Моноклональные антитела, специфичные к белку рустицианин, и использование антител для диагностики и лечения злокачественных новообразований Российский патент 2024 года по МПК C07K16/00 C12P21/00 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и биомедицины, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфически связывается с белком рустицианин.

Уровень техники

За последние 30 лет терапевтические антитела произвели революцию в области таргетной терапии рака. FDA (Food and Drug Administration) одобрило более 100 моноклональных антител для лечения различных заболеваний человека, включая рак, аутоиммунные и хронические воспалительные заболевания [1]. Значительные успехи в области открытия антител и вычислительных платформ способствовали разработке моноклональных антител с высокой эффективностью и пониженной иммуногенностью. В настоящее время моноклональные антитела рассматриваются как основной инструмент таргетной терапии и иммунотерапии [2].

Однако для разработки подходящей схемы иммунотерапии для любого типа рака идентификация конкретных молекулярных мишеней или биомаркеров терапии и/или диагностики становится необходимой. В настоящее время растет число установленных молекулярных мишеней для лечения различных типов рака [3].

Таким образом, несмотря на то, что известно множество мишеней для создания противораковых моноклональных антител, по-прежнему существует острая потребность в новых противораковых методах лечения, а также в новых мишенях для поиска и разработки моноклональных антител.

Рустицианин представляет собой белок синей меди 1-го типа, который действует как основной переносчик электронов в дыхательной цепи переноса электронов железа у Thiobacillus ferrooxidans. Рустицианин представляет собой экстремофильный белок с окислительно-восстановительной активностью всего лишь при рН 0,5 и окислительно-восстановительным потенциалом 680 мВ, что как минимум в два раза выше, чем у любого другого члена семейства купредоксинов. Трехмерная структура состоит из β-сэндвича из двух смешанных β-листов, одного из шести и одного из семи нитей, а также одной амфипатической спирали вблизи N-конца [4].

Раскрытие изобретение

Задачей настоящего изобретения является разработка новых моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, для применения в качестве противоопухолевых агентов.

Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка новых моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывается с белком рустицианин.

Техническим результатом изобретения является разработка и получение новых выделенных моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связываются с белком рустицианин; указанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител характеризуются высоким антипролиферативным действием, высокой эффективностью в ингибировании роста опухоли, а также способностью к снижению жизнеспособности опухолевых клеток, поэтому антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител являются перспективными для терапевтического их использования в качестве противоопухолевых агентов, в том числе для лечения злокачественных новообразований.

Указанный технический результат достигается посредством разработки и создания выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с белком рустицианин, включающее:

1) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотные последовательности HCDR 1-3, где:

HCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,

HCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2,

HCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;

2) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотные последовательности LCDR 1-3, где:

LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,

LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность AAS,

LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где:

(a) вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;

(b) вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело, включающее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело, включающее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело, включающее:

(a) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,

(b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело представляет собой полноразмерный иммуноглобулин.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело является человеческим, мышиным, химерным, гуманизированным.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное моноклональное антитело, которое специфично связывается с белком рустицианин, представляет собой полноразмерное антитело IgG, IgM.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG2a, IgG2b или IgG3.

В частных вариантах воплощения изобретения выделенное полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1.

Настоящее изобретение также включает выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.

В частных вариантах воплощения изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

Настоящее изобретение также включает экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по изобретению.

Предметом настоящего изобретения также является применение выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению в качестве противоопухолевого средства.

Предметом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью, включающая эффективное количество моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Подробное раскрытие изобретения

Краткое описание чертежей.

Фигура 1. Карта плазмиды pET45b(+) His Rtc.

Фигура 2. Карта плазмиды рЕТ21а(+) Rtc.

Фигура 3. Кинетические кривые взаимодействия мышиного антитела 3G7H8 к Rusticyanin с антигеном His-Rusticyanin.

Фигура 4. Кинетические кривые взаимодействия химерного антитела 3G7H8 к Rusticyanin с антигеном His-Rusticyanin.

Фигура 5. Результаты исследования антипролиферативного действия моноклонального антитела 3G7H8 (мышиное) по изобретению на клеточных моделях.

Определения (термины)

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины и аббревиатуры, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

Если термины специально не определены где-либо в данном документе, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, общепринятые для специалиста в той области техники, к которой относится это изобретение.

Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «KD» в данном описании относится к константе аффинности (или константе равновесия), которую получают из отношения Kd и Ka (т.е. Kd/Ka), и ее выражают в виде молярной концентрации (М).

Антитело

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается с белком рустицианин. Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Моноклональное антитело получают из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, с помощью любых доступных или известных из уровня техники способов. Моноклональные антитела, применимые в случае настоящего изобретения, можно получать с применением огромного множества методик, известных из уровня техники, включая применение гибридомной технологии, рекомбинантной технологии и технологии фагового дисплея или их комбинации. Антитело по изобретению является рекомбинантным антителом.

Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется в клетке или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности), которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.

Определение «выделенный» («изолированный»), применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.

Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела. Термин «антитело» относится к белку, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Известно пять типов тяжелых цепей антител млекопитающих, которые обозначают греческими буквами: α, δ, ε, γ и μ. Присутствующий тип тяжелой цепи определяет класс антитела; указанные цепи обнаружены в антителах типа IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно. Различные тяжелые цепи отличаются по размеру и составу; α и γ содержат примерно 450 аминокислот, а μ и ε состоят примерно из 550 аминокислот.Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи γ, α и δ содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов СН1, СН2 и СН3 (выстроены в ряд) и шарнирной области, которая придает гибкость; тяжелые цепи μ и ε содержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов СН1, СН2, СН3 и СН4. У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (λ) и каппа (κ). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую каппа (κ)-цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой С-каппа (κ).

«Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA1 и IgA2, предпочтительно IgG1).

Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), разбросанные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками), и первый компонент (Clq) классического пути активации системы комплемента.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела»), как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая часть» антитела включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН 1; (и) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR). Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv). Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых «гипервариабельными областями» или CDR. Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител. Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC).

Термин «гипервариабельная область» по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR», и/или такие остатки из «гипервариабельной петли».

Антитело по данному изобретению, «которое связывает» целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку или ткань, экспрессирующую антиген. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия.

