АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/113 

Область техники

Настоящее изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам и к фармацевтической композиции, содержащей их.

Предшествующий уровень техники

После того, как информацию в последовательностях ДНК клеток транскрибируют в мРНК, белки продуцируются посредством процесса, в котором тРНК переносит соответствующие аминокислоты на основе информации мРНК из рибосом с последующим лигированием их посредством пептидных связей.

Если при экспрессии этого гена имеются одноцепочечные ДНК или РНК, имеющие последовательность, комплементарную мРНК, эта комплементарная ДНК или РНК может связываться с мРНК с образованием двойной цепи, тем самым блокируя продуцирование белка.

Олигонуклеотид комплементарной ДНК или РНК, которая может связываться с мРНК (смысловой РНК), который может транскрибироваться и транслироваться в белок, как описано выше, образуя двойную цепь для ингибирования его функции, называется антисмысловой РНК или антисмысловым олигонуклеотидом.

Описание изобретения

Технические задачи

В результате исследования по разработке антисмыслового олигонуклеотида с улучшенной способностью ингибировать экспрессию мРНК TGF-β авторы настоящего изобретения обнаружили, что новый антисмысловой олигонуклеотид, в структуре которого некоторые сахара модифицированы, среди антисмысловых олигонуклеотидов проявлял превосходные эффекты ингибирования на TGF-β и высокую стабильность.

Таким образом, настоящее изобретение предназначено для предложения нового антисмыслового олигонуклеотида и фармацевтической композиции, содержащей его.

Технические решения

Настоящее изобретение относится к новому антисмысловому олигонуклеотиду, включающему по меньшей мере один модифицированный нуклеозид из олигонуклеотидов 5'-GGCGG CATGT CTATT TTGTA-3', представленного SEQ ID NO: 1; олигонуклеотида 5'-CGGCA TGTCT ATTTT GTAAA-3', представленного SEQ ID NO: 2; или олигонуклеотид 5'-GCGGC ATGTC TATTT TGTAA-3', представленного SEQ ID NO: 3.

Конкретно, настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду с любой из SEQ ID NO: от 1 до 3, где антисмысловый олигонуклеотид содержит нуклеотид, в котором по меньшей мере один нуклеозид олигонуклеотида модифицирован.

В данном изобретении нуклеотид с модифицированным нуклеозидом может представлять собой 2'-O-метоксиэтил(МОЕ)-модифицированный нуклеотид 2'-фтор(F)-модифицированный нуклеотид, 2'-O-метил(0-Ме)-модифицированный нуклеотид, модифицированный нуклеотид с закрытой нуклеиновой кислотой (LNA), модифицированный нуклеотид с этилен-мостиковой нуклеиновой кислотой (ENA), модифицированный нуклеотид с (R/S)-затрудненным этилом, или модифицированный нуклеотид с полиалкиленоксидом (например триэтиленгликолем (TEG)). (Ниже, если не указано иное, нуклеотиды с нуклеозидами, модифицированными, как описано выше, называются "модифицированными нуклеотидами").

Например, антисмысловой олигонуклеотид по настоящему изобретению может находиться в положении 2' на пентозе рибоза модифицированного нуклеозида в 2'-O-метоксиэтильной (МОЕ) форме, 2'-фтор-форме или 2'-O-метильной форме, или может находиться в форме LNA или ENA, где кислород в положении 2' на пентозе рибоза модифицированного нуклеозида соединен с углеродом в положении 4', или в форме сЕТ, где мостик, который соединяет кислород в положении 2' и углерод в положении 4' LNA, заменен на метальную группу.

Структура модифицированного нуклеозида, показанного выше, может быть представлена следующим образом:

Олигонуклеотид по настоящему изобретению включает один или более модифицированных нуклеозидов на 5'-конце и/или 3'-конце. Например, олигонуклеотид включает один или более модифицированных нуклеозидов на 5'-конце или 3'-конце олигонуклеотида по настоящему изобретению. Таким образом, может быть включен нуклеотид, имеющий по меньшей мере один модифицированный нуклеозид на 5'-конце или 3'-конце олигонуклеотида по настоящему изобретению, т.е. "модифицированный нуклеотид".

Конкретно, олигонуклеотид по настоящему изобретению представляет собой олигонуклеотид, в котором один или более нуклеотидов на 5'-конце или один или более нуклеотидов на 3'-конце олигонуклеотида представляют собой модифицированные нуклеотиды.

