ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к модифицированным F-белкам метапневмовируса (hMPV), стабилизированным в конформации перед слиянием. Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям (вакцинам), содержащим эти белки, для предотвращения и/или лечения субъектов, представляющих собой людей, от инфекций дыхательных путей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Метапневмовирус человека (hMPV) является основной причиной острых инфекций дыхательных путей у детей младшего возраста (0-4 года), пациентов с ослабленным иммунитетом и пожилых людей, которые могут быть летальными для этих категорий пациентов (Schildgen et al. 2011. Clinical Microbiology Reviews 24(4): 734-54). Несмотря на значительные усилия в настоящее время отсутствуют лицензированные вакцины или противовирусные препараты для предотвращения или лечения инфекции hMPV. Среди нескольких изученных стратегий вакцинации наиболее перспективной является субъединичная вакцина, содержащая вирусный белок, в частности, F-белок hMPV (Melero & Mas. 2015. Virus Res. 209: 128-35).

hMPV представляет собой заключенный в оболочку одноцепочечный РНК-вирус из рода Pneumovirus семейства Paramyxoviridae. Геном hMPV состоит из восьми генов, кодирующих девять белков, включая три поверхностных гликопротеина F, G и SH. Защита от hMPV обеспечивается в основном нейтрализующими антителами, направленными против гликопротеина слияния (F), который является высококонсервативным в разных генотипах и обладает сходством с другими парамиксовирусами (см. van den Hoogen et al. 2004. Emerging Infectious Diseases 10(4): 658-66; van den Hoogen et al. 2002. Virology 295(1): 119-32).

Парамиксовирусный F-белок представляет собой интегральный мембранный белок типа I, который однократно пронизывает мембрану и содержит на своем N-конце сигнальный пептид, который направляет эктодомен к внеклеточной мембране. На С-конце гидрофобный останавливающий перенос домен (ТМ-домен) закрепляет белок в мембране, оставляя короткий цитоплазматический хвост (см. Фигуру 1).

Нативный F-белок синтезируется как неактивный предшественник, обозначенный F0, после отщепления сигнального пептида (Yin et al. 2006. Nature 439 (7072): 38-44; Yin et al. 2005. Proc. Nat. Acad. Sci. 102(26): 9288-93; Russell et al. 1994. Virology 199(1): 160-8). Чтобы стать биологически активным, F0 подвергается процессингу протеазой хозяина с образованием двух цепей, называемых F1 и F2, которые остаются ковалентно связанными дисульфидными связями (Schowalter et al. 2006. Journal of Virology 80(22): 10931-41; Biacchesi et al. 2006. Journal of Virology 80(12): 5798-806; Yun et al. 2015. Scientific Reports 5: 15584). Три гетеродимера F1-F2 образуют зрелый F-белок, который встроен в оболочку вириона в метастабильной конформации перед слиянием (Battles et al. 2017. Nat. Commun. 8(1): 1528) и опосредует слияние оболочки вириона и плазматической мембраны клетки хозяина. Во время процесса слияния F-белок претерпевает необратимое повторное укладывание из лабильной конформации перед слиянием в стабильную конформацию после слияния (см. Фигуру 2).

Нейтрализующие антитела, специфично распознающие структуру F-белка hMPV перед слиянием, были обнаружены в человеческих сыворотках (Wen et al. 20012. Nat. Struct. Mol. Biol. 19: 461-463; Ngwuta et al. 2015. Science Translational Medicine 7(309): 309; Rossey et al. 2018. Trends in Microbiology 26(3): 209-19), это указывает на то, что F-белок перед слиянием может быть подходящим кандидатом для вакцины (Melero & Mas. 2015. Virus Res. 209: 128-35). Одним очевидным недостатком конформации F-белка перед слиянием по сравнению с конформацией после слияния является ее нестабильность. В предшествующих попытках получить стабилизированный F-белок перед слиянием применяли тщательный структурный анализ и компьютерное моделирование. В частности, одна группа описала дизайн высокостабильного F-белка RSV перед слиянием, способного обеспечивать защитный ответ у крыс (см. Krarup et al. 2015. Nat. Commun. 6: 8143). Другая группа раскрыла конструкцию стабилизированных форм F-белка hMPV перед слиянием, которые вызывали выработку нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных этими белками (см. WO 2016/103238).

Кристаллические структуры F-белка в конформациях перед слиянием и после слияния были определены для hMPV, RSV и других парамиксовирусов (см., например, Battles et al. 2017. Nat. Commun. 8(1): 1528). Несмотря на общее структурное сходство, было выявлено, что F-белок hMPV перед слиянием обладает уникальными структурными признаками, которые придают существенные функциональные и иммунологические различия F-белкам из hMPV и RSV.

Несмотря на значительный прогресс в понимании механизма действия, структуры и иммуногенных свойств F-белка hMPV в продаже отсутствует вакцина на основе F-белка. Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить новые модифицированные кандидатные F-белки hMPV в конформации перед слиянием для разработки вакцины против инфекции дыхательных путей для применения у человека.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему раскрытию предложены рекомбинантные иммуногенные F-белки метапневмовируса человека (hMPV) и их фрагменты (называемые в данном документе F-белками hMPV), способные вызывать выработку нейтрализующих антител и защищать от инфекции hMPV. Нативная кодирующая последовательность F-белка hMPV была модифицирована с получением стабильной конформации перед слиянием. Такие модификации были разработаны на основе трехмерных (3D) моделей гомологии, включенных как часть настоящего изобретения. Настоящее изобретение дополнительно включает способы получения рекомбинантных иммуногенных белков и способы применения иммуногенных белков для предотвращения и/или лечения инфекции hMPV у человека.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен модифицированный F-белок hMPV или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием, содержащий одноцепочечный полипептид, состоящий из домена F2, гетерологичного пептидного линкера и домена F1, в котором отсутствует пептид слияния (FP), причем указанный линкер расположен между доменами F2 и F1 и содержит один или более остатков цистеина, каждый из которых образует неприродную дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим в домене F1.

Согласно одному варианту реализации одноцепочечный F-белок содержит домен F2 и домены F1, соединенные так, что С-конец F2 находится проксимальнее N-конца F1. Сайт расщепления протеазой между F2 и F1 может быть мутирован для устранения расщепления предшественника белка. Согласно некоторым вариантам реализации домен F1 может представлять собой усеченный домен F1, например, так, что в нем отсутствует пептид слияния (FP), охватывающий аминокислотные остатки в положениях 103-118 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1, соответствующие остаткам с 1 по 16 последовательности нативного домена F1 SEQ ID NO: 3. Таким образом, домен F1 может содержать фрагмент, соответствующий остаткам 119-539 из SEQ ID NO: 1 или остаткам 17-437 из SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам реализации одноцепочечный полипептид может содержать фрагмент домена F1, соответствующий остаткам 119-490 из SEQ ID NO: 1 или остаткам 17-338 из SEQ ID NO: 3, который не содержит якорного трансмембранного (ТМ) домена и цитоплазматического хвоста на его С-конце. Кроме того, домены F1 и F2 могут быть соединены за счет гетерологичного пептидного линкера, содержащего, например, пять остатков, содержащих по меньшей мере один остаток цистеина, предпочтительно линкера, имеющего SEQ ID NO: 4.

Согласно еще одному варианту реализации одноцепочечный F-белок согласно настоящему изобретению имеет стабильную конформацию перед слиянием. С одной стороны, конформацию перед слиянием стабилизируют за счет устранения протеазного расщепления между доменами F1 и F2 и отсутствия свободного N-конца F1. Другой признак, который обеспечивает стабилизацию, представляет собой наличие по меньшей мере одной дополнительной (включая неприродную) дисульфидной связи, которая фиксирует домен HRA внутри полости, образованной в результате тримеризации (см. Фигуру 3). Согласно одному варианту реализации неприродная дисульфидная связь может быть образована между остатком цистеина гетерологичного пептидного линкера, вставленного между F2 и F1, и остатком цистеина, расположенным в домене F1, предпочтительно в его С-концевой области и расположенным внутри указанной полости. Например, неприродная дисульфидная связь может быть образована между остатком цистеина в пептидном линкере и неприродным остатком цистеина, присутствующим в домене F1 в положении 338 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1, соответствующем положению 236 последовательности нативного домена F1 SEQ ID NO: 3. Согласно таким вариантам реализации домен F1, присутствующий в одноцепочечном F-белке (например, усеченный домен F1, в котором отсутствует пептид слияния из остатков 1-16 SEQ ID NO: 3), может содержать мутацию, такую как А236С, в последовательности SEQ ID NO: 3 (соответствующую А338С в SEQ ID NO: 1). Остаток цистеина в пептидном линкере, например, может находиться непосредственно рядом с доменом F2, например, может представлять собой первый остаток на N-конце гетерологичного линкера, и рядом с С-концом домена F2. Например, остаток цистеина в пептидном линкере может присутствовать в рекомбинантном полипептиде в положении, эквивалентном остатку 103 из SEQ ID NO: 1.

Согласно дополнительному варианту реализации одноцепочечный F-белок может содержать одну или более дополнительных модификаций, которые компенсируют измененную геометрию тримера, содержащего одноцепочечный F-белок. Предпочтительно указанная модификация (и) представляет собой замену (ы) в положениях, соответствующих положениям 49, 51, 67, 80, 97, 137, 147, 159, 160, 161, 166, 177, 185, 258, 266, 294, 480 и/или 481 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. В частности, аспарагин в положении 97 может быть заменен глутаматом (N97Q) или аланин в положении 185 может быть заменен пролином (А185Р). Таким образом, рекомбинантный полипептид может содержать домен F2, содержащий одну или более замен в положениях 31, 33, 49, 62 и/или 79 из SEQ ID NO: 2. Рекомбинантный полипептид может содержать домен F1 (например, усеченный домен F1, в котором отсутствуют остатки 1-16 из SEQ ID NO: 3), содержащий одну или более замен в положениях 35, 45, 57, 58, 59, 64, 75, 83, 156, 164, 192, 378 и/или 379 из SEQ ID NO: 3.

Кроме того, некоторые мутации могут компенсировать недостаточное заполнение полости. В частности, заполняющие полость мутации могут быть выбраны из перечня, содержащего аминокислотные замены в положениях 49, 67, 80, 137, 147, 159, 160, 161, 177 и 258 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту реализации заполняющие полость мутации включают замену Т49М, замену I67L, замену I137W, замену A147V, замену A159V, замену T160F, замену А161М и/или замену I177L в SEQ ID NO: 1. Таким образом, в некоторых вариантах реализации рекомбинантный полипептид может содержать домен F2, содержащий замену Т31М или I49L в последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно другим вариантам реализации рекомбинантный полипептид может содержать (например, усеченный) домен F1, содержащий одну или более замен в SEQ ID NO: 3, выбранных из I35W, A45V, A57V, T58F, А59М, I75L и/или F156I.

Согласно другому варианту реализации рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать одну или более замен, приводящих к образованию неприродной водородной связи (ей) или солевого мостика (ов). Например, такие замены включают E80N и S266D в SEQ ID NO: 1. Таким образом, рекомбинантный полипептид может содержать домен F2, содержащий замену E62N в последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно другим вариантам реализации рекомбинантный полипептид может содержать (например, усеченный) домен F1, содержащий замену S164D в SEQ ID NO: 3.

Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать дополнительную (ые) цистеиновую (ые) замену (ы) для создания дополнительной стабилизирующей дисульфидной связи (ей). Например, замены Е51С и K166C могут образовывать неприродную дисульфидную связь между остатком цистеина в положении 51 β-цепи домена F2 и цистеином в положении 166 элемента α4 HRA последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. Эта модификация нарушает возможный солевой мостик между Е51 и K138 из спирали в HRA. Мутация S266D вводит неприродный солевой мостик в K138, чтобы компенсировать потерю присоединения для этой спирали. Кроме того, замена вицинальных остатков I480 и L481 из SEQ ID NO: 1 цистеином позволяет ввести три дисульфидные связи среди трех протомеров с образованием ковалентно связанного тримерного белка. Таким образом, в одном варианте реализации рекомбинантный полипептид может содержать домен F2, содержащий замену Е33С в последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно другим вариантам реализации рекомбинантный полипептид может содержать (например, усеченный) домен F1, содержащий замену (ы) K64C, S164D, I378C и/или L379C в SEQ ID NO: 3.

Согласно другому варианту реализации рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать модификацию (и), полезную (ые) для экспрессии растворимого рекомбинантного белка. Например, замена глицина остатком глутаминовой кислоты может присутствовать в положении 294 (G294E) последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1, что может привести к более высокому выходу экспрессии белка. Таким образом, в одном варианте реализации рекомбинантный полипептид может содержать (например, усеченный) домен F1, содержащий замену G192E в SEQ ID NO: 3.

Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать комбинации двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более аминокислотных замен и/или других модификаций.

Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать вспомогательный домен тримеризации, так называемый foldon-домен, например, связанный с С-концом субъединицы рекомбинантного F-белка, который обеспечивает образование тримера белка. Foldon-домен может происходить из фибритина бактериофага Т4. Рекомбинантный F-белок hMPV согласно настоящему изобретению может быть получен в виде моно- или гетеротримера.

Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный F-белок hMPV может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO: 5-9 или 24-28. Рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать домен F2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. Рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать домен F1, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать усеченный домен F1, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательностей с остатками 17-437 или 17-388 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Рекомбинантные белки hMPV согласно настоящему изобретению являются иммуногенными и могут индуцировать нейтрализующие антитела, распознающие нативный F-белок hMPV. Настоящее раскрытие также включает иммуногенные фрагменты рекомбинантных белков hMPV и иммуногенные белки, имеющие по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью любой из SEQ ID NO: 5-9 или 24-28.

Согласно настоящему раскрытию также предложены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированные F-белки hMPV, векторы, содержащие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, клетки-хозяева для рекомбинантной экспрессии модифицированных F-белков hMPV.

Согласно настоящему раскрытию также предложены иммуногенные композиции или вакцины, содержащие рекомбинантные F-белки hMPV или выделенные молекулы ДНК, кодирующие F-белок hMPV, или векторы согласно настоящему изобретению, дополнительно содержащие фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество, используемые с адъювантом или без него. В частности, согласно настоящему раскрытию предложены иммуногенные композиции или вакцины для стимуляции иммунного ответа у субъекта, в частности, иммунного ответа, который может нейтрализовать вирусы hMPV и защитить от инфекций hMPV. Согласно настоящему раскрытию также предложены иммуногенные композиции или вакцины, содержащие дополнительные антигены, происходящие из hMPV, RSV или PIV3 (вирус парагриппа типа 3). Иммуногенные белки, выделенные молекулы ДНК, векторы и иммуногенные композиции или вакцины, раскрытые в данном документе, подходят для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для профилактического и/или терапевтического лечения вирусных инфекций дыхательных путей и ассоциированных заболеваний, в частности, инфекций и заболеваний, вызванных hMPV.

