СПОСОБ ПОСТГИБРИДИЗАЦИОННОЙ ОТМЫВКИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, молекулярной диагностике и представляет собой способ постгибридизационной отмывки биологического микрочипа, направленный на повышение эффективности методов идентификации однонуклеотидных замен, таких как клинически значимые точечные мутации в ДНК микроорганизмов или патогенные варианты в геноме человека.

Уровень техники

Биологические микрочипы низкой плотности с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, обеспечивающие идентификацию однонуклеотидных замен, таких как клинически значимые мутации в ДНК микроорганизмов или патогенные варианты в геноме человека, в настоящее время являются одним из инструментом молекулярной биологии и применяются в различных отраслях биомедицины (Gryadunov D.A., Shaskolskiy B.L., Nasedkina T.V., Rubina A.Yu., Zasedatelev A.S. The EIMB hydrogel microarrays technology: thirty years later. Acta Naturae. 2018. 4 (39): 4-18. doi: 10.32607/20758251-2018-10-4-4-18). В основе проведения анализа на олигонуклеотидных биологических микрочипах лежит гибридизация нуклеиновых кислот (НК). Преимуществами гибридизации являются простота, мультиплексность и воспроизводимость. В отличие от ферментативных реакций, гибридизацию возможно проводить в широком диапазоне температур и композиций буферов. В то же время, гибридизация не обеспечивает непосредственной амплификации НК и должна быть сочетала с технологиями усиления сигналов. В этой связи микрочипы используются для идентификации мишеней в геномной ДНК посредством регистрации гибридизационных комплексов, образованных иммобилизованными в элементах микрочипа зондами и флуоресцентно-меченными ампликонами, полученными в предварительной стадии амплификации НК, как правило, с использованием мультиплексной ПЦР с одновременным флуоресцентным маркированием (Zimenkov D.V., Kulagina E.V., Antonova O.V., Zhuravlev V.Y., Gryadunov D.A. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2016. 71 (6): 1520-1531.doi: 10.1093/jac/dkw015; Shaskolskiy B., Kandinov I., Kravtsov D., Vinokurova A., Gorshkova S., Filippova M., Kubanov A., Solomka V., Deryabin D., Dementieva E., Gryadunov D. Hydrogel droplet microarray for genotyping antimicrobial resistance determinants in Neisseria gonorrhoeae isolates. Polymers. 2021. 13, 22, 3889. doi: 10.3390/polyml3223889).

Основными характеристиками олигонуклеотидного микрочипа являются значения интенсивности полезного сигнала и достигнутых дискриминационных отношений между совершенными (perfect, I_p) и несовершенными (mismatch, I_m) гибридизационными комплексами I_p/I_m. Чем выше интенсивность сигналов и значения дискриминационных отношений, тем эффективнее обеспечивается идентификация геномных мишеней. Эти величины определяются последовательностями и концентрациями иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, составом гибридизационного буфера, температурой гибридизации, а также кинетикой гибридизации и отмывки микрочипов. Показано, что значительное повышение величины интенсивности полезного сигнала элементов микрочипов с иммобилизованными олигонуклеотидами может быть достигнуто за счет увеличения времени гибридизации до выхода на насыщение гибридизационных комплексов в элементах микрочипа (Sorokin NV, Chechetkin V.R., Chechetkin M.A., Vasiliskov V.A., Turygin A.Y., Mirzabekov A.D. Kinetics of hybridization on the oligonucleotide microchips with gel pads. J Biomol Struct Dyn. 2003 Oct; 21 (2): 279-88. doi: 10.1080/07391102.2003.10506923). Недостатком такого подхода в условиях статической гибридизации является длительное время выхода на насыщение (8 часов и более), что существенно ограничивает применимость метода в условиях современной лабораторной диагностики. Активное перемешивание реакционной смеси в ходе гибридизации на олигонуклеотидных микрочипах уменьшает время выхода на насыщение, увеличивает интенсивность полезных сигналов и величины дискриминационных отношений (Schaupp С.J., Jiang G., Myers T.G., Wilson M.A. Active mixing during hybridization improves the accuracy and reproducibility of microarray results. Biotechniques. 2005. 38 (1): 117-9. doi: 10.2144/05381MT01). Однако создание условий для перемешивания на микрочипах требует соответствующих устройств, коммерческие варианты которых в настоящее время отсутствуют.

