ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к области антител. В частности, настоящее изобретение относится к антителу к полипептиду А, относящемуся к цепи главного комплекса гистосовместимости I класса (MICA), с созреванием аффинности и способам его применения, и более конкретно, к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, молекуле нуклеиновой кислоты, вектору экспрессии, способу получения антитела или его антиген-связывающего фрагмента, рекомбинантной клетке, композиции и ее применению, и лекарственному препарату и его применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Рак представляет собой одно из основных заболеваний, влияющих на выживание и развитие человечества. По последним данным, число новых случаев заболевания раком в мире составляет около 19 миллионов в год, а число смертей, вызванных раком, составляет около 10 миллионов в год. Заболеваемость и смертность от рака имеют тенденцию к росту.
[0003] Кроме хирургического удаления, традиционные способы лечения рака, такие как химиотерапия и радиотерапия, имеют такие недостатки, как значительные побочные эффекты и легкое рецидивирование. В последние годы иммунотерапия, включающая антитела, нацеленные на опухоль, антитела иммунных контрольных точек и биспецифические антитела, стала новым направлением и перспективным подходом к борьбе с раком.
[0004] В последние годы иммунотерапия, представленная PD-1/L1, демонстрирует огромный потенциал. Тем не менее немаловажным фактом является то, что большее количество пациентов не могут получить пользу от терапии, даже если коэффициент общего ответа на одобренную в настоящее время терапию PD-1/L1 с наиболее широкими показаниями составляет до 30%. Молекула иммунной контрольной точки представляет собой ингибирующую молекулу, экспрессируемую на поверхности иммунных клеток, включая Т-клетки, NK-клетки и мононуклеарные макрофаги, способную передавать ингибирующий сигнал в иммунные клетки после связывания с соответствующим лигандом, тем самым подавляя функции иммунных клеток против рака. С одной стороны, поскольку экспрессия лигандов иммунных контрольных точек в опухолях и опухолевых инфильтрирующих лимфоцитах крайне неоднородна, терапия иммунными контрольными точками одного вида не может быть универсальной для всех пациентов, и поэтому большинство пациентов не могут получить пользу от терапии иммунными контрольными точками. С другой стороны, у пациентов, принявших терапию иммунными контрольными точками, могут возникать рецидивы опухоли и толерантность к терапии иммунными контрольными точками, так что непрерывная терапия может не оказать лечебного эффекта. Кроме того, Т-клетки распознают неоантигены, то есть антигены мутаций опухолевых генов, через Т-клеточные рецепторы (TCR) на поверхности. Тем не менее некоторые опухоли, называемые «холодными опухолями», имеют низкую частоту генных мутаций и, таким образом, имеют небольшие разновидности неоантигенов. Существующие способы лечения иммунными контрольными точками, такими как терапия PD-1/L1, направлены на восстановление собственной функции Т-клеток для борьбы с раком. В связи с этим Т-клетки не могут эффективно распознавать «холодные опухоли». Следовательно, терапия иммунными контрольными точками неэффективна в отношении холодных опухолей.
[0005] NK-клетки представляют собой очень важные противораковые иммунные клетки другого типа. NK-клетки имеют отличные от Т-клеток механизмы распознавания. На поверхности NK-клеток экспрессируется ряд активирующих рецепторов, а активирующие рецепторы распознают и связываются с лигандами, экспрессированными на поверхности опухоли. Например, NK-клетки распознают и связываются с лигандами, такими как главный комплекс гистосовместимости I класса полипептидов, связанных с цепями A и B (MICA и MICB), на поверхности опухоли через активирующий рецептор NKG2D, после чего опухолевые клетки активируются и погибают.
[0006] MICA и MICB представляют собой белки, кодированные аутологичными генами, и не экспрессированные в нормальных тканях или клетках. Если клетки становятся опухолевыми в результате злокачественной трансформации, MICA и MICB экспрессируются на поверхностях опухолевых клеток. NK-клетки могут распознавать и уничтожать опухоли посредством взаимодействия NKG2D-MICA/B.
[0007] Опухоли могут подавлять экспрессии MICA/B (в том числе опосредованное металлопротеиназой матрикса сбрасывание MICA/B) на поверхностях клеток посредством различных механизмов. MICA и MICB представляют собой трансмембранный белок I типа, внеклеточные домены которых включают три домена α1, α2 и α3. MICA и MICB связаны с NKG2D через домены α1 и α2. Под воздействием металлопротеиназы матрикса большинство аминокислот внеклеточных доменов MICA/B (в том числе доменов α1 и α2 и части домена α3) сбрасывание с поверхностей опухолевых клеток. NKG2D не может связываться с одной частью домена α3, оставшейся на поверхности клетки. Следовательно, опухоли могут ускользать от иммунного надзора NK-клеток.
[0008] Исследования показывают, что антитело MICA, способное связываться с доменом α3, может ингибировать сбрасывание MICA с поверхности опухоли и дополнительно способствовать NKG2D-MICA/B-опосредованному распознаванию NK-клеток, тем самым ингибируя ускользание опухоли от иммунного ответа. На данный момент только один лекарственный препарат на основе моноклонального антитела MICA (CLN-619) вступает в фазу I клинической стадии. Таким образом, это имеет большое значение для лечения опухолей при разработке лекарственного препарата моноклонального антитела, нацеленного на MICA.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0009] Целью настоящего изобретения является решение по меньшей мере одной из технических проблем, существующих в связанной по меньшей мере в какой-то степени.
[0010] Настоящее изобретение основано на следующих проблемах и фактах, обнаруженных заявителем.
[0011] MICA не экспрессируется в нормальных тканях большинства людей и имеет низкую экспрессию в тканях, таких как только яичник и яичко. Тем не менее активная высокая экспрессия MICA может быть обнаружена в опухолевых тканях, что делает MICA потенциальной мишенью для лечения опухолей. На данный момент на стадии клинических испытаний доступен только одно моноклональное антитело MICA, то есть CLN-619. Кроме того, Genentech разработали антитело MICA (1D5V11 как указано в настоящем изобретении, раскрытом в патенте Genentech). В заключение, MICA представляет собой потенциальную терапевтическую мишень. Очень важно разработать лекарственный препарат на основе моноклонального антитела, нацеленного на MICA.
[0012] В первом аспекте настоящего изобретения представлено антитело или его антиген-связывающий фрагмент. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент включает: последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR2 и последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3, как указано в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно, или как указано в аминокислотных последовательностях, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно; и последовательность вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность вариабельной области легкой цепи CDR2, и последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3, как указано в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно, или как указано в аминокислотных последовательностях, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.
[0013] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент может связываться с MICA с высокой аффинностью.
[0014] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент может дополнительно включать по меньшей мере одно из дополнительных технических свойств, как описано ниже.
[0015] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент включает: последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR1, как указано в SEQ ID NO: 1; последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR2, как указано в SEQ ID NO: 2; последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3, как указано в SEQ ID NO: 3; последовательность вариабельной области легкой цепи CDR1, как указано в SEQ ID NO: 4; последовательность вариабельной области легкой цепи CDR2, как указано в SEQ ID NO: 5; и последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3, как указано в SEQ ID NO: 6.
[0016] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент способны специфически распознаваться.
[0017] В соответствии вариантами осуществления настоящего изобретения антитело включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 7, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи указана в SEQ ID NO: 8.
[0018] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело.
[0019] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент включает последовательность каркасной области тяжелой цепи и последовательность каркасной области легкой цепи, причем по меньшей мере одна часть по меньшей мере одной из последовательности каркасной области тяжелой цепи и последовательность каркасной области легкой цепи получены по меньшей мере из одного мышиного антитела, гуманизированного антитела, полученного от примата антитела или их мутанта.
[0020] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент включает по меньшей мере одну из константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи, причем по меньшей мере одна часть по меньшей мере одной из константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи получена по меньшей мере из одного из гуманизированного антитела, полученного от примата антитела, мышиного антитела или их мутанта.
[0021] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения обе из константной области легкой цепи и константной области тяжелой цепи получены из мышиного антитела IgG1, мышиного антитела IgG2a или их мутанта; или человеческого антитела IgG1, человеческого антитела IgG2, человеческого антитела IgG3, человеческого антитела IgG4 или их мутанта.
[0022] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляет собой по меньшей мере одно из одноцепочечного антитела, мультимерного антитела, антитело для целей трансплантации CDR, Fab-антитело или Fv-антитело.
[0023] Во втором аспекте настоящего изобретения представлена молекула нуклеиновой кислоты. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом.
[0024] Следует отметить, что специалисту в данной области будет понятно, что нуклеиновые кислоты, указанные в описании и формуле настоящего изобретения, в действительности включают любые одну или две комплементарных двойных нитей. Для удобства, в настоящем описании и формуле изобретения, несмотря на то, что в большинстве случаев приводится только одна нить, в действительности раскрывается и другая нить, комплементарная одной нити. Кроме того, нуклеотидные последовательности в настоящем изобретении включают форму ДНК или форму РНК. Если раскрыта одна форма, это означает, что также раскрыта другая форма.
[0025] В третьем аспекте настоящего изобретения представлен вектор экспрессии. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии несет молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом. Вектор экспрессии может включать необязательную контрольную последовательность. Контрольная последовательность функционально связана с указанной молекулой нуклеиновой кислоты. Контрольная последовательность относится к одной или более контрольным последовательностям, которые направляют экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты у хозяина. Вектор экспрессии, представленный в вариантах осуществления настоящего изобретения, может эффективно и существенно экспрессировать указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент в подходящих клетках-хозяевах.
[0026] Вектор экспрессии, представленный в вариантах осуществления настоящего изобретения, может эффективно экспрессировать антитело или его антиген-связывающий фрагмент в подходящих рецепторных клетках. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, разработанные в настоящем изобретении, имеют более высокую специфичность и более высокую безопасность.