Способы получения рекомбинантных F-белков hMPV или выделенных молекул ДНК, кодирующих F-белок hMPV, или иммуногенных композиций (вакцин) включены в настоящее раскрытие. Также включены способы получения иммунного ответа у субъекта и способы лечения, ингибирования или предотвращения инфекций hMPV. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен иммуногенный модифицированный F-белок метапневмовируса человека (hMPV) или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием посредством одной или более аминокислотных замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV; причем указанный модифицированный F-белок или его фрагмент содержит остаток глутамина, заменяющий остаток аспарагина в положении, соответствующем положению 97 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1 (N97Q). Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен иммуногенный модифицированный F-белок метапневмовируса человека (hMPV) или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием посредством одной или более аминокислотных замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV; причем указанный модифицированный F-белок или его фрагмент содержит остаток глицина, замененный остатком глутаминовой кислоты в положении, соответствующем положению 294 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1 (G294E). Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен иммуногенный модифицированный F-белок метапневмовируса человека (hMPV) или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием посредством одной или более аминокислотных замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV; причем указанный модифицированный F-белок или его фрагмент содержит одну или более замен в положениях, соответствующих положениям 49, 51, 67, 80, 137, 147, 159, 160, 161, 166, 177, 258, 266, 480 и/или 481 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен иммуногенный модифицированный F-белок метапневмовируса человека (hMPV) или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием посредством двух или более аминокислотных замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV; причем указанный модифицированный F-белок или его фрагмент содержит замены Е51С и K166C относительно последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1, и при этом указанные замененные остатки цистеина образуют ненативную дисульфидную связь.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен иммуногенный модифицированный F-белок метапневмовируса человека (hMPV) или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием посредством одной или более аминокислотных замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV; причем указанный модифицированный F-белок или его фрагмент содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из Т49М, E80N, I137W, A147V, A159V, T160F, А161М, I67L, I177L, F258I, S266D, I480C и/или L481C относительно нативной последовательности F-белка hMPV SEQ ID NO: 1.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен иммуногенный модифицированный F-белок метапневмовируса человека (hMPV) или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием посредством трех или более аминокислотных замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV; причем указанный модифицированный F-белок или его фрагмент содержит по меньшей мере замены Т49М, А161М и I67L или I177L относительно последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен иммуногенный модифицированный F-белок метапневмовируса человека (hMPV) или его фрагмент, стабилизированный в конформации перед слиянием посредством трех или более аминокислотных замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV; причем указанный модифицированный F-белок или его фрагмент содержит одну из следующих комбинаций замен относительно последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1:

N97Q, R102G и G294E;

N97Q, R102G, T160F, I177L и G294E;

N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E80N, F258I и G294E;

N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E51C, K166C, S266D, G294E, I480C и L481C; или

N97Q, R102G, Т49М, А161М, I137W, A159V, A147V, I177L и G294E.

Если не указано иное, все положения аминокислот, упомянутые в настоящем описании, соответствуют положениям аминокислот последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. Соответствующие положения таких мутаций в домене F2, имеющем SEQ ID NO: 2, и домене F1, имеющем SEQ ID NO: 3, могут быть получены непосредственно из них. Домен F2, имеющий SEQ ID NO: 2, соответствует остаткам с 19 по 102 из SEQ ID NO: 1. Домен F1, имеющий SEQ ID NO: 3, соответствует остаткам с 103 по 539 из SEQ ID NO: 1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 показывает схематическую диаграмму нативного F-белка hMPV с указанными доменами и важными мотивами. F0: предшественник белка; F1, F2: домены F1 и F2; SP: сигнальный пептид; FP: пептид слияния; HRA, HRB: домен А и В с гептадным повтором, ТМ: трансмембранный домен; CYT: цитоплазматический хвост; S-S: дисульфидная связь.

Фигура 2 показывает структурные изменения в конформациях перед слиянием и после слияния нативного F-белка hMPV. (А) Ленточная диаграмма тримера F-белка перед слиянием, в котором С-концы HRB тримеризованы с foldon-доменом, a HRA уложен на головной домен. (В) Ленточная диаграмма тримера F-белка после слияния, в котором HRA образует длинный параллельный пучок из трех спиралей, который вместе со смещенными спиралями HRB образует стабильный пучок из шести спиралей.

Фигура 3 показывает трехмерную структуру (ленточную диаграмму) модифицированного F-белка hMPV перед слиянием с указанными мутациями.

Фигура 4 показывает анализ рекомбинантных F-белков hMPV с помощью SE-HPLC. 1 - sF_A1_K-Е294, 2 - sF_A1_K_L7, 3 - L7F_A1_4.2, 4 - L7F_A1_31, 5 - L7F_A1_23, 6 - L7F_A1_33.

Фигура 5 показывает данные ИФА, полученные с использованием антител, специфичных в отношении рекомбинантных F-белков hMPV перед слиянием или после слияния: (А) sF_A1_K-Е294; (В) sF_A1_K_L7; (С) L7F_A1_4.2; (D) L7F_A1_23; (E) L7F_A1_31; (F) L7F_A1_33; (G) L7F_A1_23.2. На всех диаграммах, кроме (G), сплошная линия обозначает сигналы, полученные с использованием различных разведений антитела против конформации перед слиянием МРЕ8 N113S, а пунктирная линия обозначает сигналы, полученные с использованием различных разведений антитела против конформации после слияния MF1. На (G): верхняя линия обозначает сигналы, полученные с использованием антитела против конформации перед слиянием МРЕ8 N113S, а нижняя линия обозначает сигналы, полученные с использованием антитела против конформации после слияния MF1.

Фигура 6 показывает титры сывороточного IgG у мышей, иммунизированных рекомбинантными F-белками в комбинации с различными адъювантами. (А и В) мыши, иммунизированные 2 мкг sF_A1_K_L7; (С и D) мыши, иммунизированные 2 мкг sF_A1_MFur.

Фигура 7 показывает титры кратных разведений (reciprocal dilution) сывороточного IgG у мышей, иммунизированных рекомбинантными F-белками с адъювантом Addavax™. Пунктирная линия обозначает предел детектирования. (А) Титры кратных разведений IgG_2a. (В) Титры кратных разведений IgG1.

Фигура 8 показывает титры кратных разведений сывороточного IgG у мышей, иммунизированных рекомбинантными F-белками с адъювантом IC31^®. Пунктирная линия обозначает предел детектирования. (А) Титры кратных разведений IgG_2a. (В) Титры кратных разведений IgG1.

Фигура 9 показывает титры нейтрализующих антител (ИК₅₀, титры кратных разведений) в сыворотках мышей, которые вырабатывались против белка sF_A1_K_L7 в комбинации с различными адъювантами.

Фигура 10 показывает титры нейтрализующих антител (ИК₅₀, титры кратных разведений) в сыворотках мышей, которые вырабатывались против рекомбинантных F-белков с адъювантом (A) Addavax™ или (В) IC31^®.

Фигура 11 показывает титры нейтрализующих антител (ИК₅₀, титры кратных разведений) в сыворотках мышей, которые вырабатывались против различных доз рекомбинантных F-белков. (А) мыши, иммунизированные 6 мкг F-белка, (В) мыши, иммунизированные 2 мкг F-белка, (С) мыши, иммунизированные 0,6 мкг F-белка, (D) мыши, иммунизированные 0,2 мкг F-белка, и (Е) мыши, иммунизированные 0,06 мкг F-белка.

Фигура 12 показывает нагрузку вирусной РНК в легких мышей, иммунизированных 2 мкг рекомбинантных F-белков с адъювантом Addavax и затем стимулированных hMPV дикого типа (измеренную с помощью количественной ОТ-ПЦР). А и В представляют два независимых эксперимента.

Фигура 13 показывает защиту у мышей после иммунизации рекомбинантными F-белками с адъювантом Addavax™ и последующей стимуляции hMPV дикого типа (анализ колонизации легких). (А) мыши, иммунизированные 6 мкг F-белка, (В) мыши, иммунизированные 2 мкг F-белка, (С) мыши, иммунизированные 0,6 мкг F-белка, (D) мыши, иммунизированные 0,2 мкг F-белка, и (Е) мыши, иммунизированные 0,06 мкг F-белка.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Адъювант

Под «адъювантом» подразумевается любое вещество, которое используется для специфического или неспецифического усиления антиген-специфичного иммунного ответа, возможно, посредством активации антигенпрезентирующих клеток. Примеры адъювантов включают масляную эмульсию (например, полный или неполный адъювант Фрейнда), неполный адъювант Montanide от Seppic, такой как ISA51, адъюванты на основе сквалена эмульсионного типа «масло-в-воде», такие как MF59^® (Novartis AG) (Ott G. et al. 1995. Pharm Biotechnol 6: 277-96) или AddaVax™ (InvivoGen), монофосфориллипид A (MPL) (Cluff CW. 2010. Adv Exp Med Biol 667:111-23), адъювант на основе соли алюминия (квасцы) (как описано в WO 2013/083726), поликатионный полимер, в частности, поликатионный пептид, в частности, полиаргинин, или пептид, содержащий по меньшей мере два мотива LysLeuLys, в частности, KLKLLLLLKLK, иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид (ODN), содержащий неметилированные динуклеотиды цитозин-гуанин (CpG), например, CpG 1018 (Dynavax), в определенном окружении оснований (например, как описано в WO 96/02555), или ODN на основе инозина и цитидина (например, как описано в WO 01/93903), или дезоксинуклеиновую кислоту, содержащую остатки дезоксиинозина и/или дезоксиуридина (как описано в WO 01/93905 и WO 02/095027), в частности, адъювант на основе олиго(dIdC)₁₃ IC31^® (Valneva SE) (как описано в WO 04/084938 и Olafsdottir et al. 2009. Scand J Immunol. 69(3): 194-202), нейроактивное соединение, в частности, гормон роста человека (описанный в WO 01/24822), хемокин (например, дефензины 1 или 2, RANTES, MIP1-α, MIP-2, интерлейкин-8 или цитокин (например, интерлейкин-1β, -2, -6, -10 или -12; интерферон-γ; фактор некроза опухоли-α; или гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор), варианты мурамилдипептида (MDP), нетоксичные варианты бактериальных токсинов, QS-21 (Antigenics Inc.), Quill А, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамил-L-аланин-2-[1,2-дипальмитоил-s-глицеро-3-(гидроксифосфорилокси)]этиламид (МТР-РЕ) и другие, как описано в Sarkar et al. 2019. Expert Rev Vaccine: 18(5): 505-521, а также композиции, например, адъювантные системы, такие как AF03, AS01, AS03 и AS04 (Giudice et al. 2018. Seminars in Immunology 39: 14-21). Адъюванты, которые передают иммунологические сигналы за счет рецепторов TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9, стимулируют иммунитет со смещением к Th1, в то время как передача сигналов за счет TLR2/TLR1, TLR2/TLR6 и TLR5 стимулирует иммунитет со смещением к Th2. Например, такие адъюванты как CpG ODN, поли(IC) и MPL преимущественно индуцируют Th1-ответы, квасцы являются сильным индуктором Th2-ответа, в то время как MF59^®, Addavax™ и IC31^® могут индуцировать смешанные Th1- и Th2-ответы. Адъювант может быть введен с антигеном или может быть введен отдельно, либо тем же путем, что и антиген, либо иным путем, чем антиген. Отдельная молекула адъюванта может обладать как адъювантными, так и антигенными свойствами.

Аминокислотные замены

Аминокислотная замена относится к замене одной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой или без аминокислоты (т.е. делеция). В данном документе консервативные замены представляют собой замены, которые не изменяют основную структуру и функцию белка, например, способность белка индуцировать иммунный ответ при введении субъекту.

Следующие шесть групп считаются консервативными заменами друг друга:

1) аланин (А), серин (S), треонин (Т);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (N), глутамин (G);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) лейцин (L), изолейцин (I), метионин (М), валин (V); и

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Неконсервативные замены представляют собой замены, которые снижают активность функции модифицированного белка hMPV, например, способность индуцировать иммунный ответ при введении субъекту.

Антитело

Антитело представляет собой полипептид или белок, который специфично связывает и распознает антиген, такой как F-белок hMPV или антигенный фрагмент F-белка MPV. Термин «антитело» используется в данном документе в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь перечисленными, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антитела, при условии, что они проявляют целевую антигенсвязывающую активность. Неограничивающие примеры антител включают, например, интактные иммуноглобулины и их варианты и фрагменты, известные в данной области техники, которые сохраняют аффинность связывания с антигеном. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются перечисленными, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антител включают антигенсвязывающие фрагменты, полученные либо путем модификации целых антител, либо синтезированные de novo с использованием методологий рекомбинантной ДНК (см., например, Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2^nd Ed., Springer Press, 2010).

В настоящем изобретении использовали следующие антитела: антитело МРЕ8 представляет собой моноклональное антитело, которое специфично связывается с эпитопом, который присутствует на поверхности F-белка hMPV в конформации перед слиянием, но не в конформации после слияния (см. Corti et al. 2013. Nature, 501:439-443). Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела МРЕ8 депонированы в GenBank под номерами доступа AGU13651.1 и AGU13652.1, соответственно. Антитело MF1 распознает домен 6НВ F-белка hMPV после слияния, как описано в Rodriguez, 2015 (J Virol Methods 224: 1-8). Антитело DS7, описанное в Williams et al., 2007 (J Virology 81(15): 8315-24), связывается с конформациями F-белка hMPV как перед слиянием, так и после слияния.

Заполняющая полость мутация (или замена)

Заполняющая полость мутация представляет собой аминокислотную замену, которая заполняет полость внутри белкового ядра F-белка hMPV. Полости по существу представляют собой пустоты внутри уложенного белка, в которых не присутствуют аминокислоты или боковые цепи аминокислот. Согласно нескольким вариантам реализации аминокислотную замену, заполняющую полость, вводят для заполнения полости в ядре эктодомена F-белка hMPV, присутствующей в конформации перед слиянием.

Foldon-домен

Foldon-домен представляет собой аминокислотную последовательность, которая естественным образом образует тримерную структуру и также может называться вспомогательным доменом тримеризации. В некоторых примерах foldon-домен может быть включен в аминокислотную последовательность раскрытого рекомбинантного белка так, что антиген будет образовывать тример. В одном примере foldon-домен представляет собой foldon-домен, происходящий из бактериофага Т4, включающий аминокислотную последовательность, указанную как, например, GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 10). Foldon-домен может быть отщеплен, например, от очищенного белка, например, путем включения сайта расщепления тромбином, смежного с foldon-доменом.

Сайт гликозилирования

Сайт гликозилирования представляет собой аминокислотную последовательность на поверхности полипептида, такого как белок, который обеспечивает присоединение гликана. Сайт N-связанного гликозилирования представляет собой триплетную последовательность NX(S/T), в которой N представляет собой аспарагин, X представляет собой любые остатки, кроме пролина, и (S/T) представляет собой остаток серина или треонина. Гликан представляет собой полисахарид или олигосахарид. Гликан также может использоваться для обозначения углеводной части гликоконъюгата, такого как гликопротеин, гликолипид или протеогликан.

Гетерологичный

Термин «гетерологичный» означает происходящий из другого генетического источника. Аминокислотная последовательность, которая является гетерологичной для белка или вируса, происходит из источника, отличного от белка или вируса, в котором она присутствует или экспрессируется. В одном конкретном неограничивающем примере гетерологичный пептидный линкер, присутствующий в рекомбинантном полипептиде между двумя доменами, относится к пептидной последовательности, которая в природе не присутствует в полипептиде дикого типа между этими двумя доменами, например, пептидный линкер представляет собой искусственную последовательность, соединяющую два домена в рекомбинантном полипептиде.

Гомологичный

Гомологичные белки имеют сходную структуру и функцию, например, белки из двух или более видов или вирусных штаммов, которые имеют сходную структуру и функцию у двух или более видов или вирусных штаммов. Гомологичные белки обладают сходными характеристиками укладывания белков и могут считаться структурными гомологами. Гомологичные белки, как правило, обладают высокой степенью консервативности последовательности, такой как по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% консервативность последовательности, и высокой степенью идентичности последовательности, такой как по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности.

