РЕКОМБИНАНТНАЯ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОГО СИНТЕЗА ВЫСОКООЧИЩЕННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ОЛИГОСАХАРИДОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/21 C12N15/77 C12P19/26 C12R1/15 

Область техники

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной Corynebacterium glutamicum для эффективного синтеза высокоочищенной гиалуроновой кислоты и ее олигосахаридов, относящейся к области техники биоинженерии.

Уровень техники

Гиалуроновая кислота представляет собой неразветвленный кислый мукополисахарид, полученный путем полимеризации дисахаридных звеньев, состоящих из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. Гиалуроновая кислота, имеющая сверхвысокую молекулярную массу, обладает такими функциями, как хорошая вязкоупругость, увлажняющие и противовоспалительные свойства, и может быть использована в качестве вязкоупругого агента в офтальмологической хирургии, для терапии посредством внутрисуставных инъекций и т.п. Гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой обладает хорошим увлажняющим и смазывающим действием и может быть использована в области косметологии. Высокоочищенная гиалуроновая кислота и ее олигосахариды оказывают противоопухолевое действие, способствуют заживлению ран, стимулируют остеогенез и ангиогенез, регулируют иммунитет. В 2016 году мировой рынок гиалуроновой кислоты составлял 7,2 млрд долларов США, и прогнозируется, что в 2020 году его стоимость достигнет 10,8 млрд долларов США.

В настоящее время коммерчески доступную гиалуроновую кислоту в основном получают путем ферментации Streptococcus zooepidemicus, который естественным образом продуцирует гиалуроновую кислоту. Однако гиалуроновая кислота, продуцируемая Streptococcus zooepidemicus, с трудом отвечает требованиям медицины, пищевой промышленности и других областей, поскольку Streptococcus zooepidemicus является патогенным штаммом и может вызывать множество заболеваний. Кроме того, полученная из него гиалуроновая кислота имеет низкую степень чистоты, что снижает качество продукта. Для решения этой проблемы была использована технология генной инженерии для синтеза гиалуроновой кислоты путем гетерологичной экспрессии гиалуронат-синтазы в некоторых сконструированных штаммах, таких как Bacillus subtilis и Corynebacterium glutamicum. Однако сама Bacillus subtilis склонна к лизису клеток, и ДНК, высвобождаемая в результате лизиса клеток, вызывает загрязнение продукта на основе гиалуроновой кислоты. Для сравнения, Corynebacterium glutamicum имеет более толстые клеточные стенки, более сильную устойчивость и лучшую стабильность клеток, чем Bacillus subtilis. Однако Corynebacterium glutamicum будет синтезировать больше экзополисахаридов вне клетки. Эти полисахариды не только конкурируют за субстраты на пути синтеза гиалуроновой кислоты, но и повышают сложность последующей очистки гиалуроновой кислоты, тем самым снижая качество продукта на основе гиалуроновой кислоты.

Краткое описание изобретения

Первой целью настоящего изобретения является обеспечение рекомбинантной Corynebacterium glutamicum, для которой ген экзополисахарида cg0420 и/или cg0424 выключен или нокаутирован, и экспрессируется гиалуронат-синтаза; ген cg0420 содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO.1; ген cg0424 содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO.2; и гиалуронат-синтаза является такой, как представлено в (а), (b) или (с):

(a) фермент, полученный из Streptococcus pyogenes, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 90% гомологии с SEQ ID NO.3;

(b) фермент, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO.3;

(c) белок, полученный из (а) или (b), замещенный или удаленный на основе (а) или (b) и обладающий гиалуронат-синтазной активностью.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гены экзополисахаридов cg0420 (SEQ ID NO. 1) и cg0424 (SEQ ID NO. 2) рекомбинантной Corynebacterium glutamicum выключены или нокаутированы, и в рекомбинантной Corynebacterium glutamicum экспрессируется гиалуронат-синтаза.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гиалуронат-синтаза получена из Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO. 3).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения путь УДФ-N-ацетилглюкозамина и/или УДФ-глюкуроновой кислоты усилен в Corynebacterium glutamicum.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения путь УДФ-N-ацетилглюкозамина включает в себя: глутамин-фруктозо-6-фосфат-трансаминазу, фосфоглюкомутазу, бифункциональный фермент УДФ-N-ацетилглюкозамин-пирофосфорилазу/глюкозо-1-фосфат-ацетилтрансферазу.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения путь УДФ-глюкуроновой кислоты включает в себя: фосфоглюкомутазу, глюкозо-6-фосфат-урамидотрансферазу, УДФ-глюкозодегидрогеназу.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фосфоглюкомутаза Pgm (SEQ ID NO.4), глюкозо-6-фосфат-урамидотрансфераза GalU (SEQ ID NO.5), УДФ-глюкозодегидрогеназа Ugd (SEQ ID NO.6), глютамин-фруктозо-6-фосфат-трансаминаза GlmS (SEQ ID NO.7), фосфоглюкомутаза GlmM (SEQ ID NO. 8), бифункциональный фермент

УДФ-N-ацетилглюкозамин-пирофосфорилаза/глюкозо-1-фосфат-ацетилтрансфераза GlmU (SEQ ID NO.9) получены из Ρseudomonas putida KT2440.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессия по меньшей мере одного гена, выбранного из pgM, ugd, galU, glms, glmM и glmU, усилена в любой из указанных выше Corynebacterium glutamicum.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная Corynebacterium glutamicum получена из промышленно безопасного штамма Corynebacterium glutamicum, гетерологично экспрессирует ген гиалуронат-синтазы hasA, полученный из Streptococcus pyogenes; гены экзополисахаридов Corynebacterium glutamicum cg0420 и cg0424 рекомбинантной Corynebacterium glutamicum нокаутированы для удаления гетерополисахаридов с экстрацитоплазматической поверхности; и конструируются экспрессионные кассеты для усиления экспрессии генов пути pgM, ugd, galU, glms, glmM и glmU, тем самым увеличивая продукцию синтетических субстратов для гиалуроновой кислоты УДФ-N-ацетилглюкозамина и УДФ-глюкуроновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения любая из указанных выше Corynebacterium glutamicum также экспрессирует гемоглобин VHb Vitreoscilla (SEQ ID NO. 10) для улучшения роста рекомбинантной Corynebacterium glutamicum в микроаэробной среде и способности синтезировать гиалуроновую кислоту. Второй целью настоящего изобретения является обеспечение способа конструирования рекомбинантного Corynebacterium glutamicum, который включает: (1) нокаутирование генов синтеза экзополисахаридов cg0420 и cg0424 поэтапно или одновременно путем конструирования нокаут-бокса(-ов); (2) лигирование гена, кодирующего гиалуронат-синтазу, и по меньшей мере одного гена, выбранного из pgM, ugd, galU, glmS, glmM и glmU, в вектор, который, в свою очередь, трансформируют в представляющую интерес клетку штамма.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор может представлять собой рХМЛ9, рЕСХК99Е, рЕС-ХТ99А, pEKExl, рЕКЕх2, pVWExl, pVWEx2, pZ8-l, рЕСТАС-К99 или рАРЕ12 (вышеуказанные векторы описаны в источнике: Eggeling, L. and Bott, M., Handbook of Corynebacterium glutamicum. 2005, Boca Raton: Taylor & Francis. 616 p).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ заключается в лигировании pgm, galU, ugd в вектор рХМЛ 9.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ заключается в лигировании glmS, glmM, glmU в вектор рЕСХК99Е.

Третьей целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения гиалуроновой кислоты, который включает ферментацию рекомбинантной Corynebacterium glutamicum.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ферментацию осуществляют при температуре 25-35°С в течение 24-72 часов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ также включает добавление гиалуронат-гидролазы или гиалуронат-лиазы на ранней стадии ферментации; гиалуронат-гидролаза или гиалуронат-лиаза добавляют в количестве 500-50000 ед/мл.

