СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ К CD73 И ИХ ВАРИАНТОВ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 C07K16/40 C07K19/00 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 G01N33/53 A61P29/00 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к антителам к CD73, их вариантам или мутантам или их антигенсвязывающим фрагментам и способам их применения при лечении видов рака человека.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] CD73, известный как экто-5'-нуклеотидаза (NT5E, ЕС 3.1.3.5), представляет собой связанный с гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) фермент клеточной поверхности массой 70 кДа, обнаруженный в большинстве тканей (Zhang В., Cancer Res., 70(16): 6407-6411, 2010). Считается, что CD73, первоначально определенный как дифференцировочный антиген лимфоцитов, функционирует в качестве косигнальной молекулы на Т-лимфоцитах и в качестве молекулы адгезии, которая важна для связывания лимфоцитов с эндотелием. Последние исследования показали, что CD73 участвует в контроле различных физиологических реакций, включающих эпителиальный транспорт ионов и жидкости, ишемическое прекондиционирование, повреждение тканей, функцию тромбоцитов, гипоксию и пропотевание жидкости из сосудов (Zhang В., Cancer Res., 70(16): 6407-6411 (2010)).

[0003] Были продемонстрированы иммуносупрессивные действия внеклеточного аденозина (Stagg J. et al., Oncogene, 29(39):5346-5358, 2010). Аденозин, взаимодействующий со своими рецепторами, может подавлять большинство функций иммунной клетки, включая цитотоксичность натуральных клеток-киллеров (NK), фагоцитоз макрофагов, Т-клеточную цитотоксичность и высвобождение цитокинов (Goto Т. et al., J. Immunol, 130(3): 1350-1355 (1983); Ohta A. et al., J. Immunol, 183(9): 5487-5493 (2009)). Блокада передачи сигналов аденозина может улучшать иммунотерапию. CD73 является ключевой молекулой, участвующей в передаче сигналов аденозина. CD73 гидролизует аденозинмонофосфат (AMP), продукт пути гидролиза аденозинтрифосфата (АТР), с помощью CD39, до аденозина, влияя на микроокружение опухоли (Allard В. et al., Immunol. Rev., 276(1): 121-144(2017); Resta R. et al., Immunol. Rev., 161: 95-109(1998)). Ось СВ73-аденозин представляет собой один из наиболее перспективных путей в иммуноонкологии.

[0004] Исследования показали, что CD73 участвует во взаимодействиях клетка-клетка и клетка-матрица, а также показали причастность CD73 к развитию лекарственной устойчивости и промоции опухоли (Spychala J., Pharmacol. Ther., 87(2-3): 161-173 (2000)). Подтверждена сверхэкспрессия CD73 в нескольких типах опухолевых клеток (Gao ZW. et al., Biomed. Res. Int., 2014: 460654 (2014)), и экспрессия коррелирует с неблагоприятным прогнозом или выживанием пациентов при некоторых видах рака (Loi S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110(27): 11091-11096 (2013); Turcotte M. et al., Cancer Res., 75(21): 4494-4503 (2015); Xiong L. et al., Cell Tissue Res., 355(2): 365-374 (2014)). В некоторых случаях лечение с применением моноклональных антител (mAb) к CD73 может ингибировать метастазирование и ангиогенез опухоли (Allard В. et al., Int. J. Cancer, 134(6): 1466-1473 (2014); Terp MG. et al., J. Immunol, 191(8): 4165-4173 (2013)). В дополнение исследователи продемонстрировали иммуносупрессивную роль оси СВ73-аденозин при раке, и при этом направленная блокада рецепторов CD73 или аденозина может эффективно активировать противоопухолевый иммунитет и повышать активность блокаторов иммунных контрольных точек первого поколения (Allard D. et al., Immunotherapy, 8(2): 145-163 (2016)).

[0005] В последние годы направленное воздействие на CD73 приводило к благоприятным противоопухолевым эффектам на доклинических моделях, а комбинированное лечение с применением блокады CD73 с другими иммуномодулирующими средствами является представляющим особенный интерес вариантом терапии (Antonioli L. et al., Trends Cancer, 2(2): 95-109 (2016)). Комбинация с mAb к CD73 может значительно усилить противоопухолевую активность mAb к CTLA-4 (антигену цитотоксического Т-лимфоцита 4) и mAb к PD-1 (белку запрограммированной гибели клеток 1) (Allard В. et al., Clin. Cancer Res., 19(20): 5626-5635 (2013)).

[0006] Однако, несмотря на успехи в исследованиях, направленных на CD73 и использование данного белка для улучшения клинических показателей, остается потребность в разработке эффективных, безопасных и сильнодействующих средств на основе антител, направленных против CD73. Данные потребности и другие потребности удовлетворяются посредством настоящего изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] В соответствии с целью(целями) настоящего изобретения, как реализовано в вариантах осуществления и широко описано в данном документе, настоящее изобретение в одном аспекте относится к антителам к CD73, их вариантам, мутантам и/или их антигенсвязывающим фрагментам, способам их получения, содержащим их фармацевтическим композициям и способам лечения субъекта-человека с их использованием. Например, раскрытые антитела к CD73 и их аффинные варианты и/или мутанты или антигенсвязывающие фрагменты можно использовать отдельно или в комбинации с другими средствами при лечении заболевания, связанного с экспрессией CD73, сверхэкспрессией CD73 и/или аномальной функцией CD73, такого как рак или фиброз. Предусмотренные в данном документе антитела также можно применять для обнаружения белка CD73 у пациентов или в образцах, взятых от пациентов, путем введения пациентам антител к CD73 и/или их аффинных вариантов/мутантов или их антигенсвязывающих фрагментов и обнаружения антитела к CD73 и/или его вариантов/мутантов или антигенсвязывающих фрагментов, связанных с белком CD73 в образце, взятом от пациента (например, in vivo или ex vivo), или путем приведения в контакт антител к CD73 и/или их вариантов/мутантов или антигенсвязывающих фрагментов с образцами, взятыми от пациентов, и качественного или количественного обнаружения антитела к CD73 и/или его аффинного варианта/мутанта или антигенсвязывающего фрагмента, связанного с белком CD73.

[0008] В настоящем изобретении предусмотрены антитела к CD73 и их варианты и/или антигенсвязывающие фрагменты. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены по меньшей мере восемнадцать (18) антител к CD73, их вариантов и/или их антигенсвязывающих фрагментов, а именно антитела к CD73 и/или варианты N1 и их варианты: N1№2, N1№2-P, N1№9 и N1№9-PH, вариант N2, варианты N4 и их варианты: N4№1, N4№4, N4№4-3, N4№5, N4№6, N4№6-2, N4№6-3, N4№6-3-P, N4№6-4, N4№6-4-P и N4№6-5. Последовательности нуклеиновых кислот и/или кодируемые ими аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи каждого из данных восемнадцати (18) антител к CD73 и/или их вариантов представлены в перечне последовательностей ниже. Последовательности CDR каждой легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3) и каждой тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) каждого антитела к CD73 и/или его варианта представлены ниже в таблицах 1 и 2 соответственно.

[0009] В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73 по настоящему изобретению содержит одну или несколько мутаций в сайтах N-гликозилирования его одной или нескольких CDR в вариабельных доменах. Полученное в результате дегликозилированное антитело сохраняет ту же функцию, что и исходное недегликозилированное антитело.

[0010] В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73 по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG, где легкая цепь состоит из указанной выше вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи антитела человека, где тяжелая цепь состоит из указанной выше вариабельной области тяжелой цепи и константной области тяжелой цепи антитела человека.

[0011] В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73 по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG, где легкая цепь состоит из указанной выше вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи антитела человека, и константная область легкой цепи представлена под SEQ ID NO. 115, где тяжелая цепь состоит из указанной выше вариабельной области тяжелой цепи и константной области тяжелой цепи антитела человека, где константная область тяжелой цепи является такой, как представлена под 112, 113 или 114.

[0012] В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73 по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG, где:

[0013] (вариант антитела N1№2-P) легкая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 93, а тяжелая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 116, или

[0014] (вариант антитела N1№9-PH) легкая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 94, а тяжелая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 117, или

[0015] (вариант антитела N4№6-3-P) легкая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 95, а тяжелая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 118, или

[0016] (вариант антитела N4№6-4-P) легкая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 96, а тяжелая цепь является такой, как представлена под SEQ ID NO. 119.

[0017] В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73 содержит последовательность Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv, диатела и линейного антитела. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело представляет собой полиспецифическое антитело.

[0018] В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73, его вариант или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73, его вариант или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с меткой. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, метка выбрана из группы, состоящей из радиоизотопа, флуоресцентного красителя и фермента.

[0019] В настоящем изобретении предусмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело к CD73, его вариант, мутант или антигенсвязывающий фрагмент согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше. Также предусмотрен вектор экспрессии, кодирующий молекулу нуклеиновой кислоты согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше. Также предусмотрены клетки, содержащие вектор экспрессии согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше. В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения антитела к CD73, его варианта или антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки согласно (или применительно к) любым из вариантов осуществления, приведенных выше, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клеточной культуры. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, клетки представляют собой стабильную клеточную линию млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, стабильная клеточная линия млекопитающего представляет собой клеточную линию СНО.

[0020] В определенном варианте осуществления предусмотрено выделенное антитело, которое специфически связывает CD73 человека на поверхности клетки, и которое способно нейтрализовать 5'-эктонуклеотидазную активность растворимых или мембраносвязанных белков CD73 человека. Антитело может индуцировать внутриклеточную интернализацию CD73.

[0021] В определенном варианте осуществления предусмотрено антитело, которое связывает растворимые или мембраносвязанные белки CD73 человека и способно ингибировать их ферментативную активность, где указанное антитело не интернализуется в клетки, экспрессирующие CD73.

[0022] В настоящем изобретении предусмотрена композиция, содержащая антитело к CD73, его вариант, мутант или антигенсвязывающий фрагмент согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0023] В настоящем изобретении предусмотрен способ обнаружения белка CD73 в образце от пациента посредством приведения в контакт антитела к CD73, его варианта, мутанта или антигенсвязывающего фрагмента согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, с образцом и обнаружения антитела к CD73, связанного с белком CD73. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, антитело к CD73, его вариант или антигенсвязывающий фрагмент применяют в иммуногистохимическом анализе (IHC) или в анализе ELISA.

[0024] Также предусмотрен способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества композиции согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше. Также предусмотрена композиция, содержащая антитело к CD73, его вариант, мутант или антигенсвязывающий фрагмент согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, для применения при лечении рака. Предусмотрено применение антитела к CD73, его варианта, мутанта или антигенсвязывающего фрагмента согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, при получении лекарственного средства для лечения рака, такого как рак, связанный с экспрессией CD73. [0025] В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, рак выбран из меланомы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака груди (например, рака молочной железы с тройным негативным фенотипом, TNBC), рака желудка, классической лимфомы Ходжкина (cHL), неходжкинской лимфомы, представляющей собой первичную медиастинальную В-клеточную лимфому (NHL PMBCL), мезотелиомы, рака яичника, рака легкого (например, мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака пищевода, носоглоточной карциномы (NPC), рака желчных путей, колоректального рака, рака шейки матки, рака щитовидной железы и рака слюнных желез. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, субъекту дополнительно вводят терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, средства, ингибирующего рост, и цитотоксического средства. В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вариантов осуществления, приведенных выше, к субъекту дополнительно применяют радиотерапию и/или хирургическое вмешательство.

[0026] Другие системы, способы, признаки и преимущества настоящего изобретения будут или станут очевидными для специалиста в данной области после изучения следующих графических материалов и подробного описания. Предполагается, что все такие дополнительные системы, способы, признаки и преимущества включены в данное описание, находятся в пределах объема настоящего изобретения и защищены прилагаемой формулой изобретения. В дополнение, все необязательные и предпочтительные признаки и модификации описанных вариантов осуществления можно использовать во всех аспектах настоящего изобретения, изложенного в данном документе. Более того, отдельные признаки зависимых пунктов формулы изобретения, а также все необязательные и предпочтительные признаки и модификации описанных вариантов осуществления можно комбинировать и взаимозаменять друг другом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0027] Многие аспекты настоящего изобретения можно лучше понять на основании следующих графических материалов.

[0028] Фиг. 1А-1В. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи (фиг. 1А) (на фиг. 1А раскрыты SEQ ID NO 79-81 соответственно, в порядке встречаемости) и тяжелой цепи (фиг. 1В) (на фиг. 1В раскрыты SEQ ID NO 97-99 соответственно, в порядке встречаемости) потенциальных вариантов N1, N2 и N4 антитела к CD73, выбранных путем пэннинга наивной фаговой библиотеки. Три выбранных потенциальных варианта антитела со связывающей и блокирующей активностью в отношении фермента CD73 идентифицировали посредством скрининга наивной фаг-дисплейной библиотеки Fab человека с применением CD73-ECD/His человека. Затем выбранные вариабельные последовательности клонировали в мутант L234F, L235E, P331S остова Fc IgG1 человека с получением полноразмерных антител. Выравнивание последовательностей потенциальных вариантов антител приведено в данном документе, a CDR (определяющие комплементарность области), определенные по Kabat, подчеркнуты и отмечены жирным шрифтом.

[0029] Фиг. 2А-2С. Связывание CD73 выбранными антителами. Выбранные антитела тестировали в отношении связывания с рекомбинантными белками CD73 человека посредством ELISA (фиг. 2А), CD73-экспрессирующих опухолевых клеток человека, клеток MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы человека) (фиг. 2В) и клеток NCI-H292 (мукоэпидермоидной карциномы легких человека) (фиг. 2С), посредством проточной цитометрии. Антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно.

[0030] Фиг. 3А-3В. Влияние потенциальных вариантов антитела к CD73 на ферментативную активность растворимого CD73 и ферментативную активность клеточного CD73. Антитела к CD73 тестировали в отношении их способности к ингибированию ферментативной активности человеческого рекомбинантного белка CD73 и CD73 клеточной поверхности. Рекомбинантные белки CD73 (фиг. 3А) и клетки NCl-Н292 (фиг. 3В) инкубировали с антителами к CD73, АТР и AMP. Концентрацию AMP в образце определяли посредством анализа CellTiter-Glo. Значение показаний люминесценции обозначает ферментативную активность CD73. Антитело к CD73 ref-1 и АРСР использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0031] Фиг. 4. Интернализация CD73, опосредованная потенциальными вариантами антитела к CD73. Экспрессию CD73 на клеточной поверхности измеряли посредством проточной цитометрии после обработки антителом к CD73. Антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

[0032] Фиг. 5А-5С. Связывание CD73 выбранными антителами с различными Fc-областями IgG. Вариабельные последовательности N1, N2 и N4 также клонировали в остов Fc IgG2 человека дикого типа или мутантного C219S. Различные изотипы IgG, представляющие собой N1 (фиг. 5А), N2 (фиг. 5В), N4 (фиг. 5С), тестировали в отношении связывания с экспрессирующими CD73 клетками MDA-MB-231 человека посредством проточной цитометрии. Антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

[0033] Фиг. 6А-6С. Влияние потенциальных вариантов антитела к CD73 с различными Fc-областями IgG на ферментативную активность клеточного CD73. Потенциальные варианты антитела к CD73, N1 (фиг. 6А), N2 (фиг. 6В), N4 (фиг. 6С), с различными изотипами IgG тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность клеточного CD73. Клетки MDA-MB-231 инкубировали с антителами к CD73. Добавляли ATP, AMP и реагент CellTiter-Glo и регистрировали люминесценцию. АРСР использовали в качестве положительного контроля в анализе ферментативной активности.

[0034] Фиг. 7А-7С. Интернализация CD73, опосредованная антителами к CD73 с различными Fc-областями IgG. После инкубации клеток с N1 (фиг. 7А), N2 (фиг. 7В) и N4 (фиг. 1С) с различными изотипами IgG экспрессию CD73 на клеточной поверхности измеряли посредством проточной цитометрии. Антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

[0035] Фиг. 8А-8В. Активность потенциальных вариантов антитела к CD73 в отношении подавления роста опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата MDA-MB-231 (рака молочной железы человека с тройным негативным фенотипом). Мышам (n=5 мышей/группа) подкожно прививали клетки MDA-MB-231. Первую дозу исследуемого антитела вводили через 14 дней после инокуляции опухоли, когда размер привитой опухоли достигал 150-300 мм³. Мышам внутрибрюшинно вводили антитела в дозе 5 мг/кг в указанное время. Кривые роста опухоли показаны на фиг. 8А. Объем отдельных опухолей в день 45 представлен на фиг. 8В. Все экспериментальные точки представляют собой средние значения ± SEM.

[0036] Фиг. 9. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи вариантов N1 и N4, полученных в результате созревания аффинности. Варианты N1 и N4 с лучшей аффинностью связывания с CD73 и блокирующей активностью в отношении растворимого фермента CD73 идентифицировали в экспериментах in vitro по созреванию аффинности на основе фагового дисплея. CDR (определяющие комплементарность области), определенные по Kabat, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. На фиг. 9 раскрыты последовательности под SEQ ID NO 82-85, 88, 86-87 и 89-92 соответственно, в порядке встречаемости.

[0037] Фиг. 10. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи вариантов N1 и N4, полученных в результате созревания аффинности. Варианты N1 и N4 с лучшей аффинностью связывания с CD73 и блокирующей активностью в отношении растворимого фермента CD73 идентифицировали в экспериментах in vitro по созреванию аффинности на основе фагового дисплея. CDR (определяющие комплементарность области), определенные по Kabat, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. Затем данные выбранные вариабельные последовательности клонировали в остов человеческого Fc IgG2 с получением полноразмерных антител. На фиг. 10 раскрыты последовательности под SEQ ID NO 100-103, 106, 104-105 и 107-110 соответственно, в порядке встречаемости.

[0038] Фиг. 11А-11В. Связывание CD73 вариантами N1 и N4. Выбранные варианты тестировали в отношении связывания с CD73-экспрессирующими клетками MDA-MB-231 (фиг. 11А) и клетками NCI-H292 (фиг. 11В) посредством проточной цитометрии. HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0039] Фиг. 12. Влияние вариантов N1 и N4 на ферментативную активность иммобилизованного CD73. Варианты N1 и N4 тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность иммобилизованного CD73. После инкубации антител к CD73 и белков CD73 добавляли ATP, AMP и реагент CellTiter-Glo и регистрировали люминесценцию. Антитело к CD73 ref-1, антитело к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролен, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0040] Фиг. 13. Интернализация CD73, опосредованная вариантами N1 и N4 антитела. Клетки NCI-H292 инкубировали с вариантами N1 и N4, и экспрессию CD73 на клеточной поверхности измеряли посредством проточной цитометрии. Антитело к CD73 ref-1 и антитело к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0041] Фиг. 14. Выравнивание аминокислотных последовательностей легкой цепи наиболее перспективных вариантов N1 и N4. CDR (определяющие комплементарность области), определенные по Kabat, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. На фиг. 14 раскрыты последовательности под SEQ ID NO 93-96 соответственно, в порядке встречаемости.

[0042] Фиг. 15. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи наиболее перспективных вариантов N1 и N4. CDR (определяющие комплементарность области), определенные по Kabat, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. Затем данные последовательности клонировали в остов Fc IgG2 человека с получением полноразмерных антител. На фиг. 15 раскрыты последовательности под SEQ ID NO 111, 101 и 108-109 соответственно, в порядке встречаемости.

[0043] Фиг. 16А-16С. CD73-связывающая способность наиболее перспективных вариантов N1 и N4. Антитела к CD73 тестировали в отношении связывания с рекомбинантными человеческими белками CD73 посредством ELISA (фиг. 16А) и экспрессирующими CD73 опухолевыми клетками человека, MDA-MB-231 (фиг. 16В) и NCI-H292 (фиг. 16С), посредством проточной цитометрии. Антитела к CD73 ref-1 и к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0044] Фиг. 17А-17С. Влияние наиболее перспективных вариантов N1 и N4 на ферментативную активность растворимого CD73 (фиг. 17А) и ферментативную активность CD73 клеточной поверхности (фиг. 17В, фиг. 17С). Антитела к CD73 тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность человеческого рекомбинантного белка CD73 и CD73 клеточной поверхности. Рекомбинантные белки CD73 (фиг. 17А), клетки MDA-MB-231 (фиг. 17В) и NCI-H292 (фиг. 17С) инкубировали с антителами к CD73. Добавляли ATP, AMP и CellTiter-Glo и регистрировали люминесценцию. Антитело к CD73 ref-1, антитело к CD73 ref-2 и АРСР использовали в качестве положительных контролей. HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0045] Фиг. 18А-18В. Интернализация CD73, опосредованная наиболее перспективными вариантами N1 и N4 антитела. Клетки MDA-MB-231 (фиг. 18А) и NCI-H292 (фиг. 18В) инкубировали с вариантами N1 и N4 антитела к CD73. После инкубации экспрессию CD73 на клеточной поверхности измеряли посредством проточной цитометрии. Антитела к CD73 ref-1 и к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0046] Фиг. 19А-19В. Нейтрализация супрессивного влияния AMP на активность Т-клеток с помощью наиболее перспективных вариантов N1 и N4. Выделенные Т-клетки человека культивировали с гранулами CD3/CD28, AMP и последовательно разбавленными антителами в течение 4 дней при 37°С. За пролиферацией CD3⁺ Т-клеток следили посредством анализа CellTiter-Glo (фиг. 19А), и секрецию IFN-γ измеряли с применением наборов Human IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe (фиг. 19В). Антитела к CD73 ref-1 и к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX04 (антитело к VEGF) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0047] Фиг. 20. Активность наиболее перспективных вариантов N1 и N4 в отношении ингибирования роста опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата MDA-MB-231 (рака молочной железы человека с тройным негативным фенотипом). Мышам (n=5 мышей/группа) подкожно прививали клетки MDA-MB-231. Первую дозу тестируемого варианта антитела вводили через 7 дней после инокуляции опухоли, когда размер привитой опухоли достигал приблизительно 100 мм³. Мышам внутрибрюшинно вводили антитела в дозе 10 мг/кг и 2 мг/кг два раза в неделю в течение 5-6 недель. Все экспериментальные точки представляют собой средние значения ± SEM.

[0048] Фиг. 21. Активность наиболее перспективных вариантов N1 и N4 в отношении подавления роста опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата NCI-H292 (мукоэпидермоидной карциномы легкого человека). Мышам (n=5 мышей/группа) подкожно прививали клетки NCI-H292. Первую дозу исследуемого варианта антитела вводили через 3 дня после инокуляции опухоли. Мышам внутрибрюшинно вводили антитела в дозах 50, 10 и 2 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель. Все экспериментальные точки представляют собой средние значения ± SEM.

[0049] Фиг. 22. Влияние наиболее перспективных вариантов N1 и N4 на ферментативную активность клеточного CD73 в ксенотрансплантатных опухолях NCI-H292. Наиболее перспективные варианты N1 и N4 тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность CD73 в ксенотрансплантатной модели NCI-H292. Мышам (n=4 мыши/группа) подкожно прививали клетки NCI-H292 за 4 дня до обработки антителом. Антитела, АРСР и плацебо вводили внутрибрюшинно в день 0. Резекцию опухолей проводили в дни 1, 3 и 7 после введения антитела. Ферментативную активность CD73 в опухолях измеряли посредством анализа CellTiter-Glo.

[0050] Фиг. 23А-23В. Влияние наиболее перспективных вариантов N1 и N4 на экспрессию CD73 и ферментативную активность клеточного CD73 в ксенотрансплантатных опухолях MDA-MB-231. Антитела к CD73 тестировали в отношении их способности снижать поверхностную экспрессию CD73 и ингибировать ферментативную активность CD73 в ксенотрансплантатной модели MDA-MB-231. Мышам (n=4 мыши/группа) подкожно прививали клетки MDA-MB-231 за 7 дней до обработки антителом. Антитела и плацебо вводили в день 0. Опухоли собирали в дни 1, 3 и 7 после введения антитела. Экспрессию CD73 измеряли по средней интенсивности флуоресценции (MFI) при окрашивании (фиг. 23А), а ферментативную активность CD73 в опухолях измеряли посредством анализа CellTiter-Glo (фиг. 23В).

[0051] Фиг. 24А-24В. Перекрестное связывание наиболее перспективных вариантов N1 и N4 с экспрессирующими CD73 клетками мыши и обезьяны. Антитела к CD73 тестировали в отношении связывания с экспрессирующими CD73 клетками 4Т1 карциномы молочной железы мыши (фиг. 24А) и эпителиальными клетками LLC-MK2 почки обезьяны (фиг. 24В) посредством проточной цитометрии. HLX01 использовали в качестве отрицательного контроля.

[0052] Дополнительные преимущества настоящего изобретения будут частично изложены в нижеследующем описании, а частично будут явным образом следовать из описания или могут быть установлены при практическом использовании настоящего изобретения. Преимущества настоящего изобретения будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и последующее подробное описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают настоящее изобретение, описанное в формуле изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0053] Настоящее изобретение в одном аспекте относится к антителам к CD73, их вариантам, мутантам и/или их антигенсвязывающим фрагментам, способам их получения, содержащим их фармацевтическим композициям и способам лечения субъекта-человека с их использованием. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено, что антитела к CD73 специфически связываются с CD73 и могут ингибировать рост опухоли посредством индукции опосредованного макрофагами фагоцитоза. Раскрытые антитела демонстрируют повышенную эффективность и/или противоопухолевую активность по сравнению с обычными моноклональными антителами к CD73, применяемыми для лечения клинических состояний, таких как рак или фиброз. Также предусмотрены иммуноконъюгаты, нуклеиновые кислоты, кодирующие новые антитела к CD73, их аффинные варианты или их антигене вязы вающие фрагменты, описанные в данном документе, и композиции (такие как фармацевтические композиции).

[0054] В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены по меньшей мере восемнадцать (18) антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или антигенсвязывающих фрагментов, а именно антител к CD73, вариантов и/или мутантов, которые обозначены, как показано в таблицах 1 и 2. Последовательности нуклеиновых кислот и/или кодируемые ими аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи каждого из данных антител к CD73, их вариантов и/или мутантов представлены в разделе "Раскрытые последовательности - перечень последовательностей" ниже в данном документе. Последовательности CDR каждой легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3) и каждой тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) каждого антитела к CD73, его варианта и/или мутанта представлены в таблицах 1 и 2 соответственно. [0055] В настоящем изобретении также предусмотрены способы применения новых антител к CD73, их аффинных вариантов и/или мутантов или антигенсвязывающих фрагментов для обнаружения CD73 в образце (таком как образец in vivo или ex vivo), и/или композиции, содержащие такие антитела, их варианты и/или мутанты, или антигенсвязывающие фрагменты, для применения при лечении клинического состояния или заболевания, связанного с экспрессией CD73, сверхэкспрессией CD73 и/или аномальной функцией CD73, такого как рак или фиброз. В других вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73 и их аффинные варианты и/или мутанты или антигенсвязывающие фрагменты можно использовать в комбинации с другими средствами при лечении заболевания, связанного с экспрессией CD73, сверхэкспрессией CD73 и/или аномальной функцией CD73, такого как рак или фиброз. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение таких антител, их вариантов или антигенсвязывающих фрагментов при получении лекарственного средства для лечения рака.

[0056] Предусмотренные в данном документе антитела также можно применять для обнаружения белка CD73 у пациентов или в образцах, взятых от пациентов, путем введения пациентам антител к CD73 и/или их аффинных вариантов/мутантов или их антигенсвязывающих фрагментов и обнаружения антитела к CD73 и/или его вариантов/мутантов или антигенсвязывающих фрагментов, связанных с белком CD73 в образце, взятом от пациента (например, in vivo или ex vivo), или путем приведения в контакт антител к CD73 и/или их вариантов/мутантов или антигенсвязывающих фрагментов с образцами, взятыми от пациентов, и качественного или количественного обнаружения антитела к CD73 и/или его аффинного варианта/мутанта или антигенсвязывающего фрагмента, связанного с белком CD73.

[0057] Специалисту в данной области будут очевидны многие модификации и другие варианты осуществления, раскрытые в данном документе, к которым относятся раскрытые композиции и способы, благодаря идеям, представленным в предшествующем описании и связанных графических материалах. Следовательно, следует понимать, что настоящее изобретение не должно ограничиваться конкретными раскрытыми вариантами осуществления и что модификации и другие варианты осуществления, как предполагается, включены в объем прилагаемой формулы изобретения. Квалифицированный специалист в данной области распознает множество вариантов и адаптации аспектов, описанных в данном документе. Данные варианты и адаптации, как предполагается, включены в идеи настоящего изобретения и охватываются формулой изобретения, представленной в данном документе.