[0027] В четвертом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения антитела или его антиген-связывающего фрагмента. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ включает: введение вектора экспрессии в соответствии с третьим аспектом в клетки; и культивацию клеток в условиях, подходящих для экспрессии и секреции белка, с получением антитела или его антиген-связывающего фрагмента.
[0028] Заявителем было обнаружено, что, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть эффективно получены с высокой чистотой и простыми шагами по эксплуатации, и стоимость является низкой.
[0029] В соответствии с некоторыми конкретными способами реализации настоящего изобретения клетки конкретно не ограничены и могут представлять собой прокариотические клетки или эукариотические клетки.
[0030] В соответствии с некоторыми конкретными способами реализации настоящего изобретения клетки представляют собой эукариотические клетки.
[0031] В соответствии с некоторыми конкретными способами реализации настоящего изобретения эукариотические клетки представляют собой клетки млекопитающего. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения, если клетки представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающего, рекомбинантное антитело имеет более высокую эффективность экспрессии.
[0032] В пятом аспекте настоящего изобретения представлена рекомбинантная клетка. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рекомбинантная клетка экспрессирует антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с пятым аспектом, или несет молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом или вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом. Рекомбинантную клетку получают посредством трансфекции или трансформации вектора экспрессии. В соответствии с некоторыми конкретными способами реализации настоящего изобретения рекомбинантная клетка может эффективно и существенно экспрессировать антитело или его антиген-связывающий фрагмент в подходящих условиях.
[0033] В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения рекомбинантная клетка может эффективно и существенно экспрессировать антитело или его антиген-связывающий фрагмент в подходящих условиях. Указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент имеет более высокую специфичность, более длинный период полужизни и более высокую эффективность, и лекарственный препарат на основе антитела может быть доставлен в целевые клетки в более низкой дозе, тем самым эффективно излечивая или предотвращая опосредованное MICA заболевание. Более того, рекомбинантная клетка имеет более низкую токсичность и побочные эффекты, и более высокую безопасность.
[0034] Следует отметить, что рекомбинантная клетка по настоящему изобретению конкретно не ограничена, и она может представлять собой прокариотическую клетку, эукариотическую клетку или фаг. Прокариотическая клетка может представлять собой Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces или Proteus mirabilis. Эукариотическая клетка включает: грибы, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces и Trichoderma; клетки насекомого, такого как совка травяная; клетки растения, такого как табак; и клетки млекопитающего, такие как клетки BHK, клетки CHO, клетки COS, и клетки миеломы. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные клетки по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой клетки млекопитающего, в том числе клетки BHK, клетки CHO, клетки NSO или клетки COS и не включают зародышевые клетки животных, оплодотворенную яйцеклетку или эмбриональные стволовые клетки.
[0035] Следует отметить, что «подходящие условия» в описании настоящего изобретения относятся к условиям, подходящим для экспрессии антитела или его антиген-связывающего фрагмента по настоящему изобретению. Специалистам в данной области будет легко понять, что условия, подходящие для экспрессии антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включают без ограничения подходящий режим трансформации или трансфекции, подходящие условия трансформации или трансфекции, здоровое состояние клетки-хозяина, подходящую плотность клеток-хозяев, подходящую культуральную среду и подходящий период культивирования. «Подходящие условия» особым образом не ограничиваются. Наиболее подходящие условия для экспрессии антитела или его антиген-связывающего фрагмента могут быть оптимизированы специалистами в данной области на основе конкретной лабораторной среды.
[0036] В шестом аспекте настоящего изобретения представлена композиция. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения композиция включает антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом, молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом, вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом или рекомбинантную клетку в соответствии с пятым аспектом.
[0037] Как указано выше, антитело или его антиген-связывающий фрагмент в некоторых конкретных способах реализации настоящего изобретения может эффективно связываться с белком MICA человека и, таким образом, может эффективно ингибировать пролиферацию опухолевых клеток. Таким образом, композиция, включающая вышеуказанные вещества, также может эффективно связываться с белком MICA человека и оказывать превосходное воздействие на предотвращение и/или лечение заболеваний, опосредованных MICA. Тип композиции специально не ограничивается. Композиция может представлять собой пищевую композицию или фармацевтическую композицию.
[0038] Композиции по настоящему изобретению можно комбинировать между собой или их можно вводить в сочетании с одним или более других терапевтических соединений, например, в сочетании с химиотерапевтическим средством. Следовательно, композиция может дополнительно включать химиотерапевтическое средство. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии или рекомбинантная клетка по настоящему изобретению могут быть в комбинации со вторым терапевтическим средством. Иллюстративные средства второго терапевтического средства включают без ограничения: другие реагенты, которые ингибируют активность MICA, включая другие антитела или их антиген-связывающие фрагменты, пептидные ингибиторы, низкомолекулярные антагонисты и т.д.; и/или средства, предотвращающие передачу сигнала MICA выше или ниже по ходу транскрипции.
[0039] В некоторых способах реализациях композиция включает комбинации, разделенные во времени или пространстве, при условии, что цель настоящего изобретения может быть достигнута на основе взаимодействия комбинаций. Например, компоненты композиции можно применять субъекту целиком или по отдельности. Если компоненты, содержащиеся в композиции, применяются к субъекту по отдельности, соответствующие компоненты могут применяться к субъекту одновременно или последовательно.
[0040] В общем, антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят в эффективной дозе, которая представляет собой дозу, достаточную для достижения ожидаемого эффекта лечения и/или профилактики. Например, эффективная доза представляет собой дозу, способную предотвращать или облегчать симптомы, связанные с заболеванием, подлежащим лечению, которое относится, например, к заболеванию, связанному с MICA. Эффективная доза композиции, вводимая субъекту, зависит от типа и тяжести заболевания, а также характеристик индивида, например, общего состояния здоровья, возраста, пола, веса и толерантности к лекарственному препарату. Эффективная доза в дальнейшем зависит от тяжести и типа заболевания. Подходящая доза может быть определена специалистами в данной области в соответствии с данными факторами.
[0041] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, композиция по настоящему изобретению обладает теми же терапевтическими эффектами, что и антитело или его антиген-связывающий фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии или рекомбинантная клетка, при введении в организм.
[0042] В седьмом аспекте настоящего изобретения представлено применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом, молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом, вектора экспрессии в соответствии с третьим аспектом, рекомбинантной клетки в соответствии с пятым аспектом или композиции в соответствии с шестым аспектом в получении лекарственного препарата. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения лекарственный препарат применяют для предупреждения и/или лечения MICA-опосредованного заболевания. Как указано выше, антитело или его антиген-связывающий фрагмент в некоторых конкретных способах реализации настоящего изобретения может эффективно связываться с белком MICA человека. Следовательно, лекарственный препарат, включающий антитело или его антиген-связывающий фрагмент в эффективной дозе, или ряд веществ на их основе могут также эффективно связываться с белком MICA человека, и, таким образом, могут иметь превосходный эффект предупреждения и/или лечения MICA-опосредованного заболевания, такого как рак.
[0043] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения MICA-опосредованное заболевание представляет собой рак.
[0044] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак представляет собой по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0045] В восьмом аспекте настоящего изобретения представлен лекарственный препарат. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения лекарственный препарат включает антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом, молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом, вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом, рекомбинантную клетку в соответствии с пятым аспектом или композицию в соответствии с шестым аспектом. Лекарственный препарат применяют для предупреждения и/или лечения MICA-опосредованного заболевания.
[0046] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения MICA-опосредованное заболевание представляет собой рак.
[0047] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак представляет собой по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0048] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения лекарственный препарат может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.
[0049] Эффективная доза антитела или его антиген-связывающего фрагмента по настоящему изобретению может варьировать в зависимости от способа введения и тяжести заболевания, подлежащего лечению. Предпочтительно эффективная доза может быть определена специалистом в данной области на основании различных факторов (например, посредством клинического испытания). Факторы включают без ограничения: фармакокинетические параметры активных ингредиентов, например, биодоступность, метаболизм и период полувыведения; тяжесть подлежащих лечению заболеваний пациентов; вес пациентов; состояние иммунитета больных; и пути введения. Нпример, в зависимости от неотложных требований состояния лечения отдельные дозы можно вводить несколько раз в день или доза может быть пропорционально уменьшена.
[0050] В девятом аспекте настоящего изобретения представлено применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом, молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом, вектора экспрессии в соответствии с третьим аспектом или рекомбинантной клетки в соответствии с пятым аспектом в получении набора. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения набор применяют для обнаружения MICA. Как указано выше, антитело или его антиген-связывающий фрагмент в некоторых конкретных способах реализации настоящего изобретения может эффективно связываться с белком MICA человека. Следовательно, антитело или его антиген-связывающий фрагмент можно применять для получения набора для обнаружения белка MICA. С использованием данного набора можно эффективно провести качественное или количественное обнаружение белка MICA человека.
[0051] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения набор может эффективно и точно обнаруживать MICA, тем самым экономя время и затраты на исследование для клинического лечения.
[0052] В десятом аспекте настоящего изобретения представлен набор. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения набор включает антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом, молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом, вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом или рекомбинантную клетку в соответствии с пятым аспектом.