Четвертой целью настоящего изобретения является обеспечение применения рекомбинантной Corynebacterium glutamicum для получения гиалуроновой кислоты и ее производных.

Преимущества изобретения: в настоящем изобретении путь синтеза гиалуроновой кислоты сконструирован в промышленно безопасном штамме Corynebacterium glutamicum, который гетерологично экспрессирует ген гиалуронат-синтазы hasA, полученный из Streptococcus pyogenes. Чистота гиалуроновой кислоты повышается путем нокаутирования генов экзополисахаридов Corynebacterium glutamicum cg0420 и cg0424 и, таким образом, удаления гетерополисахаридов с экстрацитоплазматической поверхности. Способность рекомбинантной Corynebacterium glutamicum синтезировать гиалуроновую кислоту улучшается благодаря конструированию экспрессионных кассет для усиления экспрессии генов пути pgM, ugd, galU, glms, glmM и glmU, что увеличивает синтез УДФ-N-ацетилглюкозамина и УДФ-глюкуроновой кислоты, как синтетических субстратов для гиалуроновой кислоты, и тем самым решает проблему недостаточного поступления субстратов во время синтеза гиалуроновой кислоты. Для решения проблемы недостаточного количества растворенного кислорода в процессе ферментации в рекомбинантной Corynebacterium glutamicum также экспрессируется гемоглобин VHb Vitreoscilla для улучшения роста рекомбинантной Corynebacterium glutamicum в микроаэробной среде и способности синтезировать гиалуроновую кислоту. Благодаря нокаутированию cg0420 выход и чистота гиалуроновой кислоты были в определенной степени улучшены. Выход неочищенного продукта увеличивается на 27,8%, с 18 г/л до 23 г/л, а чистота увеличивается с 75% до 86%. При нокаутировании cg0420 и cg0424 выход гиалуроновой кислоты увеличивается на 58,3%, достигая 28,5 г/л, а чистота неочищенного продукта достигает 95%. Благодаря двойному нокауту в сочетании с экспрессией VHb, производительность рекомбинантного Corynebacterium glutamicum достигает 40 г/л, что на 40,3% больше по сравнению с исходным штаммом. Продуцирование олигосахаридов гиалуроновой кислоты достигают путем добавления 6000 ед/мл экзогенной гидролазы гиалуроновой кислоты в процессе ферментации. Наконец, способность продуцировать гиалуроновую кислоту достигает 72 г/л, что на 152,6% больше, чем у исходного штамма, и в 2,5 раза больше, чем у самого высокопродуктивного штамма, о котором сообщалось до сих пор.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Метаболические пути и соответствующие ферменты для производства гиалуроновой кислоты рекомбинантной Corynebacterium glutamicum.

Фигура 2: График, демонстрирующий выход и чистоту продукта гиалуроновой кислоты рекомбинантной Corynebacterium glutamicum.

Фигура 3: График, демонстрирующий выход гиалуроновой кислоты рекомбинантной Corynebacterium glutamicum в ферментационном резервуаре объемом 5 л.

Фигура 4: График, демонстрирующий выход гиалуроновой кислоты рекомбинантной Corynebacterium glutamicum при экзогенном добавлении гиалуронат-гидролазы в ферментационном резервуаре объемом 5 л.

Фигура 5: Масс-спектр дисахаридного звена гиалуроновой кислоты, продуцируемой рекомбинантной Corynebacterium glutamicum.

Подробное описание изобретения

Штамм: Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, плазмиды: рХМЛ9, рЕС-ХК99Е, pKl&mobSacB

Среда LB: сухие дрожжи: 5 г/л, пептон: 10 г/л и хлорид натрия: 10 г/л.

ВHI: сердечно-мозговой экстракт: 17 г/л, сорбитол: 21 г/л

Ферментационная среда: глюкоза: 40 г/л, порошок кукурузного экстракта: 20 г/л, KН₂РО₄: 15 г/л, K₂НРО₄: 5 г/л, MgSO₄: 1 г/л.

Определение выхода гиалуроновой кислоты: Ферментационный бульон отбирали соответствующим образом и разбавляли в 10 раз, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут, супернатант отбирали и добавляли к нему 4-кратный объем предварительно охлажденного этанола, помещали на -20°С для 6-часового осаждения этанолом, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут, супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали водой до первоначального объема, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут, осадок отбрасывали, а супернатант отбирали и добавляли 4-кратный объем предварительно охлажденного этанола, помещали на -20°С для 6-часового осаждения этанолом, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут, супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали водой до первоначального объема, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут, отбирали супернатант и отбрасывали осадок. Супернатант отбирали и разводили в 50 раз до конечного разведения в 500 раз. Для измерения образца, образец был разбавлен в соответствии с линейным эффективным диапазоном, а затем измерен карбазол-серным способом.

Определение карбазол-серным способом: 1 мл образца добавляли в стеклянную пробирку, содержащую 5 мл буры с серной кислотой (4,77 г буры растворяли в 500 мл концентрированной H₂SO₄), хорошо перемешивали, кипятили на кипящей водяной бане в течение 15 мин и охлаждали на льду. Добавляли 250 мкл карбазолового реагента (0,125 г карбазола, растворенного в 100 мл абсолютного этанола), хорошо перемешивали и кипятили на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Пустой контроль готовили в тех же условиях, только образец заменяли равным объемом дистиллированной воды, и измеряли значение абсорбции при длине волны 530 нм. Различные концентрации (10, 20, 30, 40, 50 мкг/мл) D-глюкуроновой кислоты использовали в качестве стандартных образцов для построения стандартной кривой, а затем рассчитывали содержание гиалуроновой кислоты путем подгонки значения ее поглощения к стандартной кривой. Уравнение стандартной кривой: у=126,88х - 9,2639, R²=0,9991 (х, поглощение А530; у, содержание глюкуроновой кислоты в образце (мкг/мл)). Формула расчета выхода хондроитина: содержание гиалуроновой кислоты (г/л)=(концентрация, определенная по стандартной кривой * коэффициент разбавления * 2,067)/1000. Для измерения образца, образец был разбавлен в соответствии с линейным эффективным диапазоном.

Определение молекулярной массы гиалуроновой кислоты: Супернатант ферментации был очищен от примесей путем повторного осаждения спиртом для получения высокоочищенной гиалуроновой кислоты, молекулярная масса которой была измерена с помощью ВЭЖХ.

Определение структуры гиалуроновой кислоты с помощью ЖХ-МС.

Супернатант ферментации был очищен от примесей путем многократного осаждения спиртом для получения высокоочищенной гиалуроновой кислоты, а затем образец обрабатывали в течение ночи при 37°С гиалуронидазой для расщепления гиалуроновой кислоты на дисахаридные звенья. Затем к образцу добавляли девятикратный объем безводного метанола. Примеси и негидролизованную гиалуроновую кислоту удаляли центрифугированием, а нерастворимые примеси отфильтровывали через органическую мембрану перед анализом структуры дисахаридных звеньев методом ЖХ-МС.