Используемый в данном документе термин "химерное" антитело относится к антителу, имеющему вариабельные последовательности, полученные из отличного от человеческого иммуноглобулина, такого как крысиное или мышиное антитело, и константные области человеческого иммуноглобулина, как правило, выбранные из матрицы человеческого иммуноглобулина.

Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши, полученное при иммунизации мышей, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши, можно заменить некоторые аминокислоты, в частности, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR-участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR-участков. Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела и каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека.

Фрагменты антител

В определенных обстоятельствах целесообразно применять фрагменты антител, а не полные антитела. Меньший размер фрагментов способствует их быстрому клиренсу и может способствовать лучшему проникновению в плотные опухоли.

Для получения фрагментов антител разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител. Однако в настоящее время эти фрагменты можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител можно экспрессировать и секретировать из Е. coli, что позволяет облегчать производство больших количеств указанных фрагментов. Согласно другому варианту Fab'-SH-фрагменты можно непосредственно выделять из Е. coli и химически сшивать с получением F(ab')2-фрагментов. Согласно другому подходу F(ab')2 - фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Fab- и Р(ab')2-фрагмент с повышенным временем полужизни in vivo, в которых сохранены остатки эпитопсвязывающего рецептора. Специалистам в данной области должны быть очевидны другие методики получения фрагментов антител. В других вариантах осуществления изобретения выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv- фрагмент (scFv). Fv и scFv представляют собой единственные виды с интактными связывающими сайтами, лишенные константных областей; в результате их можно применять для пониженного неспецифического связывания при применении in vivo. Слитые белки, несущие scFv, можно конструировать для получения слияния эффекторного белка либо на N-, либо на С-конце scFv. Фрагмент антитела может представлять собой также «линейное антитело». Такие фрагменты линейного антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

Физические и функциональные свойства типичных антител «Консервативно модифицированные варианты» или «консервативная замена» относится к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими сходные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость основной цепи и т.д.), так, что эти замены часто могут быть сделаны без изменения биологической активности белка. Специалисты в данной области признают, что, как правило, единичные аминокислотные замены в несущественных областях полипептида существенно не изменяют биологическую активность. Кроме того, замены структурно или функционально сходных аминокислот с меньшей вероятностью нарушают биологическую активность. Функционально-консервативные варианты антител по изобретению также предусмотрены настоящим изобретением.

«Функционально-консервативные варианты» в контексте настоящего описания относятся к антителам или фрагментам, в которых один или несколько аминокислотных остатков изменены без изменения желаемого свойства, такого как аффинность и/или специфичность к антигену. Такие варианты включают, без ограничения таковыми, замену аминокислоты аминокислотой, имеющей сходные свойства. Также предоставляются выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению, имеющие 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных замен, предпочтительно в каркасной области.

Молекула нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение также относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, а именно к последовательностям, кодирующим выделенное моноклональное антитело или его фрагмент, которое специфически связывается с белком рустицианин, по данному изобретению, которые описаны в данном документе.

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.

Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия антитела, например, в случае если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

В любом из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.

Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии рекомбинантного моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком рустицианином.

Вектор

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему вышеуказанную выделенную нуклеиновую кислоту. Настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы»).

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком рустицианином, или их частей (например, последовательностей тяжелой цепи первого и/или тяжелой и/или легкой цепи второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител.

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).

Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными.

Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС- и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации соответствующей мРНК. Интронные последовательности находятся в окружении сплайс-донора и сплайс-акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов. Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы).

Помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.

В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор.

Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.

Клетка-хозяин

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с белком рустицианин, включающий трансформирование клетки описанным выше вектором.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с белком рустицианин, содержащей описанную выше нуклеиновую кислоту.

Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена связывающей молекулы поданному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может на самом деле быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианин, по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами.

Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО), NSO клетки, клетки SP2, HEK-293Т клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (BHK), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антител в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения антител в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином, может быть выделено из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Кроме того, уровень продукции моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком рустицианином, по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях.

Вполне вероятно, что моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином, различных клеточных линий или трансгенные животные будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования. Однако моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином, кодируемое молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащее аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, являются частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия посттрансляционных модификаций.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с использованием человеческих эмбрионов.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

Способ получения антитела

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с белком рустицианином, заключающемуся в культивировании описанной выше клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.

Настоящего изобретения относится к способам получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с белком рустицианином, по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком рустицианином, как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином, культивированию указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии продукции моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком рустицианином, и выделение полученного моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком рустицианином. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах упоминается в данном документе как «рекомбинантное моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком рустицианином». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и моноклональному антителу, которое специфически связывается с белком рустицианином, полученному аналогично.

Фармацевтическая композиция

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям с противоопухолевой активностью, которые содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента вместе с антителом, составляющим сущность этого изобретения, и которые не разрушают фармакологическую активность этого антитела, и нетоксичны при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества антитела.

Фармацевтические композиции, указанные в этом изобретении, содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению вместе с, по крайней мере, одним из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, полиолы, хлористый натрий и им подобные. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты.

Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый» относится к таким компонентам композиции, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска.

Предметом настоящего изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, структура которых оптимизирована для определенного способа введения в организм в терапевтической эффективной дозе, например, для введения в организм внутривенно, перорально, внутримышечно, подкожно, внутриглазным способом, ингаляционно, интраназально и сублингвально, в рекомендуемых дозировках.

Для введения парентеральным способом используются водные суспензии, изотонические физиологические растворы или стерильные растворы для инъекций, совместимые агенты которых содержат фармакологические, например, пропиленгликоль или бутиленгликоль.

Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается такое количество антитела, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на введение (антипролиферативный, противоопухолевый эффект). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Под «профилактически эффективным количеством» подразумевается такое количество антитела, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на профилактику опухолевых заболеваний. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.Для профилактического лечения терапевтически или профилактически эффективное количество представляет собой то количество, которое будет эффективно в предотвращении опухоли.

Термин «пациент» («субъект») охватывает все виды млекопитающих, предпочтительно человека.

Термины «лечение», «терапия» охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) блокирование (приостановку) течения заболевания, б) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания.

Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых еще не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.