Кроме того, олигонуклеотид по настоящему изобретению представляет собой олигонуклеотид, в котором один или более нуклеотидов на 5'-конце и один или более нуклеотидов на 3'-конце олигонуклеотида представляют собой модифицированные нуклеотиды.

В настоящем изобретении нуклеотиды от первого до n-го на 5'-конце олигонуклеотида или нуклеотиды от первого до m-го на 3'-конце олигонуклеотида могут представлять собой модифицированные нуклеотиды.

Кроме того, в настоящем изобретении нуклеотиды от первого до n-то на 5'-конце олигонуклеотида и нуклеотиды от первого до m-го на 3'-конце олигонуклеотида могут представлять собой модифицированные нуклеотиды.

В этом документе n и m, каждый независимо, представляют собой целое число от 1 до 10, предпочтительно n и m, каждый независимо, представляют собой целое число от 1 до 9, и более предпочтительно n и m, каждый независимо, представляют собой целое число от 1 до 7.

Кроме того, олигонуклеотид по настоящему изобретению может дополнительно включать модифицированный нуклеотид между модифицированными нуклеозидами, присутствующими на 5'-конце или на 3'-конце.

Другими словами, олигонуклеотид может дополнительно включать один или более модифицированных нуклеотидов между (n+1)-ым нуклеотидом на 5'-конце и (m+1)-ым нуклеотидом на 3'-конце олигонуклеотида.

Предпочтительный пример олигонуклеотида по настоящему изобретению может представлять собой любой из антисмысловых олигонуклеотидов, обозначенных от 1 до 30 в следующей Таблице.

Ниже в Таблице 1 выделенные жирным шрифтом нуклеотиды указывают на модифицированные нуклеотиды.

Таблица 1

Модифицированный нуклеотид олигонуклеотида в Таблице 1 (указанный подчеркнутыми буквами жирным шрифтом) представляет собой 2'-O-метоксиэтил(МОЕ)-модифицированный нуклеотид.

В этом документе идентификационный номер GenBank NM_001135599 в Таблице 1 известен как последовательность, которая экспрессирует TGF-β2_f как показано ниже (смотрите SEQ ID NO: 4).

Например, олигонуклеотид А002 в Таблице 1 представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который комплементарно связывается с SEQ ID NO: 1695-1676 в последовательности NM_001135599, и олигонуклеотид А002-01М представляет собой нуклеотид, в котором модифицированы 4 нуклеотид а в 5'-положении и 4 нуклеотид а в 3'-положении из 20 нуклеотидов в олнгонуклеотндах А002 (предпочтительно 2'-O-метоксштил (МОЕ)-модифицированный нуклеотид).

В олигонуклеотиде по настоящему изобретению связь между нуклеозидами, независимо от того, модифицирован ли нуклеозид, может представлять собой либо фосфодиэфирную, либо фосфотиоатную связь.

Знак * между нуклеотидами в олигонуклеотидах в Таблице 1 выше указывает на фосфотиоатную связь

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут образовывать соли с катионами. Таким образом, термин "олигонуклеотид", при использовании здесь, следует понимать как понятие, которое также включает фармацевтически приемлемые соли олигонуклеотидов.

Модификация нуклеозидов, как описано выше в настоящем изобретении, может быть получена посредством методов органохнмнческого синтеза, известных в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей антисмысловой олигонуклеотид, модифицированный, как описано выше.

Например, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая включает антисмысловой олигонуклеотид, модифицированный, как описано выше, и предназначена для предупреждения или лечения заболеваний (например злокачественных опухолей, доброкачественных опухолей, иммунных заболеваний, фиброза или офтальмологических заболеваний), связанных со сверхэкспрессией белков TGF-β2.

Полезные эффекты

Когда линию клеток солидной опухоли обрабатывали олигонуклеотидом по настоящему изобретению, было обнаружено, что были получены намного более хорошие эффекты ингибирования экспрессии белков TGF-β2 и выраженные эффекты уничтожения раковых клеток, а также улучшена стабильность в плазме.

Таким образом, олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть полезным в виде фармацевтической композиции для лечения заболеваний, связанных с экспрессией TGF-J3, таких как злокачественные опухоли, доброкачественные опухоли, иммунные заболевания, фиброз и офтальмологические заболевания.

Краткое описание графических материалов

ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий изменения в экспрессии мРНК TGF-p2 в результате обработки А549 с помощью 20 нМ ASO (антисмысловой олигонуклеотид) по настоящему изобретению.

ФИГ. 2 и 3 представляют собой графики, показывающие изменения в экспрессии мРНК TGF-β2 в результате обработки А549 и PANC-1 с помощью 1 мкМ ASO по настоящему изобретению.