ПРИМЕР 1: Конструирование рекомбинантной Corynebacterium glutamicum (1)

Нокаут генов cg0420 и cg0424

Фрагмент примерно на 500 п.н. в 5'-направлении от cg0420, 0420-up, получали методом ПЦР с геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и с использованием 0420-up-F и 0420-up-R в качестве праймеров, продукт ПЦР очищали;

Фрагмент примерно на 500 п. н. в 3'-направлении от cg0420, 0420-down, получали методом ПЦР с геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и с использованием 0420-down-F и 0420-down-R в качестве праймеров, продукт ПЦР очищали;

Суицидную плазмиду Corynebacterium glutamicum pK18mobsacB подвергали двойному расщеплению с помощью EcoRI/Bamhl, а фрагменты 0420-up и 0420-down лигировали с расщепленной pK18mobsacB в один этап с помощью набора Gibson Assembly, полученная рекомбинантная плазмида была названа рК 18-0420;

Corynebacterium glutamicum АТСС13032 трансфицировали плазмидой рК18-0420 путем электропорации, и условия электрошока были следующими: напряжение 1,5 кВ, 5 мс (ширина сосуда для электропорации была 1 мм), электрошок проводили дважды. Первый скрининг рекомбинантных бактерий проводили на чашках с BHI, содержащих 25 мг/л канамицина. Положительные рекомбинанты собирали и далее культивировали в жидкой среде LB в течение ночи, а затем проводили второй скрининг на чашках с BHI, содержащих 100 г/л сахарозы. ПЦР проводили на колонии с использованием праймеров 0420-up-F и 0420-down-R, и фрагмент размером 1 Кб был амплифицирован из рекомбинанта с нокаутом гена 0420, и рекомбинантный штамм был назван С.glutamicum Δ0420. Ген cg0424 также был нокаутирован вышеуказанным способом, в результате чего был получен штамм с одним нокаутом cg0424 и штамм с двойным нокаутом cg0420 и cg0424, названные С.glutamicum Δ0420 и С.glutamicum Δ0420&Δ0424, соответственно.

В том числе использовали следующие последовательности праймеров:

(2) Интеграция генов Has А и VHb

Фрагмент U-up размером 500 п. н. амплифицировали методом ПЦР с геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы с использованием U-up-F и U-up-R в качестве праймеров, продукт ПЦР очищали;

Фрагмент D-down размером около 500 п. н. амплифицировали методом ПЦР с геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы с использованием D-down-F и D-down-R в качестве праймеров, продукт ПЦР очищали;

Фрагмент, представленный в SEQ ID NO. 10, амплифицировали методом ПЦР с геномной ДНК Vitreoscilla {Vitreoscilla stercoraria DSM 513) в качестве матрицы с использованием HasA-F и HasA-R в качестве праймеров, продукт ПЦР очищали;

Суицидную плазмиду Corynebacterium glutamicum pKISmobsacB подвергали двойному расщеплению с помощью EcoRI/Bamhl, а фрагменты U-up, D-down и VHb лигировали с расщепленной pKISmobsacB в один этап с помощью набора Gibson Assembly, полученная рекомбинантная плазмида была названа pK18-VHB;

Штамм С.glutamicum Δ0420, штамм С.glutamicum Δ0424 и штамм С.glutamicumA0420 Δ0424, сконструированный на этапе (1), и штамм дикого типа трансфицировали плазмидой pK18-VHB путем электропорации, и условия электрошока были следующими: напряжение 1,5 кВ, 5 мс, (ширина сосуда электропорации 1 мм), электрошок проводили дважды. Первый скрининг рекомбинантных бактерий проводили на чашках с BHI, содержащих 25 мг/л канамицина. Положительные рекомбинанты собирали и далее культивировали в жидкой среде LB в течение ночи, а затем проводили второй скрининг на чашках с BHI, содержащих 100 г/л сахарозы. ПЦР проводили на колонии с использованием праймеров U-up-F и D-down-R, и фрагмент размером 1,3 Кб амплифицировали из рекомбинанта, интегрированного геном HasA, и рекомбинантный штамм был назван С.glutamicum-HasA. Вышеуказанный способ также использовали для интеграции гена VHb, и в конечном итоге были получены штаммы С.glutamicum Δ0420-HasA-VHB, A0424-HasA-VHB, Δ0420&Δ0420-НasA-VHB и WT-HasA-VHB, соответственно.

(3) Конструирование рекомбинантных плазмид pXMJ19-pgm-galU-ugd и pECXK99E-glmS-glmM-glmU

Pseudomonas putida KT2440 инокулировали в 3 мл жидкой среды LB и культивировали при 30°С при 220 об/мин в течение 24 часов. Бактерии собирали и выделяли геномную ДНК с помощью набора для экстракции клеточного генома. Были разработаны праймеры pgm-Flpgm-R, galU-F/galU-R, ugd-F/ugd-R, glmS-F/glmS-R, glmM-F/glmM-R и glmU-F/glmU-R, a выделенную геномную ДНК Pseudomonas putida использовали в качестве матрицы для амплификации и получения генов pgm, ugd, galU, glmU, glmS и glmM с помощью системы и процедуры ПЦР-амплификации. Плазмиды рХМЛ9 и рЕСХК99Е ферментативно расщепляли по выбранным сайтам рестрикции с получением линейных плазмид рХМЛ9 и рЕСХК99Е, а реакции сборки Гибсона проводили на амплифицированных фрагментах pgm, ugd, galU и линейной плазмиде рХМЛ9, а также на glmU, glmS, glmM и линейной плазмиде рЕСХК99Е. Компетентные клетки JM109 были трансформированы с помощью реакционной системы сборки Гибсона. Трансформанты отбирали для проведения реакции секвенирования плазмид и выравнивания последовательностей, и успешно сконструировали рекомбинантные плазмиды pXM3l9-pgm-ugd-galU и pECX99E-glmU-glmM-glmS. Рекомбинантные плазмиды электротрансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, С.glutamicumA0420-HasA-VHB, A0424-HasA-VHB, A0420&A0424-HasA-VHB и WT-HasA-VHB, и полученные рекомбинантные штаммы были названы WT, Δ0420, Δ0424 и Δ0420&Δ0424, соответственно.

ПРИМЕР 2: Продуцирование гиалуроновой кислоты рекомбинантной Corynebacterium glutamicum

По одному клону каждого из сконструированных рекомбинантных штаммов Corynebacterium glutamicum WT, Δ0420, Δ0424 и Δ0420&Δ0424 инокулировали в 5 мл среды BHI при 200 об/мин и 30°С в течение ночи. Через 10 часов 1% инокулята переносили в 250 мл колбу Эрленмейера (содержащую 25 мл ферментационной среды). Через 3 часа после инкубации при 200 об/мин, 28°С, добавляли ИПТГ в конечной концентрации 0,25 мМ для индуцирования экспрессии генов. Период ферментации составил 48 часов. После завершения ферментации отбирали супернатант и добавляли четырехкратный объем этанола для осаждения спиртом для удаления некоторых примесей. После двукратного повторения осаждения спиртом содержание гиалуроновой кислоты определяли карбазол-серным способом. Как показано на фиг. 2, выход и чистота гиалуроновой кислоты были в определенной степени улучшены путем нокаутирования cg0420 и cg0420. Для штамма с двойным нокаутом выход и чистота гиалуроновой кислоты с использованием термостатируемой качалки достигали 6,9 г/л и 95%, соответственно.

ПРИМЕР 3: Ферментационная культура рекомбинантной Corynebacterium glutamicum в ферментационном резервуаре объемом 5 л

По одному клону каждого из сконструированных рекомбинантных штаммов Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum HasA-VGB/pXMJ19-pgm-ugd-galU и pECX99E-glmU-glmM-glmS (нокаут cg0420 и cg0424) инокулировали в 5 мл среды BHI при 200 об/мин и 30°С в течение ночи. Через 10 часов 1% инокулята переносили в 250 мл колбу Эрленмейера (содержащую 25 мл ферментационной среды). Культивировали при 200 об/мин и 28°С в течение 10 часов и 10% инокулята инокулировали в ферментационный резервуар. Во время процесса ферментации содержание глюкозы в резервуаре поддерживали на уровне около 10 г/л путем подачи глюкозы, а рН регулировали до нейтрального уровня путем добавления NaOH. Через 20 часов после ферментации экзогенно добавляли гидролазу гиалуроновой кислоты в конечной концентрации 6000 ед/мл. Период ферментации составил 72 часов. Как показано на фиг. 3, OD достигала наивысшего уровня через 48 часов без добавления гидролазы гиалуроновой кислоты. Гиалуроновая кислота быстро накапливалась с 24 до 48 часов, и выход достигал 40 г/л через 60 часов. Как показано на фиг. 4, бактерии находились в логарифмической фазе роста с 4 до 36 часов, бактерии быстро росли и перешли в стационарную фазу через 36 часов. Кроме того, гиалуроновая кислота быстро накапливалась с 24 часов до 60 часов. По сравнению с фиг. 3 период ферментации был на 12 часов дольше, и выход гиалуроновой кислоты также значительно увеличился. Через 72 часа выход гиалуроновой кислоты достиг 72 г/л, что на 32 г/л выше, чем без гидролазы, и OD также увеличилась до определенной степени.