Терапевтическое применение моноклонального антитела или его антигеновязывающего фрагмента, которое специфически связывается с рустицианином

В рамках настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с рустицианином, применяется в качестве противоопухолевого агента и может применяться для лечения опухолевого заболевания. В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеком.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения опухолевого заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, опухолевого заболевания или нарушения.

Диагностическое использование антитела, которое специфически связывается с рустицианином

Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с рустицианином, по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo). Например, данное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с рустицианином, по данному изобретению может использоваться для обнаружения или измерения уровня рустицианином в образцах. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология.

Осуществление изобретения

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного белка рустицианина.

Для получения рекомбинантного белка рустицианина была использована следующая последовательность белка:

Синтетическая последовательность кодирующей последовательности рустицианина:

Вышеуказанную последовательность клонировали в плазмидудля наработки белка. Кодирующая последовательность рустицианина была клонирована в вектор pET45b (фиг. 1), а также в вектор рЕТ21а(+) (фиг. 2). Плазмида была трансформирована в бактерии BL21 для экспрессии белка рустицианина с His-тагом.

Очистка белка проводилась с использованием следующего протокола.

1. Получение ночной культуры на агаре с ампициллином при 37°С.

2. Получение ночной культуры в 5 мл среды LB с ампициллином при 37°С и 250 мин^-1.

3. Разведение 5 мл культуры в 55 мл среды LB с ампициллином. Инкубирование 1 час при 25-27°С и скорости вращения шейкера 250 мин^-1.

4. Добавление IPTG до 1 мМ. Инкубирование 5 часов при 25-27°С и 250 мин^-1.

5. Охлаждение культуры 30 мин при 4°С. Центрифугирование 20 мин при 4000 g и 4°С. Замораживание осадка клеток ночь при -20°С.

6. Состав денатурирующего буфера, используемого для очистки белка: 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris Cl, 8 М мочевина. При лизировании клеток рН=8,0; при промывке рН=6,3; при элюции рН=4,5. рН доводится NaOH или HCl.

7. Клетки лизируются в 10 мл буфера при комнатной температуре в течение часа и периодическом помешивании. Затем центрифугирование 30 мин при 14000 g и комнатной температуре.

8. Надосадок наноситься на подготовленную колонку Ni-NTA FastStart (Qiagen).

9. Затем колонка промывается 2 раза по 4 мл буфера.

Пример 2. Получение моноклональных антител к рекомбинантному белку рустицианину.

1 этап.

Иммунизация мышей

На первом этапе были подготовлено два варианта антигена: Rustycianin с 6xHis на N-конце (условно RUS №1) и Rustycianin с 6xHis на С-конце (условно RUS №2).

Для получения моноклональных антител были проиммунизированы 3 самца мышиной линии Balb/C по 30 мкг антигена на мышь.

Одна мышь по короткому протоколу иммунизации:

Протокол короткой иммунизации

• Мышь была праймирована смесью антигенов (15 мкг RUS №1, 15 мкг RUS №2) с полным адъювантом Фрейнда.

• Через две недели мышь была бустирована смесью антигенов (15 мкг RUS №1, 15 мкг RUS №2).

Две мыши по длительному протоколу иммунизации:

Протокол длительной иммунизации:

• Мыши были иммунизированы по 30 мкг антигена с полным адъювантом Фрейнда внутрибрюшинно и в холку. Одна - RUS №1, другая RUS №2.

• Через 3 недели мыши иммунизированы повторно по 30 мкг антигена на мышь, внутрибрюшинно и в холку с неполным адъювантом Фрейнда, внутривенно в хвост без адъюванта.

Получение клеточных линий гибридом после короткой иммунизации.

Через 3 дня после бустирования мыши по протоколу короткой иммунизации была проведена гибридизация иммунных лимфоцитов, взятых из паховых и подколенных лимфоузлов с миеломной линией Sp 2/0. Суспензия клеток распределена на четыре 96-луночных платы.

Дальнейшие проверки выполнялись методами иммуноферментного анализа (ИФА)

Протокол:

Покрытие планшетов антигеном.

Материалы

• Карбонат-бикарбонатный буфер (КББ), рН 9,5

• ИФА-планшеты (96-луночные, стрипованные или цельные)

• mQ

• Бычий сывороточный альбумин (BSA)

• Молоко сухое для блоттинга

• PBS-T: таблетки фосфатно-солевого буфера и 20% раствор Твин 20

• Антиген для покрытия планшетов

Необходимое оборудование

• Дозатор переменного объема, предпочтительно от 50 до 300 мкл

• Автоматические дозаторы разных объемов с наконечниками

• Ванночка для многоканальной пипетки

• Бумажные полотенца

• Зип-лок пакеты

• Шейкер для планшетов

Подготовка растворов.

• Подготавливаются необходимые растворы (предпочтительно, непосредственно перед использованием):

• КББ: 0,3 г Na₂CO₃ и 0,56 г NAHCO₃ на 100 мл mQ воды, рН сразу после разведения 9,5

• 1% раствор BSA в PBS (10 мг/мл): 1 таблетка PBS и 1 г BSA на 100 мл mQ

или

• 1% раствор молока в PBS (10 мг/мл): 1 г молока на 100 мл mQ

• PBS-T: 10 таблеток фосфатно-солевого буфера и 2,5 мл 20% Твин 20 на 1 литр mQ

• Материал для покрытия планшетов (рекомбинантный белок) в концентрации 5-10 м кг/мл

Процедура:

• Определяется сколько материала нужно развести, если на 1 планшет требуется 10 мл, по 100 мкл на лунку.

• Материал разводится для покрытия в свежеприготовленном КББ в концентрации 5-10 мкг/мл в КББ.

• Подготовленный раствор переливают в ванночку для многоканальной пипетки.

• Многоканальной пипеткой раскапывают раствор на чистые планшеты для ИФА по 100 мкл на лунку.

• Планшет накрывают крышкой, кладут сверху влажное бумажное полотенце, убирают в пакет зип-лок. Инкубируют на шейкере при комнатной температуре 1 час (допустимо оставлять на ночь в холодильнике на ночь).

• Для блокировки используют или 1% раствор BSA в PBS или 1% раствор молока в PBS, добавляя в лунки с нанесенным антигеном или антителами (не выливая) по 100 мкл блокирующего раствора. Инкубируют 1 час на шейкере при КТ.

• Содержимое планшета сливают, промывают планшет PBS-T многоканальной пипеткой 4 раза по 150 мкл.