[0058] Хотя в данном документе употребляются специальные термины, они используются только в общем и описательном смысле, а не в целях ограничения.

[0059] Как будет очевидно специалистам в данной области после прочтения настоящего изобретения, каждый из отдельных вариантов осуществления, описанных и проиллюстрированных в данном документе, имеет дискретные компоненты и признаки, которые можно легко отделить от признаков любого из нескольких других вариантов осуществления или комбинировать с ними без отклонения от объема или сущности настоящего изобретения.

[0060] Любой изложенный способ может выполняться в порядке изложения событий или в любом другом логически возможном порядке. То есть, если прямо не указано иное, никоим образом не подразумевается, что какой-либо способ или аспект, изложенный в данном документе, должен истолковываться как предусматривающий выполнение его стадий в определенном порядке. Соответственно, если в формуле изобретения или описании способа конкретно не указано, что стадии должны ограничиваться определенным порядком, это никоим образом не подразумевает, что порядок должен определяться так или иначе. Это справедливо для любой возможной неявной основы для интерпретации, включая вопросы логики в отношении порядка расположения стадий или технологической схемы, простого значения, определяемого на основе грамматической организации или пунктуации, или количества или типа аспектов, изложенных в описании изобретения.

[0061] Все ссылки, цитируемые в данном документе, включая заявки на патент и патентные публикации, полностью включены в данный документ посредством ссылок. Рассматриваемые в данном документе публикации приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в данном документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права датировать такую публикацию более ранней датой в силу предшествующего настоящего изобретения. Дополнительно, указанные в данном документе даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, что может потребовать независимого подтверждения.

[0062] Хотя аспекты настоящего изобретения могут быть описаны и заявлены в конкретной установленной законом категории, такой как системная установленная законом категория, это сделано только для удобства, и специалист в данной области поймет, что каждый аспект настоящего изобретения может быть описан и заявлен в любой установленной законом категории.

[0063] Также следует понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных аспектов и не предполагает ограничения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относятся раскрытые композиции и способы. Далее будет понятно, что термины, такие как те, которые определены в общеупотребительных словарях, должны интерпретироваться как имеющие значение, которое согласуется с их значением в контексте описания изобретения и соответствующей области техники, и не должны интерпретироваться в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если явным образом не определены в данном документе.

[0064] Перед описанием различных аспектов настоящего изобретения приведены следующие определения, которые следует использовать, если не указано иное. Дополнительные термины могут быть определены в другом месте настоящего изобретения. Определения

[0065] Следует понимать, что аспекты и варианты осуществления по настоящему изобретению, описанные в данном документе, включают аспекты и варианты осуществления терминов "содержащий", "состоящий" и "состоящий по сути из".

[0066] Используемый в данном документе термин "содержащий" следует интерпретировать как определяющий наличие указанных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, но не исключающий наличие или добавление одного или нескольких признаков, целых чисел, стадий или компонентов, или их групп. Более того, каждый из терминов "с помощью", "содержащий", "содержит", "состоящий из", "включающий", "включает", "включенный", "вовлекающий", "вовлекает", "вовлеченный" и "такой как" используется в его открытом, неограничивающем смысле, и данные термины могут использоваться взаимозаменяемо. Дополнительно, термин "содержащий" предназначен для включения примеров и аспектов, охватываемых терминами "состоящий по существу из" и "состоящий из". Аналогичным образом, термин "состоящий по сути из" предназначен для включения примеров, охватываемых термином "состоящий из".

[0067] Следует отметить, что соотношения, концентрации, количества и другие числовые данные в данном документе могут выражаться в формате диапазона. Дополнительно следует понимать, что конечные точки каждого из диапазонов являются значимыми как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Также следует понимать, что существует ряд значений, раскрытых в данном документе, и что каждое значение также раскрыто в данном документе как "приблизительно" данное конкретное значение в дополнение к самому значению. Например, если раскрывается значение "10", то также раскрывается значение "приблизительно 10". В данном документе диапазоны могут быть выражены как от "приблизительно" одного конкретного значения и/или до "приблизительно" другого конкретного значения. Аналогичным образом, когда значения выражаются в виде приближений с применением антецедента "приблизительно", следует понимать, что конкретное значение формирует дополнительный аспект. Например, если раскрыто значение "приблизительно 10", то также раскрыто значение "10".

[0068] При выражении диапазона дополнительный аспект включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Например, если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из данных включенных пределов, также включены в настоящее изобретение, например, фраза "от х до у" включает диапазон от 'х' до 'у', а также диапазон больше чем 'х' и меньше чем 'у'. Диапазон также может выражаться в виде верхнего предела, например, 'приблизительно х, у, z или менее', и должен интерпретироваться как включающий конкретные диапазоны 'приблизительно х', 'приблизительно у' и 'приблизительно z', а также диапазоны 'меньше чем х', 'меньше чем у' и 'меньше чем z'. Аналогично, фраза 'приблизительно х, у, z или более' должна интерпретироваться как включающая конкретные диапазоны 'приблизительно х', 'приблизительно у' и 'приблизительно z', а также диапазоны 'больше чем х', 'больше чем у' и 'больше чем z'. В дополнение, фраза от "приблизительно 'х' до 'у'", где 'х' и 'у' представляют собой числовые значения, включает от "приблизительно 'х' до приблизительно 'у'''.

[0069] Следует понимать, что такой формат диапазона используется для удобства и краткости, и, следовательно, его следует интерпретировать гибко, с включением не только числовых значений, явно указанных в виде пределов диапазона, но также с включением всех отдельных числовых значений или поддиапазонов, входящих в этот диапазон, как если бы каждое числовое значение и поддиапазоны явно указывались. В качестве иллюстрации числовой диапазон "от приблизительно 0,1% до 5%" следует интерпретировать с включением не только явно указанных значений от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, но также с включением отдельных значений (например, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3% и приблизительно 4%) и поддиапазонов (например, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,1%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,4%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 3,2% и от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,4%, и других возможных поддиапазонов) в пределах указанного диапазона.

[0070] Используемые в данном документе термины "приблизительно", "примерно", "составляющий или приблизительно" и "по сути" означают, что рассматриваемое количество или значение может являться точным значением или значением, которое обеспечивает результаты или эффекты, эквивалентные указанным в формуле изобретения или изложенным в данном документе. Упоминание "приблизительно" значения или параметра в данном документе относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, хорошо известному специалисту в данной области техники. То есть следует понимать, что количества, размеры, составы, параметры и другие величины и характеристики не являются точными и не обязательно должны быть точными, но могут являться приблизительными и/или большими или меньшими, произвольно, отражая допуски, коэффициенты пересчета, округление, погрешность измерения и т.п., а также другие факторы, известные специалистам в данной области техники, позволяющие получить эквивалентные результаты или эффекты. В некоторых случаях значение, обеспечивающее эквивалентные результаты или эффекты, невозможно обоснованно определить. В таких случаях в контексте данного документа обычно подразумевается, что термины "приблизительно" и "составляющий или приблизительно" означают номинальное значение, указанное с отклонением ± 10%, если иное не указано или не предполагается. В целом, количество, размер, состав, параметр или другая величина или характеристика представляют собой "приблизительно", "примерно" или "составляющий или приблизительно" значение, независимо от того, указано ли это явным образом или нет. Следует понимать, что если термины "приблизительно", "примерно" или "составляющий или приблизительно" используются перед количественным значением, параметр также включает само конкретное количественное значение, если специально не указано иное. То есть упоминание "приблизительного" значения или параметра в данном документе включает (и описывает) аспекты, которые направлены на это значение или параметр per se. Например, описание, в котором упоминается "приблизительно X" включает описание "X".

[0071] Используемые в данном документе термины "необязательный" или "необязательно" означают, что описываемое далее событие или обстоятельство может или не может реализоваться, и что описание включает случаи, когда упомянутое событие или обстоятельство реализуется, и случаи, когда не реализуется.

[0072] Используемые в данном документе термины "CD73" и "CD-73" могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к ферменту клеточной поверхности, кодируемому геном, у человека, содержащим 8 экзонов с цитогенетическим расположением 3q13.12 и молекулярным расположением пар оснований 85449584-85495791 на хромосоме 6 (Homo sapiens, выпуск аннотации 109, GRCh38.p12). Белок CD73 является ферментом (классификация ЕС: 3.1.3.5), представляющим собой 5'-нуклеотидазу, использующую Zn⁺² в качестве кофактора. Белок способен гидролизовать внеклеточные нуклеотиды до нуклеозидов, способных проникать через мембрану, и участвует в регуляции метаболизма азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Он связан с внутриклеточной локализацией, главным образом, на цитоплазматической мембране посредством GPI-якоря. Белок CD73 человека имеет две описанные изоформы, полученные посредством альтернативного сплайсинга. Каноническая изоформа (UniProtKB, идентификатор Р21589) содержит 574 аминокислоты и характеризуется молекулярной массой, составляющей приблизительно 63 кДа. CD73 также называют экто-5'-нуклеотидазой и 5'-нуклеотидазой. Мутации в гене CD73 ассоциированы с кальцификацией суставов и артерий, т.е. с наследственным синдромом множественной кальцификации артерий и суставов.

[0073] Используемые в данном документе термины "лечение" или "обработка" представляют собой подход к получению положительных или требуемых результатов, включая клинические результаты. В контексте настоящего изобретения положительные или требуемые клинические результаты включают без ограничений одно или несколько из следующего: облегчение одного или нескольких симптомов, возникающих в результате заболевания, уменьшение степени заболевания, стабилизацию заболевания (например, предотвращение или задержку усугубления заболевания), предотвращение или задержку распространения (например, метастазирования) заболевания, предотвращение или задержку рецидива заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности болезненного состояния, обеспечение ремиссии (частичной или полной) заболевания, снижение дозы одного или нескольких других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, задержку прогрессирования заболевания, повышение или улучшение качества жизни, увеличение в прибавке массы тела и/или увеличение выживаемости. Термин "лечение" также охватывает уменьшение патологических последствий рака (таких как, например, объем опухоли). Способы, предусмотренные в данном документе, предполагают любой один или несколько из данных аспектов лечения.

[0074] Термины "повторное проявление", "рецидив" или "рецидивирующий" относятся к возвращению рака или заболевания после клинической оценки исчезновения заболевания. Диагноз отдаленных метастазов или местного повторного проявления можно считать рецидивом.

[0075] Термин "рефрактерный" или "устойчивый" относится к раку или заболеванию, которое не поддается лечению.

[0076] Термин "адъювантная терапия" относится к лечению, проводимому после первичной терапии, обычно хирургического вмешательства. Адъювантная терапия рака или заболевания может включать иммунотерапию, химиотерапию, радиотерапию или гормональную терапию.

[0077] Термин "поддерживающая терапия" относится к запланированному повторному лечению, которое проводится для поддержания эффекта предыдущего лечения. Поддерживающую терапию часто применяют, чтобы помочь сохранить ремиссию рака или продлить ответ на специфическую терапию независимо от прогрессирования заболевания.

[0078] Термин "инвазивный рак" относится к раку, который распространился за пределы слоя ткани, в котором он возник, в нормальные окружающие ткани. Инвазивные виды рака могут являться метастатическими, а могут и не являться таковыми.

[0079] Термин "неинвазивный рак" относится к раку на очень ранней стадии или раку, который не распространился за пределы исходной ткани.

[0080] Термин "выживаемость без прогрессирования" в онкологии относится к промежутку времени во время и после лечения, в течение которого рак не растет. Выживаемость без прогрессирования включает количество времени, в течение которого пациенты подвергались полному или частичному ответу, а также количество времени, в течение которого пациенты подвергались стабильному заболеванию.

[0081] Термин "прогрессирующее заболевание" в онкологии может относиться к росту опухоли более чем на 20 процентов с момента начала лечения - либо за счет увеличения массы, либо за счет распространения опухоли.

[0082] Термин "нарушение" относится к любому клиническому состоянию, связанному с экспрессией CD73, сверхэкспрессией CD73 и/или аномальной функцией CD73 у субъекта (например, млекопитающих, таких как люди), при котором субъект получит положительный эффект при лечении или профилактике с применением раскрытых антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или фрагментов, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе. Например, млекопитающие, страдающие от сверхэкспрессии CD73 или нуждающиеся в ее профилактике. Это включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры нарушений, подлежащих лечению согласно данному документу, включают раскрытый рак (такой как рак головы и шеи, рак горла, колоректальный рак, рак легкого и т.д.) или фиброз, включая идиопатический фиброз легких.

[0083] Термин "опухоль", используемый в данном документе, относится ко всем видам роста и пролиферации неопластических клеток, злокачественным или доброкачественным, и ко всем предзлокачественным и злокачественным клеткам и тканям.

[0084] Термин "антитело" используется в самом широком смысле и специфически охватывает, например, одиночные моноклональные антитела (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела), композиции на основе антител с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (см. ниже) при условии, что они специфически связываются с природным полипептидом и/или проявляют биологическую активность или иммунологическую активность по настоящему изобретению. В соответствии с одним вариантом осуществления антитело связывается с олигомерной формой белка-мишени, например, с тримерной формой. В соответствии с другим вариантом осуществления антитело специфически связывается с белком, причем связывание может ингибироваться моноклональным антителом по настоящему изобретению (например, осажденным антителом по настоящему изобретению и т.д.). Фраза "функциональный фрагмент или аналог" антитела означает соединение, обладающее качественной биологической активностью, общей с антителом, к которому оно относится. Например, функциональный фрагмент или аналог антитела по настоящему изобретению может являться фрагментом или аналогом, который может специфически связываться с CD73. В одном варианте осуществления антитело может индуцировать опосредованный макрофагами фагоцитоз CD73-экспрессирующих опухолевых клеток.

[0085] "Выделенное антитело" представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его природной среды. Загрязняющими компонентами природной среды являются вещества, которые могли бы препятствовать диагностическому или терапевтическому использованию антитела; они могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до более 95% по массе антитела, что определяется способом Лоури, и наиболее предпочтительно до более 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, с применением секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с применением окрашивания кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку в таком случае будет отсутствовать по меньшей мере один компонент природной среды антитела. Однако, как правило, выделенное антитело будет получено в ходе по меньшей мере одной стадии очистки.

[0086] Основная 4-цепочечная единица антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц наряду с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и следовательно, содержит 10 антигенсвязывающих участков, в то время как секретируемые антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных скоплений, содержащих 2-5 основных 4-цепочечных единиц наряду с J-цепью). В случае IgG молекулярная масса 4-цепочечной единицы обычно составляет приблизительно 150000 дальтон. Каждая легкая (L) цепь связана с тяжелой (Н) цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, в то время как две Н-цепи связаны друг с другом посредством одной или нескольких дисульфидных связей в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая Н- и L-цепь также содержит регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая Н-цепь содержит на N-конце вариабельный домен (VH), за которым следуют три константных домена (СН) для каждой из цепей а и у, и четыре домена СН для изотипов μ и ε. Каждая L-цепь содержит на N-конце вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL), расположенный у другого конца. VL выровнен с VH, a CL выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи (СН1). Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют границу раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Пара VH и VL вместе образует единый антигенсвязывающий участок. О структуре и свойствах различных классов антител см., например, в Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites et al., Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, стр. 71 и глава 6.

[0087] L-цепь от любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, названных каппа и лямбда на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (СН) иммуноглобулины можно отнести к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, тяжелые цепи которых обозначаются α, β, γ, ε и μ соответственно. Классы γ и α дополнительно делятся на подклассы на основе относительно незначительных различий в последовательности и функции СН, например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

[0088] Термин "вариабельный" относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов сильно различаются по последовательности среди антител. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена по участку из ПО аминокислот вариабельных доменов. Вместо этого V-области состоят из относительно инвариантных отрезков, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями чрезвычайной вариабельности, называемыми "гипервариабельными областями", длина каждой из которых составляет 9-12 аминокислот. Каждый из вариабельных доменов природных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в значительной степени принимающих конфигурацию бета-листа, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые образуют соединенные петли, и в некоторых случаях образуют часть структуры бета-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости за счет FR и вместе с гипервариабельными областями из другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего участка антител (см., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Elvin A. Kabat et al., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

[0089] Используемый в данном документе термин "CDR" или "определяющая комплементарность область" предназначен для обозначения несмежных антигенсвязывающих центров антитела, обнаруживаемых в вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Данные конкретные области описаны в Kabat ЕА. et al., J. Biol. Chem., 252(19): 6609-6616 (1977); Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Elvin A. Kabat et al., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; a Chothia C. et al., J. Mol. Biol, 196(4): 901-917 (1987); и MacCallum RM. et al., J. Mol Biol, 262(5): 732-745 (1996), где определения включают перекрывающиеся аминокислотные остатки или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее предполагается, что применение любого определения для обозначения CDR антитела или привитых антител, или их вариантов находится в пределах объема термина, определенного и используемого в данном документе. Аминокислотные остатки, которые охватывают CDR, определенные в каждой из приведенных выше ссылок, изложены ниже в таблице 4 для сравнения.

[0090] Термин "моноклональное антитело", используемый в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по сути гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта. Более того, в отличие от препаратов на основе поликлональных антител, которые содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, преимущество моноклональных антител состоит в том, что их можно синтезировать без загрязнения другими антителами. Модификатор "моноклональное" не должен истолковываться как требование получения антитела любым конкретным способом. Например, моноклональные антитела, применимые по настоящему изобретению, можно получать в соответствии с гибридомной методологией, впервые описанной Kohler G. et al., Nature, 256(5517): 495-497 (1975), или можно получать с применением способов рекомбинантной ДНК в бактериальных клетках, эукариотических клетках животных или растений (см., например, патент США №4816567). "Моноклональные антитела" также можно выделять из фаговых библиотек антител с применением методик, описанных в Clackson Т. et al., Nature, 352(6336): 624-628 (1991), Marks JD. et al., J. Mol. Biol, 222(3): 581-597 (1991) и, например, в примерах ниже.

[0091] Моноклональные антитела в данном документе включают "химерные" антитела, у которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(цепей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют биологическую активность по настоящему изобретению (см. патент США №4816567 и Morrison SL. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81(21): 6851-6855 (1984)). Представляющие интерес химерные антитела включают "приматизированные" антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от примата, не являющегося человеком (например, мартышки, человекообразной обезьяны и т.д.), и последовательности константной области человека.

[0092] "Интактное" антитело представляет собой антитело, которое содержит антигенсвязывающий участок, а также CL и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи, CH1, СН2 и СН3. Константные домены могут являться константными доменами природной последовательности (например, константными доменами природной последовательности человека) или вариантами их аминокислотной последовательности Предпочтительно, интактное антитело выполняет одну или несколько эффекторных функций. Константный домен (константная область) предпочтительно представляет собой константную область антитела человека, более предпочтительно константную область антитела IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека или IgG4 человека. Конкретная последовательность альтернативной константной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 112, 113 или 114, и конкретная последовательность альтернативной константной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 115.

[0093] "Фрагменты антител" включают часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (см. патент США №5641870, пример 2; Zapata G. et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)); одноцепочечные молекулы антител; и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Выражение "линейные антитела" обычно относится к антителам, описанным в Zapata G. et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062, 1995. Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут являться биспецифичными или моноспецифичными.

[0094] Расщепление антител папаином позволяет получить два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых фрагментами "Fab", и остаточный фрагмент "Fc", название которого отражает способность легко кристаллизоваться. Фрагмент Fab состоит из полной L-цепи вместе с доменом вариабельной области Н-цепи (VH) и первым константным доменом одной тяжелой цепи (СН1). Каждый фрагмент Fab является моновалентным в отношении связывания антигена, т.е. он содержит один антигенсвязывающий участок. Обработка антитела пепсином дает один большой фрагмент F(ab')2, который примерно соответствует двум соединенным дисульфидными связями фрагментам Fab, обладающим бивалентной антигенсвязывающей активностью и все еще способным к перекрестному связыванию антигена. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab наличием нескольких дополнительных остатков на карбоксильном конце домена СН1, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляет собой обозначение в данном документе для Fab', в котором остаток(остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. Фрагменты антитела F(ab')2 первоначально были получены в виде пар фрагментов Fab', которые содержат шарнирные цистеины между ними. Также известны другие химические связи фрагментов антител.

[0095] Фрагмент Fc включает карбоксиконцевые части обеих Н-цепей, удерживаемые вместе дисульфидами. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-области, которая также является частью, распознаваемой рецепторами Fc (FcR), обнаруженными на определенных типах клеток.

[0096] "Вариант Fc-области" содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности Fc-области с природной последовательностью вследствие по меньшей мере одной "аминокислотной модификации", определенной в данном документе. Предпочтительно, вариант Fc-области содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-областью с природной последовательностью или с Fc-областью исходного полипептида, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти аминокислотных замен и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных замен в Fc-области с природной последовательностью или в Fc-области исходного полипептида. В одном варианте осуществления вариант Fc-области в данном документе будет обладать гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 80%, гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 85%, гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 90%, гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 95% или гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 99%, с Fc-областью с природной последовательностью. В соответствии с одним вариантом осуществления вариант Fc-области в данном документе будет обладать гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 80%, гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 85%, гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 90%, гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 95% или гомологией, составляющей по меньшей мере приблизительно 99%, с Fc-областью исходного полипептида.

[0097] Термин "полипептид, содержащий Fc-область" относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин (см. определения в других местах в данном документе), который содержит Fc-область. С-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, во время очистки полипептида или путем рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Соответственно, композиция, содержащая полипептиды, включая антитела, которые содержат Fc-область согласно настоящему изобретению, может содержать популяции полипептидов с удаленными остатками K447, популяции полипептидов без удаленных остатков K447 или популяции полипептидов, содержащие смесь полипептидов с остатками K447 и без них.

[0098] "Эффекторные функции" антитела относятся к тем видам биологической активности, которые связаны с Fc-областью (Fc-областью с природной последовательностью или Fc-областью с вариантами аминокислотной последовательности) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание с C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; ингибирование рецепторов клеточной поверхности и активацию В-клеток. "Fc-область с природной последовательностью" содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, встречающейся в природе. Примеры последовательностей Fc описаны, например, но без ограничений, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Elvin A. Kabat et al., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

[0099] "Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный участок распознавания и связывания антигена. Данный фрагмент состоит из димера домена вариабельной области одной тяжелой и одной легкой цепей в тесной, нековалентной связи. Укладка этих двух доменов приводит к образованию шести гипервариабельных петель (по 3 петли на каждой Н- и L-цепи), в которых участвуют аминокислотные остатки для связывания антигена и которые придают антителу специфичность связывания антигена.

[0100] Однако даже единичный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем целый связывающий участок.

[0101] "Одноцепочечный Fv", также сокращенно обозначаемый "sFv" или "scFv", представляет собой фрагменты антител, которые содержат домены антитела VH и VL, соединенные в единую полипептидную цепь. Предпочтительно полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет sFv образовывать требуемую структуру для связывания антигена. Для обзора sFv см. A. Pluckthun, "Antibodies from Escherichia coli" in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 1994, pp. 269-315; или Ahmad ZA. et al., Clin. Dev. Immunol, 2012: 980250 (2012).

[0102] Термин "диатела" относится к малым фрагментам антитела, полученным посредством конструирования фрагментов sFv (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (приблизительно 5-10 остатков) между доменами VH и VL таким образом, что достигается межцепочечное, но не внутрицепочечное спаривание V-доменов, которое приводит к получению бивалентного фрагмента, то есть фрагмента, содержащего два антигенсвязывающих участка. Биспецифичные диатела представляют собой гетеродимеры, состоящие из двух "перекрестных" фрагментов sFv, в которых домены VH и VL двух антител находятся в разных полипептидных цепях. Более полно диатела описаны, например, в ЕР 404,097; WO 93/11161; и Hollinger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993).

[0103] "Гуманизированные" формы антител, не являющихся человеческими (например, антител грызуна), представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из антитела, не являющегося человеческим. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, которые обладают требуемой специфичностью, аффинностью и способностью антител. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими.

[0104] Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Данные модификации сделаны для дополнительного улучшения характеристик антител. В целом, гуманизированное антитело будет содержать по сути все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по сути все гипервариабельные петли соответствуют таковым иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по сути все FR являются таковыми из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, обычно константной области иммуноглобулина человека. Для получения дополнительной информации см. Jones РТ. et al., Nature, 321(6069): 522-525 (1986); Riechmann L. et al., Nature, 332(6162): 323-329 (1988); и Presta LG, Curr. Opin. Biotechnol, 3(4): 394-398 (1992).

[0105] "Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" или "гомология" по отношению к последовательностям полипептида и антитела, идентифицированным в данном документе, определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в сравниваемом полипептиде после выравнивания последовательностей с учетом любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые известны специалистам в данной области, например, с применением общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить оптимальные параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей данного документа значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают с применением компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc., а исходный код был подан вместе с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, D.C., 20559, где он зарегистрирован под номером регистрации авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна из Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния. Программу ALIGN-2 следует скомпилировать для использования в операционной системе UNIX, предпочтительно digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей задаются программой ALIGN-2 и не меняются.

[0106] Термины "Fc-рецептор" или "FcR" используются для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. В одном варианте осуществления FcR по настоящему изобретению представляет собой FcR, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые обладают сходными аминокислотными последовательностями, которые различаются, прежде всего, их цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене.

Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) в своем цитоплазматическом домене, (см., Daëron М, Аппи. Rev. Immunol, 15: 203-234 (1997)). Термин включает аллотипы, такие как аллотипы FcγRIIIA: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Vai158, FcγRIIA-R131 и/или FcγRIIA-H131. Обзор FcR представлен в Ravetch JV. et al., Annu. Rev. Immunol, 9: 457-492 (1991); Capel PJ. et al., Immunomethods, 4(1): 25-34 (1994); и de Haas M. et al., J. Lab. Clin. Med., 126(4): 330-341 (1995). Другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются в данном документе термином "FcR". Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за передачу материнских IgG плоду (Guyer RL. et al., J. Immunol, 117(2): 587-593 (1976) и Kim JK. et al., Eur. J. Immunol, 24(10): 2429-2434 (1994)).

[0107] Термин "FcRn" относится к неонатальному Fc-рецептору (FcRn). FcRn структурно подобен главному комплексу гистосовместимости (МНС) и состоит из α-цепи, нековалентно связанной с β2-микроглобулином. Множественные функции неонатального Fc-рецептора FcRn рассмотрены в Ghetie V. et al., Annu. Rev. Immunol, 18: 739-766 (2000). FcRn играет роль в пассивной доставке иммуноглобулинов IgG от матери потомству и регуляции сывороточных уровней IgG. FcRn может действовать как рецептор реутилизации, связывая и транспортируя пиноцитозированные IgG в интактной форме как внутри клетки, так и между клетками, и обеспечивая их избегание от стандартного пути деградации.

[0108] "Домен СН1' Fc-области IgG человека (также называемый "С1" домена "H1") обычно продолжается от приблизительно аминокислоты 118 до приблизительно аминокислоты 215 (система нумерации EU).

[0109] "Шарнирная область" обычно определяется как участок от Glu216 до Pro230 IgG1 человека (Burton DR., Mol. Immunol, 22(3): 161-206 (1985)). Шарнирные области других изотипов IgG можно выравнивать с последовательностью IgG1, помещая первый и последний остатки цистеина, образующие S-S-связи между тяжелыми цепями, в одинаковых положениях.

[0110] "Нижняя шарнирная область" Fc-области обычно определяется как участок остатков, расположенный непосредственно на С-конце по отношению к шарнирной области, т.е. остатки с 233 по 239 Fc-области. В предыдущих сообщениях связывание FcR обычно относили на счет аминокислотных остатков в нижней шарнирной области Fc-области IgG.

[0111] "Домен СН2" Fc-области IgG человека (также называемый "С2" домена "Н2") обычно продолжается от приблизительно аминокислоты 231 до приблизительно аминокислоты 340. Домен СН2 уникален тем, что он не спарен тесно с другим доменом. Скорее, две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами СН2 интактной нативной молекулы IgG. Было высказано предположение, что углевод может обеспечивать замену спариванию домен-домен и помогать стабилизации домена СН2 (Burton DR., Mol. Immunol, 22(3): 161-206 (1985).

[0112] "Домен СН3" (также называемый доменом "С2" или доменом "Н3") содержит участок остатков, расположенный на С-конце по отношению к домену СН2 в Fc-области (т.е. от приблизительно аминокислотного остатка 341 до С-конца последовательности антитела, обычно по аминокислотный остаток 446 или 447 IgG).

[0113] "Функциональная Fc-область" осуществляет "эффекторную функцию" Fc-области с природной последовательностью. Примеры "эффекторных функций" включают связывание с C1q; комплементзависимую цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; ингибирование рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR) и т.д. Такие эффекторные функции обычно требуют объединения Fc-области со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценивать, например, с использованием различных анализов, раскрытых в данном документе.