Сравнительный пример:

Следуя той же стратегии, что и в примере 1, нокаутировали кодирующие гены Cgl111S (NC_003450.3) и Cgl0452 (NC_003450.3) в конкурирующем предшественнике другого пути. Рекомбинантные плазмиды, сконструированные согласно этапам (2) и (3) в примере 1, трансформировали в нокаутные клетки Cgl111S (NC_003450.3) и Cgl0452 (NC_003450.3). Ферментацию проводили в соответствии со способом, представленным в примере 2 или 3. Результаты показывают, что выход гиалуроновой кислоты был значительно снижен в этих штаммах с нокаутом генов. Выход с использованием термостатируемой качалки составил всего 3,1 г/л. Основная причина заключается в том, что нокаутирование этих генов влияет на рост бактерий, что приводит к замедлению роста штамма. Значение OD при ферментации в течение 48 часов составляло 34, что составляло лишь половину от значения OD штамма дикого типа, культивируемого в тех же условиях.

Хотя настоящее изобретение было раскрыто выше с предпочтительными вариантами осуществления, указанное не предназначено для ограничения настоящего изобретения. Различные изменения и модификации могут быть сделаны специалистами в данной области техники, не выходя за рамки сущности и области применения настоящего изобретения. Таким образом, объем охраны настоящего изобретения должен быть определен формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> JIANGNAN UNIVERSITY

BLOOMAGE BIOTECHNOLOGY CORPORATION LIMITED

<120> Рекомбинантная Corynebacterium glutamicum для эффективного синтеза

высокоочищенной гиалуроновой кислоты и ее олигосахаридов

<160> 32

<170> PatentIn версия 3.3

<210> 1

<211> 387

<212> Белок

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

Met Ile Leu Arg Asn Arg Ser Arg Cys Arg Ser Ser Arg Glu Asn Val

1 5 10 15

Ile Leu Phe Gly Ala Thr Thr Asp Met Ser Asn Ile Phe Tyr Glu Gly

20 25 30

Ile Leu Gln Asn Leu Ile Gln Asp Gly Trp Asp Val His Leu Val Ser

35 40 45

Asn Pro Gly Pro Val Gly Lys Lys Leu Leu Asn Gly Lys Ala His Thr

50 55 60

Ile Glu Met Ser Arg Glu Ile Ser Ile Gly Thr Asp Val Lys Ser Leu

65 70 75 80

Phe Asn Trp Val Leu Leu Leu Arg Lys Ile Arg Pro Arg Val Leu Ile

85 90 95

Val Gly Thr Pro Lys Ala Ser Leu Leu Gly Val Val Ala Ala Arg Ile

100 105 110

Ala Arg Val Pro Arg Ile Val Tyr Val Ala His Gly Leu Arg Ser Glu

115 120 125

Thr Val Leu Gly Leu Lys Lys Lys Ile Leu Val Phe Leu Glu Tyr Leu

130 135 140

Thr Gln Leu Phe Ala His Gln Thr Leu Ala Val Ser His Ser Leu Lys

145 150 155 160

Lys Ala Ile Glu Asp Ala His Pro Arg Phe Lys Gly Arg Val Gln Val

165 170 175

Leu Gly Tyr Gly Ser Met Asn Gly Val Glu Leu Asp Arg Phe Arg Val

180 185 190

Pro Ser Leu Glu Glu Lys Leu Ser Ala Arg Asn Ala Leu Asn Leu Pro

195 200 205

Ser Lys Ser Val Ile Val Gly Phe Val Gly Arg Ile Asn Lys Asp Lys

210 215 220

Gly Gly Asp Leu Leu Ala Ala Leu Thr Lys His Glu Ala Phe Thr Arg

225 230 235 240

Leu Arg Leu His Leu Leu Ile Ile Gly Glu Leu Glu Asp Asp Asp Leu

245 250 255

Arg Glu Ala Phe Ile Lys Leu Val Asn Glu Gly Gln Val Thr Ile Thr

260 265 270

Gly Trp Ile Asp Phe Pro Glu Glu Pro Leu Ala Ala Val Asp Val Leu

275 280 285

Leu His Pro Thr Gln Arg Glu Gly Leu Gly Met Ser Leu Leu Glu Ala

290 295 300

Gln Ala Met Gly Val Pro Val Leu Thr Asn Ala Val Thr Gly Thr Val

305 310 315 320

Asp Ala Val Thr Ser Gly Glu Gly Gly Phe Phe Ala Asp Asp Asp Ser

325 330 335

Val Glu Ser Trp Val Ser Lys Ile Asp Leu Leu Val Ser Asp Pro Lys

340 345 350

Leu Arg Asp Arg Met Gly Arg Ala Gly Arg Gln Phe Val Ser Ala Arg

355 360 365

Phe Asn Arg Asp Asp Val Ala Ala Arg Phe Ser His Phe Val Glu Gln

370 375 380

Phe Lys Lys

385

<210> 2

<211> 345

<212> Белок

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

Met Pro Lys Val Ser Val Val Thr Gly Phe Tyr Asn Arg Cys Glu His

1 5 10 15

Leu Glu Arg Thr Ile Glu Ser Ile Leu Asn Gln Thr Tyr Ser Asp Phe

20 25 30

Glu Leu Ile Val Phe Asp Asp Ala Ser Thr Asp Gly Thr Ala Ser Arg

35 40 45

Leu Leu Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Asp Asp Pro Arg Phe Arg Phe Ile

50 55 60

Ile His Glu Glu Asn Lys Gly Phe Val Lys Gly Leu Ser Glu Ala Ile

65 70 75 80

Ser Gly Ala Lys Gly Gln Tyr Ile Ala Val Gln Gly Ser Gly Asp Val

85 90 95

Ser Leu Pro Arg Arg Leu Glu Leu Gln Val Glu Phe Leu Asp Ala Asn

100 105 110

Pro Ser Val Gly Ala Val Gly Gly Ala Ile Tyr Asn Ile Gln Glu Asp

115 120 125

Thr Gly Thr Arg Asn Pro Gln Arg Phe Glu Lys Pro Ile Ala Thr Phe

130 135 140

Asp Asp Leu Leu Thr Ser Asn Pro Phe Thr His Gly Glu Val Met Tyr

145 150 155 160

Arg Leu Asp Leu Tyr Lys Ser Ile Gly Gly Tyr Arg Ser Gly Phe Thr

165 170 175

Phe Ala Gln Asp Arg Asp Leu Trp Leu Arg Met Ala Lys Lys Ala Asp

180 185 190

Leu Gly Ile Ile Pro Asp Phe Leu Tyr His Arg Tyr Thr Leu Leu Asp

195 200 205

Gly Val Ser Phe Val Pro Asp Lys Thr Ile Arg Gln Arg Cys Phe Ser

210 215 220

Glu Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Met Pro Glu Glu Glu Gly Ala Leu

225 230 235 240

Ala Tyr Ser Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Thr Ala Val Val Pro Ile