Важным процессом, влияющим на величину полезного сигнала и повышение дискриминационного отношения I_p/I_m, является постгибридизационная отмывка микрочипа. Скорость вымывания комплексов в элементах микрочипа, как и скорость гибридизации, может быть увеличена снижением концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов, а также повышением температуры реакции (Sorokin N.V., Chechetkin V.R., Livshits M.A., Pan'kov S.V., Donnikov M.Y., Gryadunov D.A., Lapa S.A., Zasedatelev A.S.

Discrimination between perfect and mismatched duplexes with oligonucleotide gel microchips: role of thermodynamic and kinetic effects during hybridization. J Biomol Struct Dyn. 2005. 22 (6): 725-34. doi: 10.1080/07391102.2005.10507039). Однако варьирование данных параметров может привести, с одной стороны, к повышению соотношения I_p/I_m, с другой - к падению полезного сигнала элементов микрочипа до недетектируемого уровня. Эффективность отмывки, обеспечивающая лучшие значения дискриминационных отношений, может быть достигнута посредством многостадийной отмывки буферами с различной ионной силой и регистрации сигналов элементов микрочипа на каждой из стадий с последующей математической обработкой сигналов (Binder, H., Krohn, К. & Burden, C.J. Washing scaling of GeneChip microarray expression. BMC Bioinformatics. 2010. 11, 291. doi: 10.1186/1471-2105-11-291). Однако такая процедура в рутинной практике при одновременной отмывке десятков микрочипов представляется трудоемкой и времязатратной, а многостадийная отмывка повышает риск кросс-контаминации флуоресцентно-меченными ампликонами, и, соответственно, увеличивает вероятность получения ложно-положительных результатов.

Величина полезного сигнала и способность элементов с иммобилизованными олигонуклеотидами к дискриминации между специфичным и неспецифичным связыванием существенно зависит от плотности олигонуклеотидов в ячейке. При малых и промежуточных значениях плотностей величина сигнала приблизительно пропорциональна плотности. Однако при большой плотности олигонуклеотидов возникают стерические препятствия связыванию, в результате чего сигналы выходят на насыщение, а дискриминирующая способность начинает быстро ухудшаться. Для поверхностных микрочипов предельные плотности иммобилизованных олигонуклеотидов отвечают значениям ~10¹³ молекул/см², а для чипов с трехмерными элементами, например, гидрогелевыми, предельные концентрации зондов в ячейке составляют ~10"² М (Чечеткин ВВ., Прокопенко Д.В., Макаров А.А., Заседателев А С.Биочипы для медицинской диагностики. Российские нанотехнологии. 2006. 1 (1-2): 13-27). В частности, для пленарных олигонуклеотидных чипов с длиной зондов 20 нуклеотидов при плотности ~10¹³ молекул/см² для гибридизации доступно только -10% зондов (Peterson AW, Heaton RJ, Georgiadis RM. The effect of surface probe density on DNA hybridization. Nucleic Acids Res. 2001. 29 (24): 5163-8. doi: 10.1093/nar/29.24.5163; Jayaraman A., Hall C.K., Genzer J. Computer simulation study of probe-target hybridization in model DNA microarrays: effect of probe surface density and target concentration. J Chem Phys. 2007. 127 (14): 144912. doi: 10.1063/1.2787618). Типичные значения плотностей олигонуклеотидов для пленарных микрочипов составляют ~10¹¹-10¹² молекул/см², а объемные концентрации зондов в ячейках трехмерных микрочипов лежат в пределах ~10^-4-10^-6 М. При таких плотностях и концентрациях зондов при образовании гибридизационных комплексов между флуоресцентно-меченным анализируемым фрагментом генома и иммобилизованным олигонуклеотидным зондом в элементах микрочипа возможно возникновение зависимости величины флуоресцентного сигнала элемента от эффекта концентрационного тушения флуоресценции, обусловленного высокой концентрацией флуорофора (Tamosiiinaite J., Streckaite S., Chmeliov J., Valkunas L., Gelzinis A. Concentration quenching of fluorescence in thin films of zinc-phthalocyanine. Chemical Physics. 2023. 572: 111949. doi: 10.1016/j.chemphys.2023.111949; Barysaite S, Chmeliov J, Valkunas L, Gelzinis A. Concentration Quenching of Fluorescence Decay Kinetics of Molecular Systems. J Phys Chem B. 2024. 128 (20): 4887-4897. doi: 10.1021/acs.jpcb.3c08254). Согласно СИ. Вавилову подавление флуоресценции молекулами-тушителями может быть статистическим (тушение первого рода) и динамическим (тушение второго рода). К тушению первого рода относятся процессы, в которых снижение выхода флуоресценции сопровождается уменьшением средней длительности возбужденного состояния. Частным случаем статистического тушения является концентрационное тушение, которое связано с образованием нефлуоресцирующих димеров и более крупных ассоциатов молекул при высокой концентрации флуорофора. Явление статистического тушения учитывается, в том числе, при разработке флуоресцентных гибридизационных зондов нуклеиновых кислот (Methods in Molecular Biology, vol. 335: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs and Protocols Edited by: V. V. Didenko Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2006. doi: 10.1385/1-59745-069-3:3). Эффект концентрационного тушения флуоресценции может негативно влиять на величины полезного сигнала и дискриминационного отношения элементов микрочипа даже при оптимальных условиях гибридизации и отмывки.

Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки процедуры постгибридизационной отмывки олигонуклеотидного микрочипа, обеспечивающей как увеличение интенсивности флуоресцентных сигналов элементов микрочипа с гибридизационными комплексами, так и повышение уровня дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами, в том числе, учитывающей эффект концентрационного тушения, отличающейся простотой и коротким временем выполнения, и при этом не требующей внесения изменения в технологию изготовления микрочипов.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом изобретения является создание способа постгибридизационной отмывки биологического микрочипа, обеспечивающего увеличение интенсивности флуоресцентных сигналов элементов микрочипа одновременно с повышением уровня дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами. Способ предусматривает стадию отмывки микрочипа в дистиллированной воде с последующей инкубацией микрочипа в водном объеме ультразвуковой ванны при заданных диапазонах мощности ультразвука и времени инкубации. Подобранные условия инкубации обеспечивают удаление избытка флуоресцентно-меченных проб, приводящего к концентрационному тушению флуоресценции, без полного разрушения гибридизационных комплексов в элементах биологического микрочипа за счет величины мощности ультразвука, не достигающей порога возникновения кавитации, что обеспечивает количественное улучшение основных характеристик при анализе на олигонуклеотидных биологических микрочипах.

В своем первом и единственном аспекте данное изобретение предусматривает способ отмывки олигонуклеотидного биологического микрочипа, включающий следующие стадии:

а) инкубацию биологического микрочипа в дистиллированной воде при 37°С в течение 2 минут;

б) инкубацию биологического микрочипа в ультразвуковой ванне в дистиллированной воде при комнатной температуре при мощности ультразвука не менее 0,02 Вт/см² и не более 0,2 Вт/см² в течение 2-4 минут.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Флуоресцентные картины и гистограммы сигналов элементов биологического микрочипа, полученные в результате стандартной отмывки (а) и в результате постгибридизационной отмывки (б), заявленной в настоящем изобретении.

Фигура 2. Распределение величин полезных сигналов элементов биологического микрочипа, в которых сформировались совершенные гибридизационные комплексы, при стандартной отмывке и при отмывке, заявленной в настоящем изобретении.

Фигура 3. Гистограммы флуоресцентных сигналов элементов биологического микрочипа с совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами в зависимости от времени воздействия ультразвука на элементы микрочипа.