[0114] "C1q" представляет собой полипептид, который содержит участок связывания Fc-области иммуноглобулина. C1q вместе с двумя сериновыми протеазами, C1r и C1s, образует комплекс С1, первый компонент пути комплементзависимой цитотоксичности (CDC). C1q человека можно приобрести на коммерческой основе, например, в Quidel, Сан-Диего, Калифорния.

[0115] Термин "связывающий домен" относится к области полипептида, которая связывается с другой молекулой. В случае FcR связывающий домен может содержать часть его полипептидной цепи (например, его альфа-цепи), которая отвечает за связывание Fc-области. Один применимый связывающий домен представляет собой внеклеточный домен альфа-цепи FcR.

[0116] Антитело с вариантом Fc IgG с "измененной" аффинностью связывания FcR или активностью ADCC представляет собой антитело, которое характеризуется либо повышенной, либо пониженной активностью связывания FcR (например, FcγR или FcRn) и/или активностью ADCC по сравнению с исходным полипептидом или полипептидом, содержащим Fc-область с природной последовательностью. Вариант Fc, который "демонстрирует повышенное связывание" с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более высокой аффинностью (например, с более низким значением кажущейся Kd или IC50), чем исходный полипептид или Fc IgG с природной последовательностью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления улучшение связывания по сравнению с исходным полипептидом является приблизительно 3-кратным, предпочтительно приблизительно 5-, 10-, 25-, 50-, 60-, 100-, 150-, 200-кратным, вплоть до 500-кратного, или составляет приблизительно от 25% до 1000% улучшения связывания. Вариант полипептида, который "демонстрирует пониженное связывание" с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более низкой аффинностью (например, с более высоким значением кажущейся Kd или более высоким значением IC50), чем исходный полипептид. Понижение связывания по сравнению с исходным полипептидом может составлять приблизительно 40% или более понижения связывания.

[0117] "Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, натуральных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), обеспечивает возможность данным цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью и впоследствии уничтожать эту клетку-мишень с помощью цитотоксинов. Антитела "вооружают" цитотоксические клетки и являются абсолютно необходимыми для такого уничтожения. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках обобщенно представлена в таблице 3 на странице 464 в Ravetch JV. et al., Аппи. Rev. Immunol, 9: 457-492 (1991). Для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как описанный в патентах США №5500362 или 5821337 или в примерах ниже. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и натуральные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или в дополнение, активность ADCC представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, в модели на животном, такой как описанная в Clynes R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(2): 652-656 (1998).

[0118] Полипептид, содержащий вариант Fc-области, который "демонстрирует повышенную ADCC" или опосредует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно, чем полипептид, содержащий Fc IgG дикого типа, или исходный полипептид, представляет собой полипептид, который in vitro или in vivo является существенно более эффективным в опосредовании ADCC, когда количества полипептида с вариантом Fc-области и полипептида с Fc-областью дикого типа (или родительского полипептида) в анализе по сути одинаковы. В целом, такие варианты будут идентифицированы с использованием любого анализа ADCC in vitro, известного в данной области, такого как анализы или способы определения активности ADCC, например, в модели на животных и т.д. В одном варианте осуществления предпочтительный вариант является от приблизительно в 5 раз до приблизительно в 100 раз, например, от приблизительно в 25 раз до приблизительно в 50 раз более эффективным в опосредовании ADCC, чем Fc дикого типа (или исходный полипептид).

[0119] "Комплементзависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с распознаваемым ими антигеном. Для оценки активации комплемента можно выполнять анализ CDC, например, описанный в Gazzano-Santoro Н. et al., J. Immunol. Methods, 202(2): 163-171 (1997). Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и повышенной или пониженной способностью связывания C1q описаны в патенте США №6194551 В1 и WO 99/51642. Содержание данных патентных публикаций специально включено в данный документ посредством ссылки (см. также Idusogie ЕЕ. et al., J. Immunol, 164(8): 4178-4184 (2000)).

[0120] "Эффективное количество" антитела к CD73 (или его фрагмента) или композиции, раскрытых в данном документе, представляет собой количество, достаточное для выполнения конкретно указанной цели. "Эффективное количество" можно определить эмпирически и рядом способов, относящихся к указанной цели. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству антитела к CD73 (или его варианта или антигенсвязывающего фрагмента) или композиции, раскрытых в данном документе, которое эффективно для "лечения" заболевания или нарушения у млекопитающего (также называемого пациентом). В случае рака терапевтически эффективное количество антитела к CD73 (или его варианта или антигенсвязывающего фрагмента) или композиции, раскрытых в данном документе, может снижать количество раковых клеток; уменьшать размер или вес опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять, а предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять, а предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; и/или облегчать до некоторой степени один или несколько симптомов, связанных с раком. В той степени, насколько антитело к CD73 (или его вариант или антигенсвязывающий фрагмент) или композиция, раскрытые в данном документе, могут предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, они могут являться цитостатическими и/или цитотоксическими. В одном варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, ингибирующее рост. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое продлевает выживаемость пациента. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое улучшает выживаемость пациента без прогрессирования заболевания.

[0121] "Ингибирующее рост количество" антитела к CD73 (или его варианта или антигенсвязывающего фрагмента) или композиции по настоящему изобретению, раскрытых в данном документе, представляет собой количество, способное ингибировать рост клетки, особенно опухолевой, например, раковой клетки, либо in vitro, либо in vivo. "Ингибирующее рост количество" полипептида, антитела, антагониста или композиции по настоящему изобретению для целей ингибирования роста неопластических клеток можно определять эмпирически и с помощью известных способов или с помощью примеров, предусмотренных в данном документе.

[0122] "Цитотоксическое количество" антитела к CD73 (или его варианта или антигенсвязывающего фрагмента) или композиции по настоящему изобретению представляет собой количество, способное вызывать разрушение клетки, особенно опухолевой, например, раковой клетки, либо in vitro, либо in vivo. "Цитотоксическое количество" антитела к CD73 (или его варианта или антигенсвязывающего фрагмента) или композиции по настоящему изобретению для целей ингибирования роста неопластических клеток можно определять эмпирически и с помощью способов, известных в данной области.

[0123] "Ингибирующее рост количество" антитела к CD73 (или его варианта или антигенсвязывающего фрагмента) или композиции по настоящему изобретению представляет собой количество, способное ингибировать рост клетки, особенно опухолевой, например, раковой клетки, либо in vitro, либо in vivo. "Ингибирующее рост количество" антитела к CD73 (или его варианта или антигенсвязывающего фрагмента) или композиции по настоящему изобретению для целей ингибирования роста неопластических клеток можно определять эмпирически и с помощью известных способов или с помощью примеров, предусмотренных в данном документе.

[0124] Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый" или "фармакологически совместимый" обозначает вещество, которое не является биологически или иным образом нежелательным, например, вещество может быть включено в фармацевтическую композицию, которую вводят пациенту, так, что не вызывает каких-либо значительных нежелательных биологических эффектов или вредного взаимодействия с любым другим компонентом композиции, в состав которой оно входит. Фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества предпочтительно удовлетворяют требуемые стандарты токсикологических и производственных испытаний и/или включены в Руководство по неактивным ингредиентам, подготовленное Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств.

[0125] Термин "обнаружение" подразумевается как включающий определение присутствия или отсутствия вещества или определение количества вещества (такого как CD73). Таким образом, термин относится к использованию веществ, композиций и способов по настоящему изобретению для качественного и количественного определения. В целом, конкретная методика, применяемая для обнаружения, не является критической для практического применения настоящего изобретения.

[0126] Например, "обнаружение" согласно настоящему изобретению может включать наблюдение присутствия или отсутствия продукта гена CD73, молекул mRNA или полипептида CD73; изменения уровней полипептида CD73 или количества, связанного с мишенью; изменения биологической функции/активности полипептида CD73. В некоторых вариантах осуществления "обнаружение" может включать обнаружение уровней CD73 дикого типа (например, уровней mRNA или полипептида). Обнаружение может включать количественную оценку изменения (увеличения или уменьшения) любого значения от 10% до 90% или любого значения от 30% до 60%, или более 100% по сравнению с контролем. Обнаружение может включать количественную оценку изменения любого значения от 2-кратного до 10-кратного включительно или более, например, 100-кратного.

[0127] Слово "метка", используемое в данном документе, относится к поддающемуся обнаружению соединению или композиции, которые непосредственно или опосредованно конъюгированы с антителом. Метка сама по себе может поддаваться обнаружению (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которые поддаются обнаружению.

Антитела к CD73 и аффинные варианты/мутанты

[0128] Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают рецептор CD73, раскрытым в данном документе. Раскрытые антитела к CD73 и их аффинные варианты и/или мутанты или их антигенсвязывающие фрагменты можно применять в различных способах терапии и диагностики. Антитело к CD73 представляет собой антитело, которое связывается с CD73 с достаточной аффинностью и специфичностью. В некоторых вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 (или его вариант или мутант, или антигенсвязывающий фрагмент) можно использовать в качестве терапевтического средства для направленного воздействия на заболевания или состояния, ассоциированные с экспрессией CD73, и вмешательства в них. В различных аспектах раскрытое антитело к CD73 (или его вариант/мутант или антигенсвязывающий фрагмент) будет демонстрировать минимальное связывание с другими белками. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы раскрытое антитело к CD73 (или его вариант/мутант или антигенсвязывающий фрагмент) являлось человеческим или рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом к CD73.

[0129] Без ограничения конкретной теорией считается, что раскрытые антитела к CD73 и их аффинные варианты и/или мутанты или их антигенсвязывающие фрагменты могут увеличивать интернализацию CD73 в клетках, экспрессирующих CD73, тем самым приводя к снижению количества белка CD73 на цитоплазматической мембране клеток, с которыми связываются раскрытые антитела к CD73 и их аффинные варианты и/или мутанты или их антигенсвязывающие фрагменты. Соответственно, снижение количества белка CD73 на цитоплазматической мембране может быть связано со снижением 5'-нуклеотидазной активности, ассоциированной с CD73. В некоторых аспектах считается, опять же, без ограничения конкретной теорией, что снижение CD73-ассоциированной 5'-нуклеотидазной активности посредством увеличения интернализации может снижать пролиферацию опухолевых клеток посредством усиления функции иммунных клеток на участках опухоли в связи со снижением 5'-нуклеотидазной активности.

[0130] Как раскрыто в данном документе, считается, что раскрытые антитела к CD73 и их аффинные варианты и/или мутанты или их антигенсвязывающие фрагменты оказывают положительный эффект при других клинических состояниях, ассоциированных с экспрессией CD73, например, фиброзе, включая идиопатический фиброз легких. Без ограничения конкретной теорией считается, что при других таких клинических состояниях раскрытые антитела к CD73 и их аффинные варианты и/или мутанты или их антигенсвязывающие фрагменты могут иметь положительный клинический эффект у пациента, например, с фиброзом, включая идиопатический фиброз легких, в связи со снижением белка CD73 (и, в равной степени, снижением 5'-нуклеотидазной активности) в соответствующих клетках, экспрессирующих CD73.

[0131] В соответствии с определенными вариантами осуществления антитело к CD73 содержит CDR, вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи любого из антител, раскрытых в данном документе.

[0132] В настоящем изобретении предусмотрены антитела к CD73, их аффинные варианты/мутанты и/или их антигенсвязывающие фрагменты. В определенных вариантах осуществления конкретное антитело к CD73, его аффинный(аффинные) вариант(варианты)/мутант(мутанты) и/или его антигенсвязывающий(антигенсвязывающие) фрагмент(фрагменты) по настоящему изобретению содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи (LC), которая содержит специфические последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, изложенные в таблице 1 выше, и последовательность вариабельного домена тяжелой (НС) цепи, которая содержит специфические последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, изложенные в таблице 2 выше. Нуклеиновая кислота и ее аминокислотная последовательность каждой легкой цепи и тяжелой цепи каждого конкретного антитела к CD73, его аффинного(аффинных) варианта(вариантов)/мутанта(мутантов) и/или его антигенсвязывающего(антигенсвязывающих) фрагмента(фрагментов) по настоящему изобретению, также представлены в перечне последовательностей ниже. В настоящем изобретении предусмотрено, что вариабельные домены тяжелой и легкой цепей и CDR, указанные в данном документе, объединены во все возможные парные комбинации с получением ряда антител к CD73 и их аффинного(аффинных) варианта(вариантов)/мутанта(мутантов) и/или их антигенсвязывающего(антигенсвязывающих) фрагмента(фрагментов).

[0133] В определенных вариантах осуществления аминокислотная(аминокислотные) замена(замены) представляет(представляют) собой консервативную(консервативные) аминокислотную(аминокислотные) замену(замены). В определенных вариантах осуществления аминокислотные замены существенно не снижают способность антитела связывать антиген. Например, можно вносить консервативные изменения (например, консервативные замены, предусмотренные в данном документе), которые существенно не снижают аффинность связывания раскрытых антител с CD73-мишенью. Аффинность связывания вариантов антитела к CD73 можно оценивать с помощью способов, описанных в примерах ниже.

[0134] Консервативные замены показаны в таблице 5 под заголовком "консервативные замены". Более существенные изменения представлены в таблице 5 под заголовком "иллюстративные замены" и, как дополнительно описано ниже, со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно вводить в представляющее интерес антитело, а продукты можно подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/улучшения связывания CD73, снижения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.

[0135] Неконсервативные замены предусматривают замену элемента одного из данных классов на элемент другого класса. Иллюстративный вариант замены представляет собой антитело с созревшей аффинностью, которое можно легко получить, например, с применением методик созревания аффинности на основе фагового дисплея, таких как описанные в данном документе. Вкратце, один или несколько остатков CDR подвергают мутации, и вариантные антитела отображают на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания). Изменения (например, замены) можно вносить в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения можно вносить в "горячих точках" HVR, т.е., в остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) и/или SDR (a-CDR), при этом полученный вариант VH или VL тестируют в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom HR, Methods Mol. Biol, 178: 1-37 (2002); Antibody Phage Display, Philippa O'Brien, R. A., Humana Press, Totowa, NJ, 2001.

[0136] В некоторых вариантах осуществления созревания аффинности вводят разнообразие в вариабельные гены, выбранные для созревания, любым из ряда способов (например, ПЦР сниженной точности, перетасовкой цепей или сайтнаправленным мутагенезом с применением олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку подвергают скринингу для выявления любых вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает подходы, направленные на HVR, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за раз). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, с применением сканирующего аланином мутагенеза или моделирования.

[0137] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73, его вариант или мутант, или антигенсвязывающий фрагмент может не содержать мотива N-гликозилирования в вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи, что может являться причиной различий в партии антител, приводящих к изменению функции, иммуногенности или стабильности. Способы анализа гликозилирования антител включают без ограничений, например, хроматографию (такую как катионообменная хроматография (СЕХ) или жидкостная хроматография), масс-спектрометрию (такую как масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением) и капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия. Такие способы описаны, например, в Jung ST. et al., Curr. Opin. Biotechnol, 22(6): 858-67 (2011); Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. В Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 45; Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. В Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 47; Leymarie N. et al., Anal. Chem., 84(7):3040-3048 (2012); Fernandez DD., European Biopharmaceutical Review, pp 106-110 (2005); и Raju TS, Methods Mol. Biol, 988:169-180 (2013).

[0138] В определенных вариантах осуществления мутант конкретного антитела к CD73 содержит одну или несколько мутаций в сайтах N-гликозилирования в одной или нескольких областях CDR, например, в последовательности N-X-S/T. Мутант антитела к CD73 с одной или несколькими мутациями в сайтах N-гликозилирования освобождается от сайта N-гликозилирования, но сохраняет такую же функцию.

[0139] В определенных вариантах осуществления антитела к CD73, их варианты и/или мутанты или антигенсвязывающие фрагменты обладают более сильной аффинностью связывания в отношении CD73, чем в отношении гомолога этого CD73. Обычно антитело к CD73 и/или его вариант или антигенсвязывающий фрагмент "специфически связывается" с CD73 (т.е., характеризуется значением аффинности связывания (Kd), составляющим не более чем приблизительно 1×10^-7 М, предпочтительно не более чем приблизительно 1×10^-8 и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1×10^-9 М), но обладает аффинностью связывания с мишенями, отличными от CD73, которая является по меньшей мере приблизительно в 50 раз или по меньшей мере приблизительно в 500 раз, или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз более слабой, чем его аффинность связывания с CD73. Антитело к CD73, которое специфически связывается с CD73, может относиться к любому из различных типов антител, определенных выше, но предпочтительно представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека.

[0140] В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела к CD73 с белком, не являющимся мишенью, составляет менее чем приблизительно 10% от степени связывания антитела с CD73, что определено способами, известными в данной области, такими как ELISA, анализ сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или радиоиммунопреципитация (RIA). Специфическое связывание можно измерять, например, посредством определения связывания молекулы в сравнении со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу подобной структуры, не обладающую связывающей активностью. Например, специфическое связывание можно определять посредством конкуренции с контрольной молекулой, которая аналогична мишени, например, избыток немеченой мишени. В данном случае специфическое связывание отмечают, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Используемый в данном документе термин "специфическое связывание" или "специфически связывается", или является "специфичным в отношении" конкретного полипептида или эпитопа на конкретной полипептидной мишени можно продемонстрировать, например, с помощью молекулы, характеризующейся Kd в отношении мишени, составляющей по меньшей мере приблизительно 10^-4 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-5 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-6 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-7 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-8 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-9 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-10 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-11 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-12 М или более. В одном варианте осуществления термин "специфическое связывание" относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде в отсутствие существенного связывания с каким-либо другим полипептидом или полипептидным эпитопом.

[0141] Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC) представляет собой механизм действия терапевтических антител в отношении опухолевых клеток. ADCC представляет собой клеточноопосредованную иммунную защиту, посредством которой эффекторная клетка иммунной системы активно лизирует клетку-мишень (например, раковую клетку), чьи антигены на поверхности мембраны связаны специфическими антителами (например, такими как антитело к CD73 и/или аффинный вариант, описанные в данном документе). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD73 и/или аффинный вариант проявляют эффекторную функцию антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), подобную таковой у эталонных моноклональных антител к CD73, что продемонстрировано, например, с помощью анализов, описанных в примерах.

[0142] Например, в определенных вариантах осуществления активность эффекторной функции ADCC антитела к CD73 и/или его аффинного варианта или мутанта, описанных в данном документе, составляет по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 100% или более 100% (например, приблизительно 105%, приблизительно 106%, приблизительно 107%, приблизительно 108%, приблизительно 109%, приблизительно 110%, приблизительно 111%, приблизительно 112%, приблизительно 113%, приблизительно 114%, приблизительно 115%, приблизительно 116%, приблизительно 117%, приблизительно 118%, приблизительно 119%, приблизительно 120%, приблизительно 121%, приблизительно 122%, приблизительно 123%, приблизительно 124%, приблизительно 125% или приблизительно 130%) активности эффекторной функции ADCC эталонного антитела к CD73, включая любой диапазон между данными значениями.

[0143] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его аффинный вариант или их мутант проявляют аффинность связывания с CD73, подобную таковой у эталонного антитела к CD73. В определенных вариантах осуществления связывание с CD73 демонстрируется посредством ELISA, описанного в примерах. Например, аффинность связывания антитела к CD73 и/или его аффинного варианта или их мутанта с CD73 на приблизительно 1%, на приблизительно 5%, на приблизительно 10%, на приблизительно 15%, на приблизительно 20%, на приблизительно 30%, на приблизительно 40%, на приблизительно 50%, на приблизительно 60%, на приблизительно 70%, на приблизительно 80%, на приблизительно 90%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98%, на приблизительно 99%, на приблизительно 100% или на более чем 100% превышает (например, на приблизительно 105%, на приблизительно 106%, на приблизительно 107%, на приблизительно 108%, на приблизительно 109%, на приблизительно 110%, на приблизительно 111%, на приблизительно 112%, на приблизительно 113%, на приблизительно 114%, на приблизительно 115%, на приблизительно 116%, на приблизительно 117%, на приблизительно 118%, на приблизительно 119%, на приблизительно 120%, на приблизительно 121%, на приблизительно 122%, на приблизительно 123%, на приблизительно 124%, на приблизительно 125% или более чем на приблизительно 125%) аффинность связывания эталонного антитела к CD73 с CD73.

[0144] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его аффинный вариант или их мутант связывают CD73 человека с Kd, составляющей от приблизительно 0,1 пМ до 200 пМ (0,2 нМ), например, приблизительно 0,1 пМ, приблизительно 0,25 пМ, приблизительно 0,5 пМ, приблизительно 0,75 пМ, приблизительно 1 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно ПО пМ, приблизительно 120 пМ, приблизительно 130 пМ, приблизительно 140 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 160 пМ, приблизительно 170 пМ, приблизительно 180 пМ, приблизительно 190 пМ или более чем приблизительно 190 пМ, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления аффинность связывания антитела к CD73 и/или его аффинного варианта или их мутанта с CD73 на приблизительно 1%, на приблизительно 5%, на приблизительно 10%, на приблизительно 15%, на приблизительно 20%, на приблизительно 30%, на приблизительно 40%, на приблизительно 50%, на приблизительно 60%, на приблизительно 70%, на приблизительно 80%, на приблизительно 90%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98%, на приблизительно 99%, на приблизительно 100% или более чем на приблизительно 100% превышает (например, на приблизительно 105%, на приблизительно 110%, на приблизительно 120% или на приблизительно 130%) аффинность связывания эталонного антитела к CD73 с CD73. В определенных вариантах осуществления аффинность связывания антитела к CD73 и/или его варианта или их мутанта с CD73 в приблизительно 1,1 раза, в приблизительно 1,2 раза, в приблизительно 1,3 раза, в приблизительно 1,4 раза, в приблизительно 1,5 раза, в приблизительно 1,6 раза, в приблизительно 1,7 раза, в приблизительно 1,8 раза, в приблизительно 1,9 раза, в приблизительно 2 раза, в приблизительно 2,25 раза, в приблизительно 2,5 раза, в приблизительно 2,75 раза, в приблизительно 3 раза, в приблизительно 3,25 раза, в приблизительно 3,5 раза, в приблизительно 3,75 раза, в приблизительно 4 раза, в приблизительно 4,25 раза, в приблизительно 4,5 раза, в приблизительно 4,75 раза или более чем в приблизительно 4,75 раза превышает аффинность связывания эталонного антитела к CD73 с CD73, включая любой диапазон между данными значениями.

[0145] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант, предусмотренные в данном документе, характеризуются более длительными периодами полужизни in vivo по сравнению с эталонным антителом к CD73. В определенных вариантах осуществления период полужизни in vivo антитела к CD73 и/или его варианта или их мутанта, описанных в данном документе, не короче, чем период полужизни in vivo эталонного антитела к CD73.

[0146] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант, предусмотренные в данном документе, проявляют фармакокинетические свойства, подобные таковым у эталонных антител к CD73. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант, предусмотренные в данном документе, демонстрируют AUC (площадь под кривой), которая составляет приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более 95% (например, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99%) от профилей зависимости концентрации в сыворотке крови от времени эталонного антитела к CD73, включая любой диапазон между данными значениями.

[0147] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению содержат последовательность Fc IgG человека, например, IgG1 человека или IgG4 человека. В определенных вариантах осуществления последовательность Fc изменена или иным образом модифицирована так, что у нее отсутствует эффекторная функция антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), часто зависящая от ее связывания с Fc-рецепторами (FcR). Существует множество примеров модификаций или мутаций последовательностей Fc, которые могут изменять эффекторную функцию. Например, в WO 00/42072 и Shields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описаны варианты антител с улучшенным или пониженным связыванием с FcR. Содержание данных публикаций специально включено в данный документ посредством ссылки. Антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению могут находиться в форме Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. Также антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению могут представлять собой полиспецифические антитело и/или его вариант или мутант, которые связываются с CD73, но также связываются с одной или несколькими другими мишенями и ингибируют их функцию(функции). Антитело к CD73 и/или его вариант или его мутант по настоящему изобретению можно конъюгировать с терапевтическим средством (например, цитотоксическим средством, радиоизотопом и химиотерапевтическим средством) или меткой для обнаружения CD73 в образцах от пациентов или in vivo посредством визуализации (например, радиоизотопом, флуоресцентным красителем и ферментом). Другие модификации, включающие конъюгацию токсинов с антителами к CD73 и/или их вариантами или мутантами, также предусмотрены в данном документе.

[0148] Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к CD73 и/или их варианты, и/или их мутанты, и векторы экспрессии, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие CDR и/или вариабельный домен тяжелой цепи, и/или вариабельный домен легкой цепи, также описаны в данном документе, а также рассматриваются клетки, содержащие молекулы нуклеиновых кислот. Антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению можно применять в способах терапии, описанных в данном документе, и для обнаружения белка CD73 в образцах, взятых от пациентов (например, с помощью анализов FACS, иммуногистохимического (ШС), ELISA), или у пациентов.

Моноклональные антитела

[0149] Моноклональные антитела можно получить, например, с применением гибридомных способов, таких как способы, описанные Kohler G. et al., Nature, 174(5): 2453-2455 (2005), или можно получить с помощью способов рекомбинантных ДНК (патент США №4816567), или можно получить с помощью способов, описанных в данном документе в примерах ниже. В гибридомном способе хомяка, мышь или другого подходящего животного-хозяина, как правило, иммунизируют с использованием иммунизирующего средства для получения лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим средством. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro.

[0150] Иммунизирующее средство, как правило, включает полипептид или слитый белок представляющего интерес белка или композицию, содержащую данный белок. В целом, используют либо лимфоциты периферической крови ("PBL"), если требуются клетки человеческого происхождения, либо используют клетки селезенки или клетки лимфатических узлов, если требуются источники, относящиеся к млекопитающим, отличным от человека. Затем лимфоциты подвергают слиянию с иммортализованной клеточной линией с применением приемлемого средства, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, с получением гибридомных клеток (Monoclonal Antibodies: principles and practice, James W. Goding, New York: Academic Press, 1986, pp. 59-103). Иммортализованные клеточные линии обычно представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности, миеломные клетки, происходящие от грызунов, крупного рогатого скота и человека. Обычно используют линии клеток миеломы крысы или мыши. Гибридомные клетки можно культивировать в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых иммортализованных клеток. Например, если у исходных клеток отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом, как правило, будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("среда HAT"), которые препятствуют росту клеток, дефицитных по HGPRT.

[0151] Предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются линии, которые эффективно подвергаются слиянию, поддерживают стабильную экспрессию антитела на высоком уровне выбранными антителопродуцирующими клетками и являются чувствительными к среде, такой как среда HAT. Более предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются линии миеломы мышей, которые можно получить, например, из Salk Institute Cell Distribution Center, Сан-Диего, Калифорния и American Type Culture Collection, Манассас, Вирджиния. Также для продукции моноклональных антител человека описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека (Kozbor D. et al., J. Immunol, 133(6): 3001-3005 (1984); Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Brodeur et al., Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987, pp. 51-63).

[0152] Затем культуральную среду, в которой культивируют гибридомные клетки, можно анализировать на наличие моноклональных антител, направленных против полипептида. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, можно определять посредством иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Такие методики и анализы известны в данной области. Аффинность связывания моноклонального антитела можно определять, например, посредством анализа Скэтчарда описанного в Munson PJ. et A., Anal. Biochem., 107(1): 220-239 (1980).

[0153] После идентификации требуемых клеток гибридомы клоны можно субклонировать с помощью процедур лимитирующих разведений и выращивать стандартными способами (Monoclonal Antibodies: principles and practice, James W. Goding, New York: Academic Press, 1986, pp. 59-103). Применимые для данной цели культуральные среды включают, например, среду Игла в модификации Дульбекко и среду RPMI-1640. Альтернативно, гибридомные клетки можно выращивать in vivo у млекопитающих в качестве асцитных опухолей.

[0154] Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно выделять или очищать из культуральной среды или асцитной жидкости с помощью обычных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, хроматография с протеином А-сефарозой, хроматография с гидроксилапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

[0155] Моноклональные антитела также можно получать способами рекомбинантной ДНК, известными в данной области и/или разработанными позже. ДНК, кодирующую моноклональные антитела, предусмотренные в данном документе, можно легко выделять и секвенировать с применением обычных процедур (например, с применением олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антител мыши). Гибридомные клетки, предусмотренные в данном документе, служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК можно встраивать в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в ином случае не продуцируют белок иммуноглобулина, с обеспечением синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также можно модифицировать, например, посредством замены последовательностью, кодирующей константные домены тяжелой и легкой цепей человека, гомологичных последовательностей мыши (например, см. Morrison et at, выше) или посредством ковале нтного присоединения к последовательности, кодирующей иммуноглобулин, всей или части последовательности, кодирующей полипептид, не являющийся иммуноглобулином. Таким полипептидом, не являющимся иммуноглобулином, можно заменять константные домены антитела, предусмотренного в данном документе, или можно заменять вариабельные домены одного антигенсвязывающего участка антитела, предусмотренного в данном документе, с получением химерного бивалентного антитела.