На ФИГ. 4-6 показаны степени поглощения ASO по настоящему изобретению, представленные в виде графиков для каждой из клеточных линий А549, PANC-1 и А2058.

На ФИГ. 7 показан результат эксперимента по определению того, обеспечивает ли ASO по настоящему изобретению эффект улучшения стабильности.

ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий уровень мРНК TGF-β2 и уровень экспрессии белка после обработки ASO по настоящему изобретению в зависимости от концентрации для клеточной линии А549.

На ФИГ. 9-11 показаны уровни мРНК TGF-β2 после обработки ASO по настоящему изобретению в зависимости от концентрации для каждой из клеточных линий А549, PANC-1 и А2058.

На ФИГ. 12-18 показаны уровни мРНК TGF-β2 после обработки ASO по настоящему изобретению для клеточных линий из различных карцином.

На ФИГ. 19-21 показаны кривые роста опухоли после введении ASO по настоящему изобретению мышам с ксенотрансплантатом, которым трансплантировали клеточную линию А2058.

Лучший вариант осуществления изобретения

Когда клеточную линию солидной опухоли обрабатывали олигонуклеотидом по настоящему изобретению, было обнаружено, что были получены намного более хорошие эффекты ингибирования экспрессии мРНК TGF-β2 и превосходные противоопухолевые эффекты для подавления роста раковых клеток, а также была улучшена стабильность в плазме.

Ниже настоящее изобретение будет подробно описано на основе Примеров. Однако приведенные ниже Примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и сущность или объем настоящего изобретения ими не ограничиваются.

1. Экспериментальные методы (общепринятые)

А. Культивирование клеток

Как показано в Таблице 2 ниже, в зависимости от типов клеток использовали такие среды, как RPMI 1640 (10% FBS (фетальная бычья сыворотка), 1% антибиотик-антимикотик), DMEM (модифицированная среда Игла-Дульбекко) (10% FBS, 1% антибиотик-антимикотик) или McCoy's 5А (10% FBS, 1% антибиотик-антимикотик), и клетки культивировали при 37°С в присутствии 5,0% СО₂.

Б. Трансфекция с помощью реагента для трансфекции (липофектамин RNAiMAX) В зависимости от характеристик клеток и размера чашки высевали подходящее количество клеток и заменяли среду через 24 часа культивирования (10% FBS, без антибиотиков). ASO добавляли в среду, не содержащую FBS, в соответствии с концентрацией и реагенты для трансфекции также добавляли в среду, не содержащую FBS.

Смесь, включающую ASO, и смесь, включающую реагент для трансфекции, смешивали в соотношении 1:1 и приводили во взаимодействие при комнатной температуре в течение 5 минут. Смесь вносили к клеточным линиям с замененной средой и культивировали в инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в течение 24 или 48 часов, в зависимости от цели тестирования.

Посев клеток и реагенты для трансфекции являются такими, как показано в Таблице 3 ниже:

В. Трансфекции без реагентов для трансфекции

В зависимости от характеристик клеток и размера планшета высевали подходящее количество клеток и культивировали в течение 24 часов.

ASO добавляли в среду, содержащую 10% FBS, в соответствии с концентрацией.

Смесь, включающую ASO, вносили в планшеты с клеточным посевом и затем культивировали в инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в течение 24 или 48 часов, в зависимости от цели тестирования.

2. Количественный анализ мРНК TGF-β2

А. Извлечение и количественный анализ РНК

Через 24 или 48 часов после трансфекции все культуральные растворы удаляли, выделяли РНК, используя набор для приготовления РНК (Rneasy Plus Mini kit, Qiagen, Cat# 74136), и затем определяли количество РНК посредством метода с измерением оптической плотности, используя планшет для микрообъемов (Take 3, Biotek) и мультипланшетный анализатор (Synergy H1, Biotek).

Б. Синтез кДНК

кДНК синтезировали с 2 мкг выделенной РНК, используя набор для синтеза кДНК (RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit, Thermo Sceientific, K1622). Синтез выполняли в условиях синтеза в соответствии с инструкциями производителя и после завершения ПЦР, кДНК разбавляли дистиллированной водой (DW) до 20 нг/мкл.

Для количественного анализа мРНК TGF-β2 выполняли ПЦР в реальном времени. В качестве эталонного гена использовали человеческий SRSF9.

Смесь готовили с составом и в условиях, которые указаны в Таблицах 4-6 ниже, и выполняли ПЦР.