Осуществление изобретения

Анализ последовательностей НК на олигонуклеотидных биологических микрочипах в общем случае включает стадии выделения НК, амплификации отдельных сегментов генома(ов) с одновременным введением флуоресцентной метки, гибридизации полученных флуоресцентно-меченных ампликонов с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, отмывки, регистрации и интерпретации результатов.

Олигонуклеотидный биологический микрочип (биологический микрочип, микрочип) представляет собой матрицу элементов с ковалентно иммобилизованными олигонуклеотидными зондами. Матрица размещается на подложке из стекла или пластика, которые могут быть сформированы разными способами. Растворы олигонуклеотидных зондов могут быть нанесены непосредственно на подложку с получением «планарного» микрочипа (Matson R.S. Microarray Methods and Protocols. 2009. CRC Press. 216 pages, ISBN 9781420046656; Marzancola M. G, Sedighi A. and Li P. C. DNA Microarray-Based Diagnostics. Methods in molecular biology. 2016. 1368: 161-178). Количество элементов варьирует от несколько десятков до сотен тысяч. Микрочип также может представлять собой матрицу, состоящую из гидрогелевых элементов полусферической формы («трехмерный биочип»), содержащих ковалентно иммобилизованные олигонуклеотиды, изготовленный методом сополимеризационной иммобилизации, разработанной и запатентованный Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (Gryadunov D.A., Shaskolskiy B.L., Nasedkina T.V., Rubina A.Yu., Zasedatelev A.S. The EIMB hydrogel microarrays technology: thirty years later. Acta Naturae. 2018. 4 (39): 4-18. doi: 10.32607/20758251-2018-10-4-4-18).

Гибридизацию проводят в растворе, содержащем буферный компонент для поддержания рН, соль для создания ионной силы и хаотропный (дестабилизирующий водородные связи) агент, при температуре, зависящей от температуры плавления иммобилизованных на микрочипе олигонуклеотидов (Mikhailovich V.M., Lapa S.A., Gryadunov D.A., Strizhkov B.N., Sobolev A.Y., Skotnikova O.I., Irtuganova O.A., Moroz A.M., Litvinov V.I., Shipina L.K., Vladimirskii M.A., Chernousova L.N., Erokhin V.V., Mirzabekov A.D. 2001 Detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization and polymerase chain reaction on a specialized ТВ-Microchip.Journal of Clinical Microbiology 39: 2531-2540. doi: 10.1128/JCM.39.7.2531-2540.2001). В качестве дестабилизирующего водородные связи агента могут быть использованы, например, гуанидин тиоцианат, мочевина или формамид. Выбор оптимальной температуры гибридизации проводят с учетом удобства практического применения системы. Олигонуклеотиды, иммобилизованные в элементах микрочипа, имеют температуру плавления в интервале от 42 до 44°С, что позволяет проводить гибридизацию при 37°С с использованием хаотропного агента. Температура 37°С удобна тем, что большинство клинических лабораторий оснащены термостатами, поддерживающими эту температуру.

Постгибридизационная отмывка микрочипа направлена как на дестабилизацию несовершенных гибридизационных комплексов и увеличение дискриминационного отношения Ip/Im, так и на снижение фона, обусловленного наличием в гибридизационной смеси несвязанных флуоресцентно-меченных субстратов или праймеров, а также кристаллов соли. Как правило, отмывку проводят в низкомолярном фосфатно-солевом или натрий-фосфатном буфере (Ikonnikova A., Morozova A., Antonova О., Ochneva A., Fedoseeva Е., Abramova О., Emelyanova М., Filippova М., Morozova I., Zorkina Y., Syunyakov T., Andryushchenko A., Andreyuk D., Kostyuk G., Gryadunov D. Evaluation of the Polygenic Risk Score for Alzheimer's Disease in Russian Patients with Dementia Using a Low-Density Hydrogel Oligonucleotide Microarray. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24 (19): 14765. doi: 10.3390/ijms241914765) или в дистиллированной воде в течение нескольких минут (Shaskolskiy В., Kandinov I., Kravtsov D., Vinokurova A., Gorshkova S., Filippova M., Kubanov A., Solomka V., Deryabin D., Dementieva E., Gryadunov D. Hydrogel droplet microarray for genotyping antimicrobial resistance determinants in Neisseria gonorrhoeae isolates. Polymers. 2021. 13, 22, 3889. doi: 10.3390/polyml3223889).