[0156] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или его мутант, предусмотренные в настоящем изобретении, экспрессируются стабильной линией клеток млекопитающих. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или его мутант, предусмотренные в настоящем изобретении, экспрессируются в стабильной линии клеток млекопитающих с титром, составляющим приблизительно 2,0 грамма/литр, приблизительно 2,5 грамма/литр, приблизительно 3,0 грамма/литр, приблизительно 3,5 грамма/литр, приблизительно 4,0 грамма/литр, приблизительно 4,5 грамма/литр, приблизительно 5,0 граммов/литр, приблизительно 5,5 граммов/литр, приблизительно 6,0 граммов/литр, приблизительно 6,5 граммов/литр, приблизительно 7,0 граммов/литр или более чем приблизительно 7,0 граммов/литр, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления стабильная линия клеток млекопитающих, в которой экспрессируется антитело к CD73 и/или его вариант или его мутант, предусмотренные в настоящем изобретении, представляет собой линию клеток СНО.

[0157] В определенных вариантах осуществления антитела представляют собой моновалентные антитела. Способы получения моновалентных антител известны в данной области. Например, один способ включает рекомбинантную экспрессию легкой цепи и модифицированной тяжелой цепи иммуноглобулина. Тяжелую цепь усекают обычно в любой точке Fc-области для предотвращения перекрестного сшивания тяжелой цепи. Альтернативно, соответствующие остатки цистеина заменяют другим аминокислотным остатком или удаляют для предотвращения перекрестного сшивания.

[0158] Для получения моновалентных антител также применимы способы in vitro. Расщепление антител для получения их фрагментов, в частности фрагментов Fab, можно осуществлять с применением без ограничения методик, известных в данной области.

Антитела человека и гуманизированные антитела

[0159] Антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению представляют собой антитела человека. Они также могут представлять собой гуманизированные антитела. Гуманизированные формы антител, не являющихся человеческими (например, мышиных), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2, или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые, как правило, содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из CDR реципиента заменены остатками из CDR вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, которые обладают требуемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в последовательностях импортированных CDR или каркасной области. В целом, гуманизированное антитело может содержать по существу все по меньшей мере из одного, и как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по сути все из областей CDR соответствуют CDR иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по сути все из областей FR представляют собой области FR консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело предпочтительно также будет содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константной области иммуноглобулина человека (см., например, Jones РТ. et al., Nature, 321(6069): 522-525 (1986); Riechmann L. et al., Nature, 332(6162): 323-327 (1988); Presta LG, Curr. Opin. Biotechnol, 3(4): 394-398 (1992)).

[0160] В целом, гуманизированное антитело обладает одним или несколькими встроенными в него аминокислотными остатками из источника, который не является человеческим. Такие не являющиеся человеческими аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые, как правило, взяты из "импортного" вариабельного домена. В соответствии с одним вариантом осуществления гуманизацию по сути можно выполнять в соответствии со способом Винтера (Winter) и коллег (Jones РТ. et al., Nature, 321(6069): 522-525 (1986); Riechmann L. et al., Nature, 332(6162): 323-327 (1988); Verhoeyen M. et al., Science, 239(4847): 1534-1536 (1988)), посредством замены CDR или последовательностями CDR грызуна соответствующих последовательностей антитела человека. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела представляют собой антитела, где по сути менее чем интактный вариабельный домен человека заменен соответствующей последовательностью вида, не являющегося человеком. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и возможно некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

[0161] В качестве альтернативы гуманизации можно получать антитела человека. Например, теперь можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации продуцировать полный спектр антител человека в отсутствие продукции эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена области соединения тяжелых цепей (JH) антитела у химерных мышей и мышей с мутантной зародышевой линией приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека таким мышам с мутантной зародышевой линией приводит к продукции антител человека при антигенной стимуляции, см., например, Jakobovits A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(6): 2551-2555 (1993); Jakobovits A. et al., Nature, 362(6417): 255-258 (1993); Bruggemann M. et al., Year Immunol, 7: 33-40 (1993); патенты США №№5545806, 5569825, 5591669; 5545807 и WO 97/17852.

[0162] Альтернативно, антитела человека можно получать посредством введения локусов иммуноглобулинов человека трансгенным животным, например мышам, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. После антигенной стимуляции наблюдается продукция антител человека, которая во всех отношениях очень схожа с таковой, наблюдаемой у людей, включая перестройку генов, сборку и спектр антител. Данный подход известен в данной области, например, см. Marks JD. et al., Biotechnology, 10(7): 779-783 (1992); Lonberg N. et al., Nature, 368(6474): 856-859 (1994); Morrison SL., Nature, 368(6474): 812-813 (1994); Fishwild DM. et al., Nat. Biotechnol, 14(7): 845-851 (1996); Neuberger M., Nat. Biotechnol, 14(7): 826 (1996); Lonberg N. et al., Int. Rev. Immunol, 13(1): 65-93 (1995).

[0163] Альтернативно можно использовать технологию фагового дисплея (McCafferty J. et al., Nature, 348(6301): 552-554, 1990) для получения антител человека и фрагментов антител in vitro из спектров генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов неиммунизированных доноров. В соответствии с одним вариантом осуществления данной методики последовательности V доменов антител клонируют в рамке считывания либо в основной, либо в минорный ген белка оболочки нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и они экспонируются в виде функциональных фрагментов антител на поверхности частицы фага. Фаговый дисплей можно осуществлять в различных форматах, например, как описано ниже в разделе "Примеры" или как описано, например, в Johnson KS. et al., Curr. Opin. Struct. Biol, 3(4): 564-571 (1993). Для фагового дисплея можно использовать несколько источников сегментов V-генов. Clackson Т. et al., Nature, 352(6336): 624-628 (1991) выделили набор разнообразных антител к оксазолону из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать спектр V-генов от неиммунизированных доноров-людей, и можно выделить антитела к разнообразному набору антигенов (включая аутоантигены), по сути, в соответствии с методиками, описанными Marks JD. et al., J. Mol. Biol, 222(3): 581-597 (1991) или Griffith AD. et al., EMBO J. 12(2): 725-734 (1993). См. также патенты США №№5565332 и 5573905.

[0164] Как рассмотрено выше, антитела человека также можно получать посредством активированных В-клеток in vitro с применением способов, известных в данной области.

[0165] Антитела человека также можно получать с применением различных методик, известных в данной области, включая фаг-дисплейные библиотеки. Hoogenboom HR. et al., J. Mol. Biol, 227(2): 381-388 (1991); Marks JD. et al., J. Mol. Biol, 222(3): 581-597 (1991). Методики Cole et al. и Boerner et al. также можно использовать для получения моноклональных антител человека (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Cole et al., Alan Liss, Inc., 1985, pp.77 и Boemer P. et al., J. Immunol, 147(1): 86-95 (1991)).

Полиспецифические антитела

[0166] Полиспецифические антитела представляют собой моноклональные, предпочтительно антитела человека или гуманизированные антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении двух или более различных антигенов (например, биспецифические антитела обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух антигенов). Например, один из вариантов специфичности связывания может проявляться в отношении белка а5~1, а другой может проявляться в отношении другого антигена. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления другой антиген представляет собой белок клеточной поверхности или рецептор, или субъединицу рецептора. Например, белок клеточной поверхности может являться рецептором натуральных клеток-киллеров (NK). Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению может связывать как CD73, так и, например, второй рецептор клеточной поверхности.

[0167] Применимые способы получения биспецифических антител хорошо известны в данной области. Например, рекомбинантный способ получения биспецифических антител основан на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают разной специфичностью (Milstein С et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)). Вследствие случайного распределения тяжелых и легких цепей иммуноглобулина данные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из десяти различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифической структурой. Очистку правильной молекулы обычно выполняют посредством стадий аффинной хроматографии. Подобные способы описаны в данной области, например, в WO 93/08829 и в Traunecker A. et al., EMBO J., 10(12): 3655-3659 (1991).

[0168] Вариабельные домены антител с требуемой специфичностью связывания (участки связывания антитело-антиген) можно подвергать слиянию с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Предпочтительно слияние осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, областей СН2 и СН3. Предпочтительно, чтобы первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, в случае необходимости, легкую цепь иммуноглобулина, вставляют в отдельные векторы экспрессии и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Дополнительную информацию о создании биспецифических антител см., например, в Suresh MR. et al., Methods Enzymol., 121: 210-228 (1986).

[0169] Также описаны различные методики получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получили с применением лейциновых застежек (Kostelny SA. et al., J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992)). Пептиды с лейциновыми застежками из белков Fos и Jun связывали с Fab'-частями двух различных антител посредством слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с образованием мономеров, а затем повторно окисляли с образованием гетеродимеров антител. Данный способ также можно использовать для получения гомодимеров антител. Технология "диатела", описанная Hollinger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993), предусматривает альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Фрагменты содержат VH, соединенный с VL посредством линкера, который является слишком коротким для возможности образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи. Соответственно, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, тем самым образуя два антигенсвязывающих участка. Сообщалось также о другой стратегии получения фрагментов биспецифических антител с применением димеров одноцепочечного Fv (sFv). См. Gruber М. et al., J. Immunol., 152(11): 5368-5374(1994).

[0170] Также предусмотрены антитела более чем с двумя валентностями. Например, можно получать триспецифические антитела (Tutt A. et al., J. Immunol., 147(1) 60-69 (1991)).

Гетероконъюгатные антитела

[0171] Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Например, такие антитела были предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки и для лечения HIV-инфекции. Предполагается, что данные антитела можно получить in vitro, с применением способов, известных в химии синтетических белков, в том числе способов, включающих перекрестносшивающие средства. Например, иммунотоксины можно сконструировать с применением реакции дисульфидного обмена или посредством образования тиоэфирной связи. Примеры реагентов, подходящих для этой цели, включают иминотиолат и метил-4 меркаптобутиримидат, а также реагенты, известные в данной области.

Разработка эффекторных функций

[0172] Может возникнуть потребность в модификации антитела, предусмотренного в данном документе, в отношении эффекторной функции, с тем чтобы повысить, например, эффективность антитела при лечении рака. Например, остаток(остатки) цистеина можно вводить в Fc-область, тем самым обеспечивая возможность образования межцепочечной дисульфидной связи в данной области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может характеризоваться улучшенной способностью к интернализации и/или усиленным комплементзависимым уничтожением клеток и повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron PC. et al., J. Exp. Med, 176(4): 1191-1195 (1992) и Shopes В., J. Immunol., 148(9): 2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также можно получать с применением гетеробифункциональных поперечносшивающих линкеров, известных в данной области. Альтернативно можно сконструировать антитело, которое обладает двойными Fc-областями и, таким образом, может обладать повышенной способностью в отношении комплементзависимого лизиса и ADCC. См., например, Stevenson GT. et al., Anticancer Drug Des., 3(4): 219-230 (1989).

[0173] Мутации или изменения в последовательностях Fc-областей можно выполнять для улучшения связывания FcR (например, FcγR, FcRn). В соответствии с одним вариантом осуществления антитело по настоящему изобретению обладает по меньшей мере одной измененной эффекторной функцией, выбранной из группы, состоящей из ADCC, CDC и улучшенного связывания FcRn, по сравнению с нативным IgG или исходным антителом. Примеры нескольких полезных специфических мутаций описаны, например, в Shields RL. et al., J. Biol. Chem., 276(6): 6591-6604 (2001); Presta, LG. et al., Biochem. Soc. Trans. 30(4): 487-490 (2002); и WO 00/42072.

[0174] В соответствии с одним вариантом осуществления мутация Fc-рецептора представляет собой замену по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439 в Fc-области, где нумерация остатков в Fc-области соответствует системе нумерации EU. В некоторых вариантах осуществления мутация Fc-рецептора представляет собой замену D265A. В некоторых вариантах осуществления мутация Fc-рецептора представляет собой замену N297 А. Дополнительные подходящие мутации известны в данной области, например, мутации, изложенные в патенте США №7332581.

Иммуноконъюгаты

[0175] Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело или его вариант или мутант, конъюгированные с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).

[0176] Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для получения радиоконъюгированных антител доступны различные радионуклиды. Примеры включают 212Bi, 131I, 13lIn, 90Y и 186Re. Примеры химиотерапевтических средств, применимых для получения таких иммуноконъюгатов, включают те, которые описаны в другом месте данного документа.

[0177] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению конъюгированы с майтанзином, майтанзиноидом или калихеамицином. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению конъюгированы с майтанзиноидом DM1.

[0178] Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с применением различных бифункциональных связывающих белок средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как 2,6-диизоцианат толуола) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин на основе рицина можно получать, как описано в Vitetta ES. et al., Science, 238(4830): 1098-1104 (1987). Меченая углеродом 14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративное хелатирующее средство для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO 94/11026.

[0179] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению можно конъюгировать с "рецептором" (таким как стрептавидин) для применения в предварительном нацеливании на опухоль, где конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту, с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с применением средства для выведения, а затем введением "лиганда" (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим средством (например, радионуклидом).

Ковалентные модификации

[0180] Ковалентные модификации антител к CD73, их вариантов, мутантов и фрагментов включены в объем настоящего изобретения. Один тип ковалентной модификации включает осуществление реакции целевых аминокислотных остатков полипептида с органическим дериватизирующим средством, которое способно реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или С-концевыми остатками полипептида. Дериватизация с применением бифункциональных средств применима, например, для перекрестного сшивания полипептида с водонерастворимой матрицей или поверхностью подложки при использовании в способе очистки антител и наоборот.Обычно используемые перекрестносшивающие средства включают, например, 1,1-бис-(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, например, сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис-(сукцинимидилпропионат), бифункциональные малемиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, и средства, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат.

[0181] Другие модификации включают деамидирование глутаминильных и аспарагинильных остатков до соответствующих глутамильных и аспартильных остатков соответственно, гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование а-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Proteins: Structure and Molecular Properties, Thomas E. Creighton, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), ацетилирование N-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.

[0182] Другой тип ковалентной модификации полипептида включает связывание полипептида с одним из множества небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (PEG), полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, способами, известными в данной области, например, изложенным в патентах США №№4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.

Химерные молекулы

[0183] Антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению также можно модифицировать, если это обеспечивает преимущество, таким образом, чтобы получить химерную молекулу, содержащую полипептид, слитый с другим, гетерологичным полипептидом или аминокислотной последовательностью (например, иммуноадгезинами или слияния пептид-Fc).

[0184] В одном варианте осуществления такая химерная молекула содержит слияние полипептида с доменом белковой трансдукции, который направленно воздействует на полипептид для доставки в различные ткани и, более конкретно, через гематоэнцефалический барьер, с применением, например, домена белковой трансдукции ТАТ-белка вируса иммунодефицита человека (Schwarze SR. et al., Science, 285(5433): 1569-1572 (1999)).

[0185] В определенных вариантах осуществления такая химерная молекула содержит слияние полипептида с полипептидом-меткой, который обеспечивает эпитоп, с которым антитело к метке может избирательно связываться. Эпитопную метку обычно размещают на амино-конце или карбоксильном конце полипептида. Присутствие таких форм полипептида с эпитопной меткой можно обнаруживать с помощью антитела к полипептиду-метке. Также наличие эпитопной метки обеспечивает возможность легкой очистки полипептида посредством аффинной очистки с применением антитела к метке или другого типа аффинной матрицы, которая связывается с эпитопной меткой. В данной области известны различные полипептиды-метки и соответствующие антитела к ним. Примеры включают полигистидиновые (поли-His) или полигистидинглициновые (поли-His-gly) метки; полипептид-метку flu НА и антитело к нему 12СА5 (Field J. et al., Mol. Cell. Biol, 8(5): 2159-2165 (1988)); метку c-myc и антитела к ней 8F9, 3С7, 6Е10, G4, В7 и 9Е10 (Evan GI. et al., Mol. Cell. Biol, 5(12): 3610-3616 (1985)); и метку в виде гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса и антитело к ней (Paborsky LR. et al., Protein Eng., 3(6): 547-553 (1990)). Другие полипептиды-метки включают Flag-пептид (Норр ТР. et al., Bio/Technology, 6: 1204-1210 (1988)); эпитопный пептид КТ3 (Martin GA. et al., Science, 255(5041): 192-194 (1992)); эпитопный пептид α-тубулина (Skinner MP. et al., J. Biol. Chem., 266(9): 15163-15166 (1991)) и пептидную метку из белка гена 10 Т7 (Lutz-Freyermuth С.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(16): 6393-6397 (1990)).

[0186] В альтернативном варианте осуществления химерная молекула может содержать слияние полипептида с иммуноглобулином или конкретной областью иммуноглобулина. В случае бивалентной формы химерной молекулы (например, "иммуноадгезина") такое слияние может осуществляться с Fc-областью молекулы IgG. Слияния Ig по настоящему изобретению включают полипептиды, которые содержат приблизительно или исключительно остатки 94-243, остатки 33-53 или остатки 33-52 человека вместо по меньшей мере одной вариабельной области в молекуле Ig. В особенно предпочтительном варианте осуществления слияние иммуноглобулина включает шарнирную область, области СН2 и СН3 или шарнирную область, области CH1, СН2 и СН3 молекулы IgG1. Получение слияния иммуноглобулинов известно в данной области, см., например, патент США №5428130.

Иммунолипосомы

[0187] Антитело к CD73 и/или его вариант или их мутант по настоящему изобретению также можно получать в составе иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело, получают с помощью способов, известных в данной области, таких как описанные в Epstein DA. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(11): 3688-3692 (1985); Hwang KJ. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4030-4034 (1980) и патентах США №№4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции раскрыты в патенте США №5013556.

[0188] Особенно подходящие липосомы можно получать способом обращено-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (PEG-РЕ). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор с получением липосомы с требуемым диаметром. Fab'-фрагменты антитела по настоящему изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано в Martin FJ. et al., J. Biol. Chem., 257(1): 286-288 (1982) посредством реакции дисульфидного обмена. В липосомах необязательно содержится антинеопластическое средство, средство, ингибирующее рост, или химиотерапевтическое средство (такое как доксорубицин). См. Gabizon A. et al., J. Natl. Cancer Inst., 81(19): 1484-1488 (1989).

Лечение с применением антител к CD73, их вариантов или их мутантов

[0189] Раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для лечения заболевания, нарушения или клинического состояния, связанного с экспрессией CD73, сверхэкспрессией CD73 или аномальной функцией CD73. Например, рак, связанный с экспрессией CD73, может представлять собой без ограничения, например, лимфому, рак почки, рак легких, рак толстой кишки, гепатому, рак желудка, первичную выпотную лимфому, остеосаркому и неходжкинскую лимфому. Дополнительным примером заболевания, нарушения или клинического состояния, связанного с экспрессией CD73, может являться фиброз, включая идиопатический фиброз легких. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены антитела к CD73 и/или варианты/мутанты, раскрытые в данном документе (или их фрагменты), для применения в производстве лекарственного средства для лечения рака или фиброза у субъекта. В определенных вариантах осуществления субъектом, подлежащим лечению, является млекопитающее (например, человек, примат, не являющийся человеком, крыса, мышь, корова, лошадь, свинья, овца, коза, собака, кошка и т.д.). В определенных вариантах осуществления субъектом является человек. В определенных вариантах осуществления субъект является пациентом, подвергающимся клиническому лечению, добровольцем, участвующим в клиническом исследовании, экспериментальным животным и т.д. В определенных вариантах осуществления предполагается, что субъект страдает раком или фиброзом, или подвержен риску их развития.

[0190] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для лечения повторного проявления рака или рецидива рака, ассоциированного с экспрессией CD73.

[0191] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для лечения рефрактерного или устойчивого рака, ассоциированного с экспрессией CD73.

[0192] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для обеспечения адъювантной терапии рака, ассоциированного с экспрессией CD73.

[0193] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для обеспечения поддерживающей терапии рака, ассоциированного с экспрессией CD73.

[0194] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для лечения инвазивного рака, ассоциированного с экспрессией CD73.

[0195] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для лечения неинвазивного рака, ассоциированного с экспрессией CD73.

[0196] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73, их варианты, мутанты и/или их фрагменты, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как люди) для увеличения выживаемости без прогрессирования у субъекта, у которого диагностирован рак, ассоциированный с экспрессией CD73.

[0197] В некоторых вариантах осуществления рак, ассоциированный с экспрессией CD73, который можно подвергать лечению с применением раскрытых антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или их фрагментов, может быть мультирезистентным (MDR) или чувствительным к лекарственным средствам. Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому, гематологический рак и лейкоз. В некоторых вариантах осуществления виды рака, ассоциированные с экспрессией CD73, которые можно подвергать лечению с применением раскрытых антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или их фрагментов, включают без ограничения колоректальный рак, рак яичников, рак желудка, рак желчного пузыря, лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз (CLL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), рак предстательной железы, меланому, рак молочной железы, рак молочной железы с тройным негативным фенотипом (TNBC), рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак в виде глиомы, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, В-клеточный острый лимфобластный лейкоз, медулл о бластому, атипичную тератоидную/рабдоидную опухоль и плоскоклеточный рак полости рта. В дополнительных вариантах виды рака, ассоциированные с экспрессией CD73, которые можно подвергать лечению с применением раскрытых антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или их фрагментов, включают без ограничения рак крови (или кроветворной ткани), мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы (например, рак молочной железы с тройным негативным фенотипом, TNBC), центральной и периферической нервной системы, шейки матки, толстой кишки, головы и шеи, почки, печени, легкого, мелкоклеточный рак легкого, пищевода, желчного пузыря, желудочно-кишечного тракта, мочеполового тракта, опухоли кроветворной ткани лимфоидного происхождения и лимфатической системы, опухоли кроветворной ткани миелоидного происхождения, рак яичников, поджелудочной железы, прямой кишки, желудка, предстательной железы, кожи, включая плоскоклеточную карциному и рак щитовидной железы.

[0198] В некоторых вариантах осуществления рак, ассоциированный с экспрессией CD73, который можно подвергать лечению с применением раскрытых антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или их фрагментов, может представлять собой гематологический рак. В еще одном дополнительном аспекте гематологический рак выбран из лейкоза, миеломы или лимфомы, включая без ограничения острый миелоидный лейкоз (AML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический миелоидный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML), хронический миеломоноцитарный лейкоз (JMML), лимфому Ходжкина, классическую лимфому Ходжкина (cHL), неходжкинскую лимфому, представляющую собой первичную медиастинальную В-клеточную лимфому (NHL PMBCL), неходжкинскую лимфому, множественную миелому, солитарную миелому, локализованную миелому, экстрамедуллярную миелому, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, В-клеточную неходжкинскую лимфому и В-крупноклеточную лимфому. Примеры опухолей кроветворной ткани лимфоидного происхождения включают без ограничения лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому и лимфому Беркитта. Опухоли кроветворной ткани миелоидного происхождения включают без ограничения острый и хронический миелогенные лейкозы, миелодиспластический синдром и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому.

[0199] В других вариантах осуществления рак, ассоциированный с экспрессией CD73, который можно подвергать лечению с применением раскрытых антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или их фрагментов, может представлять собой рак головного мозга или центральной нервной системы. Опухоли центральной и периферической нервной системы включают без ограничения астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы. Дополнительные примеры видов рака головного мозга или центральной нервной системы включают глиому, медуллобластому, примитивную нейроэктодермальная опухоль (PNET), невриному слухового нерва, глиому, менингиому, аденому гипофиза, шванному, лимфому ЦНС, примитивную нейроэктодермальную опухоль, краниофарингиому, хордому, медуллобластому, церебральную нейробластому, центральную нейроцитому, пинеоцитому, пинеобластому, атипичную тератоидную рабдоидную опухоль, хондросаркому, хондрому, карциному сосудистого сплетения, папиллому сосудистого сплетения, краниофарингиому, дизэмбриопластическую нейроэпителиальную опухоль, ганглиоцитому, герминому, гемангиобластому, гемангиоперицитому и метастатическую опухоль головного мозга. В еще одном дополнительном аспекте глиома выбрана из эпендимомы, астроцитомы, олигодендроглиомы и олигоастроцитомы, В еще одном дополнительном аспекте глиома выбрана из ювенильной пилоцитарной астроцитомы, субэпендимальной гигантоклеточной астроцитомы, ганглиоглиомы, субэпендимомы, плеоморфной ксантоастроцитомы, анапластической астроцитомы, мультиформной глиобластомы, глиомы ствола головного мозга, олигодендроглиомы, эпендимомы, олигоастроцитомы, астроцитомы мозжечка, десмопластической детской астроцитомы, субэпендимальной гигантоклеточной астроцитомы, диффузной астроцитомы, смешанной глиомы, глиомы оптических путей, глиоматоза головного мозга, мультифокальной глиоматозной опухоли, многоочаговой опухоли мультиформной глиобластомы, параганглиомы и ганглиоглиомы.

[0200] Другие примеры опухолей, ассоциированных с экспрессией CD73, которые можно подвергать лечению с применением раскрытых антител к CD73, их вариантов, мутантов и/или их фрагментов, включают без ограничения плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карциному легкого, мелкоклеточную карциному легкого, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, остеосаркому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, меланому, тератокарциному, пигментную ксенодерому, кератоакантому, фолликулярный рак щитовидной железы и саркому Капоши.

[0201] Многие способы диагностики рака (такого как меланома, NSCLC, рак головы и шеи, уротелиальний рак, рак молочной железы (например, рак молочной железы с тройным негативным фенотипом, TNBC), рак желудка, классическая лимфома Ходжкина (cHL), неходжкинская лимфома, представляющая собой первичную медиастинальную В-клеточную лимфому (NHL PMBCL), мезотелиома, рак яичника, рак легкого (например, мелкоклеточный рак легкого), рак пищевода, носоглоточной карциномы (NPC), рак желчных протоков, колоректальный рак, рак шейки матки, рак щитовидной железы) или любого другого заболевания, при котором проявляется аномальная функция CD73, и клиническое описание данных заболеваний известны в данной области. Такие способы включают без ограничения, например, иммуногистохимию, ПЦР, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH). Дополнительные подробности, касающиеся способов диагностики аномальной активности или экспрессии CD, описаны в данной области.

[0202] Раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить любым приемлемым путем включая, например, внутривенный, внутримышечный или подкожный пути. В некоторых вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно применять посредством парентерального введения. Под "парентеральным" подразумевается внутривенное, подкожное и внутримышечное введение.

[0203] В некоторых вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации по меньшей мере с одним средством, таким как второе, третье или четвертое средство. По меньшей мере одно средство может представлять собой любое применимое средство, которое, как известно, применяют для лечения рака или фиброза, включая идиопатический фиброз легких.

[0204] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации по меньшей мере с одним средством, применяемым при лечении рака. В конкретном варианте осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации по меньшей мере с одним средством, применяемым при лечении рака, таким как оксалиплатин, лейковорин, фторурацил (5-FU), гемцитабин, паклитаксел (включая связанный с белком паклитаксел, такой как без ограничения связанный с альбумином паклитаксел в виде наночастиц, который иногда называют "наб-паклитаксел") или их ко мбинациями.

[0205] Дополнительные примеры по меньшей мере одного средства, применяемого для лечения рака, включают без ограничения химиотерапевтические средства, иммунотерапевтические средства, противораковые вакцины, антиангиогенные средства, цитокины, виды гормональной терапии, виды генной терапии, виды биологической терапии и виды радиотерапии. Например, по меньшей мере одно средство, которое, как известно, применяют для лечения рака, может являться известным цитостатическим или цитотоксическим, или противоопухолевым средством, таким как антинеопластическое средство, ингибирующее рост, цитотоксическое средство или химиотерапевтическое средство, такое как доцетаксел, гефитиниб, FOLFIRT (иринотекан, 5-фторурацил и лейковорин), иринотекан, цисплатин, карбоплатин, паклитаксел, бевацизумаб (антитело к VEGF), FOLFOX-4, инфузионный фторурацил, лейковорин и оксалиплатин, афатиниб, гемцитабин, капецитабин, пеметрексед, тивантиниб, эверолимус, CpG-ODN, рапамицин, леналидомид, вемурафениб, эндостатин, лапатиниб, РХ-866, импрайм PGG и ирлотинибм.