3. Количественный анализ на экспрессию белка TGF-β2 (ELISA (иммуноферментный анализ))

Засевали подходящее количество клеток, и через 24 часа трансфицировали ASO.

Через 48 часов после трансфекции собирали супернатант и центрифугировали (13000 оборотов в минуту, 1 минута).

Отбирали только надосадочную жидкость для проведения количественного анализа в соответствии с инструкциями производителя с использованием набора для ELISA TGF-β2 (R&D).

4. Приготовление ASO веществ

Вещество ASO, указанное в Таблице 1 выше, получали посредством известных способов, которые обычно используют (например, со ссылкой на способ, описанный в статье S.L. Beaucage and R.P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; или S. L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223).

Экспериментальный Пример 5. Результаты обработки клеточных линий А549 с помощью 20 нМ ASO

После обработки клеточной линии А549 с помощью ASO в концентрации 20 нМ в присутствии реагента для трансфекции сравнивали изменения уровня мРНК TGF-β2 для каждого вещества-кандидата.

Среда культивирования для клеток линии А549 (карцинома легкого) представляла собой RPMI 1640+10%FBS+1% антибиотика.

На 6-луночный планшет высевали 2x10⁵ клеток/2 мл клеток на лунку.

Трансфекция: Через 24 часа после посева клеток среду заменяли (после удаления существующего культурального раствора добавляли 1,8 мл среды, включающей 10% FBS без антибиотиков), подлежащий тестированию ASO добавляли в среду без добавок так, чтобы его концентрация в 20 раз превышала концентрацию для обработки (400 нМ), и реагент для трансфекции (липофектамин RNAiMAX) также добавляли в среду без добавок до достижения концентрации 7,5 мкл/100 мкл. Смесь, включающую предварительно разбавленный ASO, и смесь, включающую реагент для трансфекции, смешивали в соотношении 1:1 и приводили во взаимодействие при комнатной температуре в течение 5 минут (здесь концентрация ASO составляет 200 нМ). Для достижения конечной концентрации смеси прореагировавшего ASO и реагента для трансфекции 20 нМ, смесь распределяли по 200 мкл в клеточные линии с замененной средой с последующим культивированием в течение 24 часов (CO₂-инкубатор (37°С, 5,0% СО₂)).

Количественный анализ мРНК TGF-β2:

- Извлечение и количественное определение РНК: через 24 часа после трансфекции все культуральные растворы удаляли и затем извлекали РНК, используя набор для приготовления РНК (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). После извлечения РНК количественно определяли РНК при OD_260НМ посредством способа измерения оптической плотности с использованием планшета для микрообъемов (Take 3, Biotek) и мультипланшетного анализатора (Synergy H1, Biotek).

- Синтез кДНК: кДНК синтезировали с помощью 2 мкг выделенной РНК, используя набор для синтеза кДНК (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Условия синтеза соответствовали инструкции производителя, и кДНК разбавляли дистиллированной водой (DW) до 20 нг/мкл после окончания ПЦР.

- Выполнение ПЦР в реальном времени для количественного анализа мРНК TGF-β2: Используя человеческий SRSF9 в качестве эталонного гена, готовили смесь для ПЦР в таком же составе и в тех же условиях, как в Таблицах 4-6 выше, и выполняли ПЦР.

- Результаты идентифицировали путем вычисления степени ингибирования экспрессии мРНК (%) человеческого TGF-β2 с относительным соотношением к необработанным клеткам (клеточным линиям, обработанным исключительно реагентом для трансфекции без ASO).

На ФИГ. 1 показано определение изменений уровней мРНК TGF-β2 человека после обработки 20 нМ ASO (вместе с реагентом для трансфекции) относительно А549.

Результат эксперимента такой, как показан в Таблице 7 ниже:

Таблица 7

Экспериментальный пример 6. Определение изменений в уровнях мРНК TGF-β2 человека после обработки клеточных линий А549 и PANC-1 с помощью 1 мкл ASO (среда свободного поглощения)

Для клеточных линий А549 и PANC-1 каждым ASO обрабатывали в концентрации 1 мкМ в отсутствие реагентов для трансфекции (среда свободного поглощения) и сравнивали изменения уровней мРНК TGF-p2 через 24 часа.

Экспериментальный способ

Культуральную среду RPMI 1640+10% FBS+1% антибиотиков использовали для клеточной линии А549 (карцинома легкого) и культуральную среду DMEM+10% FBS+1% антибиотиков использовали для клеточной линии PANC-1 (эпителиоидная карцинома поджелудочной железы).

(2-2,5)×10⁵ клеток/1,8 мл клеток на лунку высевали в 6-луночный планшет.