F-белок hMPV

F (слияние) белок hMPV представляет собой гликопротеин оболочки, который способствует слиянию вирусной и клеточной мембран. В природе F-белок hMPV синтезируется как единый полипептидный предшественник длиной приблизительно 540 аминокислот, который включает N-концевой сигнальный пептид (приблизительно первые 18 остатков), который направляет локализацию в эндоплазматический ретикулум, в котором отщепляется сигнальный пептид. Оставшийся полипептид, обозначенный F0, составляет мономер F-белка (протомер), который подвергается процессингу в сайте расщепления протеазой между положениями 102 и 103 в последовательности нативного F-белка SEQ ID NO: 1, образуя два связанных дисульфидной связью фрагмента, F1 и F2. Фрагмент F2 происходит из N-концевой части предшественника F и включает приблизительно остатки 19-102 из SEQ ID NO: 1. Более крупный из этих фрагментов, F1, включает С-концевую часть предшественника F (приблизительно остатки 103-539 из SEQ ID NO: 1), включая внеклеточную/просветную область (остатки 103-490), трансмембранный домен (остатки 491-513) и цитоплазматический домен (остатки 514-539) на С-конце. Внеклеточная часть F-белка hMPV представляет собой эктодомен F, который включает домен F2 (приблизительно положения 19-102 F-белка hMPV) и эктодомен F1 (приблизительно положения 103-490 F-белка hMPV). Три протомера F2-F1 олигомеризуются в тример зрелого белка F, который принимает метастабильную предшествующую слиянию конформацию, которая претерпевает конформационное изменение в конформацию после слияния, запускаемое при контакте с мембраной клетки-мишени. Это конформационное изменение экспонирует гидрофобную последовательность, известную как пептид слияния (FP), расположенную на N-конце домена F1, которая ассоциируется с мембраной клетки хозяина и стимулирует слияние мембраны вируса, или инфицированной клетки, с мембраной клетки-мишени. Три эктодомена F hMPV могут образовывать белковый комплекс из трех протомеров F hMPV. Настоящее изобретение относится к модифицированному F-белку hMPV или его фрагменту, т.е. рекомбинантному полипептиду, содержащему одну или более неприродных аминокислотных мутаций относительно последовательности дикого типа, нативного или встречающегося в природе F-белка hMPV, которые стабилизируют конформацию перед слиянием.

Полипептид F0 hMPV

Полипептид F0 является предшественником F-белка hMPV, оставшимся после отщепления сигнального пептида, который состоит из домена F2 и домена F1, включая внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитозольный хвост F1. Нативный полипептид F0 подвергается процессингу в сайте расщепления протеазой, разделяющем F1 и F2 (приблизительно между положениями 102 и 103 из SEQ ID NO: 1), с образованием полипептидных фрагментов (доменов) F1 и F2.

Домен F1 hMPV

Домен F1 hMPV является частью аминокислотной последовательности F-белка hMPV. В данном документе «домен Fl» относится как к нативным последовательностям F1, так и к последовательностям F1, включающим модификации (например, аминокислотные замены, вставки или делеции). Нативный домен F1 (SEQ ID NO: 3) включает приблизительно остатки 103-539 нативного F-белка hMPV и включает (от N- к С-концу) внеклеточную/просветную область (остатки 103-490 из SEQ ID NO: 1), трансмембранный домен (остатки 491-513 из SEQ ID NO: 1) и цитозольный домен (остатки 514-539 из SEQ ID NO: 1) на С-конце. Несколько вариантов реализации включают домен F1, модифицированный из нативной последовательности F1, например, домен F1, в котором отсутствует пептид слияния (например, остатки 103-118 из SEQ ID NO: 1). Согласно некоторым вариантам реализации домен F1 представляет собой эктодомен F1, т.е. в нем отсутствует трансмембранный и цитозольный домен, например, домен F1 соответствует остаткам с 103 по 490 или с 119 по 490 из SEQ ID NO: 1. Согласно дополнительным вариантам реализации домен F1 включает одну или более аминокислотных замен, которые стабилизируют рекомбинантный одноцепочечный F-белок (содержащий домен F1) в конформации перед слиянием.

Домен F2 hMPV

Домен F2 hMPV является частью аминокислотной последовательности F-белка hMPV. В данном документе «домен F2» относится как к нативным полипептидам F2, так и к полипептидам F2, включающим модификации (например, аминокислотные замены) относительно нативной последовательности, например, модификации, сконструированные для стабилизации рекомбинантного F-белка (включая модифицированный полипептид F2) в конформации перед слиянием F-белка hMPV. Нативный домен F2 (SEQ ID NO: 2) включает приблизительно остатки 19-102 из SEQ ID NO: 1. В нативном зрелом F-белке hMPV домен F2 связан с доменом F1 двумя дисульфидными связями.

Пептид слияния (FP) hMPV

Пептид слияния hMPV является частью аминокислотной последовательности F-белка hMPV. Пептид слияния может представлять собой остатки 103-118 из SEQ ID NO: 1, то есть N-концевые остатки с 1 по 16 домена F1 из SEQ ID NO: 3.

Конформация перед слиянием F-белка hMPV

Конформация перед слиянием F-белка hMPV представляет собой структурную конформацию, принятую F-белком hMPV до запуска события слияния, которое приводит к переходу F-белка hMPV в конформацию после слияния и последующему процессингу в зрелый F-белок hMPV в секреторной системе. Трехмерная структура примерного F-белка hMPV в конформации перед слиянием обсуждается в данном документе и, например, в WO 2016/103238. Конформация перед слиянием F-белка hMPV сходна по общей структуре с конформацией перед слиянием F-белка других парамиксовирусов (таких как RSV), хотя и с некоторыми существенными различиями. Согласно нескольким вариантам реализации рекомбинантный F-белок hMPV, стабилизированный в конформации перед слиянием, специфично связывается с антителом (таким как антитело МРЕ8, см. WO 2016/103238), специфичным в отношении тримерной формы F-белка hMPV в конформации перед слиянием, но не в конформации после слияния.

Одноцепочечный F-белок hMPV

Одноцепочечный F-белок hMPV согласно настоящему изобретению представляет собой эктодомен рекомбинантного F-белка hMPV (также используется в данном документе как «одноцепочечный полипептид»), который экспрессируется в виде одной полипептидной цепи, включающей (модифицированный) домен Fl hMPV и (модифицированный) домен F2 hMPV. Одноцепочечный F-белок hMPV, как правило, может тримеризоваться с образованием тримерной субъединицы F-белка hMPV, предпочтительно слитой со вспомогательным доменом тримеризации, например, foldon. Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный одноцепочечный полипептид F hMPV не включает сайт расщепления протеазой между доменом F1 и доменом F2 и не расщепляется на отдельные полипептиды домена F1 и домена F2 при продуцировании в клетках. Согласно одному варианту реализации домен F1 и домен F2 связаны с гетерологичный пептидным линкером с получением одноцепочечной конструкции.

Иммунный ответ

Иммунный ответ представляет собой ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Т-клетка или моноцит, на стимул. Согласно одному варианту реализации ответ специфичен в отношении конкретного антигена («антиген-специфичный ответ»). Согласно одному варианту реализации иммунный ответ представляет собой ответ Т-клеток, такой как ответ CD4⁺ или ответ CD8⁺. Согласно другому варианту реализации ответ представляет собой ответ В-клеток и приводит к выработке специфичных антител. «Праймирование иммунного ответа» относится к предварительной обработке субъекта адъювантом для усиления целевого иммунного ответа на введенный позже иммуногенный агент.«Усиление иммунного ответа» относится к совместному введению адъюванта и иммуногенного агента, причем указанный адъювант усиливает целевой иммунный ответ на иммуногенный агент по сравнению с введением иммуногенного агента субъекту в отсутствие адъюванта.

Иммуноген

Иммуноген представляет собой соединение, композицию или вещество, которые могут стимулировать выработку антител или Т-клеточного ответа у животного, включая композиции, которые вводят животному путем инъекции или которые всасываются в его организме. Иммуноген реагирует с продуктами специфического гуморального или клеточного иммунитета, включая продукты, индуцированные гетерологичными антигенами, такими как раскрытые рекомбинантные F-белки hMPV. Иммуноген может включать один или более эпитопов. Согласно некоторым вариантам реализации иммуноген может представлять собой рекомбинантный F-белок hMPV или его иммуногенный фрагмент, белковую наночастицу или вирусоподобную частицу, включающие рекомбинантный F-белок hMPV или его иммуногенный фрагмент, или нуклеиновую кислоту или вектор, кодирующий рекомбинантный F-белок hMPV или его иммуногенный фрагмент, который способен индуцировать иммунный ответ у млекопитающего, такого как млекопитающее, инфицированное или подверженное риску инфекции патогеном. Введение иммуногена субъекту может привести к защитному иммунитету и/или проактивному иммунитету против представляющего интерес патогена.

Иммуногенная композиция

Иммуногенная композиция представляет собой композицию, содержащую иммуноген, который индуцирует измеримый ответ CTL против антигена или индуцирует измеримый ответ В-клеток (например, выработку антител) против антигена, включенного в иммуноген или кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, включенной в иммуноген. В одном примере иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая включает раскрытый рекомбинантный F-белок hMPV или его иммуногенный фрагмент, который индуцирует измеримый ответ CTL против вируса hMPV или индуцирует измеримый ответ В-клеток (например, выработку антител) против F-белка hMPV при введении субъекту. Иммуногенная композиция может включать выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуногенный белок, которые можно использовать для экспрессии иммуногенного белка и, таким образом, для индукции иммунного ответа против этого белка. Таким образом, в другом примере иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую раскрытый рекомбинантный F-белок hMPV или его иммуногенный фрагмент, которая индуцирует измеримый ответ CTL против вируса hMPV или индуцирует измеримый ответ В-клеток (такой как выработка антител) против полипептида F hMPV при введении субъекту. Для применения in vivo иммуногенная композиция, как правило, будет включать иммуногенный полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенный полипептид, в фармацевтически приемлемом носителе, а также может включать другие агенты, такие как адъювант. Способность любого конкретного полипептида, такого как раскрытый рекомбинантный F-белок hMPV или нуклеиновая кислота, кодирующая этот белок, индуцировать ответ CTL или В-клеток может быть легко протестирована с помощью анализов, признанных в данной области техники.

Выделенный

«Выделенный» биологический компонент был по существу отделен или очищен от других биологических компонентов, таких как другие биологические компоненты, в которых указанный компонент присутствует в естественных условиях, таких как другие хромосомные и внехромосомные ДНК, РНК и белки. Белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, которые были «выделены», включают белки, очищенные с помощью стандартных методов очистки. Термин также включает белки или пептиды, полученные путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные белки, пептиды и молекулы нуклеиновой кислоты. Выделенный не требует абсолютной чистоты и может включать белок, пептид или молекулы нуклеиновой кислоты, которые выделены по меньшей мере на 50%, например, выделены по меньшей мере на 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или даже 99,9%. Модифицированные F-белки hMPV, раскрытые в данном документе, которые стабилизированы в конформации перед слиянием, выделены из F-белков hMPV в конформации после слияния, например, выделены по меньшей мере на 80%, выделены по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или даже на 99,9% из F-белков hMPV в конформации после слияния.

Линкер

Линкер представляет собой бифункциональную молекулу, которую можно применять для соединения двух молекул в одну непрерывную молекулу, например, для соединения двух доменов в один полипептид. Предпочтительно линкер представляет собой пептидный линкер. Линкер может быть любой подходящей длины, например, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5 или менее аминокислотных остатков. Линкер может содержать или состоять из, например, остатков аланина, серина, глицина, цистеина и/или валина. Предпочтительно линкер может содержать по меньшей мере один остаток цистеина.

Нативный (или природный) белок, последовательность или дисульфидная связь

Нативный или природный (используется в данном документе взаимозаменяемо) полипептид, последовательность, остаток или дисульфидная связь представляет собой тот(ту), который (ая) не был (а) модифицирован (а), например, посредством селективной мутации, чтобы нацелить антигенность антигена на целевой эпитоп или ввести в белок дисульфидную связь, которая не встречается в нативном белке. Нативные или природные белки, остатки или последовательности также называют белками, остатками или последовательностями дикого типа. Ненативная или неприродная дисульфидная связь представляет собой дисульфидную связь, которая не присутствует в нативном белке, например, дисульфидную связь, которая образуется в белке из-за введения одного или более остатков цистеина в белок с помощью генной инженерии. Аналогичным образом, неприродный остаток цистеина в домене представляет собой остаток цистеина, который не присутствует в этом положении в последовательности дикого типа, нативной или природной последовательности.

Нейтрализующее антитело

Нейтрализующее антитело уменьшает инфекционный титр инфекционного агента за счет связывания со специфическим антигеном на инфекционном агенте. В некоторых примерах инфекционный агент представляет собой вирус. В некоторых примерах антитело, специфичное в отношении F-белка hMPV, нейтрализует инфекционный титр hMPV. Согласно некоторым вариантам реализации нейтрализующее антитело связывается и ингибирует функцию родственных антигенов, таких как антигены, которые имеют по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности антигенной поверхности антигена. В отношении антигена из патогена, такого как вирус, антитело может связываться и ингибировать функцию антигена более чем из одного класса и/или подкласса патогена. Например, в отношении hMPV, антитело может связываться и ингибировать функцию антигена, такого как F-белок hMPV более чем из одной группы. Согласно одному варианту реализации нейтрализующие антитела к hMPV с широким спектром отличаются от других антител к hMPV тем, что они нейтрализуют высокий процент многих типов hMPV в кровотоке.

Фармацевтически приемлемый носитель

Фармацевтически приемлемые носители используются для изготовления иммуногенного F-белка hMPV для клинического введения. В Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995, описаны композиции и составы, подходящие для фармацевтической доставки раскрытых иммуногенов. В целом характер носителя будет зависеть от конкретного применяемого способа введения. Например, парентеральные составы обычно содержат жидкости для инъекций, которые включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или тому подобное, в качестве носителя. Для твердых композиций (например, в форме порошка, пилюли, таблетки или капсулы) обычные нетоксичные твердые носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической категории. В дополнение к биологически нейтральным носителям фармацевтические композиции для введения могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты, рН-забуферивающие агенты и тому подобное, например, ацетат натрия или монолаурат сорбитана. Согласно конкретным вариантам реализации носитель, подходящий для введения субъекту, может быть стерильным и/или суспендированным или может иным образом содержаться в стандартной лекарственной форме, содержащей одну или более отмеренных доз композиции, подходящей для индукции целевого иммунного ответа против MPV. Он также может сопровождаться лекарственными средствами для его применения в лечебных целях. Стандартная лекарственная форма может быть, например, в запечатанном флаконе, который содержит стерильное содержимое, или в шприце для инъекции субъекту, или лиофилизирована для последующей солюбилизации и введения, или в виде твердой дозировки или дозировки с контролируемым высвобождением.

Полипептид

Полипептид представляет собой любую цепь аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования). «Полипептид» применяется к аминокислотным полимерам, включая полимеры встречающихся в природе аминокислот и полимер не встречающихся в природе аминокислот, а также к тем, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой неприродную аминокислоту, например, искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты. «Остаток» относится к аминокислоте или миметику аминокислоты, включенному в полипептид посредством амидной связи или миметика амидной связи. Полипептид имеет амино-концевое (N-концевое) окончание и карбокси-концевое (С-концевое) окончание. «Полипептид» используется взаимозаменяемо с пептидом или белком и используется в данном документе для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Во многих случаях один или более полипептидов могут укладываться в конкретную трехмерную структуру, включающую экспонируемые на поверхности аминокислотные остатки и не экспонируемые на поверхности аминокислотные остатки. В некоторых случаях белок может включать несколько полипептидов, которые укладываются вместе в функциональное звено. Например, зрелый F-белок hMPV на поверхности клетки включает три гетеродимера F2/F1, которые тримеризируются в мультимерный белок. «Экспонируемые на поверхности аминокислотные остатки» представляют собой те аминокислоты, которые имеют некоторую степень экспонирования на поверхности белка, например, так, что они могут контактировать с растворителем, когда белок находится в растворе. Напротив, аминокислоты, не экспонируемые на поверхности, представляют собой те аминокислотные остатки, которые не экспонируются на поверхности белка, так, что они не контактируют с раствором, когда белок находится в растворе. В некоторых примерах аминокислотные остатки, не экспонируемые на поверхности, являются частью ядра белка.