[0053] Как указано выше, антитело или его антиген-связывающий фрагмент в некоторых конкретных способах реализации настоящего изобретения может эффективно связываться с белком MICA человека. Таким образом, с использованием набора, включающего антитело или его антиген-связывающий фрагмент, можно эффективно осуществлять качественное или количественное обнаружение белка MICA человека. Набор, представленный в настоящем изобретении, например, может представлять собой набор, включающий специфическое связывание MICA человека и антитела, например, набор для иммуноблоттинга или набор для иммунопреципитации. Такой набор может включать любые или несколько антагонистов, антител к MICA или эталонных материалов лекарственных препаратов; колонки для очистки белков; буферные средства для аффинной очистки иммуноглобулинов; разбавители для определения клеток; руководство или литературу. Антитела к MICA можно использовать для диагностических испытаний разных типов, например, для обнаружения существования различных заболеваний или лекарственных препаратов, токсинов или других белков in vitro или in vivo; например, для диагностики сопутствующих заболеваний посредством обнаружения сыворотки или крови субъектов и для проведения научных исследований. Белок MICA человека в образце, подлежащем обнаружению, обнаруживают с использованием набора. Сопутствующие заболевания могут включать заболевания, связанные с MICA, такие как рак. Несомненно, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, представленные в настоящем изобретении, можно также применять для радиоиммунологического анализа и радиоиммунотерапии приведенных выше заболеваний. Что касается вышеуказанных сценариев применения, также применима связывающая молекула, которая не описана подробно в данном документе.
[0054] В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения набор может дополнительно включать, например, раствор покрытия, который является обычным для обнаружения MICA.
[0055] В одиннадцатом аспекте настоящего изобретения представлен способ лечения или предупреждения сопутствующего заболевания, вызванного MICA. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ включает шаг введения субъекту по меньшей мере одного из: 1) антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом; 2) молекула нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом; 3) вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом; 4) рекомбинантная клетка в соответствии с пятым аспектом; 5) композиция в соответствии с шестым аспектом; и 6) лекарственный препарат в соответствии с восьмым аспектом. Как упоминалось выше, антитело или его антиген-связывающий фрагмент может связываться с белком MICA человека, тем самым эффективно излечивая или предупреждая сопутствующее заболевание, вызванное MICA, такое как рак. Следовательно, способ в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения может эффективно излечивать или предупреждать сопутствующее заболевнаие, вызванное MICA.
[0056] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак включает по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0057] В двенадцатом аспекте настоящего изобретения представлен способ диагностики MICA-опосредованного заболевания. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ включает шаг обнаружения MICA в образце для обнаружения посредством применения по меньшей мере одного из: 1) антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом; 2) молекула нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом; 3) вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом; и 4) рекомбинантная клетка в соответствии с пятым аспектом. Содержание MICA в образце для обнаружения определяют на основании результата обнаружения MICA. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, представленные в настоящем изобретении, или антитела или их антиген-связывающие фрагменты, экспрессированные молекулой нуклеиновой кислоты, вектором экспрессии и рекомбинантной клеткой по настоящему изобретению, могут эффективно связываться с белком MICA человека. Следовательно, способ по настоящему изобретению может эффективно обнаруживать содержание MICA в образце для обнаружения, полученном от субъекта, и, таким образом, способ может дополнительно эффективно диагностировать сопутствующие заболевания, вызванные MICA.
[0058] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, способ диагностики заболевания может дополнительно включать по меньшей мере одно дополнительное техническое свойство, как указано ниже.
[0059] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, признаком того, что образец для обнаружения получен от пациента с сопутствующим заболеванием, вызванным MICA, является то, что содержание MICA в образце для обнаружения не ниже самого низкого стандарта страдания от такого заболевания. Значение наименьшего стандарта может быть определено посредством проведения сравнительного анализа различий и проверки содержания MICA в подлежащих обнаружению образцах, полученных от большого количества людей, страдающих заболеванием, опосредованным MICA, и большого количества здоровых людей.
[0060] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, образец для обнаружения включает по меньшей мере одно из крови, слюны, пота, тканей, клеток, крови, сыворотки крови, плазмы, экскременты и моча.
[0061] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения сопутствующие заболевания, вызванные MICA, включают рак.
[0062] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак включает по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0063] В тринадцатом аспекте настоящего изобретения представлен способ для постановки сопутствующего заболевания, вызванного MICA. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ включает шаг обнаружения MICA в образце для обнаружения посредством применения по меньшей мере одного из: 1) антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом; 2) молекула нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом; 3) вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом; и 4) рекомбинантная клетка в соответствии с пятым аспектом. Содержание MICA в образце для обнаружения определяют на основании результата обнаружения MICA. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, представленные в настоящем изобретении, или антитела или их антиген-связывающие фрагменты, экспрессированные молекулой нуклеиновой кислоты, вектором экспрессии и рекомбинантной клеткой по настоящему изобретению, могут эффективно связываться с белком MICA человека. Таким образом, способ по настоящему изобретению может эффективно обнаруживать содержание MICA в образце для обнаружения от субъекта, и, таким образом, способ может дополнительно оценивать стадию сопутствующего заболевания, вызванного MICA, на основе содержания MICA.
[0064] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, способ определения стадии заболевания может дополнительно включать по меньшей мере одно из дополнительных технических свойств, как показано ниже.
[0065] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, признаком того, что образец для обнаружения получен от пациента с опухолью IV стадии, является то, что содержание MICA в образце для обнаружения не ниже стандартного уровня пациентов, страдающих опухолью IV стадии; признаком того, что образец для обнаружения получен от пациента с опухолью стадии III, является то, что содержание MICA в образце для обнаружения находится между стандартным уровнем пациентов, страдающих опухолью стадии IV, и стандартный уровень пациентов, страдающих опухолью III стадии; признаком того, что образец для обнаружения получен от пациента с опухолью II стадии, является то, что содержание MICA в образце для обнаружения находится между стандартным уровнем пациентов, страдающих опухолью III стадии, и стандартным уровнем пациентов, страдающих опухолью II стадии; и признаком того, что образец для обнаружения получен от пациента с опухолью I стадии, является то, что содержание MICA в образце для обнаружения находится между стандартным уровнем пациентов, страдающих опухолью I стадии, и стандартным уровнем пациентов, страдающих опухолью II стадии. Специалисты в данной области могут понять, что у пациентов, страдающих опухолями стадий I, II, III и IV, уровень MICA варьирует в зависимости от разных типов опухолей; и стадии опухоли можно определить посредством сравнения содержания MICA в обнаруживаемом образце со стандартным уровнем MICA на соответствующей стадии опухоли или посредством сравнения содержания MICA в образце для обнаружения с содержанием MICA в образцах от индивидов или групп на известной стадии заболевания. Значения стандартных уровней на стадиях опухоли I, II, III и IV могут быть определены посредством проведения сравнительного анализа различий и проверки содержания MICA в образцах для обнаружения большого числа индивидов, страдающих сопутствующими заболеваниями, вызванными MICA и большого количества здоровых индивидов.
[0066] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, образец для обнаружения включает по меньшей мере одно из крови, слюны, пота, тканей, клеток, крови, сыворотки крови, плазмы, экскременты и моча.
[0067] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения сопутствующие заболевания, вызванные MICA, включают рак.
[0068] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак включает по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0069] В четырнадцатом аспекте настоящего изобретения представлен способ оценки прогноза сопутствующего заболевания, вызванного MICA. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ включает шаг обнаружения MICA в образце для обнаружения посредством применения по меньшей мере одного из: 1) антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом; 2) молекула нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом; 3) вектор экспрессии в соответствии с третьим аспектом; и 4) рекомбинантная клетка в соответствии с пятым аспектом. Содержание MICA в образце для обнаружения определяют на основании результата обнаружения MICA. Как упоминалось выше, содержание MICA оказывает существенное влияние на рак. После лечения индивидов, страдающих сопутствующими заболеваниями, прогноз заболеваний можно эффективно оценивать посредством мониторинга содержания MICA в тканях или экскрементах (периферическая кровь и моча) индивидов, например, посредством сравнения содержания MICA в организме субъектов до и после лечения, или сравнение содержания MICA в организме субъектов после лечения с уровнем MICA нормальных индивидов или больных индивидов. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, представленные в настоящем изобретении, или антитела или их антиген-связывающие фрагменты, экспрессированные молекулой нуклеиновой кислоты, вектором экспрессии и рекомбинантной клеткой по настоящему изобретению, могут эффективно связываться с MICA человека. Таким образом, способ по настоящему изобретению может эффективно обнаруживать содержание MICA в образце для обнаружения от проходящих испытание индивидов, и, таким образом, способ может дополнительно оценивать стадию сопутствующих заболеваний, вызванных MICA, на основе содержания MICA.
[0070] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, способ оценки прогноза заболевания может дополнительно включать по меньшей мере одно из дополнительных технических свойств, как показано ниже.
[0071] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, образец для обнаружения получен от пациентов, страдающих сопутствующим заболеванием, вызванным MICA, до и после лечения.
[0072] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, образец для обнаружения включает по меньшей мере одно из крови, слюны, пота, тканей, клеток, крови, сыворотки крови, плазмы, экскременты и моча.
[0073] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, прогностический эффект сопутствующего заболевания, вызванного MICA, определяют на основании содержания MICA в образце для обнаружения от пациента, страдающего сопутствующим заболеванием, вызванным MICA, до и после лечения.
[0074] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения сопутствующие заболевания, вызванные MICA, включают рак.
[0075] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак включает по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0076] В пятнадцатом аспекте настоящего изобретения представлено применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом, молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом, вектора экспрессии в соответствии с третьим аспектом, рекомбинантной клетки в соответствии с пятым аспектом, композиции в соответствии с шестым аспектом или лекарственного препарата в соответствии с восьмым аспектом в лечении или предупреждении сопутствующего заболевания, вызванного MICA. Как упоминалось выше, антитело или его антиген-связывающий фрагмент может эффективно связываться с MICA человека, тем самым эффективно излечивая или предупреждая сопутствующее заболевание, вызванное MICA.
[0077] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, применение может дополнительно включать одно из дополнительных технических свойств, как показано ниже.
[0078] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения сопутствующие заболевания, вызванные MICA, включают рак.
