролик был индивидуально проверен с использованием Men А, С, Y или W-135 полисахаридов, конъюгированных с белком-носителем CRM197, в отношении связывания и специфичности. Сыворотка кролика была проверена на положительный сигнал связывания, который эквивалентен показателю поглощения, которые более чем в три раза превышают фоновое поглощение. Кроме того, сыворотку кролика проверяли на низкое неспецифическое связывание, которое представляло любой показатель поглощения для комбинаций сыворотки без антигена, вторичное или превышающее показание поглощения для контрольной пробы, а также низкую перекрестная реактивность, которая представляла собой любые показатель поглощения для гетерологичных серотипов, которые превышали фоновое поглощение. Кролики, которые соответствовали критериям отбора, были объединены. Диапазон стандартной кривой был установлен с помощью CRM конъюгатов и подтвержден с помощью, восстановленной лиофилизированной MenACWY-TT композиции.

Установлена осуществимость количественного определения конъюгатов А, С, Y и W в комбинированном лекарственном продукте (композиции MenABCWY). Установлено, что MnB бивалентная rLP2086 композиция сама по себе не обнаруживалась в анализе. Кроме того, при солюбилизации фосфата алюминия в образцах композиции MenABCWY, было получено полное извлечение конъюгатов. Кроме того, было определено, что MnB бивалентная rLP2086 композиция не влияет на количественное определение MenACWY-TT конъюгатов посредством ELISA.

ПРИМЕР 6: Определение пригодности методов оценки MnB бивалентной rLP2086 композиции в присутствии композиции MenACWY-TT

IEX-HPLC оценивали на ее пригодность для определения концентрации белков подсемейства А и В MnB бивалентной rLP2086 композиции в присутствии композиции MenACWY-TT. Оценивали результаты по общему белку и связанному белку для MnB бивалентной rLP2086 композиции в присутствии и в отсутствии композиции MenACWY-TT.

ПРИМЕР 7: Оценка чистоты и соотношения пиков MnB бивалентной rLP2086 композиции в присутствии композиции MenACWY-TT

RP-HPLC оценивали на ее пригодность для определения чистоты MnB бивалентной rLP2086 композиции в присутствии композиции MenACWY-TT. Сравнивали показатели чистоты MnB бивалентной rLP2086 композиции в присутствии и отсутствии композиции MenACWY-TT. Наложенные хроматограммы показаны на Фиг. 2 патента US 10183070. Пример интегрирования пика примеси показан в виде вставки на Фиг. 2 патента US 10183070. Результаты оценки показывают, что присутствие композиции MenACWY-TT не препятствует оценке чистоты MnB бивалентной rLP2086 композиции с использованием метода RP-HPLC.

ПРИМЕР 8: Оценка MnB бивалентной rLP2086 композиции в присутствии композиции MenACWY-TT с помощью метода IVRA

Метод IVRA оценивали на его пригодность для определения относительной антигенности белков MnB бивалентной rLP2086 композиции подсемейства A (SEQ ID NO: 1) и подсемейства В (SEQ ID NO: 2) in vitro в присутствии композиции MenACWY-TT.

Сравнивали результаты IVRA для белков MnB бивалентной rLP2086 композиции подсемейства А и подсемейства В в присутствии и в отсутствии композиции MenACWY-TT. Результаты оценки пригодности показали, что в пределах вариабельности анализа, результаты сопоставимы и, что присутствие композиции MenACWY-TT не препятствует определению относительной антигенности in vitro.

ПРИМЕР 9: Восстановление флаконов с композицией MenACWY-TT с помощью MnB бивалентной rLP2086 композиции

Лекарственные продукты, композицию MenACWY-TT и MnB бивалентную rLP2086 композицию, получали с использованием флаконов с композицией MenACWY-TT, восстановленных с помощью лекарственного продукта - MnB бивалентной rLP2086 композиции. Флаконы с композицией MenACWY-TT восстановленные либо физиологическим раствором, либо плацебо композиции MenACWY-TT, использовали в качестве контроля в зависимости от метода.

Определение объема физиологического раствора для восстановления композиции MenACWY-TT

Упаковка коммерческого продукта NFMENRIX® содержит флакон, содержащий лиофилизированную композицию MenACWY-TT, и шприц, содержащий 0,9% физиологический раствор, используемый для восстановления. Чтобы воспроизвести конечную NFMENRIX® концентрацию в коммерческой вакцине после восстановления с помощью MnB бивалентной rLP2086 композиции, необходимо определить количество физиологического раствора, дозируемого с использованием шприца из коммерческого продукта. Этот же объем MnB бивалентной rLP2086 композиции затем используют во всех исследованиях восстановления.

Растворение флаконов композиции MenACWY-TT с помощью MnB бивалентной rLP2086 композиции

MnB бивалентная rLP2086 композицию объединяли в 10 мл стеклянном флаконе. Примерно 800 мкл раствора было загружено в 1 мл шприц. Скорректированное содержимое шприца вводили во флакон, содержащий композицию MenACWY-TT. Флакон перемешивали вращением для растворения содержимого.

рН и внешний вид определяли в дублирующих образцах композиции MenABCWY. Осмоляльность измеряли в трех параллелях композиции MenACWY-TT, восстановленной физиологическим раствором, и композиции MenACWY-TT, восстановленной с помощью MnB бивалентной rLP2086 композиции.

ПРИМЕР 10: SEC-MALLS (метод гель-хроматографии с детекцией многоуглового лазерного рассеивания) для оценки стабильности полисахаридов Mening А, С, Y и W-135 в DP Matrix.

Полисахариды Mening А, С, Y и W-135 использовались в качестве косвенных доказательств для оценки того, можно ли ожидать какой-либо нестабильности конъюгированных менингококковых полисахаридов А, С, Y и W-135 в комбинированном лекарственном продукте (композиция MenABCWY).

Обработка Полисахаридов Mening А, С, Y и W-135

Приготовление реагента (матрица полного буфера композиции MenABCWY)

2,24 г сахарозы и 7,8 мг Трис (Трометамин) добавляли к 20 мл матрицы буфера 2Х MnB бивалентной rLP2086 композиции с белками MnB rLP2086 (20 мМ гистидина, рН 6,0, 300 мМ NaCl, 0,07 мг/мл PS 80, 1 мг/мл (8 мМ) AlPO₄, белки rLP2086 подсемейства A (SEQ ID NO: 1) и подсемейства В (SEQ ID NO: 2) по 240 мг/мл каждого).

Приготовление образца

Каждый Mening полисахарид растворяли 1:1 с помощью полной матрицы буфера композиции MenABCWY и инкубировали в течение 0, 6 и 24 часов при 5°С, 25°С и 37°С. После инкубации суспензию образца центрифугировали в течение 1 минуты при 14 000 об/мин. Супернатант анализировали с помощью SEC-MALLS.

ПРИМЕР 11: Стабильность композиции MenABCWY - определение рН, внешнего вида и осмоляльности комбинированных композиций MnB бивалентная rLP2086 композиция и MenACWY-TT

рН и внешний вид комбинированной MnB бивалентной rLP2086 композиции и MenACWY-TT композиции, то есть композиции MenABCWY, оценивали немедленно после восстановления и еще раз через 24 часа.

Все результаты соответствовали ожидаемым (Таблица 6).

Средняя осмоляльность композиции MenACWY-TT, восстановленной MnB бивалентной rLP2086 композицией, находилась в пределах 3% от средней осмоляльности композиции MenACWY-TT, растворенной с помощью физиологического раствора.

ПРИМЕР 12: Концентрации конъюгатов полисахаридов Mening А, С, Y и W-135 в комбинированном лекарственном продукте

Концентрацию конъюгатов Mening А, С, Y и W-135-TT в композиции MenABCWY оценивали сразу после приготовления и повторно через 24 часа. Концентрации четырех конъюгатов были стабильными в течение 24 часового периода (Таблица 8).

ПРИМЕР 13: Оценка стабильности MnB бивалентных rLP2086 белков в композиции MenABCWY

Концентрация общих и связанных белков rLP2086 подсемейства A (SEQ ID NO: 1) и подсемейства В (SEQ ID NO: 2) в комбинированном лекарственном продукте

Образцы композиции MenABCWY анализировали с помощью IEX-HPLC для определения концентрации белков. Как показано в Таблица 9, общий белок, связанный белок (с алюминием), и % связанных MnB бивалентных rLP2086 Подсемейства A (SEQ ID NO: 1) и Подсемейства В (SEQ ID NO: 2) белков (связанных с алюминием) не меняется в течение 24 часов, указывая на то, что белки rLP2086 Подсемейства А и Подсемейства В являются стабильными в течение 24-часового периода.

ПРИМЕР 14: Чистота белка rLP2086 и отношение пиков в комбинированной композиции MenABCWY

Образцы композиции MenABCWY анализировали с помощью RP-HPLC для определения чистоты и соотношения пиков для белков rLP2086. Смотрите Фиг. 3 патента US 10183070. Пик, соответствующий 11,9 мин исключен из расчета чистоты.

IVRA белка rLP2086 Подсемейства А и Подсемейства В в комбинированном лекарственном продукте

IVRA образцов композиции MenABCWY оценивали вплоть до 24 часов после смешивания. Было определено, что относительная антигеннность белков rLP2086 Подсемейства A (SEQ ID NO: 1) и Подсемейства В (SEQ ID NO: 2) в композиции MenABCWY является стабильной в течение 24-часового периода.

ПРИМЕР 15: Стабильность полисахаридов Mening А, С, Y и W-135 в полной буферной матрице композиции MenABCWY посредством SEC-MALLS

Стабильность Mening A PS в полной буферной матрице композиции MenABCWY, определенная посредством SEC-MALLS через 6 и 24 часа инкубации при различных температурах

Полисахариды Mening А, С, W и Y смешивали с полной буферной матрицей композиции MenABCWY и оценивали стабильность с помощью SEC-MALLS после инкубации при 5°С, 25°С и 37°С в течение 24 часов. Все четыре полисахарида оказались стабильными вплоть до 24 часов при 5°С и 25°С.Некоторую деградацию наблюдали при 37°С для Mening А и Y. Степень деградации не удалось определить для полисахаридов Mening Y из-за образования агрегатов с высокой Mw при всех испытанных условиях, кроме начальных

ПРИМЕР 16: Оценка иммуногенности Neisseria meningitidis серогруппы В Mn пентавалентной и Trumenba® вакцин на мышах CBA/J.

Иммунный ответ на Neisseria meningitidis серогруппы В fHBP после вакцинации с помощью либо бивалентной Mn В fHBP вакцины, вакцины Trumenba, либо бивалентной Mn В fHBP вакцины, изготовленной с четырехвалентной ACWY полисахаридной конъюгатной вакциной (Mn Пентавалентная ABCWY), оценивали в модели с мышами СВА/J. Группы мышей СВА/J иммунизировали 3 разными вакцинами: пентавалентной (ABCYW), Trumenba® (MnB) и Nimenrix® (ACYW) (Таблица 11).

Каждую группу мышей СВА/J (25/группа) подкожно иммунизировали, вводя в загривок 2-кратно разведенную соответствующую вакцину (Таблица 11). Мышей примировали вакциной во время 0 и производили бустер-инъекцию на 2 неделе. Сыворотку собирали PD2 на 3-й неделе для тестирования с использованием двух разных сывороточных бактерицидных анализов, в которых использовался человеческий комплемент (hSBA). В одном hSBA использовали штамм, экспрессирующий fHBP подсемейства А (М98250771), и в другом - штамм, экспрессирующий fHBP подсемейства В (CDC1127).

С помощью hSBA измеряли антителозависимую, комплемент-опосредованную бактерицидную активность против штаммов N meningitidis серогруппы В. В кратком изложении, тестируемую сыворотку в соответствующем разведении смешивали в 96-луночном микротитрационном планшете для анализа со свежеприготовленными бактериальными культурами штаммов N meningitidis В (подсемейства А или В) и комплементом человека. Планшеты для анализа помещали на орбитальный шейкер и перемешивали в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе (37°С/5% СО₂). Затем аликвоты аналитической реакционной смеси из каждой лунки переносили на 96-луночные фильтрующие планшеты для подсчета выживших бактерий.

Уровни ответа на вакцинацию рассчитывали, как процент мышей в каждой группе дозирования (n=25), которые отвечали в hSBA. При тестировании с заранее определенным уровнем разведения, образцы сыворотки мыши, которые убивают ≥ 50% Т₃₀ контрольных менингококковых бактерий, считаются отвечающими. Контрольные лунки Т₃₀ содержали бактерии и комплемент, но не содержали тестируемой сыворотки и учитывались в конце 30-минутной инкубации при анализе.

Таблица 12 и Смотрите соответствующие уровни дозы в Таблица 11 Таблица 13 показаны сравнимые дозозависимые показатели ответа, индуцированные либо TRUMENBA®, либо Mn пентавалентной композицией для штаммов обоих подсемейств А и В N meningitidis серотипа В. Как и ожидалось, NFMENRIX™ не индуцировал функционального иммунного ответа на штаммы Mn В.

ПРИМЕР 16: Исследование для описания иммуногенности, безопасности и переносимости бивалентной rLP2086-содержащей пентавалентной вакцины (MenABCWY) у здоровых субъектов в возрасте от ≥10 до <26 лет (В1971057)

В1971057 представляет собой исследование фазы 2 для проверки концепции (РОС) для оценки безопасности и иммуногенности Penta у здоровых субъектов в возрасте от ≥10 до <26 лет. Исследование было начато в апреле 2017 года с примерно 530 субъектами, получившими Penta.

Менингококковые вакцины лицензировали посредством иммунологической имитации, сывороточный бактерицидный анализ с использованием человеческого комплемента (hSBA), который демонстрировал способность иммунных сывороток убивать менингококковые штаммы, которые представляют серогруппы, включенные в вакцину. Для MenACWY ответов, один штамм из каждой серогруппы оценивали с помощью hSBA анализов и ответы Penta сравнивали с лицензированной ACWY вакциной MENVEO. Для оценки MenB; были протестированы 4 штамма серогруппы В, которые также использовали во время исследований для лицензирования TRUMENBA

Данные исследования показали, что Penta не уступает Menveo после 1 вакцинации для оценки ACWY, и Penta не уступает Trumenba после 2 вакцинаций для оценки В.

Исследуемая вакцина Penta

Для этого исследования исследуемыми продуктами являются бивалентный rLP2086 (TRUMENBA), (Penta; описанная в Примере 1 и Примере 4 выше), MenACWY-CRM (MENVEO) и плацебо.

Дизайн исследования

В1971057 представляет собой фазу 3 рандомизированного, активно контролируемого, слепого для наблюдателя, многоцентрового исследования, в котором примерно 1590 субъектов были случайным образом распределены для получения либо Penta и плацебо (физиологический раствор), или Trumenba (Pfizer), и Menveo (GSK). Все субъекты не получали никакой вакцины против какой-либо менингококковой группы В перед включением в исследование. Рандомизация была стратифицирована по предшествующей истории вакцинации; ~ 50% ACWY-наивных субъектов и ~ 50% получавших ACWY (получивших 1 предварительную дозу вакцины, содержащую 1 или более групп ACWY за ≥4 года до даты рандомизации). Эта опытная группа ACWY была включена, потому что в США 86% подростков получают дозу ACWY вакцины в возрасте примерно 11 лет и должны получать бустерную дозу в возрасте 16 лет. Рандомизация также была стратифицирована по географическому региону. Примерно 80% субъектов из исследовательских центров США и примерно 20% субъектов из Европы. Региональная стратификация обеспечивала достаточную представленность населения. Исследование проводили в 2 этапа. Этап 1, который в настоящее время завершен, включал фазу вакцинации первичными сериями. График визитов для этапа 1 отмечен в Таблица 14 ниже. На этапе 2 оценивали стойкость иммунитета и бустерную дозу, введенную примерно через 4 года после завершения первичной серии Penta.