Регистрацию результатов гибридизации проводят посредством оценки интенсивности флуоресцентных сигналов элементов микрочипа. Регистрацию выполняют с использованием специализированных анализаторов флуоресценции (Lysov, Y., Barsky, V., Urasov, D., Urasov, R., Cherepanov, A., Mamaev, D., Yegorov, Y., Chudinov, A., Surzhikov, S., Rubina, A. et al. Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomedical Optics Express 2017, 8, 4798, doi:10.1364/boe.8.004798). Интерпретацию результатов гибридизации осуществляют, сравнивая интенсивности флуоресцентных сигналов в элементах, принадлежащих одной группе. Максимальный сигнал флуоресценции свидетельствует об образовании совершенного гибридизационного комплекса (I) в элементе, где данный сигнал зарегистрирован. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции элементов, в которых образовались комплексы. Проведение гибридизации и отмывки при оптимальных условиях (температура, время, композиция буферов) позволяет добиться соотношения I_p/I_m ≥2,0 между двумя элементами, содержащими зонды, принадлежащие одной группе, и различающиеся на один нуклеотид. Однако в реальной практике, например, при анализе клинического образца, на величину полезного сигнала и дискриминационные отношения влияет концентрация геномной ДНК анализируемой мишени. Значение полезного сигнала элемента микрочипа и дискриминационного отношения также зависит от вторичной структуры последовательности анализируемого фрагмента генома и иммобилизованного олигонуклеотидного зонда. Эти факторы, а также эффект концентрационного тушения флуоресценции, могут влиять на универсальность и эффективность выявления геномных мишеней с использованием олигонуклеотидных биологических микрочипов.

В результате проведенных научных исследований, авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача увеличения интенсивности полезного сигнала элементов микрочипа и повышения уровня дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами, может быть успешно решена на стадии постгибридизационной отмыки микрочипа посредством введения в процедуру отмывки стадии инкубации в водном объеме ультразвуковой ванны при определенных значениях мощности ультразвука и времени инкубации.

Применение ультразвука обеспечивает удаление избытка флуоресцентно-меченных фрагментов из элементов микрочипа, приводящего к концентрационному тушению флуоресценции, без полного разрушения гибридизационных комплексов в элементах биологического микрочипа за счет величины мощности ультразвука, не достигающей порога возникновения кавитации. Установлено, что для водопроводной воды возбуждение кавитации при нормальных условиях на частоте 20 кГц происходит при мощности ультразвука, составляющей 1 Вт/см², на частоте 200 кГц - 10 Вт/см² (Донской А.В., Келлер O.K., Кратыш Г.С.Ультразвуковые электротехнологические установки, 1982. Ленинград. Энергоиздат). Таким образом, заявленные в настоящем изобретении мощности ультразвука, составляющие от 0,02 Вт/см² до 0,2 Вт/см² не приводят к формированию кавитационных пузырьков, способных к повреждению (формированию разрывов) цепей ДНК (GrokhovskiX SL. The specific cleavage of DNA with ultrasound. Mol Biol (Mosk). 2006. 40(2): 317-25) и, соответственно, влияющих на разрушение гибридизационных комплексов.

