Способ диагностики болезни Паркинсона с деменцией Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно, к неврологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики болезни Паркинсона с деменцией (БПД).

БПД относится к синуклеинопатиям, заболеваниям, связанным с олигомеризацией белка альфа-синуклеина. Диагноз БПД будет поставлен в том случае, когда деменция начинается более чем через год после проявления моторной симптоматики характерной для болезни Паркинсона (БП) (Патент EA035799B1 12.08.2020). Возникновение и прогрессирование деменции при БП оказывает важное влияние на ведение пациентов, понимание патофизиологии, лежащей в основе когнитивной дисфункции, и имеет решающее значение для разработки терапии. Проблема дифференциальной диагностики синуклеинопатий на сегодняшний день остается актуальной.

В качестве биомаркера при синуклеинопатиях рассматривается оценка уровня белка альфа-синуклеина в различных клетках (клетки периферической крови, фибробласты) и биологических жидкостях (спинномозговая жидкость, слеза, слюна, плазма крови).

В работе (Lin CH, Yang SY, Horng HE, Yang CC, Chieh JJ, Chen HH, Liu BH, Chiu MJ. Plasma α-synuclein predicts cognitive decline in Parkinson’s diseaseJournal of Neurology.// Neurosurgery & Psychiatry. – 2017 – 88 – P. 818-824) пациенты с БП характеризовались повышенным уровнем альфа-синуклеина в плазме крови по сравнению с контролем, при этом уровень альфа-синуклеина в плазме крови у пациентов с БПД был значительно выше по сравнению с пациентами с БП с умеренными когнитивными нарушениями и без них. При оценке уровня олигомерного альфа-синуклеина в спинномозговой жидкости было выявлено статистически значимое повышение у пациентов с БПД по сравнению с лицами контрольной группы (Hansson O, Hall S, Ohrfelt A, Zetterberg H, Blennow K, Minthon L, Nägga K, Londos E, Varghese S, Majbour NK, Al-Hayani A, El-Agnaf OM. Levels of cerebrospinal fluid α-synuclein oligomers are increased in Parkinson's disease with dementia and dementia with Lewy bodies compared to Alzheimer's disease.// Alzheimers Res Ther. – 2014 - №6(3)- P. 25). Известно исследование, в котором проводился мета-анализ 32 статей с участием 2683 пациентов с БП, включая 263 пациента БПД, и 1838 лиц контрольной группы. Согласно результатам исследования, различий в концентрации олигомерного альфа-синуклеина не наблюдалось, в то время как уровень общего альфа-синуклеина достоверно отличался между пациентами с БП, БПД и контрольной группой (Zubelzu M, Morera-Herreras T, Irastorza G, Gómez-Esteban JC, Murueta-Goyena A. Plasma and serum alpha-synuclein as a biomarker in Parkinson's disease: A meta-analysis.// Parkinsonism Relat Disord. – 2022 -№99 – P.107-115). Исходя из рассмотренных выше работ можно сделать предположение, что наличие деменции сопровождается более выраженным нарушением метаболизма альфа-синуклеина.

Сложность при оценке олигомерных форм альфа-синуклеина заключается в контаминации целевых образцов эритроцитами и их гемолизом. Это значительно затрудняет использование уровня олигомерного альфа-синуклеина в качестве биомаркера при БПД, а также других синуклеинопатиях, поскольку полученные результаты могут быть недостоверны в связи с тем, что содержание альфа-синуклеина в эритроцитах во много раз превышает его содержание в других фракциях клеток крови. Для разрешения данной проблемы в работе П.А. Андоскина и др. (П. А. Андоскин, Емельянов, М. А. Николаев, К. А. Сенкевич, В. П. Шилин, А. А. Тимофеева, А. Ф. Якимовский, С. Н. Пчелина. Влияние дофамина плазмы на уровень альфа-синуклеина CD45+клеток крови при болезни Паркинсона. // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова Том XXII № 2 - 2015 - с.14-17), уровень общего белка альфа-синуклеина определялся в однородной фракции CD45+ клеток периферической крови, полученной с помощью магнитного сортинга. Использование CD45+ клеток, полученных путем магнитного сортинга из периферической крови, позволяет исключить из дальнейшего анализа клетки с неоднородным накоплением альфа-синуклеина. Известно, что CD45+ клетки экспрессируют основные белки дофаминергической нейротрансмиссии и, таким образом, отражающих процессы метаболизма альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах. В CD45+ в клетках периферической крови пациентов с БП (n=14) показан повышенный уровень общего альфа-синуклеина по сравнению с контрольной группой (n=17) (p=0,04).

В качестве прототипа рассмотрен патент RU 2657763 C1 от 15.06.2018. В CD45+ в клетках крови пациентов с БП методом ИФА проводилась оценка концентрации олигомерного альфа-синуклеина. Использование данного подхода позволяет диагностировать БП. В прототипе представлен способ диагностики БП, но он не может быть применен для диагностики БПД. К недостаткам данного патента можно отнести, что концентрация олигомерного альфа-синуклеина, определяемая методом ИФА в лизатах CD45+ пациентов с БП, мала и детектировалась на уровне нижней границы чувствительности набора для ИФА.