Проведение теста

Материалы и оборудование

• Материал для анализа (антиген, антитела, конъюгат)

• Пероксидазный конъюгат антител

• ТМБ (тетраметилбензидин)

• 10% H₂SO₄

_{• Шейкер}

• Дозатор переменного объема и ванночка

• Ридер для планшетов

Процедура:

• В зависимости от целей на подготовленный планшет наносят либо антиген (если на планшете антитела по изобретению), либо антитела (если на планшете антиген), либо смесь антител или антигена (в случае конкуренции). Обычно используются концентрации 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, либо 5 мкг/мл, либо рабочие разведения. Материал разводится в PBS-T, с добавлением белкового носителя, например, BSA 5 мг/мл, либо молока. Для проверки антител в среде, среда не разводится ничем. Наносится по 100 мкл раствора на лунку. Инкубируется на шейкере 1 час при комнатной температуре.

• Содержимое планшета сливают, промывают планшет PBS-T многоканальной пипеткой 4 раза по 150 мкл.

• Наносят пероксидазный конъюгат антител к первичным антителам, разведенный в PBS-T, с добавлением белкового носителя, например, BSA 5 мг/мл, либо молока (в этом случае использовали BSA) по 100 мкл на лунку, либо в случае конкуренции или проверки полученных пероксидазных конъюгатов сразу переходят к следующему шагу.

• Содержимое планшета сливают, промывают планшет PBS-T многоканальной пипеткой 6 раз по 150 мкл.

• Добавляют в сухой планшет по 100 мкл ТМБ и после развития голубой окраски.

• Добавляют по 25 мкл 10% раствора серной кислоты для остановки реакции.

• Оптическую плотность измеряют на ридере с фильтрами 450, и дифференциальным 630 нм.

Получение пероксидазных конъюгатов полученных антител

Подготовка антител:

• Среда собрана и с финальных клонов и с первичных по 15-20 мл.

• Сконцентрирована до 0,5 мл в концентраторах Amicon (100 кДа).

• Антитела выделены 40% насыщением раствора сульфата аммония

• Измерена концентрация полученного белка и отобрано по 0,5 мг антител на получение пероксидазных конъюгатов.

Протокол конъюгации антител с пероксидазой хрена

• Для приготовления пероксидазного конъюгата антител 5 мг пероксидазы хрена с Rz>3 растворяется в 0.5 мл деминерализованной воды. К раствору добавляется 1 мг мета-периодата натрия до конечной концентрации 10 мМ. Реакционная смесь инкубируется в течение 2 часов при комнатной температуре в темном месте. 5 мг пероксидазы рассчитано на 15 мг антител.

• Антитела, специфичные к рустицианину, диализируют против 100 мМ буфера бикарбоната натрия рН 9.2.

• Активированная пероксидаза добавляется к раствору антител, и смесь переносится в 1 мл наконечник для автоматической пипетки, закрытый силиконовым шлангом с зажимом на конце и кусочком нейлоновой ваты в качестве фильтра. К смеси добавляется сухой сефадекс G-10 до полного поглощения жидкости. Данная процедура используется для: повышения концентрации белков, а, следовательно, повышения выхода конъюгированного продукта, нейтрализации избытка иона периодата и частичного обессоливания за счет абсорбции соли с водой гранулами сефадекса. Реакция конъюгации проводится 3 часа при комнатной температуре либо в течение ночи при +4°С в закрытой «колонке».

• Белковый материал элюируется в колонке при добавлении нескольких мл PBS по каплям на поверхность геля. Бурый раствор собирается на выходе из колонки. Для остановки реакции добавляется 5 мг/мл метилового эфира глицина и 1/10 объема свежеприготовленного раствора цианборогидрида натрия (5 мг/мл NaCNBH₃ в 0.1 мМ NaOH) для восстановления шиффовых оснований. В полученный конъюгат добавить проклин 300 или этиленгликоль. Конъюгат может быть фракционирован для выделения наиболее иммунологически активной фракции или использован в полученном виде.

В результате проведенной работы получены следующие результаты:

• Получено 18 клонов, узнающих рустицианин в ИФА.

• Пять клеточных линий субклонировано, получены субклоны, узнающие рустицианин в ИФА.

2 этап.

Иммунизация мышей

На первом этапе работы было подготовлено два варианта антигена: Rustycianin с 6xHis на N-конце (условно RUS №1) и Rustycianin с 6xHis на С-конце (условно RUS №2). На данном этапе подготовлено еще два антигена - участки RUS №1 - 155 аминокислот (155аа) от N-конца и 104 аминокислоты (104аа) от N-конца.

Для получения моноклональных антител были проиммунизированы 3 самца мышиной линии Balb/C по 30 мкг антигена на мышь. Одну из мышей иммунизировали по протоколу короткой иммунизации.

Двух других мышей кололи по протоколу длительной иммунизации.

Протокол длительной иммунизации:

• Мыши были иммунизированы по 30 мкг антигена с полным адъювантом Фрейнда внутрибрюшинно и в холку. Одна - RUS №1, другая RUS №2.

• Через 3 недели мыши иммунизированы повторно по 30 мкг антигена на мышь, внутрибрюшинно и в холку с неполным адъювантом Фрейнда, внутривенно в хвост без адъюванта.

• Одна мышь пала, другую мышь иммунизировали повторно RUS №2, а через три недели иммунизировали уже RUS №1 по протоколу псевдокороткой иммунизации.

Протокол псевдокороткой иммунизации:

• Мышь была иммунизирована в лапы и в холку с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) 30 мкг антиигена.

• Через две недели было проведено бустирование в лапы и в холку тем же антигеном RUS №1 с неполным адъювантом.

Получение клеточных линий гибридом после короткой иммунизации.

Через 3 дня после бустирования мыши по протоколу короткой иммунизации была проведена гибридизация иммунных лимфоцитов, взятых из паховых и подколенных лимфоузлов и спленоцитов с миеломной линией Sp 2/0. Суспензия клеток распределена на четыре 96-луночных чашки Петри.

Дальнейшие проверки выполнялись методами иммуноферментного анализа (ИФА).

Протокол:

Покрытие планшетов антигеном.