Рекомбинантный полипептид или белок

Рекомбинантный полипептид (или белок) представляет собой полипептид, который имеет не встречающуюся в природе последовательность или последовательность, полученную путем искусственной комбинации двух сегментов последовательности, разделенных в иных случаях. Эта искусственная комбинация может быть достигнута путем химического синтеза или чаще путем искусственного манипулирования выделенными сегментами из аминокислотных остатков, например, с помощью методик генной инженерии. Согласно нескольким вариантам реализации рекомбинантный одноцепочечный полипептид кодируется гетерологичной (например, рекомбинантной) нуклеиновой кислотой, которая была введена в клетку-хозяина, такую как бактериальная или эукариотическая клетка. Нуклеиновая кислота может быть введена, например, в вектор экспрессии, имеющий сигналы, способные экспрессировать белок, кодируемый введенной нуклеиновой кислотой, или нуклеиновая кислота может быть интегрирована в хромосому клетки-хозяина.

Идентичность последовательностей Идентичность последовательностей часто измеряется как процент идентичности: чем выше процент, тем более идентичны две последовательности. Гомологи, ортологи или варианты полипептида будут обладать относительно высокой степенью идентичности последовательностей при выравнивании с использованием стандартных методов.

Методы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны в: Smith & Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981); Needleman & Wunsch (Mol. Biol. 48:443, 1970); Pearson & Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988); Higgins & Sharp (Gene, 73:237-44, 1988); Higgins & Sharp (CABIOS 5:151-3, 1989); Corpet et al. (Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988); Huang et al. (Computer Appls in the Biosciences 8:155-65, 1992); Pearson et al. (Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994) и Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990), в которых представлено подробное рассмотрение методов выравнивания последовательностей и расчетов гомологии. После выравнивания количество совпадений определяется путем подсчета количества положений, в которых идентичный нуклеотидный или аминокислотный остаток присутствует в обеих последовательностях. Процент идентичности последовательностей определяется путем деления количества совпадений либо на длину последовательности, указанной в идентифицированной последовательности, либо на указанную длину (например, 100 последовательных нуклеотидов или аминокислотных остатков из последовательности, указанной в идентифицированной последовательности) с последующим умножением полученного значения на 100. Предпочтительно процент идентичности последовательностей определяется по всей длине последовательности. Например, пептидная последовательность, которая имеет 1166 совпадений при выравнивании с тестовой последовательностью, имеющей 1554 аминокислоты, на 75,0 процентов идентична тестовой последовательности (1166÷1554*100=75,0). Значение процента идентичности последовательностей округляется до ближайшей десятой. Например, 75,11, 75,12, 75,13 и 75,14 округляются до 75,1, в то время как 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 и 75,19 округляются до 75,2. Значение длины всегда будет целым числом.

Основное средство поиска локальных соответствий NCBI (Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)) (Altschul et al. 1990. Mol. Biol. 215:403) доступно из нескольких источников, включая Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, Бетесда, Мэриленд, США), и в Интернете для использования в сочетании с программами анализа последовательностей BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN и TBLASTX. Описание того, как определить идентичность последовательностей с помощью этой программы, доступно на веб-сайте NCBI в Интернете. Алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 также описаны в Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1977). Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (ncbi.nlm.nih.gov). Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию использует длину слова (W) - 11, выравнивания (В) - 50, ожидание (Е) - 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Программа BLASTP (для аминокислотных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (W) - 3, ожидание (Е) - 10 и оценочную матрицу BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919).

Гомологи и варианты полипептида, как правило, характеризуются наличием по меньшей мере примерно 75%, например, по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности, подсчитанной на протяжении по меньшей мере 50, 100, 150, 250, 500 аминокислотных остатков референсной последовательности, по всей длине референсной последовательности или по всей длине выравнивания с референсной аминокислотной последовательностью, представляющей интерес. Белки с еще большим сходством с референсными последовательностями будут демонстрировать повышающийся процент идентичности при оценке этим методом, такой как по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности. Для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, как правило, одна последовательность выступает в качестве референсной последовательности, с которой сравниваются тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестовая и референсная последовательности вводятся в компьютер, при необходимости указываются координаты подпоследовательности, и указываются параметры алгоритма программы сравнения последовательностей. Используются параметры программы по умолчанию.

Одним из примеров полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP использует упрощение метода прогрессивного выравнивания Feng & Doolittle (Mol. Evol. 35: 351-360, 1987). Используемый метод сходен с методом, описанным Higgins & Sharp (CABIOS 5:151-153, 1989). С помощью PILEUP референсная последовательность сравнивается с другими тестовыми последовательностями для определения процентного соотношения идентичности последовательностей с использованием следующих параметров: вес пропуска по умолчанию (3,00), вес длины пропуска по умолчанию (0,10) и взвешенные концевые пропуски. PILEUP можно получить из пакета программного обеспечения для анализа последовательности GCG, например, версии 7.0 (Devereaux et al. 1984. Nuc. Acids Res. 12: 387-395).

В данном документе ссылка на «по меньшей мере 80% идентичности» относится к «по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичности» указанной референсной последовательности, например, по меньшей мере 50, 100, 150, 250, 500 аминокислотным остаткам референсной последовательности или полной длине последовательности. В данном документе ссылка на «по меньшей мере 90% идентичности» относится к «по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичности» указанной референсной последовательности, например, по меньшей мере 50, 100, 150, 250, 500 аминокислотным остаткам референсной последовательности или полной длине последовательности.

Терапевтически эффективное количество

Терапевтически эффективное количество представляет собой количество агента, такого как раскрытый иммуноген или иммуногенная композиция, которое достаточно для предотвращения, лечения (включая профилактику), уменьшения и/или облегчения симптомов и/или основных причин нарушения или заболевания, например, для предотвращения, ингибирования и/или лечения инфекции hMPV. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество достаточно для уменьшения или устранения симптома заболевания, такого как инфекция hMPV. Например, это может быть количество, необходимое для ингибирования или предотвращения репликации вируса или для измеримого изменения внешних симптомов вирусной инфекции. В целом этого количества будет достаточно для измеримого ингибирования репликации вируса или инфекционности. В одном примере целевой ответ заключается в ингибировании, уменьшении или предотвращении инфекции hMPV. Для того чтобы способ был эффективен, инфекция не обязательно должна быть полностью устранена, уменьшена или предотвращена. Например, введение терапевтически эффективного количества агента может уменьшить инфекцию (измеряемую по инфицированию клеток или по количеству или проценту инфицированных субъектов) на желаемую величину, например, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или даже по меньшей мере 100% (устранение или предотвращение детектируемой инфекции hMPV) по сравнению с подходящим контролем.

Понятно, что для получения защитного иммунного ответа против патогена могут потребоваться многократные введения иммуногенной композиции. Таким образом, терапевтически эффективное количество включает дробную дозу, которая в комбинации с предыдущими или последующими введениями способствует достижению защитного иммунного ответа. Например, терапевтически эффективное количество агента можно вводить в одной дозе или в нескольких дозах, например, ежедневно, во время курса лечения (такого как лечение путем праймирования/стимулирования вакциной). Однако терапевтически эффективное количество может зависеть от субъекта, которого лечат, степени тяжести и типа состояния, которое лечат, и способа введения. Стандартная лекарственная форма агента может быть упакована в терапевтическом количестве или в количестве, кратном терапевтическому количеству, например, во флаконе (например, с прокалываемой крышкой) или в шприце, содержащем стерильные компоненты.

Вакцина

Вакцина представляет собой фармацевтическую композицию, которая вызывает профилактический или терапевтический иммунный ответ у субъекта. В некоторых случаях иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ. Как правило, вакцина вызывает антиген-специфичный иммунный ответ на антиген патогена, например, вирусного патогена, или на клеточный компонент, связанный с патологическим состоянием. Вакцина может включать полинуклеотид (такой как нуклеиновая кислота, кодирующая раскрытый антиген), пептид или полипептид (такой как раскрытый антиген), вирус, клетку или один или более клеточных компонентов. В одном конкретном неограничивающем примере вакцина уменьшает тяжесть симптомов, ассоциированных с инфекцией hMPV, и/или снижает вирусную нагрузку по сравнению с контролем. В другом неограничивающем примере вакцина уменьшает инфекцию hMPV по сравнению с контролем.

Моделирование гомологии

В одном аспекте настоящее раскрытие обеспечивает новый модифицированный F-белок hMPV, стабилизированный в конформации перед слиянием. Согласно настоящему раскрытию также предложен способ получения стабилизированных F-белков перед слиянием на основе кристаллических структур и моделирования гомологии. Для анализа структурной основы стабилизирующей модификации (ий) использовали ряд структур доступных белков слияния hMPV и гомологичных белков слияния. Они включали модели кристаллической структуры эктодомена F-белка hMPV перед слиянием (PDB:5WB0) и эктодомена F-белка hMPV после слияния (PDB:5L1X), модели кристаллической структуры эктодомена F-белка RSV перед слиянием (PDB:4DAB) и эктодомена F-белка RSV после слияния (PDB:3RRR). Была смоделирована модель гомологии так называемого вспомогательного домена тримеризации с использованием foldon-домена и на основе структурных данных в PDB:2IBL, 1ОХ3 и 1AVY.

Нативный зрелый F-белок hMPV состоит из двух полипептидов F2 и F1, ковалентно связанных двумя дисульфидными связями. Процесс созревания включает одно расщепление предшественника F0 трипсиноподобной протеазой, что приводит к образованию свободного N-конца домена F1 пептида слияния FP, который взаимодействует с клеточной мембраной-мишенью и запускает конформационные изменения. После расщепления происходит перемещение С-концевой части F1 в гидрофобную область внутренней тримерной полости. Это может повысить стабильность метастабильного состояния перед слиянием до тех пор, пока триггерное событие не инициирует повторную укладку в конформер после слияния (см. Фигуру 2). В конформации перед слиянием HRA-содержащая область изогнута и связана с головным доменом, в то время как в конформации после слияния она является частью длинной выступающей спирали. Переход от конформации перед слиянием к конформации после слияния включает повторную укладку последовательностей гептадного повтора A (HRA) субъединицы F1 в одну длинную α-спираль и вставку пептида слияния (FP), расположенного на N-конце HRA на его конце, в клеточную мембрану. Такое повторное укладывание стимулирует сборку последовательностей HRA и HRB в стабильный пучок из шести спиралей, который управляет слиянием мембран.

Одноцепочечный F-белок

Моделирование одноцепочечного F-белка выполняли, чтобы получить стабилизированную конформацию перед слиянием и одновременно сохранить максимальное структурное сходство с нативным F-белком hMPV (см. Фигуру 3). Предполагалось, что делеция сайта расщепления между F1 и F2 стабилизирует конформер перед слиянием. Также устранение одной стадии расщепления является преимуществом для способа получения рекомбинантного белка. Мотив RQSR, подобный распознаваемому трипсином, охватывает положения с 99 по 102 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1, и расщепление происходит сразу после второго аргинина в положении 102 (R102). Устранение расщепления может быть достигнуто с помощью по меньшей мере одной мутации в сайте расщепления, предпочтительно замены аргинина в положении 102. В частности, R102 может быть заменен глицином или другим подходящим аминокислотным остатком. В частности, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения сайт расщепления трипсином удаляется путем замены аргинина в положении 102 глицином (R102G).

Для достижения сходства трехмерной структуры эктодомена одноцепочечного F с нативным F-белком hMPV перед слиянием была сконструирована петля между доменом F1 и доменом F2. Согласно одному варианту реализации петлю конструируют путем вставки гетерологичного пептидного линкера. Согласно предпочтительным вариантам реализации размер и композиция линкера оптимизированы для стабильности, свойств связывания антител и выхода антигена. Согласно одному варианту реализации длина линкера может составлять от 2 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно от 2 до 5 остатков, более предпочтительно от 3 до 5 остатков, еще более предпочтительно от 4 до 5 остатков, наиболее предпочтительно 5 остатков. Согласно другому варианту реализации линкер может быть вставлен между аминокислотным остатком в положениях с 95 по 102, предпочтительно в положениях 102, наиболее предпочтительно у остатка глицина в положении 102 из SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации линкер может состоять из одного или более остатков цистеина, глицина, аланина, фенилаланина, валина и/или серина. Линкер может содержать один, два или три остатка аланина, один или два остатка валина и один или два остатка глицина. Например, аланин может находиться в положении 1, 2, 3, 4 и/или 5 линкера; глицин может находиться в положении 2, 3 и/или 4 линкера; и валин предпочтительно может находиться в положении 3 и/или 5 линкера. Некоторые неограничивающие примеры линкера вместе с дополнительными модификациями F2 и F1 представлены в Таблице 1.

В предпочтительном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один (например, один) остаток цистеина. Цистеин может находиться в любом положении линкера, предпочтительно в положении 1 или 3, что соответствует положению 103 и 105 из SEQ ID NO: 1. Более предпочтительно цистеин находится в положении 1 линкера (т.е. на N-конце линкера, предпочтительно рядом с доменом F2), что соответствует положению 103 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. Еще более предпочтительно линкер представляет собой CGAGA, CGAGV, CGAAV, AGCGA, CAAAV, CAAFV или CGAGA. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации линкер представляет собой CGAGA (SEQ ID NO: 4).

Таблица 1a. Примеры вариантов одноцепочечного линкера, соединяющего домены F2 и F1. Операция вставка/делеция (indel) вызывает делецию пептида слияния и приводит к суммарному укорачиванию последовательности эктодомена. Цистеины, отмеченные соответствующими номерами, такими как С(1) или С(2), образуют дисульфидные связи между доменами F1 и F2. Цистеины, отмеченные штрихом ('С), расположены на соседнем протомере.

Согласно некоторым вариантам реализации конформация перед слиянием одноцепочечного F-белка может быть ковалентно стабилизирована путем введения по меньшей мере одной неприродной внутри- или межпротомерной дисульфидной связи. Например, неприродная дисульфидная связь может быть введена между остатком цистеина гетерологичного пептидного линкера, расположенного между доменами F2 и F1, и остатком цистеина домена F1. Первый остаток цистеина может находиться в любом положении указанного линкера, например, в положении 1, 2, 3 или 4, предпочтительно в положении 1, которое соответствует положению 103 из SEQ ID NO: 1. В качестве альтернативы, первый остаток цистеина может быть введен в домен F2 в положении 96 или 101, или 102 из SEQ ID NO: 1. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации цистеин в положении 103 образует неприродную дисульфидную связь с цистеином, заменяющим аланин, в положении 338 последовательности нативного F hMPV SEQ ID NO: 1. Эта S-S-связь может стабилизировать конформацию перед слиянием одноцепочечного F-белка, фиксируя петлю между F2 и F1 внутри гидрофобной тримерной полости. Такая фиксация петли имитирует эффект позиционирования интернализованных расщепленных N-концов F1 в нативном белке hMPV. Согласно некоторым вариантам реализации одноцепочечный F-белок hMPV может содержать дополнительную цистеиновую замену (ы), которая может вводить ненативные межпротомерные дисульфидные связи, например, для стабилизации тримера белка путем его ковалентного связывания.