Для элементов биологического микрочипа с гибридизационными комплексами, образованными флуоресцентно-меченными ампликонами и олигонуклеотидными зондами одинаковой структуры и концентрации, флуоресцентный сигнал при постгибридизационной отмывке зависит от концентрации флуорофоров и величины тушения флуоресценции. Увеличение флуоресцентного сигнала и повышение дискриминационного отношения происходит при отмывке избытка флуорофора, вызывающего концентрационное тушение при условии, что общая концентрация гибридизационных комплексов не упадет настолько, что это приведет к понижению уровня флуоресцентного сигнала. Отмывка комплексов, сформированных как в поверхностных элементах планарных микрочипов, так и в порах трехмерных элементов, может быть выполнена при перемешивании раствора с помощью акустических волн, возникающих в ультразвуковой камере. Оптимальное время воздействия ультразвуком на гибридизационные комплексы элементов микрочипа составляет от 2 до 4 минут. Меньшее время инкубации не приводит к удалению избытка флуорофора, в то время как большая длительность обработки ультразвуком вызывает существенную дестабилизацию гибридизационных комплексов и падение величины полезного сигнала и дискриминационного отношения.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примером, который предназначен для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должен рассматриваться как ограничивающий данное изобретение.

Пример. Результаты постгибридизационной отмывки биологического микрочипа в методе идентификации мутаций в геноме возбудителя гонококковой инфекции Neisseria gonorrhoeae, ассоциированных с устойчивостью к цефтриаксону.

Геномную ДНК выделяют из клинического изолята, предоставленного из коллекции Государственного научного центра дерматовенерологии и косметологии Минздрава РФ (Kubanov A., Solomka V., Plakhova X., Chestkov A., Petrova N., Shaskolskiy В., Dementieva E., Leinsoo A., Gryadunov D., Deryabin D. Summary and Trends of the Russian Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme, 2005-2016. Journal of Clinical Microbiology. 2019. 57:e02024-18. doi: 10.1128/JCM.02024-18).

Изготовление биологических микрочипов для идентификации мутаций в геноме N. gonorrhoeae, ассоциированных с устойчивостью к цефтриаксону, проведение мультиплексной амплификации участков генома микроорганизма, гибридизацию полученных флуоресцентно-меченных ампликонов на биологическом микрочипе проводят по процедуре, описанной ранее в работе (Shaskolskiy В., Kandinov I., Kravtsov D., Filippova M., Chestkov A., Solomka V., Kubanov A., Deryabin D., Dementieva E., Gryadunov D. Prediction of ceftriaxone MIC in Neisseria gonorrhoeae using DNA microarray technology and regression analysis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2021. 76 (12): 3151-3158. doi: 10.1093/jac/dkab308). Анализ образца ДНК проводят в 10 повторностях. По окончании гибридизации проводят стандартную отмывку пяти микрочипов с использованием 30 мкл дистиллированной воды при 37°С в течение 2 минут. Отмывку других пяти микрочипов выполняют следующим образом:

- стадия 1. Инкубация биологического микрочипа в дистиллированной воде при 37°С в течение 2 минут;

- стадия 2. Инкубация биологического микрочипа в ультразвуковой ванне («Ультразвуковой очиститель 30/50 Вт», «BALASHOV», Китай, https://aIiexpress.ru/item/1005003286376908.html?sku_id=: 12000029050507725&srcSns=sns_More&businessType=ProductDetail&spreadType=socialShare&tt=MG&utm_medium=sharin) в 500 мл дистиллированной воды при комнатной температуре при мощности ультразвука 0,08 Вт/см² и частоте 40 кГц в течение 4 минут.

По окончании отмывки микрочипы высушивают в потоке воздуха и регистрируют флуоресцентную картину гибридизации с использованием Универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов (УАПК) (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия), оснащенного специализированным программным обеспечением 'ImageGel Studio' (ООО «БИОЧИП-ИМБ»).

Флуоресцентные картины и гистограммы сигналов элементов биологического микрочипа, полученные в результате стандартной отмывки (а) и в результате постгибридизационной отмывки (б), заявленной в настоящем изобретении, представлены на Фигуре 1. Флуоресцентная картина микрочипа, прошедшего постгибридизационную отмывку, заявленную в настоящем изобретении, визуально существенно ярче флуоресцентной картины микрочипа при стандартной отмывке.