Материалы

• Карбонат-бикарбонатный буфер (КББ), рН 9,5 (67 мМ NaHCO₃ и 28 мМ Na₂CO₃),

• ИФА-планшеты (96-луночные, стрипованные или цельные)

• mQ

• Бычий сывороточный альбумин (BSA)

• Молоко сухое для блоттинга

• PBS-T: таблетки фосфатно-солевого буфера и 20% раствор Твин 20

• Антиген для покрытия планшетов Необходимое оборудование

• Дозатор переменного объема, предпочтительно от 50 до 300 мкл

• Автоматические дозаторы разных объемов с наконечниками

• Ванночка для многоканальной пипетки

• Бумажные полотенца

• Зип-лок пакеты

• Шейкер для планшетов

Подготовка растворов.

• Подготавливаются необходимые растворы (предпочтительно, непосредственно перед использованием):

• КББ: 0,3 г Na₂CO₃ и 0,56 г NaHCO₃ на 100 мл mQ воды, рН сразу после разведения 9,5

• 1% раствор BSA в PBS (10 мг/мл): 1 таблетка PBS и 1 г BSA на 100 мл mQ или

• 1% раствор молока в PBS (10 мг/мл): 1 г молока на 100 мл mQ

• PBS-T: 10 таблеток фосфатно-солевого буфера и 2,5 мл 20% Твин 20 на 1 литр mQ

• Материал для покрытия планшетов (рекомбинантный белок) в концентрации 5-10 мкг/мл

Процедура

• Определяется сколько материала нужно развести, если на 1 планшет требуется 10 мл, по 100 мкл на лунку.

• Материал разводится для покрытия в свежеприготовленном КББ в концентрации 5-10 мкг/мл в КББ

• Подготовленный раствор переливают в ванночку для многоканальной пипетки.

• Многоканальной пипеткой раскапывают раствор на чистые планшеты для ИФА по 100 мкл на лунку

• Планшет накрывают крышкой, кладут сверху влажное бумажное полотенце, убирают в пакет зип-лок. Инкубируют на шейкере при комнатной температуре 1 час (допустимо оставлять на ночь в холодильнике на ночь)

• Для блокировки используют или 1% раствор BSA в PBS или 1% раствор молока в PBS, добавляя в лунки с нанесенным антигеном или антителами (не выливая) по 100 мкл блокирующего раствора. Инкубируют 1 час на шейкере при КТ.

• Содержимое планшета сливают, промывают планшет PBS-T многоканальной пипеткой 4 раза по 150 мкл.

Проведение теста

Материалы и оборудование

• Материал для анализа (антиген, антитела, конъюгат)

• Пероксидазный конъюгат антител

• ТМБ (тетраметилбензидин) 10% H₂SO₄

• Шейкер

• Дозатор переменного объема и ванночка

• Ридер для планшетов

Процедура

• В зависимости от целей на подготовленный планшет наносят либо антиген (если на планшете антитела), либо антитела (если на планшете антиген), либо смесь антител или антигена (в случае конкуренции). Обычно используются концентрации 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, либо 5 мкг/мл, либо рабочие разведения. Материал разводится в PBS-T, с добавлением белкового носителя, например, BSA 5 мг/мл, либо молока (в этом случае использовали BSA). Для проверки антител в среде, среда не разводится ничем. Наносится по 100 мкл раствора на лунку. Инкубируется на шейкере 1 час при комнатной температуре.

• Содержимое планшета сливают, промывают планшет PBS-T многоканальной пипеткой 4 раза по 150 мкл.

• Наносят пероксидазный конъюгат антител к первичным антителам, разведенный в PBS-T, с добавлением белкового носителя, например, BSA 5 мг/мл, либо молока (в этом случае использовали BSA) по 100 мкл на лунку, либо в случае конкуренции или проверки полученных пероксидазных конъюгатов сразу переходят к следующему шагу.

• Содержимое планшета сливают, промывают планшет PBS-T многоканальной пипеткой 6 раз по 150 мкл.

• Добавляют в сухой планшет по 100 мкл ТМБ и после развития голубой окраски

• Добавляют по 25 мкл 10% раствора серной кислоты для остановки реакции

• Оптическую плотность измеряют на ридере с фильтрами 450, и дифференциальным 630 нм.

Тестирование полученных антител

Среды от полученных первичных клонов после гибридизации (после короткой иммунизации) проверены методом ИФА на антигене RUS 155аа (5 мкг/мл). Отобраны клоны в 12-луночные планшеты.

Отобранные клоны проверены на антигене (5 мкг/мл) RUS №2 и p16-His (в качестве отрицательного контроля). Несколько клеточных линий гибридом было клонировано. В результате клонирования отобраны самые сильные субклоны методом ИФА. В результате получен наиболее перспективный клон - 3G7H8. По истечении нескольких недель культивирования клеток, супернатант указанного клона был проверен в ИФА для контроля продукции антител. Отмечено, что указанный клон связываются и с антигеном RUS #2 и с антигеном RUS # 1.

Пример 3. Секвенирование, клонирование, наработка и тестирование антител к рустицианину.

1. Гибридомный клон 3G7H8. Криовиала 2 мл. Клетки в замороженной среде. V-700 мкл.

Пробирку с клетками гибридомы центрифугировали на микроцентрифуге 5 мин, 3000 оборотов в минуту. Образовался небольшой осадок. Супернатант удален. Оставлен клеточный осадок.

2. Выделение РНК из гибридомы получение кДНК.

Метод: набор для выделения РНК Invitrogen RNeasy Mini Kit №74104 по протоколу производителя.

Результат: концентрация полученной РНК - 380 нг/мкл.

Получение кДНК.

4mkl Buf + 2mkl dNTP + 1mkl oligo-dT + 0.5mkl RiboLock (40un/mkl EO0381) + 0.5mkl RT (RevertAid RT 200ut/mkl EP0441) + 3mkl RNA+Н₂О до 20mkl.

3. Амплификация вариабельных сегментов генов иммуноглобулинов гибридомы.

ПЦР - тяжелые цепи (праймеры HS + HRem - 10 пар).

ПЦР - легкие цепи (праймеры KS + LRem - 16 пар).

Результат: Электрофорез ПЦР продуктов - тяжелые цепи (HS + HRem - 10 пар).

4. Секвенирование ПЦР продуктов

Для секвенирования взяты ПЦР продукты - HS5 и KS5.

В результате последовательность вариабельного домена тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 13 и последовательность вариабельного домена легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 14.