245 250 255

Ala Asp Arg Ala Val Gln Lys Phe Val Pro Lys Ala Ala Ile Arg Leu

260 265 270

Cys Leu Tyr Gly Ala Pro Glu Thr Gly Leu His Met Ala Arg Asp Tyr

275 280 285

Ile Gln Asn Pro Leu Arg Arg Thr Ile Val Val Val Leu Ile Ser Ile

290 295 300

Tyr Ser Ser Arg Leu Ile Lys Pro Leu Gln Asp Ile Leu Tyr Lys Ser

305 310 315 320

Ile Phe Lys Gly Val Ser Ile Ser Lys Pro Ile Lys Ser Ser Leu Val

325 330 335

Lys Phe Thr Arg Arg Ile Gln Gly Lys

340 345

<210> 3

<211> 419

<212> Белок

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 3

Met Pro Ile Phe Lys Lys Thr Leu Ile Val Leu Ser Phe Ile Phe Leu

1 5 10 15

Ile Ser Ile Leu Ile Tyr Leu Asn Met Tyr Leu Phe Gly Thr Ser Thr

20 25 30

Val Gly Ile Tyr Gly Val Ile Leu Ile Thr Tyr Leu Val Ile Lys Leu

35 40 45

Gly Leu Ser Phe Leu Tyr Glu Pro Phe Lys Gly Asn Pro His Asp Tyr

50 55 60

Lys Val Ala Ala Val Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser Leu

65 70 75 80

Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Leu Ala Gln Thr Tyr Pro Leu Ser Glu

85 90 95

Ile Tyr Ile Val Asp Asp Gly Ser Ser Asn Thr Asp Ala Ile Gln Leu

100 105 110

Ile Glu Glu Tyr Val Asn Arg Glu Val Asp Ile Cys Arg Asn Val Ile

115 120 125

Val His Arg Ser Leu Val Asn Lys Gly Lys Arg His Ala Gln Ala Trp

130 135 140

Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser Asp

145 150 155 160

Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Glu Thr Val Tyr Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Ala Arg Asn Arg

180 185 190

Gln Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn Ala

195 200 205

Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gln Ser Leu Thr Gly Asn Ile Leu Val

210 215 220

Cys Ser Gly Pro Leu Ser Ile Tyr Arg Arg Glu Val Ile Ile Pro Asn

225 230 235 240

Leu Glu Arg Tyr Lys Asn Gln Thr Phe Leu Gly Leu Pro Val Ser Ile

245 250 255

Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Ile Asp Leu Gly Arg Thr

260 265 270

Val Tyr Gln Ser Thr Ala Arg Cys Asp Thr Asp Val Pro Phe Gln Leu

275 280 285

Lys Ser Tyr Leu Lys Gln Gln Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe Arg

290 295 300

Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Leu Ser Asn Pro Ile Val Ala

305 310 315 320

Leu Trp Thr Ile Phe Glu Val Val Met Phe Met Met Leu Ile Val Ala

325 330 335

Ile Gly Asn Leu Leu Phe Asn Gln Ala Ile Gln Leu Asp Leu Ile Lys

340 345 350

Leu Phe Ala Phe Leu Ser Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg Asn

355 360 365

Val His Tyr Met Val Lys His Pro Ala Ser Phe Leu Leu Ser Pro Leu

370 375 380

Tyr Gly Ile Leu His Leu Phe Val Leu Gln Pro Leu Lys Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Leu Cys Thr Ile Lys Asn Thr Glu Trp Gly Thr Arg Lys Lys Val Thr

405 410 415

Ile Phe Lys

<210> 4

<211> 545

<212> Белок

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 4

Met Thr Leu Ser Pro Leu Ala Gly Lys Pro Ala Pro Ala Ser Val Leu

1 5 10 15

Val Asp Ile Pro Arg Leu Leu Thr Ala Tyr Tyr Thr Gly Arg Pro Asp

20 25 30

Ala Thr Val Ala Ala Gln Arg Val Ala Phe Gly Thr Ser Gly His Arg

35 40 45

Gly Ser Ser Leu Glu Leu Ser Phe Asn Glu Tyr His Val Leu Ala Ile

50 55 60

Ser Gln Ala Ile Cys Leu Tyr Arg Gln Glu Lys Gly Ile Asp Gly Pro

65 70 75 80

Leu Phe Ile Gly Ala Asp Thr His Ala Leu Ser Ala Pro Ala Thr Ala

85 90 95

Ser Ala Leu Glu Val Leu Ala Ala Asn Gly Val Gln Val Met Leu Ser

100 105 110

Lys Asp Asp Glu Tyr Thr Pro Thr Pro Ala Val Ser His Ala Ile Leu

115 120 125

Cys His Asn Arg Gly Arg Thr Gln Gly Leu Ala Asp Gly Ile Val Ile

130 135 140

Thr Pro Ser His Asn Pro Pro Gln Ser Gly Gly Phe Lys Tyr Asn Pro

145 150 155 160

Pro Asn Gly Gly Pro Ala Asp Ser Asp Val Thr Lys Trp Ile Glu Gly

165 170 175

Lys Ala Asn Glu Leu Leu Ala Ala Asn Leu Ala Gly Val Lys Arg Met

180 185 190

Asp His Ala Gln Ala Leu Gln Ala Pro Thr Thr His Arg His Asp Tyr

195 200 205

Val Ser Asn Tyr Val Ala Asp Leu Glu Asn Val Ile Asp Phe Asp Val

210 215 220

Ile Arg Gly Ala Gly Leu Arg Leu Gly Val Asp Pro Leu Gly Gly Ala

225 230 235 240

Gly Val Arg Tyr Trp Ser Ala Ile Ala Lys His Tyr Gln Leu Asp Leu

245 250 255

Glu Val Val Asn Thr Glu Val Asp Pro Thr Phe Arg Phe Met Thr Val

260 265 270

Asp Trp Asp Gly Gln Ile Arg Met Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Ala Met

275 280 285

Gln Gly Leu Ile Gly Leu Arg Glu Arg Phe Asp Val Ala Phe Ala Cys

290 295 300

Asp Pro Asp His Asp Arg His Gly Ile Val Thr Pro Asp Gly Leu Leu

305 310 315 320

Gln Pro Asn Asn Tyr Leu Ala Val Ala Ile Asp Tyr Leu Phe Arg His

325 330 335

Arg Pro Gln Trp Arg Ser Asp Ala Ala Val Gly Lys Thr Val Val Ser

340 345 350

Ser Gly Leu Ile Asp Arg Val Thr Gln Arg Leu Gly Arg Asp Leu Tyr

355 360 365

Glu Val Pro Val Gly Phe Lys Phe Phe Ala Gln Gly Leu Phe Asp Gly

370 375 380

Ser Leu Gly Phe Gly Gly Glu Glu Ser Ala Gly Ala Ser Phe Leu Arg

385 390 395 400

Arg Asp Gly Ser Val Trp Ala Thr Asp Lys Asp Gly Leu Ile Pro Ala

405 410 415

Leu Leu Ala Ala Glu Met Thr Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Ser Gln

420 425 430

Ala Tyr Ala Asp Leu Thr Glu Ala Leu Gly Lys Pro Phe Ala Thr Arg

435 440 445

Val Glu Ala Lys Ala Asp Ala Arg Gln Lys Ala Leu Leu Ser Lys Leu

450 455 460

Ala Pro Glu Gln Val Lys Ser Thr Glu Leu Ala Gly Glu Pro Ile Val

465 470 475 480

Gln Ile Leu Ser His Ala Pro Gly Asn Gly Gln Ala Ile Gly Gly Leu

485 490 495

Lys Val Met Thr Ala Asn Gly Trp Phe Ala Ala Arg Pro Ser Gly Thr

500 505 510

Glu Asp Ile Tyr Lys Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Ile Asp Glu Ala His