[0206] В некоторых вариантах осуществления антитела к CD73 и/или их варианты/мутанты (их фрагменты) конъюгированы с дополнительным средством. Например, по меньшей мере одно средство включает урациловый иприт, хлорметин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, пипоброман, триэтиленмеламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин, темозоломид, тиотепу, альтретамин, метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, цитарабин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабинфосфат, пентостатин, бортезомиб, винбластин, винкристин, винорелбин, виндезин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, дексаметазон, клофарабин, кладрибин, пемекстресед, идарубицин, паклитаксел, доцетаксел, иксабепилон, митрамицин, топотекан, иринотекан, дезоксикоформицин, митомицин-С, L-аспарагиназу, интерфероны, этопозид, тенипозид 17а-этинилэстрадиол, диэтилстилбестрол, тестостерон, преднизон, флюоксиместерон, дромостанолон пропионат, тестолактон, мегестролацетат, тамоксифен, метилпреднизолон, метилтестостерон, преднизолон, триамцинолон, хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглютетимид, эстрамустин, медроксипрогестеронацетат, лейпролид, флутамид, торемифен, гозерелин, цисплатин, карбоплатин, гидроксимочевину, амсакрин, прокарбазин, митотан, митоксантрон, левамизол, навельбен, анастразол, летразол, капецитабин, релоксафин, дролоксафин, гексаметилмеламин, оксалиплатин (Eloxatin®), прессу (гефинитиб, Zdl839), XELODA® (капецитабин), Tarceva® (эрлотиниб), азацитидин (5-азацитидин; 5-AzaC), темозоломид (Temodar®), гемцитабин (например, GEMZAR® (гемцитабин HCl)) и вазостатин.

[0207] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним средством, таким как алкилирующие средства, такие как тиотепа и CYTOXAN(R) циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL(R)); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновая кислота; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN(R)), СРТ-I1 (иринотекан, CAMPTOSAR(R)), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновая кислота; тенипозид; криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TML); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; производные нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гаммаII и калихеамицин омегаII (см., например, Nicolaou KC. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов ендииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMYCIN(R), морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, липосомальный доксорубицин HCl для инъекций (DOXIL(R)) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR(R)), тегафур (UFTORAL(R)), капецитабин (XELODA(R)), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиниевая кислота; ацеглатон; альдофосфамидный гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльфорнитин; эллиптиния ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK(R) (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин); уретан; виндезин (ELDISEME(R), FILDESIN(R)); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ара-С"); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL(R)), стабилизированный альбумином состав наночастиц паклитаксела (ABRAXANE(TM)) и доцетаксел (TAXOTERE(R)); хлоранбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN(R)); платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN(R)); оксалиплатин; лейковорин; винорелбин (NAVELBINE(R)); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных средств; а также комбинации двух или более из вышеперечисленных средств, такие как CHOP, сокращение для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращение для схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN(TM)) в комбинации с 5-FU и лейковорином.

[0208] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним средством, которое является ингибитором ангиогенеза, таким как без ограничения ангиостатин (фрагмент плазминогена); антиангиогенный антитромбин III; ангиозим; АВТ-627; Bay 12-9566; бенефин; бевацизумаб; BMS-275291; ингибитор хрящевого происхождения (CDI); CAI; фрагмент комплемента CD59; СЕР-7055; Col 3; комбретастатин А-4; эндостатин (фрагмент коллагена XVIII); фрагмент фибронектина; гро-бета (gro-beta); галофугинон; гепариназы; фрагмент гексасахарида гепарина; HMV833; хорионический гонадотропин человека (hCG); IM-862; интерферон альфа/бета/гамма; индуцируемый интерфероном белок (IP-10); интерлейкин-12; крингл 5 (фрагмент плазминогена); маримастат; ингибиторы металлопротеиназы (TIMP); 2-метоксиэстрадиол; MMI 270 (CGS 27023А); MoAb IMC-1C11; неовастат; NM-3; панзем; PI-88; ингибитор рибонуклеазы плаценты; ингибитор активатора плазминогена; тромбоцитарный фактор-4 (PF4); приномастат; фрагмент пролактина 16 кДа; белок, связанный с пролиферином (PRP); РТК 787/ZK 222594; ретиноиды; солимастат; скваламин; SS 3304; SU 5416; SU 6668; SU 11248; тетрагидрокортизол-С; тетратиомолибдат; талидомид; тромбоспондин-1 (TSP-1); TNP-470; трансформирующий фактор роста-бета (TGF-b); васкулостатин; вазостатин (фрагмент кальретикулина); ZD6126; ZD 6474; ингибиторы фарнезилтрансферазы (FTI) и бисфосфонаты.

[0209] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации по меньшей мере с одним средством, выбираемым из средств, взаимодействующих с ДНК, таких как цисплатин или доксорубицин; ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид; ингибиторы топоизомеразы I, такие как СРТ-11 или топотекан; средства, взаимодействующие с тубулином, такие как паклитаксел, доцетаксел или эпотилоны (например, иксабепилон), либо встречающиеся в природе, либо синтетические; гормональные средства, такие как тамоксифен; ингибиторы тимидилатсинтазы, такие как 5-фторурацил; и антиметаболиты, такие как метотрексат, другие ингибиторы тирозинкиназы, такие как иресса и OSI-774; ингибиторы ангиогенеза; ингибиторы ВТК, ингибиторы SYK, ингибиторы ITK, ингибиторы PI3-киназы, ингибиторы FLT3, ингибиторы EGF; ингибиторы PAK, ингибиторы VEGF; ингибиторы CDK; ингибиторы SRC; ингибиторы c-Kit; ингибиторы Her1/2 и моноклональные антитела, направленные против рецепторов факторов роста, такие как эрбитукс (EGF) и герцептин (Her2), а также другие модуляторы протеинкиназы. Данные средства можно применять в комбинации со средствами дифференциации, такими как ATRA, ингибиторы EZH2, ингибиторы DNMT, кортикостероиды, ингибиторы IDH1, ингибиторы IDH2 и витамин С.

[0210] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации с малыми молекулами, которые усиливают уничтожение за счет повреждений ДНК в раковых клетках, включая ингибиторы PARP, ингибиторы MDM2, ингибиторы NAMPT и ингибиторы HSP90.

[0211] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими средствами, включая антагонисты, антитела и иммуно модуляторы, которые включают без ограничения герцептины, ритуксаны, OVAREX™, PANOREX@, ВЕС2, IMC-C225, VITAMIN, САМРАТН@ I/H, Smart MI95, LYMPHOCIDE™, Smart I D10 и ONCOLYM™, ритуксимаб, гемтузумаб или трастузумаб. В других случаях иммунотерапевтическое средство может представлять собой антитело, направленное в отношении PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, LAG3, TIGIT, TIM3, СЕАСАМ-1, галектина-1, галектина-9, BLTA, CD69, CD113, GPR56, 2В4, CD48, PD1H, LAIR1, TIM-1, TIM-4, VISTA, GARP, CD73, CD39, A2AR, В7-1, В7-2, 4-1BBL, CD137, CD28, CD28H, GITR, GITRL, ICOS, ICOS-L, ОХ40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3, или комбинации антител к таким мишеням. В некоторых случаях иммунотерапевтическое средство может представлять собой антагонист, направленно воздействующий на PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, LAG3, TIGIT, TIM3, СЕАСАМ-1, галектин-1, галектин-9, BLTA, CD69, CD113, GPR56, 2 В4, CD48, PD1H, LAIR1, TIM-1, TIM-4, VISTA, GARP, CD73, CD39, A2AR, или их комбинации; агонист, направленно воздействующий на В7-1, В7-2, 4-1BBL, CD137, CD28, CD28H, GITR, GITRL, ICOS, ICOS-L, ОХ40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 или их комбинации; или комбинации вышеуказанных антагонистов и агонистов.

[0212] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации с антителами, которые направлены в отношении молекул клеточной поверхности на иммунных клетках или раковых клетках, включая без ограничения EGFR, HER2, CD38, мезотелин, CD33, CD37, CD19, CD20, CD3, CD123, CD70, BAFFR, CD4, CD8, CD56, CD38, или комбинациями таких антител. В некоторых конкретных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации с антителами, которые направлены в отношении молекул клеточной поверхности на иммунных клетках или раковых клетках, включая без ограничения EGFR, HER2, или комбинациями таких антител.

[0213] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации по меньшей мере с одним химиотерапевтическим средством, таким как алкилирующие средства, антиметаболиты, платинирующие средства, таксоид, антигормональное средство, ингибиторы топоизомеразы, средства, воздействующие на тубулин, ингибиторы передачи сигналов (например, ингибиторы киназ) и другие химиотерапевтические средства. "Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, применимое при лечении рака. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; производные нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гаммаII и калихеамицин омегаII (см., например, Nicolaou KC. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов ендииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMYCIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, липосомальный доксорубицин HCl для инъекций (DOXIL®), липосомальный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®), пеглилированный липосомальный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабин (XELODA®), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиниевая кислота; ацеглатон; альдофосфамидный гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльфорнитин; эллиптиния ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин); уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ара-С"); тиотепу; таксоид, например, паклитаксел (TAXOL®), стабилизированный альбумином состав наночастиц паклитаксела (ABRAXANE™) и доцетаксел (TAXOTERE®); хлоранбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка розового, которые предотвращают образование микротрубочек при полимеризации тубулина, включая винбластин (VELBAN®); винкристин (ONCOVIN®), виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®); этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN®); бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOSO® или OSTAC®), этидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедроновая кислота/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) или ризедронат (ACTONEL®); троксацитабин (аналог цитозина 1,3-диоксоланового нуклеозида); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности те, которые ингибируют экспрессию генов в сигнальных путях, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, такие как, например, PKC-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и геннотерапевтические вакцины, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®); rmRH (например, ABARELIX®); BAY439006 (сорафениб; Bayer); SU-11248 (Pfizer); перифозин, ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®); CCI-779; типифарниб (R11577); орафениб, АВТ510; ингибитор Bcl-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®); пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже); ингибиторы тирозинкиназы (см. определение ниже); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных средств; а также комбинации двух или более из вышеперечисленных средств, такие как CHOP, сокращение для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращение для схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN™) в комбинации с 5-FU и лейковорином.

[0214] В данном документе химиотерапевтические средства включают "антигормональные средства" или "эндокринные терапевтические средства", чье действие регулирует, уменьшает, блокирует или ингибирует эффекты гормонов, которые могут способствовать росту рака. Они могут сами являться гормонами, включая без ограничения антиэстрогены со смешанным профилем агонистов/антагонистов, включая тамоксифен (NOLVADEX®), 4-гидрокситамоксифен, торемифен (FARESTON®), идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®), триоксифен, кеоксифен и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецептора эстрогена (ER), ингибировать связывание ДНК, увеличивать обмен ER и/или подавлять уровни ER); ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и экземестан (AROMASIN®), и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®), летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид, и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR®), мегестрола ацетат (MEGASE®), фадрозол и 4(5)-имидазолы; агонисты гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®), гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероидные гормоны, включая прогестины, такие как мегестрола ацетат и медроксипрогестерона ацетат, эстрогены, такие как диэтилстильбэстрол и премарин, и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; супрессоры эстрогеновых рецепторов (ERD); антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных средств; а также комбинации двух или более из вышеперечисленных средств.

[0215] В данном документе "таксоид" представляет собой химиотерапевтическое средство, чье действие ингибирует деполимеризацию микротрубочек. Примеры включают паклитаксел (TAXOL®), стабилизированный альбумином состав наночастиц паклитаксела (ABRAXANE™) и доцетаксел (TAXOTERE®). Предпочтительным таксоидом является паклитаксел.

[0216] Используемый в данном документе термин "ингибитор EGFR" относится к соединениям, которые связываются с EGFR или иным образом непосредственно взаимодействуют с ним и предотвращают или снижают его сигнальную активность, и данный термин альтернативно упоминается как "антагонист EGFR". Примеры таких средств включают антитела и малые молекулы, которые связываются с EGFR. Примеры антител, которые связываются с EGFR, включают MAb 579 (АТСС CRL НВ 8506), MAb 455 (АТСС CRL НВ8507), MAb 225 (АТСС CRL 8508), MAb 528 (АТСС CRL 8509) (см. патент США №4943533, Mendelsohn et al.) и их варианты, такие как химер изо ванное 225 (С225 или цетуксимаб; ERBUTIX®) и реконструированное 225 человека (Н225) (см. WO 96/40210, knclone Systems Inc.); IMC-11F8, полностью человеческое, направленное на EGFR антитело (hnclone); антитела, которые связывают мутантный EGFR типа II (патент США №5212290); гуманизированные и химерные антитела, которые связывают EGFR, описанные в патенте США №5891996; и антитела человека, которые связывают EGFR, такие как ABX-EGF или панитумумаб (см. WO 98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto G. et al., Eur. J. Cancer, 32A(4): 636-640 (1996)); EMD7200 (матузумаб), гуманизированное антитело к EGFR, направленное против EGFR, которое конкурирует как с EGF, так и с TGF-альфа за связывание EGFR (EMD/Merck); человеческое антитело к EGFR, HuMax-EGFR (GenMab); полностью человеческие антитела, известные как Е1.1, Е2.4, Е2.5, Е6.2, Е6.4, E2.11, Е6.3 и Е7.6.3, описанные в патенте США №6235883; MDX-447 (Medarex Inc); и mAb 806 или гуманизированное mAb 806 (Johns TG. et al., J. Biol. Chem., 279(29):30375-30384 (2004)). Антитело к EGFR можно конъюгировать с цитотоксическим средством с получением при этом иммуноконъюгата (см., например, ЕР659439А2, Merck Patent GmbH). Антагонисты EGFR включают малые молекулы, такие как соединения, описанные в патентах США №№: 5616582, 5457105, 5475001, 5654307, 5,679,683, 6084095, 6265410, 6455534, 6521620, 6596726, 6713484, 5770599, 6140332, 5866572, 6399602, 6344459, 6602863, 6391874, 6344455, 5760041, 6002008 и 5747498, а также следующих публикациях РСТ: WO 98/14451, WO 98/50038, WO 99/09016 и WO 99/24037. Конкретные малые молекулы-антагонисты EGFR включают OSI-774 (СР-358774, эрлотиниб, TARCEVA®, Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-пропенамид, N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолинил)пропокси]-6-хиназолинил]-, дигидрохлорид, Pfizer Inc.); ZD1839, гефитиниб (IRESSA J) 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-амино-4-(3-метилфениламино)хиназолин, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-хлор-4-фторфенил)-N2-(1-метилпиперидин-4-ил)пиримидо[5,4-d]пиримидин-2,8-диамин, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-фенилэтил)амино]-1Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенол); (R)-6-(4-гидроксифенил)-4-[(1-фенилэтил)амино]-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин); CL-3 87785 (N-[4-[(3-бромфенил)амино]-6-хиназолинил]-2-бутинамид); EKB-569 (N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолинил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид) (Wyeth); AG1478 (Sugen); AG1571 (SU 5271; Sugen); двойные ингибиторы тирозинкиназы EGFR/HER2, такие как лапатиниб (GW 572016 или N-[3-хлор-4-[(3 фторфенил)метокси]фенил]6[5[[[2метилсульфонил)этил]амино]метил]-2-фуранил]-4-хиназолинамин; Glaxo-SmithKline).

[0217] "Ингибитор тирозинкиназы" представляет собой молекулу, которая ингибирует тирозинкиназную активность тирозинкиназы, такой как рецептор HER. Примеры таких ингибиторов включают лекарственные средства, направленные на EGFR, указанные в предыдущем абзаце; малую молекулу-ингибитор тирозинкиназы HER2, такой как TAK 165, доступный от Takeda; СР-724,714, селективный ингибитор тирозинкиназы рецептора ErbB2 для перорального применения (Pfizer и OSI); двойные ингибиторы HER, такие как EKB-569 (доступный от Wyeth), который предпочтительно связывает EGFR, но ингибирует как HER2-, так и EGFR-сверхэкспрессирующие клетки; лапатиниб (GW572016; доступный от Glaxo-SmithKline), ингибитор тирозинкиназы HER2 и EGFR для перорального применения; PKI-166 (доступный от Novartis); пан-ингибиторы HER, такие как канертиниб (CI-1033; Pharmacia); ингибиторы Raf-1, такие как антисмысловое средство ISIS-5132, доступное от ISIS Pharmaceuticals, которое ингибирует передачу сигнала Raf-1; ингибиторы TK, не направленные на HER, такие как иматиниба мезилат (GLEEVAC J) доступный от Glaxo; ингибитор MAPK регулируемой внеклеточными сигналами киназы I CI-1040 (доступный от Pharmacia); хиназолины, такие как PD 153035,4-(3-хлоранилино)хиназолин; пиридопиримидины; пиримидопиримидины; пирролопиримидины, такие как CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706; пиразолопиримидины, 4-(фениламино)-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидины; куркумин (диферулоилметан, 4,5-бис-(4-фторанилино)фталимид); тирфостины, содержащие нитротиофеновые фрагменты; PD-0183805 (Warner-Lambert); антисмысловые молекулы (например, те, которые связываются с HER-кодирующей нуклеиновой кислотой); хиноксалины (патент США №5804396); трифостины (патент США №5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); пан-ингибиторы HER, такие как CI-1033 (Pfizer); аффинитак (ISIS 3521; Isis/Lilly); иматиниба мезилат (гливек (Gleevac); Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); семаксиниб (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1С11 (Imclone); или средства, описанные в любой из следующих патентных публикаций: патент США №5804396; WO 99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); и WO 96/33980 (Zeneca).

[0218] В различных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в комбинации с актиномицином D, капецитабином, карбоплатином, цисплатином, колхицином, даунорубицином, доцетакселом, доксорубицином, эпирубицином, этопозидом, 5-фторурацилом, гемцитабином, мелфаланом, метотрексатом, митомицином С, митоксантроном, паклитакселом, талидомидом, топотеканом, винбластином и винкристином.

[0219] В различных вариантах осуществления раскрытые антитела к CD73 и/или их варианты или мутанты (или их фрагменты), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно применять в комбинации с одним или несколькими дополнительными видами терапии или клинических вмешательств, такими как радиотерапия, хирургическое вмешательство, химиотерапия и/или таргетная терапия. В определенных вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант (или его фрагмент), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, применяют в комбинации с радиотерапией при выявленном раке.

[0220] В некоторых вариантах осуществления раскрытое антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или их фрагмент), и/или фармацевтическую композицию, предусмотренную в данном документе, можно вводить совместно с хирургическим вмешательством, например, хирургическое вмешательство можно проводить до введения раскрытых антител к CD73, хирургическое вмешательство можно проводить после введения раскрытых антител к CD73, и/или хирургическое вмешательство можно проводить во время введения раскрытых антител к CD73 или примерно в то же время, что и введение раскрытых антител к CD73.

[0221] В зависимости от показания к лечению и факторов, относящихся к дозированию, с которыми должен быть знаком врач-специалист в своей области, антитела к CD73, их варианты, мутанты или их фрагменты, предусмотренные в данном документе, будут вводиться с эффективной дозировкой, например, дозировкой, которая обеспечивает эффективность лечения при данном показании с одновременной минимизацией токсичности и побочных эффектов. В целом является предпочтительным использование максимальной дозы фармакологических средств по настоящему изобретению (отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами), то есть наивысшей безопасной дозы согласно результатам обоснованной медицинской оценки. Однако специалистам в данной области будет понятно, что пациент может настаивать на более низкой дозе или переносимой дозе по медицинским причинам, психологическим причинам или практически по любым другим причинам. В некоторых случаях эффективная дозировка может являться дозировкой, при которой требуемый ответ представляет собой подавление прогрессирования заболевания или состояния, например, прогрессирования рака. Это может включать только временное замедление прогрессирования заболевания, хотя более предпочтительно, ответ включает постоянное прекращение прогрессирования заболевания. Это можно контролировать с помощью обычных диагностических способов, известных обычному специалисту в данной области, для любого конкретного заболевания. Требуемый ответ в отношении лечения заболевания или состояния также может представлять собой задержку начала или даже предотвращение начала заболевания или состояния.

[0222] Токсичность и терапевтическую эффективность раскрытых антител к CD73 и/или их вариантов или мутантов (или их фрагментов), и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, можно определять с помощью стандартных фармацевтических способов на культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (дозы, приводящей к гибели 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной в 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами является терапевтическим индексом, и его можно выразить как соотношение LD₅₀/ED₅₀. Требуемыми могут являться соединения, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы. Хотя можно применять раскрытые антитела к CD73 и/или их варианты или мутанты (или их фрагменты), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, которые проявляют токсические побочные эффекты, следует позаботиться о разработке системы доставки, которая направляет такие соединения к участку пораженной ткани, с целью минимизации потенциального повреждения непораженных клеток и, следовательно, уменьшения побочных эффектов.

[0223] Данные, полученные из анализов в клеточных культурах и исследований на животных, можно использовать для составления диапазона доз для применения на людях. Доза раскрытых антител к CD73 и/или их вариантов или мутантов (или их фрагментов), и/или фармацевтических композиций, предусмотренные в данном документе, предпочтительно находится в пределах диапазона концентраций в циркулирующей крови, который включает ED50 с небольшой токсичностью или без нее. Дозы могут варьировать в данном диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого из раскрытых антител к CD73 и/или их вариантов или мутантов (или их фрагментов), и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, терапевтически эффективную дозу можно первоначально оценивать с помощью анализов на культуре клеток. Дозу можно определять в моделях на животных с получением диапазона концентраций в плазме циркулирующей крови, который включает IC50, определенную в экспериментах на клеточных культурах. Такую информацию можно использовать для более точного определения применимых доз для человека. Уровни в плазме крови можно измерять, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

[0224] Противоопухолевую активность раскрытых антител к CD73 и/или их вариантов или мутантов (или их фрагментов), и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, можно определять посредством использования различных экспериментальных моделей на животных, таких как модель на мышах SCID или голых мышах с трансплантатами опухолей человека, известных в данной области и описанных в Yamanaka K. et al., Microbiol. Immunol, 45(7): 507-514 (2001).

[0225] Раскрытые антитела к CD73 и/или их варианты или мутанты (или их фрагменты) и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно тестировать in vitro, и затем in vivo в отношении требуемой терапевтической или профилактической активности перед применением на людях. Например, анализы in vitro, которые можно использовать для определения того, показано ли применение конкретного терапевтического протокола, включают анализы in vitro на клеточных культурах, в которых образец ткани пациента выращивают в культуре и подвергают протоколу или иным образом применяют протокол, и наблюдают влияние такого протокола на образец ткани.

[0226] Более низкий уровень пролиферации или выживания клеток, подвергшихся контакту, может указывать на то, что раскрытые антитела к CD73 и/или их варианты или мутанты (или их фрагментов), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, могут являться эффективными для лечения выбранного нарушения у субъекта. Альтернативно, вместо культивирования клеток пациента, протоколы можно проверять с применением клеток опухолевой линии или линии злокачественных клеток. Многие анализы, известные в данной области, можно применять для оценки такой выживаемости и/или роста; например, пролиферацию клеток можно анализировать посредством измерения включения ЗН-тимидина, посредством непосредственного подсчета клеток, посредством обнаружения изменений транскрипционной активности известных генов, таких как протоонкогены или маркеры клеточного цикла; жизнеспособность клеток можно оценивать посредством окрашивания трипановым синим, тогда как дифференциацию можно оценивать визуально на основе изменений морфологии и т.д.

[0227] Раскрытые антитела к CD73 и/или их варианты или мутанты (или их фрагменты), и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, для применения в терапии можно тестировать в применимых системах моделей на животных перед тестированием на людях, включая без ограничений модели на крысах, мышах, курах, коровах, обезьянах, кроликах и т.д. Основные животные модели рака, известные в данной области и широко применяемые, включают мышей, таких как описанные в Напп В. et al., Curr. Opin. Cell Biol., 13 (6): 778-784 (2001), которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.

[0228] Дополнительно, любые анализы, известные специалистам в данной области, можно применять для оценки профилактической и/или терапевтической полезности раскрытых антител к CD73 и/или их вариантов или мутантов (или их фрагментов), и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, для лечения, профилактики, контроля или облегчения одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или нарушением, которые описаны выше в данном документе.

[0229] Специалисты в данной области могут легко определить применимые суточные дозы для лечения или профилактики нарушения, описанного в данном документе. Для лечения раскрытого рака типичная доза может находиться, например, в диапазоне от 0,001 до 1000 мкг; однако дозы ниже или выше данного иллюстративного диапазона находятся в пределах объема настоящего изобретения. Суточная доза может составлять от приблизительно 0,1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг общей массы тела (например, приблизительно 5 мкг/кг, приблизительно 10 мкг/кг, приблизительно 100 мкг/кг, приблизительно 500 мкг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг или находиться в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеперечисленных значений), предпочтительно от приблизительно 0,3 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг общей массы тела (например, приблизительно 0,5 мкг/кг, приблизительно 1 мкг/кг, приблизительно 50 мкг/кг, приблизительно 150 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 750 мкг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг или находиться в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеперечисленных значений), более предпочтительно от приблизительно 1 мкг/кг до 1 мг/кг общей массы тела (например, приблизительно 3 мкг/кг, приблизительно 15 мкг/кг, приблизительно 75 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 900 мкг/кг или находиться в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеперечисленных значений) и еще более предпочтительно от приблизительно 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день (например, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг или находиться в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеперечисленных значений, включая любой диапазон между вышеперечисленными значениями). Как отмечалось выше, терапевтическую или профилактическую эффективность можно контролировать посредством периодической оценки пациентов, получающих лечение. При повторных введениях в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до проявления требуемого подавления симптомов заболевания. Однако, другие схемы введения могут являться применимыми и находятся в пределах объема настоящего изобретения. Требуемую дозу можно доставлять посредством однократного болюсного введения композиции, посредством многократного болюсного введения композиции или посредством введения непрерывной инфузией композиции.

[0230] Фармацевтическую композицию, содержащую антитело к CD73, его вариант, мутант или их фрагмент, можно вводить один, два, три или четыре раза в день. Композиции также можно вводить с меньшей частотой, чем ежедневно, например, шесть раз в неделю, пять раз в неделю, четыре раза в неделю, три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца или один раз в шесть месяцев. Композиции также можно вводить в составе с замедленным высвобождением, например, в имплантате, который постепенно высвобождает композицию для использования в течение определенного периода времени и который обеспечивает возможность введения композиции с меньшей частотой, например, введения один раз в месяц, один раз в 2-6 месяцев, один раз в год или даже однократно. Средства с замедленным высвобождением (такие как гранулы, наночастицы, микрочастицы, наносферы, микросферы и т.п.) можно вводить посредством инъекции.

[0231] Антитело и/или вариант или мутант (или их фрагмент) можно вводить в виде однократной суточной дозы, или общую суточную дозу можно вводить разделенными дозами, вводимыми два, три или четыре раза в сутки. Композиции также можно вводить с меньшей частотой, чем ежедневно, например, шесть раз в неделю, пять раз в неделю, четыре раза в неделю, три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца или один раз в шесть месяцев. Антитело (или его фрагмент) также можно вводить в составе с замедленным высвобождением, например, в имплантате, который постепенно высвобождает композицию для использования в течение определенного периода времени и который обеспечивает возможность введения композиции с меньшей частотой, например, введения один раз в месяц, один раз в 2-6 месяцев, один раз в год или даже однократно. Средства с замедленным высвобождением (такие как гранулы, наночастицы, микрочастицы, наносферы, микросферы и т.п.) можно вводить посредством инъекции или имплантировать хирургически в различные места.

[0232] Способы лечения рака можно оценивать, например, без ограничения по регрессии опухоли, уменьшению массы или размера опухоли, времени до прогрессирования, продолжительности выживания, выживаемости без прогрессирования, общей частоте ответа, продолжительности ответа, качеству жизни, экспрессии и/или активности белка. Можно использовать подходы к определению эффективности терапии, включающие, например, измерение ответа с помощью радиологической визуализации.

[0233] В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения измеряют как процент ингибирования роста опухоли (% TGI), рассчитанный с применением уравнения 100-(Т/С × 100), где Т представляет собой средний относительный объем обработанной опухоли, а С представляет собой средний относительный объем необработанной опухоли. В определенных вариантах осуществления %TGI составляет приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95% или более 95%. В определенных вариантах осуществления % TGI в случае антитела CD73 и/или его варианта или мутанта является таким же, как % TGI в случае эталонного антитела к CD73, или превышает его, например, в приблизительно 1,1 раза, в приблизительно 1,2 раза, в приблизительно 1,3 раза, в приблизительно 1,4 раза, в приблизительно 1,5 раза, в приблизительно 1,6 раза, в приблизительно 1,7 раза, в приблизительно 1,8 раза, в приблизительно 1,9 раза, в приблизительно 2 раза, в приблизительно 2,1 раза, в приблизительно 2,2 раза, в приблизительно 2,3 раза, в приблизительно 2,4 раза, в приблизительно 2,5 раза, в приблизительно 2,6 раза, в приблизительно 2,7 раза, включая любой диапазон между данными значениями, или более чем в приблизительно 2,7 раза превышает % TGI в случае эталонного антитела к CD73.