Для оценки иммунного ответа функциональные антитела были проанализированы в hSBA с менингококковыми штаммами групп А, В, С, W, и Y. Анализ hSBA определяет антитела в человеческой сыворотке, которые приводят к комплемент-зависимой гибели целевого менингококкового штамма. Для оценки иммунного ответа на Trumenba или В-компонент Penta, 4 первичных MnB тестируемых штаммов, РМВ80 (А22), РМВ2001 (А56), РМВ2948 (В24) и РМВ2707 (В44), использовали в hSBA для определения конечных критериев иммуногенности в этом исследовании. Для оценки иммунного ответа на MENVEO и ACWY компоненты Penta, тестируемые штаммы, специфичные для каждой из ACWY групп были идентифицированы и квалифицированы в hSBA до начала тестирования. Валидированные анализы, используемые для оценки MenB, были такими же, как использованные для лицензирования TRUMENBA.

Цели

Данное исследование было предназначено для описания безопасности, переносимости и иммуногенности Penta и описания иммунного ответа на группы А, В, С, W и Y после введения Penta, или Trumenba и Menveo, лицензированной в США менингококковой (группы А, С, W-135 и Y) конъюгатной вакцины. Nimenrix не использовали в качестве препарата для сравнения ACWY; она не лицензирована в США.

Иммуногенность компонента MenACWY вакцины Penta была основана на hSBA средних геометрических титрах (GMT) Penta после одиночной дозы, по сравнению с hSBA GMT, наблюдаемыми для Trumenba + Menveo после 1 дозы.

Авторы провели эту оценку для субъектов, которые ранее не получали дозу вакцины MenACWY (ACWY- наивные субъекты), в дополнение к субъектам, которые получат вторую бустерную дозу MenACYW (ACWY-обученные субъекты). Критерий РОС для MenACWY компонента Penta должен быть удовлетворен у ACWY-наивных субъектов.

Критерий иммуногенности MenB компонента Penta основан на достижении точечных оценок 4-кратного увеличения и составных hSBA ответов после 2 доз Penta, вводимых согласно 0-, 6-месячному графику, который предсказывает соответствие LCI критерию 3 фазы, установленному для 0,6-месячного графика.

Вторичные конечные критерии для этого исследования включали стандартные оценки "не хуже контроля" соотношения 2 GMT с 2,0-кратной границей и процентом отвечающих для В компонента Penta. Анализ процента отвечающих выполняли путем определения ответчика как достигающего ≥4-кратного повышения hSBA титра и составного ответа через 1 месяц после вакцинации 2 для первичных штаммов MenB и последующего расчета разницы между Penta и Trumenba. Разница не должна превышать 10% для достижения успеха.

Иммунный ответ на Penta и РОС результаты по иммуногенности

Исследование В1971057 показывает далее, в отношении бактерицидных ответов против MenACWY между Penta и Menveo: подобные hSBA GMT для компонентов ACWY наблюдались для субъектов, которые получали Penta по сравнению с Menveo, после единичной дозы. 1,5-кратное GMT соотношение границы "не хуже контроля" (NI) было достигнуто у ACWY-наивных субъектов (Таблица 15) и 2,0-кратное GMT соотношение NI границы было достигнуто у ACWY-обученных субъектов (Таблица 16).

Trumenba была лицензирована на основании доли субъектов, достигающих 4-кратного увеличения (и составного ответа) титров антител, которые соответствовали предварительно заданному нижнему пределу границы доверительного интервала (LCI). При оценке 4-кратных антительных ответов на них могут влиять фоновые титры в популяции, которые могут независимо влиять на долю субъектов, имеющих 4-кратный ответ на вакцину. Кроме того, используемые анализы hSBA содержат биологические компоненты, которые даже при строгом контроле могут влиять на абсолютные критерии ответа от исследования до исследования. Принимая во внимание, что лицензионные пороги LCI были рассчитаны на основании точечных оценок, достигнутых в другой популяции и с использованием других источников комплемента, авторы изобретения также сравнили ответы Penta серогруппы В с ответами групп Trumenba + Menveo. Результаты представлены в Таблица 17.

Для трех из 4 тестируемых штаммов серогруппы В 4-кратное повышение SBA и составные ответы значительно превышают предварительно установленные точечные оценки. Для одного штамма, РМВ80(А22), 75,8% субъектов достигали 4-кратного повышения титров (для группы Trumenba точечная оценка (РЕ) составляла 73,8), по сравнению с РОС критерием РЕ, равным 78,1%; однако, как указано выше, критерии 95% LCI сложнее контролировать в разных популяциях и во времени. Исследование фазы 2 использовали для создания LCI для этого РОС исследования, включающего европейскую популяцию, где исходный уровень hSBA для А22 составлял 22,1%. Поскольку РЕ вакцины Penta была выше, чем РЕ вакцины Trumenba, предполагают, что не было иммунного вмешательства компонента MenB вакцины Penta. В подтверждение этой точки зрения, вторичный анализ конечной точки показал, что Trumenba + Menveo не уступают Penta в 2 анализах "не хуже контроля". Действительно, они удовлетворяли жесткой 1,5 GMR границе "не хуже контроля" (Таблица 18) и анализу процента отвечающих с 5% границей (Таблица 19).

ПРИМЕР 17: Потенциальное влияние на здоровье населения США пентавалентной вакцины, нацеленной на Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С, W и Y

Цель: Оценить возможность дополнительных сокращений случаев PMD (иммуноопосредованных заболеваний) среди населения США при различных ограничениях режимов вакцинации и уровней соблюдения режима лечения для пентавалентной вакцины.

Сценарии Вакцинации

Четыре сценария первичной вакцинации анализировали и сравнивали с установленными случаями, предотвращенными благодаря текущим рекомендациям, и уровнями соблюдения режима лечения (Фиг. 1)

1. Замена вакцин MenACWY/MenB в возрасте 16 лет вакциной Penta и сохранение MenACWY в возрасте 11 лет

2. Замена вакцин MenACWY/MenB в возрасте 11 лет и 16 лет вакциной Penta

3. Замена MenACWY/MenB в возрасте 16 лет вакциной Penta и отсутствие вакцинации MenACWY в возрасте 11 лет

4. Замена MenACWY в возрасте 11 лет 2 дозами Penta и MenACWY/MenB в возрасте 16 лет 1 дозой Penta

Охват вакциной для каждого из режимов варьировался для оценки влияния разных рекомендаций на снижение общих уровней IMD.

Оценки снижения заболеваний были основаны на опубликованных в 2018 году оценках охвата иммунизацией подростков в США

- 86,6% получили ≥1 дозы MenACWY

- 68,1% всех подростков получили ≥1 дозы HPV

- 50,8% получили ≥2 доз MenACWY

- 17,2% получили ≥1 дозы MenB

- Охват 2-ой дозой в 2-дозовых сериях в возрасте 16 лет предполагался равным 50% охвата 1-ой дозой и 70% в возрасте 11 лет.

Результаты

С нынешними уровнями охвата и режимов вакцинации, которые требуют в общей сложности 4 инъекций, считают, что вакцины MenACWY и MenB предотвращают 178 случаев PMD за 10 лет, по сравнению с предположительным отсутствием вакцинации совсем. Замена вакцинаций MenACWY или/и MenB вакциной Penta исключает по меньшей мере 1 инъекцию; предполагая, что охват иммунизацией в возрасте 16 лет остается аналогичным текущему охвату вакциной MenACWY, предполагается, что вакцина Penta предотвращает аналогичное или большее количество случаев PMD (Фиг. 3).

Две дозы Penta в возрасте 11 лет и 1 доза Penta в возрасте 16 лет (сценарии 10-12) могут предотвратить большинство случаев (вплоть до 282), по сравнению с другим режимом вакцинации с сопоставимым уровнем охвата. Одна доза Penta в возрасте 11 лет и 2 дозы Penta в возрасте 16 лет (сценарии 4-6) могут предотвратить вплоть до 251 случая.

С немного более высоким охватом 2ой дозой Penta, чем текущий уровень охвата MenB в возрасте 16 лет, аналогичное число случаев PMD может быть предотвращено одной дозой вакцины MenACWY в возрасте 11 лет и 2 дозами Penta в возрасте 16 лет (сценарий 3) или 2 дозами Penta в возрасте 16 лет (сценарий 8, см. Фиг. 1).

Заключение

Влияние стратегии вакцинации на заболевания непосредственно связано с полученным уровнем охвата. Замена одной или более доз вакцин MenACWY или MenB вакциной Penta может еще больше уменьшить IMD, вызванные всеми 5 менингококковыми серогруппами;

Уменьшить число введений вакцины для подростков;

Потенциально улучшить соблюдение рекомендациям АСГР (Консультативного комитета по проблемам вакцинации), уменьшить визиты ко врачу и стоимость реагирования здравоохранения на отдельные случаи IMD.

Инвазивное менингококковое заболевание (IMD), вызванное Neisseria meningitidis, является необычной, быстро прогрессирующей и потенциально смертельной инфекцией с наивысшей заболеваемостью, наблюдаемой в возрастных группах младенцев и подростков. Число заболеваний, вызванных серогруппами А, В, С, W и Y, составляет 94% во всем мире; в США большинство заболеваний вызвано серогруппами В, С и Y. Согласно данным эпиднадзора в 2018 году в Соединенных Штатах заболеваемость IMD составляла 0,10 случаев на 100 000 человек. Серогруппа В преобладала среди подростков и молодых людей США (62% случаев среди 16-23-летних), а также среди всех возрастных групп (36% случаев).

Консультативный комитет США по методам иммунизации (ACIP) в настоящее время рекомендует 2 типа менингококковых вакцин для защиты подростков от IMD. Четырехвалентную менингококковую вакцину серогрупп А, С, W и Y (MenACWY), как правило, рекомендуют в качестве первичной дозы в возрасте от 11 до 12 лет и бестарной дозы в возрасте 16 лет. Вакцинация против менингококковой серогруппы В (MenB) рекомендуется для подростков и молодых людей в возрасте от 16 до 23 лет (предпочтительно 16-18 лет) на основе коллективного клинического принятия решений. В 2018 году установлено, что охват вакцинации MenACWY для подростков в возрасте 13-17 лет составлял 86,6% для ≥1 дозы и 50,8% для ≥2 доз. Напротив, только 17,2% 17-летних получили ≥1 дозы вакцины MenB, а менее 50% этих субъектов завершили серии мультидозовой вакцинации. На основании этих данных можно предположить, что многие подростки в Соединенных Штатах не полностью защищены от менингококкового заболевания.

Одна вакцина, которая может помочь защитить от менингококкового заболевания, вызванного всеми 5 серогруппами (то есть пентавалентная вакцина MenABCWY), вместо 2 отдельных вакцин MenB и MenACWY с разными схемами вакцинации может упростить иммунизацию, уменьшить число необходимых инъекций и в результате улучшить охват вакцинацией. Авторы изобретения разработали модель для оценки влияния на общественное здравоохранение различных программ менингококковой иммунизации с использованием пентавалентной вакцины MenABCWY.

2.0 МЕТОДЫ

2.1 Описание модели

Для оценки ожидаемого числа случаев PMD, предотвращенных за 10-летний период в Соединенных Штатах, была разработана популяционная динамическая модель. Структура модели аналогична той, которая была полностью описана ранее в другом источнике. Популяция была стратифицирована на 101 возрастную группу одного года, и субъекты в каждой возрастной группе переходили в следующую возрастную группу в следующем году. Менингококковое носительство являлось основным источником передачи инфекционного заболевания и было основным фактором в модельных расчетах. Менингококковое носительство и передача были смоделированы путем стратификации населения на 10 взаимоисключающих возрастных групп (0-5 месяцев, 6-12 месяцев, 1 год, 2-4 года, 5-9 лет, 10-14 лет, 15-19 лет, 20-24 года, 25-59 лет и ≥60 лет). Каждая возрастная группа характеризовалась долей субъектов, которые были носителями менингококковых серогрупп А, В, С, W и Y и имели зависимые от возраста вероятность развития IMD и передачи бактерий в пределах своей возрастной группы или в другие возрастные группы. Долю менингококковых носителей в каждой из 10 возрастных групп за каждый год рассчитывали на основе 1) распространенности передачи в предыдущем году; 2) картин передачи и смешивания бактерий внутри возрастных групп и между ними; 3) количества вакцинированных субъектов (охват вакцинации); и (4) эффективности вакцины против восприимчивости к носительству. Во время каждого года 10-летнего периода времени в рамках модели, оценивали доли субъектов в целевых возрастных группах для получения вакцин MenACWY, MenB и/или MenABCWY согласно 4 разным схемам. Для всех схем вакцинации в модели было установлено, что субъекты, у которых развивалось IMD, либо выздоравливали с осложнениями или без них, либо умирали.

2.2 Исходные данные для построения модели

Средние показатели заболеваемости PMD на основе возрастных групп для каждой серогруппы были получены из отчетов Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) по менингококковым заболеваниям за 2015-2017 гг. Предполагалось, что вакцина MenABCWY обеспечивает прямую защиту против серогрупп А, В, С, W и Y.

Предположения об эффективности вакцины против серогруппы В у подростков, получавших 1 или 2 дозы вакцины MenABCWY, были основаны на опубликованном клиническом исследовании для вакцины MenB-FHbp (Trumenba®, бивалентная rLP2086; Pfizer Inc, Philadelphia, PA). В этом исследовании процент субъектов с сывороточной бактерицидной активностью в анализах с использованием титров комплемента человека (hSBA) ≥1:8 (стандартный коррелят защиты составляет ≥1:4) через 1 месяц после вакцинации варьировал от 23,8% до 67,6% и от 69,1% до 100% после 1 или 2 доз MenB-FHbp соответственно. На основании этих данных предполагались оценки эффективности вакцины против серогруппы В, составляющие 30% и 85% для подростков, получавших 1 или 2 дозы вакцины MenABCWY соответственно.

Предположения об эффективности вакцины против серогрупп А, С, W и Y были основаны на обзоре опубликованной иммуногенности и данных об эффективности клинических исследовании вакцины MenACWY-TT (Nimenrix®, Pfizer Ltd, Sandwich, UK), у которых процент субъектов с бактерицидной активностью сыворотки в анализах с использованием кроличьего комплемента (rSBA) или титров hSBA ≥1:8 через 1 месяц после вакцинации находился в диапазоне от 81,9% до 97,4% после 1 дозы MenACWY-TT. На основе этих данных предполагалась 95% эффективность вакцины против серогрупп А, С, W и Y.

Косвенная защита невакцинированных лиц за счет снижения распространенности носительства и передачи предполагалась на уровне 0% для серогруппы В и 36,2% для серогрупп А, С, W и Y, где оба значения получены из опубликованной литературы по вакцинам MenB и MenACWY.

5-летняя продолжительность защиты и показанный фиксированный 10% годовой темп ослабления для вакцины MenABCWY против серогруппы В, были приняты на основе соображений (1) ранее опубликованных экономических моделей здравоохранения и (2) клинических данных фазы 3 расширенного исследования у подростков, в котором оценивалось сохранение иммунного ответа, вызванного вакциной MenB-FHbp. Результаты клинического исследования показали, что уровни ответов достигали максимума после первичной вакцинации, снижалась в течение последующих 12 месяцев, а затем оставалась стабильными выше исходного уровня через 48 месяцев. Через 48 месяцев после первичной вакцинации от 18,0% до 61,3% субъектов имели титры hSBA, превышающие или равные нижней границе количественной оценки (то есть 1:16 или 1:8 в зависимости от штамма) по 4 различным штаммам серогруппы В, используемым для оценки широты защиты.

Для оценки защиты вакциной MenABCWY против серогрупп А, С, W и Y (Таблица 2), 5-летняя продолжительность прямой защиты и 10% годовой уровень ослабления были консервативными предположениями, основанными на клинических данных исследований, которые оценивали сохранение иммунного ответа, вызванного MenACWY-TT у подростков и взрослых в возрасте от 11 до 55 лет в течение 10 лет после первичной вакцинации. Через 10 лет от 70,2% до 90,7% вакцинированных субъектов имели rSBA титры ≥1:8 для серогрупп А, С, W и Y по сравнению с диапазоном от 99,7% до 100% через 1 месяц после вакцинации. В настоящее время нет данных о продолжительности косвенной защиты и уровнях ослабления для лицензированных вакцин MenACWY; таким образом, на основании модели можно предположить, что уровни снижения для MenACWY были равны MenABCWY.