515 520 525

Leu Gln Arg Leu Val Glu Glu Ala Gln Val Leu Val Asp Glu Ala Ile

530 535 540

Ala

545

<210> 5

<211> 279

<212> Белок

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 5

Met Ile Lys Lys Cys Leu Phe Pro Ala Ala Gly Tyr Gly Thr Arg Phe

1 5 10 15

Leu Pro Ala Thr Lys Ala Met Pro Lys Glu Met Leu Pro Val Val Asn

20 25 30

Lys Pro Leu Ile Gln Tyr Gly Val Glu Glu Ala Leu Asp Ala Gly Leu

35 40 45

Asn Glu Ile Ser Ile Val Thr Gly Arg Gly Lys Arg Ala Leu Glu Asp

50 55 60

His Phe Asp Ile Ser Tyr Glu Leu Glu Asn Gln Ile Lys Gly Thr Asp

65 70 75 80

Lys Glu Lys Tyr Leu Val Gly Ile Arg Arg Leu Leu Asn Glu Cys Ser

85 90 95

Phe Ser Tyr Thr Arg Gln Thr Glu Met Lys Gly Leu Gly His Ala Ile

100 105 110

Leu Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Asp Glu Pro Phe Ala Val Val Leu

115 120 125

Ala Asp Asp Leu Cys Val Asn Pro Glu Gly Asp Gly Val Leu Thr Gln

130 135 140

Met Val Lys Leu Tyr Lys Gln Tyr Arg Cys Ser Ile Val Ala Ile Gln

145 150 155 160

Glu Val Asp Pro Gln Glu Thr Asn Lys Tyr Gly Val Ile Ala Gly Glu

165 170 175

Met Ile Arg Asp Asp Ile Phe Arg Val Thr Asn Met Val Glu Lys Pro

180 185 190

Ala Pro Glu Asp Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ile Ile Gly Arg Tyr Ile

195 200 205

Leu Thr Pro Asp Ile Phe Asp Ile Ile Ala Asn Thr Lys Pro Gly Lys

210 215 220

Gly Gly Glu Ile Gln Ile Thr Asp Ala Leu Leu Gln Gln Ala Lys Asp

225 230 235 240

Gly Cys Val Ile Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Lys Arg Phe Asp Cys Gly

245 250 255

Gly Ala Glu Gly Tyr Ile Asp Ala Thr Asn Phe Cys Phe Glu Asn Tyr

260 265 270

Tyr Lys Thr Gly Lys Ala Tyr

275

<210> 6

<211> 442

<212> Белок

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 6

Met Lys Val Thr Val Phe Gly Thr Gly Tyr Val Gly Leu Thr Gln Ala

1 5 10 15

Val Cys Leu Ala Gln Val Gly His Ser Val Leu Cys Met Asp Val Asp

20 25 30

Ala Asp Arg Val Ala Ser Leu Ser Glu Gly His Cys Pro Ile Phe Glu

35 40 45

Pro Gly Leu Ala Pro Leu Leu Glu Lys Asn Leu Ala Cys Gly Arg Leu

50 55 60

Arg Phe Thr Thr Asp Ala Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Ala Arg Leu Gln

65 70 75 80

Phe Ile Ala Val Gly Thr Pro Pro Gln Ala Asp Gly Ser Ala Asp Leu

85 90 95

Lys His Val Phe Ala Val Val Asp Ser Ile Leu Glu His Ala Asp Gly

100 105 110

Pro Lys Val Ile Val Asn Lys Ser Thr Val Pro Val Gly Thr Val His

115 120 125

Arg Ile Lys Ala Arg Ile Ala Gln Ala Val Ala Asp Thr Ser Arg Phe

130 135 140

Gln Val Ile Ser Asn Pro Glu Phe Leu Lys Glu Gly Ser Ala Val Asp

145 150 155 160

Asp Cys Met Arg Pro Gln Arg Ile Ile Ile Gly Gly Ala Glu Ala Ala

165 170 175

Glu Val Glu Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Phe Asn Arg Asn Arg

180 185 190

Glu Lys Phe Met Val Met Asp Ala Arg Ser Ala Glu Leu Thr Lys Tyr

195 200 205

Ala Ala Asn Cys Met Leu Ala Thr Lys Ile Ser Phe Ile Asn Glu Ile

210 215 220

Ala Asn Leu Ala Glu His Leu Gly Ala Asp Ile Glu Met Val Arg Arg

225 230 235 240

Gly Ile Gly Ser Asp Pro Arg Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Tyr Ala Gly

245 250 255

Cys Gly Phe Gly Gly Ser Cys Phe Pro Lys Asp Leu Gln Ala Leu Arg

260 265 270

His Ser Ala Glu Ala Glu Gly Phe Glu Thr Gln Leu Leu Arg Ala Val

275 280 285

Glu Ser Val Asn Glu Gln Gln Lys Gly Arg Leu Phe Ser Lys Ile Gln

290 295 300

Arg His Tyr Pro Gly Gly Leu Arg Gly Lys Val Phe Ala Leu Trp Gly

305 310 315 320

Leu Ser Phe Lys Pro Asn Thr Asn Asp Ile Arg Glu Ala Ser Ser Arg

325 330 335

Val Leu Leu Glu Ala Leu Trp Ala Ala Gly Ala Arg Val Gln Ala His

340 345 350

Asp Pro Gln Ala Met Glu Glu Ile Arg Arg His Tyr Gly Pro Arg Ala

355 360 365

Asp Leu Gln Leu Val Pro Cys Lys Asp Asp Ala Leu Arg Gly Ala Asp

370 375 380

Ala Leu Val Ile Val Thr Glu Trp Gln Asp Tyr Arg Val Leu Asn Leu

385 390 395 400

Asp Glu Val Pro Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Val Phe Asp Gly Arg

405 410 415

Asn Leu Tyr Glu Pro Glu His Met Ala Ser Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr

420 425 430

Gly Ile Gly Arg Gly Lys Ile Ala Pro Ala

435 440

<210> 7

<211> 611

<212> Белок

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 7

Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Val Ala Glu Arg Asn Ile Thr Ala Ile

1 5 10 15

Leu Ile Glu Gly Leu Lys Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Leu Ala Val Leu Thr Gln Asn Gly Glu Leu Gln Arg Arg Arg Arg

35 40 45

Ile Gly Lys Val Ser Glu Leu Glu Val Ala Val Ala Asp Asp Pro Leu

50 55 60

Ala Gly Gln Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Ala

65 70 75 80

Pro Thr Glu Gly Asn Ala His Pro His Phe Ser Gly Asn Asp Val Ala

85 90 95

Val Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Glu Leu Arg Glu Glu

100 105 110

Leu Lys Gly Leu Gly Tyr Val Phe Thr Ser Gln Thr Asp Thr Glu Val

115 120 125

Ile Val His Leu Ile His His Thr Leu Lys Ser Ile Pro Asp Leu Thr

130 135 140

Asp Ala Leu Lys Ala Ala Val Lys Arg Leu His Gly Ala Tyr Gly Leu

145 150 155 160

Ala Leu Ile Ser Ala Lys Gln Pro Asp Arg Leu Val Ala Ala Arg Ser

165 170 175

Gly Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Leu Gly Glu Asn Phe Leu Ala

180 185 190

Ser Asp Gln Leu Ala Leu Arg Gln Val Thr Asp Arg Phe Met Tyr Leu

195 200 205

Glu Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Arg Arg Asp Gln Val Ser Ile Trp

210 215 220

Asp Gln Gln Gly Asn Lys Val Gln Arg Glu Thr Val Gln Tyr His Glu

225 230 235 240

Gly Ala Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Tyr Arg His Phe Met Leu Lys

245 250 255

Glu Ile His Glu Gln Pro Ser Val Val Gln Arg Thr Leu Glu Gly Arg

260 265 270

Leu Gly Lys Asp Asn Val Leu Val Gln Ala Phe Gly Pro Gln Ala Ala

275 280 285

Asp Leu Phe Ala Lys Val Arg Asn Val Gln Ile Val Ala Cys Gly Thr

290 295 300

Ser Tyr His Ala Gly Met Val Ala Arg Tyr Trp Leu Glu Ser Leu Ala

305 310 315 320

Gly Ile Pro Cys Gln Val Glu Val Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys

325 330 335

Val Val Val Gln Pro Asp Thr Leu Phe Val Ser Ile Ser Gln Ser Gly

340 345 350

Glu Thr Ala Asp Thr Leu Ala Ala Leu Arg Asn Ala Lys Glu Leu Gly

355 360 365

Phe Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Gly Ile Ser Ser Leu Val

370 375 380

Arg Glu Ser Asp Leu Thr Leu Leu Thr Leu Ala Gly Pro Glu Ile Gly

385 390 395 400

Val Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Val Ser Leu Met Leu

405 410 415

Leu Thr Leu Ala Leu Gly Gln Val Arg Gly Thr Leu Glu Ala Gly Val

420 425 430

Glu Ala Glu Leu Val Glu Glu Leu Arg Arg Leu Pro Thr Arg Leu Gly

435 440 445

Glu Ala Leu Ala Met Asp Ala Thr Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Phe

450 455 460

Ala Asp Lys His His Thr Leu Phe Leu Gly Arg Gly Ala Gln Tyr Pro

465 470 475 480

Val Ala Met Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His

485 490 495

Ala Glu Ala Tyr Pro Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu

500 505 510

Val Asp Asn Asp Met Pro Val Val Thr Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu

515 520 525

Leu Glu Lys Leu Lys Ser Asn Leu Gln Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly

530 535 540

Glu Leu Val Val Phe Ala Asp Glu His Ala Gly Met Thr Asn Gly Glu

545 550 555 560

Gly Thr His Val Ile Lys Val Pro His Ile Ala Asp Ala Leu Ala Pro

565 570 575

Ile Leu Tyr Thr Ile Pro Leu Gln Leu Leu Ser Tyr Tyr Val Ala Val

580 585 590

Leu Lys Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val

595 600 605

Thr Val Glu

610

<210> 8

<211> 446

<212> Белок

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 8

Met Ser Arg Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg Val Gly

1 5 10 15

Glu Tyr Pro Ile Thr Pro Asp Phe Met Leu Lys Leu Gly Trp Ala Ala

20 25 30

Gly Met Ala Phe Arg Lys Gln Gly His Cys Arg Val Leu Val Gly Lys

35 40 45

Asp Thr Arg Ile Ser Gly Tyr Met Phe Glu Ser Ala Leu Glu Ala Gly

50 55 60

Leu Ser Ala Ala Gly Ala Asp Val Met Leu Leu Gly Pro Met Pro Thr

65 70 75 80

Pro Ala Ile Ala Tyr Leu Thr Arg Thr Phe His Ala Glu Ala Gly Ile

85 90 95

Val Ile Ser Ala Ser His Asn Pro His Asp Asp Asn Gly Ile Lys Phe

100 105 110

Phe Ser Gly Gln Gly Thr Lys Leu Pro Asp Glu Val Glu Leu Met Ile

115 120 125

Glu Glu Leu Leu Asp Gln Pro Met Thr Val Val Glu Ser Gly Lys Leu

130 135 140

Gly Lys Val Ser Arg Ile Asn Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Ile Glu Phe

145 150 155 160

Cys Lys Ser Ser Val Pro Ser Ser Thr Ser Phe Glu Gly Leu Lys Leu

165 170 175

Val Val Asp Cys Ala His Gly Ala Thr Tyr Lys Val Ala Pro Ser Val

180 185 190

Phe Arg Glu Leu Gly Ala Asp Val Thr Val Leu His Ala Gln Pro Asp

195 200 205

Gly Leu Asn Ile Asn Glu Gly Cys Gly Ser Thr His Ile Glu Ser Leu

210 215 220

Gln Ala Ala Val Leu Val Gly His Ala Asp Leu Gly Ile Ala Phe Asp

225 230 235 240

Gly Asp Gly Asp Arg Val Leu Met Val Asp His Thr Gly Ala Ile Val

245 250 255

Asp Gly Asp Glu Leu Leu Phe Ile Ile Ala Arg Asp Leu Gln Glu His

260 265 270

Gly Lys Leu Gln Gly Gly Val Val Gly Thr Leu Met Ser Asn Leu Gly

275 280 285

Leu Glu Leu Ala Leu Lys Asp Leu Asp Ile Pro Phe Val Arg Ala Lys

290 295 300

Val Gly Asp Arg Tyr Val Met Ala Glu Leu Leu Glu Arg Glu Trp Leu

305 310 315 320

Val Gly Gly Glu Asn Ser Gly His Val Val Cys Cys Asn His Thr Thr

325 330 335

Thr Gly Asp Ala Ile Ile Ala Ala Leu Gln Val Leu Met Ala Leu Lys

340 345 350

Arg Arg Gly Glu Thr Leu Ala Gln Ala Arg Gln Ala Leu Arg Lys Cys

355 360 365

Pro Gln Val Leu Ile Asn Val Arg Phe Gly Ala Ser Lys Val Asp Pro

370 375 380

Leu Glu His Pro Ala Val Lys Glu Ala Ser Ala Lys Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Leu Ala Gly Arg Gly Arg Val Leu Leu Arg Lys Ser Gly Thr Glu Pro