Согласно еще одному варианту реализации в одноцепочечном F-белке hMPV отсутствуют аминокислотные остатки с 1 по 16 на N-конце домена F1, имеющего SEQ ID NO: 3, включающие полную или частичную последовательность пептида слияния FP. Предпочтительно в одноцепочечном F-белке hMPV отсутствуют аминокислотные остатки в положениях 103-118 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. Делеция FP дополнительно стабилизирует конформацию перед слиянием одноцепочечного F-белка hMPV.

Согласно некоторым вариантам реализации одноцепочечный F-белок hMPV может содержать одну или более дополнительных модификаций. С одной стороны, дополнительная модификация может компенсировать измененную геометрию одноцепочечного F-белка hMPV. С другой стороны, дополнительная модификация может дополнительно стабилизировать конформацию перед слиянием. Дополнительные модификации могут включать одну или более аминокислотных замен, вставок и/или делеций. Среди модификаций консервативные замены могут быть, но не обязательно, предпочтительными. Консервативными считаются следующие группы замен:

1) аланин (А), серин (S), треонин (Т);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (N), глутамин (G);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) лейцин (L), изолейцин (I), метионин (М), валин (V); и

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Согласно одному варианту реализации дополнительная модификация, которая стабилизировала одноцепочечный F-белок hMPV, представляет собой замену остатка аспарагина остатком глутамина в положении 97 (N97Q) последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1.

Согласно другому варианту реализации дополнительная модификация эктодомена одноцепочечного F может содержать одну или более замен, заполняющих полость, включая, но не ограничиваясь перечисленными, замены в положениях 49, 67, 137, 159, 147, 160, 161 и/или 177 относительно последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. В частности, заполняющая полость замена может быть выбрана, но не ограничивается перечисленными, из замены Т49М, замены I67L, замены I137W, замены A147V, замены A159V, замены T160F, замены А161М или замены I177L. Кроме того, возможны комбинации двух или более замен, заполняющих полость. Согласно одному конкретному варианту реализации комбинация содержит замены T160F и I177L. Согласно другому конкретному варианту реализации комбинация содержит замены Т49М, I67L и А161М. Согласно еще одному конкретному варианту реализации комбинация содержит замены Т49М, А161М, I137W, A147V, A159V и I177L.

Упрочнение α3 HRA путем заполнения полости. В нативном и расщепленном F-белке N-концевая часть F1 несет HRA-содержащий домен, длинную вытянутую спираль в термодинамически более стабильном F-белке после слияния, но уложенную несколькими отдельными небольшими спиралями, даже несущими бета-шпилечный элемент, в конформации перед слиянием («напряженная пружина»). Дополнительные контакты этого элемента могут способствовать стабилизации белка в конформации перед слиянием. Чтобы заполнить полость под α3 HRA, два небольших остатка были заменены заполняющим пространство алифатическим остатком метионина в положениях Т49М и А161М, чтобы получить комплементарную пару, упаковывающуюся вместе, и усилить алифатическую фиксацию этой спирали, расположенной на поверхности. Battles et al., 2017 сообщили о мутациях в положении 161 для эктодомена F hMPV перед слиянием, что приводит либо к неэкспрессирующимся субъединицам F-белка (A161F), либо к субъединицам, слабо реагирующим с антителом МРЕ8 (A161L) (см. Battles et al. 2017. Nat. Commun. 8(1): 1528).

Ковалентное присоединение α4 HRA с помощью дисульфидной связи. α4 HRA простирается до конца F-белка и располагается на С-конце бета-шпилечного элемента после α3 HRA в структуре перед слиянием. Все эти элементы участвуют в преобразовании в длинный альфа-спиральный элемент в конформации после слияния, что включает движение от головного домена к мембране клетки-хозяина в процессе слияния вируса. В данном случае дисульфидный мостик введен между спиральным элементом α4 HRA (K166С) и длинной бета-цепью, обеспечиваемой частью F2 (Е51С). Это изменение модифицирует два заряженных остатка, которые участвуют в полярной сети, включая контакты с α3 HRA. Дополнительная модификация, S266D, была введена для частичного восстановления нарушения в сети солевых мостиков, вызванного этой мутацией, образующей дисульфидную связь.

Упрочнение α2-α3 HRA путем введения триптофана. α2-α3 HRA образует изогнутую субструктуру на F-белке hMPV перед слиянием (при этом она является частью длинной спирали в конформации после слияния). Упрочнение этого изгиба может препятствовать преобразованию в конформацию после слияния. Для этого изгиба можно наблюдать сходные уложенные субструктуры, в которых 1137 F-белка hMPV представляет собой триптофан в аналогичном положении и обеспечивает более плотно упакованную субструктуру, например, в кристаллической структуре N-концевой части расщепленного ингибитора протеина С, связанного с гепарином (PDB:3DY0, W271 цепи А). На основе моделирования гомологии и молекулярного моделирования были введены две дополнительные мутации A147V и A159V, чтобы обеспечить заполнение избыточного пространства в этой субструктуре, чтобы заставить боковую цепь триптофана принять ориентацию, наблюдаемую в структуре ингибитора протеина С, что позволяет дополнительно стабилизировать амид боковой цепи триптофана с полярным контактом с S149 (аспарагин в ингибиторе протеина С). Кроме того, положения, аналогичные А147 и А159, обеспечивают остатки с боковыми цепями, заполняющими пространство.

Согласно некоторым вариантам реализации одноцепочечный F-белок hMPV может содержать одну или более дополнительных стабилизирующих замен, например, замен, ведущих к образованию неприродной водородной связи (ей), вариантной упаковки ядра или солевого мостика (ов). В частности, модифицированный одноцепочечный F-белок hMPV может содержать замены E80N, F258I и/или G294E. Замена E80N может установить межпротомерную Н-связь с D224' (штрих обозначает соседний протомер) и уменьшить отталкивание с D209. С другой стороны, замена E80N усиливает рекомбинантную экспрессию одноцепочечного F-белка hMPV. Другая модификация, которая помогает увеличить выход рекомбинантного белка, представляет собой замену G294E.

Согласно некоторым вариантам реализации замена вицинальных остатков I480 и L481 остатками цистеина позволяет ввести три дисульфидные связи среди трех протомеров в форме ковалентного кольца. Предполагается, что ковалентно связанный тример более стабилен, чем foldon-тримеризованная частица. Для образования функционального кольца необходимо, чтобы были образованы все три дисульфидные связи или, в случае нескольких колец, по меньшей мере одна дисульфидная связь между каждым протомером. Расстояние от кольца до foldon-домена невелико, а положение присоединения foldon оптимизировано для более жесткой геометрии.

Согласно предпочтительному варианту реализации комбинации замен представляют собой:

N97Q, R102G и G294E (L7F A123) (например, присутствующие в SEQ ID NO: 5)

N97Q, R102G, T160F, I177L и G294E (sF_A1_K_L7) (например, присутствующие в SEQ ID NO: 6);

N97Q, R102G, Т49М, I67L, А161М, E80N, F258I и G294E (L7F_A1_31) (например, присутствующие в SEQ ID NO: 7);

N97Q, R102G, Т49М, I67L, А161М, Е51С, К166С, S266D, G294E, I480C и L481C (L7F_A1_33) (например, присутствующие в SEQ ID NO: 8) и

N97Q, R102G, Т49М, А161М, I137W, A159V, A147V I177L и G294E (L7F A14.2) (например, присутствующие в SEQ ID NO: 9).

Тример белка

Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные одноцепочечные F-белки hMPV согласно настоящему изобретению отличаются от нативного F-белка hMPV тем, что они не обладают транс мембранным доменом и цитоплазматическим хвостом. Тем не менее, согласно некоторым вариантам реализации модифицированные одноцепочечные F-белки hMPV могут образовывать моно- или гетеротримеры. Для образования тримера вспомогательный домен тримеризации, так называемый «foldon», может быть вставлен в С-концевой части эктодомена F. Добавление вспомогательного домена тримеризации, который сохраняет растворимое состояние, к С-концу эктодомена субъединицы поддерживает образование стабильного тримерного и растворимого тримера белка. Согласно одному варианту реализации foldon-домен может происходить из фибритина бактериофага Т4 и содержит последовательность SEQ ID NO: 10.

Согласно другому варианту реализации foldon фибритина может быть модифицирован путем вставки одного или более сайтов N-гликозилирования (мотив NxT/S, где «х» представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина), что может помочь скрыть неспецифический эпитоп (ы) hMPV. Ниже приведены некоторые неограничивающие примеры последовательностей модифицированных foldon-доменов:

В качестве альтернативы, foldon-домен может содержать структурные элементы из лейциновой молнии GCN4 (Harbury et al. 1993. Science 262:1401) или мономеры самособирающихся наночастиц, позволяющие осуществлять присоединения вокруг оси С3 (например, ферритина и люмазинсинтазы).

Согласно другому варианту реализации foldon-домен присоединен к С-концу F-белка, заменяя его трансмембранный и цитозольный домены. Остаток глицина на N-конце foldon может быть присоединен к домену F1 напрямую или за счет пептидного линкера различной длины, который может включать по меньшей мере один сайт протеазы. Более длинные линкеры позволяют разъединять движение foldon-домена, но они менее эффективны для поддержания нахождения спиралей области HRB (стебель) в определенном положении. Спирали могут совершать движения с поперечным смещением и изгибом вспомогательных доменов тримеризации под углом вне оси основной оси с3 частицы. Более короткие линкеры обеспечивают более жесткое присоединение foldon-домена с более сильным фиксирующим эффектом на три спирали стеблевого домена.

В частности, foldon-домен может быть присоединен за счет остатка аланина, вставленного после S482 последовательности нативного F-белка hMPV SEQ ID NO: 1. Это позволяет сохранить S482 в качестве С-концевого кэпа спирали и воспроизвести локальную геометрию контактной поверхности foldon. Такая геометрия может быть достигнута путем присоединения foldon за счет короткого линкера, например, короткого линкера, называемого «VSL» или «VSA», состоящего из последовательности ILSA (SEQ ID NO: 34) и CCS A (SEQ ID NO: 35), соответственно. В указанном линкере аланин (А483) находится в аналогичном положении, что и аланин в положении n-2 по отношению к тирозину в кристаллической структуре PDBTAVY (соответствует положению 2 в SEQ ID NO: 10), и демонстрирует сходные контакты с боковой цепью тирозина в структурных моделях. Кроме того, короткий линкер «VSL» или «VSA» можно использовать в комбинации с другими мутациями, например, аминокислотными заменами в непосредственной близости от линкера. Например, комбинация линкера «VSA» с заменами С480 и С481 позволяет ковалентно связать три протомера за счет образования дисульфидного кольца через три протомера. В этой геометрии остатки цистеина дисульфидного кольца удерживаются в пространственной близости, и, следовательно, поддерживается образование полностью замкнутых колец, что увеличивает общую стабильность протомерного тримера. Пример менее жесткого присоединения foldon сохраняет остатки 483-485 из SEQ ID NO: 1 (ILSSAE или CCSSAE с дисульфидным кольцом). Некоторые примеры модифицированных линкеров foldon, образующих более одного цистеинового кольца, показаны ниже:

Другими неограничивающими примерами коротких линкеров являются: GG, SG, GS, GGG, GGA, GGS, SGG, SSG, SGS, SGA, GGA, SSA и SGGS. Такие линкеры можно использовать в комбинациях с сайтами расщепления, введенными, например, путем замены А496. Сайт расщепления предпочтительно представляет собой сайт расщепления тромбином, сайт расщепления TEV (протеаза вируса гравировки табака) или сайт расщепления Ха (фактор Ха), раскрытые в Таблице 2.

Согласно некоторым вариантам реализации для более легкой очистки рекомбинантного белка одноцепочечный полипептид может содержать любые последовательности меток для очистки, известные в предшествующем уровне техники. Примеры полипептидов, которые облегчают очистку, включают, но не ограничиваются перечисленными, His-метку, myc-метку, S-пептидную метку, МВР-метку, GST-метку, FLAG-метку, тиоредоксиновую метку, GFP-метку, ВССР, кальмодулиновую метку, стрептавидиновую метку, HSV-эпитопную метку, V5-эпитопную метку и СВР-метку. Белки согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат His и/или стрептавидиновую метки, имеющие последовательности SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно.

Неограничивающие примеры комбинаций, которые могут применяться, показаны в Таблице 3, которые могут обеспечить образование параллельного пучка из трех спиралей с двумя дисульфидными кольцами. Тримеризация может происходить с участком последовательности, содержащим 480-495 остатков, но может быть облегчена присутствием foldon-домена. Наличие цистеиновых колец обеспечивает образование дисульфидных связей, образующих ковалентную связь между тремя протомерами. После этого функция вспомогательного домена тримеризации становится ненужной, и упаковывающий помощник может быть отщеплен с тем преимуществом, что можно избежать иммуногенных побочных эффектов гетерологичной последовательности (и, например, не-hMPV).

Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный F-белок hMPV может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO: 5-9 или 24-28, например, причем указанный процент идентичности последовательностей определяется по всей длине референсной последовательности. Рекомбинантный одноцепочечный F-белок hMPV может содержать домен F2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. Рекомбинантный одноцепочечный F-белок может содержать домен F1, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, предпочтительно в отношении по меньшей мере остатков 17-437 или 17-388 из SEQ ID NO: 3.

Кодирующие нуклеиновые кислоты и векторы

В настоящей заявке предложены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие рекомбинантные белки hMPV согласно настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота может кодировать, например, полипептид, содержащий, например, а) (модифицированный) домен F1 F-белка hMPV; b) (модифицированный) домен F2 F-белка hMPV; с) гетерологичный пептидный линкер, расположенный между доменами F1 и F2; d) вспомогательный домен тримеризации; и необязательно е) метку для очистки, причем указанные домены F1 и F2 ковалентно связаны по меньшей мере одной неприродной дисульфидной связью, введенной между цистеином в линкере и цистеином в домене F1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки согласно настоящему изобретению, могут содержать последовательности SEQ ID NO 19-23 или состоять из них. Настоящая заявка также включает выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки, имеющие по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO 5-9 или 24-28. Настоящая заявка также включает выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO 19-23, например, причем указанный процент идентичности последовательности определен по всей длине референсной последовательности.

В настоящей заявке также предложены векторы, содержащие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты для экспрессии рекомбинантных белков согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению также предложены системы экспрессии, разработанные для облегчения экспрессии и обеспечения выделенных полипептидов. В настоящей заявке также предложены клетки-хозяева для экспрессии рекомбинантных F-белков hMPV согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой прокариота. Прокариот может представлять собой, например, Е. coli. Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку.

Иммуногенные композиции и составы

Рекомбинантные одноцепочечные F-белки hMPV согласно настоящему изобретению являются иммуногенными и могут индуцировать нейтрализующие антитела, распознающие нативный F-белок hMPV. Настоящее раскрытие также включает иммуногенные фрагменты рекомбинантных белков hMPV и иммуногенные белки, имеющие по меньшей мере 85% идентичности последовательности с белками, имеющими SEQ ID NO 5-9 или 24-28.