2.3 Схемы вакцинации и анализы чувствительности

Схемы вакцинации были построены на основе существующей в США подростковой менингококковой платформы вакцинации (т.е. в возрасте 11 и 16 лет). Четыре схемы первичной вакцинации были изучены и их сравнивали с текущей схемой: (1) 1 доза вакцины MenACWY в возрасте 11 лет и 2 дозы вакцины MenABCWY в возрасте 16 лет; (2) 1 доза вакцины MenABCWY в возрасте 11 лет и 2 дозы вакцины MenABCWY в возрасте 16 лет; (3) только 2 дозы вакцины MenABCWY в возрасте 16 лет; и (4) 2 дозы вакцины MenABCWY в возрасте 11 лет и 1 доза в возрасте 16 лет.

Предположения об охвате вакцинацией для каждой первичной схемы были взяты из наблюдаемого охвата вакцинацией подростков, возраста вакцинирования и количества необходимых доз, как сообщалось в Национальном обследовании иммунизации подростков 2018 года (NIS-Teen). В соответствии с тенденциями, наблюдавшимися в исследовании NIS-Teen, охват вакцинацией среди подростков в возрасте 11 лет предполагался более высоким, чем в возрасте 16 лет, и соблюдение режима терапии (то есть полное выполнение рекомендуемой серии дозирования) с 2-дозовыми сериями в возрасте 11 лет предполагалось более высоким, чем соблюдение режима терапии с 2-дозовыми сериями в возрасте 16 лет.

Для анализа базового сценария охват вакцинацией для первой дозы в возрасте 11 лет предполагался таким же, как и общий охват первой дозой вакцины MenACWY, о котором сообщалось в 2018 году (86,6%), а охват вакцинацией для первой дозы в возрасте 16 лет предполагался таким же, как охват бестарной дозой MenACWY (50,8%). На основании этих данных предполагалось, что 80% подростков в возрасте 11 лет, получивших первую дозу MenABCWY, завершат 2-дозовую серию, тогда как соблюдение режима терапии с 2-дозовыми сериями в возрасте 16 лет предполагалась равным 50% на основе имеющейся информации о завершении серии вакцины MenB. Анализы чувствительности проводили для схем введения каждой из 4 менингококковых вакцин с использованием уровней охвата вакциной подростков в возрасте 16 лет, представленного в 2018. Самый высокий предполагаемый охват был таким же, что и охват для ≥1 дозы вакцины от вируса папилломы человека (HPV) (68,1%) в возрасте 11-12 лет, и наименьший предполагаемый охват был таким же, что и охват для ≥1 дозы вакцины MenB (17,2%) в возрасте 16 лет. После рассмотрения схем первичного дозирования и оценок охвата вакцинации, оценивали в общей сложности 13 разных схем.

3.0 РЕЗУЛЬТАТЫ

С текущей схемой вакцинации и представленным охватом вакцинации в 2018 году (MenACWY, 86,6% в возрасте 11 лет и 50,8% в возрасте 16 лет; MenB, 17,2% в возрасте 16 лет), вакцинация 2 дозами каждой вакцины MenACWY и MenB, в общей сложности 4 инъекции в возрасте от 11 до 16 лет, может потенциально предотвратить 165 случаев FMD в течение следующих 10 лет по сравнению с отсутствием менингококковой вакцинации (текущий сценарий). При таком сценарии установлено, что 19 случаев серогруппы В (11,5% от общего числа предотвращаемых случаев FMD) будут предотвращены в течение следующих 10 лет. Замена или MenACWY и/или MenB вакцин пентавалентной вакциной MenABCWY устранит 1 или 2 инъекции в зависимости от схемы вакцинации и потенциально предотвратит большее число случаев FMD (сценарии 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11). Это при условии, что охват вакцинацией MenABCWY для возраста 16 лет остается аналогичным охвату вакцинации MenACWY 2018 года (50,8%; сценарии 1, 4, 7 и 10) или возможно небольшое увеличение охвата вакцинации HPV, наблюдаемой для возраста 11-12 лет (68,1%; сценарии 2, 5, 8 и 11).

Однако предполагаемый охват вакцинацией MenABCWY в возрасте 16 лет, который является таким же, что и в случае текущей 2-дозовой схемы MenB вакцинации в возрасте 16 лет (17,2%), 1-дозовой схемы MenABCWY в возрасте 11 лет и 2-дозовой в возрасте 16 лет (то есть аналогично текущей схеме) предотвратит меньше случаев FMD (n=137) по сравнению с текущей схемой вакцинации (Фиг. 2, сценарий 6). Эти результаты, в основном, обусловлены предположением о более низком охвате вакцинацией MenACWY, чем в настоящее время сообщается для возраста 16 лет, что приводит к снижению установленного числа предотвращенных случаев для серогрупп А, С, W и Y (n=89; 65,0%) по сравнению с текущей схемой.

3.1 Базовые предположения об охвате вакцинацией

Во всех базовых сценариях вакцинации (сценарии 1, 4, 7 и 10) предполагаемый охват MenABCWY вакцинацией является таким же, что и текущий охват для вакцины MenACWY в возрасте 11 лет (86,6%) или возрасте 16 лет (50,8%), замена или MenACWY и/или MenB вакцин пентавалентной вакциной MenABCWY предотвратит большее число случаев FMD, чем текущая схема (в диапазоне 189-256 предотвращенных случаев FMD, в зависимости от схемы). Большее число предотвращенных случаев от общего числа случаев FMD по сравнению с текущей схемой вакцинации, в основном обусловлено большим числом предотвращенных случаев для серогруппы В (в диапазоне 55-111 случаев для серогруппы В). Среди всех оцененных сценариев базового случая вакцинации предотвращение заболевания будет максимизировано путем введения 2 доз вакцины MenABCWY в возрасте 11 лет и 1 дозы для возраста 16 лет (сценарий 10; 256 предотвращенных случаев [111 серогруппы В; 146 серогрупп А, С, W и Y]).

3.2 Анализ чувствительности на основе альтернативных охватов вакцинацией

Если охват вакцинацией MenABCWY в возрасте 16 лет поднимается до уровней, наблюдаемых для вакцины FIPV в возрасте 11-12 лет (68,1%), наибольшее влияние на предупреждение менингококковых заболеваний будет обеспечено 2 дозами вакцины MenABCWY в возрасте 11 лет и 1 дозой в возрасте 16 лет (сценарий 11; 299 предотвращенных общих случаев). Эта схема также предупреждает наибольшее число и процент случаев серогруппы В из общих предупреждаемых случаев на период 10 лет (140 предотвращенных случаев серогруппы В [46,8%]). Следующая лучшая схема представляет собой 1 дозу вакцины MenABCWY в возрасте 11 лет и 2 дозы вакцины MenABCWY в возрасте 16 лет (сценарий 5; 263 предотвращенных случаев; 103 серогруппы В; 159 серогрупп А, С, W и Y). Кроме того, аналогичное число случаев будет предотвращено с включением или без включения рекомендуемой в настоящее время дозы MenACWY в возрасте 11 лет (сценарий 2 [234 предотвращенных случаев; 74 серогруппы В; 159 серогрупп А, С, W и Y] и 8 [220 предотвращаемых случаев; 74 серогруппы В; 146 серогрупп А, С, W и Y]). Напротив, схемы, где предполагалось, что охват вакцинацией MenABCWY является таким же, как в случае текущей 2-дозовой схемы вакцинации MenB в возрасте 16 лет (17,2% для ≥1 дозы), приводит к гораздо меньшему количеству установленных предотвращенных случаев FMD, главным образом из-за меньшего числа предотвращенных случаев серогруппы В (сценарии 3, 6, 9 и 12). При таком предполагаемом охвате вакцинацией, самое низкое число из общего числа предотвращенных случаев FMD будет при схеме 2 вакцины MenABCWY в возрасте 16 лет (сценарий 9, 93 общих предотвращенных случаев [19 серогруппы В; 74 серогрупп А, С, W и Y]).

4.0 ОБСУЖДЕНИЕ

Это первое исследование, насколько нам известно, которое моделирует влияние пентавалентной MenABCWY вакцины на защиту против менингококкового заболевания, вызванного 5 наиболее распространенными болезнетворными серогруппами (т.е. серогруппой А, В, С, W и Y) в контексте американской платформы иммунизации подростков против менингококковой инфекции. Во всем мире различные моновалентные, бивалентные или четырехвалентные менингококковые вакцинные композиции, которые нацелены на разные комбинации этих 5 серогрупп, используются для защиты от менингококковой инфекции. В ряде стран в рамках предпринимаемых усилий по эпиднадзору были выявлены изменения в циркулирующих болезнетворных менингококковых серогруппах; эти эпидемиологические сдвиги привели к изменениям в некоторых национальных стратегиях вакцинации, чтобы включить MenACWY вакцины для комплексной защиты от FMD. Задействование вакцины MenABCWY потенциально защитит от 94% случаев FMD во всем мире, которые, по оценкам, вызваны этими 5 серогруппами.

В Соединенных Штатах MenACWY вакцинация подростков рекомендуется с 2005 года, а рекомендации по MenB вакцинации были введены в действие в 2015 году. Одна пентавалентная MenABCWY вакцина может упростить схемы иммунизации, устраняя необходимость в множественных инъекциях с использованием 2 разных вакцин в разном возрасте, потенциально улучшая охват вакцинацией и усиливая защиту от наиболее распространенных болезнетворных серогрупп. Основываясь на текущей схеме и охвате вакцинацией для вакцин MenACWY и MenB в Соединенных Штатах, данная модель устанавливает, что вакцинация и MenACWY, и MenB вакцинами может потенциально предотвратить 165 случаев FMD в течение 10 лет по сравнению с отсутствием вакцинации. Предполагая, что охват MenABCWY вакцинацией аналогичен текущему охвату MenACWY вакцинацией, указанному в исследовании CDC NIS-Teen от 2018 года, по оценкам нашей модели, замена одной или более доз вакцины MenACWY или MenB вакциной MenABCWY приведет к предотвращению не менее 256 случаев FMD среди подростков США при одновременном сокращении рекомендуемого числа инъекций вакцины. Фактически, большинство сценариев, проверенных в этом исследовании, демонстрируют дополнительную выгоду одной вакцины MenABCWY с точки зрения большего количества предотвращаемых случаев по сравнению с текущей схемой.

Иммунизация подростков является сложной задачей, отчасти потому, что показатели профилактических посещений - когда обычно происходят иммунизации - неуклонно снижаются после 16 лет, и в сочетании с переходом от педиатров к медицинским работникам, которые, как правило, менее вовлечены в иммунизацию подростков, это может способствовать неоптимальной защите от заболевания в этой возрастной группе. Возрастная платформа для MenABCWY вакцинации будет поддерживать и содействовать иммунизации подростков, позволяя вводить вакцину в возрасте, когда подростки с большей вероятностью получают и соблюдают многодозовые режимы, и уменьшать количество инъекций и посещений. Важно отметить, что иммунизация подростков конъюгатными вакцинами MenACWY и рекомбинантными вакцинами на основе белка MenB вызывает защитные иммунные реакции после первичной вакцинации и устойчивые реакции после бестарной дозы. Вместе эти данные не только поддерживают существующую в США платформу иммунизации подростков MenACWY и MenB, но и поддерживают гибкий график вакцинации MenABCWY, где подростки могут начать серию вакцинации в любой момент в возрасте от 11 до 16 лет и поддерживать защиту в течение периода наибольшего риска.

Исследования показали, что социально-экономический статус, образование и раса также играют роль в информированности о вакцинации, доступе и использовании, а также в показателях завершения серий вакцинации. Таким образом, вакцина MenABCWY может помочь уменьшить эти диспропорции путем упрощения рекомендаций по менингококковой вакцинации, тем самым уменьшая проблемы доступа к вакцинам и устраняя путаницу вокруг существующих рекомендаций по вакцинам MenB и MenACWY. Кроме того, было показано, что комбинированные вакцины в общем случае улучшают охват вакцинацией среди различных возрастных групп.

ПРИМЕР 18: Широта человеческого иммунного ответа на TRUMENBA: Краткое описание вариантов fHBP, экспрессируемых штаммами MenB, восприимчивыми в hSBA

Введение и цели: TRUMENBA (бивалентная rLP2086), вакцина для предупреждения заболевания, вызванного Neisseria meningitis серогруппы В (MenB), включает два белковых антигена, варианты менингококкового фактор Н-связывающего белка (fHBP). fHBP существует в виде двух подсемейств, А и В. В рамках каждого подсемейства было выявлено несколько сотен уникальных вариантов fHBP. Несмотря на такое разнообразие последовательностей, было продемонстрировано, что вакцина, содержащая один белок из каждого подсемейства, индуцирует широкий охват штаммов MenB, которые представляют собой разнообразие вариантов fHBP. Лицензирование было основано на способности вакцины индуцировать антитела, которые инициируют комплемент-опосредованное уничтожение инвазивных штаммов MenB в сывороточном бактерицидном анализе с использованием человеческого комплемента (hSBA). Из-за эндемической природы менингококковой инфекции невозможно предсказать, каким вариантам fHBP могут подвергаться субъекты. По этой причине авторы изобретения продолжают изучать охват, обеспечиваемый TRUMENBA, и представляют здесь дополнительные доказательства, иллюстрирующие широту иммунного охвата.

Материалы и методы: Инвазивные штаммы MenB (n=109) были выбраны для подтверждения широты охвата TRUMENBA. Штаммы, кодируемые 22 и 16, представляли собой уникальные варианты fHBP подсемейства А и подсемейства В соответственно. Экспрессию fHBP на бактериальной поверхности определяли с использованием проточного цитометрического анализа Экспрессии Менингококкового Поверхностного Антигена (MEASURE). Исследовательские hSBA выполняли с использованием сыворотки молодых людей до и после вакцинации (соответствующих субъектов). Штамм считался восприимчивым к иммунной сыворотке TRUMENBA, если между образцами сыворотки до и после вакцинации было достигнуто 4-кратное повышение титра hSBA.

Результаты: Из 109 штаммов 87 (почти 80%) были восприимчивы к иммунной сыворотке TRUMENBA в hSBA. Это включает штаммы, экспрессирующие fHBP варианты А02, А28, А42, А63, А76, В05, В07, В08, В13, В52 и В107, в дополнение к вариантам, о которых сообщалось ранее. Большинство штаммов, которые не могли быть убиты, имели уровни экспрессии fHBP, которые были ниже уровня, считающегося достаточным для инициирования бактерицидного уничтожения в hSBA. См. Фиг. 3, Таблицу 1, Таблицу 2 и Таблицу 3.

Заключение: hSBA признан косвенным доказательством эффективности для менингококковых вакцин. Сложность анализа предупреждает демонстрацию бактерицидной активности иммунной сыворотки TRUMENBA против MenB штаммов, которые экспрессируют каждую из сотен уникальных последовательностей вариантов fHBP. Чтобы проиллюстрировать широту иммунного охвата, обеспечиваемую TRUMENBA, авторы изобретения показали, что штаммы MenB, экспрессирующие дополнительные различные варианты fHBP могут быть убиты в hSBA, несмотря на гетерологичность по отношению к вакцинным антигенам.

ПРИМЕР 19: Выбор различных штаммов для оценки широкого охвата двухвалентной FHbp вакцины против менингококка В

Хотя передача Neisseria meningitidis обычно приводит к бессимптомной колонизации верхних дыхательных путей, у некоторых людей наблюдается бактериемия и возникает инвазивное менингокковое заболевание (FMD). FMD обычно представлено как менингит и/или септицемия; пневмония, септический артрит, эпиглотит и воспаление среднего уха наблюдаются реже. Высокий уровень фатального исхода связан с FMD (10%-15%), и примерно 20% выживших имеют серьезные пожизненные последствия такие как ампутация конечностей, потери слуха и неврологическое нарушение

Почти все менингкоковые заболеваний во всем мире вызвано 6-ю из 12 охарактеризованных менингококковых серогрупп (то есть А, В, С, W, X и Y). Эффективные вакцины на основе капсульных полисахаридов были разработаны для серогрупп А, С, W и Y. Однако иммуногенность полисахарида MenB является слабой из-за сходства со структурами на основе полисиаловой кислоты, присутствующими на нейрональных клетках человека. В последние годы, в частности, менингококковая серо группа В (MenB) была связана с большой долей FMD в Европе, Соединенных Штатах, Канаде, Австралии и Новой Зеландии. Хотя вакцины, основанные на везикулах внешней мембраны (OMV) успешно использовались для контроля эпидемий, вызванных внезапной вспышкой одного штамма MenB, сгенерированный иммунный ответ преимущественно направлен против высоковариабельного белка-порина А (PorA). Следовательно, эффективность, как правило, ограничена целевым штаммом. Следовательно, велся поиск поверхностных белков, способных индуцировать защитные бактерицидные антитела в различных штаммах MenB, для разработки широкоэффективной MenB вакцины.