405 410 415

Leu Val Arg Val Met Val Glu Gly Glu Asp Glu Ser Gln Val Arg Ala

420 425 430

His Ala Glu Ala Leu Ala Lys Leu Val Gly Glu Val Cys Val

435 440 445

<210> 9

<211> 455

<212> Белок

<213> Pseudomonas putida KT2440

<400> 9

Met Ser Leu Asp Ile Val Ile Leu Ala Ala Gly Gln Gly Thr Arg Met

1 5 10 15

Arg Ser Ala Leu Pro Lys Val Leu His Pro Val Ala Gly Asn Ser Met

20 25 30

Leu Gly His Val Ile His Ser Ala Arg Gln Leu Gln Pro Gln Gly Ile

35 40 45

His Val Val Ile Gly His Gly Ala Glu Leu Val Arg Glu Arg Leu Ala

50 55 60

Ala Asp Asp Leu Asn Phe Val Met Gln Asp Lys Gln Leu Gly Thr Gly

65 70 75 80

His Ala Val Ala Gln Ala Leu Pro Ala Leu Thr Ala Asp Thr Val Leu

85 90 95

Val Leu Tyr Gly Asp Val Pro Leu Ile Glu Val Glu Thr Leu Gln Arg

100 105 110

Leu Leu Ala Lys Ala Asn Asp Gln Gln Leu Gly Leu Leu Thr Val Thr

115 120 125

Leu Asp Asp Pro Thr Gly Tyr Gly Arg Ile Val Arg Asp Glu Gln Gly

130 135 140

Lys Val Thr Ala Ile Val Glu His Lys Asp Ala Asn Asp Ala Gln Lys

145 150 155 160

Ala Ile Lys Glu Gly Asn Thr Gly Ile Leu Ala Leu Pro Ala Ala Arg

165 170 175

Leu Ala Asp Trp Met Gly Arg Leu Ser Asn Asn Asn Ala Gln Gly Glu

180 185 190

Tyr Tyr Leu Thr Asp Val Ile Ala Met Ala Val Ala Asp Gly Leu Val

195 200 205

Val Ala Thr Glu Gln Pro His Asp Ala Met Glu Val Gln Gly Ala Asn

210 215 220

Asp Arg Arg Gln Leu Ser Glu Leu Glu Arg His Tyr Gln Leu Arg Glu

225 230 235 240

Gly Arg Arg Leu Met Ala Gln Gly Val Thr Leu Arg Asp Pro Ala Arg

245 250 255

Phe Asp Val Arg Gly Glu Val Ser Val Gly Arg Asp Val Leu Ile Asp

260 265 270

Ile Asn Val Ile Leu Glu Gly Lys Val Val Ile Glu Asp Asp Val Gln

275 280 285

Ile Gly Pro Asn Cys Val Ile Lys Asn Thr Thr Leu Arg Lys Gly Ala

290 295 300

Val Val Lys Ala Asn Ser His Leu Glu Gly Ala Val Met Gly Glu Gly

305 310 315 320

Ser Asp Ala Gly Pro Phe Ala Arg Leu Arg Pro Gly Ser Val Leu Asp

325 330 335

Ala Lys Ala His Val Gly Asn Phe Val Glu Leu Lys Asn Ala His Leu

340 345 350

Gly Glu Gly Ala Lys Ala Gly His Leu Thr Tyr Leu Gly Asp Ala Glu

355 360 365

Ile Gly Ala Arg Thr Asn Ile Gly Ala Gly Thr Ile Thr Cys Asn Tyr

370 375 380

Asp Gly Ala Asn Lys Phe Lys Thr Val Met Gly Glu Asp Val Phe Ile

385 390 395 400

Gly Ser Asn Asn Ser Leu Val Ala Pro Val Glu Ile Lys Ala Gly Ala

405 410 415

Thr Thr Ala Ala Gly Ser Thr Ile Thr Gln Ala Val Glu Ala Gly Asp

420 425 430

Leu Ala Val Ala Arg Ala Arg Gln Arg Asn Ile Ser Gly Trp Lys Arg

435 440 445

Pro Glu Lys Ile Lys Lys Ser

450 455

<210> 10

<211> 146

<212> Белок

<213> Vitreoscilla

<400> 10

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

20 25 30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

85 90 95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

115 120 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

130 135 140

Val Glu

145

<210> 11

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

gcaggtcgac tctagaggat ccaagtttcg aaccatgctt gaac 44

<210> 12

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

gatctgattc ttcgcaccaa taggcgacat accgtttcta actgctcag 49

<210> 13

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

ctgagcagtt agaaacggta tgtcgcctat tggtgcgaag aatcagatc 49

<210> 14

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

ctatgaccat gattacgaat tctggaccct aaactgagca gtga 44

<210> 15

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

gcaggtcgac tctagaggat ccttagaaga actgcttctg aat 43

<210> 16

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

aataggcatg atatacgctc cttcgaacac ggcgacactg aac 43

<210> 17

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

gttaccgacg gtttctttca tattccaagc cggagaattt cc 42

<210> 18

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

ctatgaccat gattacgaaa tgaaagaaac cgtcggtaac 40

<210> 19

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

aaggagcgta tatcatgcct attttcaaga agact 35

<210> 20

<211> 52

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

aataggcatg atatacgctc cttttattta aaaatagtaa ctttttttct ag 52

<210> 21

<211> 64

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 21

gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc aaggagcgta tatcatgacg ctcagtcctt 60

tggc 64

<210> 22

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 22

cttcatgata tacgctcctt tcaggcaatg gcttcatcga c 41

<210> 23

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 23

tcgatgaagc cattgcctga aaggagcgta tatcatgaag gtcacggttt tcggaac 57

<210> 24

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 24

gatcatgata tacgctcctt tcaagctggc gcaatcttgc 40

<210> 25

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 25

gcaagattgc gccagcttga aaggagcgta tatcatgatc aaaaaatgct tgttcccggc 60

ag 62

<210> 26

<211> 52

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 26

ctcatccgcc aaaacagcca agctgaattc tcagtaagcc ttgccagtct tg 52

<210> 27

<211> 73

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 27

caatttcaca caggaaacag accatggaat tcaaggagcg tatatcatgt cactcgatat 60

cgttattctc gcc 73

<210> 28

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 28

cgtcggtacc aaagtatttt ctgctcattc agctcttctt gatcttctcc g 51

<210> 29

<211> 65

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 29

cggagaagat caagaagagc tgaaaggagc gtatatcatg agcagaaaat actttggtac 60

cgacg 65

<210> 30

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 30

gacagcacca acgattccac acattcagac acaaacttcg ccgacc 46

<210> 31

<211> 59

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 31

ctggtcggcg aagtttgtgt ctgaaggagc gtatatcatg tgtggaatcg ttggtgctg 59

<210> 32

<211> 53

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 32

gcaggtcgac tctagaggat ccccgggtac cttactcgac agtcaccgac ttg 53

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена рекомбинантная бактерия Corynebacterium glutamicum для получения гиалуроновой кислоты, содержащая выключенные или нокаутированные гены экзополисахарида cg0420 и/или cg0424, при этом указанная бактерия содержит ген, кодирующий гиалуронат-синтазу, и ген, кодирующий гемоглобин VHb. Также предложены способ конструирования указанной рекомбинантной бактерии, способ получения гиалуроновой кислоты с применением указанной рекомбинантной бактерии. Изобретение обеспечивает продукцию гиалуроновой кислоты с увеличенными выходом и чистотой. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

1. Рекомбинантная бактерия Corynebacterium glutamicum для получения гиалуроновой кислоты, характеризующаяся тем, что гены экзополисахарида cg0420 и/или cg0424 рекомбинантной бактерии Corynebacterium glutamicum выключены или нокаутированы, и при этом указанная рекомбинантная бактерия Corynebacterium glutamicum содержит ген, кодирующий гиалуронат-синтазу, и ген, кодирующий гемоглобин VHb; причем гиалуронат-синтаза представляет собой фермент, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3;

где аминокислотная последовательность генов экзополисахарида cg0420 представляет собой SEQ ID NO: 1; и

где аминокислотная последовательность генов экзополисахарида cg0424 представляет собой SEQ ID NO: 2;

где указанная рекомбинантная бактерия Corynebacterium glutamicum трансформирована вектором, содержащим гены pgm, ugd и galU, и вектором, содержащим гены glmS, glmM и glmU.

2. Рекомбинантная бактерия Corynebacterium glutamicum по п. 1, отличающаяся тем, что она экспрессирует гемоглобин VHb, полученный из Vitreoscilla.

3. Рекомбинантная бактерия Corynebacterium glutamicum по любому из пп. 1, 2, отличающаяся тем, что вектор включает любой из следующих: pXMJ19, pECXK99E, pEC-XT99A, pEKEx1, pEKEx2, pVWEx1, pVWEx2, pZ8-1, pECTAC-K99 и pAPE12.

4. Способ конструирования рекомбинантной бактерии Corynebacterium glutamicum по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что указанный способ включает этапы: (1) нокаутирование генов экзополисахаридов cg0420 и/или cg0424 поэтапно или одновременно путем конструирования нокаут-бокса(ов); и (2) лигирование гена, кодирующего гиалуронат-синтазу, и гена, кодирующего гемоглобин VHb, в вектор, и лигирование генов pgm, ugd, galU в другой вектор, и лигирование генов glmS, glmM, glmU в другой вектор, которые, в свою очередь, трансформируют в клетку Corynebacterium glutamicum.

5. Способ получения гиалуроновой кислоты, характеризующийся тем, что ферментацию осуществляют с применением рекомбинантной бактерии Corynebacterium glutamicum по любому из пп. 1-3; и ферментацию осуществляют при 25-35°C в культуральной среде, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соли, ионы металлов и кислород, в течение 24-72 часов.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что гиалуронат-гидролазу или гиалуронат-лиазу добавляют на ранней стадии ферментации; и количество добавленной гиалуронат-гидролазы или гиалуронат-лиазы составляет 500-50000 ед./мл.

7. Способ по п. 5 или 6, отличающийся тем, что в процессе ферментации добавляют глюкозу.

8. Применение рекомбинантной бактерии Corynebacterium glutamicum по любому из пп. 1-3 для получения гиалуроновой кислоты.