Согласно настоящему раскрытию также предложены иммуногенные композиции или вакцины, содержащие рекомбинантные F-белки hMPV или выделенные молекулы ДНК, кодирующие F-белок hMPV, или векторы согласно настоящему изобретению, содержащие приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество, или стабилизаторы, известные в данной области техники (см. в целом Remington, 2005. The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams and Wilkins). Иммуногенная композиция представляет собой любую композицию материала, которая вызывает иммунный ответ у млекопитающего-хозяина при введении иммуногенной композиции путем инъекции или иным путем. Иммунный ответ может быть гуморальным, клеточным или и тем, и другим. Бустерный эффект относится к усилению иммунного ответа на иммуногенную композицию при последующем воздействии той же иммуногенной композиции на млекопитающего-хозяина. Гуморальный ответ приводит к выработке антител млекопитающим-хозяином при воздействии иммуногенной композиции. Иммуногенные композиции или вакцины могут дополнительно содержать адъювант. Адъювант может быть выбран в зависимости от способа введения и может включать адъюванты на основе минерального масла, такие как полный и неполный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Montanide от Seppic, такой как ISA, адъюванты на основе эмульсии типа «масло-в-воде», такие как адъювантная система Риби, адъюванты на основе эмульсии типа «масло-в-воде», такие как MF59^® (Novartis AG) или Addavax™ (InvivoGen) (Ott G. et al. 1995. Pharm Biotechnol 6: 277-96), монофосфориллипид A (MPL) (Chuff CW. 2010. Adv Exp Med Biol 667:111-23), адъювант на основе соли алюминия (квасцы) (например, как описано в WO 2013/083726), адъювантный состав от Syntex, содержащий мурамилд и пептид (MDP), поликатионный полимер, в частности, поликатионный пептид, в частности, полиаргинин или пептид, содержащий по меньшей мере два мотива LysLeuLys, в частности, KLKLLLLLKLK, иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид (ODN), содержащий неметилированные динуклеотиды цитозин-гуанин (CpG), например, CpG 1018 (Dynavax), в определенном окружении оснований (например, как описано в WO 96/02555), или ODN на основе инозина и цитидина (например, как описано в WO 01/93903), или дезоксинуклеиновую кислоту, содержащую остатки дезоксиинозина и/или дезоксиуридина (как описано в WO 01/93905 и WO 02/095027), в частности, олиго(dIdC)₁₃ (как описано в WO 01/93903 и WO 01/93905), IC31^® (Valneva SE), как описано в WO 04/084938 и Olafsdottir et al. 2009 (Scand JImmunol. 69(3): 194-202), нейроактивное соединение, в частности, гормон роста человека (описанный в WO 01/24822) и другие, описанные в Sarkar I. et al. 2019 (Expert Rev Vaccine: 18(5): 505-521), или их комбинации, такие как AF03, AS01, AS03 и AS04, описанные в Giudice GD et al. 2018 (Seminars in Immunology 39: 14-21). Некоторые комбинации соответствуют комбинациям, например, описанным в WO 01/93905, WO 02/32451, WO 01/54720, WO 01/93903, WO 02/13857, WO 02/095027 и WO 03/047602. Согласно одному предпочтительному варианту реализации адъювант представляет собой гидроксид алюминия или соль алюминия, которая индуцирует сильный ответ антител и иммунный ответ, смещенный к Th2. Согласно другому предпочтительному варианту реализации адъювант представляет собой адъювант или композицию адъювантов, которые индуцируют смешанные ответы Th1/Th2, такие как MF59^® или Addavax™, MPL/квасцы и IC31^®.

Согласно настоящему раскрытию также предложены фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантные F-белки hMPV согласно настоящему изобретению, дополнительно содержащие фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители и/или вспомогательные вещества. Фармацевтически приемлемые носители и/или вспомогательные вещества могут включать буферы, стабилизаторы, разбавители, консерванты и солюбилизаторы (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition, 1975).

Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов во вводимых дозировках и концентрациях. Носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы могут дополнительно содержать буферы. Примеры вспомогательных веществ включают, но не ограничиваются перечисленными, углеводы (такие как моносахарид и дисахарид), сахара (такие как сахароза, маннит и сорбит), фосфат, цитрат, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота и метионин), консерванты (такие как фенол, бутанол, бензанол; алкилпарабены, катехол, хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол, хлорид бензалкония, хлорид бензетония и м-крезол), низкомолекулярные полипептиды, белки (такие как сывороточный альбумин или иммуноглобулины), гидрофильные полимеры, аминокислоты, хелатирующие агенты (такие как ЭДТА), солеобразующие противоионы, комплексы металлов (такие как комплексы Zn-белок) и неионные поверхностно-активные вещества (такие как TWEEN™ и полиэтиленгликоль). Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению вызывают иммунный ответ у млекопитающего-хозяина, включая человека. Иммунный ответ может представлять собой либо клеточнозависимый ответ, либо антителозависимый ответ, либо и тот, и другой. Эти иммуногенные композиции могут применяться в качестве вакцин и могут обеспечивать защитный ответ против инфекции hMPV.

Согласно настоящему раскрытию дополнительно предложены иммуногенные композиции или вакцины, содержащие один или более дополнительных антигенов, происходящих по меньшей мере из одного другого инфекционного вируса, в частности, вируса, который вызывает инфекцию дыхательных путей, такого как hMPV, RSV (респираторно-синцитиальный вирус), PIV3 (вирус парагриппа типа 3), вирус гриппа или коронавирус (например, SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS или подобные). Предпочтительно дополнительный антиген представляет собой F-белок RSV, F-белок PIV3, гемагглютинин вируса гриппа или S-белок коронавируса.

Иммуногенные рекомбинантные белки, выделенные молекулы ДНК или РНК, векторы и иммуногенные композиции или вакцины, раскрытые в данном документе, подходят для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для профилактического и/или терапевтического лечения вирусных инфекций дыхательных путей и ассоциированных заболеваний, в частности, инфекций и заболеваний, вызванных hMPV. Способы получения рекомбинантных F-белков hMPV или выделенных молекул нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), кодирующих F-белок hMPV, или иммуногенных композиций (вакцин) включены в настоящее раскрытие. Также включены способы получения иммунного ответа у субъекта и способы лечения, ингибирования или предотвращения инфекций дыхательных путей, в частности, вызванных hMPV. Настоящее изобретение далее будет описано только в виде примеров со ссылкой на следующие неограничивающие варианты реализации.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Дизайн модифицированных F-белков

Структурные модели

Дизайн мутированных F-белков hMPV в стабилизированной конформации перед слиянием выполняли на основе моделей гомологии, полученных из доступных кристаллических структур белков F RSV перед слиянием (PDB:4JHW и 4MMV, а также 4MMU, 4MMS), F PIV-5 перед слиянием (PDB:5GIP), F hMPV перед слиянием (PDB:5WB0) и F hMPV после слияния (PDB:5L1X), представляющих модели различных переходных фаз процесса слияния. Foldon-домен адаптировали из модели PDB:2IBL. Построение модели и структурный анализ выполняли с использованием открытой версии пакета программ редактора структуры PyMol (Schrodinger LLC, https://github.com/schrodinger/pymol-open-source). Модели уточняли с помощью пакета программ для моделирования NAMD (Phillips et al. 2005. J Comput Chem. 26(16): 1781-802) и силового поля charmm36 (McKerell et al. 1998. J Phys Chem В. 102(18):3586-3616) или Gromacs (Berendsen et al. 1995. Сотр. Phys. Comm. 91:43-56; Hess et al. 2008, J. Chem Theory Comput. 4, 435-447; www.gromacs.org)/OPLS-AA (Jorgensen WL, Йельский университет). Кандидатные модели, как правило, уточняли в протоколе, применяемом после релаксации in vacuo при NVT, NPT-моделировании последовательности в общей сложности 13 нс с применением трех циклов симметричного отжига (адаптировано из Anishkin et al. 2010. Proteins. 78(4): 932-949) с последующей свободной выборкой и минимизацией энергии.

ПРИМЕР 2: Получение рекомбинантных F-белков

Штаммы

Нативный F-белок hMPV может быть выбран из любого штамма hMPV и любого серотипа, представленного последовательностями SEQ ID NO 1, 13-18 или их вариантами. Согласно определенным примерным вариантам реализации F-белок hMPV происходит из штамма NL/1/00, серотипа А1, представленного SEQ ID NO: 1, и штамма CAN97-83, серотипа А2, представленного SEQ ID NO: 14.

Векторы экспрессии

Плазмида pVVS 1371, использованная для клонирования, содержит:

- последовательность инсулятора HS4 из локуса куриного β-глобина,

- два промотора CMV,

- два химерных интрона, расположенных в 3'-направлении от промоторов CMV, состоящих из 5 -донорного сайта из первого интрона гена β-глобина человека и точки ветвления и 3'-акцепторных сайтов из интрона гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Последовательности донорного и акцепторного сайтов, а также сайта точки ветвления адаптировали для соответствия консенсусным последовательностям для сплайсинга. Интрон расположен в 5'-направлении от вставки кДНК, чтобы предотвратить использование возможных скрытых 5'-донорных сайтов сплайсинга в последовательности кДНК,

- последовательность сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH А),

- ген неомицин-фосфотрансферазы из Tn5, регулируемый энхансером и областью раннего промотора SV40,

- сигнал полиаденилирования ТК HSV из гена тимидинкиназы вируса герпеса расположен в 3'-направлении от гена неомицин-фосфотрансферазы,

- ген устойчивости к канамицину, регулируемый бактериальным промотором, и

- точку начала репликации pUC.

Кодирующую последовательность F-белка дикого типа выделяли из штамма hMPV NL/1/00, сублинии А1, и оптимизировали по кодонам для экспрессии в клетках СНО. Кодирующие последовательности F-белков дикого типа и модифицированных F-белков клонировали в плазмиду pVVS1371 для временной или стабильной экспрессии белка в клетках СНО.

В общих чертах, кодирующие последовательности клонировали между химерным интроном и сайтом полиаденилирования bGH А вектора pVVS1371 с использованием сайтов рестрикции SalI и PacI. Вектор и синтезированную кодирующую последовательность (синтез был выполнен GeneArt) расщепляли SalI и PacI перед очисткой на агарозном геле. Фрагменты лигировали ДНК-лигазой Т4, и продукт лигирования использовали для трансформации компетентных клеток Max efficiency DH5α. Отобранные клоны тестировали для определения сконструированных мутаций с помощью анализа последовательности.

Экспрессия в клетках СНО

Экспрессия белка основана на временной трансфекции клеток СНО с использованием устройства системы масштабируемой трансфекции MaxCyte^® STX в соответствии с экспериментальными рекомендациями поставщика. В общих чертах, перед электропорацией клетки СНО осаждают, суспендируют в буфере для электропорации MaxCyte^® и смешивают с ДНК соответствующей экспрессионной плазмиды. Смесь клетка-ДНК переносят в блок для обработки кассет и загружают в систему масштабируемой трансфекции MaxCyte^® STX. Клетки подвергают электропорации с использованием протокола «СНО», предварительно загруженного в устройство, немедленно переносят в колбы для культивирования и инкубируют в течение 30-40 минут при 37°С с 8% СО₂. После периода восстановления клетки ресуспендируют при высокой плотности в среде EX-CELL ACF СНО (Sigma Aldrich). Культивирование клеток после электропорации проводят при 37°С с 8% СО₂ и орбитальным встряхиванием.

Кинетика продукции состоит из снижения температуры культивирования до 32°С и ежедневной подачи питательных веществ трансфицированным клеткам, используя среду для периодической подпитки, разработанную для временной экспрессии белка в клетках СНО (СНО CD EfficientFeed™ A (ThermoFischer Scientific) с добавлением дрожжевого экстракта, глюкозы и glutaMax). Примерно через 7-14 дней культивирования проверяют жизнеспособность клеток и собирают кондиционированную среду после очистки от клеток, соответствующую двум циклам центрифугирования на максимальной скорости в течение 10 минут. Очищенный продукт фильтруют через стерильную мембрану с размером пор 0,22 мкм и хранят при -80°С перед очисткой белка.

Детектирование белков с помощью внутриклеточного иммуноокрашивания

На 7 день после трансфекции клетки промывают один раз в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и фиксируют в течение 10 минут в 4% параформальдегиде (ПФА) при комнатной температуре. Фиксированные клетки пермеабилизируют в промывке BD Perm в течение 15 минут при комнатной температуре и инкубируют с первичным антителом, разведенным в промывке BD Perm, в течение 1 часа при 4°С. Наконец, вторичное антитело, связанное с флуоресцентным маркером, добавляют на 1 час при 4°С и хранят в ФСБ при 4°С до анализа методом проточной цитометрии (MacsQuant Analyzer, Miltenyi Biotec). В качестве первичного антитела использовали антитело МРЕ8 N113S (PRO-2015-026-01), специфично распознающее конформацию перед слиянием F-белка hMPV, или антитело DS7 IgG1 (PRO-2016-003), распознающее F-белок hMPV как перед слиянием, так и после слияния. Флуоресцентное FITC-конъюгированное вторичное антитело представляло собой козий Ig против мышиного IgG+IgM (JIR 115-096-068).

Очистка белка

Замороженный супернатант доводят до комнатной температуры и диализуют с использованием диализной мембраны из регенерированной целлюлозы стандартной категории Spectra/Por^® 1-7 CR (НОММ: 3,5 кДа) (Spectrum) против ФСБ. Затем его уравновешивают 50 мМ буфером на основе Na₂HPO₄ при рН 8,0, 300 мМ NaCl, и выполняют очистку белка с использованием аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) с последующей гель-фильтрационной хроматографией.

Для IMAC агарозная смола, содержащая Ni²⁺ (His GraviTrap), упаковывается в хроматографические колонки производителем (GE Healthcare). Смолу промывают двумя объемами деионизированной воды и уравновешивают тремя объемами уравновешивающего и промывочного буфера (20 мМ фосфата натрия, рН 7,4, с 0,5 М хлорида натрия и 20 мМ имидазола), как указано производителем. После загрузки образца колонку промывают 10 мл промывочного буфера. His-меченый белок элюируют из колонки, используя 3-10 объемов колонки элюирующего буфера, как указано производителем (50 мМ фосфата натрия, рН 8,0, с 0,5 М хлорида натрия и 500 мМ имидазола). Затем элюат фильтруют на фильтре с размером пор 0,22 мкм и дважды диализуют в кассетах для диализа Slide-A-lyzer™ против буфера для хранения (50 мМ Na₂HPO₄, 300 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, рН 8,0) перед разделением на аликвоты и хранением при -20°С.

Анализ чистоты, размера и агрегации рекомбинантных белков выполняют с помощью эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC), и электрофорез в ДСН-ПААГ (SDS-PAGE) с SE-HPLC (Shimadzu) проводят на колонке SUPERDEX200 (GE Healthcare). Для электрофореза в ДСН-ПААГ белки разводят в буфере для образцов (0,08 М трис-HCl при рН 8,8, 2% ДСН, 10% глицерина, 0,01% бромфенолового синего), кипятят в течение пяти минут в присутствии бета-меркаптоэтанола (или DTT) и выполняют электрофоретическое разделение на 4-12% бис-трис-глицин-полиакриламидных гелях Criterion XT (BioRad) (SDS-PAGE). Гели окрашивают в растворе Кумасси синего (Instant blue, Sigma Aldrich). Избыточный краситель удаляют водой, и полосы визуализируют с использованием Imager 600 (Amersham). На Фигуре 4 показан анализ очищенных рекомбинантных F-белков с помощью SE-HPLC. Примерные выходы рекомбинантных F-белков показаны в Таблице 4.