Фактор Н-связывающий белок (FHbp; также известный, как LP2086 и GNA1870), консервативный поверхностный липопротеин, экспрессируемый почти на всех штаммах MenB, был определен в качестве такой мишени. На основе аминокислотной последовательности, варианты FHbp разделяются на 2 иммунологически различные подсемейства (называемые подсемейство А и подсемейство В); каждый MenB штамм экспрессирует один вариант подсемейства (см. Фиг. 1А)

MenB-FHbp (TRUMENBA®, бивалентный rLP2086; Pfizer Inc, Philadelphia, PA, USA) представляет собой бивалентную, рекомбинантную белковую MenB вакцину, состоящую из равных количеств 2 рекомбинантных липидированных FHbp антигенов, один из подсемейства А (вариант А05) и другой из подсемейства В (вариант В01).

Важно, что прогнозируется, что эта комбинация FHbp вариантов способна обеспечить защиту пролив против разных MenB штаммов. MenB-FHbp был одобрена для предупреждения FMD в нескольких странах и регионах, включая Соединенные Штаты, Канаду, Европу и Австралию. Другая вакцина MenB, MenB-4C (Bexsero®, 4CMenB; GlaxoSmithKline Vaccines, Sri, Siena, Italy), также имела рекомбинантный FHbp компонент (нелипидированный вариант 1.1 из подсемейства В), а также 2 других рекомбинантных белковых антигенов и OMV. Таким образом, MenB-4С отличается от MenB-FHbp, которая содержит два варианта одного антигена для обеспечения широкого охвата.

Сывороточный бактерицидный анализ с использованием человеческого комплемента (hSBA) измеряет комплемент зависимый, антитело-опосредованный лизис менингококковых бактерий. Титр hSBA определяют, как самое высокое разведение сыворотки, убивающее ≥50% анализируемых бактерий; титр hSBA ≥1:4 является признанным соотношением для защиты против менингококкового заболевания, и уровни hSBA ответа, основанные на этом соотношении, используют как косвенные доказательства эффективности менингококковой вакцины. Уровень hSBA ответа, в частности, коррелирует с естественной защитой для полисахаридных вакцин серогрупп С и А. Поскольку серогруппспецифические полисахариды не являются вариабельными, одного штамма из каждой серогруппы было достаточно для прогнозирования широкого охвата вакцины. MenB OMV вакцины также являются эффективными и индуцированные вакциной hSBA титры коррелировали с защитой против целевого штамма, вызывающего эпидемию. Точное прогнозирование охвата штаммов для белковых вакцин является более сложным с использованием hSBA, чем для вакцин, нацеленных на капсульные полисахариды, учитывая, что разнообразие последовательности белка и вариабельности уровней экспрессии различаются среди разных штаммов менингококковых заболеваний. Например, PorA представляет собой преобладающую мишень для сывороточных бактерицидных антител, обеспечивающих защиту после иммунизации OMV вакциной. PorA представляет собой порин клеточной поверхности, небольшая экспонированная область клеточной поверхности которого обладает высокой степенью разнообразия последовательности. Было установлено, что необходимо продемонстрировать защитный иммунитет со штаммами, экспрессирующими 20 разных PorA серосубтипов для защиты против примерно 80% случайных вызывающих MenB-заболевание штаммов в США. Исторически, OMV вакцины содержат 1 PorA и не демонстрируют защиту против штаммов с последовательностями PorA, которые гетерологичны по аминокислотной последовательности по сравнению с вакцинным антигеном. Следовательно, выбор репрезентативных тестируемых штаммов, для того чтобы продемонстрировать, что антитела, индуцированные вакциной, могут быть эффективными против штамма менингококковых заболеваний имеет первостепенное значение для белковых вакцин.

Иммунная сыворотка, индуцированная MenB-FHbp в доклинических и ранних клинических исследованиях, продемонстрировала широкий спектр бактерицидных антител, которые могут убивать разнообразные штаммы MenB, содержащие варианты FHbp подсемейства А и В, гетерологичные по отношению к вакцинным FHbp вариантам А05 и В01. В ранней оценке потенциальной широты охвата MenB-FHbp, 100 изолятов MenB с различными вариантами FHbp, географическим происхождением и генетическим фоном были протестированы в hSBA с использованием иммунной сыворотки кролика MenB-FHbp. Из 100 протестированных штаммов, 87 были убиты в этих hSBA. Анализ 13 штаммов, которые не были убиты, свидетельствует, что пороговой уровень экспрессии поверхностного FHbp на данном MenB штамме повлиял на ответ hSBA. Впоследствии определяли пороговый уровень экспрессии поверхностного FHbp, выше которого изоляты были предсказуемо убиты в hSBA. Дополнительные исследования потенциальных факторов, определяющих восприимчивость штамма, показали, что гибель в значительной степени не зависела от последовательности варианта FHbp, типа мультилокусной последовательности или субтипа PorA.

Для выбора штаммов с широким антигенным и эпидемиологическим разнообразием для клинических испытаний, более 1200 инвазивных изолятов MenB заболеваний были собраны из лабораторий и учреждений здравоохранения в Соединенных Штатах и Европе, чтобы представлять преобладание изолятов MenB, которые были актуальны на время сбора; все штаммы содержали ген FHbp. Беспристрастный подход был использован для выбора 4 антигенных и эпидемиологически разнообразных репрезентативных тестируемых штаммов для использования в исследованиях MenB-FHbp иммуногенности. Критерии селекции включали экспрессию вариантов FHbp, гетерологичных по отношению к антигенам вакцины и адекватно отражающих разнообразие FHbp в изолятах MenB заболеваний, от низкого до среднего уровни поверхностной экспрессии FHbp, и низкие базовые уровни серопозитивной реакции hSBA. Эти 4 первичных тестируемых MenB штаммов экспрессируют FHbp варианты обоих подсемейств FHbp (штамм [вариант]: РМВ2001 [А22], РМВ80 [А56], РМВ2707 [В24] и РМВ2948 [В44]; см. Фиг. 1А).

Чтобы дополнить данные по иммуногенности, полученные с использованием 4 первичных тестируемых штаммов MenB, и продемонстрировать, что иммунные ответы против 4 первичных тестируемых MenB штаммов являются прогностическими для иммунных ответов против разнообразных вариантов FHbp, экспрессируемых изолятами, вызывающими MenB заболевание, были разработаны hSBA-анализы с использованием 10 дополнительных тестируемых штаммов. 10 дополнительных тестируемых штаммов были отобраны так, чтобы включать распространенные варианты FHbp, обнаруженные в болезнетворных MenB штаммах в Соединенных Штатах и Европе. Здесь авторы изобретения (1) описывают стратегию и критерии, используемые для выбора 10 дополнительных тестируемых штаммов, и (2) представляют данные, демонстрирующие, что иммунные ответы, измеренные посредством hSBA с использованием 4 первичных штаммов MenB, являются прогностическими в отношении ответов, полученных с использованием 10 дополнительных тестируемых штаммов, что дополнительно демонстрирует и поддерживает широкий охват иммунного ответа, индуцированного MenB-FHbp.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Источники и критерии отбора для дополнительных тестируемых штаммов MenB

Девять из 10 дополнительных тестируемых штаммов MenB были получены из коллекции 1263 инвазивных болезнетворных штаммов MenB (коллекции изолятов MenB). Для коллекции изолятов MenB американские штаммы были получены из мест Активного эпидемиологического надзора за ключевыми бактериальными патогенами (2000-2005), охватывающими примерно 13% популяции. Европейские изоляты (2001-2006) были из лабораторий здравоохранения Норвегии, Франции, Чешской Республики и Агентства по охране здоровья в Манчестере (которое охватывает Англию, Уэльс и Северную Ирландию) и собирались систематически (каждый седьмой или восьмой изолят был включен по заказу, полученному в референс-лаборатории страны) и представляли собой примерно 13% инвазивных изолятов MenB за этот период. Штаммы, экспрессирующие FHbp вариант А07, были получены из продолжения коллекции изолятов MenB, которое включало еще 551 болезнетворный штамм MenB из Испании и Германии (n=1814). Расширенную коллекцию изолятов MenB использовали в качестве А07-экспрессирующих штаммов в коллекции изолятов MenB, которые не подходили из-за низкой поверхностной экспрессии FHbp на этих штаммах, высокой исходной серопозитивности и отсутствия легкодоступного источника комплемента.

Критерии, использованные для отбора дополнительных тестируемых штаммов MenB, были следующими: (1) превалирование варианта FHbp среди болезнетворных штаммов MenB в США и/или Европе, (2) вариант FHbp должен отличаться от тех, которые экспрессируются первичными тестируемыми штаммами MenB, (3) уровни экспрессии FHbp in vitro на медианных уровнях или ниже их для соответствующей группы вариантов FHbp для обеспечения того, чтобы штамм является репрезентативным для группы вариантов, к которой он принадлежит, (4) техническая совместимость в hSBA, и (5) считаться преобладающим клональным комплексом для группы вариантов (если бы существовал преобладающий комплекс). Штаммы, отвечающие этим критериям, также должны были быть технически совместимыми в hSBA, включая адекватную доступность подходящих партий человеческого комплемента (Фиг. 2). Штаммы в каждой группе вариантов FHbp с уровнями экспрессии ниже уровня отсечения (т.е. на медианных уровнях или ниже их для соответствующей группы вариантов FHbp) были выбраны случайным образом, причем первые штаммы в группе вариантов FHbp, отвечающие требуемым генетическим, фенотипическим и hSBA критериям расчета, стали дополнительными тестируемыми штаммами MenB. Исключение из этой методологии было сделано для штамма, экспрессирующего вариант FHbp В03, который был выбран совместно и с использованием руководства, предоставленного FDA США на основе его предыдущего использования в фазе 2 исследования.

Характеристики дополнительных тестируемых штаммов MenB 10 дополнительных выбранных тестируемых штаммов MenB экспрессируют FHbp варианты А06, А07, А12, А15, А19, А29, В03, В09, В15 и В16, которые отличаются от вариантов в 4 первичных тестируемых штаммах (А22, А56, В24, В44) и имеют разные последовательности по сравнению с вакцинными антигенами (Таблица 23). Специфические варианты, экспрессируемые 4 первичными тестируемыми штаммами, присутствуют в 42,0% (530/1263) болезнетворных изолятов в коллекции изолятов MenB, и специфические варианты, экспрессируемые 10 дополнительными тестируемыми штаммами, присутствуют в дополнительных, не перекрывающихся 38,8% (490/1263) болезнетворных изолятах в коллекции изолятов MenB (Фиг. 1В).

Анализ иммуногенности: Субъекты с титром hSBA≥LLOQ для 10 дополнительных штаммов

4 первичных штамма использовали для оценки серологических реакций после 2 или 3 доз MenB-FHbp у субъектов, участвующих в 2 ключевых исследованиях фазы 3 у подростков и молодых людей. Серологические ответы на 10 дополнительных штаммов hSBA оценивали в подгруппе исследуемых субъектов. Большинство субъектов имели hSBA ≥ нижнего предела количественной оценки (LLOQ; то есть титр hSBA, равный 1:8 или 1:16, в зависимости от штамма) через 1 месяц после дозы 2 и через 1 месяц после дозы 3 для каждого из первичных (64,0%-99,1% и 87,1%-99,5% соответственно) и 10 дополнительных штаммов MenB (51,6%-100,0% и 71,3%-99,3% соответственно) (с дополнительным увеличением после приема третьей дозы.

Таблица 24). Для первичных и дополнительных тестируемых штаммов MenB, существенное увеличение от исходного уровня доли субъектов, достигших титра hSBA≥LLOQ наблюдалось среди MenB-FHbp реципиентов (0, 2, 6-месячная схема) после второй дозы MenB-FHbp, с дополнительным увеличением после приема третьей дозы.

Положительные прогностические значения для первичных и дополнительных штаммов

Была оценена взаимосвязь между индуцированными вакциной hSBA ответами для первичных и 10 дополнительных тестируемых штаммов MenB (Таблица 25). В пределах FHbp подсемейства, положительные прогностические значения (PPV) были больше, чем 80% для большинства первичных/дополнительных пар штаммов через 1 месяц после дозы 3. Таким образом, иммунные ответы, измеренные в hSBA с использованием первичных тестируемых штаммов, были высокопрогностическими в отношении иммунных ответов для дополнительных штаммов в пределах того же подсемейства. Значения PPV через 1 месяц после дозы 2 обычно были немного ниже, чем наблюдаемые через 1 месяц после дозы 3 и варьировали от 61,6% до 100% и от 70,0% до 100% для пар штаммов подсемейства А и В соответственно, во всех исследованиях. В кратком изложении, все PPV показали высокую предсказуемость защитных реакций при сравнении реакций hSBA первичного и дополнительного штамма.

ОБСУЖДЕНИЕ

Критическим компонентом клинической оценки вакцины MenB-FHbp для определения широты защиты стала разработка hSBA с использованием тестируемых штаммов с поверхностными белковыми антигенами, последовательность и изменчивость экспрессии которых типична для разнообразных болезнетворных штаммов MenB, присутствующих на момент сбора коллекции. Как описано в исследованиях фазы 3 у подростков и молодых людей, данные ответа hSBA для 4 первичных тестируемых штаммов MenB, все из которых экспрессируют вариант FHbp, гетерологичный по отношению к антигенам вакцины, убедительно свидетельствуют о том, что двухвалентная вакцина MenB-FHbp обеспечивает широкий охват разнообразных болезнетворных штаммов менингококков. 10 дополнительных тестируемых штаммов MenB, описанных здесь, предоставляют подтверждающие иммунологические данные для MenB-FHbp и дополнительно подтверждают обоснованность использования 4 первичных тестируемых штаммов для измерения иммунного ответа на MenB-FHbp.Поскольку ответы, полученные для 4 первичных тестируемых штаммов, являются прогностическими по отношению к ответам, полученным для дополнительных 10 тестируемых штаммов, иммунологические ответы, полученные путем оценки первичных штаммов в hSBA, являются репрезентативными для разнообразных штаммов, вызывающих инвазивное заболевание MenB.

Для оценок иммуногенности, основанных на проверке гипотез, в исследованиях лицензирования MenB-FHbp, был использован непредвзятый подход для выбора 4 первичных тестируемых штаммов MenB из панелей болезнетворных MenB, собранных в США и Европе. Аналогичный метод был использован для отбора 10 дополнительных тестируемых штаммов MenB hSBA с учетом конкретных критериев отбора для гарантии того, что тестируемые штаммы были репрезентативными для антигенного разнообразия изолятов MenB. В совокупности 14 тестируемых штаммов MenB представляют собой большинство наиболее распространенных менингококковых FHbp, причем варианты FHbp соответствуют примерно 80% циркулирующих инвазивных болезнетворных изолятов в США и Европе.

Анализ положительных прогностических значений использовали для определения ассоциации иммунных ответов, измеренных с помощью hSBA, среди первичных и дополнительных тестируемых штаммов, экспрессирующие FHbp в пределах одного подсемейства. Все анализы PPV показали высокую прогностичность защитных реакций против первичного штамма для защитных реакций, наблюдаемых против дополнительных штаммов. Эти анализы PPV показывают, что ответы, наблюдаемые против 4 первичных тестируемых штаммов MenB, являются репрезентативными для ответов на другие болезнетворные штаммы MenB, которые экспрессируют дополнительные отличающиеся последовательностями варианты FHbp, отличные от вариантов антигена вакцины.