[0079] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак включает по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0080] В шестнадцатом аспекте настоящего изобретения представлено применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом, молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом, вектора экспрессии в соответствии с третьим аспектом или рекомбинантной клетки в соответствии с пятым аспектом в диагностике MICA-опосредованного заболевания, определении стадии заболевания, опосредованного MICA или оценке прогноза заболевания, опосредованного MICA. Как указано выше, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, представленные в настоящем изобретении, или антитела или их антиген-связывающие фрагменты, экспрессированные молекулой нуклеиновой кислоты, вектором экспрессии и рекомбинантной клеткой могут эффективно связываться с MICA человека. Таким образом, способ по настоящему изобретению может эффективно определять содержание MICA в образцах для обнаружения индивидов, проходящих испытание, а также осуществлять эффективную диагностику, определение стадии и оценку прогноза заболеваний, опосредованных MICA.
[0081] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, применение может дополнительно включать одно из дополнительных технических свойств, как показано ниже.
[0082] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения сопутствующие заболевания, вызванные MICA, включают рак.
[0083] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения рак включает по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и рак головы и шеи.
[0084] «Субъект» или «индивид», включенный в настоящее изобретение, относится к млекопитающему, например, примату и/или грызуну, особенно человеку, обезьяне или мыши.
Положительные эффекты настоящего изобретения
[0085] 1) По сравнению с материнским антителом h5A1 и однородным антителом CLN-619 (Cullinan, на клинической стадии I), антитело h5A1002 с созреванием аффинности, полученное в настоящем изобретении, обладает более высокой связывающей активностью.
[0086] 2) По сравнению с материнским антителом h5A1 и однородным антителом CLN-619 (Cullinan, на клинической стадии I), антитело h5A1002 с созреванием аффинности, полученное в настоящем изобретении, может более интенсивно стимулировать активность мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) для уничтожения опухоли.
[0087] 3) По сравнению с однородным антителом CLN-619 (Cullinan, на клинической стадии I), антитело h5A1002 с созреванием аффинности, полученное в настоящем изобретении, обладает более низкой эндоцитарной активностью и обладает более высокой лекарственной способностью при использовании в качестве моноклонального антитела или двойного антитела.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0088] Вышеуказанные и/или дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными и будут легко поняты из описаний вариантов осуществления в сочетании с графическими материалами, приведенными ниже.
[0089] Фиг. 1 представляет собой диаграмму результата SPR для определения аффинности материнского гуманизированного антитела h5A1 в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения к белку MICA;
[0090] Фиг. 2 представляет собой диаграмму результата SPR для определения аффинности антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения к белку MICA;
[0091] Фиг. 3 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с белком MICA*002-Fc;
[0092] Фиг. 4 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с белком MICA*005-Fc;
[0093] Фиг. 5 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с белком MICA*008-Fc;
[0094] Фиг. 6 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с белком MICA*004-Fc;
[0095] Фиг. 7 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с белком MICB*001-Fc;
[0096] Фиг. 8 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с белком MICB*005-Fc;
[0097] Фиг. 9 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с клетками A-375 злокачественной меланомы человека;
[0098] Фиг. 10 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии связывания материнского антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения с клетками HCT-15 колоректального рака человека;
[0099] Фиг. 11 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с белком MICA*002-Fc;
[00100] Фиг. 12 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с белком MICA*005-Fc;
[00101] Фиг. 13 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с белком MICA*008-Fc;
[00102] Фиг. 14 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с белком MICA*004-Fc;
[00103] Фиг. 15 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с белком MICB*001-Fc;
[00104] Фиг. 16 представляет собой диаграмму результата ELISA связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с белком MICB*005-Fc;
[00105] Фиг. 17 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с клетками A-375 злокачественной меланомы человека;
[00106] Фиг. 18 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с клетками A549 немелкоклеточного рака легкого у человека;
[00107] Фиг. 19 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с клетками HCT-15 колоректального рака человека;
[00108] Фиг. 20 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с клетками MDA-MB-231 рака молочной железы человека;
[00109] Фиг. 21 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с клетками HCT-15 колоректального рака человека в сравнении с антителом h5A1002-биотин;
[00110] Фиг. 22 представляет собой диаграмму результата проточной цитометрии эндоцитоза антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения и однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) с клетками MDA-MB-231 рака молочной железы человека;
[00111] Фиг. 23 представляет собой диаграмму результата эффекта антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения относительно стимуляции PBMC для уничтожения клеток A-375 злокачественной меланомы человека;
[00112] Фиг. 24 представляет собой диаграмму результата эффекта антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения и однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) относительно стимуляции PBMC для уничтожения клеток HCT-15 колоректального рака человека; и
[00113] Фиг. 25 представляет собой диаграмму результата эффекта антитела h5A1002 с созреванием аффинности в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения и однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) относительно стимуляции PBMC для уничтожения клеток A-375 колоректального рака человека.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00114] Варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны ниже. Варианты осуществления, описанные ниже, являются иллюстративными, используются только для объяснения настоящего изобретения и не могут пониматься как ограничение настоящего изобретения.
[00115] Следует отметить, что термины «первое» и «второе» используются только в описательных целях, но не могут пониматься как указание или значение относительной важности или подразумеваемое указание количества указанных технических свойств. Таким образом, свойства, определенные как «первое» и «второе», могут явно или неявно включать одно или более свойство. Кроме того, в описаниях настоящего изобретения, если не указано иное, значение «более» относится к двум или более чем двум.
[00116] В настоящем изобретении термин «включает» или «содержит» представляет собой открытое включающее выражение, т.е., включающее содержание, указанное в настоящем изобретении, но не исключая другое содержание.
[00117] В настоящем изобретении термины «необязательно» и «необязательный» обычно означают, что последующие события или статусы могут произойти, но не обязательно; и описания включают условия, при которых происходят события или состояния, и условия, при которых события или состояния не происходят.
[00118] Для облегчения понимания настоящего изобретения, ниже приведены конкретные определения некоторых технических и научных терминов. Если явно и четко не определено в других частях настоящего документа, все другие технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют значения, обычно понятные специалистам в области настоящего изобретения. Сокращение аминокислотных остатков представляет собой стандартный 3-буквенный и/или 1-буквенный код, который относится к одной из 20 широко используемых L-аминокислот в данной области.
[00119] Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению обычно получают посредством способа биосинтеза. В соответствии с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению кодированные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть обычно получены специалистом в данной области с использованием различных известных способов. Например, данные способы включают без ограничения: ПЦР, искусственный синтез ДНК и т.д. Конкретный способ может относиться к J. Sambrook, Molecular Cloning: Laboratory Manual. В качестве реализации настоящего изобретения кодированные последовательности нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы посредством способа синтеза нуклеотидных последовательностей посредством стадий и проведения ПЦР с удлинением перекрытия. Антитела или фрагмент антигена нумеруются и определяются по системе нумерации Кабата.
[00120] В настоящем изобретении «моноклональное антитело» относится к антителу с одним антиген-связывающим сайтом.
[00121] В настоящем изобретении «поликлональное антитело» относится к антителу с двумя или более различными антиген-связывающими сайтами.
[00122] В настоящем изобретении термин «мутант» или «вариант» могут относиться к молекуле, полученной посредством осуществления мутации одного или более нуклеотидов или аминокислот на любой природной или сконструированной молекуле.
[00123] Термин «определяющая комплементарность область» или «CDR» или «последовательность CDR» относится к аминокислотной последовательности для связывания антигена в антителе, и, например, обычно она включает: аминокислотные остатки около 23-34(L1), 50-56(L2) и 89-97(L3) в вариабельной области легкой цепи, и аминокислотные остатки около 31-35B(H1), 50-65(H2) и 95-102(H3) в вариабельной области тяжелой цепи (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)); и/или аминокислотные остатки из «гипервариабельной петли» (например, аминокислотные остатки около 26-32(LI), 50-52(L2) и 91-96(L3) в вариабельной области легкой цепи, и около 26-32(H1), 53-55(H2) и 96-101(H3) в вариабельной области тяжелой цепи) (Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987)).
[00124] «Функциональная связь» в настоящем изобретении означает, что экзогенный ген связан с вектором, что позволяет контрольным компонентам в векторе, таким как транскрипционный контроль последовательности и трансляционный контроль последовательности, оказывать ожидаемый эффект регулирования транскрипции и трансляции экзогенного гена. Если молекулы нуклеиновой кислоты связаны с вектором, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть прямо или косвенно связаны с контрольными компонентами вектора, при условии, что данные контрольные компоненты могут контролировать трансляцию и экспрессию молекул нуклеиновой кислоты. Данные контрольные компоненты могут быть непосредственно получены из вектора, а также могут быть экзогенными, то есть происходить не из вектора. Специалисту в данной области будет понятно, что молекула нуклеиновой кислоты, применяемая для кодирования антитело или антиген-связывающий фрагмент могут быть соответственно и независимо вставлены в различные векторы, и обычно вставлены в один и тот же вектор. Обычными векторами, например, могут быть плазмиды, фаги и т.д., такие как Plasmid-X.
[00125] В настоящем изобретении, если термины «идентичность», «гомология» или «подобие» применяют для описания аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот относительно эталонной последовательности, процент одинаковых аминокислоты или нуклеотида между двумя аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты определяют посредством обычного способа, например, в соответствии с Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1995, New York); и программой ALIGN (Dayhoff (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl.3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Для выравнивания последовательности и определения идентичности последовательности применяют различные алгоритмы, в том числе: алгоритм выравнивания по гомологии Needleman et al. (1970) J.Mol.Biol.48: 443; алгоритм локальной гомологии Smith et al. (1981) Adv.Appl.Math.2: 482; метод поиска сходства Pearson et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.85: 2444; алгоритм Smith-Waterman (Meth.Mol.Biol.70: 173-187(1997)); и алгоритмы BLASTP, BLASTN и BLASTX (ссылаясь на Altschul et al. (1990) J.Mol.Biol.215: 403-410). Также доступны компьютерные программы, использующие данные алгоритмы, и они включают без ограничения: программное обеспечение ALIGN или Megalign (DNASTAR), или WU-BLAST-2 (Altschul et al., Meth. Enzym., 266: 460-480(1996)); или GAP, BESTFIT, BLAST Altschul etc., FASTA и TFASTA, доступные в пакете Genetics Computing Group (GCG), версия 8, Мэдисон, Висконсин, США; и CLUSTAL в программе PC/Gene, представленной Intelligenetics, Маунтин Вью, Калифорния.