5. Клонирование цепей SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 в вектор pOptiVec с константной тяжелой цепью IgG1 человека и константной легкой цепью каппа человека. ПЦР продукты - очистка, рестрикция Nhel + Notl.

Лигирование в pOptiVec /Nhel + Notl.

Трансформация E.coli XL-Blue.

Проверка клонов после трансформации. Праймеры: CMV-F + pOV-R.

Результат: все клоны содержат правильную последовательность.

6. Наработка плазмидной ДНК для трансфекции.

Трансформация клеток XL-Blue плазмидами L3 и Н3. Засев по 1 колонии в 75 мл среды. Выделение плазмидной ДНК L3 и Н3 из 75 мл среды для трансфекции. Метод: Набор для выделения пДНК Midiprep (QIAGEN). Секвенирование плазмид. Праймеры для секвенирования:

7. Транзиентная экспрессия химерных антител 3G7H8 в клетках HEK293.

Плазмиды использованы для транзиентной наработки в суспензионных HEK293. Культивирование в течение 7 дней.

Получены образцы осветленной культуральной жидкости после культивирования трансфецированных Expi293F-TGE_chim3G7H8.

Добавлен азид Na и PMSF. Объем - 200 мл. Концентрация по BLI ForteBio на сенсоре с белком А около 20 мг/л (метод ориентировочный). Переданы на выделение и очистку.

8. Выделение и очистка антител.

Материалы:

- раствор культуральной жидкости штаммов Expi293F-TGE_chim3G7H8, содержащий антитела 200 мл.

- сорбент Белок А-сефароза (ФГУП Гос НИИ ОЧБ ФМБА, Россия), содержащий белок А.

Для проведения хроматографической очистки проводили подготовку сорбента Белок А-сефароза объемом 1 мл. Уравновешивали колонку 10 мл буфера 1 (0,05 М фосфатного буфера, 0,15 М натрия хлорида, рН 7,2 + NaN₃) со скоростью 1,5 мл/мин. Наносили КЖ со скоростью 1,5 мл/мин, для адсорбции антител, далее проводили промывку буфером 1 объемом 20 мл. Элюция проводилась 0,1 М глициновым буфером рН 3.5 со скоростью 1 мл/мин. Объем элюата, содержащего антитела, составил 10,5 мл. Подвели рН элюата до 6.5, после чего измерили количество выделившегося белка на спектрофотометре NP80-Touch при длине волны 280 нм.

Результат: объем элюата V=10,5 мл; концентрация белка в растворе С=0,16 мг/мл; выход по белку Р=1,89 мг.

Раствор концентрировали методом ультрафильтрации под давлением на ячейке с нитроцеллюлозной мембраной. Раствор был сконцентрирован от изначального объема V=10,5 мл до объема V=3 мл. Дальнейшее концентрирование не производилось, так как наблюдалась прогрессирующая агрегация материала. После концентрирования раствор был поставлен на диализ против буфера 0,05 М фосфатный буфер, 0.15 М натрия хлорида, рН 7,2 + NaN₃ на ночь. Раствор антител сняли с диализа и провели измерение концентрации белка при длине волны 280 нм. Итоговая концентрация раствора С=0,58 мг/мл, суммарное количество Р=1,72 мг.

Вывод: получен раствор антител V=3 мл; концентрация белка в растворе С=0,58 мг/мл; тотальный выход по белку - 1,72 мг.

Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующую тяжелую и легкую цепь химерного антитела 3G7H8 соответственно SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23

Пример 4. Исследование кинетических свойств связывания антител с антигеном (рустицианин) с помощью метода биослойной интерферометрии.

Химические реактивы:

Параметры инструментального анализа

Дизайн эксперимента:

a) раскапывание плашки для эксперимента по 200 мкл/лунка;

b) регенерация 5 циклов;

c) базовая линия 2 минуты в PBS;

d) сорбция антител - (антитело к Rusticyanin мышиное 3G7H8 // антитело к Rusticyanin химерное 3G7H8) - 10 мкг/мл в PBS - 10 минут;

e) базовая линия 10 минут в PBST/BSA;

f) ассоциация с антигеном Rusticyanin в PBST/BSA - 12 минут;

g) диссоциация 30 минут;

h) регенерация 5 циклов.

Скорость перемешивания для каждого этапа - 1000 rpm.Температура платы -30°С.

Схема эксперимента представлена в таблице 1:

Обработка данных

Обработка данных проводилась в программе Data Analysis НТ 10(10.0.1.7). Результаты представлены на фигурах 3 и 4, а также в таблицах 2 и 3.

Пример 5. Оценка антипролиферативного действия моноклонального антитела 3G7H8 по изобретению на клеточных моделях.

Для оценки антипролифиративного эффекта антитела 3G7H8 (мышиное) по изобретению была использована адгезивная клеточная культура линии HeLa (аденокарцинома шейки матки). Анализ проводился с использованием инструмента xCELLigence DP (ACEA Biosciences), позволяющего детектировать клеточный индекс в режиме реального времени. Эксперимент проводился в 3 сериях.

Представленные на фигуре 5 графики роста клеток в отсутствии или присутствии антител 3G7H8 в культуральной среде демонстрируют, что использование антител 3G7H8 значительно подавляет рост опухолевых клеток тестированной линии и не подавляет рост контрольной культуры. Таким образом, полученные моноклональные антитела 3G7H8 ингибируют клеточный ответ, замедляя темп пролиферации опухолевых клеток in vitro. Результаты указывают на перспективность терапевтического использования моноклонального антитела 3G7H8 для лечения рака шейки матки человека.

Пример 6. Оценка антипролиферативного действия моноклонального антитела 3G7H8 на клеточных моделях.

Чтобы оценить антипролифиративный и цитотоксический эффект моноклонального антитела 3G7H8 (мышиное) была использована суспензионная культура К562 (миелогенный лейкоз).

Культивирование проводилось в течение трех дней в 24-луночных планшетах с использованием среды RPMI в инкубаторе Thermo Scientific (США) при температуре 37°С. В каждую лунку добавлялось по 1 мл среды, содержащей 1 млн клеток K562. Исследуемое моноклональное антитело в двух концентрациях (концентрация 1 - 0,01442 мг, концентрация 2 - 0,02884 мг) добавлялось к клеточной культуре. Подсчет клеток и оценка жизнеспособности проводились на клеточном анализаторе Countess 2FL с трипановым синим по утвержденной производителем анализатора методике в день 1 до добавления исследуемого вещества, и на третий день культивации. Эксперимент проводился в 10 сериях.