Ответы, вызванные MenB-FHbp, измеренные с помощью hSBA на 4 первичных и 10 дополнительных тестируемых штаммах MenB, оценивали с использованием сывороток от отдельных реципиентов вакцины. Путем определения доли вакцинированных субъектов с функциональными бактерицидными антителами оценивали широту охвата MenB-FHbp на индивидуальном уровне, что невозможно при использовании объединенных сывороток. 4 первичных тестируемых штамма MenB были отобраны для представления разнообразия вызывающих MenB-заболевания FMD, и это подтверждает потенциальную широту охвата MenB-FHbp с использованием hSBA. Ответы субъектов с титрами hSBA ≥1:4 являются общепринятым коррелятом защиты и косвенным доказательством эффективности менингококковой вакцины. Таким образом, ответы обеспечивают универсальную и биологически прогностическую оценку широты охвата вакциной. Релевантность ответов hSBA на 4 первичных тестируемых штамма MenB для описания широты охвата вакциной подтверждена демонстрацией защитных бактерицидных ответов MenB-FHbp, также наблюдаемых против различных и современных вызывающих вспышки заболевания штаммов MenB из Европы и США и против болезнетворных штаммов, не являющихся MenB (т.е. менингококков серогрупп С, Y, W и X).

Другая методология, система типирования менингококковых антигенов (MATS), основанная на иммуноферментном анализе, была использована для прогнозирования охвата вакциной MenB-4С. Однако MATS только предсказывает охват антигенов, специфичных для MenB-4С, и не пригоден для оценки охвата других вакцин с другими составами антигенов. В частности, MATS измеряет экспрессию антигена, а не бактерицидную активность, и представляет относительную эффективность по сравнению с эталонным штаммом для каждого антигена. Если относительная активность для любого из компонентов-антигенов соизмерима с бактерицидной активностью для иммунных сывороток MenB-4С (т.е. достигает положительного бактерицидного порога), штамм считается восприимчивым к уничтожению. Однако, поскольку сыворотки от вакцинированных лиц не используются в MATS, анализ не может предсказать долю популяции, достигающей титров hSBA ≥1: 4 (т.е. коррелят защиты) в ответ на иммунизацию.

Следует отметить, что существуют ограничения в выполнении hSBA. Например, получение hSBA является трудоемким процессом и может требовать больших количеств сывороток и комплемента, совместимого с анализом, особенно при оценке большего количества штаммов и/или сывороток. Кроме того, межлабораторные различия в качестве реагентов для анализа и штаммов, используемых в hSBA, ограничивают сравнение ответов и оценки широты охвата между вакцинами. Известным ограничением анализа PPV является зависимость величины ответа от распространенности (т.е., в этих условиях, доли субъектов, достигших hSBA≥LLOQ для дополнительных штаммов). Однако, в этом анализе примечательно, что, хотя был диапазон поствакцинационных реакций на дополнительные штаммы (через 1 месяц после 2 и после 3 дозы), PPV были одинаково высокими.

Взятые вместе, данные по иммуногенности, полученные от 10 дополнительных тестируемых штаммов MenB hSBA, подтверждают данные ответа, полученные от 4 первичных тестируемых штаммов MenB hSBA, и подтверждают широкий охват изолятов MenB, обеспечиваемый MenB-FHbp.Это первая работа, в которой применили строгую оценку вызываемого вакциной MenB иммунного ответа с использованием эпидемиологии штаммов MenB в отношении последовательности и экспрессии антигена вакцины в сочетании с признанным косвенным доказательством защиты (hSBA) и, использование этих знаний привело к лицензированию вакцины.

МЕТОДЫ

Количественное определение поверхностной экспрессии FHbp

Для всех штаммов поверхностную экспрессию FHbp количественно определяли с помощью анализа MEASURE, проточного цитометрического анализа с использованием распознавания моноклональным антителом (MN86-994-11) консервативного эпитопа FHbp, общего для обоих подсемейств FHbp. Детали анализа MEASURE были описаны ранее. Уровень отсечения, принятый для каждой группы вариантов FHbp, представлял собой наблюдаемую медиану средней интенсивности флуоресценции плюс 1 стандартное отклонение, с использованием оценки точности 25,2% относительного стандартного отклонения

Анализ иммуногенности

Каждый из 10 дополнительных тестируемых штаммов MenB использовали в hSBA для тестирования сывороток от субъектов, участвующих в 2 ключевых исследованиях MenB-FHbp фазы 3. В общей сложности 900 субъектов в каждом исследовании должны были быть разделены на 3 подгруппы (n=300 в каждой); 10 дополнительных тестируемых штаммов были распределены по этим группам таким образом, что 2 подгруппы включали по 3 тестируемых штамма каждая, и 1 подгруппа включала 4 тестируемых штамма. Подгруппы включали образцы от 300 субъектов, чтобы гарантировать, что будут получены ≥150 поддающихся оценке hSBA результатов из каждого исследования. Иммунные реакции, измеренные с помощью hSBA с использованием сывороток с фазы 3 клинического исследования, были основаны на анализе LLOQ, который представлял собой титр hSBA, равный 1:8 или 1:16 в зависимости от штамма.

Анализ позитивных прогностических значений

PPV для каждой пары первичного/дополнительного штамма в подсемействе FHbp определяли как долю субъектов, отвечающих на дополнительный штамм (титр hSBA≥LLOQ для дополнительного штамма) среди общего числа субъектов, отвечающих на первичный штамм (титр hSBA≥LLOQ для первичного штамма). В PPV анализах оценивали можно ли по наблюдаемым hSBA ответам на 4 первичных штамма прогнозировать иммунные ответы на дополнительные штаммы, экспрессирующие FHbp из того же подсемейства.

ПРИМЕР 20: Пентавалентная менингококковая (MenABCWY) вакцина является безопасной и хорошо переносится с иммуногенностью, не уступающей совместному введению MenB-FHbp и MenACWY-CRM в фазе 2 исследования здоровых подростков и молодых людей

Предпосылки: Менингококки серо группа А, В, С, W и Y вызывают почти все менингококковые заболевания во всем мире. Вакцинация осложняется разными рекомендациями по дозировке вакцины для серогруппы В (MenB) и четырехвалентной (MenACWY) вакцины, которые могут быть решены с помощью одной пентавалентной вакцины. В этом исследовании на подростках и молодых людях оценивали новую пентавалентную вакцину MenABCWY, в которой скомбинированы 2 лицензированные вакцины, MenB-FHbp (TRUMENBA®; бивалентная rLP2086) и MenACWY-TT (NFMENRIX®), в одной вакцине.

Методы: В этом продолжающемся, рандомизированном, контролируемом, слепом для наблюдателя, многоцентровом исследовании (NCT03135834), MenB вакцина-"наивные" и MenACWY--"наивные" или - обученные здоровые 10-25-летние субъекты были рандомизированы 1:2 в MenABCWY (месяц 0,6) или MenB-FHbp (месяц 0,6) и MenACWY-CRM (месяц 0). Иммунные реакции измеряли с помощью анализов бактерицидной активности сыворотки с человеческим комплементом (hSBA) против штаммов серогрупп А, С, W и Y и 4 отличных, вакцина-гетерологичных штаммов MenB. Конечные точки включали процент субъектов, достигших ≥4-кратного повышения титров по сравнению с исходным уровнем. Сопоставимость иммунных ответов оценивали априори при 10% границе (95% CI (доверительный интервал) нижний предел > -10%). Оценивали безопасность.

Результаты: После дозы 2 высокие проценты реципиентов MenABCWY (n=543) и MenB-FHbp (n=1057) достигали ≥4-кратного повышения против каждого из 4 штаммов MenB (75,8-94,7% против 67,4-95,0%) и титров по меньшей мере нижней границы количественной оценки против всех 4 штаммов вместе взятых (79,9% против 74,3%; Фиг. 1А). MenABCWY не уступала MenB-FHbp для всех 5 конечных точек. MenABCWY также не уступала одной дозе MenACWY-CRM с 75,5-96,9% и 93,0-97,4% MenABCWY реципиентов после дозы 1 или 2 соответственно, достигая ≥4-кратного повышения против серогруппы А, С, W и Y в зависимости от предыдущего опыта с MenACWY (Фиг. 1В). Местные реакции и системные события после MenABCWY или MenB-FHbp были одинаково частыми, в основном легкой/умеренной тяжести (Фиг. 2) и не сопровождали опыт с MenACWY.

6.2.2.3 Результаты иммуногенности MenABCWY из программы клинических разработок

(Исследование В1971057) Эта часть исследования была компонентом фазы 2 общего исследования. Для компонента MenB из MenABCWY, доли реципиентов MenABCWY и двувалентной rLP2086 + MenACWY-CRM, достигших 4-кратного повышения по сравнению с базовым уровнем титра hSBA через 1 месяц после вакцинации 2, составляли 75,8% и 73,8% соответственно, для РМВ80 (А22); 94,7% и 95,0% соответственно, для РМВ2001 (А56); 76,1% и 67,4% соответственно, для РМВ2948 (В24); и 91,7% и 86,4% соответственно, для РМВ2707 (В44). Доли реципиентов MenABCWY и двухвалентной rLP2086 + MenACWY-CRM, достигших составного ответа (титры hSBA≥LLOQ для всех 4 тестируемых штаммов MenB) через 1 месяц после вакцинации 2 составляли 79,9% и 74,3% соответственно.

Заключение: Эти результаты показывают, что MenABCWY, независимо от того, вводится ли он в виде однократной дозы или в виде серии из 2 доз, разделенных 6 месяцами, обеспечивает высокую степень защитного иммунитета против MenB после 2 доз и MenACWY после 1 или 2 доз, аналогичных тому, который достигается при введении двухвалентной rLP2086 (0, 6-месячный) и MenACWY-CRM (0-месячный) отдельно, независимо от предыдущего опыта с ACWY. MenABCWY 4-кратные иммунные ответы по сравнению с исходным уровнем было надежными и не уступали MenB-FHbp и MenACWY-CRM, вводимым отдельно. Вакцинация по 0-, 6-месячному графику была безопасной и хорошо переносилась. Благоприятный результат с точки зрения польза-риск поддерживает дальнейшую разработку MenABCWY в качестве упрощенной альтернативы текущей практике вакцинации менингококковых инфекций.

Данные, полученные из исследования В1971057 (MenABCWY[FIH]) показали, что ответы на MenABCWY не уступали TRUMENBA (двухвалентная рекомбинантная липопротеиновая 2086 вакцина против менингококков группы В) (оценка MenB) и MENVEO (менингококковая (группы А, С, Y и W-135) олигосахаридная CRM197 конъюгатная вакцина) (оценка MenACWYCRM) при введении здоровым субъектам от 10 до 25 лет (см. раздел 5.2). Не было иммунного мешающего влияния между компонентами MenABCWY, наблюдаемыми в этом FIH (исследования, впервые проводимые с участием людей) исследовании.

ПРИМЕР 21: Влияние стресса при транспортировке на суспензионные вакцины

Этот пример иллюстрирует влияние стрессов при транспортировке (удар/падение, вибрация, низкое давления/большая высота и температура) на суспензионную вакцину. Ресуспендирование вакцинной суспензии имеет важное значение. Понимание факторов, которые могут влиять на время ресуспендирования, чтобы минимизировать это время для конечных пользователей, является ключевой целью при разработке продукта. Авторы изобретения представляют системный способ оценки параметров, которые влияют на время диспергирования для суспензионной вакцины и связанную с этим стратегию контроля.

Суспензионные вакцины представляют собой термодинамически нестабильные системы, что создает значительные проблемы в поддержании физических свойств при хранении и доставке по сравнению с жидкой композицией или лиофилизированным порошком. Хотя стрессы при доставке могут влиять на качество продукта, а также на физические свойства вакцинного продукта, этот пример фокусируется на влиянии стрессов при доставке на физические свойства суспензионных вакцин. Последствия для качества продукта не входят в объем, поскольку зависимость качества продукции находится на молекулярном уровне и может быть оценена путем аналитических и биологических методов, специфичных для продукта.

Алюминий-содержащие адъюванты были включены в вакцины для усиления или изменения иммунного ответа на антигены в течение более нескольких десятилетий. Алюминий-содержащая вакцина представляет собой суспензию, в которой внутренняя фаза состоит из нерастворимых алюминий-содержащих солей (фосфата алюминия или гидроксида алюминия), а внешняя фаза представляет собой жидкий носитель. Добавление нерастворимых адъювантов к вакцинному лекарственному продукту приводит к образованию суспензии, где диспергированная фаза имеет тенденцию со временем оседать. В идеале суспензия должна быть однородной, и любое осаждение, возникающее во время хранения, можно было ресуспендировать посредством перемешивания. Сравните предварительно заполненный шприц, содержащий суспензионную вакцину, до и после ресуспендирования. Очень часто проблема ресуспендирования превалирует, после того как суспензией заполняют предварительно заполняемые шприцы и хранят в течение длительного времени. Бесчисленное количество исследований были сосредоточены на добавлении контролируемых флокулирующих агентов или полимерных добавок для формирования больших свободных и легко диспергируемых осадков. Некоторые коммерческие вакцины на основе алюминия, имеют ясную инструкцию на вкладыше в упаковку "энергично встряхнуть непосредственно перед использованием". 26 апреля 2010 г В03 рекомендовала отозвать и уничтожить все партии вакцины SHAN 5 в качестве предупредительной меры после инцидентов появления белого осадка, прилипающего к флаконам вакцины SHAN 5, которые было трудно или невозможно повторно суспендировать. Следовательно, ресуспендирование вакцинной суспензии следует тщательно оценивать, чтобы установить факторы, влияющие на время повторного диспергирования и, в случае необходимости, должны быть применены меры для смягчения последствий.

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ РАЗМЕРОМ ЧАСТИЦ, ЗАРЯДОМ И СКОРОСТЬЮ ОСАЖДЕНИЯ.

Важно понять факторы, которые влияют на устойчивость суспензии, поскольку авторы изобретения стремятся понять причину увеличения времени повторного суспендирования. В этом разделе представлены ранее известные соображения о стабильности суспензии, наряду с исследованиями двух суспензий, для того, чтобы установить связь между размером частиц, зарядом и осаждением суспензии.

В идеальной суспензионной системе дисперсионная фаза является суспендированной в течение длительного времени и, в случае осаждения разреженной системы, дисперсионная система может быть легко ресуспендирована или диспергирована. Суспензионная стабильность может быть достигнута термодинамическими или кинетическими средствами. Термодинамические подходы включают создание заряда на поверхности частиц суспензии, тем самым вызывая стерические препятствия из-за отталкивания частиц, приводящие к стабилизации суспензии. С другой стороны, кинетический подход включает увеличение вязкости суспензии, что приводит к снижению осаждения суспензии и, следовательно, к обеспечению стабильности. Размер частиц играет важную роль в этом взаимодействии термодинамической и кинетической стабильности. Для суспензионных систем, которые имеют размер частиц больше субмикронного, различия в плотности между чистой фазой и дисперсной фазой являются значительными факторами и могут привести к осаждению дисперсной фазы из-за гравитации. Сообщается, что размер частиц может влиять на флоккуляцию или коагуляцию суспензионной системы. PEG, например, добавляют ко множеству инъекционных твердых/жидких суспензий, чтобы позволить твердым активным частицам ингредиента образовать больший флоккулированный осадок, создавая таким образом возможность более легкого ресуспендирования осадка. Принимая во внимание, что супермикронные частицы идеально подходят для замедления кинетики растворения, на них в большей степени влияют эффекты гравитации, что может привести к более компактному и трудно ресуспендируемому осадку.

Седиментация или осаждение является результатом коллективных взаимодействий в концентрированных суспензиях. Коллективные взаимодействия включают гидродинамические и межчастичные взаимодействия (которые определяются взаимодействиями зарядов). Гидродинамические эффекты являются причиной замедления встречного потока, который является обратным потоком жидкости, для компенсации движения осаждающихся частиц. Межчастичные взаимодействия обусловлены аттрактивным самоистощением и отталкивающими структурными силами в концентрированных дисперсиях.

Две суспензионные системы использованы для иллюстрации взаимодействия между зарядом, скоростью осаждения и размером частиц. Лекарственный продукт в виде суспензионной вакцины в этом исследовании обозначен, как суспензия 1 и 2, для этой иллюстрации. Суспензия 1 и суспензия 2 отражают сопоставимый размер частиц (приблизительно 15 мкм). Эти суспензии ведут себя совершенно по-разному при сравнении скорости осаждения. Суспензия 1 осаждается значительно быстрее со скоростью осаждения примерно 0,04 абс/мин, в то время как суспензии 2 требуются недели даже для начала осаждения. Эта разница является очевидной, несмотря на сопоставимое распределение размера частиц. Как обсуждалось ранее, понимание заряда на поверхности частиц становится существенным. Дзета-потенциал для суспензии 1 составляет примерно -5 мВ, в то время как для суспензии 2 дзета-потенциал составляет -45 мВ. Поскольку суспензия 1 имеет небольшой заряд на поверхности частиц, термодинамическая нестабильность суспензии способствует межчастичному притяжению и в конечном итоге приводит к осаждению дисперсной фазы.