Технический результат заявленного изобретения заключается в создании способа диагностики болезни Паркинсона с Деменцией.

Заявленный технический результат достигается тем, что для диагностики болезни Паркинсона проводится забор периферической крови у пациентов с последующим выделением однородной фракции CD45+ клеток с помощью магнитного сортинга. В лизате CD45+ клеток измеряют концентрацию общего альфа-синуклеина методом ИФА и при концентрации более или равной 1,90 нг/мкг общего белка диагностируют болезнь Паркинсона с деменцией. Использование способа позволяет сократить стоимость проведения исследования и упрощает его проведение. Концентрация общего альфа-синуклеина, определяемая данным способом, достаточная для детекции в анализируемых образцах.

Способ разработан на основе проведенного исследования по оценке уровня общего альфа-синуклеина в CD45+ клетках в группе пациентов с БПД, которые ранее не проходили лечение содержащих предшественники дофамина (Л-ДОФА-содержащие препараты) (N=27, 12 муж., 15 жен., средний возраст 74,9±5,9 лет, средний возраст начала заболевания 66,1±7,8 лет), по сравнению с соответствующей по возрасту и полу лиц контрольной группой, не имеющих неврологических расстройств (N=159, 76 муж., 83 жен., средний возраст 61,9± 8,9 лет).

При анализе концентрации общего альфа-синуклеина в лизате клеток CD45+ периферической крови (медиана (мин-макс), нг/мкг общего белка), было установлено статистически значимое повышение в группе пациентов с БПД (2.15 (0.01 - 6.01), нг/мкг общего белка) по сравнению с контрольной группой (1.09 (0.01 – 7,62), нг/мкг общего белка) (p<0,0001).

Для оценки возможности использования уровня общего альфа-синуклеина в CD45+ клетках в клинической практике, а именно, для подтверждения диагноза БПД, был проведен ROC-анализ с целью установления порога концентрации вышеуказанной формы белка. Точка отсечения концентрации общего альфа-синуклеина составила 1,90 нг/мкг общего белка. Чувствительность метода составила 69,2%, специфичность метода – 79,11%, индекс точности метода составил: 77,7%, площадь под ROC-кривой составила 0.756 (p<0.0001). Полученные данные позволили установить критерий диагностики БПД.

На фигуре 1 графически представлен уровень общего альфа-синуклеина в CD45+ клетках периферической крови в группе пациентов с БПД и контрольной группе.

На фигуре 2 представлена ROC-кривая концентрации общего альфа-синуклеина в CD45+ клетках периферической крови в группе пациентов с БПД и контрольной группе, а также оптимальное значение пороговой концентрации общего альфа-синуклеина в CD45+ клетках для диагностики БПД.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Забор крови у пациентов проводят из вены в пробирку объёмом 9 мл с ЭДТА. Выделение лимфоцитарной фракции периферической крови производят путём центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare). С целью получения фракции CD45+ клеток осуществляют магнитную сепарацию лимфоцитарной фракции путем смешивания с магнитными микрочастицами (CD45+ MicroBeads, human, Miltenyi Biotec, США), с дальнейшим использованием магнитного ручного сепаратора MACS (Miltenyi Biotec, США) и колонок для сортинга miniMACS типа MS (Miltenyi Biotec, США). В результате получают однородную фракцию CD45+ клеток крови, которую далее замораживают и хранят при температуре -80°С до выполнения ИФА.

Перед выполнением ИФА осуществляют лизис CD45+ клеток крови с использованием набора Total Protein Extraction Kit (Chemicon (Millipore), США) согласно прилагаемой инструкции. Измерение уровня общего белка в клеточных лизатах проводят с использованием набора Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Scientific, США) согласно прилагаемой инструкции. Для проведения ИФА могут быть использованы образцы клеточных лизатов с концентрацией общего белка 6 мкг. Определение концентрации общего альфа-синуклеина в исследуемых образцах проводят на основе метода ИФА с использованием набора Human alpha-synuclein ELISA Kit (Thermo Scientific, США). В данном наборе используются моноклональные антитела, которые специфично связываются с белком альфа-синуклеином. С целью построения стандартной кривой используют соответствующие разведения входящих в набор стандартов общего альфа-синуклеина согласно инструкции. Аналитическая чувствительность вышеуказанного набора составляет 0.23-15 нг/мл. Концентрацию общего альфа-синуклеина определяют путем измерения оптической плотности на планшетном спектрофлюориметре. При концентрации более или равной 1,90 нг/мкг общего белка диагностируют болезнь Паркинсона с деменцией.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами:

1. Пациент 89 лет, со слов пациента – отмечает нарушение равновесия, падения. МРТ головного мозга: МР- картина немногочисленных очагов в белом веществе, выраженная наружная заместительная гидроцефалия. Выявлено нарушение памяти. Пациенту был поставлен диагноз БП, акинетико-ригидная форма, 3,0 стадия по шкале Хен и Яра, осложненная деменцией, постуральными нарушениями, постуральной деформацией. Неврологический статус: в сознании, мнестически снижен: по шкале исследования психического статуса Mini-Mental State Examination (MMSE) - 22 балла и ТРЧ - 4 балла. У пациента был осуществлен забор периферической крови, методом магнитного сортинга выделена однородная фракция CD45+ клеток, в лизате CD45+ клеток измерена концентрация альфа-синуклеина методом ИФА. Концентрация белка составила 1,9 нг/мкг, что позволяет использовать оценку концентрации общего белка альфа-синуклеина в лизате CD45+ клеток методом ИФА в качестве подтверждающей диагностики БПД.