Полученные результаты, представленные в таблице 4, показывают, что при добавлении антитела 3G7H8 количество клеток К562 уменьшается на третий день на 61% при концентрации 1 и на 72% при концентрации 2. В контрольных лунках без добавления антител количество клеток увеличилось на 83%.

Полученные результаты, представленные в таблице 5, продемонстрировали снижение жизнеспособности опухолевых клеток. При добавлении антитела 3G7H8 жизнеспособность клеток К562 уменьшается на третий день на 91% при концентрации 1 и на 98% при концентрации 2. В контрольных лунках без добавления антител жизнеспособность значимо не изменяется.

Таким образом, моноклональное антитело 3G7H8 ингибируют пролиферацию и жизнеспособность опухолевых клеток К562 in vitro. Результаты указывают на перспективность терапевтического использования моноклонального антитела 3G7H8 для лечения злокачественных новообразований.

Пример 7. Противоопухолевое действие моноклонального анатитела 3G7H8 на моделях животных.

С целью оценки противоопухолевого действия антитела 3G7H8 (мышиное) проведено исследование на клетках рака HeLa (карцинома шейки матки) в модели ксенографтов человеческих опухолей на мышах (2 группы по 10 мышей).

В исследовании использованы безтимусные мыши как модель, позволяющая провести ксенотрансплантацию и выращивание опухолей человека в животных. Данное исследование проведено на самках мышей, линии Athymic Nude (Charles River GmbH). Количество животных в исследовании - 20, минимально возможное с точки зрения этических принципов и регуляторных требований.

Клетки карциномы шейки матки человека HeLa клон S3 наращивали во флаконах в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 2 mM глутамина, MEM аминокислоты, Na пируват, антибиотик-антимикотик (Streptomycin, Amphotericin В, Penicillin, применение в 1Х, Gibco, 100Х) до 80-90% конфлюэнтности во влажной атмосфере при 95% воздуха и 5% СО₂ при 37°С. Культуральную среду меняли два раза в неделю.

После периода адаптации, животным перевивали клетки HeLa S3. Этот день считали днем 0 исследования. Клетки собирали с помощью TrypLE Express (Invitrogen), промывали и суспендировали в стерильном физиологическом растворе до необходимой конечной концентрации (1*10^∧6 с матригелем). Полученную суспензию клеток вводили SC (подкожно) в левый бок мышам по 200 мкл на мышь.

При достижении опухолями размеров 100-300 мм³, животные были рандомизированы на группы (таблица 6) так, чтобы средний размер опухоли не различался между группами. После рандомизации начали введение исследуемого моноклонального антитела.

Введение исследуемого и контрольного вещества-растворителя проводили внутривенно по схеме, описанной в таблице 6. Объем введения 7 мл/кг.

Наблюдение за животными проводили 28 дней после первого введения препаратов. Наблюдение включало в себя взвешивание и измерение объема опухоли (3 раза в неделю).

После эвтаназии животных опухоли были выделены и фиксированы в 10% нейтральном формалине. После фиксации ткань была обезвожена, пропитана и залита парафином (температура плавления 56-58°С).

Для проведения гистологического исследования, из полученных парафиновых блоков опухолей на микротоме были изготовлены срезы толщиной 5 мкм, которые были окрашены гематоксилин-эозином и исследованы при помощи светового микроскопа OLYMPUS ВХ51 TF.

При проведении исследования был определен митотический индекс, который определяется как количество клеток, находящихся в состоянии митоза на 1000 опухолевых клеток.

При микроскопии гистопрепаратов, (объектив х4) с помощью программы анализа изображения ВидеоТесТ - Морфология 5.2, методом выделения фаз выделены зоны некроза и ткани опухоли с экспортом результатов в таблицу данных. Измерение площади проводили в мкм².

Для всех данных применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение и стандартное отклонение.

Для статистического сравнения использован непараметрический критерий Краскала-Уоллиса и постанализ Данна. Для статистического сравнения повторяющихся измерений (изменения массы тела животных и объема опухолей в течение эксперимента) использован Repeated measures ANOVA и постанализ Тьюки.

Различия определены при 0,05 уровне значимости и обозначены «*».

Статистическая обработка проведена с использованием программы GraphPad Prism.

Результаты:

Было продемонстрировано снижение индекса прироста опухоли на 28й день после первого введения (35й день исследования). При расчете ингибирования роста опухоли показано, что данный параметр для исследуемого моноклонального антитела составляет 32,7% при двукратном введении (см. таблицу 7).

При проведении гистологического исследования показано, что количество клеток в состоянии митоза в ткани опухолей мышей, получавших исследуемое моноклональное антиетло, на 9,9% меньше, чем в группе контроля. При исследовании процента зон некроза к общей площади опухоли на микрофотографиях различий между группами не выявлено.

Таким образом, в проведенном исследовании моноклональное антитело 3G7H8 показана его противоопухолевая активность при двухкратном введении.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:

[1] - Shijie Jin et al. / Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment / Signal Transduction and Targeted Therapy volume 7, Article number: 39 (2022).

[2] - Jinsha Liu et al. / Therapeutic Advances in Oncology / Int J Mol Sci. 2021 Feb; 22(4): 2008/doi: 10.3390/ijms22042008.

[3] - Brian Effer et al. / Therapeutic Targets of Monoclonal Antibodies Used in the Treatment of Cancer: Current and Emerging/ Biomedicines 2023, 11(7), 2086; https://doi.orq/10.3390/biomedicines11072086.