С другой стороны, высокий заряд для суспензионной системы 2 делает ее термодинамически стабильной и вызывает межчастичное отталкивание, что приводит значительному замедлению осаждения дисперсной фазы. Основываясь на этом, суспензия 2 имеет максимальную термодинамическую устойчивость и является более желательной. Хотя самый большой вопрос состоит в том, способна ли термодинамически стабильная суспензия легче диспергироваться после осаждения диспергированной системы или наоборот, как это превращается в легкость суспензии в шприце для суспензионной вакцины? Полученные данные с этими двумя суспензиями позволяют предположить, что, хотя суспензия 1 является термодинамически нестабильной из-за отсутствия заряда, что приводит к взаимодействию частиц и, возможно, образованию большего флокулированного осадка, приводящего к быстрому осаждению и, следовательно, делающему дисперсную фазовую систему легко ресуспендируемой. С другой стороны, суспензии 2 требуется значительно больше времени для оседания из-за полярности заряд-заряд, хотя после оседания более мелкие частицы плотно упаковываются вместе, образуя значительно более трудную для ресуспендирования осевшую дисперсную фазу.

Основываясь на этих наблюдениях и предыстории, два ключевых вопроса были протестированы в этих исследованиях для того, чтобы понять увеличение времени ресуспендирования для суспензионной вакцины 1: Может ли стресс при доставке изменить термодинамическую стабильность суспензии, что приведет к увеличению времени ресуспендирования? Каково влияние отдельных компонентов стресса при доставке и есть ли корреляция с увеличением времени ресуспендирования?

ВЛИЯНИЕ СТРЕССА ПРИ ТРАНСПОРТИРОВКЕ НА ТЕРМОДИНАМИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ СУСПЕНЗИИ

В другом исследовании лекарственный продукт в виде суспензионной вакцины был подвергнут имитации стресса при транспортировке, включающей температуру транспортировки, удар/падение и вибрацию. Термодинамическую стабильность суспензии определяли посредством измерения заряда (дзета-потенциала), распределения размера частиц и скорости осаждения до и после доставки.

Лекарственный продукт суспензии демонстрировал значение дзета-потенциала около -5 мВ, что предполагает наличие небольшого заряда на частицах суспензии. Эта термодинамическая нестабильность суспензии способствует притяжению частиц-частиц и в конечном итоге оседанию дисперсной фазы. Полученные данные позволяют предположить, что не было никаких видимых изменений в значении дзета-потенциала, распределении частиц по размерам и измеренной скорости оседания до и после имитированной транспортировки шприцев. Эти результаты свидетельствуют о том, что транспортное воздействие не изменяет термодинамическую стабильность лекарственного препарата суспензии. Поскольку эти свойства не изменяются после транспортировки, можно сделать вывод, что термодинамическая стабильность не является движущим фактором наблюдаемого увеличения времени ресуспендирования и необходимо оценить влияние транспортировки и понять, какой конкретный физический механизм вносит вклад в наблюдаемое время ресуспендирования.

ВЛИЯНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СТРЕССОВ ПРИ ТРАНСПОРТИРОВКЕ НА ВРЕМЯ РЕСУСПЕНДИРОВАНИЯ

При транспортировке упаковки продукт отчетливо испытывает различные вызванные транспортировкой стрессы. Они включают стресс удара/падения при падении упаковки с различной высоты, вибрации во время транспортировки грузовиком или самолетом, хотя амплитуда частоты вибрации является разной между самолетом и грузовиком. Влияние конкретного стресса при транспортировке на время ресуспендирования оценивали, когда шприцы с лекарственным продуктом подвергали имитации транспортировки¹¹. Дизайн исследования также включал оценку влияния стресса при транспортировке в зависимости от ориентации шприца. Шприцы держали в трех различных ориентациях: крышка наконечника вниз, крышка наконечника вверх и горизонтальная крышка наконечника. Исследование направлено на обнаружение отдельных стрессов и понимание их влияния.

Было обнаружено, что удар/падение сокращает время ресуспендирования при ориентации колпачка наконечника вниз и наблюдалось незначительное влияние воздействия удар/падение на время ресуспендирования при горизонтальной ориентации колпачка наконечника и колпачка наконечника вверх.

С другой стороны, вибрация самолета увеличила время ресуспендирования при ориентации колпачка наконечника вниз. Это была интересная находка и может быть связана с вибрационными частотами, встречающимися при транспортировке самолета. Частота вибрации, когда шприцы находятся в ориентации наконечника колпачка вниз, может дополнительно содействовать продвижению частиц суспензии вниз по цилиндру шприца. Наблюдалось незначительное влияние вибрации самолета на шприцы, с расположением наконечника колпачка вверх и горизонтально. Подобно авиационной вибрации, вибрация грузовика увеличивала время ресуспендирования при ориентации наконечника крышки вниз. Эти результаты аналогичны авиационной вибрации, хотя степень увеличения времени ресуспендирования была больше по сравнению с вибрацией самолета. Кроме того, наблюдалось незначительное влияние вибрации грузовика на шприцы, расположенные наконечником колпачка вверх и горизонтально, что согласовалось с вибрацией самолета.

Кроме того, когда в шприцах оценивалось время ресуспендирования при комбинированном стрессе (удар/падение, вибрация самолета, вибрационный удар/падение для грузовика), данные были противоречивыми, позволяя предположить, что при реальной транспортировке, скорее всего, один или более воздействий стресса при транспортировке могут доминировать, приводя к совершенно иному результату.

Было интересно отметить, что интенсивность частоты вибрации является важным фактором, основанным на различиях, наблюдаемых в вибрации самолетов и грузовиков. Увеличение времени ресуспендирования при помещении шприца в ориентацию колпачком наконечника вниз может быть связано с тем, что нисходящее движение частиц суспензии, происходящее благодаря силе тяжести и усугубляемое вибрацией, облегчает плотное уплотнение более крупных частиц с более мелкими частицами, заполняющими пустотные пространства. Частицы на дне, особенно в отверстии шприца, постепенно спрессовываются вместе под весом выше расположенных частиц.

Когда лекарственное средство транспортируется в ориентации колпачка наконечника вверх, гравитационный эффект все еще существует, но осаждение происходит на более широкой поверхности поршня, а не в узком отверстии. Уплотнение массы незаметно. Когда лекарственное средство поставляется с горизонтальной ориентацией колпачка наконечника, боковое движение, являющееся результатом броуновского движения, и конвекционный ток от вибрации преодолевают гравитацию. Даже когда осаждение происходит, оно будет происходить на большой поверхности стенки шприца с небольшим шансом уплотнения частиц. Таким образом, повторное суспендирование не является проблемой как при ориентации наконечника вверх, так и при горизонтальной ориентации, при этом горизонтальная ориентация наконечника дает несколько лучшие результаты, предположительно из-за большей площади поверхности. При транспортировке вибрация является доминирующей силой, которая приводит к конечному состоянию, при котором осадок уплотнен. В зависимости от ориентации шприца и имеющихся разных площадей поверхности, время ресуспендирования соответствует этим открытым участкам поверхности.

МЕРЫ ПО СНИЖЕНИЮ БОЛЬШОГО ВРЕМЕНИ РЕСУСПЕНДИРОВАНИЯ

Исходя из данных исследования с моделированием транспортировки, ясно, что ориентация колпачка наконечника горизонтально или вверх может уменьшить более высокое время ресуспендирования для вакцинной суспензии.

Влияние температуры транспортировки на суспензионные вакцины Помимо ресуспендирования, на качество продукта вакцинных суспензий может также влиять температура во время транспортировки. После замораживания связь между адъювантом и антигеном может быть разорвана. Отделенный адъювант имеет тенденцию к образованию агломерата, который увеличивается по размеру и весу частицы, и затем постепенно оседает на дно контейнера. Размер агломерата может увеличиваться после многократных циклов замораживания и оттаивания. Образование агломерата влияет как на ресуспендирование, так и на физические и химические свойства продукта. К руководству В03 по международной упаковке и перевозке вакцины прилагается протокол вибрационного испытания для определения того, влияет ли на адсорбированные вакцины замораживание. Руководство также предписывает проведение испытания на встряхивание случайной выборки вакцины, если есть признаки того, что температура во время транспортировки упала ниже нуля. Более высокие температуры, с другой стороны, также могут влиять на качество продукта в виде вакцинной суспензии, приводя к образованию частиц и к изменению их химических свойств или к тому и другому. Поэтому В03 определяет +8°С как максимальную температуру, допустимую внутри изолированной упаковки класса А во время международной перевозки, в течение по меньшей мере 48 часов. Максимальная температура, допустимая для упаковки класса В и С, составляет +30°С.

В следующих пунктах описаны дополнительные воплощения изобретения:

С1. Композиция содержащая (а) первый полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitidis; (б) второй полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitidis; (в) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; (г) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; (д) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W; и (е) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y; где композиция вызывает иммунный ответ на любой из капсульных полисахаридов N. meningitidis серогруппы А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной против этой серогруппы N. meningitidis.

С2. Способ по п. С1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 62.

С3. Способ по п. С1, где композиция содержит (а) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А, конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера.

С4. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к любому из N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду серогрупп N. meningitidis А, С, W-135 и Y.

С5. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы А, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С6. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы С, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С7. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы W, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С8. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С9. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к любому из N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С10. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы В, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной на основе фактор Н-связывающего белка Neisseria meningitidis серогруппы В.

С11. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция вызывает иммунный ответ к любому N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ к каждому из капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y выше, чем вызванный лицензированной вакциной к капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y; и композиция вызывает иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы В, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y и лицензированной менингококковой вакциной на основе фактор Н -связывающего белка серогруппы В; где лицензированную вакцину к капсульному полисахариду N. meningitidis серогруппы А, С, W-135 и Y и лицензированную вакцину к фактор Н-связывающему белку серогруппы В вводят последовательно, а не в виде комбинированной дозы.

С12. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит адъювант.

С13. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит алюминевый адъювант.

С14. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит гидроксид алюминия.

С15. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит фосфат алюминия.

С16. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит алюминий.

С17. Способ по любому из пп. С1-С3, где по меньшей мере 90% первого полипептида соединено с алюминием в композиции.

С18. Способ по любому из пп. С1-С3, где по меньшей мере 90% второго полипептида соединено с алюминием в композиции.

С19. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция приготовлена в виде стерильной жидкости.

С20. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит фармацевтически приемлемый консервант.

С21. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит полисорбат-80.

С22. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит Tris-HCl; хлорид натрия; сахарозу; гистидин; полисорбат 80; и фосфат алюминия.

С23. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит примерно 120 мкг/мл первого полипептида; примерно 120 мкг/мл второго полипептида; примерно 0,5 мг/мл алюминий в виде фосфата алюминия; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 10 мМ гистидина; и примерно 150 мМ хлорида натрия.

С24. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит примерно 60 мкг первого полипептида; примерно 60 мкг второго полипептида; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenA, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenC, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenW, конъюгированного с примерно 3,75 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenY, конъюгированного с примерно 3,25 мкг ТТ; примерно 97 мкг Tris-HCl, рН 6,8±0,3; 4,69-4,71 мг хлорида натрия; примерно 28 мг сахарозы; примерно 0,78 мг L-гистидина; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 0,25 мг алюминия; и дополнительно содержит 0,5 мл воды, на дозу.

С25. Способ по любому из пп. С1-С3, где иммунный ответ включает сывороточное бактерицидное антитело.

С26. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция способна вызывать бустерный иммунный ответ к по меньшей мере одному N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С27. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция способна вызвать бустерный иммунный ответ к N. meningitidis серогруппы В.

С28. Способ по любому из пп. С1-С3, где иммунный ответ индуцируют у человека в возрасте от 10 до 26 лет.

С29. Способ по любому из пп. С1-С3, где иммунный ответ индуцируют у человека в возрасте от 12 до <18 месяцев или от 18 до <24 месяцев.

С30. Способ по любому из пп. С1-С3, где иммунный ответ индуцируют у человека в возрасте от 18 до <24 месяцев.

С31. Способ по любому из пп. С1-С3, где иммунный ответ индуцируют у человека в возрасте от ≥24 месяцев до <10 лет.

С32. Способ по любому из пп. С1-С3, где иммунный ответ индуцируют у человека, который является серонегативным к N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С33. Способ по любому из пп. С1-С3, где иммунный ответ индуцируют у человека, который является серопозитивным к N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С34. Способ по любому из пп. С1-С3, где композицию вводят человеку в виде по меньшей мере двух доз, где вторую дозу вводят через примерно 6 месяцев после первой дозы.

С35. Способ по п. С34, где возраст человека составляет по меньшей мере 10 лет и не более 17 лет.

С36. Способ по п. С35, где третью дозу композиции вводят человеку, где возраст человека составляет по меньшей мере 16 лет.

С37. Способ по любому из пп. С1-С3, где композицию вводят человеку в виде не более двух доз, где вторую дозу вводят примерно через 6 месяцев после первой дозы.

С38. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция индуцирует иммунный ответ против А22.

С39. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция индуцирует иммунный ответ против А56.

С40. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция индуцирует иммунный ответ против В24.

С41. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция индуцирует иммунный ответ против В44.

С42. Способ по любому из пп. С1-С3, где композиция содержит примерно 60 мкг первого полипептида; примерно 60 мкг второго полипептида; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenA, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenC, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenW, конъюгированного с примерно 3,75 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenY, конъюгированного с примерно 3,25 мкг ТТ; примерно 97 мкг Tris-HCl, рН 6,8±0,3; 4,69-4,71 мг хлорида натрия; примерно 28 мг сахарозы; примерно 0,78 мг L-гистидина; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 0,25 мг алюминия; и дополнительно содержит 0,5 мл воды, на дозу.

С43. Композиция, содержащая (а) первый полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitidis; (б) второй полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitidis; (в) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; (г) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; (д) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W; и (е) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y; где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере к одного N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной вакциной против этой серогруппы N. meningitidis.

С44. Композиция по п. С43, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 62.

С45. Композиция, содержащая (а) первый полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitidis; (б) второй полипептид, полученный из фактор Н-связывающего белка (fHBP) Neisseria meningitidis; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А, конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; где композиция индуцирует иммунный ответ к капсульным полисахаридам каждой из серогрупп N. meningitidis А, С, W-135 и Y, где указанный сывороточный бактерицидный антительный ответ выше, чем вызванный лицензированной менингококковой вакциной к капсульному полисахариду N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С46. Способ индукции иммунного ответа против штамма Neisseria meningitidis серогруппы В подсемейства А и против штамма Neisseria meningitidis серогруппы В подсемейства В у человека, включающий введение человеку эффективного количества композиции по любому из пп. С43-С45.

С47. Способ индукции иммунного ответа против штамма Neisseria meningitidis серогруппы A, Neisseria meningitidis серогруппы С, Neisseria meningitidis серогруппы W, и/или Neisseria meningitidis серогруппы Y у человека, включающий введение человеку эффективного количества композиция по любому из пп. С43-С45.

С48. Способ индукции иммунного ответа против штамма Neisseria meningitidis серогруппы A, Neisseria meningitidis серогруппы В, Neisseria meningitidis серогруппы С, Neisseria meningitidis серогруппы W, и/или Neisseria meningitidis серогруппы Y у человека, включающий введение человеку эффективного количества композиция по любому из пп. С43-С45.

С49. Способ индукции иммунного ответа против штамма Neisseria meningitidis серогруппы A, Neisseria meningitidis серогруппы В, Neisseria meningitidis серогруппы С, Neisseria meningitidis серогруппы W, Neisseria meningitidis серогруппы Y и/или Neisseria meningitidis серогруппы X у человека, включающий введение человеку эффективного количества композиция по любому из пп. С43-С45.