[00126] Без существенного влияния на активность антитела (оставшиеся по меньшей мере 95% активности), замещение, добавление и/или делеция одной или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, или более) могут проводиться специалистами в данной области на последовательностях в настоящем изобретении с получением вариантов последовательностей антитела или их функциональных фрагментов. Данные варианты могут рассматриваться как включенные в объем охраны настоящего изобретения. Например, аминокислоты с подобными свойствами замещены в вариабельной области. Последовательности вариантов в настоящем изобретении могут иметь однородность (или гомологию) по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% эталонной последовательности. Однородность последовательности по настоящему изобретению может быть измерена с использованием программного обеспечения для анализа последовательности, например, компьютерной программы BLAST с использованием параметра по умолчанию, в частности, BLASTP или TBLASTN. Аминокислотные последовательности по настоящему изобретению показаны в порядке от конца N до C.
[00127] Как упоминалось выше, моноклональное антитело по настоящему изобретению может представлять собой полноразмерное антитело или может включать только его функциональные фрагменты (такие как фрагменты Fab, F(ab')2 или scFv) или может быть модифицировано для воздействия на функцию. Антитело по настоящему изобретению включает антитело к MICA с модифицированным режимом гликозилирования. В некоторых случаях может оказаться полезным проведение модификации для удаления неожиданных сайтов гликозилирования или отсутствия фукозной части в олигосахаридной цепи, например, для усиления антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В некоторых других способах применения модификация галактозилирования может быть выполнена для изменения комплементзависимой цитотоксичности (CDC).
[00128] В настоящем изобретении «полноразмерное антитело» имеет структуру тетрапептидной цепи, образованную посредством соединения двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей посредством межцепочечных дисульфидных связей, таких как иммуноглобулин G (IgG), иммуноглобулин A (IgA), иммуноглобулин M (IgM), иммуноглобулин D (IgD) или иммуноглобулин E (IgE). Иммуноглобулины одного класса также можно разделить на разные подклассы по аминокислотным компонентам, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкая цепь иммуноглобулина делится на κ-цепь или λ-цепь в соответствии с различными константными областями.
[00129] Термин «функциональный фрагмент», используемый в настоящем изобретении, в частности, относится к фрагменту антитела, такому как антитело для целей трансплантации CDR, Fab, Fab', (Fab')2, Fv или scFv, нанотело, или любому фрагменту, который может продлевать период полужизны за счет химической модификации или посредством введения в липидосому. Химическая модификация, например, относится к добавлению поли(алкилен)гликоля, такого как полиэтиленгликоль («пегилирование, ПЭГилирование») (фрагмент пэгилирования, называемый Fv-ПЭГ, scFv-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab')2 -ПЭГ или Fab'-ПЭГ) («ПЭГ» представляет собой полиэтиленгликоль); и данный фрагмент обладает активностью связывания MICA. Предпочтительно, функциональный фрагмент состоит из частичных последовательностей в вариабельной область тяжелой или легкой цепи исходного антитела или включает частичные последовательности. Частичные последовательности достаточны для сохранения специфичности связывания, идентичной исходному антитело, и достаточной аффинности для MICA, предпочтительно по меньшей мере равной 1/100 от аффинности исходного антитело, по меньшей мере равную 1/10 в более предпочтительном режиме. Функциональный фрагмент включает по меньшей мере 3 аминокислоты, предпочтительно, 5, 10, 15, 25, 50 и 100 непрерывных аминокислот в последовательности исходного антитела.
[00130] В настоящем изобретении, если не указано иное, применяемый термин «антиген-связывающий фрагмент» обычно относится к антиген-связывающему фрагменту антитела, и он может включать одну часть полноразмерного антитела, обычно антиген-связывающую область или вариабельную область, например, включая антитело для целей трансплантации CDR, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv или scFv, нанотело, и т.д.
[00131] В настоящем изобретении термин «антитело для целей трансплантации CDR» относится к трансплантации CDR моноклонального антитела одного вида в вариабельную область антитела другого вида. Например, CDR мышиного моноклонального антитела может быть трансплантирована в вариабельную область гуманизированного антитела для замещения CDR гуманизированного антитела, так что гуманизированное антитело получает антиген-связывающую специфичность мышиного моноклонального антитела, снижая таким образом гетерологичность антитела.
[00132] В настоящем изобретении термин «антитело Fab» или «Fab» обычно относится к антителу, включающему только молекулы Fab, и состоит из VH и CH1 тяжелой цепи и полной легкой цепи, причем легкая цепь и тяжелая цепь связаны дисульфидными связями.
[00133] В настоящем изобретении термин «нанотело» (одиночный домен антитела или VHH антитела) первоначально описывался как антиген-связывающий (вариабельный) домен иммуноглобулина «антитело тяжелой цепи» (то есть «у антитела отсутствует легкая цепь») (Hamers-Casterman C, AtarhouchT, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: “Naturally occurring antibodies devoid of light chains”; Nature 363 ,446-448(1993)), включает только вариабельную область тяжелой цепи (VH) и обычные области CH2 и CH3 и специфически связывается с антигеном через вариабельная область тяжелой цепи.
[00134] В настоящем изобретении термин «антитело Fv» обычно относится к антителу, образованному посредством соединения вариабельной области легкой цепи (VL) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) посредством нековалентных связей, и представляет собой минимальный функциональный фрагмент молекулы антитела, который остается полным сайтом связывания антигена.
[00135] В настоящем изобретении термин «одноцепочечное антитело» или «scFv» представляет собой фрагмент, образованный посредством соединения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела посредством короткоцепочечного полипептида.
[00136] В настоящем изобретении термин «эффективное количество» или «эффективная доза» относится к количеству, которое может обеспечивать функции или активность для людей и/или животных и может приниматься людьми и/или животными.
[00137] В настоящем изобретении «фармацевтически приемлемый» компонент представляет собой вещество, которое применяют для людей и/или млекопитающих без чрезмерных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергия), то есть имеющее разумное соотношение польза/риск. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителю, используемому для введения терапевтического средства, включая различные наполнители и разбавители.
[00138] Лекарственный препарат по настоящему изобретению включает активные ингредиенты по настоящему изобретению в безопасной эффективной дозе и фармацевтически приемлемые носители. Данные носители включают (без ограничения): физиологический раствор, буферный раствор, глюкозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Общий фармацевтический препарат должен соответствовать способу введения. Способ введения может относиться к пероральному введению, интраназальному введению, внутрикожному лечению, подкожному введению, внутримышечному или внутривенному введению, или внутрибрюшинному введению. Лекарственные формы лекарственного препарата по настоящему изобретению включают инъекционные препараты, препараты для перорального применения (таблетки, капсулы и жидкость для перорального применения), трансдермальные средства и средства с пролонгированным высвобождением. Например, лекарственный препарат получают обычным способом с использованием физиологического раствора или водного раствора, содержащего глюкозу и другие адъюванты. Лекарственный препарат подходит для получения в стерильных условиях. Антитело или антиген-связывающий фрагмент может применяться посредством внутривенной инфузии или инъекции, внутримышечной или подкожной инъекции.
[00139] В предпочтительном способе реализации настоящего изобретения для дальнейшего повышения биологической приемлемости антитела, антитело может быть гуманизированным, то есть, антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. Термин «химерное антитело» относится к рекомбинантному антителу, полученному посредством замещения константной области аминокислотной последовательности моноклонального антитела одного вида (такого как мышь) в константной области антитела другого вида (такого как человек) посредством применения технологии рекомбинантной ДНК. Термин «гуманизированное антитело» относится к рекомбинантному антителу, полученному посредством замещения общих отличных от CDR (каркасной области Fv (FR)) аминокислотных последовательностей в константной области и вариабельной области моноклонального антитела одного вида (такого как мышь) в отличных от CDR аминокислотных последовательностях константной области и вариабельной области антитела другого вида (такого как человек) посредством технологии рекомбинантной ДНК. То есть, если константная область одного антитела является гуманизированной, антитело называется химерным антителом. После того, как общие отличные от CDR аминокислотные последовательности в константной области и вариабельной области гуманизированы, антитело называют гуманизированным антителом. Гуманизированный метод может быть реализован с использованием традиционной технологии разработки антител, которая не описана подробно в данном документе.
[00140] В настоящем изобретении антитело с созреванием аффинности по настоящему изобретению относится к обычно присутствующему состоянию иммунной функции организма. При гуморальном иммунитете средняя аффинность антитела, вызванная вторичным ответом, выше аффинности, вызванной первичным иммунным ответом. Такой феномен называют антителом с созреванием аффинности. Функциональный статус организма является результатом длительной эволюции и постоянной адаптации к внешней среде и имеет большое значение для защиты организма и поддержания аутоиммунного надзора. В настоящем документе применяют технологию антитела с созреванием аффинности in-vitro. В частности, антитело с созреванием аффинности представляет собой процесс мутации аминокислот CDR антител посредством молекулярной биологической методики, скрининга антител из библиотеки антител после мутации и получение антител со значительно повышенной аффинностью.
[00141] Последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот, включенные в настоящее изобретение, конкретно перечислены в табл. 1.