[4] - Menachem Shoham/ Rusticyanin/ Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry, doi: 10.1002/9781119951438.eibc0617.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="4107097_Перечень

последовательностей.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-26">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024105101</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>4107097</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью «ИНБИО ЭНЕРДЖИ»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Obschestvo s ogranichennoi otvetstvennostiu

&quot;INBIO ENERGY&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Моноклональные антитела,

специфичные к белку рустицианин, и использование антител для

диагностики и лечения злокачественных

новообразований</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>23</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GFNIKDYY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IDPENGDT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IAAYDGFAY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>10</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ESVDNCGISF</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QQSKEVRT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>116</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..116</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EVQLQQSGAEVVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVKQRPEQGLEWIG

WIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVSYCIAAYDGFAYWGQGTLVTVSA</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>110</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..110</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNCGISFMNWFQQKPGQPPK

LLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVRTFGGGTKLEIK</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>446</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..446</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EVQLQQSGAEVVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVKQRPEQGLEWIG

WIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVSYCIAAYDGFAYWGQGTLVTVSAAST

KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS

SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT

CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA

PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>218</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..218</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNCGISFMNWFQQKPGQPPK

LLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVRTFGGGTKLEIKRRTVAAPSV

FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>164</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..164</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ALGISTAMAAPLDTSWKMATLPQVKALLAKDSGKVSGKTVTYSGKTVHV

VAAAVLPGFPFPSFEIHDVKNPTLDIPAGATVDITFINTNKGFGHSLDITKKGPPYAVMPVIDPIIAGTG

FSPVPKSGGFGYTDFTWRPAAGTYYYVCQIPGHAATGMFGKIVVK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>492</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..492</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgctgggtatcagtaccgcgatggcggcaccgctggatacctcctgga

aaatggctacattgccgcaagtgaaggctttgttggccaaggatagcgggaaagtcagtggcaaaacggt

aacctatagcggcaaaaccgtgcatgtggtcgcggcagccgtccttcctgggtttccattccccagcttt

gaaattcatgacgtcaaaaatccgaccttggatatccccgcaggtgccaccgtggatatcaccttcatca

acaccaacaagggatttggtcatagtttagacattaccaagaagggaccgccttatgcagttatgccggt

catcgaccccattatcgcaggtacgggatttagtccggttcccaagagtggggggttcggatacacggac

ttcacctggcgcccggcagcgggcacatactactacgtgtgccagatccctggtcatgcggcaacgggca

tgtttggcaagatcgttgtaaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>349</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..349</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggttcagctgcagcagtctggggcagaggttgtgaggtcaggggcct

cagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgaagcagag

gcctgaacagggcctggagtggattggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgccccgaag

ttccagggcaaggccactatgactgcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcagcctga

catctgaggacactgccgtctcttactgtattgcagcctatgatgggtttgcttactggggccaagggac

tctggtcactgtctctgcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>331</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..331</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggc

agagggccaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattgtggcattagttttatgaactggtt

ccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaaccaaggatccggggtccct

gccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctatggaggaggatgata

ctgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaa

ac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1424</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1424</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggatccaccatggatttccaggtgcagatcttcagctttctcctgatta

gcgctagcgtgatcattagccgcggcgaggttcagctgcagcagtctggggcagaggttgtgaggtcagg

ggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgaag

cagaggcctgaacagggcctggagtggattggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgccc

cgaagttccagggcaaggccactatgactgcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcag

cctgacatctgaggacactgccgtctcttactgtattgcagcctatgatgggtttgcttactggggccaa

gggactctggtcactgtctctgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctcca

agagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggt

gtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactc

tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtga

atcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatg

cccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac

accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgagg

tcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagta

caacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtac

aagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagc

cccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgac

ctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaac

aactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtgg

acaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccacta

cacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatgagcggccgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>723</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..723</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggatttccaggtgcagatcttcagctttctcctgattagcgctagcg

tgatcattagccgcggcgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagag

ggccaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattgtggcattagttttatgaactggttccaa

cagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaaccaaggatccggggtccctgcca

ggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctatggaggaggatgatactgc

aatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgg

cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcct

ctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccct

ccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagc

accctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcc

tgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="17">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgcaaatgggcggtaggcgtg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="18">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggggcggcgttaactgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="19">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccttattccaagcggcttcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="20">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcctccaccaagggccca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="21">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaactgtggctgcaccatct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="22">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1338</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1338</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggttcagctgcagcagtctggggcagaggttgtgaggtcaggggcct

cagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgaagcagag

gcctgaacagggcctggagtggattggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgccccgaag

ttccagggcaaggccactatgactgcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcagcctga

catctgaggacactgccgtctcttactgtattgcagcctatgatgggtttgcttactggggccaagggac

tctggtcactgtctctgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagc

acctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt

ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactc

cctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcac

aagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccac

cgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccct

catgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag

ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca

gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtg

caaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccga

gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcc

tggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaacta

caagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaag

agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc

agaagagcctctccctgtccccgggtaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="23">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>654</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..654</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggc

agagggccaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattgtggcattagttttatgaactggtt

ccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaaccaaggatccggggtccct

gccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctatggaggaggatgata

ctgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaa

acggcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaact

gcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacg

ccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcag

cagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag

ggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфически связывается с белком рустицианин, нуклеиновым кислотам, их кодирующим, а также к применению антител в качестве противоопухолевых агентов и фармацевтических композиций с противоопухолевой активностью. Указанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител характеризуются высоким антипролиферативным действием, высокой эффективностью в ингибировании роста опухоли, а также способностью к снижению жизнеспособности опухолевых клеток. Изобретение позволяет расширить арсенал противоопухолевых агентов, в том числе для лечения злокачественных новообразований. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 табл., 4 пр.

1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с белком рустицианин, включающее:

1) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотные последовательности HCDR 1-3, где:

HCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,

HCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2,

HCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;

2) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотные последовательности LCDR 1-3, где:

LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,

LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность AAS,

LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

2. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

3. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где:

(a) вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;

(b) вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

5. Выделенное моноклональное антитело по п. 1, включающее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

6. Выделенное моноклональное антитело по п. 1, включающее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

7. Выделенное моноклональное антитело по п. 1, включающее:

(c) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,

(d) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

8. Выделенное моноклональное антитело по п. 1, где антитело представляет собой полноразмерный иммуноглобулин.

9. Выделенное моноклональное антитело по любому из пп. 1-8, где антитело является человеческим, мышиным, химерным, гуманизированным.

10. Выделенное моноклональное антитело по любому из пп. 1-8, где антитело, которое специфично связывается с белком рустицианин, представляет собой полноразмерное антитело IgG.

11. Выделенное моноклональное антитело по п. 10, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2a, IgG2b или IgG3.

12. Выделенное моноклональное антитело по п. 10, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1.

13. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12.

14. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 13, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

15. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 13, 14.

16. Применение выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-12 в качестве противоопухолевого средства.

17. Фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью, включающая эффективное количество моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-12 и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.