С50. Способ по любому из пп. С46-С49, где пациент раньше не получал мультивалентную менингококковую вакцину на основе конъюгата капсульный сахарид-белок-носитель до первого введения композиции по любому из пп. С43-С45.

С51. Способ по любому из пп. С46-С49, где пациент раньше не получал мультивалентную менингококковую вакцину на основе конъюгата капсульный сахарид-белок-носитель до первого введения композиции по любому из пп. С1-С10.

С52. Применение эффективного количества композиция для индукции иммунного ответа против Neisseria meningitidis серогруппы В у человека, где указанная композиция содержит а) первый липидированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и б) второй липидированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного штамма N. meningitidis серогруппы В, экспрессирующего полипептид, выбранного из группы, состоящей из А02, А28, А42, А63, А76, В05, В07, В08, В13, В52 и В107.

С53. Применение по п. С52, где индуцированный иммунный ответ является бактерицидным.

С54. Применение по п. С52, где композиция дополнительно содержит полисорбат-80.

С55. Применение по любому из пп. С52-С54, где композиция дополнительно содержит алюминий.

С56. Применение по любому из пп. С52-С55, где композиция дополнительно содержит гистидиновый буфер.

С57. Применение по любому из пп. С52-С56, где композиция дополнительно содержит хлорид натрия.

С58. Применение по любому из пп. С52-С57, где композиция содержит примерно 120 мкг/мл первого полипептида; примерно 120 мкг/мл второго полипептида; примерно 2,8 молярного соотношения полисорбата-80; примерно 0,5 мг/мл алюминия; примерно 10 мМ гистидина; и примерно 150 мМ хлорида натрия.

С59. Применение по любому из пп. С52-С58, где композиция содержит примерно 60 мкг первого полипептида; примерно 60 мкг второго полипептида; примерно 18 мкг полисорбата-80; примерно 250 мкг алюминия; примерно 780 мкг гистидина; и примерно 4380 мкг хлорида натрия.

С60. Применение по любому из пп. С52-С59, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную иммуногенную композицию, содержащую смесь четырех отдельных и независимо изготовленных конъюгатов белок-капсульный полисахарид, где первые конъюгат содержит капсульный полисахарид N. meningitidis серогруппы W, конъюгированный с белком-носителем, второй конъюгат содержит капсульный полисахарид N. meningitidis серогруппы Y, конъюгированный с белком-носителем, третий конъюгат содержит капсульный полисахарид N. meningitidis серогруппы А, конъюгированный с белком-носителем, и четвертый конъюгат содержит капсульный полисахарид N. meningitidis серогруппы С, конъюгированный с белком-носителем, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из дифтерийного анатоксина, CRM197 и столбнячного токсина.

С61. Применение по п. С60, где белок-носитель представляет собой анатоксин дифтерии.

С62. Применение по п. С60, где белок-носитель представляет собой столбнячный анатоксин.

С63. Применение по п. С60, где по меньшей мере одна дополнительная иммуногенная композиция представляет собой жидкую композицию.

С64. Применение по п. С60, где по меньшей мере одна дополнительная иммуногенная композиция не является лиофилизированной.

С65. Применение по любому из пп. С60-С64, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного штамма Neisseria meningitides серогруппы А.

С66. Применение по любому из пп. С60-С64, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного штамма Neisseria meningitides серогруппы С.

С67. Применение по любому из пп. С60-С64, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного штамма Neisseria meningitides серогруппы W.

С68. Применение по любому из пп. С60-С64, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного штамма Neisseria meningitides серогруппы Y.

С69. Применение по любому из пп. С60-С64, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного штамма Neisseria meningitides серогруппы А, штамма Neisseria meningitides серогруппы С, штамма Neisseria meningitides серогруппы Y, штамма Neisseria meningitides серогруппы W и любой их комбинации.

С70. Применение по любому из пп. С52-С69, где эффективное количество композиции содержит одну дозу.

С71. Применение по любому из пп. С52-С70, где эффективное количество композиции содержит две дозы.

С72. Применение по любому из пп. С52-С70, где эффективное количество композиции дополнительно содержит бустерную дозу.

С73. Применение по любому из пп. С52-С70, где эффективное количество композиции содержит не более двух доз.

С74. Применение по любому из пп. С52-С70, где эффективное количество композиции содержит не более трех доз.

С75. Применение по п. С52, где композиция не содержит гибридный белок.

С76. Применение по п. С52, где композиция не содержит слитый белок.

С77. Применение по п. С52, где композиция не является лиофилизированной.

С78. Применение по п. С52, где композиция не содержит формальдегид

С79. Применение по п. С60, где композиция не содержит дифтерийный анатоксин или CRM.

С80. Применение по п. С60, где капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы А (MenA) конъюгирован с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (конъюгат MenA_AH-ТТ).

С81. Применение по п. С60, где капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы С (MenC) конъюгирован с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (MenC_AH-ТТ конъюгат).

С82. Применение по п. С60, где капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы W (MenW) непосредственно конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера (конъюгат MenW-TT).

С83. Применение по п. С60, где капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы Y (MenY) непосредственно конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера (конъюгат MenY-TT).

С84. Применение по п. С60, где капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы А (MenA) конъюгирован с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (MenA_AH-ТТ конъюгат); капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы С (MenC) конъюгирован с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) с помощью карбодиимидных химических методов (MenC_AH-ТТ конъюгат); капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы W (MenW) непосредственно конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера (MenW-TT конъюгат); и капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы Y (MenY) непосредственно конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина (ТТ) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера (конъюгат MenY-TT).

С85. Применение по п. С60, где композиция не содержит капсульный сахарид MenA в отсутствие линкера в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH).

С86. Применение по любому из пп. С52-С85, где возраст пациента составляет от 12 до <18 месяцев или от 18 до <24 месяцев.

С87. Применение по любому из пп. С52-С85, где возраст пациента составляет от 18 до <24 месяцев.

С88. Применение по любому из пп. С52-С85, где возраст пациента составляет от ≥24 месяцев до <10 лет.

С89. Применение по любому из пп. С52-С88, где композиция индуцирует бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина, который по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, чем бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина у человека перед получением первой дозы, при измерении в идентичных условиях в сывороточном бактерицидном анализе с использованием человеческого комплемента.

С90. Применение по любому из пп. С52-С89, где композиция индуцирует бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина, который по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения первой дозы, чем бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в сывороточном бактерицидном анализе с использованием человеческого комплемента.

С91. Применение по любому из пп. С52-С90, где композиция индуцирует бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина, который по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения первой дозы, чем бактерицидный титр сывороточного иммуноглобулина у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в сывороточном бактерицидном анализе с использованием человеческого комплемента.

С92. Способ индукции иммунного ответа у человека, включающий введение человеку композиции, содержащей

(а) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А, конъюгированный с линкером, в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера,

где композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере к одному N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител, и где этот титр выше, чем титр, индуцированный лицензированной вакциной против менингококковых капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С93. Способ по п. 1, где лицензированная вакцина против менингококковых капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y представляет собой вакцину MENVEO.

С94. Способ индукции иммунного ответа у человека, включающий введение человеку композиции, содержащий а) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А, конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH) посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера, где композиция индуцирует иммунный ответ против Neisseria meningitidis серогруппы В, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител, который выше, чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированный лицензированной вакциной против N. meningitidis серогруппы В.

С95. Способ по п. С94, где лицензированная вакцина против N. meningitidis серогруппы В представляет собой TRUMENBA.

С96. Способ индукции иммунного ответа у человека, включающий введение человеку композиции, содержащей а) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; (б) второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (в) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы А, конъюгированный с линкером в виде дигидразида адипиновой кислоты (ADH), посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (г) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы С, конъюгированный с линкером ADH посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов; (д) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и (е) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином посредством 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера, где композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного из N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y и N. meningitidis серогруппы В, где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител против каждого из N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, который выше, чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированный лицензированной вакциной против капсульного полисахарида N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y, и где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител против N. meningitidis серогруппы В, который выше, чем титр сывороточных бактерицидных антител, индуцированный лицензированной вакциной против N. meningitidis серогруппы В.

С97. Способ по п. С96, где лицензированная вакцина против капсульных полисахаридов N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y представляет собой MENVEO.

С98. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция дополнительно содержит адъювант.

С99. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция дополнительно содержит алюминий.

С100. Способ по п. С99, где адъювант содержит гидроксид алюминия.

С101. Способ по п. С99, где адъювант содержит фосфат алюминия.

С102. Способ по п. С94, где по меньшей мере 90% первого полипептида связано с алюминием в композиции.

С103. Способ по п. С94, где по меньшей мере 90% второго полипептид связано с алюминием в композиции.

С104. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция приготовлена в виде стерильной жидкости.

С105. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция дополнительно содержит полисорбат-80.

С106. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция дополнительно содержит Tris-HCl; хлорид натрия; сахарозу; гистидин; полисорбат 80; и фосфат алюминия.

С107. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция содержит примерно 120 мкг/мл первого полипептида; примерно 120 мкг/мл второго полипептида; примерно 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 10 мМ гистидина; и примерно 150 мМ хлорида натрия.

С108. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция содержит примерно 60 мкг первого полипептида; примерно 60 мкг второго полипептида; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenA, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenC, конъюгированного с примерно 7,5 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenW, конъюгированного с примерно 3,75 мкг ТТ; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenY, конъюгированного с примерно 3,25 мкг ТТ; примерно 97 мкг Tris-HCl, рН 6,8±0,3; 4,69-4,71 мг хлорида натрия; примерно 28 мг сахарозы; примерно 0,78 мг L-гистидина; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 0,25 мг алюминия; и дополнительно содержит 0,5 мл воды, на дозу.

С109. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция способна вызывать бустерный иммунный ответ к каждой из серогрупп Neisseria meningitidis А, С, W-135 и Y.

С110. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция способна вызывать бустерный иммунный ответ против N. meningitidis серогруппы В.

С111. Способ по любому из пп. С94-С97, где возраст человека составляет от 10 до 26 лет.

С112. Способ по любому из пп. С94-С97, где возраст человека составляет от 12 до <18 месяцев или от 18 до <24 месяцев.

С113. Способ по любому из пп. С94-С97, где возраст человека составляет от 18 до <24 месяцев.

С114. Способ по любому из пп. С94-С97, где возраст человека составляет от ≥24 месяцев до <10 лет.

С115. Способ по любому из пп. С94-С97, где возраст человека по меньшей мере 16 лет.

С116. Способ по п. С115, включающий введение человеку одной дозы.

С117. Способ по любому из пп. С94-С97, где возраст человека составляет от 10 до 12 лет.

С118. Способ по п. С113 включающий введение человеку по меньшей мере двух доз.

С119. Способ по п. С113, где возраст человека составляет не более 16 лет.

С120. Способ по любому из пп. С94-С97, включающий введение по меньшей мере одной дозы композиции человеку в возрасте примерно 11 лет и введение еще одной дозы композиции человеку по меньшей мере через 4 года после первой дозы.

С121. Способ по любому из пп. С94-С97, включающий введение по меньшей мере одной дозы композиции человеку в возрасте примерно 11 лет и введение еще одной дозы композиция человеку по меньшей мере через 4 года после последней дозы.

С122. Способ по п. С116, где еще одну дозу композиции вводят примерно через пять лет после последней дозы.

С123. Способ по любому из пп. С94-С97, включающий введение одной дозы композиции человеку в возрасте примерно 11 лет и введение по меньшей мере двух доз композиции человеку примерно через пять лет после первой дозы.

С124. Способ по любому из пп. С94-С97, где человек является серонегативным к капсульным полисахаридам N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

С125. Способ по любому из пп. С94-С97, где человек является серопозитивным к капсульным полисахаридам N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y.

C126. Способ по любому из пп. С94-С97, включающий введение первой дозы и второй дозы композиции, где вторую дозу вводят примерно через 6 месяцев после первой дозы.

С127. Способ по п. С122, где возраст человека составляет не более 17 лет.

С128. Способ по п. С122, включающий введение третьей дозы композиции человеку в возрасте 16 лет.

С129. Способ по любому из пп. s С94 to С97, включающий введение не более двух доз композиции, где вторую дозу вводят примерно через 6 месяцев после первой дозы.

С130. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция индуцирует иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы В, экспрессирующего А22.

С131. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция индуцирует иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы В, экспрессирующего А56.

С132. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция индуцирует иммунный ответ против штамма Ж. meningitidis серогруппы В, экспрессирующего В24.

С133. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция индуцирует иммунный ответ против штамма Ж. meningitidis серогруппы В, экспрессирующего В44.

С134. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция индуцирует бактерицидный иммунный ответ против любого из штаммов А22, А56, В24, В44 N. meningitidis серогруппы В или любой их комбинации.

С135. Способ по любому из пп. С94-С97, где композиция индуцирует бактерицидный иммунный ответ против любого из штаммов В24, В16, В44, А22, В03, В09, А12, А19, А05, А07, В153 N. meningitidis серогруппы В или любой их комбинации.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Pfizer Inc.

<120> КОМПОЗИЦИИ С NEISSERIA MENINGITIDIS И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> PC072522

<150> 63/040498

<151> 2020-06-17

<150> 62/907097

<151> 2019-09-27

<160> 74

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 258

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 1

Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu

20 25 30

Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr

35 40 45

Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp

50 55 60

Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe

65 70 75 80

Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala

85 90 95

Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala

100 105 110

Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile

115 120 125

Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala

130 135 140

Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe

145 150 155 160

Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala

165 170 175

Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln

180 185 190

Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His

195 200 205

Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr

210 215 220

Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser

225 230 235 240

Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly

245 250 255

Lys Gln

<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 2

Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala

1 5 10 15

Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His

20 25 30

Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln

35 40 45

Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly

50 55 60

Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser

65 70 75 80

Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr

85 90 95

Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu

100 105 110

Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys

115 120 125

Met Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His

130 135 140

Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly

145 150 155 160

Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile

165 170 175

Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser

180 185 190

Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu

195 200 205

Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu

210 215 220

Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly

245 250 255

Leu Ala Ala Lys Gln

260

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 3

Cys Gly Ser Ser

1

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 4

Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 5

Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

<210> 6

<211> 255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 6

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Glu Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 7

<211> 259

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 7

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr

1 5 10 15

Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly

20 25 30

Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu

35 40 45

Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys

50 55 60

Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg

65 70 75 80

Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu

85 90 95

Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val

100 105 110

Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu

115 120 125

Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr

130 135 140

Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala

145 150 155 160

Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe

165 170 175

Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu

180 185 190

Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser

195 200 205

His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly

210 215 220

Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly

225 230 235 240

Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala

245 250 255

Gly Lys Gln

<210> 8

<211> 261

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 8

Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly

35 40 45

Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly

50 55 60

Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile

85 90 95

Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala

100 105 110

Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp

115 120 125

Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu

130 135 140

His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly

145 150 155 160

Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile

165 170 175

Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr

180 185 190

Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu

195 200 205

Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu

210 215 220

Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly

245 250 255

Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 9

<211> 254

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 9

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly

165 170 175

Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 10

<211> 254

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 10

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 11

<211> 263

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 11

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu

85 90 95

Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser

100 105 110

Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser

115 120 125

Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly

130 135 140

Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr

145 150 155 160

Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

165 170 175

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

180 185 190

Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro

195 200 205

Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln

210 215 220

Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln

225 230 235 240

Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His

245 250 255

Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

260

<210> 12

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 12

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg

115 120 125

Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 13

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 13

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 14

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 14

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 15

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 15

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 16

<211> 263

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 16

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu

85 90 95

Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser

100 105 110

Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser

115 120 125

Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly

130 135 140

Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr

145 150 155 160

Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

165 170 175

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

180 185 190

Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro

195 200 205

Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln

210 215 220

Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln

225 230 235 240

Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His

245 250 255

Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

260

<210> 17

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 17

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 18

<211> 254

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 18

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly

165 170 175

Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<211> 257

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 20

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn

50 55 60

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp

65 70 75 80

Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser

85 90 95

Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu

100 105 110

Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn

115 120 125

Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe

130 135 140

Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser

145 150 155 160

Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala

165 170 175

Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn

180 185 190

Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala

195 200 205

Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala

225 230 235 240

Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Ser Ile Ala Gly Lys

245 250 255

Gln

<210> 21

<211> 254

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 21

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Thr Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly

165 170 175

Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 22

<211> 262

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 22

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

85 90 95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser

100 105 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile

115 120 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

130 135 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His

145 150 155 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr

165 170 175

Ile Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys

180 185 190

Thr Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp

195 200 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu

210 215 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

245 250 255

Gly Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 23

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 23

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 24

Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala

1 5 10 15

Asp

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 25

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp

1 5 10 15

<210> 26

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 26

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 27

<211> 254

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 27

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly

165 170 175

Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 28

<211> 254

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 28

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 29

<211> 260

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 29

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Met Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn

35 40 45

Glu Lys Leu Lys Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn

50 55 60

Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg

65 70 75 80

Phe Asp Phe Ile His Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu

85 90 95

Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr

100 105 110

Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Glu Lys Met

115 120 125

Val Ala Lys Arg Arg Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr

130 135 140

Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr

145 150 155 160

Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp

165 170 175

Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro

180 185 190

Glu Leu Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys

195 200 205

Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys

210 215 220

Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu

245 250 255

Ala Ala Lys Gln

260

<210> 30

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 30

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg

115 120 125

Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 31

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 31

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu

180 185 190

Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu

225 230 235 240

Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 32

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 32

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys

100 105 110

Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe

115 120 125

Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro

145 150 155 160

Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr

165 170 175

Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala

180 185 190

Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly

195 200 205

Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu

210 215 220

Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile

225 230 235 240

Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 33

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 33

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys

100 105 110

Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe

115 120 125

Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala

145 150 155 160

Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His

165 170 175

Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly

195 200 205

Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu

210 215 220

Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile

225 230 235 240

Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 34

<211> 256

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 34

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn Ser

50 55 60

Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe

65 70 75 80

Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly

85 90 95

Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln

100 105 110

Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln

115 120 125

Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn

130 135 140

Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser

145 150 155 160

Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys

165 170 175

Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val

180 185 190

Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val

195 200 205

Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His

210 215 220

Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr

225 230 235 240

Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Ser Ile Ala Gly Lys Gln

245 250 255

<210> 35

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 35

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Thr Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys

100 105 110

Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe

115 120 125

Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro

145 150 155 160

Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr

165 170 175

Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala

180 185 190

Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly

195 200 205

Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu

210 215 220

Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile

225 230 235 240

Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 36

<211> 261

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 36

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Gly

35 40 45

Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly

50 55 60

Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile

85 90 95

Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala

100 105 110

Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp

115 120 125

Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu

130 135 140

His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Gly

145 150 155 160

Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr Ile

165 170 175

Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr

180 185 190

Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu

195 200 205

Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu

210 215 220

Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly

245 250 255

Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 37

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 37

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys

225 230 235 240

Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 38

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 38

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu

180 185 190

Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu

225 230 235 240

Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 39

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 39

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys

100 105 110

Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe

115 120 125

Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro

145 150 155 160

Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr

165 170 175

Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala

180 185 190

Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly

195 200 205

Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu

210 215 220

Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile

225 230 235 240

Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 40

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 40

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys

100 105 110

Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe

115 120 125

Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala

145 150 155 160

Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His

165 170 175

Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly

195 200 205

Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu

210 215 220

Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile

225 230 235 240

Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 41

<211> 259

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 41

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Gly Leu Gln Ser Leu Met Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu

35 40 45

Lys Leu Lys Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe

65 70 75 80

Asp Phe Ile His Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu

85 90 95

Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala

100 105 110

Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Glu Lys Met Val

115 120 125

Ala Lys Arg Arg Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser

130 135 140

Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala

145 150 155 160

Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe

165 170 175

Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu

180 185 190

Leu Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg

195 200 205

His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly

225 230 235 240

Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala

245 250 255

Ala Lys Gln

<210> 42

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 42

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg Phe

115 120 125

Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu

180 185 190

Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys

225 230 235 240

Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 43

<211> 262

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 43

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly

35 40 45

Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly

50 55 60

Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile

85 90 95

Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala

100 105 110

Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly

115 120 125

Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Glu

130 135 140

His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg

145 150 155 160

Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr

165 170 175

Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys

180 185 190

Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp

195 200 205

Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala

210 215 220

Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu

225 230 235 240

Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile

245 250 255

Gly Leu Ala Ala Lys Gln

260

<210> 44

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 44

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu

225 230 235 240

Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 45

<211> 259

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 45

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu

35 40 45

Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe

65 70 75 80

Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu

85 90 95

Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala

100 105 110

Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val

115 120 125

Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser

130 135 140

Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala

145 150 155 160

Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe

165 170 175

Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu

180 185 190

Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg

195 200 205

His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly

225 230 235 240

Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala

245 250 255

Ala Lys Gln

<210> 46

<211> 260

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 46

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly

1 5 10 15

Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys

20 25 30

Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp

50 55 60

Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val

100 105 110

Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser

115 120 125

Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His

130 135 140

Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys

145 150 155 160

Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp

165 170 175

Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro

180 185 190

Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys

195 200 205

Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys

210 215 220

Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile

245 250 255

Ala Gly Lys Gln

260

<210> 47

<211> 259

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 47

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly

35 40 45

Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe

65 70 75 80

Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu

85 90 95

Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala

100 105 110

Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met Val

115 120 125

Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser

130 135 140

Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala

145 150 155 160

Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe

165 170 175

Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu

180 185 190

Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His

195 200 205

His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly

225 230 235 240

Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala

245 250 255

Ala Lys Gln

<210> 48

<211> 260

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 48

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn

50 55 60

Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg

65 70 75 80

Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu

85 90 95

Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr

100 105 110

Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met

115 120 125

Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr

130 135 140

Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr

145 150 155 160

Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp

165 170 175

Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro

180 185 190

Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys

195 200 205

His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys

210 215 220

Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu

245 250 255

Ala Ala Lys Gln

260

<210> 49

<211> 255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 49

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 50

<211> 255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 50

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 51

<211> 255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 51

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 52

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 52

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 53

<211> 258

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 53

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp

20 25 30

Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu

35 40 45

Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe

65 70 75 80

Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala

85 90 95

Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala

100 105 110

Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile

115 120 125

Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala

130 135 140

Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe

145 150 155 160

Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr

165 170 175

Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln

180 185 190

Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His

195 200 205

Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr

210 215 220

Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser

225 230 235 240

Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly

245 250 255

Lys Gln

<210> 54

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 54

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys

100 105 110

Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe

115 120 125

Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala

145 150 155 160

Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His

165 170 175

Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala

180 185 190

Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly

195 200 205

Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu

210 215 220

Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile

225 230 235 240

Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 55

<211> 255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 55

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile

195 200 205

Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu

210 215 220

Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val

225 230 235 240

Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250 255

<210> 56

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 56

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 57

<211> 262

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 57

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

85 90 95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser

100 105 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile

115 120 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

130 135 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His

145 150 155 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr

165 170 175

Ile Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys

180 185 190

Thr Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp

195 200 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu

210 215 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

245 250 255

Gly Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 58

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 58

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu

180 185 190

Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu

225 230 235 240

Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 59

<211> 258

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 59

Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu

20 25 30

Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr

35 40 45

Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp

50 55 60

Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe

65 70 75 80

Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala

85 90 95

Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala

100 105 110

Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile

115 120 125

Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala

130 135 140

Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe

145 150 155 160

Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala

165 170 175

Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln

180 185 190

Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His

195 200 205

Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr

210 215 220

Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser

225 230 235 240

Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly

245 250 255

Lys Gln

<210> 60

<211> 257

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 60

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn

50 55 60

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp

65 70 75 80

Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser

85 90 95

Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu

100 105 110

Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn

115 120 125

Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe

130 135 140

Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser

145 150 155 160

Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala

165 170 175

Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn

180 185 190

Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala

195 200 205

Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala

225 230 235 240

Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys

245 250 255

Gln

<210> 61

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 61

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro

130 135 140

Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys

225 230 235 240

Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 62

<211> 252

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность

<400> 62

Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala

1 5 10 15

Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr

20 25 30

Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln

35 40 45

Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys

50 55 60

Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu

65 70 75 80

Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr

85 90 95

Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln

100 105 110

Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile

115 120 125

Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly

130 135 140

Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly

145 150 155 160

Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly

165 170 175

Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser

195 200 205

Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe

210 215 220

Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val

225 230 235 240

Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250

<210> 63

<211> 262

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 63

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

85 90 95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser

100 105 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile

115 120 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

130 135 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His

145 150 155 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser

165 170 175

Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Gly Ile Glu His Leu Lys

180 185 190

Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp

195 200 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu

210 215 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

245 250 255

Gly Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 64

<211> 262

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 64

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

85 90 95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser

100 105 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile

115 120 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

130 135 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His

145 150 155 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr

165 170 175

Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys

180 185 190

Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp

195 200 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu

210 215 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

245 250 255

Ser Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 65

<211> 257

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 65

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly Asn Lys Asp Asn

50 55 60

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp

65 70 75 80

Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser

85 90 95

Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu

100 105 110

Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn

115 120 125

Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Ser Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe

130 135 140

Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser

145 150 155 160

Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys

165 170 175

Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn

180 185 190

Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala

195 200 205

Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala

225 230 235 240

Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys

245 250 255

Gln

<210> 66

<211> 262

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 66

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

85 90 95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser

100 105 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile

115 120 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

130 135 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His

145 150 155 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr

165 170 175

Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys

180 185 190

Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp

195 200 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Asp Ser Glu

210 215 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

245 250 255

Ser Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 67

<211> 262

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 67

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

85 90 95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser

100 105 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Thr Glu Lys Val Asn Asn Pro Asp Lys Thr

115 120 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

130 135 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Val Gly Lys Ser Glu Tyr His

145 150 155 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr

165 170 175

Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys

180 185 190

Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp

195 200 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu

210 215 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

245 250 255

Ser Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 68

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 68

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile Gln His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 69

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 69

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Leu Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Val Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 70

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 70

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 71

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 71

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Arg Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 72

<211> 255

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 72

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Glu Gln Asp Leu Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg

115 120 125

Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 73

<211> 258

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 73

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn

50 55 60

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp

65 70 75 80

Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser

85 90 95

Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu

100 105 110

Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala

115 120 125

Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ser Phe

130 135 140

Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe

145 150 155 160

Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala

165 170 175

Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu

180 185 190

Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His

195 200 205

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser

210 215 220

Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser

225 230 235 240

Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala

245 250 255

Lys Gln

<210> 74

<211> 257

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (group B)

<400> 74

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn

50 55 60

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp

65 70 75 80

Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser

85 90 95

Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu

100 105 110

Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn

115 120 125

Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe

130 135 140

Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser

145 150 155 160

Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala

165 170 175

Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn

180 185 190

Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala

195 200 205

Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala

225 230 235 240

Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys

245 250 255

Gln

<---

Изобретение относится способу индукции иммунного ответа на Neisseria meningitidis у субъекта-человека в возрасте от 10 до 26 лет. Способ включает введение человеку композиции, содержащей (a) жидкую композицию, содержащую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и (б) лиофилизированную композицию, содержащую конъюгированный капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы A, C, W и Y. Изобретение обеспечивает индукцию иммунного ответа на Neisseria meningitidis у субъекта-человека в возрасте от 10 до 26 лет. 21 з.п. ф-лы, 3 ил., 25 табл., 21 пр.

1. Способ индукции иммунного ответа на Neisseria meningitides у субъекта-человека в возрасте от 10 до 26 лет, включающий введение человеку композиции, содержащей (a) жидкую композицию, содержащую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и

(б) лиофилизированную композицию, содержащую

(i) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы A, конъюгированный с линкером на основе дигидразида адипиновой кислоты (ADH) при помощи 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином (TT) с помощью карбодиимидных химических методов;

(ii) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы C, конъюгированный с линкером ADH при помощи 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, где линкер конъюгирован со столбнячным анатоксином с помощью карбодиимидных химических методов;

(iii) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы W, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином при помощи 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера; и

(iv) капсульный сахарид Neisseria meningitides серогруппы Y, непосредственно конъюгированный со столбнячным анатоксином при помощи 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторбората, в отсутствие линкера, где композиция индуцирует иммунный ответ против каждой из серогрупп A, C, W-135 и Y N. meningitidis;

где указанная лиофилизированная композиция восстановлена указанной жидкой композицией; и

где иммунный ответ включает титр сывороточных бактерицидных антител, и где этот титр выше, чем титр, индуцированный композицией, выбранной из любой из (a) композиции, содержащей конъюгаты капсульного полисахарида менингококков N. meningitidis серогрупп A, C, W-135 и Y, где указанная композиция дополнительно не содержит полипептиды N. meningitidis, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; и (б) композиции, содержащей полипептиды N. meningitidis серогруппы B, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, где указанная композиция дополнительно не содержит конъюгаты капсульного полисахарида менингококков N. meningitidis серогрупп A, C, W-135 и Y;

где указанный человек является серонегативным к капсульным полисахаридам N. meningitides серогрупп A, C, W-135 и Y;

где композицию вводят субъекту в первой дозе и второй дозе, и где вторую дозу вводят субъекту примерно через 6 месяцев после первой дозы.

2. Способ по п. 1, где титр выше, чем титр, индуцированный композицией, содержащей конъюгаты капсульного полисахарида менингококков N. meningitidis серогрупп A, C, W-135 и Y, где указанная композиция дополнительно не содержит полипептиды N. meningitidis, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

3. Способ по п. 1, где титр выше, чем титр, индуцированный композицией, содержащей полипептиды N. meningitidis серогруппы B, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, где указанная композиция дополнительно не содержит конъюгаты капсульного полисахарида менингококков N. meningitidis серогрупп A, C, W-135 и Y.

4. Способ по п. 1, где композиция дополнительно содержит адъювант.

5. Способ по п. 1, где композиция дополнительно содержит алюминий.

6. Способ по п. 4, где адъювант содержит гидроксид алюминия.

7. Способ по п. 4, где адъювант содержит фосфат алюминия.

8. Способ по п. 5, где от 90% до 100% количества первого полипептида связано с алюминием в композиции в течение 24 часов.

9. Способ по п.5, где от 90% до 100% количества второго полипептида связано с алюминием в композиции в течение 24 часов.

10. Способ по п. 1, где композиция дополнительно содержит полисорбат-80.

11. Способ по п. 1, где композиция дополнительно содержит Tris-HCl; хлорид натрия; сахарозу; гистидин; полисорбат 80; и фосфат алюминия.

12. Способ по п. 1, где композиция содержит примерно 120 мкг/мл первого полипептида; примерно 120 мкг/мл второго полипептида; примерно 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 10 мМ гистидина; и примерно 161 мМ хлорида натрия.

13. Способ по п. 1, где композиция содержит примерно 60 мкг первого полипептида; примерно 60 мкг второго полипептида; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenA, конъюгированного с примерно 15 мкг TT; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenC, конъюгированного с примерно 15 мкг TT; примерно 5 мкг капсульного сахарида MenW, конъюгированного с примерно 7,5 мкг TT; и примерно 5 мкг капсульного сахарида MenY, конъюгированного с примерно 6,5 мкг TT.

14. Способ по п. 13, где композиция дополнительно содержит Tris-HCl; хлорид натрия; сахарозу; гистидин; полисорбат-80; фосфат алюминия; и воду.

15. Способ по п. 14, где композиция содержит примерно 97 мкг Tris-HCl, pH 6,8±0,3; 4,69-4,71 мг хлорида натрия; примерно 28 мг сахарозы; примерно 0,78 мг L-гистидина; примерно 0,02 мг полисорбата-80; примерно 0,25 мг фосфата алюминия; и воду для достижения общего объема примерно 0,5 мл на дозу.

16. Способ по п. 1, где вводят в общей сложности две дозы композиции.

17. Способ по п. 1, где композиция вызывает иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы B, экспрессирующего A22.

18. Способ по п. 1, где композиция вызывает иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы B, экспрессирующего A56.

19. Способ по п. 1, где композиция вызывает иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы B, экспрессирующего B24.

20. Способ по п. 1, где композиция вызывает иммунный ответ против штамма N. meningitidis серогруппы B, экспрессирующего B44.

21. Способ по п. 1, где композиция индуцирует бактерицидный иммунный ответ против любого из штаммов A22, A56, B24, B44 N. meningitidis серогруппы B или любой их комбинации.

22. Способ по п. 1, где композиция индуцирует бактерицидный иммунный ответ против любого из штаммов B24, B16, B44, A22, B03, B09, A12, A19, A05, A07, B153 N. meningitidis серогруппы B или любой их комбинации.