Фармацевтические композиции

[0234] Раскрытое антитело к CD73 и/или вариант или мутант (или их фрагмент) по настоящему изобретению можно получать в виде фармацевтической композиции, содержащей подходящие носители или вспомогательные вещества, если они являются подходящими для введения. Подходящие фармацевтические композиции на основе антител получают посредством смешивания антитела (или его фрагмента), характеризующегося требуемой степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие буферы на основе органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил-или пропилпарабен; катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONIC™ или полиэтиленгликоль (PEG). Иллюстративные составы на основе антител описаны в WO 98/56418, явным образом включенной в данный документ посредством ссылки. Лиофилизированные фармацевтические композиции, адаптированные для подкожного введения, описаны в WO 97/04801. Такие лиофилизированные фармацевтические композиции можно восстанавливать с применением подходящего разбавителя до высокой концентрации белка и восстановленный состав можно вводить подкожно млекопитающему, подлежащему лечению согласно данному документу.

[0235] В некоторых вариантах осуществления раскрытая фармацевтическая композиция является подходящей для парентерального или внутривенного введения. В некоторых случаях раскрытая фармацевтическая композиция, подходящая для парентерального введения, может представлять собой водный и неводный состав, который является изотоничным по отношению к крови предполагаемого субъекта, и водные и неводные стерильные суспензии могут включать суспендирующие системы, разработанные для нацеливания соединения на компоненты крови одного или нескольких органов. Составы могут быть представлены в герметичных контейнерах с однократной дозой или многократными дозами, например в ампулах или флаконах. Экстемпоральные инъекционные растворы и суспензии можно получать из стерильных порошков, гранул и таблеток, подобных описанным ранее. Состав для парентерального и внутривенного введения может содержать минералы и другие материалы, для придания ему совместимости с выбранным типом инъекции или системой доставки.

[0236] Обычно используемые фармацевтически приемлемые носители для парентерального введения включают воду, подходящее масло, солевой раствор, водный раствор декстрозы (глюкозы) или растворы родственных Сахаров и гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоли. Растворы для парентерального введения предпочтительно содержат водорастворимую соль активного ингредиента, подходящие стабилизирующие средства и, при необходимости, буферные вещества, антиоксидантные средства, такие как бисульфит натрия, сульфит натрия или аскорбиновая кислота, либо по отдельности, либо в комбинации, являющиеся подходящими стабилизирующими средствами. Соли лимонной кислоты и натриевую соль EDTA также можно использовать в качестве носителей. Кроме того, растворы для парентерального введения могут содержать консерванты, такие как хлорид бензалкония, метил- или пропилпарабен или хлорбутанол. Подходящие фармацевтические носители описаны в Remington, упомянутом выше.

[0237] Составы для инъекций можно получать в обычных формах либо в виде жидких растворов, либо в форме суспензий; в твердых формах, подходящих для солюбилизации или суспендирования в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Предпочтительно стерильные суспензии для инъекций составляются согласно методикам, известным из уровня техники, с применением подходящих фармацевтически приемлемых носителей и других необязательных компонентов, описанных выше.

[0238] Парентеральное введение можно осуществлять множеством способов, но предпочтительным является применение шприца, катетера или подобного устройства для парентерального введения составов, описанных в данном документе. Состав можно вводить путем инъекции системно, таким образом, что действующее вещество перемещается в значительной степени по всему кровотоку.

[0239] Кроме того, состав также можно вводить путем инъекции локально в целевой участок, например вводить путем инъекции в конкретную часть тела для лечения рака или фиброза. Преимущество локального введения посредством инъекции состоит в том, что оно ограничивает или предотвращает воздействие действующего вещества(веществ) (например ингибиторов и/или других терапевтических средств) на весь организм. Следует отметить, что в контексте настоящего изобретения термин "локальное введение" включает региональное введение, например введение состава, направленное в часть тела посредством доставки в кровеносный сосуд, снабжающий данную зону тела. Локальная доставка может быть прямой, например внутриопухолевой. Локальная доставка также может быть почти прямой, т.е. внутриочаговой или внутрибрюшинной, то есть в область, которая находится достаточно близко к опухоли или участку инфекции, таким образом, чтобы ингибитор проявлял требуемую фармакологическую активность. Таким образом, если требуется локальная доставка, фармацевтические составы предпочтительно доставляются внутриочагово, интратуморально или внутрибрюшинно.

[0240] В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции представлены в стандартной лекарственной форме. В такой форме композиция разделена на однократные дозы, содержащие соответствующие количества действующего компонента. Стандартная лекарственная форма может представлять собой упакованный препарат, при этом упаковка содержит дискретные количества препаратов, например лиофилизированные порошки во флаконах или ампулах.

[0241] Фармацевтическая композиция согласно данному документу также может содержать более одного активного соединения, если это необходимо в случае конкретного показания к лечению, предпочтительно соединения с дополняющими видами активности, которые не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Например, может потребоваться дополнительное предоставление антинеопластического средства, средства, подавляющего рост, цитотоксического средства или химиотерапевтического средства. Такие молекулы должным образом присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для достижения предполагаемой цели. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела, присутствующего в составе, типа заболевания или нарушения, или лечения и других факторов, рассмотренных выше. Они обычно используются в таких же дозах и с теми же путями введения, которые описаны в данном документе, или используются от приблизительно 1 до 99% прежде применяемых доз. Активные ингредиенты также можно заключать в микрокапсулы, полученные, например, посредством методик коацервации или посредством межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0242] Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Примеры подходящих препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антагонист, при этом данные матрицы находятся в форме изделий определенной формы, например пленки или микрокапсулы. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, недеградируемые сополимеры этилена и винила, деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как сополимер этилена и винилацетата и сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, обеспечивают высвобождение молекул в течение более чем 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Если инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. В зависимости от задействованного механизма можно разрабатывать рациональные стратегии стабилизации. Например, если выявлено, что механизм агрегации представляет собой образование межмолекулярной связи S-S посредством тиодисульфидного обмена, стабилизации можно достичь посредством модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контроля содержания влаги, применения соответствующих добавок и разработки композиций на основе специфической полимерной матрицы.

[0243] Липофектины или липосомы можно использовать для доставки полипептидов и антител (или их фрагментов) или композиций по настоящему изобретению в клетки. Если используются фрагменты антител, предпочтительным является наименьший ингибирующий фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом белка-мишени. Например, на основе последовательностей вариабельных областей антитела можно сконструировать пептидные молекулы, которые сохраняют способность связываться с последовательностью белка-мишени. Такие пептиды можно синтезировать химическим путем и/или получать посредством технологии рекомбинантных ДНК. См., например, Marasco WA. etal.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(16): 7889-7893 (1993).

[0244] Активные ингредиенты также можно заключать в микрокапсулы, полученные, например, посредством методик коацервации или посредством межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, выше.

[0245] Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Примеры подходящих препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело (или его фрагмент), при этом данные матрицы находятся в форме изделий определенной формы, например пленки или микрокапсулы. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, недеградируемые сополимеры этилена и винилацетата, деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOT ТМ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как сополимер этилена и винилацетата и сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, обеспечивают высвобождение молекул в течение более чем 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Если инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. В зависимости от задействованного механизма можно разрабатывать рациональные стратегии стабилизации. Например, если выявлено, что механизм агрегации представляет собой образование межмолекулярной связи S-S посредством тиодисульфидного обмена, стабилизации можно достичь посредством модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контроля содержания влаги, применения соответствующих добавок и разработки композиций на основе специфической полимерной матрицы.

[0246] В определенных вариантах осуществления состав содержит антитело к CD73 и/или его вариант или мутант, раскрытые в данном документе, в концентрации, превышающей приблизительно 0,5 мг/мл, превышающей приблизительно 1 мг/мл, превышающей приблизительно 2 мг/мл, превышающей приблизительно 3 мг/мл, превышающей приблизительно 4 мг/мл, превышающей приблизительно 5 мг/мл, превышающей приблизительно 6 мг/мл, превышающей приблизительно 7 мг/мл, превышающей приблизительно 8 мг/мл, превышающей приблизительно 9 мг/мл, превышающей приблизительно 10 мг/мл, превышающей приблизительно 11 мг/мл, превышающей приблизительно 12 мг/мл, превышающей приблизительно 13 мг/мл, превышающей приблизительно 14 мг/мл, превышающей приблизительно 15 мг/мл, превышающей приблизительно 16 мг/мл, превышающей приблизительно 17 мг/мл, превышающей приблизительно 18 мг/мл, превышающей приблизительно 19 мг/мл, превышающей приблизительно 20 мг/мл, превышающей приблизительно 21 мг/мл, превышающей приблизительно 22 мг/мл, превышающей приблизительно 23 мг/мл, превышающей приблизительно 24 мг/мл, превышающей приблизительно 25 мг/мл, превышающей приблизительно 26 мг/мл, превышающей приблизительно 27 мг/мл, превышающей приблизительно 28 мг/мл, превышающей приблизительно 29 мг/мл или превышающей приблизительно 30 мг/мл, включая любой диапазон между данными значениями.

[0247] Состав, содержащий раскрытое антитело, должен характеризоваться рН (в конечном составе), который не сходен со значением изоэлектрической точки антитела или фрагмента, например, если рН состава составляет 7, то подходящим может быть значение pI от 8 до 9 или выше. Без ограничения теорией считается, что это может в конечном итоге придать конечному составу улучшенную стабильность, например, антитело или фрагмент останутся в растворе. Например, в определенных вариантах осуществления раскрытый фармацевтический состав при рН в диапазоне от 4,0 до 7,0 может содержать: от 1 до 200 мг/мл антитела согласно настоящему изобретению и от 1 до 100 мМ буфера и необязательно одно или несколько из следующего: (а) от 0,001 до 1% поверхностно-активного вещества, (b) от 10 до 500 мМ стабилизатора, (с) от 10 до 500 мМ стабилизатора и от 5 до 500 мМ средства, регулирующего тоничность, и/или (d) от 5 до 500 мМ средства, регулирующего тоничность. Подходящие буферы включают без ограничения цитратный, глициновый, фосфатный, ацетатный, сукцинатный и бикарбонатный. Например, состав при рН, составляющем приблизительно 6, может содержать от 1 до 50 мг/мл антитела, 20 мМ L-гистидина HCl, 240 мМ трегалозы и 0,02% полисорбата 20. В качестве альтернативы, состав при рН, составляющем приблизительно 5,5, может содержать от 1 до 50 мг/мл антитела, 20 мМ цитратного буфера, 240 мМ сахарозы, 20 мМ аргинина и 0,02% полисорбата 20.

[0248] В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или мутант составляются (например при концентрации, превышающей приблизительно 0,5 мг/мл, превышающей приблизительно 1 мг/мл, превышающей приблизительно 5 мг/мл, превышающей приблизительно 10 мг/мл, превышающей приблизительно 15 мг/мл, превышающей приблизительно 20 мг/мл или превышающей приблизительно 25 мг/мл, включая любой диапазон между данными значениями) в буфере, содержащем цитрат, NaCl, ацетат, сукцинат, глицин, полисорбат 80 (Tween 80) или любую комбинацию из вышеперечисленного. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант составляются (например при концентрации, превышающей приблизительно 0,5 мг/мл, превышающей приблизительно 1 мг/мл, превышающей приблизительно 5 мг/мл, превышающей приблизительно 10 мг/мл, превышающей приблизительно 15 мг/мл, превышающей приблизительно 20 мг/мл или превышающей приблизительно 25 мг/мл, включая любой диапазон между данными значениями) в буфере, содержащем от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ глицина. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант составляются в буфере, содержащем от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ NaCl. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или мутант составляются (например при концентрации, превышающей приблизительно 0,5 мг/мл, превышающей приблизительно 1 мг/мл, превышающей приблизительно 5 мг/мл, превышающей приблизительно 10 мг/мл, превышающей приблизительно 15 мг/мл, превышающей приблизительно 20 мг/мл или превышающей приблизительно 25 мг/мл, включая любой диапазон между данными значениями) в буфере, содержащем от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ ацетата. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант составляются в буфере, содержащем от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ сукцината. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или мутант составляются (например при концентрации, превышающей приблизительно 0,5 мг/мл, превышающей приблизительно 1 мг/мл, превышающей приблизительно 5 мг/мл, превышающей приблизительно 10 мг/мл, превышающей приблизительно 15 мг/мл, превышающей приблизительно 20 мг/мл или превышающей приблизительно 25 мг/мл, включая любой диапазон между данными значениями) в буфере, содержащем от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,02% полисорбата 80. В определенных вариантах осуществления антитело к CD73 и/или его вариант или мутант составляются в подходящем буфере с обеспечением рН буфера, составляющего от приблизительно 5,1 до 5,6. Например, антитело к CD73 и/или его вариант или мутант можно составлять в буфере, содержащем 10 мМ цитрата, 100 мМ NaCl, 100 мМ глицина и 0,01% полисорбата 80, где состав характеризуется рН, составляющим 5,5.

[0249] В определенных вариантах осуществления состав (такой как состав, содержащий буфер, содержащий 10 мМ цитрата, 100 мМ NaCl, 100 мМ глицина и 0,01% полисорбата 80, где состав характеризуется рН, составляющим 5,5), содержащий антитело к CD73 и/или его вариант или мутант, описанные в данном документе (например при концентрации, превышающей приблизительно 0,5 мг/мл, превышающей приблизительно 1 мг/мл, превышающей приблизительно 5 мг/мл, превышающей приблизительно 10 мг/мл, превышающей приблизительно 15 мг/мл, превышающей приблизительно 20 мг/мл или превышающей приблизительно 25 мг/мл, включая любой диапазон между данными значениями), является стабильным при комнатной температуре (например при приблизительно 20-25°С в течение приблизительно 0,5 недели, 1,0 недели, 1,5 недель, 2,0 недель, 2,5 недель, 3,5 недель, 4,0 недель, 4,5 недель или 5,0 недель, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления состав (такой как состав, содержащий буфер, содержащий 10 мМ цитрата, 100 мМ NaCl, 100 мМ глицина и 0,01% полисорбата 80, где состав характеризуется рН, составляющим 5,5), содержащий антитело к CD73 и/или его вариант или мутант, описанные в данном документе (например при концентрации, превышающей приблизительно 0,5 мг/мл, превышающей приблизительно 1 мг/мл, превышающей приблизительно 5 мг/мл, превышающей приблизительно 10 мг/мл, превышающей приблизительно 15 мг/мл, превышающей приблизительно 20 мг/мл или превышающей приблизительно 25 мг/мл, включая любой диапазон между данными значениями), является стабильным в специализированных условиях (например при хранении при приблизительно 37°С) в течение приблизительно 0,5 недели, 1,0 недели, 1,5 недель, 2,0 недель, 2,5 недель, 3,5 недель, 4,0 недель, 4,5 недель или 5,0 недель, включая любой диапазон между данными значениями.

[0250] Эксклюзионная хроматография (SEC) представляет собой широко известный и широко применяемый способ, используемый в исследованиях стабильности белков для выявления потенциальной фрагментации и агрегации, соответствующих физической и химической нестабильности. В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует повышение уровня высокомолекулярных разновидностей (HMWS), составляющее менее чем приблизительно 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2% или 0,1% через 1 неделю при 37°С, по сравнению с начальным % высокомолекулярных разновидностей, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73, описанного в данном документе, демонстрирует повышение уровня высокомолекулярных разновидностей, составляющее менее чем приблизительно 2,0%, 1,8%, 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2% или 0,1% через 2 недели при 37°С, по сравнению с начальным % высокомолекулярных разновидностей, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует повышение уровня высокомолекулярных разновидностей, составляющее менее чем приблизительно 3,3%, 3,2%, 3,1%, 3,0%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,2%, 2,0%, 1,8%, 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2% или 0,1% через 4 недели при 37°С, по сравнению с начальным % высокомолекулярных разновидностей, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями.

[0251] В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует повышение уровня низкомолекулярных разновидностей (LMWS), составляющее менее чем приблизительно 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2% или 0,1% через 1 неделю при 37°С, по сравнению с начальным % низкомолекулярных разновидностей, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует повышение уровня низкомолекулярных разновидностей, составляющее менее чем приблизительно 2,0%, 1,8%, 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, %, 0,4%, 0,2% или 0,1% через 2 недели при 37°С, по сравнению с начальным % низкомолекулярных разновидностей, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует повышение уровня низкомолекулярных разновидностей, составляющее менее чем приблизительно 2,4%, 2,2%, 2,0%, 1,8%, 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2% или 0,1% через 4 недели при 37°С, по сравнению с начальным % низкомолекулярных разновидностей, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями.

[0252] В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует снижение уровня мономера, составляющее не более чем приблизительно 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4% или 3,5% через 1 неделю при 37°С, по сравнению с начальным % мономера, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует снижение уровня мономера, составляющее не более чем приблизительно 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4% или 3,5% через 2 недели при 37°С, по сравнению с начальным % мономера, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления состав, содержащий 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, демонстрирует снижение уровня мономера, составляющее не более чем приблизительно 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4% или 3,5% через 2 недели при 37°С, по сравнению с начальным % мономера, как измерено с применением SEC, включая любой диапазон между данными значениями.

[0253] Катионообменная хроматография (СЕХ) представляет собой широко известный и широко используемый инструмент для выявления явлений деградации белков, таких как дезамидирование или окисление (Moorhouse KG. et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 16(4): 593-603, 1997). Продукты деградации, как правило, называются кислотными или основными разновидностями. Кислотные разновидности представляют собой варианты, которые элюируются раньше главного пика при СЕХ, тогда как основные разновидности представляют собой варианты, которые элюируются позже главного пика при СЕХ. В определенных вариантах осуществления фракция кислотного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, составляет не более чем приблизительно 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15% общего белка через 1 неделю при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления фракция кислотного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта, описанных в данном документе, составляет не более чем приблизительно 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17% или 18% общего белка через 2 недели при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления фракция кислотного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), описанных в данном документе, составляет не более чем приблизительно 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26% или 27% общего белка через 2 недели при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями.

[0254] В определенных вариантах осуществления фракция основного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), описанных в данном документе, составляет не более чем приблизительно 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45% или 46% общего белка через 1 неделю при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления фракция основного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), описанных в данном документе, составляет не более чем приблизительно 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45% или 46% общего белка через 2 недели при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления фракция основного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), описанных в данном документе, составляет не более чем приблизительно 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45% или 46% общего белка через 4 недели при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями.

[0255] В определенных вариантах осуществления фракция главного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), описанных в данном документе, составляет не менее чем приблизительно 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45% или 46% общего белка через 1 неделю при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления фракция основного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), описанных в данном документе, составляет не менее чем приблизительно 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45% или 46% общего белка через 2 недели при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями. В определенных вариантах осуществления фракция основного пика в составе, содержащем 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл или 25 мг/мл антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), описанных в данном документе, составляет не менее чем приблизительно 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45% или 46% общего белка через 4 недели при 37°С, как измерено с применением СЕХ, включая любой диапазон между данными значениями.

[0256] Составы, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Этого легко достичь, например, посредством фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Способы диагностики и визуализации с применением антител к CD73 и их вариантов/мутантов

[0257] Меченые антитела к CD73, варианты, мутанты, их фрагменты, а также их производные и аналоги, которые специфически связываются с CD73, можно использовать в диагностических целях для выявления, диагностики или контроля заболеваний и/или нарушений, ассоциированных с экспрессией, аберрантной экспрессией и/или активностью CD73. Например, раскрытое антитело к CD73 и/или вариант или мутант (или их фрагмент), предусмотренные в данном документе, можно использовать в диагностических анализах in situ, in vivo, ex vivo и in vitro или анализах визуализации. Способы выявления экспрессии CD73 включают (а) анализ экспрессии полипептида в клетках (например в ткани) или биологической жидкости индивидуума с применением одного или нескольких антител по настоящему изобретению и (b) сравнение уровня экспрессии гена со стандартным уровнем экспрессии гена, при этом повышение или снижение уровня экспрессии анализируемого гена по сравнению со стандартным уровнем экспрессии указывает на аберрантную экспрессию.

[0258] Дополнительные варианты осуществления, предусмотренные в данном документе, включают способы диагностики заболевания или нарушения, ассоциированных с экспрессией или аберрантной экспрессией CD73 у животного (например млекопитающего, такого как человек). Способы включают выявление молекул CD73 у млекопитающего. В определенных вариантах осуществления диагностика включает: (а) введение млекопитающему эффективного количества меченого антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента), (b) выдерживание временного интервала после введения для обеспечения преимущественного накопления меченого антитела к CD73 и/или его варианта или мутанта (или фрагмента) в участках организма субъекта, где экспрессируется CD73 (и снижения уровня несвязавшейся меченой молекулы до фонового уровня); (с) определение фонового уровня и (d) выявление меченой молекулы у субъекта таким образом, что выявление меченой молекулы выше фонового уровня указывает на то, что субъект страдает конкретным заболеванием или нарушением, ассоциированным с экспрессией или аберрантной экспрессией CD73. Фоновый уровень можно определять различными способами, включая сравнение количества выявленной меченой молекулы со стандартным значением, ранее определенным для конкретной системы.

[0259] Антитела к CD73 и/или их варианты или мутанты (или фрагменты), предусмотренные в данном документе, можно использовать для анализа уровней белка в биологическом образце с применением классических иммуногистологических способов, известных специалистам в данной области техники (например, см. Jalkanen, et al, J. Cell. Biol 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol 105:3087-3096 (1987)). Другие способы, основанные на применении антител, применимые для выявления экспрессии гена белка, включают иммуноанализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). Подходящие метки для анализов с применением антител известны из уровня техники и включают ферментные метки, такие как, глюкозооксидаза; радиоизотопы, такие как йод (¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I), углерод (¹⁴С), сера (³⁵S), тритий (³Н), индий (^115mIn, ^113mIn, ¹¹²In, ¹¹¹In), технеций (⁹⁹Tc, ^99mTc), таллий (²⁰¹Ti), галлий (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), палладий (¹⁰³Pd), молибден (⁹⁹Mo), ксенон (¹³³Хе), фтор (¹⁸F), самарий (¹⁵³Sm), лютеций (¹⁷⁷Lu), гадолиний (¹⁵⁹Gd), прометий (¹⁴⁹Pm), лантан (¹⁴⁰La), иттербий (¹⁷⁵Yb), гольмий (¹⁶⁶Но), иттрий (⁹⁰Y), скандий (⁴⁷Sc), рений (¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re), празеодим (¹⁴²Pr), родий (¹⁰⁵Rh), рутений (⁹⁷Ru), люминол, и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин, и биотин.

[0260] Методики, известные из уровня техники, можно применять в отношении меченых антител (или их фрагментов), предусмотренных в данном документе. Такие методики включают без ограничения применение бифункциональных конъюгирующих средств (см., например, патенты США №№5756065; 5714631; 5696239; 5652361; 5505931; 5489425; 5435990; 5428139; 5342604; 5274119; 4994560 и 5808003).

[0261] В качестве альтернативы или дополнительно, можно измерять уровни кодирующей CD73 нуклеиновой кислоты или mRNA в клетке, например посредством флуоресцентной гибридизации in situ с применением зонда на основе нуклеиновой кислоты, соответствующего кодирующей CD73 нуклеиновой кислоте или комплементарной ей последовательности (FISH; см. W098/45479, опубликованную в октябре 1998 г.), методик саузерн-блоттинга, нозерн-блоттинга или полимеразной цепной реакции (ПЦР), таких как количественная ПЦР в режиме реального времени (RT-PCR). Также можно исследовать сверхэкспрессию CD73 посредством измерения уровня отщепившегося антигена в биологической жидкости, такой как сыворотка крови, например с применением анализов на основе антител (см. также, например, патент США №4933294, выданный 12 июня 1990 г.; W091/05264, опубликованную 18 апреля 1991 г.; патент США №5401638, выданный 28 марта 1995 г., и Sias et al, J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Помимо вышеуказанных анализов, квалифицированному практикующему специалисту доступны различные анализы in vivo и ex vivo. Например, можно подвергать клетки в организме млекопитающего воздействию антитела, которое необязательно помечено детектируемой меткой, например радиоактивным изотопом, и связывание антитела с клетками можно оценивать, например, посредством внешнего сканирования в отношении радиоактивности или посредством анализа образца (например биопсии или другого биологического образца), взятого у млекопитающего, ранее подвергавшегося воздействию антитела.

Изготавливаемые изделия и наборы

[0262] В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему раскрытое антитело к CD73, его вариант, мутант и/или фрагмент, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, и одно или несколько из следующего: (а) по меньшей мере одного средства, которое, как известно, используется для лечения рака, или (b) инструкций по лечению рака.

[0263] В дополнительном варианте осуществления раскрытое антитело к CD73, его вариант, мутант и/или фрагмент, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, и по меньшей мере одно средство, которое, как известно, используется для лечения рака, составлены совместно.

[0264] В еще одном дополнительном варианте осуществления раскрытое антитело к CD73, его вариант, мутант и/или фрагмент, и/или фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, и по меньшей мере одно средство, которое, как известно, используется для лечения рака, упакованы совместно.

[0265] В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере одно средство, которое, как известно, используется для лечения рака, представляет собой средство гормональной терапии. В еще одном дополнительном варианте осуществления средство гормональной терапии выбрано из одного или нескольких средств из группы, состоящей из лейпролида, тамоксифена, ралоксифена, мегестрола, фулвестранта, трипторелина, медроксипрогестерона, летрозола, анастрозола, эксеместана, бикалутамида, гозерелина, гистрелина, флуоксиместерона, эстрамустина, флутамида, торемифена, дегареликса, нилутамида, абареликса и тестолактона или их фармацевтически приемлемых соли, гидрата, сольвата или полиморфа.

[0266] В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере одно средство, которое, как известно, используется для лечения рака, представляет собой химиотерапевтическое средство. В еще одном дополнительном варианте осуществления химиотерапевтическое средство выбрано из одного или нескольких средств из группы, состоящей из алкилирующего средства, средства, представляющего собой антиметаболит, антинеопластического антибиотического средства, средства, представляющего собой ингибитор митоза, средства, представляющего собой ингибитор mTor, или другого химиотерапевтического средства.

[0267] В дополнительном варианте осуществления антинеопластическое антибиотическое средство выбрано из одного или нескольких средств из группы, состоящей из доксорубицина, митоксантрона, блеомицина, даунорубицина, дактиномицина, эпирубицина, идарубицина, пликамицина, митомицина, пентостатина и валрубицина или их фармацевтически приемлемых соли, гидрата, сольвата или полиморфа.

[0268] В дополнительном варианте осуществления средство, представляющее собой антиметаболит, выбрано из одного или нескольких средств из группы, состоящей из гемцитабина, 5-фторурацила, капецитабина, гидроксимочевины, меркаптопурина, пеметрекседа, флударабина, неларабина, кладрибина, клофарабина, цитарабина, децитабина, пралатрексата, флоксуридина, метотрексата и тиогуанина или их фармацевтически приемлемых соли, гидрата, сольвата или полиморфа.

[0269] В дополнительном варианте осуществления алкилирующее средство выбрано из одного или нескольких средств из группы, состоящей из карбоплатина, цисплатина, циклофосфамида, хлорамбуцила, мелфалана, кармустина, бусульфана, ломустина, дакарбазина, оксалиплатина, ифосфамида, мехлоретамина, темозоломида, тиотепы, бендамустина и стрептозоцина или их фармацевтически приемлемых соли, гидрата, сольвата или полиморфа.

[0270] В дополнительном варианте осуществления средство, представляющее собой ингибитор митоза, выбрано из одного или нескольких средств из группы, состоящей из иринотекана, топотекана, рубитекана, кабазитаксела, доцетаксела, паклитаксела, этопсида, винкристина, иксабепилона, винорелбина, винбластина и тенипозида или их фармацевтически приемлемых соли, гидрата, сольвата или полиморфа.

[0271] В дополнительном варианте осуществления средство, представляющее собой ингибитор mTor, выбрано из одного или нескольких средств из группы, состоящей из эверолимуса, сиролимуса и темсиролимуса или их фармацевтически приемлемых соли, гидрата, сольвата или полиморфа.