Трансфекции

- Культивирование выполняли в течение 24 часов после посева клеток.

- ASO добавляли в культуральную среду, включающую 10% FBS, до достижения концентрации (10 мкм), в 10 раз превышающей концентрацию, которая подлежит конечной обработке.

- Смесь, включающую ASO, вносили по 200 мкл до достижения конечной концентрации 1 мкМ в планшет с клеточным посевом с последующим культивированием в течение 24 часов (СО₂-инкубатор (37°С, 5,0% СО₂)).

Количественный анализ мРНК TGF-β2

- Извлечение и количественное определение РНК: через 24 часа после трансфекции все культуральные растворы удаляли и выделяли РНК с помощью набора для приготовления РНК (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). После выделения РНК вычисляли концентрацию при OD_26OHM посредством метода измерения оптической плотности с использованием планшета для микрообъемов (Take 3, Biotek) и мультипланшетного анализатора (Synergy HI, Biotek).

- Синтез кДНК: кДНК синтезировали с 2 мкг извлеченной РНК, используя набор для синтеза кДНК (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Синтезированную кДНК разбавляли дистиллированной водой (DW) до 20 нг/мкл.

- Выполняли ПЦР в реальном времени для количественного анализа мРНК TGF-β2: в качестве эталонного гена использовали человеческий SRSF9 и затем готовили смесь для ПЦР с тем же составом и в тех же условиях, что и в Таблицах 4-6, для выполнения ПЦР.

- Результаты проверяли путем вычисления степени ингибирования экспрессии мРНК (%) человеческого TGF-β2 с относительным отношением к необработанным клеткам (клеточным линиям, обработанным только реагентами для трансфекции без ASO), где результаты для клеточной линии А549 показаны в Таблице 8 и на ФИГ. 2 ниже и результаты для клеточной линии PANC-1 показаны в Таблице 9 и на ФИГ. 3 ниже.

Таблица 8

Экспериментальный пример 7: Сравнение свободного поглощения в клеточной линии А549 с использованием 5'-флуоресцеинамидит(FAM)-ASO

Свободное поглощение (абсорбцию в среде, не содержащей реагентов для трансфекции) сравнивали в клеточных линиях А549, PANC-1 и А2058, используя ASO, меченный 5'-флуоресцеинамидитом (FAM).

Экспериментальный метод

Культуральную среду RPMI1640+10%FBS+1% антибиотиков использовали для клеточной линии А549 (карцинома легкого) и культуральную среду DMEM+10%FBS+1% антибиотиков использовали для клеточных линий PANC-1 (эпителиоидная карцинома поджелудочной железы) и А2058 (меланома).

Посев клеток:

4×10⁵ клеток/500 мкл клеток на лунку высевали в 4-луночное предметное стекло.

Трансфекция

Подлежащий тестированию ASO добавляли в каждую лунку по 200 мкл до достижения концентрации 1 мкМ в среде DMEM, включающей 10% FBS и 1% антибиотиков, с последующим культивированием в течение 24 часов (инкубатор с СО₂ при температуре 37°С, 5,0% CO₂).

Анализ FACS

Клетки разделяли путем обработки смесью трипсин-ЭДТА и промывали в PBS. После того, как клетки суспендировали в PBS, выполняли анализ с помощью клеточного сортировщика с активацией флуоресценции (FACS). Измеряли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) и сравнивали относительное содержание ASO, меченного FAM, в каждой клетке.

Результаты измерений MFI для клеточной линии А549, клеточной линии РАС-1 и клеточной линии А2058 показаны на ФИГ. 4, 5 и 6 соответственно.

В результате этого эксперимента было обнаружено, что все ASO, использованные в тестировании, хорошо поглощались клетками.

Экспериментальный Пример 8: Измерение стабильности после введения ASO в плазму человека

ASO добавляли в плазму человека и культивировали в течение 7 суток, после чего анализировали количество оставшегося ASO.

Экспериментальный метод

Добавление выполняли, чтобы допустить достижения конечной концентрации равной 5 мкМ ASO в плазме крови человека, и инкубировали в течение 7 суток в инкубаторе при температуре 37°С с вращением 40 об/мин. Образцы плазмы отбирали в разные моменты времени (сутки 0, 4 часа, сутки 1, сутки 2 и сутки 7) и количество оставшегося ASO анализировали посредством ВЭЖХ. Долю оставшегося количества ASO вычисляли, исходя из количества ASO, обнаруженного в час 0.

Результат эксперимента показан на ФИГ. 7.