[00142] [Таблица 1]
[00143] Варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны ниже. Варианты осуществления, описанные ниже, являются иллюстративными, применяемыми только для объяснения настоящего изобретения, но их нельзя понимать как ограничение настоящего изобретения. Процедуры в вариантах осуществления без указания конкретных технологий или условий проводятся согласно технологиям или условиям, описанным в документе в данной области или в соответствии с руководством по эксплуатации. Использованные реагенты или инструменты без указания производителя являются обычными продуктами, которые можно приобрести на рынке.
Пример 1: Получение антитела
[00144] Конкретные экспериментальные действия по получению антитела заключаются в следующем: (1) Клетки ExpiCHO (приобретенные у Thermo Fisher) культивировали с использованием среды для экспрессии ExpiCHO (приобретенной у Thermo Fisher), и концентрацию клеток регулировали до значения 6×106/мл с получением раствора клеток ExpiCHO; (2) вектор pcDNA3.4, содержащий тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела (синтезированного посредством полученного GenScript, Нанкин) добавляли в 2 мл среды OptiSFM (приобретенной у Thermo Fisher) в соответствии с отношением 1:1 с получением раствора A; (3) 160 мкл реагента для трансфекции ExpiFectamineCHO (приобретенного у Thermo Fisher) добавляли в 2 мл среды OptiSFM (приобретенной у Thermo Fisher) с получением раствора B; (4) затем раствор A и раствор B смешивали с получением смеси для трансфекции, и смесь для трансфекции полностью добавляли в 50 мл раствора клеток ExpiCHO в течение 5 минут; (5) раствор культивировали в условиях 37° и 5% CO2 в течение 1 дня, в раствор добавляли 8 мл питательной среды и 300 мкл энхансера (приобретенного у Thermo Fisher), и культуральный суперантант собирали в течение 9 дней после культивирования раствора в условиях 37° и 5% CO2, причем 8 мл питательной среды добавляли в день 5; и (6) аффинную очистку культурного супернатанта осуществляли с использованием колонки для очистки белка А (приобретенной у Nano-Micro), с получением таким образом материнского гуманизированного антитела h5A1.
Пример 2: Созревание аффинности антитела
[00145] В процессе созревания аффинности природного антитела соматическая сверхмутация в основном была сконцентрирована в области CDR. В ходе экспериментов in vitro на каждом сайте области CDR была проведена одноточечная насыщенная мутация для получения достаточного разнообразия мутаций, при этом структура белка не была разрушена. Такой путь может реализовать in vitro воспроизведение соматической сверхмутации природного антитела in vivo с наивысшим сходством.
[00146] Каждый аминокислотный сайт области CDR подвергали одноточечной насыщающей мутации для создания не содержащей отклонения плазмидной библиотеки с одноточечной насыщающей мутацией материнского антитела. Сайты мутаций с повышенным специфическим связыванием с антигеном отбирали посредством ELISA. Затем данные сайты подвергали комбинаторному скринингу с получением последовательностей мутаций антител-кандидатов.
[00147] Техническим путем материнское гуманизированное антитело h5A1 (полученное в соответствии со способом в примере 1, включающее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 10, как известно из патента CN 114369162 A), подвергали высокой аффинности с получением высокоаффинного моноклонального антитела MICA h5A1002 (полученного в соответствии со способом в примере 1), включающего последовательности вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 7) и вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 8). Сравнение последовательностей CDR материнского гуманизированного антитела h5A1 и антитела h5A1002 с созреванием аффинности показано в табл. 2.
[00148] [Таблица 2]
Пример 3: Анализ аффинности антитела
[00149] Biacore, в качестве способа анализа биомолекулярного взаимодействия, основанного на оптическом поверхностном плазмонном резонансе (SPR), позволяет не только обнаружить специфическое связывание между антигеном и антителом, но также получить очень важные данные в исследованиях и разработке лекарственных препаратов, таких как константа скорости связывания (Ka) между молекулами, константа скорости диссоциации (Kd) и константа равновесной диссоциации (KD), тем самым рассчитывая аффинность антитела.
[00150] В системе Biacore 8K (Cytiva) антитело разводили до концентрации 10 мкг/мл рабочим буфером (HBS-EP), и антитело конъюгировали с чипом белка А (Cytiva, 29127556) при скорости потока 10 мкл/мин. Данные кинетики и аффинности связывания антигена и антитела определяли при скорости потока 30 мкл/мин.; период связывания составлял 120 с; и время диссоциации составляло 800 с.
[00151] Были обнаружены кинетические и аффинные данные связывания материнского антитела h5A1 и аффинности антител h5A1002 и MICA. Результаты показаны в табл. 3. По сравнению с материнским антителом h5A1, аффинность антитела h5A1002 с созреванием аффинности к MICA значительно увеличивается в около 39 раз.
[00152] [Таблица 3]
Примечания: Ka представляет собой константу скорости связывания (чем больше значение, тем выше аффинность); Kd представляет собой константу скорости диссоциации (чем меньше число, тем выше аффинность), отражающую аффинность соединения к мишени; и KD представляет собой Kd/Ka, которая представляет собой равновесную константу диссоциации (константу аффинности), причем чем меньше KD, тем меньше диссоциация и тем выше аффинность.
Пример 4: Анализ связывания ELISA антител MICA
[00153] (1) ELISA применяли для определения характеристик связывания материнского антитела h5A1, антитела h5A1002 с созреванием аффинности и доменов α3 MICA и MICB. Слитые белки Fc во внеклеточных доменах α3 (доменах α3 MICA-002, 005, 008, 004 и MICB-001, 005) нескольких вариантов MICA и MICB наносили на 96-луночный планшет. После добавления антител интенсивность сигнала использовали для оценки характеристик связывания антител с MICA и MICB.
[00154] Слитые белки (производятся в лаборатории Заявителя; аминокислотная последовательность MICA002α3-Fc указана в SEQ ID NO: 22; аминокислотная последовательность MICA005α3-Fc указана в SEQ ID NO: 24; аминокислотная последовательность MICA008α3-Fc указана в SEQ ID NO: 25; аминокислотная последовательность MICA004α3-Fc указана в SEQ ID NO: 23; аминокислотная последовательность MICB001α3-Fc указана в SEQ ID NO: 26; аминокислотная последовательность MICB005α3-Fc указана в SEQ ID NO: 27) разбавляли до концентрации 1 мкг/мл PBS, а затем добавляли в 96-луночный планшет в объеме 100 мкл/лунку. Планшет оставляли при температуре 4°C в течение ночи. PBS из 96-луночного планшета удаляли отсасыванием. После промывания планшета с использованиме PBST (т.е. PBS с pH 7,2 включал 0,1 об. % Tween 20) 6 раз, добавляли PBS, содержащий 10% BSA, в объеме 200 мкл/лунку. Планшет инкубировали при 37°C в течение 2 часов для блокировки. Блокирующий раствор удаляли. После промывания планшета с использованием PBST 6 раз, антитело h5A1 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 11, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 12), антитело h5A1002 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 13, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), и контрольный IgG1 (приобретенный у компании Biointron), который градиентно разбавляли (при максимальной рабочей концентрации 20000 нг/мл, разбавлен в 5 раз, 8 градиентов) с использованием PBST, содержащего 0,05% BSA, добавляли в объеме 100 мкл/лунку, и планшет инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Реакционную систему в лунках удаляли отсасыванием. После промывания планшета с использованием PBST 6 раз, добавляли меченный пероксидазой хрена (HRP) вторичное антитело к клеткам человека (Fab-специфическое) (приобретенное у Sigma), разведенное PBST, содержащим 0,05% BSA, в объеме 100 мкл/лунка. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Вторичное антитело в лунках удаляли отсасыванием. После промывания планшета с использованием PBST 6 раз, добавляли тетраметилбензидин (TMB) в объеме 80 мкл/лунка и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Для остановки реакции добавляли 4М серную кислоту в объеме 80 мкл/лунку. Значение поглощения считывали с использованием считывающего устройства для микропланшетов на расстоянии 450 мм.
[00155] Результаты показаны на фиг. 3, фиг. 4, фиг. 5, фиг. 6, фиг. 7 и фиг. 8. Указывается, что антитело по настоящему изобретению может связываться с MICA*002, MICA*005, MICA*008, MICA*004, MICB*001 и MICB*005, и связывание антитела h5A1002 с созреванием аффинности с MICA*002, MICA*005 и MICA*008 сильнее, чем у материнского гуманизированного антитела h5A1.
[00156] (2) характеристики связывания антитела h5A1002 с созреванием аффинности, однородных антител CLN-619 (Cullinan, с последовательностью из патента US20210253711A1, полученных посредством способа в варианте осуществления 1) и 1D5V11 (Genentech, с последовательностью, известной из патента US20200055939A1, полученных посредством способа в примере 1) и доменов α3 MICA и MICB обнаруживают посредством ELISA. Слитые белки Fc во внеклеточных доменах α3 (доменах α3 MICA-002, 005, 008, 004 и MICB-001, 005) нескольких вариантов MICA и MICB наносили на 96-луночный планшет. После добавления антител интенсивность сигнала использовали для оценки характеристик связывания антител с MICA и MICB.
[00157] Экспериментальные процедуры описаны в соответствии с шагом (1), и результаты показаны на фиг. 11, фиг. 12, фиг. 13, фиг. 14, фиг. 15 и фиг. 16. Результаты показывают, что антитело по настоящему изобретению может связываться с MICA*002, MICA*005, MICA*008, MICA*004, MICB*001, и MICB*005, и что связывание антитела h5A1002 с созреванием аффинности с MICA*002, MICA*005 и MICA*008 является более числьным, чем связывание антитела CLN-619 (Cullinan) с идентичной мишенью.