[0272] В дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, в сочетании с хирургическим вмешательством. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, в сочетании с хирургическим вмешательством, где в инструкциях предусматривается, что хирургическое вмешательство проводится перед введением по меньшей мере одного соединения. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, в сочетании с хирургическим вмешательством, где в инструкциях предусматривается, что хирургическое вмешательство проводится после введения раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, в сочетании с хирургическим вмешательством, где в инструкциях предусматривается, что хирургическое вмешательство проводится после введения раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, и где в инструкциях предусматривается, что введение раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, предназначено для осуществления циторедукции опухоли перед хирургическим вмешательством. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению соединения в сочетании с хирургическим вмешательством, где в инструкциях предусматривается, что хирургическое вмешательство проводится после введения раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, и где в инструкциях предусматривается, что хирургическое вмешательство проводится приблизительно одновременно с введением раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе.

[0273] В дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций в сочетании с радиотерапией. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций в сочетании с радиотерапией, где в инструкциях предусматривается, что радиотерапия проводится перед введением раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций в сочетании с радиотерапией, где в инструкциях предусматривается, что радиотерапия проводится после стадии введения раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций в сочетании с радиотерапией, где в инструкциях предусматривается, что радиотерапия проводится приблизительно одновременно со стадией введения раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций.

[0274] В дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит некоторое количество лекарственных форм, при этом некоторое количество включает одну или несколько доз; где каждая доза содержит терапевтически эффективное количество раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций и по меньшей мере одного средства. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит некоторое количество лекарственных форм, при этом некоторое количество включает одну или несколько доз; где каждая доза содержит терапевтически эффективное количество раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций и по меньшей мере одного средства, и где каждая доза раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций и по меньшей мере одно средство, которое, как известно, используется для лечения рака, составлены совместно. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит некоторое количество лекарственных форм, при этом некоторое количество включает одну или несколько доз; где каждая доза содержит терапевтически эффективное количество раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций и по меньшей мере одного средства, и где каждая доза раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций и по меньшей мере одно средство, которое, как известно, используется для лечения рака, упакованы совместно.

[0275] В дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит некоторое количество лекарственных форм, при этом некоторое количество включает одну или несколько доз; где каждая доза, содержащая терапевтически эффективное количество раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, составлена для внутривенного введения, и по меньшей мере одно средство составлено для перорального введения и/или внутривенного введения. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит некоторое количество лекарственных форм, при этом некоторое количество включает одну или несколько доз; где каждая доза, содержащая терапевтически эффективное количество раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, составлена для внутривенного введения, и по меньшей мере одно средство составлено для перорального введения. В еще одном дополнительном варианте осуществления набор дополнительно содержит некоторое количество лекарственных форм, при этом некоторое количество включает одну или несколько доз; где каждая доза, содержащая терапевтически эффективное количество раскрытого антитела к CD73, его варианта, мутанта и/или фрагмента, и/или фармацевтических композиций, составлена для внутривенного введения, и по меньшей мере одно средство составлено для внутривенного введения.

[0276] Раскрытое антитело к CD73, его вариант, мутант и/или фрагмент, и/или фармацевтические композиции можно для удобства представлять в виде набора, в котором два или более компонентов, которые могут представлять собой активные или неактивные ингредиенты, носители, разбавители и т.п., снабжены инструкциями по получению окончательной лекарственной формы пациентом или лицом, вводящим лекарственное средство пациенту. Такие наборы могут быть укомплектованы всеми необходимыми материалами и ингредиентами, которые в них содержатся, или они могут содержать инструкции по применению или получению материалов или компонентов, которые пациенту или лицу, вводящему лекарственное средство пациенту, следует получить самостоятельно. В дополнительных вариантах осуществления набор может содержать необязательные компоненты, которые способствуют введению однократной дозы пациентам, такие как флаконы для восстановления порошковых форм, шприцы для инъекций, индивидуализированные системы IV доставки, ингаляторы и т.п.Дополнительно набор может содержать инструкции по получению и введению композиций. Набор можно изготавливать таким образом, чтобы он содержал однократную дозу для однократного применения одним пациентом, многократного применения конкретным пациентом (в постоянной дозе или где эффективность отдельных соединений может изменяться по мере прогрессирования терапии), или набор может содержать несколько доз, подходящих для введения нескольким пациентам ("упаковка с несколькими дозами"). Компоненты набора могут быть собраны в картонные коробки, блистерные упаковки, бутылки, тубы и т.п.

[0277] В дополнительном варианте осуществления описанные наборы можно упаковывать согласно схеме введения суточных доз (например, упаковывать в контурную упаковку, упаковывать с картами дозирования, упаковывать в блистеры или формованную с раздувом пластиковую емкость и т.п.). Такая упаковка стимулирует интерес к продуктам и помогает пациентам соблюдать схемы введения лекарственных средств. Такая упаковка также может снижать ошибки пациента. В настоящем изобретении также представлены такие наборы, дополнительно содержащие инструкции по применению.

[0278] В дополнительном варианте осуществления в настоящем изобретении также предусмотрены фармацевтическая упаковка или набор, содержащие один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Такой контейнер(контейнеры) может сопровождаться уведомлением в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, при этом уведомление отражает одобрение данным органом изготовления, применения или продажи для введения человеку.

[0279] В различных вариантах осуществления описанные наборы могут также содержать соединения и/или продукты, упакованные совместно, составленные совместно и/или доставляемые совместно с другими компонентами. Например, производитель лекарственного средства, посредник, осуществляющий перепродажу лекарственного средства, врач, рецептурно-производственная аптека или фармацевт могут предоставить набор, содержащий раскрытое соединение и/или продукт и другой компонент для доставки пациенту.

[0280] Предполагается, что описанные наборы можно использовать в сочетании с раскрытыми способами получения, раскрытыми способами применения или лечения и/или раскрытыми композициями.

[0281] Также предусмотрены наборы, применимые для различных целей, например для выделения или выявления CD73 у пациентов, необязательно в комбинации с изготавливаемыми изделиями. Для выделения и очистки CD73 набор может содержать антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или фрагмент), предусмотренные в данном документе, нанесенные на шарики (например шарики из SEPHAROSE™). Могут предусматриваться наборы, которые содержат антитела (или их фрагменты) для выявления и количественного определения CD73 in vitro, например посредством ELISA или вестерн-блоттинга. Как и в случае с изготавливаемым изделием, набор содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере или совместно с ним. Например, контейнер содержит композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или фрагмент), предусмотренные в данном документе. Можно включать дополнительные контейнеры, которые содержат, например, разбавители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или листок-вкладыш могут содержать описание композиции, а также инструкции по предполагаемому применению in vitro или диагностическому применению.

[0282] Другой вариант осуществления, предусмотренный в данном документе, представляет собой изготавливаемое изделие, содержащее материалы, применимые для лечения описанного типа рака. Изготавливаемое изделие может содержать контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере или совместно с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.п.Контейнеры можно получать из различных материалов, таких как стекло или пластик. Обычно контейнер содержит композицию, которая эффективна для лечения состояния, и может содержать отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело к CD73 и/или его вариант или мутант (или фрагмент), предусмотренные в данном документе. На этикетке или листке-вкладыше указано, что композиция используется для лечения определенного состояния. Этикетка или листок-вкладыш дополнительно будут содержать инструкции по введению композиции на основе антитела пациенту. Также рассматриваются изготавливаемые изделия и наборы, содержащие средства комбинированной терапии, описанные в данном документе.

[0283] Листок-вкладыш относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предупреждения относительно применения таких терапевтических продуктов. В одном варианте осуществления в листке-вкладыше указано, что композиция используется для лечения рака (такого как рак головы и шеи, рак легкого или колоректальный рак).

[0284] Кроме того, изготавливаемое изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно содержать другие материалы, требуемые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

[0285] Далее, после описания аспектов настоящего изобретения в целом в следующих примерах описаны некоторые дополнительные аспекты настоящего изобретения. Хотя аспекты настоящего изобретения описаны в связи со следующими примерами и соответствующим текстом и графическими материалами, отсутствует намерение ограничивать аспекты настоящего изобретения данным описанием. Напротив, намерение состоит в том, чтобы охватить все альтернативы, модификации и эквиваленты, включенные в сущность и объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

[0286] Следующие примеры изложены для предоставления специалистам в данной области техники полного раскрытия и описания того, каким образом соединения, композиции, изделия, устройства и/или способы, заявленные в данном документе, получают и оценивают, и предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема того, что авторы считают своим изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности чисел (например, значений количества, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые ошибки и отклонения. Если не указано иное, части являются весовыми частями, температура указана в °С или представляет собой температуру окружающей среды, и давление равно атмосферному или близко к нему.

[0287] ПРИМЕР 1. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К CD73 И ВАРИАНТОВ.

[0288] Наивную библиотеку фагового дисплея человеческих Fab подвергали пэннингу с применением человеческого CD73-ECD/His. После четырех циклов пэннинга с применением биотинилированного huCD73-ECD/His, слитого с покрытыми стрептавидином магнитными шариками Dynabeads® М-280 (Thermo Fisher Scientific, №11205D), отбирали пятьдесят два возможных клона с активностью связывания CD73 и блокирования иммобилизованного фермента CD73 и определяли четыре вида последовательности (N1-N4). Затем отобранные вариабельные последовательности клонировали в остов Fc человеческого IgG1 с мутациями L234F, L235E, P331S с получением полноразмерных антител для функционального анализа in vitro (связывание CD73, блокирование ферментативной активности CD73, опосредованная антителами интернализация CD73). Потенциальные варианты N1, N2 и N4 также клонировали в остов человеческого Fc IgG2 дикого типа или в остов человеческого Fc IgG2 с мутацией C219S. Согласно тестированию эффективности in vitro и эффективности in vivo (модель ксенотрансплантата MDA-MB-231) N1 и N4 отобрали для последующего созревания аффинности и определяли остов wtIgG2.

[0289] Потенциальный вариант N1 и потенциальный вариант N4 антител использовали в экспериментах по созреванию аффинности на основе фагового дисплея in vitro с получением дополнительных клонов с улучшенными характеристиками активности связывания CD73 и блокирования фермента CD73. Библиотеки нуклеиновых кислот CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3 (с акцентированием внимания на 3 CDR) потенциального варианта N1 получили посредством ПЦР, клонировали в вектор для фагового дисплея и трансформировали им клетки Е. coli TG1 с получением библиотеки фагов. После трех циклов пэннинга с применением биотинилированного huCD73-ECD/His пятнадцать видов клонов Fab с различными последовательностями подвергали скринингу посредством анализа связывания и анализа блокирования фермента и выявили, что два Fab (N1№2 и N1№9) характеризуются лучшей эффективностью. В отношении созревания аффинности потенциального варианта N4, во-первых, получали библиотеки нуклеиновых кислот CDR-L3/CDR-H1/CDR-H3 с получением библиотеки фагов. После трех циклов пэннинга шесть видов клонов Fab (от N4№1 до N4№6) с различными последовательностями подвергали скринингу посредством анализа связывания и анализа блокирования фермента. Во-вторых, получали библиотеки нуклеиновых кислот CDR-L1/CDR-L2/CDR-H2 клонов N4№1, N4№4, N4№5 и N4№6 с получением библиотеки фагов. После трех циклов пэннинга отбирали клоны N4№4-3, N4№6-2, N4№6-3, N4№6-4, N4№6-5 с лучшей активностью связывания и блокирования фермента.

[0290] После созревания аффинности N1№2, N1№9, N4№5, N4№6, N4№4-3, N4№6-2, N4№6-3, N4№6-4, N4№6-5 клонировали в остов человеческого Fc IgG2 с получением полноразмерных антител и подвергали тестированию в отношении эффективности in vitro (включая связывание белка CD73 посредством ELISA, связывание экспрессирующих CD73 опухолевых клеток, блокирование иммобилизованного и клеточного фермента CD73, опосредованную антителами интернализацию CD73) и тестированию в отношении эффективности in vivo (ксенотрансплантатная модель NCI-H292) и отбирали клоны N1№2, N1№9, N4№6-3, N4№6-4. Согласно выравниванию последовательностей и стабильности CMC данные четыре клона модифицировали с получением N1№2-P, N1№9-PH, N4№6-3-Р, N4№6-4-P. N1№9-PH характеризуется лучшей эффективностью в отношении блокирования растворимого фермента CD73, a N4№6-3-P, N4№6-4-P были способны индуцировать интернализацию поверхностного CD73. N1№9-PH, N4№6-3-P, N4№6-4-P способны ослаблять АМР-опосредованную супрессию Т-клеток и характеризуются противоопухолевой активностью в отношении ксенотрансплантатов MDA-MB-231 in vivo. Кроме того, N4№6-4-P способен индуцировать отрицательную модуляцию CD73 и блокировать ферментативную активность CD73 в ксенотрансплантатных опухолях и характеризуется лучшей противоопухолевой активностью, чем другие антитела к CD73 в ксенотрансплантатной модели NCI-H292.

[0291] Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи потенциальных вариантов N1, N2 и N4 антитела к CD73, отобранных посредством пэннинга из наивной фаговой библиотеки, представлено на фиг. 1А и фиг. 1В соответственно. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи вариантов N1 и N4, полученных в результате созревания аффинности, показано на фиг.9, где CDR (определяющие комплементарность области), определенные согласно Kabat, подчеркнуты и отмечены жирным шрифтом, а выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи вариантов N1 и N4, полученных в результате созревания аффинности, показано на фиг. 10, где CDR (определяющие комплементарность области), определенные согласно Kabat, подчеркнуты и отмечены жирным шрифтом. Затем данные выбранные вариабельные последовательности клонировали в остов человеческого Fc IgG2 с получением полноразмерных антител. Аминокислотные последовательности константной области легкой цепи и константной области тяжелой цепи человеческого антитела можно отобрать следующим образом (в данном документе отсутствуют ограничения на аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи):

[0292] константная область тяжелой цепи изотипа wtIgG2 (SEQ ID NO: 112)

[0293] константная область тяжелой цепи изотипа mtIgG2 (SEQ ID NO: 113)

[0294] константная область тяжелой цепи изотипа tmtIgG1 (SEQ ID NO: 114)

[0295] константная область легкой цепи (SEQ ID NO: 115)

[0296] тяжелая цепь N1№2-P (SEQ ID NO: 116)

[0297] тяжелая цепь N1№9-PH (SEQ ID NO: 117)

[0298] тяжелая цепь N4№6-3-P_(SEQ ID NO:118)

[0299] тяжелая цепь N4№6-4-P (SEQ ID NO: 119).

[0300] На фиг. 14 показано выравнивание аминокислотных последовательностей легкой цепи наиболее перспективных вариантов N1 и N4, где CDR (определяющие комплементарность области), определенные согласно Kabat, подчеркнуты и отмечены жирным шрифтом, и на фиг. 15 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи наиболее перспективных вариантов N1 и N4, где CDR (определяющие комплементарность области), определенные согласно Kabat, подчеркнуты и отмечены жирным шрифтом. Затем данные последовательности клонировали в остов человеческого Fc IgG2 с получением полноразмерных антител.

[0301] ПРИМЕР 2. СПОСОБНОСТЬ ВЫБРАННЫХ АНТИТЕЛ К СВЯЗЫВАНИЮ С CD73.

[0302] Анализы посредством ELISA проводили для оценки связывания выбранных антител с рекомбинантными человеческими белками CD73-ECD/His. Тридцать нанограмм на лунку козьих антител к человеческому Fd (или Fc) IgG наносили на 96-луночный микропланшет для EIA в течение ночи при 4°С. После блокирования с применением 5% обезжиренного молока (в PBS) добавляли последовательно разбавленные антитела и инкубировали при RT в течение 1 часа. Несвязавшиеся антитела удаляли и лунки три раза промывали с помощью 1×PBST, содержащего 0,05% Tween 20. Тридцать нанограмм на лунку меченных биотином белков CD73-ECD/His добавляли в лунки и инкубировали при RT в течение еще 1 часа. Несвязавшиеся меченные биотином белки CD73-ECD/His три раза промывали с помощью 1×PBST, содержащего 0,05% Tween 20. Затем в лунки добавляли авидин-HRP и инкубировали при RT в течение 30 минут. Избыточные вторичные антитела удаляли посредством трехкратного промывания с помощью 1×PBST, содержащего 0,05% Tween 20. После промывания планшеты проявляли с применением ТМВ. Поглощение считывали при длине волны 450 нм с помощью микропланшет-ридера.

[0303] Выбранные антитела к CD73 тестировали в отношении связывания с рекомбинантными человеческими белками CD73 посредством ELISA и данные по связыванию представлены на фиг. 2А.

[0304] Способность антител к CD73 к связыванию с целыми клетками тестировали посредством инкубации клеток MDA-MB-231 или NCI-H292 с последовательно разбавленными антителами в буфере для FACS (PBS с 2% FBS) при 4°С в течение 30 минут. Клетки промывали буфером для FACS и связывание выявляли с применением FITC-меченных козьих антител к человеческому IgG (H+L) (или РЕ-меченных козьих антител к человеческому Fey IgG) при 4°С в течение еще 30 минут. Связывание антител с клеточной поверхностью измеряли по средней интенсивности флуоресценции (MFI) при окрашивании. Анализы посредством проточной цитометрии проводили с применением проточного питометра Cytomics FC500 или CytoFLEX (Beckman Coulter Inc.). На фиг. 2B и 2C показано связывание выбранных антител к CD73 с опухолевыми клетками MDA-MB-231 человека, экспрессирующими CD73 (аденокарциномы молочной железы человека) (фиг. 2В) и клетками NCI-H292 (мукоэпидермоидной карциномы легкого человека) (фиг. 2С).

[0305] В данных исследованиях антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что все выбранные антитела к CD73 способны связываться как с человеческими рекомбинантными белками CD73, так и с опухолевыми клетками человека, экспрессирующими CD73.

[0306] На фиг. 11А-11В также показано связывание CD73 вариантами N1 и N4. Выбранные варианты тестировали в отношении связывания с экспрессирующими CD73 клетками MDA-MB-231 (фиг. 11А) и NCI-H292 (фиг. 11В) посредством проточной цитометрии. HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля. Эти данные указывают на то, что после созревания аффинности все варианты N1 и N4 способны связываться с экспрессирующими CD73 опухолевыми клетками человека. Варианты N4 характеризуются лучшей способностью связываться с CD73, чем варианты N1 в двух данных линиях клеток. Порядок ранжирования по способности к связыванию с целой клеткой: N4№5, N4№6-4, N4№6-5>N4№6-2>N4№4-3, N4№6, N4№6-3, N1№9>N1№2.

[0307] На фиг. 16A-16C показана способность наиболее перспективных вариантов N1 и N4 к связыванию с CD73. Антитела к CD73 тестировали в отношении связывания с рекомбинантными человеческими белками CD73 посредством ELISA (фиг. 16А) и экспрессирующими CD73 опухолевыми клетками человека, MDA-MB-231 (фиг. 16В) и NCI-H292 (фиг. 16С), посредством проточной цитометрии. Антитела к CD73 ref-1 и к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля. Эти данные указывают на то, что N4№6-3-P, N4№6-4-P и N1№9-PH связываются с сопоставимой аффинностью с рекомбинантным CD73 и поверхностным CD73 на клетках MDA-MB-231. Связывание N1№9-PH с экспрессирующими CD73 клетками NCI-H292 является немного лучшим, чем связывание N4№6-3-P и N4№6-4-P.

[0308] ПРИМЕР 3. ВЛИЯНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ АНТИТЕЛА К CD73 НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ РАСТВОРИМОГО И КЛЕТОЧНОГО CD73.

[0309] Антитела к CD73 тестировали в отношении их способности к ингибированию ферментативной активности человеческого рекомбинантного белка CD73 и CD73 клеточной поверхности. Катализируемый CD73 гидролиз AMP до аденозина и неорганического фосфата анализировали посредством измерения АТР-зависимого окисления люциферина, которое ингибируется AMP (анализ CellTiter-Glo; Promega). Пятнадцать нанограмм рекомбинантных человеческих белков CD73-ECD/His инкубировали с последовательно разбавленными антителами к CD73, АТР (в конечной концентрации 100 мкМ) и AMP (в конечной концентрации 300 мкМ) в буфере для анализа (25 мМ Tris, 5 мМ MgCh, рН 7,46) при 37°С. Такой же объем реагента CellTiter-Glo добавляли к реакционной смеси и перемешивали в течение 2 мин в белом 96-луночном микропланшете. После 10-минутной инкубации измеряли люминесценцию. [0310] Экспрессирующие CD73 клетки (5Е3-1Е4 клеток/лунка), ресуспендировали в культуральной среде и высевали в 96-луночный микропланшет (или предварительно высевали в течение 24 часов). К каждой культуре добавляли трехкратные (или пятикратные) последовательные разбавления антител. После инкубации при 37°С в течение 15 минут добавляли AMP (в конечной концентрации 225 мкМ) и инкубировали в течение 4-20 часов. После центрифугирования собирали культуральные образцы надосадочной жидкости, помещали в белый 96-луночный микропланшет и добавляли АТР до конечной концентрации 100 мкМ для 2-минутной инкубации. Такой же объем реагента CellTiter-Glo добавляли в каждую лунку и перемешивали в течение 2 мин. После 10-минутной инкубации измеряли люминесценцию.

[0311] Данные, демонстрирующие влияние потенциальных вариантов антитела к CD73 на ферментативную активность растворимого и клеточного CD73, представлены на фиг. 3А и 3В соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что все выбранные антитела способны ингибировать ферментативную активность как растворимого, так и поверхностного человеческого CD73. В анализе ферментативной активности растворимого CD73 наблюдали потерю ингибирования, когда IgG был в стехиометрическом избытке относительно sCD73. Этот так называемый "хук-эффект" может быть результатом связывания моновалентного антитела, которое осуществляется посредством Fab-плеч на одной и той же молекуле IgG, конкурирующих за ограниченное количество участков связывания на антигене-мишени.

[0312] Потенциальные варианты антитела к CD73 N1, N2, N4 с различными изотипами IgG тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность клеточного CD73. Клетки MDA-MB-231 инкубировали с антителами к CD73. Добавляли ATP, AMP и реагент CellTiter-Glo и регистрировали люминесценцию. АРСР использовали в качестве положительного контроля в анализе ферментативной активности. Влияние данных потенциальных вариантов антитела к CD73 с различными Fc-областями IgG на ферментативную активность клеточного CD73 показано на фиг. 6А (потенциальный вариант N1), 6В (потенциальный вариант N2) и 6С (потенциальный вариант N4).

[0313] Эти данные указывают на то, что изотип wtIgG2 клона N1 характеризуется лучшей блокирующей активностью, чем изотипы tmtIgG1 и mtIgG2. Изотип tmtIgG1 клона N2 характеризуется лучшей блокирующей активностью, чем изотипы wtIgG2 и mtIgG2. N4 с изотипом wtIgG2 демонстрирует лучшую блокирующую активность, чем изотипы tmtIgG1 и mtIgG2. Изотип tmtIgG1 характеризуется следующими сайт-специфическими изменениями Fc: L234F, L235E и P331S.

[0314] На фиг. 17А-17С также показано влияние наиболее перспективных вариантов N1 и N4 на ферментативную активность растворимого CD73 (фиг. 17А) и ферментативную активность CD73 клеточной поверхности (фиг. 17В и 17С). Антитела к CD73 тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность человеческого рекомбинантного белка CD73 и CD73 клеточной поверхности. Рекомбинантные белки CD73 (фиг. 17А), клетки MDA-MB-231 (фиг. 17В) и NCI-H292 (фиг. 17С) инкубировали с антителами к CD73. Добавляли ATP, AMP и CellTiter-Glo и регистрировали люминесценцию. Антитело к CD73 ref-1, антитело к CD73 ref-2 и АРСР использовали в качестве положительных контролей. HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0315] Данные, представленные на фиг. 17А-17С, демонстрируют, что способность N1№9-PH ингибировать ферментативную активность растворимого CD73 лучше, чем такая способность N4№6-3-P и N4№6-4-P. Однако, N1№9-PH и N4№6-4-P демонстрировали сопоставимую блокирующую активность в отношении ферментативной активности CD73 клеточной поверхности.

[0316] ПРИМЕР 4. ИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ CD73. ОПОСРЕДОВАННАЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫМИ ВАРИАНТАМИ АНТИТЕЛА К CD73.

[0317] Опухолевые клетки (от 5Е4 до 1Е5 клеток/лунка) суспендировали в культуральной среде и инкубировали с антителами к CD73 в различных концентрациях в течение 4 часов. После удаления культуральной среды клетки суспендировали в буфере для FACS (PBS с 2% FBS) и инкубировали с мышиными антителами к человеческому CD73 (4G4) при 4°С в течение 30 минут. Клетки промывали буфером для FACS и инкубировали с FITC-меченными козьими антителами к мышиному IgG (H+L) или Alexa488-меченными козьими антителами к мышиному Fcγ IgG. Анализы посредством проточной цитометрии проводили с применением проточного цитометра Cytomics FC500 или CytoFLEX (Beckman Coulter Inc.). Антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

[0318] Данные, представленные на фиг. 4, указывают на то, что только N4-tmtIgG1 способен индуцировать интернализацию CD73. N1-tmtIgG1 и N2-tmtIgG1 не способны индуцировать интернализацию CD73.

[0319] На фиг. 7 также проиллюстрирована интернализация CD73, опосредованная антителами к CD73 с различными Fc-областями IgG. После инкубации клеток с N1 (фиг. 7А), N2 (фиг. 7В) и N4 (фиг. 7С) с различными изотипами IgG экспрессию CD73 на клеточной поверхности измеряли посредством проточной цитометрии. Антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Данные демонстрируют, что N4, но не N1 и N2, способен индуцировать интернализацию CD73. Очевидная разница между различными изотипами IgG отсутствует.

[0320] На фиг. 13 также показана интернализация CD73, опосредованная вариантами антитела N1 и N4. Клетки NCI-H292 инкубировали с вариантами N1 и N4 и экспрессию CD73 на клеточной поверхности измеряли посредством проточной цитометрии. Антитело к CD73 ref-1 и антитело к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля. Данные указывают на то, что после созревания аффинности варианты N4 способны индуцировать интернализацию CD73, а варианты N1 все еще не способны индуцировать интернализацию CD73.

[0321] На фиг. 18А и 18В также показана интернализация CD73, опосредованная наиболее перспективными вариантами антитела N1 и N4. Клетки MDA-MB-231 (фиг. 18А) и NCI-H292 (фиг. 18В) инкубировали с вариантами N1 и N4 антитела к CD73. После инкубации экспрессию CD73 на клеточной поверхности измеряли посредством проточной цитометрии. Антитела к CD73 ref-1 и к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля. Эти данные указывают на то, что N4№6-3-P и N4№6-4-P способны индуцировать интернализацию CD73 в обеих линиях раковых клеток, экспрессирующих CD73.

[0322] ПРИМЕР 5. СВЯЗЫВАНИЕ CD73 ВЫБРАННЫМИ АНТИТЕЛАМИ С РАЗЛИЧНЫМИ FC-ОБЛАСТЯМИ IGG.

[0323] Связывание антител к CD73 с CD73 клеточной поверхности тестировали посредством инкубации клеток MDA-MB-231 с последовательно разбавленными меченными биотином антителами к CD73 в буфере для FACS (PBS с 2% FBS) при 4°С в течение 30 минут. Клетки промывали буфером для FACS и связывание выявляли с применением стрептавидин-FITC при 4°С в течение 30 минут. Анализы посредством проточной цитометрии проводили с применением Cytomics FC500 (Beckman Coulter Inc.).

[0324] Вариабельные последовательности N1, N2 и N4 клонировали в остов человеческого Fc IgG2 дикого типа или в остов человеческого Fc IgG2 с мутацией C219S. N1 (фиг. 5А), N2 (фиг. 5В), N4 (фиг. 5С) с различными изотопами IgG тестировали в отношении связывания с экспрессирующими CD73 клетками MDA-MB-231 человека посредством проточной цитометрии. Антитело к CD73 ref-1 и HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

[0325] Данные, представленные на фиг. 5А-5С, указывают на отсутствие разницы между N1 с различными изотипами IgG в отношении способности связывания CD73. Данные также демонстрируют, что клон N2 с изотопом tmtIgG1 характеризуется лучшей активностью связывания CD73, чем изотипы wtIgG2 и mtIgG2, и клон N4 с изотипом tmtIgG1 характеризуется лучшей активностью связывания CD73, чем изотипы wtIgG2 и mtIgG2.

[0326] ПРИМЕР 6. АКТИВНОСТЬ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ АНТИТЕЛА К CD73 В ОТНОШЕНИИ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ОПУХОЛИ В МЫШИНОЙ МОДЕЛИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАТА MDA-MB-231 ГРАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА С ТРОЙНЫМ НЕГАТИВНЫМ ФЕНОТИПОМ).