Вещество ASO по настоящему изобретению имело значительно увеличенную стабильность по сравнению с ASO в чистом виде (А002 и А004) и было обнаружено, что более чем 80% остается в плазме даже через 7 суток.

Экспериментальный Пример 9: Идентификация изменений уровней высвобождения мРНК и белка после обработки концентрацией ASO в присутствии реагента для трансфекции клеточных линий А549 (5-160 нМ)

После обработки клеточных линий А549 при помощи ASO в определенной концентрации (0 нМ, 5 нМ, 20 нМ, 80 нМ) в присутствии реагентов для трансфекции проверяли изменения уровней мРНК и уровней высвобождения белка TGF-β2.

Экспериментальный метод

Для клеточной линии А549 (карцинома легкого) использовали культуральную среду RPMI 1640+10% FBS+1% антибиотиков.

В 6-луночный планшет высевали 2×10⁵ клеток/2 мл клеток на лунку.

Трансфекции

- Через 24 часа после посева клеток среду заменяли (после удаления существующего культурального раствора добавляли 1,8 мл среды, содержащей 10% FBS без антибиотиков). Подлежащий тестированию ASO разбавляли в простой среде до концентрации, в 20 раз превышающей концентрацию для обработки.

- Реагент для трансфекции (липофектамин RNAiMAX) также разбавляли обычной средой до достижения концентрации 7,5 мкл/100 мкл.

- Смесь, включающую предварительно разбавленный ASO, и смесь, включающую реагент для трансфекции, смешивали в объемном соотношении 1:1 и приводили во взаимодействие при комнатной температуре в течение 5 минут.

- Для достижения заданной конечной концентрации смесь прореагировавшего ASO и реагента для трансфекции вносили по 200 мкл в клеточную линию с замененной средой с последующим культивированием в течение 24 часов (CO₂-инкубатор (37°С, 5,0% CO₂)).

- Среду заменяли на 1 мл среды, которая включает 1% FBS без антибиотиков, с последующим культивированием в течение 48 часов (CO₂-инкубатор (37°С, 5,0% CO₂)).

Количественный анализ мРНК TGF-β2:

- Извлечение и количественное определение РНК: через 72 часа после трансфекции все культуральные растворы удаляли и выделяли РНК, используя набор для приготовления РНК (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). После извлечения РНК вычисляли концентрацию путем измерения оптической плотности при OD_26OHM, используя планшет для микрообъемов (Take 3, Biotek) и мультипланшетный анализатор (Synergy H1, Biotek).

- Синтез кДНК: кДНК синтезировали с 2 мкг выделенной РНК, используя набор для синтеза кДНК (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Синтезированную кДНК разбавляли до 20 нг/мкл дистиллированной водой (DW).

- Выполнение ПЦР в реальном времени для количественного анализа мРНК TGF-J32: в качестве эталонного гена использовали человеческий SRSF9. Смесь для ПЦР готовили в таком же составе и в тех же условиях, что и в Таблицах 4-6 выше, и выполняли ПЦР.

Количественный анализ экспрессии белка TGF-β2 (ELISA)

- Отдельно собранный культуральный раствор центрифугировали, отбирали только надосадочную жидкость и проводили количественный анализ согласно инструкции производителя, используя набор для ELISA TGF-β2 (R&D).

Результат эксперимента показан на ФИГ. 8. В результате эксперимента было определено, что ASO по настоящему изобретению снижает уровни мРНК TGF β2 человека и уровни секреции зависимым от концентрации образом.

Экспериментальный Пример 10: Определение ингибирования мРНК TGF-β2 человека после обработки ASO в зависимости от концентрации в отсутствие реагента для трансфекции (условие свободного поглощения)

После обработки ASO клеточных линий А549, PANC-1 и А2058 в концентрации (3,9 нМ-4000 нМ) в условиях свободного поглощения без реагентов для трансфекции проверяли изменения уровней мРНК человеческого TGF-β2 по сравнению с необработанными клетками.

Экспериментальный метод

Культуральную среду RPMI1640+10% FBS+1% антибиотиков использовали для клеточной линии А549 (карцинома легкого) и культуральную среду DMEM+10% FBS+1% антибиотиков использовали для клеточных линий PANC-1 (эпителиоидная карцинома поджелудочной железы) и А2058 (меланома).

В 6-луночный планшет высевали (2~2,5)×10⁵ клеток/2 мл клеток на лунку.

Трансфекция

- Через 24 часа после посева клеток среду заменяли (после удаления существующего культурального раствора добавляли 1,8 мл среды, включающей 10% FBS без антибиотиков). Подлежащий тестированию ASO разбавляли в обычной среде до концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию, подлежащую обработке.