Пример 5: Анализ связывания посредством проточной цитометрии антител MICA
[00158] (1) Опухолевые клетки разводили до плотности 2×106/мл с использованием PBS, а затем добавляли в пробирку EP на 1,5 мл в объеме 100 мкл/пробирка. В пробирку EP добавляли 10 мкл/пробирку козьей сыворотки; и блокирование проводили при 4°С в течение 30 мин. Антитело h5A1 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 11, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 12), антитело h5A1002 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 13, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), и контрольный IgG1 (приобретенный у Biointron) градиентно разбавляли (при максимальной рабочей концентрации 50 мкг/мл, 10 градиентов, разбавляли в 3 раза для каждого градиента) и добавляли. Пробирку инкубировали при 4°С в течение 30 мин. В пробирку EP добавляли 1 мл PBS и проводили центрифугирование при 4°C со скоростью 3500 об./мин. в течение 5 мин. Супернатант удаляли. Пробирку EP один раз промывали PBS. Супернатант удаляли после центрифугирования. Клетки повторно суспендировали в PBS в объеме 100 мкл/пробирку. В пробирку добавляли меченное Alexa-647 вторичное антитело козы к клеткам человека (приобретенное у Jackson lab) в объеме 1 мкл/пробирку; и планшет инкубировали в темноте при 4°С в течение 30 мин. Пробирку дважды промывали PBS, супернатант удаляли после центрифугирования. Клетки повторно суспендировали в PBS в объеме 200 мкл/пробирку и детектирование проводили с использованием проточного цитометра. Результаты показаны на фиг. 9 и фиг. 10. Результаты показывают, что связывание антитела h5A1002 с созреванием аффинности по настоящему изобретению с клетками A-375 меланомы и клетками HCT-15 колоректального рака является более сильным, чем у материнского гуманизированного антитела h5A1.
[00159] (2) Опухолевые клетки разводили до плотности 2×106/мл с использованием PBS и добавляли в пробирку EP на 1,5 мл в объеме 100 мкл/пробирка. В пробирку EP добавляли 10 мкл/пробирку козьей сыворотки; и блокирование проводили при 4°С в течение 30 мин. Антитело h5A1002 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 13, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), антитело CLN-619 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 17, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 18), антитело 1D5V11 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 19, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 20), и контрольный IgG1 (приобретенный у Biointron) градиентно разбавляли (при максимальной рабочей концентрации 50 мкг/мл, 10 градиентов, разбавляли в 3 раза для каждого градиента) и добавляли. Пробирку инкубировали при 4°С в течение 30 мин. В пробирку EP добавляли 1 мл PBS и проводили центрифугирование при 4°C со скоростью 3500 об./мин. в течение 5 мин. Супернатант удаляли. Затем пробирку EP промывали один раз PBS и супернатант удаляли после центрифугирования. Клетки повторно суспендировали в PBS в объеме 100 мкл/пробирку. В пробирку добавляли меченный Alexa-647 вторичное антитело козы к клеткам человека (приобретенное у Jackson lab) в объеме 1 мкл/пробирку; и пробирку инкубировали в темноте при 4°С в течение 30 мин. Пробирку дважды промывали PBS, супернатант удаляли после центрифугирования. Клетки повторно суспендировали в PBS в объеме 200 мкл/пробирку и детектирование проводили с использованием проточного цитометра. Результаты показаны на фиг. 17, фиг. 18, фиг. 19 и фиг. 20. Результаты показывают, что связывание антитела h5A1002 с созреванием аффинности по настоящему изобретению с опухолевыми клетками (например, клетками A-375 меланомы, клетками A-549 немелкоклеточного рака легкого, клетками HCT-15 колоректального рака и клетками MDA-MB-231 рака молочной железы) является более сильным, чем связывание антитела CLN-619 (Cullinan) с идентичной мишенью.
Пример 6: Анализ конкуренции за эпитоп
[00160] Проточную цитометрию использовали для обнаружения условий конкуренции за эпитоп антитела h5A1002 с созреванием аффинности и однородных антител CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech).
[00161] Клетки HCT-15 разводили до плотности 2×106/мл с использованием PBS и добавляли в пробирку EP на 1,5 мл в объеме 100 мкл/пробирка. В пробирку EP добавляли 10 мкл/пробирку козьей сыворотки, и блокирование проводили при 4°С в течение 30 мин. Антитело h5A1002 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 13, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), антитело CLN-619 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 17, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 18), антитело 1D5V11 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 19, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 20), и hIgG1 (приобретенный у Biointron) градиентно разбавляли (при максимальной рабочей концентрации 300 мкг/мл, 10 градиентов, разбавляли в 3 раза для каждого градиента) и добавляли. Пробирку инкубировали при 4°С в течение 30 мин. Добавляли меченное биотином антитело биотин-h5A1002 с созреванием аффинности (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 13, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14). Пробирку инкубировали при 4°С в течение 30 мин. В пробирку EP добавляли 1 мл PBS и проводили центрифугирование при 4°C со скоростью 3500 об./мин. в течение 5 мин. Супернатант удаляли. Пробирку EP промывали один раз PBS и супернатант удаляли после центрифугирования. Клетки повторно суспендировали в PBS в объеме 100 мкл/пробирку. В пробирку добавляли меченное Alexa-647 вторичное стрептавидиновое антитело (приобретенное у Biolegend) в объеме 1 мкл/пробирку; и пробирку инкубировали в темноте при 4°С в течение 30 мин. Пробирку дважды промывали PBS, супернатант удаляли после центрифугирования. Клетки повторно суспендировали в PBS в объеме 200 мкл/пробирку и детектирование проводили с использованием проточного цитометра. Результаты приведены на фиг. 21. Результаты показывают, что антиген связан с антителом h5A1002 с созреванием аффинности по настоящему изобретению и CLN-619 (Cullinan) имеет наложение эпитопов, тогда как h5A1002 и 1D5V11 (Genentech) связаны с различными эпитопами.
Пример 7: Анализ эндоцитоза антител MICA
[00162] Антитело h5A1002 с созреванием аффинности, а также однородные антитела CLN-619 (Cullinan) и 1D5V11 (Genentech) помечали pHrodo (приобретенным у Thermo) и добавляли в клеточную культуральную среду. После инкубации в течение 24 часов регистрировали флуоресценцию клеток. Интенсивность сигнала флуоресценции отражает условия эндоцитоза антител.
[00163] Клетки MDA-MB-231 разводили до плотности 1×105/мл PBS и добавляли в 96-луночный планшет в объеме 200 мкл/лунку. h5A1002-pHrodo (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 13, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), CLN-619-pHrodo (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 17, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 18), и 1D5V11-pHrodo (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 19, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 20) градиентно разбавляли (при максимальной рабочей концентрации 50 мкг/мл, 10 градиентов, разбавляли 3 раза для каждого градиента) и добавляли в 96-луночный планшет. Планшет инкубировали в условиях 37°С и 5% CO2 в течение 24 часов. Затем эндоцитоз антитела обнаруживали посредством проточной цитометрии. Результаты приведены на фиг. 22. Результаты указывают, что эндоцитоз антитела h5A1002 с созреванием аффинности по настоящему изобретению является более слабым, чем эндоцитоз однородных антител CLN-619 и 1D5V11, предполагая, что антитело h5A1002 с созреванием аффинности обладает более высокой пригодностью для разработки лекарства, чем моноклональное антитело.
Пример 8: Усиление эффекта РВМС относительно уничтожения опухолевых клеток антителами MICA
[00164] Обнаружена способность моноклонального антитела MICA усиливать эффект РВМС относительно уничтожения клеток А-375 меланомы и клеток HCT-15 колоректального рака.
[00165] (1) Полную среду RPMI-1640 добавляли в 16-луночный планшет RTCA в соответствии с объемом 50 мкл/лунку; и калибровку проводили на машине.
[00166] (2) Опухолевые клетки разбавляли до плотности 2×105/мл полной средой RPMI-1640. Клетки добавляли в планшет RTCA, полученный на шаге (1), в объеме 50 мкл/лунку. Затем клеточный коэффициент детектировали в условиях 37°C и 5% CO2 с использованием оборудования xCELLigence RTCA MP в течение 24 часов.
[00167] (3) h5A1002 (с последовательностью тяжелой цепи как указано в SEQ ID NO: 13, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), h5A1002-hIgG1LALA (полученное посредством способа в примере 1; ч последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 15, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), h5A1002-hIgG1DLE (полученное посредством способа в примере 1; ч последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 16, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 14), антитело CLN-619 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 17, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 18), антитело 1D5V11 (с последовательностью тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 19, и последовательностью легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 20) и hIgG1 (приобретенное у Biointron) градиентно разбавляли (максимальная концентрация на фиг. 23 составляла 10 мкг/мл, 8 градиентов, разбавляли 3 раза для каждого градиента. На фиг. 24 и фиг. 25 максимальная концентрация составляла 50 мкг/мл, 12 градиентов, разбавляли 5 раз для каждого градиента) с использованием полной среды RPMI-1640. Антитела добавляли в планшет RTCA, полученный на шаге (2), и объем добавления составлял 20 мкл/лунка.
[00168] (4) PBMC (приобретенные у Milestone® Biotechnologies) разбавляли до плотности 1,25×106/мл полной средой RPMI-1640, и добавляли в планшет RTCA, полученный на шаге (3), в соответствии с объемом добавления 80 мкл/лунка.
[00169] (5) Реакционную систему, полученную на стадии (4), помещали в условия 37°C и 5% CO2. Коэффициент клеток определяли с использованием оборудования xCELLigence RTCA MP.
[00170] Как показано на фиг. 23, антитело MICA по настоящему изобретению способствует эффекту РВМС относительно уничтожению опухоли; антитело h5A1002 подтипа hIgG1, антитело h5A1002-hIgG1LALA, не содержащее ADCC, и антитело h5A1002-hIgG1DLE, усиленное ADCC, оказывали стимулирующий эффект.