ПРИМЕР 3: Конформация рекомбинантных F-белков hMPV

Определение конформационного профиля с помощью ИФА в формате «сэндвич»

Умеренно связывающие планшеты (Greiner) покрывают захватывающим человеческим антителом DS7 IgG1 (Williams et al., 2007) при 200 нг/лунку и инкубируют в течение ночи при 4°С. Планшеты насыщают в течение 2 часов при 37°С с использованием ФСБ + 0,05% Tween 20 и 5% сухого обезжиренного молока при перемешивании (буфер для насыщения). Из лунок удаляют жидкость, и планшеты инкубируют в течение 1 часа при 37°С с 2,5 нг/лунку представляющих интерес очищенных белков, разведенных в буфере для насыщения. После промывки 5-кратное последовательное разведение в буфере для насыщения мышиного антитела МРЕ8 N113S (Corti et al., 2013), направленного против F-белка hMPV перед слиянием, или мышиного антитела MF1 (Melero, личные сообщения), направленного против F-белка hMPV после слияния, инкубируют в течение 1 часа при 37°С. Затем иммунные комплексы детектируют путем инкубации в течение одного часа при 37°С с конъюгированным с пероксидазой хрена (ПХ) вторичным видоспецифичным козьим α-Ig-антителом против мышиного IgG (Covalab, № по каталогу lab0252) с последующим введением 50 мкл субстрата пероксидазы (ТМВ, Sigma). Колориметрическую реакцию останавливают, добавляя 3 н. H₂SO₄, и поглощение каждой лунки измеряют при 490 нм с помощью спектрофотометра (MultiSkan). На Фигуре 5 показаны результаты ИФА, выполненного для рекомбинантных F-белков с антителами, специфичными в отношении конформации перед слиянием или конформации после слияния. Все протестированные кандидаты проявляют распространенность профиля перед слиянием, за исключением одного кандидата L7F A14.2, который существует как в конформации перед слиянием, так и в конформации после слияния. Рекомбинантный белок L7F A123.3 отличается от L7F A123 только одним аминокислотным остатком в гетерологичном линкере, то есть он содержит валин в положении 5 линкера (CGAGV), который соответствует валину, находящемуся в положении 118 из SEQ ID NO: 1.

ПРИМЕР 4: Исследование иммуногенности

Иммуногенность у мышей

Группы из пяти-десяти мышей BALB/c трижды подкожно иммунизируют с трехнедельным интервалом (например, дни 0, 14 или 21 и 28 или 42) рекомбинантными F-белками (используемыми в различных экспериментах в количествах от 0,06 мкг до 6,0 мкг на мышь) с разным адъювантом или без него, в частности, квасцами, квасцами +MPL, IC31^®, Addavax™ (InvivoGen). Сыворотки собирают путем взятия крови из ретроорбитального синуса. Через одну-четыре недели после последней вакцинации берут кровь и готовят сыворотки. Оценку иммунного ответа типа Th₁/Th₂ выполняют путем определения подтипов IgG₁/IgG_2a в сыворотках с помощью непрямого ИФА, как описано ниже.

ИФА подкласса IgG

Рекомбинантный F-белок разводят в карбонатном/бикарбонатном буфере при рН 9,6, и 50 нг белка на лунку добавляют в 96-луночный планшет с высоким связыванием (50 мкл/лунку, Greiner). Планшеты инкубируют в течение ночи при 4°С. Лунки насыщают в течение 30 минут при комнатной температуре 150 мкл ФСБ с 0,05% Tween 20 и 5% сухого обезжиренного молока (буфер для насыщения). Из лунок удаляют жидкость, и планшеты инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре с 50 мкл/лунку сывороток иммунизированных мышей при различных разведениях (5-кратное последовательное разведение) в буфере для насыщения. После трехкратной промывки ФСБ с 0,05% Tween 20 иммунные комплексы детектируют путем инкубации в течение одного часа при комнатной температуре с 50 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела, специфичного в отношении мышиного IgG₁ или IgG_2a, с последующим введением 50 мкл субстрата пероксидазы (ТМВ, Sigma). Колориметрическую реакцию останавливают добавлением ортофосфорной кислоты, и поглощение каждой лунки измеряют при 490 нм с помощью спектрофотометра (MultiSkan).

На Фигуре 6 показаны результаты ИФА IgG, полученные при тестировании сывороток от мышей, иммунизированных 2 мкг на мышь рекомбинантного белка sF_A1_K_L7 (SEQ ID NO: 6) или sF_A1_MFur (SEQ ID NO: 53), введенных в комбинации с различными адъювантами. Индукция высоких титров IgG₁/IgG_2a продемонстрирована для обоих F-белков независимо от использованного адъюванта.

На Фигуре 7 показаны результаты для титров IgG₁ и IgG_2a, которые были измерены у мышей, иммунизированных одним из рекомбинантных F-белков (2 мкг) с адъювантом Addavax™, смешанным при 1:1 (об./об.).

На Фигуре 8 также показаны титры сывороточных IgG₁ и IgG_2a, измеренные у мышей, иммунизированных одним из рекомбинантных F-белков (2 мкг) с адъювантом IC31^®. Несмотря на некоторые различия, данные ясно показывают, что все кандидатные вакцины обладают высокой иммуногенностью и способны вызывать выработку антител IgG₁/IgG_2a.

ПРИМЕР 5: Индукция нейтрализующих антител

Анализ нейтрализации

В общих чертах, тест на реакцию нейтрализации бляшкообразования (PRNT) используется для определения титра сыворотки/антитела иммунизированного субъекта, необходимого для уменьшения количества бляшек вируса hMPV на 50% (PRNT50) по сравнению с контрольной сывороткой/антителом. PRNT50 выполняют с использованием монослоев клеток, которые могут быть инфицированы hMPV. Сыворотки субъектов разводят и инкубируют с живым вирусом hMPV. Бляшки, образованные на монослоях клеток, подсчитывают и сравнивают с количеством бляшек, образованных вирусом в отсутствие сыворотки или контрольного антитела. Порог нейтрализующих антител при разведении сыворотки 1:10 в PRNT50 обычно считается доказательством защиты (Hombach et. al. 2005. Vaccine 23: 5205-5211).

Протокол PRNT

В 24-луночный планшет высевают клетки LLC-MK2, 1,2×10⁵ клеток на лунку, под 1 мл буфера ЕМЕМ (Lonza), 2 мМ L-Gln (Ozyme), 5% ФБС и 1% NeAA (Ozyme), и инкубируют 24 часа при 37°С и 5% CO₂. Вирус hMPV Al (банк Valneva MVB 1611-009) разводят до 50 БОЕ/62,5 мкл (на лунку) или 800 БОЕ/мл. Равные объемы вируса и разведения сыворотки (2×62,5 мкл) объединяют и инкубируют при 37°С с 5% СО₂ в течение приблизительно 1 часа. После промывания планшета ФСБ в каждую лунку добавляют 125 мкл смеси вирус/сыворотка, и планшет инкубируют в течение 2 часов при 37°С при встряхивании (100 об./мин). Затем добавляют 225 мкл/лунку верхнего слоя раствора (ЕМЕМ, 2 мМ Gln, 0,75% метилцеллюлозы) и планшет инкубируют 5 дней при 37°С с 5% СО₂. Для фиксации клеток добавляют 225 мкл/лунку 4% ПФА/ФСБ, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре и затем трижды промывают ФСБ. Для пермеабилизации клеток в каждую лунку добавляют 0,5 мл ФСБ, 0,5% Tween, 0,1% БСА и инкубируют 30 минут при 4°С. Первичное антитело (человеческое DS7-PRO-2016-003) (0,91 мкг/мл) разводят в ФСБ до конечной концентрации 5 мкл/мл, добавляют 150 мкл разведения первичного антитела на лунку и инкубируют 45 минут при 37°С при встряхивании. После удаления первичного антитела и трехкратной промывки планшета блокирующим буфером добавляют 150 мкл/лунку разведенного вторичного антитела ПХ-конъюгированного антитела к белку человека (UP 783493) - и планшет инкубируют еще 45 минут при 37°С при встряхивании. Затем вторичное антитело удаляют, и планшет трижды промывают блокирующим буфером. Для окрашивания добавляют 150 мкл субстрата DAB 1х на лунку. После 1 часа инкубации при комнатной температуре клетки подсчитывают вручную под микроскопом.

На Фигуре 9 показаны результаты анализа нейтрализации, полученные с сыворотками, собранными на день 57 у мышей, иммунизированных рекомбинантным белком sF_A1_K_L7 (2 мкг) с различными адъювантами. Обычно нейтрализующие антитела против тестируемого F-белка присутствуют в сыворотках мышей вне зависимости от использованного адъюванта.

В экспериментах, в которых одновременно тестировали все кандидатные белки, значения ИК₅₀ были самыми высокими для кандидата L7F_А1_23 с адъювантом Addavax™ и для кандидата L7F_А1_23 с адъювантом IC31^® (см. Фигуру 10 и Таблицу 5). Наименьшие значения ИК₅₀ были рассчитаны для кандидата L7F_A1_31 независимо от использованного адъюванта.

На Фигуре 11 показано исследование зависимости ответа от дозы, выполненное для оценки иммуногенности рекомбинантных F-белков при инокулировании мышам в комбинации с Addavax™. В отличие от группы плацебо (данные не показаны) в сыворотке мышей, иммунизированных 0,06-6,0 мкг рекомбинантного F-белка, детектируют нейтрализующие антитела. Не наблюдали значительного различия ИК₅₀ между ко нструкциями.

ПРИМЕР 6: Защита у мышей

Иммуноокрашивание вирусных бляшек (очагов)

Анализ для количественной оценки очагов hMPV был разработан на основе методов, опубликованных в Williams et al, 2005. J Virology 79(17): 10944-51; Williams et al., 2007. J Virology 81(15):8315-24; и Cox et al, 2012. J. Virology 86(22):12148-60. В общих чертах, конфлюэнтные культуры клеток Vero или клеток LLC-MK2 в 24-луночных планшетах инфицировали 50 мкл/лунку вируса hMPV, предварительно инкубированного в течение 30 минут при комнатной температуре в присутствии или в отсутствие сывороток мышей, разведенных в среде. Для детектирования hMPV используют мышиное моноклональное антитело IgG_2a DS7. После периода адсорбции вируса в течение двух часов при 37°С добавляют верхний слой 1,5% метилцеллюлозы, содержащий среду ЕМЕМ с добавлением 2 мМ L-Gln и от 20 до 50 мкг/мл трипсина. На 6 день после инфицирования супернатант удаляют и клетки дважды промывают ФСБ. Монослои клеток фиксируют и окрашивают человеческим антителом IgG₁ DS7. Подсчитывают очаги и рассчитывают титры уменьшения количества бляшек на 50% с учетом соответствующих отрицательных и положительных контролей. Изображения клеток регистрируют с помощью микроскопа Zeiss с 2,5-кратным или 10-кратным объективом. Результаты иммуноокрашивания выражают в бляшкообразующих единицах на миллилитр или БОЕ/мл.

Протокол стимуляции

В экспериментах по стимуляции животных используются изоляты hMPV A1 и А2, выращенные на клетках LLC-MK2. Мышей BALB/c трижды иммунизируют с интервалом в две недели рекомбинантным F-белком с адъювантом, как описано ранее, и на день 42 после иммунизации их интраназально стимулируют примерно 1×10⁶ БОЕ hMPV. Через четыре-пять дней животных умерщвляют, берут индивидуальные образцы сыворотки и замораживают.Образцы ткани легких собирают, взвешивают и гомогенизируют для определения вирусного титра. Вирусную нагрузку в тканях легких определяют с помощью иммуноокрашивания вирусных очагов, как описано выше. Альтернативно или дополнительно, для определения вирусной нагрузки в собранных тканях используют количественную ОТ-ПЦР (ОТ-кПЦР).

Фигура 12 демонстрирует нагрузку вирусной РНК (GCE) в легких мышей, иммунизированных рекомбинантным F-белком с адъювантом, после стимуляции hMPV дикого типа, оцененную с помощью ОТ-кПЦР. Наибольшая нагрузка РНК hMPV наблюдается в группах плацебо, в то время как в легких иммунизированных мышей наблюдается сильное снижение вирусной нагрузки, это демонстрирует защиту кандидатными вакцинами. Защитный эффект еще более очевиден при использовании иммуноокрашивания вирусных бляшек (очагов). Сильное снижение (до 4 log) вирусной нагрузки, рассчитанной в БОЕ/мл, наблюдается у мышей, иммунизированных различными дозами белка (от 0,06 до 6,0 мкг на мышь), по сравнению с группой плацебо для всех протестированных кандидатных F-белков hMPV, как показано на Фигуре 13. Будет понятно, что точные детали описанных способов или композиций могут быть изменены или модифицированы без отклонения от сущности описанных вариантов реализации. В формулу изобретения включены все такие модификации и варианты, которые находятся в пределах объема и сущности приведенной ниже формулы изобретения. Все публикации, описанные в настоящей заявке, включены в данный документ посредством ссылки.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

SEQ ID NO: 1

Последовательность нативного F-белка hMPV штамма NL/1/00, серотип генотипа А1 (GenBank: AAK62968.2)

SEQ ID NO: 2

Последовательность нативного домена F2 hMPV штамма NL/1/00, серотипа A1

SEQ ID NO: 3

Последовательность нативного домена Fl hMPV штамма NL/1/00, серотипа A1

SEQ ID NO: 4

Гетерологичный пептидный линкер

SEQ ID NO: 5

Последовательность белка L7F_A1_23

SEQ ID NO: 6

Последовательность белка sF_A1_K_L7

SEQ ID NO: 7

Последовательность белка L7F_A1_31

SEQ ID NO: 8

Последовательность белка L7F_A1_33

SEQ ID NO: 9

Последовательность белка L7F_A1_4.2

SEQ ID NO: 10

Вспомогательный домен тримеризации (foldon) из фибритина бактериофага Т4

SEQ ID NO: 11

Последовательность His-метки с лидерным GS в качестве линкера

SEQ ID NO: 12

Последовательность стрептавидиновой метки

SEQ ID NO: 13

Последовательность нативного F-белка hMPV штамма NL/17/00, серотипа А2 (GenBank: AY304360.1)

SEQ ID NO: 14

Последовательность нативного F-белка hMPV штамма CAN97-83, серотипа А2 (Uniprot Q6WB98)

SEQ ID NO: 15

Последовательность нативного F-белка hMPV штамма NCL174, серотипа A2 (Uniprot G0ZRI7)

SEQ ID NO: 16

Последовательность нативного F-белка hMPV штамма NL/1/99, серотипа B1 (GenBank: AY304361.1)

SEQ ID NO: 17

Последовательность нативного F-белка hMPV штамма NDL00-1, серотипа Bl (GenBank: AAK62968.2)

SEQ ID NO: 18

Последовательность нативного F-белка hMPV штамма CAN98-75, серотипа B2 (Uniprot: 6WBA7)

SEQ ID NO: 19

Кодирующая нуклеотидная последовательность sF_A1_K_L7, оптимизированная по кодонам

SEQ ID NO: 20

Кодирующая нуклеотидная последовательность L7F_A1_23, оптимизированная по кодонам

SEQ ID NO: 21

Кодирующая нуклеотидная последовательность L7F_A1_31, оптимизированная по кодонам

SEQ ID NO: 22

Кодирующая нуклеотидная последовательность L7F_A1_33, оптимизированная по кодонам

SEQ ID NO: 23

Кодирующая нуклеотидная последовательность L7F_А1_4.2, оптимизированная по кодонам