- Для достижения заданной конечной концентрации смесь, включающую предварительно разбавленный ASO, вносили по 200 мкл в линию клеток с замененной питательной средой с последующим культивированием в течение 48 часов (СО₂-инкубатор (37°С, 5,0% CO₂)).

Количественный анализ мРНК TGF-β2

- Выделение и количественное определение РНК: через 48 часов после трансфекции все культуральные растворы удаляли и выделяли РНК, используя набор для приготовления РНК (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). После выделения РНК вычисляли концентрацию посредством способа измерения оптической плотности при OD_26OHM с использованием планшета для микрообъемов (Take 3, Biotek) и мультипланшетного анализатора (Synergy H1, Biotek).

- Синтез кДНК: кДНК синтезировали с 2 мкг выделенной РНК, используя набор для синтеза кДНК (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Синтезированную кДНК разбавляли до 20 нг/мкл, используя дистиллированную воду (DW).

- Выполнение ПЦР в реальном времени для количественного анализа мРНК TGF-J32: в качестве эталонного гена использовали человеческий SRSF9. Смесь для ПЦР готовили в таком же составе и в тех же условиях, что и в Таблицах 4-6 выше, и выполняли ПЦР.

Результат эксперимента для клеточной линии А549, клеточной линии РАС-1 и клеточной линии А2058 показан на ФИГ. 9, 10 и 11, соответственно.

В результате эксперимента А002-04М, А002-05М и А002-08М имели особенно хорошие эффекты ингибирования мРНК TGF-β2 для клеточной линии А549; А002-01М, А002-04М, А002-05М и А002-08М имели особенно превосходные эффекты ингибирования мРНК TGF-β2 для клеточной линии PANC-1; и А002-04М, А002-05М, А002-08М и А004-04М имели особенно хорошие эффекты ингибирования мРНК TGF-β2 для клеточной линии А2058.

Экспериментальный Пример 11: Определение изменений уровней мРНК TGF-β2 человека после обработки ASO в отсутствие реагента для трансфекции (условие свободного поглощения) для клеточных линий различных карцином

Клеточные линии из различных карцином обрабатывали ASO и через 24 или 72 часа определяли снижение уровней мРНК TGF-p2.

Экспериментальный метод

Клеточная линия объекта эксперимента и используемая среда являются такими, как показано в Таблице 2 выше.

В 6-луночный планшет высевали (2~2,5)×10⁵ клеток/2 мл клеток на лунку.

Трансфекция

- Через 24 часа после посева клеток добавляли 1,8 мл среды, содержащей 1% FBS.

- Подлежащий тестированию ASO разбавляли в простой среде до концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию для обработки.

- Для достижения заданной конечной концентрации смесь, включающую предварительно разбавленный ASO, вносили по 200 мкл в клеточную линию с замененной средой с последующим культивированием в течение 24 или 72 часов. (СО₂-инкубатор (37°С, 5,0% CO₂)).

Количественный анализ мРНК TGF-β2

- Выделение и количественное определение РНК: через 48 часов после трансфекции все культуральные растворы удаляли и выделяли РНК, используя набор для приготовления РНК (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). После выделения РНК вычисляли концентрацию при OD_26OHM посредством способа измерения оптической плотности с использованием микропланшета для микрообъемов (Take 3, Biotek) и мультипланшетного анализатора (Synergy H1, Biotek).

- Синтез кДНК: кДНК синтезировали с 2 мкг выделенной РНК, используя набор для синтеза кДНК (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Синтезированную кДНК разбавляли до 20 нг/мкл дистиллированной водой (DW).

- Выполнение ПЦР в реальном времени для количественного анализа мРНК TGF-J32: в качестве эталонного гена использовали человеческий SRSF9. Смесь для ПЦР готовили с таким же составом и в тех же условиях, что и в Таблицах 4-6 выше, и выполняли ПЦР.

Степень ингибирования мРНК (%) человеческого TGF-p2 вычисляли с относительным отношением к необработанным клеткам (клеточным линиям, обработанным исключительно реагентами для трансфекции без ASO).

Результаты эксперимента для каждой клеточной линии показаны на ФИГ. 12-18.

В результате эксперимента обнаружили, что уровни мРНК hTGF-p2 значительно снижались в различных карциномах (рак легких, холангиокарцинома, трижды негативный рак молочной железы, меланома, рак поджелудочной железы и глиобластома) у А002-04М или А002-05М.