2. Пациентка 71 год, со слов – появление немоторных симптомов заболевания, которые постепенно прогрессируют. Заметила замедленность движений, появилась скованность мышц. Интеллектуально-мнестические функции снижены до деменции легкой степени выраженности: MMSE - 25 баллов, ТРЧ - 7 баллов. Эмоционально несколько снижена. Обоняние снижено, со слов. Поставлен диагноз БП с выраженными когнитивными и легкими психотическими нарушениями (фенотип БПД), акинетико-ригидная форма, 3,0 ст по шкале Хён и Яра, с преимущественным вовлечением левых конечностей, умеренными аффективными, вегетативными расстройствами, выраженными постуральными нарушениями, акатизией, синдромом беспокойных ног. У пациентки был осуществлен забор периферической крови, методом магнитного сортинга выделена однородная фракция CD45+ клеток, в лизате CD45+ клеток измерена концентрация олигомерного альфа-синуклеина. Концентрация белка составила 2,8 нг/мкг, что позволяет использовать оценку концентрации общего белка альфа-синуклеина в лизате CD45+ клеток методом ИФА в качестве подтверждающей диагностики БПД.

Список используемой литературы:

1. Emelyanov A, Usenko T, Nikolaev M, Senkevich K, Kulabukhova D, Lavrinova A, Andoskin P, Miliukhina I, Pchelina S. Increased α-Synuclein Level in CD45+ Blood Cells in Asymptomatic Carriers of GBA Mutations/ // Mov Disord. 2021 Aug;36(8):1997-1998

2. Hansson O, Hall S, Ohrfelt A, Zetterberg H, Blennow K, Minthon L, Nägga K, Londos E, Varghese S, Majbour NK, Al-Hayani A, El-Agnaf OM. Levels of cerebrospinal fluid α-synuclein oligomers are increased in Parkinson's disease with dementia and dementia with Lewy bodies compared to Alzheimer's disease.// Alzheimers Res Ther. – 2014 - №6(3)- P. 25.

3. Lin C, Yang S, Horng H, et alPlasma α-synuclein predicts cognitive decline in Parkinson’s diseaseJournal of Neurology.// Neurosurgery & Psychiatry. – 2017 – 88 – P. 818-824.

4. Zubelzu M, Morera-Herreras T, Irastorza G, Gómez-Esteban JC, Murueta-Goyena A. Plasma and serum alpha-synuclein as a biomarker in Parkinson's disease: A meta-analysis.// Parkinsonism Relat Disord. – 2022 -№99 – P.107-115.

5. П. А. Андоскин, Емельянов, М. А. Николаев, К. А. Сенкевич, В. П. Шилин, А. А. Тимофеева, А. Ф. Якимовский, С. Н. Пчелина. Влияние дофамина плазмы на уровень альфа-синуклеина CD45+клеток крови при болезни Паркинсона. // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова Том XXII № 2 - 2015 - с.14-17.

6. Патент EA035799B1 12.08.2020 METHOD OF TREATING AN ADULT MAMMAL FOR AN AGING-ASSOCIATED IMPAIRMENT.

7. Патент RU 2657763 C1 от 15.06.2018 СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики болезни Паркинсона с деменцией. Проводят забор периферической крови, выделение фракции CD45+ клеток и лизирование выделенной клеточной фракции. В лизате клеток CD45+ измеряют концентрацию общего белка альфа-синуклеина методом иммуноферментного анализа. При концентрации общего альфа-синуклеина более или равной 1,90 нг/мкг общего белка диагностируют болезнь Паркинсона с деменцией. Способ обеспечивает возможность диагностики болезни Паркинсона с деменцией с сокращением стоимости проведения исследования и упрощением его проведения за счет выделения однородной фракции CD45+ клеток из крови пациента с помощью магнитного сортинга и измерения в лизате CD45+ клеток концентрации общего альфа-синуклеина. 2 ил., 2 пр.

Способ диагностики болезни Паркинсона с деменцией, включающий забор периферической крови, выделение фракции CD45+ клеток и лизирование выделенной клеточной фракции, характеризующийся тем, что в лизате клеток CD45+ измеряют концентрацию общего белка альфа-синуклеина методом иммуноферментного анализа и при концентрации общего альфа-синуклеина более или равной 1,90 нг/мкг общего белка диагностируют болезнь Паркинсона с деменцией.