SEQ ID NO: 24

Последовательность зрелого белка sF_A1_K_L7 без меток для очистки

SEQ ID NO: 25

Последовательность зрелого белка L7F_A1_23 без меток для очистки

SEQ ID NO: 26

Последовательность зрелого белка L7F_A1_31 без меток для очистки

SEQ ID NO: 27

Последовательность зрелого белка L7F_А1_33 без меток для очистки

SEQ ID NO: 28

Последовательность зрелого белка L7F_A1_4.2 без меток для очистки

SEQ ID NO: 29 Foldon-глик-1

SEQ ID NO: 30 Foldon-глик-2

SEQ ID NO: 31 Foldon-глик-3

SEQ ID NO: 32 Foldon-глик-4

SEQ ID NO: 33 Foldon-глик-5

SEQ ID NO: 34

Мотив VSL вспомогательного домена тримеризации

SEQ ID NO: 35

Мотив VSA вспомогательного домена тримеризации

SEQ ID NO: 36

SEQ ID NO: 37

SEQ ID NO: 38

SEQ ID NO: 39

SEQ ID NO: 40

SEQ ID NO: 41

SEQ ID NO: 42

Сайт расщепления тромбином

SEQ ID NO: 43

Сайт расщепления TEV

SEQ ID NO: 44

Сайт расщепления фактора Ха

SEQ ID NO: 45

SEQ ID NO: 46

SEQ ID NO: 47

SEQ ID NO: 48

SEQ ID NO: 49

SEQ ID NO: 50

SEQ ID NO: 51

Последовательность белка sF_A1_K-E294 с заменами A113C, A339C, T160F, I177L и вспомогательным доменом тримеризации KLL

SEQ ID NO: 52

Кодирующая нуклеотидная последовательность sF_A1_K-E294, оптимизированная по кодонам

SEQ ID NO: 53

Последовательность белка sF_A1_MFur с делецией аминокислот в положениях с 103 по 111, заменой R102 сайтом фурина KKRKRR и заменой G294E, стабилизированная в конформации после слияния

SEQ ID NO: 54

Кодирующая нуклеотидная последовательность sF_A1_MFur, оптимизированная по кодонам

--->

Перечень последовательностей

<110> Valneva SE

<120> Субъединичная вакцина для лечения или предотвращения инфекции

дыхательных путей

<130> EP19175413.4

<140> PAT040/PCT

<141> 2020-05-15

<150> EP/19175413.4

<151> 2019-05-20

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 539

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 1

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile

115 120 125

Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala

165 170 175

Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser

180 185 190

Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln

225 230 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe

245 250 255

Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln

260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala

275 280 285

Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp

325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile

340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His

355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys

370 375 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile

385 390 395 400

Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp

405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly

420 425 430

Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro

435 440 445

Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe

450 455 460

Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile

465 470 475 480

Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile

485 490 495

Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Thr Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile

500 505 510

Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser

515 520 525

Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Asn

530 535

<210> 2

<211> 84

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 2

Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly

1 5 10 15

Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu

20 25 30

Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu

35 40 45

Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg

50 55 60

Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Asn Pro

65 70 75 80

Arg Gln Ser Arg

<210> 3

<211> 437

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 3

Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Ala Val

1 5 10 15

Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val

20 25 30

Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr

35 40 45

Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr Ala Val Arg Glu Leu Lys

50 55 60

Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg

85 90 95

Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala

115 120 125

Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu

130 135 140

Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val

145 150 155 160

Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val

165 170 175

Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Gly

180 185 190

Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr

195 200 205

Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys

210 215 220

Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala Gly Ile Asn

225 230 235 240

Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn

245 250 255

Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala

260 265 270

Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys

275 280 285

Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly

290 295 300

Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn

305 310 315 320

Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys

325 330 335

Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp

340 345 350

Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser

355 360 365

Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Lys

370 375 380

Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile Leu Ile Ala Val Leu Gly

385 390 395 400

Ser Thr Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile Ile Ile Lys Lys Thr Lys

405 410 415

Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly

420 425 430

Phe Ile Pro His Asn

435

<210> 4

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный

<400> 4

Cys Gly Ala Gly Ala

1 5

<210> 5

<211> 523

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 5

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala

100 105 110

Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn

115 120 125

Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val

130 135 140

Arg Val Leu Ala Thr Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys

145 150 155 160

Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu

165 170 175

Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val

180 185 190

Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu

195 200 205

Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro

210 215 220

Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val

225 230 235 240

Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val

245 250 255

Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

260 265 270

Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr

275 280 285

Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly

290 295 300

Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp

305 310 315 320

His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser

325 330 335

Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val

340 345 350

Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly

355 360 365

Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn

370 375 380

Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr

385 390 395 400

Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu

405 410 415

Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser

420 425 430

Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala

435 440 445

Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp

450 455 460

Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg

465 470 475 480

Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser

485 490 495

Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His

500 505 510

His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

515 520

<210> 6

<211> 529

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 6

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala

100 105 110

Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn

115 120 125

Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val

130 135 140

Arg Val Leu Ala Phe Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys

145 150 155 160

Asn Leu Thr Arg Ala Leu Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu

165 170 175

Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val

180 185 190

Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu

195 200 205

Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro

210 215 220

Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val

225 230 235 240

Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val

245 250 255

Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

260 265 270

Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr

275 280 285

Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly

290 295 300

Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp

305 310 315 320

His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser

325 330 335

Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val

340 345 350

Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly

355 360 365

Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn

370 375 380

Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr

385 390 395 400

Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu

405 410 415

Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser

420 425 430

Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala

435 440 445

Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp

450 455 460

Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr

465 470 475 480

Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly

485 490 495

Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly

500 505 510

Ser His His His His His His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

515 520 525

Lys

<210> 7

<211> 523

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 7

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Met Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Leu Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Asn

65 70 75 80

Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala

100 105 110

Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn

115 120 125

Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val

130 135 140

Arg Val Leu Ala Thr Met Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys

145 150 155 160

Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu

165 170 175

Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val

180 185 190

Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu

195 200 205

Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro

210 215 220

Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val

225 230 235 240

Arg Arg Lys Gly Phe Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val

245 250 255

Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

260 265 270

Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr

275 280 285

Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly

290 295 300

Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp

305 310 315 320

His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser

325 330 335

Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val

340 345 350

Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly

355 360 365

Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn

370 375 380

Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr

385 390 395 400

Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu

405 410 415

Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser

420 425 430

Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala

435 440 445

Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp

450 455 460

Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg

465 470 475 480

Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser

485 490 495

Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His

500 505 510

His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

515 520

<210> 8

<211> 523

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 8

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Met Leu Cys Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Leu Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala

100 105 110

Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn

115 120 125

Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val

130 135 140

Arg Val Leu Ala Thr Met Val Arg Glu Leu Cys Asp Phe Val Ser Lys

145 150 155 160

Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu

165 170 175

Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val

180 185 190

Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu

195 200 205

Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro

210 215 220

Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val

225 230 235 240

Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Asp Val

245 250 255

Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

260 265 270

Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr

275 280 285

Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly

290 295 300

Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp

305 310 315 320

His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser

325 330 335

Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val

340 345 350

Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly

355 360 365

Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn

370 375 380

Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr

385 390 395 400

Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu

405 410 415

Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser

420 425 430

Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala

435 440 445

Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp

450 455 460

Gln Ser Asn Arg Cys Cys Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg

465 470 475 480

Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser

485 490 495

Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His

500 505 510

His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

515 520

<210> 9

<211> 529

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 9

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Met Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala

100 105 110

Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Trp Lys Asn

115 120 125

Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Val Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val

130 135 140

Arg Val Leu Val Thr Met Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys

145 150 155 160

Asn Leu Thr Arg Ala Leu Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu

165 170 175

Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val

180 185 190

Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu

195 200 205

Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro

210 215 220

Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val

225 230 235 240

Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val

245 250 255

Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

260 265 270

Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr

275 280 285

Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly

290 295 300

Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp

305 310 315 320

His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser

325 330 335

Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val

340 345 350

Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly

355 360 365

Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn

370 375 380

Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr

385 390 395 400

Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu

405 410 415

Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser

420 425 430

Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala

435 440 445

Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp

450 455 460

Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr

465 470 475 480

Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly

485 490 495

Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly

500 505 510

Ser His His His His His His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

515 520 525

Lys

<210> 10

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Бактериофаг Т4

<400> 10

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

1 5 10 15

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 11

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<400> 11

Gly Ser His His His His His His

1 5

<210> 12

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 12

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 539

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 13

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ser Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile

115 120 125

Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Thr Thr

130 135 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala

165 170 175

Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser

180 185 190

Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln

225 230 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe

245 250 255

Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Thr Val Gln

260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala

275 280 285

Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp

325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile

340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His

355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys

370 375 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile

385 390 395 400

Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp

405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly

420 425 430

Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro

435 440 445

Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe

450 455 460

Glu Asn Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile

465 470 475 480

Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile

485 490 495

Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Ser Met Ile Leu Val Ser Ile Phe Ile

500 505 510

Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser

515 520 525

Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Ser

530 535

<210> 14

<211> 539

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 14

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ser Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile

115 120 125

Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Thr Thr

130 135 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala

165 170 175

Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser

180 185 190

Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln

225 230 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe

245 250 255

Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln

260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala

275 280 285

Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp

325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile

340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His

355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys

370 375 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile

385 390 395 400

Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp

405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly

420 425 430

Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro

435 440 445

Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe

450 455 460

Glu Asn Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile

465 470 475 480

Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile

485 490 495

Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Ser Met Ile Leu Val Ser Ile Phe Ile

500 505 510

Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser

515 520 525

Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Ser

530 535

<210> 15

<211> 539

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 15

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Ser Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Lys Pro Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile

115 120 125

Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala

165 170 175

Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser

180 185 190

Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Gln

225 230 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe

245 250 255

Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln

260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala

275 280 285

Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp

325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile

340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His

355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys

370 375 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile

385 390 395 400

Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp

405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly

420 425 430

Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro

435 440 445

Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe

450 455 460

Glu Asn Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile

465 470 475 480

Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile

485 490 495

Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Ser Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile

500 505 510

Ile Ile Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser

515 520 525

Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Ser

530 535

<210> 16

<211> 539

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 16

Met Ser Trp Lys Val Met Ile Ile Ile Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Ile Ala Ile Ala Lys Thr Ile

115 120 125

Arg Leu Glu Ser Glu Val Asn Ala Ile Lys Gly Ala Leu Lys Gln Thr

130 135 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Leu Lys Glu Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Ser Ala

165 170 175

Ile Asn Arg Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser

180 185 190

Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Tyr Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln

225 230 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe

245 250 255

Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln

260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Ile Lys Ala

275 280 285

Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp

325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn Ile

340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His

355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys

370 375 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Trp Val Gly Ile Ile

385 390 395 400

Lys Gln Leu Pro Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp

405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly

420 425 430

Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro

435 440 445

Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe

450 455 460

Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Lys Ile

465 470 475 480

Leu Asn Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Val Ile

485 490 495

Leu Val Ala Val Leu Gly Leu Thr Met Ile Ser Val Ser Ile Ile Ile

500 505 510

Ile Ile Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Asn

515 520 525

Gly Val Thr Asn Gly Gly Phe Ile Pro His Ser

530 535

<210> 17

<211> 539

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 17

Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile

115 120 125

Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala

165 170 175

Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser

180 185 190

Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln

225 230 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe

245 250 255

Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln

260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala

275 280 285

Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp

325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile

340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His

355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys

370 375 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile

385 390 395 400

Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp

405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly

420 425 430

Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro

435 440 445

Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe

450 455 460

Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile

465 470 475 480

Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile

485 490 495

Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Thr Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile

500 505 510

Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser

515 520 525

Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Asn

530 535

<210> 18

<211> 539

<212> БЕЛОК

<213> Метапневмовирус человека

<400> 18

Met Ser Trp Lys Val Met Ile Ile Ile Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln

1 5 10 15

His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe

35 40 45

Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu

85 90 95

Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Ile Ala Ile Ala Lys Thr Ile

115 120 125

Arg Leu Glu Ser Glu Val Asn Ala Ile Lys Gly Ala Leu Lys Thr Thr

130 135 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Val Arg Glu Leu Lys Glu Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Ser Ala

165 170 175

Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser

180 185 190

Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Tyr Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln

225 230 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe

245 250 255

Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln

260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Ile Lys Ala

275 280 285

Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Lys Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp

325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn Ile

340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His

355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys

370 375 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile

385 390 395 400

Lys Gln Leu Pro Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp

405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly

420 425 430

Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro

435 440 445

Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe

450 455 460

Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Lys Ile

465 470 475 480

Leu Asn Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile

485 490 495

Leu Ile Ala Val Leu Gly Leu Thr Met Ile Ser Val Ser Ile Ile Ile

500 505 510

Ile Ile Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Asn

515 520 525

Gly Val Thr Asn Gly Gly Phe Ile Pro His Ser

530 535

<210> 19

<211> 1590

<212> ДНК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 19

atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60

gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120

accggctggt acaccaacgt gttcaccctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180

gctgatggcc ccagcctgat caagaccgag ctggacctga ccaagtctgc cctgagagaa 240

ctgaggaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagca gcctagacag 300

tccggatgtg gtgctggtgc tacagctggc gtggccattg ccaagaccat ccggctggaa 360

tctgaagtga ccgccatcaa gaacgccctg aaaaagacca acgaggccgt gtctaccctc 420

ggcaatggcg ttagagtgct ggcctttgct gtgcgcgagc tgaaggactt cgtgtccaag 480

aacctgacca gggctctgaa caagaacaag tgtgatatcg ccgacctgaa gatggccgtg 540

tcctttagcc agttcaaccg gcggttcctg aacgtcgtgc ggcagttctc tgataacgcc 600

ggcatcaccc ctgccatcag cctggatctg atgaccgatg ccgagctggc tagagccgtg 660

tccaacatgc ctacctctgc cggccagatc aagctgatgc tggaaaacag agccatggtc 720

cgacggaaag gcttcggctt tctgatcggc gtgtacggct cctccgtgat ctacatggtg 780

cagctgccta tcttcggcgt gatcgacacc ccttgctgga tcgtgaaggc cgctcctagc 840

tgctctgaga agaagggcaa ctacgcctgc ctgctgagag aggaccaagg ctggtactgt 900

cagaacgccg gctccaccgt gtactacccc aacgagaagg actgcgagac aagaggcgac 960

cacgtgttct gcgatacctg cgctggcatc aatgtggccg agcagtccaa agagtgcaac 1020

atcaacatct ccaccaccaa ctatccctgc aaggtgtcca ccggcaggca ccctatttcc 1080

atggtggctc tgtctccact gggcgccctg gtggcttgtt ataagggcgt gtcctgctcc 1140

atcggctcca acagagtggg catcatcaag cagctgaaca agggctgcag ctacatcacc 1200

aaccaggacg ccgataccgt gaccatcgac aataccgtgt atcagctgtc caaggtggaa 1260

ggcgagcagc acgtgatcaa gggcagacct gtgtcctcca gcttcgaccc cgtgaagttc 1320

cctgaggatc agttcaacgt ggccctggac caggtgttcg agtccatcga gaactctcag 1380

gctctggtgg accagtccaa ccggatcctg tcctctgccg agtctgctat cggcggctat 1440

atccccgagg ctcctagaga tggccaggcc tatgttcgga aggatggcga atgggtgctg 1500

ctgtctacct tcctcggagg cctggtgcct agaggctctc accaccatca tcaccactcc 1560

gcttggtccc atccacagtt cgagaagtga 1590

<210> 20

<211> 1572

<212> ДНК

<213> Искусственный

<220>

<223> Искусственный

<400> 20

atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60

gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120

accggctggt acaccaacgt gttcaccctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180

gctgatggcc ccagcctgat caagaccgag ctggacctga ccaagtctgc cctgagagaa 240

ctgaggaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagca gcctagacag 300

tccggatgtg gtgctggtgc tacagctggc gtggccattg ccaagaccat ccggctggaa 360

tctgaagtga ccgccatcaa gaacgccctg aaaaagacca acgaggccgt gtctaccctc 420

ggcaatggcg ttagagtgct ggccacagcc gtgcgcgagc tgaaggattt cgtgtccaag 480

aacctgacca gggccatcaa caagaacaag tgtgatatcg ccgacctgaa gatggccgtg 540

tccttcagcc agttcaaccg gcggttcctg aatgtcgtgc ggcagttctc tgacaacgcc 600