[00171] Как показано на фиг. 24 и фиг. 25, антитело h5A1002 по настоящему изобретению способствует эффекту РВМС относительно уничтожения опухоли. Более того, усиленный эффект уничтожения у антитела подтипа hIgG1 (h5A1002) был лучше, чем у антитела CLN-619 с идентичной мишенью (также подтипа hIgG1); антитело h5A1002-hIgG1DLE, усиленное ADCC, имело наиболее превосходный стимулирующий эффект по сравнению с другими антителами.
[00172] В настоящем описании указания эталонных терминов, таких как «один вариант осуществления», «некоторые варианты осуществления», «примеры», «конкретные примеры» и «некоторые примеры» означают, что конкретные свойства, структуры, материалы или характеристики, описанные в комбинации с вариантами осуществления или примерами, включены по меньшей мере в один вариант осуществления или пример настоящего изобретения. В настоящем описании схематические выражения вышеуказанных терминов излишне указаны для одного и того же варианта осуществления или примера. Кроме того, описанные в данном документе свойства, структуры, материалы или характеристики могут сочетаться в любом или нескольких вариантах осуществления или примерах в соответствующем режиме. Кроме того, при отсутствии взаимного противоречия, различные варианты осуществления или примеры, описанные в настоящем описании, и свойства различных вариантов осуществления или примеров могут быть объединены и комбинированы специалистами в данной области.
[00173] Несмотря на то, что варианты осуществления настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны выше, можно понять, что приведенные выше варианты осуществления являются иллюстративными и не ограничивающими настоящее изобретение. Специалисты в данной области могут вносить изменения, модификации, замены и преобразования в вышеуказанные варианты осуществления, не отступая от объема настоящего изобретения.
--->
<?xml version="1.0" encoding="utf-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Sequence
listing.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2024-04-16">
<ApplicantFileReference>POI240680</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023105096847</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-05-06</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="en">Хефеи ТГ ИммуноФарма Ко.,
Лтд.</ApplicantName>
<InventionTitle languageCode="en">АНТИТЕЛО MICA С СОЗРЕВАНИЕМ
АФФИННОСТИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>27</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GFSLTTYGG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>IWTDGWT</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>13</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ARKGHGYYYAMDY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>SSVSSSY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>STSNLI</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>HQYHRSPFT</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>119</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..119</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIG
MIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSS
</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>108</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..108</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLI
YSTSNLISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPFTFGQGTKLEIK</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>119</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..119</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGVHWIRQPPGKGLEWIG
MIWTDGTTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSS
</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>108</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..108</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLI
YSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPFTFGQGTKLEIK</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>449</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..449</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGVHWIRQPPGKGLEWIG
MIWTDGTTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLI
YSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>449</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..449</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIG
MIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLI
YSTSNLISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>449</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..449</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIG
MIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>449</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..449</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIG
MIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTP
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>451</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..451</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWIRQAPGKGLEWVS
YISPGGDYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTTDRRHYGSYAMDYWGQGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR
TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence
>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>219</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..219</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNLNTYLYWFLQKPGQSP
QILIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGPGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA
DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>447</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..447</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q38">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTSQNIYWVRQAPGQGLEWIG
YIEPYNVVPMYNPKFKGRATLTVDKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARSGSSNFDYWGQGTLVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSISSHYLHWYQQKPGKSPKLLI
YRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSLPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>383</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..383</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q42">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEV
HLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVC
EIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQ
ELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPD
GNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVR
CCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA</INSDSeq_sequen
ce>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>336</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..336</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q44">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQ
QWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>336</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..336</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RRVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHDTQ
QWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>335</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..335</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQ
QWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPA
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>336</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..336</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNIILTWRQDGVSLSHDTQ
QWGGVLPDGNGTYQTWVATRICRGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>336</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..336</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQ
QWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLVLQSQRPKSCDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>336</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..336</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_мол</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая
конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQ
QWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLALQSQWPKSCDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ А2 ТЕНАСЦИНА С И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2011 |
|
RU2584597C2 |
| АНТИТЕЛО ПРОТИВ КЛАУДИНА 18.2 И ЕГО КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2022 |
|
RU2814164C2 |
| АНТИТЕЛА К MICA/B И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2821021C2 |
| АНТИ-CD40-АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2012 |
|
RU2609647C2 |
| СВЯЗЫВАЮЩИЕ MICA АГЕНТЫ | 2013 |
|
RU2656183C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К СЕА С СОЗРЕВШЕЙ АФФИННОСТЬЮ | 2010 |
|
RU2570554C2 |
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD19 ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАДАЮЩИЕ ВЫСОКОЙ АФФИННОСТЬЮ | 2016 |
|
RU2761077C1 |
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ MST1R И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2010 |
|
RU2534890C2 |
| АНТИТЕЛА, ПРИГОДНЫЕ В ДИАГНОСТИКЕ РАКА | 2018 |
|
RU2815883C1 |
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ VEGF | 2020 |
|
RU2809746C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, способному специфически распознавать полипептид А, относящийся к цепи главного комплекса гистосовместимости I класса (MICA), лекарственному препарату и набору, его содержащему, а также к способу его получения. Также раскрыты молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, а также вектор и клетка, ее содержащие. Изобретение эффективно для лечения MICA-опосредованного заболевания, а также для обнаружения MICA. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 25 ил., 3 табл., 8 пр.
1. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, способное специфически распознавать полипептид А, относящийся к цепи главного комплекса гистосовместимости I класса (MICA), содержащее:
последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR1, как указано в SEQ ID NO: 1;
последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR2, как указано в SEQ ID NO: 2;
последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3, как указано в SEQ ID NO: 3;
последовательность вариабельной области легкой цепи CDR1, как указано в SEQ ID NO: 4;
последовательность вариабельной области легкой цепи CDR2, как указано в SEQ ID NO: 5; и
последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3, как указано в SEQ ID NO: 6.
2. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, причем антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 7, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи указана в SEQ ID NO: 8.
3. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, причем антитело представляет собой гуманизированное антитело.
4. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, содержащее последовательность каркасной области тяжелой цепи и последовательность каркасной области легкой цепи, причем по меньшей мере одна часть по меньшей мере одной последовательности каркасной области тяжелой цепи и последовательности каркасной области легкой цепи получена из по меньшей мере одного из мышиного антитела, гуманизированного антитела, полученного от примата антитела или их мутанта.
5. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, содержащее по меньшей мере одну из константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи, причем по меньшей мере одна часть по меньшей мере одной из константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи получена из по меньшей мере одного из гуманизированного антитела, полученного от примата антитела, мышиного антитела или их мутанта;
необязательно, обе из константной области легкой цепи и константной области тяжелой цепи получены из:
мышиного антитела IgG1, мышиного антитела IgG2a или их мутанта; или
человеческого антитела IgG1, человеческого антитела IgG2, человеческого антитела IgG3, человеческого антитела IgG4 или их мутанта.
6. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, причем антитело представляет собой по меньшей мере одно из одноцепочечного антитела, мультимерного антитела, антитела для целей трансплантации CDR, Fab-антитела или Fv-антитела.
7. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп. 1-6.
8. Вектор экспрессии, несущий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 7.
9. Способ получения антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп. 1-6, включающий:
введение вектора экспрессии по п. 8 в клетки; и
культивацию клеток в условиях, подходящих для экспрессии и секреции белка, с получением антитела или его антиген-связывающего фрагмента,
необязательно, клетки представляют собой прокариотические клетки или эукариотические клетки; и
необязательно, клетки представляют собой эукариотические клетки.
10. Рекомбинантная клетка для экспрессии антитела или его антиген-связывающий фрагмента, способного специфически распознавать MICA, рекомбинантная клетка несущая вектор экспрессии по п. 8.
11. Применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп. 1-6, молекулы нуклеиновой кислоты по п. 7, вектора экспрессии по п. 8, или рекомбинантной клетки по п. 10 в получении лекарственного препарата для лечения MICA-опосредованного заболевания.
12. Применение по п. 11, причем MICA-опосредованное заболевание представляет собой рак;
необязательно, рак представляет собой по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака молочной железы, глиомы, рака почки, рака желудка, рака пищевода, плоскоклеточной карциномы полости рта и рака головы и шеи.
13. Лекарственный препарат для лечения MICA-опосредованного заболевания, содержащий: антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, молекулу нуклеиновой кислоты по п. 7, вектор экспрессии по п. 8, или рекомбинантную клетку по п. 10; и
фармацевтически приемлемый носитель.
14. Лекарственный препарат по п. 13, причем MICA-опосредованное заболевание представляет собой рак;
необязательно, рак представляет собой по меньшей мере одно из рака легкого, рака печени, рака яичника, рака шейки матки, рака кожи, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака молочной железы, глиомы, рака почки, рака желудка, рака пищевода, плоскоклеточной карциномы полости рта и рака головы и шеи.
15. Применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп. 1-6, молекулы нуклеиновой кислоты по п. 7, вектора экспрессии по п. 8 или рекомбинантной клетки по п. 10 в получении набора, применяемого для обнаружения MICA.
16. Набор для обнаружения MICA, содержащий антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, молекулу нуклеиновой кислоты по п. 7, вектор экспрессии по п. 8 или рекомбинантную клетку по п. 10;
антагонисты;
колонки для очистки белков;
буферные средства для аффинной очистки иммуноглобулинов;
разбавители для определения клеток; и
руководства или литература.
| WO 2017157895 A1, 21.09.2017 | |||
| WO 2018081648 A2, 03.05.2018 | |||
| MATHIEU BLERY et al., Targeting MICA/B with cytotoxic therapeutic antibodies leads to tumor control, Open Research Europe 2021, 1: 107 | |||
| NICOLAS TORRES et al., Restoration of antitumor immunity through anti-MICA antibodies elicited with a chimeric protein, Journal for ImmunoTherapy of |