[0327] Активность антител к человеческому CD73 in vivo исследовали в мышиных моделях ксенотрансплантата с применением мышей NOD/SCID с ослабленным иммунитетом (с диабетом без ожирения/тяжелым комбинированным иммунодефицитом). Всего 1Е7 экспрессирующих CD73 клеток MDA-MB-231 рака молочной железы человека с тройным негативным фенотипом в 100 мкл PBS смешивали со 100 мкл матригеля (Corning, Калифорния, США) (в соотношении 1:1) и подкожно имплантировали в боковую поверхность с обеих сторон самкам мышей NOD/SCID (Biolasco, Тайбэй, Тайвань). Когда размер опухоли достигал 150-300 мм³ (день 14 после инокуляции опухоли) внутрибрюшинно два раза в неделю или в указанное время вводили 5 мг/кг антител к CD73 или 10 мл/кг плацебо. Опухоли наблюдали и измеряли до дня 45. Объем опухоли определяли как TV (объем опухоли) = (длина × ширина²)/2.

[0328] Кривые роста опухоли показаны на фиг. 8А. Объем отдельных опухолей в день 45 представлен на фиг. 8В. Все экспериментальные точки представляют собой средние значения ± SEM. Данные демонстрируют, что все антитела к CD73 характеризуются противоопухолевой активностью в модели ксенотрансплантата MDA-MB-231 (TGI≥50%), за исключением изотипа tmtIgG1 клонов N1, N2 и N4. N1-wtIgG2, N1-mtIgG2, N2-wtIgG2 и N2-mtIgG2 почти полностью подавляют рост опухоли.

[0329] На фиг. 20 также показана активность наиболее перспективных вариантов N1 и N4 в отношении подавления роста опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата MDA-МВ-231 (рака молочной железы человека с тройным негативным фенотипом). Мышам (n = 5 мышей/группа) подкожно прививали клетки MDA-MB-231. Первую дозу тестируемого варианта антитела вводили через 7 дней после инокуляции опухоли, когда размер привитой опухоли достигал приблизительно 100 мм³. Мышам внутрибрюшинно вводили антитела в дозе 10 мг/кг и 2 мг/кг два раза в неделю в течение 5-6 недель. Все экспериментальные точки представляют собой средние значения ± SEM. Эти данные демонстрируют, что все наиболее перспективные варианты N1 и N4 характеризуются противоопухолевой активностью в отношении ксенотрансплантатов MDA-MB-231 in vivo. N4№6-3-P, N4№6-4-P и N1№9-PH характеризуются лучшей противоопухолевой активностью, чем эталонное антитело к CD73.

[0330] ПРИМЕР 7. ВЛИЯНИЕ ВАРИАНТОВ N1 И N4 НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО CD73.

[0331] Варианты N1 и N4 тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность иммобилизованного CD73. Триста нанограмм на лунку козьих антител к человеческому Fd IgG наносили на белый 96-луночный микропланшет с высокой аффинностью в течение ночи при 4°С. После блокирования с применением 5% обезжиренного молока (в PBS) добавляли последовательно разбавленные антитела и инкубировали при RT в течение 1 часа. Несвязавшиеся антитела удаляли и лунки три раза промывали с помощью 1×PBST, содержащего 0,05% Tween 20. Двадцать пять микролитров белков CD73-ECD/His с концентрацией 100 нг/мл в буфере для анализа (25 мМ Tris, 5 мМ MgCh, рН 7,46) добавляли в лунки и инкубировали при RT в течение еще 1 часа. Добавляли двадцать пять микролитров смеси 66 мкМ АТР и 200 мкМ AMP и инкубировали при 37°С в течение 9 минут. Такой же объем реагента CellTiter-Glo добавляли к реакционной смеси и перемешивали содержимое в течение 2 мин (в белом 96-луночном микропланшете). После 10-минутной инкубации измеряли люминесценцию. Антитело к CD73 ref-1, антитело к CD73 ref-2 использовали в качестве положительных контролей, тогда как HLX01 (антитело к CD20) использовали в качестве отрицательного контроля.

[0332] Влияние вариантов N1 и N4 на ферментативную активность иммобилизованного CD73 показано на фиг. 12. Данные указывают на то, что после созревания аффинности все варианты N1 и N4 способны ингибировать ферментативную активность CD73. Активность вариантов N1 в отношении блокирования фермента CD73 была лучше, чем активность вариантов N4 и антитела к CD73 ref-2, но сопоставимой с активностью антитела к CD73 ref-1. Блокирование ферментативной активности иммобилизованного CD73: N1№2, N1№9>N4№6-4, N4№6-5>N4№4-3, N4№6-2>N4№6-3, N4№5>N4№6.

[0333] ПРИМЕР 8. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ СУПРЕССИВНОГО ВЛИЯНИЯ AMP НА АКТИВНОСТЬ Т-КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ N1 И N4.

[0334] CD73 катализирует внеклеточное образование аденозина из аденозинмонофосфата (AMP). Аденозин супрессирует иммунные ответы, в том числе ответы Т-клеток, NK-клеток и дендритных клеток, посредством активации рецепторов A2aR и A2bR. В дополнение к ингибированию и интернализации фермента CD73 исследовали функциональное влияние ингибирования CD73 антителами к CD73 на пролиферацию Т-клеток.

[0335] Т-клетки человека выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с применением набора для обогащения Т-клеток человека MagniSort (eBioscience, Inc.) и суспендировали в полной среде (RPMI-1640 с 10% FBS), содержащей 50 МЕ/мл рекомбинантного человеческого IL-2 (eBioscience, Inc.). Т-клетки (5Е4 клеток/реакционная смесь) в объеме 100 мкл смешивали с шариками Dynabeads™ с активатором CD3/CD28 Т-клеток человека (Thermo Fisher Scientific) в соотношении клеток к шарикам, составляющем 1:0,5. AMP (1 мМ) и последовательно разбавленные антитела добавляли в каждую реакционную смесь в объеме 100 мкл. Реакционную смесь, не содержащую активирующие шарики (нестимулированная группа), содержащую только шарики с CD3/CD28 (стимулированная группа) или шарики с CD3/CD28 плюс AMP (группа АМР-опосредованного ингибирования) использовали в анализах в качестве контролей. Антитело к CD73 ref-1, антитело к CD73 ref-2 и АРСР использовали в качестве положительных контролей. HLX04 (антитело к VEGF) использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки культивировали в течение 4 дней при 37°С. В день 4 клетки собирали, промывали и ресуспендировали в свежей среде RPMI-1640. Пролиферацию Т-клеток анализировали посредством анализа CellTiter-Glo. Культуральные образцы надосадочной жидкости собирали для измерения уровня цитокинов. Уровень IFN-γ измеряли с применением наборов Human IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe (BioLegend, Inc.).

[0336] Нейтрализация супрессивного влияния AMP на активность Т-клеток с помощью наиболее перспективных вариантов N1 и N4 показана на фиг. 19А и 19В. Пролиферацию CD3⁺ Т-клеток определяли посредством анализа CellTiter-Glo (фиг. 19А) и секрецию IFN-γ измеряли с применением наборов Human IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe (фиг. 19В). Антитело к CD73 ref-1, антитело к CD73 ref-2 и АРСР использовали в качестве положительных контролей. HLX04 (антитело к VEGF) использовали в качестве отрицательного контроля. Данные, проиллюстрированные на фиг. 19А и 19В, свидетельствуют о том, что наиболее перспективные варианты N1 и N4 способны повышать пролиферацию Т-клеток и секрецию IFN-γ дозозависимым образом. Данные дополнительно указывают на то, что N4№6-3-P, N4№6-4-P и N1№9-PH способны ослаблять АМР-опосредованную супрессию Т-клеток.

[0337] ПРИМЕР 9. АКТИВНОСТЬ НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ N1 И N4 В ОТНОШЕНИИ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ОПУХОЛИ В МЫШИНОЙ МОДЕЛИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАТА NCI-H292 (МУКОЭПИДЕРМОИДНОЙ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКАМ.

[0338] Активность антител к человеческому CD73 in vivo исследовали в мышиных моделях ксенотрансплантата с применением бестимусных мышей BALB/c с ослабленным иммунитетом. Всего 5Е6 клеток NCI-H292 в 100 мкл PBS смешивали со 100 мкл матригеля (Corning, Калифорния, США) (в соотношении 1:1) и подкожно имплантировали в боковую поверхность с обеих сторон самцам бестимусных мышей BALB/c (Biolasco, Тайбэй, Тайвань). Когда размер опухоли достигал 150-300 мм3 антитела к CD73 или плацебо вводили внутрибрюшинно два раза в неделю в течение 3 недель. Опухоли наблюдали и измеряли два раза в неделю. Объем опухоли определяли как TV (объем опухоли) = (длина × ширина²)/2.

[0339] На фиг. 21 показана активность наиболее перспективных вариантов N1 и N4 в отношении ингибирования роста опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата NCI-Н292 (мукоэпидермоидной карциномы легкого человека). Мышам (n=5 мышей/группа) подкожно прививали клетки NCI-H292. Первую дозу исследуемого варианта антитела вводили через 3 дня после инокуляции опухоли. Мышам внутрибрюшинно вводили антитела в дозах 50, 10 и 2 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель. Все экспериментальные точки представляют собой средние значения ± SEM. Данные демонстрируют, что N4№6-4-P характеризуется лучшей противоопухолевой активностью, чем другие антитела к CD73 в ксенотрансплантатной модели NCI-H292.

[0340] ПРИМЕР 10. ВЛИЯНИЕ НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ N1 И N4 НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОЧНОГО CD73 В КСЕНОТРАНСПЛАНТАТНЫХ ОПУХОЛЯХ NCI-H292.

[0341] Всего 5Е6 клеток NCI-H292 в 100 мкл PBS смешивали со 100 мкл матригеля (Corning, Калифорния, США) (в соотношении 1:1) и подкожно имплантировали в боковую поверхность с обеих сторон самцам бестимусных мышей BALB/c (Biolasco, Тайбэй, Тайвань) за 4 дня до введения антител. Мышам внутрибрюшинно вводили 30 мг/кг антител, АРСР и плацебо в день 0 и опухоли собирали в день 1, 3 и 7. Опухолевые клетки (2Е4) ресуспендировали в буфере для анализа (25 мМ Tris, 5 мМ MgCl₂, рН 7,46) и обрабатывали с помощью АТР (в конечной концентрации 100 мкМ) и AMP (в конечной концентрации 300 мкМ) при 37°С в течение 45 минут.Такой же объем реагента CellTiter-Glo добавляли к реакционной смеси и перемешивали содержимое в течение 2 мин (в белом 96-луночном микропланшете). После 10-минутной инкубации измеряли люминесценцию.

[0342] На фиг. 22 показано влияние наиболее перспективных вариантов N1 и N4 на ферментативную активность клеточного CD73 в ксенотрансплантатных опухолях NCI-Н292. Наиболее перспективные варианты N1 и N4 тестировали в отношении их способности ингибировать ферментативную активность CD73 в ксенотрансплантатной модели NCI-H292. Мышам (n=4 мыши/группа) подкожно прививали клетки NCI-H292 за 4 дня до обработки антителом. Антитела, АРСР и плацебо вводили внутрибрюшинно в день 0. Резекцию опухолей проводили в дни 1, 3 и 7 после введения антитела. Ферментативную активность CD73 в опухолях измеряли посредством анализа CellTiter-Glo.

[0343] Данные демонстрируют, что наиболее перспективные варианты N1 и N4 способны ингибировать ферментативную активность CD73 в ксенотрансплантатной модели NCI-Н292. N4№6-3-P и N4№6-4-P блокировали ферментативную активность CD73 в опухолях лучше, чем N1№9-PH и эталонное антитело к CD73.

[0344] ПРИМЕР 11. ВЛИЯНИЕ НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ N1 И N4 НА ЭКСПРЕССИЮ CD73 И ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОЧНОГО CD73 В КСЕНОТРАНСПЛАНТАТНЫХ ОПУХОЛЯХ MDA-MB-231.

[0345] Всего 1Е7 клеток MDA-MB-231 в 100 мкл PBS смешивали со 100 мкл матригеля (Corning, Калифорния, США) (в соотношении 1:1) и подкожно имплантировали в боковую поверхность с обеих сторон самкам мышей NOD/SCID (Biolasco, Тайбэй, Тайвань) за 7 дня до введения антител. Мышам внутрибрюшинно вводили 2 мг/кг антител и 10 мл/кг плацебо в день 0. Опухоли собирали в день 1, 3 и 7. Для измерения уровня экспрессии поверхностного CD73 5Е4 опухолевых клеток ресуспендировали в буфере для FACS (PBS с 2% FBS) и обрабатывали реагентом, блокирующим FcR человека и мыши, при 4°С в течение 30 минут. После центрифугирования клетки затем инкубировали с мышиными антителами к человеческому CD73 (4G4) при 4°С в течение 30 минут. Клетки промывали буфером для FACS и инкубировали с меченными Alexa 488 козьими антителами к мышиному Fcγ IgG при 4°С в течение еще 30 минут. Анализы посредством проточной цитометрии выполняли с применением проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter Inc.). Всего 2E4 опухолевых клеток ресуспендировали в буфере для анализа (25 мМ Tris, 5 мМ MgCh, рН 7,46) для измерения ферментативной активности CD73. Суспензии клеток обрабатывали с помощью АТР (в конечной концентрации 100 мкМ) и AMP (в конечной концентрации 300 мкМ) при 37°С в течение 45 минут. Такой же объем реагента CellTiter-Glo добавляли к реакционной смеси и перемешивали в течение 2 мин (в белом 96-луночном микропланшете). После 10-минутной инкубации измеряли люминесценцию.

[0346] На фиг. 23А и 23В показано влияние наиболее перспективных вариантов N1 и N4 на экспрессию CD73 и ферментативную активность клеточного CD73 в ксенотрансплантатных опухолях MDA-MB-231. Экспрессию CD73 измеряли по средней интенсивности флуоресценции (MFI) при окрашивании (фиг. 23А) и ферментативную активность CD73 в опухолях измеряли посредством анализа CellTiter-Glo (фиг. 23В). Данные демонстрируют, что по сравнению с группой плацебо N4№6-4-P способен подавлять экспрессию поверхностного CD73 и ингибировать ферментативную активность CD73 в ксенотрансплантатной мышиной модели MDA-MB-231.

[0347] ПРИМЕР 12. ПЕРЕКРЕСТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ N1 И N4 С ЭКСПРЕССИРУЮЩИМИ CD73 КЛЕТКАМИ МЫШИ И ОБЕЗЬЯНЫ.

[0348] Связывание антител к CD73 оценивали посредством инкубации клеток 4Т1 или LLC-MK2 (1Е5 клеток/тест) с последовательно разбавленными антителами в буфере для FACS (PBS с 2% FBS) при 4°С в течение 30 минут. Клетки промывали буфером для FACS и связывание выявляли с применением FITC-меченных козьих антител к человеческому IgG (H+L) при 4°С в течение еще 30 минут.Связывание антител с клеточной поверхностью измеряли по средней интенсивности флуоресценции (MFI) при окрашивании. Анализы посредством проточной цитометрии проводили с применением проточного цитометра Cytomics FC500 или CytoFLEX (Beckman Coulter Inc.).

[0349] На фиг. 24А и 24В проиллюстрировано перекрестное связывание наиболее перспективных вариантов N1 и N4 с экспрессирующими CD73 клетками мыши и обезьяны. Антитела к CD73 тестировали в отношении связывания с экспрессирующими CD73 клетками 4Т1 карциномы молочной железы мыши (фиг. 24А) и эпителиальными клетками LLC-MK2 почки обезьяны (фиг. 24В) посредством проточной цитометрии. HLX01 использовали в качестве отрицательного контроля. Эти данные указывают на то, что наиболее перспективные варианты N1 и N4 характеризуются перекрестной реактивностью с экспрессирующими CD73 клетками обезьяны. Наиболее перспективные варианты N1 и N4 не способны перекрестно связываться с мышиным CD73.

[0350] Предшествующие примеры приведены только в иллюстративных целях и являются всего лишь возможными примерами осуществления, изложенными для ясного понимания принципов настоящего изобретения, и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В вышеописанный вариант(варианты) осуществления можно вносить многие вариации и модификации без существенного отклонения от сущности и принципов настоящего изобретения. Предполагается, что все такие модификации и вариации включены в данном документе в объем настоящего изобретения и защищены следующей формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SHANGHAI HENLIUS BIOTECH, INC.

SHANGHAI HENLIUS BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD.

SHANGHAI HENLIUS BIOLOGICS CO., LTD.

<120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ К CD73 И ИХ ВАРИАНТОВ

<130> SH1903-20P450112

<140>

<141>

<160> 119

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 1

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 2

Thr Cys Ser Gly Gly Arg Ile Ala Asn Asn Tyr Val Gln

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 3

Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 4

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Thr Val Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 5

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Lys Val Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 6

Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Gln Gly Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 7

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 7

Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly His Gly Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 8

Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Leu Gly Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 9

Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Phe Asp Ile His

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 10

Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 11

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 12

Glu Asp Asn Leu Arg Pro Ser

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 13

Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 14

Arg Phe Val Arg Arg Pro Ser

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 15

Arg Phe Asp Arg Arg Pro Ser

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 16

Arg Phe Ser Arg Arg Pro Ser

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 17

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 18

Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asp Gly Val Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 19

Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Arg Gly Trp Val

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 20

Ala Ala Trp Asp Ile Ser Leu Asn Gly Arg Val

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 21

Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Arg Gly Trp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 22

Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Arg Gly Trp Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 23

Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Arg Gly Leu Val

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 24

Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Gln Arg Gly Trp Val

1 5 10

<210> 25

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 25

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 26

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 26

Gly Tyr Tyr Trp Ser

1 5

<210> 27

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 27

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 28

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 28

Ser Tyr Ala Ile Thr

1 5

<210> 29

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 29

Ser Tyr Ala Ile Ala

1 5

<210> 30

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 30

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 31

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 31

Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 32

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 32

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 33

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 33

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Pro Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 34

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 34

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 35

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 35

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 36

Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 37

Met Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 38

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 38

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 39

Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 40

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 40

Gly Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 41

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 41

Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 42

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 42

Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 43

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 43

Asp Met Gly Trp Ser Leu Leu Lys Thr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 44

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 44

Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Ser Ile

1 5 10

<210> 45

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 45

Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile

1 5 10

<210> 46

<211> 651

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 46

cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtcgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtt gcccttacag aatgttcata a 651

<210> 47

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 47

cttaatttta tgctgactca gccccactct gtgtcggagt ctccggggaa gacggtgacc 60

atctcctgca catgcagcgg tggcagaatt gccaacaact atgtgcagtg gtaccagcag 120

cgcccgggca cttcccccac cactgtgatc tatgaggata acctaagacc ctctggggtc 180

cctgatcgct tctctggctc gatcgacagg gcctccaatt ctgcctccct caccatctct 240

gacctgagga ctgaggacga ggctcactat tattgccagt cttatgattc caacgatggg 300

gtggctttcg gcggcgggac caaactgacc gtcctgggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420

ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggcct ggaaggcaga tagcagcccc 480

gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540

agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600

gtcacgcatg gagggagcac cgtggagaag acagtggccc ttacagaatg ttcataa 657

<210> 48

<211> 654

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 48

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctggccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc caccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acagcaagta cgcggccagc 540

agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gttgccctta cagaatgttc ataa 654

<210> 49

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 49

cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga ggtaatactg taaattggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcttgggatg acagcctgaa tggtcgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 50

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 50

cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaataagg taaattggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggata ttagcctgaa tggtcgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 51

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 51

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct gcgtggttgg 300

tacttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 52

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 52

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct acgtggttgg 300

gcgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 53

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 53

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggttc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct gcgtggtctt 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 54

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 54

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gggggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 55

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 55

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg cagggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca cccggcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct acgtggttgg 300

gcgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 56

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 56

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg catggttatg atatccactg gtatcaacat 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttcg ttagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 57

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 57

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg ctgggttatg atatccactg gtatcaacat 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttcg atagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 58

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 58

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttttg atattcactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca gtagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 59

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 59

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg actggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccggttca ccagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 60

<211> 651

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 60

cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga ggtaatactg taaattggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcttgggatg acagcctgaa tggtcgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgcctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtt gcccctacag aatgttcata a 651

<210> 61

<211> 651

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 61

cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaataagg taaattggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggata ttagcctgaa tggtcgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtt gcccctacag aatgttcata a 651

<210> 62

<211> 654

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 62

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg ctgggttatg atatccactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttcg atagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540

agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca aaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gttgccccta cagaatgttc ataa 654

<210> 63

<211> 654

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 63

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttttg atattcactg gtatcaacaa 120

cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca gtagacggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240

caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540

agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca aaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gttgccccta cagaatgttc ataa 654

<210> 64

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 64

gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180

gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300

gggtgggagc tactaaaaac ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct caagc 375

<210> 65

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 65

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggccggtac 300

gatttttgga gtggttatta tgcgtacttt gactactggg gccagggcac cctggtcacc 360

gtctcaagc 369

<210> 66

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 66

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 67

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 67

gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggact cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtaatag cataggctat 180

gcggaccctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300

gggtgggagc tactaaaaac ctcttactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct caagc 375

<210> 68

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 68

gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggctagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180

gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300

gggtggagtc tactaaaaac caactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct caagc 375

<210> 69

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 69

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctctggata taccttcagc agctatgcta tcacttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatt tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 70

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 70

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcgct agctatgcta ttagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatt tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 71

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 71

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcgcttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttagtata tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 72

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 72

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 73

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 73

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcgct agctatgcta ttagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agttaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatt tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 74

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 74

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 75

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 75

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 76

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 76

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaatg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatggg 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360

agc 363

<210> 77

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 77

caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240

atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccatgt attactgtgc gagtgatgga 300

gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcg 360

agc 363

<210> 78

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 78

gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtaatag cataggctat 180

gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300

gggtgggagc tactaaaaac ctcttactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct caagc 375

<210> 79

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 79

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 80

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 80

Leu Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Cys Ser Gly Gly Arg Ile Ala Asn

20 25 30

Asn Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Thr Thr

35 40 45

Val Ile Tyr Glu Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ala Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Asp Leu Arg Thr Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp

85 90 95

Ser Asn Asp Gly Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Gly Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 81

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 81

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 82

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 82

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 83

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 83

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Lys Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ile Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 84

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 84

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Trp Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 85

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 85

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 86

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 86

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 87

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 87

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 88

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 88

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Gln Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 89

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 89

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly His Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Val Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 90

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 90

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Leu Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 91

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 91

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Phe Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 92

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 92

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 93

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 93

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 94

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 94

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Lys Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ile Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 95

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 95

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Leu Gly

20 25 30

Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 96

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 96

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Phe Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Met Tyr Arg Phe Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 97

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 97

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 98

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 98

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 99

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 99

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 100

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 100

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Ser Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 101

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 101

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Met Gly Trp Ser Leu Leu Lys Thr Asn Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 102

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 103

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 103

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 104

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 104

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Ser Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 105

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 105

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 106

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 106

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 107

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 108

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 108

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 109

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 109

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 110

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 110

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 111

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 111

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Ser Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 112

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 112

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 113

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 113

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 114

<211> 329

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 114

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Ser

1 5 10 15

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 115

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 115

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 116

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Ser Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu

210 215 220

Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 117

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 117

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Met Gly Trp Ser Leu Leu Lys Thr Asn Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu

210 215 220

Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 118

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 118

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys

210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 119

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 119

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys

210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, специфически связывающиеся с CD73, и конъюгаты указанных антител с терапевтическим средством или меткой. Также предложены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к CD73, а также относящиеся к ним векторы экспрессии и клетки-хозяева. Предусмотрен способ получения антител к CD73. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к применению антител, конъюгатов и композиций для обнаружения белка CD73 в образце и для лечения рака или фиброза. Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты связываются с CD73 человека с высокой аффинностью, подавляют ферментативную активность CD73 и индуцируют интернализацию CD73. 11 н. и 10 з.п. ф-лы, 44 ил., 6 табл., 2 пр.

1. Антитело к CD73, содержащее:

(i) последовательность вариабельного домена легкой цепи (LC), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39;

(ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи (LC), состоящую по сути из а) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:12 и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из а) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:26, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40;

(iii) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:41;

(iv) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:33, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:42;

(v) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:43;

(vi) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:28, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:41;

(vii) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:34, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:41;

(viii) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:23, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:29, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:35, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:44;

(ix) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:34, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:45;

(x) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:35, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:41;

(xi) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:7, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:36, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:45;

(xii) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:8, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:15, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:45;

(xiii) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:16, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:37, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:45;

(xiv) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:36, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:45; или

(xv) последовательность вариабельного домена легкой цепи (LC), состоящую по сути из a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4, b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), состоящую по сути из a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25, b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38, и c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:42.

2. Антитело к CD73 по п. 1, где:

(i) LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:79, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:97;

(ii) LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:80, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:98;

(iii) LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:81, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:99;

(iv) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:82, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:100;

(v) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:83, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:101;

(vi) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:84, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:102;

(vii) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:85, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:103;

(viii) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:86, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:104;

(ix) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:87, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105;

(x) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:88, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:106;

(xi) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:89, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:107;

(xii) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:90, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:108;

(xiii) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:91, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:109;

(xiv) VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:92, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:110;

(xv) LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:93, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:111;

(xvi) LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:94, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:101;

(xvii) LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:95, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:108; или

(xviii) LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:96, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:109.

3. Антитело к CD73 по п. 1, содержащее: последовательность вариабельного домена легкой цепи (LC), содержащую a) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, b) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и c) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), содержащую а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, b) CDR-H2 содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30, и c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39.

4. Антитело к CD73 по п. 1 или 2, где LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:79, и VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97.

5. Антитело к CD73 по п. 1, содержащее: последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), содержащую a) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6, b) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и c) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), содержащую а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2 содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:35, и c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:41.

6. Антитело к CD73 по п. 1 или 2, где VL антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:88, и где VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:106.

7. Антитело к CD73 по п. 1, содержащее: последовательность вариабельного домена легкой цепи (LC), содержащую a) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, b) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:16, и c) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), содержащую a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:27, b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:37, и c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:45.

8. Антитело к CD73 по п. 1 или 2, где LC антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:96, и VH антитела к CD73 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:109.

9. Антитело к CD73 по любому из пп. 1-8, где антитело к CD73 содержит антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из группы, состоящий из Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечного Fv (scFv), Fv-фрагмента, диатела и линейного антитела.

10. Конъюгат для лечения рака у субъекта, содержащий антитело к CD73 по любому из пп. 1-9, конъюгированное с терапевтическим средством.

11. Конъюгат для обнаружения белка CD73 в образце, содержащий антитело к CD73 по любому из пп. 1-9, конъюгированное с меткой, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, флуоресцентного красителя и фермента.

12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к CD73 по любому из пп. 1-9.

13. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 12.

14. Клетка для продуцирования антитела к CD73 по любому из пп. 1-9, содержащая вектор экспрессии по п. 13.

15. Способ получения антитела к CD73 по любому из пп. 1-9, предусматривающий культивирование клетки по п. 14 и выделение антитела к CD73 из клеточной культуры.

16. Композиция для лечения рака или фиброза, содержащая антитело к CD73 по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Применение антитела к CD73 по любому из пп. 1-9 или конъюгата по п. 11 для обнаружения белка CD73 в образце, полученном от пациента, посредством обнаружения антитела к CD73, связанного с белком CD73.

18. Применение по п. 17, где антитело к CD73 применяется в иммуногистохимическом анализе (IHC) или в анализе ELISA.

19. Применение антитела к CD73 по любому из пп. 1-9 или конъюгата по п. 10 или композиции по п. 16 для лечения рака у субъекта, где рак предпочтительно выбран из группы, состоящей из меланомы, NSCLC, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака молочной железы с тройным негативным фенотипом (TNBC), рака желудка, классической лимфомы Ходжкина (cHL), неходжкинской лимфомы, первичной медиастинальной B-клеточной лимфомы (NHL PMBCL), мезотелиомы, рака яичника, рака легкого, рака пищевода, носоглоточной карциномы (NPC), рака желчных путей, колоректального рака, рака молочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака слюнных желез и злокачественных новообразований, экспрессирующих CD73.

20. Применение антитела к CD73 по любому из пп. 1-9, или конъюгата по п. 10, или композиции по п. 16 для лечения фиброза у субъекта.

21. Применение по п. 19 или 20, где субъекту дополнительно вводят терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, средства, ингибирующего рост, цитотоксического средства и иммунотерапевтического средства, или где в отношении субъекта дополнительно осуществляется радиотерапия и/или хирургическая процедура.