В ходе интерпретации результатов выявляют элементы микрочипа с максимальными флуоресцентными сигналами в группах и относят их к элементам с совершенными гибридизационными комплексами (I_p). Элементы с меньшей интенсивностью сигнала в каждой из групп классифицируют как элементы с несовершенными гибридизационными комплексами (I_m). Распределение величин полезного сигнала элементов биологического микрочипа с совершенными гибридизационными комплексами при стандартной отмывке и при отмывке, заявленной в настоящем изобретении, представлено на Фигуре 2. По результатам обработки сигналов микрочипов, прошедших стандартную отмывку, и микрочипов, прошедших инкубацию в ультразвуковой ванне, получают, что заявленный в настоящем изобретении способ постгибридизационной отмывки обеспечивает повышение флуоресцентных сигналов в среднем не менее чем на 40% и дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными комплексами I_p/I_m не менее чем на 15%.

Результаты оценки оптимального времени воздействия ультразвука (инкубации в ультразвуковой ванне) представлены на Фигуре 3. Время инкубации, обеспечивающее увеличение величины полезного сигнала не менее чем на 40% и повышение дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными комплексами Ip/Im в среднем не менее чем на 15%, находится в диапазоне от 2 до 4 минут. Меньшее время инкубации не обеспечивает необходимых характеристик микрочипа, в то время как большая длительность обработки ультразвуком приводит к падению величины полезного сигнала и дискриминационного отношения.

Аналогичные результаты в отношении увеличения величины полезного сигнала и дискриминационных отношений были получены при анализе генома человека с использованием заявленной в настоящем изобретении постгибридизационной отмывки микрочипов для выявления генетических маркеров риска развития деменции альцгеймеровского типа (Ikonnikova A., Morozova A., Antonova О., Ochneva A., Fedoseeva Е., Abramova О., Emelyanova М., Filippova М., Morozova I., Zorkina Y., Syunyakov T., Andryushchenko A., Andreyuk D., Kostyuk G., Gryadunov D. Evaluation of the Polygenic Risk Score for Alzheimer's Disease in Russian Patients with Dementia Using a Low-Density Hydrogel Oligonucleotide Microarray. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24 (19): 14765. doi: 10.3390/ijms241914765). Введение в процедуру отмывки стадии инкубации в ультразвуковой ванне, обеспечивающей снижение концентрационного тушения флуоресценции, также приводило к увеличению величины полезного сигнала в среднем на 40% и повышению дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными комплексами I_p/I_m в среднем на 15%.

Заявленный в настоящем изобретении способ выгодно отличается от известных из уровня техники изобретений тем, что позволяет получить как увеличение интенсивности полезных сигналов элементов микрочипа, так и повышение уровня дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами. Способ отличается простотой и коротким временем выполнения процедуры с использованием недорогого и коммерчески доступного оборудования (ультразвуковой ванны). Способ не требует внесения изменения в технологию изготовления микрочипов, например, встраивания на этапе производства элементов для перемешивания растворов или ультразвуковых осцилляторов.

Изобретение относится к молекулярной биологии, молекулярной диагностике и представляет собой способ постгибридизационной отмывки биологического микрочипа, направленный на повышение эффективности методов идентификации однонуклеотидных замен, таких как клинически значимые точечные мутации в ДНК микроорганизмов или патогенные варианты в геноме человека. Способ постгибридизационной отмывки олигонуклеотидного биологического микрочипа включает инкубацию биологического микрочипа в дистиллированной воде при 37°С в течение 2 минут с последующей инкубацией биологического микрочипа в ультразвуковой ванне в дистиллированной воде при комнатной температуре при мощности ультразвука не менее 0,02 Вт/см² и не более 0,2 Вт/см² в течение 2-4 минут. Осуществление способа обеспечивает увеличение интенсивности флуоресцентных сигналов элементов микрочипа одновременно с повышением уровня дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами. 3 ил.

Способ постгибридизационной отмывки олигонуклеотидного биологического микрочипа, включающий:

а) инкубацию биологического микрочипа в дистиллированной воде при 37°С в течение 2 минут;

б) инкубацию биологического микрочипа в ультразвуковой ванне в дистиллированной воде при комнатной температуре при мощности ультразвука не менее 0,02 Вт/см² и не более 0,2 Вт/см² в течение 2-4 минут.