Экспериментальный Пример 12: Оценка противораковой эффективности на гуманизированных ксенотрансплантатных мышиных моделях с трансплантированной клеточной линией меланомы А2058.

Гуманизированная модель ксенотрансплантата А2058:

Мышь: мыши с иммунодефицитом NSG-b2m, самки в возрасте 5-7 недель, по 6 мышей в группе.

После получения мышей их приручали в течение недели.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС: Zenbio, Cat# SER-PBMC-200-F) трансплантировали путем внутривенного (вв) введения в количестве 1×10⁷ клеток на мышь.

Через 5 суток после трансплантации РВМС клеточную линию А2058 трансплантировали путем подкожного введения 2×10⁶ клеток на мышь.

Через 5 дней после трансплантации клеточной линии А2058 приступали к введению посредством внутрибрюшинной инъекции ASO по настоящему изобретению:

Лечение: 3 раза в неделю в дозировке 30 мг/кг и с объемом введения 10 мл/кг (т.е. концентрация раствора для инъекций составляет 30 мг/10 мл).

Наблюдение: измерение массы тела и объема опухоли два раза в неделю.

Общая схема эксперимента для наборов А, В и С, приведенных ниже, аналогична, но отличается каждым донором трансплантированных РВМС

Схема эксперимента для каждой группы для наборов А, В и С показана в Таблицах 10-12 ниже:

Кривая роста опухоли для каждого набора показана на ФИГ. 19-21. Степень ингибирования роста опухоли (IR) для каждого набора показана в Таблицах 13-15 ниже:

По результатам данного эксперимента определили, что степень ингибирования роста опухоли после введения ASO согласно настоящему изобретению, является более высокой, чем иммунотерапевтический эффект от РВМС.

Промышленная применимость

Олигонуклеотид по настоящему изобретению можно использовать в качестве противоракового средства благодаря подавлению экспрессии TGF-(32.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применимо в медицине. Изобретение раскрывает новые антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один модифицированный нуклеотид из олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1-3 и способные эффективно ингибировать экспрессию белка TGF-β2. Антисмысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению обладают улучшенной стабильностью в плазме в сравнении с олигонуклеотидами, не содержащими модификаций. Антисмысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы в терапии заболеваний, связанных с патологической экспрессией TGF-β2, в том числе и различных видов рака. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 21 ил., 15 табл., 12 пр.

1. Олигонуклеотид для ингибирования экспрессии мРНК TGF-β (трансформирующий фактор роста бета), который представляет собой антисмысловой олигонуклеотид c любой из SEQ ID NO: 1-3,

где по меньшей мере один нуклеотид олигонуклеотида представляет собой нуклеотид, имеющий модифицированный нуклеозид, и

модифицированный нуклеотид представляет собой модифицированный 2'-О-метоксиэтилом (MOE) нуклеотид.

2. Олигонуклеотид по п. 1, где один или более нуклеотидов на 5'-конце или один или более нуклеотидов на 3'-конце олигонуклеотида представляют собой модифицированные нуклеотиды.

3. Олигонуклеотид по п. 1, где один или более нуклеотидов на 5'-конце и один или более нуклеотидов на 3'-конце олигонуклеотида представляют собой модифицированные нуклеотиды.

4. Олигонуклеотид по п. 2, где нуклеотиды от первого до n-го на 5'-конце олигонуклеотида или нуклеотиды от первого до m-го на 3'-конце олигонуклеотида представляют собой модифицированные нуклеотиды (здесь каждый из n и m независимо представляет собой целое число от 1 до 10).

5. Олигонуклеотид по п. 3, где нуклеотиды от первого до n-го на 5'-конце олигонуклеотида и нуклеотиды от первого до m-го на 3'-конце олигонуклеотида представляют собой модифицированные нуклеотиды.

6. Олигонуклеотид по п. 5, который дополнительно содержит один или более модифицированных нуклеотидов между (n+1)-м нуклеотидом на 5'-конце и (m+1)-м нуклеотидом на 3'-конце олигонуклеотида.

7. Олигонуклеотид для ингибирования экспрессии мРНК TGF-β, который представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, представленный любой из SEQ ID NO: 1-30, в котором модифицированный нуклеотид представляет собой модифицированный 2'-MOE нуклеотид.

8. Олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, где связь между соседними нуклеозидами представляет собой либо фосфодиэфирную, либо фосфотиоатную связь.

9. Олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, где связь между соседними нуклеозидами представляет собой фосфотиоатную связь.

10. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая олигонуклеотид по п. 8.